TW201331362A - 一種用以防治肝纖維化的樟芝組合物 - Google Patents
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Abstract
本發明係評估樟芝組合物對硫代乙醯胺(TAA)誘導大鼠肝臟纖維化的效果。大鼠每週三次腹腔注射硫代乙醯胺持續8週，三組大鼠分別給予0.5% CMC和樟芝(131，393 mg/kg)。硫代乙醯胺造成大鼠血漿白蛋白值下降、γ-GT活性上升，並明顯增加脾臟重量和肝臟膠原蛋白含量、減少肝臟蛋白質含量，肝臟glutathione含量下降，及造成脂質過氧化程度上升。樟芝則對硫代乙醯胺所升高的血漿ALT和AST值有明顯降低作用、增加第八週血清白蛋白含量及降低γ-GT活性，以及增加glutathione含量及glutathione peroxidase的活性，和減少脂質過氧化程度。上述結果明確顯示，樟芝組合物能抑制肝臟結節及膽管纖維化的產生，及減輕硫代乙醯胺所誘發的大鼠肝臟纖維化。
Description
本發明係關於一種樟芝組合物，特別係指一種用以防治肝纖維化的樟芝組合物。
樟芝(Antrodia camphorate)屬於非褶菌目、多孔菌科，為多年生蕈菌類，為台灣特有種真菌，其菌絲體可用以進行粗萃取物或活性化合物之分離，進而製成樟芝相關的保健食品或藥物，目前已知樟芝具有改善肝炎、脂肪肝及抗肝癌的功能，然而，迄今樟芝對於肝纖維化的減緩效果仍未能釐清。
肝纖維化為一可逆過程，目前在臨床上將肝纖維化視為一種癒合的模式，其形成機制係源自於：當肝臟損傷時會產生發炎反應，此時身體的免疫反應以及肝細胞的再生就會被活化，當傷害持續進行，則會令免疫反應、細胞再生持續被活化，造成細胞外間質(ECM)沉積，此時肝臟就會進一步的發展為肝纖維化，ECM堆積所形成的纖維疤痕會造成肝功能異常，之後若進一步發展成結節，就轉變為肝硬化，此時就成為一不可逆過程；而造成肝臟纖維化的原因包含：毒物、或是藥物濫用等化學物質所引起的傷害，還有B、C型肝炎病毒所引起的肝炎、非酒精性脂肪肝、酒精過度攝取所造成的脂肪肝等。
肝臟係為人體內最大的器官，其功能包括醣類、胺基酸、脂肪、維生素及荷爾蒙的代謝、藥物轉化、解毒、製造膽汁及合成球蛋白、白蛋白(albumin)、纖維蛋白原等，而上述功能皆須不同酵素協助反應，如：丙胺酸轉胺酶(Alanine amino-transferase,ALT)，又稱麩草酸轉胺基酶(glutamyl pyruvic transaminase,GPT)可以催化丙胺酸(alanine)轉移胺基至a-草醯戊二酸鹽(a-oxoglutarate)之反應，而產生麩胺酸鹽(glutamate)與丙酮酸鹽(pyruvate)；以及天門冬氨酸轉胺酶(Aspartate amino-transferase,AST)，又稱麩氨基酸草醋酸轉氨基酵素(Glutamic oxaloacetic transaminase,GOT)則催化天門冬胺酸鹽(aspartate)轉移胺基至a-酮戊二酸鹽(a-ketoglutamate)，以形成麩胺酸鹽(aspartate)與草醯二酸鹽(oxaloacetate)，而由於ALT與AST是屬於細胞質之酵素，因此只要肝臟的損傷與細胞膜之破壞或改變有關時，均會使ALT或AST漏出而進入血液中，使GPT及GOT數值升高，而此兩項生化檢驗值被認為是偵測肝損傷之功能重要指標，除此之外，白蛋白(albumin)、丙種谷氨酸轉肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GT)、羥基脯胺酸(Hydroxyproline)、穀胱甘胺酸(Glutathione,GSH)、丙二醛(malondialdehyde)、穀胱甘過氧化酶(Gutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)及過氧化氫酶(Catalase)等生化數值之量測亦可作為評估肝損傷的依據。
為了進一步釐清肝損傷之生理模式，目前研究多以四氯化碳、硫代乙醯胺、乙醯胺基苯酚以及三氯甲烷等化學物質誘導肝損傷以進行後續實驗，而其中硫代乙醯胺在大小白鼠所誘發的肝損傷之病理變化類似人類的肝損傷模式，因此可利用硫代乙醯胺對大鼠進行肝損傷及肝纖維化之誘導，以評估健康食品的功效。
硫代乙醯胺(thioacetamide,TAA)，分子式為C2H5NS，可溶於水及酒精，具高度特異性之肝毒性，此毒性係來自於細胞代謝TAA後之代謝產物-雙氧化物(dioxide)，其會對細胞產生氧化壓力，而此雙氧化物若進一步與細胞中的蛋白質或脂質結合就會造成細胞死亡；另一方面，TAA引起的肝臟病變亦會造成膽管增生，進而誘發膽管纖維化(cholangio-fibrosis)。
於中華民國第I296929號發明專利案中，提出一種用以預防及治療B型肝炎、酒精性肝損傷及四氯化碳肝損傷之樟芝製劑，此樟芝製劑係包含樟芝菌絲體做為活性成分，對於酒精誘發肝炎具特別的保肝效果，但該發明專利案未曾敘明該樟芝製劑是否對於肝纖維化有顯著的保護效果。
有鑑於此，本案發明人鑑於利用此樟芝試劑防治肝纖維化的重要性及市場需求性，乃亟思加以改良創新，並經多年苦心孤詣潛心研究後，終於成功研發完成本件”一種用以防治肝纖維化的樟芝組合物”。
本說明書中所述之所有科學性及技術性用語，除非另有定義，否則皆為該所屬領域具通常知識者可通曉之定義。
本發明之目的係提供一種用以防治肝纖維化之樟芝菌絲體。
本發明之次一目的係為探討樟芝對於硫代乙醯胺誘發大鼠肝纖維化的改善效果。
本發明之再一目的係為探討樟芝作用於肝臟細胞的分生機制。
可達成上述目的之樟芝菌絲體，該菌絲體寄存於新竹食品工業發展研究所菌種保存中心，登錄號碼為：BCRC 35398。將此樟芝菌絲體與一藥學上可接受之賦形劑，如：稀釋劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑等混合，以製成各型式劑型的醫藥組合物，此醫藥組合物的有效使用劑量為成人每日使用0.42-3.78公克。
本發明之樟芝菌絲體係經由硫代乙醯胺誘發大鼠肝纖維化之動物模式探討其保肝效果，其主要藉由評估血漿中AST、ALP、γ-GT活性及Albumin濃度、肝臟中Glutathione、Malondialdehyde、蛋白質及Hydroxyproline之含量、肝臟中SOD、Catalase及GSH-Px之活性、肝臟、脾臟重量以及肝臟組織切片之情況，全面確認該樟芝作用於肝臟細胞的運作機制。
本試驗所使用的樟芝菌絲體，基本上係採本案申請人曾申請之中華民國發明專利申請號第097150616號之液體培養方法來進行。其中包括將菌絲體接種於平板上，於適當溫度如15-35℃，(較佳者周溫約25℃)下培養約2週後，刮取菌絲接種於燒瓶內，並加入由1%榖類(如麥粉類)、0.1%蛋白凍、0.05%硫酸鎂、0.05%磷酸氫二鉀、0.05%硫酸鐵、2%蔗糖、0.5%酵母抽出物、粉、膏、0.2%豆類(如黃豆粉、綠豆粉、大豆粉等)所組成之培養基，在約30℃，pH 2-8，較佳者pH 4-7，更佳者約pH 4.5，及振盪速率50-250 rpm之下振盪培養到log期初期，亦即約5-7天；最後，將燒瓶培養物接種於醱酵槽培養基(同燒瓶培養基)內，在15-30℃，(較佳者周溫約25℃)，槽壓0.1-1.5公斤/平方公分，及pH約4.5下，以0.5-1vvm通氣速率通入空氣，或空氣與氧氣，二氧化碳或氮氣的混合物，較佳者空氣，在50-300 rpm攪拌速率下培養約8-16天，即得樟芝菌絲體液體培養懸浮液，經冷凍乾燥後得樟芝菌絲體發酵全液凍乾粉，本發明所使用的樟芝即是以此樟芝菌絲體發酵全液凍乾粉充填膠囊而成。
而此樟芝係以腺苷(adenosine)及芝麻素(sesamine；adenosine)為指標成分，每克腺苷及芝麻素的含量分別為0.96-1.92毫克及1.44-2.4毫克。
於下列實施例中，將上述樟芝菌絲體發酵全液凍乾粉，以0.5%羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl cellulose,CMC)溶液分別配成濃度為13.1、39.3及78.6 mg/ml之懸浮液，經口投予、投予體積為每100公克大鼠體重投與1毫升。控制組大鼠給予同體積的0.5% CMC溶液。
本試驗使用雄性Wistar大鼠，購自樂斯科生物科技股份有限公司，飼養於中國醫藥大學動物室。動物室設定溫度為22±20 C，光照為12小時亮、12小時暗(早上8點亮，下午8點暗)。動物經一週適應後，篩選出健康大鼠使用。飼料使用進口飼料(TestDiet)，飲水經逆滲透處理。在試驗物質投予第一天，大鼠依體重大小，分成適當重量群，進行隨機分組，分成5組，每組動物12隻。
試驗物質於第一次硫代乙醯胺投予前一天開始投與，而後每日投與直至大鼠犧牲前一天止。大鼠肝纖維化的誘導，每週三次以腹腔注射投與硫代乙醯胺(溶於生理食鹽水；投與體積為0.2 ml/100 g body weight)，硫代乙醯胺在試驗物質投與40分鐘後投與。硫代乙醯胺的劑量隨著時間的增加而增加，第一、二週的劑量為100 mg/kg，第三~五週的劑量為150 mg/kg，第六~八週的劑量為200 mg/kg。於硫代乙醯胺投與後滿一、三、六週時，大鼠在麻醉下由尾動脈抽血，供血清生化值檢定。第八週採血時，大鼠也同時犧牲，迅速取下肝臟及脾臟，以冰冷生理食鹽水洗淨後，吸乾水分，稱重。最大葉肝臟分成五部分，相同的部位分別(1)浸於10%中性福馬林溶液，供病理切片使用，(2)稱重後在100 0C完全烘乾供膠原蛋白含量測定。其餘肝臟分裝3袋，儲存於-800C備用。每週稱體重一次，做為當過投予試驗物質的體重依據。
除了病理H.E染色判讀數據外，其它實驗所得數據均以單尾變異數分析(one-way analysis of variance)，並進行Duncan‘s multiple range test，當p<0.05時表示組間具有顯著性差異。病理H.E染色判讀依據結果以Kruskall Wallis H變異數分析，而後進行Mann-Whitney U test檢定，以P值小於0.05認為有顯著差異。
如表一所示，第一至第八週硫代乙醯胺+CMC組大鼠平均體重較正常控制組輕。樟芝兩個劑量組(131、393 mg/kg)處理之大鼠體重與硫代乙醯胺+CMC組比較沒有明顯差異。
所有數據均以Mean±SD(n=12)表示。以英文字母a、b及c表示統計之結果，相同字母表示組間不具統計上差異(p>0.05)。
血液取得後，以4700 rpm離心15分鐘，取血漿供生化檢驗用。第一、三、六週只進行ALT及AST檢驗。第八週除alanine aminotransferase(ALT)、Aspartate aminotransferase(AST)外，增加白蛋白(albumin)及丙種谷氨酸轉肽酶γ-glutamyltranspeptidase(γ-GT)的測定。檢驗使用市售檢驗試劑(Roche)，以血清生化自動分析儀測定(COBAS MIRA)。
如表二至表五所示，大鼠投予硫代乙醯胺之後，第一、三、六及八週的血漿AST、ALT值均高於控制組。低、高劑量樟芝處理之大鼠，其第一至第八週的血漿AST值低於硫代乙醯胺+CMC組。低、高劑量樟芝處理之大鼠，第一、六、八週的血漿ALT值低於硫代乙醯胺+CMC組，第三週血漿ALT值雖低於硫代乙醯胺+CMC組，但不具統計上的差異。
所有數據均以Mean±SD(n=12)表示。以英文字母a及b表示統計之結果，相同字母表示組間不具統計上差異(p>0.05)。
所有數據均以Mean±SD(n=12)表示。以英文字母a及b表示統計之結果，相同字母表示組間不具統計上差異(p>0.05)。
所有數據均以Mean±SD(n=12)表示。以英文字母a、b及c表示統計之結果，相同字母表示組間不具統計上差異(p>0.05)。
所有數據均以Mean±SD(n=12)表示。以英文字母a及b表示統計之結果，相同字母表示組間不具統計上差異(p>0.05)。
如表六所示，大鼠投予硫代乙醯胺之後，第八週的血漿albumin值較控制組低且γ-GT活性較控制組高。樟芝兩個劑量組都可提升的血漿albumin濃度及降低血中γ-GT活性。
所有數據均以Mean±SD(n=12)表示。以英文字母a、b及c表示統計之結果，相同字母表示組間不具統計上差異(p>0.05)。
如表七所示，大鼠投予硫代乙醯胺之後，最後肝臟、脾臟的絕對重量和相對重量較控制組高。樟芝兩個劑量組的肝臟絕對重量和相對重量與硫代乙醯胺+羧甲基纖維素鈉組比較沒有差異。樟芝兩個劑量組的脾臟絕對重量和硫代乙醯胺+羧甲基纖維素鈉組比較沒有差異、但樟芝高劑量組的脾臟相對重明顯低於硫代乙醯胺+羧甲基纖維素鈉組。
所有數據均以Mean±SD(n=12)表示。以英文字母a及b表示統計之結果，相同字母表示組間不具統計上差異(p>0.05)。
肝組織GSH的測定依據Hissin and Hilf(1973)的方法，秤取肝臟組織0.5公克，加入5ml的1.15%KCl溶液，以均質機均質化後，取1 ml的均漿，加入1 ml trichloroacetic acid 10%，混合均勻後，以3000 g，離心15分鐘。取0.01 ml上清液，加入0.18 ml phosphate-EDTA緩衝液及新鮮配製的0.01 ml s-phthaldehyde(1mg/ml methanol)溶液，混合均勻後，以螢光420 nm，激發波長350 nm偵測之。以μmole/g weight表示之。
如表八所示，硫代乙醯胺誘發大鼠慢性肝損傷肝臟glutathione含量明顯下降。樟芝高劑量組能提升肝臟glutathione含量。
肝組織的脂質過氧化測定依據Ohkawa et al.(1979)的方法，以1.15% KCl溶液製備10%肝組織均質液，經4000 rpm、40C離心5分鐘。取上清液和thiobarbituric acid溶液加熱反應，以n-butanol、pyridine(15:1)混合液萃取，在532 nm測吸光度。脂質過氧化的程度以nmol malondialdehyde(MDA)/mg protein表示之。
如表八所示，硫代乙醯胺誘發大鼠慢性肝損傷，肝臟malondialdehyde含量增加，即脂質過氧化程度明顯提升。樟芝兩個劑量組的肝臟malondialdehyde含量明顯低於硫代乙醯胺+CMC組。
所有數據均以Mean±SD(n=12)表示。以英文字母a及b表示統計之結果，相同字母表示組間不具統計上差異(p>0.05)。
肝臟蛋白質的測定使用脂質過氧化測定的肝組織均質液上清液，以市售蛋白質測定試劑Coomassie Blue(Kenlor Indus. Inc.；USA)呈色，於540 nm測吸光值。以牛血清白蛋白為標準品。蛋白質量以mg/g tissue表示之。如表九所示，硫代乙醯胺誘發大鼠慢性肝損傷，使肝臟的可溶性蛋白質含量降低，樟芝高劑量組與硫代乙醯胺+CMC組比較，其肝臟可溶性蛋白質含量明顯增加。
Hydroxyproline的測定參照Neuman and Logan(1950)的方法。肝臟乾組織水解後加H2O2氧化，再以p-dimethylaminobenzoaldehyde呈色，於540 nm測吸光值。hydroxyproline量以μg/g tissue表示之。如表九所示，硫代乙醯胺誘發大鼠慢性肝損傷明顯增加肝臟hydroxyproline含量。樟芝高劑量組與硫代乙醯胺+CMC組比較，其肝臟hydroxyproline含量明顯減少。
所有數據均以Mean±SD(n=12)表示。以英文字母a及b表示統計之結果，相同字母表示組間不具統計上差異(p>0.05)。
組織之前處理依據Xia et al.(1995)的方法。活性的測定使用市售SOD活性檢驗試劑Ransod(RANDOX Lab. Ltd. UK)。SOD活性定義為抑制2-(-iodophenyl)-3-(4-nitrophenol)-5-phenyltetrazolium chloride還原反應速率50%所需酵素的量為一個單位(U)，以U/mg protein表示之。
肝組織之前處理依具Xia et al.(1995)的方法。GSH-Px活性測定使用市售GSH-Px活性檢驗試劑Ransel(RANDOX Lab. Ltd. UK)。GSH-Px活性定義為每分鐘氧化1μmol NADPH所需酵素的量為為一個單位(U)。肝組織的GSH-Px活性以mU/mg protein表示之。
catalase活性測定依具Aebi(1984)的方法。其活性定義以K(一級反應之速率常數；min-1)為一個單位(U)，以U/mg protein表示之。K的計算方法如右：K=(2.3/t2-t1)(logA1/A2)，其中A1：為t1=0秒時之吸光值，A2：為t2=25秒時之吸光值。
如表十所示，硫代乙醯胺誘發大鼠慢性肝損傷，使肝臟的抗氧化酵素SOD、catalase及GSH-Px活性降低。樟芝處理組對SOD及catalase的活性沒有影響。但樟芝高劑量組能提升GSH-Px的活性。
所有數據均以Mean±SD(n=12)表示。以英文字母a及b表示統計之結果，相同字母表示組間不具統計上差異(p>0.05)。
肝臟組織經福馬林固定後，進行石臘包埋及切片製作，使用兩種染色法，一為一般的H.E. stain(Hematoxylin and eosin stain)，另一種為膠原蛋白的特殊染色即Sirius red stain。病理學比較依照衛生署公告的護肝功能評估辦法，將肝臟的損傷分為四個等級，加以評分。為了使病變的評分客觀，H.E染色部分委託國立中興大學獸醫學院廖俊旺教授判讀評分。肝臟纖維化使用影像分析系統(Image-Pro Plus version 5.1;Media Cybernetics,MD,USA)分析肝纖維化的比例，每個切片以中間分成兩個區塊以20×照相，進行分析。
上述四個等級則依據慢性肝損傷時，肝細胞發炎的程度、脂質變性、肝細胞壞死及膽管增生等予以半定量分析。評估分數是由”0”到”4”分，其中”0”代表沒有(absent)；”1”代表少量(trace)；”2”分代表輕微(weak)；”3”分代表中等程度(moderate)；”4”分代表極嚴重(strong)。而對肝纖維化的半定量分析，則可以依據Ruward等(1989)及Gabriele等(1997)的方法，將肝纖維化區分為以下五個等級：”0”分代表正常肝組織、沒有任何肝纖維化；”1”分代表有膠原的增生，但沒有形成中隔(在中央靜脈或門脈區有放射狀纖維增生)；”2”分代表在中央靜脈和門脈區二者間，形成不完全的中隔(此中隔彼此沒有交會)；”3”分代表形成完整的中隔，中間彼此交會，並將肝實質分割成許多節片斷，但此中隔尚很薄；”4”分代表形成完全的中隔，且中隔變厚，亦即完全的肝硬化。
如圖一所示，硫代乙醯胺誘發大鼠慢性肝損傷，肝臟外觀可見巨大結節(macronodula)。由圖二H.E.染色也可見明顯的Nodular hyperplasia。如表十一，硫代乙醯胺+羧甲基纖維素鈉組明顯出現Nodular hyperplasia的比率為8/12。H.E.染色明顯看到膽管纖維化的情形(圖二B)，但空泡及壞死組織相當輕微。樟芝處理組的空泡及組織壞死情形與硫代乙醯胺+羧甲基纖維素鈉組比較沒有差異。但結節及膽管纖維化的情形，樟芝高劑量組明顯較硫代乙醯胺+羧甲基纖維素鈉組輕(表十一)。圖三以Sirius red染色，明顯出現纖維化的情形(圖三B)。以影像分析軟體分析纖維化面積占肝臟面積的比率，硫代乙醯胺+羧甲基纖維素鈉組明顯高於控制組，樟芝高劑量組明顯較硫代乙醯胺+羧甲基纖維素鈉組輕(表十二)。
表中數字係依據半定量分析法定義肝臟細胞損傷或發炎的程度，*p<0.05,**p<0.01此統計分析係與僅注射硫代乙醯胺組之大鼠進行比較。
所有數據均以Mean±SD(n=12)表示。以英文字母a及b表示統計之結果，相同字母表示組間不具統計上差異(p>0.05)。
1.可降低血漿ALT、AST和γ-GT值。
2.可增加血漿白蛋白。
3.可減輕脾臟腫大。
4.可增加肝臟蛋白質含量。
5.可降低肝臟脂質過氧化程度。
6.可活化肝臟glutathione抗氧化系統。
7.可降低肝臟肝臟巨大結節的產生及膽管纖維化程度。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
綜上所述，本案確屬創新，並能較習用物品增進上述多項功效，應已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。
圖一、硫代乙醯胺誘發大鼠肝臟纖維化之肝臟外觀；
圖二、蘇木精-伊紅染色之大鼠肝臟組織圖，A：控制組、B：硫代乙醯胺+羧甲基纖維素鈉組，明顯出現肝臟局部結節性增生、C：硫代乙醯胺+樟芝(131mg/kg)組、D：硫代乙醯胺+樟芝(393mg/kg)組，肝臟局部結節性增生明顯減少。放大倍數40x；以及
圖三、蘇木精-伊紅染色之大鼠肝臟組織圖，A：控制組、B：硫代乙醯胺+羧甲基纖維素鈉組，明顯出現膽管纖維症、C：硫代乙醯胺+樟芝(131mg/kg)組，D：硫代乙醯胺+樟芝(393mg/kg)組，膽管纖維症明顯減少。放大倍數200x。
Claims (8)
- 一種用以防治肝纖維化之樟芝菌絲體。
- 如申請專利範圍第1項所述之用以防治肝纖維化之樟芝菌絲體，該菌絲體係寄存於新竹食品工業發展研究所菌種保存中心，登錄號碼為：BCRC 35398。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之用以防治肝纖維化之樟芝菌絲體，其中該肝纖維化之症狀係為硫代乙醯胺之氧化壓力傷害或肝炎所誘導。
- 一種用以防治肝纖維化之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係包含如申請專利範圍第1或2項所之樟芝菌絲體及一藥學上可接受之賦形劑。
- 如申請專利範圍第4項所述之醫藥組合物，其中該賦形劑為稀釋劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑。
- 如申請專利範圍第4項所述之醫藥組合物，其中該醫藥組合物之有效劑量為0.42-3.78公克/天。
- 如申請專利範圍第1或4項所述之用以防治肝纖維化之樟芝菌絲體，其中該樟芝菌絲體係經液體發酵培養生產而得。
- 如申請專利範圍第1或4項所述之用以防治肝纖維化之樟芝菌絲體，其中該樟芝菌絲體之用途係在於降低丙胺酸轉胺酶及天門冬氨酸轉胺酶活性、增加血漿白蛋白並降低肝臟脂質過氧化程度。
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