TW201326213A

TW201326213A - 治療代謝病症之融合蛋白質

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Publication number: TW201326213A
Application number: TW101135183A
Authority: TW
Inventors: 布萊恩Ｒ伯特察爾; 沙瑞Ｌ卡伯嵐; 道格拉斯Ｓ丹尼爾斯; 浜松典郎; 史都華李其; 史蒂芬庫吉維德
Original assignee: 諾華公司
Priority date: 2011-09-26
Filing date: 2012-09-25
Publication date: 2013-07-01
Also published as: US20180369332A1; CN107266579B; EA201490695A1; ES2895080T3; JP6567613B2; MX2014003677A; ZA201401700B; MY166059A; EP3321276A3; IL231533A0; HRP20211575T1; AP2014007543A0; CU20150171A7; LT3321276T; JP2020007314A; AR088044A1; EP2760475B1; RS57868B1; ES2689762T3; UY34346A

Abstract

本發明係關於鑑別包含纖維母細胞生長因子21(FGF21)之多肽及蛋白質變異體之融合蛋白質，其具有改良之醫藥性質。亦揭示治療FGF21相關病症(包括代謝性病狀)之方法。

Description

治療代謝病症之融合蛋白質

本發明係關於包含纖維母細胞生長因子21(FGF21)之新型融合蛋白質，已知其可改良其所投與之個體的代謝概況。

纖維母細胞生長因子(FGF)家族之特徵在於22個遺傳學上不同的同源配位體，其可分為7個子族。FGF-21與FGF-19及FGF-23最緊密相關且與其一起形成一個子族。此FGF子族可調節多樣化的生理過程(此對於經典FGF而言則不常見)，亦即能量及膽汁酸內穩態、葡萄糖及脂質代謝、及磷酸鹽以及維生素D內穩態。此外，與其他FGF不同，此子族以內分泌方式起作用(Moore,D.D.(2007)Science 316,1436-8)(Beenken等人，(2009)Nature Reviews Drug Discovery 8,235)。

FGF21為具有209個胺基酸之多肽，其含有具有28個胺基酸之前導序列(SEQ ID NO：5)。人類FGF21與小鼠FGF21具有約79%的胺基酸一致性且與大鼠FGF21具有約80%的胺基酸一致性。已描述纖維母細胞生長因子21(FGF21)可用於治療缺血性血管疾病、傷口癒合及與肺、支氣管或肺泡細胞功能損傷有關之疾病(Nishimura等人，(2000)Biochimica et Biophysica Acta,1492：203-206；專利公開案WO 01/36640；及專利公開案WO 01/18172)。儘管FGF-21活化FGF受體及下游信號傳導分子(包括FRS2a及ERK)，但未偵測到FGFR與FGF-21之直接相互作用。研究已鑑別出β-可囉索(β-klotho)(其於肝臟、脂肪細胞及胰臟中高度表現)為對FGF-21之細胞反應之決定子及經由FGFR介導FGF-21信號傳導之輔因子(Kurosu,H.等人，(2007)J Biol Chem 282,26687-95)。FGF21為FGFR1(IIIc)、FGFR2(IIIc)及FGFR3(IIIc)β-可囉索信號傳導複合物之有效促效劑。

已證實FGF-21可誘導非胰島素依賴性葡萄糖攝取。亦已證實FGF-21可改善一系列糖尿病性齧齒動物模型中之高血糖。此外，發現過表現FGF-21之轉殖基因小鼠對飲食誘導之代謝異常具有抗性，且顯示體重及脂肪質量降低及胰島素敏感性增強(Badman,M.K.等人，(2007)Cell Metab 5,426-37)。向糖尿病性非人類靈長類動物投與FGF-21會引起空腹血糖、三酸甘油酯、胰島素及升糖素含量降低且使得脂蛋白概況有顯著改良，包括HDL膽固醇增加約80%(Kharitonenkov,A.等人，(2007)Endocrinology 148,774-81)。調查FGF21作用之分子機制的最近研究已鑑別出FGF21為一種重要的內分泌激素，其有助於控制空腹狀態適應性(Badman等人，(2009)Endocrinology 150,4931)(Inagaki等人，(2007)Cell Metabolism 5,415)。此提供先前缺失之PPARα之下游鏈路，肝臟可藉由PPARα之下游鏈路與身體其餘部分通信，從而調節能量內穩態之生物學(Galman等人，(2008)Cell Metabolism 8,169)(Lundasen等人，(2007)Biochemical and Biophysical Research Communications 360,437)。

FGF21經由活化AMPK/SIRT1/PGC1α路徑來調節脂肪細胞內穩態以抑制PPARγ表現及增強線粒體功能(Chau等人，(2010)PNAS 107,12553)。FGF21亦增強骨骼肌之葡萄糖攝取，如在培養之人類肌管及分離之小鼠組織中所量測出。用FGF21處理齧齒動物胰島細胞可經由活化ERK1/2及Akt路徑來改良功能及存活率(Wente等人，(2006)Diabetes 55,2470)。FGF21處理亦使得齧齒動物肝臟中脂肪生成及脂肪酸氧化酶之基因表現改變(此可能經由HNF4α及Foxa2信號傳導進行)。

與直接使用FGF-21作為生物治療劑相關之難點在於其半衰期極短(Kharitonenkov,A.等人，(2005)Journal of Clinical Investigation 115：1627-1635)。在小鼠中，人類FGF21之半衰期為0.5至1小時，且在食蟹獼猴中，半衰期為2至3小時。FGF21可以多用途的無菌醫藥調配物形式來利用。然而，已確定防腐劑(亦即間甲酚)在該等條件下對其穩定性具有不良影響。

在研發用作治療第1型糖尿病及第2型糖尿病以及其他代謝性病狀之治療劑的FGF21蛋白質時，半衰期及穩定性增加將為合乎需要的。具有增加之半衰期及穩定性之FGF21蛋白質將使接受該蛋白質給藥之患者之給藥頻率減少。顯然，需要研發治療性蛋白質FGF21之穩定水性蛋白質調配物。

此外，在研發FGF21作為蛋白質藥物時之重大挑戰為解決其物理及化學不穩定性。蛋白質之組成種類及特徵定義特定性質，諸如摺疊、構形穩定性及伸展/變性。當在利用蛋白質水溶液研發醫藥調配條件之過程中意欲使蛋白質穩定時，應解決與該等特徵有關之問題(Wang,W.,Int.J.of Pharmaceutics,18,(1999))。穩定化相關治療性蛋白質(例如本發明之蛋白質)之所需作用為增加對蛋白水解作用及酶促降解之抗性，藉此改良蛋白質穩定性及減少蛋白質聚集。

本發明係關於鑑別新型融合蛋白質，其包含纖維母細胞生長因子21(FGF21)且在醫藥調配條件下與野生型FGF21及其變異體相比具有改良之醫藥性質，例如更為穩定、具有改良接受投藥之個體之代謝參數的能力、對蛋白水解作用及酶促降解之敏感性更低及不太可能發生聚集及形成複合物。本發明之融合蛋白質包含FGF21之截短體、突變體及變異體。

亦揭示治療FGF21相關病症以及其他代謝性、內分泌性及心血管病症(諸如肥胖症、第1型糖尿病及第2型糖尿病、胰臟炎、血脂異常、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肝炎(NASH)、胰島素抗性、高胰島素血症、葡萄糖不耐、高血糖、代謝症候群、急性心肌梗塞、高血壓、心血管疾病、動脈粥樣硬化、周邊動脈疾病、中風、心臟衰竭、冠心病、腎病、糖尿病性併發症、神經病變、胃輕癱、與胰島素受體之嚴重失活突變有關之病症及其他代謝病症)及降低重症患者之死亡率及發病率之方法。

本發明之融合蛋白質可以每週一次之注射劑形式使用，其可單獨使用或與口服抗糖尿病劑組合使用，該等口服抗糖尿病劑可改良第1型糖尿病及第2型糖尿病患者之血糖控制、體重及脂質概況。該等蛋白質亦可用於治療肥胖症或其他FGF21相關病狀。

藉由呈現在醫藥調配條件下與野生型FGF21相比更為穩定、對蛋白水解作用及酶促降解之敏感性更低及不太可能發生聚集及形成複合物之蛋白質，本發明之融合蛋白質克服了與蛋白質治療劑有關(包括例如與投與野生型FGF21有關)的重大物理不穩定性障礙。

在第一態樣中，本發明提供纖維母細胞生長因子21(FGF21)融合蛋白質，其包含表1中所列及本文中進一步描述之一或多個序列。表1中列出之FGF21序列可為野生型FGF21序列(例如具有NCBI參考編號NP_061986.1之野生型FGF21序列)之變異體，且可見於諸如以下之授權專利中：例如讓渡給Chiron Corporation之US 6,716,626B1。

該等融合可例如在變異型FGF21序列(例如表1之序列)與其他分子(非FGF21部分)(例如IgG恆定域或其片段(例如Fc區域)、人類血清白蛋白(HSA)或白蛋白結合多肽)之間發生。在較佳實施例中，分子之非FGF21部分為Fc區域。

其他實施例係關於編碼本發明之融合蛋白質之聚核苷酸、含有該等聚核苷酸之載體及攜帶該載體之宿主細胞。

本文中提供用於產生本發明之融合蛋白質之方法，其中該等方法涉及經由例如在野生型FGF21蛋白質內的相關位置處位點特異性地併入胺基酸來修飾野生型FGF21蛋白質，以及在分子之FGF21部分與其他分子(例如IgG恆定域或其片段(例如Fc區域)、人類血清白蛋白(HSA)或白蛋白結合多肽)之間發生融合。與蛋白質之野生型型式相比，該等修飾及融合增強本發明之融合蛋白質的生物學性質，而且在一些情況下，可充當例如標記及蛋白質半衰期延長劑之連接點，及用於將該等變異體附著至固體支撐物表面的目的。本發明之相關實施例為製備能夠產生本發明之該等蛋白質之細胞的方法，及製備含有編碼該等變異體及融合物之DNA之載體的方法。

在各種實施例中，本文中揭示之本發明之融合蛋白質可包含FGF21野生型序列之一或多個片段，包括長度小至8至12個胺基酸殘基之片段，且其中多肽能夠降低哺乳動物之血糖。在各種實施例中，本文中揭示之本發明之融合蛋白質可包含FGF21野生型序列之一或多種變異體，例如該一或多種變異體與FGF21野生型序列相比具有一或多個胺基酸缺失、插入、添加或取代。

在一些實施例中，本文中揭示之本發明之融合蛋白質可與一或多種聚合物(諸如聚乙二醇(PEG)或聚唾液酸)共價連接，該連接在與野生型FGF21相比已進行位點特異性胺基酸修飾之位置處發生或在與該等蛋白質之野生型型式共有之胺基酸位置處發生。PEG基團以一定方式連接以便增強及/或不會干擾本發明之融合蛋白質之構成部分(例如FGF21蛋白質變異體)的生物功能。在其他實施例中，本發明之多肽可視情況經由連接子(諸如GS、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：6))與異源胺基酸序列融合。異源胺基酸序列可為IgG恆定域或其片段(例如Fc區域)、人類血清白蛋白(HSA)或白蛋白結合多肽。本文中揭示之該等融合蛋白質亦可形成多聚體。

在一些實施例中，異源胺基酸序列(例如HSA、Fc等)與本發明之融合蛋白質之胺基端融合。在其他實施例中，融合異源胺基酸序列(例如HSA、Fc等)與本發明之融合蛋白質之羧基端融合。

另一實施例係關於治療展現一或多種FGF21相關病症(諸如肥胖症、第2型糖尿病、第1型糖尿病、胰臟炎、血脂異常、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肝炎(NASH)、胰島素抗性、高胰島素血症、葡萄糖不耐、高血糖、代謝症候群、急性心肌梗塞、高血壓、心血管疾病、動脈粥樣硬化、周邊動脈疾病、中風、心臟衰竭、冠心病、腎病、糖尿病性併發症、神經病變、胃輕癱、與胰島素受體之失活突變有關之病症及其他代謝病症)之患者的方法，，其包含投與需要該治療之該患者治療有效量之一或多種本發明之蛋白質或其醫藥組合物。

本發明亦提供醫藥組合物，其包含本文中揭示之本發明之融合蛋白質及醫藥學上可接受之調配劑。該等醫藥組合物可用於治療代謝病症之方法，且該方法包含投與有需要之人類患者本發明之醫藥組合物。可被治療之代謝病症之非限制性實例包括第1型糖尿病及第2型糖尿病以及肥胖症。

將在以下[實施方式]中說明本發明之該等及其他態樣。

本發明之融合蛋白質表示此項技術中已知的全長野生型FGF21多肽之經修飾型式。FGF21野生型序列將充當參考序列(SEQ ID NO：1)，例如當需要比較FGF21野生型序列與蛋白質變異體時。FGF21野生型序列之NCBI參考序號為NP_061986.1且可見於諸如以下之授權專利中：例如讓渡給Chiron Corporation之US 6,716,626B1(SEQ ID NO：1)。

編碼全長FGF21多肽之相應mRNA序列(NCBI參考序號為NM_019113.2)展示於下文中(SEQ ID NO：2)

成熟FGF21序列缺乏前導序列且亦可能包括其他多肽修飾，諸如胺基端(具有或不具有前導序列)及/或羧基端之蛋白水解加工、小型多肽自大型前驅體裂解、N-連接及/或O-連接之糖基化作用及熟習此項技術者所理解的其他轉譯後修飾。成熟FGF21序列之代表性實例具有以下序列(SEQ ID NO：3，其表示全長FGF21蛋白質序列(NCBI參考序號NP_061986.1)之胺基酸位置29至209)：

編碼成熟FGF21多肽(SEQ ID NO：3)之相應cDNA序列展示於下文中(SEQ ID NO：4)：

本發明之融合蛋白質可包含本文中所列之野生型蛋白質的蛋白質變異體或突變體，例如FGF21變異體。如本文中所用，術語「蛋白質變異體」、「人類變異體」、「多肽或蛋白質變異體」、「變異體」、「突變體」以及其任何類似術語或特定型式(例如「FGF21蛋白質變異體」、「變異體」、「FGF21突變體」等)定義包含天然存在的(亦即野生型)蛋白質或多肽對應物或相應天然序列之修飾體、截短體、其他變異體之蛋白質或多肽序列。舉例而言，「變異體FGF21」或「FGF21突變體」係相對於如本文中所描述之野生型(亦即天然存在的)FGF21蛋白質進行描述。

本發明之代表性融合蛋白質序列列於表1中。該等融合物之說明包括FGF21變異體及(適當時)連接子。由FGF21變異體使用之變化或取代係相對於野生型FGF21進行編號及描述。作為實例，「變異體101(V101)」(SEQ ID NO：10)為Fc-FGF21融合物，其具有兩個胺基酸連接子及以下相對於野生型FGF21進行之取代：Q55C、A109T、G148C、K150R、P158S、P174L、S195A、P199G、G202A。

本發明之融合蛋白質中所用的變異體或突變體(例如野生型FGF21之變異體)相對於野生型蛋白質，有至少一個胺基酸經取代、添加及/或移除。此外，該等變異體相對於野生型蛋白質，可包括N端及/或C端截短型式。一般而言，變異體具有野生型蛋白質的一些經改良之性質(結構性或功能性)。舉例而言，變異體在濃溶液中可具有增強或改良之物理穩定性(例如疏水性介導之聚集作用較少)，與血漿一起培育時血漿穩定性有增強或改良，或具有增強或改良之生物活性同時保持良好的生物活性概況。

構成本發明之融合蛋白質之部分與其野生型比較蛋白質之間的差異的可接受之胺基酸取代及修飾包括(但不限於)一或多個胺基酸取代(包括由非天然存在之胺基酸類似物取代)及截短。因此，本發明之融合蛋白質(例如本發明之融合蛋白質)包括(但不限於)如本文中所描述之定點突變體、截短多肽、蛋白水解抗性突變體、減少聚集之突變體、組合突變體及融合蛋白質。

熟習蛋白質表現技術者將認識到可在任一種本發明之融合蛋白質之N端引入甲硫胺酸或甲硫胺酸-精胺酸序列，以表現於大腸桿菌(E.coli)中，且涵蓋於本發明之範圍內。

本發明之融合蛋白質與醫藥防腐劑(例如間甲酚、苯酚、苯甲醇)之相容性得到提高，因此能夠製備可在儲存期間保持蛋白質之生理化學性質及生物活性的保藏醫藥調配物。因此，相對於野生型具有增強之醫藥穩定性之變異體在生理學條件及保藏醫藥調配條件下在濃溶液中具有改良之物理穩定性，同時可保持生物學效能。作為非限制性實例，本發明之融合蛋白質與其野生型對應物或相應天然序列相比對蛋白水解及酶促降解之抗性更強；可具有改良之穩定性；且不太可能發生聚集。如本文中所用，該等術語並不互斥或具有限制性，既定變異體完全可能具有一或多種經改良之野生型蛋白質性質。

本發明亦涵蓋編碼本發明之融合蛋白質之核酸分子，其包含例如FGF21胺基酸序列，該序列與SEQ ID NO：3之胺基酸序列具有至少約95%一致性，但其中賦予FGF21蛋白質變異體所需性質(例如針對FGF21受體改良之效能、蛋白水解抗性、增加之半衰期或減少聚集之性質及其組合)之特定殘基未經進一步修飾。換言之，除FGF21突變序列中經修飾以賦予蛋白水解抗性、減少聚集之性質或其他性質之殘基外，FGF21突變序列中所有其他胺基酸殘基中之約5%(或4%，或3%，或2%，或1%)胺基酸殘基可經修飾。該等FGF21突變體具有野生型FGF21多肽之至少一種活性。

本發明亦涵蓋包含一段核苷酸序列之核酸分子，該核苷酸序列與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4之核苷酸序列具有至少約85%一致性且更佳具有至少約90%至95%一致性，但其中編碼賦予經編碼蛋白質蛋白水解抗性、減少聚集之性質或其他性質之胺基酸殘基的核苷酸未經進一步修飾。換言之，除編碼FGF21突變序列中經修飾以賦予蛋白水解抗性、減少聚集之性質或其他性質之殘基的核苷酸外，突變序列中所有其他核苷酸中的約15%且更佳約10%至5%核苷酸可經修飾。該等核酸分子編碼具有其野生型對應物之至少一種活性的蛋白質。

本文中提供用於產生本發明之融合蛋白質之方法，其中該等方法涉及該等蛋白質之野生型型式(例如如本文中所描述之FGF21野生型蛋白質)的位點特異性修飾及非位點特異性修飾，例如野生型蛋白質之截短、及在野生型蛋白質內相關位置處位點特異性併入胺基酸。相對於野生型蛋白質，該等修飾增強本發明之融合蛋白質的生物學性質，而且在一些情況下，可充當例如標記及蛋白質半衰期延長劑之連接點，及用於將該等變異體附著至固體支撐物表面的目的。本發明之相關實施例為製備能夠產生本發明之該等融合蛋白質之細胞的方法，及製備含有編碼該等變異體之DNA之載體的方法。

在某些實施例中，使用該等修飾(例如位點特異性修飾)連接結合物，例如將PEG基團連接至本發明之蛋白質、多肽及/或肽，以用於例如延長該等蛋白質、多肽及/或肽之半衰期或以其他方式改良其生物學性質。該等技術進一步描述於本文中。

在其他實施例中，使用該等修飾(例如位點特異性修飾)連接其他可延長本發明之蛋白質之半衰期的聚合物、小分子及重組型蛋白質序列。一種該類實施例包括將脂肪酸或特定白蛋白結合化合物連接至蛋白質、多肽及/或肽。在其他實施例中，該等修飾係在特定類型的胺基酸處進行且可連接在蛋白質上的一或多個位點處。

在其他實施例中，使用該等修飾(例如位點特異性修飾)作為連接方式以用於產生野生型及/或變異型多聚體，例如二聚體(同二聚體或雜二聚體)或三聚體或四聚體。該等多聚蛋白質分子可另外具有諸如以下之基團：PEG、糖及/或PEG-膽固醇結合物，其在胺基端或羧基端與其他蛋白質(諸如Fc、人類血清白蛋白(HSA)等)連接或融合。

在其他實施例中，使用該等位點特異性修飾來產生蛋白質、多肽及/或肽，其中位點特異性合併之吡咯離胺酸或吡咯離胺酸類似物或非天然存在之胺基酸(對-乙醯基-Phe、對-疊氮基-Phe)之位置可允許控制該等蛋白質、多肽及/或肽在固體支撐物之表面上的定向及連接，或連接有諸如以下之基團：PEG、糖及/或PEG-膽固醇結合物。

在其他實施例中，使用該等位點特異性修飾來使蛋白質、多肽及/或肽位點特異性交聯，藉此形成雜寡聚物，包括(但不限於)雜二聚體及雜三聚體。在其他實施例中，使用該等位點特異性修飾來使蛋白質、多肽及/或肽位點特異性交聯，藉此形成蛋白質-蛋白質結合物、蛋白質-多肽結合物、蛋白質-肽結合物、多肽-多肽結合物、多肽-肽結合物或肽-肽結合物。在其他實施例中，位點特異性修飾可包括一個分支點以使一種以上類型之分子能夠連接在蛋白質、多肽或肽之單一位點處。

在其他實施例中，本文中列舉之修飾可以非位點特異性方式進行且產生本發明之蛋白質-蛋白質結合物、蛋白質-多肽結合物、蛋白質-肽結合物、多肽-多肽結合物、多肽-肽結合物或肽-肽結合物。

定義

貫穿本文件使用多種定義。大部分字詞具有熟習此項技術者認為該等字詞所具有之含義。總體而言且如熟習此項技術者通常所理解，下文中或此文件中別處特定定義之字詞具有本發明之內容中提供之含義。

如本文中所用，術語「FGF21」係指纖維母細胞生長因子(FGF)蛋白質家族之一員。FGF21之胺基酸序列(GenBank寄存編號NP_061986.1)如SEQ ID NO：1所示，其相應聚核苷酸序列如SEQ ID NO：2(NCBI參考序號NM_019113.2)所示。「FGF21變異體」、「FGF21突變體」及類似術語描述FGF21蛋白質之經修飾型式，例如有構成性胺基酸殘基缺失、經添加、修飾或取代。

如本文中所用，術語「FGF21受體」係指FGF21之受體(Kharitonenkov,A，等人，(2008)Journal of Cellular Physiology 215：1-7；Kurosu,H等人，(2007)JBC 282：26687-26695；Ogawa,Y等人，(2007)PNAS 104：7432-7437)。

術語「FGF21多肽」係指於人類中表現之天然存在的多肽。對於本發明而言，術語「FGF21多肽」可互換地用於指任何全長FGF21多肽，例如SEQ ID NO：1，其由209個胺基酸殘基組成且由SEQ ID NO：2之核苷酸序列編碼；多肽之任何成熟形式，其由181個胺基酸殘基組成且其中全長FGF21多肽之胺基端處的28個胺基酸殘基(亦即其構成信號肽)已經移除。

如本文中所用，「變異體76」為FGF21蛋白質變異體，其特徵在於經Cys154連接之40 kDa分支鏈PEG，及相對於177個胺基酸的野生型蛋白質，具有8個點突變。本文中更詳細地描述變異體之合成，且蛋白質序列呈現於表1及SEQ ID NO：9中。

術語「分離之核酸分子」係指具以下特徵之本發明之核酸分子：(1)當全部核酸自源細胞分離時，與至少約50%與其一起天然發現之蛋白質、脂質、碳水化合物或其他物質分離，(2)未連接至該「分離之核酸分子」天然連接之整個聚核苷酸或聚核苷酸之一部分，(3)與其未天然連接之聚核苷酸可操作地連接，或(4)未天然地作為大型聚核苷酸序列之一部分存在。本發明之分離之核酸分子較佳實質上不含任何在其天然環境中發現之其他污染核酸分子或其他污染物，該等污染核酸分子或污染物將干擾核酸分子在多肽製備或其治療性、診斷性、預防性或研究用途中之使用。

術語「載體」用於指代任何用於將編碼資訊轉移至宿主細胞之分子(例如核酸、質體或病毒)。

術語「表現載體」係指適用於宿主細胞之轉型且含有引導及/或控制插入之異源核酸序列的表現之核酸序列的載體。表現包括(但不限於)諸如轉錄、轉譯及RNA拼接(若存在內含子時)之過程。

術語「可操作地連接」在本文中用於指代側接序列之配置，其中如此描述之側接序列經組態或組裝以發揮其常見功能。融合蛋白質之元件可操作地連接於彼此以使融合蛋白質可充當(若其為天然存在的時)內源性蛋白及/或以協同方式組合該等融合蛋白質之不同元件。

在核苷酸層面上，與編碼序列可操作地連接之側接序列能夠影響該編碼序列之複製、轉錄及/或轉譯。舉例而言，當啟動子能夠引導編碼序列之轉錄時，則該編碼序列與該啟動子可操作地連接。側接序列無需與編碼序列相鄰，只要其正確地發揮功能即可。因此，舉例而言，插入之未轉譯但經轉錄之序列可存在於啟動子序列與編碼序列之間且啟動子序列仍可視為與編碼序列「可操作地連接」。

術語「宿主細胞」用於指代經轉型或能夠由核酸序列轉型且接著表現相關所選基因之細胞。該術語包括母細胞子代，無論該子代是否在形態上或在遺傳構成上與原始親本相同，只要存在所選基因即可。

如本文中所用之術語「胺基酸」係指天然存在之胺基酸、非天然胺基酸、胺基酸類似物及胺基酸模擬物(其以與天然存在之胺基酸類似之方式起作用，均呈其D立體異構體及L立體異構體形式，只要其結構允許該等立體異構形式存在即可)。本文中使用胺基酸之名稱、其通常已知的3個字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的1個字母符號指代胺基酸。

當與生物物質(諸如核酸分子、多肽、宿主細胞及其類似物)結合使用時，術語「天然存在」係指在自然界中發現且未經人類加工之物質。類似地，如本文中所用，「非天然存在」係指未在自然界中發現或已由人類進行結構上之修飾或合成之物質。當與核苷酸結合使用時，術語「天然存在」係指鹼腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)。當與胺基酸結合使用時，術語「天然存在」係指20種習知胺基酸(亦即丙胺酸(A)、半胱胺酸(C)、天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)、苯丙胺酸(F)、甘胺酸(G)、組胺酸(H)、異白胺酸(I)、離胺酸(K)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、天冬醯胺(N)、脯胺酸(P)、麩醯胺酸(Q)、精胺酸(R)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、纈胺酸(V)、色胺酸(W)及酪胺酸(Y))以及硒半胱胺酸、吡咯離胺酸(Pyl或O)及吡咯啉-羧基-離胺酸(Pcl或Z)。

吡咯離胺酸(Pyl)為天然存在於甲烷八聯球菌屬(Methanosarcina)之甲烷生成古菌(methanogenic archaea)之甲胺甲基轉移酶內的胺基酸。吡咯離胺酸為離胺酸類似物，其在各別mRNA中之框內UAG密碼子處以共轉譯方式併入，且將其視為第22種天然胺基酸。

至少如PCT專利公開案WO 2010/48582(申請人IRM、LLC)中所描述，嘗試在大腸桿菌中生物合成吡咯離胺酸(Pyl)會引起形成「去甲基吡咯離胺酸」，本文中將其稱為吡咯啉-羧基-離胺酸或Pcl。如本文中所用，「Pcl」係指Pcl-A或Pcl-B。

如本文中所用，術語「非-天然胺基酸」及「非天然胺基酸」可互換地意欲表示不能在任何有機物中使用來自任何有機物(無論是否相同)之未經修飾之基因或經修飾之基因以生物合成方式產生的胺基酸結構。該等術語係指不存在於天然存在的(野生型)FGF21蛋白質序列或本發明之序列中的胺基酸殘基。其包括(但不限於)不為20種天然存在之胺基酸之一的經修飾之胺基酸及/或胺基酸類似物、硒半胱胺酸、吡咯離胺酸(Pyl)或吡咯啉-羧基-離胺酸(Pcl，例如如PCT專利公開案WO 2010/48582中所描述)。該等非天然胺基酸殘基可藉由取代天然存在之胺基酸來引入及/或藉由將非天然胺基酸插入天然存在的(野生型)FGF21蛋白質序列或本發明之序列中來引入。亦可併入非天然胺基酸殘基以賦予FGF21分子所需功能性，例如連接功能性部分(例如PEG)之能力。如本文中所用，當與胺基酸結合使用時，符號「U」應意謂「非-天然胺基酸」及「非天然胺基酸」。

此外，應瞭解，該等「非天然胺基酸」需要經修飾之tRNA及經修飾之tRNA合成酶(RS)以便併入蛋白質中。該等「所選」正交tRNA/RS配對係藉由如Schultz等人研發之選擇過程或藉由隨機或目標突變來產生。作為實例，吡咯啉-羧基-離胺酸為「天然胺基酸」，因為其係由自一種有機物轉移入宿主細胞中之基因以生物合成方式產生且因為其係藉由使用天然tRNA及tRNA合成酶基因而併入蛋白質中，而對胺基苯丙胺酸(參見Generation of a bacterium with a 21 amino acid genetic code,Mehl RA,Anderson JC,Santoro SW,Wang L,Martin AB,King DS,Horn DM,Schultz PG.J Am Chem Soc.2003年1月29日；125(4)：935-9)為「非天然胺基酸」，因為儘管其係以生物合成方式產生，但其係藉由「所選」正交tRNA/tRNA合成酶配對併入蛋白質中。

經修飾之編碼的胺基酸包括(但不限於)羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、O-磷絲胺酸、氮雜環丁烷羧酸、2-胺基己二酸、3-胺基己二酸、β-丙胺酸、胺基丙酸、2-胺基丁酸、4-胺基丁酸、6-胺基己酸、2-胺基庚酸、2-胺基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-胺基庚二酸、第三丁基甘胺酸、2,4-二胺基異丁酸、鎖鏈素(desmosine)、2,2'-二胺基庚二酸、2,3-二胺基丙酸、N-乙基甘胺酸、N-甲基甘胺酸、N-乙基天冬醯胺、高脯胺酸、羥基離胺酸、別羥基離胺酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸、異鎖鏈素、別異白胺酸、N-甲基丙胺酸、N-甲基甘胺酸、N-甲基異白胺酸、N-甲基戊基甘胺酸、N-甲基纈胺酸、萘丙胺酸、正纈胺酸、正白胺酸、鳥胺酸、戊基甘胺酸、2-哌啶甲酸及硫代脯胺酸。術語「胺基酸」亦包括天然存在之胺基酸，其為某些有機物中之代謝物，但不藉由遺傳密碼編碼而併入蛋白質中。該等胺基酸包括(但不限於)鳥胺酸、D-鳥胺酸及D-精胺酸。

如本文中所用之術語「胺基酸類似物」係指與天然存在之胺基酸具有相同基本化學結構之化合物，僅作為實例，其可為結合於氫、羧基、胺基及R基團之α-碳。胺基酸類似物包括以可逆或不可逆方式經化學阻斷、或其C端羧基、其N端胺基及/或其側鏈官能基經化學修飾之天然胺基酸及非天然胺基酸。該等類似物包括(但不限於)甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸碸、S-(羧甲基)-半胱胺酸、S-(羧甲基)-半胱胺酸亞碸、S-(羧甲基)-半胱胺酸碸、天冬胺酸-(β-甲酯)、N-乙基甘胺酸、丙胺酸甲醯胺、高絲胺酸、正白胺酸及甲硫胺酸甲基鋶。

如本文中所用之術語「胺基酸模擬物」係指具有與胺基酸之一般化學結構不同之結構但以與天然存在之胺基酸類似之方式起作用的化合物。

與引入多肽變異體中之修飾之類型或數目無關，術語「生物學活性變異體」係指本發明之融合蛋白質中所用的任何多肽變異體，例如作為融合物之構成蛋白質，其具有其野生型(例如天然存在的)蛋白質或多肽對應物之活性，諸如能夠調節血糖、HbA1c、胰島素、三酸甘油酯或膽固醇含量；增強胰臟功能；降低肝臟中之脂質含量；降低體重；及改良葡萄糖耐受性、能量消耗或胰島素敏感性。相對於野生型型式活性程度略有降低之多肽變異體仍可視為生物學活性多肽變異體。本發明之生物學活性多肽變異體之非限制性代表性實例為FGF21變異體，其係自野生型FGF21經修飾而得，且相對於野生型FGF21，具有類似或增強之生物學性質。

術語「有效量」及「治療有效量」各係指用於實現可觀測到之程度的野生型多肽或蛋白質對應物之一或多種生物活性的本發明之融合蛋白質之量，該等生物活性諸如有能夠降低血糖、胰島素、三酸甘油酯或膽固醇含量；降低肝臟三酸甘油酯或脂質含量；降低體重；或改良葡萄糖耐受性、能量消耗或胰島素敏感性。舉例而言，投與展現、罹患或傾向於罹患FGF21相關病症(諸如第1型糖尿病或第2型糖尿病、肥胖症或代謝症候群)之患者的「治療有效量」為可促使改良、改善或以其他方式改良與先前提及之病症有關之病理學症狀、疾病進程、生理狀況或能防止患上先前提及之病症的量。在本發明中，「個體」或「患者」較佳為人類，但亦可為動物，更特定言之，亦可為伴侶動物(例如犬、貓及其類似物)、家畜(例如母牛、綿羊、豬、馬及其類似物)及實驗動物(例如大鼠、小鼠、天竺鼠及其類似物)。

如本文中所用之術語「醫藥學上可接受之載劑」或「生理學上可接受之載劑」係指適用於實現或增強本發明之融合蛋白質之傳遞的一或多種調配材料。

術語「抗原」係指能夠由抗體結合且另外能夠在動物中用於產生能夠與該抗原之抗原決定基結合之抗體的分子或分子之一部分。抗原可具有一或多個抗原決定基。

術語「天然Fc」係指包含由整個抗體消化產生或以其他方式產生之非抗原結合片段序列之分子或序列，不論呈單體或多聚體形式，且可含有絞鏈區。天然Fc之原始免疫球蛋白來源較佳係人類來源且可為任一種免疫球蛋白，儘管較佳為IgG1及IgG2。天然Fc分子係由單體多肽組成，可藉由共價(亦即雙硫鍵)及非共價締合連接成二聚或多聚形式。視類別(例如IgG、IgA及IgE)或子類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgA1及IgGA2)而定，天然Fc分子之單體次單元之間的分子間雙硫鍵數目在1個至4個範圍內。天然Fc之一個實例為由IgG經木瓜酶消化產生的雙硫鍵結合之二聚體(參見Ellison等人，1982,Nucleic Acids Res.10：4071-9)。如本文中所用，術語「天然Fc」為單體形式、二聚形式及多聚形式之總稱。

術語「Fc變異體」係指天然Fc經修飾但仍包含救助受體(salvage receptor)FcRn(新生兒Fc受體)之結合位點的分子或序列。國際公開案第WO 97/34631號及第WO 96/32478號描述例示性Fc變異體以及與救助受體之相互作用，且以引用的方式併入本文中。因此，術語「Fc變異體」可包含非人類天然Fc經人類化之分子或序列。此外，天然Fc包含可移除之區域，因為該等區域提供並非本發明融合蛋白質之融合分子所需要的結構特徵或生物活性。因此，術語「Fc變異體」包含缺乏一或多個天然Fc位點或殘基、或一或多個Fc位點或殘基經修飾之分子或序列，該等Fc位點或殘基影響或涉及：(1)雙硫鍵形成，(2)與所選宿主細胞之不相容性，(3)在所選宿主細胞中表現的N端異質性，(4)糖基化作用，(5)與補體之相互作用，(6)與救助受體以外的Fc受體結合，或(7)抗體依賴之細胞毒性(ADCC)。Fc變異體進一步詳細地描述於下文中。

術語「Fc域」涵蓋如上文所定義之天然Fc及Fc變異體及序列。如Fc變異體及天然Fc分子，術語「Fc域」包括呈單體或多聚形式之分子，無論由完整抗體消化產生或以其他方式產生。在本發明之一些實施例中，Fc域可經由例如Fc域與FGF21序列之間的共價鍵與FGF21或FGF21突變體(包括FGF21之截短形式或FGF21突變體)融合。該等融合蛋白質可經由Fc域之締合形成多聚體，且該等融合蛋白質及其多聚體為本發明之態樣。

如本文中所用，術語「經修飾之Fc片段」應意謂抗體中包含經修飾之序列的Fc片段。Fc片段為抗體之一部分，其包含CH2、CH3及部分絞鏈區。經修飾之Fc片段可來源於例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。FcLALA為具有LALA突變(L234A、L235A)之經修飾之Fc片段，其以較低效率引起ADCC且以較弱的程度結合及活化人類補體，Hessell等人，2007 Nature 449：101-104。對Fc片段之其他修飾描述於例如美國專利第7,217,798號中。

術語「異源」意謂並未發現該等結構域與抗體之恆定區天然相關。特定言之，該等異源結合結構域不具有抗體可變域之典型結構，該典型結構係由4個構架區域(FR1、 FR2、FR3及FR4)及在其之間的3個互補決定區(CDR)組成。因此，融合體(fusobody)之每一臂包含第一單鏈多肽(包含共價連接在抗體之C_H1重鏈恆定區之N端部分處的第一結合域)及第二單鏈多肽(包含共價連接在抗體之恆定C_L輕鏈之N端部分處的第二結合域)。共價連接可為直接連接(例如經肽鍵結合)或間接連接(經由連接子，例如肽連接子)。與抗體結構類似，融合體之兩個雜二聚體係例如藉由其絞鏈區處的至少一個雙硫橋鍵共價連接。此項技術中已描述了具有融合體結構之分子之實例，特定言之，包含雜二聚受體之配位體結合域之融合體(參見例如國際專利公開案WO 01/46261及WO 11/076781)。

術語「聚乙二醇」或「PEG」係指聚伸烷二醇化合物或其衍生物，其具有或不具有偶合劑或由偶合部分或活化部分衍生化。

本文中所用之術語「FGF21相關病症」及類似術語包括肥胖症、第1型糖尿病及第2型糖尿病、胰臟炎、血脂異常、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肝炎(NASH)、胰島素抗性、高胰島素血症、葡萄糖不耐、高血糖、代謝症候群、急性心肌梗塞、高血壓、心血管疾病、動脈粥樣硬化、周邊動脈疾病、中風、心臟衰竭、冠心病、腎病、糖尿病性併發症、神經病變、胃輕癱、與胰島素受體之嚴重失活突變有關之病症及其他代謝病症。

本文中所用之術語「與胰島素受體之嚴重失活突變有關之病症」及類似術語描述因胰島素受體(或直接處於其下游之可能蛋白質)突變而受折磨之個體的病狀，該等突變引起嚴重的胰島素抗性但通常(但並非總是)未發現在第2型糖尿病中常見之肥胖症。在許多方面，罹患該等病狀之個體顯示第1型糖尿病及第2型糖尿病之混合症狀。因此患病之個體可按大致增加之嚴重性分為若干個類別，包括：A型胰島素抗性、C型胰島素抗性(AKA HAIR-AN症候群)、羅布森-蒙德豪爾症候群(Rabson-Mendenhall症候群)及最終的矮妖精貌症候群(Donohue's Syndrome)或矮妖症(Leprechaunism)。該等病症與極高的內源胰島素含量有關且極常為高血糖症。因此患病之個體亦呈現多種與「胰島素毒性」有關之臨床特徵，包括雄激素過多症、多囊卵巢症候群(PCOS)、多毛症及皮膚皺褶中之黑棘皮病(過度生長及色素沈著)。

「第2型糖尿病」為特徵如下之病狀：儘管胰島素可用，但葡萄糖仍過量產生，且由於葡萄糖清除率不足，因此循環葡萄糖含量始終過高。

「第1型糖尿病」為特徵在於由完全缺乏胰島素而引起血糖含量高之病狀。此病症在身體免疫系統攻擊胰臟中產生胰島素之β-細胞且對其進行破壞時發生。接著胰臟產生極少胰島素或不產生胰島素。

「葡萄糖不耐」或葡萄糖耐受性異常(IGT)為血糖代謝障礙之前期糖尿病狀態，其與心血管病變風險增加有關。前期糖尿病病狀阻止個體將葡萄糖有效移送至細胞中且將葡萄糖用作有效燃料源，引起血液中之葡萄糖含量升高及產生一定程度的胰島素抗性。

「高血糖」係定義為血液中糖(葡萄糖)過量。

「低血糖症」(亦稱為低血糖)係在血糖含量降得過低從而無法提供保持身體活動所需之足夠能量時發生。

「高胰島素血症」係定義為血液中胰島素含量高於正常含量。

「胰島素抗性」係定義為正常含量的胰島素產生次正常生物反應之狀態。

在人類個體中，「肥胖症」可定義為體重比既定群體之理想體重高出20%以上(R.H.Williams,Textbook of Endocrinology,1974，第904-916頁)。

「糖尿病性併發症」為由高血糖含量引起之其他身體功能(諸如腎、神經(神經病變)、腳(腳部潰瘍及血液循環不良(poor circulation)及眼睛(例如視網膜病))之問題。糖尿病亦增加心臟病以及骨骼及關節病症之風險。糖尿病之其他長期併發症包括皮膚問題、消化問題、性功能障礙以及牙齒及齒齦問題。

「代謝症候群」可定義為以下病徵中至少三種之組合：腹部脂肪--(大部分男性中)腰圍為40吋或大於40吋；高血糖--空腹後至少110毫克/分升(mg/dl)；高三酸甘油酯--血流中至少150 mg/dL；低HDL--低於40 mg/dl；及血壓為130/85 mmHg或更高。

「胰臟炎」為胰臟之炎症。

「血脂異常」為脂蛋白代謝病症，包括脂蛋白過度產生或不足。血脂異常可表現為：血液中總膽固醇、低密度脂蛋白(LDL)膽固醇及三酸甘油酯濃度升高及高密度脂蛋白(HDL)膽固醇濃度降低。

「非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)」為與酒精消耗無關之肝臟疾病，其特徵在於肝細胞之脂肪變化。

「非酒精性脂肝炎(NASH)」為與酒精消耗無關之肝臟疾病，其特徵在於肝細胞之脂肪變化，其伴有小葉內炎症及纖維化。

「高血壓」為全身動脈血壓短暫或持續升高至可能誘發心血管損害或其他不良後果之程度。高血壓已任意地定義為收縮壓高於140 mmHg或舒張壓高於90 mmHg。

「心血管疾病」為與心臟或血管有關之疾病。

「急性心肌梗塞」在一部分心臟供血中斷時發生。若在足夠長的時間內不接受治療，則所引起之局部缺血及氧不足會造成心臟肌肉組織(心肌)損傷或死亡(梗塞)。

「周邊動脈疾病」係在斑塊在向頭部、器官及肢體輸送血液之動脈中積聚時發生。隨時間推移，斑塊會使動脈硬化及變窄，從而限制富含氧之血液流向器官及身體之其他部分。

「動脈粥樣硬化」為特徵如下之血管疾病：在大型及中型動脈內膜中有不規則分佈之脂質沈積物，從而引起動脈內腔狹窄且最終發生纖維化及鈣化。病灶通常較集中且進展緩慢及呈間歇性。血流受限引起大部分臨床症狀，其隨病灶分佈及嚴重性而變化。

「中風」為任何與腦循環受損有關之急性臨床事件，其持續時間超過24小時。中風涉及不可逆腦損傷，症狀之類型及嚴重性視循環受損之腦組織之位置及程度而定。

「心臟衰竭」(亦稱為充血性心臟衰竭)為心臟無法再將足夠血液泵送至身體其餘部分之病狀。

「冠心病」(亦稱為冠狀動脈病)為向心臟供應血液及氧之小血管變窄。

「腎病」或腎病變為任何腎臟疾病。糖尿病性腎病為第1型糖尿病或第2型糖尿病人群之發病及死亡之主要起因。

「神經病變」為任何與腦神經或周邊神經系統或自主神經系統有關之疾病。

「胃輕癱」為胃蠕動虛弱，其引起腸部排空延遲。

本發明所涵蓋之重症患者通常經歷不穩定的代謝過盛狀態。此不穩定的代謝狀態係由基質代謝變化(其會引起一些營養物相對不足)引起。通常，脂肪及肌肉之氧化增加。

此外，重症患者較佳為經歷全身發炎性反應症候群或呼吸窘迫之患者。發病率降低意謂降低重症患者將患上其他疾病、病狀或症狀之可能性或降低其他疾病、病狀或症狀之嚴重性。舉例而言，降低發病率可對應於與多器官衰竭有關之菌血症或敗血症或併發症之發病率降低。

如本文中所用，除非內容另有明確指示，否則單數形式「一」及「該」包括複數涵義。因此，舉例而言，對「一(種)抗體」之提及包括兩種或兩種以上該等抗體之混合物。

如本文中所用，術語「約」係指某一值之+/- 20%，更佳為其+/- 10%或更佳為其+/- 5%。

術語「多肽」及「蛋白質」可互換使用且係指任何長度之胺基酸之聚合形式，其可包括經編碼及未經編碼之胺基酸、天然存在及非天然存在之胺基酸、化學或生物化學修飾或衍生化之胺基酸及具有經修飾之肽主鏈之多肽。該術語包括融合蛋白質，包括(但不限於)具有異源胺基酸序列之融合蛋白質、具有異源及同源前導序列之融合物(具有或不具有N端甲硫胺酸殘基)；免疫標籤蛋白質；及其類似物。

術語「個體(individual/subject)」、「宿主」及「患者」可互換使用且係指任何需要診斷、治療或療法之個體，尤其為人類。其他個體可包括牛、犬、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、馬及其類似物。在一些較佳實施例中，該個體為人類。

如本文中所用，術語「樣品」係指來自患者之生物物質。本發明所分析之樣品不限於任何特定類型。作為非限制性實例，樣品包括單細胞、多細胞、組織、腫瘤、生物流體、生物分子或前述各物中任一者之上清液或提取物。實例包括經移取以用於活組織檢驗之組織、在切除術期間移除之組織、血液、尿、淋巴組織、淋巴液、腦脊髓液、黏液及糞便樣品。所用樣品將視分析法格式、偵測方法及待分析之腫瘤、組織、細胞或提取物之性質而不同。用於製備樣品之方法已在此項技術中熟知且可容易地修改以獲得與所用方法相容之樣品。

如本文中所用，術語「生物分子」包括(但不限於)多肽、核酸及醣。

如本文中所用，術語「調節」係指基因、蛋白質、或細胞內部、外部或表面上之任何分子的品質或數量之變化。該變化可為分子之表現或含量的增加或降低。術語「調節」亦包括改變生物功能/活性之品質或數量，該生物功能/活性包括(但不限於)降低血糖、胰島素、三酸甘油酯或膽固醇含量之能力；降低肝臟脂質或肝臟三酸甘油酯含量之能力；降低體重之能力；及改良葡萄糖耐受性、能量消耗或胰島素敏感性之能力。

如本文中所用，術語「調節劑」係指調節與FGF21相關病症(諸如第1型糖尿病或第2型糖尿病或代謝性病狀，例如肥胖症)有關之一或多種生理學或生物化學事件的組合物。該等事件包括(但不限於)降低血糖、胰島素、三酸甘油酯或膽固醇含量之能力；降低肝臟脂質或肝臟三酸甘油酯含量之能力；降低體重之能力；及改良葡萄糖耐受性、能量消耗或胰島素敏感性之能力。

「基因產物」為由基因表現或產生之生物聚合產物。基因產物可例如為未剪接之RNA、mRNA、剪接變異型mRNA、多肽、經轉譯後修飾之多肽、剪接變異型多肽等。此術語亦涵蓋使用RNA基因產物作為模板(亦即RNA之cDNA)來產生之生物聚合產物。可以酶促方式、重組性方式、化學方式或在基因天然細胞內產生基因產物。在一些實施例中，若基因產物為蛋白質性基因產物，則其展現生物活性。在一些實施例中，若基因產物為核酸，則其可轉譯為展現生物活性之蛋白質性基因產物。

如本文中所用，「調節FGF21活性」係指增加或降低FGF21活性，其可由例如試劑與FGF21聚核苷酸或多肽之相互作用、抑制FGF21轉錄及/或轉譯(例如經由反義物或siRNA與FGF21基因或FGF21轉錄物之相互作用、經由調節有助於FGF21表現之轉錄因子)及其類似因素引起。舉例而言，調節生物活性係指增加或降低生物活性。FGF21活性可藉由包括(但不限於)以下之方法來評估：分析個體之血糖、胰島素、三酸甘油酯或膽固醇含量、評估FGF21多肽含量、或評估FGF21轉錄量。亦可藉由例如量測FGF21下游生物標記之含量及量測FGF21信號傳導增量來實現FGF21活性之比較。FGF21活性亦可藉由量測以下項來評估：細胞信號傳導；激酶活性；脂肪細胞中之葡萄糖攝取；血液胰島素、三酸甘油酯或膽固醇含量波動；肝臟脂質或肝臟三酸甘油酯含量變化；FGF21與FGF21受體之間的相互作用；或FGF21受體之磷酸化。在一些實施例中，FGF21受體之磷酸化可為酪胺酸磷酸化。在一些實施例中，FGF21活性之調節可引起FGF21相關表型之調節。

亦可藉由例如量測FGF21下游生物標記之含量及量測FGF21信號傳導增量來實現FGF21活性之比較。FGF21活性亦可藉由量測以下項來評估：細胞信號傳導；激酶活性；脂肪細胞中之葡萄糖攝取；血液胰島素、三酸甘油酯或膽固醇含量波動；肝臟脂質或肝臟三酸甘油酯含量變化；FGF21與受體(FGFR-1c、FGFR-2c或FGFR-3c)之間的相互作用；或FGF21受體之磷酸化。在一些實施例中，FGF21受體之磷酸化可為酪胺酸磷酸化。在一些實施例中，FGF21活性之調節可引起FGF21相關表型之調節。

如本文中所用，「FGF21下游生物標記」為基因或基因產物，或基因或基因產物之可量測標誌。在一些實施例中，作為FGF21之下游標記之基因或活性展現表現量變化或在維管組織中之含量變化。在一些實施例中，下游標記之活性在FGF21調節劑存在下發生變化。在一些實施例中，當FGF21受本發明之調節劑干擾時，下游標記展現表現量變化。FGF21下游標記包括(但不限於)葡萄糖或2-去氧-葡萄糖攝取量、pERK及其他磷酸化或乙醯化蛋白或NAD含量。

如本文中所用，術語「上調」係指活性之增加、活化或刺激或數量之增加。舉例而言，在本發明情形中，FGF21調節劑可增加FGF21受體之活性。在一個實施例中，可回應於FGF21調節劑而上調一或多種FGFR-1c、FGFR-2c或FGFR-3c。上調亦可指FGF21相關活性，例如降低血糖、胰島素、三酸甘油酯或膽固醇含量之能力；降低肝臟脂質或三酸甘油酯含量之能力；降低體重之能力；改良葡萄糖耐受性、能量消耗或胰島素敏感性之能力；或引起FGF21受體之磷酸化之能力；或增加FGF21下游標記之能力。 FGFR21受體可為FGFR-1c、FGFR-2c或FGFR-3c中之一或多者。與對照組相比，上調可為至少25%、至少50%、至少75%、至少100%、至少150%、至少200%、至少250%、至少400%或至少500%之程度。

如本文中所用，術語「N端」係指蛋白質之至少前20個胺基酸。

如本文中所用，術語「N端結構域」及「N端區域」可互換使用且係指在蛋白質之第一個胺基酸處開始且在蛋白質之N端半部之任一胺基酸處結束的蛋白質片段。舉例而言，FGF21之N端結構域為自SEQ ID NO：1之胺基酸1至SEQ ID NO：1之約胺基酸10與胺基酸105之間的任一胺基酸。

如本文中所用，術語「C端」係指蛋白質之至少最後20個胺基酸。

如本文中所用，術語「C端結構域」及「C端區域」可互換使用且係指在蛋白質之C端半部之任一胺基酸處開始且在蛋白質之最後一個胺基酸處結束的蛋白質片段。舉例而言，FGF21之C端結構域在SEQ ID NO：1之胺基酸105至約胺基酸200的任一胺基酸處開始且在SEQ ID NO：1之胺基酸209處結束。

如本文中所用之術語「結構域」係指生物分子中有助於生物分子之已知或待檢功能之結構部分。結構域可與其區域或部分共同擴展且除整個某一特定區域或部分該區域外，其亦可合併有生物分子中與該區域不同之部分。

如本文中所用，術語「信號結構域」(亦稱為「信號序列」或「信號肽」)係指存在於前驅體蛋白質(通常為細胞膜結合蛋白質或分泌型蛋白質)之N端區域處的一段連續的胺基酸序列中的肽結構域且其與轉譯後蛋白質轉運有關。在許多情況下，在完成分類過程後，藉由專門的信號肽酶自全長蛋白質移除信號結構域。各信號結構域指定細胞中前驅體蛋白質之特定目標。FGF21之信號結構域為SEQ ID NO：1之胺基酸1至28。

如本文中所用，術語「受體結合域」係指蛋白質中任何與細胞膜結合受體蛋白接觸從而引起細胞反應(諸如信號傳導事件)之部分或區域。

如本文中所用，術語「配位體結合域」係指本發明之融合蛋白質中任何保留相應天然序列之至少一種定性結合活性之部分或區域。

術語「區域」係指生物分子之一級結構之實體上相鄰的部分。在蛋白質情況下，區域係由該蛋白質之胺基酸序列之相鄰部分界定。在一些實施例中，「區域」與生物分子之功能有關。

如本文中所用之術語「片段」係指生物分子之一級結構之實體上相鄰的部分。在蛋白質情況下，一部分係由該蛋白質之胺基酸序列之相鄰部分界定且係指至少3至5個胺基酸、至少8至10個胺基酸、至少11至15個胺基酸、至少17至24個胺基酸、至少25至30個胺基酸、及至少30至45個胺基酸。在寡核苷酸情況下，一部分係由該寡核苷酸之核酸序列之相鄰部分界定且係指至少9至15個核苷酸、至少18至30個核苷酸、至少33至45個核苷酸、至少48至72個核苷酸、至少75至90個核苷酸、及至少90至130個核苷酸。在一些實施例中，生物分子之部分具有生物活性。在本發明情形中，FGF21多肽片段不包含如SEQ ID NO：1所示之整個FGF21多肽序列。

「天然序列」多肽為與來源於自然界之多肽具有相同胺基酸序列之多肽。該等天然序列多肽可自自然界分離而得或可藉由重組型或合成方法產生。因此，天然序列多肽可具有天然存在之人類多肽、鼠類多肽或來自於任何其他哺乳動物物種之多肽的胺基酸序列。

如本文中所用，片語「同源核苷酸序列」或「同源胺基酸序列」或其變異體係指特徵在於在核苷酸層面或胺基酸層面上具有至少指定百分比之同源性的序列且可與「序列一致性」互換使用。同源核苷酸序列包括編碼蛋白質之同功異型物之序列。作為例如RNA之替代性剪接之結果，該等同功異型物可於同一有機物之不同組織中表現。或者，同功異型物可由不同基因編碼。同源核苷酸序列包括編碼除人類以外的物種(包括(但不限於)哺乳動物)之蛋白質的核苷酸序列。同源核苷酸序列亦包括(但不限於)天然存在之對偶基因變異及本文中闡述之核苷酸序列之突變。同源胺基酸序列包括含有保守性胺基酸取代且其中多肽具有相同結合及/或活性之胺基酸序列。在一些實施例中，若核苷酸或胺基酸序列與比較序列具有至少60%或60%以上直至99%的一致性，則其為同源核苷酸或胺基酸序列。在一些實施例中，若核苷酸或胺基酸序列與比較序列共有一或多個直至60個核苷酸/胺基酸取代、添加或缺失，則其為同源核苷酸或胺基酸序列。在一些實施例中，同源胺基酸序列具有不超過5個或不超過3個保守性胺基酸取代。

可藉由例如Gap程式(Wisconsin Sequence Analysis Package，第8版(UNIX),Genetics Computer Group,University Research Park,Madison WI)使用預設設定(其使用Smith及Waterman之演算法(Adv.Appl.Math.,1981,2,482-489))來測定同源性或一致性百分比。在一些實施例中，探針與目標之間的同源性介於約75%至約85%之間。在一些實施例中，核酸中之核苷酸與SEQ ID NO：2或其部分具有至少約95%、約97%、約98%、約99%及約100%同源性。

同源性亦可為多肽層面上之同源性。在一些實施例中，本發明之融合蛋白質之構成性多肽可與其全長野生型對應物或相應天然序列或其部分具有至少95%同源性。本發明之融合蛋白質或其部分與不同胺基酸序列之一致性程度或一致性百分比係計算為兩序列之對準中之精確匹配數目除以「本發明序列」或「外來序列」中最短者之長度。結果可表示為一致性百分比。

如本文中所用，術語「混合」係指將一或多種化合物、細胞、分子及其類似物在同一區域中組合在一起的過程。此過程可例如在試管、皮氏培養皿(petri dish)或允許混合一或多種化合物、細胞或分子之任何容器中進行。

如本文中所用，術語「實質上經純化」係指某一化合物(例如聚核苷酸或多肽或抗體)已自其天然環境脫離且不含至少60%、至少75%及至少90%的與其天然締合之其他組分。

術語「醫藥學上可接受之載劑」係指用於投與治療劑(諸如抗體或多肽、基因及其他治療劑)之載劑。該術語係指本身不會誘導對接受組合物之個體有害之抗體產生且可被投與而無不當毒性的任何醫藥載劑。合適載劑可為大型緩慢代謝的巨分子，諸如蛋白質、多醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物、脂質聚集體及非活性病毒粒子。該等載劑已為一般熟習此項技術者所熟知。治療性組合物中之醫藥學上可接受之載劑可包括液體，諸如水、鹽水、甘油及乙醇。該等媒劑中亦可存在輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、pH值緩衝物質及其類似物。

增強本發明之融合蛋白質之物理穩定性

天然存在之雙硫鍵(如由半胱胺酸殘基提供)通常增加蛋白質之熱力學穩定性。熱力學穩定性增加之成功實例(如由熔融溫度增加所衡量)為T4溶菌酶(Matsumura等人，PNAS 86：6562-6566(1989))及芽孢桿菌RNA酶(barnase)(Johnson等人，J.Mol.Biol.268：198-208(1997))之多種雙硫鍵鍵結之突變體。本發明之一個態樣為增強在防腐劑存在下FGF21之物理穩定性，此係藉由在變異體內存在雙硫鍵來實現，該等雙硫鍵限制野生型FGF21之可變性且藉此限制防腐劑接近蛋白質之疏水性核心。

因此，本發明之第二態樣提供人類FGF21之變異體或其生物學活性肽，其醫藥穩定性藉由合併有其他雙硫鍵而增強，例如經由將半胱胺酸殘基併入或取代入野生型FGF21蛋白質或本發明之多肽及蛋白質變異體中來達成。除本文中所描述之建議實施例外，熟習此項技術者將認識到天然半胱胺酸、半胱胺酸103及半胱胺酸121可用作基因座以引入可提供改良之性質的新穎雙硫鍵。

該等物質包括融合蛋白質，該等融合蛋白質合併有以下胺基酸中之兩者或兩者以上經半胱胺酸取代的野生型FGF-21：麩醯胺酸46、精胺酸47、酪胺酸48、白胺酸49、酪胺酸50、蘇胺酸51、天冬胺酸52、天冬胺酸53、丙胺酸54、麩醯胺酸55、麩醯胺酸56、蘇胺酸57、麩胺酸58、丙胺酸59、組胺酸60、白胺酸61、麩胺酸62、異白胺酸63、纈胺酸69、甘胺酸70、甘胺酸71、丙胺酸72、丙胺酸73、白胺酸144、組胺酸145、白胺酸146、脯胺酸147、甘胺酸148、天冬醯胺149、離胺酸150、絲胺酸151、脯胺酸152、組胺酸153、精胺酸154、天冬胺酸鹽155、脯胺酸156、丙胺酸157、脯胺酸158、精胺酸159、甘胺酸160、脯胺酸161、丙胺酸162、精胺酸163、苯丙胺酸164，其中胺基酸之編號係基於具209個胺基酸的全長hFGF21序列SEQ ID NO：1。

此外，本發明之融合蛋白質可合併有野生型人類FGF21之變異體或其生物學活性肽，其因除Cys103-Cys121處天然存在之一個雙硫鍵以外亦帶有經工程改造之雙硫鍵而增強，該等經工程改造之雙硫鍵之位置如下：Gln46Cys-Ala59Cys、Gln46Cys-His60Cys、Gln46Cys-Leu61Cys、Gln46Cys-Glu62Cys、Gln46Cys-Ile63Cys、Arg47Cys-Ala59Cys、Arg47Cys-His60Cys、Arg47Cys-Leu61Cys、Arg47Cys-Glu62Cys、Arg47Cys-Ile63Cys、Tyr48Cys-Ala59Cys、Tyr48Cys-His60Cys、Tyr48Cys-Leu61Cys、Tyr48Cys-Glu62Cys、Tyr48Cys-Ile63Cys、Leu49Cys-Ala59Cys、Leu49Cys-His60Cys、Leu49Cys-Leu61Cys、Leu49Cys-Glu62Cys、Leu49Cys-Ile63Cys、Tyr50Cys-Ala59Cys、Tyr50Cys-His60Cys、Tyr50Cys-Lue61Cys、Tyr50Cys-Glu62Cys、Tyr50Cys-Ile63Cys、Leu144Cys-Gly160Cys、Leu144Cys-Pro161Cys、Leu144Cys-Ala162Cys、Leu144Cys-Arg163Cys、Leu144Cys-Phe164Cys、His145Cys-Gly160Cys、His145Cys-Pro161Cys、His145Cys-Ala162Cys、His145Cys-Arg163Cys、His145Cys-Phe164Cys、Leu146Cys-Gly160Cys、Leu146Cys-Pro161Cys、Leu146Cys-Ala162Cys、Leu146Cys-Arg163Cys、Leu146Cys-Phe164Cys、Pro147Cys-Gly160Cys、Pro147Cys-Pro161Cys、Pro147Cys-Ala162Cys、Pro147Cys-Arg163Cys、Pro147Cys-Phe164Cys、Gly148Cys-Gly160Cys、Gly148Cys-Pro161Cys、Gly148Cys-Ala162Cys、Gly148Cys-Arg163Cys、Gly148Cys-Phe164Cys、 Thr57Cys-Val69Cys、Thr57Cys-Gly70Cys、Thr57Cys-Gly71Cys、Thr57Cys-Ala72Cys、Thr57Cys-Ala73Cys、Glu58Cys-Val69Cys、Glu58Cys-Glu70Cys、Glu58Cys-G71Cys、Glu58Cys-Ala72Cys、Glu58Cys-Ala73Cys、Ala59Cys-Val69Cys、Ala59Cys-Gly70Cys、Ala59Cys-Gly71Cys、Ala59Cys-Ala72Cys、Ala59Cys-Ala73Cys、His60Cys-Val69Cys、His60Cys-Gly70Cys、His60Cys-Gly71Cys、His60Cys-Ala72Cys、His60Cys-Ala73Cys、Leu61Cys-Val69Cys、Leu61Cys-Gly70Cys、Leu61Cys-Gly71Cys、Leu61Cys-Ala72Cys、Leu61Cys-Ala73Cys、Arg47Cys-Gly148Cys、Tyr48Cys-Gly148Cys、Leu49Cys-Gly148Cys、Tyr50Cys-Gly148Cys、Thr51Cys-Gly148Cys、Asp52Cys-Gly148Cys、Asp53Cys-Gly148Cys、Ala54Cys-Gly148Cys、Gln55Cys-Gly148Cys、Gln56Cys-Gly148Cys、Thr57Cys-Gly148Cys、Glu58Cys-Gly148Cys、Arg47Cys-Asn149Cys、Tyr48Cys-Asn149Cys、Leu49Cys-Asn149Cys、Tyr50Cys-Asn149Cys、Thr51Cys-Asn149Cys、Asp52Cys-Asn149Cys、Asp53Cys-Asn149Cys、Ala54Cys-Asn149Cys、Gln55Cys-Asn149Cys、Gln56Cys-Asn149Cys、Thr57Cys-Asn149Cys、Glu58Cys-Asn149Cys、Arg47Cys-Lys150Cys、Tyr48Cys-Lys150Cys、Leu49Cys-Lys150Cys、Tyr50Cys-Lys150Cys、Thr51Cys-Lys150Cys、Asp52Cys-Lys150Cys、Asp53Cys-Lys150Cys、Ala54Cys-Lys150Cys、Gln55Cys-Lys150Cys、Gln56Cys-Lys150Cys、Thr57Cys-Lys150Cys、 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Glu58Cys-Gly160Cys、Arg47Cys-Pro161Cys、Tyr48Cys-Pro161Cys、Leu49Cys-Pro161Cys、Tyr50Cys-Pro161Cys、Thr51Cys-Pro161Cys、Asp52Cys-Pro161Cys、Asp53Cys-Pro161Cys、Ala54Cys-Pro161Cys、Gln55Cys-Pro161Cys、Gln56Cys-Pro161Cys、Thr57Cys-Pro161Cys、Glu58Cys-Pro161Cys、Arg47Cys-Ala162Cys、Tyr48Cys-Ala162Cys、Leu49Cys-Ala162Cys、Tyr50Cys-Ala162Cys、Thr51Cys-Ala162Cys、Asp52Cys-Ala162Cys、Asp53Cys-Ala162Cys、Ala54Cys-Ala162Cys、Gln55Cys-Ala162Cys、Gln56Cys-Ala162Cys、Thr57Cys-Ala162Cys、Glu58Cys-Ala162Cys、Arg47Cys-Arg163Cys、Tyr48Cys-Arg163Cys、Leu49Cys-Arg163Cys、Tyr50Cys-Arg163Cys、Thr51Cys-Arg163Cys、Asp52Cys-Arg163Cys、Asp53Cys-Arg163Cys、Ala54Cys-Arg163Cys、Gln55Cys-Arg163Cys、Gln56Cys-Arg163Cys、Thr57Cys-Arg163Cys、Glu58Cys-Arg163Cys。

本發明之另一態樣提供包含野生型人類FGF21之變異體或其生物學活性肽之融合蛋白質，其包含本發明之第一實施例中指示的胺基酸位置中之任一處的任何帶電及/或極性但不帶電的胺基酸之取代與本發明之第二實施例中指示的兩個或兩個以上胺基酸位置處的半胱胺酸之取代的組合。

本發明之融合蛋白質相較於野生型蛋白質比較物及其變異體的改良之處

此項技術中已熟知蛋白質藥物研發過程中之重大挑戰為處理蛋白質之物理及化學不穩定性。此在蛋白質醫藥調配物意欲作為需要穩定、濃縮及保藏溶液同時保持良好生物活性概況之多用途、可注射調配物時更加明顯。在文獻中對野生型FGF21之生物物理學表徵表明濃縮蛋白質溶液(>5 mg/ml)在暴露於應力條件(諸如高溫或低pH值)時引起締合及聚集作用增強(亦即弱物理穩定性及生物醫藥性質)。FGF21之濃縮蛋白質溶液基露於醫藥防腐劑(例如間甲酚)亦對物理穩定性具有不良影響。

因此，本發明之一個實施例為在生理學及保藏調配物條件下增強濃縮溶液之物理穩定性，同時保持化學穩定性及生物學效能。可認為締合及聚集作用可由疏水性相互作用引起，因為在既定蛋白質濃度下，溫度及離子強度對物理穩定性具有顯著影響。在多數情況下，以非保守性、假設的表面曝露之胺基酸殘基為目標。分析該等殘基之局部環境且選擇認為在結構上不重要的殘基來進行突變誘發。一種引起特定變化之方法為藉由引入麩胺酸殘基來進一步降低蛋白質之pI(「麩胺酸掃描」)。假設引入帶電取代物將經由電荷-電荷排斥來抑制疏水性介導之聚集且可能改良防腐劑相容性。此外，熟習此項技術者亦將認識到在充分的突變誘發程度下，可藉由引入正電荷(伴有或不伴有負電荷減少)使pI轉變至鹼性pH值範圍，從而實現電荷-電荷排斥。

與野生型FGF21作為生物治療劑之治療性應用有關之另一個難點為例如其活體內半衰期極短(在小鼠及靈長類動物中分別為約0.5小時及2小時)。因此需要研發因效能更高或半衰期更長而更有效的追蹤化合物。研發出本發明之融合蛋白質作為一種以更高效能且以半衰期延長型調配物形式實現FGF21治療之所需效果的方法。

如本文中進一步描述，與野生型FGF21之極短半衰期及PCT公開案WO 10/129600中之融合蛋白質Fc-L(15)-FGF21(L98R、P171G、A180E)之17小時半衰期相比，本發明之融合蛋白質在小鼠中之半衰期超過兩週。與聚乙二醇化V76相比，本發明之融合蛋白質亦顯示改良之半衰期及藥物動力學性質，如本文中及2010年11月19日申請之美國專利申請案61/415,476中所描述。

此外，1 mpk之本發明之Fc-FGF21融合蛋白質在降低葡萄糖、胰島素、體重及肝臟脂質方面比5 mpk之V76更有效。在ob/ob小鼠中之12天處理研究中，融合蛋白質與媒劑相比顯示以下變化百分比(所有融合物均以1.0 mg/kg投與且V76以5.0 mg/kg投與)：與媒劑相比之總葡萄糖(AUC)變化百分比：V76為-42%；V101為-53%；V103為-46%且V188為-42%；與媒劑相比之總血漿胰島素變化百分比：V76為-46%；V101為-82%；V103為-69%且V188為-59%；與媒劑相比之總體重變化百分比：V76為-7%；V101為-12%；V103為-12%且V188為-11%；及與媒劑相比之總肝臟脂質變化百分比：V76為-30%；V101為-44%；V103為-50%且V188為-51%。

類似地，活體外分析法顯示本發明之融合蛋白質之效能為V76之效能的5倍或5倍以上：在人類脂肪細胞分析法(平均EC50±SEM)之pERK中，V76為21±2 nM(n=3)；V101為1.0±0.1 nM(n=3)，V103為1.3±0.2 nM(n=3)且V188為1.4±0.4 nM(n=3)；在人類β可囉索分析法(平均EC50±SEM)之HEK293中之pERK中，V76為13±4 nM(n=5)，V101為0.60±0.06 nM(n=5)，V103為0.9±0.3 nM(n=5)且V188為0.4±0.1 nM(n=3)；及在小鼠脂肪細胞分析法(平均EC50±SEM)中之葡萄糖攝取中，V76為5±1 nM(n=3)，V101為0.60±0.06 nM(n=3)，V103為0.60±0.07 nM(n=3)且V188為0.48±0.14 nM(n=3)。

儘管本發明之實施例係關於在生理學及保藏醫藥調配條件下之物理及化學穩定性，但保持本發明之融合蛋白質之生物學效能(例如與野生型FGF21相比)亦為應考慮之重要因素。因此，如本文在實例中所示，本發明之蛋白質之生物學效能係由蛋白質影響葡萄糖攝取之能力及/或血糖含量之降低程度來確定。

根據本發明投與之本發明之蛋白質、多肽及/或肽可藉由此項技術中已知之任何方法來產生及/或分離。用於產生變異體之最佳方法為重組型DNA方法且其為熟習此項技術者所熟知。該等方法描述於Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,Inc.)中，後者以引用的方式併入本文中。

此外，較佳實施例包括來源於本文中所描述之變異體的生物學活性肽。該種肽將含有所述取代中之至少一者且變異體將具有生物活性。肽可藉由熟習此項技術者已知之任何及所有方法來產生，該等方法之實例包括(但不限於)酶促消化、化學合成或重組型DNA方法。

在此項技術中已確定某些纖維母細胞生長因子之肽的片段具有生物學活性。參見例如Baird等人，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)85：2324-2328(1988)，及J.Cell.Phys.Suppl.5：101-106(1987)。因此，變異體之片段或肽之選擇係基於此項技術中已知之準則進行。舉例而言，已知二肽基肽酶IV(DPP-IV或DPP-4)為絲胺酸型蛋白酶，其與神經肽、內分泌肽及細胞激素之去活化有關(Damme等人，Chem.Immunol.72：42-56,(1999))。FGF21之N端(HisProIlePro)含有兩個二肽，其可能為DPP-IV之受質，從而產生在N端截短4個胺基酸之FGF21之片段。意外的是，已證實野生型FGF21之此片段保留生物活性，因此，在N端截短至多4個胺基酸之本發明之蛋白質為本發明之一個實施例。

本發明亦涵蓋編碼上述變異體之聚核苷酸，其可呈RNA形式或呈DNA形式，該DNA包括cDNA、基因組DNA及合成型DNA。DNA可為雙股DNA或單股DNA。編碼本發明之蛋白質之編碼序列會因遺傳密碼之冗餘性或簡併性而有所不同。

編碼本發明之融合蛋白質之聚核苷酸可包括以下項：僅變異體之編碼序列；變異體之編碼序列及其他編碼序列，諸如功能性多肽，或前導序列或分泌性序列或前蛋白質序列；變異體之編碼序列及非編碼序列，諸如變異體之編碼序列之內含子或非編碼序列5'及/或3'。因此術語「編碼變異體之聚核苷酸」不僅涵蓋可包括變異體之編碼序列之聚核苷酸，而且涵蓋包括其他編碼及/或非編碼序列之聚核苷酸。

此外，本發明係關於所描述之聚核苷酸之變異體，該等聚核苷酸編碼含有所指取代之多肽之片段、類似物及衍生物。聚核苷酸之變異體可為如上文所描述的天然存在之人類FGF21序列之對偶基因變異體、非天然存在之變異體或截短型變異體。因此，本發明亦包括編碼上述變異體之聚核苷酸以及該等聚核苷酸之變異體，該等變異體編碼所揭示變異體之片段、衍生物或類似物。該等核苷酸變異體包括缺失型變異體、取代型變異體、截短型變異體及添加型或插入型變異體，只要存在第一實施例或第二實施例中所示胺基酸取代中之至少一者即可。

在各序列與表現控制序列可操作地連接(亦即經定位以確保表現控制序列起作用)後，本發明之聚核苷酸將表現於宿主中。該等表現載體通常在宿主有機物中可複製為游離基因體或宿主染色體DNA之一個組成部分。通常，表現載體將含有選擇標記(例如四環素、新黴素(neomycin)及二氫葉酸還原酶)以允許偵測經所需DNA序列轉型之細胞。FGF21變異體可在合適啟動子控制下表現於哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞、細菌細胞或其他細胞中。亦可使用不含細胞之轉譯系統以使用來源於本發明之DNA構築體之RNA來產生該等蛋白質。

大腸桿菌為尤其適用於選殖本發明之聚核苷酸之原核宿主。其他適用的微生物宿主包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilus)、鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium)及沙雷氏菌屬(Serratia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈球菌屬(Streptococcus)及葡萄球菌屬(Staphylococcus)中之各種物種，但亦可使用其他微生物宿主作為所選物質。在該等原核宿主中，一種原核宿主亦可產生表現載體，其將通常含有與宿主細胞相容之表現控制序列(例如複製起點)。此外，可存在多種熟知啟動子中之任一種，諸如乳糖啟動子系統、色胺酸(Trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統、或來自噬菌體λ或T7之啟動子系統。啟動子將通常視情況藉由操作序列來控制表現，且具有核糖體結合位點序列及其類似物，以用於起始及完成轉錄及轉譯。

熟習蛋白質表現技術者將認識到可在成熟序列(SEQ ID NO：3)之N端引入甲硫胺酸或甲硫胺酸-精胺酸序列以便表現於大腸桿菌中且涵蓋於本發明之情形中。因此，除非另有說明，否則於大腸桿菌中表現之本發明之蛋白質具有在N端引入之甲硫胺酸序列。

其他微生物(諸如酵母或真菌)亦可用於表現。甲醇酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)及安格斯畢赤酵母(Pichia angusta)為較佳酵母宿主之實例，且合適載體視需要具有表現控制序列(諸如啟動子，包括3-磷酸甘油酸激酶或其他醣解酵素)及複製起點、終止序列及其類似者。黑麯黴(Aspergillus niger)、里氏木黴(Trichoderma reesei)及裂褶菌(Schizophyllum commune)為真菌宿主之實例，但亦可使用其他真菌宿主作為所選物質。

哺乳動物組織細胞培養物亦可用於表現及產生本發明之多肽。實際較佳為真核細胞，因為在此項技術中已研發出多種能夠分泌完整變異體之合適宿主細胞株，且其包括CHO細胞株、多種COS細胞株、NSO細胞、敍利亞倉鼠卵巢細胞株(Syrian Hamster Ovary cell lines)、海拉細胞(HeLa cells)或人類胎腎細胞株(亦即HEK293、HEK293EBNA)。

該等細胞之表現載體可包括表現控制序列，諸如複製起點、啟動子、強化子及必需加工資訊位點，諸如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點及轉錄終止子序列。較佳表現控制序列為來源於SV40、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒、細胞巨大病毒、勞氏肉瘤病毒(Raus sarcoma virus)及其類似物之啟動子。較佳聚腺苷酸化位點包括來源於SV40及牛生長激素之序列。

可藉由熟知方法將含有相關聚核苷酸序列(例如本發明之融合蛋白質及表現控制序列)之載體轉移於宿主細胞中，此視細胞宿主類型而有所不同。舉例而言，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主。

可使用多種蛋白質純化方法且該等方法在此項技術中為已知的且描述於例如Deutscher,Methods in Enzymology 182：83-9(1990)及Scopes,Protein Purification：Principles and Practice,Springer-Verlag,NY(1982)中。所選純化步驟將視例如用於本發明之融合蛋白質的製備過程之性質而定。

本發明之蛋白質、多肽及/或肽(例如本發明之雙重活性融合蛋白質)應考慮到患者之臨床狀況、蛋白質組合物之傳遞位點、投藥方法、給藥時程及醫師已知之其他因素，以與良好的醫療實踐一致之方式加以調配及給藥。因此根據該等考慮因素確定用於本文中之目的的本發明之融合蛋白質之「治療有效量」。

本發明蛋白質之醫藥組合物可藉由任何能實現以下一般所欲目的之方式投與：治療第1型糖尿病及第2型糖尿病、肥胖症、代謝症候群或重症患者。非限制性的許可投藥方式包括例如藉由吸入或栓劑，或投與黏膜組織，諸如藉由陰道灌洗，經直腸、經尿道、經頰及經舌下組織、經口、經鼻、局部、鼻內、腹膜內、非經腸、靜脈內、肌肉內、胸骨內、藉由關節內注射、淋巴內、間質、動脈內、皮下、滑膜內、經上皮及經皮投藥。在一些實施例中，經灌洗、經口或動脈內投與醫藥組合物。其他適合引入方法亦可包括可再充填或生物可降解裝置及緩慢或持續釋放聚合裝置。本發明之醫藥組合物亦可作為組合療法之一部分與其他已知代謝劑一起投與。

投藥劑量將視接受者之年齡、健康狀況及體重、並行治療種類(若有)、治療頻率及所需效果之性質而定。屬於本發明範疇內之組合物包括其中FGF21變異體之存在量可有效實現治療第1型糖尿病或第2型糖尿病、肥胖症或代謝症候群之所需醫療效果的所有組合物。儘管個體需要可能視患者而不同，但決定所有組分之有效量之最佳範圍屬於一般熟練臨床醫師之能力範圍內。

可根據用於製備醫藥學上適用組合物的已知方法調配本發明之蛋白質。所需調配物可為穩定凍乾製品，其可用適合稀釋劑或高純度水溶液及視情況選用之醫藥學上可接受之載劑、防腐劑、賦形劑或穩定劑復原[Remington's Phar-maceutical Sciences第16版(1980)]。本發明之蛋白質可與醫藥學上可接受之緩衝液組合，且調節pH以提供可接受之穩定性及投藥可接受之pH。

對於非經腸投藥，在一個實施例中，本發明之融合蛋白質通常係由混合所需純度之一或多種本發明之融合蛋白質與醫藥學上可接受之載劑(亦即在所用劑量及濃度下對接受者無毒性且與調配物之其他成分相容之載劑)調配成單位劑量可注射形式(溶液、懸浮液或乳液)。較佳可添加一或多種醫藥學上可接受之抗微生物劑。苯酚、間甲酚及苯甲醇為較佳的醫藥學上可接受之抗微生物劑。

可視情況添加一或多種醫藥學上可接受之鹽以調節離子強度或滲性。可添加一或多種賦形劑以進一步調節調配物之等滲性。甘油、氯化鈉及甘露醇為等滲性調節賦形劑之實例。

熟習此項技術者可容易地最佳化包含本發明之蛋白質之治療性組合物的醫藥學有效劑量及投藥方案，如根據良好的醫療實踐及個體患者之臨床狀況確定。對於成年人，本發明之蛋白質之典型劑量範圍將在每天約0.01 mg至每天約1000 mg範圍內(或每週約0.05 mg至每週約5000 mg(每週投與一次))。劑量範圍較佳為每天約0.1毫克至每天約100毫克(或每週約0.5毫克至每週約500毫克(每週投與一次))，更佳為約1.0毫克/天至約10毫克/天(或每週約5毫克至每週約50毫克(每週投與一次))。劑量最佳為約1至5毫克/天(或每週約5毫克至每週約25毫克(每週投與一次))。FGF21變異體之合適的投與劑量將藉由更快及更有效的葡萄糖利用作用引起血糖含量降低及能量消耗增加，且因此適用於治療第1型糖尿病及第2型糖尿病、肥胖症及代謝症候群。

此外，因為高血糖及胰島素抗性在給予營養支持之重症患者中較常見，一些ICU投與胰島素以治療進食後重症患者中之過高性高血糖。事實上，新近研究證明使用外源胰島素來保持血糖含量不高於110毫克/分升可降低外科重病監護室(surgical intensive care unit)之重症患者的發病率及死亡率，而與其是否具有糖尿病史無關(Van den Berghe等人，N Engl J Med.,345(19)：1359,(2001))。因此，本發明之蛋白質特別適用於幫助恢復代謝不穩定的重症患者之代謝穩定性。本發明之蛋白質(諸如含有FGF21之變異體之蛋白質)的獨特之處在於其刺激葡萄糖攝取及增強胰島素敏感性但不誘發低血糖。

在本發明之另一態樣中，涵蓋用作藥劑之本發明之蛋白質，該藥劑係用於治療肥胖症、第1型糖尿病及第2型糖尿病、胰臟炎、血脂異常、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肝炎(NASH)、胰島素抗性、高胰島素血症、葡萄糖不耐、高血糖、代謝症候群、急性心肌梗塞、與胰島素受體之嚴重失活突變有關之病狀及其他代謝病症。

位點特異性FGF21突變體

在一些實施例中，本發明之融合蛋白質包括其他FGF21突變體或FGF21類似物，該等FGF21突變體或FGF21類似物具有非天然胺基酸。

在一些實施例中，本發明之融合蛋白質包含FGF21促效劑，該等FGF21促效劑具有以下對野生型FGF21之其他修飾中之一或多者：(i)其他二硫鍵、非天然胺基酸或旨在以下之修飾：促進二聚，諸如在R154C處形成二硫鍵，或在另一位點處引入半胱胺酸，或經融合Fc域進行二聚，或經交聯劑(諸如雙官能PEG)形成二聚體；(ii)FGF21之片段；(iii)經選擇而具有FGF21活性(結合至β-可囉索及結合且活化FGFR)之蛋白質；及(iv)FGF21模擬抗體(多種形式，諸如Fab、單抗 (unibody)、svFc等)。

在一些實施例中，本發明之融合蛋白質包含以下連接子中之一或多者：簡單醯胺鍵、短肽(尤其Ser/Gly重複)、其他來自FGF21轉譯序列之殘基、或大型連接子直至整個蛋白質(諸如Fc域、HSA結合螺旋束、HSA等)。該兩個部分亦可藉由其他化學方法連接，諸如經非天然胺基酸或標準化學連接子(順丁烯二醯亞胺-Cys、NHS-Lys、扣夾(click)等)連接。

本發明之其他實施例包括(但不限於)以下用於延長半衰期之連接：HSA結合脂質或小分子或微胞與融合物之單體或二聚型式的連接。

在本發明之某些實施例中，可對本發明之蛋白質、多肽及/或肽進行其他連接以實現半衰期延長及獲得其他改良之生物學性質。其可包括連接PEG-膽固醇結合物(包括微胞及脂質體)與本發明之蛋白質、多肽及/或肽，及/或連接糖(糖基化物)與本發明之蛋白質、多肽及/或肽。在其他實施例中，使用類似技術將例如聚唾液酸(PSA)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合配位體或碳水化合物遮蔽物(carbohydrate shields)之結合物加成至蛋白質、多肽及/或肽。

羥乙基澱粉化技術，例如經還原烷基化作用使分支鏈羥基乙基澱粉(HES)鏈(60 kDa或100 kDa，來自玉米澱粉之高度分支支鏈澱粉片段)與蛋白質、多肽及/或肽偶合。聚唾液酸化作用以與聚乙二醇化作用類似之方式使相關蛋白質、多肽及/或肽與聚唾液酸(PSA)聚合物結合。PSA聚合物帶負電，其為天然存在於體內且可以10至50 kD之分子量獲得的非免疫原性聚合物。

在本發明之其他實施例中，可對本發明之蛋白質、多肽及/或肽進行其他連接或修飾以實現半衰期延長及獲得其他改良之生物學性質。該等連接或修飾包括產生重組型PEG(rPEG)基團且使其連接至本發明之蛋白質、多肽及/或肽。正如由Amunix公司研發。rPEG技術係基於具有類PEG性質之蛋白質序列，其以遺傳方式與生物醫藥劑融合，從而避免額外化學結合步驟。rPEG為半衰期經延長之艾塞那肽(exenatide)構築體，其含有較長的非結構性親水性胺基酸尾部且其能夠延長蛋白質或肽之血清半衰期且減緩其吸收速率，因此可顯著降低峰谷比(peak-trough ratio)。rPEG之流體動力學半徑增加且其表觀分子量為其實際分子量之約15倍，從而模仿聚乙二醇化作用實現長血清半衰期之方式。

截短型FGF21多肽

本發明之一個實施例係關於成熟FGF21多肽(SEQ ID NO：3)之截短形式。本發明之該實施例由於以下而產生：試圖鑑別截短型FGF21多肽，其能夠提供與成熟FGF21多肽之未經截短形式類似的活性且在一些情況下其與成熟FGF21多肽之未經截短形式相比可提供更優良的活性。

如本文中所用，術語「截短型FGF21多肽」係指已自FGF21多肽之胺基端(或N端)移除胺基酸殘基、已自FGF21 多肽之羧基端(或C端)移除胺基酸殘基、或已自FGF21多肽之胺基端及羧基端移除胺基酸殘基之FGF21多肽。如本文中所描述製備本文中揭示之各種截短型式。

可使用活體外磷酸化ERK分析法(phospho-ERK assay)分析N端截短型FGF21多肽及C端截短型FGF21多肽之活性。可用於檢驗截短型FGF21多肽之活性之活體外分析法的特定細節可見於實例中。

亦可在活體內分析法(諸如ob/ob小鼠)中評估本發明之截短型FGF21多肽之活性。通常，為評估截短型FGF21多肽之活體內活性，可以腹膜內方式投與測試動物截短型FGF21多肽。在所需潛伏期(例如1小時或1小時以上)後，可抽取血液樣品且可量測血糖含量。

a. N端截短型式

在本發明之一些實施例中，N端截短型式包含成熟FGF21多肽之N端的1、2、3、4、5、6、7或8個胺基酸殘基。具有含有少於9個胺基酸殘基之N端截短型式的截短型FGF21多肽保留成熟FGF21多肽降低個體之血糖的能力。因此，在特定實施例中，本發明涵蓋成熟FGF21多肽或FGF21蛋白質變異體之截短形式，其具有1、2、3、4、5、6、7或8個胺基酸殘基之N端截短型式。

b. C端截短型式

在本發明之一些實施例中，C端截短型式包含成熟FGF21多肽之C端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個胺基酸殘基。在活體外ELK-螢光素酶分析法中，具有含有少於13個胺基酸殘基之C端截短型式的截短型FGF21多肽之功效至少為野生型FGF21之功效之50%(Yie J.等人，FEBS Letts 583：19-24(2009))，表明該等FGF21突變體保留成熟FGF21多肽降低個體之血糖的能力。因此，在特定實施例中，本發明涵蓋成熟FGF21多肽或FGF21蛋白質變異體之截短形式，其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個胺基酸殘基之C端截短型式。

c. N端及C端截短型式

在本發明之一些實施例中，截短型FGF21多肽可具有N端截短型式及C端截短型式之組合。具有N端截短型式及C端截短型式之組合的截短型FGF21多肽共有僅具有N端截短型式或僅具有C端截短型式之相應截短型FGF21多肽之活性。換言之，具有少於9個胺基酸殘基之N端截短型式及少於13個胺基酸殘基之C端截短型式的截短型FGF21多肽具有與具有少於9個胺基酸殘基之N端截短型式之截短型FGF21多肽或具有少於13個胺基酸殘基之C端截短型式之截短型FGF21多肽類似或更大的血糖降低活性。因此，在特定實施例中，本發明涵蓋成熟FGF21多肽或FGF21蛋白質變異體之截短形式，其具有1、2、3、4、5、6、7或8個胺基酸殘基之N端截短型式及1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個胺基酸殘基之C端截短型式。

與本發明之所有FGF21變異體相同，截短型FGF21多肽可視情況包含胺基末端甲硫胺酸殘基，其可藉由定向突變或作為細菌性表現過程之結果引入。

本發明之截短型FGF21多肽可如本文中所描述之實例中所描述來製備。一般熟習此項技術者(熟悉標準分子生物學技術)可使用該知識結合本揭示案來製備及使用本發明之截短型FGF21多肽。可使用標準技術進行重組型DNA、寡核苷酸合成、組織培養及轉型(例如電穿孔、脂質體轉染)。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，見上文，其以引用的方式併入本文中以用於任何目的。可根據製造商說明書，如此項技術中通常所實現般，或如本文中所描述般，進行酶促反應及純化技術。除非提供特定定義，否則關於本文中所描述之分析化學、合成有機化學以及醫藥及藥物化學利用之命名以及分析化學、合成有機化學以及醫藥及藥物化學之實驗程序及技術為此項技術中之熟知及常用者。可使用標準技術進行化學合成；化學分析；醫藥製備、調配及傳遞；及患者治療。

本發明之截短型FGF21多肽亦可與另一實體融合，該實體可賦予截短型FGF21多肽其他性質。在本發明之一個實施例中，截短型FGF21多肽可與IgG恆定域或其片段(例如Fc區域)、人類血清白蛋白(HSA)或白蛋白結合多肽融合。可使用已知分子生物學方法及/或本文中提供之指導實現該融合。該等融合多肽之益處以及製備該等融合多肽之方法更詳細地論述於本文中。

FGF21融合蛋白質

如本文中所用，術語「FGF21融合多肽」或「FGF21融合蛋白質」係指本文中所描述之任何FGF21蛋白質變異體之N端或C端處融合有一或多個胺基酸殘基(諸如異源蛋白質或肽)。

如本文中定義，可藉由使異源序列在例如FGF21蛋白質變異體之N端或C端處融合來產生FGF21融合蛋白質。如本文中所描述，異源序列可為胺基酸序列或不含胺基酸之聚合物。異源序列可直接與FGF21蛋白質變異體融合或經連接子或配接分子與FGF21蛋白質變異體融合。連接子或配接分子可為一或多個胺基酸殘基(或基體)，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9個殘基(或基體)，較佳為10至50個胺基酸殘基(或基體)，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個殘基(或基體)，且更佳為15至35個胺基酸殘基(或基體)。連接子或配接分子亦可經設計而具有DNA限制性核酸內切酶或蛋白酶之裂解位點以允許融合部分之分離。

異源肽及多肽包括(但不限於)允許偵測及/或分離FGF21蛋白質變異體之抗原決定基；跨膜受體蛋白質或其部分，諸如細胞外結構域或跨膜及細胞內結構域；結合於跨膜受體蛋白之配位體或其部分；具有催化活性之酶或其部分；促進寡聚之多肽或肽，諸如白胺酸拉鏈結構域；增加穩定性之多肽或肽，諸如免疫球蛋白恆定區；功能性或非功能性抗體或其重鏈或輕鏈；及具有與本發明之FGF21蛋白質變異體不同之活性(諸如治療活性)的多肽。本發明亦涵蓋與人類血清白蛋白(HSA)融合之FGF21突變體。

a. Fc融合物

在本發明之一個實施例中，FGF21蛋白質變異體與人類IgG之Fc區域之一或多個結構域融合。抗體包含兩個功能上獨立的部分，即：稱為「Fab」之可變域，其結合抗原；及稱為「Fc」之恆定域，其與效應子功能(諸如補體活化及吞噬細胞攻擊)有關。Fc具有長血清半衰期，而Fab之壽命較短(Capon等人，1989,Nature 337：525-31)。當與治療性蛋白質結合在一起時，Fc域可提供較長半衰期或合併諸如以下之功能：Fc受體結合、蛋白質A結合、補體固定或也許甚至合併胎盤轉移功能(Capon等人，1989)。

在本發明中，Fc-FGF21係指Fc序列與FGF21之N端融合之融合蛋白質。類似地，在本發明中，FGF21-Fc係指Fc序列與FGF21之C端融合之融合蛋白質。

本發明之較佳實施例為包含如本文中定義之FGF21變異體之Fc-FGF21融合蛋白質。尤其較佳的實施例為包含如本文中定義之經修飾之Fc片段(例如FcLALA)及FGF21變異體的Fc-FGF21融合蛋白質。

可例如藉由使用蛋白質A親和管柱來純化融合蛋白質。與未融合之對應物相比，已發現與Fc區域融合之肽及蛋白質展現實質上更長的活體內半衰期。與Fc區域之融合亦允許進行融合多肽之二聚作用/多聚作用。Fc區域可為天然存在Fc區域，或可經變化以改良某些品質，諸如治療品質、循環時間，或減少聚集。

藉由與抗體之「Fc」結構域融合進行的蛋白質治療劑之有效修飾詳細論述於PCT公開案第WO 00/024782號中。此文獻論述與「媒劑」(諸如聚乙二醇(PEG)、聚葡萄糖或Fc區域)之鍵聯。

b.融合蛋白質連接子

當形成本發明之融合蛋白質時，可(但非必需)使用連接子。當存在時，連接子之化學結構可能並不關鍵，因為其主要起間隔基作用。連接子可由胺基酸組成，該等胺基酸由肽鍵連接在一起。在本發明之一些實施例中，連接子由1至20個由肽鍵連接之胺基酸組成，其中該等胺基酸係選自20種天然存在之胺基酸。在多種實施例中，該1至20種胺基酸係選自胺基酸甘胺酸、絲胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸及離胺酸。在一些實施例中，連接子由大部分非位阻胺基酸(諸如甘胺酸及丙胺酸)組成。在一些實施例中，連接子為聚甘胺酸、聚丙胺酸、甘胺酸與丙胺酸之組合(諸如聚(Gly-Ala))或甘胺酸與絲胺酸之組合(諸如聚(Gly-Ser))。儘管已發現具有15個胺基酸殘基之連接子尤其適用於FGF21融合蛋白質，但本發明涵蓋具有任何長度或組成之連接子。

本文中所描述之連接子為例示性的，且本發明涵蓋長度更長及包括其他殘基之連接子。本發明亦涵蓋非肽連接子。舉例而言，可使用(諸如)烷基連接子。該等烷基連接子可進一步經任何非位阻基團(包括(但不限於)低碳烷基(例如C1-C6)、低碳醯基、鹵素(例如Cl、Br)、CN、NH₂或苯基)取代。例示性非肽連接子為聚乙二醇連接子，其中該連接子之分子量為100至5000 kD，例如100至500 kD。

化學修飾之融合蛋白質

本文中所描述之融合蛋白質之化學修飾形式(包括例如本文中所描述之FGF21融合物之截短及變異形式)可由熟習此項技術者根據本文中所描述之揭示內容製備。該等化學修飾之融合蛋白質經變化使得化學修飾之突變體與未經修飾之突變體不同，其在天然連接至突變體之分子之類型或位置方面有所不同。化學修飾之突變體可包括由一或多個天然連接之化學基團之缺失形成之分子。

在一個實施例中，本發明之蛋白質可藉由一或多種聚合物之共價連接來修飾。舉例而言，所選聚合物通常為水溶性的，以使得其所連接之蛋白質不會在水性環境(諸如生理環境)中沈澱。在合適聚合物之範疇內包括聚合物之混合物。對於終產物製劑之治療性用途，聚合物較佳將為醫藥學上可接受的。非水溶性聚合物與本發明之蛋白質之結合物亦形成本發明之一個態樣。

例示性聚合物各自可具有任何分子量且可為分支鏈或未分支的。聚合物通常各具有約2 kDa至約100 kDa之間的平均分子量(術語「約」表示在水溶性聚合物之製劑中，一些分子將重於所述分子量且一些分子將輕於所述分子量)。各聚合物之平均分子量較佳在約5 kDa與約50 kDa之間，更佳在約12 kDa與約40 kDa之間且最佳在約20 kDa與約35 kDa之間。

合適的水溶性聚合物或其混合物包括(但不限於)N-連接或O-連接之碳水化合物、糖、磷酸鹽、聚乙二醇(PEG)(包括PEG之已用於衍生化蛋白質之形式，包括單(C1-C10)、烷氧基-聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇)、單甲氧基-聚乙二醇、聚葡萄糖(諸如低分子量聚葡萄糖，例如約6 kD)、纖維素、或其他基於碳水化合物之聚合物、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)及聚乙烯醇。本發明亦涵蓋雙功能交聯分子，其可用於製備共價連接之FGF21蛋白質變異體多聚體。本發明亦涵蓋共價連接至聚唾液酸之FGF21突變體。

多醣聚合物為另一種可用於蛋白質修飾之水溶性聚合物。因此，與多醣聚合物融合之本發明之融合蛋白質形成本發明之實施例。聚葡萄糖為多醣聚合物，其包含主要由α1-6鍵連接之葡萄糖之個別次單元。聚葡萄糖本身可在多種分子量範圍內獲得，且可容易地以約1 kD至約70 kD之分子量獲得。聚葡萄糖為本身適用作媒劑或適於與另一媒劑(例如Fc)組合使用之水溶性聚合物。參見例如國際公開案第WO 96/11953號。已報導與治療性或診斷性免疫球蛋白結合之聚葡萄糖之用途。參見例如歐洲專利公開案第0 315 456號，其據此以引用的方式併入本文中。本發明亦涵蓋使用約1 kD至約20 kD之聚葡萄糖。

通常，化學修飾可在任何適用於使蛋白質與活性聚合物分子反應之條件下進行。用於製備化學修飾之多肽之方法通常將包含以下步驟：(a)使多肽與活性聚合物分子(諸如聚合物分子之反應性酯或醛衍生物)在使FGF21蛋白質變異體變為連接至一或多個聚合物分子之條件下反應，及(b)獲得反應產物。將基於已知參數及所需結果確定最佳反應條件。舉例而言，聚合物分子與蛋白質之比率越大，則所連接之聚合物分子之百分比越大。在本發明之一個實施例中，化學修飾之FGF21突變體可在胺基端具有單一聚合物分子部分(參見例如美國專利第5,234,784號)。

在本發明之另一實施例中，本發明之蛋白質可以化學方式與生物素偶合。接著允許本發明之生物素/蛋白質結合於抗生物素蛋白，從而產生本發明之四價抗生物素蛋白/生物素/蛋白質。本發明之蛋白質亦可與二硝基苯酚(DNP)或三硝基苯酚(TNP)共價偶合且所得結合物可與抗DNP或抗TNP-IgM一起沈澱從而形成原子價為10之十聚體結合物。

通常，可藉由投與本發明之化學修飾之FGF21突變體而緩解或調節的病狀包括本文中關於本發明之蛋白質所描述之病狀。然而，與未經修飾之FGF21突變體相比，本文中揭示之化學修飾之FGF21突變體可具有其他活性、增強或降低之生物活性或其他特徵，諸如半衰期延長或縮短。

融合蛋白質之治療性組合物及其投藥

本發明亦提供治療性組合物，其包含一或多種本文中所描述之本發明之融合蛋白質且呈與經選擇而與投藥模式相適應的醫藥學上或生理學上可接受之調配劑或醫藥學上可接受之載劑的混合物形式。考慮到例如鑑別展現增強之性質之融合蛋白質，明確涵蓋該等組合物。

在一些實施例中，治療性組合物經製備為可注射劑形式，如液體溶液或懸浮液；亦可製備適用於在注射前溶解或懸浮於液體媒劑中之固體形式。在醫藥學上可接受之載劑之定義內包括脂質體。在醫藥組合物中亦可存在醫藥學上可接受之鹽，例如無機酸鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽及其類似物；及有機酸鹽，諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽及其類似物。醫藥學上可接受之賦形劑之全面論述可於Remington：The Science and Practice of Pharmacy(1995)Alfonso Gennaro,Lippincott,Williams,& Wilkins中獲悉。

可接受之調配材料較佳在所用劑量及濃度下對接受者無毒性。

醫藥組合物可含有用於改變、保持或保留例如組合物之pH值、容積莫耳滲透濃度、黏度、澄清度、顏色、等滲性、氣味、無菌度、穩定性、溶解或釋放速率、吸收作用或滲透作用之調配材料。合適調配材料包括(但不限於)胺基酸(諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸)、抗微生物劑、抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)、緩衝液(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)、增積劑(諸如甘露醇或甘胺酸)、螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))、錯合劑(諸如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥基丙基-β-環糊精)、填充劑、單醣、雙醣及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、著色劑、調味劑及稀釋劑、乳化劑、親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮)、低分子量多肽、成鹽相對離子(諸如鈉)、防腐劑(諸如氯化苯甲烴銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、洗必太(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫)、溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(諸如甘露醇或山梨糖醇)、懸浮劑、界面活性劑或濕潤劑(諸如普洛尼克(pluronics)；PEG；脫水山梨糖醇酯；聚山梨醇酯，諸如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；去利通(triton)；緩血酸胺；卵磷脂；膽固醇或泰洛沙泊(tyloxapal))、穩定性增強劑(諸如蔗糖或山梨糖醇)、滲性增強劑(諸如鹼金屬鹵化物；較佳為氯化鈉或氯化鉀；或甘露醇山梨糖醇)、傳遞媒劑、稀釋劑、賦形劑及/或醫藥佐劑(參見例如Remington,Pharmaceutical Sciences(第18版，A.R.Gennaro編，Mack Publishing Company 1990)及其後續版本，其以引用的方式併入本文中以用於任何目的)。

將由熟練技師根據例如所欲投藥途徑、傳遞方式及所需劑量確定最佳醫藥組合物(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，見上文)。該等組合物會影響本發明之融合蛋白質之物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。

醫藥組合物中之主要媒劑或載劑可本質上為水性或非水性的。舉例而言，適用於注射之媒劑或載劑可為水、生理食鹽水溶液或人造腦脊髓液，其可能補充有用於非經腸投藥之組合物中常用的其他材料。中性緩衝鹽水或鹽水與血清白蛋白之混合物亦為例示性媒劑。其他例示性醫藥組合物可包含Tris緩衝液(約pH 7.0至8.5)或乙酸鹽緩衝液(約pH 4.0至5.5)，此外其可包括山梨糖醇或合適取代物。在本發明之一個實施例中，可藉由以凍乾塊狀物或水溶液形式混合具有所需純度之所選組合物與視情況選用之調配劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，見上文)來製備雙功能醫藥組合物以作儲存。此外，使用合適賦形劑(諸如蔗糖)將雙功能蛋白質產物調配為凍乾產物。

可對含有本發明之融合蛋白質之醫藥組合物進行選擇以用於非經腸傳遞。或者，可對組合物進行選擇以用於吸入或用於經消化道(諸如經口)傳遞。該等醫藥學上可接受之組合物之製備方法屬於熟習此項技術者之技能範疇內。

調配物組分以投藥位點可接受之濃度存在。舉例而言，使用緩衝液保持組合物具有生理學pH值或稍微較低的PH值，pH值通常在約5至約8範圍內。

當涵蓋非經腸投藥時，本發明中所用之治療性組合物可呈無熱原質、非經腸可接受之水溶液形式，其在醫藥學上可接受之媒劑中包含所需雙功能蛋白質。對於非經腸注射，尤其合適的媒劑為無菌蒸餾水，其中雙功能蛋白質經調配為無菌、等滲溶液，其經適當保藏。另一種製備可涉及所需分子與試劑(諸如可注射微球體、生物可腐蝕性粒子、聚合化合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體) 之調配物，該試劑提供產物之控制釋放或持續釋放，產物接著可經積存注射傳遞。亦可使用玻尿酸(Hyaluronic acid)，且此可具有促進循環中之持續時間之作用。其他適用於引入所需分子之方法包括可植入藥物傳遞裝置。

在一個實施例中，可調配用於吸入之醫藥組合物。舉例而言，本發明之雙功能蛋白質可調配為用於吸入之乾燥粉末。雙功能蛋白質吸入溶液亦可與推進劑一起調配以用於噴霧傳遞。在另一實施例中，可使溶液霧化。肺部投藥進一步描述於國際公開案第WO 94/20069中，其描述化學修飾之蛋白質之肺部傳遞。

亦預期某些調配物可經口投與。在本發明之一個實施例中，可在有或無在混配固體劑型(諸如錠劑及膠囊)時常用之載劑的情況下調配以此方式投與之本發明之融合蛋白質。舉例而言，膠囊可經設計以在胃腸道中在生物可用性得以最大化且系統前降解得以最小化之時釋放調配物之活性部分。可包括其他試劑以有助於本發明之融合蛋白質之吸收。亦可使用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑及黏合劑。

另一種醫藥組合物可包括有效量之本發明之融合蛋白質與適用於製造錠劑之無毒性賦形劑之混合物。藉由使錠劑溶解於無菌水或另一合適媒劑中，可製備呈單位劑量形式之溶液。合適賦形劑包括(但不限於)惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或結合劑，諸如澱粉、明膠或阿拉伯膠；或潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。

熟習此項技術者將顯而易知其他包含本發明之融合蛋白質之醫藥組合物，包括包含本發明之融合蛋白質之調配物，其呈持續傳遞或受控傳遞調配物形式。用於調配多種其他持續傳遞形式或受控傳遞形式(諸如脂質體載劑、生物可腐蝕性微粒或多孔珠粒及積存注射劑)之技術亦為熟習此項技術者所知(參見例如國際公開案第WO 93/15722號，其描述用於傳遞醫藥組合物之多孔聚合微粒之控制釋放，及Wischke & Schwendeman,2008,Int.J Pharm.364：298-327以及Freiberg & Zhu,2004,Int.J Pharm.282：1-18，其論述微球體/微粒製備及使用)。

持續釋放製劑之其他實例包括半滲透性聚合物基質，呈成型物品形式，例如薄膜，或微膠囊。持續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚丙交酯(美國專利第3,773,919號及歐洲專利第0 058 481號)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物(Sidman等人，1983,Biopolymers 22：547-56)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981,J.Biomed.Mater.Res.15：167-277及Langer,1982,Chem.Tech.12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，見上文)或聚-D-3-羥基丁酸(歐洲專利第0 133 988號)。持續釋放組合物亦可包括脂質體，其可藉由此項技術中已知的若干種方法中之任一種製備。參見例如Epstein等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-92；及歐洲專利第0 036 676號、第0 088 046號及第0 143 949號。

欲用於活體內投藥之本發明之醫藥組合物通常必須為無菌的。此可藉由經無菌過濾薄膜過濾來實現。當組合物經冷凍乾燥時，可在凍乾及復原之前或在凍乾及復原之後使用此方法進行滅菌。用於非經腸投藥之組合物可以凍乾形式或溶液形式儲存。此外，非經腸組合物通常置放於具有無菌進入孔之容器(例如具有可由皮下注射針穿透之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)中。

一旦調配出醫藥組合物後，其即可以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體形式或以脫水或凍乾粉末形式儲存於無菌小瓶中。該等調配物可以即用形式或以需要在投藥之前復原之形式(例如凍乾形式)儲存。

在特定實施例中，本發明係關於用於產生單劑量投藥單元之套組。該等套組可各含有第一容器(具有乾燥蛋白質)及第二容器(具有水性調配物)。本發明之範疇內亦包括含有單腔室及多腔室預裝藥品之注射器(例如液體注射器及凍乾物注射器)之套組。

融合蛋白質之劑量及其投藥

欲治療性使用之本發明之醫藥組合物的有效量將例如視治療情形及目標而定。熟習此項技術者應瞭解，用於治療之合適劑量水準將因此部分地視所傳遞之分子、使用融合蛋白質變異體治療之適應症、投藥途徑及患者體型(體重、體表面積或器官大小)及狀況(年齡及一般健康狀況)而變化。因此，臨床醫師可確定劑量且改良投藥途徑以獲得最佳治療效果。視上述因素而定，典型劑量可在約0.1 μg/kg至多達約100 mg/kg或100 mg/kg以上範圍內。在其他實施例中，該劑量可在0.1 μg/kg直至約100 mg/kg範圍內；或1 μg/kg至約100 mg/kg範圍內。

給藥頻率將視所用調配物中雙功能蛋白質之藥物動力學參數而定。通常，臨床醫師將投與組合物直至達到獲得所需效果之劑量。因此，組合物可隨時間以單次劑量、以兩次或兩次以上劑量(其可能含有或可能不含相同量之所需分子)投與，或經由植入裝置或導管以連續輸注方式投與。合適劑量之進一步精細化通常由一般熟習此項技術者進行且屬於其通常執行之任務範圍內。可使用合適劑量-反應資料來確定合適劑量。

醫藥組合物之投藥途徑與已知方法一致，例如經口；經靜脈內、腹膜內、腦內(實質內)、腦室內、肌肉內、動脈內、門靜脈內或病灶內注射途徑；藉由持續釋放系統投與(其亦可被注射)；或藉由植入裝置投與。可視需要藉由快速注射或連續輸注或植入裝置投與組合物。

或者或另外，可經植入上面已吸收或封裝有所需分子之薄膜、海綿或其他合適材料來局部投與組合物。當使用植入裝置時，可將裝置植入任何合適組織或器官中，且可經由擴散、定時釋放藥團或連續投藥傳遞所需分子。

融合蛋白質之治療性用途

本發明之蛋白質可用於治療、診斷、改善或預防多種疾病、病症或病狀，包括(但不限於)代謝病症。在一個實施例中，欲治療之代謝病症為糖尿病，例如第2型糖尿病。在另一實施例中，代謝病症為肥胖症。其他實施例包括代謝性病狀或病症，諸如第1型糖尿病、胰臟炎、血脂異常、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肝炎(NASH)、胰島素抗性、高胰島素血症、葡萄糖不耐、高血糖、代謝症候群、高血壓、心血管疾病、急性心肌梗塞、動脈粥樣硬化、周邊動脈疾病、中風、心臟衰竭、冠心病、腎病、糖尿病性併發症、神經病變、與胰島素受體之嚴重失活突變有關之病症、胃輕癱及其他代謝病症。

在應用中，可藉由投與有需要之患者治療有效劑量之量的如本文中所描述之FGF21蛋白質變異體來治療諸如第1型糖尿病或第2型糖尿病或肥胖症之病症或病狀。投藥可如本文中所描述進行，諸如藉由靜脈內注射、腹膜內注射、肌肉內注射或以錠劑或液體製品形式經口投與。在大部分情形中，所需劑量可由臨床醫師如本文中所描述確定且可表示FGF21突變型多肽之治療有效劑量。熟習此項技術者將顯而易見，FGF21突變型多肽之治療有效劑量將尤其視給藥時程、所投與抗原之單位劑量、核酸分子或多肽是否與其他治療劑組合投與、接受者之免疫狀態及健康狀況而定。如本文中所用之術語「治療有效劑量」意謂可在組織系統、動物或人類中引起為研究人員、醫療醫師或其他臨床醫師所尋求之生物學或醫學反應(其包括減輕所治療疾病或病症之症狀)的FGF21突變型多肽之量。

現已詳細描述了本發明，藉由參考以下實例將更清楚地理解本發明，包括以下實例僅用於說明目的且不意欲限制本發明。

除非另有說明，否則本發明之實踐將使用屬於此項技術技能範圍內的化學、生物化學、分子生物學、免疫學及藥理學之習知方法。該等技術已在文獻中全面說明。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton,Pennsylvania：Mack Publishing Company,1990)；Methods In Enzymology(S.Colowick及N.Kaplan編，Academic Press,Inc.)；及Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir及C.C.Blackwell編，1986,Blackwell Scientific出版)；及Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)。

實例 實例1：製備FGF21變異型蛋白質

FGF21變異體之表現構築體：將FGF21變異體選殖入經修飾之大腸桿菌表現載體pET30a(由Achmuller等人，(2007)(Nature Methods 4：1037-1043)描述)中，以產生與FGF21之N端(aa 33-209)處之六-組胺酸標籤及隨後的N^pro-EDDIE標籤的框內融合物。

FGF21變異體之表現及純化：將pET30a-His-N^pro-EDDIE-FGF21表現質體轉型於大腸桿菌BL21星形(DE3)勝任細胞(Invitrogen)中。在37℃下於含有50 μg/mL卡那黴素(kanamycin)之50 mL Terrific培養液(Terrific Broth/TB)中進行自新近轉型之細胞之單一群落的隔夜生長。將預培養物轉移入具有卡那黴素之1 L TB培養基中且於三角燒瓶 (baffled flask)中在37℃下在250 rpm振盪下培養。在培養6小時後，藉由以1 mM最終濃度添加IPTG來誘導FGF21之表現，且培養物在37℃下隔夜生長。接著收集細胞且再懸浮於50 mL冰冷的溶解緩衝液(50 mM Tris-HCl(pH 8)、150 mM NaCl、1 mM EDTA)中，接著使用microfluidizer^TM進行溶解。

藉由在4℃下以30,000×g離心1小時來使包涵體(IB)沈澱。IB用50 mM Tris-HCl(pH 8)、150 mM NaCl洗滌且接著溶解於30 mL溶解緩衝液(10 mM Tris-HCl(pH 8)、100 mM NaH₂PO₄、6 M GnHCl)中。藉由在25℃下以30,000×g離心1小時來使溶解之IB澄清。將IB溶液裝載於用溶解緩衝液平衡之5 mL Ni-NTA高效樹脂管柱(GE Healthcare)上。藉由使pH值降低至4.5來使結合於樹脂之蛋白質溶離。藉由調節pH值及添加20 mM濃度之二硫蘇糖醇(DTT)來調節溶離液。在1 L再摺疊緩衝液(50 mM Tris-HCl(pH 8)、0.5 M精胺酸、20 mM DTT)中緩慢稀釋調節之溶離液，接著在4℃下培育2天。濃縮稀釋樣品且使用超濾方法進行緩衝液交換進入20 mM Tris-HCl(pH 9)中。將濃縮樣品裝載於用20 mM Tri-HCl(pH 9)平衡之10 mL Q瓊脂糖凝膠快速流動樹脂管柱(GE Healthcare)上。

在用平衡緩衝液洗滌樹脂後，用20 mM Tris-HCl(pH 9)、500 mM NaCl使結合於樹脂之蛋白質溶離。為自再摺疊FGF21蛋白質移除裂解之His-N^pro融合片段及任何未裂解之融合蛋白質，將溶離液裝載於用20 mM Tris(pH 8.0)、 50 mM咪唑平衡之5 mL Ni-NTA高效樹脂管柱上，且收集含有FGF21之流經部分。為降低內毒素含量，用EndpTrap HD樹脂(Hyglos)(用10 mM Tris(pH 8)、50 mM咪唑、500 mM NaCl、1 mM CaCl₂平衡)處理FGF21部分。針對PBS對低內毒素樣品進行透析且接著用0.22 μm過濾器滅菌。經純化之FGF21蛋白質在液氮中快速冷凍且在-80℃下儲存。使用9362 M^-1 cm^-1作為莫耳消光係數，根據280 nm下之吸光度確定FGF21之蛋白質濃度。藉由HPLC、SDS-PAGE及液相層析-質譜分析法確定蛋白質純度及完整性。

圖1A至1D展示V188與V76相比在ob/ob糖尿病性小鼠模型中具有改良之功效。與以5毫克/公斤(mpk)投與之V76相比，V188在以1毫克/公斤投與時展示更優良的結果。圖1A展示進食後血糖資料(圓形表示媒劑(PBS-磷酸鹽緩衝鹽水)，正方形表示V76(5 mpk)且三角形表示V188(1 mpk))。圖1B展示進食後血漿胰島素資料(自左至右分別為：媒劑、V76(5 mpk)及V188(1 mpk))。圖1C展示體重資料(自左至右分別為：媒劑、V76(5 mpk)及V188(1 mpk))。圖1D展示肝臟脂質含量資料(自左至右分別為：媒劑、V76(5 mpk)及V188(1 mpk))。

圖2A至2D展示V101與V76相比在ob/ob糖尿病性小鼠模型中具有改良之功效。與以5毫克/公斤(mpk)投與之V76相比，V101在以1毫克/公斤投與時展示更優良的結果。圖2A展示進食後血糖資料(圓形表示媒劑(PBS-磷酸鹽緩衝鹽水)，正方形表示V76(5 mpk)且三角形表示V101(1 mpk))。圖2B展示進食後血漿胰島素資料(自左至右分別為：媒劑、V76(5 mpk)及V101(1 mpk))。圖2C展示體重資料(自左至右分別為：媒劑、V76(5 mpk)及V101(1 mpk))。圖2D展示肝臟脂質含量資料(自左至右分別為：媒劑、V76(5 mpk)及V101(1 mpk))。

圖3A至3D展示V103與V76相比在ob/ob糖尿病性小鼠模型中具有改良之功效。與以5毫克/公斤(mpk)投與之V76相比，V103在以1毫克/公斤投與時展示更優良的結果。圖3A展示進食後血糖資料(圓形表示媒劑(PBS-磷酸鹽緩衝鹽水)，正方形表示V76(5 mpk)且三角形表示V103(1 mpk))。圖3B展示進食後血漿胰島素資料(自左至右分別為：媒劑、V76(5 mpk)及V103(1 mpk))。圖3C展示體重資料(自左至右分別為：媒劑、V76(5 mpk)及V103(1 mpk))。圖3D展示肝臟脂質含量資料(自左至右分別為：媒劑、V76(5 mpk)及V103(1 mpk))。

圖4A至4C顯示本發明之融合蛋白質與此項技術中之FGF21融合蛋白質相比具有更優良的藥物動力學性質。圖4A比較本發明之融合蛋白質特定言之與在PCT公開案WO 10/129600中描述為Fc-L(15)-FGF21(L98R、P171G、A180E)之FGF21融合蛋白質在小鼠中靜脈內注射後的結果的。圖4B展示在抗FGF21西方墨點分析中本發明之融合蛋白質之抽樣檢查，其與120小時及15天時之抗Fc-ELISA資料一致。墨點分析中之樣品如下：A表示V101，B表示 V103且C表示V188。對照物為V101及血清。圖4C顯示本發明之融合蛋白質與V76相比熱力學穩定性顯著增加。自上至下，圖式分別表示V101、V103及V188，其與V76(Tm<50℃(未圖示))及野生型FGF21(Tm=46.5℃±0.3(未圖示))相比均具有改良之Tms。

<110> 瑞士商諾華公司

<120> 治療代謝病症之融合蛋白質

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<141> 2012/09/25

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<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

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Claims

一種融合蛋白質，其包含FGF21變異體及Fc區域。
如請求項1之融合蛋白質，其中該蛋白質之序列係選自表1中所列之序列。