TW201200526A - A method for the preparation of a heat stable oxygen carrier-containing pharmaceutical composition - Google Patents

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201200526 • 四、指定代表圖： ()本案指定代表圖為：第（2)圖。 (一）本代表圖之元件符號簡單說明：無。 五本案若有化學式日寺，請揭示最能顯示發明特徵的化學 無。 八 八、發明說明： 【發明所屬之技術領域】

本發明係關於—種含熱穩定氧載體之藥學組成物的製 法與由此程序所製造的組成物。本發明也關於 穩定氧載體之藥學組成物對於人類或其他： 療、缺氧失調與n官保存㈣途。 H 【先前技術】 素（hem〇gl〇bin)在大部分脊椎動物中扮演—重要 角色用於在血管系統與組織之間的氣體交換。其對經由血 :循裱從呼吸系統攜帶氧氣至身體細胞及並且攜帶代謝廢 棄：物二氧化碳離開身體細胞至呼吸系統負責，其中二氧 :匕碳被呼出。由於血紅素具有此氧氣運送特徵，所以若: I以咖被穩定化且/7? _被使用，則其可作為一強 有力的氧氣供應者。 自然發生之血紅素為一四聚體’當存在於紅血球内 0、，其通常為穩定的'然而’當將自然發生之血紅素從紅 3 201200526 血球f夕出時，其在血漿中變得不穩定且裂成兩個α _点二 聚體（dlmer)。這些二聚體的每一個在分子量中為約32 kDa。逆些二聚體可導致實質腎臟損傷，當其經由腎臟過濾 並排/世時。四聚體連接的損壞也負面地衝擊在循環中之功 能性血紅素的持續性。 為了解決此問題，近來在血紅素處理的發展中已將各 種交聯技術具體化以產生在四聚體内之分子内鍵結及在四 ^ 門的刀子間鍵結以形成聚合之血紅素。先前技術教 丁為了增加血紅素之循環半衰期，聚合之血紅素為較佳的 开式而，依照本發明發明人所測定，聚合之血紅素在 血液循環中更谷易轉變為變性血紅素（社七―hem〇gi〇bin)。 羑丨生血紅素無法結合氧氣且因此無法使組織充氧。因此， 引起聚s之血紅素开）成之由先前技術所教示的交聯是個問 題。本技術領域中需要一技術，其允許分子内交聯以產生 穩疋的四聚體而沒有聚合之血紅素的同時形成。 隨著試圖穩定血紅素之先前技術的更進一步問題包括 包含不能接受之高百分比之二聚體單元的四聚體血紅素的 產生；二聚體的存在使血紅素組成物不符合投予哺乳動物 的要求。血紅素之二聚體形式可在哺乳動物身體中導致嚴 重腎臟知傷；此腎臟損傷可嚴重至足以導致死亡。因此， 本技術領域中需要產生穩定的四聚體血紅素，其在終產物 中具有偵測不到的二聚體形式。 隨著先前技術血紅素產物的另一問題為在投藥後於血 壓方面的突然增加。在過去，已記錄了由於較老一代之血 201200526 紅素氧氣載體的血管收縮（vasoconstriction)事件。例 如，如 Katzetal., 2010 所揭露，Hemopure® 產品（Biopure Co.，USA)導致較高的平均動脈企壓（124 ±9 mmHg)，或當 相較於基線（96±10 mmHg)時高出30%。試圖解決此問題之 先前技術已依靠硫醇基（sul fhydry 1)基團試劑來與血紅素 硫醇基基團反應，據稱以避免内皮衍生血管舒張因子 (endothe 1 ium-derived relaxing factor)與硫醇基基團結 合。然而’硫醇基處理的使用增加了處理步驟，導致成本 與之後必須從血紅素組成物移除之雜質的增加。因此本技 術領域中需要一程序’其用來製備出當提供給哺乳動物時 不會引起血管收縮與高血壓的血紅素。 隨著先前技術試圖產生穩定之血紅素的更進一步問題 包括蛋白質雜質，例如免疫球蛋白G的出現，其會在哺乳 動物中導致過敏反應。因此，本技術領域中需要一程序， 其可產生穩定的四聚體血紅素而無蛋白質雜質。 除了上述問題’本技術領域中需要一經穩定化的四聚 體血紅素’其為沒有二聚體、沒有磷脂質，且可以工業規 模來生產。 【發明内容】 本發明提供用來處理—韭 非聚合、熱穩定經純化之經交 聯之四聚體血紅素，此 知體血紅素適合用於哺乳動物中 而不導致嚴重腎臟損傷' & . 、 血管不利作用（vascular detrimental effect)^ m -ir ^ 一、重有害事件’包括死亡。本發明 201200526 移除血紅素的二聚體形式、未經交聯之四聚體血紅素、構 脂質與蛋白質雜質。此外，本發明使用（1)用以準確且經控 制之低滲透壓裂解（hypotonic lysis)的即刻細胞容解設 備（instant cytolys is apparatus)，（2)流動管柱層析 (flowthrough column chromatography)，（3)用以在純化 程序中熱處理血紅素溶液的高溫短時間設備以移除不希望 獲得之非經穩定化的血紅素二聚體並移除蛋白質雜質，例 如免疫球蛋白G (immunoglobin-G)，以可避免腎臟損傷、 血管不利作用與其他毒性反應，及（4)一密閉輸液袋包裝以 避免氧氣侵入產物。 此方法包括哺乳動物全血的起始材料，其包括至少紅 血球與血漿。在哺乳動物全血中將紅血球從血漿分離，接 著藉由過濾以獲得一經過濾之紅血球部分組（fract i〇n)。 清洗經過濾之紅血球部分組以移除血漿蛋白質雜質。在一 即刻細胞溶解設備以5〇_1〇〇〇 L/小時之流速，藉由一經控 制之低滲透壓裂解達到足以裂解紅血球而不裂解白血球的 時間來使經清洗的紅血球破裂。執行過濾以從溶解產物 (lysate)移除無用阻留物的至少一部份。從上述溶解產物 萃取一第一血紅素溶液。 使用設置來移除相較於四聚體血紅素具有較高分子量 之雜質的超過;慮過據器（ultraf i 1 tration f i Iter)來執 亍第超過’慮程序，以從第一血紅素溶液更進一步移除 任何病毒與殘餘之無用阻留物以獲得一第二血紅素溶液。 對第一血紅素溶液執行流動管柱層析（flowthrough 6 201200526 column chromatography)以移除蛋白質雜質、二聚體血紅 素與碟脂質以形成無填脂質血紅素溶液。使用設置來移除 雜質一過濾器來對無碟脂質血紅素溶液執行一第二超過濾 程序產生一經濃縮純化之無磷脂質血紅素溶液。 藉由雙-3,5-二漠水楊基延胡索酸脂（]3丨5-3，5-dibromosal i cy 1 f umarate)來使至少經純化之血紅素的 α -α次單元交聯以形成熱穩定之經交聯的血紅素而沒有 聚合之血紅素的形成，以使所產生之非聚合之經交聯的四 聚體血紅素的分子量為60-70 kDa。如在此使用之措辭“非 聚合’意指四聚體血紅素’其不與其他血紅素分子或任 何其他非血紅素分子，例如PEG，分子内（intermc)leeulaFly) 交聯。將一適合之生理緩衝溶液’例如磷酸鹽緩衝溶液 (phosphate buffered saline’ PBS)、乳酸林格氏液 (lactated Ringer’s solution)、醋酸林格氏液（acetated Ringer’s solution)或Tris緩衝溶液，與經交聯之四聚體 血紅素進行交換（exchange)。使用切流式過波 (tangentia卜f low f i 1 tration)來移除任何殘留之化學藥 劑。 在此程序之後，熱處理經交聯之血紅素以移除任何殘 餘之未經交聯之四聚體血紅素與任何未經穩定化的血紅 素’例如一聚體形式之血紅素與任何其他蛋白質雜，在 熱處理之前，視需要而定，以約〇. 2%之濃度將乙醯基半 胱氨酸（N-acety 1 cysteine)添加至經交聯之取 「〜w取體血紅 素以避免變性血紅素的形成。立即在熱處理與冷卻之後， 201200526 以約 0. 2%至 〇. 4%之谨 ,* 又添加N-乙醯基半胱氨酸以更進— 步避免變性血紅素的形成。熱處理較佳為執行於約7吖至 :C達30秒至3小時，伴隨隨後冷卻至饥 時間的處理。藉由—雜、、+ 〜或一過濾裝置來移除在熱處理期 間所形成的任何沈澱以因此形成-乾淨的溶液。 然後將無二聚體、無鱗脂質、無蛋白質雜質、熱穩定、 非聚合之經交聯的四聚體血紅素添加至-藥學上可接受之 載體。 之後將此熱穩定、經交聯的四聚體血紅素配製並 成一訂製且密封之聚乙稀、乙婦乙酸乙稀醋、乙稀-乙稀醇 (PE，EVA，卿輸液袋。此包裝避免氧氣污染，氧 導致失效之變性血紅素的形成。 /、 將由以上方法形成之熱穩定經交聯的四聚體血红素被 用於各種癌症’例如白血病、大腸直腸癌、肺癌、乳癌、 肝癌鼻因癌與食道癌的治療。摧毀癌症細胞的機制為增 進在缺氧狀態中之腫瘤的充氧，因此增強對於放射與化^ 療法試劑的敏感度。也將此熱穩定經交聯之四聚體聚合$ 詩在移植期間之器官組織的保存’或用於在&心缺 乏氧氣供應之情況中的心臟的保存’例如在缺氧心臟 (oxygen-deprived heart)中。 【實施方式】 血紅素為在哺乳動物與其他動物之血液之紅血球中的 含鐵氧氣運送蛋白質。血紅素顯示蛋白質三級與四級結構 8 201200526 兩者的特性。在血ι^ 在血、，工素中的大部分胺基酸形成α螺 由短的非螺旋片段 於 ^ 連接。氲鍵穩定在血紅素中的螺 分引起在分子肉斜甘 '疋口ρ 内對其之吸引折疊各多胜肽成一特定形 從四個球狀蛋白質次單元來裝配血紅素分子。各單：為由 —多胜肽鏈所組成，多胜肽鏈被排成—組之^螺旋結様 段’其連接成一呈古< λ 八有嵌入之血色素（heme)基團的“肌紅蛋 白折疊 Uy0gl0bin i〇u)” 配置。 、’ 、企色素基團係由包含於雜環中之鐵原子所組成，已知 卜啉（porphyrin)。鐵原子在環中心平均地與四個氮原子 結合’而環呈-個平面的狀態。之後氧可垂直於。卜啉環的 平面與鐵中心結合m —的血紅素分子具有與四 個氧之分子結合的能力。 在成年人類中’最通常形式的血紅素為一被稱為血紅 素A的四聚體，其係由稱為α2々2之兩個^與兩個石非 共價結合次單元所組成，各分別纟141肖146個胺基酸殘 基所形成。α與^的大小與結構為彼此非常相似。各次 早疋具有約65 kDa之四聚體總分子量的約丨6 kDa分子量。 四條多胜肽鏈藉由鹽橋、氫鍵與疏水交互作用 (hydrophobic interact ion)彼此結合。牛之血紅素的結構 相似於人類血紅素（在α鏈中9〇14%相同；在冷鏈中 84· 35%相同）。差異為在牛之血紅素中位於石Cys 93的兩 個硫醇基（sulfhydryl)基團，而在人類之血紅素中之硫醇 基為分別位於〇： Cys 104、沒Cys 93與；5 Cys 112。第 1圖顯示牛、人類、狗、豬與馬的血紅素的胺基酸序列排 201200526

比，分別標示為B、H 胺基酸序列進行比’時、、。第1圖指出當將它們的 血 時’人類血紅素與牛、狗、豬與馬的 ，素共有咼的相似度。 万鍵球内自，然發生的血紅素中，1鏈與其對應之 ’ ’、。。為非常牢固的，且不在生理上正常的狀態下分 離。然而，—自聚體與另-個Ο二聚體二结合 在紅血球外為相當地弱。此聯結具有分裂成各約32 kDa之 兩個a $ —聚體的傾向。這些不希望得到之二聚體夠小而 被腎臟過;並被排泄’伴隨潛在腎臟損傷與實質上下降之 血管内保留時間的結果。 因此，為了功效與安全性，需要使用在紅血球外的任 何血紅素穩定。於下方概述產生經穩定化之血紅素的製 程；將本發明製程的概要呈現在第2圖的流程圖中^ 最初選擇一全血為來自紅血球之血紅素的來源。選 擇哺乳動物全血，包括，但不限於人類、牛、豬、馬與狗 的全血。將紅血球細胞從血漿分離、進行過濾與清洗以移 除血漿蛋白質雜質。 為了從紅血球細胞釋放血紅素，將細胞膜裂解。雖然 可使用各種技術來裂解紅血球’本發明使用在低滲透壓狀 態下的裂解，以適合工業規模生產之在體積方面可被準確 地控制的方式。為此目的’使用如第3圖所見之即刻細胞 溶解設備來裂解紅血球。低滲透壓裂解產生溶解產物的溶 液’其包括血紅素與無用之阻留物。為了使工業規模生產 可能’裂解被小心地控制以便只裂解紅血球而不裂解白血 10 201200526 球或其他細胞。在一實施例中，選擇即刻細胞溶解設備的 尺寸以使紅血球細胞在此設備來回移動2至3〇秒或其他足 夠以裂解紅血球的一時間的期間，且較佳為3〇秒。即刻細 胞溶解設備包括一靜態攪拌器（static mixer)。將經去離 子與瘵餾的水使用為一低滲透壓溶液。當然可以瞭解的 是，具有不同鹽類濃度之低滲透壓溶液的使用會導致不同 的紅血球裂解時間期間。由於經控制之裂解程序只裂解紅 血球而不裂解白血球或細胞物質，其將毒性蛋白質、填脂 貝或來自白血球之DNA與其他細胞物質的釋放最小化。在 30秒後立即添加高滲透壓（hypert〇nic)溶液，其為在含紅 血球之溶液已於即刻裂解裝置之靜態攪拌器部分來回移動 之後。所產生之血紅素相較於產生自使用其他裂解技術的 血紅素，具有較高的純度及較低程度的污染物，例如不希 望付到的DNA與磷脂質。分別藉由聚合酶鏈鎖反應 (polymerase chain reaction)(偵測極限=64 pg)與高效 能液相層析（high performance iiquid chromat〇graphy， HPLC)方法（偵測極限二i从g/ml)，並未在血紅素溶液中偵 測到來自白血球之不希望得到的核酸與磷脂質雜質。 執行兩個超過濾程序：一個，其在流動管柱層析前， 移除具有大於血紅素之分子量的雜質，而另一個，其在流 動管柱層析後，移除具有小於血紅素之分子量的雜質。後 面的超過濾程序濃縮了此血紅素。在一些實施例中，_ 1〇〇 kDa過濾器被使用為此第一超過濾，而一 3〇让“過濾器被 使用為此第二超過濾。 11 201200526 使用流動管柱層析來移除在經純化之血紅素溶液中的 蛋白質雜質，例如免疫球蛋白G、白蛋白（albumin)與碳酸 酐酶（carbonic anhydrase)。在一些實施例中，藉由使用 市售可得之離子交換管柱，例如DEAE管柱、CM管桎 '經 ^灰石管柱（hydroxyapatite column)等的一個或一組合 來執行管柱層析。管柱層析的PH 一般從6至8. 5。在—實 施例中’使用流動CM管柱管柱層析步驟，以在pH 8· 〇移 除蛋白質雜質。在從管柱層析洗提之後，執行酵素連結免 &及附 i 析（enzyme-1 inked immunosorbent assay, ELISA) 以偵測殘留在樣本中的蛋白質雜質與磷脂質。此獨特的流 動管柱層析分離使工業規模生產之連續分離系統為可能。 酵素連結免疫吸附分析結果顯示這些雜質的量在經洗提的 血紅素中是相當低的（免疫球蛋白G: 44 3 ng/ml ;白蛋白： 20.37 ng/ml ;碳酸酐酶：812 。以不同之pH值 使用不同之管柱的蛋白質雜質移除結果顯示於下方表玉 中。 表1 --------- ------- --—__ 移除百分比(％) 白蛋白

管柱(pH狀態） — 碳酸酐酶 DEAE〇pH7.5) --- DEAE〇^pH7.8) --- CM(於 PH 6. 2) --- CM(於 pH 8· 0) 5.6 羥磷灰石（於pH 7. 5) 4.5 " ΠΓ Μ 在管柱層析程序之後，藉由雙—3, 5_二溴水揚基延胡索 酸脂（bis-3，5-dibromosalicyi fumarate，DBSF)使血紅 12 201200526 素遭受交聯。為了避免聚合之血紅素的形成，於周遭溫度 (15 25C)’較佳為在約8 — 9的pH，以介於1: 2.5至1 : 4· 0之血紅素比DBSF的莫耳比，將反應小心地控制在一無 氧％、丨兄中（較佳為小於〇 · 1 ppm溶氧程度），計自3至1 6小 時的一時間期間，以使所產生之經交聯的血紅素為四聚體 血紅素，其具有6〇_7〇 kDa的分子量，顯示聚合之血紅素 不存在。DBSF反應的產量為高的，> 99%，且二聚體濃度 在終產物中是低的。視需要而定，此程序不需要如在各種 先别技術中所使用之在交聯前與血紅素反應的硫醇基處理 試劑’例如碘乙醯胺（i〇d〇acetamide)。 在此觀點，將磷酸緩衝溶液，一生理緩衝溶液與此經 父聯的溶液交換（exchange)，且藉由切流式過濾 (tangential flow filtrati〇n)來移除任何殘留之化學藥 劑。 在無氧狀態下藉由D B S F之血紅素的交聯程序之後，本 發明對於在-無氧環境巾經交聯的四聚體血紅素溶液提供 :熱處理步驟。在熱處理之前，視需要而定添加n—乙酿基 半胱氨酸（N-acetyl cysteine)以避免變性血紅素（失效的 血紅素)的形成。在熱處理之後，將溶液冷卻並立即添加 恥乙醯基半胱氨酸以保持低程度的變性血紅素。若在熱處 理之前與之後添力口 N -乙醯基半胱錢，在熱處王里之前的添 加量為約0· 2%，而在熱處理之後的添加量 0. 4%。然而，若僅在熱處理後添加N_乙醯基半 則添加量為〇. 4 %。 為約0. 2至 胱氨酸的話， 13 201200526 在一些實施例中，在從5〇°C至95°C的溫度範圍，在一 無氧裱境中（小於〇· 1 ppm溶氧程度）將經交聯之四聚體血 、'素/谷液加熱，持續〇 _ 5分鐘至1 〇小時。在一些實施例中， 在彳之70 C至95 C的溫度範圍，將經交聯之四聚體血紅素溶 液加熱持續3 0秒至3小時。在一些較佳實施例中，在 8〇 C將經父聯之四聚體血紅素溶液加熱30分鐘。且在 又其他實施例中，將經交聯之血紅素溶液加熱至⑽^計3〇 私至3分鐘，之後在約15至30秒内快速冷卻至約25°C， 且如前述添加N-乙醯基半胱氨酸。產生―非常低量的變性 血紅素，例如小於3%。沒有N-乙醯基半胱氨酸的使用，則 斤形成之變性血紅素的量為約i 6%，對於藥學應用而言為 不能接受的高百分比。 之後使用高效能液相層析分析、電喷灑離子化質譜 (electroSpray ionization mass spectrometry, ESI- )衣兩色相性光谱（circular dichr〇ism spectr〇sc〇py) 與，於P50測量之血氧分析儀（Hem〇x 來分析並 、’曰此熱穩定經父聯之四聚體血紅素的特性。關於來自牛 來源之血紅素的方面，第4圖顯示對於遭受於9 〇。〇達 45秒至2分鐘或80°C達30分鐘之熱處理之血紅素而言， 一聚體形式的血紅素在高效能液相層析系統中（偵測極 2· 6以g/mi或〇· 043%)為偵測不到的。發現經交聯之 非聚。四聚體血紅素在80或9(rc為熱穩定的達一段時 間。此熱處理(高溫短時間’ Hm)步驟為使自然未經反應 之四聚_式與二聚體形式之血紅素變㈣強效步驟。 14 201200526 為了分析此高溫短時間步驟的結果，使用高效能液相 層析的分析方法來偵測在此熱處理後之二聚體的量。高效 能液相層析分析的移動相包含氣化鎂（〇. 75 μ)，其可分離 二聚體（非經穩定化之四聚體）與熱穩定經交聯的四聚體。 對於促進血紅素分解成二聚體而言，在相同之離子強度， 亂化鎮比氣化納更有效約3 〇倍。熱處理步驟也扮演一變性 步驟以引人注目地移除在經交聯之四聚體血紅素中的不需 要的蛋白質雜質（在免疫球蛋白G方面偵測不到；在白蛋白 方面偵測不到，在碳酸酐酶方面99· 9⑽降低）。執行酵素 連-免疫吸附分析(EL ISA )以在樣本中偵測蛋白質雜質。因 此、，此經純化、熱穩定之經交聯的四聚體血紅素溶液具有 無法债測出之程度的二聚鹽「你I a 又J t體C低於偵測極限：〇. 〇43%)，與 免疫球蛋白G，及非當供县λα gr gfe r〇 、蛋白（0· 02 V g/ml)與碳酸 肝轉（0.014 _ 王表2顯示關於藉由高溫短時間熱處 里V驟來移除蛋白質雜皙盘_取Μ *曰 與一聚體的實驗結果。此玄溫短 時間熱處理步驟使熱穩定 I此_狃 體盘mm u又聯的四聚體從非 拉/、一 I體的選擇性分離為可能。 表2 無熱處理 8〇°c，ίο 分鐘 8〇°C，15 分鐘 80°C，3Q 分錄 無熱處理 9〇°C ’ 1. 〇 分鐘 9〇°C ’1.5 分鐘 〇. 36 無法伯測出 無法傾測出 0.29 無法偵測出 ίϋΙάΕΐ)— 355. 41 0.032 0. 022 0.014 — ϋΓδό1· >〇. 063 0.022 0. 016 在對於經交聪夕t Λ ± 又％卩之血紅素在—益 *»»、 94,9 96.1 -聚體《) 氣狀態下的熱處理步驟 15 201200526 之後，此熱穩定經交聯的四 裝而言為具備適合的條件。 熱穩定經交聯之四聚體血紅 明中之熱穩定經父聯的四聚 態下是穩定的。 聚體血紅素對於藥學配製與包 本發明描述在一無氧環境中之 素的一密封包裝步驟。在本發 體血紅素，大於兩年在無氧狀 在本發明中’含氧载體之藥與 料賜之樂子組成物主要是為了靜脈 内注射應用而準備。傳统I·，生A + * „丄 丨号，·死上，先刖之產品使用—般pvc血

袋或Stericon血袋，1呈古古认容友，A A 〃具有同的氧氣滲透性’高的氧氣滲 透性最終會縮短產品的毒合 Λ J可叩，由於其在充氧狀態下快速轉 變成失效之變性血紅素（在幾天内）。 於本毛明中使用的包裝導致熱穩定經交聯之四聚體血 紅素大於兩年是穩定的。使用EVA/EV〇H材料之一多層包裝 來將氣體滲透性最小化並避免失效血紅素的形成。設計用 來包含本發明經純化與熱穩定之經交聯的四聚體血紅素的 100ml輸液袋，為由一具有〇4mm厚度之五層的 疊層材料（laminated material)所製成，其具有在室溫每 大軋壓每24小時每100平方英吋〇· 〇〇6_〇. 132 cm3的氧氣 滲透度。此材料為一第VI類塑膠（Class VI plastic)(如 88〉中所疋義）’其符合/·77-生物反應測試 (Fi Biological Reactivity Tests)與物理化學挪試 (Physico-Chemical Test)，且適合製造為用來靜脈内注射 目的之輸液袋。此主要的袋子對於保護熱穩定經交聯的四 聚體血紅素溶液免於導致其不穩定性並最終影響其治療特 性的長期氧氣暴露為有效的。 16 201200526 對於血液產品的第一級保護而言，其已知為使用銘外 包裝（overwrap)以免於潛在的氣體洩漏且維持產品於一無 氧狀態。然而’在銘外包裝中具有針孔（p i n h 〇丨e)的可能 性’此可能性危及其密封並使產品不穩定。因此，本發明 使用鋁外包裝小袋（aluminum overwrap p〇uch)為第二級包 裝，其避免充氧且也避免光暴露。外包裝小袋的組成包括 〇·〇12 mm之聚對笨二曱酸乙二酯（p〇lyethylene terephthalate，PET)、0. 007 mm 的鋁（A1)、〇. 〇15 mm 的 尼龍（1^1〇11，心）與0.1111111的聚乙烯（1)〇1^让丫16此，1^)。 外包裝薄膜具有〇.丨4 mm的厚度與在室溫每大氣壓每24小 時每100平方英吋0.006 Cffl3的氧氣穿透率。此第二級包 裝延長血紅素的穩定時間，延長產品的貯藏期限 (shelf-life) 〇 包括電喷灑離

藉由各種技術來分析本發明的血紅素 子化質譜（ESI-MS)。電噴灑離子化質譜使 17 201200526 疊，甚至是在90°C熱處理之後。環二色結果顯示此熱穩定 經交聯之四聚體血紅素具有約42%的 α 螺旋（alpha_ 1^11义）、38%的/3摺疊（匕6七&-511661;)、2.5%的/3.脊曲（56士3-turn)與16%的無規線圈（random coi 1)。其更進一步確認 此經交聯之四聚體血紅素是熱穩定的。 於本發明中的製程為可適用於此熱穩定經交聯之四聚 體血紅素的大規模工業生產。此外，與藥學上可接受之載 體（例如，水、生理緩衝溶液、以膠囊形式）結合之此熱穩 定經交聯的四聚體血紅素為適合哺乳動物使用。 本發明更揭露含氧載體之藥學組成物在增進組織充氧 中、在癌症治療中、在氧氣缺乏失調，例如缺血性休克的 ~療中與在低氧氣含1環境下（例如心臟移植）之心臟保存 中的用途。選擇劑量以具有約0.2-1.3 g/kg之濃度範圍， 伴隨小於10 m 1 /小時/kg體重的注射速率。 對於在癌症治療中的用途而言，本發明之含氧載體的 藥學組成物作為組織充氧試劑以增進在腫瘤組織中的充 氧，因此促進化學敏感性（chemosensiu vi )與放射線敏 感性（radiation sensitivity)。 此外’於本發明中證明此熱穩定經交聯的四聚體血紅 素增進在正常組織中（第7圖）與極度缺氧之腫瘤中（第8圖 之充氧、人類鼻咽癌（使用CNE2細胞株）的能力。於第8 圖中顯示循著人類CNE2異體移植（xen〇graf t)之組織路徑 (tissue track)的代表性氧氣輪廓。藉由與一微定位系統 (miCr〇-positi〇ning system) (Dn Limited)結合之光纖 18 201200526 氧氣感應器（fibreoptic oxygen sensor)來直接監測在腫 瘤塊中的氧氣分壓（p〇2)。在此熱穩定交聯之四聚體血紅素 之〇.2g/kg的靜脈内注射後’在15分鐘内，中位數（me(jian) P〇2值從基線（base 1 i ne)提高至約兩倍的相對平均氧氣分 壓且延續至6小時。此外，在注射後2 4至4 8小時，氧氣 程度平均仍然維持高於基線值25%至30%的程度。當與在本 發明中所製備之含氧載體的藥學組成物比較時，沒有市售 產品或現存之技術顯示如此高的功效。 對於腫瘤組織充氧而言，於第8圖中顯示人類頭頸鱗 狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC) 異體移植（FaDu)的代表性氧氣輪廟。在此熱穩定交聯之四 聚體血紅素之°.2g/kS的靜脈内注射後，在3小時與6小 時分別觀察到在大於6. 5仵盥5 ' .J 畀b借之在千均p〇2方面的顯 著增加（第8圖）。 ’ :對於癌症治療方面中的應用而言，本發明之含氧載 :樂學組成物作為—組織充氧試劑以增進在種瘤組織中 此敖^因此增強化學與放射線㈣度。在W放射線與 此熱穩定經交聯之四平 、 的生長。在第9A圖中1 =素結合的方面，延遲了腫瘤 物模式中顯著的腫’曲線顯不在鼻咽癌之鼠科動 熱穩定經交聯之四X—綠射線陶或與 ⑽異體移植之裸小：血：素結合_)來處理帶有 時，將Ug/kg之此執穩/先放射線之前約3至6小 注射進小鼠，且導致鼻：广聯的四聚體血紅素靜脈内 癌異體移植的一部分縮小。 201200526 在一實施例中，在注射此組成物並與化學治療試劑結 合之後’觀察到顯著之肝臟腫瘤縮小。在第9B圖中，代表 性圖顯示在大鼠原位（or t ho top i c)肝癌模式中的顯著腫瘤 縮小。以單獨3mg/kg順氣氨鉑（cisplatin)或與〇.4g/kg 之此熱穩定經交聯的四聚體血紅素結合（順氣氨鉑)來 處理帶有肝腫瘤移植（orthograft)(CRL16〇1細胞株）的布 法羅大鼠（Buffalo rat)。在順氯氨鉑注射前之此熱穩定經 交聯的四聚體血紅素的投予導致肝腫瘤的一部份縮小。 對於在缺氧失調的治療中的用途而言與對於心臟保存 而言，本發明含氧載體之藥學組成物作為提供氧氣至目標 器官的血液代替物。 於第10圖中顯示以〇· 5 g/kg之熱穩定經交聯的四聚 體血紅素處理後’在嚴重缺血性休克之大鼠模型中的主要 動脈壓力的改變。在嚴重缺血性休克的大鼠模型中，以熱 穩定經交聯的四聚體血紅素處理後，主要動脈壓力回復至 一安全且穩定的程度且維持於或約基線。以熱穩定經交聯 的四聚體血紅素處理之後，主要動脈壓力回復至正常所需 的時間甚至比投予作為正控制組之自體（aut〇1〇g〇us)大鼠 血液來得更短。結果指出在此熱穩定經交聯之四聚體血紅 素的輸液（transfusion)後，沒有發生血管收縮事件。 【實施例】 藉由描述本發明特定實施例的方式來提供下列例子， 而不傾向以任何方式來限制本發明的範圍。 實施例1 20 201200526 製程概觀 '、第2圖中圖解說明本發明之製程的概要流程圖。將 ’ 欠本進含有3.8%(w/v)三檸檬酸納（tri-sodium

Cltrate)/合液為抗凝血劑（anti-coagUiant)之一封住無菌 的谷器/衣子中。之後立即將血液與三檸檬酸鈉溶液混合均 勾、P制血/夜凝固。藉由一機採機制（apheres i s mechani sm)彳火血漿與其他較小之血液細胞將紅血球細胞 (red Mood cells，RBC)分離出並收集。伴隨τ無菌可拋 棄式離 u 钵（ga_a steriHzed diSp0sabie centrifuge b〇wl) 細胞洗蘇益被使用於此程序。以等體積之 0· 9%(w/v氣化鈉）鹽水來清洗紅血球。 藉由操作對紅血球細胞膜的低滲透壓休克，將經清洗 之紅血球裂解以釋放出血紅素内容物。為此目的，使用顯 不於第3圖中一專門之用於紅血球裂解裝置的即刻細胞溶 解設備。在紅血球裂解後，藉由使用一 i 〇〇 kDa膜的切流 式超過濾來從其他蛋白質分離出血紅素分子。為了流動管 住層析’收集在遽出液中的血紅素且藉由一 3〇kDa膜更進 一步將其濃縮至12-14 g/dL。執行管住層析以移除蛋白質 雜質。 首先將經濃縮之血紅素溶液與DBSF反應以形成在無 氧狀態下熱穩疋經父聯之四聚體血紅素分子。之後在最後 配製與包裝之則，在無氧狀態下於90°C執行熱處理步驟30 秒至三分鐘° 實施例2 21 201200526 時間&經控制之低滲透壓裂解與過渡 新鮮地收集牛的全血並將其在一適冷的狀態（2至1 〇 °c )下運送。經由細胞洗滌器且隨後以一 〇. 65 # m過濾來 將紅血球從血漿分離出。在以0.9%鹽水清洗紅血球濾出液 後，藉由低滲透壓裂解來使此濾出液破裂。藉由使用顯示 於第3圖中之即刻細胞溶解設備來執行低滲透壓裂解。即 刻細胞溶解設備包括一靜態攪拌器以協助細胞裂解。將具 有經控制血紅素濃度（12-14g/dL)之紅血球懸浮液與4體 積之經純化的水混合以產生對紅血球細胞膜之一低滲透壓 休克。控制低滲透壓休克的期間以避免不需要之白血球與 血小板的裂解。低滲透壓溶液通過即刻細胞溶解設備之靜 態擾掉器部分達2 S 30秒、或一足夠裂解紅血球的時間，且 較佳為30秒。在30秒後，藉由將溶解產物與1/1〇體積之 局渗透壓緩衝溶液混合來終止休克，隨著其退出靜態授拌 器。所使用之高滲透壓溶液為O.i M磷酸緩衝溶液、7 4%

NaCl，pH 7.4。第3圖之即刻細胞溶解設備可以每小時處 理50至100公升的溶解產物，且較佳為以一連續方式每小 時至少3 0 0公升。 22以m過濾器來過濾紅血 在紅血球裂解之後，藉由〇 球溶解產物以獲得一血紅素溶液。分別以聚合酶鏈鎖反應 (偵測極限：64 Pg)與高效能液相層析（偵測極限：丨"g/mi) 方法並未在此血紅素溶液中偵測到來自白血球的核酸與磷 脂質。執行第—10。kDa超過濾以移除相車交於血紅素具有 較高分子量的雜質。採用流動管柱層析以更進一步純:匕此 22 201200526 血紅素溶液。之後執行第二30 kDa超過濾以移除相較於血 紅素具有較低分子量的雜質並濃縮。 實施例3 對無基質（stroma-free)血紅素溶液方面的病毒清除研究 為了證明來自本發明之產物的安全性，藉由病毒確認 研究（virus validation study)來證明（1) 0.65 濾洗 (diafUtration)步驟與（2) 1〇〇 kDa超過濾步驟的病毒移 除能力。其為以不同之模型病毒（腦心肌炎病毒 (encephalomyocarditis virus)、假性狂犬病病毒 (pseudoraMes virus)、牛病毒性下痢病毒（b〇vine virai diarrhea virus)與牛小病毒（bovine parvovirus)),藉由 這兩個程序的低規模版本（down-scaled versi〇n)的謹慎 穿刺（deliberate spiking)來完成。在此研究中，使用四 種形式的病毒（參見表3)。這些病毒在它們的生物生理學 與結構特徵方面呈多樣化，且它們在對於生理與化學試劑 或處理的抗性方面表現差異。

C型肝炎病 毒（HCV) 牛病毒性下 痢病毒 (BVDV) 黃熱病毒科 (Flaviviridae) ssRNA 套膜 40-60 低 腦心肌炎病 毒(EMCV) 小病毒B19 B型肝炎病 毒（HBV) 牛小病毒 (BPV) 假性狂犬病 病毒 (PRV) 小核糖核酸病毒 (Picornavirus) 小病毒科 (Parvoviridae) 疮療病毒科 (Herpesviridae)

ssRNA

ssDNA

dsDNA 無套膜 無套膜 套膜 25-30 18-26 120-200 中 非常高 低至中 23 201200526 於下方表4中簡單地顯示確認方案

細胞清洗 太 1 病毒穿刺（virus spiking) 病毒測試 在（1) 0.65 μιη渡洗與（2) 1〇〇 kDa超過渡中之四種 病毒的對數減少結果的概要顯示於下方表5中。所有四種 病毒，牛病毒性下痢病毒（BVDV)、牛小病毒（BPV)、腦心肌 炎病毒（EMCV)與假性狂犬病病毒（pRV)，被以〇 65 濾 洗與100 kDa超過濾有效地移除。 表5

實施例4 流動管柱層析 使用一 CM管柱（市售可從GE heai獲得）來更進 24 201200526 一步移除任何蛋白質雜質。起始 ( 货衝吟液為20 mM醋酸鈉

CpH 8. 〇) ’而洗提緩衝溶液為

M 醋馱鈉、2M NaClCpH 心〇)。在以起始缓衝溶液平衡 澈人p 之後’將蛋白質樣本 載入此官柱中。以至少5普缸粬蚀 積之起始緩衝溶液來清洗 未結合之蛋白質雜質。卩8f柱體積使用⑽洗提緩衝溶 液（H.、5MNa⑴來執行洗提。於第U圖中顯示洗提輪廓； 血紅素溶液為在流出之部分組中。 精由酵素連結免疫吸附

刀析來分析流出之部分組的純度。方\ y π t β I 4没万' 下列表6中顯示結果。 表6 — CM管柱之前 免疫球蛋白G 1320^Anl 碳酸Sf酶 860. 3 ug/ml Γ白蛋白 ~ 流出物（Flowthrough) (含血紅素） 44. 3 ng/ml 81.2 eg/mi ^oj.L ng/ml 20.4 ng/ml ^------ 由於血紅素是在來自pH 管柱層析的流出物中 (不在洗出液中），因此其為連續工業規模操作的良好方 式。對於工業規模操作而言，第—超㈣裝備被直接連接 至流動CM管柱層析系統，且此流出管柱可被直接連接至第 二超過濾裝備。於第12圖中顯示概要的工業製程設置。 實施例5 熱穩定經交聯之四聚體血紅素的製備 (5a)與DBSF之交聯反應 於一無氧狀態中執行交聯反應。將DBSF添加至血紅素 溶液，以形成經交聯之四聚體血紅素而沒有聚合之血紅素 的形成。DBSF穩定化程序穩定了四聚體形式之血紅素（π kDa)且避免其分離成經由腎臟被排泄的二聚體ο〗 kj)a)。 201200526 在此實施例中，使用1 : 2. 5之血紅素比DBSF的莫耳比且 pH為8. 6。在氮氣的一惰性大氣中在周遭溫度（1卜25它） 執行此程序達3-6小時的期間，以避免血紅素的氧化而形 成三價鐵變性血紅素，其為生理上失效的（溶氧程度維持小 於〇.1 ppm)。藉由使用高效能液相層析測量殘餘之卯卯 來監測DBSF反應的完成。DBSF反應的產量是高的，> 9料。 (5 b )高溫短時間熱處理步驟 於第13圖中顯示一高溫短時間^以以處理設備。使用 此高溫短時間處自設備來對,經交聯t四聚|^紅素執行— :熱處理。在此例子中’熱處理的條件為赃，3。秒至3 ’里且奴佳為45至60秒，然而如前所討論也可選擇其 他條件且設備因此而修飾。以每分鐘1〇公升的流速將視 需要而疋以〇.2%之N_乙醯基半胱氨酸添加於其之含經交 時„ :、工素的洛液抽吸進一高溫短時間處理設備(高溫短 ^处理熱父換器的第一部份為被預熱且維持於90°C )， :備之第—部份的滞留時間為介於45至60秒之間，之後 :::相同之流速通過進入維持於25。。之此熱交換器的另 饥w卻所需時間為介於15至3g秒之間。在冷卻至 卜乙=^^2%至G'4%’較佳為〇.4%的濃度立即添加

加土半胱氨酸。在两溫短時間熱處理之後的此化學添 加對於維持變神& έ κ λ 予J 分重要的 、工素（失效血紅素）在一低程度而言是十 控制的操作而言’處理設備的裝備為容易被 血紅素 4圖中顯不對應二聚體含量的溫度輪廓。若 、·卜‘乂聯的，其為非熱穩定的且在加熱步驟後形 26 201200526 成沈澱。之後藉由—離 離、或一過濾設備來移 形成一乾淨的溶液。 和除沈我以因此 在9〇t之高溫短時間熱處理期間， 血紅幻被增加（如於第15圖中所 、.素(失效 基半胱氨酸之後，可唯捭### 即添加N-乙醯 了.，隹持低程度的變性血紅素，約小於狀。 下列表7顯示在敎虛拂斗_ 、 0 在熱處理步驟之後移除 例如免疫球蛋白G、白|, 震曰負雜為， 經穩定化之四聚體或二聚體于到之未 析方法來測量免疫球蛋白f ώ酵素連，，、。免疫吸附分 ]里免度球蛋白G、白蛋白與碳酸酐酶的量，而 藉由-南效能液相層析方法來測定二 n± on - j. 7至你回/皿紐 守間，.,、處理步驟後，此埶轉定έ<7< A + '、，、榱疋皴乂聯之四聚體血紅素的绅 度疋非常高的，在980至 主9的靶圍中。藉由一血氧分 析儀（He_ Analyzer)所測量之p5〇值，氧氣分愿（於盆血 紅素溶液為—半⑽）飽和的），經由高溫短時間熱處理步 驟破維持於約30至40 _Hg，且因此此熱處理經交聯之四 聚體血紅素在90°C是穩定的。 表7

由於本發明產物在無氧狀態下為穩定的，所以產物的 27 201200526 包裝重要的是將氣體滲透率最小化。對於靜脈内應用而 言，一訂製設計之100 ml輸液袋係由一具有〇. 4 _厚度 之五層的EVA/EV0H疊層材料所製成，其具有在室溫每大氣 壓每24小時每100平方英吋〇 〇〇6_〇132㈣3的氧氣滲透 度。此材料為一第VI類塑膠（class VI plastic)(如 USP<88>中所定義）’其符合生物反應測試與物理 化學測試，且適合製造為用來靜脈内注射目的之輸液袋（需 注意的是，同樣依照所需應用，其他形式的包裝可由此材 料所製成）。也可將第二級包裝鋁外包裝袋應用至第一級包 裝輸液袋’其提供額外的屏障’將光暴露與氧氣擴散最小 化。袋的層包括：〇· 012 min之聚對苯二曱酸乙二酯 (polyethylene terephthalate， PET) 、 0.007 ram 的鋁 (Al)、0.015则i的尼龍（nyl〇n，Νγ)與〇1 _的聚乙烯 (polyethylene, PE)。外包裝薄膜具有〇. 14 _的厚度與 在室溫每大氣壓每24小時每1〇〇平方英吋〇.〇〇6 cm3的氧 亂穿透率。於第16圖中顯示輸液袋的概要顯示。根據本發 明各輸液袋的全部氧氣滲透度為在室溫每大氣壓每24小 時 〇 0025 cm3。 實施例7 充氧的增進 (7a)在正常組織中之充氧的增進 藉由熱穩定經交聯之四聚體金紅素來執行對於正常組 織充氧的一些研究（如於第7圖中所示）。於布法羅大鼠中 執行比較藥物動力學（Pharmacokinetic)與藥效學 28 201200526 (PhannaC〇dynamic)研究。藉由彈丸式注射（^丨“ i n j ect i on).經由大鼠之降苹私, 乳心I丟里静脈（pern le vein)，以0_ 2 g/kg熱穩定經交聯之四聚體血紅素溶液或林格氏醋酸緩衝 溶液（控制組）分別地投予雄性近親繁殖之布法羅大鼠。藉 由Hem〇CUeTM光度計在丨、6、24、48小時測定血聚血紅素 之濃度-時間輪廓並與基線讀數比較。此方法為根據血紅素 之光度測量法，其中血紅素的濃度直接讀出為g/dL。在布 法羅大鼠之後腿肌肉中藉由〇xylabTM組織充氧與溫度監 測器（Oxford 0ptronix Llmited)來直接測量氧氣分壓 (p〇2)。藉由腹腔内注射（intra_peri1：〇neal ⑽） 30-50 mg/kg戊巴比妥（pent〇barbit〇ne)溶液來麻醉大 鼠’接著將氧氣感測器插入肌肉中。藉由Datatrax2資料 獲知·糸統（World Precision Instrument)以一即時方式記 錄所有p〇2讀數。結果顯示，在〇· 2 g/kg之熱穩定經交聯 之四聚體血紅素的靜脈内注射後，在丨5分鐘内平均p〇2值 從基線提升至約兩倍之相對平均氧氣分壓且延長至6小 時。此外，在注射後2 4至4 8小時，平均氧氣程度仍維持 高於在基線值25%至3 0%(第7B圖）。 (7b)在極度缺氧腫瘤區域中之充氧的顯著增進 藉由一頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC )異體移植模型來評估 在極度缺氧腫瘤區域中之充氧的增進。從美國菌種保存中 心（American Type Culture Collection)獲得咽下部 (hypopharyngeal)鱗狀細胞癌（FaDu細胞株）。將約ιχ1〇6 個癌細胞皮下注入四至六週大近親繁殖的BALB/c AnN-nu 29 201200526 (裸（nude))小鼠。當腫瘤異體移植達到n 〇 M的直徑時， 藉由OxylabTM組織充氧與溫度監測器（〇xf〇r(J〇ptr〇nix Limited)來直接測量在腫瘤塊内的氧氣分壓（p〇2)。藉由 Datatrax2 資料獲得系統（world Precisi〇n Instrument) 以即時方式記錄所有p〇2讀數。當p〇2讀數為穩定時，經 由小鼠之尾靜脈靜脈内注射〇·2 g/kg之熱穩定經交聯的四 聚體血紅素溶液並測量組織充氧。結果顯示，在靜脈内注 射〇· 2 g/kg之此熱穩定經交聯的四聚體血紅素後，分別在 3與6小時中觀察到在大於6.5倍與5倍之平均p〇2方面的 顯著增加（第8圖）。 實施例8 疡症/D療研九.鼻咽癌中顯著的腫瘤縮小 在投予熱穩定經交聯的四聚體血紅素溶液並結合X光 照射後觀察到顯著之腫瘤 雌·塯细小I第g A圖）。使用人類鼻咽癌 異體移植模型。將& j e 將、力1x10個癌細胞（CNE2細胞株）皮下注 入四至六週大近親繁殖的 瘤異體移植達到8-1() _ 機分成如下三個群組： BALB/c AnN-nu(裸）小鼠。當腫 的直控時’帶有腫瘤之小鼠被隨 s acetated buffer) 群、，且1 .林格氏醋酸緩衝溶液（Ringer， (控制組） 林格氏醋酸緩衝溶液+X光照射(2Gy)

群且：：穩定經交聯的四聚體血紅素+X光照射（2Gy + H 2)或結合敎：二、體▲移植之裸小鼠被以單獨X光照射(群 …° 〇…，。定經交聯的四聚體血紅素（群組3)。為了 30 201200526 光照射（群組2與3)，藉由腹腔内注射50 mg/kg之戊巴比 女溶液來麻醉小鼠。藉由一光加速系統（linear accelerator system)(Varian Medical Systems)將 2 戈雷 (Gray )之X光傳送至帶有腫瘤之小鼠的此異體移植。對於 群組3在X光處理之前，將丨.2 g/kg熱穩定經交聯之四 聚體血紅素經由尾靜脈靜脈内注射進小鼠。以治療的第一 天開始每一隔天記錄腫瘤尺寸與體重。使用方程式丨/2LW2 來計算腫瘤重量，其中L與w代表腫瘤塊的長度與寬度， 藉由一數位卡尺（digital caiiper) (Mitutoyo Co, Tokyo, Japan)在每次測量時測量。群組i為未處理控制組。結果 (顯示於第9圖中）顯示在以熱穩定經交聯之四聚體血紅素 洛液結合X光照射處理之小鼠中觀察到CNE2異體移植的顯 著縮小（群組3，第9A圖）。 實施例9 癌症治療研究：肝腫瘤中顯著的腫瘤縮小 此外，在投予熱穩定經交聯的四聚體血紅素溶液並結 合順氣氨鉑後觀察到顯著之腫瘤縮小（第9B圖）。使用大鼠 原位肝癌模型。將以螢光酵素（luciferase)基因 (CRL16(H-Luc)標示之約2χΐ〇6個大鼠肝腫瘤細胞注入布法 羅大机中之肝的左葉中。藉由一 Xen〇gen ^ 成像系 統來監測腫瘤生長。在注射後2至3週將腫瘤組織收穫、 切成小片且原位地（0rth〇t〇pical ly)植入一第二群組之大 鼠的左肝葉中。帶有肝腫瘤之大鼠被隨機分成如下三個群 組： 31 201200526 群組1 :林格氏醋酸緩衝溶液（控制組） 群組2 :林格氏醋酸緩衝溶液+順氯氨鉑（順氯氨鉑）（2Gy) 群組3 :熱穩定經交聯的四聚體血紅素+順氯氨鉑（順氣氨 鉑 +Hb) 帶有肝腫瘤組織之大鼠被以單獨3 mg/kg之順氣氨鉑 (群組2)或結合熱穩定經交聯的四聚體血紅素（群組3 )處 理。對於群組2與3而言’藉由腹腔内注射50 mg/kg之 戊巴比妥溶液來麻醉大鼠且經由左門靜脈〇efi: portal ve 1 η)來投予順氣氨鉑。對於群組3而言，在順氣氨鉑處理 前’經由大鼠之陰莖靜脈靜脈内注射〇. 4 g/kg之熱穩定經 交聯的四聚體血紅素。群組丨為未處理控制組。重要地， 在治療3週後觀察到肝腫瘤的顯著縮小（第9B圖）。 實施例1 0 於大乳中之急性嚴重缺血性休克的治療 在大鼠中之急性嚴重缺血性休克的模型中，熱穩定經 父聯之四聚體血紅素也被使用為復越（resusci 丨〇n)試 劑。依照復甦試劑將50隻斯普拉—道Dawley) 大鼠隨機分成3個群組’每個群組中16至18隻大鼠。 群組1 .林格氏醋酸緩衝溶液（負控制組，16隻大鼠） 群組2 .動物自體的血液（正控制組，丨6隻大鼠） 群組3 .熱穩定經交聯的四聚體血紅素處理組（〇. 5 體重之kg，18隻大鼠） 藉由抽取的50%之動物全血來建立急性缺血性休克， 其估計為7. 4%之體重。在建立缺血性休克1〇分鐘後，將 32 201200526 醋酸林格氏溶液、動物自體的血液或〇. 5 g Hb/kg之熱穩 定經交聯的四聚體血紅素注入動物中。將熱穩定經交聯之 四聚體金紅素的注入速率設定為5 ml /小時，之後觀察所 有實驗動物24小時。在研究期間，觀察並分析一組參數， 包括存活 '血液動力學（hemodynamics)、心肌力學 (myocardial mechanics)、心輸出血量（cardiac output)、 心臟功能（cardiac function)、血中氣體（blood gas)、組 織氧氣傳送&消耗、組織灌注（tissue perfusion)&氧張力 (oxygen tens ion)(肝、腎與腦）、肝與腎功能、血液流變 學（hemorheology)(血液黏度）、與粒腺體呼吸控制率 (mitochondrial respiratory control rate)(肝、腎與 腦）。尤其是’存活率為主要目的。在24小時的觀察後， 與醋酸林格氏溶液或負控制組及自體血液組比較，熱穩定 經交聯的四聚體血紅素處理組具有高得多的存活率（如下 列表8中所示）。 表8

負控制組 大鼠自體血液 0. 5 g Hb/kg 熱穩定經交聯的四聚體 24小時存活率(%) 18.8

24小時後之存活齡曰 16隻大鼠中3隻 16隻大鼠中1〇隻 18隻大鼠中13隻 限制 關於各種實施例已描述前述發明， 。熟悉此技藝人士可瞭解為數眾多 這些 内。 變化與修飾考慮為 而這些實施例並非 的變化與修飾。將 i έ於下列申請專利範圍的範圍 33 201200526 【圖式簡單說明】 第1圖顯示不同之血紅素的胺基酸序列排比。 第2圖為一流程圖’其顯示本發明製程的概觀。 第3圖綱要性地顯示用於本發明製程中的一即刻細胞 溶解設備。 第4圖顯示（a)非經熱處理之經交聯的四聚體血紅 素’與（b)遭受90°C達45秒至2分鐘或8(TC達30分鐘之 熱處理之熱穩定經交聯之四聚體血紅素的高效能液相層析 分析。 第5圖顯示熱穩定經交聯之四聚體血紅素的電喷灑離 子化質譜（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS)分析。 第6圖顯示（a)經純化之血紅素溶液與熱穩定經 交聯之四聚體血紅素的環兩色相性光譜（circular dichroism spectroscopy)分析。 第7圖顯示在正常組織中之充氧的增進。ο.〗 g/kg之 熱穩定經交聯的四聚體血紅素溶液的注射導致在（A)血聚 血紅素濃度與（B)傳送至肌肉之氧氣方面的顯著增加。相 較於金漿血紅素程度，觀察到在充氧方面的顯著增加達到 一較長的時間期間。 第8圖顯示在缺氧腫瘤組織中之充氧的增進。〇.2g/kg 之熱穩定經交聯的四聚體血紅素溶液的注射導致在傳送至 頭頸鱗狀細胞癌（head and neck squamous ce 11 carei noma HNSCC)異體移植（xenograft)之氧氣方面的顯著增加。 34 201200526 第 9 圖顯示在（A)鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC)與（B)肝腫瘤之齧齒目動物模式中的部分腫瘤縮小 (tumor shrinkage)。 第10圖顯示在以熱穩定經交聯之四聚體血紅素處理 後於嚴重缺血性休克（hemorrhagic shock)之大鼠模式中 的平均動脈血壓變化。 第11圖為流動管柱層析之洗提輪廓；血紅素為在流出 部分組中。 第1 2圖綱要性地顯示用於工業規模操作之伴隨超過 濾的流動CM管柱層析系統。 第13圖為用於高溫短時間熱處理程序步驟之設備的 概要顯示。 第14圖顯示在高溫短時間處理設備中的溫度輪靡與 本發明在 8 5 °C 與 9 0 V $ μ· i χ C之此糸統中移除未穩定化之四聚體 (二聚體）所花費的時間。 1示在第13圖之高溫短時間處理設備中，在 阶與咖之系統中之變性血紅素形成的速率。 第16圖為用於太旅 、 …、穩定經交聯之四聚體血红素 之輸液袋的概要顯示。 【主要元件符號說明】 fe 〇 35

Claims (1)

1. 201200526 七、申睛專利範圍： 1·—種高度純化且熱穩定之含氧載體之藥學組成物的 製備方法’該含氧載體之藥學組成物包括血紅素，該血紅 素實質上係由非聚合之經交聯的四聚體血紅素所組成，該 方法包括： a) 提供哺乳動物全血，其包括至少紅血球與血漿； b) 在該哺乳動物全血中從該血漿分離該紅血球； c) 過遽從該血漿分離之該紅血球以獲得一經過濾之紅 血球部分組； d) π洗該經過濾之紅血球部分組以移除血漿蛋白質雜 質，產生經清洗的紅血球； e) 在一即刻細胞溶解設備中以5〇_1〇〇〇L/小時的低流 速藉由準確且經控制的低滲透壓裂解達2至30秒或其 他足夠以裂解該紅血球的一時間來使該經清洗的紅血球破 裂以產生一溶液，其包括經破裂之紅血球的一溶解產物； f) 執行過濾、以移除至少來自該溶解產物的無用阻留物 的一部份； g) 從該溶解產物萃取一第一血紅素溶液； h) 使用設置來移除相較於血紅素具有較高分子量之雜 質的-超過濾過濾器來執行一第一超過濾程序，以從該第 、素/合液更進步移除任何病毒與殘餘之無用阻留物 以獲得一第二血紅素溶液； υ對該第二血紅素溶液執行流動管柱層析以移除蛋白 質雜質以獲得一經純化之血紅素溶液； 36 201200526 j)使用設置來移除雜質並農 貝ι展％該經純化之血紅素溶液 的一第二超過濾過濾器來執 第二超過濾程序； k )藉由雙-3，5 -二溴皮媒| ，吴水杨基延胡索酸脂來使至少該血 紅素之次單元交聯以在— …、氧％境中形成經交聯之 血紅素，其中該經交聯之血红 、常為非I合之經交聯的四聚 體血紅素； 承 1)使該經父聯之血紅*盘— 京〃、—適合之生理緩衝溶液交 換； m )藉由切流式過淚來懿 木私除任何殘留之化學藥劑. 殘餘無氧環境中熱處理該經交聯之血紅素以使任何 殘餘之未經反應的血紅素、 任何i他鲂 穩疋化之血紅素（二聚體）與 仕何其他蛋白質雜質變性及 蛞六_ ^以便所產生之熱穩定之 心乂聯的四聚體血紅素且有一 實質η人 八有偵測不到的二聚體濃度，且 實質上係由非聚合之經交 11刃四汆體血紅素所組成； 〇)在熱處理該經交聯之 7艫苴上 聚體血紅素之後立即添加Ν- 乙醯基半胱氨酸以維持一 τ 低红度的變性血紅素； Ρ)藉由一離心哇_讲、.南< ^ 的溶液；以及 。“備來移除沈殿以形成-乾淨 f與熱穩定之經交聯的四聚體 樂學上可接受之載體。 芏 2.如申請專利範圍第j 含41項所叙向度純化且熱穩定之 <樂學組成物的製備方法，其甲該熱處理為— 間程序，其被執行於靖 了 時’接著立即冷卻，且在該冷卻之後立即添加二二 37 201200526 之量的該N-乙醯基半胱氨酸。 3. 如申請專利範圍第丨項所述之高度純化且熱穩定之 含氧載體之藥學組成物的製備方法，#中該全血為人類、 牛、豬、狗、馬的全血。 4. 如申請專利範圍第1項所述之高度純化且熱穩定之 含氧載體之藥學組成物的製備方法，纟中該管柱層析包括 一或更多之陽離子交換管柱或陰離子交換管柱。 5. 如申請專利範圍第4項所述之高度純化且熱穩定之 3氧載體之藥學組成物的製備方法，其中該陽離子交換管 柱或陰離子交換管柱為一或更多之DEAE管柱、CM管柱及/ 或羥磷灰石管柱。 6. 如申請專利範圍第1項所述之高度純化且熱穩定之 3氧載體之藥學組成物的製備方法，其中該藥學上可接受 之載體為一生理緩衝溶液或水。 7. 一種高度純化且熱穩定之含氧載體的藥學組成物， 包括血紅素，該血紅素實質上係由非聚合之經交聯的四聚 體血紅素所組成，該非聚合之經交聯的四聚體血紅素係由 申請專利範圍第1項之程序所形成。 8· —種高度純化且熱穩定之含氧載體之藥學組成物的 製備方法’該含氧載體之藥學組成物包括血紅素，該血紅 素實質上係由非聚合之經交聯的四聚體血紅素所組成，該 方法包括： a) 提供哺乳動物全血’其包括至少紅血球與血漿； b) 在該哺乳動物全血中從該血漿分離該紅血球； 38 201200526 C )過;慮彳At §亥血衆分離之該紅血球以獲得一經過淚之紅 血球部分組； d) 清洗該經過濾之紅血球部分組以移除血聚蛋白質雜 質’產生經清洗的紅血球； e) 在一即刻細胞溶解設備中以soq 〇〇〇L/小時的低流 速，藉由一準確且經控制的低滲透壓裂解達2至3〇秒或其 他足夠以裂解該紅血球的一時間來使該經清洗的紅血球破 裂以產生一；谷液，其包括經破裂之紅血球的一溶解產物； 〇執行過濾以移除至少來自該溶解產物的無用阻留物 的一部份； g) 從該溶解產物萃取一第一血紅素溶液； h) 使用設置來移除相較於血紅素具有較高分子量之雜 +视订一第一超過濾程序，以從該第 步移除任何病毒與殘餘之無用阻留物 質的一超過濾過濾器來執行—第 一血紅素溶液更進一步移玲 以獲得一第二血紅素溶液； 1)對β玄第一血紅素溶液執行流動管柱層析以移除蛋白 質雜質以獲得一經純化之血紅素溶液；

   1)使該經交聯之血紅素與 一無氧環境中形成經交聯之 ‘之經交聯的四聚體血紅素； [一適合之生理缓衝溶液交 39 201200526 m)藉由切流式過濾來移除任何殘留之化學藥劑； η)以約9(TC至95°C的溫度熱處理該經交聯之血紅素 以使任何殘餘之未經反應的血紅素、未穩定化之血紅素（二 聚體）與任何其他蛋白質雜質變性及沈澱，以便所產生之熱 穩定之經交聯的四聚體血紅素具有一偵測不到的二聚體濃 度且實質上係由非聚合之經交聯的四聚體血紅素所組成， 並且立即冷卻至約2 5； 〇)在熱處理該經交聯之四聚體血紅素之後立即添加N — 乙醯基半胱氨酸以維持一低程度的變性血紅素； P)藉由一離心或一過濾設備來移除沈澱以形成一乾淨 的溶液；以及 q)將該經純化與熱穩定之經交聯的四聚體血紅素加至 一藥學上可接受之載體。 ” 之高度純化且熱穩定之 ’其中該熱處理係執行 9·如申凊專利範圍第8項所述 含氧載體之藥學組成物的製備方法 於一無氧環境中。 10.如申請專利範圍第8項所述之高度純化 夕入备共丨心 < 冋厌死亿且熱希 之a氧载體之藥學組成物的製 3〇 侑方法，其中執仃該熱肩 ”至广時’接著立即冷卻，且在該冷卻之後立即, .〇.4%之量的該N-乙醯基半胱氨酸。 11. 如申請專利範圍第8項所、— Λ 7 之含氧都# 斤述之向度純化且熱稽 之a氧載體之藥學組成物的 Μ . 4,认 展備方法，其中該全血為 類牛、豬、狗、馬的全血。 12. 如申請專利範圍第8項 > 斤述之向度純化且熱稽 40 201200526 之含氧載體之藥學組成物 括一或更多之陽離子交換 的製備方法，其中該管柱層析包 官柱或陰離子交換管柱。 13.如申請專利範圍第] 2項所述之高度純化且熱穩 之含氧載體之藥學組成物的制 、‘“ 〕I備方法，其中該陽離子交換 管柱或陰離子交換管柱為—# ^ 、 或更多之DEAE管柱、CM管柱 及/或羥磷灰石管柱。 14. -種高度純化且熱穩定之含氧載體的藥學組成 物，包括血紅素，該血紅素實質上係由非聚合之經交聯的 聚體、.X素所組成，該非聚合之經交聯的四聚體血红素 係由申請專利範圍帛8項之程序所形成。 …' 15 ·-種鬲度純化且熱穩定之含氧載體之藥學組成物 的製備方法’該含氧載體之藥學組成物包括血紅素，該血 紅素實質上係由非聚合之經交聯的四聚體血紅素所組成， 該方法包括： a) 提ί、甫乳動物全血，其包括至少紅血球與血漿； b) 在該哺乳動物全血中從該血漿分離該紅血球； c) 過濾從該血漿分離之該紅血球以獲得一經過濾之紅 血球部分組； d) 清洗該經過濾之紅血球部分組以移除血漿蛋白質雜 質’產生經清洗的紅血球； e) 在—即刻細胞溶解設備中以5〇-i〇〇〇l/小時的低流 速’藉由一準確且經控制的低滲透壓裂解達2至3〇秒或其 他足夠以裂解該紅血球的一時間來使該經清洗的紅血球破 裝以產生一溶液’其包括經破裂之紅血球的一溶解產物； 41 201200526 f) 執行過濾、以移除至少來自解 的一部份； 解座物的無用阻留物 g) 從該溶解產物萃取-第-金紅素溶液； h) 使用設置來移除相較於血紅素具有較高分 質的一超過細器來執行-第-超過渡程序，以從該第 一血紅素溶液更it —步移除任何 以獲得-第二血紅素溶液；毒與殘餘之無用阻留物 質雜1質)對：第二血紅素溶液執行流動管柱層析以移除蛋白 質雜質以獲得-經純化之血紅素溶液； j)使用設置來移除雜暂廿，曲& 除雜質並濃縮該經純化之血紅素溶液 第:超過慮過遽器來執行一第二超過濾程序； )藉由雙3’5-_溴水揚基延胡索酸脂來使至少該血 素之α α _人早兀父聯以在一無氧環境中形成經交聯之 血紅素，#中該經交聯之血紅素為非聚合之經交聯的四聚 體血紅素； )使H交聯之血紅素與—適合之生理緩衝溶液交 換； m)藉由切流式過濾來移除任何殘留之化學藥劑； 、“將N-乙醯基半胱氨酸加至該經交聯之四聚體血紅素 並在一無氧環境下以約7〇它至95t的溫度熱處理該經交 聯之血紅素以使任何殘餘之未經反應的血紅素、未穩定化 ’工素（—聚體）與任何其他蛋白質雜質變性及沈澱，以 更斤產生之熱穩$之經交聯白勺㈤#體血紅素具有一偵測不 J勺聚體;農度且實質上係由非聚合之經交聯#日聚體血 42 201200526 紅素所組成； 〇)在熱處理該經交聯之四聚體血紅素之後立即添加N-乙醯基半胱氨酸以維持_低程度的變性血紅素； P)精由一離心或_過濾設備來移除沈澱以形成一乾淨 的溶液；以及 Q )將該經純化愈斂籍中 ^ ......&疋之經父聯的四聚體血紅素加至 —藥學上可接受之載體。 16·如申請專利範圍第15項所述之高度純化且熱穩定 =氧載體之藥學組成物的製備方法，其中執行該熱處理 ^至3小時’接著立即冷卻至饥，且在該冷卻之後立 P添加。.2至。.4%之量的該N_乙醯基半胱氨酸。 如中請專㈣圍第15項所述之高度純化且熱穩定 之3氧載體之藥學組成物 N 備方法，其中在熱處理前之 酿基半耽氨酸的添加係以約0.2%之量。 1 8.如申請專利範圍第 b項所述之尚度純化且熱穩定 夂载體之藥學組成 類、半祕 '的製備方法，其中該全血為人 顯牛、豬、狗、馬的全血。 19· 一種高度純化且埶 ^ , ‘、，、L疋之含氧載體的藥學組& 物，包括血紅素，該血紅素 戍 四帑俨主 ，、貫質上係由非聚合之經交聯的 I體血紅素所組成，該 %合之經交聯的四聚體血紅素 “利_ 15項之程序所形成。 43