TW201217786A - Methods and kits for the diagnosis of prostate cancer - Google Patents

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201217786 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明屬於診斷領域且更具體地屬於藉由使用基因組 合的方式診斷前列腺癌的領域，其中該等基因於前列腺癌 細胞內的表現與彼等於正常（即非癌性）前列腺細胞內的表 現相比較係屬過度表現。 【先前技術】 在西方男性人體中，前列腺癌（PC a)已成爲最爲普遍 的癌症類型，且與其他任何癌症（除肺癌外）相比，PC a導 致更多男性病患死亡。據估計，男性在生命中罹患此癌症 的風險爲1/6，且因轉移性PCa而導致死亡的風險爲1/36。 雖然在上世紀80年代末期，前列腺特異性抗原（PSA)檢驗 的引進已使PCa偵測獲得大幅度提高，但是死亡率並沒有 顯著減少（Jemal, A. et al.，（2007) Cancer statistics，2007. C A: a cancer journal for clinicians, 2009，June 9, 57，43-6 6)。此主要有兩個原因：50歲以上大部分男性人口所接 受之遺漏、非侵入性早期診斷方法，及只有當疾病仍侷限 於前列腺時，方可使用放射性外科手術治愈。 因爲早期階段沒有症狀出現，相對於70%以上的女性 人口，不到3 0 %的男性接受必要的預防性檢查。目前，這 些檢查係由三部分診斷所組成：（i)病患血液內PSA的定量 、（Π)直腸指檢（DRE)檢査及最後（iii)藉由大約10次經直腸 超音波引導的穿刺生檢（TRUS)之一套診斷方法進行確認， £ -5- 201217786 該經直腸超音波引導的穿刺生檢係對顯現異常DRE、升高 PSA(>4.0 ng/ml :實際傾向 >2.5 ng/ml)或 PSA 速率（PSA 變 化率）>0.4至0.75 ng/ml/年的男性施行。該檢查在西半球成 爲用於PCa篩選照護的黃金標準。然而，PSA和DRE缺乏明 顯的特異性且生檢缺乏理想之敏感度。 PSA作爲腫瘤標記的限制之一係其缺乏特異性，此導 致高的陰性生檢率。在PSA的灰色區域（4-10 ng/ml)，在患 有早期PCa和前列腺良性症狀（諸如良性增生（BPH)和無症 狀慢性前列腺炎）的男性病患之間，彼等之血清PSA値實質 上重疊（Loeb，S. et al·，（2009) Exclusion of inflammation in the differential diagnosis of an elevated prostate-specific antigen (PSA). Urol Oncol 27，64-66; Pannek, J., and Partin, A.W. (1 997) Prostate-specific antigen: what's new in 1 997. Oncology (Williston Park) 11，1 273- 1 278; discussion 1279-1282) ° 已作出多種嘗試以克服PS A篩選的限制。這些嘗試包 括使用年齡校正的PSA截取點、游離PSA、PSA密度、PSA 速率、PS A斜度和PS A倍增時間。所有此等方法皆已被提 出以作爲改善“臨床重要的”PC a案例偵測的方式。然而， 沒有證據表示此等檢測策略的任何一種能改善健康結果。 目前篩選參數的結果是，歐洲每年進行約390,000個 生檢的約2/3都.是不必要的（Catalona， W. J. et al., Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. N Engl J Med 324:

-6- 201217786 1 1 56-6 1, ( 1 99 1 ); Makinen, T. et al., Second round results of the Finnish population-based PCa screening trial. Clin Cancer Res，l〇: 223 1 -6 (2004))。生檢的僞陽性率大約爲 零，但是第一次生檢的僞陰性率可能介於1 2 %至3 0 %之間 。因此，很多顯現陰性生檢結果的男性進行重復之生檢以 排除PCa。 需要更準確的檢驗以幫助鑑別哪些病患係屬於罹患 PCa的高風險群，且對該高風險群病患强制性實施重復之 前列腺生檢。因此，迫切需要使用非侵入性之方法在早期 階段檢測出PCa。 已經鑑別出許多令人相信的PCa生物標記，該等生物 標記不僅具有前列腺特異性且亦被前列腺腫瘤過度表現， 其包括GSTP1的CpG過度甲基化、TMPRSS2:ERG基因融合 及 RNA 生物標記 PCA3 (Marks，L.S.和 Bostwick，D.G. (2008) Prostate Cancer Specificity of PC A3 Gene Testing: Examples from Clinical Practice. Rev Urol 10, 175-181;

Sararaaki et a 1. (2008) TMPRS S2: ERG fusion identifies a subgroup of prostate cancers with a favorable prognosis. Clin Cancer Res 1 4, 3395-3400; Vener et al. (2008)

Development of a multiplexed urine assay for prostate cancer diagnosis. Clin Chem 54，874-882)。因爲在摧患 PCa的男性尿液中可以檢測出前列腺細胞，基於尿的診斷 檢驗具有非侵入性或最小侵入性的優勢，因而將會被更多 男性群體所接受。儘管已經在大型篩選項目中進行對 201217786 PCA3表現和GSTP1甲基化的基於尿之檢驗，但是只有兩個 基於考慮癌症發展的異質性之診斷輪廓的硏究，其中一個 使用RNA且另一個使用基因組DNA (Laxman et al. (2008) Cancer Res 68， 645-649)。 WO 03/009 8 1 4揭露一種評估病患是否罹患PCa之方法 ，其包含將病患樣本中選自一組標記之標記的表現量與對 照組非PCa樣本中該標記的正常表現量作比較，其中該病 患樣本中該標記的表現量顯著高於正常量即表示該病患罹 患 PCa。該組標記包括 PCA3 (M381)、PSMA (FOLH1)及 PSGR (M311)標記；然而，WO 03/009814並未揭露該PCA3 、PSMA及PSGR標記之特異性組合以作爲供PCa早期檢測 之特異性三基因組。 DE 1 0 2006 032 3 94揭露一種用於診斷PCa之方法，其 包含比較病患樣本中選自標記ZIP/CREB3L4、AMACR、 DD3/PCA3、D-GPCR、EZH2' PCGEM1、PDEF、前列腺特— 異蛋白 prostein 、 PSGR/OR51E2 、 PSMA/FOLH1 、 TMPRSS2或TRPM8之至少兩種標記的表現。然而，藉由邏 輯回歸分析進行資料分析。此外，DE 10 2006 032 394所 提及之優選的標記組合皆未由PC A3、PSMA及PSGR標記之 特異性組合所組成。 另外，WO 2008/1 2 1 1 32揭露一種評估病患是否罹患 PCa之方法，其包含將病患樣本中選自一組標記之一個標 記的表現量與參考値作比較。該組標記包括PC A3、PSMA 及PSGR標記；然而，WO 2008/121132並未揭露該PCA3、 201217786 PSMA及PSGR標記之特異性組合以作爲供PCa早期檢測之 特桌性三基因組。 儘管事實上PSA血清測量與DRE和TRUS之組合在西半 球構成PCa篩選照護的黃金標準，然而PSA和DRE明顯缺乏 特異性，且生檢缺乏理想之敏感度（12至30%僞陰性）。 用於PC a診斷的最爲普遍使用的標記之一係測定尿液 樣本中 PCA3。Van Gils et al. (van Gils MP et al·，Clin Cancer Res 1 3: 93 9-43 (2007))報告 5 34 個病患（其血清 PSA 介於3至15 ng/ml)中，PCA3敏感度爲65%且特異性爲66% (AUC 0.66)，其包括顯現癌陽性生檢的174個男性（33%)。 Hessels et al· (Hessels D et al.，Eur Urol 44: 8-15;討論 1 5-6 (2003 ))觀察108個病患的群體硏究中，敏感度爲67% 且特異性爲 83% (AUC 0.72)。Marks et al. (Marks L S，et al· Urology 69: 532-5 (2007))觀察經重復生檢後，27%顯 現癌表徵之2 3 3個病患（PSA22.5 ng/1)的群體硏究中，敏感 度爲 58% 且特異性爲 72% (AUC 0.68) » Groskopf et al. (Groskopf J et al.，Clin Chem 52: 1 0 89-95 (2006))觀察在 70個病患的群體硏究中，敏感度爲69%且特異性爲79% (AUC 0.75)。Haese et al. (Haese A et al.，Eur Urol 54: 1 08 1 -8 (200 8))報告在463個病患硏究中，截取値爲35時 PCA3敏感度爲47%且特異性爲72% (A U C 0 · 6 6)，該硏究係 用於鑑別顯現陽性重復生檢之高風險性病患。 目前，生檢策略可能遺漏異質性腫瘤病竈，且基於尿 液的試驗將具有很大之優勢，因爲源自整個前列腺的多重

S -9- 201217786 病竈之細胞可被釋出至尿液中並經收集（Laxman B et al.， Neoplasia 2006; 8: 8 85 -8)。然而，若在尿液樣本中分析·該 標記，則於經前列腺按摩（PM)後所獲得的排出尿液樣本之 沈積物上進行的定量聚合酶鏈反應（qPCR)檢測可能能夠在 占多數非惡性細胞之環境中檢測出少許之惡性細胞。再者 ，因爲單一標記可不一定能反映出PCa的多因數、多病竈 及異質性本質，因此相對於單一標記，多種生物標記之組 合將明確地改善功效（Etzioni R et al·，Biostatistics 2003; 4: 523-3 8)。多重標記與臨床和人口統計資料之結合使用 將有助於預測處於罹患PCa風險的病患並評估他們的預後 。對此，敏感度>9 5 %的單一標記，特異性將大幅下降。例 如，對PCA3之敏感度爲96%，發現特異性僅爲14% (Marks L S et al., Rev. Ur ο 1 · 2 0 0 8 ; 1 0 : 1 7 5 - 8 1)。 進一步，儘管對此問題進行硏究，目前從臨床觀點看 僅有少數腫瘤標記可用於PCa診斷。此外，歐洲每年進行 數量極爲龐大（約260,000次）的非必要性生檢。因此，此技 藝需要能夠解决上述任何提及之缺陷的診斷PCa之方法。 該等方法有利地應當能使用非侵入性方式在早期階段檢測 出PCa。因此，需要額外的生物標記以補充或潛在地替代 目前所使用的診斷技術。 【發明內容】 已經鑑別出尿轉錄物的新穎多樣組，其在PCa檢測方 面優於單獨PC A3轉錄物和單獨PSA。爲經前列腺生檢之 201217786 154個病患的推定PCa生物標記PCA3、PSGR及PSMA之過度 表現，發明人已檢驗經前列腺按摩後的尿液沈澱物。該組 合標記模型的曲線下面積（AUC)爲0.80。藉由前列腺生檢 的PCa檢出率爲37 % (57/154)。隨後，發明人在77個男性（ 其中35%罹患PCa)的目標子群中具體地測驗該組合之臨床 有效性，其中該等男性的血清PSA介於4至10 ng/ml且先前 未接受生檢（特殊目的組）。PSA密度（PSAD)亦包括在此分 析中作爲典型的臨床工具以提高PSA特異性。藉由使用多 重模型，在該特殊目的組內的男性之該曲線下面積（AUC) 爲0.89且在整體組爲0.80。顯現96%敏感度和62%特異性（ 整體組爲40%) »使用該三基因與PSAD之組合將能節省 42°/。（整體組爲26%)的非必要實施的生檢。因此，發明人已 證實一種在尿液中檢測PCa之敏感方法，其可用於提高 PS A的特異性並避免大量非必要的生檢。此新穎方法提高 PS A的診斷效率且在PS A的灰色區域特別有用。 因此，本發明係基於基因組合的鑑別，該基因的差異 性表現與PCa相關。進一步使用此模型以評估是否應該實 施生檢。在不同方面，本發明提供評估PCa存在或不存在（ 例如診斷或預後）之方法、評估或監測患有PCa之個體對治 療的反應之方法及監測個體PCa進展之方法，該等方法係 基於源自個體之樣本並定量測定與PCa相關的3個特異性基 因（PCA3、PSMA及 PSGR)量。 因此’第一方面’本發明關於一種在所欲之敏感度下 診斷個體的前列腺癌之方法，其包含

-11 - •S 201217786 (i) 測定自該個體分離的生物流體樣本中PCA3、 PSMA及PS GR基因之表現量，其中該生物流體選自尿、前 列腺分泌物、精液或前列腺經按摩後之尿，及 (ii) 將該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量與每個 該基因之預定截取値作比較，其中每個基因之該預定截取 値對應與接受者操作特徵（ROC)曲線中於該所欲之敏感度 下最高特異性相關的該基因之表現量，該曲線係基於測定 處於罹患PCa之風險的病患群體之PCA3、PSMA及PSGR基 因表現量進行計算， 其中該樣本中至少一個該基因之表現量相對於該基因 之該預定截取値顯著增加即表示該個體於該所欲之敏感度 下罹患P C a。 另一方面，本發明關於一種用於評估或監測患有PCa 之個體對治療的反應之方法，其包含 (i) 對該個體施予該治療之前，測定自該個體分離所 獲得的生物流體樣本中該PC A3、PSMA及PSGR基因之表現 量，其中該生物流體選自尿、前列腺分泌物、精液或前列 腺經按摩後之尿， (ii) 對該個體施予該治療之後，測定自該個體分離所 獲得的生物流體樣本中該PC A3、PSMA及PSGR基因乏表現 量，其中該生物流體選自尿、前列腺分泌物、精液或前列 腺經按摩後之尿，及 (iii) 將對該個體施予該治療之前及之後所獲得的該 PC A3、PSMA及PSGR基因之表現量與每個該基因之預定截 201217786 取値作比較，其中每個基因之該預定截取値對應與接受者 操作特徵（ROC)曲線中於該所欲之敏感度下最高特異性相 關的該基因之表現量，該曲線係基於測定處於罹患PCa之 風險的病患群體之PCA3、PSMA及PSGR基因表現量進行計 算， 其中經施予該治療後，該個體樣本中至少一個該基因 之表現量相對於該基因之該預定截取値顯著減少或沒有變 化即表示所施予之治療有效，或 其中經施予該治療後，該個體樣本中至少一個該基因 之表現量相對於該基因之該預定截取値顯著增加即表示所 施予之治療無效。 另一方面，本發明關於一種用於監測個體PCa進展之 方法，其包含 (i)測定第一時期自該個體分離所獲得的生物流體樣 本中該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量，其中該生物流 體選自尿、前列腺分泌物、精液或前列腺經按摩後之尿， (Π)測定第二時期自該相同個體分離所獲得的生物流 體樣本中該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量，其中該第 二時期係晚於該第一時期，且其中該生物流體選自尿、前 列腺分泌物、精液或前列腺經按摩後之尿，及 (iii)將該第一時期和該第二時期所獲得的該PC A3、 PS Μ A及PSGR基因之表現量與每個該基因之預定截取値作 比較，其中每個基因之該預定截取値對應與接受者操作特 徵（ROC)曲線中於該所欲之敏感度下最高特異性相關的該 -13- 201217786 基因之表現量，該曲線係基於測定處於罹患PCa之風險的 病患群體之該PCA3、PSMA及PSGR基因表現量進行計算， 其中該第二時期之個體樣本中至少一個該基因之表現 量相對於該第一時期之表現量顯著減少或沒有變化即表示 該個體之陽性進展，或 其中該第二時期之個體樣本中至少一個該基因之表現 量相對於該第一時期之表現量顯著增加即表示該個體之陰 性進展。 另一方面，本發明關於一種用於評估個體是否必須接 受前列腺生檢之方法，其包含 (i)測定自該個體分離所獲得的生物流體樣本中PCA3 、PSMA及PSGR基因之表現量，其中該生物流體選自尿、 前列腺分泌物、精液或前列腺經按摩後之尿，及 (ϋ)將該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量與每個該 基因之預定截取値作比較，其中每個基因之該預定截取値 對應與接受者操作特徵（ROC)曲線中於該所欲之敏感度下 最高特異性相關的該基因之表現量，該曲線係基於測定處 於罹患PCa之風險的病患群體體內該PCA3、PSMA及PSGR 基因之表現量進行計算， 其中該樣本中至少一個該基因之表現量相對於該基因 之該預定截取値顯著增加即表示該個體係前列腺生檢之候 選者。 另一方面，本發明關於一種套組，其包含第一組分和 可選擇地第二組分，其中該第一組分係一組由下述所組成 -14- 201217786 之試劑： (i)能測定基因PCA3表現量之試劑； (Π)能測定基因PSMA表現量之試劑；及 (iii)能測定基因PSGR表現量之試劑；且 其中該第二組分包含能測定一或多種前列腺家務 (housekeeping)基因表現量之一或多種試劑。 另一方面，本發明關於如申請專利範圍第1項所請之 套組於PCa診斷、用於評估或監測患有pCa之個體對治療的 反應或用於監測個體PCa進展之用途。 發明詳述 本發明的診斷方法 當經組合R0C分析進行分析時，本發明的作者已經鑑 別特定基因之組合，該組合在被診斷患有PCa的病患之腫 瘤樣本中相對於在無PCa的參考樣本中能進行差異性表現 ’藉以得到能改善功效之PCa檢測的組合標記。例如，如 本發明的圖2所示，該組合ROC分析能檢測PCa (AUC爲 0.80)，其相對於單一標記的AUC顯現改善（PCA3爲0.61; PSGR爲0.64 ; PSMA爲0.63)。對每個生物標記使用檢測閥 値（截取値）；然後，若至少一個分數高於其檢測閥値，則 將病患宣布爲陽性。超過閥値（截取値）範圍，計算敏感度 和特異性値。 因此，第一方面，本發明關於一種在所欲之敏感度下 診斷個體前列腺癌之方法，其包含 -15- 201217786 (i) 測定自該個體分離的生物流體樣本中PCA3 ' PSMA及PSGR基因之表現量，其中該生物流體選自尿、前 列腺分泌物、精液或前列腺經按摩後之尿，及 (ii) 將該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量與每個 該基因之預定截取値作比較，其中每個基因之該預定截取 値對應與接受者操作特徵（ROC)曲線中於該所欲之敏感度 下最高特異性相關的該基因之表現量，該曲線係基於測定 處於罹患PCa之風險的病患群體之PCA3、PSMA及PSGR基 因表現量進行計算， 其中該生物流體樣本中至少一個該基因之表現量相對 於該基因之該預定截取値顯著增加即表示該個體於該所欲 之敏感度下罹患PCa。 本發明關於一種在所欲之敏感度下用於診斷個體前列 腺癌之方法，其包含 (i) 提供源自該個體的生物流體樣本，其中該生物流 體選自尿、前列腺分泌物、精液或前列腺經按摩後之尿， (ii) 測定該生物流體樣本中PCA3、PSMA及PSGR基因 之表現量，及 (iii) 將該PC A3、PSMA及PSGR基因之表現量與每個 該基因之預定截取値作比較，其中每個基因之該預定截取 値對應與接受者操作特徵（ROC)曲線中於該所欲之敏感度 下最高特異性相關的該基因之表現量，該曲線係基於測定 處於罹患PCa之風險的病患群體之PCA3、PSMA及PSGR基 因表現量進行計算， -16- 201217786 其中該生物流體樣本中至少一個該基因之表現量相對 於該基因之該預定截取値顯著增加即表示該個體於該所欲 之敏感度下罹患PCa。 如本文所使用者，術語“用於診斷的方法”關於本質上 可由前述步驟組成或可包括其他步驟的方法。然而，必須 理解的是，該方法在優選的實施方案中是在體外實施的方 法，即不在人體或動物體內實施。本文所使用之診斷關於 評估個體患病的可能性。本領域技術人員當能理解的是， 儘管是優選的，此種評估於正常情况下可能不是對1 〇〇%受 診斷的病患皆屬正確。然而，該術語要求可將個體的統計 上顯著部分鑑定爲患病或具有患病傾向。本領域技術人員 可藉由使用幾種衆所周知的統計評估工具立刻測定某部分 是否呈統計上顯著，例如測定信賴區間、測定P値、 Student t檢驗、Mann-Whitney檢驗等》詳細內容參見 Dowdy和 Wearden，Statistics for Research, John Wiley & Sons，New York 1 983。優選的信賴區間是至少50%、至少 6 0 %、至少7 0 %、至少8 0 %、至少9 0 %、至少9 5 %及優選地 至少99%。p値優選的是0.2、0.1、0.05及優選地0.01。本 發明用於診斷的方法能評估個體是否患有PCa。 術語“前列腺癌”係指任何一種前列腺的癌症，其中前 列腺細胞突變並開始不受控制的繁殖，其與癌症階段無關 。通過分析臨床和組織病理學信息，評估前列腺癌在病患 體內進展之程度。癌症階段係根據腫瘤大小（T)、是否有 淋巴結牽連（N)、轉移的存在（M)及腫瘤等級（G)分類。T1 -17- 201217786 類腫瘤限於前列腺且因爲太小而不能通過直腸指診檢查。 T1進一步包括Tla (在組織樣本中癌細胞低於5%)和Tib (高 於5%)子部分。Tic表示該病患具有升高的前列腺特異性抗 原（PS A ;參見下文的定義）。如果腫瘤足夠大且能夠在直 腸指診中被檢査出來，則歸類爲T2。T2a是指只有前列腺 的一邊（左邊或右邊）有腫瘤；T2b是指兩邊都有腫瘤。通 常將T2稱爲“局部癌症”。若該癌症是T3，其已擴散到臨近 前列腺的結締組織（T3a)或精囊（T3b)的連接組織。T4表示 癌症擴散到前列腺旁邊的組織，例如膀胱括約肌、直腸或 骨盆壁。前列腺癌還可能擴散到骨盆的局部淋巴結，其被 評爲前列腺癌的N1階段。將T3、T4及N1階段統稱爲“局部 晚期”或區域癌症。如果癌症已擴散到遠離的部位，如骨 骼，則被稱爲“轉移”或處於Μ 1階段。將已擴散到遠處淋巴 結的前列腺癌歸類爲Μ 1 a，而將已擴散到骨胳的前列腺癌 歸類爲Mlb，並將已擴散到器官如肝臟和大腦等的前列腺 癌歸類爲Mlc。若不治療，前列腺癌幾乎全部會轉移至骨 骼。 如本文所使用者，“個體”是指任何一種歸類爲哺乳動 物的動物，其包括但不限於家畜和農畜、靈長類動物及人 類，例如人、非人類之靈長類動物、牛 '馬、猪、綿羊、 山羊、狗、猫或嚙齒類動物。優選地，該個體爲任何年齡 或人種的男人或女人。 在優選的實施方案中，實施測定的個體顯示高於4 ng/ml PSA濃度。在更優選的實施方案中，對顯示出低於 -18- 201217786 10 ng/ml且更優選地4至10 ng/ml PSA濃度的個體實施本發 明的方法。在另一實施方案中，對還未接受前列腺生檢的 個體實施本發明的方法。 在優選的實施方案中’施予本發明的方法的個體是指 患有前列腺惡性腫瘤前期病變、如分離型高等級前列腺上 皮內瘤形成的病患。 如本文所使用者，術語“高等級前列腺上皮內瘤形成” 或“HG-PIN”是指與前列腺癌的高風險有關的症狀，且亦稱 爲發育異常、管內發育異常 '大腺泡非典型增生、非典型 原發性增生、伴有惡性變化的增生、標記的非典型和管-腺泡發育不良的症狀。HG-PIN的特徵可能在於高的核/質 比、著色過度、粗糙的顆粒狀染色質、缺少核仁、分離的 細胞、及細胞多形性和核多形性。用於診斷PIN的方法在 本領域中屬習知，其包括但不限於穿刺生檢和埃兹（ezrin) 蛋白表現的測定，該蛋白爲細胞骨架之連接蛋白，其對控 制癌細胞的增長和轉移能力具有積極作用（參見Pang et al. Urology. 2004 Mar; 63(3): 609-12)，且美國專利號 6,054,3 20提供用於鑑別PIN的套組。HG-PIN包括分離的及 多病灶的HG-PIN。 因此，診斷出HG-PIN的病患是施予本發明的方法之特 別合適候選者，因爲彼等因HG-PIN惡性轉化之結果而處於 發生前列腺癌的高風險。 如本文所使用者，術語“敏感度”是指當樣本呈陽性時 ，本發明的診斷方法得出陽性結果的槪率。敏感度係藉由

S -19- 201217786 真陽性結果數除以真陽性和僞陰性的總數加以計算。敏感 度本質上是一種標準，其衡量一種鑑別患有疾病的病患之 方法的準確度，該疾病爲前列腺癌。在本發明的方法中， 可選擇截取値以使得在受驗病患群體的至少.60%、或受驗 病患群體的至少65%、70%、75%或80%中，診斷個體的敏 感度爲至少大約70%，且可以是例如至少75%、至少80%、 至少8 5 %、至少9 0 %、至少9 5 %、至少9 6 % '至少9 7 %、至 少9 8 %、至少9 9 %或至少1 0 0 %。 在第一步驟，本發明的診斷方法包含測定自受診斷的 個體所分離的樣本中PCA3、PSMA及PSGR基因的表現量。 本發明的方法所使用的術語“一或多個基因的表現量” 關於一或多個基因之表現程度。典型地，藉由測定RN A表 現量可測定給定基因的表現量，其中術語“ RN A表現量’’是 指轉化成經轉錄之RNA、初始未經剪接的RNA轉錄物或成 熟mRNA的DNA基因序列資訊的測定濃度。 可通過測定該基因的全部RNA或子序列的濃度以監測 RN A表現。實際上，可在本發明的框架下採用任何一種用 於檢測基因存在並定量基因量的方法，藉以檢測並定量由 生物標記基因編碼的mRNA量。通過非限制性說明，在特 殊之實施方案中，爲測定樣本中特定RN A量，可使用本領 域技術人員習知之方法以抽取並定量源自樣本的有關生物 標記基因（PSGR)的轉錄RNA»參見WO 2008/1 2 1 1 32和WO 98/24935，彼等有關RN A分析方案的內容藉由參考的方式 納入本文。簡言之，自樣本（例如任意之組織、體液、細

-20- 201217786 胞（例如循環腫瘤細胞）等）中抽取RNA。例如，可在合適的 溶液中溶解細胞並洗提RNA。在RNA經抽取後，可藉由使 用逆轉錄酶進行第一鏈合成。然後，可進行基因擴增（更 具體地定量PCR分析），且相對於內部標記（例如18S rRNA) 校準標的基因，雖然亦可使用其他內源性標記，例如2 8 S -25S rRNA和5S rRNA。多次重復測試樣本，例如3次重復 。在本發明的實施方案中，使用擴增、報導試劑及諸如 Applied Biosystems商業化供應的儀器施行qPCR。給定粑 轉錄物的擴增之限定效率，可檢測的自擴增之靶模板發出 信號之點（例如周數或ct)可直接與測定樣本中特異性資訊 轉錄物相關。相似地，當其他可計量的信號（諸如螢光、 酶活性、每分鐘降解、吸光度等）與已知靶模板濃度相關（ 即參考標準曲線）或經標準化而成爲有限變異性之標準時 ，可用於定量未知樣本內的靶模板之量。 儘管並不限於擴增方法，定量基因表現技術可使用靶 轉錄物的擴增。可替代地，或者與該靶轉錄物的擴增結合 ’亦可使用對內部標記的報導信號的定量，該內部標記係 由擴增産物的指數增生。可藉由等溫基因擴增策略或藉由 使用熱循環（諸如PCR)進行基因擴增以完成該靶模板的擴 增。 使用信使特異性引子或隨機引子擴增特異性RNA。根 據自公開數據庫（例如Unigene，National. Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Bethesda，MD)所獲得的數據可合成該特異性引子，彼等數 -21 - 201217786 據包括自人類和其他動物獲得的基因組和cDNA庫信息。 選擇引子以優先自特異性RNA擴增，該特異性RNA係自檢 驗或指示樣本中獲得（參見例如RT PCR，Chapter 15 in RNA Methodologies. A Laboratory Guide for Isolation and Characterization. 2nd edition, 1 998, Robert E. Farrell, Jr., Ed., Academic Press ；或 Chapter 22 pp . 1 4 3 - 1 5 1 , RNA Isolation and Characterization Protocols. Methods in Molecular Biology, Volume 86，1 998，R. Rapley 和 D. L. Manning Eds., Human Press, 或 Chapter 14 Statistical refinement of primer design parameters ；或 Chapter 5, pp.55-72， P C R Applications: protocols for functional genomics, M . A . I nni s , D . H . Gelfand 和 J. J . Sninsky, Eds.，1999，Academic Press)。在®溫條件下進行擴增或使 用熱循環儀擴增（例如Applied Biosystems之ABI 9600或 9700或 7900)。藉由使用螢光標記檢測寡核苷酸探針以 檢測擴增的核酸（參見例如Taqman™ PCR Reagent Kit, Protocol, part number 402823, Revision A, 1 996, Applied Biosystems)，其係根據針對擴增引子描述的公開資料庫中 鑑別並合成。 例如但不限於，通過使用合適的檢測系統（例如ABI Prism®7900序列檢測系統（Applied Biosystems))檢測並定 量擴增的cDNA。該檢驗樣本中含有特異性RNA的量可與 觀察到的蛋光相對量有關（參見例如Advances in Quantitative PCR Technology: 5’ Nuclease Assays, Y. S. -22- 201217786 lie and C J. Petropolus, Current Opinion in Biotechnology, 1 998, 9 : 43-4 8 或 Rapid Thermal Cycling and PCR Kinetics, pp. 2 1 1 -229, chapter 14 in PCR applications: protocols for functional genomics, M. A. Innis, D. H. GelfandandX J. Sninsky, Eds., 1 999; Academic Press) o 在特定之實施方案中，使用定量PCR (qPCR)檢測並定 量PSGR、PCA3及PSMA基因的表現量。可自例如Sambrook et al., 2 0 0 1 “Molecular cloning: to Laboratory Manual”， 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3中找到定量基因表現量的常見方法。 術語“PCA3”是指已知爲前列腺癌抗原3 (NCBI登錄號 爲AF 1 03907或NR_0 1 5 3 42)的基因，其對應位於染色體9的 非蛋白編碼基因，該基因編碼前列腺特異性非編碼RNA， 該RNA在95%以上的原發性PCa樣本和PCa轉移中高度過度 表現。 如本文所使用者，術語“PSMA”是指已知爲前列腺特 異性膜抗原的基因，亦稱爲FOLH1 (葉酸水解酶前列腺特 異性膜抗原1)，其編碼至少2個轉錄變體（NCBI鑑別爲 NM_0044 76和NM_00 1 0 1 49 8 6)，該等變體編碼整體非剪切 之第2型膜蛋白，其在前列腺上皮細胞上高度特異性表現 且在PCa及其他固體腫瘤的新血管系統中強烈上調 (Elsasser-Beile, U. et al.. Curr Drug Targets 10: 118-25 (2009)) 〇 如本文所使用者，術語“PSGR”是指前列腺特異性G蛋 5 -23- 201217786 白偶聯受體，亦稱爲OR51E2 (嗅覺受體，51家族，E亞族， 成員2，NM_030774)，其爲G蛋白偶聯〇R家族的一員，該 家族具有高前列腺組織特異性和腫瘤相關之過度表現。 爲確定起見，用於實施本發明的多核苷酸包括但不限 於突變體、同系物、亞型、等位基因等。應理解的是，只 要變體基因與自然基因相似，皆顯示在彼等的表現量與 PCa的存在之間的相關性，則不需要本發明的序列編碼 PCA3、PSMA及PSGR基因的功能性變體。如本文所使用者 ’術語“變體”是指PSGR多核苷酸之缺失、插入或替代一或 多個核苷酸所得到的多核苷酸。該PSGR變體包括但不限 於顯示與PSGR mRNA至少70%、有利地至少75 %、典型地 至少8 0 %、優選地至少8 5 %，更優選地至少9 0 %，還更優選 地至少9 5 %、9 7 %、9 8 %或 9 9 %的同一性的多核苷酸。可 藉由常見方法，例如藉由本領域已知的標準序列比對演算 法’諸如BLAST ’測定兩個胺基酸序列間之同一性 (Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1 990 Oct 5; 2 1 5(3): 403-1 0) 〇 本發明中，術語“樣本”或“生物樣本”是指自個體身上 所分離的生物材料。如本文所使用者，術語“生物流體，’是 指提供來自前列腺組織或細胞的核酸源的樣本，其包括例 如前列腺細胞、前列腺組織、’前列腺液、尿、射精的精液 、精液等。實際上，由於可在PCa男性病患的尿中檢測出 前列腺細胞，推薦使用流體，諸如尿。在特定的實施方案 中，本發明用於測定生物標記的樣本優選地是前列腺經按 -24- 201217786 摩（例如DRE)後或前列腺經生檢後（生檢後）或藉由自發排 尿所得到的尿液樣本。優選地，本發明的方法包含使用前 列腺經按摩（例如DRE)後所得到的尿液樣本。該樣本似乎 是男性病患廣泛能接受的微創技術和爲作出正確診斷以獲 得足夠細胞的可能性之間最好的折中。在另一實施方案中 ，本發明用於測定生物標記的樣本係藉由表現的前列腺分 泌物或前列腺切除術所得到的樣本（其作爲陰性對照組使 用）。因爲排出尿液樣本的第一部分含有最高濃度的前列 腺和尿道分泌物（Iwakiri J et al.，J Urol 1 49: 783 -6 ( 1 993 ))，選擇前列腺經按摩後所收集的排出尿液樣本。此 外，此樣本比精液或表現的前列腺分泌物更容易從男性病 患身上收集。 第二步驟，本發明的方法包含將該PCA3、PSMA及 PSGR基因之表現量與每個該基因之預定截取値作比較， 其中每個基因之該預定截取値對應與接受者操作特徵 (ROC)曲線中於該所欲之敏感度下最高特異性相關的該基 因之表現量，該曲線係基於測定處於罹患PCa之風險的病 患群體之PCA3、PSMA及PSGR基因表現量進行計算。 術語“截取値，’，當涉及PC A3、PS Μ A及PSGR基因的表 現量時*係指參考表現量，其表示若病患的表現量高於上 述截取値或參考値，則顯現給定敏感度的個體可能罹患 PCa。典型地，使用接受者操作特徵曲線（R〇c曲線）以計算 截取値。 實際上，典型地藉由繪製“正常，’（即明顯健康）和“患病 -25- 201217786 ”群體中變數値對相對頻率以計算接受者操作特徵曲線 (ROC曲線）。對任何特殊標記或標記組（即該PCA3、PSMA 及PSGR基因的表現量），患病和未患病個體的標記濃度分 布可能重疊。在此情况下，檢驗無法100%準確地完全將正 常個體與患病個體區分，且該重疊區域即表示該檢驗不能 將正常個體與患病個體區分的部位。選擇閥値或截取値， 高於該閥値或截取値（或低於該閥値或截取値，此取决於 標記係如何隨疾病改變）則被認爲該檢驗呈現異常，且低 於該閥値或截取値則被認爲該檢驗呈現正常。ROC曲線下 面積係用於度量認知的測量値能對症狀進行正確鑑定的槪 率。甚至#檢驗結果未必能給出精確數値時，亦可以使用 ROC曲線。只要能排歹IJ結果，就食g作出ROC曲線。例如， 可根據等級（例如，1 =低，2 =正常及3=高）排列“疾病”樣本 的檢驗結果。該排列可與“正常”群體的結果相關，並作出 R Ο C曲線。此等方法係爲此領域所習知。參見例如H a r 11 e y et al. 1 982，Radiology 1 43: 29-36。優選地，選擇閥値以 提供大於約0.5，更優選地大於約0.7，還更優選地大於約 0.8，甚至更優選地大於約0.85，最優選地大於約0.9的 ROC曲線面積。在上下文中，術語“大約”是指給定測量値 的 +/-5%。 ROC曲線的橫軸表示（1-特異性），其隨著僞陽性率而 增加。該曲線的縱軸表示敏感度，其隨著真陽性率而增加 。因此，對所選擇的特定截取値，可確定（1-特異性）値， 且可獲得對應的敏感度。R0C曲線下面積係用於度量所測 -26- 201217786 定的標記濃度能正確鑑定疾病或症狀的槪率。因此，可使 用ROC曲線下面積以確定該檢驗的有效性。 在某些實施方案中，不依賴組內一或多個標記的特定 閥値以測定自個體所獲得的標記濃度輪廓是否表示特定的 診斷/預後。相反地，本發明可使用標記組“輪廓，，的評估以 作爲一個整體。實質上’在此標記組中，特定“指紋，，變化 模式可作爲特異性診斷或預後之指示。如本文所討論者， 可自單一樣本或自該組內一或多個成員的暫時變化（或組 反應値）獲得此變化模式。本文中的組係指一組標記。 如下文所描述者’優選地藉由繪製在不同截取値下特 定組標記的敏感度（即真陽性）對該組標記的1_(特異性）（即 僞陽性）的ROC曲線以測定該組之反應値。在此等方法中， 將個體的標記測量輪廓一起考慮以提供診斷或預後的總槪 率（以數字分數或百分比風險表示）。在該等實施方案中， 標記的某些子集的增加能充分表示某一病患的特定診斷或 預後’且標記的不同子集的增加能充分表示另一病患的相 同或不同診斷/預後。亦可將加權因數應用至一組的一或 多個標記，例如當標記在鑑別某一特定診斷/預後方面具 有特別高的應用性時，可將該標記加權，從而在某一給定 濃度上，僅該標記一者即足以表示陽性結果。同樣地，可 提供加權因數，從而未給定濃度的特殊標記即足以表示陽 性結果，但當另一標記亦應用於該分析時，該特殊標記僅 能表示一個結果。 對在連續尺度上所測定的標記，ROC曲線是真陽性部 -27- 201217786 分對僞陽性部分的繪圖，其係用於評估所有可能的截取點 値。爲得到二元結果，即前列腺癌是否存在，該R 〇 C曲線 定量標記的區分案例與對照組的鑑別能力。藉由DeLong等 的U -統計（Biometrics, 1988，44: 837-845)或引導重採樣方 法，計算該曲線下面積（AUC)的標準方差和Auc之間的差 別。 優選地，首先對k個生物標記之每一者使用k_分量檢 測閥値，然後若至少一個分數係高於彼之檢測閥値，則宣 稱該檢驗呈陽性，從而測定該k個標記的R〇c曲線。通常 在k -分量闘値範圍內計算敏感度和特異性値，該區域能產 生點雲。可藉由下述方法獲得新標記的最佳ROC曲線點： 對固定的敏感度値，在與敏感度値相匹配的點雲之特異性 區域內選擇特異性最大値。 在某些實施方案中，選擇標記及/或標記組以顯示至 少約70%敏感度，更優選地至少約80%敏感度，甚至更優 選地至少約85%敏感度，還更優選地至少約90%敏感度， 最優選地至少約9 5 %敏感度，與至少約7 0 %特異性，更優 選地至少約8 0 %特異性，甚至更優選地至少約8 5 %特異性 ，還更優選地至少約90%特異性，最優選地至少約95%特 異性組合。在特別優選的實施方案中，該敏感度和特異性 皆爲至少約75%，更優選地至少約80%，甚至更優選地至 少約85%，還更優選地至少約90%，最優選地至少約95%。 在此上下文中，術語“約”係指給定測量値的+Λ5 %。 熟習此技藝者當能理解的是，將診斷或預後的指示與 -28- 201217786 診斷或未來臨床結果的預後風險相聯結係一種統計分析。 例如，如統計之顯著水準所測定者，與顯現小於或等於X 標記濃度的病患相比，大於X標記濃度可表示病患更有可 能遭受不良之結果。此外，自基礎濃度的標記濃度變化可 反應病患之預後，且該標記濃度的變化程度可能與不良情 况的嚴重程度相關。通常藉由比較2或多個群體及測定信 賴區間及/或P値以決定統計之顯著水準。參見例如Dowdy 和 Wearden，Statistics for Research, John Wiley and Sons, New York, 1 98 3 »本發明優選的信賴區間係9 0 %、9 5 %、 9 7.5 %、9 8 %、9 9 %、9 9.5 %、9 9 _ 9 % 及 9 9.9 9 %，且優選的 p 値係 0.1 、 0.05 、 0.025 、 0.02 、 0.01 、 0.005 、 0.001 及 0.0001 ° 如本文所使用者，術語“處於罹患前列腺癌風險的病 患群體”係指已被診斷爲顯現罹患前列腺癌風險的病患群 體，該診斷係基於可用於檢測前列腺癌的一或多個試驗。 例如’該群體可包含3、 4、 5、 10、 15、 20、 30、 40、 50 或更多個體。 處於罹患前列腺癌風險的病患包括但不限於表現一或 多個下述診斷特徵的病患： -DRE呈陽性，即如Richie J P et al·，Urology，1993, 42: 365-74 和 Carvalhal G F et al·，J. Urol·，1 999，161: 83 5 -9所述，檢驗員將戴手套經潤滑的手指插入直腸中以 檢查前列腺的大小、形狀及結構’且藉由此程序檢測出存 在不規則、堅硬及塊狀的區域。儘管DRE僅能評估前列腺 -29- 201217786 的背面，但是85%前列腺癌發生在前列腺的背面部分。藉 由DRE可觸摸到之前列腺癌通常係發展到較晚期者。 -經直腸超音波，亦稱爲前列腺超音波'超音波掃描 或超音波描記術，其涉及將身體一部分暴露於高頻率音波 下以產生身體內部的圖像。因爲超音波圖像係屬即時捕捉 者’因此可顯現身體內部器官的結構和運動及流經血管的 血液。 -血液中升高的PS A濃度：儘管對血液顯現升高PS A 濃度的病患進行生檢的判定濃度並不存在標準，但是已任 意選擇不同的PSA値作爲判定濃度，特別地將高於4 ng/ml 的濃度選爲臨床試驗進行生檢的判定濃度，並基於此FDA 於19Θ4年增加對50歲年齡男性的前列腺癌檢測；將4 ng/ml 作爲PLCO (前列腺癌、肺癌、結腸直腸癌及卵巢癌）試驗 的生檢判定濃度，將3 ng/ml用於ERSPC (歐洲前列腺癌的 隨機篩檢）和ProtecT試驗，且將2.5 ng/ml用於2007 NCCN ( 美國國立綜合癌症網）指南。PS A濃度可因癌症之外的原因 而改變。高PSA濃度的2個普遍原因是前列腺腫大（良性前 列腺增生（BPH))和前列腺感染（前列腺炎）。 -血液中前列腺酸性磷酸酶（PAP)濃度升高。 -年齡高於50歲的病患。 在優選的實施方案中，處於罹患前列腺癌風險的病患 群體之病患係顯現高於4 ng/ml PSA濃度的病患及/或顯現 陽性DRE的病患。在更優選的實施方案中，處於罹患前列 腺癌風險的病患群體係由顯現所謂的灰色區域內的PS A濃 -30- 201217786 度的病患所組成，該灰色區域對應與不欲之大量僞陽性和 僞陰性相關的血清或血液PS A濃度。典型地，該灰色區域 對應於高於4 ng/ml且低於10 ng/ml PSA濃度。 在更優選的實施方案中，實施本發明的方法的個體係 先前未經生檢的病患。 一旦將給定病患體內PCA3 ' PSMA及PSGR基因的量與 每個個別基因的表現量作比較，該單一基因的表現量係藉 由使用多種標記R〇C曲線分析在所欲之敏感度下測出之最 大特異性決定，當至少一個上述基因的表現量高於該預定 的表現量時，在所欲之敏感度下診斷病患罹患前列腺癌。 如本文所使用者，在所硏究的個體樣本內，術語基因的“ 表現量的顯著升高”係指該表現量相對於該截取値升高至 少5 %、至少1 0 %、至少1 5 % '至少2 0 %、至少2 5 %、至少 3〇%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少 5 5%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少 8 0 %、至少8 5 %、至少9 0 %、至少9 5 %、至少1 0 0 %、至少 1 1 0 %、至少1 2 0 %、至少1 3 0 %、至少1 4 0 %、至少1 5 0 %或更 多。 如本文所使用者，術語“特異性”係指當樣本不呈陽性 時，本發明的診斷方法給出陰性結果的槪率。特異性係藉 由真陰性結果數除以真陰性與僞陽性之和計算。本質上’ 特異性係一種方法如何排除未罹患前列腺癌的病患之準確 度的度量。在本發明的方法中，可選擇對PC A3 ' PSM A及 PSGR基因表現的截取値，使得當敏感度在至少約70%時， 201217786 診斷個體的特異性在70至100%區域內，例如在至少6〇%受 檢的病患群體中，或在至少65%、7〇%、75%或80%受檢的 病患群體中，該特異性爲至少7 5 %、8 0 %、8 5 %、9 0 %或 95%。如本發明實施例所描述者，該方法能診斷出敏感度 爲9 6%且特異性爲40%時，存在PCa，其陽性和陰性預測値 分別爲49%和95%(圖2)。 如本文所使用者，術語“陰性預測値”與“NPV”同義， 其係指診斷出未患有前列腺癌的個體確實未患有前列腺癌 的槪率。陰性預測値可藉由真陰性數除以真陰性和僞陰性 之和計算。 如本文所使用者，術語“陽性預測値”與“ p p V ’，同義， 。 算 率計 槪和 的之 狀性 症陽 此僞 有和 具 性 實陽 確真 體以 個除 的數 化性 維陽 纖真 有由 患藉 出可 斷値 診測 指預 係性 其陽0 當至少一個本發明的方法所測定的標記表現高於作爲 參考的截取値濃度時，本發明的方法能在所欲之敏感度下 檢測出PC a且無需大幅降低該診斷方法的特異性。此種令 人驚奇的效果係源自下述事實，即在某一病患中不同基因 的變化表現可能與在另一病患中不同，其係取决於腫瘤起 源、腫瘤亞型及進展程度。在此情况下，單一基因或配對 基因組合的測定會導致某些案例無法被恰當地診斷，從而 降低敏感度。根據本發明的方法，能藉由測定所有3個基 因的表現以提高敏感度且不會影響特異性。 本領域之技術人員當能理解，當至少PCA3、至少 -32- 201217786 PSMA或至少PSGR的表現量高於截取値時，該診斷可稱陽 性。此外，當3種上述基因中2者的表現量高於每個基因的 參考値（諸如當PCA3和PSMA濃度升高、當PCA3和PSGR濃 度升高或當PCA3和PSGR濃度升高）時，亦可被診斷呈陽性 。此外，當PCA3、PSMA及PSGR的表現量同時升高時，可 得到陽性之診斷結果。 由於本發明提供的PCa診斷方法是非侵入性方法，因 爲可藉由使用來自所分析的個體之含有前列腺細胞的尿液 樣本進行，且由於該方法的高敏感度和特異性（在敏感度 爲96%時得到40%特異性），該診斷方法係安全可靠的；此 外，陽性和陰性預測値分別爲49%和95%。因此，綜合考 量，可將此等結果用於開發PCa的高特異性檢驗，該檢驗 可容易地整合至常規的泌尿科醫生的工作流程中，且如下 文所討論者，由於PSA檢驗特別在特殊臨床目的病患組（該 等病患顯現4至10 ng/ml血清PSA且先前未接受生檢）的低 特異性，可明顯減少大量不必要的生檢。 在優選的實施方案中，考慮樣本中升高的基因表現量 可能不是前列腺細胞惡性增殖的結果，而是例如在BPH中 發生非惡性前列腺增長的結果，所以藉由使用家務基因的 表現量將PCA3' PSMA及PSGR基因的表現量標準化。此外 ，可對含有自組織而不是從表現此等標記的前列腺中取得 的細胞樣本實施該方法》特別地，若在尿沉降中實施該方 法，除癌細胞外，亦可發現來自尿路上皮、腎臟、膀胱或 血液的細胞。因此，在優選的實施方案中，將形成標記組

S -33- 201217786 的不同基因之表現量標準化成家務基因的量。 如本文所使用者，術語“標準化”係指定量數値被轉換 成可與自其他基因表現分析中所得之基因表現量相比較的 數値。典型地，使用穩定表現的家務基因之基因表現量進 行標準化，將該基因之表現量作爲基因表現量的標準化指 數。 如本文所使用者，術語“家務基因”係指通常在所有組 織中被普遍表現的基因。此等基因編碼蛋白質且該蛋白質 提供所有細胞生存所需的基礎實質功能。家務基因通常在 所有細胞和組織中以相同濃度表現，但存有某些差異，特 別是在細胞生長和有機體之發展過程中。普遍使用的家務 基因包括.但不限於GAPDH (3-磷酸甘油醛脫氫酶）、β-肌動 蛋白基因、微管蛋白基因、編碼核糖體18S或28S rRNA次 單位的基因。例如，可在 Trends in Genetics, 19，362-365 (2003 )中找到家務基因的典型代表。 在優選的實施方案中，該家務基因爲“前列腺家務基 因”。如本文所使用者，術語“前列腺家務基因”係指不管 前列腺細胞係正常前列腺細胞亦或前列腺癌細胞，皆在該 等細胞中以穩定濃度表現的基因。該基因允許在樣本中檢 測前列腺衍生細胞的數量。 因此，在優選的實施方案中，本發明的第一方法包含 在測定PCA3、PSMA及PSG的相同樣本中，經標準化成前 列腺家務基因之表現量後的PCA3、PSMA及PSGR基因的表 現量之用途。 -34- 201217786 本發明使用的合適前列腺家務基因包括但不限於PSA (Sokoll et al., 1 997, Urol. Clin. North Am. 24: 253 -25 9) ' DD3 (Cancer Res., 1 9 9 9，5 9 : 5 9 7 5 - 9 )、Η P G -1、P S M、 NKX3、前列腺的6跨膜上皮抗原（STEAP)、Trp-p8 (Tsvaler et al·)、前列腺酸性磷酸酶、肌酸激酶、胸腺素 b-15、HPC1基礎前列腺癌基因、hKLK2基因編碼的前列腺 特異性腺體激肽釋放酶蛋白hK2、前列腺特異性抗原蛋白 、hKLK3 基因編碼的 hK3 (PSA)、SIM2 基因（WO 09/ 1 3 5 0 1 9 A)、ERG 基因（WO 09/1 3 5 0 1 9 A)、TMPRSS2、PSM或前列 腺特異性膜抗原（Fair et al.，1 997, Prostate 32: 1 40- 1 48) 、PSCA 或前歹IJ 腺幹細胞抗原（Reiter et al., 1 998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1 735- 1 740)、TMPRSS2 (Lin et al., 1 9 9 9. Cancer Res. 59: 4 1 80-4 1 84)、P D E F (Oettgen et al.，2000, J. Biol. Chem. 275: 1 2 1 6- 1 225)、PSG-1 或前歹 lj 腺特異性基因-1 (Herness, 2003，Cancer Res. 63: 329-336) 、P C A 3 (Bussemakers et al., 1 999，Cancer Res. 59: 597 5-5979)、WO 98/045420、WO 0 1 /023 5、WO 2004/070056、 WO 2005/003387)、PCGEM1 (Srikantan et al., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 1 22 1 6- 1 222 1 )及基因 P704P、 P7 1 2P 及 P 77 5 P (Stolk et al_，2004. Prostate 60: 2 1 4-226)。 在優選的實施方案中，前列腺家務基因係PSA基因。 如本文所使用者，術語PSA是指位於染色體19上的基因’ 染色體19編碼顯現絲胺酸蛋白酶活性的糖蛋白’該糖蛋白 係藉由前列腺上皮細胞在雄激素之控制下表現並分泌成精 -35- 201217786 清而將其液化。正常情况下，PSA蛋白在前列腺內，但是 在如癌症或BPH的前列腺疾病的情况下，PSA滲入血液中 且以不同的形式存在，該形式包括與蛋白錯合物組合的形 式和不與蛋白錯合物組合的形式（£1-3^1*1^1^，1994，八(^· Clin. Chem. 31: 99)。總PSA血清濃度的測定是前列腺癌病 患的篩選和管理中使用最頻繁並獲FDA所認可的生化試驗 之一。迄今的硏究顯示，PS A篩選組合DRE和直腸超音波 通常能提高早期前列腺癌的檢出率，但仍局限於腺體本身 (Brawer et al.，1992，J. Urol. 147: 841)。血清 PSA亦用於 治療後（特別是前列腺癌切除手術後）對病患的監測。然而 ，總PSA測定亦鑑別出具有異常升高濃度但後來發現未患 有前列腺癌的大量病患。最近，測定游離/總P S A比例百分 比的槪念顯示在對顯現4至10 ng/ml PS A的男性進行篩選時 增加前列腺癌的特異性（Letran et al.，1 998，J. Urol. 160: 426)。在優選的實施方案中，藉由使用pSA mRN A濃度進 行標準化。 本發明的作者亦觀察到’藉由合倂前列腺癌的其他生 物標記可進一步提高該標記組的診斷價値，該其他生物標 記選自PSA密度（PSAD)或血清PSA濃度。 因此’如本發明的實施例所示，包含PCA3、PSMA及 PSGR的表現量及PSAD的標記組能在AUC爲0.89時診斷出 前列腺癌’其中使用無PSAD的3個表現量導致AUC爲0.82 。該組合的標記模型的敏感度爲96%且特異性爲40%。陽 性和陰性預測値分別爲4 9 %和9 5 % (參見圖2)。 -36- ► .，.v 201217786 術語“生物標記”在本領域內通用且係指過程、結果或 條件的區別性生物的或生物衍生的指示物。 將其他生物標記倂入該診斷方法係需要（i)測定所硏究 的病患體內的其他生物標記値 '和（Π)將該生物標記値與 參數的截取値作比較，其中該截取値對應藉由使用ROC曲 線在所欲之敏感度下提供最高特異性的截取値，該曲線係 藉由使用組合的4個標記組計算。 其中其他生物標記爲PSAD，本發明的診斷方法亦包 含（i)測定所硏究的病患體內PSAD値、和（ii)將PSAD値與 參數的截取値作比較，其中該截取値對應藉由使用ROC曲 線在所欲之敏感度下提供最高特異性的截取値，該曲線係 藉由使用組合的4個標記組計算。 其中其他生物標記爲PS A，本發明的診斷方法亦包含 (i)測定所硏究的病患體內PSA値、和（ii)將PSA値與參數的 截取値作比較，其中該截取値對應藉由使用ROC曲線在所 欲之敏感度下提供最高特異性的截取値，該曲線係藉由使 用組合的4個標記組計算。 因此，在優選的實施方案中，本發明的診斷方法亦包 含步驟（i)測定病患體內PSAD、和步驟（ii)將病患體內 PSAD濃度與PSAD的預定截取値作比較，其中該預定截取 値對應與ROC曲線中在所欲之敏感度下的最高特異性相關 之PSAD値，該曲線係依處於罹患PCa風險的病患群體測定 PCA3、PSMA及PSGR基因表現量和PSAD計算，且最後判 定病患是否顯示前列腺癌，其中該樣本中至少1個該基因

S -37- 201217786 的表現量相對該基因的該預定截取値升高，或PS AD値相 對該預定截取値升高，其表示在該所欲之敏感度下該個體 罹患PCa。 如本文所使用者，術語“PSA密度”或PSAD係指源自體 液樣本的PSA値除以前列腺體積所得的PSA値。 例如：PSA密度（PSAD) = PSA値/前列腺體積 可藉由測定樣本（例如血清、血液等，優選者血清）中 PSA濃度和前列腺體積（描述生態學）並根據下式測定PSAD (PSA/前列腺體積）値。 PSA密度=PSA體積/前列腺體積 可藉由任何測定樣本中PS A濃度的方法，其包括上述 本領域之技術人員所習知的常見方法（例如免疫學方法等 等）以測定樣本中PSA濃度。 藉由測定前列腺體積的任何方法，其包括本領域技術 人員所習知的常見方法（包括但不限於使用公式 HxWxLxO.52的所謂TRUS檢査）以測定前列腺體積。典型地 ，根據超音波測量値以測定前列腺體積，其包括但不限於 以最大尺寸進行的經直腸超音波測量値（TRUS)。在另一特 定實施方案中，藉由HxWxLxO.52的橢球體積方法計算 TRUS測量値-可藉由測量整個前列腺腺體以計算體積， 或可替代地’亦可獲得測量過渡區（TZ)/尿道周良性前列腺 腺體葉（腺瘤）的體積且該値可用於測定PS A密度。 “經直腸超音波”或“TRUS”係5至15分鐘門診診病程式 ，其使用音波創建前列腺腺體的視頻圖像。該程式包括將 -38- 201217786 小型潤滑探針置入直腸內，其釋放音波並當該音波進入前 列腺時産生回聲。前列腺腫瘤通常産生與正常前列腺組織 不同的回音。反彈的回音被送至電腦，該電腦將回聲模式 轉換成前列腺圖片。使用TRUS估計該前列腺腺體的重量 ，並幫助醫生對輔助鑑別BPH和PCa的PSA密度有更好的瞭 解。 “用於測定前列腺體積的橢球體積方法”係一種用於評 估前列腺體積的方法且係TRUS程式的重要組成部分。已 使用幾個公式，但最普遍的一個是橢球公式，其需要3個 前列腺尺寸的測量値。藉由在最寬的橫向尺寸的估計點上 測定橫向和前後尺寸以首先在軸平面測定大小。在中線旁 邊的徑向平面上測定縱向尺寸，因爲膀胱頸經常遮住腺體 的向頭側部分。然後應用該橢球體積公式：體積=高度X寬 度X長度χθ.52。 可替代地，可藉由使用PSA、cPSA (PSA至αΐ抗凝乳 蛋白酶）、游離PSA、B-PSA (良性PSA)的組合；PRO-PSA (游離PS Α的前體同種型，其係與前列腺癌相關且係由天然 PSA前體及截短的PSA前體形式組成，[-2]ρΡ8Α和[-4]pPSA)及/或人激肽釋放酶（ΗΚ2)測量値以測定前列腺體 積。 如本文所使用者，術語“PSA”有關33 kDa的胰凝乳蛋 白酶蛋白的血清濃度，該蛋白是人激肽釋放酶基因家族的 一貢且係由前列腺腺體細胞産生。 如本文所使用者，術語“總PSA血清濃度，，關於PSA血 -39- 201217786 清濃度’其係對應“游離PSA，，（未結合或不與其他實體結合 的PSA)和“結合PSA”（與其他實體如α1抗凝乳蛋白酶（ACT) 、αΐ抗胰蛋白酶（AT)、蛋白酶c抑制劑（pci)及α2巨球凝 集素（macroglobupsilonlin)(A2M)結合的 PSA)之和。 如本文所使用者，術語“游離PS A血清濃度”係指未結 合或不與其他實體結合的PSA量。 術語“游離PSA對總血清PSA的比例”係指“游離PSA，，（ 未結合或不與其他實體結合的PSA)與“結合PSA”（與其他實 體如αΐ抗凝乳蛋白酶（ACT)、αΐ抗胰蛋白酶（AT)、蛋白酶C 抑制劑（PC1)及 α2 巨球凝集素（macroglobupsilonlin)(A2M) 結合的PSA)在血清中的濃度比例。 如本文所使用者，術語“PSA前體”係指PSA前體形式 。PS A的全長前體形式包括7個胺基酸的前肽（即前導肽）、 在237個胺基酸的成熟PSA蛋白之前的APLILSR。PSA前體 的全長胺基酸序列爲本領域所習知，且Kumar A. et al. Cancer Res，1 997, 5 7: 3 1 1 1 -3 1 1 4已充分描述。爲達到本發 明的目的，將前肽序列的最後胺基酸“R”算作[-1]胺基酸。 例如，[-7]PSA前體是具有在前肽的-7胺基酸處起始末端的 PSA前體，其含有全長PSA前體。[-5]PSA前體表示該PSA 前體的末端在該前肽的-5胺基酸處起始，且含有該前肽序 列的最後5個胺基酸序列。爲達到本發明的目的，PSA前體 包括末端在前肽的任何胺基酸處起始的全長和截短形式的 PSA前體，即PSA前體可以是[-1]PSA前體、[-2]PSA前體、 [-3]PSA 前體、[_4]PSA 前體 ' [-5]PSA 前體、[-6]PSA 前體 -40- 201217786 、[-7]PSA前體及上述組合。 術語“PS A倍增時間”定義爲治療期間血清PSA的倍增 數。 本發明的方法能鑑別罹患PCa的病患’其中至少一個 上述標記相對於截取値係明顯增加。本領域之技術人員當 能理解，若至少PCA3、至少PSMA或至少PSGR或至少 PSAD/血清PSA的表現量高於截取値濃度，則診斷爲陽性 '。另外，當3個.標記中的2個的表現量局於個別基因的參考 値時，比如當PCA3濃度和PSGR濃度升高、當PCA3濃度和 PSMA濃度升高、當PCA3濃度和PSAD/血清PSA濃度升高、 當PSGR和PSMA濃度升高、當PSGR濃度和PSAD/血清PSA 濃度升高或當PSMA濃度和PSAD/血清PSA濃度升高時，亦 爲陽性診斷。此外，當PC A3、PSMA及PSGR的表現量同時 升高、當PCA3、PSMA及PSAD/PSA血清値的表現量同時升 高、當PCA3和PSGR及PSAD/PSA血清値的表現量同時升高 、當PSGR和PSMA及PSAD/PSA血清的表現量同時升高時 ，得到陽性診斷結果。 用於評估或監測對P C a治療之反應的方法 可將本發明的教示用於監測並確定對患有PCa的個體 施予治療之療效。特別地，本發明基於的事實是可將不同 標記的表現量用於監測PC a是否對給定治療發生反應。然 而，前列腺的手術移除導致不同標記不再表現，因爲負責 産生該等標6己的器吕已經不存在。因此，本發明的方法特 -41 - 201217786 別地用於其中使用不會導致前列腺完全被移除的方法（例 如放射線治療、化學治療等）所治療之病患。 因此，另一方面，本發明關於一種用於評估或監測患 有PCa的個體對治療之反應的方法，其包含 (i)對該個體施予該治療之前，測定自該個體分離的 生物流體樣本中該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量，其 中該生物流體選自尿、前列腺分泌物、精液或前列腺經按 摩後之尿， (Π)對該個體施予該治療之後，測定自該個體分離的 生物流體樣本中該PCA3' PSMA及PSGR基因之表現量，其 中該生物流體選自尿、前列腺.分泌物、精液或前列腺經按 摩後之尿，及 (iii)將對該個體施予該治療之前及之後所獲得的該 PC A3、PSMA及PSGR基因之表現量與每個該基因之預定截 取値作比較，其中每個基因之該預定截取値對應與接受者 操作特徵（ROC)曲線中於該所欲之敏感度下最高特異性相 關的該基因之表現量，該曲線係基於測定處於罹患PCa之 風險的病患群體之PC A3、PSMA及PSGR基因表現量進行計 算， 其中經施予該治療後，該個體樣本中至少一個該基因 之表現量相對於該基因之該預定截取値顯著減少或沒有變 化即表示所施予之治療有效。 可替代地，另一方面’本發明關於一種用於評估或監 測患有PCa的個體對治療之反應的方法，其包含 -42- 201217786 (i) 對該個體施予該治療之前，測定自該個體分離的 生物流體樣本中該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量，其 中該生物流體選自尿、前列腺分泌物、精液或前列腺經按 摩後之尿， (ii) 對該個體施予該治療之後，測定自該個體分離所 獲得的樣本中該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量，其中 該生物流體選自尿、前列腺分泌物、精液或前列腺經按摩 後之尿，及 (iii) 將對該個體施予該治療之前及之後所獲得的該 PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量與每個該基因之預定截 取値作比較，其中每個基因之該預定截取値對應與接受者 操作特徵（ROC)曲線中於該所欲之敏感度下最高特異性相 關的該基因之表現量，該曲線係基於測定處於罹患PCa之 風險的病患群體之PCA3、PSMA及PSGR基因表現量進行計 算， 其中經施予該治療後，該個體樣本中至少一個該基因 之表現量相對於該基因之該預定截取値顯著增加即表示所 施予之治療無效。 如本發明所使用者，表述“評估或監測對治療的反應” 關於測定患有PCa的個體對施予該個體的治療之反應的可 能性。對PCa治療，可採取多種治療以試圖根除或控制癌 症。對PCa治療可包括主動監視、激素治療、包括近距離 放射線治療（前列腺近距離放射線治療）和外粒子束輻射的 放射線治療、高强度聚焦超音波（HIFU)、化學治療或某些 -43- 201217786 組合。哪種選擇最好取决於疾病的階段、Gleason評分及 PS A濃度。其他重要因素爲男性年齡、整體健康狀况、對 潛在治療的感覺和彼等可能產生的副作用。因爲所有治療 可能有明顯的副作用，如勃起功能障礙和尿失禁，治療討 論通常集中在如何平衡治療的目標和生活方式變更的風險 〇 簡言之，根據上述因素（例如個體年齡及大小、位置 及癌症階段），可使用（i)細胞毒性/細胞抑制治療，如化學 治療，其使用抗癌藥品，藉由使藥品經過血管在體內循環 以破壞癌細胞；放射線治療，其使用高能量輻射殺死癌細 胞，及抗癌劑；及/或（ii)免疫治療，其中施予化合物刺激 、提高或增强免疫系統抗癌的天然功能以識別並根除體內 的癌細胞。因此，本發明的方法能測定患有PCa的個體對 任何治療的反應，特別地針對任何細胞毒性及/或細胞抑 制治療，更具體地針對藉由化學治療、放射線治療、抗癌 劑或上述組合方式的治療。 合適的化學治療試劑包括但不限於烷化劑（例如順鉑 、卡鉑、奧沙利鉑、BBR3 464、苯丁酸氮芥、氮芥、環磷 醯胺、Ifosmade、苯丙氨酸氮芥、卡氮芥、福替目丁、洛 莫司汀、鏈脲菌素、白消安、氮烯咪（唑）胺、二氯甲基二 乙胺、甲基苄肼、替莫唑胺、ThioTPA、芥尿嘧啶等）；抗 代謝藥（例如嘌呤（硫唑嘌呤、锍基嘌呤）、嘧啶（卡培他濱 、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、吉西他濱）、葉酸（氨甲喋呤、培 美曲塞、雷替曲塞）等）；長春花生物鹼（例如長春新鹼 '長 -44 - 201217786 春花鹼、長春瑞濱、長春地辛）；紫杉烷（例如紫杉醇、多 西他奇、BMS-247550等）：蒽環類抗生素（柔紅黴素、阿黴 素、表柔比星、伊達比星、米托蒽醌、戊柔比星、博萊黴 素、羥基脲、絲裂黴素等）；拓撲異構酶抑制劑（例如托泊 替康、伊立替康依托泊苷、替尼泊甙等）；單株抗體（例如 阿侖單抗、貝伐單抗、西妥昔單抗、吉姆單抗、帕尼單抗 、利妥昔單抗、曲妥單抗）；光敏劑（例如胺基酮戊酸、甲 基胺基酮戊酸鹽、卟吩姆鈉、維替泊芬等）；酪胺酸激酶 抑制劑（例如Gleevec(TM));表皮生長因子受體抑制劑（例如 Iressa(TM))、埃羅替尼（Tarceva(TM))、吉非替尼等）； FPTase 抑制劑（例如 FTIs (R1 15777、SCH66336、L- 778，123)等）；〖011抑制劑（例如31；6668、？1'1^787等）；蛋白 體抑制劑（例如PS341等）；TS/DNA合成抑制劑（例如 ZD933 1 ' 雷替曲塞（ZD1694、拓優得）、ZD9331、5-FU 等） ;S腺苷亮胺酸脫殘酶抑制劑（例如SAM468A等）；DNA甲 基化劑（例如TMZ等）；DNA結合劑（例如PZA等）；結合並使 Ο -院基鳥嘿哈AGT去活性的試劑（例如BG) ; c-ra/-l反義寡 脫氧核苷酸（例如ISIS-5132(CGP-69846A));腫瘤免疫治療 :甾族及/或非甾族抗發炎藥（例如皮質類固醇、COX-2抑 制劑）；或其他試劑，諸如阿利維A酸、六甲蜜胺、安吖啶 、阿那格雷、三氧化二砷、天門冬醯胺酶、貝沙羅汀、硼 替佐米、塞來考昔、達沙替尼、Denileukin Diftitox、雌 氮芥、羥基脲、伊馬替尼、噴司他丁、馬丙考、米托擔、 天門冬醯胺酶和維甲酸。合適的化學治療試劑在相關文獻

S -45- 201217786 中有更詳細的描述，諸如The Merck Index in CD-ROM， 13th 版。 根據本發明此一方面，將第一時期自患有PCa的個體 身上獲得的樣本（第一個體樣本）中測定基因PC A3、PSM A 及PSGR之表現量與第二時期自患有PCa的個體身上獲得的 樣本（第二個體樣本）中測定基因PCA3、PSMA及PSGR之表 現量作比較，從而能評估或監測該患有PCa的個體對治療 之反應的效力。可在第二時期，亦就是第一時期後的任何 時間，例如第一個體樣本後的1天、1周、1個月、2個月、 3個月、1年、2年或更久的時間，自進行第一次測定的患 有PCa的相同個體身上採集第二個體樣本。在特殊實施方 案中，在個體接受治療（例如化學治療或放射線治療）前採 集第一個體樣本；並在治療後採集第二個體樣本。在另一 特殊實施方案中，在個體已開始/接受治療（例如化學治療 或放射線治療）後採集第一個體樣本，並隨後在治療過程 的不同時期採集第二個體樣本，藉以評估和監測該治療的 功效。此等方法能對之前診斷出PCa的所選個體的特定治 療進行評估。因此，若該治療對該個體的PCa無效，則應 改變該治療方法並應該設計新療法以治療該個體的PCa。 根據此方法可輕易跟進新治療。 如前述之本發明的診斷方法，可藉由本領域中已知的 任何合適方法（例如qPCR)以測定生物標記基因（PCA3、 PSMA及PSGR)的表現量。在大量可重復的條件下獲得該測 量値。 -46- 201217786 一旦測定在不同時期的個體樣本（第一和第二個體樣 本）中生物標記基因的表現量，則有必要鑑別第二個體樣 本中每個該基因的表現量與第一個體樣本中該基因生物標 記的表現量相比是否顯著減少。當第二個體樣本的表現量 相對於第一個體樣本的該表現量降低至少5%、至少1 0%、 至少1 5 %、至少2 0 %、至少2 5 %、至少3 0 %、至少3 5 %、至 少4 0 %、至少4 5 %、至少5 0 %、至少5 5 %、至少6 0 % '至少 65%、至少70%、至少75%、至少80% '至少85%、至少 9 0%、至少95%、至少10 0% (即缺失）時，所硏究的第二個 體樣本中基因表現相對於該第一個體樣本中該生物標記基 因的表現量的減少被認爲是“顯著減少”。 同樣地，當第二個體樣本的表現量相對於第一個體樣 本的該表現量升高至少5%、至少10% '至少1 5%、至少 20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少 45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少 9 5 %、至少1 0 0 %、至少1 1 0 %、至少1 2 0 %、至少1 3 0 %、至 少1 4 0 % '至少1 5 0 %或更多時，所硏究的第二個個體樣本 的基因表現量相對於該第一個體樣本的該生物標記基因的 表現量的升高被認爲是“顯著升高”。 同樣地，當硏究第二個體樣本的表現量時’所硏究的 第二個體樣本的基因表現量相對於該第一個體樣本的該生 物標記基因的表現量沒有變化，表示該表現量在兩個測量 値之間是實質上恒定的。例如，恒定的表現量表示第一測 -47- 201217786 量値不高於1 0 5 %、不高於1 〇 4 %、不高於1 〇 3 %、不高於 1 02 %、不高於1 〇 1 %、不低於9 9 %、不低於9 8 %、不低於 9 7 %、不低於9 7 %、不低於9 6 %或不低於9 5 %。 因此，在第二個體樣本中至少一個該生物標記基因 (PCA3 ' PSMA及PSGR)的表現量相對於在第一個體樣本中 每個該生物標記基因的表現量顯著減少，表示施予患有 PCa的個體的治療是有效的。反之，若第二個體樣本中該 生物標記基因的表現量相對於第一個體樣本中該生物標記 基因的表現量沒有顯著減少（沒有變化或顯著升高），或者 甚至第二個體樣本中至少一個該生物標記基因的表現量相 對於第一個體樣本中至少一個該生物標記基因的表現量顯 著升高，則施予該個體的該治療對治療該個體的PCa是無 效的；因此，應改變該治療並設計新治療以治療該個體的 PCa。根據此方法可輕易的跟進新治療。 此外，可藉由將不同基因的表現量與對PCa的其他生 物標記値結合以進一步改進本發明用於評估或監測對PCa 治療之反應的方法，從而當至少一個上述基因的表現量或 至少其他生物標記値低於截取値時，該治療被認爲是有效 的，或者當至少一個上述基因的表現量或至少其他生物標 記値高於截取値時，該治療被認爲是無效的。如本發明的 診斷方法的上下文所描述者，自PS A密度（P SAD)、游離血 清PSA濃度' 總血清PSA濃度、游離血清PSA濃度對總血清 PSA濃度的比例、PSA前體濃度及PSA倍增時間（PSADT)或 PS A中選出其他生物標記。 -48 - 201217786 因此，在優選的實施方案中，藉由施行上述定義的步 驟（i)和（ϋ)以實施本發明用於監測對治療之反應的方法， 但其中步驟⑴和（ii)亦包含測定自病患體內的PSAD，其中 步驟（iii)亦包含將病患體內的PSAD濃度與對PSAD的預定 截取値作比較，其中該預定截取値對應與ROC(接受者操作 特徵曲線）中在所欲之敏感度下的最高特異性相關的PSAD 値，該曲線係根據處於罹患PCa風險的病患群體中測定 PCA3、PSMA和PSGR基因的表現量和PSAD計算。最後， 該方法能得出該治療是否有效，如下述進行判斷，即若檢 測樣本中至少一個該基因的表現量相對於該基因的該預定 截取値降低，或PSAD値相對於該預定截取値降低，該治 療是有效的，或者若檢測該樣本中至少一個該基因的表現 量相對於該基因的該預定截取値升高或沒有變化，或 PSAD値相對於該預定截取値升高或沒有變化，該治療是 無效的。 因此，在優選的實施方案中，藉由施行上述定義的步 驟（i)和（ii)以實施本發明用於監測對治療之反應的方法， 但其中步驟（i)和（ii)亦包含測定自病患體內的PSA，其中 步驟（iii)亦包含將病患體內的PSA濃度與PSA的預定截取値 作比較，其中該預定截取値對應與ROC (接受者操作特徵曲 線）中在所欲之敏感度下的最高特異性相關的PSA値，該曲 線係根據處於罹患前列腺癌風險的病患群體中測定PC A3 、PSMA及PSGR基因的表現量和PSA計算。最後，該方法 能得出治療是否有效，如下述進行判斷，即若檢測該樣本

S -49- 201217786 中至少一個該基因的表現量相對於該基因的該預定截取値 降低，或PSA値相對於該預定截取値降低，該治療是有效 的，或者若檢測該樣本中至少一個該基因的表現量相對於 該基因的該預定截取値升高或沒有變化，或PS A値相對於 該預定截取値升高或沒有變化，該治療是無效的。 監測個體體內PCa的進展 亦可將本發明的教示用於監測個體體內PCa的進展。 因此，另一方面，本發明關於一種用於監測個體體內PCa 進展的方法，其包含 (i) 測定第一時期自該個體分離所獲得的生物流體樣 本中該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量，其中該生物流 體選自尿、前列腺分泌物、精液或前列腺經按摩後之尿， (ii) 測定第二時期自該相同個體分離所獲得的生物流 體樣本中該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量，其中該生 物流體選自尿、前列腺分泌物、精液或前列腺經按摩後之 尿，且其中該第二時期係晚於該第一時期，及 (iii) 將該第一時期和該第二時期所獲得的該PCA3、 PSMA及PSGR基因之表現量與每個該基因之預定截取値作 比較，其中每個基因之該預定截取値對應與接受者操作特 徵（ROC)曲線中於該所欲之敏感度下最高特異性相關的該 基因之表現量，該曲線係基於測定處於罹患PCa之風險的 病患群體之該PCA3、PSMA及PSGR基因表現量進行計算， 其中該第二時期之個體樣本中至少一個該基因之表現 -50- +Ί 201217786 量相對於該第一時期之表現量顯著減少或沒有變化即表示 前列腺癌未於該個體體內進展。 可替代地，用於監測個體體內pCa進展的方法包含 (i) 測定第一時期自該個體分離所獲得的生物流體樣 本中該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量，其中該生物流 體選自尿、前列腺分泌物、精液或前列腺經按摩後之尿， (ii) 測定第二時期自該相同個體分離所獲得的生物流 體樣本中該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量，其中該生 物流體選自尿、前列腺分泌物、精液或前列腺經按摩後之 尿，且其中該第二時期係晚於該第一時期，及 (iii) 將該第一時期和該第二時期所獲得的該PCA3、 PSMA及PSGR基因之表現量與每個該基因之預定截取値作 比較，其中每個基因之該預定截取値對應與接受者操作特 徵（ROC)曲線中於該所欲之敏感度下最高特異性相關的該 基因之表現量，該曲線係基於測定處於罹患P C a之風險的 病患群體之該PC A3、PSMA及PSGR基因表現量進行計算， 其中該第二時期之個體樣本中至少一個該基因之表現 量相對於該第一時期之表現量顯著增加即表示前列腺癌進 展。 如本發明所使用者，表述“監測p C a的進展，，相當於“測 定預後”，其關於測定一或數個表示診斷患有p C a的病患體 內疾病進展的參數。適用於測定診斷患有pCa的個體進展 的參數選自腫瘤反應、復發風險、無病生存及/或該個體 的總生存率。如本文所使用者，表述“復發風險，’應理解爲 -51 - 201217786 個體在無病階段後再次發生PCa及/或二次轉移的槪率；“ 無病生存”應理解爲在治療後沒有發現癌症的時段；而“個 體總生存率”應理解爲自診斷或治療的時間起，在測定時 段後個體存活的百分比。如本文所使用者，疾病惡化是指 徵狀更爲嚴重。 優選的實施方案中，可將用於監測PCa進展的方法用 於檢測器官局限性疾病（OCD)與非器官局限性疾病（N0CD) 之間的差異。另一優選實施方案中，可將用於監測PCa進 展的方法用於預測侵略性前列腺癌或臨床顯著/慢性PCa。 根據本發明此一方面，將第一時期自患有PCa的個體 身上獲得的樣本（第一個體樣本）測定PCA3、PSMA及PSGR 基因的表現量和第二時期自患有PCa的個體身上獲得的樣 本（第二個體樣本）測定PCA3、PSMA及PSGR基因的表現量 分別與每個基因的截取値作比較，其中對該截取値如上述 地進行測定。可在第二時期，即第一時期後的任何時間， 例如第一個體樣本後1天、1周、1個月、2個月、3個月、1 年、2年或更久的時間，自進行第一次測量的患有PCa的相 同個體身上採集第二個體樣本。特定實施方案中，在個體 接受治療（例如化學治療或放射線治療）前採集第一個體樣 本；並在治療後採集第二個體樣本。另一特定實施方案中 ，在個體已開始/接受治療（例如化學治療或放射線治療）後 採集第一個體樣本，並隨後在治療過程的不同時期採集第 二個體樣本。該等方法能對之前診斷罹患PCa的所選個體 的PCa進展進行評估。因此，若該PCa預後不良，則應設計

-52- 201217786 其他治療法以治療該個體的PCa。根據本發明提供的教示 ，可輕易跟進施予該新治療後PCa的進展。 如前述本發明的診斷方法，可藉由本領域已知的任何 合適方法（例如qPCR)以測定生物標記基因（PCA3、PSMA及 PSGR)的表現量。在大量可重復的條件下獲得該測量値。 一旦測定不同時期的個體樣本（第一和第二個體樣本） 中生物標記基因的表現量，則有必要鑑別第二個體樣本中 至少一個該基因的表現量與第一個體樣本中該基因生物標 記的表現量相比是否顯著升高。可替代地，如果需要，可 分析第二個體樣本中至少一個該基因的表現量與第一個體 樣本中該基因生物標記的表現量相比是否顯著減少或沒有 變化。應用於生物標記基因表現量的術語“顯著增加”、“ 顯著減少”及“沒有變化”在之前已經定義。 因此，第二個體樣本中至少一個該生物標記基因 (PC A3、PS Μ A及PSGR)的表現量相對於第一個體樣本中每 個該生物標記基因的表現量顯著升高，表示所硏究的個體 PCa進展（即具有不良的預後）；因此，應改變施予所硏究 的個體的治療並應設計新治療以治療該個體的PCa。根據 此方法可輕易跟進個體PCa的進展。 反之，若第二個體樣本中至少一個該生物標記基因的 表現量相對於第一個體樣本中每個該生物標記基因的表現 量沒有顯著升高，或者甚至若第二個體樣本中至少一個該 生物標記基因的表現量相對於第一個體樣本中每個該生物 標記基因的表現量顯著減少，則所硏究的該個體的PCa沒 -53- 201217786 有進展（即不具有不良預後）^ 此外，可藉由不同基因表現量與PCa的其他生物標記 値的結合以進一步改善本發明用於監測PCa進展的方法， 從而當至少一個上述基因的表現量或至少該其他生物標記 値低於截取値時，可認爲疾病沒有進展。如上述，自 PSAD和PSA中選擇其他生物標記。 因此，另一方面，藉由施行上述定義的步驟（i)和（ii) 以實施本發明用於監測對治療之反應的方法，但是其中步 驟（i)和（ii)亦包含測定病患體內的PSAD，其中步驟（iii)亦 包含將病患體內的PSAD濃度與PSAD的預定截取値作比較 ，其中該預定截取値對應與ROC(接受者操作特徵曲線）中 在所欲之敏感度下最高特異性相關的PSAD値，該曲線係 處於罹患前列腺癌風險的病患群體中測定PC A3、PSM A及 PSGR基因的表現量和PSAD計算。最後，該方.法會g推斷 PCa是否進展，即若該樣本中至少一個該基因的表現量相 對於該基因的該預定截取値升高或沒有變化，或PSAD値 相對於該預定截取値升高或沒有變化，則PCa在進展中。 另一方面，藉由施行上述定義的步驟（i)和（Π)以實施 本發明用於監測對治療之反應的方法，但是其中步驟（i)和 (Π)亦包含測定病患體內PSA，其中步驟（iii)亦包含將病患 體內PS A濃度與PS A的預定截取値作比較，其中該預定截 取値對應與ROC(接受者操作特徵曲線）中在所欲之敏感度 下最高特異性相關的PS A値，該曲線係處於罹患前列腺癌 風險的病患群體測定PCA3、PSMA及PSGR基因和PSA的表 8 -54- 201217786 現量計算。該方法能推斷PCa是否進展，若檢測該樣本中 至少一個該基因的表現量相對於該基因的該預定截取値升 高或沒有變化’或PS A値相對於該預定截取値升高或沒有 變化，則PCa在進展中。 選擇生檢病患 如上述，可將本發明的教示用於選擇生檢病患。事實 上，由於PSA檢驗的低特異性，進行許多不必要的生檢。 特別是顯現在被稱爲“灰色區域”的4.0至10.0 ng/ml區域的 血清PSA濃度之病患，PSAD遠比總PSA更精確（Ohori M，et al. Urology 46: 666-7 1 (1995)) ° 如本發明的作者所示，本發明的標記組的應用能判定 顯現升高的敏感度和特異性的病患是否罹患PCa，從而能 大幅减少不必要生檢的數量。如本發明的實施例所示，藉 由對特殊臨床目的組（血清PSA介於4至10 ng/ml且先前未 接受生檢）使用本發明提供的3分量生物標記結合PSAD所節 省的生檢數計算爲“節省的生檢=真陰性+僞陰性”，其係： -敏感度爲100%時，可節省32.5%生檢， -敏感度爲96%時，可節省41.6%生檢， 此對應歐洲地區每年節省約1 26,750至 1 62,240的生 檢。 因此，另一方面，本發明關於一種用於評估個體是否 必須接受前列腺生檢的方法，其包含 (i)測定自該個體分離所獲得的生物流體樣本中PCA3

S -55- 201217786 、PSMA及PSGR基因之表現量，其中該生物流體選自尿、 前列腺分泌物、精液或前列腺經按摩後之尿，及 (ii)將該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量與每個該 基因之預定截取値作比較，其中每個基因之該預定截取値 對應與接受者操作特徵（ROC)曲線中於該所欲之敏感度下 最高特異性相關的該基因之表現量，該曲線係基於測定處 於罹患PCa之風險的病患群體體內該PCA3、PSMA及PSGR 基因之表現量進行計算， 其中該樣本中至少一個該基因之表現量相對於該基因 之該預定截取値顯著增加即表示該個體係前列腺生檢之候 選者。 可藉由測定其他前列腺生物標記以改進用於評估個體 是否必須接受前列腺生檢的方法。特別地，該其他標記可 爲PSA密度（PSAD)、游離血清PSA濃度、總血清PSA濃度 、游離血清PS A濃度對總血清PS A濃度的比例、PS A前體濃 度及PSA倍增時間（PSADT)(如上述在本發明的診斷方法的 內容所解釋的定義和計算）。 本發明的方法所進行分析的病患優選地係先前未接受 前列腺生檢的病患。另一優選實施方案中，本發明進行分 析的病患是先前至少接受過一次生檢、先前至少接受過兩 次生檢、先前至少接受過三次或更多次生檢的病患。 因此’在優選方面，本發明關於根據本發明選擇生檢 的病患之方法， 其中步驟⑴亦包含測定病患體內PSAD， -56- 201217786 其中步驟（Π)亦包含將病患體內PSAD濃度與PS AD的預 定截取値作比較，其中該預定截取値對應與ROC(接受者操 作特徵曲線）中在所欲之敏感度下最高特異性相關的P SAD 値，該曲線係對處於罹患前列腺癌風險的病患群體測定 PCA3、PSMA及PSGR基因的表現量和PSAD計算，且 其中，該樣本中至少一個該基因的表現量相對於該基 因的該預定截取値升高，或PSAD値相對於該預定截取値 升高，表示該個體爲前列腺生檢的候選者。 另一優選方面，本發明關於根據本發明選擇生檢的病 患之方法， 其中步驟⑴亦包含測定病患體內PS A， 其中步驟（ii)亦包含將病患體內PSA濃度與PSA的預定 截取値作比較，其中該預定截取値對應與ROC(接受者操作 特徵曲線）中在所欲之敏感度下最高特異性相關的PS A値， 該曲線係對處於罹患前列腺癌風險的病患群體測定PC A 3 、PSMA及PSGR基因的表現量和PSA計算，且 其中，該樣本中至少一個該基因的表現量相對於該基 因的該預定截取値升高，或PSA値相對於該預定截取値升 高，表示該個體爲前列腺生檢的候選者。 優選的實施方案中，用於評估個體是否必須接受前列 腺生檢的病患係由PSA濃度高於4 ng/rnl的病患、具有陽性 DRE的病患或50歲以上的病患所組成。更優選的實施方案 中，處於罹患PCa風險的病患群體係由PSA濃度低於10 ng/ml的病患所組成。 -57- 201217786 本發明的套組 另一方面，本發明關於一種套組，其包含第一組分和 可選擇地第二組分，其中該第一組分係一組由下述所組成 之試劑： (i) 能測定基因PCA3表現量之試劑； (ii) 能測定基因PSMA表現量之試劑；及 (iii) 能測定基因PSGR表現量之試劑；且 其中該第二組分包含能測定一或多種前列腺家務基因 表現量之一或多種試劑。 可將本發明的套組用於診斷PCa，即用於評估病患是 否罹患PCa，或用於評估或監測PCa病患對治療的反應，即 用於評估治療對診斷出PCa的個體的療效，或用於監測個 體PCa的進展或分化，即用於確定診斷出PC a的個體的預後 〇 在本發明的上下文中，“套組”應理解爲含有實施本發 明的方法所必須的不同試劑的産品，將其包裝以便運輸和 儲存。適於包裝套組成分的材料包括水晶、塑膠（聚乙烯 、聚丙烯、聚碳酸酯等）、瓶、管瓶、紙、信封等。此外 ，本發明的套組可包含套組內不同成分的同時、連續或獨 立使用的說明書。該說明書可以是列印材料的形式，或能 夠被個體讀取的可儲存說明書的電子支援的形式，如電子 存儲媒質（磁片、磁帶等）、光學介質（CD-ROM、DVD)等。 此外，或者可替代地，該媒質可含有提供該說明書的網路 -58- 二 201217786 adDRMsses 〇 “能確定基因表現量的試劑”係指能確定基因表現量， 例如RNA材料的抽取等’例如測定對應mRNA濃度等的化 合物或一組化合物’例如藉由RT的方式使用對應cDNa合 成引子’用於DNA擴增的引子，能與該基因編碼的A( 或相應的cDNA)特異性雜交的探針，

Taqman探針等。 特定實施方案中’設計本發明的套組以用於qPCR試驗 。此外，優選的實施方案中，本發明的套組的第一組分係 由PCA3、PSMA及PSGR每個基因的特異性Taqman探針組 成。用於qPCR分析的基因表現試劑可由本領域技術人員設 計或購自例如 Applied Biosystems，料號 Hs01371938-ml (PCA3) 、 Hs003795 1 5-ml (PSMA)及 Hs0095 1 952-m 1 (PSGR)(實施例 1)。 另一方面’本發明關於本發明的套組之用途，其係用 於PCa診斷、評估或監測患有PCa的個體對治療的反應、監 測個體PCa的進展或判定病患是否必須接受前列腺生檢。 優選的實施方案中，對顯現4至10 ng/ml血清PSA濃度 的個體實施本發明的套組。 藉由下述實施例對本發明進行詳述，但其僅爲說明且 絕非限制本發明的範圍。 【實施方式】 實施例1 尿中PCa早期檢測的3基因組的鑑別 £ -59- 201217786 1 ·材料和方法 1 · 1病患和尿收集 本硏究獲Vail d’Hebron醫院的機構審議委員會批准。 自Vail d’Hebron醫院（巴賽隆納，西班牙）的泌尿部門，對 接受前列腺生檢的1 9 8個男性經前列腺按摩（p Μ)後立即採 集所有尿液樣本。生檢顯示呈異常直腸指檢（DRE)及/或高 於4.0 ng/ml血清PSA。取得所有病患的書面同意書。此硏 究排除顯現其他已知腫瘤及/或先前接受過PCa治療的病患 «表1顯示其中154個病患的臨床和病理學資料。 PM操作方法：藉由對前列腺自底至頂，對每個葉自 側邊至中線系統地施予數位重壓。 生檢操作方法和PCa檢出率：使用端射式.超音波能量 轉換器（Falcon 2101，B-K Medical Inc)和自動 18號針規 (Bard, Inc.)進行生檢。根據維也納（Vienna)列線圖，每個 過程中除去之最低核心數量爲10，且將1至8個的多餘核心 除去（Remzi 等，J. Urol. 2005, 1 74: 1 256-60;討論 1260-1;作者回覆1261)。 所硏究的總個體組中，198個樣本中有154個獲得足夠 用於分析的RNA，其對應78%資料樣本率（91%PCa病患和 28%良性病患）。藉由前列腺生檢的PCa檢出率爲 3 7% (5 7/ 1 54)。在77個特殊臨床目的病患的子群中，爲判 定是否應施行生檢’顯現4至10 ng/ml PSA且先前未接受生 檢，PCa檢出率爲36%(28/77)(表1)。 -60- 201217786 表1 :資訊病患的臨床和病理學資料 所有病患 病患 PSA4至 10ng/ml 且先前未接受生檢 病患數 154 82 年齡(歲） 65.5 (44 - 85) 64.8 (44-85) PSA濃度(範圍） 10.9 (2.5-189) 6.6 (4.0-10) 前列腺體積㈣ 51.1 (162.0-10.0) 46.2 (16.0-120.0) PSA 密度(PSAD) 1.61 (0.29-43.7) 0.167 (0.06-0.34) 游離PSA/總PSA的比例 0.17(0.00-0.80) 0.18(0.01-0.80) 前列腺癌 57 (37%) 28 (34.1%) GLEASON < 7 7 (12.3%) 4(14.3%) GLEASON=7 41 (71.9%) 20 (71.4%) GLEASON > 7 9(15.8%) 4 (14.3%) 良性 97 (63%) 54 (65.9%) 1.2樣本製備 在尿液收集杯中收集尿液樣本（第一次收集約50 ml)， 置於冰上保存，運送到實驗室並在3 0分鐘內處理。將該尿 液樣本在4°C下經2500 g離心10分鐘，然後經冷PBS IX清 洗沉降物2次。最後，將該沉降物於-80°C下經1 :5 RNA Later (Ambion)保存直至RNA提取。 1.2.1 RNA分離和預擴增 使用QIAamp®病毒RNA迷你套組（Qiagen)抽取尿液 RNA。使用Superscript III逆轉錄酶（Invitrogen)合成單鏈 201217786 cDNA，將該cDNA置於-20°C下保存直至使用TaqMan Preamp Master混合套組（Applied Biosystems)進行預擴增 1.2.2定量PCR分析 發明人選擇3個假定的PCa尿生物標記（PCA3、PSMA 及PSGR)。藉由使用TaqMan®基因表現檢測（Applied Biosystems)將定量PCR(qPCR)用於分析該3個假定的PCa尿 生物標記和對照組轉錄物PSA。使用ABI-棱鏡-7900 qPCR 裝置實施3次反應，只接受標準誤差（STDEV)小於（<)0.38 的結果。將閥値濃度設置至qPCR的指數期。使用ABI-棱 鏡- 7900SDS 軟體 V2.3(Applied Biosystems)進行資料分析， 並對每個平板設置相同的基線和閥値，以對每個樣本的所 有基因産生閥循環（Ct)値。爲排除一種可能性，即該標記 亦可能於能在尿沈澱物中正常發現的非癌症細胞（如尿道 上皮、腎臟、膀胱及血液的細胞）中表現，將臨床樣本量 經標準化成前列腺源RNA量。因爲在尿液中只發現相對少 量的前列腺細胞，在qPCR前施行cDNA預擴增步驟。然後 發明人建立預擴增前的ct(PSA)小於（< )3 5的qPCR截取値， 以確定樣本是否提供訊息，即存在的RNA量係足以產生精 確結果。對每個標記以log ((ct(標記）/ct(PSA)xl 000)計算 分數。測定每個標記的截取値，且當該標記超過該截取値 時，認爲該樣本呈陽性。 -62- 201217786 1 .3統計分析 藉由比較PCa和陰性生檢個體之間的候選生物標記平 均値以完成該候選生物標記的特徵界定。當數據分布正常 時使用T檢驗及Welch校正，並在其他情况下使用Mann-Whitney檢驗》使用Shapiro-Wilk正常性檢驗證明正常性。 根據用於穩定變異的經對數轉化之資料進行所有檢驗。使 用多變數分析以硏究候選標記和疾病狀况之間的關聯性。 使用接受者操作特徵（ROC)曲線和曲線下面積（AUC) 評估每個標記分數的性能以作爲區別PC a組病患和其他組 病患的措施。對每個標記單獨計算ROC曲線，並對標記組 合和PSA計算多變數ROC(多ROC)。 簡言之，對每個生物標記使用檢測閥値；然後，如果 至少一個分數高於該檢測閥値，將新標記表示呈陽性。在 閥値的範圍內計算敏感度和特異性値。按下列方法獲得新 標記的多ROC曲線點：對固定的敏感度値，自與敏感度値 匹配的點雲的特異性範圍中選擇特異性最大値。 爲組合一個以上標記（k)，後續過程如下：首先，對每 個生物標記使用k -分量檢測閥値；然後，若至少一個分數 高於該檢測閥値，將新標記表示呈陽性。在k-分量閥値的 範圍內計算敏感度和特異性値。此產生點雲。按下列方法 獲得新標記的最佳R0C曲線點：對固定的敏感度値，自與 敏感度値匹配的點雲的特異性範圍中選擇特異性最大値 (Baker, S. G·，J Natl C anc er I n s t 2 0 0 3，9 5，5 1 1 - 5 1 5 )。因 爲當k增長時，計算的複雜性指數增長，只有3個標記同時

S -63- 201217786 加入。使用指向最佳ROC曲線點的k-分量截取値，將新變 數加入至k-多樣標記。將此等k-分量閥値與該新變數値結 合，進而産生用於獲得新的最佳ROC曲線的（k+Ι)分量檢測 閥値。使用PASW V17.0和自由統計語言R以及 Bioconductor 專案（http://www.bioconductor.org)的 ROC 方 案進行統計分析》 測量多R0C曲線下面積（AUCm)以比較組合標記和單一 標記之間的結果預測性能。爲測定於固定敏感度下，該組 合模型的預測效果是否明顯比單一生物標記預測效果更好 ，使用比例的z檢驗以比較對應的僞陽性率。如 Krzanowski et a 1. J . Biopharm. S t at. 2 0 0 9, 20: 485-487 戶斤 述，單獨對PSMA、PSGR及PCA3計算z檢驗的僞陽性率的 誤差。在PSMA 、 PSGR及PCA3的組合和PSA ((PSMA_PSGR_PCA3)_PSA)的實例中，使用重採樣方法。 對多個檢驗問題修正該等比較的P値，然後進行僞發現率 過程（J. R, Stat. Soc. Ser. B (Methodol) 1995; 57: 289-300) 〇 製作ROC曲線以表示生物標記組合性能的主要問題是 擬合。爲控制此偏差，使用分半（5 0%)方法的方式以驗證 結果（J. Clin. Epidemiol. 2001; 54: 774-78 1 )。簡言之，使 用5 0%的該樣本作爲訓練集以計算R0C曲線。使用該ROC 曲線以測定獲得限定組的敏感度（90至100%)需要的截取値 。因此，藉由測定的截取値，使用檢驗樣本以評估對應每 個敏感度的特異性。重復該方式5 00次，並藉由計算所有 -64- 201217786 重復所産生的平均値以獲得最後的評估。藉由使用PAS W V17.0和自由統g十語言R及Bioconductor專案 (http://www_bioconductor.org)的 ROC 方案以進行統計分析 2.結果 藉由前列腺生檢的PCa檢出率爲37 % (57/154)。對所硏 究的總個體組，198個樣本中有154個産生足夠用於分析的 RNA，其對應78.8%的資料樣本率（PCa病患爲95.0%，良性 病患爲70.3%)。 對1 5 4個病患經前列腺按摩後取得尿沉降物，檢驗 PCA3、PSGR、PSMA及其他臨床參數，以測定彼等是否能 區別患有PCa的病患與顯現陰性穿刺生檢的病患。 PCA3(p = 0.0 1 8) 、 PSGR(p<0.00 1) 、 P S M A (p = 0.0 1 6)及 ?8八0(? = 0_027)具統計上顯著水準（圖1(八至0)框鬚圖），且 PSA(p = 0.55)、游離 PSA(fPSA)(p = 0.60)及前列腺體積（PST VOL)(p = 0.05 3 )未顯示統計上顯著水準。 經多變數分析後，發明人選擇PCA3、PSGR、PSMA及 P SAD於R0C曲線分析以使診斷效力直觀化，並總結該尿液 樣本的基於基因的qPCR試驗的資料。獲得下述AUC値： PCA3(0.60)、PSGR(0.64)、P S M A (0 · 6 2)及 P S A D (0.6 1)(圖 2 ) 。顯著水準p(面積=0.5)分別爲ρ = 〇·〇43、0.002、0.012及 0.051 ° 爲確定多種生物標記的組合是否能改善單一生物標記 -65- 201217786 之性能，使用多ROC方法（PSMA_PSGR_PCA3)並使用傳統 二元邏輯回歸分析以組合PSMA、PSGR及PCA3(3M)。 由於癌症的多因數性質，標記A在一個病患體內可能 呈陽性，而標記B在另一個病患體內呈陽性。邏輯模型滿 足邏輯曲線以適於病患的疾病槪率。使用此技術，兩個標 記的組合本質上呈線性，將單獨的權重分配給每個標記。 此在兩個標記的表現比每個標記的單獨表現更爲顯著的假 設條件下是有效的。然而，當A或B自身的表現足以將病患 分類時，出現資訊缺失。因此，本發明所硏究的模型中， 若至少一個分數高於其檢測閥値，則將該組合標記表示呈 陽性。該多ROC模型的性能高於該邏輯回歸分析（圖3) ^ 3M(PSMA_PSGR_PCA3)^ #ROCT®^S〇-74 (0.68-0.80)(圖2)。彼等間進行比較以得到下述結果：3M對PCA3 P = 0.0071 * 3M 對 PSGR P = 0.0493，3M 對 PSMA P = 0.0253， PSMA 對 PSGR P = 0.75，PSMA 對 PCA3 P = 0.69，及 PSGR 對 PCA3 P = 0.46 (表 2)。 表2.比例艰驗對PSMA、PSGR、PCA3及3M(PSMA_PSGR_PCA3)的比較 全組 臨床目的組 (PSA4至10ng/ml,第一次生檢） PSGR對 PCA3 0.4623 0.5407 PSGR 對 PSMA 0.7500 0.3601 PSMA 對 PCA3 0.6885 0.1214 PCA3 對 3M 0.0071 0.0024 PSGR對 3M 0.0493 0.0199 PSMA 對 3M 0.0253 0.1542 藉由使PSMA的敏感度和特異性之和最大化，該試驗 敏感度爲81% (68至90)，該特異性爲41% (31至52)。如所 -66- 201217786 示者，對PSGR，該試驗敏感度爲63% (49至77)，該特異性 爲64% (5 4至73)，且對PC A3，該敏感度爲86% (74至94)， 該特異性爲35% (27至45)。對3M，敏感度爲89% (79至95) ，特異性爲45% (35至57)。表2顯示ROC曲線的統計比較。 當藉由將敏感度固定在90至100%臨床目的値範圍以比較 ?3厘八、卩3 011、？0八3及31^且當單一標記的特異性自100% 敏感度減少至〇%時，該組合模型維持29% (21至39)的特異 性（圖2)。實施標準Ζ檢驗以測定此等差異是否顯著。例如 ，對96%敏感度，獲得下述P値：3M比PSMA;P¼ 0.0001 ，3Μ 比 PSGR; Ρ '/4 0.0002，3Μ 比 PCA3; Ρ % 0.0006。爲 驗證此等資料，藉由500次重復的分半方法進行驗證。建 立敏感度範圍介於90%至100%的驗證ROC曲線（表3) ^ 表3.藉由500次重復的分半方法驗證 3Μ(全組) 敏感度(％) 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 特異性(％) 38 38 38 38 34 34 34 29 29 29 29 3m (臨床目的組， ?8八4至10明/1111， 第一次生檢) 敏感度(％) 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 特異性(％) 49 49 49 45 45 45 45 45 45 45 45 然後將此3個標記模型（3Μ)與PSAD(PSA/PST VOL)組 合成新標記。爲此，發明人對每個標記使用4-分量標記檢 測閥値。若至少一個標記高於其檢測閥値，則該組合標記 表示呈陽性。爲繪製R〇C曲線，發明人計算4-分量閥値範 圍內的敏感度和特異性。因此，發明人能確定敏感度値。 自發明人已獲得的與敏感度相匹配的特異性範圍中選擇特 異性最大値者。組合的標記模型的AUC爲0.80 (0.71至

-S -67- 201217786 0.83)。敏感度爲96%時，特異性爲40%。陽性和陰性預測 値分別爲48%和95 %(圖2)。表4顯示含有該組合（（PC A3、 PSRG和PSMA)和PSAD)的數値。 表4· (PCA、PSRG和PSMA)和PSAD組合的最佳截取値 _ PCA3 PSGR PSMA PSA密度 敏感度 特異性 1.5 26.9 141.3 0.19 1.00 0.28 7.2 26.9 46.8 0.21 0.98 0.34 7.2 66.1 46.8 0.21 0.96 0.40 7.2 66.1 141.3 0.21 0.94 0.44 9772.4 33.9 44.7 0.21 0.91 0.49 9772.4 24.5 46.8 0.27 0.89 0.50 9772.4 38.0 128.8 0.21 0.87 0.54 9772.4 38.0 128.8 0.21 0.85 0.57 398.1 51.3 128.8 0.21 0.83 0.58 9772.4 33.9 141.3 0.27 0.81 0.62 9772.4 33.9 182.0 0.27 0.80 0.63 9772.4 38.0 128.8 0.27 0.78 0.64 398.1 177.8 128.8 0.21 0.76 0.66 398.1 51.3 128.8 0.27 0.74 0.69 3715.4 147.9 182.0 0.21 0.72 0.70 3715.4 147.9 182.0 0.21 0.70 0.72 3715.4 79.4 141.3 0.27 0.69 0.73 9772.4 51.3 141.3 0.41 0.65 0.76 398.1 177.8 128.8 0.27 0.63 0.77 398.1 147.9 182.0 0.27 0.61 0.79 3715.4 147.9 182.0 0.27 0.59 0.81 398.1 147.9 182.0 0.30 0.56 0.83 3715.4 147.9 182.0 0.30 0.54 0.86 截取値 顯現4至10 ng/ml PSA的病患體內的3標記模型 爲判定是否應施行生檢’檢驗特殊臨床目的組的子群 -68- 201217786 。該群係由先前未接受PB的82個病患所組成，其結果在4 至10 ng/ml PSA診斷的“灰色區域”內。藉由PB的PCa檢出 率爲34% (28/82)(表1)。所硏究的總個體組中，93個樣本 中有82個産生足够用於分析的RNA，其對應資料的樣本率 爲 8 8.2 %。 藉由單變數分析檢驗所有標記，觀察彼等是否能區分 PCa病患與顯現陰性PB的病患。得到下述結果： PSMA(p = 0.003) 、 PSGR(p = 0.009) 、 P C A 3 (p = 〇 . 〇 2 5 )、 PSAD(p = 0.03 6)(圖1)及前列腺體積（p = 〇.〇2)具有統計上顯 著水準，而PSA(p = 0.26)和fPSA(p = 0.67)未顯示任何統計上 顯著水準。獲得下述AUC (95%CI)値：PSMA 0.74 (0.63-0.86)、PSGR 0.66 (0.54-0.79)及 PCA3 0.6 1 (0.48-0.74)。 3M 的 AUC 爲 0.82 (0.77-0.86)，3M 與 PSAD 組合的 AUC 爲 0.80(圖4)。表2顯示ROC曲線的統計比較。 藉由使PSMA的敏感度和特異性之和最大化，敏感度 爲64%(44至81)，特異性爲70%(56至82)。對PSGR，敏感 度爲61 % (41至79)，特異性爲70 % (56至82)，對PCA3，試 驗敏感度爲71 % (51至87)，特異性爲54 % (40至67)。對3M， 敏感度爲89 % (72至96)，特異性爲57 % (4 4至70)。然後，藉 由將敏感度固定在90至100%的臨床目的値範圍內，比較 PSMA、PSGR、PCA3及3M ’且當單一標記的特異性在 1 0 0 %敏感度減少至〇 %時，該組合模型維持4 6 % (3 7至6 3 )的 特異性。獲得PSMA的特異性爲4 % (1至13)，PSGR的特異 性爲12%(6至24)及PCA3的特異性爲〇%(〇至7)(圖3)。對兩 -69- 201217786 部分在敏感度範圍（90%至100%)內實施標準檢驗以測定此 等差異是否顯著。表5顯示在敏感度90%至10 0%的區域內 驗證ROC曲線。例如，對96%的敏感度，獲得下述P値： 3M 比 PSMA ， ρ = 0·0005 ； 3Μ 比 PSGR， p<0.0001 ； 3Mt匕 PCA3 ； ρ = 0·000 1。 表5 :在特異性臨床恤清PSA 4至10 ng/ml且先前未接受生檢)病患的子群中(PCA、 PSRG及PSMA)與PSAD組合的最佳截取値_ 截取値 PCA3 PSGR PSMA PSA密度 rng/ml/ml] 敏感度 特異性 13.5 162.2 39.8 0.27 1.00 0.50 3715.4 30.2 44.7 0.27 0.96 0.62 3715.4 26.9 128.8 0.27 0.89 0.68 3715.4 30.2 128.8 0.27 0.85 0.72 3715.4 162.2 128.8 0.21 0.81 0.78 3715.4 239.9 128.8 0.21 0.78 0.82 3715.4 239.9 128.8 0.21 0.74 0.84 3715.4 239.9 128.8 0.23 0.70 0.86 3715.4 162.2 128.8 0.27 0.67 0.90 3715.4 239.9 128.8 0.27 0.63 0.94 3715.4 239.9 128.8 0.30 0.52 0.96 3715.4 239.9 128.8 0.31 0.48 0.98 3715.4 1122.0 295.1 0.30 0.15 1.00 測定可避免的生檢數 最後，藉由對全組和PSA爲4至10 ng/ml的組使用組合 的標記模型（3 M)以計算可避免的生檢數，其公式爲節省的 生檢％=真陰性+僞陰性。敏感度爲96%時，全組可避免 23%(具有3MvPSA 23%)的生檢，其包括PSA的全部範圍和 重復生檢。在此實例中，陽性（PPV)預測値和陰性（NPV)預 201217786 測値分別爲46%和94%。在先前未接受生檢的特殊目的臨 床風險組的分析與PSA “灰色區域”介於4至10 ng/ml之間的 結果中，敏感度爲96%時，可避免34 %的生檢。PPV和NPV 分別爲51%和 96%(圖5)。 3個標記組合（PCA3、PSMA及PSGR)提供比PCA3、PSMA及 AMACR組合更高的敏感度 如前述，測定該分數。 對每個生物標記使用檢測閥値（截取値）；然後，若至 少一個分數高於其檢測閥値，該病患表示呈陽性。在閥値 (截取値）範圍內計算敏感度和特異性値。對固定的敏感度 値，自與該敏感度値相匹配的點雲中的特異性範圍中選擇 特異性最大値。 上述實施例中，自25個病患的同期群組（48%罹患PCa) 中測定PC A3、PSMA、PSGR及PSMA的相對表現。自PC A3 、PSMA及PSGR的截取組合（分別爲10.3、16.57及1.43)得 到92%敏感度和67%特異性。當具有相同的PCA3和PSMA截 取値並具有AMACR的102截取値的PCA3、PSMA及AMACR 組合得到77%敏感度和64%特異性時，兩者皆低（且敏感度 差異極大）。 然後，計算敏感度和特異性之和（分別爲1.6和1.4)。 PCA3、PSMA及 PSGR組合得到比 PCA3、PSMA及 A M A C R組 合更局的値。 使用AMACR的較低截取値增加敏感度但却降低特異 -71 - 201217786 性，因此非爲可行的選擇。例如，96截取値給出84.62%敏 感度和54.5 5%特異性，而敏感度和特異性之和維持在1.4 ，此表不不是一個較好的總結果。 此實施例顯示若至少一個分數高於其檢測閥値，則該 病患表示呈PCa陽性的方法提高敏感度且未降低特異性。 此部分係令人驚奇的，因爲改變用於單一標記的截取値總 是會同時改變敏感度和特異性》通常，使用較低的截取値 以提高敏感度會導致較低的特異性値。令人驚奇的是，藉 由使用PCA3、PSMA及PSGR的組合能使用較高的且更特異 性的截取値以達到與單獨使用每個標記時相同的敏感度値 〇 實施例顯示若3個標記（PCA3、PSMA及PSGR)中任何 一者的至少一個分數高於其檢測閥値，則該病患表示呈陽 性的方法可在與每個單獨標記一起使用的相同敏感度値下 鑑別出更多的病患。p s GR能够鑑別前列腺癌病患# 1 6和 #25，其顯現低濃度PCA3和PSMA。PSMA能鑑別前列腺癌 病患#19，其顯現低濃度？€人3和？8011(左邊組）。該組合能 鑑別患有PCa的較大病患庫，因爲能捕獲更多的前列腺癌 中常見的突變異質性。相比之下，與AMACR而不是與 PSGR的組合不能在此種組合的敏感度和特異性（右邊組）下 鑑別其他病患。 201217786 組合 敏感度 特異性 敏感度+特異性之和 PSMA+PCA3+PSGR 92.30% 66.67% 1.6 PSMA+PCA3+AMACR 76.92% 63.64% 1.4 PSMA+PCA3+AMACR 84.62% 54.55% 1.4 3.討論 發明人已硏究在PM後的尿沈澱物中對PCa的多種基於 qPCR的檢驗。引入其他臨床參數能進一步改進診斷精確度 。此等參數之一可以是PSAD。在被稱爲“灰色區域”的血 清PSA 4.0至10.0 ng/ml範圍內，PSAD明顯比總PSA更精確 (Ohori Μ，e t a 1 · 1 9 9 5，Ur ο 1 〇 g y 4 6 : 6 6 6 - 7 1 )。因此，發明 人將PS AD作爲包括在內之標準以用於確定是否施行前列 腺生檢。 在PCa細胞中高度過度表現的前列腺特異性mRNA會是 所欲之目標。因爲這些基因亦可在尿沈澱物中正常發現的 非癌症細胞（如尿道上皮、腎臟、膀胱及血液的細胞）中表 現，將該等mRNA在臨床樣本中的含量標準化成前列腺源 RNA的量。此可藉由使用基因/PSA mRNA濃度的比例作爲 診斷指示而達成。與血液中蛋白濃度相比，可看出PS A mRNA表現在正常前歹IJ腺細胞中相對穩定，且僅報告PCa細 胞內PSA表現的微弱下調（Meng F J et al·，Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 11: 305-9 (2002))。本硏究所 使用的基因在前列腺腫瘤中，與非腫瘤前列腺組織相比顯 示高的上調。因此，在前列腺腫瘤中PS A的下調將導致腫 -73- 201217786 瘤-基因/PS A的比例提高。因爲PS A在尿液中存在的其他細 胞（諸如移位上皮、血液或腎臟）中並不表現，故可將其作 爲前列腺腺體家務基因。爲判定樣本是否可提供資訊，即 存在的RN A量是否足以産生精確的結果，發明人使用PS A mRNA量，因爲其只在前列腺細胞中出現，且不會受尿液 中存在的其他細胞類型的不同含量影響。 儘管已在大型篩選過程中證明對PC A3表現的基於尿 液的檢驗，只有兩個基於診斷分布圖的硏究分析考慮到癌 症發展的異質性。多種生物標記的組合應能更明確地改善 單一標記的性能。爲此，發明人使用尿轉錄物的新穎多樣 組，其藉由在組合的ROC分析中將3個最好的標記（PC A3、 PSGR及PSMA)與PSAD組合以形成新標記。該分析的硏究 組中，組合的標記模型的AUC(0.80)與單一標記的AUC : PCA3(0.60)、PSGR(0_64)及 PSMA(0.62)相比得到顯著改善 。例如，PCA3分數爲7.23，與PSGR的65.51分數、PSMA 的46.61分數及PSAD的0.21分數組合對應在具有高診斷精 確度的ROC曲線上的點：敏感度和特異性（分別爲96%和 40%)(圖2)。只分析具有血清PSA 4至10 ng/mi且先前未接 受生檢的病患，該組合的標記模型在96%敏感度和 八1；(：(0.89)下特異性提高至62%(圖4)。 因爲發明人和先前的硏究使用不同方法以檢測病患尿 液中PC A3轉錄物，且彼等很多未在其硏究組中使用相同 的P C a患病率（大約3 5 % )，直接比較A U C可能不恰當；然而 ，發明人顯示當與上述硏究的結果或血清PSA比較時， -74- 201217786 PC A3顯示改善的AUC。重要的是，發明人已表示，組合模 型與單獨的PC A3相比，明顯改善預測能力。構成組合生 物標記方法的原理與用於鑑別乳癌病患的高復發風險的檢 驗一致（Paik S, et al. ； N Engl J Med 35 1: 28 1 7-26 (2004) y van de Vijver M J, et al, N. Engl. J. Med. 347: 1 999- 2 009 (2002))。總之，發明人已顯示自準備進行前列腺生 檢的病患的尿沈澱物的多樣qPCR試驗比單獨血清PS A或 PCA3的性能更優越。 爲將這些發現轉入臨床，必須分析僞陰性和僞陽性的 相對重要性。結果，設想將敏感度固定在高範圍（9 0 %至 100%)上，並計算對應的特異性。選擇高百分比，因爲在 判定生檢是否應實施的檢驗中，僞陰性會比僞陽性更糟。 此係因爲遺漏癌症事例的後果可能對病患産生致命的影響 (Pepe et al., 2008，J. Natl. Cancer Inst., 10 0： 1432-1438) 。在接近100%敏感度時，單一標記的特異性通常大幅減少 。該硏究中，在100%敏感度下，PSMA、PSGR及PCA3的 特異性爲〇%，而組合模型（3 M)維持29%特異性。使用3M與 PS A的組合並未出現更多的優勢（29%)。 由本發明提供的該組合3標記模型+PSA的結果提供完 全升高的敏感度，且未降低特異性。轉入臨床中，發明人 只藉由PS A檢驗獲得同樣高的敏感度，但大幅增加特異性 。使用此方法，在100%、33%及96%敏感度下，可節省 42 %的生檢。此相當於在歐洲地區每年節省大約126,750至 1 62,240案例的生檢。

S -75- 201217786 作爲本硏究和其他硏究的可能限制，對P C a的陰性病 患的定義是基於近期的陰性生檢。然而，此定義可能存在 問題，因爲12%至3 2%的顯現陰性前列腺生檢的病患實際 上會在晚期被診斷出罹患PCa (Cervera Deval J et al.， Actas Urol. Esp. 28: 666-71 (2004)和RaberMetal·，AΓch· Ital. Urol. Androl. 72: 1 97-9 (2000))。結果，很多發現顯 現陰性生檢的男性經重復生檢以排除PCa，因此將會出現 進行陽性檢驗的大量個體，其表現呈陽性，儘管生檢呈陰 性。然而，本發明提供的資料支援將本發明提供的4標記 非侵入性試驗方法應用於對PCa的精確診斷檢驗。 【圖式簡單說明】 圖1 :基於尿的PC a生物標記的特徵界定。圖1.1顯示 患有PCa的男性對比良性男性的體內PCA3 (A)、PSGR (B) 、PSMA (C)及PSAD (D)的相對濃度，及患有PCa的男性對 比良性男性（顯現4至10 ng/ml血清PSA且先前未接受生檢（ 特殊臨床目的病患組））體內PCA3 (E)、PSGR (F)、PSMA (G)及PSAD (H)的相對濃度。 圖2 :對生檢中檢測出患有前列腺癌的男性和生檢中 未檢測出癌症的男性體內的組合生物標記之接受者操作特 徵（ROC)曲線。PCA3的ROC曲線（X)、PSGR的ROC曲線（·) 及PSMA的ROC曲線（▽)，以及PSAD (X)結合3基因ROC〇) 。組合的3基因+PSAD ROC曲線（口）。圖中顯示完整的R〇C 曲線和對應90至100%敏感度的區域。 -76- 201217786 圖3:生檢中檢測出前列腺癌的男性和生檢中未檢測 出癌症的男性中邏輯回歸模型與mROC模型3M (PSMA對 PSGR對PCA3)的比較。 圖4:顯現4至10 ng/ml PSA且先前未接受生檢的男性 中，比較個S!l標記與組合標記（PCA3 、PSGR、 PSMA + PSAD)的接受者操作特徵（ROC)曲線。PCA3的ROC 曲線（X)、PSGR的ROC曲線（·）及PSMA的ROC曲線（▽)’以 及PSAD (X)結合3基因ROC (♦) »組合的3基因+PSAD ROC 曲線（□)。圖中顯示完整的ROC曲線和對應於90至100%敏 感度的區域。 圖5:將硏究中所有的病患與特殊目的臨床風險組 (PSA介於4至10 ng/ml且先前未接受生檢）作比較，可節省 的生檢。生檢節省（％) = (真陰性+僞陰性）/所有病患。敏感 度=真陽性/(真陽性+僞陰性）。 £ •77-

Claims (1)

1. 201217786 七、申請專利範園： 1.—種套組，其包含第一組分和可選擇地第二組分， 其中該第一組分係一組由下述所組成之試劑： (i)能測定基因PCA3表現量之試劑； (Π)能測定基因PSMA表現量之試劑；及 (iii)能測定基因PSGR表現量之試劑；且 其中該第二組分包含能測定一或多種前列腺家務 (housekeeping)基因表現量之一或多種試劑β 2 _ —種如申請專利範圍第1項之套組於製備供診斷個 體之前列腺癌（PCa)且具有所欲之敏感度的診斷工具之用 途，其包含 (i) 測定自該個體分離的生物流體樣本中PC A3、PSM A 及PSGR基因之表現量，其中該生物流體選自尿、前列腺 分泌物、精液或前列腺經按摩後之尿，及 (ii) 將該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量與每個該 基因之預定截取値作比較，其中每個基因之該預定截取値 對應與接受者操作特徵（R0C)曲線中於該所欲之敏感度下 最高特異性相關的該基因之表現量，該曲線係基於測定處 於罹患PCa之風險的病患群體之PC A3、PSMA及PSGR基因 表現量進行計算， 其中該生物流體樣本中至少一個該基因之表現量相對 於該基因之該預定截取値顯著增加即表示該個體於該所欲 之敏感度下罹患PCa。 3.如申請專利範圍第2項之用途， -78- 201217786 其中步驟⑴更包含測定該病患體內PCa之另一生物標 記，其中該生物標記選自PS A密度（P SAD)、游離血清PSA 濃度、總血清PSA濃度、游離血清PSA濃度對總血清PSA濃 度之比例、PSA前體濃度或PSA倍增時間（PSADT)，及 其中步驟（Π)更包含比較該病患體內該另一生物標記 量與該另一生物標記之預定截取値，其中該預定截取値對 應與接受者操作特徵（ROC)曲線中於該所欲之敏感度下最 高特異性相關之生物標記値，該曲線係基於測定處於罹患 PCa之風險的病患群體之PCA3、PSMA及PSGR基因表現量 和該另一生物標記量進行計算，且 其中該樣本中至少一個該基因之表現量相對於該基因 之該預定截取値增加或該另一生物標記量相對於該另一生 物標記之該預定截取値增加即表示該個體於該所欲之敏感 度下罹患PCa ^ 4 · 一種如申請專利範圍第1項之套組於製備供評估或 監測罹患PCa的個體對治療之反應的偵測工具之用途，其 包含 (i) 對該個體施予該治療之前，測定自該個體分離所獲 得的生物流體樣本中該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量 ，其中該生物流體選自尿、前列腺分泌物、精液或前列腺 經按摩後之尿， (ii) 對該個體施予該治療之期間或之後，測定自該個 體分離所獲得的生物流體樣本中該PCA3、PSMA及PSGR基 因之表現量，其中該生物流體選自尿、前列腺分泌物、精 -79- 201217786 液或前列腺經按摩後之尿，及 (iii)將對該個體施予該治療之前及期間或之後所獲得 的該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量與每個該基因之預 定截取値作比較，其中每個基因之該預定截取値對應與接 受者操作特徵（ROC)曲線中於該所欲之敏感度下最高特異 性相關的該基因之表現量，該曲線係基於測定處於罹患 PCa之風險的病患群體之PCA3、PSMA及PSGR基因表現量 進行計算， 其中經施予該治療後，該生物流體樣本中至少一個該 基因之表現量相對於該基因之該預定截取値顯著減少或沒 有變化即表示所施予之治療有效，或 其中經施予該治療後，該生物流體樣本中至少一個該 基因之表現量相對於該基因之該預定截取値顯著增加即表 示所施予之治療無效。 5.如申請專利範圍第4項之用途， 其中步驟⑴和（Π)更包含測定該病患體內PCa之另一生 物標記，其中該另一生物標記選自PS A密度（P SAD)、游離 血清PSA濃度、總血清PSA濃度、游離血清PSA濃度對總血 清PSA濃度之比例、PSA前體濃度或PSA倍增時間（PSADT) ，且 其中步驟（iii)更包含比較該另一生物標記量與該另一 生物標記之預定截取値，其中該預定截取値對應與接受者 操作特徵（ROC)曲線中於該所欲之敏感度下最高特異性相 關之生物標記値，該曲線係基於測定處於罹患PCa之風險

   -80- 201217786 的病患群體之PCA3' PSMA及PSGR基因表現量和該另一生 物標記量進行計算， 其中該樣本中至少一個該基因之表現量相對於該基因 之該預定截取値顯著減少或沒有變化，或該另一生物標記 量相對於該另一生物標記之該預定截取値減少，即表示所 施予之治療有效，或 其中經施予該治療後，該個體之樣本中至少一個該基 因之表現量相對於該基因之該預定截取値顯著增加，或該 另一生物標記量相對於該另一生物標記之該預定截取値顯 著增加，即表示所施予之治療無效。 6 · —種如申請專利範圍第1項之套組於製備供監測個 體的前列腺癌（PCa)之進展的偵測工具之用途，其包含 (i) 測定第一時期自該個體分離所獲得的生物流體樣本 中該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量，其中該生物流體 選自尿、前列腺分泌物、精液或前列腺經按摩後之尿， (ii) 測定第二時期自該相同個體分離所獲得的生物流 體樣本中該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量，其中該生 物流體選自尿、前列腺分泌物、精液或前列腺經按摩後之 尿，且其中該第二時期係晚於該第一時期，及 (iii) 將該第一時期和該第二時期所獲得的該PC A3、 PSMA及PSGR基因之表現量與每個該基因之預定截取値作 比較，其中每個基因之該預定截取値對應與接受者操作特 徵（ROC)曲線中於該所欲之敏感度下最高特異性相關的該 基因之表現量，該曲線係基於測定處於罹患前列腺癌之風 -81 - 201217786 險的病患群體之該PCA3、PSMA及PSGR基因表現量進行計 算， 其中該第二時期之樣本中至少一個該基因之表現量相 對於該第一時期之表現量顯著減少或沒有變化即表示前列 腺癌未於該個體體內進展’或 其中該第二時期之個體樣本中至少一個該基因之表現 量相對於該第一時期之表現量顯著增加即表示前列腺癌進 展。 7.如申請專利範圍第6項之用途， 其中步驟（i)和（Π)更包含測定該病患體內前列腺癌之 另一生物標記量，其中該另一生物標記選自PSA密度 (PSAD)、游離血清PSA濃度、總血清PSA濃度、游離血清 PSA濃度對總血清PSA濃度之比例、PSA前體濃度或PSA倍 增時間（PSADT)，且 其中步驟（iii)更包含比較該病患體內之該另一生物標 記量與該另一生物標記之預定截取値，其中該預定截取値 對應與接受者操作特徵（ROC)曲線中於該所欲之敏感度下 最高特異性相關之生物標記量，該曲線係基於測定處於罹 患前列腺癌之風險的病患群體之PCA3、PSMA及PSGR基因 表現量和該另一生物標記量進行計算， 其中該第二時期之該個體樣.本中至少—個該基因之表 現量或該生物標記量相對於該第一時期之表現量顯著減少 或沒有變化即表示該個體之陽性進展，或 其中該第二時期之該個體樣本中至少一個該基因之表 -82- S 201217786 現量或該生物標記量相對於該第一時期之表現量顯著增加 即表示該個體之陰性進展。 8. —種如申請專利範圍第1項之套組於製備供評估個 體是否必須接受前列腺生檢的偵測工具之用途’其包含 (i) 測定自該個體分離所獲得的生物流體樣本中pC A3 、PSM A及PS GR基因之表現量，其中該生物流體選自尿、 前列腺分泌物、精液或前列腺經按摩後之尿’及 (ii) 將該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量與每個該 基因之預定截取値作比較，其中每個基因之該預定截取値 對應與接受者操作特徵（ROC)曲線中於該所欲之敏感度下 最高特異性相關的該基因之表現量，該曲線係基於測定處 於罹患PCa之風險的病患群體體內該PCA3、PSMA及PSGR 基因之表現量進行計算， 其中該生物流體樣本中至少一個該基因之表現量相對 於該基因之該預定截取値顯著增加即表示該個體係前列腺 生檢之候選者。 9. 如申請專利範圍第8項之用途， 其中步驟（i)更包含測定該病患體內PCa之另一生物標 記，其中該另一生物標記選自PSA密度（PSAD)、游離血清 PS A濃度、總血清PS A濃度、游離血清PS A濃度對總血清 PSA濃度之比例、PSA前體濃度或PSA倍增時間（PSADT) ’ 及 其中步驟（Π)更包含比較該病患體內之該另一生物標 記量與該另一生物標記之預定截取値’其中該預定截取値 -83- 201217786 對應與接受者操作特徵（ROC)曲線中於該所欲之敏感度下 最高特異性相關之生物標記量，該曲線係基於測定處於罹 患PCa之風險的病患群體之該PCA3、PSMA及PSGR基因表 現量和該另一生物標記量進行計算，且 其中該樣本中至少一個該基因之表現量相對於該基因 之該預定截取値增加或該另一生物標記量相對於該另一生 物標記之預定截取値增加即表示該個體係前列腺生檢之候 選者。 • 10.如申請專利範圍第8或9項之用途，其中該處於罹 患PCa風險的病患群體係由體內PSA濃度高於4 ng/ml的病 患及/或呈陽性DRE的病患所組成。 1 1 .如申請專利範圍第1 〇項之用途，其中該處於罹患 PCa風險的病患群體係由體內PSA濃度低於10 ng/ml的病患 所組成。 1 2 .如申請專利範圍第2至9項中任一項之用途，其中 該生物流體樣本係前列腺經按摩後所獲得的排出尿液樣本 的沉降物。 1 3 .如申請專利範圍第2至9項中任一項之用途，其中 該所欲之敏感度係100%。 14.如申請專利範圍第2至9項中任一項之用途，其中 令該PCA3、PSMA及PSGR基因之表現量對於經測定該 PCA3、PSMA及PSGR之相同樣本中前列腺特異性家務基因 之表現量標準化。 1 5 .如申請專利範圍第1 4項之用途，其中該前列腺家

   -84- 201217786 務基因係p s A ’且藉由測量p s A m RN A量以測定P S A之表現 量。 16. 如申請專利範圍第2至9項中任一項之用途，其中 藉由定量PCR以測定該PCA3、PSMA及PSGR基因及/或該家 務基因之表現量。 17. 如申請專利範圍第16項之用途，其中該定量PCR係 多重PCR。 I8·如申請專利範圍第2至9項中任一項之用途，其中 該病患罹患分隔的或多病灶的高等級前列腺上皮內瘤。 S -85-