TW201300131A

TW201300131A - 包含艾塞那肽（ｅｘｅｎｄｉｎ）連接子接合物之前藥

Info

Publication number: TW201300131A
Application number: TW100133115A
Authority: TW
Inventors: Felix Cleemann; Ulrich Hersel; Torben Lessmann; Harald Rau
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 2010-09-17
Filing date: 2011-09-15
Publication date: 2013-01-01

Abstract

本發明係關於一前藥或其製藥上可接受的鹽，其包含艾塞那肽(exendin)連接子接合物D-L，其中D代表艾塞那肽基團；且-L為一以式(I)代表之非生物活性連接子部份-L1，□其中，該虛線係指藉由形成醯胺鍵而連接至艾塞那肽部份之胺基基團之一。本發明進一步關於包含該前藥之製藥組成物以及其等作為用於治療或預防可用艾塞那肽處理之疾病或障礙的醫藥品之用途。

Description

包含艾塞那肽(exendin)連接子接合物之前藥

本發明係關於艾塞那肽(exendin)前藥，包含該前藥之製藥組成物以及其等作為用於治療或預防可用艾塞那肽處理之疾病或障礙的醫藥品之用途。

艾塞那肽-4為一種39-胺基酸之胜肽，其係由劇毒之希拉毒蜥(Heloderma suspectum)之唾液腺分泌物中單離出來。其具有似胰高血糖素胜肽家族之數員之某些序列類似性，其對似胰高血糖素胜肽-1[7-36]-醯胺(GLP-1)之最高同質性為53%。艾塞那肽-4係於GLP-1受體上作用為GLP-1激動劑且於單離之老鼠胰島上帶有似GLP-1胰島素促泌素作用。艾塞那肽-4為一高效能激動劑及縮短之艾塞那肽-(9-39)-醯胺，於分泌胰島素之β-細胞上之似胰高血糖素胜肽1-(7-36)-醯胺受體之拮抗劑(參見例如生物化學期刊268(26)：19650-19655)。最近，艾塞那肽-4("艾塞拿肽得(exenatide)")於美國及歐洲被認可來改良服用二甲雙胍及/或磺醯脲但尚未達到適當血糖控制之第二型糖尿病患者的血糖控制。

目前以艾塞拿肽得治療需要頻繁的注射(一天兩次)，於注射後造成高血漿濃度，其與噁心相關聯(參見Nauck M. A.，Meier J. J.(2005)，Regul Pept.128(2)：135-148)，並與低的波谷濃度相關聯，其造成不完全的血糖控制(參見Kim D.，等(2007)，Diabetes Care. 30(6)：1487-1493)。為了克服這些問題，很想要艾塞那肽-4之長效型配劑。

理想上，該胜肽係以一型式調配而於人類提供持續之血漿濃度達至少為施用至人體後一週造成每週一次或更長時間一次之注射頻率。今建議數種長效型艾塞那肽。

為了加強藥物於生體內之物化或藥物動力特性，例如其半生期，可將此等藥物與一載體接合。如該藥物係瞬間結合至一載體及/或一連接子，此等系統通常指稱為連接載體之前藥。根據IUPAC所提供之定義(如給定於http：//www.chem.qmul.ac.uk/iupac.medchem，於2009年7月22日存取)，一連接載體之前藥為一前藥，其含有給定活性物質與瞬態載體之暫時連接，其產生改良之物化或藥代動力學特點且其於生體內可容易的移除，通常係藉由水解裂離。

於此等連接載體之前藥中採用之連接子可為瞬態，係指其等於生理條件下(水性緩衝液於pH 7.4，37℃)為非酶解水解可降解(可裂離)，其半生期範圍係由，例如，一小時至三個月。適當的載體為聚合物且可直接結合至連接子試劑(reagent)或經由不可裂離之間隔子。

經由無蹤前藥連接子之瞬態聚合物的接合反應包含之優點為延長的循環時間，其係由於聚合物之附著及於原生胜肽由聚合物接合物釋出後之原有藥理的回復。

使用聚合物-連接子胜肽接合物時，原生未改變之胜肽係於施用至患者後緩緩釋出，藉由連接子之釋出動力學及聚合物載體之藥物動力學來控制。理想上，釋出動力學與體液中如似蛋白酶或酯酶之酵素出現無關，以確保一致且均勻之釋出模式。

國際專利申請案WO-A 2009/095479係指稱包括藥物連接子接合物之前藥，其中該連接子係經由一可裂離之鍵而共價連接至生物活性部份，例如艾塞那肽。該生物活性部份係藉由環亞胺形成反應中於環化-激活反應時由前藥釋出。係說明一艾塞那肽-前藥，其中該連接子係以L-丙胺酸為主。

依然，仍需開發長效之具有較長半生期之艾塞那肽前藥。因此，本發明之一個目的係提供具有較長半生期之艾塞那肽前藥。

此係藉由前藥或其製藥上可接受的鹽而達成，其包括共價之式D-L艾塞那肽前藥，其中D代表一艾塞那肽部份；且-L為以式(I)代表之非生物活性連接子部份-L¹，

其中，該虛線係指藉由形成醯胺鍵而連接至艾塞那肽之胺基基團之一；R¹係選自C_1-4烷基，較佳為CH₃；R²，R^2a係獨立選自由H及C_1-4烷基組成的群組之基團；其中L¹係被一個L²-Z所取代且任意再被取代，但式(I)中以星號標記之氫未被取代基所代替，且其中L²為單一化學鍵或一間隔子；且Z為一水凝膠。

今發現以式(I)所示之立體化學為主之前藥連接子，亦即胺基酸於其之D-型式者，與此等胺基酸於其之L-型式為主之前藥連接子相較具有利的半生期。再者，此等前藥可提供艾塞那肽由皮下儲積物(depot)以結構完整型式於至少2天之給藥期間內釋出。另一有利點為，該釋出之艾塞那肽的結構完整性可藉由良好-水合之聚合物基質使艾塞那肽分子的分子內接觸最小化來提供且可藉由艾塞那肽及該聚合物基質之間的自我裂離前藥連接子而持續釋出。

因此，應可能以本發明之前藥型式投與艾塞那肽，其頻率低於現用之長效型艾塞那肽。其他有利點在於小的波峰與波谷比率，其大幅的降低負面情況之風險，如噁心及胃腸道併發症。此可協助患者降低注射頻率，同時可對艾塞那肽之血漿濃度及所造成之血液葡萄糖維持最佳控制。

“艾塞那肽”一詞，係指一艾塞那肽激動劑，艾塞那肽類似物，艾塞那肽衍生物，縮短(truncated)之艾塞那肽，縮短之艾塞那肽激動劑，縮短之艾塞那肽衍生物，縮短之艾塞那肽類似物，拉長之艾塞那肽，拉長之艾塞那肽激動劑，拉長之艾塞那肽衍生物，拉長之艾塞那肽類似物，GLP-1，GLP-1類似物，或GLP-1衍生物，如呈醯胺化、縮短或拉長型式之GLP-1或GLP-1類似物。較佳者，該艾塞那肽為序列ID 1至ID 21之艾塞那肽或艾塞那肽激動劑(參見如下)，且較佳者為具有序列ID 2之艾塞那肽-3或具有序列ID 1之艾塞那肽-4。

“拉長”之詞係指胜肽或蛋白質其於其等之N-終端或C-終端具有額外的胺基酸殘基或其具有內部插入。該詞亦係指該胜肽或蛋白質稠合至其他胜肽或蛋白質，如，例如，GST蛋白質，FLAG胜肽，六-組胺酸胜肽，粘合麥芽糖之蛋白質。

本文中所使用之艾塞那肽激動劑之實例為艾塞那肽-3或艾塞那肽-4激動劑，其包括但非侷限於：

(i)　艾塞那肽-4類似物及醯胺化之艾塞那肽-4類似物，於該序列中一個或多個胺基酸殘基已被包括N-終端變異型之不同胺基酸殘基所代替；

(ii)　艾塞那肽-4之縮短及拉長型式及醯胺化之縮短及拉長型式；

(iii)　縮短及拉長之艾塞那肽-4及醯胺化之縮短及拉長型式，於該序列中一個或多個胺基酸殘基已被不同胺基酸殘基所代替；

(iv) GLP-1及醯胺化之GLP-1；

(v) GLP-1-類似物及醯胺化之GLP-1類似物，於該序列中一個或多個胺基酸殘基已被包括N-終端修飾之不同胺基酸殘基所代替；

(vi)　縮短及拉長之GLP-1及醯胺化之縮短及拉長型式；

(vii)　縮短之GLP-1及醯胺化之縮短型式，於該序列中一個或多個胺基酸殘基已被不同胺基酸殘基所代替；

(viii)　已知之物質AVE-0010/ZP-10/利西拉來(Lixisenatide)(Sanofi-Aventis Zealand Pharma；sequence ID 21)，BAY-73-7977(Bayer)，TH-0318，BIM-51077(Ipsen，Tejin，Roche)，NN2211(Novo Nordisk)，LY315902。

上述艾塞那肽激動劑之實例可為那些，其中艾塞那肽-4之類似物係選自包括下列者H-desPro³⁶-艾塞那肽-4-Lys₆-NH₂，H-des(Pro^36,37)-艾塞那肽-4-Lys₄-NH₂及H-des(Pro^36,37)-艾塞那肽-4-Lys₅-NH₂，或其藥理上可容忍的鹽。

上述艾塞那肽激動劑之其他實例可為那些，其中艾塞那肽-4之類似物係選自包括下列者desPro³⁶[Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)，desPro³⁶[IsoAsp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)，desPro³⁶[Met(O)¹⁴,Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)，desPro³⁶[Met(O)¹⁴,IsoAsp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)，desPro³⁶[Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]艾塞那肽-2(1-39)，desPro³⁶[Trp(O₂)²⁵，IsoAsp²⁸]艾塞那肽-2(1-39)，desPro³⁶[Met(O)¹⁴Trp(O₂)²⁵，Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)及desPro³⁶[Met(O)¹⁴Trp(O₂)²⁵，IsoAsp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)，或其藥理上可容忍的鹽。

於前述章節中說明之艾塞那肽激動劑的其他實例可為那些其中該胜肽-Lys₆-NH₂係連接至艾塞那肽-4類似物之C終端。

前述艾塞那肽激動劑的其他實例可為那些其中艾塞那肽-4類似物係選自包含下列者：H-(Lys)₆-des Pro³⁶[Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-Lys₆-NH₂des Asp²⁸Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸艾塞那肽-4(1-39)-NH₂，H-(Lys)₆-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-NH₂，H-Asn-(Glu)₅ des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-NH₂，des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，H-(Lys)₆-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，H-Asn-(Glu)₅-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，H-(Lys)₆-des Pro³⁶[Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-Lys₆-NH₂，H-des Asp²⁸ Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵]艾塞那肽-4(1-39)-NH₂，H-(Lys)₆-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-NH₂，H-Asn-(Glu)₅-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-NH₂，des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，H-(Lys)₆-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，H-Asn-(Glu)₅-des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，H-(Lys)₆-des Pro³⁶[Met(O)¹⁴，Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-Lys₆-NH₂，des Met(O)¹⁴ Asp²⁸ Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸艾塞那肽-4(1-39)-NH₂，H-(Lys)6-des Pro³⁶，Pro³⁷，Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-NH₂，H-Asn-(Glu)₅-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-NH₂，des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，H-(Lys)₆-Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-Lys₆-NH₂，H-Asn-(Glu)₅ des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，H-(Lys)₆- des Pro³⁶[Met(O)¹⁴,Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-Lys₆-NH₂，des Asp²⁸ Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Trp(O₂)²⁵]艾塞那肽-4(1-39)-NH₂，H-(Lys)₆-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Trp(O₂)²⁵，Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-NH₂，H-Asn-(Glu)₅-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-NH₂，des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，H-(Lys)₆-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Trp(O₂)²⁵，Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，H-Asn-(Glu)₅-des Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Met(O)¹⁴,Trp(O₂)²⁵,Asp²⁸]艾塞那肽-4(1-39)-(Lys)₆-NH₂，或其藥理上可容忍的鹽。

如上所述艾塞那肽激動劑之其他實例為Arg³⁴,Lys²⁶(N^ε(γ-谷醯基(N^α-六癸醯基)))GLP-1(7-37)[利拉魯肽(liraglutide)]或其藥理上可容忍的鹽。

艾塞那肽激動劑模擬艾塞那肽-3或艾塞那肽-4之活性，其係藉由結合至於其中艾塞那肽-3或艾塞那肽-4產生有利於作為促胰島素劑及於治療糖尿病的作用之受體上，或藉由模擬艾塞那肽於尿流程、減緩胃空、誘發飽足感、提高尿鈉排出及/或降低尿中鉀濃度之作用，其藉由結合至其中艾塞那肽造成這些效應之受體上。

於一個具體例中，該具有序列ID No：1-22之艾塞那肽或艾塞那肽激動劑可用來製備本發明之長效型聚合接合物：

[Seq ID No：1]艾塞那肽-4

HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG

PSSGAPPPS-NH2

[Seq ID No：2]艾塞那肽-3

HSDGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG

PSSGAPPPS-NH2

[Seq ID No：3]

HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG P

[Seq ID No：4]

HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG Y

[Seq ID No：5]

HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG

[Seq ID No：6]

HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG-NH2

[Seq ID No：7]

HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKN-NH2

[Seq ID No：8]

HGEGTFTSDL SKQLEEEAVR LFIEFLKNGG

PSSGAPPPS-NH2

[Seq ID No：9]

HGEGTFTSDL SKQLEEEAVR LFIEFLKN-NH2

[Seq ID No：10]

HGEGTFTSDL SKQLEEEAVR LAIEFLKN-NH2

[Seq ID No：11]

HGEGTFTSDL SKQLEEEAVR LFIEWLKNGG

PSSGAPPPS-NH2

[Seq ID No：12]

HGDGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG

PSSGAPPPS-NH2

[Seq ID No 13]GLP-1(7-36)醯胺

HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2

[Seq ID No 14]

HSEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2

[Seq ID No 15] GLP-1(7-37)

HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGRG

[Seq ID No 16]

HAXaaGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2

Xaa=P，F，Y

[Seq ID No 17]

HXaaEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2

Xaa=T，a-胺基丁酸，D-Ala，V，Gly

[Seq ID No 18]

HaEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGG

[Seq ID No 19]

R-HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2

R=乙醯基，焦谷醯基，N-2-羥基苯醯基，N-反式-3-己烯醯基

[Seq ID No 20]

HXaaAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2

Xaa=6-胺基-己醯。

[Seq ID No 21] AVE-0010/ZP-10/利西拉來(lixisenatide)

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2

[Seq ID No 22] Arg³⁴，Lys²⁶(N^ε(γ-谷醯基(N^α-六癸醯基)))

GLP-1(7-37)[利拉魯肽]

HAEGTFTSDV SSYLEGQAAXaaEFIAWLVRGRG

Xaa=Lys(N^ε(γ-谷醯基(N^α-六癸醯基)))

較佳者、該艾塞那肽具有序列ID 1、ID 13、ID 15、ID 21或ID 22。

更佳者，該艾塞那肽具有序列ID 1、ID 13或ID 21。

於一個具體例中，該艾塞那肽為具有序列ID 1之艾塞那肽-4。

於另一具體例中，該艾塞那肽為具有序列ID 13之類似物。

於另一具體例中，該艾塞那肽為具有序列ID 21之類似物。

本發明之該艾塞那肽及艾塞那肽激動劑衍生物會具有原始未修飾分子所具有之任何及所有活性，但作用期延長。

連結於非生物活性連接子之艾塞那肽係指稱為“艾塞那肽部份”。

“非生物活性連接子”係指一連接子，其未顯示由生物活性劑所衍生之藥物的藥理功效。

“保護基團”係指一部份其暫時性的於合成法中保護一分子之化學官能基而於隨即之化學反應中得到化學選擇性。醇之保護基團為，例如，苄基及三苯甲基，胺類之保護基團為，例如，第三-丁氧基羰基，9-茀基甲基氧基羰基及苄基且硫醇之保護基團的實例為2,4,6-三甲氧基苄基，苯基硫基甲基，乙醯胺基甲基，對-甲氧基苄基氧基羰基，第三-丁硫基，三苯基甲基，3-硝基-2-吡啶基硫代，4-甲基三苯甲基。

“經保護之官能基團”係指一被保護基團保護之化學官能基團。

“醯化劑”係指具結構R-(C=O)-之部份，其於一醯化反應中提供醯基基團，任意的連接至一釋離基，如醯基氯，N-羥基琥珀醯亞胺，五氟苯酚及對-硝基苯酚。

“烷基”係指直鏈或分支碳鏈。烷基碳之各個氫可被取代基所代替。

“芳基”係指任何由單環或聚環或稠合芳族環所衍生之取代基，包括雜環，如苯基，噻吩，吲哚基，萘基，吡啶基，其可任意的進一步被取代。

“醯基”係指式R-(C=O)-之化學官能基團，其中R為烷基或芳基。

"C1-4烷基"係指具有1至4個碳原子之烷基鏈，例如，如出現於分子之末端：甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基，第二丁基，第三丁基，或如-CH₂-，-CH₂-CH₂-，-CH(CH₃)-，-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH(C₂H₅)-，-C(CH₃)₂-，當分子之兩個部份係藉由烷基基團連接。C_1-4烷基碳之各個氫可被取代基所代替。

"C_1-6烷基"係指具有1至6個碳原子之烷基鏈，例如，如出現於分子之末端：C_1-4烷基，甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基，第二-丁基；第三-丁基，正戊基，正己基，或如-CH₂-，-CH₂-CH₂-，-CH(CH₃)-，-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH(C₂H₅)-，-C(CH₃)₂-，當分子之兩個部份係藉由烷基基團連接。C_1-6烷基碳之各個氫可被取代基所代替。

因此，“C_1-18烷基”係指具有1至18個碳原子之烷基鏈且“C_8-18烷基”係指具有8至18個碳原子之烷基鏈。因此，“C_1-50烷基”係指具有1至50個碳原子之烷基鏈。

“C_2-50烯基”係指具有2至50個碳原子之分支或未分支烯基鏈，例如，如出現於分子之末端：-CH=CH₂，-CH=CH-CH₃，-CH₂-CH=CH₂，-CH=CH-CH₂-CH₃，-CH=CH-CH=CH₂，或如-CH=CH-，當分子之兩個部份係藉由烯基基團連接。C_2-50烯基之各個氫可被進一步說明之取代基所代替。因此，“烯基”一詞係關於含有至少一個碳-碳雙鍵之碳鏈。任意的，可存有一個或多個叁鍵。

“C_2-50炔基”係指具有2至50個碳原子之分支或未分支炔基鏈，例如，如出現於分子之末端：-C≡CH，-CH₂-C≡CH，CH₂-CH₂-C≡CH，CH₂-C≡C-CH₃，或如-C≡C-，當分子之兩個部份係藉由炔基基團連接。C_2-50炔基之各個氫可被進一步說明之取代基所代替。因此，“炔基”一詞係關於含有至少一個碳-碳叄鍵之碳鏈。任意的，可存有一個或多個雙鍵。

"C_3-7環烷基"或"C_3-7環烷基環"係指具有3至7個碳原子之環烷基鏈，其可具有至少部份飽和之碳-碳雙鍵，如環丙基，環丁基，環戊基，環己基，環己烯基，環庚基。環烷基碳之各個氫可被取代基所代替。"C_3-7環烷基"或"C_3-7環烷基環"之詞亦包括橋連二環如原冰片烷或原冰片烯。因此，"C_3-5環烷基"係指具有3至5個碳原子之環烷基。

因此，“C_3-10環烷基”係指具有3至10個碳原子之環烷基，如C_3-7環烷基；環丙基，環丁基，環戊基，環己基，環己烯基，環庚基，環辛基，環壬基，環癸基。“C_3-10環烷基”一詞亦包括至少部份飽和之碳單-及-二環。

"鹵素"係指氟，氯，溴或碘。通常較佳之鹵素為氟或氯。

"4至7員雜環基"或"4至7員雜環"係指具有4，5，6或7個環原子之環，其可含有多至最大數目的雙鍵(芳族或非芳族環，其為完全，部份或不飽和)其中，至少一個環原子多至四個環原子係被一選自包含硫(包括-S(O)-，-S(O)2-)，氧及氮(包括=N(O)-)之雜原子所代替且其中該環係經由碳或氮原子而連接至分子之其餘部份。4至7員雜環之實例為氮雜環丁二烯，坦，噻坦，呋喃，噻吩，吡咯，吡咯啉，咪唑，咪唑啉，吡唑，吡唑啉，唑，唑啉，異唑，異唑啉，噻唑，噻唑啉，異噻唑，異噻唑啉，噻二唑，噻二唑啉，四氫呋喃，四氫噻吩，吡咯啶，咪唑啉，吡唑啶，唑啶，異唑啶，噻唑啶，異噻唑啶，噻二唑啶，烷碸，吡喃，二氫吡喃，四氫吡喃，咪唑啶，吡啶，嗒，吡，嘧啶，六氫吡，六氫吡啶，嗎福啉，四唑，三唑，三唑啶，四唑啶，二吖半(diazepane)，氮雜或高六氫吡。

"9至11員雜二環基"或"9至11員雜環"係指具有9至11個環原子之雜環系，其中至少一個環原子係共享兩個環且其可含有多至最大數目之雙鍵(芳族或非芳族環，其為完全，部份或不飽和)其中至少一個環原子多至六個環原子係被一選自包含硫(包括-S(O)-，-S(O)2-)，氧及氮(包括=N(O)-)之雜原子所代替且其中該環係經由碳或氮原子而連接至分子之其餘部份。9至11員雜環之實例為吲哚，吲哚啉，苯並呋喃，苯並噻吩，苯並唑，苯並異唑，苯並噻唑，苯並異噻唑，苯並咪唑，苯並咪唑啉，喹啉，喹唑啉，二氫喹唑啉，喹啉，二氫喹啉，四氫喹啉，十氫喹啉，異喹啉，十氫異喹啉，四氫異喹啉，二氫異喹啉，苯並氮雜，嘌啉或蝶啶。9至11員雜環一詞亦包括二環之螺結構如1,4-二-8-氮雜螺[4.5]癸烷或橋連雜環基如8-氮雜-二環[3.2.1]辛烷。

於含有根據式(I)之化合物之艾塞那肽前藥含有一個或多個酸性或鹼性基團之情況時，本發明亦包括其等之相對應之製藥上或毒物藥理學上可接受的鹽類，特別為其等之製藥上可利用的鹽類。因此，該包括式(I)化合物之艾塞那肽前藥，其含有酸性基團，可根據本發明來使用，例如，作為鹼金屬鹽類，鹼土金屬鹽類或作為銨鹽類。此等鹽類之更精確實例包括鈉鹽，鉀鹽，鈣鹽，鎂鹽或與氨或有機胺之鹽類如，例如，乙胺，乙醇胺，三乙醇胺或胺基酸。包含式(I)化合物之艾塞那肽前藥，其含有一個或多個鹼性基團，亦即基團其可被質子化，可根據本發明以其等與無機或有機酸之加成鹽類的型式呈現或使用。適當酸之實例包括氫氯酸，氫溴酸，磷酸，硫酸，硝酸，甲烷磺酸，對甲苯磺酸，萘二磺酸，草酸，醋酸，酒石酸，乳酸，水楊酸，苯甲酸，甲酸，丙酸，特戊酸，二乙基醋酸，丙二酸，琥珀酸，庚二酸，富馬酸，馬來酸，蘋果酸，胺基磺酸，苯基丙酸，葡糖酸，抗壞血酸，異菸鹼酸，檸檬酸，己二酸，及精於此方面技藝者所已知之其他酸。如果包含式(I)化合物之艾塞那肽前藥於分子中同時含有酸性及鹼性基團，本發明亦包括，除了已提及之鹽型式，內鹽或甜菜鹼(兩性離子)。根據包含式(I)之艾塞那肽前藥之各別鹽類可藉由精於此方面技藝者所熟知之習用方法獲得如，例如藉由將其等與有機或無機酸或鹼於一溶劑或分散劑中接觸，或藉由與其他鹽類之陰離子交換或陽離子交換。本發明亦包括包含式(I)化合物之艾塞那肽前藥的所有鹽類其，由於低的生理包容性，並不適合直接用於製藥而其可用作為，例如，化學反應或製藥上可接受之鹽類之製備時的中間體。

為了加強藥物，如艾塞那肽，於生體內之物化或藥物動力特性，此等藥物可與載體接合。如果該藥物係瞬間連結至載體及/或連接子，此等系統通常係指稱為連接載體之前藥。根據IUPAC所提供之定義(如http：//www.chem.qmul.ac.uk/iupac. medchem給予，於July 22，2009存取)，連接載體之前藥為一含有給定之含有瞬態載體基團之活性物質的暫時連接之前藥，其產生改良之物化或藥物動力學特點且可容易於活體內移除，通常藉由水解裂離。

於此連接載體之前藥中使用之連接子係瞬態的，係指其等在生理條件下(水性緩衝液於pH 7.4，37℃)為非-可酶解水解可降解(可裂離)，其半生期範圍為例如1小時至3個月。

該水凝膠載體可直接接合至該連接子L或經由一間隔子，較佳為不可裂離之間隔子。“艾塞那肽水凝膠前藥”之詞係指艾塞那肽之連接載體之前藥，其中該載體為一水凝膠。“水凝膠前藥”及“連接水凝膠之前藥”之詞係指生物活性劑之前藥瞬間連接至水凝膠且使用上同義。

“水凝膠”可定義為能夠攜帶大量水份之立體、親水性或兩性聚合網絡。該網絡包括均聚物或共聚物，因存在有共價化學或物理(離子性，疏水性交互作用，糾結)交聯而為不溶性。該交聯提供了網絡結構及物理完整性。水凝膠與水具有熱力學相容性其允許其等於水性介質中膨脹。該網絡之鏈係以此等方式連結使得存有孔洞且相當大部份之此等孔洞的直徑係介於1毫微米及1000毫微米之間。

藥物之“游離型式”係指一藥物，尤其是艾塞那肽，呈其未經修飾、藥理活性型式，如由聚合物接合物釋出後之型式。

應瞭解艾塞那肽之藥理活性型式亦包括氧化及去醯胺化之藥。

"藥物"，"生物活性分子"，"生物活性部份"，"生物活性劑"，"活性劑"之詞，係同義使用且係指艾塞那肽，或為其束縛型式或為游離型式。

本文中艾塞那肽之"治療有效量"係指足以治療，減輕或部份阻止一既定疾病之臨床表現及其併發症的量。足以完成此之量係定義為"治療有效量"。每一目的之有效量將依據疾病或傷害之嚴重性以及個體之體重及一般狀態而定。應瞭解確定適當劑量可使用例行試驗，藉由建構有用之基質並於基質之不同點測試來達成，其均在訓練有素之醫生的一般技能範圍內。

“穩定”及“穩定性”係指於所提及之儲存時間內該水凝膠接合物仍接合且未水解至相當程度且相關於艾塞那肽展現一可接受的不純態樣。考量穩定時，該組成物含有少於5%呈其游離型式之藥物。

“製藥上可接受的”之詞係指由管理機構如EMEA(歐洲)及/或FDA(美國)及/或任何其他用於動物，較佳為於人類之國家管理機構認可。

"製藥組成物"或“組成物”係指一個或多個活性組成份，及一個或多個惰性組成份，以及任何產物，其係直接或間接由含任何兩個或更多組成份之組合物、絡合物或聚合物產生，或由一個或多個組成份之解離產生，或由反應或一個或多個組成份之交互作用的其他式樣產生。因此，本發明之製藥組成物包含任何組成物，其係藉由將本發明化合物與製藥上可接受的賦形劑(製藥上可接受的載體)掺合而製成。

“乾性組成物”係指該艾塞那肽水凝膠前藥組成物於容器中係呈乾燥型式。乾燥之適當方法為噴乾及冷凍乾燥(凍乾)。此等艾塞那肽水凝膠前藥之乾性組成物之殘留水含量最高為10%，較佳為少於5%且更佳為少於2%(根據Karl Fischer來確定)。較佳之乾燥法為冷凍乾燥。“凍乾之組成物”係指首先冷凍該艾塞那肽水凝膠聚合物前藥組成物且隨即藉由減壓予以除水。此用語未排除其他將組成物填充至最終容器之前發生於製作過程中的乾燥步驟。

“冷凍乾燥”(凍乾)為一脫水過程，其特點在於將組成物冷凍且然後降低周圍.壓力且，任意的，加熱使組成物中之冷凍水直接由固相昇華為氣相。典型的，將該昇華的水藉由凝華而收集。

“重組”係指將液體添加至乾性組成物中使其成為液體或懸浮組成物之型式。應瞭解該詞“重組”非侷限於添加水，而係指可添加任何液體，包括例如緩衝液或其他水性溶液。

“重組溶液”係指於給藥至需要的患者之前用來重組該艾塞那肽水凝膠前藥之乾性組成物之液體。

“容器”係指任何容器，其中該艾塞那肽水凝膠前藥組成物係包含於其中且可儲存直到重組。

“緩衝液”或“緩衝劑”係指將pH維持於想要範圍之化合物。生理上可容忍之緩衝液為，例如，磷酸鈉，琥珀酸鹽，組胺酸，碳酸氫鹽，檸檬酸鹽及醋酸鹽，丙酮酸鹽。亦可使用制酸劑如Mg(OH)₂或ZnCO₃。可將緩衝力調整至符合對pH穩定性最為敏感之條件。

“賦形劑”係指與治療劑一起投藥之化合物，例如，緩衝劑，等張性調整劑，防腐劑，穩定劑，抗吸附劑，氧化保護劑，或其他輔助劑。然而，於某些情形時，一個賦形劑可具有兩個或三個功能。

"冷凍保護劑"為一分子，當其與感興趣的蛋白質合併時，明顯的避免或降低蛋白質通常於乾燥且尤其是於冷凍乾燥期間且隨即於儲藏時之化學及/或物理不穩定性。冷凍保護劑之實例包括糖，如蔗糖或海藻糖；胺基酸如精胺酸，甘胺酸，谷胺酸或組氨酸；甲基胺如甜菜鹼；易溶的鹽如硫酸鎂；多元醇如三價或更高價之糖醇，如甘油，赤蘚糖醇，丙三醇，阿糖醇，木糖醇，山梨糖醇，及甘露糖醇；乙二醇；丙二醇；聚乙二醇；普朗尼克(pluronics)；羥基烷基澱粉，如羥基乙基澱粉(HES)，及其組合物。

“表面活化劑”係指能降低液體表面張力之濕潤劑。

“等張性調整劑”係指使由於注射儲積物之滲透壓差異之細胞受損所造成的疼痛減至最小之化合物。

“穩定劑”之詞係指用來穩定聚合物前藥之化合物。穩定係藉由強化穩定蛋白質之力，藉由使變性狀態不穩定，或藉由直接將賦形劑黏合至蛋白質而達成。

“抗吸附劑”主要係指離子性或非離子性用來完全包敷或吸附至組成物之容器內表面的表面活性劑或其他蛋白質或可溶性聚合物。所選擇之賦形劑濃度及型式係依據所要避免之效果而定但典型的係於CMC值正上方之界面形成單層表面活性劑。

“氧化保護劑”係指抗氧化劑，如抗壞血酸，四氫嘧啶，穀胱甘肽，蛋胺酸，單硫代丙三醇，莫林(morin)，聚乙烯亞胺(PEI)，沒食子酸丙酯，維生素E，螯合劑如檸檬酸，EDTA，六磷酸鹽，硫代乙醇酸。

“抗微生物劑”係指一化學物質，其殺死或抑制微生物生長，如細菌，黴菌，酵母菌，原生動物及/或破壞病毒。

“密封一容器”係指該容器係以此方式封閉使其為氣密，使得外面與裡面之間沒有氣體交換並保持內容物無菌。

“試劑(reagent)”或“先質”之詞係指一於製造本發明前藥之製程中使用之中間體或起始物質。

“化學官能基團”之詞係指羧酸及活性衍生物，胺基，馬來醯亞胺，硫醇及衍生物，磺酸及衍生物，碳酸化物及衍生物，胺基甲酸化物及衍生物，羥基，醛，酮，肼，異氰酸化物，異硫代氰酸化物，磷酸及衍生物，膦酸及衍生物，鹵乙醯，鹵代烴，丙烯醯及其他-β未經取代之邁克爾受體，芳基化劑如芳基氟化物，羥基胺，二硫化物如吡啶二硫化物，乙烯基碸，乙烯基酮，重氮鏈烷，重氮乙醯化合物，環氧乙烷，及氮丙啶。

如果一化學官能基團係偶合至另一個化學官能基團，所產生之化學結構係指稱為“鍵結(linkage)”。例如，胺基團與羧基基團之反應產生醯胺鍵結。

“反應性官能基團”為主幹部份之化學官能基團，其係連結至該超支化部份。

“官能基團”為“反應性官能基團”，“可降解之交聯官能基團”，或“接合官能基團”之集合名詞。

“可降解之交聯(interconnected)官能基團”為一連接，其包括生物可降解之鍵，其一方面被視為連結至連接主幹部份之一間隔子部份且另一方面被視為連結至交聯部份。“可降解之交聯官能基團”，“生物可降解之交聯官能基團”，“交聯生物可降解之官能基團”及“交聯官能基團”之詞係同義使用。

“阻斷基團”或“封包基團”之詞係同義使用且係指一部份，其係不可逆轉的連結至反應性官能基團，使得其等不能與例如化學官能基團進行反應。

“保護基團”或“保護性基團”之詞係指一部份，其係不可逆的連結至反應性官能基團，使得其等不能與例如化學官能基團進行反應。

“可交聯之官能基團”之詞係指化學官能基團，其參與於基團聚合反應且為交聯試劑或主幹試劑之部份。

“可聚合之官能基團”之詞係指化學官能基團，其參與於接合-型式之聚合反應且為該交聯試劑及主幹試劑之部份。

一主幹部份可包括一間隔子部份，其於一端連結至主幹部份且另一端連結至交聯部份。

“衍生物”之詞係指化學官能基團，其適當的被保護及/或活化基團所取代或為相對應之化學官能基團之活化型式，其係精於此方面技藝者所已知。例如，羧基基團之活化型式包括但非侷限於活性酯，如琥珀醯亞胺酯，苯並三唑酯，硝基苯基酯，五氟苯基酯，氮雜苯並三唑酯，醯基鹵，掺合或對稱的酐，醯基咪唑。

“非可酶解之可裂離連接子(linker)”之詞係指在生理條件下不具酶活性之水解可降解的連接子。

“非生物活性連接子”係指連接子，其未顯示由生物活性部份衍生之藥物(D-H)之藥理作用。

“間隔子(spacer)”，“間隔基團”，“間隔分子”，及“間隔部份”之詞可互換使用且如用來說明本發明水凝膠載體中出現之部份，係指適於連接兩個部份之任何部份，如C_1-50烷基，C_2-50烯基或C_2-50炔基，該片段係任意被一個或多個選自下列之基團插入：-NH-，-N(C_1-4烷基)-，-O-，-S-，-C(O)-，-C(O)NH-，-C(O)N(C_1-4烷基)-，-O-C(O)-，-S(O)-，-S(O)₂-，4至7員雜環基，苯基或萘基。

“終端”，“終點”或“末端”之詞係指於分子或部份中之官能基團或連接的位置，其中此等官能基團可為一化學官能基團且該連接可為可降解或永久連接，其特點在於位於鄰接或在兩個部份之間的連接內或位於齊聚或聚合鏈之終端。

“於束縛型式”或“部份(moiety)”之片語係指為一較大分子之一部份的次結構。“於束縛型式”之片語係用來藉由命名或明列試劑而簡化對部份之參考，起始物質或假想起始物質為技藝所熟知，且因此“於束縛型式”係指例如一個或多個氫基(-H)，或一個或多個活化或保護基團出現於試劑中或起始物質並未出現於部份。

應瞭解所有包含聚合部份的試劑及部份係指已知關於分子量，鏈長或聚合程度，或官能基團數目具有變異之大分子實體。因此，主幹試劑，主幹部份，交聯試劑，及交聯劑部份之所示結構僅為代表性實例。

試劑或部份可為線形或分支。倘若試劑或部份具有兩個終端基團，其係指稱為線形試劑或部份。倘若試劑或部份具有多於兩個終端基團，其被認為是分支或複數-官能試劑或部份。

“以聚(乙二醇)為主之聚合鏈”或“以PEG為主之鏈”之詞係指寡-或聚合物之分子鏈。

較佳者，此等以聚(乙二醇)為主之聚合鏈係連接至分支核，其為線形聚(乙二醇)鏈，其中一個終端係連接至分支核且另一個係連接至超支化分枝部份。應瞭解的是以PEG為主之鏈可被任意地經雜原子及化學官能基取代之烷基或芳基基團終止或插入。

如果“以聚(乙二醇)為主之聚合鏈”之詞係使用於有關交聯試劑時，其係指包含至少20重量%乙二醇部份之交聯劑部份或鏈。

本發明係更詳細的說明於下列章節中。

本發明係關於一前藥或其製藥上可接受的鹽，其包含艾塞那肽連接子接合物D-L，其中D代表艾塞那肽部份；且-L為一以式(I)代表之非生物活性連接子部份-L¹，

其中，該虛線係指藉由形成醯胺鍵而連接至艾塞那肽之胺基基團之一；R¹係選自C_1-4烷基，較佳為CH₃；R²，R^2a係獨立選自由H及C_1-4烷基組成群組之基團；其中L¹係被一個L²-Z所取代且任意的再被取代，但於式(I)中該以星號標記之氫未被取代基代替且其中L²為單化學鍵或一間隔子；且Z為水凝膠。

較佳者，於式(I)中，R²係被L²-Z代替。

較佳者，於式(I)中，R¹為CH₂-L²-Z。

較佳者，L¹未再被取代。

較佳者，該艾塞那肽部份係經由N-終端氮或經由艾塞那肽部份之離胺酸鏈之氮而連接至L¹。最佳者，該艾塞那肽部份係經由N-終端氮而連接至L¹。

本發明之較佳前藥包含艾塞那肽連接子接合物D-L，其中L係藉式(Ia)或(Ib)代表：

其中D，R¹，R²，R^2a，L²，Z具有此處說明之定義及較佳之定義且其中L係任意的再被取代，但於式(Ia)或(Ib)中以星號標記之氫未被一取代基所代替，然而較佳為L未進一步被取代(除了已顯示於(Ia)及(Ib)之經設定的取代基L²-Z)。

如式(Ia)或(Ib)所示，式(I)中L¹中之一個氫被基團L²-Z所取代。

通常，L²可連接至式(I)中於任何位置之L¹除了以星號標記之氫的取代之外。較佳者，R¹，R²，R^2a提供之氫中之一個係直接或為C_1-4烷基或其他基團之氫被L²-Z所代替。

再者，於式(I)中之L¹可任意的再被取代。通常，可使用任何取代基，只要裂解未受影響。然而，較好L¹未進一步被取代。

較佳者，一個或多個其他任意取代基係獨立選自包含下列之基團：鹵素；CN；COOR⁹；OR⁹；C(O)R⁹；C(O)N(R⁹R^9a)；S(O)₂N(R⁹R^9a)；S(O)N(R⁹R^9a)；S(O)₂R⁹；S(O)R⁹；N(R⁹)S(O)₂N(R^9aR^9b)；SR⁹；N(R⁹R^9a)；NO₂；OC(O)R⁹；N(R⁹)C(O)R^9a；N(R⁹)S(O)₂R^9a；N(R⁹)S(O)R^9a；N(R⁹)C(O)OR^9a；N(R⁹)C(O)N(R^9aR^9b)；OC(O)N(R⁹R^9a)；T；C_1-50烷基；C_2-50烯基；或C_2-50炔基，其中T；C_1-50烷基；C_2-50烯基；及C_2-50炔基係任意的被一個或多個R¹⁰所取代，其為相同或不同且其中C_1-50烷基；C_2-50烯基；及C_2-50炔基係任意被一個或多個選自包含下列之基團插入：T，-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R¹¹)-；-S(O)₂N(R¹¹)-；-S(O)N(R¹¹)-；-S(O)₂-；-S(O)-；-N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a)-；-S-；-N(R¹¹)-；-OC(O)R¹¹；-N(R¹¹)C(O)-；-N(R¹¹)S(O)₂-；-N(R¹¹)S(O)-；-N(R¹¹)C(O)O-；-N(R¹¹)C(O)N(R^11a)-；及-OC(O)N(R¹¹R^11a)；R⁹，R^9a，R^9b係獨立選自包含下列之基團：H；T；及C_1-50烷基；C_2-50烯基；或C_2-50炔基，其中T；C_1-50烷基；C_2-50烯基；且C_2-50炔基係任意的被一個或多個R¹⁰所取代，其為相同或不同且其中C_1-50烷基；C_2-50烯基；及C_2-50炔基係任意的被一種或多種選自包括下列之基團插入：T，-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R¹¹)-；-S(O)₂N(R¹¹)-；-S(O)N(R¹¹)-；-S(O)₂-；-S(O)-；-N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a)-；-S-；-N(R¹¹)-；-OC(O)R¹¹；-N(R¹¹)C(O)-；-N(R¹¹)S(O)₂-；-N(R¹¹)S(O)-；-N(R¹¹)C(O)O-；-N(R¹¹)C(O)N(R^11a)-；及-OC(O)N(R¹¹R^11a)；T係選自包含苯基；萘基；茚基；氫茚基；萘滿基；C_3-10環烷基；4至7員雜環基；或9至11員雜二環基之基團，其中T係任意被一個或多個R¹⁰所取代，其為相同或不同；R¹⁰為鹵素；CN；酮基(=O)；COOR¹²；OR¹²；C(O)R¹²；C(O)N(R¹²R¹²a)；S(O)₂N(R¹²R¹²a)；S(O)N(R¹²R¹²a)；S(O)₂R¹²；S(O)R¹²；N(R¹²)S(O)₂N(R^12aR^12b)；SR¹²；N(R¹²R^12a)；NO₂；OC(O)R¹²；N(R¹²)C(O)R^12a；N(R¹²)S(O)₂R^12a；N(R¹²)S(O)R^12a；N(R¹²)C(O)OR^12a；N(R¹²)C(O)N(R^12aR^12b)；OC(O)N(R¹²R^12a)；或C_1-6烷基，其中C_1-6烷基係任意被一個或多個鹵素所取代，其為相同或不同；R¹¹，R^11a，R¹²，R^12a，R^12b係獨立選自包含H；或C_1-6烷基之基團，其中C_1-6烷基係任意被一個或多個鹵素所取代，其為相同或不同。

“插入”之詞係指一基團插入兩個碳之間或於碳鏈末端之碳及氫之間。

L²為單化學鍵或一間隔子。當L²為一間隔子，其較佳係定義為一個或多個定義如前之任意取代基，但L²係被Z所取代。

因此，當L²不為單化學鍵時，L²-Z為COOR⁹；OR⁹；C(O)R⁹；C(O)N(R⁹R^9a)；S(O)₂N(R⁹R^9a)；S(O)N(R⁹R^9a)；S(O)₂R⁹；S(O)R⁹；N(R⁹)S(O)₂N(R^9aR^9b)；SR⁹；N(R⁹R^9a)；OC(O)R⁹；N(R⁹)C(O)R^9a；N(R⁹)S(O)₂R^9a；N(R⁹)S(O)R^9a；N(R⁹)C(O)OR^9a；N(R⁹)C(O)N(R^9aR^9b)；OC(O)N(R⁹R^9a)；T；C_1-50烷基；C_2-50烯基；或C_2-50炔基，其中T；C_1-50烷基；C_2-50烯基；及C_2-50炔基係任意被一個或多個R¹⁰所取代，其為相同或不同且其中C_1-50烷基；C_2-50烯基；且C_2-50炔基係任意被一個或多個選自包含下列之基團插入：-T-，-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R¹¹)-；-S(O)₂N(R¹¹)-；-S(O)N(R¹¹)-；-S(O)₂-；-S(O)-；-N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a)-；-S-；-N(R¹¹)-；-OC(O)R¹¹；-N(R¹¹)C(O)-；-N(R¹¹)S(O)₂-；-N(R¹¹)S(O)-；-N(R¹¹)C(O)O-；-N(R¹¹)C(O)N(R^11a)-；及-OC(O)N(R¹¹R^11a)；R⁹，R^9a，R^9b係獨立選自由下列組成的群組：H；Z；T；及C_1-50烷基；C_2-50烯基；或C_2-50炔基，其中T；C_1-50烷基；C_2-50烯基；且C_2-50炔基係任意被一個或多個R¹⁰所取代，其為相同或不同且其中C_1-50烷基；C_2-50烯基；且C_2-50炔基係任意被一個或多個選自包含下列之基團插入：T，-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R¹¹)-；-S(O)₂N(R^11a)-；-S(O)N(R¹¹)-；-S(O)₂-；-S(O)-；-N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a)-；-S-；-N(R¹¹)-；-OC(O)R¹¹；-N(R¹¹)C(O)-；-N(R¹¹)S(O)₂-；-N(R¹¹)S(O)-；-N(R¹¹)C(O)O-；-N(R¹¹)C(O)N(R^11a)-；及-OC(O)N(R¹¹R^11a)；T係選自包含下列之基團：苯基；萘基；茚基；氫茚基；萘滿基；C_3-10環烷基；4至7員雜環基；或9至11員雜二環基，其中T係任意被一個或多個R¹⁰所取代，其為相同或不同；R¹⁰為Z；鹵素；CN；酮基(=O)；COOR¹²；OR¹²；C(O)R¹²；C(O)N(R¹²R^12a)；S(O)₂N(R¹²R^12a)；S(O)N(R¹²R^12a)；S(O)₂R¹²；S(O)R¹²；N(R¹²)S(O)₂N(R^12aR^12b)；SR¹²；N(R¹²R^12a)；NO₂；OC(O)R¹²；N(R¹²)C(O)R^12a；N(R¹²)S(O)₂R^12a；N(R¹²)S(O)R^12a；N(R¹²)C(O)OR^12a；N(R¹²)C(O)N(R^12aR^12b)；OC(O)N(R¹²R^12a)；或C_1-6烷基，其中C_1-6烷基係任意被一個或多個鹵素所取代，其為相同或不同；R¹¹，R^11a，R¹²，R^12a，R^12b係獨立選自包含下列之基團：H；Z；或C_1-6烷基，其中C_1-6烷基係任意被一個或多個鹵素所取代，其為相同或不同；但R⁹，R^9a，R^9b，R¹⁰，R¹¹，R^11a，R¹²，R^12a，R^12b中之一個為Z。

更佳者，L²為C_1-20烷基鏈，其任意被一個或多個獨立選自下列之基團插入：-O-；及C(O)N(R^3aa)；任意被一個或多個獨立選自下列之基團所取代：OH；及C(O)N(R^3aaR^3aaa)；且其中R^3aa，R^3aaa係獨立選自包含H；及C_1-4烷基之基團。

較佳者，L²之分子量範圍為由14克/莫耳至750克/莫耳。

較佳者，L²係經由下列之終端基團而連接至Z：

當L²具有此等終端基團時，L²於不含此終端基團時更宜具有由14克/莫耳至500克/莫耳計算值之分子量。

較佳者，該於連接子及Z之間所形成的共價連接為永久鍵。

較佳者，該水凝膠Z為生物可降解之以聚(乙二醇)(PEG)為主之水不溶性水凝膠。本文中應瞭解該詞“以PEG為主”係指於水凝膠中之PEG鏈的重量比為至少10%重量，較佳為至少25%，以水凝膠總重計。其餘可由其他間隔子及/或寡聚物或聚合物，如寡-或聚離胺酸組成。

再者，“水不溶性”之詞係指可由水凝膠膨脹之三度空間交聯分子網。該水凝膠，如懸浮於大量水或生理滲透壓之水性緩衝液中，佔有大量水，如，以每重量基準計多至10-倍重量，且因此為可膨脹但於移除多於水之後，仍維持一凝膠及一形狀之物理穩定性。此形狀可為任何幾何型且應瞭解此等個別水凝膠物體被視為含有組成份之單一分子，其中各個組成份係與各個其他組成份經由化學鍵連接。

根據本發明，該水凝膠包括可藉由水解可降解之鍵交聯的主幹部份。較佳者，該水凝膠為包含主幹部份之以PEG為主之水凝膠。

較佳者，L²係連接至主幹部份。

較佳者，該主幹部份之分子量係在由1 kDa至20 kDa之範圍間，更佳為由1 kDa至15 kDa且又更佳為由1 kDa至10 kDa。該主幹部份較佳為包含一個或多個PEG鏈之以PEG為主者。

於一攜有根據本發明之艾塞那肽-連接子接合物的水凝膠中，主幹部份之特點為若干官能基團，其包括交聯生物可降解之官能基團及連接水凝膠之藥物連接子接合物，及任意的封包基團。其意謂主幹部份之特點為若干連接水凝膠之藥物連接子接合物；官能基團，其包含生物可降解之交聯官能基團；及任意的封包基團。較佳者，交聯生物可降解之官能基團及藥物連接子接合物及封包基團之總數為16-128，較佳為20-100，更佳為24-80且最佳為30-60。

較佳者，交聯官能基團及連接水凝膠之藥物連接子接合物及主幹部份之封包基團之總數係用以PEG為主由分枝核延伸之聚合鏈的數目來均分。例如，如果其等為32個交聯官能基團及連接水凝膠之藥物連接子接合物及封包基團，該四個以PEG為主由核延伸之聚合鏈每個係提供八個基團，較佳者係藉由連接至每個以PEG為主之聚合鏈之終端的分枝部份。或者，八個以PEG為主由該核延伸之聚合鏈每個可提供四個基團，或十六個以PEG為主之聚合鏈每個提供兩個基團。倘若以PEG為主由分枝核延伸之聚合鏈的數目不允許平均分配，較佳為於每個以PEG為主之聚合鏈中該交聯官能基團及連接水凝膠之藥物連接子接合物及封包基團之總數之平均數的偏差係維持至最小。

於此等根據本發明之連接載體之前藥中，想要的是幾乎所有的藥物釋出(>90%)之發生係在顯著量之主幹部份(<10%)之釋出發生之前。其可藉由調整連接載體之前藥之半生期相對於根據本發明之水凝膠之降解動力學而達成。

優先的，主幹部份之特點在於具有分支核，由此，至少三個以PEG為主之聚合鏈拉長。因此，於本發明之較佳方面中，主幹試劑包含分支核，由此，至少三個以PEG為主之聚合鏈拉長。此等分支核可包含於束縛型式之聚-或寡醇，較佳為季戊四醇，三季戊四醇，六甘油，蔗糖，山梨糖醇，果糖，甘露糖醇，葡萄糖，纖維素，直鏈澱粉，澱粉，羥基烷基澱粉，聚乙烯基醇，葡聚糖，玻尿酸(hyualuronans)，或分支核可包含於束縛型式之聚-或寡胺類如鳥胺酸，二胺基丁酸，三離胺酸，四離胺酸，五離胺酸，六離胺酸，七離胺酸，八離胺酸，九離胺酸，十離胺酸，十一離胺酸，十二離胺酸，十三離胺酸，十四離胺酸，十五離胺酸或寡離胺酸，聚乙烯亞胺，聚乙烯胺。

較佳者，該分支核延伸3至16個以PEG為主之聚合鏈，更佳為四至八個。較佳之分支核可包含於束縛型式之季戊四醇，鳥胺酸，二胺基丁酸，三離胺酸，四離胺酸，五離胺酸，六離胺酸，七離胺酸或寡離胺酸，低分子量PEI，六甘油，三季戊四醇。較佳者，該分支核延伸3至16個以PEG為主之聚合鏈，更佳為四至八個。較佳者，以PEG為主之聚合鏈為直鏈聚(乙烯乙二醇)鏈，其中一端係連接至該分支核且另一端係連接至超支化分枝部份。應瞭解的是聚合之以PEG為主之鏈可被任意地經雜原子及化學官能基團取代之烷基或芳基基團而終止或插入。

較佳者，以PEG為主之聚合鏈為適當經取代之聚(乙二醇)衍生物(以PEG為主)。

含於主幹部份之相對應之以PEG為主由分支核延伸之聚合鏈的較佳結構為複數臂PEG衍生物如，例如，詳見JenKem Technology，USA之產物清單(於July 28，2009由www.jenkemusa.com下載存取)，4臂PEG衍生物(季戊四醇核)，8臂PEG衍生物(六甘油核)及8臂PEG衍生物(三季戊四醇核)。最佳為4臂PEG胺(季戊四醇核)及4臂PEG羧基(季戊四醇核)，8臂PEG胺(六甘油核)，8臂PEG羧基(六甘油核)，8臂PEG胺(三季戊四醇核)及8臂PEG羧基(三季戊四醇核)。於主幹部份中此等複數臂PEG-衍生物之較佳分子為1 kDa至20 kDa，更佳為1 kDa至15 kDa且再更佳為1 kDa至10 kDa。

應瞭解上述複數臂分子之終端胺基團係以束縛型式出現於主幹部份以進一步提供主幹部份之交聯官能基團及反應性官能基團。

較佳者為主幹部份之交聯官能基團及反應性官能基團之總數係被以PEG為主由分支核延伸之聚合鏈的數目來均分。如果以PEG為主由分支核延伸之聚合鏈的數目不允許平均分配，較佳為每個以PEG為主之聚合鏈之交聯及反應性官能基團之總數的平均數的偏差係維持至最小。

更佳者，主幹部份之交聯及反應性官能基團之總合係藉由以PEG為主由分支核延伸之聚合鏈之數目來均分。例如，如有32個交聯官能基團及反應性官能基團，4個以PEG為主由分支核延伸之聚合鏈可各自提供8個基團，較佳者藉由分枝部份連接至各自以PEG為主之聚合鏈的終端。或者，8個以PEG為主由分支核延伸之聚合鏈可各自提供4個基團或16個以PEG為主之聚合鏈可各自提供兩個基團。

此等額外之官能基團可由分枝部份提供。較佳者，各個分枝部份之分子量係在由0.4 kDa至4 kDa之範圍，更佳為0.4 kDa至2 kDa。較佳者，各個分枝部份具有至少3個分枝及至少4個反應性官能基團，及至多63個分枝及64個反應性官能基團，較佳為至少7個分枝及至少8個反應性官能基團及至多31個分枝及32個反應性官能基團。

此等較佳分枝部份之實例包括於束縛型式之三離胺酸，四離胺酸，五離胺酸，六離胺酸，七離胺酸，八離胺酸，九離胺酸，十離胺酸，十一離胺酸，十二離胺酸，十三離胺酸，十四離胺酸，十五離胺酸，十六離胺酸，十七離胺酸，十八離胺酸，十九離胺酸。此等較佳分枝部份之實例包括於束縛型式之三離胺酸，四離胺酸，五離胺酸，六離胺酸，七離胺酸，最佳為於束縛型式之三離胺酸，五離胺酸或七離胺酸，鳥胺酸，二胺基丁酸。

最佳者，本發明之水凝膠載體之特點在於該主幹部份具有式C(A-Hyp)₄之四元碳，其中每個A係獨立為以聚(乙二醇)為主之聚合鏈終端藉由永久共價鍵而連接至四元碳及以PEG為主之聚合鏈之末端係共價結合至分枝部份Hyp，各個分枝部份Hyp具有至少四個官能基團代表交聯官能基團及反應性官能基團。

較佳者，每個A係獨立選自式-(CH₂)_n1(OCH₂CH₂)_nX-，其中n1為1或2；n為由5至50之整數；且X為共價連接A及Hyp之化學官能基團。

較佳者，A及Hyp係藉由醯胺連接而共價連接。

較佳者，該分枝部份Hyp為一超支化聚胜肽。較佳者，該超支化聚胜肽包括於束縛型式之離胺酸。較佳者，每個分枝部份Hyp之分子量係在由0.4 kDa至4 kDa之範圍。應瞭解主幹部份C(A-Hyp)4可含有相同或不同之分枝部份Hyp且每個Hyp可獨立選擇。每個部份Hyp含有5個及32個間之離胺酸，較佳者含有至少7個離胺酸，亦即每個部份Hyp係包含5個及32個間於束縛型式之離胺酸，較佳者包含7個於束縛型式之離胺酸。最佳者，Hyp係包含七離胺醯。

可聚合之官能基團與主幹試劑之反應，更明白言為Hyp與以聚(乙二醇)為主之交聯試劑之可聚合之官能基團的反應產生永久之醯胺鍵。

較佳者，C(A-Hyp)4之分子量係在由1 kDa至20 kDa之範圍，更佳為1 kDa至15 kDa且再更佳為1 kDa至10 kDa。

一種較佳之主幹部份係示於下，虛線係指交聯生物可降解之連接至交聯劑部份且n為由5至50之整數：

根據本發明之該水凝膠的生物可降解性係藉由引進水解可降解之鍵來達成。

於本發明內文中，“水解可降解之”，“生物可降解之”或“水解可裂離”，“自動可裂離”，或“自我裂離”，“自我可裂離”，“瞬態”或“暫時”之詞係指鍵及連接，其於生理條件下(水性緩衝液於pH 7.4，37℃)為非-酶解水解可降解或可裂離，其半生期範圍係由一小時至三個月，包括，但非侷限於，烏頭基類(aconityls)，乙縮醛，醯胺類，羧酸酐，酯類，亞胺，腙，馬來醯胺酸醯胺，原酸酯，磷醯胺，磷酯，磷矽烷基酯，矽烷基酯，磺酸酯，芳族胺基甲酸酯，其等之組合等。

如果以可降解之交聯官能基團出現於根據本發明之水凝膠，較佳之生物可降解之連接為羧酸酯，碳酸酯，磷酸酯及磺酸酯且最佳為羧酸酯或碳酸酯。

永久性連接於生理條件下(水性緩衝液於pH 7.4，37℃)為非酶解水解可降解，其半生期為六個月或更長，如，例如，醯胺類。

為了將水解可裂離之鍵引至本發明之水凝膠載體中，該主幹部份可直接藉由生物可降解之鍵而相交聯接。

於一個具體例中，該生物可降解之水凝膠載體之主幹部份可直接連接一起，亦即不需交聯劑部份。此等生物可降解之水凝膠之兩個主幹部份的超支化分枝部份可直接經由連接至該兩個超支化分枝部份之交聯官能基團來連接。或者，兩個不同主幹部份之兩個超支化分枝部份可經由連接至主幹部份且於另一面連接至交聯部份之兩個間隔部份來交聯，其係藉由交聯官能基團來分離。

或者，主幹部份可經由交聯劑部份而連接一起，每個交聯劑部份係藉由至少兩個水解可降解之鍵來終止。除了終止可降解之鍵，該交聯劑部份可再含有生物可降解之鍵。因此，該連接至主幹部份之交聯劑部份的各個末端包含水解可降解之鍵，且其他的生物可降解之鍵可任意的存在於交聯劑部份。

較佳者，該生物可降解之水凝膠載體係包含藉由水解可降解之鍵來交聯之主幹部份且該主幹部份係經由交聯劑部份而連接一起。

該生物可降解之水凝膠載體可含有一個或多個不同型式之交聯劑部份，較佳為一個。該交聯劑部份可為直鏈或分支分子且較佳為直鏈分子。於本發明之較佳具體例中，該交聯劑部份係藉由至少兩個生物可降解之鍵而連接至主幹部份。

較佳者，交聯劑部份具有由60 Da至5 kDa範圍之分子量，更佳者，由0.5 kDa至5 kDa，又更佳為由1 kDa至4 kDa，又更佳為由1 kDa至3 kDa。於一個具體例中，交聯劑部份包括聚合物。

除了齊聚物或聚合物之交聯部份，可使用低分子量之交聯部份，尤其是當親水性高分子量之主幹部份係用來形成根據本發明之生物可降解之水凝膠。

較佳者，該以聚(乙二醇)為主之交聯劑部份為烴鏈，其包含乙二醇單位，任意包含其他化學官能基團，其中該以聚(乙二醇)為主之交聯劑部份每個包含至少m個乙二醇單位，其中m為由3至100範圍間之整數，較佳者為由10至70。較佳者，該以聚(乙二醇)為主之交聯劑部份具有由0.5 kDa至5 kDa範圍間之分子量。

如參考下列之使用，交聯劑部份或以PEG為主連接至分支核之聚合鏈，“以PEG為主”之詞係指交聯劑部份或以PEG為主之聚合鏈包含至少20重量%乙二醇部份。

於一個具體例中，構成聚合物交聯劑部份的單體係藉由生物可降解之鍵而連接。此等聚合物之交聯劑部份可含有至多100個生物可降解之鍵或更多，根據交聯劑部份之分子量及單體單位之分子量。此等交聯劑部份之實例為以聚(乳酸)或聚(乙醇酸)為主之聚合物。其應瞭解的是此等聚(乳酸)或聚(乙醇酸)鏈可被烷基或芳基基團終止或插入且其等係任意被雜原子及化學官能基團所取代。

較佳者，該交聯劑部份為以PEG為主，較佳以僅有一個PEG為主之分子鏈代表。較佳者，該以聚(乙二醇)為主之交聯劑部份為包含乙二醇單位，任意包含其他化學官能基團之烴鏈，其中該以聚(乙二醇)為主之交聯劑部份每個包含至少m個乙二醇單位，其中m為由3至100範圍間之整數，較佳為由10至70。較佳者，該以聚(乙二醇)為主之交聯劑部份具有由0.5 kDa至5 kDa範圍間之分子量。

於本發明之較佳具體例中，該交聯劑部份含有PEG，其係對稱的經由酯鍵連接至兩個α，Ω-脂族二羧酸間隔子，其係由經由永久醯胺鍵連接至超支化分枝部份的主幹部份來提供。

該連接至主幹部份且另一面連接至交聯部份之間隔部份的二羧酸包含3個至12個碳原子，最佳為介於5個及8個碳原子且可於一個或多個碳原子上被取代。較佳之取代基為烷基基團，羥基基團或醯胺或被取代之胺基基團。一個或多個脂族二羧酸之亞甲基基團可任意的被O或NH或經烷基取代之N所取代。較佳之烷基為具有1至6個碳原子之直鏈或分支烷基。

較佳者，有一永久醯胺鍵介於超支化分枝部份及間隔部份，其係連接至主幹部份且另一面係連接至交聯部份。

一個較佳之交聯劑部份係示於下；虛線係指至主幹部份之交聯之生物可降解的連接：

其中q為由5至50之整數。

較佳者，該水凝膠載體係包括由水解可降解之鍵交聯的主幹部份。

更佳者，該主幹部份包含下式之分支核：

其中該虛線係指連接至主幹部份之其餘。

更佳者，該主幹部份包含下式之結構：

其中n為由5至50之整數且該虛線係指連接至主幹部份之其餘。

較佳者，主幹部份包括超支化部份Hyp。

更佳者，該主幹部份包括下式之超支化部份Hyp：

其中該虛線係指連接至分子之其餘且以星號標記之碳原子係指S-構型。

較佳者，該主幹部份係連接到下式之至少一個間隔子：

其中虛線之一係指連接至該超支化部份Hyp且第二個虛線係指連接至分子之其餘部份；且其中m為由2至4之整數。

較佳者，該主幹部份係經由具有下列結構之交聯劑部份連接一起

其中q為由3至100之整數，較佳為由5至50。

於本發明之水凝膠前藥中，於主幹部份及交聯劑部份之間的生物可降解之鍵的水解速率係被鄰接至PEG-酯羧基基團之原子之數目及種類所影響及確定。例如，藉由選擇PEG酯生成法中之琥珀酸，己二酸或戊二酸，其可改變根據本發明之水凝膠載體之生物可降解之半生期。

較佳者，L²係經由硫代琥珀醯亞胺基團而連接至Z，其依序係經由一間隔子，如寡乙二醇鏈而連接至水凝膠之主幹部份。較佳者，此間隔子鏈至主幹部份之連接係一永久鍵，較佳為醯胺鍵。

根據本發明之水凝膠生物降解係藉由引進可降解之鍵之水解而達成。

於交聯官能基團中，“水解可降解”之詞於本發明內文中係指連接，其為於生理條件下(水性緩衝液於pH 7.4，37℃)非-可酶解水解可降解，其半生期範圍為由一小時至三個月，包括，但非侷限於，烏頭基類，乙縮醛，羧酸酐，酯類，亞胺，腙，馬來醯胺酸醯胺，原酸酯，磷醯胺，磷酯，磷矽烷基酯，矽烷基酯，磺酸酯，芳族胺基甲酸酯，其等之組合等。較佳之生物可降解之連接為羧酸酯，碳酸化物，磷酯及磺酸酯且最佳為羧酸酯或碳酸化物。為了實用目的，應瞭解的是為了試管內研究係使用加速之條件如，例如，pH 9，37℃，水性緩衝液。

永久的連接為於生理條件下(水性緩衝液於pH 7.4，37℃)為非-可酶解水解可降解，為六個月之半生期或較長，如，例如醯胺。

根據本發明之生物可降解之水凝膠載體的降解係多步驟反應，其中許多可降解之鍵係裂解而產生降解產物，其可為水溶性或水不溶性。然而，水不溶性降解產物可進一步包括可降解之鍵，因此其等可裂離而得到水溶性降解產物。這些水溶性降解產物可包括一個或多個主幹部份。應瞭解該釋出之主幹部份可，例如，為永久接合至間隔子或阻斷或連接子基團或親和基團及/或前藥連接子降解產物而且水溶性降解產物可包括可降解之鍵。

分支核之結構，以PEG為主之聚合鏈，超支化分枝部份及連接至超支化分枝部份之部份可由於涵蓋本發明之水凝膠載體之章節所提供之相對應說明來推斷。應瞭解該降解之結構係依據根據本發明正在進行降解之水凝膠型式而定。

主幹部份之總量可於溶液中，於根據本發明之水凝膠完全降解之後來測量，且於降解期間，可溶性主幹降解產物之餾份由根據本發明之不溶性水凝膠中分離出來並可計量而不受由根據本發明之水凝膠中釋出之其他可溶性降解產物干擾。根據本發明之水凝膠物體可由生理滲透壓之緩衝液的過量水中藉由沉降或離心分離而分離出來。可以此方式進行離心分離使得上層清液提供至少10%體積之根據本發明膨脹之水凝膠。可溶性水凝膠降解產物於此等沉降或離心分離步驟之後仍存留於水性上層清液中，且包含一個或多個主幹部份之水溶性降解產物可藉由將此等上層清液之等份進行適當的分離法及/或分析法而檢測。

較佳者，水溶性降解產物可藉由通過0.45微米濾器來過濾而由水不溶性降解產物中分離出來，之後可於流程中發現水溶性降解產物。水溶性降解產物亦可由水不溶性降解產物中藉由離心分離及過濾步驟之合併法而分離出來。

例如該主幹部份可攜帶於其中其他降解產物不具有UV吸收之波長具有UV吸收之基團。此等選擇性UV-吸收基團可為主幹部份之結構性組份，如醯胺鍵或可藉由芳族環系如吲哚基團而連接至其反應性官能基團而引進至主幹。

於此等根據本發明之連接水凝膠之艾塞那肽前藥中，想要的是幾乎所有的艾塞那肽釋出(>90%)之發生係在顯著量之主幹降解產物(<10%)之釋出發生之前。其可藉由調整連接至水凝膠之艾塞那肽前藥之半生期相對於水凝膠降解動力學而達成。

較佳者，該艾塞那肽前藥D-L具有一結構，其中L係藉式(II)代表

其中該虛線係指藉由形成醯胺鍵而連接至艾塞那肽的氮，較佳為N-終端氮，且Z為水凝膠；較佳者，於(II)中之水凝膠為生物可降解之以聚(乙二醇)(PEG)為主之水不溶性水凝膠。

較佳者，於(II)中之水凝膠係由水解可降解之鍵來交聯之主幹部份組成。

更佳者，該主幹部份包含下式之分支核：

其中該虛線係指連接至主幹部份之其餘。

更佳者，該主幹部份包含下式之結構：

其中n為由5至50之整數且該虛線係指連接至分子之其餘。

較佳者，主幹部份包含超支化部份Hyp。

更佳者，該主幹部份包含下式之超支化部份Hyp：

較佳者，該主幹部份係至少連接至下式之一個間隔子：

其中該虛線之一係連接至超支化部份Hyp且第二虛線係指連接至分子之其餘部份；且其中m為由2至4之整數。

較佳者，該主幹部份係至少連接至下式之一個間隔子：

其中，該以星號標記之虛線係指水凝膠及該硫代琥珀醯亞胺基團之N之間的鍵；其中另一虛線係指連接至Hyp；且其中p為由0至10之整數。

較佳者，該主幹部份係經由具有下列結構之交聯劑部份而連接一起

其中q為由3至100之整數。

該介於主幹及交聯劑部份之生物可降解之鍵的水解速率係藉由連接至PEG-酯羧基基團之原子之數目及種類來確定。例如藉由選自PEG酯形成反應之琥珀酸，己二酸或戊二酸，其可改變降解交聯劑之半生期。

本發明連接水凝膠之艾塞那肽前藥可由本發明之水凝膠開始藉由技藝已知之習用方法來製備。此方面之醫生很清楚存有多條途徑。例如，上述生物活性部份所共價連接至其上之前藥連接子可與本發明之水凝膠之反應性官能基團進行反應，其已部份或全部攜有該活活部份。

於較佳之製備方法中，該水凝膠係經由化學接合反應而產生。該水凝膠可由兩個含有互補官能基之大分子離析物來形成，其進行如縮合反應或添加之反應。這些起始物質之一為具有至少兩個相同官能基團之交聯試劑且另一個起始物質為同多功能的主幹試劑。存在於交聯試劑上之適當的官能基團包括終端胺基，羧酸及衍生物，馬來醯亞胺及其他α，β未經取代之Michael受體如乙烯碸，硫醇，羥基基團。主幹試劑中出現之適當官能基團包括但非侷限於胺基，羧酸及衍生物，馬來醯亞胺及其他α，β未經取代之Michael受體如乙烯碸，硫醇，羥基基團。

如果交聯試劑反應性官能基團係相關於主幹反應性官能基團而以次化學計量(substoichiometrically)使用，該產生之水凝膠將會是一含有連接至主幹結構之游離反應性官能基團之反應性水凝膠。

任意的，該前藥連接子可首先接合至艾塞那肽且然後所產生之艾塞那肽-前藥連接子接合物與水凝膠之反應性官能基進行反應。或者，於將前藥連接子之官能基團中之一個活化之後，該連接子-水凝膠接合物可與艾塞那肽於第二個反應中接觸並將過量之艾塞那肽於該艾塞那肽接合至束縛水凝膠之前藥連接子之後藉由過濾法移除。

根據本發明之前藥的較佳製備法如下：於主幹試劑合成法中較佳之起始物質為4臂PEG四胺或8臂PEG八胺，其中PEG試劑之分子量為由2000至10000 Dalton之範圍，最佳為由2000至5000 Da。至此等多臂PEG-衍生物，離胺酸殘基係依序偶合而形成超支化主幹試劑。應瞭解於偶合步驟期間，該離胺酸可部份或全部被保護基所保護而且最終主幹試劑可含有保護基。較佳之構築崁段為雙-boc離胺酸。或者，取代依序添加離胺酸殘基，係首先組織分枝聚-離胺酸部份且隨即偶合至4臂PEG四胺或8臂PEG八胺。想要得到攜有32個胺基基團之主幹試劑，因此將七個離胺酸連接至4臂PEG之各臂，或將五個離胺酸連接至8臂PEG之各臂。於另一個具體例中，該多臂PEG衍生物為四-或八羧基PEG。於此情況中，該分枝部份可由戊二酸或天門冬胺酸產生，且該產生之主幹試劑將攜帶32個羧基基團。應瞭解所有或部份主幹試劑之官能基團可以游離型式存在，呈鹽類或接合以保護基團。應瞭解由於實際原因，該主幹試劑中每個PEG臂之離胺酸數目將介於六及七個之間，更佳為約七個。

較佳之試劑係顯示於下：

該交聯試劑之合成係由線性PEG鏈起始，其分子量係在由0.2至5 kDa之範圍，更佳為由0.6至2 kDa，其係用二羧酸，如己二酸或戊二酸之半酯來酯化。半酯形成法中較佳之保護基團為苄基基團。該產生的雙二羧酸PEG半酯係轉化為更具反應性之羧基化合物如醯基氯或活性酯類，如五氟苯基或N-羥基琥珀醯亞胺酯，更佳者為N-羥基琥珀醯亞胺酯，其中較佳選擇之結構係顯示如下。

或者，該雙二羧酸PEG半酯可於偶合劑，如DCC或HOBt或PyBOP存在下活化。

於一其他具體例中，該主幹試劑載體羧基基團及相關之交聯試劑係選自含酯胺基-終端PEG-鏈。

主幹試劑及交聯試劑可聚合以形成根據本發明之水凝膠使用逆相乳劑聚合反應。選擇該想要的主幹及交聯劑官能基團間之化學劑量後，將主幹及交聯劑溶解於DMSO及具經適當選擇之HLB值的適當乳化劑，較佳者Arlacel P135，係用機械攪拌器並控制攪拌速度而用來形成反相乳液。聚合反應係藉由添加適當鹼而起動，較佳係藉由N,N,N‘,N‘-四甲基乙烯二胺。於攪拌適當時間後，將反應物藉由添加酸而驟冷，如醋酸及水。收集小球，清洗，並根據粒子大小藉由機械過篩而分餾。任意的，保護基團可於此階段移除。

再者，此等根據本發明之水凝膠可用一攜有不同反應性官能基團之間隔子予以官能化然後由水凝膠提供。例如馬來醯亞胺反應性官能基團可藉由偶合一適當的雜二官能之間隔子如Mal-PEG6-NHS至水凝膠而引進至水凝膠。此等經官能化之水凝膠可進一步接合至艾塞那肽連接子試劑，攜有反應性硫醇基團於連接子部份而形成根據本發明連接水凝膠之艾塞那肽前藥。

將艾塞那肽-連接子接合物負載至經官能化之含馬來醯亞胺基團水凝膠之後，將所有賸餘之官能基團用適當的阻斷劑封包，如氫硫基乙醇，以避免不想要的副作用。

於本發明之另一較佳具體例中，一攜有游離硫醇之艾塞那肽-連接子接合物係連接至連接子部份，係與經馬來醯亞胺官能化之水凝膠於室溫及4℃之間，更佳為於室溫，於pH 5.5-8之緩衝水溶液，較佳為pH 6.5-7.5進行反應。隨即，將產生的藥物-連接子-水凝膠接合物用包含硫醇基團之低分子量化合物處理，較佳為34-500 Da之含硫醇的化合物，最佳為含氫硫基乙醇於室溫及4℃之溫度間，更佳為於室溫時，於pH 5.5-8之緩衝水溶液，較佳為pH 6.5-7.5。

於本發明之另一較佳具體例中，係將攜有馬來醯亞胺基團之艾塞那肽-連接子接合物與根據本發明之經硫醇官能化之水凝膠於室溫及4℃之間，更佳為於室溫時，於pH 5.5-8，較佳為pH 6.5-7.5之緩衝溶液中進行反應。隨即，該相對應之產生的藥物-連接子-水凝膠接合物用含馬來醯亞胺基團之低分子量化合物處理，較佳為100-300 Da之含馬來醯亞胺的化合物，如N-乙基-馬來醯亞胺，於室溫及4℃之間，更宜為於室溫，於pH 5.5-8之緩衝水溶液中，較佳為於6.5-7.5。

本發明另一方面為包含下列步驟之方法：

(a)　於室溫及4℃之溫度之間於一pH 5.5-8之緩衝水溶液中，將一含有經馬來醯亞胺官能化之水凝膠微粒子之水性懸浮液於一含有本發明艾塞那肽-連接子試劑之溶液接觸，其中該化學官能基團L²*包含硫醇基團，產生艾塞那肽-連接子-水凝膠接合物；

(b)　任意的，將來自步驟(a)之艾塞那肽-連接子-水凝膠接合物用34 Da至500 Da之含有硫醇的化合物於室溫及4℃之溫度間於pH 5.5-8之緩衝水溶液中處理。

本發明另一方面為包含下列步驟之方法：

(a)　於室溫及4℃之溫度間於一pH 5.5-8之緩衝水溶液中將含有經硫醇官能化之水凝膠微粒子之水性懸浮液與包含本發明艾塞那肽-連接子試劑的溶液接觸，其中該化學官能基團L²*包含馬來醯亞胺基團，產生艾塞那肽-連接子-水凝膠接合物；

(b)　任意的，將來自步驟(a)之該艾塞那肽-連接子-水凝膠接合物用100至300 Da之含有馬來醯亞胺的化合物於室溫及4℃之溫度間於pH 5.5-8之緩衝水溶液中處理。

製備本發明前藥之特別佳的方法包括下列步驟：

(a)　將式C(A’-X¹)₄化合物，其中於其黏至Hyp或Hyp之先質之前A’-X¹代表A且X¹為適當官能基團，與式Hyp’-X²化合物進行反應，其中於其黏至A或Hyp之先質之前Hyp’-X²代表Hyp且X²為一適當的官能基團，與X¹進行反應；

(b)　任意的於一個或多個進一步之步驟中將步驟(a)中產生的化合物進行反應而產生具有至少四個官能基團之式C(A-Hyp)₄化合物；

(c)　將步驟(b)所產生之具有至少四個官能基的化合物與以聚(乙二醇)為主之交聯劑先質進行反應，其中該交聯劑先質之活性酯基團係以相較於反應性官能基團C(A-Hyp)₄總數量之次-化學計量使用而產生水凝膠；

(d)　將步驟(c)之水凝膠主幹中所賸餘之未反應官能基團(代表包含於水凝膠中主幹之反應性官能基團)與生物活性部份及瞬態前藥連接子之共價接合物進行反應，或首先將未反應官能基團與瞬態前藥連接子進行反應且隨即與生物活性部份進行反應；

(e)　任意的將剩餘未反應之官能基團封包而產生本發明之前藥。

特別的，本發明艾塞那肽前藥之水凝膠係如下合成：於團塊聚合反應時，係將主幹試劑與交聯試劑以胺/活性酯為2：1至1.05：1之比率掺合。

將主幹試劑及交聯試劑兩者溶解於DMSO而得到每100毫升濃度為5至50克之溶液，較佳為每100毫升7.5至20克且最佳為每100毫升10至20克。

為了使聚合反應生效，係將2至10%(體積)N,N,N’,N’-四甲基乙烯二胺(TMEDA)添加至含有交聯試劑及主幹試劑之DMSO溶液中並將混合物振盪達1至20秒並予以靜置。混合物於少於1分鐘內固化。

根據本發明之此等水凝膠宜藉由機械方法如攪拌，壓碎，分割壓迫(cutting pressing)，或研磨而弄碎，並任意的過篩。

於乳液聚合反應時，反應混合物係包含分散相及連續相。

於分散相時，係將主幹試劑及交聯試劑以胺/活性酯為2：1至1.05：1之比率掺合並溶解於DMSO而得到每100毫升濃度為5至50克之溶液，較佳為每100毫升7.5至20克且最佳為每100毫升10至20克。

該連續相為任何溶劑，其不溶混於DMSO，不為鹼性，對質子為惰性且顯示出黏度低於10 Pa*s。較佳者，該溶劑不溶混於DMSO，不為鹼性，對質子為惰性，顯示出黏度低於2P a*s且為無毒性。更佳者，該溶劑為具有5至10個碳原子之直鏈或分支飽和烴。最佳者，該溶劑為正庚烷。

為了於連續相中形成分散相之乳液，將乳化劑添加至連續相再加入分散相。乳化劑之量為2至50毫克/毫升分散相，更佳為5至20毫克/毫升分散相，最佳為10毫克/毫升分散相。

該乳化劑之HLB-值為3至8。較佳者，該乳化劑為山梨糖醇及脂肪酸或聚(羥基脂肪酸)-聚(乙二醇)接合物之三酯。更佳者，該乳化劑為聚(羥基脂肪酸)-聚乙二醇接合物，其線形聚(乙二醇)之分子量在由0.5 kDa至5 kDa範圍內且聚(羥基-脂肪酸)單位之分子量在由0.5 kDa至3 kDa範圍內於鏈之各個終端。最佳者，該乳化劑為聚(乙二醇)二聚羥基硬脂酸，Cithrol DPHS(Cithrol DPHS，former Arlacel P135，英商柯洛達國際公共有限公司)。

分散相之液滴係藉由用幾何型式類似於如Isojet，Intermig，Propeller(EKATO Rhr- und Mischtechnik GmbH，Germany))之軸流式葉輪攪拌器來攪拌而生成，最佳為類似於Isojet其直徑為反應器直徑之50至90%。較佳者，攪拌係於添加分散相之前開始。攪拌器速度係設定於0.6至1.7 m/s。該分散相係於室溫加入，且分散相之濃度為2%至70%，較佳為5至50%，更佳為10至40%，且最佳為20至35%之反應總體積。將含分散相，乳化劑及連續相之混合物攪拌5至60分鐘接著加入鹼以起動聚合反應。

將5至10當量(係指各個將形成之醯胺鍵)之鹼添加至含有分散相及連續相之混合物中。該鹼為對質子為惰性，非親核性且溶解於分散相。較佳者，該鹼為對質子為惰性，非親核性，易溶於分散相及DMSO兩者。更佳者，該鹼為對質子為惰性，非親核性，易溶於分散相及DMSO兩者，一胺鹼及無毒性。最佳者，該鹼為N,N,N’,N’四甲基乙烯二胺(TMEDA)。於鹼存在下繼續攪拌1至16小時。

於攪拌期間，分散相之液滴硬化而成為根據本發明之交聯水凝膠小球，將其收集且根據大小於75微米及32微米板於振動連續過篩器上進行分餾而得到根據本發明之水凝膠微粒子。

本發明另一方面為艾塞那肽-連接子接合物中間體D-L’，其中L’為下式(III)

其中該虛線係指藉由形成醯胺鍵而連接至艾塞那肽部份之一個胺基基團；本發明另一方面為艾塞那肽-連接子試劑D-L*，其中D代表艾塞那肽部份；且L*為以下式(IV)代表之非生物活性連接子試劑，

其中該虛線係指藉由形成醯胺鍵而連接至艾塞那肽之一個胺基基團；R¹係選自C_1-4烷基，較佳為CH₃；R²，R^2a，係獨立選自包括H及C_1-4烷基之基團，其中L*係被一個L²*所取代且任意的再被取代，但於式(IV)中該以星號標記之氫未被取代基代替且其中L²*為一間隔子，其係連接至L*且包含一意欲接合至一水凝膠之化學官能基團。

較佳者，於式(IV)中之R²係被L²*代替。

較佳者，於式(IV)中之R²為CH₂-L²*。

較佳者，於式(IV)中之L*未進一步被取代。

較佳者，L²*包括硫醇基團。

較佳者，L²*包括馬來醯亞胺基團。

較佳者，L²*為L²-H。

本發明前藥之水凝膠可於製備方法中以成形之物體型式得到，如一篩子或支架或微粒子。最佳者，該水凝膠係形成微粒小球，其可以皮下或肌肉注射藉由標準注射筒來給藥。此等軟式小球之直徑係介於1及500微米。

較佳者，如懸浮於一等滲水製劑緩衝液，該微粒子之直徑係介於10及100微米，更佳者直徑係介於20及100微米，最佳者直徑係介於25及80微米。

較佳者，該微粒子可經由小於0.6毫米內部直徑之針來注射給藥，較佳為經由小於0.3毫米內部直徑之針，更佳為經由小於0.225毫米內部直徑之針，又更佳者為經由小於0.175毫米內部直徑之針，且最佳者為經由小於0.16毫米內部直徑之針。

應瞭解該“可藉由注射給藥”，“可注射的”或“注射性”之詞係指各因素之組合，如施加相當力道至含有可於特定溫度及以特定濃度(w/v)於液體中膨脹之根據本發明之生物可降解之水凝膠之注射筒的活塞上，具有給定內部直徑而連接至此等注射筒之出口之針，而由注射筒經由針而擠壓出特定體積之根據本發明之生物可降解之水凝膠所需要的時間。

為了提供可注射性，將1毫升體積之根據本發明的艾塞那肽前藥於水中膨脹至濃度為至少5%(w/v)且包含於一持有4.7毫米直徑之活塞的注射筒可於室溫10秒鐘內藉由施用少於50 Newton之力而擠壓出來。

較佳者，根據本發明之艾塞那肽前藥之可注射性係於水中膨脹至約10%(w/v)之濃度而達成。

本發明另一方面為製備針型可注射前藥的方法，其包括下列步驟：

(a)　將本發明之艾塞那肽水凝膠前藥製作成微粒子型式；

(b)　將微粒子過篩。

(c)　選擇直徑介於25及80微米之前藥小球的餾份。

(d)　將步驟(c)之小球餾份懸浮於適於注射之水性緩衝溶液中。

本發明另一方面為一可得自上述方法之針型可注射前藥，其中該針型可注射前藥可經由內部直徑小於300微米之針來注射，較佳為可經由內部直徑小於225微米之針來注射，且更佳為可經由內部直徑小於175微米之針來注射。

本發明另一方面為製藥組成物，其包括本發明之前藥或其製藥上可接受的鹽以及製藥上可接受的賦形劑。該製藥組成物係於下列章節中進一步說明。

該艾塞那肽-水凝膠前藥組成物可以懸浮組成物或呈乾性組成物來提供。較佳者，該艾塞那肽-水凝膠前藥之製藥組成物為乾性組成物。適當的乾燥方法為，例如，噴乾及冷凍乾燥(凍乾)。較佳者，該艾塞那肽-水凝膠前藥之製藥組成物係藉由冷凍乾燥而乾燥。

較佳為，該艾塞那肽水凝膠前藥於組成物係為足夠劑量以提供治療有效量之艾塞那肽於一次施用足供至少三天。更佳為，艾塞那肽水凝膠前藥一次施用足供一週。

根據本發明之艾塞那肽-水凝膠前藥含有一種或多種賦形劑。

於非經腸胃組成物中使用之賦形劑可分類為緩衝劑，等張性調整劑，防腐劑，穩定劑，抗吸附劑，氧化保護劑，增稠劑/黏度加強劑，或其他輔助劑。於某些情況時，這些組成份可具有兩種或三種功能。根據本發明之艾塞那肽-水凝膠前藥組成物含有一種或多於一種之賦形劑，其係選自包含下列之基團：

(i)　緩衝劑：生理上可容忍之緩衝液以維持pH於想要的範圍，如磷酸鈉，碳酸氫鹽，琥珀酸鹽，組氨酸，檸檬酸鹽及醋酸鹽，硫酸鹽，硝酸鹽，氯化物，丙酮酸鹽。亦可使用抗酸藥如Mg(OH)₂或ZnCO₃。可調整緩衝能力以配合對於pH穩定性最敏感之條件

(ii)等張性調整劑：使由於注射儲積時之滲透壓差異，細胞受損所造成的疼痛減至最小。實例為甘油及氯化鈉。有效濃度可藉由滲透壓計使用假定之滲透壓285-315 mOsmol/kg血清來測出

(iii)防腐劑及/或抗菌劑：複數劑量腸胃外製劑需要添加足夠濃度之防腐劑以使患者於注射時之感染風險減至最小並建立相對應之監管需求。典型的防腐劑包括間甲酚，苯酚，羥苯甲酯，羥苯乙酯，羥苯丙酯，羥苯丁酯，丁醇氯，苄醇，苯基硝酸汞，硫柳汞，山梨酸，山梨酸鉀，苯甲酸，氯甲酚，及苯扎氯銨

(iv)穩定劑：穩定性係藉由下列來達成：藉由強化蛋白質-穩定力，藉由變性stater之不穩定性作用，或藉由直接將賦形劑連接至蛋白質。穩定劑可為胺基酸如丙胺酸，精胺酸，天門冬胺酸，甘胺酸，組氨酸，離胺酸，脯胺酸，糖如葡萄糖，蔗糖，海藻糖，多元醇如甘油，甘露糖醇，山梨糖醇，鹽類如磷酸鉀，硫酸鈉，螯合劑如EDTA，六磷酸鹽，配位體如二價金屬離子(鋅，鈣，等)，其他鹽類或有機分子如苯酚衍生物。此外，可使用齊聚物或聚合物如環糊精，葡聚糖，樹枝高分子，PEG或PVP或魚精蛋白或HSA

(v)抗吸附劑：主要為離子性或非離子性表面活性劑或其他蛋白質或可溶性聚合物係用來完全包敷或吸附至組成物之容器的內表面。如，泊洛沙姆(Pluronic F-68)，PEG十二烷基醚(Brij 35)，聚山梨酸20及80，葡聚糖，聚乙二醇，PEG-聚組胺酸，BSA及HSA及明膠。所選擇之賦形劑濃度及型式係依據所要避免之效果而定但典型的係於CMC值正上方之界面形成單層表面活性劑

(vi)Lyo-及/或冷凍保護劑：於凍乾-或噴乾期間，賦形劑可抵消因打斷氫鍵及移除水所造成之不穩定效果。為此目的，可使用糖及多元醇但亦觀察到表面活性劑，胺基酸，非水性溶劑，及其他胜肽之相對應的正面效應。海藻糖特別有效於降低誘發濕氣之聚合作用且亦改善可能由蛋白質疏水性基團與水之接觸所產生的熱穩定性。亦可使用甘露糖醇及蔗糖，或作為唯一lyo/冷凍保護劑或互相合併其中較高的甘露糖醇：已知蔗糖之比率可促進凍乾塊之物理穩定性。甘露糖醇亦可與海藻糖合併。海藻糖亦可與山梨糖醇合併或以山梨糖醇用作為唯一保護劑。亦可使用澱粉或澱粉衍生物。

(vii)氧化保護劑：抗氧化劑如抗壞血酸，四氫嘧啶，蛋胺酸，穀胱甘肽，單硫代丙三醇，莫林，聚乙烯亞胺(PEI)，沒食子酸丙酯，維生素E，螯合劑如檸檬酸，EDTA，六磷酸鹽，硫代乙醇酸

(viii)增稠劑或黏度強化劑：阻礙小瓶及注射筒中之粒子沉降並用以促進掺合及粒子之再懸浮並使懸浮液較易於注射(亦即，注射筒活塞僅需少力)。適當的增稠劑或黏度強化劑為，例如，卡波姆增稠劑如Carbopol 940，Carbopol Ultrez 10，纖維素衍生物如羥基丙基甲基纖維素(羥丙甲纖維素，HPMC)或二乙基胺基乙基纖維素(DEAE或DEAE-C)，膠體矽酸鎂(Veegum)或矽酸鈉，羥基磷灰石凝膠，磷酸三鈣凝膠，黃原膠，卡拉膠如山塔(Satia)膠UTC30，脂族聚(醇酸)，如聚(D,L-或L-乳酸)(PLA)及聚(乙醇酸)(PGA)及其等之共聚物(PLGA)，D,L-乳酸，乙醇酸及己內酯之三元共聚物，泊洛沙姆，親水性聚(氧基乙烯)崁段及疏水性聚(氧基丙烯)崁段組成聚(氧基乙烯)-聚(氧基丙烯)-聚(氧基乙烯)之三崁段(如Pluronic)，聚醚酯共聚物，如聚乙二醇對苯二甲酸乙二醇酯/聚對苯二甲酸丁二醇酯共聚物，蔗糖醋酸異丁酸酯(SAIB)，葡聚糖或其衍生物，葡聚糖及PEG之組合物，聚二甲基矽氧烷，膠原，殼聚醣，聚乙烯基醇(PVA)及衍生物，聚烷基亞胺，聚(丙烯醯胺-共-二烯丙基二甲基銨(DADMA))，聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，粘多醣(GAGs)如硫酸皮膚素，硫酸軟骨素，硫酸角質素，肝素，硫酸乙醯肝素，透明質酸，ABA三崁段或AB崁段共聚物，其含有疏水性A-崁段，如聚乳酸(PLA)或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)，及親水性B-崁段，如聚乙二醇(PEG)或聚乙烯基吡咯烷酮。此種崁段共聚物以及上述泊洛沙姆可具有可逆之熱凝膠化行為(於室溫時為液態以利於給藥且於注射之後於體溫為溶膠-凝膠轉變溫度以上時為凝膠態樣)。

(ix)散佈或擴散劑：經由將於細胞內的空間中細胞外基質之組成份水解而修改結締組織之滲透性，如，但非侷限於透明質酸酶，聚醣類，其係於結締組織之細胞內空間發現。散佈劑，如，但非侷限於透明質酸，其暫時降低了細胞外基質之黏度並促進所注射藥物之擴散。

(x)　其他輔助劑：如濕潤劑，黏度調整劑，抗生素，透明質酸酶。酸及鹼如氫氯酸及氫氧化鈉為於製造期間調整pH之必要輔助劑。

較佳者，該艾塞那肽-水凝膠前藥組成物中含有一個或多於一個之增稠劑及/或黏度調整劑。

"賦形劑"之詞較佳係指稀釋劑，輔助劑，或載體，治療係與其等一起給藥。此等製藥賦形劑可以為無菌液體，如水及油，包括該等石油，動物，植物或合成的來源，包括但非侷限於花生油，大豆油，礦物油，芝麻油等。當製藥組成物係口服給藥時，水為較佳之賦形劑。當製藥組成物係以靜脈給藥時，鹽水及水性右旋糖為較佳之賦形劑。鹽水溶液及水性右旋糖及丙三醇溶液為於注射溶液中用作為液體賦形劑之較佳者。適當的製藥賦形劑包括澱粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明膠，麥芽，稻米，麵粉，白堊，矽膠，硬脂酸鈉，丙三醇單硬脂酸，滑石，氯化鈉，脫脂奶粉，丙三醇，丙烯，乙二醇，水，乙醇等。如果想要，該組成物亦可含有微量濕潤劑或乳化劑，或pH緩衝劑。這些組成物可以為溶液，懸浮液，乳液，錠劑，藥片，膠囊，粉末，緩釋製劑等型式。該組成物可調劑成栓劑，含傳統的黏合劑及賦形劑如三酸甘油脂。口服製劑包括標準賦形劑如製藥級甘露糖醇，乳糖，澱粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等。製藥賦形劑之適當實例係說明於"Remington's Pharmaceutical Sciences"by E.W. Martin。此種組成物將含有治療有效量之治療劑，較佳係以純粹型式，與適當量之賦形劑一起以便提供給藥至患者之適當型式。該製劑應符合給藥之型式。

於一般具體例中，本發明之製藥組成物，無論係以乾燥型式或以懸浮液或其他形式，可呈單一或複數劑量組成物提供。

於本發明之一個具體例中，該艾塞那肽-水凝膠前藥之乾性組成物係以單一劑量提供，係指該容器中含有一份製藥劑量。

因此，於本發明另一方面中，該組成物係以單一劑量組成物提供。

較佳為，該懸浮組成物為複數劑量組成物，係指其含有多於一份之治療劑量。較佳為，複數劑量組成物含有至少2劑量。此等艾塞那肽-水凝膠之複數劑量組成物可施用於需要此等處理之不同患者或施用於一個患者，其中賸餘之劑量係於第一份劑量施用後儲存直到需要。

於本發明之另一方面，該組成物係包含於一容器中。較佳為該容器為一雙槽注射筒。尤其係提供根據本發明之乾燥組成物於雙槽注射筒之第一槽且提供重組溶液於雙槽注射筒之第二槽。

於施用該艾塞那肽-水凝膠前藥之乾性組成物至需要的患者之前，將該乾性組成物重組。重組可在容器內進行，其中該艾塞那肽-水凝膠前藥之乾性組成物係於，例如於小瓶，注射筒，雙槽注射筒，安瓿，及注射筒中提供。重組係藉由添加預定量之重組溶液至該乾性組成物中而進行。重組溶液為無菌液體，如水或緩衝液，其可再含有添加劑，如防腐劑及/或抗菌劑。如果艾塞那肽-水凝膠前藥組成物係以單一劑量提供，該重組溶液中可含有一種或多種防腐劑及/或抗菌劑。較佳為，該重組溶液為無菌水。如果艾塞那肽-水凝膠前藥組成物為複數劑量組成物，該重組溶液宜含有一種或多種防腐劑及/或抗菌劑，例如，苄醇及甲酚。

本發明再一方面係關於重組之艾塞那肽水凝膠前藥組成物的給藥方法。該艾塞那肽水凝膠前藥組成物可藉由注射或灌注法給藥，包括皮內，皮下，肌肉內，靜脈，骨內，及腹膜內給藥。

再一方面為製備重組之包含治療有效量之艾塞那肽水凝膠前藥，及任意一種或多種製藥上可接受之賦形劑之組成物的方法，其中該艾塞那肽係瞬態的連接至水凝膠，該方法包括下列步驟

●　將本發明之組成物與重組溶液接觸。

另一方面為包含治療有效量之艾塞那肽水凝膠前藥，及任意一個或多個製藥上可接受之賦形劑的重組組成物，其中該艾塞那肽係瞬態連接至可由上述方法得到的水凝膠。

本發明另一方面為製備艾塞那肽-水凝膠前藥之乾性組成物的方法。此種懸浮組成物係藉由如下製成

(i)將艾塞那肽-水凝膠前藥與一種或多種賦形劑掺合，

(ii)將等同於單一或複數劑量之含量移轉至一適當容器中，

(iii)將該組成物於該容器中乾燥，且

(iV)將該容器密封。

適當容器為小瓶，注射筒，雙槽注射筒，安瓿，及注射筒。

另一方面為部件(parts)之試劑盒。當給藥器具簡單地為皮下注射筒時，該試劑盒可含有注射筒，針及一含有該用注射筒來使用之乾性艾塞那肽-水凝膠前藥組成物的容器及一含有該重組溶液之第二容器。於更多較佳具體例中，該注射筒具不為簡易的皮下注射筒且因此該含有再重組之艾塞那肽-水凝膠前藥之分別的容器係使用來與注射筒具一起參與，使得於使用時於容器中之組成物係於液體中與注射筒具之出口連接一起。給藥器具之實例包括但非侷限於皮下注射筒及筆型注射筒。特別佳之注射筒具為筆型注射筒，於此種情況時，該容器為一注射筒，較佳為拋棄式注射筒。

較佳之部件的試劑盒包含針及一容器其含有根據本發明之組成物且任意再含有再重組溶液，該容器係與該針一起使用。較佳為，該容器為一雙槽注射筒。

於另一方面，本發明係提供一含有如前所述以一筆型注射筒具使用之艾塞那肽-水凝膠前藥組成物之注射筒。該注射筒可含有單一劑量或複數劑量之艾塞那肽。

於本發明之一個具體例中，該艾塞那肽-水凝膠前藥之懸浮組成物不僅含有艾塞那肽-水凝膠前藥及一種或多於一種之賦形劑，亦含有其他以其等之游離型式或作為前藥之生物活性試劑。較佳為，此種額外之一個或多個生物活性劑為一前藥，更佳為水凝膠前藥。此生物活性試劑包括，但非侷限於，以下種類之化合物：

(i)磺脲類，例如，氯磺丙尿，甲磺氮草尿，甲苯磺丁脲，格列本脲，格列吡嗪，格列美脲，格列本脲，格列齊特等；

(ii)　苯丙胺酸類，例如，瑞格列奈，那格列奈或米格列奈；

(iii)　似胰高血糖素胜肽-1(GLP-1)及其類似物，葡萄糖-促胰島素胜肽(GIP)及其類似物，艾塞那肽及其類似物，及雙肽蛋白酶抑制劑(DPPIV)；

(iv)　雙胍類，例如，二甲雙胍；

(v)　噻唑烷二酮，如，例如，羅格列酮，吡格列酮，曲格列酮，沙格列酮(isaglitazone)(已知為MCC-555)，2-[2-[(2R)-4-己基-3,4-二氫-3-酮基-2H-1,4-苯並-2-基]乙氧基]-苯乙酸，環格列酮，羅格列酮或該化合物說明於WO 97/41097由Dr. Reddy's Research Foundation，尤其是5-[[4-[(3,4-二氫-3-甲基-4-酮基-2-喹唑啉基甲氧基]苯基]甲基]-2,4-噻唑烷二酮等；

(vi)　GW2570，等；

(vii)　視黃醛類-X受體(RXR)調節劑，如，例如，蓓薩羅丁，9-順式-視黃醛類，等；

(viii)　其他胰島素增敏劑，如，例如，INS-1，PTP-1B抑制劑，GSK3抑制劑，糖原磷酸化酶抑制劑，果糖-1,6-雙磷酸酶抑制劑，等；

(ix)　胰島素，包括短效或，中效，及長效型胰島素，吸入型胰島素，胰島素衍生物及胰島素類似物，如天然胺基酸序列中具有微小差異之胰島素分子；

(x)　胰島素之小分子模擬物，包括，但非侷限於L-783281，TE-17411，等；

(xi)　鈉-依賴葡萄糖運送劑1及/或2(SGLT1，SGLT2)抑制劑，例如KGA-2727，T-1095，T-1095A，SGL-0010，AVE 2268，SAR 7226，SGL-5083，SGL-5085，SGL-5094，ISIS-388626，舍格列凈，dapagliflozin或remogliflozin etabonate，canagliflozin，根皮苷，等；

(xii) Amylin激動劑，其包括，但非侷限於pramlintide，等；

(xiii)　胰高血糖素拮抗劑如AY-279955，等。

(xiv)　胃腸激素及胃腸激素活性調節劑，如生長抑素(Somatostatin)，Oxyntomodulin，膽囊收縮素(Cholecystokinin)，腸促胰島素(Incretins)，類生長激素(Ghrelin)，PYY_3-36，等。

上述胰島素可獨立選自包含下列者：牛胰島素，豬胰島素，及人類胰島素。更佳為胰島素係獨立選自人胰島素。胰島素可選自未修飾之胰島素，更特別為選自牛胰島素，豬胰島素，及人胰島素。

胰島素衍生物為天然生成之胰島素及/或胰島素類似物之衍生物，其係藉由化學修飾而得到。該化學修飾可包括，例如，添加一個或多個定義之化學基團至一個或多個胺基酸。

說明於EP 0 214 826，EP 0 375 437，EP 0 678 522，EP 0 885 961，EP 0 419 504，WO 92/00321，德國專利申請案102008 003 568.8及10 2008 003 566.1，及EP-A 0 368 187之胰島素類似物可為本發明組成物之部份。文件EP 0 214 826，EP 0 375 437，EP 0 678 522，EP 0 419 504，WO 92/00321，及EP-A 0 368 187係合併於本文中作為參考。

較佳胰島素類似物中之一者可選自包含下列者：Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)人胰島素(胰島素甘精，Lantus)；Arg(A0)-His(A8)-Glu(A15)-Asp(A18)-Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)人胰島素，Lys(B3)-Glu(B29)人胰島素；Lys^B28Pro^B29人胰島素(lyspro胰島素)，B28 Asp人胰島素(門冬胰島素)，其中脯胺酸於位置B28之人胰島素係被Asp，Lys，Leu，Val或Ala所取代且其中於位置B29之Lys可被Pro所取代

AlaB26人胰島素；des(B28-B30)人胰島素；des(B27)人胰島素或B29Lys(ε-四癸醯)，des(B30)人胰島素(地特胰島素)。

較佳之胰島素衍生物係選自包含下列者：激動之B29-N-肉豆蔻醯-des(B30)人胰島素，B29-N-棕櫚醯-des(B30)人胰島素，B29-N-肉豆蔻醯人胰島素，B29-N-棕櫚醯人胰島素，B28-N-肉豆蔻醯Lys^B28Pro^B29人胰島素，B28-N-棕櫚醯-Lys^B28Pro^B29人胰島素，B30-N-肉豆蔻醯-Thr^B29Lys^B30人胰島素，B30-N-棕櫚醯-Thr^B29Lys^B30人胰島素，B29-N-(N-棕櫚醯-Y-谷醯基)-des(B30)人胰島素，B29-N-(N-石膽基-Y-谷醯基)-des(B30)人胰島素，B29-N-(ω-羧基七癸醯)-des(B30)人胰島素，及B29-N-(ω-羧基七癸醯)人胰島素。

更佳之胰島素衍生物係選自包含下列者：Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)人胰島素，Lys^B28Pro^B29人胰島素(lyspro胰島素)，B28 Asp人胰島素(門冬胰島素)，B29Lys(ε-四癸醯)，desB30人胰島素(地特胰島素)。

較佳者，此等額外之一個或多個生物活性劑為胰島素之水凝膠前藥如說明於W 2011/012718及WO2011/012719。

除了抗糖尿病藥，生物活性化合物可為抗肥胖劑如奧利司他，胰腺脂肪酶抑制劑，其預防脂肪之崩解及吸收；或西布曲明，食慾抑制劑及羥色胺再吸收抑制劑，大腦之去甲腎上腺素及多巴胺，提高脂肪流通之生長因子(如，生長激素，IGF-1，生長激素釋放因子)，胰高血糖素及生長素調節劑。其他具潛力的生物活性抗肥胖劑包括，但非侷限於，食慾-抑制劑經由腎上腺素機制來作用，如苄非他明，苯甲嗎啉，芬特明，二乙胺苯酮，馬吲哚，西布曲明，苯基丙醇胺或，麻黃素；食慾-抑制劑經由羥色胺機制來作用，如喹哌(quipazine)，氟西汀，舍曲林，芬氟拉明，或右芬氟拉明；食慾-抑制劑經由多巴胺機制來作用，如，阿樸嗎啡；食慾-抑制劑經由組胺機制來作用(如，組胺類似物，H3受體調節劑)；能量消耗之增強劑，如β-3腎上腺素激動劑及不偶合蛋白質官能基之刺激劑；瘦素及瘦素類似物(如，美曲普汀)；神經胜肽Y拮抗劑；黑皮素-1，3及4受體調節劑；膽囊收縮素激動劑；似胰高血糖素胜肽-1(GLP-1)類似物及類似物(如，艾塞那肽)；雄激素(如，脫氫表雄酮及衍生物如還原尿睪酮)，睾丸酮，促蛋白合成類固醇(如，氧甲氫龍)，及甾體激素；甘丙肽受體拮抗劑；細胞激素劑如睫狀神經營養因子；澱粉酶抑制劑；enterostatin激動劑/類似物；食慾素/丘腦分泌素拮抗劑；urocortin拮抗劑；蛙皮素激動劑；蛋白質激酶A調節劑；腎上腺皮質激素釋放因子類似物；可卡因-及安非他明-調節轉錄類似物；降鈣素基因相關胜肽類似物；及脂肪酸合成酶抑制劑。

於其他具體例中，根據本發明之該艾塞那肽-水凝膠前藥組成物係與第二生物活性以此等方式合併使得艾塞那肽-水凝膠前藥係首先給藥至需要的患者，接著給藥以第二個化合物。或者，係將艾塞那肽-水凝膠組成物於另一個化合物給藥至需要的患者後給藥至相同的患者。

本發明另一方面為用作為醫藥品之本發明之前藥或本發明之製藥組成物。

本發明另一方面為用於治療或預防可用艾塞那肽治療之疾病及障礙之方法中的本發明之前藥或本發明之製藥組成物。該組成物係用於已知用艾塞那肽及艾塞那肽激動劑來治療或預防之疾病及障礙的方法中，例如，用於治療及預防高血糖及用於治療及預防任何型式之糖尿病，如胰島素-依賴型糖尿病，非胰島素依賴型糖尿病，糖尿病前期或妊娠期糖尿病，用於預防及治療代謝徵候群及/或肥胖及/或飲食失調，胰島素抵抗徵候群，降低血脂濃度，降低心臟風險，降低食慾，降低體重等。

需要用於本發明中說明之長效型艾塞那肽組成物來治療之患者為發展成併發症之高風險群。因此，可使用含本發明長效型艾塞那肽及適當生物活性化合物之組合，如，用來預防，延遲發展或治療選自包括下列之疾病及障礙：高血壓(包括但非侷限於單純性收縮性高血壓及家族性血脂異常性高血壓)，充血性心臟衰竭，左心室肥大，外周動脈疾病，糖尿病性視網膜病變，黃斑變性，白內障，糖尿病腎病，腎小球硬化，慢性腎功能衰竭，糖尿病性神經病，X徵候群，經前期徵候群，冠心病，心絞痛，血栓形成，動脈粥樣硬化，心肌梗塞，短暫性腦缺血發作，中風，血管再狹窄，高血糖，高胰島素血症，高脂血症，高甘油三酯血症胰島素抗性，葡萄糖代謝受損，葡萄糖耐量受損之情況，空腹血糖受損之情況，肥胖，勃起功能障礙，皮膚和結締組織疾病，足部潰瘍及潰瘍性結腸炎，內皮功能障礙及血管順應性受損。

預防，延遲發展或治療選自包括上述之疾病及障礙可藉由本發明之長效型艾塞那肽組成物與至少一種選自用來治療該情況之藥物種類之生物活性化合物之組合來達成，包括AT₁-受體拮抗劑；血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑；腎素抑制劑；β腎上腺素受體阻斷劑；α腎上腺素受體阻斷劑；鈣道阻斷劑；醛固酮合成酶抑制劑；醛固酮受體拮抗劑；中性肽鏈內切酶(NEP)抑制劑；雙血管緊張素轉化酶/中性肽鏈內切酶(ACE/NEP)抑制劑；內皮素受體拮抗劑；利尿劑；他汀類藥物；硝酸鹽；抗凝血劑；利鈉胜肽；洋地黃化合物；PPAR調節劑。

於生物活性劑之情況時；前藥，尤其是含有一個或多個酸性或鹼性基團之水凝膠前藥，本發明亦包括其等相對應之製藥上或毒物藥理上可接受的鹽，特別是其等之製藥上可用的鹽類。因此，該含有酸性基團之前藥可根據本發明來使用，例如，呈鹼金屬鹽，鹼土金屬鹽類或銨。此等鹽類更精確之實例包括鈉鹽，鉀鹽，鈣鹽，鎂鹽或與氨或有機胺之鹽類，如，例如，乙胺，乙醇胺，三乙醇胺或胺基酸。含有一個或多個鹼性基團，亦即可被質子化之基團，之前藥可存在且可根據本發明以其等與無機酸或有機酸之加成鹽型式來使用。適當酸之實例包括氫氯酸，氫溴酸，磷酸，硫酸，硝酸，甲烷磺酸，對甲苯磺酸，萘二磺酸，草酸，醋酸，酒石酸，乳酸，水楊酸，苯甲酸，甲酸，丙酸，特戊酸，二乙基醋酸，丙二酸，琥珀酸，庚二酸，富馬酸，馬來酸，蘋果酸，胺基磺酸，苯基丙酸，葡糖酸，抗壞血酸，異菸鹼酸，檸檬酸，己二酸，及精於此方面技藝者所已知之其他酸。如果該前藥同時於分子中含有酸性及鹼性基團，除了前述鹽型式，本發明亦包括內鹽或甜菜鹼(兩性離子)。該各別之鹽可藉由精於此方面技藝者所已知之習用方法而得到如，例如藉由將這些與有機或無機酸或鹼於一溶劑或分散劑中接觸，或藉由與其他鹽類之陰離子交換或陽離子交換。本發明亦包括該前藥之所有鹽類，其由於低的生理兼容性，不宜直接用於製藥中而係可，例如，呈中間體而用於化學反應或用來製備製藥上可接受的鹽類。

“製藥上可接受”一詞係指經由監控單位如EMEA(歐洲)及/或FDA(美國)及/或任何其他國家監控單位認可以用於動物，較佳為用於人類。

本發明仍有另一方面為於有一個或多個情況需要處理之哺乳類患者，較佳為於人類上治療，控制，延遲或預防的方法，其包括將治療有效量之本發明前藥或本發明之製藥組成物或製藥上可接受的鹽給藥至該患者。

實例 物質與方法

藉由Fmoc模式合成之於樹脂(負載約0.1毫莫耳/克)的艾塞那肽-4[Seq ID No：1]係得自丹麥之CASLO Laboratory Aps，Lyngby。藉由Fmoc模式合成之於樹脂(負載約0.1毫莫耳/克)的利西拉來[Seq ID No 21]及GLP-1[Seq ID No 13]係得自胜肽Specialty Laboratories，德國海德堡。該胜肽之支鏈完全經保護且含游離N-終端。

胺基4臂PEG 5kDa係由中國北京之JenKem Technology，P. R.取得。

N-(3-馬來醯亞胺丙基)-21-胺基-4,7,10,13,16,19-六氧雜-廿一烷酸NHS酯(Mal-PEG6-NHS)係得自德國柏林之Celares GmbH。6-(S-三苯甲基氫硫基)己酸係購自法國聖特拉斯堡之聚胜肽公司。如未註明所使用之胺基酸為L構型。

所有其他化合物係來自德國陶夫基興城之Sigma-ALDRICH Chemie GmbH。

Fmoc之去保護作用：

於移除Fmoc保護基團時，係將樹脂與2/2/96(v/v/v)六氫吡啶/DBU/DMF一起攪拌(兩次，每次10分鐘)並用DMF清洗(十次)。

RP-HPLC純化作用：

除非另有註明，RP-HPLC係於100 x 20毫米或100 x 40毫米C18 ReproSil-Pur 300 ODS-35微米管柱(Dr. Maisch，德國Ammerbuch)連接至一Waters 600 HPLC System及Waters 2487 Absorbance檢測器進行。使用溶液A(0.1% TFA於H₂O)及溶液B(0.1% TFA於乙腈)之線性梯度。將含有產物之HPLC餾份集中並凍乾。

閃蒸色層分離法

閃蒸色層分離純化作用係於來自瑞典Biotage AB之Isolera One系統，使用Biotage KP-Sil矽膠管柱並用正庚烷及醋酸乙酯作為洗提液而進行。產物係於254毫微米檢測。

於水凝膠小球時，裝置有聚乙烯玻璃料之注射筒係用作為反應槽或用於清洗步驟。

分析用超性能LC(UPLC)係於Waters Acquity系統上進行，其係裝置有Waters BEH300 C18管柱(2.1 x 50毫米，1.7微米粒徑)偶合至來自Thermo Scientific之LTQ Orbitrap Discovery質譜儀。

由於PEG起始物質之聚合度分布性，PEG產物之MS顯示一系列之(CH₂CH₂O)_n部份。為了易於瞭解，實例中僅提供一個單一代表性m/z訊號。

水凝膠中胜肽含量：胜肽含量係以相對於水凝膠毛重(馬來醯亞胺官能化之水凝膠重量及胜肽連接子硫醇重量之總和)之%胜肽重量來表現。水凝膠中胜肽連接子硫醇於之重量(且然後單獨胜肽重量)係藉由於與馬來醯亞胺官能化之水凝膠之接合反應期間胜肽連接子硫醇之消耗來測定。胜肽連接子硫醇之消耗係藉由Ellman測試(Ellman，G. L.等，Biochem. Pharmacol.，1961，7，88-95)來測定。

實例1 主幹試劑1g之合成

主幹試劑1g係由胺基4臂PEG5000 1a根據下列程式來合成：

為了合成化合物1b，係將胺基4臂PEG5000 1a(MW約5200克/莫耳，5.20克，1.00毫莫耳，HCl鹽)溶解於20毫升DMSO(無水)中。將Boc-Lys(Boc)-OH(2.17克，6.25毫莫耳)於5毫升DMSO(無水)，EDC HCl(1.15克，6.00毫莫耳)，HOBt‧H2O(0.96克，6.25毫莫耳)，及可力丁(5.20毫升，40毫莫耳)加入。將反應混合物於室溫攪拌30分鐘。

將反應混合物用1200毫升DCM稀釋並用600毫升0.1N H₂SO₄(2 x)，鹽水(1 x)，0.1 M NaOH(2 x)，及1/1(v/v)鹽水/水(4 x)清洗。將含水層用500毫升DCM再萃取。將有機相於Na₂SO₄上乾燥，過濾並蒸發而得到6.3克呈無色油之粗產物1b。將化合物1b藉由RP-HPLC予以純化：產量3.85克(59%)無色玻璃樣產物1b。MS：m/z 1294.4=[M+5H]⁵⁺(MW計算值[M+5H]⁵⁺=1294.6)。

化合物1c係藉由將含3.40克化合物1b(0.521毫莫耳)之5毫升甲醇及含9毫升4 N HCl之二烷於室溫攪拌15分鐘而得到。將揮發物於真空中移除。產物未經進一步純化即使用於下個步驟。MS：m/z 1151.9=[M+5H]⁵⁺(MW計算值[M+5H]⁵⁺=1152.0)。

為了合成化合物1d，將3.26克化合物1c(0.54毫莫耳)溶解於15毫升DMSO(無水)中。將含2.99克Boc-Lys(Boc)-OH(8.64毫莫耳)之15毫升DMSO(無水)，1.55克EDC HCl(8.1毫莫耳)，1.24克HOBt‧H₂O(8.1毫莫耳)，及5.62毫升可力丁(43毫莫耳)加入。將反應混合物於室溫攪拌30分鐘。

將反應混合物用800毫升DCM稀釋並用400毫升0.1 N H₂SO₄(2 x)，鹽水(1 x)，0.1 M NaOH(2 x)，及1/1(v/v)鹽水/水(4 x)清洗。含水層用800毫升DCM再萃取。將有機相於Na₂SO₄上乾燥，過濾並蒸發而得到呈玻璃樣之粗產物。

將產物溶解於DCM中並用冷的(-18℃)二乙醚予以沉澱。將此過程重複兩次並將沉澱物於真空中乾燥。產量：4.01克(89%)無色玻璃樣產物1d，其未經進一步純化即使用於下個步驟：MS：m/z 1405.4=[M+6H]⁶⁺(MW計算值[M+6H]⁶⁺=1405.4)。

化合物1e係藉由將一含有化合物1d(3.96克，0.47毫莫耳)於7毫升甲醇之溶液與20毫升4 N HCl於二烷者於室溫攪拌15分鐘而得到。將揮發物於真空中移除。產物未經進一步純化即使用於下個步驟。MS：m/z 969.6=[M+7H]⁷⁺(MW計算值[M+7H]⁷⁺=969.7)。

為了合成化合物1f，將化合物1e(3.55克，0.48毫莫耳)溶解於20毫升DMSO(無水)中。將Boc-Lys(Boc)-OH(5.32克，15.4毫莫耳)於18.8毫升DMSO(無水)，EDC HCl(2.76克，14.4毫莫耳)，HOBt‧H₂O(2.20克，14.4毫莫耳)，及10.0毫升可力丁(76.8毫莫耳)加入。將反應混合物於室溫攪拌60分鐘。

將反應混合物用800毫升DCM稀釋並用400毫升0.1 N H₂SO₄(2 x)，鹽水(1 x)，0.1 M NaOH(2 x)，及1/1(v/v)鹽水/水(4 x)清洗。含水層用800毫升DCM再萃取。將有機相於Na₂SO₄上乾燥，過濾並蒸發而得到呈無色油之粗產物1f。

將產物溶解於DCM並用冷(-18℃)二乙醚予以沉澱。將此步驟重複兩次並將沉澱物於真空中乾燥。產量：4.72克(82%)無色玻璃樣產物1f其未經進一步純化即使用於下個步驟。MS：m/z 1505.3=[M+8H]⁸⁺(MW計算值[M+8H]⁸⁺=1505.4)。

主幹試劑1g係藉由將一含有化合物1f(MW約12035克/莫耳，4.72克，0，39毫莫耳)於20毫升甲醇之溶液與40毫升4 N HCl於二烷者於室溫攪拌30分鐘而得到。將揮發物於真空中移除。產量：3.91克(100%)，玻璃樣產物主幹試劑1g。MS：m/z 977.2=[M+9H]⁹⁺(MW計算值[M+9H]⁹⁺=977.4)。

1g之其他合成途徑

為了合成化合物1b，於45℃時，於一含有4臂PEG5000四胺(1a)(50.0克，10.0毫莫耳)於250毫升iPrOH(無水)之懸浮液中，加入boc-Lys(boc)-OSu(26.6克，60.0毫莫耳)及DIEA(20.9毫升，120毫莫耳)並將混合物攪拌30分鐘。

隨即，將正丙胺(2.48毫升，30.0毫莫耳)加入。5分鐘後，將溶液用1000毫升MTBE稀釋並於-20℃儲存過夜，不攪拌。將約500毫升上層清液傾析出來並丟棄。將300毫升冷MTBE加入並於振盪1分鐘後，將產物藉著經玻璃過濾器而過濾收集並用500毫升冷MTBE清洗。將產物於真空中乾燥16小時。產量：65.6克(74%) 1b呈白色凹凸狀固體。MS：m/z 937.4=[M+7H]⁷⁺(MW計算值[M+7H]⁷⁺=937.6)。

化合物1c係藉由將來自上述步驟之化合物1b(48.8克，7.44毫莫耳)於156毫升2-丙醇中於40℃攪拌而得到。將一含有196毫升2-丙醇及78.3毫升乙醯氯之混合物於1-2分鐘內攪拌加入。將溶液於40℃攪拌30分鐘並冷卻至-30℃過夜，不攪拌。將100毫升冷MTBE加入，將懸浮液振盪1分鐘並於-30℃冷卻1小時。將產物藉由過濾法經由玻璃濾器予以收集並用200毫升冷MTBE清洗。將產物於真空中乾燥16小時。產量：38.9克(86%) 1c呈白色粉末MS：m/z 960.1=[M+6H]⁶⁺(MW計算值[M+6H]⁶⁺=960.2)。

為了合成化合物1d，於45℃時，將boc-Lys(boc)-OSu(16.7克，37.7毫莫耳)及DIPEA(13.1毫升，75.4毫莫耳)添加至一含有來自上述步驟之1c(19.0克，3.14毫莫耳)於80毫升2-丙醇之懸浮液中並將混合物於45℃攪拌30分鐘。隨即，將正丙胺(1.56毫升，18.9毫莫耳)加入。5分鐘後，將溶液用600毫升冷MTBE予以沉澱並離心(3000分鐘-1，1分鐘)。將沉澱物於真空中乾燥1小時並溶解於400毫升THF。將200毫升二乙醚加入並將產物冷卻至-30℃達16小時，不攪拌。將懸浮液經由玻璃過濾器予以過濾並用300毫升冷MTBE清洗。將產物於真空中乾燥16小時。產量：21.0克(80%) 1d呈白色固體MS：m/z 1405.4=[M+6H]⁶⁺(MW計算值[M+6H]⁶⁺=1405.4)。

化合物1e係藉由將來自上述步驟之化合物1d(15.6克，1.86毫莫耳)溶解於3 N含於甲醇之HCl(81毫升，243毫莫耳)並於40℃攪拌90分鐘而得到。將200毫升MeOH及700毫升iPrOH加入並將混合物於-30℃儲存2小時。為了完成結晶作用，將100毫升MTBE加入並將懸浮液於-30℃儲存過夜。將250毫升冷MTBE加入，將懸浮液振盪1分鐘並經由玻璃過濾器予以過濾並用100毫升冷MTBE清洗。將產物於真空中乾燥。產量：13.2克(96%) 1e呈白色粉末MS：m/z 679.1=[M+10H]¹⁰⁺(MW計算值[M+10H]¹⁰⁺=679.1)。

為了合成化合物1f，於45℃時，將boc-Lys(boc)-OSu(11.9克，26.8毫莫耳)及DIPEA(9.34毫升，53.6毫莫耳)添加至一含有來自上述步驟之1e(8.22克，1.12毫莫耳)於165毫升2-丙醇之懸浮液中並將該混合物攪拌30分鐘。隨即，將正丙胺(1.47毫升，17.9毫莫耳)加入。5分鐘後，將溶液冷卻至-18℃達2小時，然後將165毫升冷MTBE加入，將懸浮液振盪1分鐘並經由一玻璃過濾器予以過濾。隨即，將濾餅用4 x 200毫升冷MTBE/iPrOH 4：1及1x 200毫升冷MTBE清洗。將產物於真空中乾燥16小時。產量：12.8克，MW(90%) 1f呈淡黃色凹凸狀固體MS：m/z 1505.3=[M+8H]⁸⁺(MW計算值[M+8H]⁸⁺=1505.4)。

將所得到的主幹試劑1g藉由溶解於含4臂PEG5kDa(-LysLys₂Lys₄(boc)₈)₄(1f)(15.5克，1.29毫莫耳)之30毫升MeOH並冷卻至0℃而得到。將4 N HCl於二烷(120毫升，480毫莫耳，冷卻至0℃)於3分鐘內加入並將該冰浴移除。20分鐘後，將3 N HCl於甲醇(200毫升，600毫莫耳，冷卻至0℃)於15分鐘內加入並將溶液於室溫攪拌10分鐘。將產物溶液用480毫升冷MTBE予以沉澱並於3000 rpm離心1分鐘。將沉澱物於真空中乾燥1小時並且再溶解於90毫升MeOH，用240毫升冷MTBE予以沉澱並將該懸浮液於3000 rpm予以離心達1分鐘。將產物1g於真空中乾燥。產量：11.5克(89%)呈淡黃色片。MS：m/z 1104.9=[M+8H]⁸⁺(MW計算值[M+8H]⁸⁺=1104.9)。

實例2 交聯試劑2d之合成

交聯試劑2d係由己二酸單苄酯(英國，Arthur R.等，醫藥化學期刊，1990，33(1)，344-347)及PEG2000根據下列圖示來製備：

將含PEG 2000(2a)(11.0克，5.5毫莫耳)及苄基己二酸半酯(4.8克，20.6毫莫耳)於DCM(90.0毫升)之溶液冷卻至0℃。將二環己基碳化二亞胺(4.47克，21.7毫莫耳)加入接著加入催化量之DMAP(5毫克)並將溶液攪拌且予以達到室溫過夜(12小時)。將燒瓶於+4℃儲存5小時。將固體過濾並將溶劑於真空中藉由蒸餾法而完全移除。將殘質溶解於1000毫升1/1(v/v)二乙醚/醋酸乙酯中並於室溫儲存2小時其間形成少量片狀固體。將該固體經由寅氏鹽墊藉由過濾法而移除。將該溶液儲存於-30℃之冰箱中緊密之燒瓶中達12小時直到結晶作用完全。將結晶產物經由玻璃料過濾並用冷二乙醚清洗(-30℃)。將濾餅於真空中乾燥。產量：11.6克(86%) 2b之無色固體。產物未經進一步純化即使用於下個步驟。MS：m/z 813.1=[M+3H]³⁺(MW計算值[M+3H]³⁺=813.3)

於一500毫升玻璃壓熱器中，將PEG2000-雙-己二酸-雙-苄酯2b(13.3克，5.5毫莫耳)溶解於醋酸乙酯(180毫升)中並將10%披鈀木碳(0.4克)加入。將溶液於6巴，40℃予以氫化直到氫氣停止消耗(5-12小時)。藉由過濾法經由寅氏鹽墊(Celite)將催化劑移除並將溶劑於真空中蒸發。產量：12.3克(定量)2c呈淡黃色油。產物未經進一步純化即使用於下個步驟。MS：m/z 753.1=[M+3H]³⁺(MW計算值[M+3H]³⁺=753.2)

將含有PEG2000-雙-己二酸半酯2c(9.43克，4.18毫莫耳)，N-羥基琥珀醯亞胺(1.92克，16.7毫莫耳)及二環己基碳化二亞胺(3.44克，16.7毫莫耳)於75毫升DCM(無水)之溶液於室溫攪拌過夜。將反應混合物冷卻至0℃並將沉澱過濾出來。將DCM蒸發並將殘質由THF中再結晶出來。產量：8.73克(85%)交聯試劑2d呈無色固體MS：m/z 817.8=[M+3H]³⁺(MW計算值[M+3H]³⁺=817.9克/莫耳)。

實例3 含有游離胺基基團之水凝膠小球(3)的製備

將含有1200毫克1g及3840毫克2d於28.6毫升DMSO之溶液添加至一含有425毫克Arlacel P135(英商柯洛達國際公共有限公司)於100毫升庚烷之溶液中。將混合物用螺旋式攪拌機於650 rpm於25℃攪拌10分鐘以於裝設有擋板之250毫升反應器中形成懸浮液。將4.3毫升TMEDA加入以進行聚合作用。2小時後，將攪拌速度降低至400 rpm並將該混合物再攪拌16小時。將6.6毫升醋酸加入且然後於10分鐘後將50毫升水及50升飽和氯化鈉水溶液加入。5分鐘後，停止攪拌器並將含水相洩水。

於小球尺寸分餾時，將水-水凝膠懸浮液於75，50，40，32及20微米篩目之鋼篩予以濕性過篩。將保留於32，40，及50微米篩子之小球餾份集中並用水清洗3次，用乙醇清洗10次並於0.1毫巴乾燥16小時而得到呈白色粉末之3。

水凝膠中胺基基團之含量係藉由將fmoc-胺基酸偶合至水凝膠之游離胺基基團且隨即如Gude，M.，J.Ryf，等(2002)Letters in Peptide Science 9(4)：203-206中說明之fmoc-測量法來測量。

不同批次之3的胺基基團含量經測定係介於0.11及0.16毫莫耳/克之間。

實例4 馬來醯亞胺官能基化之水凝膠小球(4)之製備及馬來醯亞胺取代作用之測量

將水凝膠小球3用99/1(v/v) DMSO/DIPEA預洗，用DMSO清洗並用含Mal-PEG6-NHS(相對於在水凝膠之胺基基團之理論量的2.0 eq)於DMSO之溶液培育45分鐘。將小球4用DMSO清洗5次且用pH 3.0琥珀酸鹽(20 mM，1 mM EDTA，0.01% Tween-20)清洗5次。將樣品用pH 6.0磷酸鈉清洗3次(50 mM，50 mM乙醇胺，0.01% Tween-20)並於相同緩衝液中於室溫培育1小時。之後，將小球用pH 3.0之琥珀酸鈉(20 mM，1 mM EDTA，0.01% Tween-20)清洗5次。

為了測定馬來醯亞胺含量，將整份水凝膠小球4每次用水及乙醇清洗。將樣品凍乾並秤重。將另一份水凝膠小球4與過量之氫硫基乙醇(於50 mM磷酸鈉緩衝液，30分鐘於室溫)進行反應，並藉由Ellman test(Ellman，G. L.等，Biochem. Pharmacol.，1961，7，88-95)測定氫硫基乙醇之消耗。馬來醯亞胺之含量經測定為介於0.10及0.13毫莫耳/克乾性水凝膠。

實例5 連接子試劑之合成5c

連接子試劑5c係根據下列圖示來合成：

連接子試劑中間體5a之合成：

將間甲氧基三苯甲基氯(3克，9.71毫莫耳)溶解於DCM(20毫升)並逐滴添加至一含有乙二胺(6.5毫升，97.1毫莫耳)於DCM(20毫升)之溶液中。2小時後，將該溶液倒至二乙醚(300毫升)中並用30/1(v/v)鹽水/0.1 M NaOH溶液(每次50毫升)清洗3次且用鹽水(50毫升)清洗1次。將有機相於Na₂SO₄上乾燥並將揮發物於減壓下移除。Mmt-經保護之中間體(3.18克，9.56毫莫耳)未經進一步純化即使用於下個步驟。

將該Mmt-經保護之中間體(3.18克，9.56毫莫耳)溶解於無水DCM(30毫升)。將6-(S-三苯甲基氫硫基)己酸(4.48克，11.47毫莫耳)，PyBOP(5.67克，11.47毫莫耳)及DIPEA(5.0毫升，28.68毫莫耳)加入並將混合物於室溫攪動30分鐘。將溶液用二乙醚(250毫升)稀釋並用30/1(v/v)鹽水/0.1 M NaOH溶液(每次50毫升)清洗三次並用鹽水(50毫升)清洗一次。將有機相於Na₂SO₄上乾燥並將揮發物於減壓下移除。將5a藉由閃蒸色層分離法予以純化。產量：5.69克(8.09毫莫耳)。MS：m/z 705.4=[M+H]⁺(MW計算值=705.0)。

連接子試劑中間體5b之合成：

於含有5a(3.19克，4.53毫莫耳)於無水THF(50毫升)之溶液中加入BH₃‧THF(1 M溶液，8.5毫升，8.5毫莫耳)並將溶液於室溫攪拌16小時。再加入BH₃‧THF(1 M溶液，14毫升，14毫莫耳)並於室溫攪拌16小時。將反應物藉由加入甲醇(8.5毫升)而驟冷。將N,N-二甲基-乙烯二胺(3毫升，27.2毫莫耳)加入並將溶液加熱至回流達3小時。將反應混合物予以冷卻至室溫且然後用醋酸乙酯(300毫升)稀釋，用飽和Na₂CO₃水溶液(2 x 100毫升)及飽和NaHCO₃水溶液(2 x 100毫升)清洗。將有機相於Na₂SO₄上乾燥並將揮發物於減壓下移除而得到粗胺中間體(3.22克)。

將胺中間體(3.22克)溶解於DCM(5毫升)中。將Boc₂O(2.97克，13.69毫莫耳)溶解於DCM(5毫升)中並將DIPEA(3.95毫升，22.65毫莫耳)加入且將混合物於室溫攪動30分鐘。將混合物藉由閃蒸色層分離法予以純化而得到粗Boc-及Mmt-經保護之中間體(3.00克)。MS：m/z 791.4=[M+H]⁺，519.3=[M-Mmt+H]⁺(MW計算值=791.1)。

將0.4 M水性HCl(48毫升)添加至含有Boc-及Mmt-經保護之中間體於乙腈(45毫升)之溶液中。將混合物用乙腈(10毫升)稀釋並於室溫攪拌1小時。隨即，將反應混合物之pH值藉由添加5 M NaOH溶液而調整至5.5。將乙腈於減壓下移除並將該水溶液用DCM(4 x 100毫升)萃取。將合併之有機相於Na₂SO₄上乾燥，並將揮發物於減壓下移除。粗5b未經進一步純化即使用於下個步驟。產量：2.52克(3.19毫莫耳)。MS：m/z 519.3=[M+H]⁺(MW計算值=519.8克/莫耳)。

連接子試劑5c之合成：

將中間體5b(985毫克，1.9毫莫耳)及對硝基苯基氯甲酸酯(330毫克，2.5毫莫耳)溶解於無水THF(10毫升)中。將DIPEA(0.653毫升，3.7毫莫耳)加入並將該混合物於室溫攪拌2小時。將該溶液藉由添加醋酸(1毫升)而酸化。藉由RP-HPLC而純化5c。產量：776毫克，(1.13毫莫耳)。MS m/z 706.3=[M+Na]⁺(MW計算值=706.3)。

實例6 艾塞那肽連接子試劑6d之合成

艾塞那肽連接子試劑6d係根據下列程式來合成：

艾塞那肽連接子試劑中間體6a之合成：

將於樹脂上支鏈完全經保護之含游離N-終端的艾塞那肽-4(2.00克，0.2毫莫耳，負載約0.1毫莫耳/克)移轉至20毫升裝設有過濾料的注射筒中。將8毫升無水DMF引入該注射筒中並將該注射筒振盪(600 rpm)15分鐘以使樹脂預膨脹。將溶劑丟棄，並將一含有Fmoc-D-丙胺酸-OH(187毫克，0.6莫耳)，PyBOP(312毫克，0.6毫莫耳)，及DIPEA(174微升，1.0毫莫耳)於無水DMF(4毫升)之溶液引入注射筒中。將注射筒於室溫及600 rpm振盪60分鐘。將溶液排出，並將樹脂用DMF清洗10次。

Fmoc-去保護作用係根據“MaterialS and Methods”而進行。

艾塞那肽連接子試劑中間體6b之合成：

將一含有5c(137毫克，0.4毫莫耳)於無水DMF(3毫升)之溶液添加至樹脂6a(0.2毫莫耳)中，接著將一含有DIPEA(80微升，0.46毫莫耳)於無水DMF(4.5毫升)之溶液加入，並於22℃將反應混合物振盪(600 rpm)15小時。

將樹脂用DMF清洗10次並用DCM清洗10次並於真空中乾燥。

艾塞那肽連接子試劑中間體6c之合成：

將3-硝基-2-吡啶-硫烯氯(sulfenyl chloride)(48毫克，0.25毫莫耳)填充至一含有6b(0.05毫莫耳，0.5克)之注射筒中。將無水DCM(4毫升)引入注射筒中且將該混合物於室溫振盪。2小時後，將溶液丟棄並將樹脂用DCM清洗14次並於真空中乾燥。

艾塞那肽連接子試劑中間體6d之合成：

於一圓底燒瓶中，將鄰甲酚(1.5毫升)，硫代苯甲醚(1.5毫升)，DTT(1.125克)，TES(1.125毫升)，及水(1.5毫升)溶解於TFA(37.5毫升)中。將6c(0.15毫莫耳，1.5克)於室溫時添加至經攪拌(250-350 rpm)的溶液中以得到均質懸浮液。繼續攪拌45分鐘。將溶液由樹脂小球中藉由過濾法分離出來，將小球用TFA清洗兩次(每次2毫升)並將清洗溶液與濾液合併。於氮氣流中將TFA由合併之溶液中移除。

將粗6d由濃縮溶液(約10毫升)中藉由添加二乙醚(30毫升)及劇烈振盪而沉澱出來。離心(2分鐘，5000 rpm)後，將上層清液丟棄並將沉澱物用二乙醚清洗兩次(每次20毫升)。

將乾燥的沉澱物溶解於一含有TCEP(114毫克，0.39毫莫耳)於30毫升含0.01% TFA(v/v)之1/19(v/v)乙腈/水之溶液中。將混合物於室溫培育15小時。將6d藉由於Materials and Methods中說明之RP-HPLC用150 x 30毫米Waters XBridge^TM BEH300 C18 10微米管柱及40毫升/分鐘之流速而純化。

多至12毫升之混合物負載於管柱上。該洗提係使用由5%至30%溶劑B之線性梯度(5分鐘)接著使用由30%至35%溶劑B之線性梯度(40分鐘)而進行。將含有產物6d之餾份集中並凍乾。純度：86%(215毫微米)產量：85.2毫克(19.2微莫耳，由2.00克樹脂起始)。MS m/z 1486.7=[M+3H]³⁺，(MW計算值=4460.0克/莫耳)。

實例7 艾塞那肽連接子試劑7之合成

艾塞那肽連接子試劑7係如於艾塞那肽連接子試劑6a-6d中說明者由在樹脂上支鏈完全經保護之含游離N-終端的艾塞那肽-4(336毫克，34微莫耳)起始而合成，但係使用Fmoc-L-丙胺酸-OH而非Fmoc-D-丙胺酸-OH。試劑係相應計量以便得到如6a-6d中所使用之相同比例。產量：13.4毫克MS：m/z 1487.4=[M+3H]³⁺(MW計算值=4460.0)

實例8 艾 塞那肽連接子水凝膠8之合成

將242.5毫克馬來醯亞胺官能化之水凝膠4(25.0微莫耳馬來醯亞胺基團)，如懸浮於pH 3.0之琥珀酸鹽緩衝液(20 mM，1 mM EDTA，0.01% Tween-20)填充至裝設有過濾料之注射筒中。將水凝膠用1/1(v/v)乙腈/水含有0.1% TFA(v/v)予以清洗10次。將含有艾塞那肽連接子試劑6d(122.7毫克，27.5微莫耳)於1/1(v/v)乙腈/水加0.1% TFA(3.7毫升)之溶液引出並於室溫振盪2分鐘而得到平衡之懸浮液。將334微升磷酸緩衝液(pH 7.4，0.5 M)加入並將注射筒於室溫攪動(600 rpm) 15分鐘。硫醇之消耗係藉由Ellman測試來監控。將該水凝膠用1/1(v/v)乙腈/水含0.1% TFA(v/v)清洗10次。

將氫硫基乙醇(47微升)溶解於1/1(v/v)乙腈/水+0.1% TFA(3毫升)及磷酸緩衝液(0.5毫升，pH 7.4，0.5 M)中。將溶液引出至注射筒中並將樣品於室溫攪拌(600 rpm)1小時。將溶液丟棄並將水凝膠用1/1(v/v)乙腈/水+0.1% TFA清洗10次。之後將水凝膠用琥珀酸鹽緩衝液(10 mM琥珀酸鹽，46克/升甘露糖醇，0.05% Tween-20，用Tris調整至pH 5.0)清洗10次並儲存於4℃。

艾塞那肽連接子水凝膠中之艾塞那肽含量係根據Materials and Methods來測定。

得到含量為30%(重量)之艾塞那肽。

實例9 於試管內之釋出動力學

將整份之艾塞那肽連接子水凝膠8(0.5毫克艾塞那肽)移轉至裝設有過濾料之注射筒中並用pH 7.4磷酸緩衝液(60 mM，3 mM EDTA，0.01% Tween-20)清洗5次。將水凝膠懸浮於相同緩衝液中並於37℃培育。於定出之時間點(每次於培育期1-7天後)，將上層清液交換且藉由於215毫微米之RP-HPLC而將釋出之艾塞那肽定量。集合相關於釋出之艾塞那肽的UV-訊號並對培育期作圖。

曲線擬合軟體係用來估量相關之釋出半生期。

得到半生期為45天之第一順位釋出動力學(參見圖1)。

實例10 艾塞那肽連接子水凝膠10之合成

艾塞那肽連接子水凝膠10係如於艾塞那肽連接子水凝膠8中說明者但用艾塞那肽連接子硫醇7而非艾塞那肽連接子硫醇6d來合成。

艾塞那肽連接子水凝膠中之艾塞那肽含量係根據Materials and Methods來測定。得到含量為30.5%(重量)之艾塞那肽。

實例11 利西拉來連接子試劑11 d之合成

合成圖示：

利西拉來連接子試劑中間體11a之合成：

將於樹脂上支鏈完全經保護之含游離N-終端的利西拉來(300毫克，負載約0.1毫莫耳/克)轉移至裝置有過濾料之5毫升注射筒中。將4毫升無水DMF引入注射筒中並將注射筒振盪(600 rpm) 15分鐘以便預膨脹該樹脂。將溶劑丟棄，並將含有Fmoc-D-丙胺酸-OH(28毫克，90微莫耳)，PyBOP(47毫克，90微莫耳)，及DIPEA(26微升，150微莫耳)於無水DMF(2毫升)之溶液引入注射筒中。將注射筒於室溫及600 rpm振盪60分鐘。將溶液排出，並將樹脂用DMF清洗10次。

Fmoc-去保護作用係根據“Materials and Methods”來進行。

利西拉來連接子試劑中間體11b之合成：

將一含有5c(41毫克，60微莫耳)於無水DMF(1.5毫升)之溶液添加至樹脂11a(30微莫耳)中，接著加入DIPEA(13微升，75微莫耳)，並將均質化之反應混合物於22℃振盪(600 rpm)22小時。

將樹脂用DMF清洗10次並於真空中乾燥。

利西拉來連接子試劑中間體11c之合成：

將3-硝基-2-吡啶-硫烯氯(38毫克，0.20毫莫耳)添加至一裝設有過濾料含有11b之注射筒中。將無水DCM(2毫升)引入至注射筒中並將混合物於室溫震盪(600 rpm)。於3.5小時後，將溶液丟棄並將樹脂用DCM清洗15次並於真空中乾燥。

利西拉來連接子試劑11d之合成：

於50毫升-Falcon管中，將NBu₄Br(2.9毫克)，硫代苯甲醚(58.3微升)，DTT(170毫克)，TES(170微升)，及水(113.3微升)溶解於TFA(5.83毫升)。於室溫時，將11c(30微莫耳)加入至經攪拌(200rpm)的溶液中以便得到均質之懸浮液。繼續攪拌1小時。將小球過濾出來並用TFA清洗兩次(每次1毫升)。清洗溶液與濾出液合併。

將粗11d由濾出液中(約10毫升)藉由添加冷二乙醚(-18℃，40毫升)及劇烈振盪而沉澱出來。將懸浮液於-18℃再冷卻15分鐘並離心(2分鐘，5000 rpm)。將上層清液丟棄並將沉澱物用二乙醚清洗2次(每次20毫升)並於減壓下乾燥。將沉澱物溶解於含有TCEP(27毫克，0.94微莫耳)於2.5毫升1/1(v/v)乙腈/水含0.01% TFA(v/v)之溶液中。將混合物於室溫培育1.5小時。將20毫升水加入並將11d藉由RP-HPLC用由5%至30%溶劑B(5分鐘)之線性梯度接著用由30%至35%溶劑B(40分鐘)之線性梯度以兩個流程予以純化。使用150 x 30毫米Waters XBridge^TM BEH300 C18 10微米管柱及40毫升/分鐘之流速。將含有產物11d之餾份集中並凍乾。產量6.1毫克MS：m/z 1284.3=[M+4H]⁴⁺(MW計算值=5131.9)。

實例12 利西拉來連接子水凝膠12之合成

利西拉來連接子水凝膠12係如於艾塞那肽連接子水凝膠8中說明者合成，但係使用利西拉來連接子硫醇11d而非艾塞那肽連接子硫醇6d。

利西拉來連接子水凝膠中利西拉來之含量係根據Materials and Methods來測定。得到32.4%之利西拉來含量。

實例13 利西拉來連接子試劑13之合成

利西拉來連接子試劑13係如利西拉來連接子試劑11a-11d中說明者合成，其係用於樹脂上支鏈完全經保護之含游離N-終端的利西拉來(335毫克，34微莫耳)起始，而非使用Fmoc-D-丙胺酸-OH。試劑係相應計量以便得到如11a-11d中所使用之相同比例。產量7.3毫克MS：m/z 1283.9=[M+4H]⁴⁺(MW計算值=5131.9)。

實例14 利西拉來連接子水凝膠14之合成

利西拉來連接子水凝膠14係如艾塞那肽連接子水凝膠8中說明者合成，但係使用利西拉來連接子硫醇13，而非艾塞那肽連接子硫醇6d。

利西拉來連接子水凝膠之利西拉來含量係根據Materials and Methods來測定。得到含量為34.5%(重量)之利西拉來。

GLP-1連接子試劑15之合成

GLP-1連接子試劑15係如利西拉來連接子試劑11a-11d中說明者合成，但係由於樹脂上支鏈完全經保護之含游離N-終端的GLP-1(258毫克，30微莫耳)起始而非於樹脂上之艾塞那肽。試劑係相應計量以便得到如11a-11d中所使用之相同比例。產量5.0毫克MS：m/z 1191.4=[M+3H]³⁺(MW計算值=3571.1)。

實例16 GLP-1連接子水凝膠16之合成

GLP-1連接子水凝膠16係如艾塞那肽連接子水凝膠8中說明者合成，但係使用GLP-1連接子硫醇15，而非艾塞那肽連接子硫醇6d。

GLP-1連接子水凝膠中之GLP-1含量係根據Materials and Methods來測定。得到含量為26.3%(重量)之GLP-1。

實例17 試管內之釋出動力學

艾塞那肽於pH 7.4，37℃由水凝膠10之釋出半生期，利西拉來由水凝膠12及14之釋出半生期，及GLP-1由水凝膠16之釋出半生期係如實例9中說明者測定。化合物8，10，12，14及16之釋出動力學係示於圖表1

實例18 連接子試劑18e之合成

連接子試劑18e係根據下列圖示來合成：

連接子試劑中間體18b之合成係於氮氣壓下進行。將含有胺18a(1.69克，4.5毫莫耳，製備法參見WO-A 2009/133137)於30毫升THF(乾，莫耳。過篩)之溶液冷卻至0℃。將氯甲酸丁酯(630微升，4.95毫莫耳)於3毫升THF(乾，莫耳。過篩)及DIPEA(980微升，5.63毫莫耳)加入。將混合物於0℃攪拌10分鐘，移除冷卻並將混合物於室溫再攪拌20分鐘。將1 M LiAlH₄於THF(9毫升，9毫莫耳)加入並將混合物回流1.5小時。反應物藉由緩緩添加甲醇(11毫升)及100毫升飽和Na/K酒石酸鹽溶液而驟冷。將混合物用醋酸乙酯萃取，將有機層於Na₂SO₄上乾燥並將溶劑於減壓下蒸發。粗產物(1.97克)未經進一步純化即使用於下個步驟。MS：m/z 390.2=[M+H]⁺(MW計算值=389.6)。

將含粗產物18b(1.97克)，N-(溴乙基)-酞醯亞胺(1.43克，5.63毫莫耳)及K₂CO₃(1.24克，9.0毫莫耳)於120毫升乙腈之溶液回流6小時。將60毫升飽和NaHCO₃溶液加入並將混合物用醋酸乙酯萃取3次。將合併之有機相乾燥(Na₂SO₄)，將溶劑於減壓下移除。將酞醯亞胺18c於矽膠上用庚烷(含有0.02% NEt₃)及提高量之醋酸乙酯(含有0.02% NEt₃)作為洗提液予以純化。產量：0.82克(1.46毫莫耳)MS：m/z 563.3=[M+H]⁺(MW計算值=562.8)。

將酞醯亞胺18c(819毫克，1.46毫莫耳)溶解於35毫升乙醇中並加入水合肼(176微升，3.64毫莫耳)。將混合物回流3小時。將沉澱過濾出來。將溶劑於減壓下移除並將殘質用15毫升二氯甲烷處理。將沉澱過濾出來並將二氯甲烷於減壓下移除。將殘質藉由RP HPLC予以純化。將集中之HPLC餾份藉由添加NaHCO₃而調整至pH 7並用二氯甲烷萃取數次。將合併之有機物乾燥(Na₂SO₄)並將溶劑於減壓下移除而得到胺18d。產量：579毫克(1.34毫莫耳)MS：m/z 433.3=[M+H]⁺(MW計算值=432.7)。

將對硝基苯基氯甲酸酯(483毫克，2.40毫莫耳)溶解於10毫升二氯甲烷(乾，莫耳。過篩)中。將一含有胺18d(1.00克，2.31毫莫耳)於5毫升二氯甲烷(乾，莫耳。過篩)及1.8毫升均-可力丁之溶液加入並於室溫攪拌40分鐘。將二氯甲烷於減壓下移除，將殘質用醋酸予以酸化並藉由RP-HPLC予以純化而產生對硝基苯基胺基甲酸酯18e。產量：339毫克(0.57毫莫耳)MS：m/z 598.3=[M+H]⁺(MW計算值=597.8)。

G LP-1連接子試劑19之合成

GLP-1連接子試劑19係如說明於GLP-1連接子試劑15者來合成，除了用連接子試劑18e來代替連接子試劑5c，由在樹脂上支鏈完全經保護之含游離N-終端的GLP-1(150毫克，16.5微莫耳)起始。試劑係相應計量以便得到如11a-11d中所使用之相同比例。產量：1.33毫克MS：m/z 1196.0=[M+3H]³⁺(MW計算值=3585.1)。

實例20 GLP-1連接子水凝膠20之合成

GLP-1連接子水凝膠20係如艾塞那肽連接子水凝膠8中說明者來合成，但用GLP-1連接子硫醇19來代替艾塞那肽連接子硫醇6d。

實例21 試管內之釋出動力學

於pH 7.4，37℃，由水凝膠20釋出之GLP-1的半生期係如實例9中者來測量。

縮寫：

AcOH　醋酸

AcOEt　醋酸乙酯

Bn　苄基

Boc　第三丁氧基羰基

DBU　1,3-二氮雜二環[5.4.0]十一碳烯

DCC　N,N-二還己基碳化二亞胺

DCM　二氯甲烷

DIPEA　二異丙基乙胺

DMAP　二甲基胺基-吡啶

DMF　N,N-二甲基甲醯胺

DMSO　二甲亞碸

DTT　DL二硫代蘇糖醇

EDC　1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺

EDTA　乙烯二胺四醋酸

eq　化學計算之當量

EtOH　乙醇

Fmoc　9-茀基甲氧基羰基

HPLC　高效液體色層分離法

HOBt　N-羥基苯並三唑

iPrOH　2-丙醇

LCMS　質譜法-偶合之液體色層分離法

Mal　3-馬來醯亞胺丙基

Mal-PEG6-NHS N-(3-馬來醯亞胺丙基)-21-胺基-4,7,10,13,16,19-六氧雜-廿一烷酸NHS酯

Me　甲基

MeOH　甲醇

Mmt　4-甲氧基三苯甲基

MS　質譜/質譜測定法

MTBE　甲基第三丁基醚

MW　分子量

NHS　N-羥基琥珀醯亞胺

PEG　聚(乙二醇)

PyBOP　苯並三唑-1-基-氧基-三-吡咯啶-鏻六氟磷酸鹽

Phth　酞醯亞胺基

RP-HPLC　逆相高效液體色層分離法

rpm　每分鐘轉數

RT　室溫

SEC　分子篩選色層分離法

TCEP　三(2-羧基乙基)膦氫氯酸鹽

TES　三乙基矽烷

TFA　三氟醋酸

THF　四氫呋喃

TMEDA　N,N,N',N'-四甲基乙烯二胺

Tris　三(羥基甲基)胺基甲烷

Trt　三苯基甲基，三苯甲基

UPLC　超性能液體色層分離法

v　體積

<110>　Sanofi-Aventis Deutschland GmbH

<120>　包含艾塞那肽連接子接合物之前藥

<130>　DE2010/304S

<160>　21

<170>　PatentIn版本3.5

<210>　1

<211>　39

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　希拉毒蜥

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(39)..(39)

<223>　醯化反應

<400>　1

<210>　2

<211>　39

<212>　PRT

<213>　希拉毒蜥

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(39)..(39)

<223>　醯化反應

<400>　2

<210>　3

<211>　31

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　艾塞那肽/艾塞那肽激動劑

<400>　3

<210>　4

<211>　31

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　艾塞那肽/艾塞那肽激動劑

<400>　4

<210>　5

<211>　30

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　艾塞那肽/艾塞那肽激動劑

<400>　5

<210>　6

<211>　30

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　艾塞那肽/艾塞那肽激動劑

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(30)..(30)

<223>　醯化反應

<400>　6

<210>　7

<211>　28

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　艾塞那肽/艾塞那肽激動劑

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(28)..(28)

<223>　醯化反應

<400>　7

<210>　8

<211>　39

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　艾塞那肽/艾塞那肽激動劑

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(39)..(39)

<223>　醯化反應

<400>　8

<210>　9

<211>　28

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　艾塞那肽/艾塞那肽激動劑

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(28)..(28)

<223>　醯化反應

<400>　9

<210>　10

<211>　28

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　艾塞那肽/艾塞那肽激動劑

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(28)..(28)

<223>　醯化反應

<400>　10

<210>　11

<211>　39

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　艾塞那肽/艾塞那肽激動劑

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(39)..(39)

<223>　醯化反應

<400>　11

<210>　12

<211>　39

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　艾塞那肽/艾塞那肽激動劑

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(39)..(39)

<223>　醯化反應

<400>　12

<210>　13

<211>　30

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　GLP-1(7-37)

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(30)..(30)

<223>　醯化反應

<400>　13

<210>　14

<211>　30

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　艾塞那肽/艾塞那肽激動劑

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(30)..(30)

<223>　醯化反應

<400>　14

<210>　15

<211>　31

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　GLP-1(7-37)

<400>　15

<210>　16

<211>　30

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　艾塞那肽/艾塞那肽激動劑

<220>

<221>　VARIANT

<222>　(3)..(3)

<223>　Pro,Phe或Tyr

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(30)..(30)

<223>　醯化反應

<400>　16

<210>　17

<211>　30

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　艾塞那肽/艾塞那肽激動劑

<220>

<221>　VARIANT

<222>　(2)..(2)

<223>　Tyr,α胺基丁酸(Abu),Val,D-Ala或Gly

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(30)..(30)

<223>　醯化反應

<400>　17

<210>　18

<211>　30

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　艾塞那肽/艾塞那肽激動劑

<400>　18

<210>　19

<211>　30

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　艾塞那肽/艾塞那肽激動劑

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(1)..(1)

<223>　修改：乙醯，焦榖胺醯基，N-2-羥基苯甲醯，N-反式-3-己烯醯基

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(30)..(30)

<223>　醯化反應

<400>　19

<210>　20

<211>　31

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　艾塞那肽/艾塞那肽激動劑

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(2)..(2)

<223>　Xaa: 6-胺基-己醯基

<220>

<221>　MPD_RES

<222>　(31)..(31)

<223>　醯化反應

<400>　20

<210>　21

<211>　44

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　利西拉來

<220>

<221>　MOD_RES

<222>　(44)..(44)

<223>　醯化反應

<400>　21

圖1係顯示化合物8、10、12、14及16於pH 7.4，37℃之釋出動力學。

Claims

一種前藥或其製藥上可接受的鹽，其包含艾塞那肽(exendin)連接子接合物D-L，其中D代表艾塞那肽部份；且-L為一以式(I)代表之非生物活性連接子部份-L¹，其中，該虛線係指藉由形成醯胺鍵而連接至艾塞那肽之胺基基團之一；R¹係選自C_1-4烷基；R²，R^2a係獨立選自由H及C_1-4烷基組成的群組之基團，其中L¹係被一個L²-Z所取代且任意進一步被取代，但式(I)中以星號標記之氫並未被取代基所代替且其中L²為單一化學鍵或一間隔子；且Z為一水凝膠。
如申請專利範圍第1項之前藥，其中L¹未進一步被取代。
如申請專利範圍第1或2項之前藥，其中R¹為-CH₃-。
如申請專利範圍第1至3項中任一項之前藥，其中L²為C_1-20烷基鏈，其係任意的被一個或多個獨立選自-O-；及C(O)N(R3aa)之基團所插入；任意的被一個或多個獨立選自OH；及C(O)N(R3aaR3aaa)之基團所取代；且其中R3aa，R3aaa係獨立選自由H；及C₁-C₄烷基組成的群組之基團。
如申請專利範圍第1至4項中任一項之前藥，其中L²係經由選自下列之終端基團而連接至Z
如申請專利範圍第1至5項中任一項之前藥，其中L係藉由式(Ia)代表其中該虛線係指藉由形成醯胺鍵而連接至艾塞那肽之氮；且其中L²為單一化學鍵或一間隔子(spacer)，Z為一水凝膠。
如申請專利範圍第1至6項中任一項之前藥，其中L係以式(II)代表其中該虛線係指藉由形成醯胺鍵而連接至艾塞那肽之氮且Z為一水凝膠。
如申請專利範圍第1至7項中任一項之前藥，其中該水凝膠為以包含主幹部份之水凝膠為主之PEG。
如申請專利範圍第8項之前藥，其中該主幹部份包含具下式之分支核：其中該虛線係指連接至主幹部份的其餘部份。
如申請專利範圍第8項之前藥，其中該主幹部份包含下式之結構：其中n為由5至50之整數且該虛線係指連接至分子之其餘部份。
如申請專利範圍第8至10項中任一項之前藥，其中該主幹部份包含下式之超支化部份Hyp：其中該虛線係指連接至分子之其餘部份；且以星號標記之碳原子係指S-構型。
如申請專利範圍第8至11項中任一項之前藥，其中該主幹部份包含至少一個下式之間隔子：其中虛線中之一個係指連接至該超支化部份Hyp且第二個虛線係指連接至分子之其餘部份；且其中m為由2至4之整數。
如申請專利範圍第8至12項中任一項之前藥，其中該主幹部份包含至少一個下式之間隔子：其中該以星號標記之虛線係指水凝膠及如申請專利範圍第5項中之硫代琥珀醯亞胺基團之N之間的鍵；其中另一虛線係指連接至Hyp；且其中p為由0至10之整數。
如申請專利範圍第8至13項中任一項之前藥，其中該主幹部份係經由包含下列結構之交聯劑部份而連接其中q為由3至100之整數。
一種製藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至14項中任一項之前藥或其製藥上可接受的鹽以及至少一個製藥上可接受的賦形劑。
如申請專利範圍第1至14項中任一項之前藥或如申請專利範圍第15項之製藥組成物，其係用作為醫藥品。
如申請專利範圍第1至14項中任一項之前藥或如申請專利範圍第15項之製藥組成物，其用於治療或預防可用艾塞那肽處理之疾病或障礙。
一種艾塞那肽-連接子試劑D-L*，其中D代表艾塞那肽部份；且-L*係以式(IV)代表之非生物活性連接子試劑，其中該虛線係指藉由形成醯胺鍵而連接至艾塞那肽之胺基基團之一；R¹係選自C_1-4烷基；R²，R^2a，係獨立選自由H及C₁-C₄烷基組成的群組之基團，其中L*係被一個L²*所取代且任意的進一步被取代，但於式(IV)中以星號標記之氫並未被取代基所代替且其中L²*為連接至L*之間隔子且包含一用來接合至水凝膠的化學官能基團。
一個艾塞那肽-連接子接合物中間體D-L’，其中L’為下式(III) 其中該虛線係指藉由形成醯胺鍵而連接至艾塞那肽之胺基基團之一。
一種製備如申請專利範圍第1至14項中任一項之前藥的方法，其包括下列步驟(a)　於室溫及4℃之溫度之間於pH 5.5-8之緩衝水溶液中將一包含馬來醯亞胺官能化之水凝膠微粒子之水性懸浮液與一包含申請專利範圍第17項之艾塞那肽連接子試劑的溶液接觸，其中該化學官能基團L²*包含硫醇基團，產生一艾塞那肽-連接子-水凝膠接合物；(b)任意的，將來自步驟(a)之艾塞那肽-連接子-水凝膠接合物於室溫及4℃之溫度間於pH 5.5-8之緩衝水溶液中用34 Da至500 Da的含有硫醇之化合物處理。
一種製備如申請專利範圍第1至14項中任一項之前藥的方法，其包括下列步驟(a)於室溫及4℃之溫度間於pH 5.5-8之緩衝水溶液中將一包含硫醇官能化之水凝膠微粒子之水性懸浮液與一包含申請專利範圍第18項之艾塞那肽-連接子試劑的溶液接觸，其中該化學官能基團L²*包含馬來醯亞胺基團，產生一艾塞那肽-連接子-水凝膠接合物；(b)任意的，將來自步驟(a)之艾塞那肽-連接子-水凝膠接合物於室溫及4℃之溫度間於pH 5.5-8之緩衝水溶液中用100至300 Da的含有馬來醯亞胺之化合物處理。
一種製備針形可注射之前藥的方法，其包括下列步驟(a)製備如申請專利範圍第1至14項中任一項之微粒形式的前藥；(b)將微粒過篩；(c)選擇直徑介於25及80微米之間的前藥小球部份；(d)將步驟(c)之小球部份懸浮於適於注射之水性緩衝溶液中。