TW201309723A - 新穎檜木花粉過敏原 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種新穎之檜木花粉症過敏原蛋白質、及使用其之檜木花粉過敏症之診斷藥、預防藥及治療藥等。本發明係一種選自以下之(a)~(c)中之檜木花粉過敏原或其片段肽：(a)包含以序列編號2所示之胺基酸序列的蛋白質；(b)包含於以序列編號2所示之胺基酸序列中置換、缺失或附加一個或數個胺基酸所得之胺基酸序列，且具有檜木花粉過敏原活性的蛋白質；(c)包含與以序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同源性之胺基酸序列，且具有檜木花粉過敏原活性的蛋白質。
Description
本發明係關於一種來自於檜木花粉之新穎過敏原蛋白質、及該蛋白質之利用。
花粉症係因吸入飛散在空中之花粉而發病，呈現出眼部瘙癢或疼痛等過敏性結膜炎、鼻炎、皮膚炎症或哮喘等症狀的過敏性疾病。已知有大量的導致花粉症之植物，在日本，最多之花粉症為柳杉花粉症。另一方面，在日本對診斷為柳杉花粉症之人士進行過敏檢查發現，多數人(61%)對檜木花粉亦顯示陽性反應。相對於柳杉花粉自2月中旬起全國性地開始飛散，檜木較其晚半個月至一個月開始飛散。繼柳杉於4月中旬結束飛散高峰之後，檜木接著持續一個月左右之飛散高峰。
檜木花粉之飛散量於昭和40年代(1965年~1975年)極少，但於之後之約20年間增加了3倍以上。柳杉之植樹造林於昭和20年代(1945年~1955年)集中地進行，於昭和40年代後半期(1970年~1975年)迎來開始飛散花粉之壯年期。檜木於柳杉植樹造林後之昭和30年代(1955年~1965年)集中地進行植樹造林，晚於柳杉迎來壯年期。根據近年來之比較，檜木之植被數量逐漸與柳杉之植被數量匹敵，可預想今後之檜木過敏症會不斷增加。
作為檜木花粉過敏原，迄今為止報告有Cha o 1、Cha o 2(專利文獻1、非專利文獻1及2)。已查明其等與作為柳杉花粉過敏原之Cry j 1、Cry j 2具有高交叉反應性(非專利文獻3及4)，因此，針對檜木花粉症，業界一直在研究利用包含Cry j 1或Cry j 2之柳杉花粉過敏原的免疫療法。然而，實際上於較多情形時該免疫療法對檜木花粉症並不奏效(非專利文獻5)，業界不斷尋求對檜木花粉特徵性之新穎過敏原蛋白質，以獲得有用性更高之檜木花粉症之免疫療法。
[專利文獻1] 日本專利特開平8-176192號公報
[非專利文獻1] Suzuki,M. et al.,Mol. Immunol.,33:451-460,1996
[非專利文獻2] Mori,T. et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun.,263:166-171,1999
[非專利文獻3] Sone,T. et al.,Clin. Exp. Allergy,35:664-671,2005
[非專利文獻4] Sone,T. et al.,Allergol. Int.,58:237-245,2009
[非專利文獻5] 岡野光博，Allergy vol.58，No.8、9，1188、2009
本發明係關於提供一種新穎之檜木花粉症過敏原蛋白質，以及使用其之檜木花粉過敏症之診斷藥、預防藥及治療藥等。
本發明者等人為解決上述問題而進行研究，結果成功地自檜木花粉粗抗原中，獲取了與來自於檜木過敏症患者之淋巴細胞及血清中IgE(immunoglobulin E，免疫球蛋白E)顯示高反應性的分子量為66 kDa左右之新穎之蛋白質，並發現其可用於檜木花粉過敏症之診斷藥、預防藥、或治療藥。
即，本發明係關於以下1)~11)者。
1) 一種選自以下之(a)~(c)之檜木花粉過敏原或其片段肽：
(a) 包含以序列編號2所示之胺基酸序列的蛋白質；
(b) 包含於以序列編號2所示之胺基酸序列中置換、缺失或附加一個或數個胺基酸所得之胺基酸序列，且具有檜木花粉過敏原活性的蛋白質；
(c) 包含與以序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同源性之胺基酸序列，且具有檜木花粉過敏原活性的蛋白質。
2) 一種基因，其係編碼選自以下之(a)~(c)之檜木花粉過敏原或其片段肽者：
(a) 包含以序列編號2所示之胺基酸序列的蛋白質；
(b) 包含於以序列編號2所示之胺基酸序列中置換、缺失或附加一個或數個胺基酸所得之胺基酸序列，且具有檜木花粉過敏原活性的蛋白質；
(c) 包含與以序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同源性之胺基酸序列，且具有檜木花粉過敏原活性的蛋白質。
3) 一種基因，其包含選自以下之(d)~(f)之多核苷酸：
(d) 包含以序列編號1所示之鹼基序列的多核苷酸；
(e) 與包含與以序列編號1所示之鹼基序列互補之鹼基序列的多核苷酸於嚴格之條件下雜交，編碼具有檜木花粉過敏原活性之蛋白質的多核苷酸；
(f) 包含與以序列編號1所示之鹼基序列具有90%以上之同源性之鹼基序列，且編碼具有檜木花粉過敏原活性之蛋白質的多核苷酸。
4) 一種檜木花粉過敏性疾病之預防或治療劑，其係以如上述1)之檜木花粉過敏原或其片段肽作為有效成分。
5) 一種檜木花粉過敏性疾病之診斷藥，其係以如上述1)之檜木花粉過敏原或其片段肽作為有效成分。
6) 一種抗體，其係針對如上述1)之檜木花粉過敏原或其片段肽者。
7) 如上述6)之針對檜木花粉過敏原之抗體，其為單株抗體。
8) 一種如上述1)之檜木花粉過敏原或其片段肽之用途，其係用以製造檜木花粉過敏性疾病之預防或治療劑。
9) 一種如上述1)之檜木花粉過敏原或其片段肽之用途，其係用以製造檜木花粉過敏性疾病之診斷藥。
10) 如上述1)之檜木花粉過敏原或其片段肽，其係用以預防或治療檜木花粉過敏性疾病。
11) 如上述1)之檜木花粉過敏原或其片段肽，其係用以診斷檜木花粉過敏性疾病。
本發明之檜木花粉過敏原蛋白質可利用於檜木花粉過敏症之診斷藥、預防藥及治療藥等。由於該檜木花粉過敏原蛋白質與Cha o 1、Cha o 2為不同之過敏原，故而藉由與該等組合，可實現更有效之減敏治療。
本發明之檜木花粉過敏原係選自以下之(a)~(c)之蛋白質或其片段肽：
(a) 包含以序列編號2所示之胺基酸序列的蛋白質；
(b) 包含於以序列編號2所示之胺基酸序列中置換、缺失或附加一個或數個胺基酸所得之胺基酸序列，且具有檜木花粉過敏原活性的蛋白質；
(c) 包含與以序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同源性之胺基酸序列，且具有檜木花粉過敏原活性的蛋白質。
(a) 之包含以序列編號2所示之胺基酸序列的蛋白質係藉由進行陽離子交換層析及陰離子交換層析，自檜木花粉分離、純化而得之蛋白質，其具有以下性質。
i) 若添加於檜木花粉症患者末梢血液細胞中，則誘導特異性淋巴細胞增殖。
ii) 與檜木花粉症患者之血清中IgE顯示結合反應。
iii) 使檜木花粉症患者之嗜鹼性細胞活化。
iv) 藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE，Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)所測定之分子量約為66 kDa。
因此，該蛋白質為與Cha o 1(分子量約為50 kDa)、Cha o 2(分子量為46 kDa)不同的新穎之檜木花粉過敏原。
本發明之檜木花粉過敏原中，只要具有檜木花粉過敏原活性，則包括：包含於該以序列編號2所示之胺基酸序列中，置換、缺失或附加一個或數個胺基酸所得之胺基酸序列的蛋白質(上述(b))。作為包含此種胺基酸序列之檜木花粉過敏原，例如可列舉含有以序列編號2所示之胺基酸序列之檜木花粉過敏原的異型體(isoform)等。
此處，所謂缺失、置換或附加之數個胺基酸，意指例如1~10個，進而較佳為1~5個胺基酸。又，上述附加包括向兩末端附加1~數個胺基酸。
作為異型體之具體例，例如可列舉於以序列編號2所示之胺基酸序列中，分別將第2位之Pro置換為Thr、第230位之Val置換為Ile，第271位之Val置換為Ile而成者。
此處，所謂「檜木花粉過敏原活性」，不僅指與肥胖細胞上之IgE結合，引發異位性(atopic)者產生立即型過敏反應的活性，亦包含僅與血清中之IgE結合之活性。
又，本發明之檜木花粉過敏原中，只要具有檜木花粉過敏原活性，則包括：包含對以序列編號2所示之胺基酸序列中相當之序列進行比對時，與以序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同源性之胺基酸序列的蛋白質((上述(c))。
此處，與以序列編號2所示之胺基酸序列之同源性較佳為95%以上，更佳為98%以上。該胺基酸序列之同源性例如可應用使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information，美國國家生物資訊中心之鹼基局部比對搜尋工具)，將選擇參數(option parameter)設為初始設定值進行計算之方法。
又，本發明之檜木花粉過敏原亦可為如融合蛋白般之更大之蛋白質之一部分。此處，作為可於融合蛋白中附加之序列，例如可列舉：多組胺酸殘基等有助於純化之序列、確保重組生產時之穩定性之附加序列等。
本發明之檜木花粉過敏原亦可為僅過敏原活性所必需之區域的片段肽。例如尤其可較佳地列舉包含可由檜木花粉症患者之T細胞特異性地識別之抗原決定區(T細胞抗原決定區)的部分片段。
本發明之基因為編碼上述檜木花粉過敏原或其片段肽者，可較佳地列舉：(d)包含以序列編號1所示之鹼基序列的多核苷酸；(e)與包含與以序列編號1所示之鹼基序列互補之鹼基序列的多核苷酸於嚴格之條件下雜交，且編碼具有檜木花粉過敏原活性之蛋白質的多核苷酸；(f)包含與以序列編號1所示之鹼基序列具有90%以上之同源性之鹼基序列，且編碼具有檜木花粉過敏原活性之蛋白質的多核苷酸。
(e)及(f)之多核苷酸中包含(d)之多核苷酸之變異體。該變異體包括天然之對偶基因變異體、或使用該領域中眾所周知之突變誘發技術可生成的天然不存在之變異體。
本發明之多核苷酸不僅包含雙鏈DNA(deoxyribonucleic acid，去氧核糖核酸)，亦包含構成其之正義鏈及反義鏈等各種單鏈DNA或RNA(ribonucleic acid，核糖核酸)。反義鏈可用作探針等。DNA包含如利用例如選殖(cloning)或化學合成技術、或者該等之組合而獲得的cDNA(complementary DNA，互補DNA)或基因組DNA等。進而，本發明之多核苷酸除編碼本發明之多肽之鹼基序列以外，亦可包含非轉譯區域(UTR)之序列或載體序列(包含表現載體序列)等鹼基序列。
此處，所謂嚴格之條件，例如可列舉：Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第二版，J. Sambrook et.al,1989)中所記載之條件等。亦即，使包含6×SSC(1×SSC之組成：0.15 M氯化鈉、0.015 M檸檬酸鈉、pH值為7.0)、0.5%SDS、5×Denhardt's溶液及100 mg/mL鮭精DNA之溶液與探針一併於65℃下恆溫8~16小時使其雜交之條件等。
又，與以序列編號1所示之鹼基序列之同源性較佳為95%以上，更佳為98%以上。該鹼基序列之同源性例如可應用使用BLAST，將選擇參數設為初始設定值而進行計算之方法。
作為上述多核苷酸之變異體，例如可列舉分別於以序列編號1所示之鹼基序列中，第88位之c變異為a、第264位之a變異為c、第681位之c變異為t、第772位之g變異為a、第792位之a變異為g、第870位之c變異為t、第895位之g變異為a、第1029位之g變異為a而成者。
本發明之檜木花粉過敏原基因可自檜木花粉選殖，作為選殖方法，可列舉使用已知之方式例如散彈槍(Shotgun)法、PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶連鎖反應)法而進行之方法。
例如，製備與本發明之多核苷酸之鹼基序列之一部分特異性地雜交之探針，使用該探針對基因組DNA基因庫或cDNA基因庫進行篩選即可。作為此種探針，只要為與本發明之多核苷酸或其互補鏈之至少一部分特異性地雜交之探針，則可使用任意序列及長度者。
又，本發明之基因亦可藉由使用適當之原理，獲取與包含一部分或全部本發明之基因之多核苷酸雜交的序列而獲得。例如可列舉：使用包含一部分上述本發明之基因之多核苷酸作為引子而進行之PCR法，使用包含一部分上述本發明之基因之多核苷酸作為探針之方法。
例如，使用PCR等擴增方式之方法中，藉由自本發明之多核苷酸之5'側及3'側之序列(或其互補序列)中分別製備引子，使用該等引子，將基因組DNA(或cDNA)等作為模板而進行PCR等擴增反應，擴增夾持於兩個引子間之DNA區域，而可大量地獲取包含該多核苷酸之DNA片段。
又，本發明所提供之基因例如亦可藉由利用有計劃或無規之突變導入法等方法，改變包含以序列編號1所示之鹼基序列之多核苷酸而製作。
此處，有計劃地導入突變時之突變計劃例如可藉由參考基因序列上之特徵序列而制定。又，作為無規地導入突變之方法，例如可列舉PCR法、利用突變原處理之方法。作為有計劃地導入突變之方法，可列舉部位特異之突變誘發法，更具體而言，可使用例如定點突變系統(Site-Directed Mutagenesis System)Mutan-Super Express Km試劑盒(Takara Bio)等來進行。又，亦可使用重組PCR法(PCR protocols,Academic Press,New York,1990)。
本發明之檜木花粉過敏原可藉由自檜木花粉分離純化而獲得。分離純化方法並無特別限定，例如使用凝膠過濾、離子交換層析、親和層析等先前公知之方法對檜木花粉萃取液進行分離、純化即可。
另外，可將藉由於適當之載體中組入本發明之基因而製作之重組載體導入至宿主細胞內，使檜木花粉過敏原蛋白質在細胞內或細胞外表現並收取。
用於插入本發明之基因之載體只要為可於大腸桿菌、枯草桿菌等細菌、酵母或動物細胞等宿主中複製者，則並無特別限定，例如可列舉質體DNA、噬菌體DNA等。構築表現載體所使用之載體DNA可使用廣泛地普及且容易獲得者。例如可列舉pUC19(Takara Bio)、pTV118N(Takara Bio)、pMAMneo(Clontech)、pGEX(GE Healthcare)、pET160(Invitrogen)、pDEST(Invitrogen)等。
為使用該重組載體將宿主轉形，可使用原生質體法、勝任細胞法、電穿孔法等進行。作為宿主並無特別限制，可使用任意者，例如可使用動物、來自於動物之細胞、植物、來自於植物之細胞、微生物等。
對所獲得之轉形體，只要使用包含可同化之碳源、氮源、金屬鹽、維生素等之培養基於適當之條件下培養即可。自以如上所述之方式獲得之培養液中，藉由通常之方法收取、純化蛋白質，藉此獲得本發明之檜木花粉過敏原。
本發明之檜木花粉過敏原或其片段肽可作為檜木花粉過敏性疾病之預防或治療劑，將其投予給需要者(患者)以預防或治療檜木花粉過敏性疾病。
此處，作為檜木花粉過敏性疾病，可列舉由檜木花粉之特異性抗原所引起之所有過敏性疾病，具體而言，例如可列舉異位性支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、異位性皮炎等。
該檜木花粉過敏性疾病之預防或治療劑例如可用作針對檜木花粉過敏性疾病之減敏療法劑。
本發明之檜木花粉過敏原蛋白質為與先前公知之Cha o 1、Cha o 2不同之過敏原，故而藉由與該等組合，可實現更有效之減敏治療。
將本發明之檜木花粉過敏性疾病之預防或治療劑用作減敏治療劑之情形時，較佳為將檜木花粉過敏原或其片段肽直接、或乾燥而製成粉末狀後使用，或者視需要藉由常法添加通常所使用之佐劑或各種添加劑，例如穩定劑、賦形劑、溶解助劑、乳濁劑、緩衝劑、鎮痛劑、防腐劑、著色劑等而製備成複合劑。
例如可將粉末狀之經純化之檜木花粉過敏原溶解於添加有苯酚之生理鹽水中，作為減敏治療用抗原之原液而使用。
本發明之檜木花粉過敏性疾病之預防或治療劑可藉由通常之投予路徑，例如經皮、經口、皮內、皮下、肌內、腹腔內等投予方法而進行。進而，例如亦可製成口含錠、舌下錠、滴眼劑、鼻腔內噴霧劑、敷劑、乳膏劑、洗劑等經皮、經黏膜藥而使用。
本發明之檜木花粉過敏性疾病之預防或治療劑之投予量及投予次數根據投予路徑、症狀等而不同，例如可在成人每一次約0.1~1000 μg之範圍內適當選擇，每週投予1次至數次左右。
本發明之檜木花粉過敏原或其片段肽可作為檜木花粉過敏性疾病診斷藥，將其投予給需要者(患者)以診斷檜木花粉過敏性疾病。
該檜木花粉過敏性疾病診斷藥可用作針對檜木花粉過敏性疾病之皮內反應診斷試劑等。
於用作皮內反應診斷試劑之情形時，可將藉由上述方法而獲取的本發明之檜木花粉過敏原或其片段肽例如乾燥並製成粉末狀，將其溶解於含有苯酚之生理鹽水中稀釋後使用。
針對本發明之檜木花粉過敏原或其片段肽之抗體為可與本發明之檜木花粉過敏原或其片段肽特異性地結合之抗體。上述抗體係指免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及該等之Fab片段、F(ab')2片段、Fc片段)，例如可列舉多株抗體、單株抗體、單鏈抗體、抗遺傳型抗體及人源化抗體，但並不限定於該等。
上述抗體可使用各種公知之方法製作，製作方法並無特別限定。
上述抗體可用於表現本發明之檜木花粉過敏原之生物體或者其組織或細胞之鑑定等。例如可用以測定大氣中或室內之空間或者人之黏膜中檜木花粉過敏原之有無等。該測定可藉由公知之免疫學方法進行，例如可藉由ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，酵素結合免疫吸附分析法)進行。
以下，藉由實施例對本發明具體地進行說明，但本發明並不受該等實施例之限定。
將檜木花粉4.2 g利用二乙醚脫脂3次並風乾。於經乾燥之花粉中添加萃取緩衝液(10 mM之Tris緩衝液、pH值為7.8)25 ml，利用鐵氟龍(Teflon)(註冊商標)均質機使其均質化。添加萃取緩衝液將容量調整為60 ml後，進而於4℃下混合1小時，然後進行離心分離(12,000 g、20分鐘)，獲得上清液。將該上清液添加於經10 mM之Tris緩衝液(pH值為7.8)平衡化之DE52陰離子交換管柱中，收集不吸附部分。將其利用10 mM乙酸緩衝液(pH值為5.0)進行透析，並使其吸附於經相同緩衝液平衡化之CM52陽離子交換管柱上，將利用含0.5 M之NaCl的10 mM之Tris緩衝液(pH值為7.8)梯度溶出者分組回收。藉由SDS-PAGE分析各組之一部分，並將包含分子量為66 kDa左右之蛋白質的組合並。將其結果示於圖1。
(i) 檜木花粉症患者淋巴細胞增殖應答
由自檜木花粉症患者(檜木RAST(Radioallergosorbent Test，放射變應原吸附試驗)≧2)獲取之末梢血液30 mL中單離末梢血液單核細胞，以成為1.11×106 cells/mL之方式懸浮於裝有10%患者自己血清之RPMI-1640培養基中。將所製備之細胞懸浮液180 μL與20 μL之純化蛋白溶液(濃度為85 μg/ml)播種至96孔培養盤中(2×105 cells/well)。於37℃、5%之CO2條件下培養3天後，添加3H-胸苷，測定直至16小時為止之摻入量作為放射活性，藉此評價細胞增殖。算出用添加純化過敏原時之3H-胸苷摻入量除以不添加時之摻入量所得的值作為刺激指數(Stimulation index)，將結果示於圖2。一般而言，於臨床檢查中之淋巴細胞刺激試驗中，係將刺激指數為1.8以上設為陽性基準(內田重行等人，肝臟，第30卷、第4號、439-443，1989)。依照該基準，15例中所有例判定為陽性。
(ii) 與檜木花粉症患者血清IgE之反應性之確認
製備本發明蛋白質為20 μg/mL之溶液，以成為1 μg/50 μL/well之方式添加於Maxisorp 96孔培養盤(Nunc)中後，於4℃下靜置一夜，藉此使抗原形成為固相。次日洗淨培養盤後，添加含有1%牛血清白蛋白之PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸鹽緩衝液)，於室溫下靜置1小時，藉此實施封閉。洗淨培養盤後，添加經5倍稀釋之患者血清，於室溫下靜置2小時。使用市售之人AB型血清(CELLectR Human AB serum，MP Biomedicals)作為陰性對照。洗淨培養盤後，添加利用含有1%牛血清白蛋白之PBS稀釋7000倍之第二抗體(HRP(Horseradish Peroxidase，辣根過氧化酶)標記羊抗人IgE抗體，Novus)，於室溫下靜置40分鐘。洗淨培養盤後，利用TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine，3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)基質試劑盒(BD Biosciences)於室溫靜置、遮光狀態下實施20分鐘TMB顯色。結束後，藉由添加1 N之硫酸而停止顯色，利用微盤分析儀測定波長450 nm之吸光度。將其結果示於圖3。
(iii) 檜木花粉症患者嗜鹼性細胞之活化
已知於經過敏原刺激之嗜鹼性細胞中，CD203c之表現增強(De Weck,AL. et al.,Int. Arch. Allergy Immunol.,146: 177-189,2008)。使用基於該原理之Allergenicity試劑盒(Beckman Coulter)，分析患者血液中之嗜鹼性細胞活化。於肝素採血之全血100 μl中添加本發明蛋白質過敏原溶液(最終濃度為1~100 ng/ml)20 μl與包含CD3-PC7、CRTH2-FITC及CD203c-PE之抗體混合物(antibody cocktail)20 μl，於37℃下培養15分鐘。添加反應停止液100 μl與溶血固定液2 ml，於室溫下反應10分鐘。進行離心分離(200×g、5分鐘)後，去除上清液，添加磷酸緩衝液(PBS)3 ml再次進行離心分離。去除上清液後，使細胞懸浮於添加有0.1%甲醛之PBS中，藉由流式細胞儀(FACScanto，BD Biosciences)進行測定。對於所獲得之資料，以CD3-PC7陰性且CRTH2-FITC陽性作為指標分選出血球中之嗜鹼性細胞，分析CD203c之表現強度。將具有代表性之結果示於圖4，發現於5例中之3例中，與僅添加PBS時相比，添加過敏原時CD203c之表現增強。
<N末端胺基酸序列之確定>
為明確本發明蛋白質之N末端序列，對經純化之蛋白質20 μg進行SDS-PAGE後，轉印至PVDF膜(polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯)上，切割出分子量66 kDa條帶附近之凝膠。藉由蛋白質序列分析儀(Procise 492cLC;Applied Biosystems)對其進行分析，結果獲得以下序列。Leu-Pro-Leu-Leu-Thr-Arg-Gly-Arg-Trp-Ile-Val-Asp-Glu-Ala-Thr-Gly-Leu-Arg-Val-Lys-Leu-Ala-X-Val-Asn-Trp-Val-Gly-His-Leu(X不詳)[部分序列1(序列編號3)]。
<部分內部胺基酸序列之確定>
為明確本發明蛋白質內部之部分胺基酸序列，對藉由蛋白酶進行限制性水解而獲得之片段加以分析。將純化蛋白質50 μg進行SDS-PAGE後，切割分子量66 kDa條帶附近之凝膠，於1 mL之純化水中進行攪拌、洗淨(20分鐘×2次)。添加300 μL的7 mol/L之胍/0.5 mol/L Tris-HCl(Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride，三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽)/0.01 mol/L EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)(pH值為8.5)及10 μL之2-巰基乙醇，進行氮氣置換與超音波處理後，於室溫下靜置2小時，藉此進行還原。繼而，添加10 μL之4-乙烯基吡啶，進行氮氣置換與超音波處理(1分鐘)後，於室溫下靜置30分鐘，藉此進行烷化。廢棄反應液後，重新添加1 mL之0.1 vol%三氟乙酸，確認為酸性後，攪拌1小時。廢棄溶液，於1 mL之0.025 mol/L碳酸氫銨/50 vol%乙腈中進行攪拌(20分鐘×2次)。廢棄溶液，於1 mL之乙腈中攪拌5分鐘後，廢棄溶液，利用離心蒸發器對凝膠進行減壓乾燥。以酵素/基質比1/20添加溶解於0.025 mol/L碳酸氫銨中之離胺酸肽鏈內切酶，靜置於冰上使凝膠膨潤1小時。追加0.025 mol/L碳酸氫銨，使溶液完全地滲透至凝膠中後，進而於37℃下反應17小時，回收反應液([1]液)。為萃取肽，於剩餘之凝膠中添加100 μL之0.1 vol%三氟乙酸/50 vol%乙腈，攪拌20分鐘後，回收萃取液([2]液)。進而於100 μL之乙腈中攪拌20分鐘後，回收萃取液([3]液)。混合[1]~[3]液並減壓濃縮後，置於逆相高速液體層析儀(XBridge C18)，以乙腈為0~80重量%之梯度進行溶出、區分。圖5中示出該溶出圖案。藉由蛋白質序列分析儀對圖5中之No.7之波峰之肽片段進行N末端胺基酸序列分析，結果獲得Ser-Pro-Leu-Ile-Ser-Thr-Asn-Glu-Cys-Ile-Cys-Ile-Thr-Asp-Ser-His-Cys-Tyr-Pro[部分序列2(序列編號4)]。
<檜木試劑RNA之萃取>
將於液態氮中冷凍粉碎之檜木試劑3 g添加於裝有植物RNA分離試劑(Plant RNA Isolation Reagent)(Invitrogen)25 ml之50 ml試管中並混和後，於室溫下靜置5分鐘。於4℃下進行離心分離(2600×g、5分鐘)後，藉由傾析，利用網眼尺寸為100 μm之篩網過濾上層。再次重複離心分離與過濾後，添加1/5倍量之5 M之NaCl與3/5倍量之氯仿。於4℃下進行離心分離(2600×g、30分鐘)後，回收上層，添加9/10倍量之異丙醇並攪拌。於室溫下靜置10分鐘後，於4℃下進行離心分離(2600×g、30分鐘)，使RNA沈澱。廢棄溶液，於RNA中添加75%乙醇10 ml進行洗淨。於4℃下進行離心分離(2600×g、5分鐘)後，廢棄上清液，於室溫下乾燥總RNA後，溶解於適量之純化水中。
<檜木試劑cDNA之製作>
使用用於RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，逆轉錄-聚合酶連鎖反應)之Superscript III第一鏈合成系統(Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR)(Invitrogen)，由所獲得之總RNA合成cDNA。使總RNA3 μg懸浮於8 μl之純化水中，添加1 μl之寡聚(dT)20、1 μl之10 mM之dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate，脫氧核糖核苷三磷酸)後，於65℃下培養5分鐘。於冰上冷卻2分鐘後，添加2 μl之10X RT緩衝液、1 μl之25 mM之MgCl2、2 μl之0.1 M之DTT(Dithiothreitol，二硫蘇糖醇)、1 μl之RNaseOUT(40 U/μl)、1 μl之SuperScript III逆轉錄酶並混和。於50℃下培養50分鐘後，於85℃下處理5分鐘後停止反應。
<cDNA序列之確定>
將所獲得之部分序列1作為檢索詞，檢索ForestGEN之資料庫時發現，與日本柳杉(Cryptomeria japonica)之Cluster Cj.5792之轉譯序列29個胺基酸中之26個胺基酸(89.7%)一致。同樣地，發現部分序列2與Cluster Cj.822之轉譯序列19個胺基酸中之17個胺基酸(89.5%)一致。進而，亦判明Cj.5792及Cj.822均與NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國國家生物技術信息中心)資料庫中之釀酒葡萄(Vitis vinifera)(歐洲葡萄vinifera種)之未命名蛋白質產品(登錄號：CAO65892)同源性較高。因此，設計對應於Cj.5792之鹼基序列中，與CAO65892及部分序列1之胺基酸序列同源性較高之區域的引子5'-AGA GTA AAG CTA GCA TGC GTC AAT TGG-3'(序列編號5)，以及對應於其下游中與CAO65892之胺基酸序列一致之區域的引子5'-CAG CAC AGC ACC ACT TGG GCT TAC TCA C-3'(序列編號6)。使用該等引子，將檜木試劑cDNA作為模板，進行利用KOD-Plus ver2聚合酶(TOYOBO)之PCR。使用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化PCR產物，使用用於定序之Zero Blunt TOPO PCR選殖試劑盒(Invitrogen)轉形為大腸桿菌(One Shot TOP10 Chemically Competent E coli;Invitrogen)。由所獲得之轉形體製備質體，使用BigDye Xterminator試劑盒(Applied Biosystems)與DNA定序儀(3130xl;Applied Biosystems)分析鹼基序列。根據所獲得之序列設計引子5'-CTG GTG TCA TGG TCA TAT TG-3'(序列編號7)。又，設計針對於序列2與Cj.822間胺基酸序列之同源性較高之區域的退化引子5'-GAG TCA GTG ATG CAI ATR CAY TC-3'(I=肌苷、R=A+G、Y=C+T)(序列編號8)。使用該等引子，將檜木試劑cDNA作為模板，進行利用KOD-FX聚合酶(TOYOBO)之PCR，分析所獲得之PCR產物之鹼基序列，獲取中間區域之序列。根據該中間區域序列，製作5'-GTT CAT CCT GCA TTT CCA CTC AAG G-3'(序列編號9)作為3'RACE(Rapid Amplification of cDNA End，cDNA末端快速擴增)用引子，使用GeneRacer試劑盒(Invitrogen)分析C末端序列。又，對於5'RACE，設定序列編號6及5'-CTC CGG ATT GTT GTG CTC GAT TC-3'(序列編號10)之二段之引子，使用5'/3'RACE試劑盒(Roche)分析N末端序列。其結果，獲得本發明之檜木花粉過敏原蛋白質之全長cDNA序列(序列編號1)及胺基酸序列(序列編號2)。
編碼本發明之檜木花粉過敏原蛋白質之cDNA包含1671bp之ORF(Open Reading Frame，開放式閱讀框)。根據鹼基序列而推測之胺基酸數為556。根據純化蛋白質之N末端胺基酸序列之結果，最初之28個胺基酸為訊息肽。因此，作為天然物之本發明之檜木花粉過敏原蛋白質之胺基酸數為528，根據該胺基酸序列而預想之本發明之檜木花粉過敏原蛋白質之分子量為59 kDa。由於SDS-PAGE中之分子量約為66 kDa，推測天然物之本發明之檜木花粉過敏原蛋白質受到糖鏈修飾。
使用DDBJ(DNA Data Bank of Japan，日本DNA資料庫)之BLAST檢索進行根據所確定之鹼基序列而推測之胺基酸序列的同源性檢索，結果與Cha o 1之同源性為10%以下，與Cha o 2之同源性為10%以下。
圖1係藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析檜木花粉粗萃取液及陽離子交換管柱層析溶出部分所得的圖。區帶1：檜木花粉粗萃取液，區帶2、3：分子量標準，區帶4：陽離子交換層析法之0.35 M之NaCl溶出部分，區帶5：陽離子交換層析法之0.50 M之NaCl溶出部分。
圖2係表示使用15名檜木花粉症患者(RAST得分≧2)之末梢血液單核細胞，測定由添加純化過敏原而引起之增殖反應之結果的圖。
圖3係表示使用16名檜木花粉症患者(RAST得分≧2)之血清，分析純化過敏原特異性IgE抗體效價之結果的圖。
圖4係表示檢測出檜木花粉症患者之末梢血液中之嗜鹼性細胞藉由純化過敏原而活化，CD203c之表現增強之情況的流式細胞儀之結果的圖。
圖5係表示為分析部分內部胺基酸序列，而藉由逆相管柱層析對利用離胺酸肽鏈內切酶將純化過敏原分解後之產物進行分離所得的溶出圖案的圖。
<110> 日商大鵬藥品工業股份有限公司
<120> 新穎檜木花粉過敏原
<130> TH0073
<140> 101103128
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<151> 2011-01-31
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<213> 檜木
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<221> 新特徵
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<223> 未知
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<212> DNA
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<221> 新特徵
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<223> n代表i
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Claims (11)
- 一種選自以下之(a)~(c)之檜木花粉過敏原或其片段肽，(a) 包含以序列編號2所示之胺基酸序列的蛋白質；(b) 包含於以序列編號2所示之胺基酸序列中置換、缺失或附加一個或數個胺基酸所得之胺基酸序列，且具有檜木花粉過敏原活性的蛋白質；(c) 包含與以序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同源性之胺基酸序列，且具有檜木花粉過敏原活性的蛋白質。
- 一種基因，其係編碼選自以下之(a)~(c)之檜木花粉過敏原或其片段肽者：(a) 包含以序列編號2所示之胺基酸序列的蛋白質；(b) 包含於以序列編號2所示之胺基酸序列中置換、缺失或附加一個或數個胺基酸所得之胺基酸序列，且具有檜木花粉過敏原活性的蛋白質；(c) 包含與以序列編號2所示之胺基酸序列具有90%以上之同源性之胺基酸序列，且具有檜木花粉過敏原活性的蛋白質。
- 一種基因，其包含選自以下之(d)~(f)之多核苷酸：(d) 包含以序列編號1所示之鹼基序列的多核苷酸；(e) 與包含與以序列編號1所示之鹼基序列互補之鹼基序列的多核苷酸於嚴格之條件下雜交，編碼具有檜木花粉過敏原活性之蛋白質的多核苷酸。(f) 包含與以序列編號1所示之鹼基序列具有90%以上之同源性之鹼基序列，且編碼具有檜木花粉過敏原活性之蛋白質的多核苷酸。
- 一種檜木花粉過敏性疾病之預防或治療劑，其係以如請求項1之檜木花粉過敏原或其片段肽作為有效成分。
- 一種檜木花粉過敏性疾病之診斷藥，其係以如請求項1之檜木花粉過敏原或其片段肽作為有效成分。
- 一種抗體，其係對於如請求項1之檜木花粉過敏原或其片段肽之抗體者。
- 如請求項6之對於檜木花粉過敏原之抗體，其為單株抗體。
- 一種如請求項1之檜木花粉過敏原或其片段肽之用途，其係用以製造檜木花粉過敏性疾病之預防或治療劑。
- 一種如請求項1之檜木花粉過敏原或其片段肽之用途，其係用以製造檜木花粉過敏性疾病之診斷藥。
- 如請求項1之檜木花粉過敏原或其片段肽，其係用以預防或治療檜木花粉過敏性疾病。
- 如請求項1之檜木花粉過敏原或其片段肽，其係用以診斷檜木花粉過敏性疾病。
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