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TW201335190A - 用於治療心臟衰竭之合成ａｐｅｌｉｎ模擬物 - Google Patents

用於治療心臟衰竭之合成ａｐｅｌｉｎ模擬物 Download PDF

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TW201335190A
TW201335190A TW102103025A TW102103025A TW201335190A TW 201335190 A TW201335190 A TW 201335190A TW 102103025 A TW102103025 A TW 102103025A TW 102103025 A TW102103025 A TW 102103025A TW 201335190 A TW201335190 A TW 201335190A
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nle
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guanamine
hkgp
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TW102103025A
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Philipp Grosche
Qi-Ying Hu
Hidetomo Imase
David Thomas Parker
Kayo Yasoshima
Frederic Zecri
Hongjuan Zhao
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Novartis Ag
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Abstract

本發明提供式I'之合成多肽，□或其醯胺、酯或鹽，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12及X13係如本文中定義。該等多肽係APJ受體之激動劑。本發明亦係關於製造本發明之多肽之方法及其治療用途，例如治療或預防急性失代償性心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺性高血壓、心房震顫、布魯格達氏症候群(Brugada syndrome)、心室性心博過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、局部缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖症、周邊動脈病、腦血管意外、暫時性腦缺血、創傷性腦損傷、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、燒傷(包括曬傷)及子癇前症。本發明進一步提供藥理活性劑之組合及醫藥組合物。

Description

用於治療心臟衰竭之合成APELIN模擬物
本發明係關於包含經修飾之肽及多肽序列之新穎組合物，該等肽及多肽序列經設計以治療其所投與之個體之心血管疾病且其比其野生型對應物展示更大之抗降解性及等效或更大之生物活性。本發明亦係關於製備該等組合物及使用該等組合物作為醫藥活性劑來治療心血管疾病之方法。
在西方世界中65歲以上成人心臟衰竭之發病率為約1/100。最常見病理係心肌收縮力且因此心輸出量(即，任一心室隨時間排出之有效血液體積)之慢性短缺。患有慢性心臟衰竭之患者在心肌收縮力進一步下降時會具有急性失代償發作(即，心臟無法維持適當血液循環)。僅美國每年便有約5×105人因「急性失代償性心臟衰竭」(ADHF)住院。
用於ADHF之當前療法包括利尿劑、血管舒張劑及直接增加心肌收縮力之強心劑(inotrope)。當前靜脈內強心劑(多巴酚丁胺(dobutamine)、多巴胺(dopamine)、米力農(milrinone)、左西孟旦(levosimendan))係用於急性環境，儘管其與諸如心律不整及增加之長期致命性等不良事件相關。該等傾向已阻止其應用於慢性心臟衰竭。地穀新(Digoxin)係口服強心劑，但其受限於窄治療指數、增加之致心 律不整性可能及腎功能不全禁忌。
ADHF迫切地需要增加心肌收縮力而無致心律不整性或致命性傾向之心臟衰竭療法，且其亦可解決慢性心臟衰竭之巨大未滿足之醫療需要。
Apelin係先前孤兒G-蛋白-偶合受體(GPCR)APJ(亦稱為apelin受體)、血管收縮素樣-1受體、血管收縮素II樣-1受體及諸如此類之內源性配體。Apelin/APJ路徑係廣泛地表現於心血管系統中且在臨床前模型中apelin已顯示重大有益心血管影響。人類之急性apelin投與引起周邊及冠狀血管舒張並增加心輸出量(Circulation.2010；121：1818-1827)。因此，APJ激動正成為患有心臟衰竭之患者之重要治療靶。認為apelin受體APJ之活化增加心肌收縮力並提供心臟保護而無當前療法之傾向。然而，天然apelin展示極短之半衰期及活體內作用持續時間。
因此，識別模擬apelin之功能但具有增加之半衰期並顯示與天然存在之apelin等效或更大之生物活性之肽及多肽係合意的。此外，識別展示增加之構形限制(即，達成並維持活性構形狀態以使得肽及多肽可與其受體及/或其他路徑靶相互作用而無需額外摺疊或重新定位之能力)之apelin類似物肽及多肽係合意的。業內需要使用該等肽及多肽類似物、包含該等類似物之組合物及製備及使用該等組合物作為醫藥活性劑之方法來治療諸如心血管疾病等疾病。
本發明之目的係提供新穎肽及多肽，其可用作APJ激動劑且亦具有以下優於野生型apelin及其他已知apelin類似物之改良中之至少一者：增加之半衰期；對投與後及/或溶解後降解更大之免除性；及增加之構形限制，其全部同時展示與野生型apelin相同或更大之生物活性。因此，本發明之肽及多肽尤其可用於治療或預防心血管疾病，例 如心臟衰竭、與心臟衰竭相關之病症及病況及對APJ受體活性之活有反應化之病症及病況。
在一實施例中，本發明之肽及多肽尤其可用於治療或預防與心臟衰竭相關之病症或病況或對APJ受體活性之活化(或激動)有反應之病症。在另一實施例中，本發明之肽及多肽可用於治療急性失代償性心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺性高血壓、心房震顫、布魯格達氏症候群、心室性心博過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、局部缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖症、周邊動脈病、腦血管意外、暫時性腦缺血、創傷性腦損傷、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、燒傷(包括曬傷)及子癇前症。
如本文所述，本發明係關於該等肽及多肽、醫藥組合物及其製造方法及用途。本發明之肽及多肽之實例包括如式I至IX中任一者之肽及多肽或其醯胺、酯或鹽、以及本文具體列示之任何肽或多肽，包括(但不限於)實驗實例。
因此，本發明提供式(I')之肽或多肽：
其中：X1係該多肽之N-末端且係不存在或係選自pE、R、Isn、Q、A、K及5-胺基-戊酸；X2係R、A、r、N-Me-R、K、H、hF、hK、F、E或Orn；X3係P、A、a、p、4-PhP、K、D、六氫吡啶-2-甲酸或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X7位置處之半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵；X4係R、A、r、N-Me-R、F、E或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側 鏈與X7位置處之半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵；X5係L、Cha、A、D-L、N-Me-L、K、D、4-PhF或F；X6及X12獨立地係選自C、c、hC、D-hC、K、D、Orn、Dab或E之天然或非天然胺基酸，其中X6之側鏈與X12經由共價鍵連接在一起形成單硫鍵(-S-)、二硫鍵(-S-S-)或醯胺鍵(-NHC(O)-或-C(O)-NH-)或式-S-CH2-C(=Z)-CH2-S-之鍵聯；其中Z係O、N-O-CH2C(O)-L1-R1或N-NH-CH2C(O)-L1-R1，其中R1係脂肪酸衍生物且L1係含有一或多個胺基酸及/或一或多個-NH-C2-6-伸烷基-NH-單元之連接體；或者X6係K，X13係不存在且X12係F或f，其中X12之C-末端與X6之胺基側鏈形成醯胺鍵；X7係H、h、A、N-Me-A、a、Aib、K、Nal、F、P、Dap、N、E或半胱胺酸，其中該半胱胺酸之側鏈與X3位置處之半胱胺酸之側鏈或與X4位置處之半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵；X8係K、k、F、f、A、hF、N-Me-R、E或4-胺基-Isn；X9係G、N-Me-G、A、D、L、R或Aib；X10係P、A、p、4-PhP或六氫吡啶-2-甲酸，X11係M、D-Nle、Nle、N-Me-Nle、M(O)、A、F、Y、L、K、3-PyA或Cha；且X13係C-末端且係不存在或係選自F、f、N-Me-F、Nal、D-Nal、3-Br-F、(S)-β-3-F、I、A、a、K、Dap、H及E；其中：Nle係L-正白胺酸；D-hC係D-高半胱胺酸hC係L-高半胱胺酸；hF係L-高苯丙胺酸；hK係L-離胺酸； Nal係L-萘基丙胺酸；Orn係鳥胺酸；Aib係α-胺基異丁酸；Dab係(S)-二胺基丁酸；Dap係(S)-2,3-二胺基丙酸；M(O)係甲硫胺酸碸；Cha係(S)-β-環己基丙胺酸；4-胺基-Isn係4-胺基六氫吡啶-4-甲酸；Isn係六氫吡啶-4-甲酸(isonipecotinoyl)；pE係L-焦麩胺酸；3-PyA係3-(3-吡啶基)-L-丙胺酸；4-PhF係4-苯基-L-苯基丙胺酸；其中該N-末端與該C-末端視情況與1個、2個、3個或4個甘胺酸胺基酸一起形成環；且其中K、Orn、Dab、Dap、hK或4-胺基-Isn之側鏈中之胺基視情況經由醯胺鍵連接至親脂性基團；或該多肽之醯胺、酯或鹽；或實質上與其等效之多肽。
如本文進一步說明，使用業內公認之3個字母或1個字母縮寫來代表構成本發明之肽及多肽之胺基酸殘基。除非當前面冠以「D」時，否則胺基酸係L-胺基酸。當1個字母縮寫係大寫字母時，其係指L-胺基酸。當1個字母縮寫係小寫字母時，其係指D-胺基酸。
任一上文所列示之式I'之胺基酸殘基或本文所述之其相關式(例如，式I、II至IX)可以保守方式經取代，條件係本發明之肽或多肽仍保持功能活性及結構性質(例如，半衰期延長、免受降解、構形限制)。本文將進一步說明可容許之保守胺基酸取代之原則及實例。
本發明之多肽藉由活化APJ受體可用於治療
急性失代償性心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺性高血壓、心房震顫、布魯格達氏症候群、心室性心博過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、局部缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖症、周邊動脈病、腦血管意外、暫時性腦缺血、創傷性腦損傷、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、燒傷(包括曬傷)及子癇前症。
在較佳實施例中，本發明之多肽可用於治療急性失代償性心臟衰竭(ADHF)。
在另一實施例中，本發明係關於用於治療需要該治療之個體之對APJ受體活化有反應之病症或疾病的方法，其包含：投與該個體有效量之如式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽，以治療該個體之對APJ受體活化有反應之病症或疾病。
在又一實施例中，本發明係關於包含如式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽及一或多種醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。
在再一實施例中，本發明係關於包括如式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽與一或多種治療活性劑之醫藥組合的組合。
在另一實施例中，本發明係關於用於活化有需要的個體之APJ受體之方法，其包含：投與該個體治療有效量之如式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽。
出於解釋本說明書之目的，除非另外指明，否則將應用下列定義且每當必要時，以單數使用之術語亦可包括複數且反之亦然。
本文所用「對APJ受體之調控有反應之病症或疾病」、「對APJ之調控有反應之病症及病況」、「對APJ受體活性之調控有反應之病 症及病況」、「對APJ受體活性之活化(或激動)有反應之病症」及諸如此類術語包括急性失代償性心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺性高血壓、心房震顫、布魯格達氏症候群、心室性心博過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、局部缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖症、周邊動脈病、腦血管意外、暫時性腦缺血、創傷性腦損傷、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、燒傷(包括曬傷)及子癇前症。
本文所用「APJ受體活性之活化」或「APJ受體之活化」係指APJ受體活性之增加。APJ受體活性之活化亦稱為APJ受體之「激動」，例如，藉由投與本發明之肽及多肽達成。
本文所用術語「多肽」及「肽」在提及連接在一起之兩個或更多個胺基酸時可互換使用。除下文表1中所陳述之不常見或非天然胺基酸之縮寫以外，使用業內公認之3個字母或1個字母縮寫來代表構成本發明之肽及多肽之胺基酸殘基。除非當前面冠以「D」時，否則胺基酸係L-胺基酸。當1個字母縮寫係大寫字母時，其係指D-胺基酸。當1個字母縮寫係後一情形之字母時，其係指L-胺基酸。使用基團或字符串或胺基酸縮寫來代表肽。肽之左側係用N-末端指示且序列係自N-末端至C-末端書寫。
本發明之肽含有非天然胺基酸(即，自然界中不存在之化合物)且可替代地使用如業內已知之其他胺基酸類似物。
某些非天然胺基酸可藉由下列中所述之技術引入：Deiters等人，J Am Chem Soc 125：11782-11783,2003；Wang及Schultz，Science 301：964-967,2003；Wang等人，Science 292：498-500,2001；Zhang等人，Science 303：371-373,2004或美國專利第7,083,970號。簡言之，一些該等表現系統參與定位誘變以將無意義密碼子(例如琥珀型TAG)引入編碼本發明之多肽之開放閱讀框中。然後將該等表現載體 引入可利用特定針對所引入之無意義密碼子之tRNA之宿主中並加載所選非天然胺基酸。有益於與本發明之多肽之部分偶聯之目的之具體非天然胺基酸包括彼等具有乙炔及疊氮基側鏈者。
可藉由(例如)添加化學實體(例如碳水化合物基團、磷酸酯基團、法呢基、異法呢基、脂肪酸基團(CqHq+1C(O)2H，其中q係3至20)、偶聯用連接體)、官能化或其他修飾等來修飾本發明之肽中之一或多種天然或非天然胺基酸。該等修飾可以位點特異性或非位點特異性方式實施。在較佳實施例中，肽之修飾產生更穩定之肽(例如，展示更大活體內半衰期之肽)。該等修飾可包括納入額外D-胺基酸等。該等修飾中無一者將實質上干擾期望該肽之生物活性，且該等修飾可賦予該肽合意之性質，例如，增強之生物活性。
該等修飾增強本發明蛋白相對於野生型蛋白之生物性質，且在一些情形下充當(例如)標記與蛋白半衰期延長劑之附接點，且出於將該等變體黏附至固體載體之表面之目的。
在某些實施例中，出於(例如)延長半衰期或者改良該等多肽及/或肽之生物性質之目的，使用該等修飾(例如，位點特異性修飾)來附接偶聯物，例如，PEG基團與本發明之多肽及/或肽。本文將進一步闡述該等技術。
在其他實施例中，該等修飾(例如，位點特異性修飾)用於附接可延長本發明之多肽之半衰期之其他聚合物及小分子及重組蛋白序列。一個該實施例包括附接脂肪酸或結合特異性白蛋白之化合物與多肽及/或肽。在其他實施例中，該等修飾係針對具體胺基酸類型進行且可附接於多肽上之一或多個位點。
在其他實施例中，該等修飾(例如，位點特異性修飾)用作產生野生型及/或不同多聚體(例如，二聚體(同源二聚體或異源二聚體)或三聚體或四聚體)之附接方式。該等多聚蛋白分子可額外具有經胺基末 端或經羧基末端附接或稠合至其他蛋白(例如Fc、人類血清白蛋白(HSA)等)之諸如PEG等基團、糖及/或PEG-膽固醇偶聯物。
在其他實施例中，該等位點特異性修飾用於製造蛋白、多肽及/或肽，其中位點特異性納入吡咯離胺酸或吡咯離胺酸類似物或非天然存在之胺基酸(對-乙醯基-Phe、對-疊氮基-Phe)之位置允許受控定向及該等蛋白、多肽及/或肽至固體載體之表面上之附接；或用於附接諸如PEG等基團、糖及/或PEG-膽固醇偶聯物。
在其他實施例中，該等位點特異性修飾用於位點特異性交聯蛋白、多肽及/或肽，藉此形成異源寡聚物，包括(但不限於)異源二聚體及異源三聚體。在其他實施例中，該等位點特異性修飾用於位點特異性交聯蛋白、多肽及/或肽，藉此形成蛋白-蛋白偶聯物、蛋白-多肽偶聯物、蛋白-肽偶聯物、多肽-多肽偶聯物、多肽-肽偶聯物或肽-肽偶聯物。在其他實施例中，位點特定修飾可包括支化點以允許一種以上類型分子附接於蛋白、多肽或肽之單一位點。
在其他實施例中，本文所列示之修飾可以非位點特異性方式實施且產生本發明之蛋白-蛋白偶聯物、蛋白-多肽偶聯物、蛋白-肽偶聯物、多肽-多肽偶聯物、多肽-肽偶聯物或肽-肽偶聯物。
在一些實施例中，本發明提供包含至少一種結合至抗體(例如特異性結合如本文所揭示之肽或多肽之抗體)之式I至IX中任一者之肽或多肽的複合物。
熟習此項技術者應瞭解，不同胺基酸取代(例如，保守胺基酸取代)可以本文所述任一多肽之序列進行，而不必降低其活性。本文所用「通常用作其取代之胺基酸」包括保守取代(即，經相當化學特性之胺基酸取代)。出於保守取代之目的，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、甘胺酸、脯胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸。極性(親水性)中性胺基酸包括絲胺酸、蘇胺酸、 半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺酸及麩醯胺酸。帶正電荷(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸。帶負電荷(酸性)胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。胺基酸取代之實例包括用L-胺基酸取代其相應D-胺基酸，用半胱胺酸取代高半胱胺酸或其他具有含硫醇側鏈之非天然胺基酸，用離胺酸取代同源離胺酸、二胺基丁酸、二胺基丙酸、鳥胺酸或其他具有含胺基側鏈之非天然胺基酸，或用丙胺酸取代正纈胺酸或諸如此類。
本文所用術語「胺基酸」係指天然存在之胺基酸、非天然胺基酸、胺基酸類似物及以與類似於天然存在之胺基酸之方式作用之胺基酸模擬物，若其結構允許其D及L立體異構體，則全部呈該等立體異構形式。本文藉由其名稱(其通常已知之3個字母符號)或藉由IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission推薦之1個字母符號指代胺基酸。
術語「天然存在」係指在自然界中發現且未經人類處理之物質。同樣，本文所用「非天然存在」、「非天然」及諸如此類係指未在自然界中發現或經人類結構修飾或合成之物質。當與胺基酸聯用時，術語「天然存在」係指20種習用胺基酸(即，丙胺酸(A或Ala)、半胱胺酸(C或Cys)、天冬胺酸(D或Asp)、麩胺酸(E或Glu)、苯基丙胺酸(F或Phe)、甘胺酸(G或Gly)、組胺酸(H或His)、異白胺酸(I或IIe)、離胺酸(K或Lys)、白胺酸(L或Leu)、甲硫胺酸(M或Met)、天冬醯胺酸(N或Asn)、脯胺酸(P或Pro)、麩醯胺酸(Q或Gln)、精胺酸(R或Arg)、絲胺酸(S或Ser)、蘇胺酸(T或Thr)、纈胺酸(V或Val)、色胺酸(W或Trp)及酪胺酸(Y或Tyr))。
本文所用術語「非天然胺基酸(non-natural amino acid及unnatural amino acid)」可互換地意欲代表無法使用來自任一生物體之未經修飾或經修飾之基因(相同或不同)在任一生物體中以生物合成方式產生之 胺基酸結構。該等術語係指在天然存在(野生型)apelin蛋白序列或本發明序列中不存在之胺基酸殘基。該等包括(但不限於)不為20種天然存在之胺基酸中之一者、硒代半胱胺酸、吡咯離胺酸(Pyl)或吡咯啉-羧基-離胺酸(Pcl，例如，如PCT專利申請案WO2010/48582中所述)之經修飾胺基酸及/或胺基酸類似物。該等非天然胺基酸殘基可藉由取代天然存在之胺基酸及/或藉由將非天然胺基酸插入天然存在(野生型)Apelin蛋白序列或本發明序列中來引入。亦可納入非天然胺基酸殘基以賦予apelin分子期望功能，例如，連接官能部分(例如，PEG)之能力。當與胺基酸聯用時，符號「U」應意指本文所用「非天然胺基酸」及「非天然胺基酸」。
另外，應瞭解，該等「非天然胺基酸」需要經修飾tRNA及經修飾tRNA合成酶(RS)以納入蛋白中。該等「所選」正交tRNA/RS對係藉由如Schultz等人所研發之選擇方法或藉由隨機或靶向突變來產生。舉例而言，吡咯啉-羧基-離胺酸係「天然胺基酸」，因為其係藉由自一個生物體轉移至宿主細胞中之基因以生物合成方式產生且因為其係藉由使用天然tRNA及tRNA合成酶基因納入蛋白中，而對-胺基苯基丙胺酸(參見Generation of a bacterium with a 21 amino acid genetic code,Mehl RA,Anderson JC,Santoro SW,Wang L,Martin AB,King DS,Horn DM,Schultz PG.J Am Chem Soc.,2003年1月29日；125(4)：935-9)係「非天然胺基酸」，因為儘管以生物合成方式產生，但其係藉由「所選」正交tRNA/tRNA合成酶對納入蛋白中。
經修飾之經編碼胺基酸包括(但不限於)羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽、O-磷絲胺酸、氮雜環丁烷甲酸、2-胺基己二酸、3-胺基己二酸、β-丙胺酸、胺基丙酸、2-胺基丁酸、4-胺基丁酸、6-胺基己酸、2-胺基庚酸、2-胺基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-胺基庚二酸、第三丁基甘胺酸、2,4-二胺基異丁酸、鎖鏈素、2,2'-二胺基庚二酸、2,3-二 胺基丙酸、N-乙基甘胺酸、N-甲基甘胺酸、N-乙基天冬醯胺酸、高脯胺酸、羥基離胺酸、別羥基離胺酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸、異鎖鏈素、別異白胺酸、N-甲基丙胺酸、N-甲基甘胺酸、N-甲基異白胺酸、N-甲基戊基甘胺酸、N-甲基纈胺酸、萘丙胺酸、正纈胺酸、正白胺酸、鳥胺酸、戊基甘胺酸、六氫吡啶-2-甲酸及硫代脯胺酸。術語「胺基酸」亦包括為某些生物體中之代謝物但未經用於納入蛋白中之遺傳密碼編碼之天然存在之胺基酸。該等胺基酸包括(但不限於)鳥胺酸、D-鳥胺酸及D-精胺酸。
本文所用術語「胺基酸類似物」係指具有與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構(僅藉助舉例而言，結合至氫、羧基、胺基及R基團之α-碳)之化合物。胺基酸類似物包括可逆地或不可逆地經化學封端、或其C-末端羧基、其N-末端胺基及/或其側鏈官能基團經化學修飾之天然及非天然胺基酸。該等類似物包括(但不限於)甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸碸、S-(羧甲基)-半胱胺酸、S-(羧甲基)-半胱胺酸亞碸、S-(羧甲基)-半胱胺酸碸、天冬胺酸-(β-甲基酯)、N-乙基甘胺酸、丙胺酸甲醯胺、高絲胺酸、正白胺酸及甲硫胺酸甲基鋶。
Nal係指1-萘丙胺酸及2-萘丙胺酸二者，較佳2-萘丙胺酸。
4-苯基脯胺酸係指順式及反式4-苯基脯胺酸二者，較佳反式-4-苯基脯胺酸。
本文所用術語「醯胺」係指羧酸基團位於C-末端之醯胺衍生物(例如-C(O)NH2、-C(O)NH-C1-6烷基、-C(O)NH-C1-2烷基苯基、-C(O)NH-NHBn或-C(O)N(C1-6烷基)2)。
術語「醯胺」亦係指胺基位於N-末端之衍生物(例如-NHC(O)C1-16烷基、-NHC(O)(CH2)nPh(n係1至6之整數)、-NHC(O)(CH2)2CO2H、4-Cl-Ph-(CH2)3C(O)NH-、C11H23C(O)NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)-NH-、C13H27C(O)NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)-NH-；C15H27C(O)NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)NH-、Ph-CH2CH2NHC(O)-NH-或CH3(OCH2CH2)mC(O)NH-(m係1至12之整數)。
本文所用術語「酯」係指羧酸基團位於C-末端之酯衍生物(例如-COOR)形式，其中該酯之R係指C1-6烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基等；C3-8環烷基，例如環戊基、環己基等；C6-10芳基，例如苯基、α-萘基等。C6-10芳基-C1-6烷基，例如苯基-C1-2烷基，例如苄基、苯乙基、二苯甲基等；及α-萘基-C1-2烷基，例如α-萘基甲基及諸如此類。亦可提及新戊醯基氧基甲基酯及諸如此類，其通常用作經口投與之酯。當本發明之多肽在除C末端以外之位置具有額外羧基或羧酸酯基團時，彼等該等基團經醯胺化或酯化之多肽亦屬於本發明之多肽之類別。在該等情形下，酯可為(例如)與上文所提及之 C-末端酯相同種類之酯。
術語「APJ」(亦稱為「apelin受體」、「血管收縮素-樣-1受體」、「血管收縮素II-樣-1受體」及諸如此類)指示基因定位於人類11號染色體之長臂上之具有380個殘基、7個跨膜結構域之Gi偶合受體(NCBI參考序列：NP_005152.1，且由NCBI參考序列：NM_005161編碼)。APJ係於1993年使用退化寡核苷酸引子自基因組人類DNA首次選殖(O'Dowd等人Gene,136：355-60,1993)並與1型血管收縮素II受體具有顯著同源性。儘管具有此同源性，然而，血管收縮素II未結合APJ。儘管孤兒許多年，但已分離出內源性配體並命名為apelin(Tatemoto等人，Biochem Biophys Res Commun 251,471-6(1998))。
術語「apelin」指示具有77個殘基之前蛋白(NCBI參考序列：NP_0059109.3，且由NCBI參考序列：NM_017413.3編碼)，其被處理成apelin肽之生物活性形式，例如apelin-36、apelin-17、apelin-16、apelin-13、apelin-12。全長成熟肽(稱為「apelin-36」)包含36個胺基酸，但最高效異構型係apelin之13mer(apelin-13)之焦麩胺酸化形式(稱為「Pyr-1-apelin-13或Pyr1-apelin-13」)。不同apelin形式闡述於(例如)美國專利6,492,324B1中。
本發明之多肽：
本文闡述本發明之各個實施例。應認識到，在每一實施例中所指明之特徵可與其他指明特徵組合以提供其他實施例。
在實施例1中，本發明因此提供式(I')之肽或多肽：
其中：X1係該多肽之N-末端且係不存在或係選自pE、R、Isn、Q、A、K及5-胺基-戊酸； X2係R、A、r、N-Me-R、K、H、hF、hK、F、E或Orn；X3係P、A、a、p、4-PhP、K、D、六氫吡啶-2-甲酸或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X7位置處之半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵；X4係R、A、r、N-Me-R、F、E或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X7位置處之半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵；X5係L、Cha、A、D-L、N-Me-L、K、D、4-PhF或F；X6及X12獨立地係選自C、c、hC、D-hC、K、D、Orn、Dab或E之天然或非天然胺基酸，其中X6之側鏈與X12經由共價鍵連接在一起形成二硫鍵或醯胺鍵；或者X6係K，X13係不存在且X12係F或f，其中X12之C-末端與X6之胺基側鏈形成醯胺鍵；X7係H、h、A、N-Me-A、a、Aib、K、Nal、F、P、Dap、N、E或半胱胺酸，其中該半胱胺酸之側鏈與X3位置處之半胱胺酸之側鏈或與X4位置處之半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵；X8係K、k、F、f、A、hF、N-Me-R、E或4-胺基-Isn；X9係G、N-Me-G、A、D、L、R或Aib；X10係P、A、p、4-PhP或六氫吡啶-2-甲酸；X11係M、D-Nle、Nle、N-Me-Nle、M(O)、A、F、Y、L、K、3-PyA或Cha；且X13係C-末端且係不存在或係選自F、f、N-Me-F、Nal、D-Nal、3-Br-F、(S)-β-3-F、I、A、a、K、Dap、H及E；其中：Nle係L-正白胺酸；D-hC係D-高半胱胺酸；hC係L-高半胱胺酸； hF係L-高苯丙胺酸；hK係L-離胺酸；Nal係L-萘基丙胺酸；Orn係鳥胺酸；Aib係α-胺基異丁酸；Dab係(S)-二胺基丁酸；Dap係(S)-2,3-二胺基丙酸；M(O)係甲硫胺酸碸；Cha係(S)-β-環己基丙胺酸；4-胺基-Isn係4-胺基六氫吡啶-4-甲酸；Isn係六氫吡啶-4-甲酸；pE係L-焦麩胺酸；3-PyA係3-(3-吡啶基)-L-丙胺酸；4-PhF係4-苯基-L-苯基丙胺酸；其中該N-末端與該C-末端視情況與1個、2個、3個或4個甘胺酸胺基酸一起形成環；且其中K、Orn、Dab、Dap、hK或4-胺基-Isn之側鏈中之胺基視情況經由醯胺鍵連接至親脂性基團；或該多肽之醯胺、酯或鹽；或實質上與其等效之多肽。
在實施例2中，本發明因此提供式(I)之肽或多肽：
其中：X1係該多肽之N-末端且係不存在或係選自pE、R、Q、A、K、5-胺基-戊酸及Isn；X2係R、A、r、N-Me-R、K、H、hF、hK或Orn； X3係P、A、a、p、4-PhP、六氫吡啶-2-甲酸或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X7位置處之半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵；X4係R、A、r、N-Me-R或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X7位置處之半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵；X5係L、Cha、A、D-L、N-Me-L或F；X6及X12獨立地係選自C、c、hC、D-hC、K、D、Orn、Dab或E之天然或非天然胺基酸，其中X6之側鏈與X12經由共價鍵連接在一起；或者X6係K，X13係不存在且X12係F或f，其中X12之C-末端與X6之胺基側鏈形成醯胺鍵；X7係H、h、A、N-Me-A、a、Aib、K、Nal、F、P、Dap、N或半胱胺酸，其中該半胱胺酸之側鏈與X3位置處之半胱胺酸之側鏈或與X4位置處之半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵；X8係K、k、F、f、A、hF、N-Me-R或4-胺基-Isn；X9係G、N-Me-G、A或Aib；X10係P、A、p、4-PhP或六氫吡啶-2-甲酸；X11係M、D-Nle、Nle、N-Me-Nle、M(O)、A、F、Y、L、K或Cha；且X13係C-末端且係不存在或係選自F、f、N-Me-F、Nal、D-Nal、3-Br-F、(S)-β-3-F、I、A、a、K、Dap；其中：Nle係L-正白胺酸；D-hC係D-高半胱胺酸；hC係L-高半胱胺酸；hF係L-高苯丙胺酸；hK係L-離胺酸； Nal係L-萘基丙胺酸；Orn係鳥胺酸；Aib係α-胺基異丁酸；Dab係(S)-二胺基丁酸；Dap係(S)-2,3-二胺基丙酸；M(O)係甲硫胺酸碸；Cha係(S)-β-環己基丙胺酸；4-胺基-Isn係4-胺基六氫吡啶-4-甲酸；Isn係六氫吡啶-4-甲酸；pE係L-焦麩胺酸；其中該N-末端與該C-末端視情況與1個、2個、3個或4個甘胺酸胺基酸一起形成環；且其中K、Orn、Dab、Dap、hK或4-胺基-Isn之側鏈中之胺基視情況經由醯胺鍵連接至親脂性基團；或該多肽之醯胺、酯或鹽；或實質上與其等效之多肽。
在實施例1或2之一態樣中，本發明係關於式I或I'之肽或多肽，其中K、Orn、Dab、Dap、hK或4-胺基-Isn之側鏈中之胺基視情況經由醯胺鍵連接至脂肪酸。在此實施例之另一態樣中，脂肪酸係選自月桂醯基、肉豆蔻醯基或棕櫚醯基，其中月桂醯基係C11H23C(O)-，肉豆蔻醯基係C13H27C(O)-且棕櫚醯基係C15H31C(O)-。或者可將脂肪酸(例如月桂醯基、肉豆蔻醯基或棕櫚醯基)之末端CH3部分氧化成其相應羧酸。
在實施例1或2之一態樣中，本發明係關於式I或I'之肽或多肽，其中K、Orn、Dab、Dap、hK或4-胺基-Isn中之側鏈之胺基視情況經由醯胺鍵連接至親脂性基團，其中該親脂性基團係選自如上文所述之脂肪酸及月桂醯基(O2Oc)、肉豆蔻醯基(O2Oc)及棕櫚醯基(O2Oc)且其 中月桂醯基(O2Oc)係C11H23C(O)NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2C(O)-；肉豆蔻醯基(O2Oc)係C13H27C(O)NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2C(O)-；棕櫚醯基(O2Oc)係C15H31C(O)NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2C(O)-。或者可將脂肪酸(例如月桂醯基、肉豆蔻醯基或棕櫚醯基)之末端CH3部分氧化成其相應羧酸。
在實施例3中，本發明係關於式I或I'之肽或多肽：
其中：X1係該多肽之N-末端且係不存在或係選自pE、R、Q、A、K(棕櫚醯基)、K(肉豆蔻醯基)、K(月桂醯基)、5-胺基-戊酸及Isn；X2係R、A、r、N-Me-R、K、H、hF、hK或Orn；X3係P、A、a、p、4-PhP、六氫吡啶-2-甲酸或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X7位置處之半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵；X4係R、A、r、N-Me-R或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X7位置處之半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵；X5係L、Cha、A、D-L、N-Me-L或F；X6及X12獨立地係選自C、c、hC、D-hC、K、D、Orn、Dab或E之天然或非天然胺基酸，其中X6之側鏈與X12經由共價鍵連接在一起；或者X6係K，X13係不存在且X12係F或f，其中X12之C-末端與X6之胺基側鏈形成醯胺鍵；X7係H、h、A、N-Me-A、a、Aib、K(月桂醯基)、K(棕櫚醯基)、Nal、F、P、Dap、N或半胱胺酸，其中該半胱胺酸之側鏈與X3位置處之半胱胺酸之側鏈或與X4位置處之半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵； X8係K、k、F、f、A、hF、N-Me-R或4-胺基-Isn；X9係G、N-Me-G、A或Aib；X10係P、A、p、4-PhP或六氫吡啶-2-甲酸，X11係M、D-Nle、Nle、N-Me-Nle、M(O)、A、F、Y、L、K(棕櫚醯基)或Cha；且X13係C-末端且係不存在或係選自F、f、N-Me-F、Nal、D-Nal、3-Br-F、(S)-β-3-F、I、A、a、K(月桂醯基)、K(肉豆蔻醯基)、K(棕櫚醯基)、K(O2Oc-棕櫚醯基)、Dap(棕櫚醯基)；其中：K(月桂醯基)係N-ε-月桂醯基-L-離胺酸；K(棕櫚醯基)係N-ε-棕櫚醯基-L-離胺酸；K(肉豆蔻醯基)係N-ε-肉豆蔻醯基-L-離胺酸；K(O2Oc-棕櫚醯基)係N-ε-(O2Oc-棕櫚醯基)-L-離胺酸；且棕櫚醯基(O2Oc)係C15H31C(O)NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)-；Nle係L-正白胺酸；D-hC係D-高半胱胺酸hC係L-高半胱胺酸；hF係L-高苯丙胺酸；hK係L-離胺酸；Nal係L-萘基丙胺酸；Orn係鳥胺酸；Aib係α-胺基異丁酸；Dab係(S)-二胺基丁酸；Dap係(S)-2,3-二胺基丙酸；M(O)係甲硫胺酸碸；Cha係(S)-β-環己基丙胺酸； 4-胺基-Isn係4-胺基六氫吡啶-4-甲酸；Isn係六氫吡啶-4-甲酸；pE係L-焦麩胺酸；且其中該N-末端與該C-末端視情況與1個、2個、3個或4個甘胺酸胺基酸一起形成環；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
在實施例4中，本發明係關於如實施例1、2或3之肽或多肽，其具有式II：
X1係不存在、pE、R、Q或Isn；X5係L或Cha；X7係H、Aib、F、K(月桂醯基)或K(棕櫚醯基)；X8係K、F或4-胺基-Isn；X9係G或Aib；X11係Nle或Cha；X13係不存在或係F、f、K(月桂醯基)、K(棕櫚醯基)；X6及X12獨立地係選自C、c、hC、D-hC、K、D、Orn、Dab或E之天然或非天然胺基酸，其中X6之側鏈與X12經由共價鍵連接在一起；或者X6係K，X13係不存在且X12係F或f，其中X12之C-末端與X6之胺基側鏈形成醯胺鍵；且其中該N-末端及該C-末端視情況與1個、2個、3個或4個甘胺酸胺基酸一起形成環；或該多肽之醯胺、酯或鹽；或實質上與其等效之多肽。
在實施例5中，本發明係關於如實施例4之肽或多肽，其中：X1係不存在、pE、R、Q或Isn； X5係L或Cha；X7係H、Aib、F、K(月桂醯基)或K(棕櫚醯基)；X8係K、F或4-胺基-Isn；X9係G或Aib；X11係Nle或Cha；X13係不存在或係F、f、K(月桂醯基)、K(棕櫚醯基)；X6及X12獨立地係選自C、K、D、Orn、Dab或E之天然或非天然胺基酸，其中X6之側鏈與X12經由共價鍵連接在一起；或者X6係K，X13係不存在且X12係F或f，其中X12之C-末端與X6之胺基側鏈形成醯胺鍵；且其中該N-末端及該C-末端視情況與1個、2個、3個或4個甘胺酸胺基酸一起形成環；或該多肽之醯胺、酯或鹽；或實質上與其等效之多肽。
在實施例6(實施例4之另一態樣)中，本發明係關於式II之肽或多肽，其中：X1係不存在、pE、R、Q或Isn；X5係L或Cha；X7係H、Aib、F、K(月桂醯基)或K(棕櫚醯基)；X8係K、F或4-胺基-Isn；X9係G或Aib；X11係Nle或Cha；X13係不存在或係F、f、K(月桂醯基)、K(棕櫚醯基)；X6及X12獨立地係選自C、c、hC、D-hC、K、D、Orn、Dab或E之天然或非天然胺基酸，其中X6之側鏈與X12經由共價鍵連接在一起；且其中該N-末端及該C-末端視情況與1個、2個、3個或4個甘胺酸胺基酸一起形成環；或該多肽之醯胺、酯或鹽；或實質上與其等效之 多肽。
在先前實施例中任一者、更特定而言實施例1至6中任一者之又一態樣中，本發明係關於式I、I'或II之肽及多肽，其中X6及X12獨立地係選自C、K、D、Orn、Dab或E之天然或非天然胺基酸，其中X6之側鏈與X12經由共價鍵連接在一起；或該多肽之醯胺、酯或鹽；或實質上與其等效之多肽。
在實施例7中，本發明係關於如先前實施例中任一者、更特定而言實施例1至6中任一者之式I、I'或II之肽或多肽，其中X6及X12獨立地選自K、Orn、Dab、E及D，且其中X6之側鏈與X12一起形成醯胺鍵；或該肽或多肽之醯胺、酯或鹽。在此實施例之另一步態樣中，X6係K、Orn或Dab且X12係E或D且X6之側鏈與X12形成醯胺鍵。在此實施例之又一態樣中，X6係K且X12係E或D。
在實施例8中，本發明係關於如先前實施例中任一者、更特定而言實施例1至6中任一者之式I、I'或II之肽或多肽，其中X6及X12獨立地係C、c、D-hC或hC，其中X6之側鏈與X12一起形成二硫鍵；或該肽或多肽之醯胺、酯或鹽。在此實施例之另一態樣中，X6及X12係C。
在實施例8A中，本發明係關於如先前實施例中任一者、更特定而言實施例1至6中任一者之式I、I'或II之肽或多肽，其中X6及X12獨立地係C、c、D-hC或hC，其中X6之側鏈與X12一起形成單硫鍵(-S-)；或該肽或多肽之醯胺、酯或鹽。在此實施例之另一態樣中，X6及X12係C。
在實施例8B中，本發明係關於如先前實施例中任一者、更特定而言實施例1至6中任一者之式I、I'或II之肽或多肽，其中X6及X12獨立地係C、c、D-hC或hC，其中X6之側鏈與X12一起形成式-S-CH2-C(=Z)-CH2-S-之鍵聯部分；其中=Z係=O、=N-O-CH2C(O)-L1-R1或=N- NH-CH2C(O)-L1-R1，其中R1係脂肪酸衍生物且L1係含有一或多個胺基酸及/或一或多個-NH-C2-6-伸烷基-NH-單元之連接體；或該肽或多肽之醯胺、酯或鹽。在此實施例之另一態樣中，X6及X12係C。
L1係經由酯鍵或醯胺鍵連接脂肪酸衍生物與該多肽之適宜有機連接體。通常，該連接體含有一或多個胺基酸部分(例如(O2Oc)單元或麩胺酸)或含有-NH-C2-6伸烷基-NH-二胺基單元或其組合。R1係可添加以增加該多肽之半衰期之改性基團，例如脂肪酸衍生物。在此實施例之一態樣中，R1係式CqHq+1C(O)2H之脂肪酸，其中q係3至20。視情況可將末端CH3單元氧化成其相應羧酸。
在一具體實施例中，-L1-R1具有式：
q係3至20之整數。較佳地，q係12至18之整數。
可根據反應圖1合成式I、I'或II之肽或多肽，其中X6及X12獨立地係C、c、D-hC或hC，其中X6之側鏈與X12一起形成式-S-CH2-C(=Z)-CH2-S-之鍵聯部分；其中=Z係=O、=N-O-CH2C(O)-L1-R1或=N-NH-CH2C(O)-L1-R1：
在還原(1A)中之多肽二硫鍵後，與二-親電子化合物(1B)進行親核反應，形成多肽(1C)。多肽(1C)之酮官能基與羥胺或肼容易地縮合以產生多肽1D。
在實施例9中，本發明之某些多肽包括如實施例1至6及8中任一者之肽或多肽，其具有式III： 或該多肽之醯胺、酯或鹽。在實施例9A中，本發明係關於式III之肽及多肽，其中6位與12位處之2個半胱胺酸形成二硫鍵(-S-S-)、單硫鍵(-S-)或式-S-CH2-C(=Z)-CH2-S-之鍵聯，其中Z係如上文所定義。在實施例9或9A之另一態樣中，本發明包括式III之肽或多肽，其中6位與12位處之2個半胱胺酸形成二硫鍵(-S-S-)。
在實施例10中，本發明之某些肽及多肽包括如實施例1至9中任一者之肽及多肽，其具有式IV： 或該多肽之醯胺、酯或鹽。
在實施例11中，本發明之某些多肽包括如實施例1至6及8至10中任一者之多肽，其具有式V： 或該多肽之醯胺、酯或鹽。在實施例11A中，本發明係關於式V之肽及多肽，其中6位與12位處之2個半胱胺酸形成二硫鍵(-S-S-)、單硫鍵(-S-)或式-S-CH2-C(=Z)-CH2-S-之鍵聯，其中Z係如上文所定義。在實施例11或11A之另一態樣中，本發明包括式V之肽或多肽，其中6位與12位處之2個半胱胺酸形成二硫鍵(-S-S-)。
在實施例12中，本發明係關於式I或I'之二環肽或多肽(如實施例1、2或3)，其中X3係半胱胺酸且其中半胱胺酸之側鏈與X7位置處之 半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵。此實施例係由式VI之肽及多肽代表：
或該多肽之醯胺、酯或鹽。
在實施例13中，本發明係關於式I或I'之二環肽或多肽(如實施例1、2或3)，其中X4係半胱胺酸且其中半胱胺酸之側鏈與X7位置處之半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵。此實施例係由式VII之肽及多肽代表：
或該多肽之醯胺、酯或鹽。
在實施例14中，本發明係關於式I至V中任一者之肽或多肽(如實施例1至11中任一者)；其中該N-末端與該C-末端視情況與1個、2個、3個或4個甘胺酸胺基酸一起形成環；或該多肽之醯胺、酯或鹽；或實質上與其等效之多肽。此實施例係由具有式VIII之肽或多肽代表：
其中L係(G)r，G係甘胺酸且r係1、2、3或4；或該多肽之鹽。
在實施例15(實施例14之另一態樣)中，本發明係關於式VIII之肽或多肽，其中X1係Q，X13係F且r係2；或其酯、醯胺或鹽。
在實施例16中，本發明係關於如式I或I'之肽或多肽(如實施例1、2或3)，其中X6係K，X13係不存在且X12係F或f，其中X12之C-末端與X6之胺基側鏈形成醯胺鍵。此實施例係由式IX之肽或多肽代表： 或該多肽之酯、醯胺或鹽。
上文或下文所列任何式I'之胺基酸殘基或本文所述之其相關化學式及所有實施例(例如，式I、II至IX)可以經保守方式取代，但條件係本發明之肽或多肽仍保持功能活性及結構性質(例如，半衰期延長、免受降解、構形限制)。本文將進一步說明可容許之保守胺基酸取代之原則及實例。
以下實施例可獨立地、共同地或以任一組合或子組合使用。
在實施例17中，本發明係關於如式I'、I至VII及IX中任一者或上文所述任何其他類別及子類中任一者(即如實施例1至13及16中任一者)之肽及多肽或其醯胺酯或鹽，其中X1係pE。
在實施例18中，本發明係關於如式I至VII及IX中任一者或上文所述任何其他類別及子類中任一者(即如實施例1至13至16中任一者)之肽及多肽或其醯胺、酯或鹽，其中X1係不存在；或該多肽之醯胺、酯或鹽。在此實施例之一態樣中，該肽之N-末端係醯胺。在實施例19(實施例18之另一態樣)中，本發明係關於如式I至VII及IX中任一者或上文所述任何其他類別及子類中任一者之肽及多肽或其醯胺、酯或鹽，其中X1係不存在且N-末端係式-NHR之醯胺且R係CH3C(O)-、CH3-(O-CH2CH2)m-C(O)-、棕櫚醯基(O2Oc)p、肉豆蔻醯基(O2Oc)p、月桂醯基(O2Oc)p或Ph-CH2CH2NHC(O)-、乙醯基、苯甲醯基、苯甲醯甲基、琥珀醯基、辛醯基、4-苯基丁醯基、4-Cl-Ph-(CH2)3C(O)-或Ph-CH2CH2NHC(O)-；且其中p係1至4之整數；m係1至12之整數；月桂醯基(O2Oc)p係C11H23C(O)[NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2- C(O)]p-；肉豆蔻醯基(O2Oc)p係C13H27C(O)[NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)]p-；棕櫚醯基(O2Oc)p係C15H31C(O)[NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)]p-。在此實施例之一具體態樣中，R係乙醯基、苯甲醯基、苯甲醯甲基、琥珀醯基、辛醯基、4-苯基丁醯基、4-Cl-Ph-(CH2)3C(O)-或Ph-CH2CH2NHC(O)-。
在實施例20中，本發明係關於如式I至VII及IX中任一者或上文所述任何其他類別及子類(即如實施例1至13及16中任一者)之肽或多肽或其醯胺、酯或鹽，其中N-末端係式NHR1之醯胺，其中R1係CH3C(O)-、CH3-(O-CH2CH2)m-C(O)-、棕櫚醯基(O2Oc)、肉豆蔻醯基(O2Oc)、月桂醯基(O2Oc)或Ph-CH2CH2NHC(O)-；且其中m、月桂醯基(O2Oc)、肉豆蔻醯基(O2Oc)及棕櫚醯基(O2Oc)係上文所定義。
在實施例21中，本發明係關於如式I至VII中任一者或上文所述任何其他類別及子類中任一者(即如實施例1至13中任一者)之肽及多肽或其醯胺、酯或鹽，其中X13係F；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
在實施例22中，本發明係關於如式I至VII中任一者或上文所述任何其他類別及子類中任一者(即如實施例1至13中任一者)之肽及多肽或其醯胺、酯或鹽，其中X13係不存在；或該多肽之醯胺、酯或鹽。在實施例23(實施例22之一態樣)中，C-末端係醯胺。在實施例24(實施例23之另一態樣)中，本發明係關於如式I至VII中任一者或上文所述任何其他類別及子類中任一者之肽及多肽或其醯胺、酯或鹽，其中C-末端係式-C(O)R2之醯胺且R2係-NH2、-NH-Me、-NH-NHBn或-NH-(CH2)2-Ph。在實施例23之較佳態樣中，本發明係關於如式I至VII中任一者或上文所述任何其他類別及子類中任一者之肽及多肽或其醯胺、酯或鹽，其中C-末端係式-C(O)R2之醯胺且R2係-NH-(CH2)2-Ph。
在實施例25中，本發明係關於如式I至IX中任一者或上文所述任何其他類別及子類中任一者(即如實施例1至25中任一者)之肽及多肽或其醯胺、酯或鹽，其中X5係L。
在實施例26中，本發明係關於如式I至V、VIII及IX中任一者或上文所述任何其他類別及子類中任一者(即如實施例1至11及14至25中任一者)之肽及多肽或其醯胺、酯或鹽，其中X7係H。
在實施例27中，本發明係關於如式I至III及VI至IX中任一者或上文所述任何其他類別及子類中任一者(即如實施例1至9及12至26中任一者)之肽及多肽或其醯胺、酯或鹽，其中X8係K或F。在此實施例之另一態樣中，X8係K。
在實施例28中，本發明係關於如式I至III及VI至IX中任一者或上文所述任何其他類別及子類中任一者(即如實施例1至9及12至27中任一者)之肽及多肽或其醯胺、酯或鹽，其中X9係G。
在實施例29中，本發明係關於如式I至IX中任一者或上文所述任何其他類別及子類中任一者(即如實施例1至28中任一者)之肽及多肽或其醯胺、酯或鹽，其中X11係Nle。
在實施例30中，本發明因此提供式(I')之肽或多肽：
其中：X1係該多肽之N-末端且係不存在或係選自pE、R、Isn及Q；X2係R、r、F或E；X3係P、p、K、D或4-PhF；或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X7位置處之半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵；X4係R、F、E或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X7位置處之 半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵；X5係L、K、D或4-PhF；X6及X12獨立地係選自C、c、hC、D-hC、K、D、Orn、Dab或E之天然或非天然胺基酸，其中X6之側鏈與X12經由共價鍵連接在一起形成二硫鍵或醯胺鍵；或者X6係K，X13不存在且X12係F或f，其中X12之C-末端與X6之胺基側鏈形成醯胺鍵；X7係H、Aib、K、E、F或半胱胺酸，其中該半胱胺酸之側鏈與X3位置處之半胱胺酸之側鏈或與X4位置處之半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵；X8係K、E、F或4-胺基-Isn；X9係G、D、L、R或Aib；X10係P或六氫吡啶-2-甲酸；X11係Nle或3-PyA；且X13係C-末端且係不存在或係選自F、f、K、H及E；其中該N-末端與該C-末端視情況與1個、2個、3個或4個甘胺酸胺基酸一起形成環；且其中K、Orn、Dab、Dap、hK或4-胺基-Isn之側鏈中之胺基視情況經由醯胺鍵連接至親脂性基團；或該多肽之醯胺、酯或鹽；或實質上與其等效之多肽。
在實施例31中，本發明係關於實施例1、2或3之肽或多肽，其中胺基酸X1至X13中之三者不同於存於Pyr-1-apelin-13中之相應胺基酸。在實施例32中，本發明係關於實施例1、2或3之肽或多肽，其中胺基酸X1至X13中之四者不同於存於Pyr-1-apelin-13中之相應胺基酸。
在另一實施例中，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、 X10、X11、X12及X13胺基酸係彼等在下文實例部分中由X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12及X13胺基酸所定義者。
在另一實施例中，本發明之個別多肽係彼等列示於下文實例部分中者或其醫藥上可接受之鹽。
除非另有說明，否則術語「本發明之多肽」係指式(I')及其子式(式I、II至IX)之多肽；或其醯胺、酯或鹽。
除非另有說明，否則術語「本發明之多肽」、「本發明之肽」、「apelin肽激動劑」及諸如此類係指式I'及其子式(式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX)之肽及多肽；或其醯胺、酯或鹽。本發明之肽及多肽顯示與本文所述之已知apelin肽及多肽(包括(但不限於)野生型apelin、apelin-13及pyr-1-apelin-13)實質上等效或改良之活性及/或血漿穩定性。
本發明之肽及多肽亦涵蓋與如式I'、I至IX中任一者之肽及多肽或其醯胺、酯或鹽以及與本文特定地列示之任何肽或多肽(包括(但不限於)實驗實例)至少約95%相同的肽及多肽。
本文所用片語「同源胺基酸序列」或其變化形式係指以至少指定百分比之同源性(在胺基酸水平上)為特徵之序列且可與「序列一致性」互換使用。同源胺基酸序列包括彼等含有保守胺基酸取代且多肽具有相同結合及/或活性之胺基酸序列。在一些實施例中，若胺基酸序列與比較物序列具有至少60%或更大、至多99%之一致性，則其係同源的。在一些實施例中，若胺基酸序列與比較物序列共用一或多個、至多60個胺基酸取代、添加或缺失，則其係同源的。在一些實施例中，同源胺基酸序列具有不超過5個或不超過3個保守胺基酸取代。
同源性亦可在多肽水平上。本發明之肽或多肽或其部分與不同胺基酸序列之一致性程度或百分比係計算為在兩個序列之排列中精確 匹配之數量除以「本發明序列」或「外源序列」中之最短者之長度。結果表示為一致性%。
包含與特定實例中所述胺基酸序列之同源性為約80%至99.9%、較佳90%至99.9%之胺基酸序列且具有優於apelin-13或pyr-1-apelin-13之血漿穩定性的多肽屬於本發明之多肽之類別。在一實施例中，血漿穩定性提高至少2倍。在一實施例中，本發明之多肽具有至少30分鐘之血漿穩定性。在另一實施例中，本發明之多肽具有至少60分鐘、較佳至少100分鐘且更佳至少150分鐘之血漿穩定性。
術語「實質上等效」意味著受體-結合活性、信號轉導活性及諸如此類之性質等效。因此，可允許甚至諸如受體結合活性之強度及多肽之分子量之等級存在差異。
在以上意義上，取代、缺失、添加或插入一或多個胺基酸之如本文所述之多肽或其實質上等效物可作為含有胺基酸序列實質上等效物之多肽提及。在以上意義上，1個至5個、較佳1個至3個且更佳1個或2個胺基酸經天然或非天然胺基酸取代之如本文所述之多肽或其實質上等效物可作為含有胺基酸序列實質上等效物之多肽提及。進一步修飾及改變可包括用D-胺基酸替代L-胺基酸或其他變化形式，包括(但不限於)磷酸化、羧化、烷基化及諸如此類，只要維持式I、II、III、IV、v、VI、VII、VIII或IX之肽或多肽之apelin激動活性且血漿穩定性經改良優於apelin-13之焦麩胺酸化形式。舉例而言，在式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX之環狀肽及多肽之2位(X2)、3位(X3)、5位、6位、7位及8位(X5、X6、X7及X8)、10位(X10)及13位(X13)處就多肽之活性及穩定性而言，D-胺基酸耐受良好。
本文所用術語「醫藥上可接受之鹽」係指保留有本發明之多肽之生物有效性及性質之鹽且其通常在生物上或在其他方面係合意的。在許多情形下，本發明之多肽借助胺基及/或羧基或與其類似之基團 之存在能夠形成酸性及/或鹼性鹽。
可使用無機酸及有機酸來形成醫藥上可接受之酸加成鹽，例如，乙酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、溴化物/氫溴酸鹽、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、樟腦磺酸鹽、氯化物/鹽酸鹽、氯茶鹼、檸檬酸鹽、乙二磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、馬尿酸鹽、氫碘酸鹽/碘化物、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲基硫酸鹽、萘酸鹽、萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、十八烷酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、巴莫酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氫鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、磺基水楊酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽及三氟乙酸鹽。
可衍生鹽之無機酸包括(例如)鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及諸如此類。
可衍生鹽之有機酸包括(例如)乙酸、丙酸、羥乙酸、草酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、甲苯磺酸、磺基水楊酸及諸如此類。可使用無機鹼及有機鹼來形成醫藥上可接受之鹼加成鹽。
可衍生鹽之無機鹼包括(例如)銨鹽及週期表第I行至第XII行之金屬。在某些實施例中，該等鹽係衍生自鈉、鉀、銨、鈣、鎂、鐵、銀、鋅及銅；尤其適宜之鹽包括銨鹽、鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽及鎂鹽。
可衍生鹽之有機鹼可包括(例如)一級胺、二級胺及三級胺、包括天然存在之經取代胺之經取代胺、環狀胺、鹼性離子交換樹脂及諸如此類。某些有機胺包括異丙基胺、苄星(benzathine)、膽鹼鹽、二乙醇胺、二乙胺、離胺酸、葡甲胺、六氫吡嗪及胺丁三醇。
本發明之醫藥上可接受之鹽可藉由習用化學方法自母體化合 物，鹼性或酸性部分來合成。通常，該等鹽可藉由使游離酸形式之該等化合物與化學計量之適當鹼(例如Na、Ca、Mg或K之氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽或諸如此類)反應來製備，或藉由使游離鹼形式之該等化合物與化學計量之適當酸反應來製備。該等反應通常係在水或有機溶劑、或二者之混合物中實施。通常，若可行，期望使用非水性介質，如醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。其他適宜鹽之列表可例如參見「Remington's Pharmaceutical Sciences」，第20版，Mack Publishing公司，Easton,Pa.,(1985)；及Stahl及Wermuth之「Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties,Selection,and Use」(Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2002)。
本發明所用術語「醫藥上可接受之載劑」包括如熟習此項技術者已知之任一及所有溶劑、分散介質、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如，抗細菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩定劑、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、矯味劑、染料及諸如此類及其組合(例如，參見Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing公司，1990，第1289頁至第1329頁)。除了任何不與活性成份相容之習用載劑之外，本發明涵蓋其於治療或醫藥組合物中之用途。
術語「治療有效量」之本發明之多肽係指激發個體之生物或醫學反應(例如，改善症狀、減輕病況、減緩或延遲疾病進程、或預防疾病等)之本發明之多肽之量。在一項非限制性實施例中，術語「治療有效量」係指當投與個體時可有效(1)至少部分地減輕、抑制、預防及/或改善(i)藉由APJ受體之活化來改善或(ii)與APJ受體之活性相關或(iii)以APJ受體之異常活性為特徵之其病況、病症或疾病、或症狀；或(2)活化APJ受體之本發明多肽之量。
在另一非限制性實施例中，術語「治療有效量」係指當投與細 胞或組織、或非細胞性生物材料、或介質時有效至少部分地活化APJ受體之本發明之多肽之量。熟習此項技術者應瞭解，具體試劑之絕對有效量可端視諸如以下因素而變化：期望生物學終點、所遞送試劑、靶組織等。熟習此項技術者瞭解，可以單一劑量投與「治療有效量」或可藉由投與多個劑量來達成「治療有效量」。舉例而言，在治療心臟衰竭之試劑之情形下，有效量可為有效達成患者之臨床改良(例如，增加之運動耐量/能力、增加之血壓、減少流體滯留及/或改良之心臟運行之定量測試之結果，例如，射血分數、運動能力(運動至力竭時間)等)之量。
本文所用術語「個體」係指動物。通常，動物係哺乳動物。受試者亦係指(例如)靈長類(例如，人類)、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、大鼠、小鼠、魚、鳥及諸如此類。在某些實施例中，個體係靈長類。在另一些實施例中，個體係人類。
本文所用術語「抑制」(「inhibit」、「inhibition」或「inhibiting」)係指減輕或阻抑給定病況、症狀或病症、或疾病，或顯著降低生物活性或過程之基線活性。
在一實施例中，本文所用術語「治療」(「treat」、「treating」或「treatment」)任一疾病或病症係指改善該疾病或病症(即，減緩或阻止或減輕該疾病或其至少一種臨床症狀之發展)。在另一實施例中，「治療」(「treat」、「treating」或「treatment」)係指減輕或改善包括彼等患者不能感受到之物理參數的至少一個物理參數。在又一實施例中，「治療」(「treat」、「treating」或「treatment」)係指在物理方面調控疾病或病症(例如，穩定可感受到之症狀)或在生理學方面調控疾病或病症(例如，穩定物理參數)或二者。在再一實施例中，「治療」(「treat」、「treating」或「treatment」)係指預防或延遲疾病或病症之開始或發展或進程。
本文所用術語「預防」(「prevent」、「preventing」及「prevention」)係指預防由療法(例如，治療劑)之投與或療法之組合(例如，治療劑之組合)之投與產生的個體病症之一或多種症狀之復發、開始或發展。
如本文所用，若個體將在生物上、在醫學上或在生活品質上受益於治療，則該個體「需要」該治療。
除非本文另外指明或上下文明顯矛盾，否則在本發明上下文中(尤其在申請專利範圍之上下文中)中所用之本文所用術語「一」(「a」、「an」)、「該」(「the」)及類似術語理解為涵蓋單數與複數二者。
除非本文另外指明或上下文另外明顯矛盾，否則本文所述所有方法均可以任一適宜順序實施。除非另外聲明，否則本文所提供任何及所有實例或實例性語言(例如，「例如」)僅意欲用於更好地說明本發明且並非對本發明之範圍加以限制。
本發明之肽及多肽可藉由本身已知用於肽合成之程序來製造。用於肽合成之方法可為任一固相合成及液相合成。因此，令人感興趣之肽及多肽可藉由縮合能夠構成蛋白之部分肽或胺基酸與其剩餘部分來製造，當產物具有保護基團時，脫除保護基團，由此可製造期望肽。用於縮合及脫除保護之已知方法包括以下文獻(1)至(5)中所述之程序。
(1) M. Bodanszky及M. A. Ondetti，Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York, 1966，(2) Schroeder及Luebke，The Peptide, Academic Press, New York, 1965，(3) Nobuo Izumiya等人，Fundamentals and Experiments in Peptide Synthesis, Maruzen, 1975， (4) Haruaki Yajima及Shumpei Sakakibara，Biochemical Experiment Series 1, Protein Chemistry IV, 205, 1977，及(5) Haruaki Yajima(編輯)，Development of Drugs-Continued, 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten。
在反應後，可藉由習用純化技術(例如溶劑萃取、管柱層析、液相層析及重結晶)之組合來純化並分離肽。若如上文所分離之肽係游離化合物，則可藉由已知方法將其轉化成適宜鹽。相反，若所分離之產物係鹽，則可藉由已知方法將其轉化成游離肽。
可藉由使用適用於醯胺化之用於肽合成之樹脂來獲得多肽之醯胺。該樹脂包括氯甲基樹脂、羥甲基樹脂、二苯甲胺樹脂、胺基甲基樹脂、4-苄氧基苄醇樹脂、4-甲基二苯甲胺樹脂、PAM樹脂、4-羥基甲基甲基苯基乙醯胺基甲基樹脂、聚丙烯醯胺樹脂、4-(2',4'-二甲氧基苯基-羥甲基)苯氧基樹脂、4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-胺基甲基)苯氧基樹脂、2-氯三苯氯甲烷樹脂等。使用此樹脂藉由本身已知之各種縮合技術按照目標肽之序列使側鏈之α-胺基及官能基團經適宜保護之胺基酸在該樹脂上縮合。在該系列反應結束時，自樹脂去除肽或經保護之肽並去除保護基團且若需要形成二硫鍵以獲得目標多肽。
對於上述保護胺基酸之縮合，可使用多種用於肽合成之活化試劑，例如HATU、HCTU或例如碳二亞胺。碳二亞胺包括DCC、N,N'-二異丙基碳二亞胺及N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺。對於利用此試劑之活化，可使用外消旋化抑制劑添加劑，例如HOBt或Oxyma Pure。經保護之胺基酸可與活化試劑及外消旋化抑制劑一起直接添加至樹脂中或可預先活化為對稱酸酐、HOBt酯或HOOBt酯，然後添加至樹脂中。用於經保護之胺基酸之活化或與樹脂縮合之溶劑可自彼等已知可用於肽縮合反應之溶劑中適當地選擇。舉例而言，可提及者係N,N-二甲基甲醯胺、N-甲基吡咯啶酮、氯仿、三氟乙醇、二甲 亞碸、DMF、吡啶、二噁烷、二氯甲烷、四氫呋喃、乙腈、乙酸乙酯或其適宜混合物。
反應溫度可選自迄今已知可用於肽鍵形成之範圍且通常係選自約-20℃至50℃之範圍。活化胺基酸衍生物通常係以過量1.5倍至4倍之比例使用。若藉由測試發現利用茚滿三酮反應縮合不充分，則可在不去除保護基團之情況下重複縮合反應以達成有效縮合。若重複縮合仍無法提供有效程度之縮合，則可用乙酸酐或乙醯基咪唑使未反應之胺基乙醯化。
用於起始材料胺基酸之胺基之保護基團包括Z、Boc、第三戊氧基羰基、異莰基氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、CI-Z、Br-Z、金剛烷基氧基羰基、三氟乙醯基、鄰苯二甲醯基、甲醯基、2-硝基苯基亞磺醯基、二苯基硫膦基或Fmoc。可使用之羧基保護基團包括(但不限於)上述C1-6烷基、C3-8環烷基及C6-10芳基-C1-2烷基以及2-金剛烷基、4-硝基苄基、4-甲氧基苄基、4-氯苄基、苯甲醯甲基、苄氧基羰基醯肼基、第三丁氧基羰基醯肼基及三苯甲基醯肼基。
絲胺酸及蘇胺酸之羥基可藉由酯化或醚化來保護。適用於該酯化之基團包括碳衍生之基團，例如低碳烷醯基(例如乙醯基等)、芳醯基(例如苯甲醯基等)、苄氧基羰基及乙氧基羰基。適用於該醚化之基團包括苄基、四氫吡喃基及第三丁基。酪胺酸之酚羥基之保護基團包括Bzl、Cl2-Bzl、2-硝基苄基、Br-Z及第三丁基。
組胺酸之咪唑之保護基團包括Tos、4-甲氧基-2,3,6-三乙基苯磺醯基、DNP、苄氧基甲基、Bum、Boc、Trt及Fmoc。
起始胺基酸之活化羧基包括相應酸酐、疊氮化物及活性酯，例如與諸如五氯苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4-二硝基苯酚、氰基甲醇、對-硝基苯酚、HONB、N-羥基琥珀醯亞胺、N-羥基鄰苯二甲醯亞胺、HOBt等醇形成之酯。起始胺基酸之活化胺基包括相應磷醯胺。
消除保護基團之方法包括在觸媒存在下(例如鈀黑或靶碳)使用氫氣催化還原，用無水氫氟酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或該等酸之混合物進行酸處理，用二異丙基乙胺、三乙胺、六氫吡啶、六氫吡嗪進行鹼處理，在液氨中用金屬鈉還原。藉助上述酸處理之消除反應通常係在-20℃至40℃之溫度下實施且可藉助添加諸如苯甲醚、苯酚、苯基甲基硫醚、間-甲酚、對-甲酚、甲硫醚、1,4-丁二硫醇、1,2-乙二硫醇等陽離子接納體有利地進行。用於保護組胺酸之咪唑基團之2,4-二硝基苯基可藉由用硫酚處理來消除，而用於保護色胺酸之吲哚基團之甲醯基可藉由在1,2-乙二硫醇、1,4-丁二硫醇存在下用稀氫氧化鈉溶液或稀氨水鹼處理以及上述酸處理來消除。
不應參與起始材料反應之用於保護官能基團之方法、可使用之保護基團、去除保護基團之方法及活化欲參與反應之官能基團之方法可全部自已知基團及方法中有判斷地選擇。
另一獲得多肽之醯胺形式之方法包含首先使C-末端胺基酸之-羧基醯胺化，然後延長N-側之肽鏈直至期望鏈長度，且然後選擇性地保護C-末端肽之α-胺基及胺基酸或肽欲形成目標多肽之殘基之α-羧基並在混合溶劑(例如提及上文所者)中縮合α-胺基及側鏈官能基團經上文所提及之適宜保護基團保護之兩個片段。此縮合反應之參數可以與上文所述相同之方式實施。藉由上述方法自藉由縮合獲得之經保護之肽去除所有保護基團，藉此提供期望粗製肽。可藉由已知純化程序來純化此粗製肽並凍乾主要流份以提供目標醯胺化多肽。為獲得多肽之酯，使C-末端胺基酸之a-羧基與期望醇縮合，得到胺基酸酯且然後實施上文所述用於製造醯胺之程序。
本發明之多肽或其醯胺、酯或鹽可以包括皮下、肌內、靜脈內、腹腔內、吸入等在內之多種方式中之任一者投與。本發明之尤佳 實施例使用本發明之多肽或其醯胺、酯或鹽之連續靜脈內投與。本發明之多肽可作為丸藥或作為連續輸注在一段時間內投與。可使用可移植幫浦。在本發明之某些實施例中，間歇或連續多肽投與持續1天至數天(例如，2天至3天或更多天)或更長時間段(例如，數週、數月或數年)。在一些實施例中，提供間歇或連續多肽投與至少約3天。在其他實施例中，提供間歇或連續多肽投與至少約1週。在其他實施例中，提供間歇或連續多肽投與至少約2週。在投與期間或在投與多個劑量之間維持平均血漿多肽濃度高於具體臨限值可能係合意的。可基於(例如)個體之生理狀況、疾病嚴重性等來確定合意濃度。該等合意值可藉由實施標準臨床試驗來確定。
在另一態樣中，本發明提供包含本發明之多肽或及其醯胺、酯或鹽及一或多種醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。該醫藥組合物可經調配用以具體投與途徑投與，例如，經口投與、非經腸投與及直腸投與等。另外，本發明之醫藥組合物可以固體形式(包括(但不限於)膠囊、錠劑、丸劑、顆粒、粉末或栓劑)或以液體形式(包括(但不限於)溶液、懸浮液或乳液)製備。可對醫藥組合物實施習用醫藥操作(例如無菌製造、滅菌)及/或可含有習用惰性稀釋劑、濾餅形成劑、張度劑、潤滑劑或緩衝劑、以及佐劑，例如防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑及緩衝液等。
適於注射之醫藥組合物通常包括無菌水性溶液(當可溶於水時)或用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之分散液及無菌粉末。
對於靜脈內投與而言，適宜載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情形下，該組合物均應無菌且就存在容易之注射可能性而言應係流動的。較佳醫藥調配物在製造及儲存條件下係穩定的且必須抵抗微生物(例如細菌及真菌)之污染作用保存。一般而言，相關載劑可為含 有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液態聚乙二醇及諸如此類)之溶劑或分散介質及其適宜混合物。可藉由(例如)使用諸如卵磷脂等包衣、藉由維持所需粒徑(對於分散劑而言)以及藉由使用表面活性劑可維持適當流動性。可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、乙汞硫柳酸鈉及諸如此類)來達成對微生物之作用之預防。在許多情形下，在組合物中包括等滲劑(例如，糖、多元醇(例如甘露醇)、胺基酸、山梨醇、氯化鈉)將較佳。可藉由將可延遲吸收之試劑(例如，單硬脂酸鋁及明膠)納入組合物中來延長可注射組合物的吸收。
某些可注射組合物係等滲水溶液或懸浮液，且栓劑較佳係自脂肪乳液或懸浮液製備。該等組合物可經滅菌及/或含有佐劑，例如防腐劑、穩定劑、潤濕劑或乳化劑、溶解促進劑、調節滲透壓之鹽及/或緩衝液。此外，其亦可含有其他治療上有價值之物質。該等組合物係分別根據習用混和、造粒或包衣方法來製備且含有約0.1%至75%或含有約1%至50%之活性成份。
無菌可注射溶液可藉由以下方式製備：將所需量之活性化合物與上文所列舉之成份中之一者或組合納入適當溶劑中，視需要隨後過濾滅菌。通常，分散液係藉由將活性化合物納入含有鹼性分散介質及來自彼等上文所列舉者之所需其他成份之無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末之情形下，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥，從而產生活性成份與來自先前經滅菌過濾之其溶液之任一額外期望成份之粉末。
口服組合物通常包括惰性稀釋劑或食用載劑。出於經口治療投與之目的，活性化合物可納入賦形劑且以錠劑、喉錠、或膠囊(例如，明膠膠囊)形式使用。口服組合物亦可使用漱口用流體載劑來製備。醫藥上相容之黏合劑及/或佐劑材料可作為組合物之一部分納 入。錠劑、丸劑、膠囊、喉錠及諸如此類可含有以下成份中之任一者或具有類似性質之化合物：黏合劑，例如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，例如澱粉或乳糖；崩解劑，例如海藻酸、Primogel或玉米澱粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂或Sterote；助流劑，例如膠態二氧化矽；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或矯味劑，例如薄荷、水楊酸甲酯或橙香精。用於經口遞送之調配物可有利地納入各試劑以改良在胃腸道內之穩定性及/或增強吸收。
對於藉由吸入投與而言，本發明治療劑較佳係自含有適宜推進劑(例如，諸如二氧化碳等氣體)或噴霧劑之加壓容器或分配器以氣溶膠噴霧形式遞送。注意，肺為治療劑之全身遞送提供大的表面積。
可將該等試劑囊封於(例如)聚合微粒中(例如彼等於美國公開案20040096403所述者)，或與業內已知之多種其他藥物遞送媒劑中之任一者聯合。在本發明之其他實施例中，該等試劑係與帶電脂質聯合遞送，如(例如)美國公開案20040062718中所述。注意，後一系統已用於投與治療性多肽、胰島素，此表明此系統用於投與肽試劑之效用。
亦可藉由經黏膜或經皮方式來實施全身投與。
適用於經皮施用之組合物包括有效量之本發明之多肽與適宜載劑。適用於經皮遞送之載劑包括可吸收性藥理上可接受之溶劑以幫助穿過宿主皮膚。舉例而言，經皮裝置係呈繃帶形式，其包含背襯元件；含有該化合物(視情況具有載劑)之儲存器；視情況包含速度控制障壁以便以受控之預定速度長時間遞送化合物至宿主皮膚；及將裝置固定至皮膚上之構件。
適用於局部施用(例如，施用至皮膚及眼腈)之組合物包括水溶液、懸浮液、軟膏、乳霜、凝膠或(例如)藉由氣溶膠遞送之可噴霧調配物或諸如此類。該等局部遞送系統將尤其適用於真皮施用。因此，其特別適用於局部施用，包括業內熟知之化妝品用調配物。該等調配 物可含有增溶劑、穩定劑、增滲劑、緩衝液及防腐劑。
如本文所用局部施用亦可係關於吸入或鼻內施用。其可在使用或未使用適宜推進劑之情況下以乾燥粉末形式(單獨、作為(例如)乾燥摻合物與乳糖之混合物或與(例如)磷脂之混合組份顆粒形式)自乾燥粉末吸入器、或以氣溶膠噴霧投遞形式自加壓容器、幫浦、噴射器、霧化器或噴霧器方便地遞送。
本發明進一步提供包含一種或多種可降低作為活性成份之本發明化合物分解速率之試劑的醫藥組合物及劑型。本文稱作「穩定劑」之該等試劑包括(但不限於)抗氧化劑(例如抗壞血酸)、pH緩衝液或鹽緩衝液等。
本發明方法：
Apelin肽家族係唯一已知的G蛋白偶合APJ受體之天然配體家族。Apelin基因編碼77個胺基酸之多肽，該多肽被處理成apelin肽之生物活性形成，例如apelin-36、apelin-17、apelin-16、apelin-13、apelin-12及apelin-13之經焦麩胺酸鹽修飾之形式(Pyr1-apelin-13)。該等apelin肽中之任一者在結合至APJ受體後經由Gi及Gq蛋白轉導信號。在心肌細胞中，Gi或Gq偶聯引起細胞內pH、PLC活化及IP3產生之變化，從而增強肌絲鈣敏感性且最終增加心肌收縮力。Gi偶聯抑制經活化之Gs、腺苷酸環化酶及cAMP產生並增加pAkt含量，從而達成心臟保護。在血管內皮細胞中，經由Gi、pAKT之APJ活化增加一氧化氮(NO)產生，從而增加平滑肌鬆弛，使得整體血管舒張。
患有慢性穩定型心臟衰竭之患者具有偶然急性失代償發作，其中心肌收縮力進一步下降且症狀惡化。該等加重稱為急性失代償性心臟衰竭(ADHF)。用於ADHF之當前療法包括利尿劑、血管舒張劑及直接增加心肌收縮力之強心劑。當前靜脈內強心劑(多巴酚丁胺、多巴胺、米力農、左西孟旦)之不良事件(例如心律不整及增加之長期致命 性)已為人們所熟知。本發明之合成apelin多肽類似物提供用於ADHF之療法，該療法增加心肌收縮力而無致心律不整性或致命性傾向並解決慢性心臟衰竭之巨大未滿足之醫學需要。
實際上，對人類之急性apelin治療(5 min)達成冠狀血管舒張及改良之心輸出量。然而，天然apelin在活體內展示極短之t½(數秒)及作用持續時間(數分鐘)。與天然apelin相比，本發明之高效合成apelin肽激動劑具有更長之半衰期。
在心肌細胞中，APJ受體活化a)經由Gi/Gq、PLC及Ca2+改良心肌收縮力並b)經由Gi、pAkt活化提供心臟保護，但不會增加cAMP(如使用其他強心劑所看到)。另外，在內皮細胞中，APJ激動達成動脈血管舒張，從而因解除左心室之工作負擔而進一步有益於心臟衰竭。同時採用該等合成apelin多肽類似物可改良整體心臟功能、減少心律不整發生並提供存活益處。
最近，存在多個著重於Apelin可能參與糖尿病及胰島素抗性之臨床前研究公開案。已證實Apelin 1)藉由改良在肌肉、脂肪及心臟中之葡萄糖吸收來降低血糖含量，2)保護胰β細胞不受內質網應激及後續凋亡，3)降低在β細胞中之胰島素分泌，及4)調節在脂肪組織中兒茶酚胺誘導之脂解。pAKT路徑之活化已參與該等過程。
如式I至IX中任一者之多肽或其醫藥上可接受之鹽(呈游離形式或呈醫藥上可接受之鹽形式)展示有價值的藥理性質，例如APJ受體激動性質，例如如在下面部分中所提供之活體外及活體內測試所指示，且因此適用於療法。
本發明之多肽或其醫藥上可接受之鹽可用於治療選自以下之適應症：急性失代償性心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺性高血壓、心房震顫、布魯格達氏症候群、心室性心博過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、局部缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維 化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖症、周邊動脈病、腦血管意外、暫時性腦缺血、創傷性腦損傷、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、燒傷(包括曬傷)及子癇前症。
因此，作為另一實施例，本發明提供式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽之用途，其用於治療與APJ受體活性相關之疾病。在另一實施例中，療法係選自對APJ受體之激動作用有反應之疾病。在另一實施例中，疾病係選自上述列表，適宜地急性失代償性心臟衰竭。在此實施例之又一子集中，本發明提供式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽在製造藥劑中之用途，該藥劑用於治療與APJ受體活性相關之疾病。
因此，作為另一實施例，本發明提供式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽在療法中之用途。在另一實施例中，該療法係選自可藉助APJ受體之活化(激動)來治療之疾病。
在另一實施例中，本發明提供治療對APJ受體之激動作用有反應之疾病之方法，其包含投與治療上可接受之量之式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽。在另一實施例中，該疾病係選自上述列表，適宜地急性失代償性心臟衰竭。
在此實施例之又一子集中，本發明提供治療與APJ受體之活性相關之疾病之方法，其包含投與治療上可接受之量之式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽。
治療上使用之本發明之醫藥組合物或組合之有效量將取決於(例如)治療內容及目標。熟習此項技術者應瞭解，用於治療之適當劑量水平因此將部分地端視以下而改變：所遞送分子、使用融合蛋白變體之適應症、投與途徑及患者之尺寸(體重、體表尺寸或器官尺寸)及/或條件(年齡及健康狀況)。因此，臨床醫師可確定劑量並改變投與途徑以獲得最佳治療效果。端視上述因素，典型劑量可介於約0.1 μg/kg至 最高約100 mg/kg或更高之間。在其他實施例中，劑量可介於0.1 μg/kg直至約100 mg/kg之間；或1 μg/kg直至約100 mg/kg。
給藥頻率將取決於所用調配物中之雙重功能蛋白之藥物動力學參數。通常，臨床醫師將投與組合物直至達到可達成期望效果之劑量。因此，組合物可以單一劑量投與，按時間以兩個或更多個劑量投與(各劑量可或可不含有相同量之期望分子)，或藉由植入裝置或導管以連續輸注方式投與。適當劑量之進一步細分係由業內一般技術人員以常規方式實施並在其所實施之常規任務之範圍內。可藉由使用適當劑量-反應數據來確定適當劑量。
本發明之多肽之活性可藉由下文所述活體外方法來評定。
hAPJ鈣流量分析：
將Chem-5 APJ穩定細胞(Millipore編號HTS068C)以384孔模式以10,000個細胞/孔平鋪於25 μl生長培養基中，然後在37℃組織培養箱中生長24小時。在分析前1小時，添加25 μl/孔FLIPR鈣4染料(Molecular Devices R8142)與2.5 mM丙磺舒，並在37℃組織培養箱中將細胞培育1小時。將肽溶解於HBSS、HEPES及0.1% BSA緩衝液中，並一式三份連續稀釋10倍(自50 μM至5 pM)。使用FLIPR Tetra將肽添加至具有染料之細胞中(1：5，對於介於10 μM至1 pM之間之最終肽濃度而言)。細胞內部之FLIPR染料在結合至鈣後發射螢光，同時標記來自細胞外部之螢光。在FLIPR Tetra上使用470至495激發波長及515至575發射波長來量測螢光。在肽添加前10秒開始進行讀數，總計3分鐘。針對每一肽濃度計算最大-最小值並繪圖，並針對肽對鈣流量之刺激使用GraphPad prism軟體來計算曲線拐點處之EC50值。
血漿穩定性分析： 材料：
工作溶液：1 mg/mL測試物件係在Milli-Q水中製備
激發溶液：具有0.1%甲酸及400 ng/mL格列本脲(Glyburide)之甲醇：乙腈：水(1：1：1)。
血漿：雄性Sprague-Dawley大鼠血漿(具有肝素鈉)，購自Bioreclamation LLC(Liverpool,NY)。
全血：雄性Sprague Dawley全血(具有肝素鈉)，購自Bioreclamation LLC(Liverpool,NY)。
肺勻漿：雄性大鼠Sprague Dawley肺係購自Bioreclamation LLC(Liverpool,NY)。在添加5x體積1X PBS後使用polytron勻質機將肺均質化。在4℃下將勻漿以9000 rpm離心10 min。將上清液以3000 rpm再次離心30 min以製備透明上清液。使用市售套組(Pierce,Thermo Scientific)來測定蛋白濃度。
樣品製備程序：
測試物件係在以下生物基質中製備：肝素化大鼠血漿、肝素化大鼠全血或肺勻漿。藉由將5 μl 1 mg/mL工作溶液添加至995 μl大鼠血漿或全血中以5000 ng/mL製備血漿及全血樣品。藉由以下方式製備肺勻漿樣品：用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)將肺勻漿稀釋至1 mg/ml蛋白濃度，隨後將5 μl工作溶液添加至995 μL經稀釋之肺勻漿中。在水浴培育箱中在37℃下培育樣品並輕微震盪(65 rpm至75 rpm)。在0 min、5 min、15 min、30 min、60 min、120 min及240 min時間時，將培育樣品之25 μl等份試樣轉移至96孔盤中並立即使用150 μl激發溶液來沈澱蛋白。在培育實驗完成後，在4℃下將樣品盤以4000 rpm離心10分鐘。此後，使用移液裝置(Tecan Temo)將上清液轉移至另一盤中並對所有樣品均添加50 μl水。在LC-MS分析前使盤旋轉。
樣品穩定性之LC-MS分析
HPLC：具有自動進樣器之Agilent 1290 HPLC
管柱：MAC-MOD ACE C18,3 μm,30 mm×2.1mm i.d.
流動相A：存於乙腈中之0.1%甲酸
流動相B：存於水中之0.1%甲酸
梯度程式：
質譜：Agilent Q-TOF 6530
數據採集模式：使用100 m/z至1000 m/z之質量範圍之全掃描
數據採集及分析軟體：MassHunter
數據分析：
穩定性分析：藉由將在每一時間點之峰面積轉化成相對於初始(t=0)峰面積之剩餘%來測定穩定性半衰期(t½)值。
剩餘%=100×(樣品峰面積)÷(t=0峰面積)
計算剩餘%值之自然對數並對樣品時間繪圖(Microsoft Excel)。藉由線性回歸來測定此直線之斜率k(Microsoft Excel)。
然後藉由式t½=0.693÷k來計算穩定性半衰期。
基於代用品活性之血漿穩定性分析：
實施上文所述鈣流量方案並進行以下變化。亦用5%大鼠血漿(Bioreclamation編號RATPLNAHP-M，經肝素Na處理)培育肽。在37℃組織培養箱中培育後，在時間點t0及t24小時進行讀數。藉由計算以下來估算肽血漿半衰期(以分鐘計)：1)LN((在t0時之EC50)/(在t24小時時之EC50))， 2)計算以上值之斜率且3)t1/2=0.693/(斜率^2)。
使用測試分析(如上文所述)，本發明之多肽展示下文所提供之表2及3之效力及穩定性。
本發明之多肽可具有與apelin-13或pyr-1-apelin-13類似之APJ受體效力。在一實施例中，本發明之多肽具有小於100 nM之EC50。在另一實施例中，本發明之多肽具有小於50 nM、較佳小於25 nM且更佳小於15 nM之EC50。在又一實施例中，本發明之多肽具有小於10 nM之EC50。
本發明之多肽可具有優於apelin-13或pyr-1-apelin-13之血漿穩定性。在一實施例中，血漿穩定性提高至少2倍。在一實施例中，本發明之多肽具有至少30分鐘之血漿穩定性。在另一實施例中，本發明之多肽具有至少10分鐘、至少40分鐘且更佳至少60分鐘之血漿穩定性。
本發明之多肽可在投與一或多種其他治療劑的同時或之前或之後投與。本發明之多肽可藉由相同或不同投與途徑分開投與或以同一醫藥組合物同其他試劑一起投與。
在一實施例中，本發明提供產品，其包含式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽及至少一種其他治療劑作為在療法中同時、分開或依序使用之組合製劑。在一實施例中，療法係對APJ受體之活化有反應之疾病或病況之治療。
作為合併製劑提供之產品包括以同一醫藥組合物一起包含式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽及其他治療劑或以獨立形式(例如以套組形式)包含式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽及其他治療劑的組合物。
在一實施例中，本發明提供包含式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽及另一治療劑之醫藥組合物。視情況，該醫藥組合物可包含如上文所述醫藥上可接受之賦形劑。
在一實施例中，本發明提供包含兩種或更多種分開醫藥組合物之套組，其至少一者含有式I'及I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽。在一實施例中，該套組包含用於獨立地保留該等組合物之構件， 例如容器、分立式瓶或分立式箔片包。此套組之實例係如通常用於包裝錠劑、膠囊及諸如此類之泡罩包裝。
本發明套組可用於投與不同劑型(例如，口服及非經腸劑型)，以不同的劑量間隔投與獨立組合物，或逐步地增加獨立組合物相對於彼此之劑量。為有助於依從性，本發明套組通常包含關於投與之說明書。
在本發明之組合療法中，本發明化合物及另一治療劑可由相同或不同製造商製造及/或調配。此外，可將本發明化合物與另一治療劑一起帶入組合療法中：(i)在對醫師發放組合產品之前(例如在包含本發明化合物及另一治療劑之套組情形下)；(ii)在即將投與前由醫師自身(或在醫師指導下)；(iii)由患者自身，例如在依序投與本發明之多肽與另一治療劑期間。
因此，本發明提供式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽之用途，其用於治療對APJ受體之激動作用有反應之疾病或病況，其中該藥劑係製備用於與另一治療劑一起投與。本發明亦提供另一治療劑之用途，其用於治療對apelin受體之激動有反應之疾病或病況，其中該藥劑係與式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽一起投與。
本發明亦提供式I至IX中任一者之多肽或其醫藥上可接受之鹽用於治療對APJ受體之激動作用有反應之疾病或病況之方法，其中該式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽係製備用於與另一治療劑一起投與。本發明亦提供另一治療劑用於治療對APJ受體之激動作用有反應之疾病或病況之方法，其中該另一治療劑係製備用於與式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽一起投與。本發明亦提供式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽用於治療對APJ受體之激動作用有反應之疾病或病況之方法，其中該式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽係與另一治療劑一起投與。本發明亦提供另一治療劑用於治療 對APJ受體之激動作用有反應之疾病或病況之方法，其中該另一治療劑係與式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽一起投與。
本發明亦提供式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽之用途，其用於治療對APJ受體之激動作用有反應之疾病或病況，其中該患者先前(例如在24小時內)經另一治療劑治療。本發明亦提供另一治療劑之用途，其用於治療對APJ受體之激動作用有反應之疾病或病況，其中該患者先前(例如在24小時內)經式I至IX中任一者之多肽或其醯胺、酯或鹽治療。
在一實施例中，其他治療劑係選自強心劑、β腎上腺素性受體阻斷劑、HMG-Co-A還原酶抑制劑、血管收縮素II受體拮抗劑、血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑、鈣通道阻斷劑(CCB)、內皮素拮抗劑、腎素抑制劑、利尿劑、ApoA-I模擬物、抗糖尿劑、減肥劑、醛固酮受體阻斷劑、內皮素受體阻斷劑、醛固酮合酶抑制劑(ASI)、CETP抑制劑、抗凝劑、鬆弛素、BNP(奈西立肽(nesiritide))及NEP抑制劑。
術語「與第二試劑或治療組合」包括共投與本發明之多肽(例如，式I至IX中任一者之多肽或本文所述其他多肽)與第二試劑或治療，首先投與本發明化合物，隨後投與第二試劑或治療；及首先投與第二試劑或治療，隨後投與本發明化合物。
術語「第二試劑」包括業內已知之治療、預防或減輕本文所述疾病或病症之症狀之任一試劑，例如對APJ受體之活化有反應之病症或疾病，例如，急性失代償性心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺性高血壓、心房震顫、布魯格達氏症候群、心室性心博過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、局部缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖症、周邊動脈病、腦血管意外、暫時性腦缺血、創傷性腦損傷、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、燒傷(包括曬傷)及子癇前症。
第二試劑之實例包括強心劑、β腎上腺素性受體阻斷劑、HMG-Co-A還原酶抑制劑、血管收縮素II受體拮抗劑、血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑、鈣通道阻斷劑(CCB)、內皮素拮抗劑、腎素抑制劑、利尿劑、ApoA-I模擬物、抗糖尿劑、減肥劑、醛固酮受體阻斷劑、內皮素受體阻斷劑、醛固酮合酶抑制劑(ASI)、CETP抑制劑、抗凝劑、鬆弛素、BNP(奈西立肽)及/或NEP抑制劑。
本文所用強心劑包括(例如)多巴酚丁胺、異丙基腎上腺素(isoproterenol)、米力農、氨力農(amirinone)、左西孟旦、腎上腺素(epinephrine)、去甲腎上腺素(norepinephrine)、異丙基腎上腺素及地穀新。
本文所用β腎上腺素性受體阻斷劑包括(例如)醋丁洛爾(acebutolol)、阿替洛爾(atenolol)、倍他洛爾(betaxolol)、比索洛爾(bisoprolol)、卡替洛爾(carteolol)、美託洛爾(metoprolol)、納多洛爾(nadolol)、普萘洛爾(propranolol)、索他洛爾(sotalol)及噻嗎洛爾(timolol)。
本文所用抗凝劑包括達替肝素(Dalteparin)、達那肝素(Danaparoid)、依諾肝素(Enoxaparin)、肝素、亭紮肝素(Tinzaparin)、華法林(Warfarin)。
術語「HMG-Co-A還原酶抑制劑」(亦稱為β-羥基-β-甲基戊二醯基-助醛素-A還原酶抑制劑)包括可用於降低血液中脂質含量(包括膽固醇)之活性劑。實例包括阿托伐坦丁(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、美伐他汀(compactin)、達伐他汀(dalvastatin)、二氫美伐他汀(dihydrocompactin)、氟斯他汀(fluindostatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、皮塔伐他汀(pitavastatin)、美伐他汀(mevastatin)、普伐他汀(pravastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、瑞伐他汀(rivastatin)、辛伐他汀(simvastatin)及維羅他汀(velostatin)、 或其醫藥上可接受之鹽。
術語「ACE-抑制劑」(亦稱為血管收縮素轉化酶抑制劑)包括中斷血管收縮素I至血管收縮素II之酶降解的分子。該等化合物可用於調節血壓及治療充血性心臟衰竭。實例包括阿拉普利(alacepril)、貝那普利(benazepril)、貝那普利拉(benazeprilat)、卡托普利(captopril)、西羅普利(ceronapril)、西拉普利(cilazapril)、地拉普利(delapril)、伊那拉普利(enalapril)、伊那普利拉(enaprilat)、福辛普利(fosinopril)、咪達普利(imidapril)、賴諾普利(lisinopril)、莫昔普利(moexipril)、莫維普利(moveltipril)、培哚普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)、雷米普利(ramipril)、螺普利(spirapril)、替莫普利(temocapril)及群多普利(trandolapril)、或其醫藥上可接受之鹽。
術語「內皮素拮抗劑」包括波生坦(bosentan)(參照EP 526708 A)、替唑生坦(tezosentan)(參照WO 96/19459)或其醫藥上可接受之鹽。
術語「腎素抑制劑」包括地替吉侖(ditekiren)(化學名稱：[1S-[1R*,2R*,4R*(1R*,2R*)]]-1-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-L-脯胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[2-羥基-5-甲基-1-(2-甲基丙基)-4-[[[2-甲基-1-[[(2-吡啶基甲基)胺基]羰基]丁基]胺基]羰基]己基]-N-α-甲基-L-組胺酸醯胺)；特拉吉侖(terlakiren)(化學名稱：[R-(R*,S*)]-N-(4-嗎啉基羰基)-L-苯基丙胺醯基-N-[1-(環己基甲基)-2-羥基-3-(1-甲基乙氧基)-3-側氧基丙基]-S-甲基-L-半胱胺酸醯胺)；阿利吉侖(Aliskiren)(化學名稱：(2S,4S,5S,7S)-5-胺基-N-(2-胺基甲醯基-2,2-二甲基乙基)-4-羥基-7-{[4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苯基]甲基}-8-甲基-2-(丙-2-基)壬醯胺)及佔吉侖(zankiren)(化學名稱：[1S-[1R*[R*(R*)],2S*,3R*]]-N-[1-(環己基甲基)-2,3-二羥基-5-甲基己基]-α-[[2-[[(4-甲基-1-六氫吡嗪基)磺醯基]甲基]-1-側氧基-3-苯基丙基]-胺基]-4-噻唑丙醯胺)或其鹽酸鹽、或 如由Speedel研發之SPP630、SPP635及SPP800、或具有式(A)及(B)之RO 66-1132及RO 66-1168： 及或， 其醫藥上可接受之鹽。
倘若未明確定義，則術語「阿利吉侖」應理解為游離鹼及其鹽，尤其係其醫藥上可接受之鹽，最佳為其半-富馬酸鹽。
術語「鈣通道阻斷劑(CCB)」包括二氫吡啶(DHP)及非DHP(例如，地爾硫卓(diltiazem)型及維拉帕米(verapamil)型CCB)。實例包括胺氯地平(amlodipine)、苄普地爾(Bepridil)、地爾硫卓、非洛地平(felodipine)、瑞西丁(ryosidine)、伊拉地平(isradipine)、拉西地平(lacidipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼古地平(niguldipine)、尼魯地平(niludipine)、尼莫地平(nimodipine)、尼索地平(nisoldipine)、尼群地平(nitrendipine)、維拉帕米及尼伐地平(nivaldipine)，且較佳係選自由下列組成之群之非DHP代表物：氟桂利嗪(flunarizine)、普尼拉明(prenylamine)、地爾硫卓、芬地林(fendiline)、戈洛帕米(gallopamil)、米貝拉地爾(mibefradil)、阿尼帕米(anipamil)、噻帕米(tiapamil)及維拉帕米、或其醫藥上可接受之鹽。CCB可用作抗高血壓藥、抗心絞痛藥或抗心律不整藥。
術語「利尿劑」包括噻嗪衍生物(例如，氯噻嗪、氫氯噻嗪、甲氯噻嗪及氯噻酮)。
術語「ApoA-I模擬物」包括D4F肽(例如，式D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F)。
血管收縮素II受體拮抗劑或其醫藥上可接受之鹽應理解為可結合血管收縮素II受體之AT1-受體亞型但不會活化該受體之活性成份。由於抑制AT1受體之結果，該等拮抗劑可用作(例如)抗高血壓藥或用於治療充血性心臟衰竭。
該類別AT1受體拮抗劑包含具有不同結構特徵之化合物，尤佳係非肽類。舉例而言，可提及選自由下列組成之群之化合物：纈沙坦(valsartan)、洛沙坦(losartan)、坎地沙坦(candesartan)、依普羅沙坦(eprosartan)、厄貝沙坦(irbesartan)、沙普立沙坦(saprisartan)、他索沙坦(tasosartan)、替米沙坦(telmisartan)、具有下式之命名為E-1477之化合物 具有下式之命名為SC-52458之化合物 及具有下式之命名為ZD-8731之化合物 或在每一情形下其醫藥上可接受之鹽。
較佳AT1-受體拮抗劑係坎地沙坦、依普羅沙坦、厄貝沙坦、洛沙坦、替米沙坦、纈沙坦。亦較佳者係彼等已市售之試劑，最佳者係纈沙坦或其醫藥上可接受之鹽。
術語「抗糖尿劑」包括可促進胰島素自胰β-細胞分泌之胰島素分泌增強劑。實例包括雙胍衍生物(例如，二甲雙胍(metformin))、磺醯脲類(SU)(例如，甲苯磺丁脲(tolbutamide)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、妥拉磺脲(tolazamide)、醋酸已脲(acetohexamide)、4-氯-N-[(1-吡咯啶基胺基)羰基]-苯磺醯胺(格隆平脲(glycopyramide))、格列本脲(glibenclamide、glyburide)、甲磺吡脲(gliclazide)、1-丁基-3-間胺基苯磺醯脲、磺胺丁脲(carbutamide)、格列波脲(glibonuride)、格列吡嗪(glipizide)、格列喹酮(gliquidone)、格列派特(glisoxepid)、格列噻唑(glybuthiazole)、格列丁唑(glibuzole)、格列已脲(glyhexamide)、格列嘧啶(glymidine)、格列平脲(glypinamide)、苯磺丁脲(phenbutamide)及格列環脲(tolylcyclamide)、或其醫藥上可接受之鹽。其他實例包括苯基丙胺酸衍生物(例如，具有下式之那格列胺(nateglinide)[N-(反式-4-異丙基環己基羰基)-D-苯基丙胺酸](參照EP 196222及EP 526171)) 瑞格列奈(repaglinide)[(S)-2-乙氧基-4-{2-[[3-甲基-1-[2-(1-六氫吡啶基)苯基]丁基]胺基]-2-側氧基乙基}苯甲酸](參照EP 589874、EP 147850 A2(具體而言第61頁之實例11)及EP 207331 A1)；(2S)-2-苄基-3-(順式-六氫-2-異二氫吲哚基羰基)-丙酸鈣二水合物(例如，米替格列(mitiglinide)(參照EP 507534))；及格列美脲(glimepiride)(參照EP 31058)。
可與本發明之肽及多肽組合使用之第二試劑之其他實例包括DPP-IV抑制劑、GLP-1及GLP-1激動劑。
DPP-IV負責使GLP-1去活化。更具體而言，DPP-IV產生GLP-1受體拮抗劑並藉此縮短對GLP-1之生理學反應。GLP-1係胰胰島素分泌之主要刺激物並對葡萄糖處理具有直接有益的效果。
DPP-IV抑制劑可為肽或較佳為非肽。DPP-IV抑制劑在每一情形下概括地且具體地揭示於(例如)WO 98/19998、DE 196 16 486 A1、WO 00/34241及WO 95/15309中，在每一情形下具體揭示於化合物申請專利範圍及工作實例之最終產物中，最終產物之標的物、醫藥製劑及申請專利範圍特此以引用該等公開案之方式併入本申請案中。較佳者係彼等分別具體揭示於WO 98/19998之實例3及WO 00/34241之實例1中之化合物。
GLP-1(升糖素，如肽-1)係促胰島素蛋白，其闡述於(例如)W.E.Schmidt等人之Diabetologia,28,1985,704-707及US 5,705,483中。
術語「GLP-1激動劑」包括GLP-1(7-36)NH2之變體及類似物，其等具體揭示於US 5,120,712、US 5,118666、US 5,512,549、WO 91/11457及C.Orskov等人之J.Biol.Chem.264(1989)12826中。其他實例包括GLP-1(7-37)(其中化合物之Arg36羧基末端醯胺官能團係經GLP-1(7-36)NH2分子第37位之Gly代替)及其變體及類似物，包括GLN9-GLP-1(7-37)、D-GLN9-GLP-1(7-37)、乙醯基LYS9-GLP-1(7-37)、LYS18-GLP-1(7-37)且尤其係GLP-1(7-37)OH、VAL8-GLP-1(7-37)、GLY8-GLP-1(7-37)、THR8-GLP-1(7-37)、MET8-GLP-1(7-37)及4-咪唑并丙醯基-GLP-1。尤佳者亦為由Greig等人闡述於Diabetologia 1999,42,45-50中之GLP激動劑類似物艾塞那肽-4(exendin-4)。
「抗糖尿劑」定義亦包括胰島素敏感性增強劑，其可恢復受損 胰島素受體功能以降低胰島素抗性及因此增強胰島素敏感性。實例包括降血糖藥噻唑啶二酮衍生物(例如，格列酮(glitazone)、(S)-((3,4-二氫-2-(苯基-甲基)-2H-1-苯并吡喃-6-基)甲基-噻唑啶-2,4-二酮(恩格列酮(englitazone))、5-{[4-(3-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基)-1-側氧基丙基)-苯基]-甲基}-噻唑啶-2,4-二酮(達格列酮(darglitazone))、5-{[4-(1-甲基-環己基)甲氧基)-苯基]甲基}-噻唑啶-2,4-二酮(環格列酮(ciglitazone))、5-{[4-(2-(1-吲哚基)乙氧基)苯基]甲基}-噻唑啶-2,4-二酮(DRF2189)、5-{4-[2-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基)-乙氧基)]苄基}-噻唑啶-2,4-二酮(BM-13.1246)、5-(2-萘基磺醯基)-噻唑啶-2,4-二酮(AY-31637)、雙{4-[(2,4-二側氧基-5-噻唑啶基)甲基]苯基}甲烷(YM268)、5-{4-[2-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基)-2-羥基乙氧基]苄基}-噻唑啶-2,4-二酮(AD-5075)、5-[4-(1-苯基-1-環丙烷羰基胺基)-苄基]-噻唑啶-2,4-二酮(DN-108)、5-{[4-(2-(2,3-二氫吲哚-1-基)乙氧基)苯基]甲基}-噻唑啶-2,4-二酮、5-[3-(4-氯-苯基])-2-丙炔基]-5-苯基磺醯基)噻唑啶-2,4-二酮、5-[3-(4-氯苯基])-2-丙炔基]-5-(4-氟苯基-磺醯基)噻唑啶-2,4-二酮、5-{[4-(2-(甲基-2-吡啶基-胺基)-乙氧基)苯基]甲基}-噻唑啶-2,4-二酮(羅格列酮(rosiglitazone))、5-{[4-(2-(5-乙基-2-吡啶基)乙氧基)苯基]-甲基}噻唑啶-2,4-二酮(吡格列酮(pioglitazone))、5-{[4-((3,4-二氫-6-羥基-2,5,7,8-四甲基-2H-1-苯并吡喃-2-基)甲氧基)-苯基]-甲基}-噻唑啶-2,4-二酮(曲格列酮(troglitazone))、5-[6-(2-氟-苄基氧基)萘-2-基甲基]-噻唑啶-2,4-二酮(MCC555)、5-{[2-(2-萘基)-苯并噁唑-5-基]-甲基}噻唑啶-2,4-二酮(T-174)及5-(2,4-二側氧基噻唑啶-5-基甲基)-2-甲氧基-N-(4-三氟甲基-苄基)苯甲醯胺(KRP297))。
其他抗糖尿劑包括胰島素傳訊路徑調控劑，如蛋白酪胺酸磷酸酶(PTPase)之抑制劑、抗糖尿病性非小分子模擬物化合物及麩醯胺酸-果糖-6-磷酸醯胺基轉移酶(GFAT)之抑制劑；影響肝葡萄糖產生失調 之化合物，如葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)之抑制劑、果糖-1,6-雙磷酸酶(F-1,6-Bpase)之抑制劑、糖原磷酸化酶(GP)之抑制劑、升糖素受體拮抗劑及磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)之抑制劑；丙酮酸脫氫酶激酶(PDHK)抑制劑；胃排空之抑制劑；胰島素；GSK-3之抑制劑；類視色素X受體(RXR)激動劑；β-3 AR之激動劑；解偶聯蛋白(UCP)之激動劑；非格列酮型PPARγ激動劑；醹2-腎上腺素；雙重PPARα/PPARγ激動劑；抗糖尿病性含釩化合物；腸促胰島素激素，如升糖素-樣肽-1(GLP-1)及GLP-1激動劑；β-細胞咪唑啉受體拮抗劑；米格列醇(miglitol)；α2-腎上腺素拮抗劑；及其醫藥上可接受之鹽。
在一實施例中，本發明提供組合、具體而言醫藥組合，其包含治療有效量之如式I至IX中任一者所定義之多肽或其醯胺、酯或鹽及一或多種選自以下之治療活性劑：β-腎上腺素性受體阻斷劑，例如醋丁洛爾、阿替洛爾、倍他洛爾、比索洛爾、美託洛爾、納多洛爾、普萘洛爾、索他洛爾及噻嗎洛爾；血管收縮素II受體拮抗劑，例如AT1阻斷劑；抗糖尿劑，例如DPPIV抑制劑(例如維格列汀(vildagliptin))及GLP1肽激動劑。
術語「減肥劑」包括脂肪酶抑制劑(例如，奧利司他(orlistat))及食欲抑制劑(例如，西布曲明(sibutramine)及芬特明(phentermine))。
應瞭解，醛固酮合酶抑制劑或其醫藥上可接受之鹽係具有抑制醛固酮產生之性質之活性成份。醛固酮合酶(CYP11B2)係在腎上腺皮質中催化醛固酮產生之最後步驟(即，11-去氧皮質酮至醛固酮之轉化)之線粒體細胞色素P450酶。已知用所謂的醛固酮合酶抑制劑抑制醛固酮產生係治療低鉀血症、高血壓、充血性心臟衰竭、心房震顫或腎衰竭之成功變體。此醛固酮合酶抑制活性可由熟習此項技術者按照標準分析(例如，US 2007/0049616)來容易地測定。
該類醛固酮合酶抑制劑包含類固醇及非類固醇醛固酮合酶抑制 劑二者，且後者最佳。
較佳者係市售醛固酮合成酶抑制劑或彼等已經衛生當局批准之醛固酮合成酶抑制劑。
該類醛固酮合成酶抑制劑包含具有不同結構特徵之化合物。非類固醇醛固酮合成酶抑制劑之實例係下式之法曲唑(fadrozole)鹽酸鹽之(+)對映異構體(美國專利第4617307號及第4889861號) 或若需要，其醫藥上可接受之鹽。
可用於該組合之醛固酮合酶抑制劑係通常且特定地揭示於(例如)US2007/0049616(具體而言化合物申請專利範圍及工作實例之最終產物)中之化合物及類似物，最終產物之標的物、醫藥製劑及申請專利範圍特此係以引用此公開案之方式併入本申請案中。適用於本發明之較佳醛固酮合酶抑制劑包括(不限於)4-(6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-基)-3-甲基苄腈；5-(2-氯-4-氰基苯基)-6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-甲酸(4-甲氧基苄基)甲基醯胺；4'-氟-6-(6,7,8,9-四氫-5H-咪唑并[1,5-a]氮呯-5-基)聯苯-3-甲腈；5-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-甲酸丁基酯；4-(6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-基)-2-甲氧基苄腈；5-(2-氯-4-氰基苯基)-6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-甲酸4-氟苄基酯；5-(4-氰基-2-三氟甲氧基苯基)-6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-甲酸甲基酯；5-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-甲酸2-異丙氧基乙基酯；4-(6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-基)-2-甲基苄腈；4-(6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-基)-3-氟苄腈；4-(6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-基)- 2-甲氧基苄腈；3-氟-4-(7-亞甲基-6,7-二氫-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-5-基)苄腈；順式-3-氟-4-[7-(4-氟-苄基)-5,6,7,8-四氫-咪唑并[1,5-a]吡啶-5-基]苄腈；4'-氟-6-(9-甲基-6,7,8,9-四氫-5H-咪唑并[1,5-a]氮呯-5-基)聯苯-3-甲腈；4'-氟-6-(9-甲基-6,7,8,9-四氫-5H-咪唑并[1,5-a]氮呯-5-基)聯苯-3-甲腈或在每一情形下其(R)或(S)對映異構體；或若需要，其醫藥上可接受之鹽。
術語醛固酮合酶抑制劑亦包括下列中所揭示之化合物及類似物：WO2008/076860、WO2008/076336、WO2008/076862、WO2008/027284、WO2004/046145、WO2004/014914、WO2001/076574。
此外，醛固酮合酶抑制劑亦包括下列中所揭示之化合物及類似物：美國專利申請案US2007/0225232、US2007/0208035、US2008/0318978、US2008/0076794、US2009/0012068、US20090048241及PCT申請案WO2006/005726、WO2006/128853、WO2006128851、WO2006/128852、WO2007065942、WO2007/116099、WO2007/116908、WO2008/119744及歐洲專利申請案EP 1886695。適用於本發明之較佳醛固酮合酶抑制劑包括(不限於)8-(4-氟苯基)-5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪；4-(5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)-2-氟苄腈；4-(5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)-2,6-二氟苄腈；4-(5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)-2-甲氧基苄腈；3-(5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)苄腈；4-(5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)鄰苯二甲腈；4-(8-(4-氰基苯基)-5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)苄腈；4-(5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)苄腈；4-(5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪-8-基)萘-1-甲腈；如藉由Speedel所研發之8-[4-(1H-四唑-5-基)苯基1-5,6-二氫-8H-咪唑并[5,1-c][1,4]噁嗪或在每一情形下 其(R)或(S)對映異構體；或若需要，其醫藥上可接受之鹽。
可用於該組合之醛固酮合酶抑制劑係通常且特定地揭示於(例如)WO 2009/156462及WO 2010/130796(具體而言化合物申請專利範圍及工作實例之最終產物)中之化合物及類似物，最終產物之標的物、醫藥製劑及申請專利範圍。適用於本發明中之組合之較佳醛固酮合酶抑制劑包括3-(6-氟-3-甲基-2-吡啶-3-基-1H-吲哚-1-基甲基)-苄腈鹽酸鹽、1-(4-甲磺醯基-苄基)-3-甲基-2-吡啶-3-基-1H-吲哚、2-(5-苄氧基-吡啶-3-基)-6-氯-1-甲基-1H-吲哚、5-(3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-菸鹼酸乙基酯、N-[5-(6-氯-3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-乙磺醯胺、吡咯啶-1-磺酸5-(6-氯-3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基酯、N-甲基-N-[5-(1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-甲磺醯胺、6-氯-1-甲基-2-{5-[(2-吡咯啶-1-基-乙基胺基)-甲基]-吡啶-3-基}-1H-吲哚-3-甲腈、6-氯-2-[5-(4-甲磺醯基-六氫吡嗪-1-基甲基)-吡啶-3-基]-1-甲基-1H-吲哚-3-甲腈、6-氯-1-甲基-2-{5-[(1-甲基-六氫吡啶-4-基胺基)-甲基]-吡啶-3-基}-1H-吲哚-3-甲腈、嗎啉-4-甲酸[5-(6-氯-3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-醯胺、N-[5-(6-氯-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-乙磺醯胺、C,C,C-三氟-N-[5-(1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-甲磺醯胺、N-[5-(3-氯-4-氰基-苯基)-吡啶-3-基]-4-三氟甲基-苯磺醯胺、N-[5-(3-氯-4-氰基-苯基)-吡啶-3-基]-1-苯基-甲磺醯胺、N-(5-(3-氯-4-氰基苯基)吡啶-3-基)丁烷-1-磺醯胺、N-(1-(5-(4-氰基-3-甲氧基苯基)吡啶-3-基)乙基)乙磺醯胺、N-((5-(3-氯-4-氰基苯基)吡啶-3-基)(環丙基)甲基)乙磺醯胺、N-(環丙基(5-(1H-吲哚-5-基)吡啶-3-基)甲基)乙磺醯胺、N-(環丙基(5-萘-1-基-吡啶-3-基)甲基)乙磺醯胺、乙磺酸[5-(6-氯-1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)-吡啶-3-基甲基]-醯胺及乙磺酸{[5-(3-氯-4-氰基-苯基)-吡啶-3-基]-環丙基-甲基}-乙基-醯胺。
術語「內皮素受體阻斷劑」包括波生坦及安立生坦(ambrisentan)。
術語「CETP抑制劑」係指可抑制膽固醇酯轉移蛋白(CETP)所介導轉運各種膽固醇酯及甘油三酸酯從HDL轉運至LDL及VLDL之化合物。該CETP抑制活性很容易利用熟習此項技術者依據標準分析法(例如，美國專利第6,140,343號)測定。其實例包括揭示於美國專利第6,140,343號及美國專利第6,197,786號中之化合物(例如，[2R,4S]4-[(3,5-雙-三氟甲基-苄基)-甲氧基羰基-胺基]-2-乙基-6-三氟甲基-3,4-二氫-2H-喹啉-1-甲酸乙酯(托徹普(torcetrapib))；揭示於美國專利第6,723,752號中之化合物(例如，(2R)-3-{[3-(4-氯-3-乙基-苯氧基)-苯基]-[[3-(1,1,2,2-四氟-乙氧基)-苯基]-甲基]-胺基}-1,1,1-三氟-2-丙醇)；揭示於美國專利申請案第10/807,838號中之化合物；揭示於美國專利第5,512,548號中之多肽衍生物；分別揭示於J.Antibiot.,49(8)：815-816(1996)及Bioorg.Med.Chem.Lett.；6：1951-1954(1996)中之膽固醇酯之玫瑰酮內酯(rosenonolactone)衍生物及含磷酸類似物。此外，CETP抑制劑亦包括彼等於WO2000/017165、WO2005/095409、WO2005/097806、WO 2007/128568、WO2008/009435、WO 2009/059943及WO2009/071509中所揭示者。
術語「NEP抑制劑」係指抑制中性內肽酶(NEP)EC 3.4.24.11之化合物。實例包括坎沙曲(Candoxatril)、坎沙曲拉(Candoxatrilat)、右卡多曲(Dexecadotril)、依卡曲爾(Ecadotril)、消旋卡多曲(Racecadotril)、山帕曲拉(Sampatrilat)、法西多曲(Fasidotril)、奧馬曲拉(Omapatrilat)、吉莫曲拉(Gemopatrilat)、達格魯曲(Daglutril)、SCH-42495、SCH-32615、UK-447841、AVE-0848、PL-37及(2R,4S)-5-聯苯-4-基-4-(3-羧基-丙醯基胺基)-2-甲基-戊酸乙基酯或其醫藥上可接受之鹽。NEP抑制劑亦包括如美國專利第US 5,155,100號中所揭示 之經膦醯基/聯芳基取代之二肽衍生物。NEP抑制劑亦包括如PCT申請案第WO 2003/104200號中所揭示之N-巰基醯基苯基丙胺酸衍生物。
NEP抑制劑亦包括如PCT申請案第WO 2008/133896號、第WO 2009/035543號或第WO 2009/134741號中所揭示之雙重作用抗高血壓藥。其他實例包括美國申請案第12/788,794號；第12/788,766號及第12/947,029號中所揭示之化合物。NEP抑制劑亦包括WO 2010/136474、WO 2010/136493、WO 2011/061271及美國臨時申請案第61/414171號及第61/414163號中所揭示之化合物。
在一實施例中，本發明提供活化個體之APJ受體之方法，其中該方法包含投與該個體治療有效量之如式I至IX中任一者所定義之多肽或其醯胺、酯或鹽。
在一實施例中，本發明提供治療個體之對APJ受體之活化有反應之病症或疾病之方法，其中該方法包含投與該個體治療有效量之如式I至IX中任一者所定義之多肽或其醯胺、酯或鹽。
在一實施例中，本發明提供治療個體之對APJ受體之活化(激動作用)有反應之病症或疾病之方法，其中該病症或該疾病係選自急性失代償性心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺性高血壓、心房震顫、布魯格達氏症候群、心室性心博過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、局部缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖症、周邊動脈病、腦血管意外、暫時性腦缺血、創傷性腦損傷、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、燒傷(包括曬傷)及子癇前症。
在一實施例中，本發明提供如式I至IX中任一者所定義之多肽，其用作藥劑。
在一實施例中，本發明提供如式I至IX中任一者所定義之多肽或其醯胺、酯或鹽在製造藥劑中之用途，該藥劑用於治療對APJ受體之 活化有反應之病症或疾病。在另一實施例中，本發明提供如式I至IX中任一者所定義之多肽或其醯胺、酯或鹽在製造藥劑中之用途，該藥劑用於治療對APJ受體之活化有反應之病症或疾病，其中該病症或疾病具體而言係選自急性失代償性心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺性高血壓、心房震顫、布魯格達氏症候群、心室性心博過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、局部缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖症、周邊動脈病、腦血管意外、暫時性腦缺血、創傷性腦損傷、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、燒傷(包括曬傷)及子癇前症。
本發明之例示：肽及多肽合成
該等肽係藉由標準固相Fmoc化學來合成。該等肽係在PreludeTM肽合成器上組裝(Protein Technologies公司，Tucson,USA)。在C-末端上具有游離羧酸之肽係自2-氯三苯氯甲烷-PS-樹脂合成(ABCR,Karlsruhe,Germany)。在C-末端上具有未經取代之甲醯胺之肽係自經Fmoc保護之Rink-醯胺-AM-PS-樹脂合成(Merck,Darmstadt,Germany)。在C-末端上具有N-經單取代之甲醯胺之肽係自負載有胺之BAL-AM-PS-樹脂合成(EMC Microcollections,Tübingen,Germany)。
該等肽係藉由製備型反相HPLC來純化。使用以下管柱：
‧Waters SunFire Prep C18 OBD管柱，5 μm,30×100 mm，部件編號186002572(1個管柱或2個串聯管柱)
‧Waters SunFire Prep C18 OBD管柱，5 μm,30×150 mm，部件編號186002797
‧Waters Atlantis Prep OBD T3管柱，5 μm,30×150 mm，部件編號186003703
‧Waters XBridge Prep C8 OBD管柱，5 μm,30×150 mm，部件編號186003083
‧Machery-Nagel Nucleosil® 100-5 C18,5 μm,250×40 mm，部件編號715340.400
流動相由洗脫液A(存於H2O中之0.1% TFA)及洗脫液B(ACN)組成。基於分離問題之特定要求來設計梯度。將純淨產物自ACN/H2O凍乾。
藉由分析型HPLC使用UV檢測在λ=214 nm處分析產物(管柱： Bischoff UHC-640(53×4.0 mm)、ProntoSil 120-3-C18-H(3 μm)，部件編號0604F185PS030)。流動相由洗脫液A(存於H2O中之0.07% TFA)及洗脫液B(存於ACN中之0.1% TFA)組成。藉由UPLC-MS(管柱：Waters Acquity UPLC® BEH C18,1.7 μm,2.1×50 mm，部件編號186002350)使用電噴霧電離來實施產物之額外表徵。
表4中所例示之肽係使用下文所述之一般程序來合成。未經取代N-或C-末端分別由小斜體H-或-OH指示。
分析方法 1)HPLC-分析方法A
‧管柱：Bischoff UHC-640(53×4.0 mm)與ProntoSil 120-3-C18-H(3 μm)；部件編號：0604F185PS030
‧洗脫液A：存於水中之0.07% TFA/洗脫液B：存於ACN中之0.1% TFA
‧流速：1.5 ml/min
‧溫度：40℃
‧梯度：
2a)UPLC-MS-分析方法B
‧Waters Acquity UPLC® BEH C18,1.7 μm,2.1×50 mm；部件編號：186002350
‧洗脫液A：存於水中之0.1% FA；洗脫液B：存於ACN中之0.1% FA
‧流速：0.7 ml/min
‧溫度：40℃
‧梯度：
2b)UPLC-MS-分析方法C
‧Waters Acquity UPLC® BEH C18,1.7 μm,2.1×50 mm；部件編號：186002350
‧洗脫液A：存於水中之0.1% FA；洗脫液B：存於ACN中之0.1% FA
‧流速：0.7 ml/min
‧溫度：40℃
‧梯度：
實例1至63之肽之分析數據匯總於表5中且係使用上文所述分析方法產生。
一般合成程序 1)第一種胺基酸至2-氯三苯氯甲烷樹脂上之負載及Fmoc-去除
用DCM充分洗滌2-氯三苯氯甲烷樹脂(1當量，1.0 mmol/g至1.6 mmol/g)。將期望胺基酸(通常相對於樹脂0.5當量至2當量，視為1.6 mmol/g負載)溶解於DCM(約10 mL/克樹脂)及DIPEA(相對於樹脂為4當量，視為1.6 mmol/g負載)中。將該溶液添加至樹脂中並在室溫下將懸浮液震盪19 h。對樹脂實施排液且然後依次用DCM/MeOH/DIPEA(17：2：1)、DCM、DMA、DCM充分洗滌。
為了Fmoc去除及負載之測定，將樹脂與六氫吡啶/DMA(1：4)或4-甲基六氫吡啶/DMA(1：4)(12×10 mL/克初始樹脂)反覆地震盪並用DMA(2×10 mL/克初始樹脂)洗滌。用MeOH將合併之溶液稀釋至250 mL體積 V /克初始樹脂。用MeOH將此溶液之2 mL等份試樣( V a )進一步稀釋至250 mL( V t )。對照MeOH參考量測在299.8 nm處之UV吸收度，得到吸收度 A 。依次用DMA、DCM、DMA、DCM充分洗滌樹脂並在40℃下在高真空中乾燥，得到 m g樹脂。
根據下式計算樹脂之負載：負載[莫耳/g]=(A×Vt×V)/d×ε×V a ×m)
(其中d：光析槽之寬度；=7800 L莫耳-1 cm-1)
2)在Prelude TM 合成器上之固相肽合成 2a)合成循環A
用DMA洗滌樹脂。藉由用4-甲基六氫吡啶/DMA(1：4)重複性處理來去除Fmoc。用DMA洗滌樹脂。藉由以下方式實施偶聯：添加Fmoc-胺基酸(3當量；存於NMP中之0.2 M溶液)、HCTU(3當量；存於NMP中之0.3 M溶液)及DIPEA(3.3當量；存於NMP中之0.66 M溶液)，隨後在室溫下將該懸浮液與氮氣混合通常15 min至4 h，此視特定要求而定。在用DMA洗滌後，通常重複偶聯步驟1至3次，此視特定要求而定。在用DMA洗滌後，藉由添加Ac2O/吡啶/DMA(1：1：8)之混合物且隨後在室溫下混合該懸浮液來實施封端。用DMA洗滌樹脂。
2b)合成循環B
用DMA洗滌樹脂。藉由用六氫吡啶/DMA(1：4)重複性處理來去除Fmoc。用DMA洗滌樹脂。藉由以下方式實施偶聯：添加Fmoc-胺基酸(3當量；存於NMP中之0.3 M溶液)、HCTU(3當量；存於NMP中之0.3 M溶液)及DIPEA(4.5當量；存於NMP中之0.9 M溶液)，隨後在室溫下將該懸浮液與氮氣混合通常15 min至4 h，此視特定要求而定。在用DMA洗滌後，通常重複偶聯步驟1至3次，此視特定要求而定。在用DMA洗滌後，藉由添加Ac2O/吡啶/DMA(1：1：8)之混合物且隨後在室溫下混合該懸浮液來實施封端。用DMA洗滌樹脂。
2c)合成循環C
用DMA洗滌樹脂。藉由用六氫吡啶/DMA(1：4)重複性處理來去除Fmoc。用DMA洗滌樹脂。藉由以下方式實施偶聯：添加Fmoc-胺基酸(3當量；存於NMP中之0.3 M溶液)、HCTU(3當量；存於NMP中之0.3 M溶液)及DIPEA(6當量；存於NMP中之0.9 M溶液)，隨後在室溫下將該懸浮液與氮氣混合通常15 min至4 h，此視特定要求而定。在用DMA洗滌後，通常重複偶聯步驟1至3次，此視特定要求而定。在用DMA洗滌後，藉由添加Ac2O/吡啶/DMA(1：1：8)之混合物且隨後在室溫下混合該懸浮液來實施封端。用DMA洗滌樹脂。
2d)合成循環D
用DMA洗滌樹脂。藉由用4-甲基六氫吡啶/DMA(1：4)重複性處理來去除Fmoc。用DMA洗滌樹脂。藉由以下方式實施偶聯：添加Fmoc-胺基酸與Oxyma Pure(各自3當量；二者均為0.2 M存於NMP中)之混合物及DIC(3當量；存於NMP中之0.3 M溶液)，隨後在室溫下將該懸浮液與氮氣混合通常15 min至4 h，此視特定要求而定。在用DMA洗滌後，通常重複偶聯步驟1至3次，此視特定要求而定。在用DMA洗滌後，藉由添加Ac2O/吡啶/DMA(1：1：8)之混合物且隨後在室溫下混合該懸浮液來實施封端。用DMA洗滌樹脂。
3)自樹脂解離並伴隨或或不伴隨保護基團去除 3a)解離方法A
在室溫下將該樹脂(0.1 mmol)與95% TFA/EDT/TIS水溶液(95：2.5：2.5)(3 mL)震盪2 h。濾出解離溶液，並添加新製備之溶液(3 mL)。在室溫下將懸浮液震盪1 h，然後濾出解離溶液。添加新製備之溶液(3 mL)並在室溫下將懸浮液震盪1 h。濾出解離溶液。將合併之解離溶液緩慢地傾倒至冷庚烷/二乙基醚之混合物(1：1)(35 mL)上，得到沈澱。對懸浮液實施離心並傾倒出上清液。用冷庚烷/二乙基醚(1：1)(10 mL)洗滌殘餘物，對懸浮液實施離心並傾倒出上清液。在高真空中乾燥固體。
3b)解離方法B
用95% TFA/EDT水溶液(4：1)(0.75 mL)處理樹脂(0.1 mmol)並在室溫下將懸浮液震盪1 h。添加95% TFA水溶液(2.18 mL)與TIS(75 μL)之混合物並繼續在室溫下振盪1 h。濾出解離溶液，然後將95% TFA/EDT/TIS水溶液(95：2.5：2.5)(3 mL)添加至樹脂中並在室溫下將懸浮液震盪1 h。濾出解離溶液並收集並添加新製備之溶液(3 mL)。在室溫下將懸浮液震盪1 h，然後濾出解離溶液。將合併之解離溶液傾倒 至冷庚烷/二乙基醚(1：1)(35 mL)上。使由此形成之沈澱沉降，離心，然後小心地傾倒出上清液。將沈澱用冷庚烷/二乙基醚(1：1)(10 mL)洗滌一次，對懸浮液實施離心並傾倒出上清液。在高真空中乾燥殘餘物。
3c)解離方法C
將HFIP/DCM(30：70)(5 mL)添加至該樹脂(0.1 mmol)中並在室溫下將懸浮液攪拌1.5 h。濾出解離溶液並收集並添加新製備之HFIP/DCM(30：70)(5 mL)。在室溫下將懸浮液攪拌30 min。濾出解離溶液並收集。用DCM(2×5 mL)洗滌樹脂，亦收集DCM。在高真空中將合併之解離溶液及洗滌溶液濃縮至乾燥。將殘餘物自tBuOH/H2O(1：1)凍乾。
4)環化方法 4a)環化方法A(二硫鍵形成)
將完全脫除保護之直鏈前體肽溶解於H2O/DMSO(9：1或4：1)中，得到通常1 mg/mL至15 mg/mL之濃度。然後在室溫下將反應混合物攪拌通常40 h，此視要求而定，且然後在高真空中濃縮至乾燥。
4b)環化方法B(二硫鍵形成)
將完全脫除保護之直鏈前體肽(1當量)溶解於H2O中，得到通常10 mg/mL之濃度。將50 mM I2於AcOH(1.2當量)中之溶液一次性添加至經攪拌溶液中並在室溫下將反應攪拌10 min。添加存於H2O(1.5當量)中之0.5 M抗壞血酸以淬滅過量I2。將溶液在真空中濃縮至近乎乾燥。
4c)環化方法C(兩個二硫鍵之選擇性形成)
將經部分地保護之直鏈前體肽(1當量)(兩個半胱胺酸係經Acm保護且兩個半胱胺酸未經保護)溶解於AcOH/H2O(4：1)中，得到通常1 mg/mL之濃度。添加存於AcOH(2當量)中之50 mM I2並在室溫下將反應混合物攪拌1 h。經4 h逐份添加另外的存於AcOH(10當量)中之50 mM I2。21 h後，將反應混合物在真空中濃縮至近乎乾燥並過量添加存於H2O中之1 M抗壞血酸以淬滅未反應之I2。
4d)環化方法D(在側鏈之間之內醯胺形成)
將完全脫除保護之直鏈前體肽(1當量)及HATU(1.5當量)溶解於NMP中(肽濃度：通常1 mmol/L)。添加DIPEA(3當量)並在室溫下將溶液攪拌90 min。將反應混合物在真空中濃縮至乾燥。
4e)環化方法E(在側鏈與C-末端之間之內醯胺形成)
用2,6-二甲基吡啶(20當量)處理肽(1當量)、HATU(1.3當量)及HOAt(1.3當量)於DMF(肽濃度：2.6 mmol/L)中之溶液並在室溫下將反應攪拌2 h。將反應混合物在真空中濃縮至乾燥。
在下文中將闡述代表性實例之合成。
實例1 pE-R-P-R-L-K-H-F-G-P-Nle-D-苯乙胺(內醯胺K6-D12)之合成
‧中間體1a之製備 (直鏈肽之組裝)
在PreludeTM肽合成器上對苯乙胺-BAL-PS樹脂(167 mg,0.100 mmol)實施固相肽合成。偶聯係如下實施：
‧中間體1b之製備 (自樹脂解離並伴隨保護基團去除，然後純化)
將95% TFA/EDT/TIS水溶液混合物(95：2.5：2.5)(2 mL)添加至中間體1a(0.1 mmol)中並在室溫下將懸浮液震盪2.5 h。濾出解離溶液，並添加新製備之解離溶液(2 mL)。在室溫下將懸浮液震盪45 min，然後濾出解離溶液。添加新製備之溶液(2 mL)並在室溫下將懸浮液震盪45 min。濾出解離溶液並用95% TFA水溶液(1 mL)洗滌樹脂。將合併之解離溶液傾倒至冷庚烷/二乙基醚之混合物(1：1)(35 mL)上，得到沈澱。對懸浮液實施離心並傾倒出上清液。用冷庚烷/二乙基醚(1：1)(20 mL)洗滌殘餘物，對懸浮液實施離心並傾倒出上清液。在高真空中乾燥固體。藉由製備型HPLC來純化粗製物並自ACN/H2O凍乾，得到呈白色固體形式之中間體1b，其為不同品質之兩種批料：批料A(35.9 mg(純度98%),0.018 mmol)及批料B(52.9 mg(純度80%),0.021 mmol)。
‧實例1之製備 (環化及純化)
按照同一方案分別處理來自先前步驟之該兩種批料：
批料A：在室溫下將該肽(35.9 mg(純度98%)，0.018 mmol)及HATU(10.0 mg,0.026 mmol)於NMP(18 mL)及DIPEA(9.2 μL,0.053 mmol)中之溶液攪拌2 h。
批料B：在室溫下將該肽(52.9 mg(純度80%),0.021 mmol)及HATU(14.5 mg,0.038 mmol)於NMP(26 mL)及DIPEA(13.0 μL,0.076 mmol)中之溶液攪拌2 h。
將每一批料在真空中濃縮至乾燥。藉由製備型HPLC來分離產物。合併該兩次純化之純淨流份並自ACN/H2O凍乾，得到呈白色固體形式之實例1(52.0 mg,0.025 mmol)。
藉由分析型HPLC(分析方法A：tR=4.16 min)及UPLC-MS(分析方法C；量測值：[M+3]3+=511.2；計算值：[M+3]3+=511.3)來分析純淨產物。
實例5 pE-R-P-R-L-K-F-K-G-P-Nle-F(內醯胺K6-C-末端)之合成
‧中間體5a之製備 (利用Fmoc-F-OH之2-氯三苯氯甲烷樹脂之負載、Fmoc去除及樹脂之負載之測定)
以與上文所述一般程序類似之方式使2-氯三苯氯甲烷樹脂(10.0 g,16.0 mmol)與Fmoc-F-OH(6.24 g,32.0 mmol)於DCM(100 mL)及DIPEA(11.2 mL,64.0 mmol)中之溶液反應，得到中間體5a(12.8 g，負載=0.79 mmol/g)。
‧中間體5b之製備 (直鏈肽之組裝)
在PreludeTM肽合成器上對中間體5a(0.100 mmol)實施固相肽合 成。偶聯係如下實施：
‧中間體5c之製備 (ivDde之去除及自樹脂解離)
將中間體5b(0.100 mmol)用肼一水合物(0.081 mL,1.67 mmol)於DMA(4 mL)中之溶液處理10 min(共計6次)。然後將該樹脂用肼一水合物(0.081 mL,1.67 mmol)於THF(4 mL)中之溶液處理20 min(共計3次)。用DCM(3×)洗滌樹脂。將HFIP/DCM(30：70)(5 mL)添加至該樹脂(0.100 mmol)中並在室溫下將懸浮液攪拌1.5 h。濾出解離溶液並添加新製備之HFIP/DCM(30：70)(5 mL)。在室溫下將懸浮液攪拌30 min。濾出解離溶液。用DCM(2×5 mL)洗滌樹脂。將合併之解離溶液及洗滌溶液在真空中濃縮至乾燥。自tBuOH/H2O(1：1)凍乾殘餘物，得到中間體5c(187 mg,0.090 mmol)。
‧實例5之製備 (環化及保護基團之去除)
用2,6-二甲基吡啶(0.210 mL,1.80 mmol)處理中間體5c(187 mg, 0.090 mmol)、HATU(44.6 mg,0.117 mmol)及HOAt(16.0 mg,0.117 mmol)於DMF(35 mL)中之溶液並在室溫下將反應攪拌2 h。將反應混合物在真空中濃縮至乾燥。將殘餘物溶解於95% TFA/EDT/TIS水溶液(95：2.5：2.5)(5 mL)中並在室溫下將該溶液攪拌2.5 h。將解離溶液傾倒至冷庚烷/二乙基醚(1：1)(30 mL)上，得到沈澱。對懸浮液實施離心並傾倒出上清液。用冷庚烷/二乙基醚(1：1)(10 mL)洗滌殘餘物，對懸浮液實施離心並傾倒出上清液。將洗滌步驟重複一次。在高真空中乾燥殘餘物。藉由製備型HPLC來分離產物並自ACN/H2O凍乾，得到呈白色固體形式之實例5(41.4 mg,0.023 mmol)。
藉由分析型HPLC(分析方法A：tR=3.70 min)及UPLC-MS(分析方法C；量測值：[M+3]3+=484.5；計算值：[M+3]3+=484.6)來分析純淨產物。
實例7 Q-R-P-R-L-C-F-K-G-P-Nle-C-F-G-G(內醯胺N-末端-C-末端)之合成
‧中間體7a之製備 (利用Fmoc-Gly-OH之2-氯三苯氯甲烷樹脂之負載、Fmoc去除及該樹脂之負載之測定)
以與上文所述一般程序類似之方式使2-氯三苯氯甲烷樹脂(2.00 g,3.20 mmol)與Fmoc-Gly-OH(0.476 g,1.60 mmol)於DCM(20 mL)及DIPEA(2.24 mL,12.8 mmol)中之溶液反應，得到中間體7a(2.22 g；負載=0.68 mmol/g)。
‧中間體7b之製備 (直鏈肽之組裝及Fmoc去除)
在PreludeTM肽合成器上對中間體7a(147 mg,0.100 mmol)實施固相肽合成。偶聯係如下實施：
在組裝肽後，藉由用六氫吡啶/DMA(1：4)重複性處理來去除Fmoc。用DMA洗滌樹脂，得到中間體7b(0.100 mmol)。
‧中間體7c之製備 (自樹脂解離HFIP)
將HFIP/DCM(30：70)(3 mL)添加至中間體7b(0.100 mmol)中並在室溫下將懸浮液震盪1.5 h。濾出解離溶液並添加新製備之HFIP/DCM(30：70)(3 mL)。在室溫下將懸浮液震盪30 min。濾出解離溶液。用DCM(2×3 mL)洗滌樹脂。將合併之解離溶液及洗滌溶液在真空中濃 縮至乾燥。將殘餘物自tBuOH/H2O(1：1)凍乾，得到中間體7c(203 mg,0.067 mmol)。
‧中間體7d之製備 (主鏈環化)
用2,6-二甲基吡啶(0.157 ml,1.35 mmol)處理中間體7c(203 mg,0.067 mmol)、HATU(33.3 mg,0.088 mmol)及HOAt(11.9 mg,0.088 mmol)於DMF(40 mL)中之溶液並在室溫下將反應攪拌2 h。將反應混合物在真空中濃縮至乾燥，得到中間體7d(0.067 mmol)。
‧中間體7e之製備 (保護基團之去除，然後純化)
將95% TFA/EDT/TIS水溶液混合物(95：2.5：2.5)(3 mL)添加至中間體7d(0.067 mmol)中並在室溫下將懸浮液震盪2.5 h。將溶液傾倒至冷庚烷/二乙基醚(1：1)之混合物(30 mL)上，得到沈澱。對懸浮液實施離心並傾倒出上清液。用冷庚烷/二乙基醚(1：1)(10 mL)洗滌殘餘物，對懸浮液實施離心並傾倒出上清液。將洗滌步驟重複一次。在高真空中乾燥固體。藉由製備型HPLC來純化粗製物並自ACN/H2O凍乾，得到呈白色固體形式之中間體7e(33.6 mg,0.017 mmol)。
‧實例7之製備 (環化及純化)
將中間體7e(33.6 mg,0.017 mmol)溶解於H2O/DMSO(9：1)(30 mL)中。在室溫下將反應混合物攪拌40 h，然後在真空中濃縮至乾燥。藉由製備型HPLC來純化粗製物並自ACN/H2O凍乾，得到呈白色固體形式之實例7(21.0 mg；0.010 mmol)。
藉由分析型HPLC(分析方法A：tR=3.85 min)及UPLC-MS(分析方法C；量測值：[M+3]3+=553.6；計算值：[M+3]3+=553.6)來分析純淨產物。
實例8 pE-R-P-R-L-C-H-K-G-P-Nle-C-F-OH(二硫鍵C6-C12)之合成
‧中間體8a之製備 (利用Fmoc-F-OH之2-氯三苯氯甲烷樹脂之負載、Fmoc去除及樹脂之負載之測定)
用DCM(3×)洗滌2-氯三苯氯甲烷樹脂(40.0 g,64.0 mmol)。添加Fmoc-F-OH(24.8 g,64.0 mmol)於DCM(400 mL)及DIPEA(44.7 mL,256 mmol)中之溶液並在室溫下將懸浮液震盪22 h。用DCM/MeOH/DIPEA(17：2：1)(3×)、DCM(3×)、DMA(3×)、DCM(3×)充分洗滌樹脂。
然後用六氫吡啶/DMA混合物(1：4)(400 mL)將樹脂處理4次(每次10 min)，隨後用DMA(2×180 ml)洗滌。收集六氫吡啶/DMA溶液及DMA洗滌溶液用以測定樹脂之負載。用MeOH將1 mL合併之溶液稀釋至500 mL並量測在299.8 nm處之UV吸收度，A=0.368。此相當於46.2 mmol之Fmoc量。
用DCM(3×)、DMA(3×)、DCM(3×)充分洗滌樹脂並在真空中乾燥，得到中間體8a(50.7 g；負載=0.91 mmol/g)。
‧中間體8b之製備 (直鏈肽之組裝)
在PreludeTM肽合成器上對中間體8a(2.64 g,2.40 mmol)實施固相肽合成。偶聯係如下實施：
‧中間體8c之製備 (自樹脂解離並伴隨保護基團去除)
用DCM(4×)仔細地洗滌中間體8b(2.40 mmol)。添加95% TFA/EDT/TIS水溶液混合物(95：2.5：2.5)(50 mL)並在室溫下將懸浮液震盪1 h。濾出解離溶液，並添加新製備之解離溶液(35 mL)。在室溫下將懸浮液震盪1 h，然後濾出解離溶液。添加新製備之溶液(35 mL)並在室溫下將懸浮液震盪1 h。濾出解離溶液。將合併之解離溶液緩慢地傾倒至經攪拌冷庚烷/二乙基醚混合物(1：1)(500 mL)上，得到沈 澱。在室溫下將懸浮液攪拌2 h且然後使沈澱沉降。用玻璃料吸出上清液。用冷庚烷/二乙基醚(1：1)(2×100 mL)洗滌殘餘物，用玻璃料吸出上清液。在高真空中乾燥固體，得到呈灰白色固體形式之中間體8c(3.75 g,1.88 mmol)。
‧實例8之製備 (環化及純化)
將中間體8c(3.75 g,1.88 mmol)溶解於H2O(375 mL)中。將50 mM I2於AcOH中之溶液(45.1 mL,2.26 mmol)一次性添加至經攪拌溶液中並在室溫下將溶液攪拌10 min。添加存於H2O中之0.5 M抗壞血酸(5.64 mL,2.82 mmol)以淬滅過量I2。將溶液濃縮至近乎乾燥。該反應係以兩份實施：0.188 mmol規模及1.69 mmol規模。合併粗製物用於純化。藉由製備型HPLC來純化粗製物並自ACN/H2O凍乾，得到呈白色固體形式之實例8(1.53 g,0.767 mmol)。
藉由分析型HPLC及UPLC-MS(分析方法B；量測值：[M+3]3+=512.4；計算值：[M+3]3+=512.6)來分析純淨產物(分析方法C：tR=3.43 min)。
或者，將實例8之粗製多肽溶解於水中(500 mL水/mmol多肽)並借助離子交換樹脂轉化成乙酸鹽(即Amberlite IRA-67(乙酸鹽形式)(200 g/mmol多肽)，並藉由製備型HPLC(購自Daisogel之C8經改質反向矽膠，梯度：ACN/H2O：3% ACN與97%[0.3%乙酸/水混合物]直至12% ACN與88%[0.3%乙酸/水混合物])來純化並凍乾，得到呈白色固體形式之實例8之乙酸鹽(產率60%至100%)。
該鹽之化學計量係基於乙酸含量(離子層析)及水含量之分析來評價且經測定介於1：3與1：4(多肽：乙酸酯)之間。
實例26 pE-R-P-R-L-C-H-K-G-P-Nle-C-K(月桂醯基)-OH(二硫鍵C6-C12)之合成
‧中間體26a之製備 (使2-氯三苯氯甲烷樹脂之負載Fmoc-K(ivDde)-OH、Fmoc去除及樹脂之負載之測定)
以與上文所述一般程序類似之方式使2-氯三苯氯甲烷樹脂(1.00 g,1.60 mmol)與Fmoc-K(ivDde)-OH(1.84 g,3.20 mmol)於DCM(10 mL)及DIPEA(1.12 mL,6.40 mmol)中之溶液反應，得到中間體26a(1.39 g；負載=0.75 mmol/g)。
‧中間體26b之製備 (直鏈肽之組裝)
在PreludeTM肽合成器上對中間體26a(134 mg,0.100 mmol)實施固相肽合成。偶聯係如下實施：
‧中間體26c之製備 (ivDde之去除及月桂酸之偶聯)
用THF(3×)洗滌中間體26b(0.100 mmol)。添加肼一水合物(0.245 ml,5.00 mmol)於THF(12 mL)中之溶液並在室溫下將懸浮液震盪1 h。濾出溶液。實施此步驟2次。用DMA(3×)、DCM(3×)、DMA(2x)、DCM(5x)及DMA(3×)洗滌樹脂。將月桂酸(100 mg,0.500 mmol)及HCTU(207 mg,0.500 mmol)溶解於NMP(3 mL)及DIPEA(0.087 ml,0.500 mmol)中。在5 min活化後，將溶液添加至樹脂中並在室溫下將懸浮液震盪16 h。濾出反應混合物並用DMA(3×)、DCM(3×)、DMA(3×)、DCM(5x)洗滌樹脂，得到中間體26c。
‧中間體26d之製備 (自樹脂解離並伴隨保護基團去除，然後純化)
將95% TFA/EDT/TIS水溶液混合物(95：2.5：2.5)(3 mL)添加至中間體26c(0.100 mmol)中並在室溫下將懸浮液震盪2 h。濾出解離溶液，並添加新製備之解離溶液(3 mL)。在室溫下將懸浮液震盪1 h，然後濾 出解離溶液。添加新製備之溶液(3 mL)並在室溫下將懸浮液震盪1 h。濾出解離溶液。將合併之解離溶液傾倒至冷庚烷/二乙基醚混合物(1：1)(35 mL)上，得到沈澱。對懸浮液實施離心並傾倒出上清液。用冷庚烷/二乙基醚(1：1)(10 mL)洗滌殘餘物，對懸浮液實施離心並傾倒出上清液。在高真空中乾燥固體。
藉由製備型HPLC來純化粗製物並自ACN/H2O凍乾，得到呈白色固體形式之中間體26d(74.1 mg,0.034 mmol)。
‧實例26之製備 (環化及純化)
將中間體2d(74.1 mg,0.034 mmol)溶解於H2O/DMSO(9：1)(74 mL)中。在室溫下將反應混合物攪拌40 h，然後在真空中濃縮至乾燥。藉由製備型HPLC來純化粗製物並自ACN/H2O凍乾，得到呈白色固體形式之實例26(60.0 mg；0.028 mmol)。
藉由分析型HPLC(分析方法A：tR=5.11 min)及UPLC-MS(分析方法B；量測值：[M+3]3+=567.0；計算值：[M+3]3+=567.0)來分析純淨產物。
實例28 pE-R-P-C-L-C-C-K-G-P-Nle-C-F-OH(二硫鍵C4-C7及C6-C12)之合成
‧中間體28a之製備 (利用Fmoc-F-OH之2-氯三苯氯甲烷樹脂之負載、Fmoc去除及樹脂之負載之測定)
以與上文所述一般程序類似之方式使2-氯三苯氯甲烷樹脂(10.0 g,16.0 mmol)與Fmoc-F-OH(6.20 g,16.0 mmol)於DCM(100 mL)及DIPEA(11.2 mL,64.0 mmol)中之溶液反應，得到中間體28a(11.6 g，負載=0.87 mmol/g)。
‧中間體28b之製備 (直鏈肽之組裝)
在PreludeTM肽合成器上對中間體28a(115 mg,0.100 mmol)實施固相肽合成。偶聯係如下實施：
‧中間體28c之製備 (自樹脂解離並伴隨部分保護基團去除)
用DCM(4×)仔細地洗滌中間體28b(0.100 mmol)。添加95% TFA/EDT水溶液混合物(4：1)(0.750 mL)並在室溫下將懸浮液震盪1 h。將TFA/H2O(95：5)(2.18 mL)與TIS(75 μL)之混合物添加至懸浮液中並繼續在室溫下震盪1 h。濾出解離溶液並將95% TFA/EDT/TIS水溶液混合物(95：2.5：2.5)(3 mL)添加至樹脂中。在室溫下將懸浮液震盪1 h，濾出解離溶液。添加新製備之溶液(3 mL)並在室溫下將懸浮液震盪1 h。濾出解離溶液。將合併之解離溶液傾倒至冷庚烷/二乙基醚(1：1)(35 mL)上，得到沈澱。對懸浮液實施離心並傾倒出上清液。用冷庚烷/二乙基醚(1：1)(10 mL)洗滌殘餘物，對懸浮液實施離心並傾倒出上清液。將洗滌步驟重複一次。在高真空中乾燥殘餘物。藉由製備型HPLC來純化粗製產物並自ACN/H2O凍乾，得到呈白色固體形式之中間體28c(51.1 mg,0.028 mmol)。
‧實例28之製備 (兩個二硫鍵之一鍋式形成)
將中間體28c(51.1 mg,0.028 mmol)溶解於AcOH(48 mL)及H2O(12 mL)中。添加I2於AcOH中之50 mM溶液(1.12 mL,56 μmol)並在室溫下攪拌該黃色溶液。經4 h逐份添加存於AcOH中之另50 mM I2(5.61 mL,0.281 mmol)。21 h後，將反應混合物在真空中濃縮至2 mL並添加存於H2O(6 mL)中之1 M抗壞血酸以淬滅過量I2。藉由製備型HPLC來分離產物並自ACN/H2O凍乾，得到呈白色固體形式之實例28(19.3 mg,0.012 mmol)。
藉由分析型HPLC(分析方法A：tR=4.16 min)及UPLC-MS(分析方法C；量測值：[M+2]2+=723.7；計算值：[M+2]2+=723.8)來分析純淨產物。
實例62 pE-R-P-R-L-C-H-K-G-P-Nle-C-F-NH 2 (二硫鍵C6-C12)之合成
‧中間體62a之製備 (直鏈肽之組裝)
在PreludeTM肽合成器上對經Fmoc保護之Rink-醯胺-AM-PS-樹脂 (217 mg,0.100 mmol)實施固相肽合成。偶聯係如下實施：
‧中間體62b之製備 (自樹脂解離並伴隨保護基團去除)
將95% TFA/EDT/TIS水溶液混合物(95：2.5：2.5)(3 mL)添加至中間體62a(0.1 mmol)中並在室溫下將懸浮液震盪1.5 h。濾出解離溶液，並添加新製備之解離溶液(2 mL)。在室溫下將懸浮液震盪45 min，然後濾出解離溶液。添加新製備之溶液(2 mL)並在室溫下將懸浮液震盪45 min。將合併之解離溶液傾倒至冷庚烷/二乙基醚混合物(1：1)(35 mL)上，得到沈澱。對懸浮液實施離心並傾倒出上清液。用冷庚烷/二乙基醚(1：1)(10 mL)洗滌殘餘物，對懸浮液實施離心並傾倒出上清液。在高真空中乾燥固體。粗製產物中間體62b未經純化即用於下一步驟。
‧實例62之製備 (環化及純化)
將中間體62b(0.100 mmol)溶解於H2O(20 mL)中。將50 mM I2於AcOH中之溶液(2.4 mL,0.120 mmol)一次性添加至經攪拌溶液中並在室溫下將溶液攪拌30 min。添加存於H2O中之0.5 M抗壞血酸(0.30 mL,0.300 mmol)以淬滅過量I2。將溶液濃縮至近乎乾燥。藉由製備型HPLC來純化粗製物並自ACN/H2O凍乾，得到呈白色固體形式之實例62(50.5 mg,0.025 mmol)。
藉由分析型HPLC(分析方法C：tR=3.22 min)及UPLC-MS(分析方法C；量測值：[M+3]3+=512.3；計算值：[M+3]3+=512.3)來分析純淨產物。
其他實例係以類似方式合成：
‧實例2至4係以與實例1類似之方式合成。
‧實例6係以與實例5類似之方式合成。
‧實例9至25及27係以與實例26類似之方式合成。
‧實例29係以與實例28類似之方式合成。
‧實例30至61係以與實例8類似之方式合成。
‧實例63係以與實例62類似之方式合成。
實例64：在6位與12位[C6-C12]處之半胱胺酸之間具有-S-CH2-C(O)CH2-S-鍵聯之pE-R-P-R-L-C-H-K-G-P-Nle-C-F-OH 分析方法 方法D(HRMS)；
洗脫液A：水+0.05%甲酸+3.75 mM乙酸銨，洗脫液B：乙腈+0.04%甲酸。
梯度：在4.4 min內自2%至98% B-流速1.0 ml/min。管柱：Acquity CSH 1.7μm 2.1*50mm 50℃
在室溫下將實例8((S)-2-((3S,6R,11R,14S,17S,25aS)-14-((1H-咪唑-5-基)甲基)-17-(4-胺基丁基)-3-丁基-11-((S)-2-((S)-5-胍基-2-((S)-1-((S)-5-胍基-2-((S)-5-側氧基吡咯啶-2-甲醯胺基)戊醯基)吡咯啶-2-甲醯胺基)戊醯胺基)-4-甲基戊醯胺基)-1,4,12,15,18,21-六側氧基二十二氫-1H-吡咯并[2,1-j][1,2,5,8,11,14,17,20]二硫雜六氮雜環二十三烷-6-甲醯胺基)-3-苯基丙酸)(12 mg,6.76 μmol)溶解於其中添加有TCEP HCl(叁(2-羧基乙基)膦)(2.91 mg,10.13 μmol)之pH 6.5 50 mM磷酸鈉緩衝液(1.5 ml)中。在室溫下將此反應混合物攪拌1 h。在室溫下向上文溶液中添加1,3-二氯丙-2-酮(4.29 mg,0.034 mmol)，在室溫下將其攪拌30 min。以具有0.1% TFA之15%至60% MeCN/水洗脫來實施RP-HPLC，得到實例64((S)-2-((3S,6R,14R,17S,20S,28aS)-17-((1H-咪唑- 5-基)甲基)-20-(4-胺基丁基)-3-丁基-14-((S)-2-((S)-5-胍基-2-((S)-1-((S)-5-胍基-2-((S)-5-側氧基吡咯啶-2-甲醯胺基)戊醯基)吡咯啶-2-甲醯胺基)戊醯胺基)-4-甲基戊醯胺基)-1,4,10,15,18,21,24-七側氧基二十六氫吡咯并[2,1-i][1,23,4,7,10,13,16,19]二硫雜：六氮雜環二十六烷-6-甲醯胺基)-3-苯基丙酸)(6 mg,2.93 μmol，產率43.4%)。HRMS(方法D)[M+1]；1590.7911(觀察值)，1590.7912(預期值)。滯留時間；3.08 min。
實例65：在6位與12位[C6-C12]處之2個半胱胺酸之間具有單硫鍵聯之pE-R-P-R-L-C-H-K-G-P-Nle-C-F-OH
在室溫下將實例8(S)-2-((3S,6R,11R,14S,17S,25aS)-14-((1H-咪唑-5-基)甲基)-17-(4-胺基丁基)-3-丁基-11-((S)-2-((S)-5-胍基-2-((S)-1- ((S)-5-胍基-2-((S)-5-側氧基吡咯啶-2-甲醯胺基)戊醯基)吡咯啶-2-甲醯胺基)戊醯胺基)-4-甲基戊醯胺基)-1,4,12,15,18,21-六側氧基二十二氫-1H-吡咯并[2,1-j][1,2,5,8,11,14,17,20]二噻六氮雜環二十三烷-6-甲醯胺基)-3-苯基丙酸TFA鹽(30 mg,0.15 mmol)及N,N,N',N',N",N"-六甲基膦三胺(12.3 mg,0.75 mmol)於pH 9.2 PBS緩衝劑(1 mL)中之混合物攪拌3天。藉由製備型HPLC(Sunfire C18，存於水/MeCN中之0.1% TFA)將反應混合物純化2次並將產物流份凍乾成白色粉末(實例65：4 mg,13.4%)。[M+2H]2+(計算值)=752.88,[M+2H]2+(量測值)=752.40,[M+3H]3+(計算值)=502.26,[M+3H]3+(量測值)=501.94。HPLC(分析方法C),Tr min=6.93。
實例66：在6位與12位[C6-C12]處之2個半胱胺酸之間具有-S-CH2-C(=Z)-CH2-S-鍵聯之pE-R-P-R-L-C-H-K-G-P-Nle-C-F-OH且Z係：
分析方法 方法D (HRMS)；
洗脫液A：水+0.05%甲酸+3.75 mM乙酸銨，洗脫液B：乙腈+0.04%甲酸。
梯度：在4.4 min內自2%至98% B-流速1.0 ml/min。管柱：Acquity CSH 1.7 μm 2.1*50 mm 50℃
在室溫下向實例64((S)-2-((3S,6R,14R,17S,20S,28aS)-17-((1H-咪唑-5-基)甲基)-20-(4-胺基丁基)-3-丁基-14-((S)-2-((S)-5-胍基-2-((S)-1-((S)-5-胍基-2-((S)-5-側氧基吡咯啶-2-甲醯胺基)戊醯基)吡咯啶-2-甲醯胺基)戊醯胺基)-4-甲基戊醯胺基)-1,4,10,15,18,21,24-七側氧基二十六氫吡咯并[2,1-i][1,23,4,7,10,13,16,19]二噻六氮雜環二十六烯酸-6-甲醯胺基)-3-苯基丙酸)(11.5 mg,5.62 μmol)及(S)-1-(胺基氧基)-19-羧基- 2,7,16,21-四側氧基-9,12-二氧雜-3,6,15,20-四氮雜三十八烷-38-酸化合物與2,2,2-三氟乙酸(1：1)(9.19 mg,0.011 mmol)於pH 6.0 100 nM磷酸鈉緩衝液(1 ml)中之溶液中添加苯胺(2.051 μl,0.022 mmol)。添加DMSO(50 μl)得到均勻溶液。在室溫下將此反應混合物攪拌2 h。以具有0.1% TFA之15%至60% MeCN/水洗脫來實施RP-HPLC，得到實例66(1-((Z)-((3S,6R,14R,17S,20S,28aS)-17-((1H-咪唑-5-基)甲基)-20-(4-胺基丁基)-3-丁基-6-((S)-1-羧基-2-苯基乙基胺基甲醯基)-14-((S)-2-((S)-5-胍基-2-((S)-1-((S)-5-胍基-2-((S)-5-側氧基吡咯啶-2-甲醯胺基)戊醯基)吡咯啶-2-甲醯胺基)戊醯胺基)-4-甲基戊醯胺基)-1,4,15,18,21,24-六側氧基二十二氫吡咯并[2,1-i][1,23,4,7,10,13,16,19]二噻六氮雜環二十六烯-10(1H,9H,11H)-亞基)胺基氧基)-19-羧基-2,7,16,21-四側氧基-9,12-二氧雜-3,6,15,20-四氮雜三十八烷-38-酸)(4.5 mg,1.646 μmol，產率29.3%)。HRMS(方法D)[(M+3)/3]；759.7487(觀察值)，759.7462(預期值)。滯留時間：4.12 min。
(S)-1-(胺基氧基)-19-羧基-2,7,16,21-四側氧基-9,12-二氧雜-3,6,15,20-四氮雜三十八烷-38-酸化合物與2,2,2-三氟乙酸(1：1)之合成：
使存於100 mL玻璃器皿中之1-氯三苯甲基氯樹脂(1.55 mmol/g)(0.500 g,0.775 mmol)在DCM(20 ml)中溶脹30 min並對其實施排液。將2-(胺基氧基)乙酸半鹽酸鹽(0.338 g,3.10 mmol)及DIPEA(1.354 ml,7.75 mmol)於NMP(7 ml)/DCM(4 ml)中之懸浮液添加至樹脂中，將其震盪5 h。排出溶劑。分別用DCM/MeOH/DIPEA(17/2/1,40 mL)、DCM(50 mL)、NMP(50 mL)、DCM(50 mL)沖洗樹脂。用KOH/NaOH乾燥所得樹脂，過夜。
使存於100 mL玻璃器皿中之樹脂(0.775 mmol)在DCM(20 ml)中溶脹30 min並對其實施排液。向2-胺基乙基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲基酯鹽酸鹽(0.081 g,0.775 mmol)、HOAt(0.422 g,3.10 mmol)及DIPEA(1.354 ml,7.75 mmol)於NMP(8 ml)中之懸浮液中添加存於NMP(2.5 ml)中之HBTU(1.176 g,3.10 mmol)，在室溫下將其震盪2 h。排出溶劑。分別用NMP(10 mL)、DCM(10 mL)沖洗樹脂。將所得樹脂乾燥過夜。
將樹脂(0.775 mmol)裝入反應容器中。將10 mL 20%六氫吡啶/NMP添加至樹脂中，在室溫下將該懸浮液攪動5 min。在排出溶劑後，添加額外10 mL 20%六氫吡啶/NMP並在室溫下攪動20 min。將HOAt(0.316 g,2.325 mmol)及1-(9H-茀-9-基)-3-側氧基-2,7,10-三氧雜-4-氮雜十二烷-12-酸(0.896 g,2.325 mmol)於NMP(8 ml)中之溶液添加至樹脂中並添加存於NMP(1 ml)中之DIC(0.362 ml,2.325 mmol)。在室溫下將反應混合物攪動2h。濾出樹脂並用NMP(10 ml)沖洗4次。將所得樹脂乾燥過夜。
將樹脂(0.775 mmol)裝入反應容器中。將10 mL 20%六氫吡啶/NMP添加至樹脂中，在室溫下將該懸浮液攪動5 min。在排出溶劑後，添加額外10 mL 20%六氫吡啶/NMP並在室溫下攪動20 min。將HOAt(0.316 g,2.325 mmol)及Fmoc-Glu-OtBu(0.989 g,2.325 mmol)於NMP(8 ml)中之溶液添加至樹脂中並添加於NMP(2.00 ml)中之DIC(0.362 ml,2.325 mmol)。在室溫下將反應混合物攪動2 h。濾出樹脂並用NMP(10 ml)沖洗4次。將所得樹脂乾燥過夜。
將樹脂(0.775 mmol)裝入反應容器中。將10 mL 20%六氫吡啶 /NMP(0.775 mmol)添加至樹脂中，在室溫下將該懸浮液攪動5 min。在排出溶劑後，添加額外10 mL 20%六氫吡啶/NMP(0.775 mmol)(0.775 mmol)並在室溫下攪動20 min。將18-第三丁氧基-18-側氧基十八烷酸(0.862 g,2.325 mmol)及HOAt(0.316 g,2.325 mmol)於NMP(8 ml)中之溶液添加至樹脂中並添加存於NMP(2.00 ml)中之DIC(0.362 ml,2.325 mmol)。在室溫下將反應混合物攪動4 h。濾出樹脂並用NMP(10 ml)沖洗4次。將所得樹脂乾燥過夜。
在室溫下將樹脂(0.775 mmol)用20 mL解離混合劑(TFA/TIPS/水=95/2.5/2.5)處理1.5 h。藉由過濾來去除樹脂並用TFA沖洗。在真空中濃縮濾液。利用C18管柱以具有0.1% TFA之15%至50% MeCN/水洗脫來實施RP-HPLC，得到(S)-1-(胺基氧基)-19-羧基-2,7,16,21-四側氧基-9,12-二氧雜-3,6,15,20-四氮雜三十八烷-38-酸與2,2,2-三氟乙酸(1：1)(207 mg,0.294 mmol，產率37.9%)。HRMS(方法D)[M+1]；704.4459(觀察值)，704.4486(預期值)。滯留時間；2.63 min。
實例1至66之多肽可如上文所述及/或藉由習用純化技術(例如溶劑萃取、管柱層析、液相層析及重結晶)之組合來純化並分離。若在上文實例中所分離之多肽係游離化合物，則可藉由已知方法將其轉化成適宜鹽。因此，可將實例1至66之肽轉化成其相應鹽(例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸酯、乳酸鹽或另一適於注射之醫藥鹽)，其中多肽：鹽之比率介於1：1至1：4之間。舉例而言，可將實例1至66之多肽溶解於水中並使用離子交換樹脂轉化成鹽。相 反，若所分離之肽係鹽，則可藉由已知方法將其轉化成游離肽或借助離子交換樹脂直接轉化成不同鹽。
已發現對於APJ受體效力而言，下文實例中之多肽具有在約0.01 nM至約1100 nM範圍內之EC50值。已發現下文實例中之多肽具有高於2分鐘、高於5分鐘、高於10分鐘、高於20分鐘、高於50分鐘及高於60分鐘之血漿穩定性。
可看到，本發明之多肽可用作APJ受體之激動劑且因此可用於治療對APJ受體之活化有反應之疾病及病況，例如本文所揭示之疾病。
儘管已如此闡述本發明之例示性實施例，但熟習此項技術者應注意，該等實例在揭示內容內僅為例示性且可在本發明之範圍內作出各種其他替換、修改及改變。因此，本發明不限於如其中所說明之特定實施例。

Claims (36)

  1. 一種具有下式I'之多肽， 其中：X1係該多肽之N-末端，且係不存在或係選自pE、R、Isn、Q、A、K及5-胺基-戊酸；X2係R、A、r、N-Me-R、K、H、hF、hK、F、E或Orn；X3係P、A、a、p、4-PhP、K、D、六氫吡啶-2-甲酸或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X7位置處之半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵；X4係R、A、r、N-Me-R、F、E或半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈與X7位置處之半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵；X5係L、Cha、A、D-L、N-Me-L、K、D、4-PhF或F；X6及X12獨立地係選自C、c、hC、D-hC、K、D、Orn、Dab或E之天然或非天然胺基酸，其中X6之側鏈與X12經由共價鍵連接在一起形成單硫鍵(-S-)、二硫鍵(-S-S-)或醯胺鍵(-NHC(O)-或-C(O)-NH-)或式-S-CH2-C(=Z)-CH2-S-之鍵聯；其中Z係O、N-O-CH2C(O)-L1-R1或N-NH-CH2C(O)-L1-R1，其中R1係脂肪酸衍生物且L1係含有一或多個胺基酸及/或一或多個-NH-C2-6-伸烷基-NH-單元之連接體；或者X6係K，X13不存在且X12係F或f，其中X12之C-末端與X6之胺基側鏈形成醯胺鍵；X7係H、h、A、N-Me-A、a、Aib、K、Nal、F、P、Dap、N、E或半胱胺酸，其中該半胱胺酸之側鏈與X3位置處之半胱胺 酸之側鏈或與X4位置處之半胱胺酸之側鏈形成二硫鍵；X8係K、k、F、f、A、hF、N-Me-R、E或4-胺基-Isn；X9係G、N-Me-G、A、D、L、R或Aib；X10係P、A、p、4-PhP或六氫吡啶-2-甲酸，X11係M、D-Nle、Nle、N-Me-Nle、M(O)、A、F、Y、L、K、3-PyA或Cha；且X13係C-末端且係不存在或係選自F、f、N-Me-F、Nal、D-Nal、3-Br-F、(S)-β-3-F、I、A、a、K、Dap、H及E；其中：Nle係L-正白胺酸；D-hC係D-高半胱胺酸hC係L-高半胱胺酸；hF係L-高苯丙胺酸；hK係L-離胺酸；Nal係L-萘基丙胺酸；Orn係鳥胺酸；Aib係α-胺基異丁酸；Dab係(S)-二胺基丁酸；Dap係(S)-2,3-二胺基丙酸；M(O)係甲硫胺酸碸；Cha係(S)-β-環己基丙胺酸；4-胺基-Isn係4-胺基六氫吡啶-4-甲酸；Isn係六氫吡啶-4-甲酸(isonipecotinoyl)；pE係L-焦麩胺酸；3-PyA係3-(3-吡啶基)-L-丙胺酸；4-PhF係4-苯基-L-苯基丙胺酸； 其中該N-末端與該C-末端視情況與1個、2個、3個或4個甘胺酸胺基酸一起形成環；且其中K、Orn、Dab、Dap、hK或4-胺基-Isn之側鏈中之胺基視情況經由醯胺鍵連接至親脂性基團；或該多肽之醯胺、酯或鹽；或實質上與其等效之多肽。
  2. 一種具有下式之多肽， X1不存在，係pE、R、Q或Isn；X5係L或Cha；X7係H、Aib、F、K(月桂醯基)或K(棕櫚醯基)；X8係K、F或4-胺基-Isn；X9係G或Aib；X11係Nle或Cha；X13不存在，或係F、f、K(月桂醯基)、K(棕櫚醯基)；X6及X12獨立地係選自C、c、hC、D-hC、K、D、Orn、Dab或E之天然或非天然胺基酸，其中X6之側鏈與X12經由共價鍵連接在一起形成二硫鍵或醯胺鍵；且其中該N-末端及該C-末端視情況與1個、2個、3個或4個甘胺酸胺基酸一起形成環；或該多肽之醯胺、酯或鹽；或實質上與其等效之多肽。
  3. 如請求項1或2之多肽，其中：X6及X12獨立地選自K、Orn、Dab、E及D，且其中X6之側鏈與X12一起形成醯胺鍵；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  4. 如請求項1或2之多肽，其中：X6及X12獨立地係C，其中X6之側鏈與X12一起形成二硫鍵；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  5. 如請求項1或2之多肽，其具有式III： 或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  6. 如請求項1或2之多肽，其具有式IV： 或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  7. 如請求項1或2之多肽，其具有式V： 或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  8. 如請求項1之多肽，其具有式VI： 或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  9. 如請求項1之多肽，其具有式VII： 或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  10. 如請求項1或2之多肽，其具有式VIII： 其中X1之N-末端及X13之C-末端與連接體L一起形成環；且其中L係(G)r，G係甘胺酸且r係1、2、3或4；或該多肽之鹽。
  11. 如請求項10之多肽，其中X1係Q，X13係F且r係2；或該多肽之鹽。
  12. 如請求項1之多肽，其中X6係K，X13不存在且X12係F或f，其中X12之該C-末端與X6之該胺基側鏈形成醯胺鍵；且其具有式IX： 或該多肽之酯、醯胺或鹽。
  13. 如請求項1、2、8、9及12中任一項之多肽，其中X1係pE；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  14. 如請求項1、2、8、9及12中任一項之多肽，其中X1不存在；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  15. 如請求項14之多肽，其中該N-末端係醯胺；或該多肽之鹽。
  16. 如請求項15之多肽，其中該N-末端係式-NHR之醯胺且R係乙醯基、苯甲醯基、苯甲醯甲基、琥珀醯基、辛醯基、4-苯基丁醯基、4-Cl-Ph-(CH2)3C(O)-或Ph-CH2CH2NHC(O)-；或該多肽之鹽。
  17. 如請求項1、2、8、9及12中任一項之多肽，其中該N-末端係式NHR1之醯胺，其中R1係CH3C(O)-、CH3-(O-CH2CH2)m-C(O)-、棕櫚醯基(O2Oc)p、肉豆蔻醯基(O2Oc)p、月桂醯基(O2Oc)p或Ph- CH2CH2NHC(O)-；且其中p係1至4之整數；m係1至12之整數；月桂醯基(O2Oc)係C11H23C(O)NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)-；肉豆蔻醯基(O2Oc)係C13H27C(O)NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)-；棕櫚醯基(O2Oc)係C15H31C(O)NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)-；或該多肽之鹽。
  18. 如請求項1、2、8及9中任一項之多肽，其中X13係F；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  19. 如請求項1、2、8及9中任一項之多肽，其中X13不存在；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  20. 如請求項19之多肽，其中該C-末端係醯胺；或該多肽之鹽。
  21. 如請求項20之多肽，其中該C-末端係式-C(O)-R2之醯胺，且R2係-NH2、-NH-Me、-NH-NHBn或-NH-(CH2)2-Ph；或該多肽之鹽。
  22. 如請求項1、2、8、9及12中任一項之多肽，其中X5係L；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  23. 如請求項1、2及12中任一項之多肽，其中X7係H；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  24. 如請求項1、2、8、9及12中任一項之多肽，其中X8係K；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  25. 如請求項1、2、8、9及12中任一項之多肽，其中X9係G；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  26. 如請求項1、2、8、9及12中任一項之多肽，其中X11係Nle；或 該多肽之醯胺、酯或鹽。
  27. 如請求項1之多肽，其係選自：pE-R-P-R-L-K*-H-F-G-P-Nle-D*-苯乙胺，pE-R-P-R-L-K*-H-F-G-P-Nle-E*-苯乙胺，pE-R-P-R-L-Orn*-H-F-G-P-Nle-D*-苯乙胺，pE-R-P-R-L-Dab*-H-F-G-P-Nle-D*-苯乙胺，pE-R-P-R-L-K*-F-K-G-P-Nle-F*，pE-R-P-R-L-K*-F-K-G-P-Nle-f*，**Q-R-P-R-L-C*-F-K-G-P-Nle-C*-F-G-G**，pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-Aib-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-Aib-K-G-P-Nle-C*-f-OH，H-Isn-R-P-R-L-C*-Aib-K-G-P-Nle-C*-f-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-苯乙胺，pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-f-OH，pE-R-P-R-Cha-C*-H-K-G-P-Cha-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-F-K-G-P-Nle-C*-F-OH，H-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，H-R-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，H-Isn-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-F-G-P-Nle-C*-苯乙胺，pE-R-P-R-L-C*-H-K-Aib-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-(4-NH-Isn)-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-K(棕櫚醯基)-OH，pE-R-P-R-L-C*-K(棕櫚醯基)-K-G-P-Nle-C*-F-OH，棕櫚醯基-O2Oc-Q-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH， 月桂醯基-O2Oc-Q-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-K(月桂醯基)-OH，pE-R-P-R-L-C*-K(月桂醯基)-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-C**-L-C*-C**-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-C**-R-L-C*-C**-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-r-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-F-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-E-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-p-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-K-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-D-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-F-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-K-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-E-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-K-D-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-E-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-(4-PhF)-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-D-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-E-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-K-L-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-K-R-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-(六氫吡啶-2-甲酸)-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-(3-PyA)-C-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-H-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-E-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-NH 2 ， pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-NH 2 ，pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-hC*-F-OH，pE-R-P-R-L-hC*-H-K-G-P-Nle-hC*-F-OH，pE-R-P-R-L-c*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-(D-hC)*-F-OH，pE-R-P-R-L-(D-hC)*-H-K-G-P-Nle-(D-hC)*-F-OH，肉豆蔻醯基O2OcO2OcQ-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-f-OH，肉豆蔻醯基O2OcO2OcO2OcQ-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-f-OH，肉豆蔻醯基O2OcO2OcO2OcO2OcQ-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C-f-OH，pE-R-P-R-L-C*H-K-G-P-Nle-c*-F-OH，pE-R-P-R-L-c*-H-K-G-P-Nle-c*-F-OH，及pE-R-P-R-L-C*-H-K(Myr)-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C***-H-K-G-P-Nle-C***-F-OH；其中用「*」標記之2個胺基酸分別代表經由其側鏈或末端形成二硫鍵或醯胺鍵之胺基酸，且其中用「**」標記之2個胺基酸代表經由其側鏈形成二硫鍵或經由其末端形成醯胺鍵之胺基酸；且其中用「***」標記之2個胺基酸代表經由其側鏈形成單硫鍵或-S-CH2-C(O)-CH2-S-鍵聯之胺基酸；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  28. 如請求項27之多肽，其係選自：pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-Aib-K-G-P-Nle-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-Aib-K-G-P-Nle-C*-f-OH， H-Isn-R-P-R-L-C*-Aib-K-G-P-Nle-C*-f-OH，pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-苯乙胺，pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-f-OH，pE-R-P-R-Cha-C*-H-K-G-P-Cha-C*-F-OH，pE-R-P-R-L-C*-F-K-G-P-Nle-C*-F-OH，H-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，H-R-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，H-Isn-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH，及pE-R-P-R-L-C*-H-F-G-P-Nle-C*-苯乙胺；其中該2個半胱胺酸胺基酸C*之側鏈一起形成二硫鍵；或該多肽之醯胺、酯或鹽。
  29. 一種以如請求項1至28中任一項之多肽或其醯胺、酯或鹽在製造藥劑中之用途，該藥劑用於為有需要的個體治療或預防對APJ受體之激動作用有反應之疾病或病症。
  30. 如請求項29之用途，其中該疾病或病症係選自急性失代償性心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺性高血壓、心房震顫、布魯格達氏症候群(Brugada syndrome)、心室性心博過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、局部缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖症、周邊動脈病、腦血管意外、暫時性腦缺血、創傷性腦損傷、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、燒傷(包括曬傷)及子癇前症。
  31. 如請求項1、2、8、9、12、27及28中任一項之多肽或其醯胺、酯或鹽，其用作藥劑。
  32. 如請求項1、2、8、9、12、27及28中任一項之多肽或其醯胺、酯或鹽，其用於治療或預防對APJ受體之激動作用有反應之疾病或病症。
  33. 如請求項1、2、8、9、12、27及28中任一項之多肽或其醯胺、酯或鹽，其用於治療急性失代償性心臟衰竭(ADHF)、慢性心臟衰竭、肺性高血壓、心房震顫、布魯格達氏症候群、心室性心博過速、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、局部缺血性心血管疾病、心肌病、心臟纖維化、心律不整、水滯留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖症、周邊動脈病、腦血管意外、暫時性腦缺血、創傷性腦損傷、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、燒傷(包括曬傷)或子癇前症。
  34. 一種組合，其包含治療有效量之如請求項1至28中任一項之多肽或其醯胺、酯或鹽，及一或多種治療活性併用藥劑。
  35. 如請求項34之組合，其中該併用藥劑係選自強心劑(inotrope)、β腎上腺素性受體阻斷劑、HMG-Co-A還原酶抑制劑、血管收縮素II受體拮抗劑、血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑、鈣通道阻斷劑(CCB)、內皮素拮抗劑、腎素抑制劑、利尿劑、ApoA-I模擬物、抗糖尿劑、減肥劑、醛固酮受體阻斷劑、內皮素受體阻斷劑、醛固酮合酶抑制劑(ASI)、CETP抑制劑、抗凝劑、鬆弛素、BNP(奈西立肽(nesiritide))及/或NEP抑制劑。
  36. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項1至28中任一項之多肽或其醯胺、酯或鹽，及一或多種醫藥上可接受之載劑。
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