TW201306837A - 使用ｐｉ３ｋ抑制劑及ｍｅｋ抑制劑用於治療癌症之組成物及方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種治療癌症患者之方法，其中該方法包括：向患者投與有效量之MEK抑制劑及有效量之PI3K抑制劑。另外亦描述其中將MEK與PI3K抑制劑組合之組成物。

Description

使用PI3K抑制劑及MEK抑制劑用於治療癌症之組成物及方法 相關申請案之交互參照

此申請案係主張於2010年12月9日申請之美國臨時申請案號61/421,465、2011年1月26日申請之美國臨時申請案號61/436,258、及2011年3月25日申請之美國臨時申請案號61/467,485之優先權，其皆以參考方式並於本文中。

在癌症治療中一直對更有效之方法及組成物存在著持續需求。本申請案總體而言係針對用於治療癌症之組成物及方法，尤其針對包括促分裂原活化蛋白激酶(MEK)及/或磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)路徑之抑制劑的組成物及方法。

利用MEK激酶抑制劑治療之腫瘤細胞通常係經由對ERK磷酸化的抑制、細胞週期蛋白D的調降、G1停滯的誘發而產生反應，並最終經歷細胞凋亡。就藥理學而言，MEK抑制可完全停止BRaf異體移植腫瘤中的腫瘤生長，然而在大多數情況下Ras突變體腫瘤僅表現出部分抑制(D.B.Solitetal.,Nature 2006；439：358-362)。因此，MEK已成為癌症治療開發者極感興趣的目標。

N-((S)-2,3-二羥基丙基)-3-(2-氟-4-碘-苯基胺基)異菸鹼醯胺(亦稱為MSC1936369或AS703026)為一新穎 的MEK之別位抑制劑。其具有相對較高的效力及選擇性，當在10μM濃度下進行測試時對217激酶或90非激酶標的無活性。AS703026在小鼠及大鼠中之體內PK特徵是可接受的，並且具有相對較高的口服生物可用率(52-57%)、中等或高清除率(0.9-2.6 L/h/kg)以及中等或長半衰期(2.2-4.7 h)。小鼠對該化合物具有相對良好的耐受性，2周最大耐受劑量為60mg/kg(每天給藥2次)。

N-(3-{[(3-{[2-氯-5-(甲氧基)苯基]胺基}喹噁啉-2-基)胺基]磺醯基}苯基)-2-甲基丙胺醯胺(亦稱為XL147或SAR245408)及2-胺基-8-乙基-4-甲基-6-(1H-吡唑-5-基)吡啶並[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(亦稱為XL765或SAR245409)係I型PI3K脂激酶之選擇性抑制劑。XL147抑制下游效應子Akt及S6核糖體蛋白質(S6RP)的磷酸化，並且僅將PI3K異構體(抑制劑濃度，即IC₅₀值，奈莫耳(nM)：PI3Kα 39、PI3Kβ 383、PI3Kδ 36、PI3Kγ 23)作為標的。XL765係以PI3K異構體(IC₅₀值/nM：PI3Kα 39、PI3Kβ 113、PI3Kδ 43、PI3Kγ 9)及mTOR(157 nM)作為標的。

單獨口服XL147或XL765可抑制載有異體移植物之小鼠中的腫瘤生長，其中PI3K訊息傳遞被活化，例如PTEN缺乏PC-3前列腺癌、U87-MG神經膠母細胞瘤、A2058黑色素瘤及WM-266-4黑色素瘤、或者PIK3CA突變MCF7乳腺癌。XL147目前正在進行數個實體腫瘤及/或淋巴瘤患者的一期試驗、以及子宮內膜癌或激素受體陽性乳癌患者的二期試驗。目前正在實體腫 瘤、淋巴瘤或神經膠母細胞瘤患者的一期臨床試驗、以及激素受體陽性乳癌患者的一期/二期試驗中，對XL765進行測試。

然而，仍然存在著對更有效抑制細胞增生及腫瘤生長同時使患者毒性最小化的癌症治療劑之需求。尤其存在著對更有效且不大幅增加或者甚至保持或減小本技術領域中傳統使用之MEK或PI3K抑制劑的劑量之MEK或PI3K抑制劑治療藥的需求。

本發明之一方面係提供組成物以及其在各種癌症治療中之用途。

於具體實施方式中，本發明提供一種組成物，該組成物包括具有以下結構式的化合物： (MSC1936369或者AS703026或者MSC6369)、以及選自由以下兩者化合物所組成之群組 (XL147或SAR245408)及

(XL765、SAR245409或MSC0765)

本發明之另一方面係提供治療癌症患者之方法，該方法包括向患者投與治療有效量的式(1)之化合物或其藥學可接受之鹽、連同式(2a)或式(2b)之化合物或其藥學可接受之鹽。

在一實施方式中，治療癌症患者之方法包括向患者投與第一劑量的MEK抑制劑及第二劑量的PI3K抑制劑，其中該MEK抑制劑具有以下結構式：

並且該PI3K抑制劑係選自由以下各化合物所組成之群組 及

在一些實施方式中，本發明方法涉及治療選自由非小細胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、大腸癌、肝癌、肌癌、血液腫瘤、黑色素瘤、子宮內膜癌及胰腺癌之癌症所組成之群組。此外，癌症係選自由大腸癌、子宮內膜癌、血液 系統腫瘤、甲狀腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌及前列腺癌所組成之群組。

在一些實施方式中，本文中所述之組成物及使用方法係以協同地減小患者腫瘤體積的量而使用(即，在組成物中或者在給藥劑量下使用)。在其他實施方式中，該協同組合實現了腫瘤停滯或腫瘤消退。

本發明之另一方面係提供一種用於治療癌症之組合物，該組合物包含：治療有效量的(A)式(1)之化合物或其藥學可接受之鹽、以及(B)式(2a)或式(2b)之化合物或其藥學可接受之鹽。

在一實施方式中，本發明係提供包括治療有效量的(A)式(1)之化合物或其藥學可接受之鹽與(B)式(2a)或式(2b)之化合物或其藥學可接受之鹽的組合物之用途，用於製備供治療癌症之藥劑。

本發明之另一方面係提供套組，該套組包括(A)式(1)之化合物或其藥學可接受之鹽、(B)式(2a)或式(2b)之化合物或其藥學可接受之鹽、以及(C)使用說明書。

通過下述的詳細說明買本發明的其它目的、特徵及優點將得以顯而易見。該詳細說明及具體實例僅以說明為目的，因為透過此詳細說明，熟習該項技術者將瞭解本發明之精神與範圍內的各種變化及修改。另外，實例展示了本發明之原理，不能預期藉由將對熟習該項技術者而言顯而易見的所有有用的實例特定解釋為本實例。

詳細說明

本發明之一方面係提供用於治療癌症患者之方法。 在一實施方式中，該方法包括向患者投與治療有效量的MEK抑制劑及治療有效量的PI3K抑制劑，如以下進一步之說明。

在一實施方式中，本發明之方法及組成物包括具有以下結構式的MEK抑制劑：

本文中根據結構式(1)的MEK抑制劑稱之為“化合物(1)”，亦稱為MSC1936369、AS703026或MSC6369。化合物(1)之製備、特性及MEK-抑制能力見於，如公開號為WO06/045514的國際專利公開案，尤其是其中的實例115及表1。WO06/045514的全部內容以引用的方式併入本文中。結構式(1)之化合物的中性及鹽形式皆在本文考慮範圍內。

在其他實施方式中，本發明之方法及組成物包括一種PI3K抑制劑，其具有以下結構之一： 或

本文中根據結構式(2a)的PI3K抑制劑稱之為“化合物(2a)”，亦稱為XL147或SAR245408。本文中根據結構式(2b)的PI3K抑制劑稱之為“化合物(2b)”，亦稱為XL765、SAR245409或者MSC0765。化合物(2a)之製備及特徵見於，如公開號為WO07/044729的國際專利公開案，尤其其中的實例357。WO07/044729的全部內容以引用的方式併入本文中。化合物(2b)之製備及特性見於，如公開號為WO 07/044813的國際專利公開案，尤其是其中的實例56。WO07/044813的全部內容以引入方式併入本文中。

在一些實施方式中，上述化合物為非溶劑化物。在其它實施方式中，本發明方法中使用的化合物中之一 種或兩種係採用溶劑化物的形式。如該技術領域所知，該溶劑可以是任何藥學可接受之溶劑，例如水、乙醇等。一般而言，溶劑的存在與否對上述MEK或PI3K抑制劑的效力並無顯著影響。

儘管具有式(1)、式(2a)及式(2b)之化合物被描繪成採用其中性形式，但在一些實施方式中，這些化合物則以藥學可接受之鹽的形式而使用。該鹽可以藉由該技術領域所熟知的任意方法而獲得，例如WO07/044729中詳細描述之任意方法，其內容以引用的方式併入本文中。本發明化合物之“藥學可接受之鹽”係指藥學可接受且保持藥理活性之鹽。應理解的是，藥學可接受之鹽類係無毒。關於適宜的藥學可接受之鹽類的其它資訊，可參見Remington's Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA，1985，或者S.M.Berge，et al.，Pharmaceutical Salts，J.Pharm.Sci.，1977；66：1-19，這兩篇文獻的內容以引用的方式併入本文中。

藥學可接受之酸加成鹽的實例包括：與無機酸，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成鹽的實例；以及與有機酸類，例如乙酸、三氟乙酸、丙酸、已酸、環戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、草酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、3-(4-羥基苯甲醯基)苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、對甲苯磺酸、樟腦磺酸、葡庚糖酸、4,4'-亞甲基二-(3-羥基-2-烯-1-甲酸)、3-苯基丙酸、 三甲基乙酸、三級丁基乙酸、十二基硫酸、葡萄糖酸、麩胺酸、羥基萘甲酸、水楊酸、硬脂酸、黏康酸、對甲苯磺酸、及水楊酸等形成鹽的實例。

在第一組實施方式中，將式(1)之MEK抑制劑與式(2a)或(2b)之PI3K抑制劑同時給藥。同時給藥通常表示兩種化合物正好在同時進入患者體內。然而，同時給藥亦包括MEK抑制劑及PI3K抑制劑於不同時間進入患者的可能性，但是時間上之差異足夠地微小以致第一次投與化合物在第二次投與之化合物進入前並未對患者產生效果。此種延遲的時間通常相當於小於1分鐘，更典型的小於30秒。

在一實例中，其中化合物係溶解於溶液中，藉由投與包括化合物之組合的溶液劑可實現同時給藥。在另一實例中，可以單獨溶液實施同時給藥，其中一個溶液包括MEK抑制劑而另一個溶液包括PI3K抑制劑。在一實例中，其中該化合物係採用固體形式，可以藉由投與包括該化合物組合的組成物而實現同時給藥。

在其它實施方式中，MEK抑制劑與PI3K抑制劑並非同時給藥。就這一點而言，在投與第二次給藥的化合物之前，提供的第一次投與之化合物已對患者生效。一般而言，該時間差並不超過第一次投與之化合物的藥效在患者體內耗盡之時間，或者不超過第一次給藥之化合物被完全或基本上消除或者在患者體內失去活性的時間。在一組實施方式中，MEK抑制劑係在PI3K抑制劑之前給藥。在另一組實施方式中，PI3K抑制劑係在MEK抑制劑 之前給藥。非同時給藥中之時間差通常大於1分鐘，可以是，例如準確地為至少、高達或短於5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、2小時、3小時、6小時、9小時、12小時、24小時、36小時、或48小時。

在一組實施方式中，以治療有效(亦即，治療的)量或劑量投與MEK抑制劑及PI3K抑制劑中之一種或兩種。“治療有效量”為當以其自身形式投與患者時有效治療癌症(例如，抑制腫瘤生長、停止腫瘤生長、或者導致腫瘤消退)之MEK抑制劑或PI3K抑制劑的量。在給定情況下證明是“治療有效量”的量，對於特定受試者而言，當以與治療本發明之疾病或在考慮之中的條件下給予相似治療，甚至該劑量被本領域醫生認為是“治療有效量”時，對受試者而言，可能不會100%有效。對應於治療有效量之化合物的量，很大程度地取決於癌症的類型、癌症的階段、受治患者的年齡以及其他因素。一般而言，這些化合物之治療有效量在該技術領域是眾所周知的，例如在上述引用的支援參考文獻中所提供的。

在另一組實施方式中，以亞治療(sub-therapeutically)有效量或劑量投與MEK抑制劑及PI3K抑制劑中的一種或兩種。亞治療有效量為當以其自身投與患者時MEK抑制劑或PI3K抑制劑隨時間推移並不能完全抑制預期標的之生物活性的量。

無論以治療量或者以亞治療量給藥，MEK抑制劑與PI3K抑制劑之組合皆應該有效治療癌症。當與PI3K抑制劑組合時，若該組合可有效治療癌症，則亞治療量的 MEK抑制劑可以是有效量。

在一些實施方式中，化合物之組合物在治療癌症尤其在減小患者腫瘤體積方面顯出協同效應(亦即，大於加成作用)。在不同的實施方式中，根據所使用之組合及所用的有效量，化合物之組合可以抑制腫瘤生長並達到腫瘤停滯、或者甚至獲得顯著或完全的消除腫瘤的效果。

在一些實施方式中，以大約7-120 mg的劑量每天1次(qd)口服(po)給藥化合物(1)。同時可以大約12-600 mg的劑量每日1次口服給藥化合物(2a)。可以大約15-90 mg的劑量每日1次口服給藥化合物(2b)。

本文中所使用之術語“大約”一般表示不大於該值的10%、5%、或1%的可能差別。例如，廣義上講“大約25 mg/kg”，通常表示22.5-27.5 mg/kg的值，亦即25±10 mg/kg。

雖然MEK抑制劑及PI3K抑制劑的量應導致癌症的有效治療，但是該量，當聯合給藥時，優選對患者不產生用藥過度毒性(即，該量優選在醫學指導中所確定的毒性極限之內)。在一些實施方式中，為防止用藥過度毒性和/或提供更有效的癌症治療，而提供一個給藥總劑量的限制。通常，本發明所考慮的量係每日劑量；然而，本發明亦將考慮半天和2天或3天週期的劑量。

不同之給藥方式可能被用於治療癌症。在一些實施方式中，每日劑量，例如上述示例性劑量中的任意劑量，係每天1次、2次、3次、或4次給藥，達3、4、5、6、7、8、9、或10天。根據癌症的分期及嚴重程度，可採用連 同高劑量給藥的較短的治療時間(例如，高達5天)、或者採用連同高劑量給藥的較長的治療時間(例如10天以上、或數周、或者個月或者更長時間)。在一些實施方式中，隔1天，投與1次或2次的日劑量。在一些實施方式中，每個劑量包括MEK抑制劑及PI3K抑制劑，而在其他實施方式中，每個劑量包括MEK抑制劑或PI3K抑制劑。在其他實施方式中，部分劑量同時包括MEK抑制劑與PI3K抑制劑，而其他劑量僅包括MEK抑制劑或PI3K抑制劑。

本發明所治療之癌症類型的實例包括但不侷限於：淋巴瘤、肉瘤及惡性腫瘤，例如纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴血管肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、淋巴管內皮瘤、依紋氏肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、食管癌、鱗狀上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺惡性腫瘤、皮脂腺癌、乳頭狀惡性腫瘤、乳頭狀囊腺瘤、囊腺癌、甲狀腺髓質癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、威爾姆氏腫瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質瘤、星狀細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤；白血病，例如，急性淋巴細胞性白血病及急性骨髓細胞性白血病(骨髓性、髓球性、骨髓單核細胞性、單核球性及紅血球性白血病)；慢性白血病 (慢性骨髓細胞性(顆粒球性)白血病及慢性淋巴性白血病)；以及真性紅血球增多症，淋巴瘤(何傑金氏病及非何傑金氏病)、多發性骨髓瘤、巨大球蛋白血症及重鏈病。

在一些實施方式中，被治療之癌症係選自由非小細胞肺癌、乳癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、大腸癌、肝癌、及肌癌所組成之群組。在其他實施方式中，癌症係選自由大腸癌、子宮內膜癌、血液系統癌症、甲狀腺癌、三重陰性乳癌或黑色素瘤。

本發明所考慮之患者通常為人類。然而，患者可以是癌症治療所適宜的任何哺乳動物。因此，本文中所述的方法可用於人類及獸類用途。

本文中使用之術語“治療”係指，至少是，減緩異常的細胞增殖之方法。例如，該方法可以降低患者體內的腫瘤生長速率、或者阻止腫瘤的繼續生長、或者甚至減小腫瘤的尺寸。

本發明之另一方面係提供預防動物之癌症的方法。就這一點而言，“防止”表示動物在接觸或傾向於發生疾病但尚未經歷或顯示疾病症狀時，導致該疾病的臨床症狀在動物體內的不再發展。該方法包括向患者投與MEK抑制劑及PI3K抑制劑，如本文中所述。在一實例中，預防動物之癌症的方法包括向動物投與式(1)之合物或其藥學可接受之鹽，結合投與選自式(2a)及式(2b)或其藥學可接受之鹽所組成的群組之化合物。

MEK及PI3K抑制化合物，或者其等藥學可接受之 鹽類或其溶劑化物形式，以純的形式或者以合適的藥物組成物形式，可經由任何可接受之給藥方式或者該領域已知的方式而給藥。例如，該化合物可口服給藥、鼻內給藥、胃腸外途徑(靜脈給藥、肌內、或者皮下給藥)、局部給藥、經皮給藥、陰道給藥、膀胱內、腦池內、或直腸給藥。例如，劑型可為固體、半固體、凍乾粉、或液體劑型，例如片劑、丸劑、軟彈性膠囊或硬膠囊、粉劑、溶液劑、懸浮液、栓劑、氣霧劑，或其它類似劑型，優選適於以精確劑量簡單給藥之單位劑型。具體給藥途徑為口服途徑，尤其是一種可以根據被治療疾病的嚴重程度對常規的每日給藥方案進行調節的給藥方式。

在另一方面，本申請係有關於一種組成物，其包含式(1)所示的MEK抑制劑和選自式(2a)及(2b)所示的化合物的PI3K抑制劑組成的組成物。在一些實施方式中，該組成物僅包括上述MEK抑制劑及PI3K抑制劑。在其他實施方式中，該組成物係採用包括MEK抑制劑及PI3K抑制劑之固體形式(例如，粉劑或片劑)，並且視情況包括一種或多種固體形式的輔料(例如佐劑)或藥物活性化合物。在其他實施方式中，該組合物進一步包括本技術領域眾所周知的藥學可接受之載體(即，媒劑(vehicle)或賦形劑(excipient))的一種或者組合，藉此提供液體劑型。

輔料及佐劑可能包括，如防腐劑、保濕劑、懸浮劑、甜味劑、調味劑、芳香劑、乳化劑、和分散劑。防止微生物作用，一般係由各種抗菌劑及抗黴菌劑所提供，例如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸和其它類 似物。亦可包括等滲劑，如糖類、氯化鈉，其它類似等滲劑也可能包括在內。藉由使用藥劑吸收延緩劑可以實現可注射劑型之延長吸收，如單硬脂酸鋁及明膠。輔料亦可以包括濕潤劑、乳化劑、pH緩衝劑、以及抗氧化劑，如檸檬酸、脫水山梨醇月桂酸酯、油酸三乙醇胺、二丁基羥基甲苯，及其類似吸收延緩劑。

適於胃腸外注射之劑型可包括生理可接受之無菌水溶液劑或非水溶液劑、分散劑、懸浮液或乳劑、及用於重新組成無菌可注射溶液之無菌粉劑、或者分散劑。適宜的水性及非水性載體、稀釋劑、溶劑或賦形藥之實例包括：水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油、及其它類似物)、其合適的混合物、植物油類(例如橄欖油)、及可注射的有機酸酯如油酸乙酯。如，藉由使用包衣材料如卵磷脂、藉由在分散劑存在的情況下，維持所要求的顆粒大小和藉由表面活性劑的使用，適當的流動性可得以保持。

用於口服之固體劑型包括：膠囊、片劑、丸劑、粉劑、及顆粒劑。在此種固體劑型中，該活性化合物與至少一種常用惰性賦形劑(或載體)如檸檬酸鈉或磷酸二鈣；或者(a)填充劑或增量劑，例如澱粉類、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、及矽酸；(b)黏合劑，例如纖維素衍生物、澱粉、海藻酸鹽類、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、及阿拉伯樹膠；(c)保濕劑，例如甘油；(d)崩散劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、海藻酸、交聯羧甲基纖維素鈉、矽酸複鹽、及碳酸鈉；(e)溶解延緩劑，例 如石蠟；(f)吸收促進劑，例如四級銨化合物；(g)濕潤劑，例如十六醇、及單硬脂酸甘油酯、硬脂酸鎂及其它類似濕潤劑；(h)吸附劑，例如高嶺土及皂土；以及(i)潤滑劑，例如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂醇硫酸鈉、或者其混合物。在膠囊、片劑、及丸劑之情況下，該劑型亦可能包括緩衝劑。

上述固體劑型可用包衣材料和外殼材料製備，如用腸溶包衣以及其它本領域公知包衣製備。這些材料可包括舒緩劑，且其可是在腸管某一部位以延遲方式釋放活性一種或多種化合物之組成物。可以使用的包埋組成物的示例為高分子質及蠟類。適當情況下，活性化合物亦可採用微膠囊化劑型，該微膠囊由上述提到一種或多種賦形劑製成。

用於口服之液體劑型包括藥學可接受之乳劑、溶液劑、懸浮液、糖漿、及酏劑。此種劑型係例如藉由將本文中所述的MEK抑制劑或PI3K抑制劑化合物或其藥學可接受之鹽、以及可選擇的藥學佐劑溶解、分散等方法置於載體、助溶劑及乳化劑、油類、或其混合物、及其它類似物中製備而成，其中該載體為諸如水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、甘油、乙醇及其它類似載體；助溶劑及乳化劑為諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺；油類，尤其棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油、甘油、四氫呋喃甲醇、聚乙二醇以及失水山梨醇之肪酸酯；或這些所述物質的混合物等，這些藉此形成溶液劑或懸浮液。

除活性化合物之外的懸浮液可包括懸浮劑，例如乙氧基化的異硬脂醇類、聚氧乙烯山梨醇及山梨醇酐酯、微晶型纖維素、偏氫氧化鋁、皂土、瓊脂及黃蓍膠、或者這些所述物質的混合物及其他類似物。

用於直腸給藥之組成物，例如栓劑，可以藉由將本文中所述的化合物與混合製備而成，例如其中合適的無刺激性賦形劑或載體為諸如，可可脂、聚乙二醇或者栓劑蠟，其在常溫下為固定但在體溫下為液體因而可在適宜的體腔中熔化並向該體腔中釋放活性成分。

用於局部給藥之劑型可包括：例如軟膏、粉劑、噴霧劑、及吸入劑等。在無菌條件下，將有效成分與生理可接受之載體以及任何需要的防腐劑、緩衝劑、或拋射劑相混合。亦可使用眼用藥、眼用軟膏、粉劑、及溶液劑。

一般而言，根據預期的給藥方式，藥學可接受之組成物將包括重量百分比大約為1%至99%的本文中所述的化合物或其藥學可接受之鹽、以及重量百分比大約為99%至1%之藥學可接受之賦形劑。在一實例中，該組成物的重量百分比大約為5%至75%的組分為本文中所述的化合物或其藥學可接受之鹽，剩餘部份為合適的藥學賦形劑。

製備此類劑型的實際方法係已知，或者對熟習該項技術者顯而易見。參考舉例如Remington's Pharmaceutical Sciences，18th Ed.,(Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1990)。

在一些實施方式中，該組成物並不包括包括一種或 多種其他抗癌化合物。在其他實施方式中，該組合物包括一種或多種其它抗癌化合物。例如，所投與之組成物可包括用於所選擇治療之腫瘤類型的標準治療劑。

本發明之另一方面係提供套組。根據本發明之套組包括包括本發明化合物或組成物之包裝。在一實施方式中，該套組包括化合物(1)或其藥學可接受之鹽、以及一種選自由化合物(2a)及化合物(2b)所組成之群組的化合物，或選自該群組的化合物的藥學可接受之鹽。

片語“包裝”表示含有本文所述化合物或組成物之任何容器。在一些實施方式中，包裝可以是盒或者包覆材料。用於對藥物產品進行包裝之包裝材料，對於熟習該項技術人員來說是眾所周知的。藥物包裝材料之實例包括但不限於：瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、器皿、注射器、瓶子以及適用於所選劑型和給藥及治療預期模式之任何包裝材料。

該套組亦可包括不包括在包裝內但附在包裝外部的物件，例如移液管。

套組可包括將本發明化合物或組成物投與患者的說明書。套組亦可包括用於管制機構，例如美國食品藥物管理局，批准使用本文中所述的化合物之說明書。套組亦可以包括用於本發明化合物的標示或產品說明書。包裝及/或任何產品說明書可能經管制機構批准。該套組可以包括在包裝中的固相或液相(例如所提供之緩衝劑)化合物。該套組亦可包括用於製備溶液劑以供實施本發明方法的緩衝劑、以及將液體從一個容器轉移至另一個容 器的移液管。

以下將給出實例來說明和描述本發明之某些具體實施方式。然而，本專利申請範圍並不以任何方式受限於本文所提供之實例。

實例1 化合物(1)與化合物(2b)組合之體外活性

此項研究描述了各個抗癌劑化合物(1)及化合物(2b)以及它們的組合在一組81個癌細胞株中之活性。經選擇的細胞株用以代表具有許多不同遺傳變異及生化特性之17種不同的適應症。另外，該研究包括靜止期外周血單核細胞，PBMC，以作為用於非增殖細胞的模型。各個活性分佈結果進一步被用於上述使用一組81個細胞株的化合物(1)與化合物(2b)的組合研究。該研究也對化合物(1)及化合物(2b)的活性分佈與300多種已知的抗癌劑進行比較。

在進行體外聯合給藥研究之前，使用一組82個細胞株來研究各個藥劑的活性。測試各個藥劑之目的是為了確定各個藥劑的單獨作用。另外，與已知抗癌劑的活性分佈之比較，可有助於形成有關於化合物作用的可能機制之假說。

材料及方法

細胞株係直接購自ATCC、NCI、CLS、及DSMZ細胞株保存中心。母庫及工作樣本得以準備。用於研究之 細胞已經歷小於20次傳代。為確保無潛在的污染及錯誤的分配，所有細胞株係均經全基因組掃描(美國Agilent公司)和以STR分析進行檢測。對於用於該研究之所有細胞株，不存在黴漿菌及SMRV污染已得到確認。

在添加有10% FCS(PAN，德國)的100 U/ml青黴素G及100 μg/ml鏈黴素的存在條件下，細胞株在供應商推薦的培養基中生長。RPMI 1640、DMEM、及MEM Earle’s培養基係購自Lonza公司(德國，科隆)；添加劑2mM L-麩醯胺、1 mM丙酮酸鈉及1% NEAA係購自PAN公司(德國艾登巴赫)，2.5%馬血清及1個單位/ml胰島素係購自Sigma-Aldrich公司(德國慕尼克)。RPMI培養基被用於培養下列細胞株：5637、22RV1、786O、A2780、A431、A549、ACHN、ASPC1、BT20、BXPC3、CAKI1、CLS439、COLO205、COLO678、DLD1、DU145、EFO21、EJ28、HCT15、HS578T、IGROV1、JAR、LOVO、MCF7、MDAMB231、MDAMB435、MDAMB436、MDAMB468、MHHES1、MT3、NCIH292、NCIH358M、NCIH460、NCIH82、OVCAR3、OVCAR4、PANC1005(添加胰島素)、PBMC、PC3、RDES、SF268、SF295、SKBR3、SKMEL28、SKMEL5、SKOV3、SW620、U2OS、UMUC3、及UO31。

DMEM被用於A204、A375、A673、C33A、CASKI、HCT116、HEPG2、HS729、HT29、J82、MG63、MIAPACA2(添加馬血清)、PANC1、PLCPRF5、RD、SAOS2、SKLMS1、SKNAS、SNB75、T24、及TE671。 MEM Earle’s培養基被用於CACO2、CALU6、HEK293、HELA、HT1080、IMR90、JEG3、JIMT1、SKHEP1、SKNSH、及U87MG。

將細胞置於HeraCell 150培養器(Thermo Scientific，德國)，5% CO₂環境條件下生長。

以下是研究中使用之化合物的列表：

如上表中所示，化合物(1)及化合物(2b)之母液在DMSO(德國Sigma-Aldrich公司)中得以製備。將母液進一步等分並且將其在-20℃氬氣下保存。

以蒸餾水製備10% w/v之三氯乙酸TCA(Sigma-Aldrich，德國)。以1%乙酸(Sigma-Aldrich)製備0.08% wt/v磺醯羅丹明B，SRB(Sigma-Aldrich，德國)溶 液。三羥甲基胺基甲烷係購自Karl Roth公司(德國)。

細胞生長及處理均在96孔微量滴定板CELLSTAR®(Greiner Bio-One，德國)上進行。將利用胰蛋白酶從指數生長期培養物中收集的細胞以最佳植入密度鋪在150 μl的培養基中。確定各細胞株之最佳植入密度以確保實驗期間的指數增長。根據目視檢測，無抗癌劑的所有細胞生長在治療結束時均是亞融合狀態。

在96孔硬質PCR板中將化合物稀釋於DMSO中。然後，將化合物以1：250之比率稀釋於RPMI培養基中。

於24小時預生長期後，藉由將150 μl的細胞與50μl的含該化合物之培養基(形成0.1%的最終DMSO濃度)混合而對細胞進行處理，使細胞在37℃下生長72小時。另外，全部實驗包括一些帶有24小時恢復期後立即進行測量處理之細胞的板。這些板包括含有關於在治療前存在的，即在零時間存在的，細胞數量資訊，並且用於計算細胞毒性。

治療後，藉由加入10% TCA而使細胞沉澱。在固定前，以上述方式抽吸出培養基。在4℃下進行1小時培養後，用400 μl去離子水清洗培養板2次。然後，用100μl的0.08% wt/v SRB對細胞染色。將培養板靜置至少30分鐘，然後用1%乙酸清洗6次以去除未結合的染料。將培養板在室溫下乾燥，用100 μl的10 mM三羥甲基胺基甲烷將結合的SRB溶解。利用Victor2培養板測試儀(Perkin Elmer，德國)，在560 nm下測量光密度。A375及H460細胞株之SRB值接近飽和(2.5 OD單位)，這是由於這些細胞 的高蛋白質含量，而不是細胞融合。取代在560 nm處，而在520 nm這些對這些細胞之測量。

在體外聯合給藥研究前，利用一組80個細胞株對各個藥劑的活性進行研究。測試各個藥劑的目的是確定其單獨作用。另外，與已知抗癌劑活性分佈的比較可能有助於形成關於化合物作用的可能機制之假說。

計算使用的術語由DTP NCI引入。將來自各微量滴定板的未處理的光密度資料保存於MS Excel或者作為文本(text)文檔保存於數據庫。資料處理的第一步是計算各板的基於含培養基的無細胞的孔之平均背景值。然後，將平均背景光密度自合適的對照值(含有細胞，不添加藥物)、代表用抗癌劑治療的細胞之值、含有零時間細胞之孔的值中去除。因此，各實驗獲得以下值：對照細胞生長，C；抗癌劑存在下的細胞T_i、以及化合物治療前的零時間的細胞T_z(或T₀，在一些出版物中)。

Z-因數係通常用以評估檢測性能的質量的參數，其依照以下方程式計算得出： 式中μ_c+及μ_c-表示陽性及陰性對照信號之平均值，σ_c+及σ_c-為其標準偏差。在單向分析中，Z'-因數反映被記錄測量的動態範圍的顯著性，並且應>0.5。在此研究中，應用Z'-因數來確定T_z及C值之溢出背景的信號顯著性。對每個案例，僅當Z-因數高於0.5時，該掃描結果才會被接 受。

利用內部開發演算法(in-house developed algorithm)及可見性工具執行非線性曲線擬合計算。該演算法類似於前述演算法，並經均方差或者MSE模型進行補充。可以將此計算與商用方法進行比較，例如XLfit(ID Business Solutions Ltd.,Guild-ford,UK)演算法“205”。該計算包括帶最佳近似線之劑量反應曲線，50%效果之95%信賴區間(見下文)。

用以表示抗癌劑效果的常見方法是以%T/C×100表示的測量藥劑存在下之細胞生存率及存活率。該存活率與劑量之間的關係稱為劑量反應曲線。兩個主要值被用於無需顯示曲線的情況下說明此關係：存活率為50%或生長抑制率為50%(IC50)時的測試藥劑的濃度、及存活率為10%或生長抑制率為90%(IC₉₀)時的測試藥劑濃度。

利用這些測量值，可以計算由於化合物活性所導致的細胞生長的不完全抑制(GI)、細胞生長(TGI)的完全抑制之細胞反應和細胞的淨損失(LC)。50%(GI₅₀)之生長抑制可計算為100×[(Ti-T_z)/(C-T_z)]=50。該值是在藥物培養期與對照細胞中的蛋白質凈增加相比導致50%降低之藥物濃度。換言之，GI₅₀係零時間之經校正的IC₅₀。類似於IC₉₀，對於所有測試化合物，亦報告計算得到的GI₉₀值。通過使T_i=T_z，TGI被計算得出。LC₅₀是導致藥物培養期結束時與培養開始時相比所測量的蛋白質下降50%之藥物濃度。該值計算為100×[(Ti-T_z)/T_z]=-50。然而，由於72小時治療，因此要求低細胞植入密度，因此LC₅₀ 可能很少實現。

計算機自動計算IC₅₀、IC₉₀、GI₅₀、GI₉₀和TGI值。所有劑量反應曲線的可見性分析得以完成以檢查擬合算法的質量。在該效果未達到或者被超過的情況下，將該值近似或者表示為“-”。在本研究中，所有值皆大於最大測試藥物濃度。在這些情況下，將該值從分析中排除，或者取IC₁₀及GI₁₀的近似值用於分析。

對所有值進行log10-轉換，以用於分析。該轉換確保資料更好地適合常態分佈，一種應用任何統計工具之先決條件。使用Oncolead公司開發的版權軟體作為資料庫分析工具進行統計學分析。然而，除了資料庫對比之外，亦可以利用MS Excel或者STATISTICA®(StatSoft，Hamburg)重複分析。利用MS Excel：確認平均值，例如平均GI₅₀(功能：“平均值”)；計算δ，delta(GI₅₀-平均GI₅₀)；以及Z分數(功能(function)“標準化”)。可以利用Pearson與Spearman相關係數法(例如藉由使用STATISITCA(R))進行化合物(1)及化合物(2b)交叉相關之活性分佈比較。另外，利用Pearson配對比較及Spearman配對比較來增加結果的可信度。基於該藥劑與資料庫中所有測試藥劑的配對相似度，計算配對比較。

Z分數是報告標準差而不是絕對差值及平均值的方法。它表示該值偏離其平均值的程度，單位為標準差： 其中，X為單個測量值(例如GI₅₀)，μ為所有量測值的平 均值(平均GI₅₀)，σ_x為X之標準偏差。

由NCI引入的平均值圖表之概念能夠使用於所有細胞中的給定抗癌藥物的一個細胞的活性參數視覺化。該圖產生一個特徵模式，該特徵模式提供了用於視覺比較的豐富資訊。該值被繪製為自平均值的平條。因此，每個水平條代表該化合物在給定細胞株中的偏離在所有細胞株中的平均值的相對活性。與NCI相反，Z分數值不是描繪成絕對差值。就統計學而言，z-值代表一種標準差，該標準差提供一種標準化和簡化的具有不同活性分佈的化合物之間比較。另外，相同起源的細胞株之平均複合Z分數也得以計算。

Z分數值以及測試濃度的範圍被包括在所有視覺化中。若藥劑的活性不符合常態分佈，則Z分數圖的適用性應被謹慎考慮。

對於各藥劑，使用用於每種藥劑的Z分數，藉由利用方框圖或者藉由選擇8種最敏感與最不敏感細胞株，使最敏感及最不敏感之細胞株可視化。此方法亦適用於藥劑活性不能確定之細胞株。方框圖由5個值構建而成：最小值(最低鬚)、第一四分值(方框的下邊線)、中值(在中部的方形)、第三四分值(方框的上邊線)、及最大值(最高鬚)。

設計篩選以用來確定潛在的增效組合。利用所有及/或5x5或7x7矩陣的部份來設計研究方案。除非另作說明，將Bliss獨立性用作計算的基礎。以下參數得以計算：δ _i =Measured value _i -Theoretical value _i

其中i=[1..n]為所使用矩陣的值中的一個值以及如Bliss獨立性方法中所描述方式計算的理論值i。以如下方式確定向量和(Vector sum)： 在此方面，向量和(Vector sum)代表標量：

低於-0.5之平均值表示強協同作用：(-0.5，-.02)-協同效果，(-0.2，.02)-零效果(相加)、(0.02，0.5)-潛在拮抗、以及高於0.5-強拮抗。然而，亦有可能組合的效果並非協同(或者甚至是拮抗)但仍然是優於各單個藥劑。再者，在體內研究中，任何優於單個藥劑的情況均被認為是臨床陽性(或者具協同作用)。在此情況下，考慮藉由最高單個藥劑HSA模型所確定的兩個藥劑的潛在相互作用。該模型確定在相同濃度下由混合物中的藥劑中的各單個藥劑所產生的較大效果之間的差異。

Single Best _i =Best of[Agent 1 _i ；agent 2 _i ]且可以按如下方式確定兩個藥劑的△HSA_i：delta HSA _i =δHSA _i =Measured value _i -Single Best _i 及

體外結果之總結

化合物(1)之效力從敏感細胞株的4-5 nM至最不敏感之細胞株的最小活性值50μM之間有較大不同。在測試條 件下，可以確定以下癌細胞株的最小活性：A673、HEK293、J82、JAR、JEG3、MDAMB436、MDAMB468、MHHES1、NCIH82、PANC1、PLCPRF5、及SF268。對於細胞株CLS439、EFO2、1 PC3、SAOS2、SF295、及SKOV3，活性值估計高於50μM的最高測試濃度。與此同時，50%之測試細胞株顯示低於500nM(中值為490 nM)的敏感性，並且發現82個細胞株中的27個細胞株對於低於100nM的化合物(1)敏感。化合物(1)與化合物(2b)在大量的人類癌症細胞株中的作用具有協同性，這提示化合物的作用機制係互補的。A673細胞對化合物(1)或化合物(2b)單獨使用的作用不敏感，但是在聯合給藥的情況下顯示強協同作用。A549及MCF7細胞對兩個藥劑顯示出部分敏感，其潛力可藉由它們的組合得以發掘。SKBR3細胞株對化合物(2b)非常敏感。然而，藉由這兩個藥劑的組合可以進一步增強該效果。這些發現可能與所有乳癌細胞株均具有HER2基因的過量表達相關。

最敏感之細胞株為HT29、COLO205、TE671、A375、SKMEL5、COLO678、SKNAS、及NCIH292，在此化合物(1)在4.8至8 nM之間顯示出活性。最敏感細胞株與最不敏感細胞株之間的差異高達10,000倍。由於此種大範圍的活性，因此活性分佈較寬並且不遵循常態分佈。在此情況下，Z分數具有很小的統計學意義；然而，它仍然適用，如對依治療適應症的組活性。

化合物(1)活性的等級(或者Z分數值的等級)是另一種可以利用的工具。化合物(1)的這些特性強調了使用不 同分析工具並且涵蓋大的濃度範圍來測試抗癌劑的必要性。一種可能性是化合物(1)具有特定的作用機制，並且僅作用於腫瘤細胞的亞群。

81個人癌細胞株代表17不同的腫瘤源。第15A圖及第15B圖顯示1個腫瘤源組內的各個Z分數、以及各治療適應症之複合Z分數，作為平均值(綠色三角)。如各個Z分數中的情況，朝向左邊點的方向指向對化合物作用的敏感性。零線對應於平均活性。該數據提示肺、胰臟、結腸、和黑色素瘤細胞株總體而言對化合物(1)更為敏感，因而該Z分數之平均值是在左側。除一個胰臟(PANC1)細胞株外，其餘細胞株對化合物(1)作用係非常敏感。HT1080亦是非常敏感之細胞株。

化合物(2b)在細胞株中之活性，GI₅₀值範圍在細胞株A204、IMR90、MDAMB468、SKBR3、CAKI1、及IGROV1(最敏感，如Z分數<-1.5所確定那樣)中的<500 nM至細胞株SW620、COLO678、及HCT116(非敏感細胞株，z分數>1.5)中的>4 μM之範圍內。這些結果可能暗示顯示與平均值有最強Z分數負偏差的細胞株，在其它生物系統中也將顯示活性，例如在小鼠異體移植模型中。所有81個細胞株中，平均GI₅₀值為1.3-1.4μM，該值係基於l0g10-轉換的資料而計算得出。在停滯的PBMC中顯示無活性提示化合物(2b)可優先作用於增殖細胞。第16A圖及第16B圖顯示活性分佈較窄，但敏感細胞株可被較好鑑別。

化合物(2b)活性分佈與包括300多種各種抗癌劑的內部資料庫的比較，鑒定出多種藥劑。最相似的藥劑(平 均相似度高於0.8)為MSC2208382A。相似度較低(高於0.7)為GDC-0941甲磺酸及ZSTK474、有些相似的為MSC2313080A。GDC-0941甲磺酸係PI-103之類似物，一種雙重PI3K/mTOR抑制劑，且其被認為是I類PI3K酶的相對特異性抑制劑，其也被稱為ZSTK474。這可能提示化合物(2b)屬於PI3K抑制劑類。

如單個Z分數中的情況，朝向左邊點的方向指向對化合物作用的敏感性。零線對應於平均活性。卵巢及前列腺腫瘤可能是特異性治療區域。至少對於所有測試細胞株，Z分數低於零。在乳癌、肺癌、及腎癌中的應用亦應該被考慮。然而，每個適應症包括對化合物(2b)作用非常敏感或不敏感之細胞株。

儘管在體外研究中在化合物(1)與化合物(2b)聯合給藥的情況下，絕大多數細胞株顯示出潛在的協同作用，但是向量和低於-1的結果可認為具有顯著性意義。表1及第17圖總結該結果。細胞株A673對單獨化合物(1)或化合物(2b)的作用係不敏感，但是在合併給藥情況下顯示出強協同作用。然而，從體內或臨床角度來看，細胞株組4與細胞株組5可能更為相關。化合物(1)在A549及MCF7細胞中之活性(GI₅₀)分別為300 nM及150nM，其具有與最敏感細胞株中的100nM活性的可比性。化合物(2b)在A549及MCF7細胞中之活性(GI₅₀)分別為1.15μM及1.6μM，低於或接近此藥劑的1.3-1.4 μM的平均活性。這些細胞株的組合指數接近於-1，組合指數係協同作用的指標。另一實例為SKBR3。此細胞株對化合物(2b)係非 常敏感而對化合物(1)則不敏感。然而，藉由兩個藥劑之組合使用可以進一步增加此作用效果。

化合物(1)及化合物(2b)作用於增殖細胞並且在靜止的PBMC中顯示無活性。然而，這些藥劑在其活性中各異。化合物(1)的最敏感與最不敏感細胞株之間的差異高達10,000倍。對於最不敏感細胞株而言，耐藥性超過測試濃度範圍，>50μM。

因此，似乎化合物(1)可能具有特定的作用機制並且僅作用於腫瘤細胞的亞群。藉由突變分析，臨床中的治療適應症的選擇可得到補充。相反，化合物(2b)在細胞株中顯現較窄的活性。敏感細胞株與不敏感細胞株的分離具有顯著性意義，但活性差異在10-20倍之範圍內。化合物(2b)的活性分佈與PI3K抑制劑具有相似性，例如PI-103或其藥物類似物GDC-0941。對於藥劑的活性以及涉及PI3K路徑(例如EGFR、PTEN、及PI3K)活化的基因突變狀態還沒有預測。某些標誌可能是依賴此PI3K抑制劑作用的細胞凋亡誘導的預測物：EGFR(突變)、HER2(擴增)、MET(突變/擴增)。間接地，該事實可被觀察到的SKBR3細胞(HER2擴增)為最敏感細胞株所支持。

利用7×7矩陣進一步對化合物(1)與化合物(2b)組合在所有細胞株中的作用進行檢測，每種藥劑之偏差係在所有細胞株的平均GI₅₀的附近。用於選擇此濃度的理論基礎如下。首先，此濃度係說明細胞模型中之抗癌劑效力之參考濃度，即僅顯示低於平均GI₅₀的顯著作用的細胞株。第二，顯示出抗癌劑之效力是有限的，根據一些 報導為10-30%。因此，平均GI₅₀的選擇相當於大約50%的預計效力。第三，由7×7矩陣形成的偏差(在兩個方向上幾乎為10倍，相當於平均GI₅₀)產生足夠的解答這兩個藥劑之間是否存在任何可能的相互作用的問題的範圍。

在幾乎所有的情況下，化合物(1)與化合物(2b)聯合給藥顯示協同的潛力(第17圖)，如通過Bliss獨立性模型(詳見，例如，Yan et al.,BMC Systems Biology,4：50(2010))所確定的那樣。亦見於第18A圖、第18B圖、第18C圖、第18D圖、第18E圖、第18F圖、第19A圖、第19B圖、第20A圖、第20B圖。

然而，當任一藥劑的活性較弱時，最強協同作用檢測得到。這可能是，至少部分是由於實驗設定的原因，也即若這些藥劑的單獨給藥導致對細胞作用微小，則任何組合效果，如果該效果作用於該細胞的話，均被認為具有顯著意義。可選地，單個藥劑的作用可以過強以致無法檢測出增強作用。在後一種情況下，HSA模型提供兩個藥劑之間的潛在相互作用的更好檢驗。

實例2 化合物(1)與化合物(2b)或化合物(2a)合併抗SCID小鼠載有的皮下人結腸癌HCT 116之體內活性

為了評估MEK抑制劑化合物(1)與PI3K抑制劑化合物(2a)或雙重pan-PI3K/mTOR抑制劑化合物(2b)聯合給藥之抗腫瘤活性，而使用載有人類結腸癌HCT 116(KRAS及PIK3CA突變體)異體移植物之雌性SCID小鼠進行實驗。4次研究得以完成：

在第一研究中，以5 mg/kg的低劑量的化合物(1)與30 mg/kg的化合物(2b)及50及75 mg/kg的化合物(2a)的組合進行測試。

在第二研究中，將化合物(1)的劑量增加至10及20 mg/kg，聯合20 mg/kg的化合物(2b)，和將10 mg/kg的化合物(1)與50及75 mg/kg的化合物(2a)聯合給藥。

在第三研究中，作為確認研究，化合物(1)之劑量為10及20 mg/kg，聯合50及75 mg/kg的化合物(2a)合併給藥。

在第四研究中，作為確認研究，化合物(1)之劑量為10及20mg/kg，聯合20 mg/kg的化合物(2b)合併給藥。

材料及方法

將購自美國Charles River公司的CB17/lCR-Prkdc嚴重複合免疫缺陷(SCID)/Crl品系小鼠，8-10周齡，其被繁育在Charles River France(Domaine des Oncins，69210 L'Arbresle，France)。至少5天馴化期後的治療開始時，小鼠體重大於18g。該小鼠自由獲取食物(UAR reference 113，Villemoisson，91160 Epinay sur Orge，France)及無菌水。將小鼠置於室內，並在12小時光/暗週期條件下。由實驗動物管理人及福利(LASW)在(22℃±2℃)、相對濕度(55%±15%)及照明時間的環境條件並且歸檔。

人結腸癌HCT 116細胞係購自American Type Culture Collection[(ATCC),Rockville,MD,USA)。將HCT 116細胞在Dulbecco's modified Eagle氏培養基(DMEM)(Invitrogen)中進行培養。藉由將與50%基質膠混 合的(SC)3x10⁶細胞(Reference 356234，Becton Dickinson Biosciences)植入每隻SCID雌性小鼠，而建立腫瘤模型。

藉由將MEK抑制劑混合進入0.5% CMC 0.25% Tween 20中，化合物(1)製劑得以製備。將該製劑於4℃下保存，並且在使用前藉由渦流攪拌而使其重懸浮。每3天製備化合物的口服製劑。每隻小鼠的給藥量為10 mL/kg。

化合物(2a)製劑在注射用水中得以製備。母液之化學性質在暗處於4℃下穩定期為7天。每隻小鼠之給藥量為10 mL/kg。

化合物(2b)製劑在1N HCl及注射用水中得以製備，接著進行5次渦流攪拌和超音波處理循環。最終溶液的pH值為3。母液之化學性質在暗處於4℃下穩定期為7天。每隻小鼠之口服給藥量為10 mL/kg。

對於腫瘤細胞之皮下植入，用酒精或聚維酮碘溶液溶液(Alcyon)對小鼠腹側皮膚進行消毒，並將腫瘤細胞之懸浮液使用23 G針頭，以0.2 mL的體積進行皮下單側接種。

在4個不同研究中，對化合物(1)、化合物(2a)及化合物(2b)之單獨給藥或者聯合給藥對腫瘤生長的活性聯合給藥進行了評估。將各研究之給藥劑量及方式描述於結果部分並且詳細描述於下述的表中。

將開始一個給定實驗所需的動物彙集在一起，並於第0日進行單側植入。將治療劑投與可測量腫瘤。實體腫瘤允許其生長至期望的體積範圍(將腫瘤不在期望範圍 內的動物排除)。然後，將小鼠彙集和非選擇性地分配至各治療組及對照組。如各表中之結果部分中所示，於HCT 116腫瘤細胞移植後第11天開始治療。該劑量以mg/kg表示，基於治療開始時之體重。每天對小鼠進行檢查，並且注意臨床不良反應。每組小鼠作為一個整體被每天稱重，直到達到體重最低點。然後，每週對每組稱重1次至3次，直到實驗結束。每週用遊標卡尺對腫瘤進行2至3次測量，直到取樣時間被最終處死，腫瘤體積達到2000 mm³或者至動物死亡(無論哪隻小鼠先死亡)。藉由二維腫瘤測量估計實體腫瘤體積，並且依照以下方程式計算腫瘤體積：腫瘤重量(mg)=長度(mm)×寬度²(mm²)/2

記錄死亡日期。將存活的動物處死，並且進行胸腔和腹腔的肉眼觀察。

在連續3天內產生15%體重減輕(BWL)(組的平均值)、1天內產生20% BWL或者發生10%及以上的藥物死亡的劑量被認為是過度毒性劑量。動物體重包括腫瘤重量。

主要的效力終點為△T/△C、平均復原百分率、部分及完全復原(PR及CR)。

藉由將第一次治療日(實施日(staging day))的腫瘤體積自指定觀察日的腫瘤體積中減去，而計算每個治療組(T)及對照組(C)之腫瘤的腫瘤體積變化。計算治療組的平均△T，並且計算對照組值平均△C。然後，計算△T/△C比，並且以百分比表示。當△T/△C低於40%認為該劑量是治療 有效的，當△T/△C低於10%時認為是非常有效。若△T/△C等於或小於0，則認為該劑量是高度有效的且復原百分率被注明日期。

腫瘤消退百分率被定義為治療組中指定的觀察日與治療第1天的體積相比的腫瘤體積減小百分比。在每個動物的特定時間點，復原百分率得以計算。然後，利用以下方程式計算該組的平均復原%：

復原(regression)%(t時)=(t₀時的體積-t時的體積)/(t₀時的體積)x 100

部分復原：若腫瘤體積減小至治療開始時之腫瘤體積的50%，則定義為部分復原。

完全復原：若腫瘤體積=0 mm³(當無法記錄腫瘤體積時認為是完全復原)則達到完全復原。

當在給定劑量下兩個產品的組合比相同劑量下的單獨給藥更有效時，使用術語“治療協同作用”。為了研究治療協同作用，而使用從對腫瘤體積參數的重複測量(時間因數)的方差雙向分析中獲得的估計值對每個組合與該最佳單個藥劑進行比較。

基於用於SUN4的SAS系統release 8.2上利用Everstat V5軟體及SAS 9.2軟體，統計學分析得以完成。低於5%(p<0.05)之機率被認為具有顯著性意義。

體內研究之結果 第一研究：化合物(1)(5mg/kg)與化合物(2b)(30 mg/kg)或化合物(2a)(50及75 mg/kg)合併抗SCID小鼠的載有的HCT 116之抗腫瘤活性

治療開始時，腫瘤負荷中位元值為198至221 mm³。作為單獨藥劑，從腫瘤植入後第11日至第18日，每天口服(PO)投與化合物(1)(5 mg/kg/給藥(Adm))，化合物(2b)(30 mg/kg/給藥)及化合物(2a)(50及75 mg/kg/給藥)。如表2中所示，在聯合給藥組中，將該劑量之化合物(1)與每個劑量之化合物(2a)及化合物(2b)聯合給藥。

作為單獨給藥或者聯合給藥，對化合物(1)及化合物(2a)的耐受性良好，導致最小BWL(第1圖及表2)。在這些實驗條件下，作為單獨藥劑，化合物(1)、化合物(2a)及化合物(2b)獲得一個>40%的△T/△C。

在聯合給藥中，用5mg/kg/給藥的化合物(1)及30mg/kg/給藥的化合物(2b)治療獲得一個27%的△T/△C(第2圖及表1)，但是如表3所示，未達到治療協同作用(p=0.0606用於全域(global)分析)。用5mg/kg/給藥的化合物(1)及50及75 mg/kg/給藥的化合物(2a)治療分別獲得22%及21%之△T/△C(第3圖及表2)。如表2中所示，兩種組合(p=0.0091及p<0.0001，全域分析，各自)獲得治療協同作用。亦見表11A和表11B。

第二研究：化合物(1)(10及20 mg/kg)與化合物(2b)(20 mg/kg)合併以及化合物(1)(10mg/kg)與化合物(2a)(50及75 mg/kg)合併抗SCID小鼠載有之HCT 116之抗腫瘤活性

治療開始時之腫瘤負荷中位元值為180至198 mm³。作為單獨藥劑，於腫瘤植入後第11日至第18日，口服投與化合物(1)(10及20 mg/kg/給藥)、化合物(2b)(20 mg/kg/ 給藥)及化合物(2a)(50及75 mg/kg/給藥)。如表3中所示，在聯合給藥組中，該劑量之化合物(1)與每個劑量之化合物(2a)及化合物(2b)聯合給藥。

作為單獨藥劑，對化合物(1)、化合物(2a)及化合物(2b)的耐受性良好，導致最低BWL(第4圖及表4)。

作為單獨藥劑，化合物(1)(10及20 mg/kg/給藥)分別獲得20%及22%之△T/△C，而化合物(2b)(20 mg/kg/給藥)獲得>40%之△T/△C。如表4中所示，化合物(2a)在兩種測試劑量下獲得>40%△T/△C。

在聯合給藥中，用10或20 mg/kg/給藥的化合物(1)及20 mg/kg/給藥的化合物(2b)治療獲得的△T/△C為0，且用10 mg/kg/給藥的化合物(1)(p=0.0004全域分析)具有治療協同作用。如表5所示，用20 mg/kg/給藥的化合物(1)治療未達到協同治療作用(p=0.2169全域分析)。在2/7小鼠之觀察到部分復原(PR)，其用於10 mg/kg/給藥的化合物(1)與20 mg/kg/給藥的化合物(2b)的合併治療(第5圖及表4)。當以10 mg/kg/給藥的劑量使用化合物(1)時，與以75及50 mg/kg/給藥的化合物(2a)聯合給藥時，分別獲得5%的△T/△C及<0的△T/△C，對於兩種聯合給藥治療，均具有1/7 PR(第6圖及表4)。如表5所示，兩種組合(p分別為0.0063及0.0019，全域分析)皆獲得治療協同作用。在所有聯合給藥組中，均實現腫瘤停滯(第5圖及第6圖)。亦見後述之表12A及表12B。

第三研究：化合物(1)(10及20 mg/kg)與化合物(2a)(50及75 mg/kg)聯合給藥抗SCID小鼠載有之HCT 116之抗腫 瘤活性

治療開始時之腫瘤負荷中位元值為187至189 mm³。作為單獨藥劑，於腫瘤植入後第11日至第20日口服投與化合物(1)(10及20 mg/kg/給藥)及化合物(2a)(50及75 mg/kg/給藥)。如表6中所示，在聯合給藥組中，將該劑量之化合物(1)與每個劑量之化合物(2a)聯合給藥。

作為單獨藥劑，對化合物(1)及化合物(2a)之耐受性良好，導致最小BWL(第7圖及表6)。

作為單獨藥劑，化合物(1)在給藥劑量為20 mg/kg/給藥下，獲得34%的△T/△C，在給藥劑量為10 mg/kg下，獲得>40%的△T/△C(第7圖)。如表6所示，在兩種測試劑量下化合物(2a)獲得>40%的△T/△C。

在聯合給藥中，用10或20 mg/kg/給藥的化合物(1)及75 mg/kg/給藥的化合物(2a)治療，分別獲得18%的△T/△C及9%的△T/△C)(第10圖及表6)，並且獲得治療協同作用(分別為p=0.0109及p=0.0003，全域性地)(表6)。用10或20 mg/kg/給藥的化合物(1)及50 mg/kg/給藥的化合物(2a)治療，分別獲得19%及22%的△T/△C)(第10圖及表6)。僅在10 mg/kg給藥的化合物(1)的聯合給藥中達到治療協同作用(p=0.0088，全域性地)(表7)。如表7所示，以20 mg/kg/給藥的化合物(1)的聯合給藥未達到治療協同作用(p=0.0764，全域性地)。在所有聯合給藥組中，達到腫瘤停滯(第8圖)。亦見以下之表13。

第四研究：化合物(1)(10及20 mg/kg)與化合物(2b)(20 mg/kg)聯合給藥抗SCID小鼠載有之HCT 116之抗腫瘤 活性

治療開始時之腫瘤負荷中位元值為189至196 mm³。作為單獨藥劑，於腫瘤植入後第11日至第20日口服投與化合物(1)(10及20 mg/kg/給藥)及化合物(2b)(20 mg/kg/給藥)。如表8中所示，在該聯合給藥組中，將該劑量之化合物(2b)與各劑量之化合物(1)聯合給藥。

作為單獨藥劑，化合物(1)及化合物(2b)之耐受性良好，導致最小BWL(第9圖及表8)。

作為單獨藥劑，化合物(1)(10及20 mg/kg/給藥)及20 mg/kg/給藥的化合物(2b)獲得>40的△T/△C%(第10圖及表8)。

在聯合給藥中，用10或20 mg/kg/給藥的化合物(1)及20 mg/kg/給藥的化合物(2b)的治療分別獲得了30%及15%之△T/△C(第10圖及表8)，並且達到治療協同作用(p=0.0002及p=0.0008，全域性地)(表9)。亦見下述之表14。

實例3 化合物(1)與化合物(2a)或化合物(2b)聯合用藥抗裸小鼠載有的皮下人胰MiaPaCa-2之體內活性

為了評估MEK抑制劑化合物(1)(5mg/kg)與pan-PI3K抑制劑化合物(2a)(50 mg/kg)或雙重pan-PI3K/mTOR抑制劑化合物(2b)(30 mg/kg)聯合給藥之抗腫瘤活性，利用載有人胰MiaPaCa-2(KRAS突變體)異體移植物之雌性裸小鼠進行實驗。

對以5mg/kg的低劑量之化合物(1)與以30mg/kg劑量的化合物(2b)及50 mg/kg劑量的化合物(2a)的聯合給 藥進行了測試。

材料及方法

將人胰腺癌細胞株MiaPaCa-2(American Type Culture Collection，Manassas VA)培養在含10%胎牛血清、1%必需胺基酸、1%丙酮酸鈉(Life Technologies，Carlsbad，CA)之MEM培養基中。在融合生長60-85%的對數增殖期對細胞進行胰酶消化收集後用PBS清洗兩次。將細胞重懸於PBS中(Life Technologies，Carlsbad，CA)，然後以1：1之比率與基質膠(BD Biosciences，San Jose，CA)混合。4℃下保存細胞至植入。

將MiaPaCa-2細胞(10x10⁶懸浮在在200 μl PBS中：基質膠(1：1)懸浮液)皮下注射入雌性裸小鼠的右腹側區(Crl：NU-Foxn1nu)(6-8周齡，Charles River Laboratories，Wilmington，MA)。此研究中的所有小鼠係依照由EMD-Serono研究所動物實驗委員會(IACUC)批准的指導規範來使用(#07-003)。

將0.5% CMC(羧甲基纖維素；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)及0.25% Tween 20(Acros Organics，Morris Plains，NJ)置於水中以用作本研究之賦形藥。藉由在水中將10mg之化合物懸浮於20mL之0.5% CMC 0.25% Tween 20中，以製備0.5 mg/mL(5.0mg/kg)之化合物(1)(批號#27)給藥溶液。

化合物(2a)被稱重(1mL溶液5mg)並加入水用於注射(最終體積的60%，即0.60 ml)。藉由5次渦流處理循環和在超音波水浴中進行1分鐘超音波處理，而將溶液混合。 加水完畢以用於給藥。化合物(2b)(每1mL溶液3mg)，加入10μL HCl 1N，然後加入水用於注射(最終體積的60%，即0.60 ml)。藉由5次渦流攪拌處理循環和在超音波水浴中進行1分鐘的超音波處理，而將溶液混合。加入1N NaOH來調節pH值至3，最終加滿水以用於注射。

隨時間的推移，用數字遊標卡尺測量位於雌性裸小鼠右腹側區的正在生長之腫瘤。細胞植入7天後，樣本小鼠群的腫瘤平均體積已達到165mm³，其足夠開始進行研究。將腫瘤體積明顯不同於平均腫瘤體積的載瘤小鼠從研究中排除。將剩餘之載有腫瘤之小鼠隨機分配入7個實驗組(n=9)，如此以致各組具有相同的平均腫瘤體積。

在所有聯合給藥組中，兩種藥劑在同一時間被投與動物，在彼此給藥時間的大約5-10分鐘內。Miapaca-2細胞移植後的第7天開始治療，其被指定為用於數據評估目的之第0日。對動物進行21天治療。治療開始後，每週對體重及腫瘤體積進行2次評估。於第22日，通過使用CO₂的持續性缺氧，對所有動物實施安樂死。

藉由對腫瘤體積及△T/△C百分率(%△T/△C)進行分析從而確定效力。通過使用腫瘤長度(l)及寬度(w)測量和以方程式l^＊w²/2來計算體積，腫瘤體積得以確定。沿腫瘤的最長軸測量其長度，並且沿垂直於長度的方向測量其寬度。以如下方式計算利用治療而實際腫瘤生長抑制的平均百分率：[%△T/△C=((TV_f-TV_i/TV_fCtrl-TV_iCtrl))×100%]，其中TV=腫瘤體積、f=最終、i=最初、及Ctrl=對照組。在治療期，用體重差異百分率來評估耐受性。 以如下方式計算體重差異百分率：[%體重差異=(BW _c -BW _i )/BW _i ×100%]，其中BW=體重、c=當前體重、i=最初體重。

藉由進行重複測量方差分析(RM-ANOVA)，其後緊跟著是緊跟Tukey’s post-hoc多重兩兩比較(α=0.05)，而對腫瘤體積資料及體重差異百分率進行分析。

體內研究之結果

在研究期間，沒有組發生大於5%之體重減輕。在與化合物(2a)聯合給藥中(第11圖)或者在與化合物(2b)聯合給藥中(第12圖)，沒有臨床症狀被發現。

作為單個藥劑，化合物(1)(5mg/kg/給藥)、化合物(2a)(50mg/kg)及化合物(2b)(30 mg/kg)在這些測定中獲得>40%的△T/△C(第13圖及第14圖以及表10)。

在聯合給藥中，用5 mg/kg/給藥的化合物(1)及30 mg/kg/給藥的化合物(2b)進行的治療獲得27.3%的△T/△C(第14圖及表10)，並達到治療協同作用(p<0.05)(表10)。相反，用5 mg/kg/給藥的化合物(1)及50 mg/kg/給藥的化合物(2a)治療獲得>40%的△T/△C(第13圖及表10)，未達到治療協同作用(p>0.05)(表10)。

體內結果之總結

在此展現的體內研究工作報道了化合物(1)，一種口服有效且為MEK1/2選擇性異構抑制劑、與口服有效且為特異性的I類PI3K脂激酶化合物(2a)抑制劑、一種pan-PI3K抑制劑、及化合物(2b)，一種雙重pan-PI3K和mTOR抑制劑聯合給藥之體內抗腫瘤活性。此工作已經 進行至抗載有人類結腸癌HCT 116異體移植物之G13D活化KRAS之突變以及已知降低對MEK抑制的敏感性的活化PIKC3A之突變株以及抗載有人類胰MiaPaCa-2異體移植物之KRAS突變株的研究。

在上述研究中，聯合治療在誘發治療期間的持續的腫瘤停滯高度有效，並且實現治療協同作用。

總之，在PIKC3A及KRAS突變體HCT 116驅動異體移植模型中，當將抑制劑MEK1/2化合物(1)與化合物(2a)、pan-PI3K抑制劑聯合給藥；以及在PIKC3A及KRAS突變體HCT 116驅動異體移植模型以及KRAS突變體MiaPaCa-2驅動異體移植模型中，當將化合物(1)與化合物(2b)、雙重pan-PI3K及mTOR抑制劑聯合給藥時，已獲得具有治療協同作用之有效抗腫瘤活性。

實例4 化合物(1)與化合物(2b)或化合物(2b)聯合給藥之抗SCID小鼠載有的皮下人類結腸癌HCT 116之螢光分子斷層成像研究

為了評估MEK抑制劑化合物(1)與pan-PI3K抑制劑化合物(2a)或雙重pan-PI3K/mTOR抑制劑化合物(2b)聯合給藥之細胞凋亡活性，使用載有人結腸癌HCT 116(KRAS及PIK3CA突變體)異體移植物之雌性SCID小鼠實施實驗，其中利用螢光斷層掃描(FMT)以非侵入方式監視細胞凋亡的誘導。

方法

將HCT116腫瘤細胞皮下植入SCID小鼠之肩胛骨內 區域。於第11日至第17日，經植入的動物接受50mg/kg之化合物(2a)或者20 mg/kg之化合物(2b)，作為單個藥劑或者與10mg/kg化合物(1)聯合給藥。以每天給藥的方式，經口服途徑投與每種藥劑。在整個實驗期間，藉由精確測量腫瘤而監視腫瘤生長。為測量細胞凋亡，於治療開始後第3和第7天，每天治療後1小時靜脈注射螢光物質Annexin-Vivo-750。於探針注射3小時後，利用FMT對動物進行成像，以記錄腫瘤中之螢光物質Annexin的攝取。利用用於剪切的凋亡蛋白酶-3及剪切的-PARP檢測的Meso Scale Discovery分析法，來評估腫瘤溶解物中的離體細胞凋亡。

結果

在這些給藥方式下，研究結束時，化合物(1)、化合物(2a)及化合物(2b)作為單獨使用藥劑時，顯示對HCT116腫瘤生長的微小活性，△T/△C分別為=40%(NS)，36%(p=0.023)及80%(NS)(第28圖)。相反，化合物(2a)和化合物(2b)與化合物(1)聯合給藥時，導致強腫瘤生長抑制(△T/△C<0，與化合物(2a)/化合物(1)的23%的平均腫瘤消退(p<0.0001)及(△T/△C<0，化合物(2b)/化合物(1)的5%平均腫瘤消退(p=0.0009)相關)。以上兩種合併治療皆與4天治療後離體剪切的凋亡蛋白酶-3(3.7及5.2倍)(第27B圖)及剪切的-PARP(8.4及12.8倍)(第27A圖)明顯增加相關。化合物(2a)/化合物(1)合併治療與腫瘤中的Annexin-V-750攝取的明顯增加相關，反應出合併治療3天及7天後之細胞凋亡誘導(p=0.005及<0.0001)(第 26B圖)。於聯合給藥治療的3天及7天後，治療動物組相對對照組之Annexin螢光分別為2.1和3.8(第26A圖)。

總結

MEK1/2抑制劑化合物(1)與Pan-PI3K抑制劑化合物(2a)或Pan-PI3K/mTOR化合物(2b)之聯合給藥，導致在雙重KRAS/PIK3CA變異腫瘤異體移植模型中的抗腫瘤活性明顯增強，伴隨腫瘤細胞凋亡的協同誘發，正如兩個組合的離體研究中和使用用於化合物(2a)/化合物(1)聯合給藥的縱向FMT造影的體內研究中所示。

實例5 化合物(1)與化合物(2b)或化合物(2a)合併之抗SCID雌性小鼠載有的皮下人結腸腫瘤CR-LRB-009C之體內活性

為了評估MEK抑制劑化合物(1)與PI3K抑制劑化合物(2a)或雙重pan-PI3K/mTOR抑制劑化合物(2b)聯合給藥的抗腫瘤活性，實驗使用載有人類原發性結腸腫瘤CR-LRB-009C(KRAS及PIK3CA突變體)異體移植之雌性SCID小鼠而實施。在此研究中，化合物(1)以20 mg/kg與化合物(2b)以20 mg/kg及化合物(2a)以75 mg/kg聯合給藥而進行測試。

材料及方法

將獲自美國Charles River公司的CB17/lCR-Prkdc嚴重複合免疫缺失(SCID)/Crl品系小鼠，8-10周齡，被繁育在Charles River France(Domaine des Oncins，69210 L'Arbresle，France)。於至少5日馴化期後，開始治療時小鼠體重超過18g。小鼠自由獲取食物(UAR reference 113，Villemoisson，91160 Epinay sur Orge，France)及無菌水。將小鼠置於室內12小時之光/暗週期環境。由實驗動物的管理人和福利監護人(LASW)記錄包括動物飼養、室溫(22℃±2℃)、相對濕度(55%±15%)及照明時間的環境條件並且歸檔。

人類原發性結腸癌CR-LRB-009C腫瘤模型係藉由植入(SC)小腫瘤片段而建立，並且利用繼代移植而維持於SCID雌性小鼠。

化合物(1)的製劑係藉由將MEK抑制劑混合進入0.5% CMC 0.25% Tween 20而製備。將該製劑於4℃下保存，並且在使用前藉由渦流攪拌而使之再懸浮。每3天製備該化合物之口服劑型。每隻小鼠之給藥體積為10 mL/kg。

在注射用水中製備化合物(2a)的製劑。母液之化學性質在暗處於4℃下可穩定7天。每隻小鼠之給藥量為10 mL/kg。

在1N HCl及注射用水中製備化合物(2a)及化合物(2b)的製劑，最終pH值為3，接著進行5次渦流攪拌循環及超音波處理。母液之化學性質在暗處於4℃下可穩定7天。每隻小鼠之口服給藥量為10 mL/kg。

對於腫瘤細胞的皮下植入，用酒精或聚維酮碘溶液(Alcyon)對小鼠腹側皮膚進行消毒並將腫瘤細胞之懸浮液使用23 G針頭，以0.2 mL的體積進行皮下單側接種。

將作為單個藥劑或者聯合給藥之化合物(1)、化合物(2a)及化合物(2b)，之藥劑量及方式描述於結果部分並且 詳細描述於於表15-17。

將開始一個給定的實驗所需的動物彙集，於第0日進行單側植入。將治療劑投與可測量的腫瘤。實體腫瘤允許其生長至期望的體積範圍(將腫瘤不在期望範圍內的動物排除)。然後，將小鼠彙集和經非選擇性地分配至各治療組及對照組中。治療開始於CR-LRB-009C腫瘤片段移植後第11天，如結果部分及各表中所示。劑量係以mg/kg表示，其基於治療開始時之體重。每天對小鼠進行檢查，並且注意臨床不良反應。每組小鼠作為一個整體被每天稱重，直到體重達到最低點。然後，每週對各組進行1次至3次稱重，直到實驗結束。每週用遊標卡尺對腫瘤進行2至3次測量，直到取樣時間被最終犧牲，腫瘤體積達到2000 mm³或者直到動物死亡(無論那隻小鼠先死亡)。根據二維腫瘤測量估計實體瘤體積並依照以下方程式計算實體腫瘤體積：腫瘤重量(mg)=長度(mm)×寬度²(mm²)/2

記錄死亡日。將存活之動物處死並且對其胸腔和腹腔進行肉眼觀察。

在連續3天內產生15%體重減輕(BWL)(組的平均值)、1天內20% BWL或者10%及其以上藥物死亡的劑量，被認為是過度毒性劑量。動物體重包括腫瘤重量。

主要的效力終點為△T/△C、平均復原%、部分及完全復原(PR及CR)。基於用於SUN4的SAS系統版本8.2(release 8.2)上利用Everstat V5軟體及SAS 9.2軟體，統計學分析得以完成。低於5%(p<0.05)之機率被認為具有 顯著性意義。

體內研究之结果

治療開始時之腫瘤負荷中位元值為126至144 mm³。作為單獨藥劑，從腫瘤植入後第11天至第21天，每天口服(PO)投與化合物(1)(20 mg/kg/給藥)、化合物(2b)(20 mg/kg/給藥)及化合物(2a)(75 mg/kg/給藥)。如表15中所示，在聯合給藥組中，將該劑量之化合物(1)與各劑量之化合物(2a)及化合物(2b)聯合給藥。

作為單獨給藥或者聯合給藥，化合物(1)、化合物(2b)及化合物(2a)的具耐受性，導致部分BWL，但是未達到毒性(第21圖及表15)。作為單獨藥劑，在這些試驗條件下，化合物(1)及化合物(2b)獲得>40%之△T/△C，而化合物(2a)獲得39%之△T/△C。

在聯合給藥中，用20 mg/kg/給藥的化合物(1)及20 mg/kg/給藥的化合物(2b)進行的治療獲得4%的△T/△C(第22圖及表15)，並且如表16所示，達到治療協同作用(p<0.0001，全域分析)。用20 mg/kg/給藥的化合物(1)及75 mg/kg/給藥的化合物(2a)進行的治療獲得21%的△T/△C(第22圖及表15)，並且如表16所示，達到治療協同作用(p=0.0386，全域性地)。亦見表17。

體內研究之總結

在此展現的體內研究工作報道了化合物(1)，一種口服有效且為MEK1/2選擇性異構抑制劑、與口服有效且為特異性的I類PI3K脂激酶化合物(2a)抑制劑、一種pan-PI3K抑制劑、及化合物(2b)，一種雙重pan-PI3K和 mTOR抑制劑聯合給藥之體內抗腫瘤活性。此工作已經進行至抗載有已知降低對MEK抑制的敏感性的雙重KRAS及PIKC3A突變株的人類原發性結腸癌CR-LRB-009C異體移植的研究。

在該研究中，聯合治療在治療期間誘導了一個持續的腫瘤停滯，並且實現治療協同作用。

相應地，當將抑制劑MEK1/2化合物(1)與化合物(2a)，一種pan-PI3K抑制劑或化合物(2b)，一種雙重pan-PI3K及mTOR抑制劑聯合給藥時，在PIKC3A-及KRAS-突變株CR-LRB-009C驅動異體移植模型中已實現具有治療協同作用的強效抗腫瘤活性。

實例6 化合物(1)與化合物(2a)或化合物(2b)聯合用藥抗SCID雌性小鼠載有的皮下人結腸腫瘤CR-LRB-013P之的體內活性

為了評估MEK抑制劑化合物(1)與pan-PI3K抑制劑化合物(2a)或雙重pan-PI3K/mTOR抑制劑化合物(2b)聯合給藥之抗腫瘤活性，而使用載有人類原發性結腸癌CR-LRB-013P(KRAS突變體)異體移植物之雌性SCID小鼠實施實驗。在此研究中，對化合物(1)(20 mg/kg)與化合物(2b)(20 mg/kg)或化合物(2a)(75 mg/kg)之組合進行測試。

材料及方法

將購自美國Charles River公司的CB17/1CR-Prkdc嚴重複合免疫缺陷(SCID)/Crl品系小鼠，8-10週齡，其被 繁育在Charles River France(Domaine des Oncins，69210 L'Arbresle，France)。至少5天馴化期後的治療開始時，小鼠體重大於18g。該小鼠自由獲取食物(UAR reference 113，Villemoisson，91160 Epinay sur Orge，France)及無菌水。將小鼠置於室內，並在12小時光/暗週期條件下。由實驗動物管理人及福利監護人(LASW)記錄包括動物飼養、室溫(22℃±2℃)、相對濕度(55%±15%)及照明時間的環境條件並且歸檔。

藉由植入(SC)小腫瘤片段並且利用繼代移植在SCID雌性小鼠中維持，從而建立人類原發性結腸癌CR-LRB-013P腫瘤模型。

藉由將MEK抑制劑與0.5% CMC 0.25% Tween 20相混合，使化合物(1)的製劑得以製備。將該製劑於4℃下保持，並且在使用前藉由攪拌使之再懸浮。每3天製備該化合物的口服製劑。每隻小鼠之給藥量為10 mL/kg。

在注射用水中製備化合物(2a)的製劑。母液之化學性質在暗處於4℃下可穩定7天。每隻小鼠之給藥量為10 mL/kg。

在1N HCl及注射用水中製備化合物(2a)及化合物(2b)的製劑，其最終pH值為3，接著進行5次渦流處理循環和超音波處理。母液之化學性質在暗處於4℃下的穩定期為7天。每隻小鼠之口服給藥量為10 mL/kg。

對於腫瘤細胞之皮下植入，用酒精或聚維酮碘溶液溶液(Alcyon)對小鼠腹側皮膚進行消毒，並將腫瘤細胞之懸浮液使用23 G針頭，以0.2 mL的體積進行皮下單側接 種。

對化合物(1)、化合物(2a)及化合物(2b)之單獨給藥或者聯合給藥之給藥劑量及方式描述於結果部分並且詳細描述於下述的表中。

將開始一個給定實驗所需的動物彙集在一起，並於第0日進行單側植入。將治療劑投與可測量腫瘤。實體腫瘤允許其生長至期望的體積範圍(將腫瘤不在期望範圍內的動物排除)。然後，將小鼠彙集和非選擇性地分配至各治療組及對照組。如結果部分及各表中所示，治療開始於CR-LRB-013P腫瘤片段移植後第33日。劑量係以mg/kg表示，其基於治療開始時的體重。每天對小鼠進行檢查，並且注意臨床不良反應。每組小鼠作為一個整體被每天稱重，直到達到體重最低點。然後，每週對每組稱重1次至3次，直到實驗結束。每週用遊標卡尺對腫瘤進行2至3次測量，直到取樣時間被最終處死，腫瘤體積達到2000 mm³或者至動物死亡(無論哪隻小鼠先死亡)。藉由二維腫瘤測量估計實體腫瘤體積，並且依照以下方程式計算腫瘤體積：腫瘤重量(mg)=長度(mm)×寬度²(mm²)/2

記錄死亡日。將存活的動物處死，並且進行對胸腔及腹腔的肉眼觀察。

在連續3天內產生15%體重減輕(BWL)、在1天內20% BWL或者10%以上的藥物死亡之劑量(組的平均值)被認為是過度毒性劑量。動物體重包括腫瘤重量。

主要的效力終點為△T/△C、平均復原百分率、部分 和完全復原(PR及CR)。基於用於SUN4的SAS系統版本8.2(release 8.2)上利用Everstat V5軟體及SAS 9.2軟體，統計學分析得以完成。小於5%(p<0.05)的機率被認為具有顯著性意義。

體內研究之结果

治療開始時之腫瘤負荷中位元值為144至162mm³。作為單獨藥劑，於腫瘤植入後第33日至第50日，口服(PO)投與化合物(1)(20 mg/kg/給藥)，化合物(2b)(20 mg/kg/給藥)及化合物(2a)(75 mg/kg/給藥)。在聯合給藥組中，將該劑量之化合物(1)與各劑量之化合物(2a)及化合物(2b)聯合給藥，如表18中所示。

作為單獨給藥或者聯合給藥，化合物(1)、化合物(2b)及化合物(2a)具有耐受性，導致部分BWL但並未達到毒性(第23圖及表18)。作為在這些實驗條件下之單個藥劑，化合物(2a)及化合物(2b)獲得一個>40%的△T/△C，而化合物(1)獲得一個30%的△T/△C。

在聯合給藥中，用20 mg/kg/給藥的化合物(1)及20 mg/kg/給藥的化合物(2b)的治療獲得一個隨1/7的部分復原的26%的△T/△C(第24圖及表18)，並且如表19所示，達到治療協同作用(p=0.0302，全域分析)。用20 mg/kg/給藥的化合物(1)與75 mg/kg/給藥的化合物(2a)聯合給藥的治療獲得了-5%之△T/△C(第24圖及表18)以及5/7部分復原，並且如表19所示，達到治療協同作用(p<0.0001，全域性地)。亦見表20。

體內结果之總結

在此展現的體內研究工作報導了化合物(1)，一種口服有效且為MEK1/2選擇性異構抑制劑、與口服有效且為特異性的I類PI3K脂激酶化合物(2a)抑制劑、一種pan-PI3K抑制劑、及化合物(2b)，一種雙重pan-PI3K和mTOR抑制劑聯合給藥之體內抗腫瘤活性。此工作已經進行至抗載有KRAS突變株的人類原發性結腸癌CR-LRB-013P異體移植的研究。

在該研究中，聯合治療在治療期間誘導持續性的腫瘤停滯，並且實現治療協同作用。

因此，在KRAS突變體CR-LRB-013P驅動之異體移植模型中，當將抑制劑MEK1/2化合物(1)與化合物(2a)、pan-PI3K抑制劑或化合物(2b)、雙重pan-PI3K及mTOR抑制劑聯合給藥時，已獲得具有治療協同作用之有效抗腫瘤活性。

實例7 腫瘤穿透性之評估

實施以下實驗，以評估化合物(2a)及化合物(2b)(單獨給藥或者與化合物(1)聯合給藥)對腫瘤血管穿透性之效果。

方法

將HCT116腫瘤細胞皮下植入SCID小鼠的肩胛骨內區域。植入動物於第11天至第13天接受50 mg/kg的化合物(2a)或者20 mg/kg的化合物(2b)作為單個藥劑或者與10 mg/kg的化合物(1)(每組5個動物)聯合給藥的治療。各藥劑是以每日給藥之方式經口服途徑給藥。在整個實驗期 間，藉由準確測量腫瘤對腫瘤生長進行監視。為了測量腫瘤血管穿透性，於第13天在氯胺酮/賽拉嗪(120/6 mg/kg皮下)麻醉下，於最後一次治療4小時後，在0.5%伊凡思藍(Evans Blue)靜脈(iv)注射30分鐘以及Dextran-Fitc(100mg/kg)靜脈注射2分鐘後切除腫瘤。然後，將腫瘤快速冷凍，獲取25μm片段以用於螢光定量分析。利用Icyte在488nm用於血管Dextran-Fitc測定和在633 nm處進行伊凡思藍滲出測定，對腫瘤段進行成像。對各個螢光進行定量，作為螢光強度的完整圖像的和，並且表示成伊凡思藍信號/Dextran-Fitc信號的平均比。

結果

在這些實驗條件下，在晚期皮下移植HCT116人類KRAS/PI3KCA變異結腸癌中，化合物(1)及化合物(2a)單獨給藥和化合物(2a)/化合物(1)聯合給藥)並未明顯改變腫瘤穿透性，與對照組相比，伊凡思藍/Dextran-Fitc比分別顯示-9%、-8%及4%的下降。另一方面，用化合物(2b)或者化合物(2b)/化合物(1)聯合給藥的3日治療導致明顯的伊凡思藍/Dextran Fitc比的調整，產生單個藥劑的50%的降低以及聯合給藥的45%的降低。參見第25圖。

總結

化合物(2b)作為單個藥劑或者與化合物(1)聯合給藥對在晚期皮下植入的HCT116人類KRAS/PI3KCA變異結腸癌進行3日治療改變腫瘤血管穿透性。此HCT116腫瘤血管穿透性的改變，中止用於FMT造影的體內螢光-Annexin腫瘤分佈，並且排除利用此方法之細胞凋亡的 檢測。

治療開始時之腫瘤大小為162-352 mm³，並且每組腫瘤負荷中位元值為198-221 mm³。藥品配製：化合物(1)=羧甲基纖維素0.5%、tween 20 0.25%水溶液；化合物 (2b)=水，pH3，化合物(2a)=水。治療期：化合物(1)、化合物(2b)、化合物(2a)以及聯合給藥=8日。使用之縮寫：BWL=體重減輕，治療組與對照組之間的△T/△C=腫瘤體積變化率(中位基線)(TVday-TV0)/(CVday-CV0)^＊100，HNTD=最高無毒劑量，HDT=最高測試劑量。

^a使用從對腫瘤體積參數的重複測量(時間因數)的方差雙向分析中獲得的估計值對每個組合與該最佳單個藥劑進行比較(SAS 9.2軟體的proc mixed)。小於5%(p<0.05) 之機率被認為具有顯著性意義。

治療開始時之腫瘤大小為126-294 mm³，每組之腫瘤負荷中位元值為180-198 mm³。藥品配製：化合物(1)=羧甲基 纖維素0.5%，Tween 20 0.25%水溶液；化合物(2b)=水，pH3；化合物(2a)=水。治療期：化合物(1)、化合物(2b)、化合物(2a)以及聯合給藥時間為8天。使用之縮寫：BWL=體重減輕、治療組與對照組之間的△T/△C=腫瘤體積變化率(中位基線)(TVday-TV0)/(CVday-CV0)^＊ 100，HNTD=最高無毒劑量，HDT=最高測試劑量。^a於第17天，小鼠接受20 mg/kg，而非10 mg/kg。

^a使用從對腫瘤體積參數的重複測量(時間因數)的方 差雙向分析中獲得的估計值對每個組合與該最佳單個藥劑進行比較(SAS 9.2軟體的proc mixed)。小於5%(p<0.05)之機率被認為具有顯著性意義。

治療開始時之腫瘤大小為112-319 mm³，每組之腫瘤負荷中位元值為187-189 mm³。藥品配製：化合物(1)=羧甲基纖維素0.5%，Tween 20 0.25%水溶液；化合物(2a)=水。治療期：化合物(1)、化合物(2a)以及聯合給藥時間為10天。使用之縮寫：BWL=體重減輕，△T/△C=(TVday-TV0)/(CVday-CV0)^＊ 100，HNTD=最高無毒劑量，HDT=最高測試劑量。

^a使用從對腫瘤體積參數的重複測量(時間因數)的方差雙向分析中獲得的估計值對每個組合與該最佳單個藥劑進行比較(SAS 9.2軟體的proc mixed)。小於5%(p<0.05)之機率被認為具有顯著性意義。

表8化合物(1)(10及20mg/kg)與化合物(2b)(20mg/kg)聯合用藥之抗載有人HCT116之SCID雌性小鼠的抗腫瘤活性 治療開始時之腫瘤大小為144-294 mm³，每組之腫瘤負荷中位元值為189-196 mm³。藥品配製：化合物(1)為羧甲基纖維素0.5%，Tween 20 0.25%水溶液；化合物(2b)=水，pH3。治療期：化合物(1)、化合物(2b)及聯合給藥時間為10天。使用之縮寫：BWL=體重減輕，△T/△C=(TVday-TV0)/(CVday-CV0)^＊ 100，HNTD=最高無毒性劑量，HDT=最高測試劑量

表9化合物(1)(10及20mg/kg)與化合物(2b)(20mg/kg)聯合用藥之抗載有人HCT116之SCID雌性小鼠之抗腫瘤活性：治療協同作用確定 ^a使用從對腫瘤體積參數的重複測量(時間因數)的方差雙向分析中獲得的估計值對每個組合與該最佳單個藥劑進行比較(SAS 9.2軟體的proc mixed)。小於5%(p<0.05)之機率被認為具有顯著性意義。

表10用化合物(1)、化合物(2a)、和化合物(2b)單獨使用或者聯合給藥治療載有MiaPaCa-2腫瘤之小鼠△T/△C百分率及統計分析。

以如下方式計算實際被治療抑制的Miapaca-2腫瘤生長的平均百分率：[%△T/△C=(TV_f-TV_i/TV_fCtrl-TV_iCtrl)x 100%]，其中TV=腫瘤體積、f=最終、i=最初、及Ctrl=對照組。

治療開始時之腫瘤大小為100-221 mm³，每組之腫瘤負荷中位元值為126-144 mm³。藥品配制：化合物(1)=羧甲基纖维素0.5%，tween 20 0.25%水溶液；化合物(2b)及化合物(2a)=水，pH3。治療期：化合物(1)、化合物(2a)及化合物(2b)以及聯合給藥時間為11天。使用之縮寫：BWL=體重減輕，治療组與對照組之間的△T/△C=腫瘤體積變化率(中位基線)(TVday-TV0)/(CVday-CV0)^＊ 100，HDT=最高測試劑量。

^a使用從對腫瘤體積參數的重複測量(時間因數)的方差雙向分析中獲得的估計值對每個組合與該最佳單個藥劑進行比較(SAS 9.2軟體的混合proc)。小於5%(p<0.05)之機率被認為具有顯著性意義。

治療開始時之腫瘤大小為108-245 mm³，每組之腫瘤負荷中位元值為144-162 mm³。藥品配製：化合物(1)=羧甲基纖維素0.5%，tween 20 0.25%水溶液；化合物(2b)及化合物(2a)為水，pH3。治療期：化合物(1)、化合物(2a)及化合物(2b)以及聯合給藥時間為18天。使用之縮寫：BWL=體重減輕，治療组與對照組之間的△T/△C=腫瘤體積變化率(中位基線)(TVday-TV0)/(CVday-CV0)^＊ 100，HDT=最高測試劑量。

表19化合物(1)(20mg/kg)與化合物(2b)(20mg/kg)或化合物(2a)(75 mg/kg)聯合用藥之抗載有人類原發性結腸CR-LRB-013P腫瘤之SCID雌性小鼠的抗腫瘤活性：治療協同作用確定 ^a使用從對腫瘤體積參數的重複測量(時間因數)的方差雙向分析中獲得的估計值對每個組合與該最佳單個藥劑進行比較(SAS 9.2軟體的混合proc)。小於5%(p<0.05)之機率被認為具有顯著性意義。

雖然已展示並描述了本發明之較佳實施例，但熟習該項技術者可在附加之申請專利範圍的範圍內作出各種變化及修改。

第1圖係顯示在評估化合物(1)(5 mg/kg)與化合物(2b)(30 mg/kg)及化合物(2a)(50及75 mg/kg)組合之針對載有人類HCT 116之SCID雌性小鼠的抗腫瘤活性期間的體重變化之圖。

第2圖係顯示化合物(1)(5 mg/kg)與化合物(2b)(30 mg/kg)組合之針對載有人類HCT 116之SCID雌性小鼠的抗腫瘤活性之圖。

第3圖係顯示化合物(1)(5 mg/kg)與化合物(2a)(50及75 mg/kg)組合之針對載有人類HCT 116之SCID雌性小鼠的抗腫瘤活性之圖。方框表示聯合給藥實現治療協同作用。

第4圖係顯示在評估化合物(1)(10及20 mg/kg)與化合物(2b)(20 mg/kg)及化合物(2a)(50及75 mg/kg)組合針 對載有人類HCT 116之SCID雌性小鼠的抗腫瘤活性期間的體重變化之圖。

第5圖係顯示化合物(1)(10及20 mg/kg)與化合物(2b)(20 mg/kg)組合之針對載有人類HCT 116之SCID雌性小鼠的抗腫瘤活性之圖。

第6圖係顯示化合物(1)(10 mg/kg)與化合物(2a)(50及75 mg/kg)組合之針對載有人類HCT 116之SCID雌性小鼠的抗腫瘤活性之圖。

第7圖係顯示在評估化合物(1)(10及20 mg/kg)與化合物(2a)(50及75 mg/kg)組合的抗腫瘤活性期間載有人類HCT 116之SCID雌性小鼠的體重變化之圖。

第8圖係顯示化合物(1)(10及20 mg/kg)與化合物(2a)(50及75 mg/kg)組合之針對載有人類HCT 116之SCID雌性小鼠的抗腫瘤活性之圖。方框表示聯合給藥實現治療協同作用。

第9圖係顯示在評估化合物(1)(10及20 mg/kg)與化合物(2b)(20 mg/kg)組合之針對載有人類HCT 116之SCID雌性的抗腫瘤活性期間的小鼠體重變化之圖。

第10圖係顯示化合物(1)(10及20 mg/kg)與化合物(2b)(20 mg/kg)組合針對載有人類HCT 116之SCID雌性小鼠的抗腫瘤活性之圖。

第11圖係顯示以化合物(1)(5 mg/kg)及化合物(2a)(50 mg/kg)單獨給藥或者聯合給藥對載有MiaPaCa-2腫瘤之小鼠治療時其體重百分比之圖。

第12圖係顯示化合物(1)(5 mg/kg)及化合物(2b)(30 mg/kg)單獨給藥或者聯合給藥治療載有MiaPaCa-2腫瘤之小鼠時其體重百分比之圖。

第13圖係顯示化合物(1)(5 mg/kg)及化合物(2a)(50 mg/kg)單獨給藥或者聯合給藥治療載有MiaPaCa-2腫瘤之小鼠時其平均腫瘤體積之圖。

第14圖係顯示化合物(1)(5 mg/kg)及化合物(2b)(30 mg/kg)單獨給藥或者聯合給藥治療載有MiaPaCa-2腫瘤之小鼠時其平均腫瘤體積之圖。

第15A圖及第15B圖顯示的是用於各種腫瘤細胞株的以鑒定特異性治療應用的化合物(1)的Z分數值之圖。對化合物(1)之特定治療應用的選擇。每個細胞株的各Z分數值被標繪在與腫瘤源相對應的組內。一組內的所有值之平均值顯示為綠色三角形，該平均值可用作一組中之化合物(1)活性的指標。至於各個Z分數，Z分數低於平均強效力，而Z分數>0近似於耐藥。

第16A圖及第16B圖係顯示的是用於各種腫瘤細胞株的以鑒定特異性治療應用的化合物(2b)之Z分數值的圖。對化合物(2b)之特定治療應用的選擇。每個細胞株的各Z分數值被標繪在與腫瘤源相對應的組內。一組內的所有值之平均值表示為綠色三角形，該平均值可用作一組內的化合物(2b)活性之指標。至於單獨的Z分數，Z分數低於零平均強效力，而Z分數>0近似於耐藥。

第17圖顯示的是化合物(1)與化合物(2b)組合用於各腫瘤細胞株的Z分數值之圖。

第18A圖、第18B圖、第18C圖、第18D圖、第18E圖 及第18F圖顯示的是在CRC腫瘤細胞株中聯合使用化合物(1)與化合物(2b)之組合結果(協同作用圖及突變分析)之圖。

第19A圖及第19B圖顯示的是在胰腫瘤細胞株中聯合使用化合物(1)與化合物(2b)的組合結果(協同作用圖及突變分析)之圖。

第20A圖及第20B圖顯示的是在NSCLC腫瘤細胞株中聯合使用化合物(1)與化合物(2b)的組合結果(協同作用圖及突變分析)之圖。

第21圖係顯示在評估化合物(1)(20 mg/kg)與化合物(2b)(20 mg/kg)及化合物(2a)(75 mg/kg)組合針對載有人類原發性結腸腫瘤CR-LRB-009C之SCID雌性小鼠的抗腫瘤活性期間的體重變化之圖。

第22圖係顯示化合物(1)(20 mg/kg)與化合物(2b)(20 mg/kg)及化合物(2a)(75 mg/kg)組合針對載有人類原發性結腸腫瘤CR-LRB-009C之SCID雌性小鼠的抗腫瘤活性之圖。

第23圖係顯示評估化合物(1)(20 mg/kg)與化合物(2b)(20 mg/kg)及化合物(2a)(75 mg/kg)組合針對載有人類原發性結腸腫瘤CR-LRB-013P之SCID雌性小鼠的抗腫瘤活性期間的體重變化之圖。

第24圖係顯示化合物(1)(20 mg/kg)與化合物(2b)(20 mg/kg)及化合物(2a)(75 mg/kg)組合針對載有人類原發性結腸腫瘤CR-LRB-013P之SCID雌性小鼠的抗腫瘤活性之圖。

第25圖用圖表形式描繪在HCT116異體移植中用化合物(2a)或化合物(2b)作為單獨給藥或者與化合物(1)組合治療之後所進行的伊凡氏藍腫瘤滲出之Icyte離體造影結果。

第26A圖和第26B圖用圖表方式描繪3天治療後、Annexin V-750給藥3小時後、HCT116異體移植中以化合物(1)、化合物(2a)或化合物(2b)作為單獨給藥或者聯合給藥進行治療後4小時之FMT造影的結果。以螢光團測量腫瘤螢光(pmol)並且使其對應腫瘤體積的標準化。統計原理：基於等級化資料的二因數的變異數分析後之Newman-Keuls檢定，NS：P<0.05)。

第27A圖及第27B圖用圖表方式顯示在用化合物(1)、化合物(2a)或化合物(2b)單獨給藥或者以其選擇性組合進行治療後腫瘤提取物中被剪切的PARP及凋亡蛋白酶-3的蛋白質水準。統計原理：單因數變異數後用於一個因數的Dunnett's檢定，NS：P<0.05。

第28圖提供顯示用化合物(1)(10 mg/kg)、化合物(2a)(50 mg/kg)或化合物(2b)(20 mg/kg)單獨給藥或者聯合給藥治療載有HCT116腫瘤小鼠時其腫瘤體積之圖。為了量化細胞凋亡，於治療開始後第3天及第7天，在每天治療1小時後靜脈注射螢光試劑Annexin-Vivo-750。探針注射3小時後利用FMT對動物進行成像。

Claims (13)

1. 一種組成物，其包含具有以下結構式的化合物或其藥學可接受鹽 、和具有選自以下所組成群組之結構式的化合物 及 或其藥學可接受之鹽。
2. 如申請專利範圍第1項之組成物，其進一步包含 一種藥學可接受之載體。
3. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中根據結構式(1)之該化合物及根據結構式(2a)或(2b)之該化合物係呈當該組成物投與患者時在減小患者腫瘤體積上產生協同作用之量。
4. 一種治療癌症患者之方法，其包括向該患者投與治療有效量之式(1)化合物或其藥學可接受之鹽，其聯合式(2a)或式(2b)之化合物或其藥學可接受鹽給藥。
5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該治療有效量在減小所述患者之腫瘤體積上達到協同作用。
6. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該治療有效量達到該患者體內之腫瘤停滯。
7. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該癌症係選自由非小細胞肺癌、乳癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、大腸癌、肝癌、肌癌、血液腫瘤、黑色素瘤、子宮內膜癌及胰腺癌所組成之群組。
8. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該癌症是選自由大腸癌、子宮內膜癌、血液腫瘤、甲狀腺癌、乳癌、黑色素瘤、胰腺癌及前列腺癌所組成之群組。
9. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該方法包括投與式(2a)之化合物。
10. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該方法包括包括投與式(2b)之化合物。
11. 一種用於治療癌症之組合物，該組合物包含治療 有效量之(A)式(1)之化合物或其藥學可接受之鹽、以及(B)式(2a)或式(2b)之化合物或其藥學可接受之鹽。
12. 一種套組，其包括(A)式(1)之化合物或者其藥學可接受之鹽、(B)式(2a)或式(2b)之化合物或其藥學可接受之鹽、以及(C)使用說明書。
13. 一種包含治療有效量的(A)式(1)之化合物或其藥學可接受之鹽、及(B)式(2a)或式(2b)之化合物或其藥學可接受之鹽的組合物之用途，其用於製備用於癌症治療之藥劑。