TW201335185A

TW201335185A - 抗－ｆｇｆｒ２抗體及其用途

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Publication number: TW201335185A
Application number: TW101143601A
Authority: TW
Inventors: 艾克爾哈倫蓋; 夏綠蒂科皮茲; 史黛芬妮漢默; 法蘭克迪特莫; 史梵古菲爾; 馬克崔特溫; 珊卓拉布魯德; 杰金法蘭茲; 畢崔克斯史戴爾堤魯德威格; 拉斯林登; 里卡達菲納恩; 西蒙葛里文; 詹堤比
Original assignee: 拜耳智慧財產有限公司
Priority date: 2011-11-23
Filing date: 2012-11-22
Publication date: 2013-09-01

Abstract

本發明提供在過度表現FGFR2的細胞以及在表現突變型FGFR2的細胞中於結合至FGFR2後皆降低FGFR2之細胞表面表現的抗體或其抗原-結合抗體片段，或其變體。亦提供以抗體為基礎的療法，其用於FGFR2-相關疾病或病況，諸如癌症。本發明抗體亦可用於診斷領域中。本發明亦提供編碼前述抗體的核酸序列、含有該等核酸序列之載體、醫藥組成物以及具有使用說明的套組。

Description

抗-FGFR2抗體及其用途

本發明提供重組型抗原-結合區及含有該等對纖維母細胞生長因子受體2(FGFR2)具專一性的抗原-結合區的抗體與功能片段。

因此，該等抗體可用於治療腫瘤以及其他與FGFR2表現有關的病症和病況。本發明亦提供編碼前述抗體的核酸序列、含有該等核酸序列之載體、醫藥組成物以及具有使用說明的套組。

以抗體為基礎的療法經證實非常有效地治療各種癌症，包括實體腫瘤。舉例而言，HERCEPTIN®已成功用於治療乳癌而RITUXAN®則對B-細胞相關的腫瘤類型是有效的。以發展出成功之以抗體為基礎的療法為重心是分離出對抗被發現到優先表現在腫瘤細胞上之細胞-表面蛋白的抗體。

纖維母細胞生長因子受體是酪胺酸受體激酶(RTK)，其中4種(FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4)在哺乳動物中是已知的。鑑定出22個人類纖維母細胞生長因子(FGF)為配體((Eswarakumar and Schlessinger,Cytokine & Growth Factor Reviews 2005,16：139-149；Shimada et al.,Proc Natl Acad Sci USA 2001,98：6500-6505)。FGFR由三個細胞外免疫球蛋白(Ig)-樣結構域D1-D3(其中結構域2及3對於配體結合來說是必要的)、一個單穿膜結構域以及一個含有催化蛋白酪胺酸激酶核心的細胞質結構域所構成(關於圖示表現參見第1圖)。細胞外部分另外具有酸性盒(acidic box，AB)以及肝素結合位點(HBS)(參見第1圖)。RTK的FGFR家族的一個重要標記為存在多樣化選擇性剪接的變體。全長FGFR2被稱為FGFR2α，而缺少D1的同型異構體稱為FGFR2β(第1圖)。結構域3中的選擇性剪接產生兩種不同的變體，即具有外顯子7與8的FGFR2 IIIb，以及含有外顯子7與9的FGFR2 IIIc(第1圖)。後者的剪接會影響配體結合，影響特異性模式。FGFR2 IIIc主要由間葉細胞所表現，FGFR2 IIIb主要由上皮細胞所表現。FGF7亦已知為角質細胞生長因子(KGF)，僅結合至FGFR2 IIIb，因此其亦稱為KGFR。在FGF結合至其受體後，接著發生FGFR二聚體化且磷酸化與經由FRS-GRB2錨定蛋白複合物下游信號傳遞至RAS-MAPK信號傳遞級聯與PI3K-AKT信號傳遞級聯。第一個信號傳遞級聯涉及細胞生長及分化，後者涉及細胞存活及命運決定(Katoh and Katoh,Int J Oncol 2006,29：163-168)。

所有四種受體(FGFR1至FGFR4)及其剪接變體經由不同FGF的精心信號傳遞在胚胎形成期間對於適當器官形成是必要的(Ornitz et al.,Genome Biol 2001,2：3005)。在FGFR2中，缺少所有FGFR2變體會造成胎盤與肢芽形成有缺陷且因此在E10.5造成致死性。特異性剔除FGFR2 IIIb也會造成致死性(在P0)，與肺臟、腦下垂體前葉、甲狀腺、牙齒與肢的發育不完全有關，而FGFR2 IIIc變體的瓦解能存活而顯示骨化作用延遲、成比例矮小症與顱底骨性結合(Eswarakumar and Schlessinger,2005)。在人類中FGFR2的生殖系活化突變於胚胎形成期間造成嚴重的畸形，諸如亞伯特氏症候群或菲費氏症候群(Pfeiffer syndrome)的冠狀與顱縫骨化症(Robin et al.,in Gene Reviews,NCBI Bookshelf Washington,edts.Pagon et al.,1993)。在成人中，FGFR2信號傳遞涉及皮膚及黏膜的傷口癒合、表皮修復與細胞保護(Braun et al.,Phil Trans R Soc Lond B 2004,359：753-757)以及受損肝的再生(Steiling et al.,Oncogene 2003,22：4380-4388；Böhm,dissertation,Swiss Federal Institute of Technology Zurich,2009)。於梗塞後，FGFR2信號傳遞在心外膜衍生細胞(EPDC)遷移至心臟中的作用仍有爭論，因為在胚胎形成期間FGF10/FGFR2信號傳遞對於EPDC遷移至緻密心肌中(完整心臟發育所需要的一個過程)是必須的(Vega-Hernández et al.,Development 2011：3331-3340；Winter and De Groot,Cell Mol Life Sci 2007,64：692-703)。

透過FGFR2的生殖系-獨立型信號傳遞增加涉及不同病理學，諸如痤瘡(Katoh,J of Invest Dermatol 2009,129：1861-1867)、牛皮癬(Finch et al.,Am J Pathol 1997,151：1619-1628；Xu et al.,J Invest Dermatol 2011：131：1521-1529)、牙周病(Li et al.,J Peridontal Res 2005,40：128-138)、日光性斑痣(Lin et al.,Journal Dermatol Sci 2010,59：91-97)、腸病(Brauchle et al.,J Pathol 1996, 149：521-529)、子宮內膜異位症(Taniguchi et al.,Fertil Steril 2008,89：478-480)、膽脂瘤(Yamamoto-Fukuda et al.,Eur Arch Otorhinolaryngol(2008)265：1173-1178；d'Alessandro et al.,Otol Neurotol.2010 Sep；31(7)：1163-9)、膽脂瘤型慢性中耳炎(Yamamoto-Fukuda et al.,Otol Neurotol.2010 Jul；31(5)：745-51)、動脈粥樣硬化(Che et al.,Am J Physiol Heart Circ Physiol 300：H154-H161,2011)及癌症(見下文)。

數個研究公開強調FGFR2表現與癌症患者治療結果不良有強烈相關性： FGFR2及/或KGF的過度表現與胃癌的擴張性生長以及患者存活期較短有關(Matsunobu et al.,Int J Cancer 2006,28：307-314；Toyokawa et al.,Oncol Reports 2009,21：875-880)。因此，在所有經測試胃癌樣本的31至36.5%中偵測到FGFR2過度表現(Matsunobu et al.,Int J Cancer 2006,28：307-314；Toyokawa et al.,Oncol Reports 2009,21：875-880)。腺癌(所有胃癌的70%)更進一步分成兩種不同的病理學類型，即腸型胃癌及瀰漫型胃癌。有趣的是，第一種、較不具侵略性的類型與活化ErbB2致癌途徑有關，而後者較具侵略性的表現型在FGFR2/PI3K途徑有畸形(Yamashita et al.,Surg Today 2011,41：24-38)。約60%胃腺癌屬於瀰漫型，其餘40%屬於腸型(Werner et al.,J Cancer Res Clin Oncol 2001,127：207-216)。在53%的瀰漫型胃癌樣本中發現FGFR2過度表現(Yamashita et al.,Surg Today 2011,41：24-38)。綜觀所有數據，HER2以及FGFR2 表現似乎發生在兩個不同的患者群中。FGFR2的表現可能部分是因為基因擴增，因為在約7至10%的原發性胃癌中發現到FGFR2擴增(Kunii et al.Cancer Res 2008,68：23-40-2348)。另外，不僅在轉移中發現到FGFR2表現，在原發性腫瘤中甚至更多(Yamashita et al.,Surg Today 2011,41：24-38)。

在乳癌中，於57%的腫瘤樣本中發現到FGFR2 IIIb表現，但在健康組織中很少(Tamaru et al.2004,84：1460-1471)。在45%的樣本中發現KGF(FGF7)，大致上與FGFR2 IIIb相符。相較於既不表現FGF7也不表現FGFR2 IIIb的原發性乳癌，FGF7及其唯一受體FGFR2 IIIb的共表現與原發性腫瘤內凋亡細胞數目明顯減少有關(Tamaru et al.2004,84：1460-1471)。如在胃癌還有在乳癌中發現基因擴增：在三重陰性乳癌(TNBC)的4%中(Turner et al.Oncogene 2010,29：2013-2023)。在乳癌中鑑定出數種小核多型性(SNP)，其與乳癌風險增加有關(Hunter et al.Nature Genetics 2007,6：870-874)。若SNP位在內含子2中，其造成FGFR2的轉錄性向上調節(Katoh Expert Reviews 2010,10：1375-1379)。有趣的是，FGFR1在ER-陽性中偏好向上調節，而FGFR2在ER-陰性乳癌中偏好向上調節(Katoh,Expert Reviews 2010,10：1375-1379)。

在胰臟癌中，FGFR2 IIIb及/或FGF7的過度表現與靜脈侵犯強烈相關(Cho et al.,Am J Pathol 170：1964-1974)，從而在腫瘤細胞中發現FGFR2與FGF7的共表現，但在與腫瘤細胞相鄰的基質細胞中甚至更為豐富(Ishiwata et al.,Am J Pathol 1998,153：213-222)。

在表皮卵巢癌中，發現80%的測試病例相較於正常組織有向上調節，而在腹水中有70% FGF7(Steele et al.,Oncogene 20：5878-5887)。

在所有測試的侵犯性子宮頸癌中發現FGFR2蛋白，其中在腫瘤的侵犯前緣有強烈表現(Kawase et al.,Int J Oncol 2010,36：331-340)。

在肺腺癌中，於51.6%的測試病例中有FGF7與FGFR2的共表現且與低度分化程度、較高增生率、淋巴結轉移及較短5-年存活有關聯(Yamayoshi et al.,J Pathol 2004,204：110-118)。

在子宮內膜癌中，於約16%子宮內膜癌中發現FGFR2的最常見活化突變(Pollock et al.,Oncogene 2007,26：7158-7162)。

在食道癌(EC)中，於與較短存活傾向有關的26%患者中發現癌細胞中有FGF7及FGFR2共表現(Yoshino et al.,Int J Oncol 2007,31：721-728)。

在肝細胞癌中，FGFR2表現於分化不良的腫瘤中被向上調節達4.7倍。這個表現與門靜脈侵犯的發生率以及較低的無疾病存活期時間有關(Harimoto et al.,Oncology 2010,78：361-368)。

數份有實驗性活體外與活體內數據的公開文獻證實異常FGFR2-信號傳遞與腫瘤進展的因果關係：

在胃中(Takeda et al.,Clin Cancer Res 2007；13：3051-3057；Kunii et al.,Cancer Res 2008；68：2340-2348)、乳房(Turner et al.Oncogene 2010,29：2013-2023)、卵巢(Cole et al.,Cancer Biol Ther 2010,10：495-504)及頭頸鱗狀細胞(Marshall et al.,Clin Cancer Res 2011,17：5016-5025)癌細胞中剔減(Knock-down)及/或抑制FGFR2導致腫瘤細胞的增生降低及/或細胞凋亡增加。同樣在腫瘤異體移植時，在過度表現FGFR2的腫瘤細胞株中剔減FGFR2以及抑制FGFR2對胃(Takeda et al.,Clin Cancer Res 2007；13：3051-3057)與卵巢(Cole et al.,Cancer Biol Ther 2010,10：495-504)癌細胞株顯示生長抑制。此外，僅活化FGFR2的FGF7會在活體外與活體內增加胃癌(Shin et al.,J Cancer Res Clin Oncol 2002,128：596-602)、乳癌(Zhang et al.,Anticancer Res 1998,18：2541-2546)及卵巢癌(Cole et al.,Cancer Biol Ther 2010,10：495-504)癌細胞株的增生。另外，在帶有活化型突變之FGFR2的子宮內膜癌細胞株中剔減FGFR2也會造成細胞週期停止並誘發細胞死亡(Byron et al.,Cancer Res 2008,68：6902-6907)。

FGFR2信號傳遞會在活體外促使胃癌細胞株(Shin et al.,J Cancer Res Clin Oncol 2002,128：596-602)、乳癌細胞株(Zhang et al.,Anticancer Res 1998,18：2541-2546)及胰臟癌細胞株(Nomura et al.,Br J Cancer 2008,99：305-313；Niu et al.,J Biol Chem 2007,282：6601-6011)的遷移與侵犯。

在食道癌中，FGFR2於腫瘤相關纖維母細胞中是最為向上調節的基因。經分離腫瘤相關纖維母細胞會釋放可溶性因子，其促進食道癌細胞增生(Zhang et al.,hum Cancer Biol 2009,15：4017-4022)，證明由基質細胞所表現的FGFR2也會促進腫瘤細胞進展。

僅報導過數目不多的抗FGFR2抗體。Fortin等人(J.Neurosci.2005,25：7470-7479)描述一種阻斷性抗FGFR2抗體。Wei等人(Hybridoma 2006,25：115-124)顯示僅對FGFR2 IIIb具有特異性的抗體，其抑制KGF誘導的細胞增生。在WO2007/144893中揭示結合FGFR2及FGFR3的抑制性抗體。在WO2010/054265以及Zhao等人(Clin Cancer Res.2010,16：5750-5758)中揭示抑制FGF結合的抗體。Bai等人(Cancer Res.2010,70：7630-7639)描述對FGFR2 IIIb具有特異性的抗體。R&D Systems銷售在其分析中會中和活性的抗-FGFR2抗體。

總結來說，已知數種FGFR2剪接變體。另外，已知FGFR2-相關性疾病是因為FGFR2表現異常，例如FGFR2的過度表現或擴增，或是因為各種突變型FGFR2蛋白。但是，缺少能夠應付多種不同FGFR2相關疾病的療法。

發明摘要

本發明係指向提供在過度表現FGFR2的細胞以及表現突變型FGFR2的細胞中於結合至FGFR2後皆降低FGFR2之細胞表面表現的抗體或其抗原-結合抗體片段或其變體。亦提供以抗體為基礎的療法，其針對FGFR2-相關疾病或病況，諸如癌症，具體而言為表現FGFR2的腫瘤，諸如胃癌、乳癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、子宮內膜癌、食道癌、頭頸癌、肝細胞癌、黑色素瘤以及膀胱癌。

本發明亦係關於編碼本發明抗體或其抗原-結合片段之多核苷酸、表現本發明抗體或其抗原-結合片段之細胞、用以製造本發明抗體或其抗原-結合片段之方法、使用本發明抗體或其抗原-結合片段用以抑制發育不良型(dysplastic)細胞生長的方法，以及使用本發明抗體或其抗原-結合片段用以治療與偵測癌症的方法。

本發明描述不同於現有FGFR2抗體的抗體，因為它們在過度表現FGFR2的細胞中以及在表現突變型FGFR2的細胞中於結合至FGFR2後皆降低FGFR2之表面表現。本發明的一個具體例為結合至FGFR2之細胞外N-端表位(¹RPSFSLVEDTTLEPE¹⁵)(SEQ ID NO：63)的抗體或其抗原-結合片段。本發明抗體或其抗原-結合片段會a)在短期內活化FGFR2、b)誘發FGFR2內化、c)引起有效率的分解、d)對表現FGFR2的癌細胞或腫瘤細胞進行去敏化，以及e)最後結果是此等抗體在活體內腫瘤實驗中的抗-腫瘤活性。本發明的這些以及其他標的在本文中會更完整地說明。

本發明抗體可與已知藥物共投與，且在一些情況下，該抗體本身可經過修飾。例如，抗體可結合至細胞毒性劑、免疫毒素、發毒團或放射性同位素以更強力地增加效力。

本發明更提供構成一種用以診斷惡性或發育不良病況之工具的抗體，其中FGFR2表現相較於正常組織升高或其中FGFR2從細胞表面脫落且變得可在血清中偵測到。前提係抗-FGFR2抗體結合至可偵測標記。較佳的標記為放射性標記、酶、發色團或螢光增白劑。

本發明亦係有關於編碼本發明抗體或其抗原-結合片段之多核苷酸、表現本發明抗體或其抗原-結合片段之細胞、用以製造本發明抗體或其抗原-結合片段之方法、使用本發明抗體或其抗原-結合片段用以抑制發育不良型細胞生長的方法，以及使用本發明抗體或其抗原-結合片段用以治療與偵測癌症的方法。

本發明亦係有關於經分離核酸序列，其每一者可編碼對FGFR2之表位具有特異性的前述抗體或其抗原-結合片段。本發明的核酸適於以重組的方式製造抗體或抗原-結合抗體片段。因此，本發明亦係有關於含有本發明核酸序列之載體與宿主細胞。

本發明組成物可用於治療性或預防性應用。因此，本發明包括含有本發明抗體或其抗原-結合片段以及醫藥上可接受載體或賦形劑之醫藥組成物。在一個相關態樣中，本發明提供一種方法，其用以治療與非所要存在表現FGFR2的細胞相關之病症或病況。在一個較佳具體例中，前述病症係癌症。此方法含有將有效量之包括如本文所述或預期之本發明抗體的醫藥組成物投與給需要的個體。

本發明亦提供關於使用抗體庫來分離該庫之特異地結合至FGFR2的一或多個成員的說明。

發明的詳細說明

本發明是基於發現對FGFR2具有特異親和力且可給予個體治療益處的新穎抗體。本發明抗體(其可為人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)可用於許多方面，在本文中將更完整說明。

定義

除非另有定義，否則所有本文使用的技術以及科學術語具有與本發明所屬技藝中具有通常技術者普遍理解的相同意思。然而，下列參考文獻可提供本發明有關之技藝中具有通常技術者許多本發明中所用術語的一般定義，且如該等定義為該技藝中通常所理解之意思供參照並使用。該等參考文獻包括，但不限於Singleton et ah,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2d ed.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；Hale & Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)；以及Lackie et al.,The Dictionary of Cell & Molecular Biology(3d ed.1999)；及Cellular and Molecular Immunology,Eds.Abbas,Lichtman and Pober,2nd Edition,W.B.Saunders Company。可查閱提供具有該技藝中普遍理解之意思的術語定義之可供該技藝中具有通常技術者使用的任何其他技術來源。為本發明之目的，進一步定義下列術語。其他術語以其他方式定義於發明說明中。如本文及隨附申請專利範圍中所用，除非本文另以其他方式清楚表明，否則單數形式「一」、「及」及「該」包括複數指向對象。因此，例如提及「一基因」是指向一或多個基因且包括那些習於技藝者已知的相同術語等。

「人類」抗體或其抗原-結合片段特此定義為不是嵌合(例如不是「人類化」)且不是來自(全部或部分)非人類物種者。因此，人類抗體或其抗原-結合片段可衍生自人類或可能是合成人類抗體。「合成人類抗體」在本文中定義為具有全部或部分衍生自在電腦中的合成序列的序列，其係以分析以之已知人類抗體序列為基礎。在電腦中，可進行人類抗體序列或其片段的設計，例如透過分析人類抗體或抗體片段序列的資料庫並使用自其所取得的數據設計多肽序列。人類抗體或其抗原-結合片段的另一個實施例是其係由分離人類來源的抗體序列庫(例如以自人類天然來源所取得之抗體庫為基礎)之核酸所編碼。人類抗體的實施例包括如Söderlind et al.,Nature Biotech.2000,18：853-856中所述的抗體。

「人類化抗體」或其人類化抗原-結合片段在本文中定義為(i)衍生自非人類來源(例如基因轉殖小鼠，其帶有異源性免疫系統)，其抗體是以人類生殖系序列為基礎；(ii)非人類抗體之骨架區的胺基酸藉由基因工程而部分置換成人類胺基酸序列或(iii)CDR經移植，其中可變域的CDR是來自非人類來源，而可變域的一或多個骨架是人類來源且恆定域(若有的話)是人類來源。

「嵌合抗體」或其抗原-結合片段在本文中定義為其中可變域衍生自非人類來源而一些或全部恆定域是衍生自人類來源者。

術語「單株抗體」如本文所用意指自一群實質上同源性抗體所獲得的抗體，亦即含有個別抗體的群是相同的，除了可能的突變以外(例如天然存在的突變，其少量存在)。因此，術語「單株」表示抗體不是分離抗體的混合物之特徵。相對於多株抗體群，其通常包括指向對抗不同決定位(表位)的不同抗體，單株抗體製備物的每一單株抗體係指向對抗抗原上的單一決定位。除了它們的特異性以外，單株抗體製備物因為它們通常未受到其他免疫球蛋白汙染而有優勢。術語「單株」不意欲為需要透過任何特定方法來製造抗體。術語單株抗體特別包括嵌合抗體、人類化抗體與人類抗體。

如本文所用，抗體「特異結合至」是對感興趣的抗原「具特異性」或「特異辨識」感興趣的抗原，例如腫瘤相關多肽抗原標的(在此為FGFR2)，係以充分親和力結合抗原而使得該抗體可在靶定表現該抗原之細胞或組織時用作為治療劑且不會與其他蛋白質有明顯交叉反應，或不會與前述抗原標的之同源基因及變體(例如突變形式、剪接變體或蛋白分解截短形式)以外的蛋白質交叉反應者。術語「特異辨識」或「特異結合至」特定多肽或特定多肽標的上之表位或對特定多肽或特定多肽標的上之表位「具有特異性」如本文所用可藉抗體或其抗原-結合片段展現，例如對抗原具有少於約10^-4 M、或者少於約10^-5 M、或者少於約10^-6 M、或者少於約10^-7 M、或者少於約10^-8 M、或者少於約10^-9 M、或者少於約10^-10 M、或者少於約10^-11 M、或者少於約10^-12 M或更少的單價K_D。若抗體能夠分辨抗原與一或多種參考抗原，則抗體「特異結合至」該抗原、對該抗原「具有特異性」或「特異辨識」該抗原。在其最普遍的形式中，「特異結合」、「特異結合至」、「對…具有特異性」或「特異辨識」意指抗體區別感興趣抗原與不相干抗原的能力，如例如依據下列方法之一者所測定。該等方法包括，但不限於西方墨點、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-試驗與肽掃描。舉例而言，可進行標準ELISA分析。可按照標準呈色(例如帶有辣根過氧化酶的二級抗體及具有過氧化氫的四甲基聯苯胺)來進行計分。在某些孔中的反應是按照光學密度來計分，例如在450 nm下。通常背景(=陰性反應)可為0.1 OD；通常陽性反應可為1 OD。這表示差異陽性/陰性超過5倍、10倍、50倍且較佳超過100倍。通常測定結合特異性是藉由使用不是單一參考抗原而是一組約三至五個不相干抗原(諸如奶粉、BSA、運鐵蛋白或類似物)來進行。

「結合親和力」意指總計一個分子的單一結合位點與其結合夥伴的全部非共價交互作用強度。除非另有指明，否則另有定義，否則如本文所用，「結合親和力」意指反映結合對之成員(例如抗體與抗原)間1：1交互作用的內生性結合親和力。解離常數「K_D」通常用來說明一個分子(諸如抗體)與其結合夥伴(諸如抗原)間的親和力，亦即配體如何緊密地結合至特定蛋白。配體-蛋白親和力受到兩個分子間的非共價分子間交互作用所影響。親和力可以透過本技藝中已知的一般方法來測定，包括那些本文中所描述者。在一個具體例中，「K_D」或「K_D值」依據本發明是如實施例7藉由利用Biacore T100儀器(GE Healthcare Biacore,Inc.)使用表面電漿共振分析來測定。簡言之，透過間接捕捉劑(抗-人類IgG Fc)將抗體固定在CM5感測晶片上。如按照製造商所說明使用「Human Antibody Capture Kit」(BR-1008-39,GE Healthcare Biacore,Inc.)的試劑。每單位固定約5000共振單位(RU)單株小鼠抗-人類IgG(Fc)抗體。注射抗FGFR2抗體以達到約200至600 RU的捕捉濃度。不同濃度的人類、鼠科、大鼠、狗與其他物種衍生之含有胺基酸1至15的FGFR2肽被注射通過經固定的抗-FGFR2抗體。在線內參考細胞校正然後扣除緩衝樣本後得到傳感圖。解離平衡常數(K_D)是依據締合(k_on)與解離(k_off)常數比來計算，透過將傳感圖與一級1：1結合模型使用Biacore評估軟體來進行擬合而獲得。其他適宜裝置為BIACORE(R)-2000、BIACORE(R)-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，或ProteOn XPR36儀器(Bio-Rad Laboratories,Inc.)。

為確定抗體或抗體片段結合的關鍵殘基，可使用例如肽的丙胺酸掃描進行表位精密測繪(epitope fine mapping)。因此，結合表位的每一個胺基酸經丙胺酸殘基置換並且在以ELISA為基礎的分析中測試本發明代表性抗體的結合。藉此，若抗體如實施例6中所述因為將某個殘基變成丙胺酸而失去其超過50%的ELISA訊號，則這個殘基對於結合來說被視為是關鍵的。

術語”抗體”，如本文所用，欲意指免疫球蛋白分子，其較佳含有4個多肽鏈，通常藉由雙硫鍵交互連結的2個重(H)鏈以及2個輕(L)鏈。各個重鏈含有1個重鏈可變區(此處縮寫為VH)以及1個重鏈恆定區。重鏈恆定區含有例如3個結構域，CH1、CH2以及CH3。各個輕鏈含有1個輕鏈可變區(此處縮寫為VL)以及1個輕鏈恆定區。輕鏈恆定區含有1個結構域(CL)。VH與VL區可進一步分成具有超變異性的區域(命名為互補決定區(complementarity determining region，CDR))，散佈有較為守恆的區域(命名為骨架區域(FR))。各個VH與VL由3個CDR以及至多4個FR所構成，以下列順序從胺基端往羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

如本文所用，術語”互補決定區(CDR；例如CDR1、CDR2與CDR3)意指一個抗體可變域的胺基酸殘基，其存在對於抗原結合來說是必須的。各可變域通常具有三個被識別為CDR1、CDR2與CDR3的CDR區。各互補決定區可含有如依據Kabat所定義的”互補決定區”的胺基酸殘基 (例如在輕鏈可變域中的殘基約24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)，以及在重鏈可變域中的殘基31-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3))(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immulological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))，及/或”超變異環”的那些殘基(例如輕鏈可變域中的約殘基26-32(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)以及重鏈可變域中的26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)(Chothia and Lesk；J Mol Biol 196：901-917(1987))。在一些情況下，互補決定區可包括依據Kabat以及超變環所定義之CDR區的胺基酸。

完整抗體可能被分派成不同”類別”，端視其重鏈恆定域的胺基酸序列而定。有五種主要類別的完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG與IgM，且這些中的數者可進一步分成”亞類”(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA與IgA2。對應於不同類別抗體的重鏈恆定域分別被稱為[α]、[β]、[ε]、[γ]與[μ]。不同類別的免疫球蛋白的次單元結構及三維構型為已知的。如本文所用抗體為習知抗體及其功能片段。

抗體/免疫球蛋白之”功能片段”或”抗原-結合抗體片段”在此定義為保留抗原-結合區的抗體/免疫球蛋白的片段(例如IgG的可變區)。抗體的”抗原-結合區”通常在抗體的一或多個超變異區，例如CDR1、CDR2及/或CDR3區；但是，可變”骨架”區亦在抗原結合時扮演重要的角色，例如因為提供CDR的骨架。較佳地，”抗原-結合區”包含至少可變輕(VL)鏈的胺基酸殘基4至103以及可變重(VH)鏈的胺基酸殘基5至109，更佳地VL的胺基酸殘基3至107以及VH的胺基酸殘基4至111，且尤佳地完整VL以及VH鏈(VL的胺基酸位置1至109以及VH的胺基酸位置1至113；依據WO 97/08320來編號)。用於本發明的一個較佳免疫球蛋白類別為IgG。

本發明的”功能片段”或”抗原-結合抗體片段”包括Fab、Fab'、F(ab')₂，及Fv片段；雙抗體；單域抗體(DAb)、線性抗體；單鏈抗體分子(scFv)；及多特異性，諸如雙特異性與三特異性抗體，由抗體片段所形成(C. A. K Borrebaeck,editor(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs in Molecular Biology),Oxford University Press；R. Kontermann & S. Duebel,editors(2001)Antibody Engineering(Springer Laboratory Manual),Springer Verlag)。應理解”多特異性”或”多功能性”抗體以外的抗體的結合位點每一者相同。F(ab’)₂或Fab可以經工程化而將C_H1與C_L域的分子間雙硫交互作用減至最低或完全去除。

本發明中所預期的抗體或抗原-結合抗體片段的變體係維持對FGFR2之抗體或抗原-結合抗體片段的結合活性的分子。

本發明中所預期的結合蛋白係例如抗體擬似物，諸如親合體(Affibodies)、Adnectin、Anticalin、DARPin、親和性多聚體(Avimer)、奈米抗體(Gebauer M.等人回顧，Curr.Opinion in Chem.Biol.2009；13：245-255；Nuttall S.D. et al., Curr.Opinion in Pharmacology 2008；8：608-617)。

如本文所用，術語”表位”包括任何能夠特異結合至免疫球蛋白或T-細胞受體的蛋白決定位。表位決定位通常由分子的具化學活性表面基團所構成，諸如胺基酸或糖側鏈，或其組合，且通常具有特定三維結構特性，以及特定電荷特性。依據習於技藝者所熟知的任一種方法，若一個抗體在競爭性結合分析中顯示與第二個抗體競爭，則兩個抗體被說是”結合相同的表位”。

”分離的”抗體是已被鑑定且從表現它的細胞組分中分離出來者。細胞的污染組分係會干擾抗體之診斷或治療用途的物質，且可包括酶、激素與其他蛋白或非蛋白溶質。在較佳具體例中，抗體經純化(1)至大於抗體重量之95%，如藉由例如勞氏法、UV-Vis光譜或藉由SDS-毛細管凝膠電泳(例如在Caliper LabChip GXII、GX 90或Biorad Bioanalyzer裝置)所測定，且在較佳具體例中超過重量的99%、(2)至足以獲得N端或內部胺基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)至在還原或非還原條件下使用考馬斯藍，或較佳銀染依據SDS-PAGE的均質性。分離的天然存在抗體包括重組型細胞中的原位抗體，因為該抗體之天然環境的至少一個組分不存在。但是，分離的抗體通常藉由至少一個分離步驟來製備。

”抗體-依賴型細胞媒介的細胞毒性”或”ADCC”意指一種細胞毒性的形式，其中存在於某些細胞毒性細胞(例如NK細胞、嗜中性球與巨噬細胞)上之結合至Fcγ受體(FcγR) 的分泌型Ig能夠使這些細胞毒性效應細胞特異結合至帶有抗原的標的細胞並因此殺滅標的細胞，例如使用細胞毒素。為評估感興趣抗體的ADCC活性，可進行活體外ADCC分析，諸如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號或美國專利第6,737,056號(Presta)中所述。對此等分析來說可使用的效應細胞包括PBMC以及NK細胞。

”補體依賴型細胞毒性”或”CDC”意指在補體存在下溶解標的細胞。經典補體路徑的活化是由補體系統的第一補體(C1q)結合至(適當亞類的)抗體開始，其結合至其同源抗原。為評估補體活化，可進行CDC分析，例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述。具有Fc區胺基酸序列有所改變的多肽變體(具有變異Fc區的多肽)及C1q結合增加或減少描述於例如美國專利第6,194,551 B1號以及WO 1999/51642中。

術語免疫結合物(可交替地意指為”抗體-藥物結合物”或”ADC”)意指結合至一或多個細胞毒性劑(諸如化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白毒素、細菌、真菌、植物或動物來源的酵素活性毒素或其片段)或放射性同位素(亦即放射性結合物))的抗體。免疫結合物已被用於細胞毒性劑(亦即殺滅或抑制細胞生長或增生的藥物)的局部投遞以治療癌症(例如Liu et al.,Proc Natl.Acad.Sci.(1996),93,8618-8623)。免疫結合物容許將藥物部分靶定地送至腫瘤，並在那裏細胞內積累，其中未結合藥物的全身性投藥可能對正常細胞及/或組織造成無法接受的毒性濃度。抗體 -毒素結合物中所用的毒素包括細胞毒素(諸如白喉毒素)、植物毒素(諸如蓖麻毒素)、小分子毒素(諸如格爾德毒素(geldanamycin))。該等毒素可能藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓樸異構酶抑制而展現它們的細胞毒性效用。

關於參考多核苷酸或多肽序列的”百分比(%)序列同一性”分別被定義為在排列序列並引入間隔(若需要的話)以達到最大百分比序列同一性後，在候選序列中分別與參考多核苷酸或多肽序列中的核酸或胺基酸殘基分別相同的核酸或胺基酸殘基百分比。守恆性取代不被視為序列同一性的一部分。較佳為非間隔排列。為決定百分比胺基酸序列同一性的排列，可使用可公開取得的電腦軟體(諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體)以不同方法來進行，其等落在本技藝的技術中。那些習於本技藝者可決定排列序列的適當參數，包括任一種在整個待比對序列的全長達至最大排列所需的演算法。

術語”成熟抗體”或”成熟的抗原-結合片段”，諸如成熟Fab變體，包括抗體或抗體片段的衍生物，其表現出更強烈結合-亦即具有親和力增高的結合-至特定抗原，諸如FGFR2的細胞外域。成熟是鑑別抗體或抗體片段之六個CDR內的少數突變的過程，其使得此親和力增加。成熟過程是將突變引入抗體並篩選鑑別經改良連結子的分子生物方法組合。

本發明抗體

本發明係有關於藉由提供抗-FGFR2抗體抑制FGFR2-陽性癌細胞的生長以及腫瘤病的進展的方法。所提供者為結合蛋白、抗體、其抗原-結合抗體片段以及抗體與片段之變體，其等於過度表現FGFR2之細胞以及表現突變型FGFR2之細胞中在結合至FGFR2後皆降低FGFR2的表面表現。本發明的另一具體例提供抗體或其抗原-結合抗體片段或其變體，其等結合至廣泛不同之表現FGFR2的細胞株，在過度表現FGFR2之細胞以及在表現突變型FGFR2之細胞中，包括但不限於SNU16(ATCC-CRL-5974)及MFM223(ECACC-98050130)，其等過度表現FGFR2與AN3-CA(DSMZ-ACC 267)和MFE-296(ECACC-98031101)，其表現突變型FGFR2。

為了這些目的，本發明的一個具體例係提供分離的人類、人類化或嵌合抗體，或其抗原結合抗體片段，其等特異結合至以成熟人類FGFR2多肽的不同形式存在的FGFR2表位(例如參見FGFR2α III b的SEQ ID NO：61以及FGFR2β IIIb的SEQ ID NO：62)，它們由表現FGFR2的癌細胞株/癌細胞所表現，及/或其由具高親和力的這些抗體所結合。如本文所用，FGFR2的不同”形式”包括，但不限於各種同型異構體、各種剪接變體、各種糖型或FGFR2多肽，其等歷經不同轉譯和轉譯後修飾。FGFR2多肽在本文被命名為”FGFR2”。

本發明的另一具體例係提供抗體或其抗原-結合抗體片段或其變體，其等對於人類投藥來說是安全的。

本發明的另一具體例係提供抗體或其抗原-結合抗體片段或其變體，其等結合至人類FGFR2並且與另一物種的FGFR2交叉反應，該另一物種包括，但不限於鼠科、大鼠、恆河猴、兔、豬與狗FGFR2。較佳地，該其他物種為齧齒動物，諸如，例如小鼠或大鼠。更佳地，該等抗體或其抗原-結合抗體片段或其變體結合至人類FGFR2並與鼠科FGFR2交叉反應。

本發明的另一具體例係提供抗體或其抗原-結合抗體片段或其變體，其等在結合至表現FGFR2的細胞後被有效地內化。本發明抗體可以與已知藥物共投藥，且在一些情況下該抗體本身可經修飾。例如，抗體可結合至細胞毒性劑、免疫毒素、發毒團或放射性同位素以更強力地增加效力。

本發明的另一具體例係提供抗體或其抗原-結合抗體片段或其變體，其等在短期間活化FGFR2並在內化後引起FGFR2分解，因而使得表現FGFR2的不同癌細胞或腫瘤細胞對於FGF刺激去敏化，以及最後在活體內抑制腫瘤生長。

本發明的另一具體例係提供構成一種用以診斷惡性或發育不良病況之工具的抗體，其中FGFR2表現相較於正常組織升高或其中FGFR2從細胞表面脫落且變得可在血清中偵測到。前提係抗-FGFR2抗體結合至可偵測標記。較佳的標記為放射性標記、酶、發色團或螢光增白劑。

在一個態樣中，本發明提供一種分離抗體或其抗原- 結合片段，其含有結合至被細胞表面所表現之FGFR2的抗原-結合區並在結合至FGFR2之後於過度表現FGFR2之細胞與表現突變型FGFR2之細胞中皆降低FGFR2的細胞表面表現。在一個具體例中，本發明提供分離抗體或其抗原-結合片段，其含有特異結合至幼稚細胞表面所表現之FGFR2並在結合至FGFR2之後於表現過度FGFR2之細胞與表現突變型FGFR2之細胞中皆降低FGFR2的細胞表面表現的抗原-結合區。在一個具體例中，該分離抗體或抗原-結合片段特異結合至被幼稚細胞表面所表現之FGFR2並在結合至FGFR2之後於至少兩種過度表現FGFR2之不同細胞與至少兩種表現突變型FGFR2之不同細胞中皆降低FGFR2的細胞表面表現。

在又一具體例中，該抗體或其抗原-結合片段特異結合至幼稚、細胞表面所表現的FGFR2並(i)在結合至FGFR2之後在過度表現FGFR2之細胞以及表現突變型FGFR2之細胞中皆降低FGFR2的細胞表面表現，以及(ii)引起FGFR2磷酸化。

在又一具體例中，該抗體或其抗原-結合片段特異結合至天然、細胞表面所表現的FGFR2並(i)在結合至FGFR2之後在過度表現FGFR2之細胞以及表現突變型FGFR2之細胞中皆降低FGFR2的細胞表面表現，以及(ii)引起FGFR2磷酸化，其該抗體令表現FGFR2之細胞對使用FGF7刺激去敏化。在又一具體例中，該去敏化是過度表現FGFR2之細胞去敏化。

在又一具體例中，該抗體或其抗原-結合片段特異結合至天然、細胞表面所表現的FGFR2並(i)在結合至FGFR2之後在過度表現FGFR2之細胞以及表現突變型FGFR2之細胞中皆降低FGFR2的細胞表面表現，以及(ii)引起FGFR2內化，造成FGFR2分解。

在又一具體例中，該抗體或其抗原-結合片段特異結合至天然、細胞表面所表現的FGFR2並(i)在結合至FGFR2之後在過度表現FGFR2之細胞以及表現突變型FGFR2之細胞中皆降低FGFR2的細胞表面表現，以及(ii)在異體移植腫瘤實驗中降低腫瘤-生長。

在又一具體例中，該抗體或其抗原-結合片段能夠在不同細胞株中降低FGFR2細胞表面表現，該等細胞株包括，但不限於在過度表現FGFR2的SNU16(ATCC-CRL-5974)與MFM223(ECACC-98050130)，以及表現突變型FGFR2的細胞株AN3-CA(DSMZ-ACC 267)與MFE-296(ECACC-98031101)中。

在又一具體例中，該抗體或其抗原-結合片段能夠在結合至FGFR2之後於過度表現FGFR2的SNU16(ATCC-CRL-5974)與MFM223(ECACC-98050130)，以及表現突變型FGFR2的細胞株AN3-CA(DSMZ-ACC 267)與MFE-296(ECACC-98031101)中降低FGFR2細胞表面表現。

在一個較佳具體例中，相較於未經處理或經對照處理細胞的FGFR2細胞表面表現，細胞表面降低至少10%、 15%、20%、25%或30%。

在又一較佳具體例中，相較於未經處理或經對照處理細胞的FGFR2細胞表面表現，於96小時後，細胞表面降低至少10%、15%、20%、25%或30%。

在又一具體例中，該抗體或其抗原-結合片段特異結合至FGFR2的細胞外N端表位(¹RPSFSLVEDTTLEPE¹⁵)(SEQ ID NO：63)。關於結合FGFR2之N端表位(¹RPSFSLVEDTTLEPE¹⁵)內的抗體或其抗原-結合片段結合的關鍵殘基包括，但不限於Arg 1、Pro 2、Phe 4、Ser 5、Leu 6及Glu 8。

在又一具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段結合至細胞外N端表位(SEQ ID NO：63)係藉由至少一個選自由以下所組成之群之表位殘基所媒介：Arg 1、Pro 2、Phe 4、Ser 5、Leu 6及Glu 8。

在又一具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段結合至細胞外N端表位(SEQ ID NO：63)係因為至少一個選自由以下殘基所組成之群之表位殘基經胺基酸丙胺酸取代而降低：Arg 1、Pro 2、Phe 4、Ser 5、Leu 6及Glu 8。

在又一具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段結合至細胞外N端表位(SEQ ID NO：63)係藉由至少一個選自由以下殘基所組成之群之表位殘基所媒介：Pro 2、Leu 6及Glu 8。

在又一具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段結合至細胞外N端表位(SEQ ID NO：63)係因為至少一個選自由以下殘基所組成之群之表位殘基經胺基酸丙胺酸取代而降低：Pro 2、Leu 6及Glu 8。

在又一具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段結合至細胞外N端表位(SEQ ID NO：63)係藉由至少一個選自由以下殘基所組成之群之表位殘基所媒介：Pro 2、Leu 6及Glu 8，且結合至該表位對於表位之位置5的序列改變是沒有變化的。

在又一具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段結合至細胞外N端表位(SEQ ID NO：63)係因為至少一個選自由以下殘基所組成之群之表位殘基經胺基酸丙胺酸取代而降低：Pro 2、Leu 6及Glu 8，且結合至該表位對於表位之位置5的序列改變是沒有變化的。

在又一具體例中，該抗體或其抗原-結合片段因為將FGFR2之N端表位(¹RPSFSLVEDTTLEPE¹⁵)的至少一個胺基酸殘基變成丙胺酸而喪失超過其50%的ELISA訊號，(i)該殘基係選自由Pro 2、Leu 6及Glu 8所組成之群，或(ii)該殘基係選自由Arg 1、Pro 2、Phe 4與Ser 5所組成之群。

在又一具體例中，該分離抗體或其抗原-結合片段因為將FGFR2之N端表位(¹RPSFSLVEDTTLEPE¹⁵)的至少一個胺基酸殘基變成丙胺酸而喪失超過其50%的ELISA訊號，其中該殘基係選自於包括，但不限於a)Pro 2、Leu 6及Glu 8，或b)Arg 1、Pro 2、Phe 4與Ser，如表7中所示。

在又一具體例中，該抗體或抗原-結合片段與選自由下列之群之至少一種抗體競爭結合至FGFR2：”M048-D01”、”M047-D08”、”M017-B02”、”M021-H02”、”M054-A05”、”M054-D03”、”TPP-1397”、”“TPP-1398”、”TPP-1399”、”TPP-1400”、”TPP-1401”、”TPP-1402”、”TPP-1403”、”TPP-1406”、”TPP-1407”、”TPP-1408”、”TPP-1409”、”TPP-1410”、”TPP-1411”、”TPP-1412”及”TPP-1415”。

本文件中，參照下列示於表9及表10中的本發明較佳抗體：”M017-B02”、”M021-H02”、”M047-D08”、”M048-D01”、”M054-A05”、”M054-D03”、”TPP-1397”、”TPP-1398”、”TPP-1399”、”TPP-1400”、”TPP-1401”、”TPP-1402”、”TPP-1403”、”TPP-1406”、”TPP-1407”、”TPP-1408”、”TPP-1409”、”TPP-1410”、”TPP-1411”、”TPP-1412”及”TPP-1415”。

M017-B02表示含有一對應於SEQ ID NO：3(DNA)/SEQ ID NO：1(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：4(DNA)/SEQ ID NO：2(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

M021-H02表示含有一對應於SEQ ID NO：13(DNA)/SEQ ID NO：11(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：14(DNA)/SEQ ID NO：12(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

M047-D08表示含有一對應於SEQ ID NO：23(DNA)/SEQ ID NO：21(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：24(DNA)/SEQ ID NO：22(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

M048-D01表示含有一對應於SEQ ID NO：33(DNA)/SEQ ID NO：31(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：(DNA)34/SEQ ID NO：32(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

M054-D03表示含有一對應於SEQ ID NO：43(DNA)/SEQ ID NO：41(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：44(DNA)/SEQ ID NO：42(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

M054-A05表示含有一對應於SEQ ID NO：53(DNA)/SEQ ID NO：51(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：54(DNA)/SEQ ID NO：52(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

TPP-1397表示含有一對應於SEQ ID NO：83(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：84(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

TPP-1398表示含有一對應於SEQ ID NO：93(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：94(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

TPP-1399表示含有一對應於SEQ ID NO：103(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：104(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

TPP-1400表示含有一對應於SEQ ID NO：113(蛋白質) 之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：114(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

TPP-1401表示含有一對應於SEQ ID NO：123(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：124(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

TPP-1402表示含有一對應於SEQ ID NO：133(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：134(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

TPP-1403表示含有一對應於SEQ ID NO：73(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：74(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

TPP-1406表示含有一對應於SEQ ID NO：153(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：154(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

TPP-1407表示含有一對應於SEQ ID NO：163(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：164(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

TPP-1408表示含有一對應於SEQ ID NO：173(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：174(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

TPP-1409表示含有一對應於SEQ ID NO：183(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：184(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

TPP-1410表示含有一對應於SEQ ID NO：193(蛋白質) 之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：194(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

TPP-1411表示含有一對應於SEQ ID NO：203(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：204(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

TPP-1412表示含有一對應於SEQ ID NO：213(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：214(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。

TPP-1415表示含有一對應於SEQ ID NO：143(蛋白質)之可變重鏈區以及一對應於SEQ ID NO：144(蛋白質)之可變輕鏈區的抗體。在又一較佳具體例中，該抗體或抗原-結合片段含有重鏈或輕鏈CDR序列，其分別至少50%、55%、60%、70%、80%、90或95%相同於至少一個，較佳對應下列抗體的CDR序列：”M048-D01”、”M047-D08”、”M017-B02”、”M021-H02”、”M054-A05”、”M054-D03”、”TPP-1397”、”TPP-1398”、”TPP-1399”、”TPP-1400”、”TPP-1401”、”TPP-1402”、”TPP-1403”、”TPP-1406”、”TPP-1407”、”TPP-1408”、”TPP-1409”、”TPP-1410”、”TPP-1411”、”TPP-1412”或”TPP-1415”，或至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%相同於下列抗體的VH或VL序列：”M048-D01”、”M047-D08”、”M017-B02”、”M021-H02”、”M054-A05”、”M054-D03”、”TPP-1397”、”TPP-1398”、”TPP-1399”、”TPP-1400”、”TPP-1401”、”TPP-1402”、”TPP-1403”、”TPP-1406”、”TPP- 1407”、”TPP-1408”、”TPP-1409”、”TPP-1410”、”TPP-1411”、”TPP-1412”或”TPP-1415”。

在一個較佳具體例中，本發明抗體或抗原-結合片段包含至少一個CDR序列或如表9及表10中所示之至少一個可變重鏈或輕鏈序列。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：5(H-CDR1)、SEQ ID NO：6(H-CDR2)及SEQ ID NO：7(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：8(L-CDR1)、SEQ ID NO：9(L-CDR2)及SEQ ID NO：10(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：15(H-CDR1)、SEQ ID NO：16(H-CDR2)及SEQ ID NO：17(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：18(L-CDR1)、SEQ ID NO：19(L-CDR2)及SEQ ID NO：20(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：25(H-CDR1)、SEQ ID NO：26(H-CDR2)及SEQ ID NO：27(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：28(L-CDR1)、SEQ ID NO：29(L-CDR2)及SEQ ID NO：30(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：35(H-CDR1)、SEQ ID NO：36(H-CDR2)及SEQ ID NO：37(H-CDR3)：以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：38(L-CDR1)、SEQ ID NO：39(L-CDR2)及SEQ ID NO：40(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：45(H-CDR1)、SEQ ID NO：46(H-CDR2)及SEQ ID NO：47(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：48(L-CDR1)、SEQ ID NO：49(L-CDR2)及SEQ ID NO：50(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：55(H-CDR1)、SEQ ID NO：56(H-CDR2)及SEQ ID NO：57(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：58(L-CDR1)、SEQ ID NO：59(L-CDR2)及SEQ ID NO：60(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：75(H-CDR1)、SEQ ID NO：76(H-CDR2)及SEQ ID NO：77(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：78(L-CDR1)、SEQ ID NO：79(L-CDR2)及SEQ ID NO：80(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：85(H-CDR1)、SEQ ID NO：86(H-CDR2)及SEQ ID NO：87(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：88(L-CDR1)、SEQ ID NO：89(L-CDR2)及SEQ ID NO：90(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：95(H-CDR1)、SEQ ID NO：96(H-CDR2)及SEQ ID NO：97(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：98(L-CDR1)、SEQ ID NO：99(L-CDR2)及SEQ ID NO：100(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：105(H-CDR1)、SEQ ID NO：106(H-CDR2)及SEQ ID NO：107(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：108(L-CDR1)、SEQ ID NO：109(L-CDR2)及SEQ ID NO：110(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：115(H-CDR1)、SEQ ID NO：116(H-CDR2)及SEQ ID NO：117(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：118(L-CDR1)、SEQ ID NO：119(L-CDR2)及SEQ ID NO：120(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：125(H-CDR1)、SEQ ID NO：126(H-CDR2)及SEQ ID NO：127(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：128(L-CDR1)、SEQ ID NO：129(L-CDR2)及SEQ ID NO：130(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：135(H-CDR1)、SEQ ID NO：136(H-CDR2)及SEQ ID NO：137(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：138(L-CDR1)、SEQ ID NO：139(L-CDR2)及SEQ ID NO：140(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：145(H-CDR1)、SEQ ID NO：146(H-CDR2)及SEQ ID NO：147(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：148(L-CDR1)、SEQ ID NO：149(L-CDR2)及SEQ ID NO：150(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：155(H-CDR1)、SEQ ID NO：156(H-CDR2)及SEQ ID NO：157(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：158(L-CDR1)、SEQ ID NO：159(L-CDR2)及SEQ ID NO；160(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：165(H-CDR1)、SEQ ID NO：166(H-CDR2)及SEQ ID NO：167(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：168(L-CDR1)、SEQ ID NO：169(L-CDR2)及SEQ ID NO：170(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：175(H-CDR1)、SEQ ID NO：176(H-CDR2)及SEQ ID NO：177(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO；178(L-CDR1)、SEQ ID NO：179(L-CDR2)及SEQ ID NO：180(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：185(H-CDR1)、SEQ ID NO：186(H-CDR2)及SEQ ID NO：187(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：188(L-CDR1)、SEQ ID NO：189(L-CDR2)及SEQ ID NO：190(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：195(H-CDR1)、SEQ ID NO：196(H-CDR2)及SEQ ID NO：197(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：198(L-CDR1)、SEQ ID NO：199(L-CDR2)及SEQ ID NO：200(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：205(H-CDR1)、SEQ ID NO：206(H-CDR2)及SEQ ID NO：207(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：208(L-CDR1)、SEQ ID NO：209(L-CDR2)及SEQ ID NO：210(L-CDR3)。

在一較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段含有一重鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：215(H-CDR1)、SEQ ID NO：216(H-CDR2)及SEQ ID NO：217(H-CDR3)；以及含有一輕鏈抗原-結合區，其含有SEQ ID NO：218(L-CDR1)、SEQ ID NO：219(L-CDR2)及SEQ ID NO：220(L-CDR3)。

舉例而言，本發明抗體可以是IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，而抗體片段可以是Fab、Fab’、F(ab’)2或scFv。據此，本發明抗體片段可以是或可含有以如本文所述之一或多種方式作用的抗原-結合區。

舉例而言，抗體Fab片段M048-D01(SEQ ID NO：31的VH鏈，以及SEQ ID NO：32的VL鏈)表示為人類IgG1 M048-D01-hIgG1(SEQ ID NO：67的重鏈，及SEQ ID NO：68的輕鏈)，而Fab片段M047-D08(SEQ ID NO：21的VH鏈，及SEQ ID NO：22的VL鏈)表示為人類IgG1 M047-D08-hIgG1(SEQ ID NO：69的重鏈，及SEQ ID NO：70的輕鏈)。為有效率地進行選殖，重鏈(SEQ ID NO：67及SEQ ID NO：69)的N-端頭3個胺基酸[EVQ]也可以另外表示為[QVE]，例如像是人類IgG1 M048-D01-hIgG1的重鏈之變體(SEQ ID NO：222)。為有效率地進行選殖，輕鏈的N-端可藉由胺基酸殘基(例如丙胺酸)被延長。

在較佳具體例中，本發明抗體或抗原-結合抗體片段為單株的。在更佳具體例中，本發明抗體或抗原-結合抗體片段為人類、人類化或嵌合抗體或抗原-結合抗體片段。

在另一個態樣中，本發明提供抗體或抗原-結合片段，其具有特異結合至FGFR2及/或對FGFR2具有高親和力的抗原-結合區，FGFR2係獨立於α與β同型異構體以及IIIb與IIIc剪接形式(例如參見SEQ ID NO：61的FGFR2α IIIb以及SEQ ID NO：62的FGFR2β IIIb)。

若親和力測量值係低於250 nM(抗體或抗原-結合片段的單價親和力)，則抗體或抗原-結合片段被說是對某抗原具有”高親和力”。本發明抗體或抗原-結合區較佳可以少於250 nM、較佳少於150 nM的親和力結合至人類FGFR2，如對人類FGFR2的單價親和力所測定。例如，本發明抗體對不同物種之FGFR2的親和力可能約為100 nM(抗體或抗原-結合片段的單價親和力)，如表8中針對M048-D1與M047-D08所例示。

IgG1形式係藉由螢光活化細胞分選(FACS)用於以細胞為基礎的親和力測定中。表6提供代表性抗-FGFR2-IgG抗體對於人類來源(SNU16、MFM223)、鼠科來源(4T1)與大鼠來源(RUCA)的癌細胞株的結合強度(EC₅₀)的歸納。

若根據FACS所測得的親和力測量值少於100 nM(IgG的表觀親和力)，則IgG1被說是對某抗原具有”高親和力”。本發明雙價抗體或抗原-結合片段較佳可以少於100 nM、更佳少於50 nM，且仍較佳地少於10 nM的親和力結合至FGFR2。更佳地雙價抗體以少於5 nM，及更佳少於1 nM的親和力結合至FGFR2，如IgG對FGFR2之表觀親和力所測定。舉例而言，本發明抗FGFR2之抗體對於人類、鼠科與大鼠來源之不同腫瘤細胞株的表觀親和力可為約89.5 nM或少於0.1 nM，如表6中所示根據FACS分析所測定。

當本發明抗體或抗原-結合片段進入表現FGFR2之腫瘤細胞之半最大內化時間(t½)少於180分鐘或更佳少於120分鐘，且又更佳少於90分鐘時，其有效率地內化。更佳的是依據如實施例12中所述程序測定，具有半最大內化時間(t½)為60分鐘或更少的抗體或抗原-結合片段。

小G-蛋白的共染色可用於更詳細地評估抗體在內化後的運載路徑。例如，調節膜運載(包括囊泡形成、囊泡沿著肌動蛋白及微管蛋白網絡移動與膜融合)的數個步驟的Rab GTPase可用來區別不同路徑。藉此，使用Rab7(其在晚期吞噬小體及溶小體中表現)標記抗體的共染色表示複合物在FGFR2內化後進入吞噬小體-溶小體路徑，而使用Rab11(其在早期與再循環吞噬小體中表現)的共染色表示此等抗體在結合至FGFR2後內化並偏好再循環路徑。進入吞噬小體-溶小體路徑能夠使抗體在內化後誘發FGFR2分解，其最後導致此路徑的去敏化。第7圖顯示如實施例12中所述本發明代表性抗體使用Rab7與Rab11的共染色型態。

本發明之可內化抗體或抗原-結合片段適於作為抗體-藥物結合物(ADC)的靶定部分。抗體或抗原-結合片段適於在活體外或活體內方法中用來將化合物(較佳為細胞毒性劑)遞送至表現FGFR2的細胞中。

在一些具體例中，分離抗體、其抗原-結合片段或其衍生物，或編碼其等的核酸。分離的生物組分(諸如核酸分子或諸如抗體的蛋白質)是實質上已從生物細胞(該等組分天然存在其中)之其他生物組分(例如其他染色體或染色體外DNA與RNA、蛋白質和胞器)被分離或純化出來者。已被”分離”的核酸與蛋白質包括經由如例如在Sambrook等人1989(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning：A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,USA)以及Robert K. Scopes等人1994(Protein Purification,-Principles and Practice,Springer Science and Business Media LLC)中所述的標準純化方法而純化的核酸及蛋白質。該術語亦含括藉由在宿主細胞以重組方式表現以及以化學方式合成的核酸所製備的核酸及蛋白質。

本發明抗體可衍生自重組型抗體庫，該重組型抗體庫是以從大量健康自願者的抗體分離出來的胺基酸序列為基礎。使用n-CoDeR®技術，將完整人類CDR重組至新的抗體分子中。獨特的重組程序容許該庫含有由比人類免疫系統天然創造者更廣泛多樣的抗體。

抗體產生

藉由組合全細胞與蛋白質淘選並透過發展特定方法，完整人類N-CoDeR抗體噬菌體展示庫被用來分離本發明的FGFR2-特異性、人類單株抗體。此等方法包括發展能夠鑑別偏好結合至展示在細胞表面，且與鼠科FGFR2以及來自其他物種之FGFR2交叉反應，並具有獨立於FGFR2過度表現和FGFR2-相關疾病(諸如癌症)中所發現的常見FGFR2突變之結合與功能活性之抗體的淘選(panning)程序以及篩選分析。

藉由組合三種非習知方法在噬菌體-展示技術(PDT)中發展出針對細胞表面FGFR2的抗體。首先，使用數種剪接變體(α、β、IIIb與IIIc)之重組型、可溶性、人類與鼠科FGFR2 Fc-融合蛋白進行篩選，以篩選出非常廣泛的剪接變體交叉反應性。其次，另外使用在其細胞表面表現FGFR2的KATO III細胞進行細胞-表面篩選。第三，發展篩選方法，其容許成功篩選在對全部KATOIII細胞及數種剪接變體之重組型、可溶性、人類與鼠科FGFR1、FGFR2、FGFR3及FGFR4 Fc融合蛋白進行淘選時所得之噬菌體產品，以針對FGFR2篩選具有非常廣泛剪接變體交叉反應性的特異性結合子(未結合至FGFR1、FGFR3及FGFR4)。

在鑑別較佳的Fab片段之後，此等表示為全長IgG。舉例而言，抗體片段M048-D01(SEQ ID NO：31的VH鏈，及SEQ ID NO：32的VL鏈)表示為人類IgG1 M048-D01-hIgG1(SEQ ID NO：67的重鏈，及SEQ ID NO： 68的輕鏈)，而Fab片段M047-D08(SEQ ID NO：21的VH鏈，及SEQ ID NO：22的VL鏈)表示為人類IgG1 M047-D08-hIgG1(SEQ ID NO：69的重鏈，及SEQ ID NO：70的輕鏈)。為有效率地進行選殖，重鏈(SEQ ID NO：67及SEQ ID NO：69)的N-端頭3個胺基酸[EVQ]也可另外表示為[QVE]，例如像是人類IgG1 M048-D01-hIgG1之重鏈的變體(SEQ ID NO：222)。為有效率地進行選殖，輕鏈的N-端可藉由胺基酸殘基(例如丙胺酸)被延長。此等建構物可例如暫時在哺乳動物細胞中被表現，如在Tom等人，Chapter 12 in Methods Express：Expression Systems edited by Micheal R. Dyson and Yves Durocher,Scion Publishing Ltd,2007中所述。簡言之，以CMV-啟動子為基礎的表現質體被轉染至HEK293-6E細胞中並培育在馮巴赫燒瓶(Fernbach-Flask)或搖袋中。在37℃下於F17培養基(Invitrogen)中表現5至6天。轉染後24小時補充5 g/l胰腖TN1(Organotechnie)、1%超低IgG FCS(Invitrogen)及0.5 mM丙戊酸(Sigma)。

進一步按照此等抗體在ELISA中的結合親和力，以及按照對可溶性FGFR2之BIAcore結合來進行此等抗體的特徵鑑定。進行與不同物種之細胞的FACS結合以篩選對小鼠、大鼠及人類癌細胞株具有高親和力的細胞結合抗體。

此等特定方法的組合容許分離出獨特抗體”M017-B02”、”M021-H02”、”M047-D08”、”M048-D01”、”M054-A05”及”M054-D03”。

更多特徵鑑定揭示所選抗體因為其特殊特徵而結合至FGFR2之N-端處的獨特表位。此等獨特抗體更進一步在活體外磷酸化分析、內化分析以及活體內腫瘤異體移植實驗中被特徵鑑定。所選抗體在使用SNU16細胞的腫瘤異體移植實驗中顯示強烈且明顯的抗-腫瘤活性。

肽變體

本發明抗體或抗原-結合片段不限於本文所提供的特定肽序列。更確切地說，本發明亦包含此等多肽的變體。參照本揭示內容以及習知可用技術與參考文獻，習於技藝的工作人員將能夠製備、測試並使用本文揭示抗體的功能變體，同時瞭解此等能夠結合至FGFR2的變體落在本發明範疇內。

變體可包括，例如，與本文揭示之肽序列相較之下至少一個互補決定區(CDR)(高變異)及/或骨架(FR)(可變)域/位置有所改變。為更充分說明這個概念，下面是抗體結構的簡要說明。

抗體由兩個肽鏈所組成，各自含有一(輕鏈)或三(重鏈)恆定域以及一可變區(VL、VH)，後者在不同情況下構成四個FR區以及三個間隔的CDR。抗原-結合位點是由一或多個CDR所形成，而FR區提供CDR的結構骨架，且因此在抗原結合時扮演重要的角色。藉由改變CDR或FR區中的一或多個胺基酸殘基，習於技藝者可慣常地製造突變型或多樣化抗體序列，其例如可以就新穎或改進特性針對抗原進行篩選。

本發明的一個更佳具體例為VH及VL序列係如表9中所示來選定的抗體或抗原-結合片段。習於技藝者可使用表9中的數據來設計落在本發明範疇內的肽變體。較佳地，變體是透過改變一或多個CDR區中的胺基酸而製造；變體亦可具有一或多個經改變的骨架區。改變也可以在骨架區內。例如，肽FR域可被改變，其中相較於生殖系序列有一個殘基誤差。

或者，習於技藝者可使用例如Knappik A.,et al.,JMB 2000,296：57-86中所述的程序，藉由將本文所揭示的胺基酸序列與同類抗體之已知序列相比對來進行相同分析。

此外，變體可藉由使用一個抗體作為最佳化的起始點，藉由使該抗體中的一或多個胺基酸(較佳係一或多個CDR中的胺基酸殘基)多樣化，以及藉由對所產生的抗體變體組合篩選具有改良特性之變體而獲得。尤佳地，VL及/或VH之CDR3中的一或多個胺基酸殘基多樣化。多樣化可以藉由使用三核苷酸突變(TRIM)技術(Virnekäs B. et al.,Nucl.Acids Res.1994,22：5600.)合成一組DNA分子來完成。抗體或其抗原-結合片段包括具有修飾/變異的分子，修飾/變異包括，但不限於例如造成半衰期改變的修飾(例如Fc部分的修飾或其他諸如PEG分子附接)、結合親和力改變的修飾或ADCC或CDC活性改變的修飾。

提供抗體變體的實施例為如表10中所示的M048-D01(TPP-1397、TPP-1398、TPP-1399、TPP-1400、TPP-1401、TPP-1402及TPP-1403)以及M047-D08(TPP-1406、 TPP-1407、TPP-1408、TPP-1409、TPP-1410、TPP-1411、TPP-1412及TPP-1415)。這些變體抗體的改良特性如表11中所示。

守恆性胺基酸變體

可製造多肽變體，其保有本文所述抗體肽序列的整個分子結構。提供個別胺基酸的特性，習於技藝者將能識別一些合理的取代。胺基酸取代，亦即”守恆性取代”可例如基於涉及殘基之極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性及/或兩親媒性的相似性而作出。

例如，(a)非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、硫胺酸、異硫胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸；(b)極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺酸及麩醯胺酸；(c)帶正電荷(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸；以及(d)帶負電荷(酸性)胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。取代通常在組(a)-(d)之間進行。此外，甘酸酸與脯胺酸可基於它們能破壞α-螺旋而彼此取代。同樣地，某些胺基酸，諸如丙胺酸、半胱胺酸、硫胺酸、甲硫胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、組胺酸與離胺酸在α-螺旋中較為常見，而纈胺酸、異硫胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸及蘇胺酸在β-折片中較為常見。甘胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸及脯胺酸在轉折處常見。一些偏好的取代可在下列群組中進行：(i)S與T；(ii)P與G；(iii)A、V、L與I。提供已知遺傳密碼，與重組及合成DNA技術，習於技藝者可容易地建構編碼守恆性胺基酸變體的DNA。

如本文所用，兩個多肽序列間的”序列同一性”表示序列間相同胺基酸的百分比。”序列同源性”表示相同或表示守恆性胺基酸取代之胺基酸的百分比。

本發明的DNA分子

本發明亦係有關於編碼本發明抗體或其抗原-結合片段的DNA分子。此等序列包括，但不限於那些SEQ ID NO：3、4、13、14、23、24、33、34、43、44、53及54中所示的DNA分子。

本發明的DNA分子不限於本文揭示的序列，但亦包括其變體。本發明中的DNA變體可依據參照它們在雜交時的物理特性來說明。習於技藝者將領會到，使用核酸雜交技術，DNA可用於鑑別其互補者還有等效物或同源物，且因為DNA為雙股。亦應領會到，雜交可能發生在少於100%互補性的情況下。但是，提供適當選擇的條件，雜交技術可基於它們與特定探針的結構關聯性而被用來區別DNA序列。有關此等條件的指導，參見Sambrook et al.,1989上文及Ausubel et al.,1995(Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds.(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York：John Wiley and Sons)。

兩個多核苷酸序列間的結構相似性可表示為條件”嚴苛度”的函數，在該條件下兩個序列將與彼此雜交。如本文所用，術語”嚴苛度”意指條件不利於雜交的程度。嚴苛

條件強烈不利於雜交，且僅有結構上最為相關的分子會在此等條件下彼此雜交。相反地，非嚴苛條件有利於表現結構相關性程度較低的分子彼此雜交。因此，雜交嚴苛度與兩個核酸序列的結構相關性直接相關。下列關係式係用於使雜交與相關性相關聯(其中T_m為核酸雙股的熔融溫度)：a. T_m=69.3+0.41(G+C)%

b.雙股DNA的T_m隨著失配鹼基對數目每增加1%而降低1℃。

c.(T_m)_μ2-(T_m)_μ1=18.5 log₁₀μ2/μ1

其中μ1及μ2係兩種溶液的離子強度。

雜交嚴苛性為許多因素的函數，包括總DNA濃度、離子強度、溫度、探針大小及存在破壞氫鍵結之試劑。增進雜交的因素包括高DNA濃度、高離子強度、低溫、較長的探針大小及不存在破壞氫鍵結之試劑。雜交通常以兩個階段進行：「結合」階段與「洗滌」階段。

功能等效變體

本發明範疇內的另一類DNA變體可參照其編碼之產物來說明。此等功能等效多核苷酸是因為遺傳密碼的簡併性，藉由它們編碼在SEQ ID NO：1、2、5-12、15-22、25-32、35-42、45-52、55-60中所發現的相同肽序列而被鑑別。

領會到本文提供的DNA分子之變體可以數種不同方式來建構。舉例而言，它們可以建構為完全合成DNA。有效率地合成20至約150個核苷酸範圍的寡核苷酸的方法係廣泛可用的。參見Ausubel et al.,section 2.11, Supplement 21(1993)。可以首先在Khorana et al.,J.Mol.Biol.72：209-217(1971)；亦參見Ausubel et al.，上文，第8.2節中所報導的方式合成並組裝重疊寡核苷酸。合成DNA較佳是使用經工程化而位在基因之5’與3端處的習知限制位點來設計，以幫助選殖至適當載體中。

如所示，產生變體的方法始於本文揭示DNA的一者，接著進行定位突變。參見Ausubel et al.，上文，chapter 8,Supplement 37(1997)。在一種典型的方法中，標的DNA被選殖至單股DNA噬菌體載體中。分離單股DNA並與含有所要核苷酸變化(等)的寡核苷酸雜交。合成互補股並將雙股噬菌體引入宿主中。一些所得的後代將含有所要突變體，其可使用DNA定序予以確認。此外，各種方法係可使用的，它們增加後代噬菌體將會是所要突變體的可能性。此等方法對於熟習本領域者來說是熟知的且用於產生此等突變體的套組為商業上可購得的。

重組型DNA建構物與表現

本發明更提供重組型DNA建構物，其含有一或多個本發明核苷酸序列。本發明重組型建構物可與載體(諸如質體、噬菌粒、噬菌體或病毒載體)一起使用，編碼本發明抗體或其抗原-結合片段的DNA分子被插入其中。

本文所提供的抗體、抗原結合部分或其衍生物可藉由在宿主細胞中重組表現編碼輕鏈與重鏈或其部分之核酸序列來製備。為以重組方式表現抗體、抗原結合部分或其衍生物，可使用帶有編碼輕鏈及/或重鏈或其部分的DNA 片段的重組型表現載體轉染宿主細胞，以在宿主細胞中表現該輕鏈與重鏈。使用標準重組型DNA方法學製備及/或獲得編碼重鏈與輕鏈的核酸、將此等核酸併入重組表現載體並將該等載體引入宿主細胞，諸如彼等描述於Sambrook,Fritsch and Maniatis(eds.),Molecular Cloning；A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989),Ausubel,F. M. et al.(eds.)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,(1989)以及Boss等人的美國專利第4,816,397號中。

此外，編碼重鏈及/或輕鏈的可變區的核酸序列可轉換成，例如編碼全長抗體鏈、Fab片段或scFv的核酸序列。編碼VL或VH的DNA片段可操作地連接(使得藉由兩個DNA片段所編碼的胺基酸序列在框架內)至另一編碼例如抗體恆定區或彈性連接子的DNA片段。人類重鏈與輕鏈恆定區的序列為此技藝中已知的(參見例如Kabat, E. A., el al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)且含括此等區的DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。

在某些分析中，本發明抗體較佳表現為鼠科IgG，例如使用人類樣本的免疫組織化學可透過使用鼠科抗體而更容易分析。因此，例如抗體Fab片段M048-D01(SEQ ID NO：31的VH鏈，及SEQ ID NO：32的VL鏈)表示為鼠科IgG2a，被稱為M048-D01-mIgG2a(SEQ ID NO：221的重鏈)。此抗體亦用於實施例17中作為對照。

為製造編碼scFv的多核苷酸序列，編碼VH以及VL的核酸可操作地連接至另一編碼彈性連接子的片段，使得VH及VL序列可表現為連續單鏈蛋白，其中VL及VH區是藉由彈性連接子而連結(參見例如Bird et al.(1988)Science 242：423-426；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty et al.,Nature(1990)348：552-554)。

為表現抗體、抗原結合部分或其衍生物，可使用標準重組型DNA表現方法(參見，例如Goeddel；Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990))。例如，編碼所要多肽的DNA可被插入表現載體中，其接而被轉染至適當宿主細胞中。適當的宿主細胞為原核及真核細胞。原核宿主細胞的實施例為例如細菌，真核宿主細胞的實施例為酵母菌、昆蟲或哺乳動物細胞。在一些具體例中，編碼重鏈與輕鏈的DNA被插入分別的載體中。在其他具體例中，編碼重鏈與輕鏈的DNA被插同一載體中。應理解表現載體的設計(包括調節序列的選定)受到諸如所選宿主細胞、所要蛋白質的表現程度及表現為組成性或誘導性的因素所影響。

細菌表現

供細菌使用的可用表現載體是藉由將編碼所要蛋白質的結構DNA序列與適當轉譯起始與終止訊號一起插入具有功能性啟動子的可操作閱讀位向。載體將包含一或多個表現型可選擇標記以及複製源點以確保載體的維持，且若需要的話在宿主中提供擴增。用於轉形的適當原核宿主包括大腸桿菌、枯草桿菌、沙門氏桿菌及假單孢菌、放線菌和葡萄球菌的不同菌種。

細菌載體可以是(例如)以噬菌體、質體或噬菌粒為基礎。此等載體可含有可篩選標記以及衍生自商業上可取得之質體的細菌複製源點(通常含有已知選殖載體pBR322(ATCC 37017)的要素)。在適當宿主菌株轉形以及宿主菌株生長至適當細胞密度之後，藉由適當的方式(例如溫度切換或化學誘導)去抑制/誘導選定的啟動子，並培養細胞又一段時間。通常藉由離心收取細胞、藉由物理或化學方式破壞並且保留所形成的粗萃取物以供進一步純化。

在細菌系統中，可依據所要用途針對待表現蛋白質有利地選定一些表現載體。例如，當要生產大量此等蛋白質以產生抗體或篩選肽庫時，直接表現易於純化之高量融合蛋白產物的載體將會是所要的。

因此，本發明之具體例為一種表現載體，其含有編碼本發明之新穎抗體的核酸序列。關於例示性說明參見實施例2。

本發明抗體或其抗原-結合片段包括天然經純化的產物、化學合成程序的產物以及藉由重組型技術由原核宿主(包括，例如大腸桿菌、枯草桿菌、沙門氏桿菌及假單孢菌、放線菌和葡萄球菌的不同菌種，較佳為大腸桿菌細胞)生產的產物。

哺乳動物表現及純化

關於哺乳動物宿主細胞表現的較佳調節序列包括在哺乳動物細胞中指引高量蛋白質表現的病毒要素，諸如衍生自巨大細胞病毒(CMV)的啟動子及/或增強子(諸如CMV啟動子/增強子)、猴病毒40(SV40)的啟動子及/或增強子(諸如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))以及多瘤病毒。更多關於病毒調節要素及其序列的說明參見(例如)Stinski的U.S.5,168,062、Bell et al.的U.S.4,510,245以及Schaffner et al.的U.S.4,968,615。重組表現載體亦可包括複製源點及可篩選標記(參見，例如Axel et al.的U.S.4,399,216、4,634,665與U.S.5,179,017)。適當的可篩選標記包括將對藥物(諸如G418、潮黴素或甲胺蝶呤)之抗性的基因賦予給已引入載體的宿主細胞。例如，二氫葉酸還原酶(DHFR)基因賦予對甲胺蝶呤之抗性，而neo基因賦予對G418的抗性。為有效率地進行選殖，重鏈(SEQ ID NO：67及SEQ ID NO：69)的N-端頭3個胺基酸[EVQ]也可以另外表示為[QVE]，例如像是人類IgG1 M048-D01-hIgG1的重鏈之變體(SEQ ID NO：222)。為有效率地進行轉殖，輕鏈的N-端可藉由胺基酸殘基(例如丙胺酸)被延長。

將表現載體轉染至宿主細胞中可使用標準技術來進行，諸如電穿孔、磷酸鈣沉澱以及DEAE-聚葡萄糖轉染。

用於表現本文提供之抗體、抗原結合部分或其衍生物的適當哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括dhfr-CHO細胞，描述於Urlaub and Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，與DHFR可篩選標記一起使用(例如描述於R. J. Kaufman and P. A. Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。在一些具體例中，設計表現載體以使得被表現的蛋白質分泌至宿主細胞所生長的培養基中。抗體、抗原結合部分或其衍生物可使用標準蛋白質純化方法由培養基中回收。

本發明抗體或其抗原-結合片段可藉由已知方法而由重組型細胞培養物中被回收並純化，已知方法包括(但不限於)硫酸銨或乙醇沉澱、酸萃取、蛋白質A層析法、蛋白質G層析法、陰離子或陽離子交換層析法、磷酸鹽-纖維素層析法、疏水性交互作用層析法、親和力層析法、氫氧磷灰石層析法及植物凝集素層析法。亦可採用高效液相層析法(「HPLC」)來純化。參見，例如Colligan,Current Protocols in Immunology,or Current Protocols in Protein Science,John Wiley & Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，各自全部以引用的方式併入本文中。

本發明抗體或其抗原-結合片段包括天然經純化的產物、化學合成程序的產物，以及藉由重組型技術由真核宿主(例如酵母菌、高等植物、昆蟲及哺乳動物)製造的產物。視重組生產程序中所用的宿主而定，本發明抗體可經糖基化或可以是未糖基化。此等方法描述於許多標準實驗室手冊中，諸如Sambrook，上文，第17.37-17.42節；Ausubel，上文，第10、12、13、16、18及20章。

因此，本發明之具體例亦為含有該載體或核酸分子的宿主細胞，其中該宿主細胞可為高等真核生物宿主細胞(諸如哺乳動物細胞)、低等真核生物宿主細胞(諸如酵母菌細胞)，且可以是原核生物細胞(諸如細菌細胞)。

本發明的另一具體例為一種使用該宿主細胞生產抗體及抗原結合片段的方法，其包含在適當條件下培養該宿主細胞並回收該抗體。

因此，本發明的另一具體例為使用本發明宿主細胞來生產依據本發明之抗體(例如抗體M048-D01-hIgG1)，以及將此等抗體純化至至少95重量%均質性。

治療方法

治療方法涉及對需要治療之個體投與治療有效量之本發明預期之抗體或其抗原-結合片段。”治療有效”量定義為在個體之受治療區域內耗盡FGFR2-陽性細胞之足量的抗體或抗原-結合片段的量-不論是單劑量或依據多劑量方案，單獨或與其他藥劑組合，其造成不良病況減輕，但該量在毒物學上是可耐受的。該個體可以是人類或非人類動物(例如兔、大鼠、小鼠、狗、猴或其他低等靈長類)。

本發明抗體或其抗原-結合片段可與以之藥物共投與，且在一些情況下該抗體本身可經修飾。舉例而言，抗體可以結合至細胞毒性劑或放射性同位素以進一步增強效力。

本發明抗體可作為單獨藥劑或與一或多種其他治療劑組合投與，其中該組合不會造成無法接受的不良效用。此組合療法包括投與單一醫藥劑量調配物，其含有本發明抗體及一或多種其他治療劑，以及投與於其分別醫藥劑量調配物中之本發明抗體及各其他治療劑。例如，本發明抗體及治療劑可在單一口服劑量組成物(諸如錠劑或膠囊)中被一起投與給患者，或每一藥劑各自在分別劑量調配物中被投與。

當使用分別劑量調配物時，本發明抗體與一或多種其他治療劑可在基本上相同的時間被投與(例如同時)或在分開交錯的時間被投與(例如依序)。

具體而言，本發明抗體可與其他抗-腫瘤劑固定或分開組合，該其他抗-腫瘤劑係諸如烷化劑、抗代謝物、植物-衍生性抗-腫瘤劑、激素療法劑、拓樸異構酶抑制劑、喜樹鹼衍生物、激酶抑制劑、靶定藥物、抗體、干擾素及/或生物反應修飾劑、抗-血管新生化合物及其他抗-腫瘤藥物。在此方面，下列為可用於與本發明抗體組合的第二藥劑實施例的非限制性列表：烷化劑包括，但不限於氮芥-氧化物(nitrogen mustard N-oxide)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、依弗醯胺(ifosfamide)、塞替派(thiotepa)、雷莫司汀(ranimustine)、尼莫司汀(nimustine)、替莫唑胺(temozolomide)、六甲蜜胺(altretamine)、阿帕奇坤(apaziquone)、波司他林辛 (brostallicin)、苯達莫司汀(bendamustine)、卡莫司汀(carmustine)、雌莫司汀(estramustine)、福莫司汀(fotemustine)、葡磷醯胺(glufosfamide)、馬磷醯胺(mafosfamide)、苯達莫司汀(bendamustin)，與二溴衛矛醇(mitolactol)；鉑-配位烷化化合物(platinum-coordinated alkylating compounds)包括，但不限於順鉑、卡鉑、依鉑(eptaplatin)、洛鉑(lobaplatin)、奈達鉑(nedaplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)，及賽特鉑(satraplatin)；抗-代謝物包括，但不限於胺甲葉酸(methotrexate)、6-巰基嘌呤核苷(6-mercaptopurine riboside)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)單獨或與甲醯四氫葉酸(leucovorin)組合、替加氟(tegafur)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、卡莫氟(carmofur)、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytarabine)、阿拉伯糖基胞嘧啶十八烷基磷酸鹽(cytarabine ocfosfate)、依諾他濱(enocitabine)、吉西他濱(gemcitabine)、氟達拉濱(fludarabin)、5-阿紮胞苷(5-azacitidine)、卡培他濱(capecitabine)、克拉屈濱(cladribine)、克羅拉濱(clofarabine)、丁西他濱(decitabine)、依氟鳥胺酸(eflornithine)、乙炔基胞嘧啶核苷(ethynylcytidine)、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytosine arabinoside)、羥基脲(hydroxyurea)、美法侖(melphalan)、奈拉濱(nelarabine)、諾拉曲特(nolatrexed)、十八烷基磷酸鹽(ocfosfite)、培美曲塞二鈉(disodium premetrexed)、噴司他丁(pentostatin)、培利曲索(pelitrexol)、雷替曲塞 (raltitrexed)、三派(triapine)、曲美沙特(trimetrexate)、維達拉濱(vidarabine)、長春新鹼(vincristine)，及長春瑞濱(vinorelbine)；激素療法劑包括，但不限於依西美坦(exemestane)、柳菩林(Lupron)、阿那曲唑(anastrozole)、度骨化醇(doxercalciferol)、法倔唑(fadrozole)、福美司坦(formestane)、11-β羥基類固醇去氫酶1抑制劑(11-beta hydroxysteroid dehydrogenase 1 inhibitors)、諸如醋酸阿比特龍(abiraterone acetate)的17-α羥化酶/17,20解離酶抑制劑(17-alpha hydroxylase/17,20 lyase inhibitors)、諸如非那雄胺(finasteride)與依立雄胺(epristeride)的5-α還原酶抑制劑(5-alpha reductase inhibitors)、諸如檸檬酸他莫西芬(tamoxifen citrate)與氟維司群(fulvestrant)的抗雌激素、羥萘酸曲普瑞林(Trelstar)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、拉索昔芬(lasofoxifene)、來曲唑(letrozole)、諸如比卡魯胺(bicalutamide)的抗雄性素、氟他胺(flutamide)、米非司酮(mifepristone)、尼魯米特(nilutamide)、可蘇多(Casodex)，及抗黃體素與其組合；植物-衍生性抗-腫瘤物質包括例如彼等選自於有絲分裂抑制劑者，例如埃博黴素(epothilones)(諸如沙戈匹隆(sagopilone)、伊沙匹隆(ixabepilone)與埃博黴素B(epothilone B))、長春花鹼(vinblastine)、長春氟寧(vinflunine)、多西紫杉醇(docetaxel)，及太平洋紫杉醇(paclitaxel)；細胞毒性拓樸異構酶抑制劑包括，但不限於阿柔比星(aclarubicin)、阿黴素(doxorubicin)、氨萘非特(amonafide)、貝洛替康(belotecan)、喜樹鹼(camptothecin)、10-羥基喜樹鹼(10-hydroxycamptothecin)、9-胺基喜樹鹼(9-aminocamptothecin)、二氟替康(diflomotecan)、依立替康(irinotecan)、托泊替康(topotecan)、艾特卡林(edotecarin)、表柔比星(epimbicin)、依託泊苷(etoposide)、依喜替康(exatecan)、吉馬替康(gimatecan)、勒托替康(lurtotecan)、雙羥蒽醌(mitoxantrone)、吡柔比星(pirambicin)、匹杉瓊(pixantrone)、魯比替康(rubitecan)、索布佐生(sobuzoxane)、他氟泊苷(tafluposide)，及其組合；免疫劑包括干擾素(諸如干擾素α、干擾素α-2a、干擾素α-2b、干擾素β、干擾素γ-1a與干擾素γ-n1)，及其他免疫增強劑，諸如L19-IL2與其他IL2衍生物、惠爾血添(filgrastim)、香菇多醣(lentinan)、西佐喃(sizofilan)、泰斯卡介苗(TheraCys)、烏苯美司(ubenimex)、阿地白介素(aldesleukin)、阿侖單抗(alemtuzumab)、BAM-002、達卡巴仁(dacarbazine)、達昔單抗(daclizumab)、地尼白介素(denileukin)、吉妥單抗(gemtuzumab)、卡奇黴素(ozogamicin)、替伊莫單抗(ibritumomab)、咪喹莫特(imiquimod)、來格司亭(lenograstim)、香菇多醣(lentinan)、黑色素瘤疫苗(melanoma vaccine)(Corixa)、莫拉司亭(molgramostim)、沙格司亭(sargramostim)、他索爾明(tasonermin)、特白介素(tecleukin)、胸腺法新(thymalasin)、托西莫單抗(tositumomab)、溫立真(Vimlizin)、依帕珠單抗(epratuzumab)、米妥莫單抗(mitumomab)、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕尼單抗(pemtumomab)，及普芬奇(Provenge)；生物反應修飾劑係彼等修飾生物的防禦機制或生物反應(諸如組織細胞的存活、生長或分化)以使得它們具有抗腫瘤活性的藥劑；此等藥劑包括，例如雲芝素(krestin)、香菇多醣(lentinan)、西佐糖(sizofiran)、畢西巴尼(picibanil)、ProMune，及烏苯美司(ubenimex)；抗-血管新生化合物包括，但不限於阿曲汀(acitretin)、阿柏西普(aflibercept)、血管增生抑制素(angiostatin)、海洋環肽(aplidine)、阿森塔(asentar)、阿西替尼(axitinib)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、博凡尼丙胺酸酯(brivanib alaninat)、西侖吉肽(cilengtide)、考布他丁(combretastatin)、內皮抑素(endostatin)、芬維A胺(fenretinide)、哈洛夫酮(halofuginone)、帕唑帕尼(pazopanib)、藍尼單抗(ranibizumab)、瑞馬司他(rebimastat)、瑞森汀(recentin)、瑞格非尼(regorafenib)、瑞木單抗(removab)、雷利米得(revlimid)、索拉非尼(sorafenib)、鯊胺(squalamine)、舒尼替尼(sunitinib)、替拉替尼(telatinib)、沙利竇邁(thalidomide)、烏可藍(ukrain)、瓦他拉尼(vatalanib)，及為他新(vitaxin)；抗體包括，但不限於曲妥珠單抗(trastuzumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、托珠單抗(ticilimumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、魯昔單抗(lumiliximab)、卡妥索單抗(catumaxomab)、阿塞西普(atacicept)、奧伐伏單抗(oregovomab)，及阿來組單抗(alemtuzumab)；VEGF抑制劑諸如，例如索拉非尼(sorafenib)、瑞格非尼(regorafenib)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、舒尼替尼(sunitinib)、瑞森汀(recentin)、阿西替尼(axitinib)、阿柏西普(aflibercept)、替拉替尼(telatinib)、博凡尼丙胺酸酯(brivanib alaninate)、瓦他拉尼(vatalanib)、帕唑帕尼(pazopanib)，及雷珠單抗(ranibizumab)；EGFR(HER1)抑制劑諸如，例如西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、維克替比(vectibix)、吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)，及凡德他尼(Zactima)；HER2抑制劑諸如，例如拉帕替尼(lapatinib)、曲妥珠單抗(tratuzumab)，及帕妥珠單抗(pertuzumab)；mTOR抑制劑諸如，例如西羅莫司(temsirolimus)、西羅莫司(sirolimus)/雷帕黴素(Rapamycin)，及依維莫司(everolimus)；c-Met抑制劑；PI3K與AKT抑制劑；CDK抑制劑，諸如瑞芬太尼(roscovitine)及夫拉平度(flavopiridol)；紡錘體組裝檢查點抑制劑及靶定抗有絲分裂劑，諸如 PLK抑制劑、Aurora抑制劑(例如Hesperadin)、檢查點激酶抑制劑，以及KSP抑制劑；HDAC抑制劑，諸如，例如帕比司他(panobinostat)、伏立諾他(vorinostat)、MS275、貝林諾他(belinostat)，及LBH589；HSP90及HSP70抑制劑；蛋白酶體抑制劑，諸如硼替佐米(bortezomib)及卡非佐米(carfilzomib)；絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑，包括MEK抑制劑及Raf抑制劑，諸如索拉非尼(sorafenib)；法尼基轉移酶抑制劑，諸如，例如替吡法尼(tipifarnib)；酪胺酸激酶抑制劑，包括，例如達沙替尼(dasatinib)、尼祿替尼(nilotibib)、瑞格法尼(regorafenib)、伯舒替尼(bosutinib)、索拉非尼(sorafenib)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、舒尼替尼(sunitinib)、西地尼布(cediranib)、阿西替尼(axitinib)、阿柏西普(aflibercept)、替拉替尼(telatinib)、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)、博凡尼丙胺酸酯(brivanib alaninate)、帕唑帕尼(pazopanib)、雷珠單抗(ranibizumab)、瓦他拉尼(vatalanib)、西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、維克替比(vectibix)、吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、曲妥珠單抗(tratuzumab)，與帕妥珠單抗(pertuzumab)，及c-Kit抑制劑；維生素D受體促效劑；Bcl-2蛋白抑制劑，諸如奧巴克拉(obatoclax)、奧利默森鈉(oblimersen sodium)，及棉子酚(gossypol)；分化叢集20受體拮抗劑諸如，例如利妥昔單抗；核糖核苷酸還原酶抑制劑諸如，例如吉西他濱(gemcitabine)；誘發腫瘤壞死細胞凋亡之配體受體1促效劑，諸如，例如馬帕木單抗(mapatumumab)；5-羥色胺受體拮抗劑，諸如，例如rEV598、紮利羅登(xaliprode)、鹽酸帕洛諾司瓊(palonosetron hydro-chloride)、格拉司瓊(granisetron)、Zindol，及AB-1001；整合素抑制劑包括，α5-β1整合素抑制劑，諸如例如E7820、JSM 6425、伏洛昔單抗(volociximab)，及內皮抑素(endostatin)；雄性素受體拮抗劑包括，例如氟奮乃靜癸酸酯(nandrolone decanoate)、氟羚甲基睪丸素(fluoxymesterone)、Android、Prost-aid、雄莫司汀(andromustine)、比卡鲁胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、apo-氯羥甲烯孕酮(apo-cyproterone)、apo-氟他胺(apo-flutamide)、醋酸氯地孕酮(chlormadinone acetate)、Androcur、Tabi、醋酸氯羥甲烯孕酮(cyproterone acetate)，及尼鲁米特(nilutamide)；芳香酶抑制劑諸如，例如阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、睪內酯(testolactone)、依西美坦(exemestane)、氨鲁米特(aminoglutethimide)，及福美坦(formestane)；基質金屬蛋白酶抑制劑；其他抗-癌劑包括，例如阿利維甲酸(alitretinoin)、安普利近(ampligen)、阿曲生坦貝沙羅汀(atrasentan bexarotene)、硼替佐米(bortezomib)、波生坦(bosentan)、骨化三醇(calcitriol)、磺酸舒林酸(exisulind)、福莫司汀(fotemustine)、伊班膦酸(ibandronic acid)、米替福(miltefosine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、I-天冬醯胺酸酶(I-asparaginase)、丙卡巴肼(procarbazine)、達卡巴仁(dacarbazine)、羥基脲(hydroxycarbamide)、培加帕酶(pegaspargase)、噴司他丁(pentostatin)、他紮羅汀(tazaroten)、萬珂(velcade)、硝酸鎵(gallium nitrate)、堪佛司非米德(canfosfamide)、達寧帕辛(darinaparsin)，及視網酸(tretinoin)。

在較佳具體例中，本發明抗體可與化療(亦即細胞毒性劑)、抗-激素及/或標靶療法(諸如其他激酶抑制劑(例如EGFR抑制劑)、mTOR抑制劑與血管新生抑制劑)組合使用。

本發明化合物亦可在癌症治療時與放射療法及/或外科干預組合使用。

本發明抗體或其抗原-結合片段在一些情況下本身可經修飾。例如，抗體可與不限於上述化合物之一者或任一放射性同位素組合以進一步增強效用。此外，可使用本發明抗體本身或在組成物中、在研究與診斷中，或作為分析參考標準品及類似者，其為技藝中所熟知。

本發明抗體或其抗原-結合片段可用做為治療或診斷工具使用於各種有異常FGFR2-信號傳遞的情況中，例如細胞增生性病症，諸如癌症或纖維化疾病。尤其適用於以本發明抗體治療的病症與病況為實體腫瘤，諸如乳房、呼吸道、腦、生殖器官、消化道、泌尿道、眼、肝、皮膚、頭頸、甲狀腺、副甲狀腺的癌症及其遠端轉移。此等病症亦包括淋巴瘤、肉瘤與白血病。

消化道的腫瘤包括，但不限於肛門、結腸、結腸直腸、食道、膀胱、胃、胰臟、直腸、小腸及唾腺癌。

食道癌的實施例包括，但不限於食道細胞癌及腺癌，以及鱗狀細胞癌、平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma)、惡性黑色素瘤(malignant melanoma)、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)及淋巴瘤。

胃癌的實施例包括，但不限於腸型與瀰漫型胃腺癌。

胰臟癌的實施例包括，但不限於管腺癌、腺樣鱗狀細胞癌及胰臟內分泌腫瘤(pancreatic endocrine tumors)。

乳癌的實施例包括，但不限於三重因性乳癌、侵犯性腺管癌、侵犯性乳葉癌(invasive lobular carcinoma)、原位腺管癌(ductal carcinoma in situ)，及原位乳葉癌(lobular carcinoma in situ)。

呼吸道癌的實施例包括，但不限於小細胞肺癌與非小細胞肺癌，以及支氣管腺瘤(bronchial adenoma)與肺母細胞瘤(pleuropulmonary blastoma)。

腦癌的實施例包括，但不限於腦幹與下視丘神經膠瘤、小腦與大腦星狀細胞瘤、神經膠母細胞瘤、神經管胚細胞瘤、室管膜瘤，以及神經外胚層與松果體腫瘤。

男性生殖器官腫瘤包括，但不限於前列腺與睪丸癌。女性生殖器官腫瘤包括，但不限於子宮內膜、子宮頸、卵巢、陰道與陰門癌，以及子宮肉瘤。

卵巢癌的實施例包括，但不限於漿液性腫瘤、子宮內膜狀癌、粘液性囊腺癌、顆粒細胞瘤、塞-萊二氏細胞腫瘤及男胚瘤。

子宮癌的實施例包括，但不限於鱗狀細胞癌、腺癌、腺樣鱗狀細胞癌、小細胞癌、神經內分泌腫瘤、玻璃狀細胞癌及子宮頸絨毛狀腺癌。

泌尿道腫瘤包括，但不限於膀胱、陰莖、腎、腎孟、輸尿管、尿道及遺傳性與偶發性乳突樣腎細胞癌。

腎癌的實施例包括，但不限於腎細胞癌、尿路上皮細胞癌、近腎小球細胞腫瘤(腎素瘤)、血管肌脂瘤、腎嗜酸細胞瘤、腎集尿管癌、腎臟的透明細胞肉瘤、中胚葉腎瘤及威爾姆氏腫瘤。

膀胱癌的實施例包括，但不限於移行上皮細胞癌、鱗狀細胞癌、腺癌、肉瘤及小細胞癌。

眼癌包括，但不限於眼球內黑色素瘤及視網膜胚細胞瘤。

肝癌的實施例包括，但不限於肝細胞癌(帶有或不帶有纖維板層變體的肝細胞癌)、膽管癌(肝內膽管癌)，及混合型肝細胞性膽管癌。

皮膚癌包括，但不限於鱗狀細胞癌、卡波西氏肉瘤、惡性黑色素瘤、梅克爾細胞皮膚癌及非黑色素瘤皮膚癌。

頭頸癌包括，但不限於頭頸部、咽部、下咽部、鼻咽部的鱗狀細胞癌、口咽癌、脣部與口腔癌，以及鱗狀細胞癌。

淋巴瘤包括，但不限於AIDS-相關淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、皮膚T-細胞淋巴瘤、伯奇氏淋巴瘤、霍奇金氏病，及中樞神經系統的淋巴瘤。

肉瘤包括，但不限於軟組織肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、淋巴肉瘤及橫紋肌肉瘤。

白血病包括，但不限於急性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病及毛細胞白血病。在一個較佳具體例中，本發明抗體或其抗原-結合片段適用於供治療或診斷癌症疾病的治療與診斷方法，該癌症疾病包含於下列組成的群組中：胃癌、乳癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、肺癌、子宮內膜癌、食道癌、頭頸癌、肝細胞癌、黑色素瘤與膀胱癌。另外，本發明抗體或其抗原-結合片段亦可在各種其他病症中用作為治療或診斷工具，該其他病症涉及FGFR2，諸如，但不限於纖維化疾病(諸如肺泡內纖維化、矽引起的肺纖維化、實驗性肺纖維化、原發性纖維化、腎纖維化)以及淋巴平滑肌增生、多囊性卵巢症侯群、痤瘡、牛皮癬、膽脂瘤、膽脂瘤型慢性中耳炎、牙周病、日光性斑痣、腸病、動脈粥樣硬化或子宮內膜異位症。

上述病症已在人類中充分鑑定特徵，但亦在其他動物(包括哺乳動物)中有類似的病因，且可藉由投與本發明醫藥組成物而被治療。

為治療前述病症的任一者，供依據本發明使用的醫藥組成物可以使用習知方式使用一或多種生理上可接受的載體或賦形劑來調配。本發明抗體或其抗原-結合片段可藉由任何適當的方式投與，其可視待治療病症類型而改變。可能的投藥途徑包括非經腸(例如肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下)、肺內與鼻內，以及若需要的話用於局部免疫抑制治療，病灶內投藥。此外，本發明抗體可藉由脈衝輸注，使用例如劑量下降的抗體。較佳地，給藥是藉由注射而提供，最佳的是靜脈內或皮下注射，某種程度上端視投藥為短暫或長期而定。要投與之量將視各種因素而定，諸如臨床症狀、個體體重，是否要投與其他藥物。習於技藝者將認知到投與途徑會隨著待治療病症或病況而改變。

依據本發明，決定新穎多肽之治療有效量大多視特定患者特性、投藥途徑以及待治療病症的特性而定。可例如在國際協調會的公開檔以及Remington's Pharmaceutical Sciences,chapters 27 and 28,pp.484-528(18th ed.,Alfonso R. Gennaro,Ed.,Easton,Pa.：Mack Pub.Co.,1990)中找到一般性指引。更特別地，決定治療有效量將視諸如藥物毒性以及效力的因素而定。毒性將使用技藝中熟知以及先前參考文獻中找到的方法來測定。效力將利用與下面實施例中所述之方法有關的相同指引來測定。

診斷方法

FGFR2抗體或其抗原-結合片段可用於偵測表現FGFR2之腫瘤的存在。含FGFR2之細胞或在各種生物樣本(包括血清與組織生檢樣本)中脫落FGFR2的存在可使用FGFR2抗體來偵測。此外，FGFR2抗體可用於各種成像方法學，諸如使用結合⁹⁹Tc(或其他同位素)之抗體的免疫閃爍造影法。例如，類似於一種近來所述使用¹¹¹In結合的抗-PSMA抗體的成像程序可用於偵測胰臟或卵巢癌(Sodee et al.,Clin.Nuc.Med.21：759-766,1997)。另一種可用的偵測方法係藉由使本發明抗體與適當同位素結合的正子放射斷層掃描(參見Herzog et al.,J.Nucl.Med.34：2222-2226,1993)。

醫藥組成物及投藥

本發明的一個具體例為含有FGFR2抗體或其抗原-結合片段單獨或與至少一種其他藥劑(諸如安定化合物)組合的醫藥組成物，其可在任何無菌、生物相容性醫藥載劑(包括，但不限於食鹽水、緩衝食鹽水、右旋糖與水)中投與。又一具體例為含有FGFR2抗體或其抗原-結合片段及又一個適於治療FGFR2相關疾病(諸如癌症)之其他醫藥活性化合物的醫藥組成物。此等分子的任一者可單獨投與，或與其他藥劑、藥物或激素組合成醫藥組成物(其中與賦形劑或醫藥可接受載劑混合)投與給患者。在本發明的一個具體例中，醫藥可接受載劑為醫藥上惰性的。

本發明亦關於投與醫藥組成物。此等投與是經口或非經腸而達致。非經腸投遞的方法包括局部、動脈內(直接對腫瘤)、肌肉內、皮下、髓內、鞘內、室內、靜脈內、腹膜內或鼻內投與。除了活性成分以外，此等醫藥組成物可含有適宜的醫藥可接受載劑，其含有賦形劑與有助於將活性化合物加工成製劑以在醫藥上使用的輔助劑。更多關於調配與投與的技術細節可在Remington's Pharmaceutical Sciences(Ed.Maack Publishing Co,Easton,Pa.)的最新版本中查到。

用於經口投與的醫藥組成物可使用本技藝中已知的醫藥可接受載體以適於經口投與的劑量調配。此等載劑能夠使醫藥組成物調配成錠劑、丸劑、糖衣錠、囊劑、液體、凝膠、糖漿、漿劑、懸浮液及類似物以供患者攝入。

用於經口服用的醫藥組成物可透過將活性化合物與固體賦形劑組合，視情況研磨所得之混合物並在添加適當輔助物質(若需要的話)後處理該顆粒混合物以得到錠劑或糖衣錠核心。適當賦形劑為碳水化合物或蛋白質填充劑，諸如糖(包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇)；玉米、麥、米、馬鈴薯或其他植物的澱粉；纖維素，諸如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素鈉；以及樹膠，包括阿拉伯膠與黃耆膠；和蛋白質，諸如明膠與膠原蛋白。若需要的話，可添加崩解劑或助溶劑，諸如交聯-聚乙烯基吡咯啶酮、洋菜、藻酸或其鹽，諸如藻酸鈉。

糖衣錠核心係以具有適當塗層(諸如濃縮糖溶液)來提供，其亦可含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯基吡咯啶酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇及/或二氧化鈦、纖維漆溶液及適當有機溶劑或溶劑混合物。染料或色素可添加至錠劑或糖衣錠塗層以供產品識別或鑑別活性化合物的量，亦即劑量。

可經口服用的醫藥製備物包括由明膠製成的推入適配膠囊，以及由明膠與塗層(諸如甘油與山梨醇)製成的軟性密封膠囊。推入適配膠囊可含有與填充劑與黏結劑(諸如乳糖或澱粉)、潤滑劑(諸如滑石或硬脂酸鎂)及視情況選用安定劑混合的活性成分。在軟膠囊中，活性化合物可在有或沒有安定劑存在下溶解或懸浮於適當液體，諸如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇中。

用於非經腸投與的醫藥調配物包括活性化合物的水溶液。就注射而言，本發明之醫藥組成物可調配成水溶液，較佳在生理相容性緩衝液中，例如漢克氏溶液、林格氏溶液或生理緩衝食鹽水。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏性的物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨醇及葡萄聚糖。此外，活性化合物的懸浮液可製備成適當的油性注射懸浮液。適當的親脂性溶劑或媒劑包括脂肪酸，諸如芝麻油，或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三甘油酯，或脂質體。此外，懸浮液亦可含有適當的穩定劑或增加化合物溶解度的物質，以容許製備高度濃縮的溶液。

關於局部或鼻投藥，適於待穿透的特定障壁的滲透劑可用於調配物中。此等滲透劑為技藝中一般習知的。

套組

本發明進一步係有關於包含一或多種填充有一或多種本發明前述組成物成分之容器的醫藥包裝與套組。關於此等容器(等)可提到由政府機關管理藥品或生物產品製造、使用或銷售所規定的形式，表示由行政機構核可製造、使用或銷售人類投與的產品。

在另一個具體例中，該等套組可含有編碼本發明抗體的DNA序列。較佳地，該等編碼此等抗體的DNA序列提供於適宜轉染至宿主細胞並由宿主細胞表現的質體中。該質體可含有啟動子(通常為可誘導性啟動子)以調節DNA在宿主細胞中的表現。該質體亦可含有適當限制位點以促進其他DNA序列插入至質體中而生產各種抗體。該等質體亦可含有許多其他要素而促進編碼蛋白的選殖及表現。此等要素為習於該技藝者所熟知且包括，例如可選擇性標記、起始密碼子、終止密碼子與類似者。

製造與貯存

本發明醫藥組成物可以技藝中熟知之方式來製造，例如藉由習知混合、溶解、造粒、糖衣錠-製造、研磨、乳化、囊封、捕捉或凍乾程序。

該醫藥組成物可提供為鹽類且可與酸形成，該酸包括但不限於氫氯酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等。鹽類傾向更易溶於水性或其他對應於游離鹼形式之質子性溶劑中。在其他情況下，較佳的製備物可以是1 mM-50 mM組胺酸、0.1%-2%蔗糖、2%-7%甘露醇在4.5至5.5的pH範圍內的凍乾粉末，其在使用前與緩衝液組合。

在已製備調配於可接受載劑中之包含本發明化合物之醫藥組成物後，它們可以被置放在適當容器中並標記用於治療指定病況。關於投與FGFR2抗體或其抗原-結合片段，此等標記可包括投與的量、頻率與方法。

治療有效劑量

適於使用在本發明中的醫藥組成物包括其中含有效達到所要目的(亦即治療特徵為FGFR2表現之特定疾病狀態)之活性成分的組成物。決定有效劑量係充分落在習於技藝者的能力內。

關於任一種化合物，治療有效劑量可最初在細胞培養物分析(例如腫瘤細胞)或在動物模型(通常為小鼠、兔、狗、豬或猴)中估算。動物模型亦用於達到所要濃度範圍及投藥途徑。此等資訊可接而用來決定在人類中投藥的劑量和路徑。

治療有效劑量意指抗體或其抗原-結合片段減輕症狀或病況之數量。此等化合物之治療效力與毒性可藉由標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中測定，例如ED₅₀(在50%群體中治療有效的劑量)以及LD₅₀(使50%群體致死的劑量)。治療效用與毒性效用之間的劑量比為治療指標，而其可表示為比率ED₅₀/LD₅₀。表現高治療指標的醫藥組成物較佳。由細胞培養物分析與動物研究所得的數據係用於調配供人類服用的劑量範圍。此等化合物的劑量較佳在ED₅₀不高或沒有毒性之循環濃度範圍內。劑量在此範圍內改變，端視所用劑量、患者的嚴重性與投藥途徑而定。

依據個別臨床醫師按照待治療患者來選定確切劑量。調整劑量與投藥以提供充分程度的活性部分或維持所要效用。可納入考量的其他因素包括疾病狀態的嚴重性，例如腫瘤尺寸與位置；患者的年齡、體重與性別；飲食、投藥時間和頻率、藥物組合、反應敏感性與對療法的耐受性/反應。長效型醫藥組成物可每3至4天、每週投與，或每兩週投與一次，端視特定調配物的半衰期及廓清率而定。

一般劑量數量可在0.1至100,000微克間改變，至多達總劑量為約2 g，端視投藥途徑而定。關於特定劑量與遞送方法的指導提供於參考文獻中。參見美國專利第4,657,760號；第5,206,344號或第5,225,212號。習於技藝者將採用就多核苷酸而言不同於蛋白質或其抑制劑的調配物。相同地，多核苷酸或多肽的投遞對於特定細胞、病況、位置等來說是具專一性的。對於放射性標記抗體的較佳比活性範圍係0.1至10 mCi/mg蛋白質(Riva et al.,Clin.Cancer Res.5：3275-3280,1999；Ulaner et al.,2008 Radiology 246(3)：895-902)。

本發明將進一步藉下列實施例說明。僅為參照特定具體例說明本發明而提供實施例。此等例示儘管說明本發明的某些特定態樣，但並非描述所揭發明的限制因素或限制本發明的範疇。

除非另有詳細說明，否則所有實施例是使用該技藝中已知且慣用的標準技術來進行。下列實施例的慣用分子生物技術可以如標準實驗室手冊(諸如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd Ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)中所述般進行。

本發明的一個較佳具體例為：

A.一種分離抗體或其抗原-結合片段，其在過度表現FGFR2的細胞株SNU16(ATCC-CRL-5974)與MFM223(ECACC-98050130)中以及在表現突變型FGFR2的細胞株AN3-CA(DSMZ-ACC 267)與MFE-296(ECACC-98031101)中於結合至FGFR2後降低FGFR2之細胞表面表現。

B.一種如申請專利範圍A之分離抗體或其抗原-結合片段，其中該抗體或其抗原-結合片段特異地結合至如(SEQ ID NO：63)所示之FGFR2之細胞外N-端表位(¹RPSFSLVEDTTLEPE¹⁵)。

C.一種如申請專利範圍B之分離抗體或其抗原-結合片段，其中該抗體結合至細胞外N-端表位(SEQ ID NO：63)係藉由至少一個選自由以下殘基所組成之群之表位殘基所媒介：Arg 1、Pro 2、Phe 4、Ser 5、 Leu 6及Glu 8。

D.如申請專利範圍B至C中任一項之分離抗體或抗原-結合片段，其中該抗體或其抗原-結合片段因為將FGFR2之N-端表位(¹RPSFSLVEDTTLEPE¹⁵)的至少一個胺基酸殘基變成丙胺酸而喪失超過其50%的ELISA訊號a)該殘基係選自Pro 2、Leu 6及Glu 8之群，或b)該殘基係選自Arg 1、Pro 2、Phe 4與Ser 5之群。

E.如申請專利範圍A至D中任一項之抗體或抗原-結合片段，其中該抗體或抗原-結合片段與選自下列之群之至少一種抗體競爭結合至FGFR2：”M048-D01”、”M047-D08”、”M017-B02”、”M021-H02”、”M054-A05”、”M054-D03”、”TPP-1397”、”“TPP-1398”、”TPP-1399”、”TPP-1400”、”TPP-1401”、”TPP-1402”、”TPP-1403”、”TPP-1406”、”TPP-1407”、”TPP-1408”、”TPP-1409”、”TPP-1410”、”TPP-1411”、”TPP-1412”及”TPP-1415”。

F.如申請專利範圍E之抗體或抗原-結合片段，其中該抗體或抗原-結合片段的胺基酸序列係與下列之至少一CDR序列至少50%、55%、60%、70%、80%、90，或95%相同：”M048-D01”、”M047-D08”、”M017-B02”、”M021-H02”、”M054-A05”、”M054-D03”、”TPP-1397”、”TPP-1398”、”TPP-1399”、”TPP-1400”、”TPP-1401”、”TPP-1402”、”TPP-1403”、”TPP- 1406”、”TPP-1407”、”TPP-1408”、”TPP-1409”、”TPP-1410”、”TPP-1411”、”TPP-1412”或”TPP-1415”，或與下列的VH或VL序列至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%相同：”M048-D01”、”M047-D08”、”M017-B02”、”M021-H02”、”M054-A05”、”M054-D03”、”TPP-1397”、”TPP-1398”、”TPP-1399”、”TPP-1400”、”TPP-1401”、”TPP-1402”、”TPP-1403”、”TPP-1406”、”TPP-1407”、”TPP-1408”、”TPP-1409”、”TPP-1410”、”TPP-1411”、”TPP-1412”或”TPP-1415”。

G.如申請專利範圍E至F中任一項之抗體或抗原-結合片段，其中該抗體或抗原-結合片段包含如表9及表10中所示之至少一個CDR序列或至少一個可變重鏈或輕鏈序列。

H.如申請專利範圍A至G之抗體或抗原-結合片段，其包含：a)如SEQ ID NO：5-7所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：8-10所表示的可變輕鏈CDR序列，或b)如SEQ ID NO：15-17所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：18-20所表示的可變輕鏈CDR序列，或c)如SEQ ID NO：25-27所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：28-30所表示的可變輕鏈 CDR序列，或d)如SEQ ID NO：35-37所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：38-40所表示的可變輕鏈CDR序列，或e)如SEQ ID NO：45-47所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：48-50所表示的可變輕鏈CDR序列，或f)如SEQ ID NO：55-57所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：58-60所表示的可變輕鏈CDR序列，或g)如SEQ ID NO：75-77所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：78-80所表示的可變輕鏈CDR序列，或h)如SEQ ID NO：85-87所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：88-90所表示的可變輕鏈CDR序列，或i)如SEQ ID NO：95-97所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：98-100所表示的可變輕鏈CDR序列，或j)如SEQ ID NO：105-107所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：108-110所表示的可變輕鏈CDR序列，或k)如SEQ ID NO：115-117所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：118-120所表示的可變輕鏈CDR序列，或l)如SEQ ID NO：125-127所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：128-130所表示的可變輕鏈CDR序列，或m)如SEQ ID NO：135-137所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：138-140所表示的可變輕鏈CDR序列，或n)如SEQ ID NO：145-147所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：148-150所表示的可變輕鏈CDR序列，或o)如SEQ ID NO：155-157所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：158-160所表示的可變輕鏈CDR序列，或p)如SEQ ID NO：165-167所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：168-170所表示的可變輕鏈CDR序列，或q)如SEQ ID NO：175-177所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：178-180所表示的可變輕鏈CDR序列，或r)如SEQ ID NO：185-187所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：188-190所表示的可變輕鏈CDR序列，或s)如SEQ ID NO：195-197所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：198-200所表示的可變輕鏈CDR序列，或t)如SEQ ID NO：205-207所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：208-210所表示的可變輕鏈CDR序列，或u)如SEQ ID NO：215-217所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：218-220所表示的可變輕鏈CDR序列。

I.如申請專利範圍A-H之抗體或抗原-結合片段，其包含：a)如SEQ ID NO：1所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：2所表示的可變輕鏈序列，或b)如SEQ ID NO：11所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：12所表示的可變輕鏈序列，或c)如SEQ ID NO：21所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：22所表示的可變輕鏈序列，或d)如SEQ ID NO：31所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：32所表示的可變輕鏈序列，或e)如SEQ ID NO：41所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：42所表示的可變輕鏈序列，或f)如SEQ ID NO：51所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：52所表示的可變輕鏈序列，或g)如SEQ ID NO：73所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：74所表示的可變輕鏈序列，或h)如SEQ ID NO：83所表示的可變重鏈序列以及如 SEQ ID NO：84所表示的可變輕鏈序列，或i)如SEQ ID NO：93所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：94所表示的可變輕鏈序列，或j)如SEQ ID NO：103所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：104所表示的可變輕鏈序列，或k)如SEQ ID NO：113所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：114所表示的可變輕鏈序列，或l)如SEQ ID NO：123所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：124所表示的可變輕鏈序列，或m)如SEQ ID NO：133所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：134所表示的可變輕鏈序列，或n)如SEQ ID NO：143所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：144所表示的可變輕鏈序列，或o)如SEQ ID NO：153所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：154所表示的可變輕鏈序列，或p)如SEQ ID NO：163所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：164所表示的可變輕鏈序列，或q)如SEQ ID NO：173所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：174所表示的可變輕鏈序列，或r)如SEQ ID NO：183所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：184所表示的可變輕鏈序列，或s)如SEQ ID NO：193所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：194所表示的可變輕鏈序列，或t)如SEQ ID NO：203所表示的可變重鏈序列以及如 SEQ ID NO：204所表示的可變輕鏈序列，或u)如SEQ ID NO：213所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：214所表示的可變輕鏈序列。

J.如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其為IgG抗體。

K.如前述申請專利範圍中任一項之抗原-結合片段，其為scFv、Fab、Fab’片段或F(ab’)₂片段。

L.如前述申請專利範圍中任一項之抗體或抗原-結合片段，其為單株抗體或抗原-結合片段。

M.如前述申請專利範圍中任一項之抗體或抗原-結合片段，其為人類、人類化或嵌合抗體或抗原-結合片段。

N.一種抗體-藥物結合物，其包含如申請專利範圍A至M之抗體或其抗原結合片段。

O.一種分離核酸序列，其編碼如申請專利範圍A至M之抗體或抗原-結合片段。

P.一種載體，其含有如申請專利範圍O之核酸序列。

Q.一種分離細胞，其表現如申請專利範圍A至M中任一項之抗體或抗原-結合片段及/或含有如申請專利範圍O之核酸或如申請專利範圍P之載體。

R.如申請專利範圍Q之分離細胞，其中該細胞為原核生物細胞或真核生物細胞。

S.一種製造如申請專利範圍A至M中任一項之抗體或抗原-結合片段的方法，其包含培養如申請專利範圍R之細胞並且純化該抗體或抗原-結合片段。

T.一種如申請專利範圍A至M之抗體或抗原-結合片段或如申請專利範圍N之抗體-藥物結合物，其係作為藥物。

U.一種如申請專利範圍A至M之抗體或抗原抗原-結合片段，其係作為診斷劑。

V.一種如申請專利範圍A至M之抗體或抗原-結合片段或如申請專利範圍N之抗體-藥物結合物，其係做為用於治療癌症的藥物。

W.一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍A至M之抗體或抗原-結合片段或如申請專利範圍N之抗體-藥物結合物。

X.一種如申請專利範圍W之醫藥組成物及一或多種治療活性化合物的組合。

Y.一種治療與FGFR2之非所要存在有關的病症或病況的方法，其包含對需要的個體投與有效量之如申請專利範圍W之醫藥組成物或如申請專利範圍X之組合。

實施例 實施例1：從n-CoDeR庫產生抗體 用於噬菌體選擇的工具：

用於分離本發明人類抗體之重組型蛋白是由R&D Systems所獲得並列示於表1中。所用的全部變體在無載體製備物中呈現為Fc-融合蛋白。hTRAIL-Fc作為避免Fc連結子的耗盡劑。依據製造商的說明使用過量約2倍莫耳的生物素-LC-NHS(Pierce；Cat.No.21347)來對蛋白質進行生物素化並使用Zeba去鹽管柱(Pierce；Cat.No.89889)去鹽。

關於對細胞的噬菌體選擇，採用在其細胞表面展現幼稚FGFR2的人類胃癌細胞株KATO III(ATCC HTB-103)。

噬菌體選擇：

分離本發明人類抗體或其抗原結合片段是藉由採用BioInvent International AB的幼稚Fab抗體庫n-CoDeR(Lund,Sweden；描述於Söderling et al.,Nat.Biotech.2000,18：853-856中)的噬菌體展現技術來進行，該抗體庫是一種衍生所有六種CDR的Fab庫。如表2中所歸納，採用三種不同策略供選擇本發明抗體。

表2：選擇策略的歸納

本實施例中所用的標準緩衝液為：1x PBS：來自Sigma(D5652-501)

PBST：1x PBS，補充有0.05% Tween20(Sigma,P7949)

阻斷緩衝液：PBST，補充有3% BSA(Sigma A4503)

沉澱緩衝液：20% PEG(Calbiochem,528877)於2.5 M NaCl中

FACS-緩衝液：PBS，補充有3% FBS(GIBCO,10082)及0.01% NaN₃(Sigma,71289)

簡言之，在室溫下離心等分試樣的Fab抗體庫5分鐘，所得丸粒再懸浮於40 ml PBS中並藉由添加沉澱緩衝液接著在冰上培育1小時與離心步驟(4000 rpm下1小時)而沉澱。沉澱庫接著再懸浮於1 ml阻斷緩衝液中並在室溫下培育30分鐘。

同時，藉由在端對端旋轉裝置上以PBS洗滌30分鐘3次製備等分試樣的經卵白素塗覆Dynabead M280(Invitrogen,11206D)。之後，一些等分試樣與200 nM生物素化TRAIL-Fc蛋白混合，同時其餘者與如表2中所示的經生物素化標的蛋白混合。在室溫下於端對端旋轉裝置上培育混合物30分鐘，接著在1 ml PBS中洗滌3次。經塗覆的珠粒最後藉由再懸浮於1 ml阻斷緩衝液中予以阻斷並收集珠粒與移除上清液。

為了耗盡非所要的Fc連接子，經阻斷的庫(上述)被添加至經TRAIL-Fc塗覆之經阻斷Dynabead並邊旋轉邊在室溫下培育30分鐘。在磁力架上收集珠粒後，將上清液與塗覆有標的蛋白質之經阻斷Dynabead混合。在端對端旋轉裝置上培育60分鐘後，以阻斷緩衝液洗滌樣本3次接著用PBST洗滌5次。透過添加100 μl三乙醇胺溶液(TEA，100 mM)洗脫結合的噬菌體。在室溫下培育10分鐘後，藉由添加400 μl的1M Tris-Cl，pH 7.5中和樣本。

淘選策略I包括對做為標的蛋白質來源的全細胞進行2輪淘選(參見表2)。為此，將KATO III細胞以10⁷細胞/ml的密度再懸浮於冰冷FACS緩衝液中。一個等分試樣的取回噬菌體被添加至1 ml細胞懸浮液並在4℃下藉由端對端旋轉予以培育。接著，以2.5 ml FACS緩衝液洗滌細胞10次，接著以300 μl的76 nM檸檬酸(pH 2.5)洗脫結合的噬菌體。5分鐘培育後，在400 g與4℃下離心細胞5分鐘，且藉由添加300 ml的1 M Tris-Cl，pH 7.5中和上清液。

繁殖洗脫的噬菌體並如先前所述測定噬菌體效價(Cicortas Gunnarsson et al.,Protein Eng Des Sel 2004；17(3)：213-21。簡言之，保留洗脫溶液的等分試樣用於效價實驗，同時其餘者用於轉形以指數生長的大腸桿菌TG1(來自Stratagene)以供製備用於依據表2中所示策略的第二輪、第三輪與第四輪選擇的新噬菌體原液。關於各個選擇回合，輸入與輸出噬菌體係針對指數生長的大腸桿菌TG1進行滴定，並從第2至4輪挑出選殖株供在噬菌體ELISA中分析。

酵素連結免疫吸附分析(ELISA)： 噬菌體ELISA：

針對特異性使用噬菌體ELISA分析從不同輪選擇而來的選定噬菌體。簡言之，藉由添加10 μl的隔夜培養物(在補充有100 μg/ml安比西林(Sigmal，A5354)、1%葡萄糖的LB-培養基)至100 μl新鮮培養基(補充有100 μg/ml安比西林及0.1%葡萄糖(Sigma,G8769)的LB-培養基)並在250 rpm與37℃下於96-孔MTP中震盪進行噬菌體表現直到OD600達到0.5。接著添加40 μl協助噬菌體M13KO7(Invitrogen，420311)並在37℃下於不震盪的情況下培育樣本又15分鐘。在添加IPTG(f.c.為0.5 mM；最終體積200 μl)後，在30℃下培育細胞隔夜同時以200 rpm震盪。

以卵白素(Pierce，15500)預先塗覆的96-孔ELISA-盤在4℃下被塗覆1 μg/ml經生物素化FGFR2-2β Fc(IIIb)或生物素化TRAIL-Fc隔夜。次日以PBST洗滌盤3次，以阻斷試劑處理，並再次以PBST洗滌3次。同時，噬菌體培養物被簡單地離心，然後移除125 μl上清液並混合125 μl阻斷緩衝液。之後將100 μl經阻斷噬菌體轉移至每孔並在室溫下培育1小時。在以PBST洗滌3次後，添加偶接至HRP的抗M13抗體(GE Healthcare，27-9421-01；1：2500稀釋於PBST中)並在室溫下培育1小時。藉由添加50 μl TMB(Invitrogen，2023)使顏色反應呈色並在5至15分鐘後藉由添加50 μl H₂SO₄(Merck，1120801000)中止。在450 nM下於盤讀取儀(Tecan)中紀錄比色反應。

藉由ELISA篩選sFab：

關於產生可溶性Fab片段(sFab)，分離由第3與4輪選擇噬菌粒DNA並使用限制酶EagI(Fermentas，FD0334)及EcoRI(NER，R0101L)依據供應商使用說明予以消化，以移除基因III序列。將所得片段再結合並使用標準方法將建構物轉形至化學勝任大腸桿菌Top 10。挑出單獨選殖株，轉移至含有LB-培養基(100 μg/ml安比西林(Sigma,A5354)、1%葡萄糖)的96-孔盤並且在250 rpm與37℃下震盪。次日早晨將10 ml的預培養物轉移至150 μl新鮮LB-培養基(100 μg/ml安比西林(Sigma,A5354)、0.1%葡萄糖)中直至OD600達到0.5。之後，藉由添加IPTG(f.c.0.5 mM)誘導sFab製造並且邊以200 rpm震盪邊在30℃下持續培育隔夜。次日早晨將50 μl BEL-緩衝液(24.7 g/l硼酸、18.7 g/l NaCl、1.49 g/l EDTA pH 8.0、2.5 mg/ml溶菌酶(Roche))添加至各孔，在室溫下培育混合物1小時。接著，添加具有9% BSA的1/3體積的阻斷緩衝液並在室溫下一個額外30分鐘的培育步驟後，除了偵測是使用偶接至HRP(1：2500稀釋；Sigma；A 0293)的抗-hIgG(Fab-特異性)在基本上如關於噬菌體所述的ELISA中分析各孔的50 μl關於sFab結合至標的。

實施例2：可溶性Fab篩選結果的小規模生產

針對其結合至不同FGFR-蛋白變體的初始分析，以小規模生產獨有篩選結果(參見實施例3)。將20-50 ml的LB-培養基(補充有0.1 mg/ml安比西林以及0.1%葡萄糖)接種個別大腸桿菌Top 10菌株的預培養物，該菌株含有被選殖至初始pBIF-載體之獨特Fab序列但缺少基因III序列。sFab是藉由添加0.5 mM IPTG(最終濃度)而被誘發生產並在30℃下以250 rpm震盪持續培養隔夜。

之後，藉由離心收取細胞並藉由在4℃下於溶解緩衝液(含有20%蔗糖(w/v)、30 mM TRIS、1 mM EDTA，pH 8.0、1 mg/ml溶菌酶(Sigma L-6876)及2.5 U/ml核酸酶(benzonase)(Sigma E1014))中培育1小時，接著添加等體積的PBS而被小心地溶解。之後，將經清除的上清液施用至Dynabead供進行His-標誌分離(Invitrogen，101-03D)並在4℃下於端對端旋轉裝置上培育2小時。接著，以緩衝液1(50 mM Na-磷酸緩衝液，pH 7.4、300 mM NaCl、5 mM咪唑、0.01% Tween-20)洗滌基質3次，然後是在緩衝液2(含有0.005% Tween-20的PBS)中的一個洗滌步驟。最後，以緩衝液E(10 mM Na-磷酸緩衝液，pH 7.4、300 mM NaCl、 300 mM咪唑)洗脫Fab並在Vivaspin 50(截斷值10000；來自GE；28-9322-25)中使用PBS-緩衝液予以濃縮。分析Fab的蛋白質含量並依據SDS-PAGE分析純度。

實施例3：抗體的交叉反應性型態

如實施例2中所述以小規模生產獨特篩選結果並在ELISA中測試對表3中所列的不同FGFR-變體的結合。

所用的全部變體在無載體製備物中呈現如Fc-融合蛋白。依據製造商的使用說明使用過量約2倍莫耳的生物素-LC-NHS(Pierce；Cat.No.21347)將蛋白質生物素化並使用Zeba去鹽管柱(Pierce；Cat.No.89889)去鹽。

關於ELISA，在4℃下將以卵白素(Pierce，15500)預先塗覆的96-孔盤使用1 μg/ml經生物素化蛋白質塗覆隔夜。塗覆有經生物素化TRAIL-Fc的孔作為參考品。次日以PBST洗滌盤3次，以阻斷試劑處理，並以PBST洗滌又3次。添加100 μl經純化Fab(1 μg/ml)並在室溫下培育1小時。在以PBST洗滌3次後，添加偶接至HRP(1：2500稀釋：Sigma；A 0293)的抗-hIgG(Fab-特異性)並在室溫下培育1小時。藉由添加50 μl TMB(Invitrogen，2023)使顏色反應呈色並在5至15分鐘後藉由添加50 μl H₂SO₄(Merck，1120801000)中止。在450 nM下於盤讀取儀(Tecan)中紀錄比色反應。含有TRAIL-Fc的孔用作為背景值並計算相對於背景的訊號比如表4中所歸納。

對背景的訊號比：0：<2；+：2-3；++：3-5；+++：>5

如表4中所示，本發明抗體結合至人類與鼠科FGFR2，與α與β以及IIIb及IIIc剪接形式無關。如表4中所示，本發明抗體不結合至FGFR1、FGFR3與FGFR4。

實施例4：FGFR2抗體結合至癌細胞株的細胞表面

為測定抗-FGFR2抗體對於小鼠、大鼠與人類癌細胞株的結合特徵，藉由流式細胞分析對一組細胞株測試結合。以PBS(無Ca與Mg)洗滌附著性細胞2次，並藉由以無酵素PBS為基礎的細胞解離緩衝液(Invitrogen)予以分離。將細胞以約10⁵細胞/孔懸浮於FACS緩衝液(不含Ca/Mg的PBS，Biochrom，含有3% FCS，Biochrom)中。將細胞離心(250g，5分鐘，4℃)並丟棄上清液。將細胞再懸浮於感興趣抗體在FACS緩衝液中的稀釋液(若未另外指明，在80 μl中5 μg/ml)，並在冰上培育1小時。接著，以100 μl冷FACS緩衝液洗滌細胞1次並添加以1：150稀釋的80 μl二級抗體(PE山羊抗-人類IgG，Dianova #109-115-098，或PE山羊抗-小鼠IgG，Jackson Immuno Research #115-115-164)。在冰上培育1小時後，再次以冷FACS緩衝液洗滌細胞，再懸浮於100 μl FACS緩衝液中並藉由流式細胞分析使用FACS-陣列(BD Biosciences)分析。結果計算為由感興趣抗體偵測的幾何平均數減去使用單獨二級抗體偵測的背景螢光。依據下列系統對數值進行計分：幾何平均數-單獨二級抗體的幾何平均數>10：+，>100：++，>1000：+++，10000：++++，接近於()中的類別邊界。所用細胞株關於抗體之交叉反應性型態的列表：

如表5中所示，以5 μg/ml的濃度來使用之本發明的所有抗FGFR2抗體結合至廣泛範圍之表現FGFR2的鼠科(4T1、EMT6)、大鼠(RUCA)與人類(表中所包括的全部其他細胞株)來源的腫瘤細胞。

(幾何平均數-單獨二級抗體的幾何平均數>10：+，>100：++，>1000：+++，>10000：++++，接近於()中的類別邊界)

為測定抗體結合至選定癌細胞株的EC₅₀值，如上所述以FGFR2抗體將細胞染色，但使用的抗體濃度不同，範圍係0.1-100 nM。EC₅₀值係使用Graph Pad Prism軟體來測定並呈現在表6中。具有最高親和力的三種抗體(M017-B02-hIgG1、M048-D01-hIgG1、M047-D08-hIgG1)在人類(SNU-16、MFM223)、鼠科(4T1)及大鼠(Ruca)細胞株中顯示低於奈莫耳至低奈莫耳的EC₅₀值。M021-H02-hIgG1、M054-A05-hIgG1及M054-D03-hIgG1亦在鼠科與人類細胞株中顯示低nM細胞EC₅₀值。因此，所有的測試抗體在結合至表現FGFR2的人類、鼠科與大鼠細胞時具有交叉反應性。

(n.d.表示未測定/測定)

實施例5：藉由針對骨架之肽掃描(Pepscan)化學連結肽(CLIPS)技術的表位圖譜

為測定所發現之抗體的結合特性，依據針對骨架之肽掃描(Pepscan)專有化學連結肽(CLIPS)技術來進行透徹的表位圖譜(Timmerman et al.,J.Mol.Recognit.2007,20：283-99)。針對幼稚人類FGFR2設計總共8653個具有15AA與30AA長度的CLIPS肽，含括線性、構型與不連續表位。在肽陣列上合成肽。在肽陣列上於以ELISA-為基礎之分析的人類IgG1形式中測試本發明抗體。分析具有最高ELISA值的肽以鑑別共有類似胺基酸序列。

為重新建構標的分子的不連續表位，合成建構肽庫。這是使用針對骨架之肽掃描(Pepscan)專有化學連結肽(CLIPS)技術來完成(Timmerman et al.,J.Mol.Recognit.2007,20：283-99)。CLIPS技術容許將肽建構成單環、雙環、三環、片樣折疊、螺旋樣折疊及其組合。CLIPS模板偶接至半胱胺酸殘基。肽中的多半胱胺酸側鏈偶接至一或兩個CLIPS模板。例如，0.5 mM的T2 CLIPS模板1,3-雙(溴甲基)苯的溶液溶解於碳酸氫銨(20 mM，pH 7.9)/乙腈(1：1(v/v))中。這個溶液被加到肽陣列上。CLIPS模板連結至如肽陣列(455孔盤，3 μl孔)的固相結合肽中所呈現之兩個半胱胺酸側鏈。小心地震盪溶液中的肽陣列持續30至60分鐘，同時完全覆蓋在溶液中。最後，使用過量的H₂O廣泛地清洗肽陣列並於70℃下在破壞緩衝液(含有1% SDS/0.1%之PBS(pH 7.2)中的β-巰基乙醇)中以音波處理30分鐘，接著在H₂O中音波處理又45分鐘。以類似的方式製造出帶有T3 CLIPS但現在有三個半胱胺酸的肽。

在以PEPSCAN為基礎的ELISA中測試抗體對各個肽的結合(Slootstra et al.,Molecular Diversity 1996,1：87-96)。以5%至100%-結合緩衝液預先培育肽陣列(1小時，20℃)。結合緩衝液是由1% Tween-80、4%馬-血清、5%卵白蛋白(w/v)所組成並使用PBS稀釋。在洗滌後，使用PBS(含有1% Tween-80)中的一級抗體溶液(1至5 μg/ml)培育肽陣列(4℃下隔夜)。洗滌後，於25℃下以1/1000稀釋度在抗體過氧化酶結合物之100%結合緩衝液中培育肽陣列1小時(抗-人類)。洗滌後，添加過氧化酶受質2,2’-次偶氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸鹽(ABTS)與2微升/毫升的3% H₂O₂。1小時後，測定成色。使用電荷耦合裝置(CCD)-照相機與影像處理系統對成色進行定量。

數據處理

原始數據為藉由CCD-照相機所取得的光學數值。數值範圍在0至3000 mAU，類似於標準96-孔盤ELISA-讀取儀。擷取結合數值供分析。偶爾一個孔含有空氣氣泡，造成偽-陽性數值，手動檢查卡片並將因為空氣氣泡所致的任何數值計分為0。

本發明的全部抗體結合至相同表位，其含有FGFR2的N-端殘基(¹RPSFSLVEDTTLEPE¹⁵)。1257 CLIPS與線性肽的分析顯示對於N-端肽有一樣高的ELISA數值。

N-端殘基(¹RPSFSLVEDTTLEPE¹⁵)存在於人類FGFR2的所有剪接變體中，與產生IIIb及IIIc同型異構體的D3交替剪接無關(參見第1圖)。若域D1從全長FGFR2被剪出((SEQ ID NO：61；FGFR2 α)而產生FGFR2的較短β形式(SEQ ID NO：62)，該表位亦存在。在此情況下，該表位正好在域D2前(參見第1圖)。

特別感興趣的是，N-端序列在人類、小鼠、大鼠與恆河猴中是守恆的。這能夠在物種間產生交叉反應性。

這個新穎的表位在已知配體結合位點與肝素結合位點以外(參見第1圖)並產生本發明抗體的新穎特性。

實施例6：依據肽之丙胺酸掃描的表位精密圖譜

為更詳細地定義本發明抗體的結合特性，進行丙胺酸-掃描。如實施例5中所述，合成15AA與30AA長度的肽且就某一個肽將人類FGFR2序列的各個胺基酸替換成丙胺酸殘基。如實施例5中所述分析抗體的結合。若胺基酸殘基替換成丙胺酸導致結合訊號明顯降低，則該殘基被認為對結合是至關重要。

表7顯示針對本發明抗體在FGFR2的N-端部分(¹RPSFSLVEDTTLEPE¹⁵)的關鍵殘基。

(對於結合至關重要的殘基標示(X)。透過將此殘基改成丙胺酸，喪失超過50%的ELISA訊號)

抗體M048-D01與M021-H02特別令人感到興趣，因為它們結合在位置Ser-5而與變異無關。這能夠使它們另外結合至人類、小鼠、大鼠與恆河猴FGFR2(SEQ ID NO1：63)、兔(SEQ ID NO：64)、豬(SEQ ID NO：65)與狗(SEQ ID NO：66)FGFR2，而能夠使用更多物種供臨床前發展用。

實施例7：由Biacore分析之N-端表位的抗體親和力

為將N-端肽的結合親和力限定至表位，進行Biacore表面電漿共振實驗。

抗FGFR2抗體的結合親和力是藉由表面電漿共振分析在Biacore T100儀器(GE Healthcare Biacore,Inc.)上測定。透過間接捕捉劑(抗-人類IgG(Fc))將如人類IgG1的抗體固定至CM5偵測晶片上。如製造商所述使用”人類抗體捕捉套組”(BR-1008-39，GE Healthcare Biacore,Inc.)的試劑。每孔固定約5000 RU單株小鼠抗-人類IgG(Fc)抗體。以5 μg/ml的濃度在10 μl/分下注射抗FGFR2抗體10秒鐘。HEPES-EP緩衝液(GE Healthcare Biacore,Inc.)中各種濃度(400 nM、200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM及3.12 nM)的肽(衍生自不同物種(人類、小鼠、大鼠、恆河猴FGFR2(SEQ ID NO：63)、兔(SEQ ID NO：64)、豬(SEQ ID NO：65)與狗(SEQ ID NO：66)之FGFR2的前 15個胺基酸)以60 μl/分的流速被注射通過經固定的抗FGFR2抗體3分鐘，並容許解離5分鐘。在線上參照細胞校正接著緩衝液樣本扣除後得到感測圖。依據締合(k_on)與解離速率(k_off)常數的比例計算解離平衡常數(K_D)，該比例是藉由將感測圖與一級1：1結合模型使用Biavaluation軟體(第4.0版)擬合而獲得。

M048-D01-hIgG1與M047-D08-hIgG1以約100 nM的K_D值結合人類、鼠科、大鼠與恆河猴FGFR2(詳情參見表8)。如受丙胺酸掃描所支持，M048-D01對於衍生自數種物種的全部肽顯示相同的K_D值(參見表8)。

實施例8：在與抗FGFR2抗體短期培育後對於過度表現FGFR2之細胞株的P-FGFR2(磷酸化FGFR2)的刺激

為測定抗FGFR2抗體在短期培育後對於磷酸化FGFR2(P-FGFR2)細胞濃度的效用，進行P-FGFR2 ELISA。將MFM223細胞以每孔7000個細胞平盤鋪於96 孔盤的生長培養基(MEM Earle(Biochrom；F0315)+10% FCS+2mM麩醯胺酸)中。平盤鋪設後24小時，將細胞與抗體(10μ/ml)一起培育15分鐘，接著兩個使用PBS的洗滌步驟並且藉由震盪5分鐘而溶解在100 μl的冷溶解緩衝液(含有50mM Hepes pH 7.2、150mM NaCl、1mM MgCl₂、10mM Na₄P₂O₇、100mM NaF、10%甘油、1.5% Triton X-100與新鮮添加的完全蛋白酶抑制劑混合物(Roche No.1873580001)、4 mM Na₃VO₄，使用NaOH將pH調節至7.4)中。將樣本急速冷凍並儲存在-80℃下直到分析。測量P-FGFR2濃度是使用R&D Systems的P-FGFR2 ELISA套組依據製造商的使用說明來進行。在450 nM下測量OD(Tecan Spectra,Rainbow)並進行背景校正。P-FGFR2的濃度計算成未經處理對照濃度%。與抗體形式的非特異性效用相對照，將平行樣本與相同同型的非細胞結合對照IgG一起培育。

結果顯示於第2圖中且指出抗FGFR2抗體M048-D01-hIgG1與M047-D08-hIgG1明顯誘發P-FGFR2濃度。相對地，對照IgG抗體或商業上購自於R&D的抗FGFR2抗體(MAB665、MAB684、MAB6843)在短期培育之後對P-FGFR2濃度皆未顯示任何明顯效用。這些結果揭示本發明中所述的抗FGFR2抗體在短期培育後對於FGFR2的促效效用。

實施例9：在與抗FGFR2抗體長期培育後過度表現FGFR2之細胞對P-FGFR2因為FGF7之刺激去敏化

為測定抗FGFR2抗體在長期培育後對於磷酸化FGFR2(P-FGFR2)的細胞濃度的效用以及抗體處理對於FGF7誘發FGFR2磷酸化效力的效用，進行P-FGFR2ELISA。將MFM223細胞以每孔7000個細胞平盤鋪於96孔盤的生長培養基(MEM Earle(Biochrom；F0315)+10% FCS+2mM麩醯胺酸)中。平盤鋪設後24小時，將細胞與抗體(10μ/ml)一起培育24分鐘，接著在存在或不存在FGFR7(R&D Systems,25 ng/ml)下培育15分鐘。接著使用PBS洗滌細胞兩次並且藉由於室溫下震盪5分鐘而溶解在溶解緩衝液(50mM Hepes pH 7.2、150mM NaCl、1mM MgCl₂、10mM Na₄P₂O₇、100mM NaF、10%甘油、1.5% Triton X-100與新鮮添加的完全蛋白酶抑制劑混合物(Roche No.1873580001)、4 mM Na₃VO₄，使用NaOH將pH調節至7.4)中。將樣本急速冷凍並儲存在-80℃下直到藉由R&D的P-FGFR2 ELISA依據製造商使用說明進行分析。在450 nM下測量光學密度(Tecan Spectra,Rainbow)並進行背景校正。P-FGFR2的濃度計算成未經處理對照濃度%。與抗體形式的非特異性效用相對照，將平行樣本與相同同型的非細胞結合對照IgG一起培育。

對應結果呈現於第3圖中。在經沒有細胞處理的細胞中以及在經同型對照IgG處理的細胞中，使用FGF7刺激P-FGFR2濃度增加約4倍。相對地，在經抗FGFR2抗體預先處理的樣本中，FGF7僅誘導P-FGFR2濃度達1.37至1.4倍。

總言之，此等結果顯示以本發明抗FGFR2抗體延長培育細胞使對於FGF7的刺激去敏化。

實施例10：細胞株在與抗FGFR2抗體培育後向下調節FGFR2表面表現

為分析使用抗FGFR2抗體處理後的FGFR2表面表現，在帶有過度表現FGFR2(MFM223、SNU16)或FGFR2突變(AN3-CA、MFE-296)的不同細胞株中進行FACS分析。以PBS(無Ca與Mg)洗滌附著性細胞兩次並藉由以無酵素PBS為基礎的細胞解離緩衝液(Invitrogen)予以分離。將細胞以約0.5*10⁵細胞/孔懸浮於80 μl生長培養基(MFM226、MFE-296：MEM Earle(Biochrom；F0315)+10% FCS+2mM麩醯胺酸，SNU-16：RPMI 1640(Biochrom,FG1215)+10% FBS，AN3-CA：MEM Earle(Biochrom；FG0325)+10% FCS+1mM丙酮酸鈉+1x NEA：非必需胺基酸Biochrom K0293)中。添加20 μl的5倍濃縮抗體稀釋液(最終濃度為10 μg/ml)並在37℃下培育4.5小時。在培育時間結束時，以100 μl FACS緩衝液洗滌細胞一次，在4℃下以偵測抗體(呈5 μg/ml，針對hIgG為小鼠抗-FGFR2，針對mIgG為人類抗-FGFR2)染色45分鐘，接著以100 μl FACS緩衝液另外洗滌。在80 μl體積中添加經PE染色的二級抗體(PE山羊抗-人類IgG，Dianova #109-115-098，或PE山羊抗-小鼠IgG，Jackson Immuno Research #115-115-164，經1：150稀釋)，在4℃下培育45分鐘且在以FACS緩衝液另外洗滌後使用FACS陣列(BD Biosciences)藉由流式細胞分析來分析。在對照實驗中，競爭重疊表位的抗體係藉由與感興趣抗體與對應偵測抗體平行培育而被排除。以單獨二級抗體染色後所測得的幾何平均數扣除以抗FGFR2抗體染色後測得之峰的幾何平均數。結果計算為在不存在抗體下培育4.5小時之對照細胞%。

結果示於第4圖中。以對照IgG培育細胞使FGFR2表面表現無降低，而抗FGFR2抗體M048-D01-hIgG1與M047-D08-hIgG1在全部4種細胞株中向下調節FGFR2表面濃度明顯達39-60%而與FGFR2過度表現或突變無關。相對地，沒有其他抗FGFR2抗體或商業上購自R&D的抗體(MAB665、MAB684、MAB6843)或實施例他處所述者例如(GAL-FR21、AL-FR22；WO2010/054265及Zhao et al.(Clin Cancer Res.2010,16：5750-5758))顯示在所有4種細胞株中向下調節表面FGFR2而與FGFR2過度表現或突變無關。GAL-FR21在以FGFR2擴增的細胞(SNU16與MFM223)中向下調節FGFR2表面濃度，但對於帶有FGFR2突變的細胞株沒有影響。GAL-FR22在FGFR2突變型細胞株(分別係AN3-CA及MFE-296)中達到73與21% FGFR2表面表現向下調節，但在SNU16與MFM223細胞中對於表面FGFR2濃度沒有顯著影響。MAB684與MAB6843又在FGFR2突變型細胞株中引起約60% FGFR2表面濃度降低而對過度表現FGFR2的細胞株沒有重要影響。最後，MAB665對於FGFR2表面濃度根本沒有顯示任何影響。

總言之，抗FGFR2抗體M048-D01-hIgG1與M047-D08-hIgG1在癌細胞株中是誘發FGFR2表面向下調節的唯二抗FGFR2抗體，與FGFR2過度表現或突變無關。

實施例11：癌細胞在與抗FGFR2抗體長期培育後向下調節總FGFR2濃度

為分析由抗FGFR2抗體所誘發的FGFR2表面向下調節是否會造成總FGFR2濃度的長期性降低，藉由FGFR2ELISA分析FGFR2的總蛋白質濃度。將SNU16細胞以5000個細胞/孔平盤鋪於96孔盤的生長培養基(RPMI 1640(Biochrome，FG1215)+10% FBS)中。2小時後，以不同濃度的指定抗FGFR2抗體或對應同型對照IgG培育細胞。在以抗體培育開始後96小時，在室溫下以300 g離心細胞5分鐘，以PBS洗滌兩次並藉由於室溫下震盪5分鐘且添加100 μl溶解緩衝液(50mM Hepes pH 7.2、150mM NaCl、1mM MgCl₂、10mM Na₄P₂O₇、100mM NaF、10%甘油、1.5% Triton X-100與新鮮添加的完全蛋白酶抑制劑混合物(Roche No.1873580001)、4 mM Na₃VO₄，使用NaOH將pH調節至7.4)予以溶解。將樣本急速冷凍並儲存在-80℃下直到使用總-FGFR2-ELISA套組(R&D Systems)依據製造商使用說明進行分析。在450 nM下測量光學密度(Tecan Spectra,Rainbow)並同時進行背景校正。為計算總FGFR2的絕對濃度，依據製造商(R&D Systems)建議應用使用分離FGFR2蛋白的標準品曲線。結果表示為不存在抗體下培育96小時之對照細胞中所測得的FGFR2濃度%。

結果呈現於第5圖中。以本發明抗FGFR2抗體培育96小時致使總FGFR2濃度降低達41至55%。在劑量為3 μg/ml抗FGFR2抗體下達到半最大降低。相對地，以同型對照抗體培育對於總FGFR2濃度沒有效用。

總言之，這些結果指出抗FGFR2抗體M048-D01-hIgG1與M047-D08-hIgG1不僅造成表面FGFR2濃度的短期性降低，也造成總FGFR2濃度的長期性降低。

實施例12：抗FGFR2抗體內化至細胞中

針對本發明抗FGFR2抗體在結合至FGFR2抗原後內化的能力分析該等抗體。

為看到這個過程，選擇FGFR2特異性抗體M048-D01-hIgG1與M047-D08-hIgG1以及同型對照抗體。該等抗體在兩莫耳過量的CypHer 5E單NHS酯(批號357392，GE Healthcare)存在下於pH 8.3被結合。在結合之後，於4℃下對反應混合物透析(slide-A-Lyser Dialysis Cassettes MWCD 10kD,Fa.Pierce)隔夜以消除過量染料並調整pH值。之後濃縮蛋白質溶液(VIVASPIN 500,Fa Sartorius stedim biotec)。除了pH依賴型螢光染料CypHer5E以外，使用ph-獨立型染料Alexa 488。使用分光光度計(Fa.NanoDrop)測定抗體的染料負載。M048-D01-hIgG1與M047-D08-hIgG1與同型對照(M014)的染料負載係在類似範圍內。在細胞結合分析中測試經標記抗體的親和力以確保標記不會改變對FGFR2的結合。此等經標記抗體用於下列內化分析中。在處理前，將細胞(2x10⁴/孔)種至96-MTP(胖、黑色透明底部，No 4308776，Fa.Applied Biosystems)的100 μl培養基中。在37℃/5% CO2培育18小時後，更換培養基並添加呈不同濃度(10、5、2.5、1、0.3、0.1 μg/ml)的經標記抗FGFR2抗體M048-D01-hIgG1與M047-D08-hIgG1。以同位素對照抗體(陰性對照)進行相同的處理。培育時間選定為0、5小時、1小時、2小時、3小時、6小時及24小時。使用InCellAnalyzer 100(Fa.GE Healthcare)進行螢光測量。顆粒計數與總螢光強度係以動力學的方式來測定。

在表現內源性FGFR2的癌細胞株SNU16(胃癌)與SUM52PE(乳癌)中觀察到M048-D01-hIgG1與M047-D08-hIgG1有高度特異性及顯著內化。

此內化係標的依賴型，因為攝入僅可能使用抗FGFR2抗體來證明，同時使用同型對照沒有觀察到內化。在前6小時期間，抗FGFR2抗體相較於同型對照顯示抗體內化增加20至40倍。同型對照顯示在長期暴露(>24小時)後有少許內化。

經Alexa 488標記的抗FGFR2抗體在結合之後內化揭示超過50%的內化抗體似乎會遵循胞吞路徑。

在第6圖中，M048-D01-hIgG1與M047-D08-hIgG1在結合至表現內源性FGFR2的細胞後顯示特異性內吞的時序的顯微性評估。對乳癌細胞株SUM 52PE研究抗體(2.5 μg/ml)內化。以動力學方式測定顆粒計數。就 M048-D01-hIgG1與M047-D08-hIgG1可觀察到快速內化，而同型對照hIgG1沒有內化。

運載路徑的一個更詳盡評估係使用小G-蛋白的共染色來進行。Rab GTPase調結膜運載(包括囊泡形成、囊泡沿著肌動蛋白及微管蛋白網絡移動與膜融合)的數個步驟。為區別不同的路徑，選擇兩種Rab蛋白來染色-Rab7，其在晚期吞噬小體及溶小體中表現，以及Rab11，其在早期與再循環吞噬小體中表現。經標記抗體內化6小時後，在以Rab 7與Rab11抗體染色前將細胞固定並使用甲醇予以通透。結果顯示於第7圖中。

M048-D01-hIgG1與M047-D08-hIgG1顯示使用Rab 7有明顯共染色，而使用Rab 11的共染色僅有少許。此等結果表示，在FGFR2內化後，複合物進入吞噬小體-溶小體路徑。

關於其他所述抗體(像是GAL-FR21與GAL-FR22(WO2010/054265及Zhao et al.(Clin Cancer Res.2010,16：5750-5758)))的染色型態看起來完全不同。在此使用Rab7幾乎沒有偵測到染色，但使用Rab11達到較多共染色。這表示此等抗體在結合至FGFR2受體後內化且偏好回收路徑。

實施例13：本發明抗FGFR2抗體在小鼠模型的實驗腫瘤中的測試

本發明抗FGFR2抗體的活體內效力係例如藉由皮下異體或同體腫瘤模型來測試。專家知曉先前技藝方法以證明本發明抗體的效力。例如，小鼠因而皮下接種表現標的FGFR2的腫瘤細胞。之後，帶有腫瘤的小鼠經靶定FGFR2的本發明抗體、非結合同型對照或磷酸鹽-緩衝食鹽水(PBS)處理。腹膜內或靜脈內施用抗體每週兩次。為了測試加成性抗-腫瘤效力，本發明FGFR2 Ab與常見標準照護組合並與單一藥劑效力來比較。腫瘤生長係藉由卡尺頻繁測量腫瘤面積來監測。在腫瘤生長與處理數週後，收取腫瘤並將經本發明抗FGFR2抗體處理的動物之腫瘤重量或腫瘤尺寸(藉由式長度x寬度計算腫瘤面積)與那些以PBS或同型對照抗體處理者相比較。經本發明抗FGFR2抗體處理的小鼠表現明顯較小的腫瘤。

表現FGFR2的人類或鼠科腫瘤細胞被皮下種植到免疫功能不足小鼠(例如裸鼠或SCID小鼠)的側脅。每隻小鼠從細胞培養瓶分離0.25-10百萬細胞，離心並分別懸浮於100 μl PBS、50%培養基/50%基質膠或100%基質膠。接著將細胞皮下接種至小鼠側脅的皮膚下。在患者衍生的腫瘤模型中，從胃癌患者收取的腫瘤被皮下通經免疫功能不足小鼠。關於測試抗FGFR2抗體的效力，限定尺寸(2 x 2 mm)的腫瘤塊被皮下移植至小鼠側脅。在幾天內確定有腫瘤。若腫瘤達到20 mm²(細胞株衍生的腫瘤)或100 mm²(患者衍生的腫瘤)的尺寸時最早開始處理，其中藉由式長度x寬度計算腫瘤面積(mm²)並藉由式長度x寬度²/2計算腫瘤體積(mm³)。以抗體治療是腹膜內或靜脈內經由尾靜脈注射來進行。抗體係溶解於PBS或50 mM乙酸鈉、150 mM NaCl中。以10 ml/kg的體積施用抗體。治療時間表是以抗體的藥物動力學行為作基礎。作為標準，每週施用抗體兩次(交替每第三天與第四天)。作為標準，進行治療直到對照組達到最大可能腫瘤尺寸。或者較早停止處理。作為標準，每個處理組使用8隻小鼠。每個處理組的小鼠數目可增加，若預期腫瘤生長有較高的變異。平行於處理組，按照相同的處理時間表以PBS處理對照組。在研究期間，經常藉由使用卡尺測量腫瘤的長度與寬度來頻繁地評估腫瘤面積。在研究結束時，收取腫瘤並稱重。經抗體處理組(T)的平均腫瘤重量與對照的平均腫瘤重量(C)的比例表示為T/C。若處理組與對照組在不同時間點中止或腫瘤重量無法用作為讀出值，變成壞死性，則T/C比是依據最後共同測量時間點的腫瘤面積來計算。

將2種於50%培養基/50%基質膠中的Mio人類胃癌SNU-16細胞皮下接種至雌性nodSCID小鼠的側脅。當腫瘤達到平均尺寸為20-30 mm²時，開始以抗FGFR2抗體腹膜內處理並持續每週兩次直到研究結束。若對照組的腫瘤達到最大可接受尺寸，中止研究並收取腫瘤與稱重。

本發明的所有測試抗FGFR2抗體相較於對照明顯降低腫瘤生長。以劑量為2 mg/kg的M017-B02-hIgG1、M021-H02-hIgG1、M048-D01-hIgG1、M054-A05-hIgG1、M054-D03-hIgG1，及M047-D08-hIgG1處理產生T/C分別為0.19、0.22、0.17、0.19、0.21及0.22(參見第8至13圖)。

將2.5x10⁵個鼠科4T1乳癌細胞於100% PBS中皮下接種至NMRI nu/nu小鼠的側脅。選擇同基因小鼠取代免疫功能不足小鼠以避免發展出對抗人類IgG蛋白的中和抗體。在腫瘤已達到24 mm²的平均尺寸時的時間點開始處理腫瘤。為測試M048-D01-hIgG1可能的加成抗-腫瘤效用，分別單獨以M048-D01-hIgG1、拉帕替尼或太平洋紫杉醇，以及與M048-D01-hIgG1與太平洋紫杉醇或拉帕替尼組合處理小鼠。作為標準，單獨以PBS處理小鼠。每週兩次使用M048-D01-hIgG1進行靜脈內(i.v.)處理，拉帕替尼每週一次經口(p.o.)而太平洋紫杉醇每週一次靜脈內。進行所有處理直到研究結束。因為腫瘤在研究結束時變成壞死性，在腫瘤細胞接種後第13天使用腫瘤面積來測定抗-腫瘤效力。這個研究揭示M048-D01-hIgG1與拉帕替尼或太平洋紫杉醇的組合達到加成性抗-腫瘤效力：使用拉帕替尼與太平洋紫杉醇的單一療法相較於載劑對照分別無法明顯改變腫瘤生長，而單獨M048-D01-hIgG1相較於載劑亦造成明顯降低，其T/C為0.73。與拉帕替尼及太平洋紫杉醇的組合使此T/C下降至0.58及0.52，相對於單一療法皆在統計上有顯著性(參見第14與15圖)。

來源衍生自患者，GC10-0608及GC12-0811(Prof.Huynh Hung,National University of Singapore(NUS))的2x2 mm胃腫瘤塊被通經至免疫功能不足小鼠，係皮下移植到雌性免疫功能不足幼稚小鼠。使用卡尺以二維測量腫瘤來頻繁評估腫瘤尺寸並藉由式長度x寬度²/2來計算腫瘤體積。在腫瘤達到平均尺寸約100 mm³時的時間點開始使用不同劑量的M048-D01-hIgG1處理。每週兩次使用劑量為5、2及1 mg/kg M048-D01-hIgG1進行靜脈內(i.v.)處理。在帶有高FGFR2蛋白質表現的腫瘤模型(GC10-0608)中，基於最終腫瘤重量為0.55、0.60及0.41，所有三種劑量造成T/C值的腫瘤生長明顯降低(參見第16圖)。在帶有明顯較低的FGFR2蛋白質的模型(GC12-0811)中，5與2 mg/kg的M048-D01-hIgG1造成腫瘤重量明顯降低，使得T/C為0.70及0.67(參見第17圖)。與較低FGFR2表現一致的是，1 mg/kg的M048-D01-hIgG1不會造成最終腫瘤重量明顯降低。關於處理兩種其他腫瘤模型，乳癌模型MFM223與結腸直腸癌模型NCI-H716(ATCC-CCL-251)，我們未發現能明顯降低腫瘤生長的適當施用方案。

實施例14：在以抗FGFR2抗體處理後在異體移植腫瘤中P-FGFR與總FGFR2濃度向下調節

為分析總FGFR2濃度所觀察到的向下調節與P-FGFR2的同時降低是否在活體內也見於異體移植腫瘤中，藉由西方墨點在以抗FGFR2抗體處理後分析SNU-16腫瘤。在以抗FGFR2抗體2 mg/kg i.p.每週處理兩次NOD/SCID小鼠的異體移植實驗結束時收集腫瘤(詳情參見實施例13)。在最後一次注射抗體後24小時取得腫瘤，急速冷凍於液態氮中並儲存於-80℃下直到分析。在西方墨點分析前，將冷凍腫瘤切成約5 mm直徑的薄片且將各薄片置於含預冷的5 mm鋼珠(Qiagen)及500 μl溶解緩衝液(50mM Hepes pH 7.2、150mM NaCl、1mM MgCl₂、10mM Na₄P₂O₇、100mM NaF、10%甘油、1.5% Triton X-100與新鮮添加的完全蛋白酶抑制劑混合物(Roche No.1873580001)、4 mM Na₃VO₄，使用NaOH將pH調節至7.4)的2 ml離心管中。在300Hz下於Tissuelyzer(Qiagen)中3分鐘，接著在冰上培育30分鐘來溶解樣本。接著，於Micro-centrifuge(Eppendorf)中在4℃下以13000 rpm離心樣本10分鐘，且將來自原腫瘤的切片的上清液集中在一起。腫瘤溶解產物中的蛋白質濃度是藉由使用BCA蛋白質分析套組(Novagen，溶解產物1：50稀釋於H₂O中)來測定。樣本稀釋至最終濃度為5mg/ml且50μl的樣本與7.7 μl的(10*)樣本還原劑及19.2μl(4*)NuPAGE樣本緩衝液(Invitrogen)混合。將對應於115μg蛋白質的樣本施用至Invitrogen的NuPAGE 4-12% SDS page凝膠並以120V運行2小時45分。藉由iBlot系統(Invitrogen)依據製造商建議進行染漬。在室溫下於PBST的5% BLOT QuickBlocker(Invitrogen)中對膜進行阻斷2小時，接著在4℃下與一級抗體培育隔夜。一級抗體係如下：P-FGFR：#AF3285，R&D Systems，0.5μg/m；總FGFR2：M017-B02-hIgG1，4μg/ml於PBST的3% BLOT QuickBlocker中。次日，在PBST中洗滌膜三次，接著在室溫下與二級抗體(過氧化酶-結合AffiniPure山羊抗-兔IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch #111-035-003或過氧化酶-結合AffiniPure山羊抗-人類IgG+IgM(H+L)(Jackson ImmunoResearch #109-035-127，1：10000於3% BLOT QuickBlocker/PBST中)一起培育2小時。然後，以PBST洗滌膜10分鐘4次，並藉由化學發光在與ECL試劑培育後偵測訊號。為偵測加載對照，以濃拆解溶液(1：10於Milipore-H2O中)在室溫下震盪15分鐘而將膜拆解，接著阻斷並使用3% QuickBlocker/PBST中的1：1000抗-肌動蛋白抗體#A2066(Sigma)偵測。

經抗FGFR2抗體處理的每組2隻動物的代表性結果顯示於第18圖中，並排的是經對照IgG處理的動物樣本。在以本發明抗FGFR2抗體處理後，總FGFR2與P-FGFR濃度強烈降低。因此，在活體外研究中所述總FGFR2向下調節的作用模式亦與以本發明抗FGFR2抗體處理後的異體移植腫瘤中有關。

實施例15：使用抗體藥物結合物的皮下異體移植癌症模型

抗FGFR2抗體可使用本技藝中習知的程序(例如Liu et al.,Proc Natl.Acad.Sci.(1996),93,8618-8623))結合至細胞毒性小分子。A431細胞在補充有10% FBS的DMEM中維持為附著性培養物。NOD SCID或其他免疫功能不足的6至7週齡小鼠將在右側脅被皮下接種0.1 ml培養基的1-5 x 10e6細胞。當腫瘤尺寸達到約25 mm²時，以1至10 mg/kg的劑量每4、7或10天腹膜內投與抗體藥物結合物3次。對照小鼠將以PBS或不相干單株抗體(結合有相同發毒團)處理，以滑動卡尺每週兩次測量腫瘤尺寸。藉由比對抗FGFR2抗體藥物結合物處理相對對照處理的腫瘤尺寸來評估抗-腫瘤效力。

實施例16：產生具有增進親和力之選定抗體的成熟變體

藉由如表9中所示的噬菌體展示而發現的本發明抗FGFR2抗體將進一步藉由親和力成熟而予以最佳化。

抗體親和力成熟是一個兩步驟的過程，其中組合飽和突變及穩定的高通量篩選來鑑別造成親和力增加的少量突變。在第一輪親和力成熟中，依據BMC Biotechnology 7：65,2007野生型抗體的位置多樣化是藉由定位突變使用NHK-三核苷酸匣(其中N表示25%混合腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤與胞嘧啶核苷酸的每一者，而K表示50%混合胸腺嘧啶與鳥嘌呤核苷酸的每一者)而被引入。這樣，所有20種胺基酸被引入個別胺基酸位置處。這個位置隨機化受限在六個互補決定區(CDR)。在第二輪親和力成熟中，有益取代係重組並篩選進一步增進。各變體的實施例示於表10中。

使用兩種不同類型的ELISA來測定突變型變體的結合增進：a)肽結合ELISA：一種合成肽，含有C-端連結至經生物素化離胺酸RPSFSLVEDTTLEPEG-Ttds-Lys(生物素)(肽序列衍生自SEQ ID NO：63，由JPT Peptide Technology GmbH,Berlin,Germany合成)的表位的胺基酸序列，及b)重組型蛋白質結合ELISA：重組型人類FGFR2(人類FGFR2的DNA序列(NP_000132.3)Met 1-Glu 377，與在C-端的多組胺酸標誌融合，# 10824-H08H，Sino Biological Inc.,Beijing,China)。

簡言之，在兩種ELISA形式中，在37℃下以2.2 μg/ml將塗覆緩衝液(# 121125 Candor Bioscience GmbH)中的20 μl抗-人類IgG Fc特異性(# I2136；sigma)塗覆MTP盤(384孔Maxisorp，Nunc)持續2.5小時。在使用50 μl PBST(磷酸鹽緩衝食鹽水，137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、2 mM KH₂PO₄，pH 7.4、0.05% Tween20)的一個洗滌步驟後，在20至22℃下以50 μl的10% Smart Block(# 113500,Candor Bioscience GmbH)阻斷盤1小時並重複洗滌步驟3次。藉由在20至22℃下培育20 μl 1小時，以在PBST的10% Smart Block中0.035 μg/ml(以肽為主的分析)或0.2 μg/ml(以重組型人類FGFR2蛋白質為主的分析)的濃度固定抗-FGFR2變體，端視待分析的形式與變體而定。在使用50 μl PBST的一個洗滌步驟後，以最大濃度100 nM添加20 μl之連續稀釋在PBST的10% Smart Block中的抗原四聯組(quadruplet)並在20至22℃下培育1小時，且重複洗滌步驟3次。為偵測經生物素化表位肽，在20至22℃下施用呈1：1000稀釋在PBST的10% SmartBlock中的20 μl卵白素/POD結合物(# S5512,Sigma)1小時。為偵測重組型FGFR2蛋白質，在20至22℃下施用呈1：10000稀釋在PBST的10% SmartBlock中的20 μl抗-His/HRP結合物(#71840,novagen)1小時。在3個洗滌步驟後，添加20 μl之在50 mM磷酸氫鈉，pH 7.6中的10 μM amplex red受質(# A12222,Invitrogen)並使用常見螢光讀取儀(例如Tecan M1000)偵測螢光訊號。藉由將數據擬合(S型劑量-反應，可變斜率，底部設為背景；GraphPad Prism軟體)來評估EC50值。

表10中提供數個在M048-D01(TPP-1403)的重鏈與輕鏈中所產生之具有胺基酸取代的變體實施例。相較於非CDR有所改變的變體，所有變體在具有不同抗原形式的兩種ELISA形式中經評估顯示在抗原結合方面有強烈增進(表11)。

表10中提供數個在M047-D08(TPP-1415)的重鏈與輕鏈中所產生之具有胺基酸取代的變體實施例。相較於非CDR有所改變的變體，所有變體顯示在抗原結合方面有明顯增進(表11)。

兩種形式間關於數值結果、EC50以及增進因素的差異性是出乎意料的，但或可解釋為因為使用呈肽或蛋白質形式的抗原以及在ELISA夾層的頂部上形成最終偵測酵素結合物的差異性：抗-His-HRP結合物以及His-標誌FGFR2的K_D未知，但是非常可能是高出偵測表位肽時所用的生物素與卵白素的K_D(10-15 M)數個量級。因此，結合肽的敏感性明顯比His-標誌蛋白質的敏感性還高，使得能夠測得較小的EC50。另外或此外，差異性可能是因為抗-FGFR2抗體與兩種抗原交互作用時的誤差，儘管它們在一段15個胺基酸是相同的序列；首先，分子的C-端後部分的化學非常不同，其次15個胺基酸可能採取與FGFR2蛋白質中的對應區域不同的3D構型。兩種解釋可能與以肽和蛋白質為基礎的ELISA間的差異性有關，在肽ELISA形式中顯示較小的EC50值。

表11中的數據清楚指出M048-D01(TPP-1403)在其N-端序列處結合FGFR2，如表位肽中所表示，且數種在CDR中具有胺基酸取代的變體出乎意料地也是，甚至具有更高的親和力。要注意的是，取代N102I存在於TPP-1403的六個其他變體中的五個，伴隨著在CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H2及/或CDR-H3中的數個其他取代，但不是在TPP-1399中出乎意料地在位置HC-102處顯示離胺酸(K)。

表11中的數據指出M047-D08(TPP-1415)在其N-端序列處結合FGFR2，如表位肽中所表示，且數種在CDR中具有胺基酸取代的變體出乎意料地也是，甚至具有更高的親和力。具有多個胺基酸取代的M047-D08(TPP-1415)變體顯示結合增進約4至40倍，TPP-1409(2.1 nM)最少而TPP-1406(0.22 nM)最多。要注意的是，它們之中有三者具有一個G102L(TPP-1406、-1407及-1412)以及一個G102V(TPP-1408)取代，伴隨著在CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、 CDR-H1及/或CDR-H3中的數個其他取代。

此外，在表11中歸納成熟抗FGFR2抗體的內化效力增進。增進係數是根據比較成熟抗體的內化與分解相對於親代抗體的對應數值所產生的總顆粒強度/細胞來計算。藉由比較同列抗體中的顆粒計數/細胞有相同的發現。實驗詳情描述於實施例12中。要注意的是，M048-D01(TPP-1403)的全部成熟變體顯示內化效力增進(1.9至2.4倍)。在M047-D08(TPP-1415)變體TPP-1412顯示內化效力增進1.5倍。內化是本發明抗體的一個重要特性。

在針對M047-D08與M048-D01所提供的變體中，清楚證明這些抗體的變體若保留表位的話可具有相似或增進的特性。

實施例17：測定與其他抗-FGFR2抗體的競爭

為分析依據本發明之抗-FGFR2抗體與本技藝中所述抗-FGFR2抗體間的競爭，在競爭性ELISA形式中評估不同抗體：在4℃下以20 μl之塗覆緩衝液(# 121125 Candor Bioscience GmbH)中的2 μg/ml抗-人類IgG(Fc特異性(#I2136；sigma))塗覆MTP盤(384孔Maxisorp,Nunc)隔夜。在使用50 μl PBST(磷酸鹽緩衝食鹽水，137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4，pH 7.4、0.05% Tween20)的一個洗滌步驟後，在20至22℃下以50 μl的100% Smart Block(# 113500,Candor Bioscience GmbH)阻斷盤1小時並重複洗滌步驟3次。藉由在20至22℃下培育20 μl 1小時，以在PBST的10% Smart Block中1 μg/ml的濃度固定M048-D01-hIgG(表示於表12中，第2排具有M048-D01-hIgG1捕捉是)；沒有M048-D01-hIgG的對照孔僅以在PBST的10% Smart Block培育(表示於表12中，第2排具有M048-D01-hIgG1捕捉否)。固定步驟接著是使用50 μl PBST的三次洗滌步驟。添加由重組型人類FGFR2、10 nM(#10824-H08H,SinoBiological)與呈5倍連續稀釋(1000至0.064 nM)的抗-FGFR2 IgG於PBST的10% SmartBlock中所構成的預先培育(1小時在20-22℃下)抗原/抗體混合物的20 μl四聯組並在20至22℃下培育1小時，繼而三次洗滌步驟。

為偵測重組型FGFR2蛋白質，在20至22℃下施用呈1：10000稀釋在PBST的10% SmartBlock中的抗-His/HRP結合物(#71840,novagen)1小時。在3個洗滌步驟後，添加20 μl之在50 mM磷酸氫鈉，pH 7.6中的10 μM amplex red受質(# A12222,Invitrogen)並使用常見螢光讀取儀(例如Tecan M1000)偵測螢光訊號。

稱為GAL-FR21、GAL-FR22以及GAL-FR23(描述於WO2010/054265與Zhao et al.(Clin Cancer Res.2010,16：5750-5758)中)三種不同的FGFR2結合抗體已被描述會結合至不同域表位。為評估使用這些抗體的差異性，進行競爭分析。

因為待分析抗體有不同同型，競爭ELISA形式必須確保在沒有重疊其他效用的情況下平衡且直接相比擬偵測競爭狀態，因為使用不同偵測抗體或單一偵測抗體對不同 IgG-同型有不同親和力。上述ELISA形式透過經其His-標誌取代結合小鼠或人類IgG1或IgG2a偵測來偵測FGFR2抗原滿足這個條件。M048-D01-hIgG1固定化就其人類Fc部分來說具有特異性，否則明顯數量的FGFR2將在塗覆抗-人類IgG(Fc特異性)但未提供M048-D01-hIgG1的ELISA盤孔中被偵測到；小鼠抗-FGFR2-IgG可能結合至抗-人類IgG(Fc特異性)且因此未偵測到FGFR2結合(表12，8-11欄)。另外，沒有觀察到FGFR2對固定型抗-人類IgG(Fc特異性)有明顯的非特異性結合(2欄)。”M048-D01-hIgG1”的”自我競爭”非常明顯(6欄)，且M048-D01-mIgG2a也是(7欄)。GAL-FR21、-FR22或-FR23均未在可偵測FGFR2(3-5欄)顯示劑量依賴型降低，而M048-D01-hIgG1與M048-D01-mIgG2a分別在1.25與0.63 nM和更高濃度的競爭抗體下具有>50%降低訊號，這證實M048-D01與三種GAL抗體之間的差異性。相對地，在單體FGFR2(10 nM)與GAL-FR22和GAL-FR23，而非與GAL-FR21預先培育之後，可偵測FGFR2的數量似乎明顯增加。因為GAL抗體既無融合至His-標誌而藉由西方分析來檢核，也沒有被抗-人類IgG(Fc特異性)所捕捉，最可能的解釋理由是，單體FGFR2可能藉由與抗體預先培育而二聚體化，而在之後FGFR2結合至固定型M048-D01-hIgG1時產生結合效用。固定型M048-D01-hIgG1直接結合至FGFR2以及藉此間接媒介至二聚體化抗體GAL-FR22與GAL-FR23的情況將進一步說明，M048-D01-hIgG1結合至與GAL抗體完全不同的FGFR2表位，否則結合事件不會發生。要注意的是，GAL-FR21不會增加可偵測FGFR2的數量。這個差異性似乎能藉由將如WO2010/054265中所述的GAL抗體的更具體說明納入考量來解釋：Gal-FR22結合至D2-D3IIIa的一個表位，而GAL-FR23結合至全部或部分位於D1中的一者；兩個區域表示在所用重組型人類FGFR2-IIIc分子中。但就GAL-FR21來說，表位被描述為在D3-IIIb中，不是由這個FGFR2-IIIc同型異構體所表示的序列段：因此GAL-FR21無法結合抗原且媒介結合效用。如所示，在分析中中沒有一者觀察到M048-D01-hIgG1與GAL抗體之一者間有競爭。

競爭實驗的結果，如上所述，受到下面的觀察結果所支持：包括GAL-FR23在內的所有三種GAL抗體(表位全部或部分位在D1中)顯示無結合至FGFR2的細胞外N-端表位的合成肽(SEQ ID NO：63)，該合成肽含有表位C-端連接至生物素化離胺酸的胺基酸序列(¹RPSFSLVEDTTLEPE¹⁵G-Ttds-Lys(生物素))，甚至在IgG連續滴定施用的最高濃度(600 nM)下，而M048-D01-hIgG1(被抗-人類IgG(Fc特異性)POD結合物所偵測：#A5175，sigma)與M048-D01-mIgG2a的強烈結合使EC50在≦1 nM的範圍內(詳細數據未示出)。關於偵測小鼠抗體係使用抗-小鼠IgG(Fc特異性)POD結合物(#715-35-15,jackson)，針對其能力正向檢核以偵測結合至FGFR2-IIIbα的GAL-FR21、-FR22、-FR23與M048-D01-mIgG2a。

第1圖：FGFR2的結構示意圖。以比對的方式顯示α(SEQ ID NO：61)與β(SEQ ID NO：62)剪接變體。此圖顯示三個Ig樣域(D1、D2與D3)、穿膜域TM以及細胞內激酶域。表示肝素結合位點(HBS)、酸性盒(AB)以及交替 IIIb/IIIc局部域。胺基端標記為N，羧端標示為C。本發明抗體的結合表位顯示為條紋。

第2圖：在與呈10 μg/ml的抗FGFR2抗體於MFM223細胞中短期(15分鐘)培育之後誘發的磷酸化FGFR2(P-FGFR2)濃度。Y為”未經處理對照細胞%”。如所示，抗體M048-D01-hIgG1以及M047-D08-hIgG1增加P-FGFR2的ELISA訊號與未經處理對照細胞相比高出4倍係數。相對地，對照IgG抗體或由R&D商業購得的抗FGFR2抗體(MAB665、MAB684、MAB6843)在短期培育後對P-FGFR2濃度皆未顯示任何顯著效用。這些結果揭示，本發明中所述的抗FGFR2抗體對於FGFR2在短期培育後的促效效用。

第3圖：在與呈10 μg/ml的抗FGFR2抗體長期(24小時)培育後，MFM223細胞對FGF7(25ng/ml，15分鐘)媒介誘發P-FGFR2濃度的去敏化。Y為”未經處理對照細胞%”。如所示，抗體M048-D01-hIgG1以及M047-D08-hIgG1降低P-FGFR2濃度，其在FGF7刺激後非常明顯。在無抗體處理的細胞中以及在同型異構體對照IgG處理的細胞中以FGF7刺激的P-FGFR2濃度增加約4倍。相對地，在經抗FGFR2抗體預先處理24小時的樣本中，FGF7僅誘導P-FGFR2濃度達1.37至1.4倍。總言之，這些結果顯示細胞與本發明抗FGFR2抗體的延長培育會使得對使用FGF7的刺激去敏化。

第4圖：在與呈10 μg/ml的抗FGFR2抗體培育後4.5小時，藉由FACS分析在帶有FGFR2過度表現 (MFM223、SNU16)或FGFR2突變(AN3-CA、MFE-296)的細胞株中FGFR2表面表現的向下調節。Y為”對照細胞%”。如所示，抗體M048-D01-hIgG1以及M047-D08-hIgG1是降低帶有FGFR2過度表現的細胞株(MFM223、SNU16)與具有FGFR2突變的細胞株(AN3-CA、MFE-296)之FGFR2表面表現的唯二抗體。像是MAB684與MAB6843的抗體(R&D)僅降低未過度表現FGFR2之細胞株的FGFR2表面表現。像是GAL-FR21的抗體未降低具有FGFR2突變之細胞株的FGFR2表面表現。

第5圖：在與抗FGFR2抗體長期(96小時)培育後，SNU16細胞中的總FGFR2濃度向下調節。Y為”對照細胞%”。X為”抗體濃度[μg/ml]”。如所示，抗體M048-D01-hIgG1(白)以及M047-D08-hIgG1(條紋)在96小時後以劑量依賴的方式顯著降低總FGFR2濃度。非結合對照抗體(黑)未顯示任何效用。這些結果指出抗FGFR2抗體M048-D01-hIgG1以及M047-D08-hIgG1不僅造成表面FGFR2濃度的短期降低，也造成總FGFR2濃度的長期降低。

第6圖：M048-D01-hIgG1以及M047-D08-hIgG1在結合至表現內源性FGFR2的細胞後特異性內化的時間過程的顯微評估。Y係”每個細胞的顆粒計數”。X係”時間[分]”。對乳癌細胞株SUM 52PE研究抗體內化。每個細胞的顆粒計數係以動力學的方式來測量。如所示，抗體M048-D01-hIgG1(黑正方形及實線)以及 M047-D08-hIgG1(黑三角形與虛線)顯示快速內化，如藉由每個細胞的顆粒計數增加所示。同型對照抗體(星形與虛線)未顯示任何內化。

第7圖：M048-D01-hIgG1(A、B)以及M047-D08-hIgG1(C、D)的內化在SUM 52PE細胞中顯示共染色，如使用Rab 7(A、C)而非使用Rab 11(B、D)所示。GAL-FR21(E、F)與GAL-FR22(G、H)的內化在SUM 52PE細胞中顯示共染色，如使用Rab 11(F、H)而非使用Rab 7(E、G)所示。

第8圖：相較於PBS(實心圓，實線)及對照IgG處理(實心三角形，實線)，皮下SNU-16異體移植物在以2 mg/kg的M017-B02-hIgG1(空心三角形，實線)腹膜內處理下的生長。繪示平均+標準偏差。X為”腫瘤接種後的時間[天]”。Y為”腫瘤面積[mm²]”。以M017-B02-hIgG1處理造成非常明顯的腫瘤生長抑制。

第9圖：相較於PBS(實心圓，實線)及對照IgG處理(實心三角形，實線)，皮下SNU-16異體移植物在以2 mg/kg的M021-H02-hIgG1(空心三角形，實線)腹膜內處理下的生長。繪示平均+標準偏差。X為”腫瘤接種後的時間[天]”。Y為”腫瘤面積[mm²]”。以M021-H02-hIgG1處理造成非常明顯的腫瘤生長抑制。

第10圖：相較於PBS(實心圓，實線)及對照IgG處理(實心三角形，實線)，皮下SNU-16異體移植物在以2 mg/kg的M048-D01-hIgG1(空心三角形，實線)腹膜內處理下的生長。繪示平均+標準偏差。X為”腫瘤接種後的時間[天]”。Y為”腫瘤面積[mm²]”。以M048-D01-hIgG1處理造成非常明顯的腫瘤生長抑制。

第11圖：相較於PBS(實心圓，實線)及對照IgG處理(實心三角形，實線)，皮下SNU-16異體移植物在以2 mg/kg的M054-A05-hIgG1(空心三角形，實線)腹膜內處理下的生長。繪示平均+標準偏差。X為”腫瘤接種後的時間[天]”。Y為”腫瘤面積[mm²]”。以M054-A05-hIgG1處理造成非常明顯的腫瘤生長抑制。

第12圖：相較於PBS(實心圓，實線)，皮下SNU-16異體移植物在以2 mg/kg的M054-D03-hIgG1(空心三角形，實線)腹膜內處理下的生長。繪示平均+標準偏差。X為”腫瘤接種後的時間[天]”。Y為”腫瘤面積[mm²]”。以M054-D03-hIgG1處理造成非常明顯的腫瘤生長抑制。

第13圖：相較於PBS(實心圓，實線)，皮下SNU-16異體移植物在以2 mg/kg的M047-D08-hIgG1(空心三角形，實線)腹膜內處理下的生長。繪示平均+標準偏差。X為”腫瘤接種後的時間[天]”。Y為”腫瘤面積[mm²]”。以M047-D08-hIgG1處理造成非常明顯的腫瘤生長抑制。

第14圖：在腫瘤細胞接種後的第13天，皮下4T1腫瘤的腫瘤面積的點狀圖，最後一個時間點前腫瘤變成壞死性。小鼠在這個時間點接受以單獨PBS(A)、5 mg/kg的M048-D01-hIgG1每週兩次i.v.(B)、100 mg/kg拉帕替尼p.o.(C)或以5 mg/kg的M048-D01-hIgG1每週兩次i.v.及 100 mg/kg拉帕替尼p.o.(D)處理。Y為在第13天的腫瘤面積[mm²]，虛線表示平均值，實線表示中位數。以單獨M048-D01-hIgG1處理造成腫瘤面積明顯降低，而單獨拉帕替尼未明顯影響腫瘤面積。M048-D01-hIgG1與拉帕替尼的組合造成明顯的加成性抗-腫瘤活性。

第15圖：在腫瘤細胞接種後的第13天，皮下4T1腫瘤的腫瘤面積的點狀圖，最後一個時間點前腫瘤變成壞死性。小鼠在這個時間點接受以單獨PBS(A)、5 mg/kg的M048-D01-hIgG1每週兩次i.v.(B)、24 mg/kg太平洋紫杉醇每週一次i.v.(C)或以5 mg/kg的M048-D01-hIgG1每週兩次i.v.及24 mg/kg太平洋紫杉醇每週一次i.v.(D)處理。Y為在第13天的腫瘤面積[mm²]，虛線表示平均值，實線表示中位數。以單獨M048-D01-hIgG1處理造成腫瘤面積明顯降低，而單獨太平洋紫杉醇未明顯影響腫瘤面積。M048-D01-hIgG1與太平洋紫杉醇的組合造成明顯的加成性抗-腫瘤活性。

第16圖：相較於PBS(空心菱形，實線)，患者衍生而來的皮下GC10-0608異體移植物在以5 mg/kg(實心三角形，實線)、2 mg/kg(實心圓形，虛線)與1 mg/kg(實心正方形，虛線)的M048-D01-hIgG1腹膜內處理下的生長。繪示平均+標準誤差。X為”處理時間[天]”。Y為”腫瘤體積[mm³]”。以全部三種劑量的M048-D01-hIgG1處理造成明顯的腫瘤生長抑制。

第17圖：相較於PBS(空心菱形，實線)，患者衍生而來的皮下GC12-0811異體移植物在以5 mg/kg(實心三角形，實線)、2 mg/kg(實心圓形，虛線)與1 mg/kg(實心正方形，虛線)的M048-D01-hIgG1腹膜內處理下的生長。繪示平均+標準誤差。X為”處理時間[天]”。Y為”腫瘤體積[mm³]”。以劑量為5與1 mg/kg的M048-D01-hIgG1處理造成明顯的腫瘤生長抑制。

第18圖：相較於對照抗體(2mg/kg，每週兩次，i.p.，樣本在最後一次給藥24小時後取得)，在以抗FGFR2抗體M048-D01-hIgG1與M047-D08-hIgG1長期處理SNU16異體移植物後，總FGFR2[總FGFR2]與磷酸化FGFR2[P-FGFR2]的向下調節。如所示，在以M048-D01-hIgG1與M047-D08-hIgG1處理後，總FGFR2[總FGFR2]與磷酸化FGFR2[P-FGFR2]相較於以對照IgG1處理明顯降低。肌動蛋白作為加載對照。

第19圖：本發明的序列。

<110> Bayer Intellectual Property GmbH

<120> 抗-FGFR2抗體及其用途

<130> BHC 11 1 042

<160> 222

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 1

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<213> 智慧人

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<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 52

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<212> DNA

<213> 智慧人

<400> 53

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<212> DNA

<213> 智慧人

<400> 54

<210> 55

<211> 8

<212> PRT

<213> 智慧人

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<213> 智慧人

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<213> 智慧人

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<213> 智慧人

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<213> 智慧人

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<213> 智慧人

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<213> 智慧人

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<212> PRT

<213> 智慧人

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<213> 家兔

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<213> 豬

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<212> PRT

<213> 家犬

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<213> 智慧人

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<213> 智慧人

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<213> 智慧人

<400> 215

<210> 216

<211> 20

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 216

<210> 217

<211> 11

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 217

<210> 218

<211> 13

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 218

<210> 219

<211> 7

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 219

<210> 220

<211> 12

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 220

<210> 221

<211> 452

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 221

<210> 222

<211> 452

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 222

Claims

一種分離抗體或其抗原-結合片段，其在過度表現FGFR2的細胞株SNU16(ATCC-CRL-5974)與MFM223(ECACC-98050130)中以及在表現突變型FGFR2的細胞株AN3-CA(DSMZ-ACC 267)與MFE-296(ECACC-98031101)中於結合至FGFR2後降低FGFR2之細胞表面表現。
一種分離抗體或其抗原-結合片段，其特異地結合至如SEQ ID NO：63所示之FGFR2之細胞外N-端表位(¹RPSFSLVEDTTLEPE¹⁵)。
如申請專利範圍第2項之分離抗體或其抗原-結合片段，其中該抗體結合至細胞外N-端表位(SEQ ID NO：63)係藉由至少一個選自由以下殘基所組成之群之表位殘基所媒介：Arg 1、Pro 2、Phe 4、Ser 5、Leu 6及Glu 8。
如申請專利範圍第2至3項中任一項之分離抗體或抗原-結合片段，其中該抗體或其抗原-結合片段係藉由將FGFR2之N-端表位(¹RPSFSLVEDTTLEPE¹⁵)的至少一個胺基酸殘基改變成丙胺酸而喪失超過其50%的ELISA訊號，a)該殘基係選自Pro 2、Leu 6及Glu 8之群，或b)該殘基係選自Arg 1、Pro 2、Phe 4與Ser 5之群。
如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體或抗原-結合片段，其中該抗體或抗原-結合片段與選自下列之群之至少一種抗體競爭結合至FGFR2：”M048-D01”、”M047-D08”、”M017-B02”、”M021-H02”、”M054-A05”、”M054-D03”、”TPP-1397”、”TPP-1398”、”TPP-1399”、”TPP-1400”、”TPP-1401”、”TPP-1402”、”TPP-1403”、”TPP-1406”、”TPP-1407”、”TPP-1408”、”TPP-1409”、”TPP-1410”、”TPP-1411”、”TPP-1412”及”TPP-1415”。
如申請專利範圍第5項中任一項之抗體或抗原-結合片段，其中該抗體或抗原-結合片段的胺基酸序列係與下列之至少一個CDR序列至少50%、55%、60%、70%、80%、90或95%相同：”M048-D01”、”M047-D08”、”M017-B02”、”M021-H02”、”M054-A05”、”M054-D03”、”TPP-1397”、”TPP-1398”、”TPP-1399”、”TPP-1400”、”TPP-1401”、”TPP-1402”、”TPP-1403”、”TPP-1406”、”TPP-1407”、”TPP-1408”、”TPP-1409”、”TPP-1410”、”TPP-1411”、”TPP-1412”或”TPP-1415”，或與下列的VH或VL序列至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%相同：”M048-D01”、”M047-D08”、”M017-B02”、”M021-H02”、”M054-A05”、”M054-D03”、”TPP-1397”、”TPP-1398”、”TPP-1399”、”TPP-1400”、”TPP-1401”、”TPP-1402”、”TPP-1403”、”TPP-1406”、”TPP-1407”、”TPP-1408”、”TPP-1409”、”TPP-1410”、”TPP-1411”、”TPP-1412”或”TPP-1415”。
如申請專利範圍第5至6項中任一項之抗體或抗原-結合片段，其中該抗體或抗原-結合片段包含如表9及表10中所示之至少一個CDR序列或至少一個可變重鏈或輕鏈序列。
如申請專利範圍第1至7項之抗體或抗原-結合片段，其包含：a如SEQ ID NO：5-7所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：8-10所表示的可變輕鏈CDR序列，或b如SEQ ID NO：15-17所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：18-20所表示的可變輕鏈CDR序列，或c如SEQ ID NO：25-27所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：28-30所表示的可變輕鏈CDR序列，或d如SEQ ID NO：35-37所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：38-40所表示的可變輕鏈CDR序列，或e如SEQ ID NO：45-47所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：48-50所表示的可變輕鏈CDR序列，或f如SEQ ID NO：55-57所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：58-60所表示的可變輕鏈CDR序列，或 g如SEQ ID NO：75-77所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：78-80所表示的可變輕鏈CDR序列，或h如SEQ ID NO：85-87所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：88-90所表示的可變輕鏈CDR序列，或i如SEQ ID NO：95-97所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：98-100所表示的可變輕鏈CDR序列，或j如SEQ ID NO：105-107所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：108-110所表示的可變輕鏈CDR序列，或k如SEQ ID NO：115-117所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：118-120所表示的可變輕鏈CDR序列，或l如SEQ ID NO：125-127所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：128-130所表示的可變輕鏈CDR序列，或m如SEQ ID NO：135-137所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：138-140所表示的可變輕鏈CDR序列，或n如SEQ ID NO：145-147所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：148-150所表示的可變輕鏈CDR序列，或 o如SEQ ID NO：155-157所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：158-160所表示的可變輕鏈CDR序列，或p如SEQ ID NO：165-167所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：168-170所表示的可變輕鏈CDR序列，或q如SEQ ID NO：175-177所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：178-180所表示的可變輕鏈CDR序列，或r如SEQ ID NO：185-187所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：188-190所表示的可變輕鏈CDR序列，或s如SEQ ID NO：195-197所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：198-200所表示的可變輕鏈CDR序列，或t如SEQ ID NO：205-207所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：208-210所表示的可變輕鏈CDR序列，或u如SEQ ID NO：215-217所表示的可變重鏈CDR序列以及由SEQ ID NO：218-220所表示的可變輕鏈CDR序列。
如申請專利範圍第1-8項之抗體或抗原-結合片段，其包含：a如SEQ ID NO：1所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：2所表示的可變輕鏈序列，或b如SEQ ID NO：11所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：12所表示的可變輕鏈序列，或c如SEQ ID NO：21所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：22所表示的可變輕鏈序列，或d如SEQ ID NO：31所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：32所表示的可變輕鏈序列，或e如SEQ ID NO：41所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：42所表示的可變輕鏈序列，或f如SEQ ID NO：51所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：52所表示的可變輕鏈序列，或g如SEQ ID NO：73所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：74所表示的可變輕鏈序列，或h如SEQ ID NO：83所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：84所表示的可變輕鏈序列，或i如SEQ ID NO：93所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：94所表示的可變輕鏈序列，或j如SEQ ID NO：103所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：104所表示的可變輕鏈序列，或k如SEQ ID NO：113所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：114所表示的可變輕鏈序列，或l如SEQ ID NO：123所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：124所表示的可變輕鏈序列，或m如SEQ ID NO：133所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：134所表示的可變輕鏈序列，或n如SEQ ID NO：143所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：144所表示的可變輕鏈序列，或o如SEQ ID NO：153所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：154所表示的可變輕鏈序列，或p如SEQ ID NO：163所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：164所表示的可變輕鏈序列，或q如SEQ ID NO：173所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：174所表示的可變輕鏈序列，或r如SEQ ID NO：183所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：184所表示的可變輕鏈序列，或s如SEQ ID NO：193所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：194所表示的可變輕鏈序列，或t如SEQ ID NO：203所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：204所表示的可變輕鏈序列，或u如SEQ ID NO：213所表示的可變重鏈序列以及如SEQ ID NO：214所表示的可變輕鏈序列。
如前述申請專利範圍中任一項之抗體，其為IgG抗體。
如前述申請專利範圍中任一項之抗原-結合片段，其為scFv、Fab、Fab’片段或F(ab’)₂片段。
如前述申請專利範圍中任一項之抗體或抗原-結合片段，其為單株抗體或抗原-結合片段。
如前述申請專利範圍中任一項之抗體或抗原-結合片段，其為人類、人類化或嵌合抗體或抗原-結合片段。
一種抗體-藥物結合物，其包含如申請專利範圍第1至13項之抗體或其抗原結合片段。
一種分離核酸序列，其編碼如申請專利範圍第1至13項之抗體或抗原-結合片段。
一種載體，其包含如申請專利範圍第15項之核酸序列。
一種分離細胞，其表現如申請專利範圍第1至13項中任一項之抗體或抗原-結合片段及/或包含如申請專利範圍第15項之核酸或如申請專利範圍第16項之載體。
如申請專利範圍第17項之分離細胞，其中該細胞為原核生物細胞或真核生物細胞。
一種製造如申請專利範圍第1至13項中任一項之抗體或抗原-結合片段的方法，其包含培養如申請專利範圍第18項之細胞並且純化該抗體或抗原-結合片段。
如申請專利範圍第1至13項之抗體或抗原-結合片段或如申請專利範圍第14項之抗體-藥物結合物，其係作為藥物。
如申請專利範圍第1至13項之抗體或抗原抗原-結合片段，其係作為診斷劑。
如申請專利範圍第1至13項之抗體或抗原-結合片段或如申請專利範圍第14項之抗體-藥物結合物，其係做為用於治療癌症的藥物。
一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至13項之抗體或抗原-結合片段或如申請專利範圍第14項之抗體-藥物結合物。
一種如申請專利範圍第23項之醫藥組成物及一或多種治療活性化合物的組合物。
一種治療與FGFR2之非所要存在有關的病症或病況的方法，其包含對需要的個體投與有效量之如申請專利範圍第23項之醫藥組成物或如申請專利範圍第24項之組合物。