TW201209406A - Test module with microfluidic device having LOC and dialysis device for separating pathogens from other constituents in a biological sample - Google Patents

Description

201209406 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於採用微系統技術（MST )之診斷裝置。 更詳細地，本發明係關於用於分子診斷學之微流體的及生 化的處理及分析。 【先前技術】

分子診斷學已然興起成爲一種保證能在疾病症狀顯現 前即有效地早期偵測疾病之領域。分子診斷性測試可用來 偵測： •遺傳性疾病 •後天罹患之疾病 •感染性疾病 •易感染健康相關疾病之遺傳素質 由於分子診斷性測試具有高度精確性及快速週轉期， 故而有潛力可減少無效健康照護服務之發生、增進醫療成 效、改善疾病管理及提供個體化之患者照護。分子診斷學 之許多技術係基於對從生物樣本（例如血液或唾液）萃取 及擴增之特定核酸（包括去氧核糖核酸（DNA)及核糖核 酸（RNA )兩者）進行偵測及鑑定。核酸鹼基之互補特性 允許合成之DNA短序列（寡核苷酸）結合（雜合）到用於 核酸測試之特殊核酸序列上。若發生雜合，則互補序列會 出現在試樣中。如此一來，會令例如預測某人在未來可能 會發生的疾病、確定感染性病原體之身份及致病性、或者 -5- 201209406 確定某人對一藥物將有之反應等成爲可能。 以核酸爲基礎之分子診斷性測試 以核酸爲基礎之測試具有四個明確步驟： 1. 試樣製備 2. 核酸萃取 3 ·(任意地）核酸擴增 4.偵測

許多試樣類型可用於基因分析，例如血液、尿液、痰 及組織試樣。由於並非所有試樣皆可代表疾病進程，所以 該診斷測試可決定所需之試樣類型。此等試樣具有多種不 同組成，不過通常僅有一種組成受到關注。舉例來說，血 液中紅血球濃度高會抑制對病原性有機體之偵測。因此， 在核酸測試開始時通常會需要進行純化及/或濃縮步驟》

血液爲一種較常採用之試樣類型。它具有三個主要的 成分：白血球（白細胞）、紅血球（紅細胞）及凝血細胞 (血小板）。凝血細胞可促進凝血且在細胞外仍有活性》 爲了抑制血液凝集，試樣在進行純化及濃縮之前會先混入 化學劑如乙二胺四乙酸（EDTA )。通常會把紅血球從試 樣中除去以濃縮目標細胞。於人類，紅血球約占血液細胞 物質之約99%，不過由於其不具細胞核所以不帶DNA »再 者，紅血球含有某些成分例如血紅素會干擾下游核酸擴增 過程（下文將予以說明）。除去紅血球一事可藉由以胞溶 溶液有區別地胞溶紅血球而保留其它細胞物質完整，然後 -6- 201209406 利用離心把完整之細胞物質從試樣中分離出來而達成。如 此可提供目標細胞之濃縮液且從該等濃縮液中萃取出核酸

用來萃取核酸之明確操作流程將視該試樣及欲進行之 診斷檢定而定。舉例來說，用來萃取病毒RN A所用之操作 流程就與用來萃取基因組DN A之操作流程顯著不同。然而 ，從目標細胞萃取核酸通常涉及了先進行細胞胞溶步驟， 接著再核酸純化。該細胞胞溶步驟會瓦解細胞及細胞膜， 釋出遺傳物質。此舉通常會使用胞溶清潔劑例如十二烷基 硫酸鈉來完成，其亦可令細胞內存在之大量蛋白質變性。 而後該核酸可用醇類（通常爲冰·冷卻乙醇或異丙醇 )沉澱步驟或者透過固相純化步驟來純化，該固相純化步 驟典型地係於氧化矽基質於管柱、樹脂或順磁性珠粒於存 在高濃度離液鹽下進行，接著清洗，而後以低離子強度緩 衝液來溶離。在核酸沉澱前之一任意步驟爲可添加蛋白酶 ，其可消化蛋白質以進一步純化試樣。 其它胞溶方法還包括透過超音波振盪之機械性胞溶及 把試樣加熱到94°C來瓦解細胞膜之熱胞溶。 已萃取的材料中可還含有極少量之目標DN A或RN A， 尤其是當該目標物係來自致病來源時更常如此。核酸擴增 法提供把低濃度之特定目標物選擇性地擴增（即複製）到 可偵測程度之濃度的能力。 最常使用之核酸擴增技術爲聚合酶連鎖反應（PCR) 。PCR已爲此領域所習知且此類型反應之詳細說明可見於 201209406 E. van Pelt-Verkuil et al., Principles and Technical Aspects of PCR Amplification, Springer, 2008。 PCR爲一種效力強大的技術，其可於複雜的DNA背景 中擴增一目標DNA序列。如果想要（藉著PCR )擴增RNA ，則必需先用被稱爲反轉錄酶之酵素來把RNA轉錄成 cDNA (互補DNA)。然後，所製成的cDNA再用PCR來擴 增。 PCR爲一種指數過程，只要支持該反應之條件允許， 該過程就會持續進行下去。該反應之成分有：

1. 引子對：其爲與目標序列之側翼區互補且長約10-30個核苷酸之單股短DNA 2. DNA聚合酶：一種能合成DNA之耐熱酶 3. 去氧核糖核苷三磷酸（dNTPs):提供倂入新合成 之DNA股之核苷酸 4-緩衝液：提供DNA合成之最佳化學環境 PCR典型地涉及把此等反應物加到含有萃取出之核酸 的小管（〜10_50微升）中。把該小管放到熱循環器（一種 裝置，其能讓反應在一系列不同溫度下反應不同長短的時 間）內。各個熱循環的標準操作流程涉及了變性期、結合 期及延伸期。延伸期有時被稱爲引子延伸期。除了這種三 步驟流程以外，也可採用兩步驟之熱流程，於此類流程中 是把結合期及延展期合倂。變性期典型地涉及把反應溫度 升高到90-95 t以令DNA股變性；於結合期，溫度會被降 到約50-60 °C好讓引子結合；然後於延伸期，溫度會被升 201209406 高到最適合DNA聚合酶活動之60-72 °C以供引子延伸。此 過程會反覆循環約20-40次，最終的結果爲製造出數百萬 個兩引子之間的目標序列拷貝。 還有許多相對於該PCR標準流程之變化流程，其中有 例如多重PCR、連接子-帶頭（linker-primed) PCR、直接 PCR、串聯PCR、即時PCR及逆轉錄酶PCR等，其現已發展 出來用於分子診斷上。

多重PCR係在單一PCR混合物中使用多個引子組以製 造對不同DNA序列特異之不同長短之擴增子。藉著同時瞄 準多個基因，可於單一測試-操作時得到更多的資訊，否 則會需要進行數個實驗才行。不過多重PCR的最適化更爲 困難且需要選取具有相似結合溫度之引子、具有類似長度 及鹼基組成之擴增子以確保各擴增子之擴增效能係相等的 連接子-帶頭PCR (亦以接合連接子PCR爲人習知）爲 一種無需目標-特異性引子就能使複雜的DNA混合物中基 本上所有的DN A序列皆可進行核酸擴增之方法。該方法涉 及了首先先用適當的限制性內切酶（酵素）來消化目標 DN A族群。然後把具有適當懸垂端之雙股寡核苷酸連接子 (亦稱爲連接子）用接合酶酵素接合到目標DN A片段之末 端上。接著使用對該連接子序列特異之寡核苷酸引子來進 行核酸擴增。藉著此種方式，由連接子寡核苷酸包夾之所 有DNA源片段皆可被擴增。 直接PCR描述一種未進行任何核酸萃取或僅有些微核 201209406

酸萃取就直接在試樣上進行PCR之系統。人們早已同意未 純化之生物試樣內有多種成分（例如血液內的血紅素成分 )會抑制P C R反應。傳統地，P C R在製備反應混合物前需 要先把目標核酸徹底純化。然而，藉著適當的改變化學性 質及試樣濃度，可在僅有極少DNA純化下進行PCR或直接 作PCR。直接PCR對PCR化學性質之調整包括增加緩衝液 強度、使用具有高活性及連續效能之聚合酶以及加入能螯 合可能的聚合酶抑制劑之添加劑。

串聯PCR係採用兩個獨立場次之核酸擴增反應以增加 對的擴增子被擴增的可能性。串聯PCR的一種形式爲巢床 (nested) PCR，其係使用兩對PCR引子於各別的核酸擴增 場次中擴增單一基因座。第一對引子會雜合到位於該目標 核酸序列外之區域之核酸序列上。第二輪擴增所用之第二 對引子（巢床引子）會結合到該第一 PCR產物內且製造出 含有該目標核酸之第二PCR產物，它會比第一PCR產物更 短。此策略背後的邏輯爲：如果在第一輪核酸擴增反應中 有不正確的基因座錯誤地被擴增，那麼該基因座被第二對 引子再次擴增的可能性會極低，如此一來即可確保其特異 性。 即時PCR或者定量PCR係用來測量pcr產物的即時量 。藉著使用含有螢光團之探針或螢光染料以及一組反應標 準物，可以定量試樣中核酸的初始量。此舉對於分子診斷 特別有用，因爲於分子診斷中治療方案將因試樣內之病原 體載量（pathogen load)而異。 -10- 201209406 逆轉錄酶PCR(RT-PCR)係用來從RNA擴增DNA。逆 轉錄酶爲一種能把RNA逆轉錄成互補DNA(cDNA)之酵素 ，該cDNA而後藉著PCR擴增。RT-PCR廣泛地用於基因表 現特徵描繪，用來決定基因表現或鑑定RNA轉錄物之序列 ，包括轉錄起始及終止位點。其亦可用來擴增RNA病毒像 是人體免疫缺損病毒或C型肝炎病毒。

等溫擴增是另一種核酸擴增形式，其擴增反應不靠目 標DN A之熱變性，所以不需要複雜的機械裝置。故而等溫 核酸擴增法可在原位進行或者於實驗室外的環境中輕易地 操作。已有多種等溫核酸擴增方法被描述，包括股置換擴 增法、轉錄媒介擴增法、核酸序列爲主擴增法、重組酶聚 合酶擴增法、滾環式擴增法、網狀分枝擴增法、解旋酶-依賴等溫DN A擴增法及環媒介等溫擴增法。 等溫核酸擴增方法不靠著對模板DN A持續加熱變性來 製造當作進一步擴增之模板之單股分子，而是於恆定溫度 下靠著其它方法例如利用特異限制性內切酶以酵素於DN A 分子上切出缺口，或使用酶來使DN A股分離。 股置換擴增法（SDA )係靠著特定的限制性內切酶於 半-修飾DNA中未修飾的那股切出缺口之能力以及5’-3’外 切酶-缺損聚合酶其延展及置換下游股鏈之能力。指數性 核酸擴增係藉著結合有意義反應及反意義反應來達成，其 中有意義反應股置換（得到之序列）會被當作反意義反應 之模板。此反應係採用切口酶（其不以傳統的方式切斷 DNA，而是在雙股DNA其中的一股切出缺口），例如N. -11 - 201209406

Alwl、N. BstNBl及Mlyl。SDA已藉著使用一熱穩定限制 性內切酶（Jval)及熱穩定外切酶缺損-聚合酶聚合 酶）之組合來改良。此組合顯示出能使擴增1 〇8倍之反應 的擴增效能增加到擴增1 〇1(1倍，故而可使用此一技術來擴 增獨特的單拷貝分子。

轉錄媒介擴增法（TMA)及核酸序列爲主之擴增法（ NASBA )係使用RNA聚合酶來複製RNA序歹IJ而非對應的基 因組DNA。此技術會使用兩個引子及兩或三種酶：RNA聚 合酶，逆轉錄酶及任意地RNase H(若該逆轉錄酶不具有 RNase活性）。一引子含有RNA聚合酶之啓動子序列。於 核酸擴增之第一步驟中，此引子會雜合到該目標核糖體 RN A ( rRNA )之一既定位點。逆轉錄酶可藉著從該啓動子 引子之3'端延伸來製造出目標rRNA之DNA拷貝。於產生之 RNA : DNA雙股體中該RNA會被逆轉錄酶擁有的RNase活 性或者添加的RNase Η分解掉。接著，讓第二引子結合到 該DN Α拷貝上。一股新的DNA股藉著逆轉錄酶從該引子之 末端合成，而形成雙股DNA分子。RNA聚合酶可辨識出 DN A模板內的啓動子序列且引發轉錄。每一個新合成的 RNA擴增子會再—進入此過程且作爲新一輪複製的模板。 於重組酶聚合酶擴增法（RPA )中，特異DNA片段之 等溫擴增係藉著讓相反的寡核苷酸引子結合到模板DN A上 且藉著DN A聚合酶之延長作用而達成。不需使用熱來令該 雙股DNA ( dsDNA )模板變性。替代地，RPA係採用重組 酶-引子複合體來掃描dsDN A且促進同源位點之股交換。生 -12- at . - 201209406 . • - ·. V.· 成的結構會藉著單股DNA結合蛋白與被置換之模板股間的 交互作用穩定下來，如此可防止引子因分支遷移而被逐出 。分解酶的拆解作用留下了親股置換性DNA聚合酶之寡核 苷酸（例如枯草芽孢桿菌·δα£^·//Μ·ϊ Pol I ( Bsu)之 大片段）的3’端，接下來引子會延伸。指數性核酸擴增可 藉著循環地重覆此過程來完成。

解旋酶-依賴擴增法（HDA )係模擬活體系統，使用 DN A解旋酶來生成供引子雜合之單股模板且接著用DN A聚 合酶令引子延伸。於HAD反應之第一步驟中，該解旋酶會 沿著該目標DN A移動，瓦解連接兩股的氫鍵，爾後分離的 兩股會與單股結合蛋白結合。經解旋酶暴露出來之單股目 標區域允許引子結合。而後該DN A聚合酶會使用游離的去 氧核糖核苷三磷酸（dNTPs)從各引子之3’端延伸而形成 兩個DN A複製體。這兩個複製的dsDN A股會各別地進入下 一個HAD循環，造成該目標序列之指數性核酸擴增。

其它以DN A爲基礎之等溫技術包括滾環式擴增法（ RCA ) ’其中該DNA聚合酶可讓引子沿著環狀的DNA模板 不斷地延伸，而產生含有許多個環狀模板之重複拷貝之長 條DN A產物。在反應結束時，該聚合酶可生成數千個環狀 模板的拷貝，且此拷貝鏈會與原本的目標DNA繫在一起。 此舉可供該目標物作空間解析以及信號之快速核酸擴增。 在1小時內可產生高達101 2個模板拷貝。網狀分支擴增爲— 種RC A的變化’其採用閉鎖的環狀探針（C_探針）或鎖式 探針及具有高連續效能之DNA聚合酶於等溫條件下指數性 -13- 201209406 地擴增該C-探針。

環媒介等溫擴增法（LAMP )具有高選擇性且採用 DNA聚合酶及一組經過特別設計、可辨識該目標DNA上總 共六個獨特序列之四個引子。一個含有該目標DN A之有意 義股及反意義股序列之內引子能引發LAMP。後續由一外 引子帶頭之股置換DNA合成作用則釋放了單股DNA。此等 單股DN A可當作第二內引子及外引子（其雜合到該目標序 列的另一端）帶頭之DN A合成之模板，其可形成莖環狀 DNA結構。在接下來的LAMP循環中，一內引子會雜合到 該產物的環上且引發置換DN A合成反應，產生原本的莖環 狀DNA及新的莖環狀DNA (其莖長爲原本之兩倍）。該循 環反應持續著且不到一個小時即可累積1〇9個目標物拷貝 。終產物爲具有數個目標物倒置複本及具有多環類花椰菜 結構（其係由目標物同一股內交錯倒置之複本相互結合所 形成）之莖環狀DNA。

在核酸擴增完成後，擴增產物必需加以分析以確定是 否已產生所需的擴增子（目標核酸之擴增量）。分析產物 的方法從簡單地透過凝膠電泳測定擴增子大小到使用DNA 雜合鑑定該擴增子之核苷酸組成。 凝膠電泳爲一種檢查核酸擴增反應是否產生所需擴增 子之最簡單的方法。凝膠電泳會對凝膠基質施加電場來讓 DNA片段分離開來。帶有負電荷之DNA片段會以不同速度 (主要是由其大小來決定）於該基質上移動。當電泳結束 後，可將凝膠內的片段染色令其肉眼可見。溴化乙錠爲一 -14- 201209406 種常用染料，其於UV光線下會發出螢光。

該等片段之大小係與DNA尺寸標準參照物（DNA階梯 ，其含有已知大小之DNA片段）比對來決定，，該等參照物 會置於擴增子旁與其同時跑膠。因爲該寡核苷酸引子係結 合到包夾該目標DNA之特異位點上，所以該擴增產物的大 小可藉著凝膠上已知尺寸大小的譜帶來預估及偵測。爲了 可靠地鑑定該擴增子，或者是如果同時產生多個擴增子， 那麼通常會用DNA探針雜合該擴增子。 DNA雜合係指藉著互補鹼基的配對反應來形成雙股 DNA。用來正面鑑定一特異擴增產物所用之DNA雜合反應 需要使用長度約20個核苷酸長之DNA探針。如果該探針的 序列係與該擴增子（目標）DN A序列互補，那麼雜合反應 會在溫度、pH及離子強度之有利條件下發生。如果雜合發 生了，表示受到關注的基因或DN A序列已出現在原始試樣 中0 光學偵測爲偵測雜合最常用的方法。擴增子或探針皆 可透過螢光或電化學發光來標記而放射出光線。此等方法 對於怎樣製造發光基團激發狀態之方式有所不同，不過兩 者都能共價標記核苷酸股鏈。於電化學發光（ECL )，光 線係在發光團分子或錯合物受到電流刺激後產生》於螢光 ，係使用能導致放射反應之激發光來照射。 螢光係使用一照明源（其能提供可被螢光分子吸收之 波長的激發光）及一偵測單元來偵測。該偵測單元包括一 能偵測放射信號之光感測器（例如光電倍增管或電荷耦合 -15- 201209406 裝置（CCD )陣列），以及防止激發光被含納於光感測器 輸出之機制（例如波長-選擇濾波器）。該螢光分子會對 激發光反應而放射出斯托克斯頻移光線，此放射光線會被 偵測單元匯集。斯托克斯頻移爲放射光線與被吸收之激發 光間的頻率差異或波長差異。

ECL發光係使用對所採用之ECL物種之放射波長敏感 之光感測器來偵測。舉例來說，過渡金屬-配體錯合物會 放射出可見光波長之光線，因此可採用傳統的光二極體及 CCD當作光感測器。ECL的一項優點爲：若排除掉周圍光 線，那麼ECL發光會是偵測系統中唯一存在的光線，其可 增進偵測敏感度。

微陣列允許同時進行數百或數千個DN A個雜合實驗。 微陣列爲分子診斷學中有力的工具，其可於單一測試中篩 選數千種疾病或偵測多種感染性病原體之存在。微陣列係 由許多固定在基材上、呈斑點狀之不同DN A探針所組成。 該目標DN A (擴增子）首先會先用一螢光或發光分子（可 於核酸擴增期間或之後）標記，然後施加到探針陣列中。 將該微陣列培育於控制溫度、潮溼的環境下數小時或數天 ，於這段期間探針與擴增子間會發生雜合。培育之後，必 需用一系列緩衝液來沖洗該微陣列以除去未結合之股鏈。 一旦清洗完畢，就用空氣注（通常爲氮氣注）來把微陣列 表面吹乾。雜合及清洗的嚴格性爲嚴苛程度。嚴格性不夠 會造成高度的非特異性結合。過度嚴格會導致無法適當地 結合，使得敏感度降低。雜合係透過已標記擴增子（其已 -16- 201209406 與互補探針形成雜合體）之光線放射來偵測。 微陣列發出之螢光會使用一微陣列掃描器來偵測，該 微陣列掃描器通常爲電腦控制之倒立式掃描性螢光共軛焦 顯微鏡，其典型地會使用雷射來激發螢光染料及使用光感 測器（例如光電倍增管或CCD )來偵測發射信號。該螢光 分子會放射出斯托克斯頻移光線（如上所述），其會由偵 測單元予以匯集。

放射出的螢光必需予以匯集、將其與未吸收之激發光 波長分離開來且傳輸到偵測器。於微陣列掃描器中經常採 用共軛焦設計，藉著位於影像平面上的共軛焦針孔來除去 離焦資訊。此舉只容許對焦部份的光線被偵測。避免來自 物件焦距平面上方及下方之光線進入偵測器，藉此提高信 號對雜訊之比率。偵測到的螢光光子會被偵測器轉化成電 能，接著再轉化成一數位訊號。此數位訊號會譯成代表一 既定像素之螢光強度的數字。該陣列之每一特性皆由一或 多個此等像素所組成。掃描的最終結果爲陣列表面的影像 。微陣列上之各個探針的確切序列及位置乃爲已知，因此 可同時鑑定及分析該等雜合之目標序列。 更多關於螢光探針之資訊可見於： http : "www.premierbiosoft.com/tech_notes/FRET_ probe, html以及 http : "www.invitrogen.com/site/us/en/home/

References/Molecular-Probes-The-Handbook/Technical-

Notes-and-Product-Highlights/Fluorescence- Resonance- 201209406

Energy-Transfer-FRET. html 定點照護之分子診斷學

雖然分子診斷測試能提供這些好處，不過臨床實驗室 內此類型測試之增長卻比預期要慢且實驗室醫藥實務中此 等測試只佔極少部份。此主要是由於使用核酸之測試相較 於不涉及核酸之其它測試方法要更複雜且更昂貴》在臨床 環境中欲廣泛地採用分子診斷測試則與裝備儀器的開發密 切相關，該等裝備儀器必需能顯著地降低費用、提供從頭 (試樣加工）到尾（產生結果）快速且自動化的檢定，且 其無需大量人力干涉操作。 用以服務醫生診所、醫院臨床或甚至於用戶爲主的居 家場所之定點照護技術具有許多好處，包括： •可快速獲得結果，致使得以立即治療及改善照護品 質》

•只需測試極少試樣即可獲得實驗室品質之測試結果 之能力。 •減輕臨床工作量。 •減少實驗室負荷及藉著減少行政工作增進辦公效能 •透過縮短滯院時間、首次就醫門診諮詢獲至結論所 需時間以及減少樣本處理、儲存及運輸時間來改善每名患 者之治療成本。 •加快達到臨床治理結論例如感染控制及抗生素使用 -18- 201209406 以晶片上實驗室（LOC)爲基礎之分子,診斷學

以微流體技術爲基礎之分子診斷系統提供了能自動操 作且加速分子診斷檢定之裝置。更快速的偵測時間主要是 基於涉及之體積極小、採自動化操作及該微流體裝置之診 斷流程步驟爲低開銷內建級聯。體積爲奈升及微升規模亦 減少了試劑耗損及成本。晶片上實驗室（L 0 C )裝置爲一 種常見的微流體裝置之形式。LOC裝置具有整合於單一支 撐基材（通常爲矽）上之MST層內之MST結構（用來進行 流體處理）。使用半導體工業之VLSI (極大規模積體化） 蝕刻技術來製造可使LOC裝置之單位成本很低。然而，欲 控制流體流經該LOC裝置之流動、添加試劑、調控反應條 件等等則需要龐大的外接管路及電子器件。事實上把LOC 裝置連接到此等外部裝置限制了分子診斷用之LOC裝置在 實驗室環境的應用。此等外部設備之成本及其操作的複雜 性使得以LOC-爲基礎之分子診斷無法成爲定點照護設備之 實用方案。 基於以上觀點，人們需要一種能用於定點照護之LOC 裝置爲主之分子診斷系統。 【發明內容】 發明槪述 本發明之不同態樣描述於以下編號的段落中。 -19- 201209406 GBS005.1本發明之此態樣係提供一種用於試樣流體 之診斷分析之微流體裝置，該微流體裝置包含： 複數個晶片上實驗室（LOC )裝置，各裝置皆具有一 支撐基材及一用來處理該試樣流體之微系統技術（MST ) 層；及

一與該複數個LOC裝置互連之頂蓋，該頂蓋具有一用 來與至少兩個LOC裝置上之MST層間建立流體連通之頂蓋 通道。 GBS005.2 較佳地，各LOC裝置中之MST層界定有至 少一用來處理該試樣流體之微通道，且該頂蓋被配置成能 在一LOC裝置之一微通道與至少另一 LOC裝置之一微通道 間建立流體連接。 GBS005.3較佳地，該頂蓋被配置成能藉著毛細作用 於諸LOC裝置間拉引液流。

GBS005.4較佳地，該頂蓋具有一與該頂蓋通道流體 連通之貯存器，該貯存器被配置成能藉著試劑彎液面之表 面張力來留住試劑。 GBS005.5 較佳地，該複數個LOC裝置乃爲第一 LOC 裝置及第二LOC裝置，該第一 LOC裝置具有一透析區，其 能接受試樣且把大於閾値尺寸之成分與小於閩値尺寸之成 分分離開來。 GBS005.6較佳地，該透析區具有相當於該閾値尺寸 之小孔且大於該閾値之成分包括白血球及小於該閾値之成 分包括病原體。 -20- 201209406 GBS005.7較佳地，該第二LOC裝置具有一含有探針 核酸序列之雜合區’該探針核酸序列能與試樣中之目標核 酸序列雜合而形成探針-目標物雜合體，該雜合區被配置 成能偵測該探針-目標物雜合體。 GBS005.8較佳地，該頂蓋具有一層狀結構且頂蓋通 道於其中一層內形成而貯存器則於另—相鄰層中形成。

GBS005.9較佳地，該層狀結構包括一用來於該頂蓋 通道及諸LOC裝置間建立流體連通之界面層。 GBS005.10較佳地，該第二LOC上之MST層具有一阻 滯試樣從MST通道往頂蓋通道流動之活性閥，直到該活性 閥被啓動才允許試樣重新流動。 GBS 005.il較佳地，該試樣爲血液且貯存器內之試 劑爲抗凝血劑且頂蓋被配置成能在血液進入該透析區前先 讓該抗凝血劑與血液相混合。 GBS 00 5. 12較佳地，該微流體裝置還具有一胞溶區 ，其與含有胞溶試劑之胞溶試劑貯存器流體連通，該胞溶 區被配置成能胞溶細胞及釋出其內之基因物質。 GBS 005.1 3較佳地，該微流體裝置還具有一用來擴 增流體內核酸序列之核酸擴增區。 GBS 005.14較佳地，該核酸擴增區爲聚合酶連鎖反 應（PCR)區且該頂蓋具有一含有dNTPs及引子之pCR試劑 貯存器以在擴增該核酸序列之前先把該等PCR試劑與試樣 混合在一起。 GBS00 5.1 5較佳地，該頂蓋具有一含有聚合酶之聚 -21 - 201209406 合酶貯存器以在擴增該核酸序列之前先把該酶與流體混合 0 GBS005.1 6較佳地’該微流體裝置還有CMOS電路， 其位於該支撐基材與M S T層之間以操作性地控制該p c r區

GBS005.1 7較佳地，該微流體裝置還有—具有雜合 室之雜合區，該等雜合室內含有能結合到該流體內之目標 核酸序列上之探針核酸序列。 GBS005.18較佳地，該探針核酸序列包含電化學發 光共振能量轉移（ERET)探針。 GBS005.1 9較佳地，各雜合室具有一能偵測ERET探 針發光之光二極體，該發光係ERET探針與目標核酸序列 結合時產生之反應。 GBS005.20較佳地，該微流體裝置還有複數個用來 控制試樣溫度之加熱器。

多重表面-微機電晶片（Multiple surface-micromachined chips)被流體地整合以提供更充份及更進 步之功能性。該微流體多晶片組件可提供更高模組性。該 組件內之表面微機電晶片比起能提供該組件所有功能之單 體晶片要小得多且不成比例地便宜許多。採用功能最佳的 較便宜製程以製造該微流體多晶片組件之各個表面-微機 電晶片之構成部份，例如唯-bioMST透析晶片可省略所有 CMOS製程步驟及可採用廉價的玻璃晶圓。 GB S006.1本發明之此態樣提供一種測試模組，其包 -22- 201209406 含： 一可供手持攜帶之外殼； 一用以收納試樣流體之貯槽；及 一與置入口流體連通之微流體裝置，該微流體裝置具 有複數個晶片上實驗室（LOC )裝置以及一與各LOC裝置 關係密切之頂蓋；其中 該頂蓋被配置成能於至少兩個LOC裝置間建立流體連

通。 GBS006.2較佳地，各LOC裝置皆具有一支撐基材及 —位於該支撐基材上之微系統技術（MST )層及一覆蓋在 該MST層上之頂蓋，該MST層倂有諸MST通道及複數個與 該頂蓋流體連通之流體連接件（fluidic connections)且該 頂蓋具有與各LOC裝置之流體連接件流體連通之頂蓋通道 GBS006.3較佳地，該試樣流體爲生物試樣且各MST 通道皆有1平方微米到400平方微米大小之橫切面積以生化 處理該生物試樣內之諸成分，各頂蓋通道皆有大於400平 方微米之橫切面積以接受生物試樣及把生物試樣內之細胞 運送到MST通道內之既定部位。 GBS006.4較佳地，該外殼具有一刺血針以刺扎病患 手指以取得加到該.試樣置入口之血液試樣。 GBS 006.5較佳地，該刺血針可在壓縮及伸展位置間 切換，該外殼具有一偏動機構可使該刺血針偏移到伸展位 置，以及一使用者啓動掣（user actuated catch )用來把刺 -23- 201209406 血針收回壓縮位置直到使用者再度啓動爲止。 GBS006.6較佳地，該頂蓋被配置成能藉著毛細作用 驅使液流流經諸頂蓋通道。 GBS006.7較佳地，該頂蓋具有一與頂蓋通道流體連 通之貯存器，該貯存器被配置成能透過試劑彎液面之表面 張力來留住試劑。

GBS006.8較佳地，該複數個LOC裝置乃爲第一 LOC 裝置及第二LOC裝置，該第一 LOC裝置具有一透析區，其 能接受試樣且把大於閾値尺寸之成分與小於閾値之成分分 離開來。 GBS0 06.9較佳地，該透析區具有相當於該閩値尺寸 之小孔且大於該閩値之成分包括白血球及小於該閩値之成 分包括病原體。

GBS006.1 0較佳地，該第二LOC裝置具有一含有探針 核酸序列之雜合區，該探針核酸序列能與試樣中之目標核 酸序列雜合以形成探針-目標物雜合體，該雜合區被配置 成能偵測該探針-目標物雜合體。 GBS 00 6.1 1較佳地，該頂蓋具有一層狀結構且頂蓋 通道於其中一層內形成而貯存器則於另一相鄰層中形成。 GBS006.12 較佳地，該層狀結構包括一用來於該頂 蓋通道及諸LOC裝置間建立流體連通之界面層。 GBS006.1 3較佳地，該第二LOC上之MST層具有一阻 滯試樣從MST通道往頂蓋通道流動之活性閥，直到該活性 閥被啓動才允許試樣重新流動。 -24- 201209406 GBS006.14較佳地’該試樣爲血液且貯存器內之試 劑爲抗凝血劑且頂蓋被配置成在血液進入該透析區前先把 該抗凝血劑與血液混合在一起。 GBS006.15較佳地，該微流體裝置還有一胞溶區， 其與含有胞溶試劑之胞溶試劑貯存器流體連通，該胞溶區 被配置成能胞溶細胞及釋出其內之基因物質。

GBS006.16較佳地，該微流體裝置還有一用來擴增 流體內核酸序列之核酸擴增區。 GBS006.1 7較佳地，該核酸擴增區爲聚合酶連鎖反 應（PCR)區且該頂蓋具有一含有dNTPs及引子之PCR試劑 貯存器以於擴增該核酸序列之前先把該等PCR試劑與試樣 混合。 GBS006.1 8較佳地，該頂蓋具有一含有聚合酶之聚 合酶貯存器以於擴增核酸序列之前先把該酶與流體混合。 GBS006.19較佳地，該微流體裝置還有CMOS電路， 其位於該支撐基材與MS T層之間以操作性地控制該PCR區 GBS006.20較佳地，該微流體裝置還有一具有雜合 室之雜合區，該等雜合室內含有能結合到該流體內之目標 核酸序列上之探針核酸序列。 多重表面-微機電晶片被流體地整合以提供更充份及 更進步之功能性。該微流體多晶片組件可提供更高模組性 。該組件內之表面微機電晶片比起能提供該組件所有功能 之單體晶片要小得多且不成比例地便宜許多。採用功能最 -25- 201209406 佳的較便宜製程以製造該微流體多晶片組件之各個表面-微機電晶片之構成部份，例如唯-bioMST透析晶片可省略 所有CMOS製程步驟及可採用廉價的玻璃基材。 GDI0 15.1本發明之此態樣提供一種用來處理含有目 標分子之試樣流體之微流體裝置，該微流體裝置包含： 一用來接受試樣及濃縮部份試樣內之目標分子之透析 裝置：

—用來分析該等目標分子之晶片上實驗室（L0C )； 及 一覆蓋在該LOC及透析裝置上以於該LOC及透析裝置 間建立流體連通之頂蓋。 GDI0 15.2較佳地，該流體試樣爲含有不同大小細胞 之生物材料之試樣，該透析區有至少兩條通道及複數個小 孔且該等小孔以流體連接該等通道，複數個小孔之尺寸相 當於流體試樣內細胞既定閾値之大小。

GD10 1 5.3較佳地，該至少兩條通道及複數個小孔被 配置成能藉著毛細作用讓試樣流過該等通道及小孔。 GD 1015.4較佳地，該至少兩條通道包含一目標物通 道及一廢棄物通道，該目標物通道被連接到頂蓋以藉毛細 驅動流動流往該L0C。 GD 10 1 5.5較佳地，該等目標分子爲試樣流體中之細 胞內之目標核酸序列，且該LOC具有一用來擴增該目標核 酸序列之核酸擴增區。 GDI015.6較佳地，該目標核酸序列係在比既定閩値 -26- 201209406 小之細胞內。 GDI015.7較佳地，該LOC有一具有雜合探針陣列之 雜合區’該探針可與目標核酸序列雜合而形成探針一目標 物雜合體。 GDI015.8較佳地，該探針被設計成能與目標核酸序 列形成探針-目標物雜合體，該探針-目標物雜合體被設 計成能對激發電流產生反應而發射出光線之光子。

GDI015.9較佳地，其中該LOC裝置具有CMOS電路以 操作性控制該PCR區，該CMOS電路具有一光感測器用來 感測該探針-目標物雜合體發射之光子。 GDI0 15. 10較佳地，該雜合區有一雜合室陣列，該等 雜合室含有能與目標核酸序列雜合之探針。 GDI0 1 5 · 1 1較佳地，該光感測器爲一光二極體陣列， 而該等光二極體則分別與各雜合室緊鄰。 GDI015.12較佳地，該CMOS電路具有一用來儲存流 體處理相關資料之數位記憶體，該等資料包括探針詳細說 明及各個探針於雜合室陣列之位置。 GDI015.13較佳地，該CMOS電路具有至少一溫度感 測器以感測雜合室陣列之溫度。 GDI015.14較佳地，該L0C裝置有一加熱器受CMOS 電路控制，該CMOS電路會利用來自溫度感測器之反饋來 把探針及目標核酸序列維持在雜合溫度之下。 GDI015.15較佳地，該光二極體離對應之雜合室不到 1600微米。 -27- 201209406 GDI015.16較佳地，該探針具有於激發狀態 光子之電化學發光（ECL)發光團。 GDI015.17較佳地，該等雜合室具有電極以 發該ECL發光團。 GDI015.18較佳地，各ECL探針皆有一發光 近該發光團用以淬熄該發光團發射之光子之淬熄 探針與一目標核酸序列雜合時會移動該淬熄物遠 而使得光子不再被淬熄。 GD1015.19 較佳地，該CMOS電路具有接合， pads)以電子連接一外部裝置，且被配置成能把 極體之輸出轉變成指示該ECL探針已與目標核酸 之指示信號，且把該信號提供給該等接合墊以傳 裝置。 GDI015.20較佳地，該頂蓋具有至少—通道 裝置及LOC間流體連通，以及複數個容納加入試 試劑之貯存器。 該易於使用、可大量生產且廉價之微流體多 能接受生物試樣’使用透析晶片將不同大小的細 且分別處理以尺寸大小區分之細胞的核酸內容物 晶片能功能性地提取更多來自試樣之資訊並增加 統之靈敏度、信號對雜訊比及動態範圍。 該微流體多晶片組件可提供更高模組性。該 面微機電晶片比起能提供該組件所有功能之單體 得多且不成比例地便宜許多。另一選擇地，一大 會發射出 用電流激 團及一貼 物，當該 離發光團 (bond- 來自光二 序列雜合 輸到外部 與該透析 樣之液體

晶片組件 胞分離， 。該透析 該檢定系 組件之表 晶片要小 型但具有 -28- 201209406 成本效益之透析晶片則能提供高級透析容量以進一步提高 該檢定系統之靈敏度、信號對雜訊比及動態範圍。 採用功能最佳的便宜製程以製造該微流體多晶片組件 之各個表面-微機電晶片之構成部份，即唯-bioMST透析晶 片可省略所有CMOS製程步驟及可採用廉價的玻璃晶圓。 GDI0 16.1本發明之此態樣提供一種用來透析含有不 同大小成分之流體的透析裝置，該透析裝置包含：

一界定有第一通道及第二通道之第一材料層，該第一 通道被配置成能接受含有不同大小成分之流體； 一具有複數個小孔及至少一流體連接件之第二層，該 複數個小孔對第一通道開放及該流體連接件則從該等小孔 接到第二通道以於該第一通道及第二通道間建立流體連通 :其中 該等小孔之大小係根據既定閩値尺寸來定，使得流往 第二通道之成分爲小於該既定閩値尺寸之較小成分，而留 在第一通道之成分則包含大於該既定閩値尺寸之較大成分 GDI0 16.2較佳地，該第二層爲具有一頂壁層之層狀 結構，該至少一流體連接件爲一系列以該頂壁層封閉之毗 連通道，該等小孔係在頂壁層內於該第一通道及該等毗連 通道間之形成。 GDI0 16.3較佳地，該第一及第二通道以及一系列毗 連通道被配置成能藉由毛細作用以試樣予以充滿。 GDI016.4較佳地，其中該透析裝置還有一介於該第 -29 - 201209406

一通道及第二通道間之旁路通道’其中各毗連通道被配置 成能固定一流體彎液面以阻滯該第一通道與第二通道間之 毛細流動；及該介於該第一通道及第二通道間之旁路通道 ，該旁路通道匯入該系列毗連通道上游之第二通道且被配 置成能提供不受阻擋的毛細驅動液流從第一通道流往第二 通道；使得於諸彎液面於各毗連通道形成之後’來自旁路 通道之液流在抵達固定於各毗連通道之彎液面時會依序地 除去各個彎液面，且該試樣液流經由該等毗連通道及旁路 通道從第一通道流往第二通道。 GDI016.5較佳地，該試樣爲含有不同大小成分之生 物試樣，該等毗連通道及旁路通道具有相當於既定閾値尺 寸之小孔，使得流入第二通道之成分爲小於該既定閩値尺 寸之較小成分，而留在第一通道之成分則包含大於該既定 閩値尺寸之較大成分。

GDI0 16.6較佳地，該生物試樣爲血液且較大成分包 括白血球及較小成分包括紅血球。 GDI0 16.7較佳地，該毗連通道爲一系列平行的相鄰 通道且通常會延伸到該第一通道及第二通道。 GDI0 16.8較佳地，該透析裝置還有一用來收納下游 處理或分析不需之成分之廢棄物貯存器。 GDI016.9較佳地，該小孔爲直徑小於8微米的孔洞。 GDI016.10較佳地，該較小成分包括目標物，因此較 小成分之處理包括對目標物之偵測。 GDI01 6.1 1較佳地，該透析裝置還有一連接到目標物 -30- 201209406 通道之胞溶區以胞溶該等目標細胞而釋出其內之目標核酸 序列。 GDI01 6.12較佳地，該透析裝置還有一用以擴增該等 目標核酸序列之核酸擴增區。 GDI 0 16.13較佳地，該透析裝置還有一具雜合探針陣 列之雜合區，該探針能與核酸擴增區擴增之目標核酸序列 雜合。

GDI016.14較佳地，該探針被設計成能與該目標核酸 序列形成探針-目標物雜合體，該探針-目標物雜合體能 對電流脈衝反應而產生電化學發光。 GDI016.15較佳地，該透析裝置還具有CMOS電路以 操作性控制該核酸擴增區及雜合區，該CMOS電路還有一 光感測器以感測探針-目標物雜合體之電化學發光放射。 GDI016.16較佳地，該雜合區有一雜合室陣列，該等 雜合室含有能與該等目標核酸序列雜合之探針。 GDI016.17較佳地，該光感測器爲一光二極體陣列， 而該等光二極體則分別與各雜合室緊鄰。 GDI016.18較佳地，該CMOS電路具有一用來儲存流 體處理相關資料之數位記憶體，該等資料包括探針詳細說 明及各個探針於雜合室陣列之位置。 GDI016.19較佳地，該CMOS電路具有接合墊以電子 連接一外部裝置，且被配置成能把來自光二極體之輸出轉 變成指示該探針已與目標核酸序列雜合之指示信號，且把 該信號提供給該等接合墊以傳輸到外部裝置。 -31 - 201209406 GDI016.20較佳地，該透析裝置還有複數個用來容納 加入試樣之液體試劑之貯存器。 該易於使用、可大量生產且廉價之微流體多晶片組件 能接受生物試樣，使用透析晶片將不同大小的細胞分離， 且分別處理以尺寸大小區分之細胞的核酸內容物。該透析 晶片能功能性地提取更多來自試樣之資訊並增加該檢定系 統之靈敏度、信號對雜訊比及動態範圍。

該微流體多晶片組件可提供更高模組性。該組件之表 面微機電晶片比起能提供該組件所有功能之單體晶片要小 得多且不成比例地便宜許多。另一選擇地，一大型但具有 成本效益之透析晶片則能提供高級透析容量以進一步提高 該檢定系統之靈敏度、信號對雜訊比及動態範圍。 採用功能最佳的便宜製程以製造該微流體多晶片組件 之各個表面-微機電晶片之構成部份，即唯-bioMST透析晶 片可省略所有CMOS製程步驟及可採用廉價的玻璃晶圓。

GDI0 17.1本發明之此態樣提供一種具有毛細驅動、 流動·通道結構以透析含有不同大小成分之流體之透析裝 置，該透析裝置包含： 一配置成藉由毛細作用以流體充塡之第一通道： 一配置成藉由毛細作用以流體充塡之第二通道； 複數個連接第一通道及第二通道之流體連接件，各連 接件被配置成能固定一流體彎液面以阻滯該第一通道及第 二通道間之毛細流動； 一第一通道及第二通道間之通道，該旁路通道匯入該 -32- 201209406 複數個流體連接件上游之第二通道且被配匱成能提供不受 阻擋之毛細驅動流動從第一通道流往第二通道；其中使用 期間， 在彎液面於各流體連接件形成後，來自旁路通道之液 流在抵達固定於各流體連接件之彎液面時會依序地除去各 個彎液面，該試樣液流經由該等複數個流體連接件及旁路 通道從第一通道流往第二通道。

GDI0 17.2較佳地，該流體爲含有不同大小成分之生 物試樣，該複數個流體連接件及旁路通道具有相當於既定 閾値尺寸之小孔，使得流往第二通道之成分爲小於該既定 閾値尺寸之較小成分，而留在第一通道之成分則包含大於 該既定閾値尺寸之較大成分。 GD 1017.3 較佳地，該生物試樣爲血液且較大成分包 括白血球及較小成分包括紅血球。 GDI017.4較佳地，該透析裝置還有： 一界定有第一通道及第二通道之第一層；及 一界定有複數個流體連接件及旁路通道之第二層。 GDI0 17.5較佳地，該第二層爲具有一頂壁層之層狀 結構，該複數個流體連接件爲一系列以該頂壁層封閉之毗 連通道，該等小孔係在頂壁層內於該第一通道及該等毗連 通道間形成。 GDI01 7.6較佳地，該毗連通道爲一系列平行的相鄰 通道且通常延伸到該第一通道及第二通道。 GDI0 17.7較佳地，該透析裝置還有一廢棄物貯存器 -33- 201209406 用來收納下游處理或分析不需的成分。 GDI0 17.8較佳地，該小孔爲直徑小於8微米的孔洞。 GDI0 17.9較佳地，該較小成分包括目標物，因此較 小成分之處理包括對目標物之偵測。 GDI01 7.10較佳地，該透析裝置還有一連接到目標物 通道之胞溶區以胞溶該目標細胞而釋出其內之目標核酸序 列。

GDI0 17.il較佳地，該透析裝置還有一用以擴增該目 標核酸序列之核酸擴增區。 GDI01 7.12較佳地，該透析裝置還有一含有雜合探針 陣列之雜合區，該探針能與核酸擴增區擴增之目標核酸序 列雜合。 GDI0 17.13較佳地，該探針被設計成能與目標核酸序 列形成探針-目標物雜合體，該探針-目標物雜合體能對 電流脈衝反應而產生電化學發光。

GDI017.14較佳地，該透析裝置還具有CMOS電路以 操作性控制該核酸擴增區及雜合區，該CMOS電路還有一 光感測器以感測來自探針-目標物雜合體之電化學發光放 射。 GDI017.15 較佳地，該CMOS電路被配置成能對諸電 極提供電脈衝。 GDI017.16較佳地，該雜合區有一雜合室陣列，該等 雜合室含有能與目標核酸序列雜合之探針。 GDI0 17.17較佳地，該光感測器爲一光二極體陣列， -34- 201209406 而該等光二極體則分別與各雜合室緊鄰》 GDI017.18較佳地，該CMOS電路具有一用來儲存流 體處理相關資料之數位記憶體，該等資料包括探針詳細說 明及各個探針於雜合室陣列之位置。

GDI017.19較佳地，該CMOS電路具有接合墊以電子 連接一外部裝置，且被配置成能把來自光二極體之輸出轉 變成指示該探針已與目標核酸序列雜合之指示信號，且把 該信號提供給該等接合墊以傳輸到外部裝置。 GDI017.20較佳地，該透析裝置還有複數個用來容納 加入試樣之液體試劑之貯存器。 該易於使用、可大量生產且廉價之微流體多晶片組件 能接受生物試樣，使用透析晶片將不同大小的細胞分離， 且分別處理以尺寸大小區分之細胞的核酸內容物》該透析 晶片能功能性地提取更多來自試樣之資訊並增加該檢定系 統之靈敏度、信號對雜訊比及動態範圍。 該微流體多晶片組件可提供更高模組性。該組件之表 面微機電晶片比起能提供該組件所有功能之單體晶片要小 得多且不成比例地便宜許多。另一選擇地，一大型但具有 成本效益之透析晶片則能提供高級透析容量以進一步提高 該檢定系統之靈敏度、信號對雜訊比及動態範圍。 採用功能最佳的便宜製程以製造該微流體多晶片組件 之各個表面-微機電晶片之構成部份，即唯-bioMST透析晶 片可省略所有CMOS製程步驟及可採用廉價的玻璃晶圓。 該特殊的流動通道結構可引發該透析晶片之毛細-驅 -35- 201209406 動作用且不會截留氣泡。 GDI0 1 9.1本發明之此態樣提供一種從生物試樣中分 離出病原體之透析裝置，該透析裝置包含： 一用以接受生物試樣之第一通道； —第二通道：及 複數個小孔；其中

該第二通道經由該等小孔與該第一通道流體連接’使 得病原體能從該第一通道流到該第二通道而生物試樣內之 較大成分則留在該第一通道內。 GDI0 19.2較佳地，該透析裝置還有一系列毗連通道 於該第一通道及第二通道間延伸，其中該等小孔係位在該 等毗連通道之上游端，各毗連通道被配置成能固定一試樣 彎液面以阻滯該第一通道與第二通道間之毛細流動：及

—介於該第一通道及第二通道間之旁路通道，該旁路 通道匯入該等毗連通道上游之第二通道且被配置成能提供 不受阻擋的毛細驅動流動從第一通道流往第二通道；其中 於使用期間- 在彎液面於各毗連通道內形成後，來自旁路通道之液 流在抵達固定於各毗連通道之彎液面時該液流會依序地除 去各個彎液面，該試樣液流經由該等毗連通道及旁路通道 從第一通道流往第二通道。 GDI019.3較佳地，該透析裝置還有： —頂蓋層，該第一通道及第二通道於其內形成；及 一支撐層，該等毗連通道於其內形成，該頂蓋層覆蓋 -36- 201209406 在該支撐層上。 GD 1019.4較佳地，該支撐層爲包含一頂壁層之層狀 結構，該頂壁層界定有該等小孔。 GDI019.5較佳地，該等毗連通道係平行的且通常會 延伸到該第一通道及第二通道。 GDI019.6較佳地，該生物試樣爲血液且該頂蓋具有 一內含加入血液之抗凝血劑之試劑貯存器。

GDI019.7較佳地，該試劑貯存器有一表面張力閥， 其具有一彎液面錨（meniscus anchor)以固定彎液面來把 該試劑留在貯存器內，因此當試樣流從彎液面錨上除去該 彎液面時會把抗凝血劑載入到試樣流中。 該易於使用、可大量生產且廉價之微流體多晶片組件 能接受生物試樣，使用透析晶片分離出試樣中之病原體， 且分別處理該等試樣中分離之病原體之核酸內容物。該透 析晶片能功能性地提取更多來自試樣之資訊並增加該檢定 系統之靈敏度、信號對雜訊比及動態範圍。 該多晶片實驗室可提供更高模組性。該組件之表面微 機電晶片比起能提供該組件所有功能之單體晶片要小得多 且不成比例地便宜許多。另一選擇地，一大型但具有成本 效益之透析晶片則能提供高級透析容量以進一步提高該檢 定系統之靈敏度、信號對雜訊比及動態範圍》 採用功能最佳的便宜製程以製造該微流體多晶片組件 之各個表面-微機電晶片之構成部份，即唯-bioMST透析晶 片可省略所有CMOS製程步驟及可採用廉價的玻璃晶圓。 -37- 201209406 GD 102 3.1本發明之此態樣提供一種將生物試樣中之 有核細胞與較小成分分離之透析裝置，該透析裝置包含： 一用以接受生物試樣之第一通道； 一第二通道；及 複數個小孔；其中

該第二通道經由該等小孔與該第一通道流體連接’該 等小孔比有核細胞更小，使得較小成分會從該第一通道流 到該第二通道且生物試樣內之有核細胞會留在該第一通道 內。 GDI023.2較佳地，該透析裝置還有一系列於該第一通 道及第二通道間延伸之毗連通道，其中該等小孔係位在該 等毗連通道之上游端，各毗連通道被配置成能固定一試樣 彎液面以阻滯該第一通道與第二通道間之毛細流動；及

一介於該第一通道及第二通道間之旁路通道，該旁路 通道匯入毗連通道上游之第二通道且被配置成能提供不受 阻擋之毛細驅動流動從第一通道流往第二通道；其中於使 用期間一 在彎液面於各毗連通道內形成後，來自旁路通道之液 流在抵達固定於各毗連通道之彎液面時該液流會依序地除 去各個彎液面，該試樣液流經由該等毗連通道及旁路通道 從第一通道流往第二通道。 GDI023.3較佳地，該透析裝置還有： 一頂蓋層，該第一通道及第二通道於其內形成；及 一支撐層，該等毗連通道於其內形成；該頂蓋層覆蓋 -38- 201209406 在該支撐層上。 GDI023.4較佳地，該支撐層爲包含一頂壁層之層狀 結構，該頂壁層界定有該等小孔。 GDI023.5較佳地，該等毗連通道係平行的且通常會 延伸到該第一通道及第二通道。 GDI023.6較佳地，該生物試樣爲血液且該頂蓋具有 一內含加入血液之抗凝血劑之試劑貯存器。

GDI023.7較佳地，該試劑貯存器有一表面張力閥， 其具有一彎液面錨以固定彎液面來把該試劑留在貯存器內 ，因此當試樣流從彎液面錨上除去該彎液面時會把抗凝血 劑載入到試樣流中。 GD 1023.8較佳地，該有核細胞爲白血球。 此多晶片實驗室設計具有從內含目標物之試樣中直接 選取該試樣成分之優點。此多晶片實驗室設計具有提高有 效目標物濃度（該目標物爲該試樣之一部份且會被多晶片 實驗室作進一步處理）之優點。此多晶片實驗室設計具有 能除去可能會抑制後續分析步驟之試樣成分之優點。此多 晶片實驗室設計具有能除去加工混合物中可能會干擾稍後 之目標物偵測之不良成分之優點。此多晶片實驗室設計具 有能除去可能會阻塞多晶片實驗室之反應室或連接件及降 低操作品質之混合物成分之優點。 該多晶片實驗室可提供更高模組性。該組件之表面微 機電晶片比起能提供該組件所有功能之單體晶片要小得多 且不成比例地便宜許多。另一選擇地，一大型但具有成本 -39- 201209406 效益之透析晶片則能提供高級透析容量以進一步提高該檢 定系統之靈敏度、信號對雜訊比及動態範圍。 採用功能最佳的便宜製程以製造該微流體多晶片組件 之各個表面-微機電晶片之構成部份，即唯-bioMST透析晶 片可省略所有CMOS製程步驟及可採用廉價的玻璃晶圓。 GDI028.1本發明之此態樣提供一種用來分析含有目 標分子之試樣流體之測試模組，該測試模組包含：

一具有收納該試樣流體之貯槽之外殻；及 一微流體裝置，其具有： 一透析裝置，其與該貯槽流體連通且被配置成能把目 標分子與試樣之其它成分分離； 一用來分析該目標分子之晶片上實驗室（LOC)裝置 :及 —覆蓋在該L0C裝置及該分析裝置上之頂蓋以於該 L0C裝置及分析裝置間建立流體連通。

GDI028.2較佳地，該流體試樣爲含有不同大小細胞 之生物材料之試樣，該透析區有至少兩條通道以複數個小 孔流體連接該等通道，該複數個小孔之尺寸相當於流體試 樣細胞之既定閾値大小。 GDI028.3較佳地，該至少兩條通道及複數個小孔被 配置成能藉著毛細作用讓試樣流過該等通道及小孔。 GDI0 28.4較佳地，該至少兩條通道包含一目標物通 道及一廢棄物通道，該目標物通道被連接到頂蓋以藉毛細 驅動液流流往該L0C裝置。 -40 - 201209406 GDI0 28.5 較佳地，該等目標分子爲試樣流體中該等 細胞內之目標核酸序列，且該LOC裝置具有一用來擴增該 目標核酸序列之核酸擴增區。 GDI02 8.6較佳地，該目標核酸序列係在比既定閾値 小之細胞內。

GDI028.7較佳地，該LOC裝置有一內含雜合探針陣 列之雜合區，該探針可與目標核酸序列雜合而形成探針-目標物雜合體。 GDI 02 8.8較佳地，該探針被設計成能與目標核酸序 列形成探針-目標物雜合體，該探針-目標物雜合體被設 計成能對激發電流產生反應而發射出光線之光子。 GDI028.9 較佳地，其中該LOC裝置具有CMOS電路以 操作性控制該PCR區，該CMOS電路具有一光感測器用來 感測該探針-目標物雜合體發射之光子。 GDI02 8.1 0較佳地，該雜合區有一雜合室陣列，該等 雜合室含有能與目標核酸序列雜合之探針》 GDI02 8.il較佳地，該光感測器爲一光二極體陣列， 而該等光二極體則分別與各雜合室緊鄰。.. GDI02 8.1 2較佳地，該CMOS電路具有一用來儲存流 體處理相關資料之數位記憶體，該等資料包括探針詳細說 明及各個探針於雜合室陣列之位置。 GDI02 8.1 3較佳地，該CMOS電路具有至少一溫度感 測器以感測雜合室陣列之溫度。

GDI028.1 4較佳地，該LOC裝置有一加熱器受CMOS 201209406 電路控制’該CMOS電路會利用來自溫度感測器之反饋來 把探針及目標核酸序列維持在雜合溫度之下。 GD 102 8.1 5較佳地’該光二極體離對應之雜合室不到 1 60 0微米。 GD 1028.1 6較佳地，該探針具有於激發狀態會發射出 光子之電化學發光（ECL)發光團。 GDI02 8.1 7較佳地’該等雜合室具有電極以用電流激 發該ECL發光團。 GDI02 8.1 8較佳地，各ECL探針皆有一發光團及一貼 近該發光團用以淬熄該發光團發射之光子之淬熄物，當該 探針與一目標核酸序列雜合時會移動該淬熄物遠離發光團 而使得光子不再被淬熄。 GDI028.1 9較佳地，該CMOS電路具有接合墊以電子 連接一外部裝置，且被配置成能把來自光二極體之輸出轉 變成指示ECL探針已與目標核酸序列雜合之指示信號，且 把該信號提供給該等接合墊以傳輸到外部裝置。 GDI02 8.20較佳地，該頂蓋具有至少一通道讓該透析 裝置與LOC裝置間流體連通，以及複數個容納加入試樣之 液體試劑之貯存器。 該易於使用、可大量生產且廉價之微流體多晶片組件 能接受生物試樣，使用透析晶片將不同大小的細胞分離， 且分別處理以尺寸大小區分之細胞的核酸內容物。該透析 晶片能功能性地提取更多來自試樣之資訊並增加該檢定系 統之靈敏度、信號對雜訊比及動態範圍。 -42- 201209406 該微流體多晶片組件可提供更高模組性。該組件之表 面微機電晶片比起能提供該組件所有功能之單體晶片要小 得多且不成比例地便宜許多。另一選擇地，一大型但具有 成本效益之透析晶片則能提供高級透析容量以進一步提高 該檢定系統之靈敏度、信號對雜訊比及動態範圍。

採用功能最佳的便宜製程以製造該微流體多晶片組件 之各個表面-微機電晶片之構成部份，即唯-bioMST透析晶 片可省略所有CMOS製程步驟及可採用廉價的玻璃晶圓。 GDI0 3 0.1本發明之此態樣提供一種用來濃縮生物試 樣內之病原體之測試模組，該測試模組包含： 一具有收納該試樣流體之貯槽之外殼；及 一透析裝置，其與該貯槽流體連通且被配置成能把病 原體與試樣內之其它成分分離開來：及 一與該透析裝置流體連通且被配置成能分析病原體之 晶片上寰驗室（LOC)裝置。 GDI030.2較佳地，該透析裝置具有一用來接受該生 物試樣之第一通道、一第二通道及複數個小孔，該第二通 道經由該等小孔與該第一通道以流體相連，使得病原體能 從該第一通道流到該第二通道而生物試樣中之較大成分則 留在該第一通道內。 GDI0 30.3較佳地，該透析裝置還有一系列於該第一 通道及第二通道間延伸之毗連通道，其中該等小孔係位在 該等毗連通道之上游端，各毗連通道被配置成能固定一試 樣彎液面以阻滯該第一通道與第二通道間之毛細流動；及 -43- 201209406 一介於該第一通道及第二通道間之旁路通道，該旁路通道 匯入毗連通道上游之第二通道且被配置成能提供不受阻擋 之毛細驅動液流從第一通道流往第二通道；其中於使用期 間，在彎液面於各毗連通道形成之後，來自旁路通道之液 流在抵達固定於各毗連通道之彎液面時該液流會依序地除 去各個彎液面，該試樣液流經由該等毗連通道及旁路通道 從第一通道流往第二通道。

GDI03 0.4較佳地，該第二通道可供作目標物通道且 該第一通道可供作廢棄物通道，該目標物通道被配置成能 以毛細驅動流動流到該LOC裝置。 GDI 0 3 0.5較佳地，該病原體含有目標核酸序列且該 LOC裝置含有一用來擴增該目標核酸序列之核酸擴增區。 GDI030.6較佳地，該LOC裝置具有一胞溶區以胞溶 該病原體來釋出其內之目標核酸序列。

GDI030.7較佳地，該LOC裝置還有一具有雜合探針 陣列之雜合區，該探針能與該目標核酸序列雜合而形成探 針-目標物雜合體。 GDI0 30.8較佳地，該探針被設計成能與該目標核酸 序列形成探針-目標物雜合體，該探針-目標物雜合體被 設計成能對激發電流產生反應而發射出光線之光子。 GDI030.9較佳地，該LOC裝置具有CMOS電路以操作 性控制該PCR區，該CMOS電路具有一光感測器來感測該 探針一目標物雜合體發射之光子。 GDI030.1 0較佳地，該雜合區有一雜合室陣列，該等 -44- 201209406 雜合室含有能與目標核酸序列雜合之探針。 GDI03 0. 1 1較佳地，該光感測器爲一光二極體陣列， 而該等光二極體則分別與各雜合室緊鄰。 GDI03 0.1 2較佳地’該CMOS電路具有一用來儲存流 體處理相關資料之數位記憶體，該等資料包括探針詳細說 明及各個探針於雜合室陣列之位置。

GDI03 0.1 3較佳地，該CMOS電路具有至少一溫度感 測器以感測雜合室陣列之溫度。 GDI030.14較佳地，該LOC裝置有一加熱器受CMOS 電路控制，該CMO S電路會利用來自溫度感測器之反饋來 把探針及目標核酸序列維持在雜合溫度之下。 GDI03 0.1 5較佳地，該光二極體離對應之雜合室不到 1 600微米。 GDI03 0.1 6較佳地，該探針具有於激發狀態會發射出 光子之電化學發光（ECL)發光團。 GDI03 0.1 7較佳地，該等雜合室具有電極以用電流激 發該ECL發光團。 GDI03 0.1 8較佳地，各ECL探針皆有一發光團及一貼 近該發光團用以淬熄該發光團發射之光子之淬熄物，當該 探針與一目標核酸序列雜合時會移動該淬熄物遠離發光團 而使得光子不再被淬熄。 GDI030.1 9較佳地，該CMOS電路具有接合墊以電子 連接一外部裝置，且被配置成能把來自光二極體之輸出轉 變成指示ECL探針已與目標核酸序列雜合之指示信號，且 -45- 201209406 把該信號提供給該等接合墊以傳輸到外部裝置。 GDI030.20較佳地，該LOC裝置及透析裝置可透過一 頂蓋以流體連接，該頂蓋具有至少一通道能讓該透析區與 該LOC間流體連通，以及複數個能容納加入試樣之液體試 劑之貯存器。

該易於使用、可大量生產、廉價且可攜帶之診斷測試 模組能接受生物試樣，使用透析晶片分離出試樣中之病原 體，且分別處理從該等試樣中分離之病原體之核酸內容物 。該透析晶片能功能性地提取更多來自試樣之資訊並增加 該檢定系統之靈敏度、信號對雜訊比及動態範圍。 該微流體多晶片組件可提供更高模組性。該組件之表 面微機電晶片比起能提供該組件所有功能之單體晶片要小 得多且不成比例地便宜許多。另一選擇地，一大型但具有 成本效益之透析晶片則能提供高級透析容量以進一步提高 該檢定系統之靈敏度、信號對雜訊比及動態範圍。

採用功能最佳的便宜製程以製造該微流體多晶片組件 之各個表面-微機電晶片之構成部份，即唯-bioMST透析晶 片可省略所有CMOS製程步驟及可採用廉價的玻璃晶圓。 【實施方式】 較佳具體例之詳細說明 槪述 此槪述係界定一體現本發明諸多具體例之分子診斷系 統之主要構件。該系統整體結構及操作之全面詳細說明稍 -46 - 201209406 後示於本專利說明書中。 參考第1、2、3、85及86圖，該系統具有以下頂層構 件：

測試模組1 〇及1 1具有典型U S B存儲器 (memory key ) 之大小且製造十分便宜。測試模組1 0及1 1各含有一微流體 裝置’其典型地爲已預先裝有分子診斷檢定用之試劑及通 常超過1 000個探針之晶片上實驗室（LOC)裝置30之形式 (參見第1圖及第8 5圖）》測試模組1 〇如第1圖示意顯示地 係採用螢光爲基礎之偵測技術來鑑定目標分子，而第85圖 之測試模組1 1則爲採用電化學發光爲基礎之偵測技術。該 LOC裝置30具有用來感測螢光或電化學發光之積體化光感 測器44 (以下將詳加描述）。測試模組1 〇及1 1兩者皆採用 標準式微型（Micro) -USB插頭14以傳輸電能、資料及進 行控制，兩者皆有印刷電路板（PCB ) 57，且兩者皆有外 部電源供應電容器3 2及電感器1 5。該測試模組1 0及1 1僅供 單次使用，皆可大量生產且以無菌包裝配送即拆即用。 外殼13具有收納生物試樣之大貯槽（macroreceptacle )24以及可拆除之無菌密封膠帶22，其較佳地具有低黏性 黏著劑，以於使用前覆蓋住該大貯槽。具有護膜罩410之 膜封條40 8構成外殼1 3的一部份以減少測試模組內之脫濕 現象同時提供釋壓作用以預防氣壓小輻波動。該護膜罩 4 10可保護膜封條40 8免於損壞。 測試模組讀取器12係透過微型-USB埠16來供應測試模 組10或11電力。該測試模組讀取器12可採用多種不同形式 -47- 201209406

且稍後將詳述此等選擇。第1、3及85圖所示之讀取器12版 本爲智慧型手機之例。該讀取器12之方塊圖示於第3圖》 處理器42可執行來自程式儲存器43之應用軟體。該處理器 42還界接顯示螢幕18及用戶界面（UI)觸控螢幕17及按鍵 19'蜂巢式無線電台21、無線網路連線23及衛星導航系統 25»該蜂巢式無線電台21及無線網路連線23係用於通訊。 衛星導航系統2 5可用位置資料更新流行病學資料庫。另一 選擇地’該位置資料可透過觸控螢幕17或按鍵19人爲地輸 入。資料儲存器27含有基因及診斷資訊、測試結果、患者 資訊、檢定及用以確認各探針及其陣列位置之探針資料。 資料儲存器27及程式儲存器43可共享同一記憶裝置。安裝 在該測試模組讀取器1 2內之應用軟體可提供結果分析，以 及其它測試及診斷資訊。

爲了進行診斷測試，把該測試模組1 0 (或測試模組1 1 )插到該測試模組讀取器12之微型-USB埠16。把無菌密封 膠帶22撕開來且將生物試樣（呈液體形式）裝載到試樣大 貯槽24中。按下開始鈕20，透過應用軟體啓動測試。試樣 會流入該LOC裝置30且該板上檢定開始萃取、培育、擴增 以及用預合成之雜合-反應性寡核苷酸探針來與試樣核酸 (目標物）雜合。於測試模組1 0 (其使用螢光爲基礎偵測 )之例中，探針係以螢光標記且安裝於外殻13內之LED 26 可提供引發已雜合探針放射螢光所需之激發光線（見第1 及2圖）。於測試模組1 1 (其係使用電化學發光（ECL )偵 測），該LOC裝置30中裝有ECL探針（如以上討論般）， -48- 201209406 且不需要LED 26以產生發光放射。替代性地，係由電極 860及870提供激發電流（見第86圖）。放射作用（螢光性 或發光性）係使用整合於各LOC裝置上之CMOS電路內之 光感測器44來偵測。偵測訊號會被放大及轉變成數位輸出 ’其可用測試模組讀取器1 2來分析。然後該讀取器會顯示 出結果。

此等資料可局部儲存及/或上傳至含有患者記錄之網 路伺服器。將測試模組10或1 1從該測試模組讀取器12上卸 除且妥善地丟棄。 第1、3及85圖顯示作成行動電話/智慧型手機28之測 試模組讀取器1 2。於其它形式中，該測試模組讀取器可爲 醫院、私人診所或實驗室使用之膝上型/筆記型電腦101、 專屬讀取器103、電子書讀取器107、平板電腦109或桌上 型電腦105 (見第87圖）。該讀取器可與廣泛的其它應用 像是患者記錄、帳單、線上資料庫及多用戶環境等界接。 其亦可與多種地區性的或遠端的周邊設備例如印表機或患 者1C智慧卡界接。 現在參考第88圖，測試模組10產生的資料可透過讀取 器12及網路125來更新流行病學資料主機系統111內的流行 病學資料庫，基因資料主機系統113內之基因資料庫、電 子健康記錄（EHR )主機系統1 1 5內之電子健康記錄、電 子病歷（EMR)主機系統121內之電子病歷以及個人健康 記錄（PHR )主機系統123內之個人健康記錄。反過來地 ，流行病學資料主機系統1 1 1內的流行病學資料庫，基因 -49- 201209406 資料主機系統113內之基因資料庫、電子健康記錄（Ehr )主機系統115內之電子健康記錄、電子病歷（EMR)主 機系統121內之電子病歷以及個人健康記錄（PHR )主機 系統123內之個人健康記錄亦可透過該網路125及讀取器12 來更新測試模組10之LOC裝置30內的數位記憶體。

現在回去參考第1、2、85及86圖，該讀取器12在行動 電話組態中係使用電池電力。該行動電話讀取器含有預先 載入之所有測試及診斷資訊。資料亦可透過多種無線或接 觸界面來載入或更新以與周邊裝置、電腦或線上伺服器交 流。提供微型-USB埠16以與電腦連通或者在電池充電時維 持電源供應。

第62圖顯示之測試模組10具體例其測試僅需顯示對一 特定目標爲正反應或負反應的結果而已，像是測試某人是 否感染例如H1N1 A型流感病毒。爲特定目的建造之唯USB 電源/指示器模組47即很適合。無需其它讀取器或應用軟 體。於唯USB電源/指示器模組4 7上之指示器45會顯示正反 應或負反應結果之訊號。此組態相當適合大量篩選。 此系統提供之其它項目還包含含有特定試樣預處理試 劑之測試管，以及試樣採集用之壓舌板及刺血針。第62圖 顯示之測試模組具體例方便地含有用彈簧頂住之可縮式刺 血針3 90及刺血針釋放鈕3 92。在偏遠地區可使用衛星電話 測試模組電子設備 -50- 201209406

第2及86圖分別爲測試模組1 0及1 1之電子組件之方塊 圖。整合於LOC裝置30內之CMOS電路具有一USB裝置驅動 器36 ' —控制器34、一 USB-相容LED驅動器29、時鐘33、 電源調節器31、RAM 3 8以及程式和資料快閃記憶體40。 此等設備提供整個測試模組1 〇或11之控制及記憶，其包括 光感測器44、溫度感測器1 70、液體感測器1 74 '及不同的 加熱器152、154、182、234，以及伴隨之驅動器37及39及 暫存器35及41。只有該LED 26 (於測試模組10之例中）、 外部電源供應電容器32及該微型-USB插頭14係在該LOC裝 置30之外部。該LOC裝置30包括了與此等外部構件連接之 接合墊（bond-pads ) 。RAM 38及程式及資料快閃記憶體 40具有應用軟體及超過1〇〇〇個探針之診斷及測試資訊（快 閃/安全儲存，例如透過加密）。於採用ECL偵測之測試模 組1 1之例，該模組並無LED 26 (見第85及86圖）。資料被 LOC裝置3 0加密以供安全儲存及與外部裝置安全通訊。該 LOC裝置30裝有電化學發光探針以及都有一對ECL激發電 極860及870之雜合室。 許多測試模組1 〇類型係採用不同測試形式製造，很容 易現成使用。此等測試形式間的差異係在於使用諸試劑及 探針之板上檢定。 能以此系統快速地鑑定出來之感染性疾病的一些實例 包括： •流行性感冒：流感病毒A ' B ' C型，傳染性鮭魚貧 -51 - 201209406 血病毒（Isavirus)，托高 土病毒（Thogotovirus) •肺炎：呼吸道融合病毒（RSV )、腺病毒、間質性 肺炎病毒、肺炎雙球菌（Streptococcus pneumoniae)、金 黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ) • 肺結核：結核分枝桿菌 （ iMftercM/oi/·?)、牛型結核菌（Μ. 、非洲分枝桿菌

(M. a_/Wci/«MW )、卡氏分枝桿菌（M. caneiiz·)及田鼠分 枝桿菌（Λ/, w i c r ο ί / ) •惡性瘡原蟲/"a/cz'/jarM/w)、剛地弓形 蟲（Γοχορ/ύ^»ΐίϊ )及其它原蟲寄生蟲 •傷寒：傷寒沙門氏菌（*5a/TW〇«e//a ·?βλ·〇να/* typhi ) •埃勃拉病毒（Ebola virus) • 人類免疫缺陷病毒 （Human immunodeficiency virus ( HIV ))

•登革熱：黃病毒（Flavivirus) •肝炎（A到E型） • 醫院獲得性感染：例如艱難梭狀芽孢桿菌（ Clostridium difficile、、耐萬古黴素之腸球菌 （ 五《ierococcw)及耐二甲氧苯青黴素之金黃色葡萄球菌 •單純疱疹病毒（HSV ) •巨細胞病毒（Cytomegalovirus ( CMV)) •伊斯坦巴病毒（Epstein-Barrvirus(EBV)) •腦炎：日本腦炎病毒、章地埔拉病毒（chandiPura -52- 201209406 virus ) •百曰咳·百日咳嗜血桿菌心 •麻疹：副黏液病毒 •腦膜炎：肺炎雙球菌及腦膜炎雙球菌（iVeiwerM meningitidis) •灰痕病：炭痕芽孢桿菌

能以此系統鑑定出來之遺傳性疾病之一些實例包括： •囊性纖維變性 •血友病 *鐮刀細胞型貧血 •黑矇性白癡 •血色素沉著症 «大腦動脈病 •克羅恩氏病 •多囊性腎病 •先天性心臓病 •瑞特氏症候群 一小群可用此診斷系統鑑定出來之癌症包括： •卵巢癌 •結腸癌 •多發性內分泌腫瘤 •視網膜母細胞瘤 -53- 201209406 •透克氏症候群 以上表列並不詳盡且該診斷系統可被配置成能使用核 酸及蛋白質組分析來偵測極多不同種類的疾病和病況。 系統組件之詳細構造 LOC裝置

該LOC裝置30爲此診斷系統之中心。藉著使用微流體 平台，其能快速地進行以核酸爲基礎之分子診斷檢定之四 個主要步驟，亦即試樣製備、核酸萃取、核酸擴增及偵測 。該LOC裝置還有其它用途，此等用途稍後會詳加說明。 如以上討論地，測試模組1 0及1 1可採用許多不同組態以偵 測不同目標物。類似地，該LOC裝置30也有許多針對硏究 目標設計之不同具體例。一種LOC裝置30之形式爲採用螢 光偵測全血試樣中病原體之目標核酸序列的LOC裝置301 。爲了說明，該LOC裝置301之結構及操作現在參考第4至 26圖及第27至57圖來詳加描述。 第4圖爲該LOC裝置301整體結構之示意代表圖。爲求 方便，第4圖顯示之流程階段係以進行該流程階段之LOC 裝置301之功能性區域的參考編號來表示。與核酸爲基礎 之分子診斷檢定之各個主要步驟相關之流程階段亦已標示 :試樣置入及製備（sample input and preparation) 288， 萃取2 90、培育291、擴增292及偵測294。該LOC裝置301 之不同貯存器、室、閥及其它構件將於稍後詳加描述。 第5圖爲該L0C裝置301之透視圖。其係採用高容積 -54- 201209406

CMOS及MST (微系統技術）製造技術製造。該LOC裝置 301之層狀結構示於第12圖之示意性（不按比例的）部份 剖面圖。該LOC裝置301具有一支撐著CMOS + MST晶片48 之矽基材84，含有CMOS電路86及MST層87，以及一覆蓋 在該MST層87上之頂蓋（cap ) 46。基於本專利說明書之 目的，術語“MST層”係指一群結構及膜層之集合，該等結 構及膜層會以不同試劑來處理試樣。據此，此等結構及構 件被配置成能界定具有特徵尺寸之流路，該特徵尺寸可於 試樣處理期間支持與該試樣具有相同物理特性之液體的毛 細驅動流動。關於此點，該等MST層及諸構件典型地係使 用表面微細加工技術及/或體微細加工（bulk micromachining)技術來製造。不過，其它製造技術亦可 生產此等結構及構件，其具有可產生毛細驅動流動之大小 並能處理極微小的體積。此專利說明書中描述之明確具體 例會顯示MST層且以MST層當作支撐在該CMOS電路86上 之結構及主動構件，卻排除掉該頂蓋46之特徵構件。不過 ，熟悉此技術之讀者應瞭解該MST層無需襯底之CMOS或 實際上的上覆頂蓋即可處理試樣。 於以下圖式中顯示之LOC裝置的整體大小爲 1 760μιηχ5824μηι。當然，不同應用之LOC裝置可具有不同 尺寸大小。 第6圖顯示被頂蓋之特徵構件疊加其上之MST層87之 特徵構件。第6圖顯示之插圖ΑΑ至AD、AG及ΑΗ分別於第 13、14、35、56、55及58中放大，且於下文中詳加描述以 -55- 201209406 讓人徹底瞭解該LOC裝置301內的各個結構。第7至10圖則 獨立顯示該頂蓋46之特徵構件而第11圖則獨立顯示 CMOS + MST裝置48之結構。 層狀結構

第12及22圖乃爲草圖，其以圖顯示該CMOS + MST裝置 48、頂蓋46及這兩者間之流體互動的層狀結構。爲了說明 ，此等圖式並未按照實際比例大小顯示。第12圖爲通過試 樣置入口 68之示意剖面圖及第22圖爲通過貯存器54之示意 剖面圖。如第12圖最佳顯示地，該CMOS + MST裝置48具有 一矽基材84，其支撐著CMOS電路86而該電路能操控上方 MST層87內的主動元件。一鈍化層88密封及保護該CMOS 層8 6免於接觸到流經該MST層87之液流。

流體流經分別位於頂蓋層46之頂蓋通道94及位於MST 通道層100之MST通道90 (參見例如第7及16圖）。細胞運 輸發生在建於頂蓋46內之較大通道94’而生化處理則在較 小的MST通道90內進行。細胞運輸通道的大小係能夠把試 樣內的細胞運送到該MST通道90內的預定位置。尺寸大於 20微米之細胞（例如，特定的白血球）的運輸會需要管徑 大於20微米之通道，因而該通道與液流垂直之橫切面積會 大於400平方微米。MST通道，特別是位在LOC內無需運輸 細胞之位置時，管徑顯著地較小。 應瞭解該頂蓋通道94及MST通道90都是通用的稱呼’ 特別的M S T通道9 0可根據其特殊功能而被稱爲例如受熱微 -56- 201209406 通道或透析MST通道。MST通道90係藉著蝕刻沉積在鈍化 層88上方之MST通道層100且用光阻劑圖型化來形成。該 MST通道90係用頂壁層66圍住，該頂壁層構成該 CMOS + MST裝置48的頂端（相對於圖式顯示之方位來看）

雖然有時候會以個別的膜層表示，不過該頂蓋通道層 80及該貯存器層78係在一整片物料上形成。當然，這片物 料可以不是單一整體的。這片物料係從兩面蝕刻以形成蝕 刻有頂蓋通道94之頂蓋通道層80以及蝕刻有貯存器54、56 、58、60及62之貯存器層78。另一選擇地，該貯存器及頂 蓋通道可用微成型法來形成。蝕刻及微成型技術兩者皆可 用來製造通道，該通道與液流垂直之橫切面可以大到 20,000平方微米或者小到8平方微米。 在LOC裝置中，不同位置之通道其與液流垂直之橫切 面積大小可有廣泛的選擇。當通道中含有大量試樣時或者 所含試樣具大構造成分時，該通道之橫切面積可高達 2〇,〇〇〇平方微米（例如，於100微米厚之膜層中有200微米 寬的通道）。當通道中只含少量液體或者所含混合物沒有 大細胞存在時，該通道與液流垂直之橫切面積最好非常小 下封條64圍住頂蓋通道94且上密封層82圍住貯存器54 、56、58、60¾ 62 ° 五個貯存器54、56、58、60及62中已先裝有檢定-特 異性試劑。在此所述之具體例中，該等貯存器內已預先裝 -57- 201209406 入以下試劑，不過很容易用其它試劑來取代： •貯存器54:抗凝血劑，任意地可含有紅血球胞溶緩 衝液 •貯存器5 6 :胞溶試劑

•貯存器5 8 :限制性內切酶、接合酶及連接子序列（ 用於連接子-帶頭PCR (見第61圖’選自T. Stachan et al·， Human Molecular Genetics 2，Garland Science, NY and London, 1999)) •貯存器60:擴增混合物（dNTPs，引子，緩衝液） 及 •貯存器62 : DNA聚合酶。 該頂蓋46及CMOS + MST層48會透過下封條64及頂壁層 66內對應之開口以流體連通。此等開口將視流體係從該 MST通道90流到頂蓋通道94或反向流動而被稱爲上導管（ uptakes) 96或下導管（downtakes) 92。

LOC裝置操作 該LOC裝置301之操作將參考分析血液試樣內之病原 性DNA之情況以逐步的方式說明如下。當然，其它類型之 生物性或非生物性流體亦可使用適當的一組試劑、測試流 程、L Ο C變化型及偵測系統，或其組合來分析。回去參考 第4圖’有五個主要步驟涉及生物性試樣之分析，其包含 試樣置入及製備288、核酸萃取290、核酸培育291、核酸 擴增292以及偵測和分析294。 -58- 201209406 試樣置入及製備步驟288涉及把血液與抗凝血劑116混 合，然後於病原體透析區70把病原體與白血球及紅血球分 離開來。如第7及1 2圖最佳顯示地，血液試樣經由試樣置 入口 68進入裝置。毛細作用會把血液試樣沿著頂蓋通道94 汲取到貯存器54內。當試樣血流打開表面張力閥118時抗 凝血劑會從貯存器54中釋出（見第15及22圖）。該抗凝血 劑可防止凝塊形成，凝塊會阻塞流動。

如第22圖最佳顯示地，抗凝血劑1 1 6藉著毛細作用從 貯存器54中被拉引出來且經由下導管92進入MST通道90。 該下導管92具有一毛細管起動特徵構件（capillary initiation feature，C IF ) 1 02以塑造彎液面之幾何性，使 其不會固定在該下導管92之邊沿。上封條82上之排氣孔 122可在抗凝血劑1 16被拉引出貯存器54時用空氣取代該抗 凝血劑。 第22圖所示之MST通道90爲表面張力閥118之一部份 。抗凝血劑116會塡滿該表面張力閥118且把一彎液面120 固定在該上導管96之彎液面錨（meniscus anchor) 98上。 使用前，該彎液面120保持著固定在上導管96上’因此抗 凝血劑不會流到頂蓋通道94內。當血液流經頂蓋通道94到 達上導管96時，彎液面120會被除去且抗凝血劑被引入液 流中。 第15到21圖顯示插圖AE，其爲第13圖所示之插圖AA 的一部份。如第15、16及17圖所示’該表面張力閥118具 有三條分離的MST通道90於各別的下導管92及上導管96之 -59- 201209406 間延伸。表面張力閥內的MST通道90之數目可有所不同以 改變試劑流入試樣混合物之流動速度。當試樣混合物及試 劑藉著擴散混合在一起時，試劑流出貯存器之流動速度會 決定該試劑於試樣流內的濃度。因此，各貯存器之表面張 力閥會被配置成能符合所需之試劑濃度。

然後血液流入病原體透析區70 (見第4及15圖），於 該處目標細胞透過採用具既定閩値大小之孔徑之小孔1 64 陣列來從試樣中濃縮。小於該閩値之細胞會通過小孔而較 大細胞則無法通過該等小孔。無用的細胞，其可爲卡在小 孔1 64陣列內之細胞或是通過小孔之細胞，會被重新導向 廢棄物單元76而該等目標細胞則繼續留在檢定之中成爲檢 定的一部份。

在此所述之病原體透析區70中，來自全血試樣之病原 體會被濃縮以供微生物DN A分析。小孔陣列係由許多直徑 3微米之孔洞164所形成且能把頂蓋通道94內的輸入液流以 流體連結到目標物通道74。直徑3微米之小孔164以及通往 目標物通道74之透析上導孔168則由一系列透析MST通道 2 〇4來連接（以第15及21圖最佳地表示）。病原體會小得 足以通過直徑3微米之小孔164且透過透析MST通道2 04充 滿目標物通道74。大於3微米之細胞例如紅血球及白血球 則留在頂蓋46內之廢棄通道72，該通道會通往廢棄貯存器 76 (見第7圖）。 可採用其它小孔形狀、尺寸及寬高比（aspect ratio ) 來分離特殊的病原體或其它目標細胞例如白血球以供人類 -60- 201209406 DNA分析。稍後會提供此透析區及透析變化型之更多細節

再次參考第6及7圖，液流被拉引流經目標物通道74到 達胞溶試劑貯存器56之表面張力閥128。該表面張力閥128 有7條MST通道90在該胞溶試劑貯存器56及目標物通道74 之間延伸。當彎液面被試樣流瓦解時，該胞溶試劑貯存器 56之流動速度（來自總共7條MST通道90)會比凝血劑貯 存器54(其表面張力閥118具有3條MST通道90)之流動速 度更快（假設該等液流之物理特性大致相同）。因此’試 樣混合物中該胞溶試劑之比例會高於抗凝血劑之比例。 該胞溶試劑及目標細胞會在化學胞溶區130內之目標 物通道74中藉著擴散作用來混合。沸騰-起動閥（boiling-initiated valve) 126 能使液 流停止 一 段足夠 的時間 以進行 擴散及胞溶，使得遺傳性物質從該等目標細胞中釋放出來 (見第6及7圖）。以下將參考第31及32圖更詳細地說明該 沸騰-起動閥之結構及運作。本案申請者亦已開發出其它 的主動閥類型（相對於被動閥例如表面張力閥118)，其 可用來代替該沸騰-起動閥。此等另外的閥設計稍後也會 加以說明。 當沸騰-起動閥126打開時，已胞溶之細胞會流入混合 區1 3 1以供擴增前限制性內切酶消化及連接子接合。 現在參考第1 3圖，當液流瓦解混合區1 3 1起始處之表 面張力閥132的彎液面時，限制性內切酶、連接子及接合 酶會從貯存器5 8中釋出。混合物沿著混合區1 3 1全長流過 -61 - 201209406 以進行擴散混合。混合區131之末端爲下導管134，其通往 培育區114之培育器入口通道133 (見第13圖）。該培育器 入口通道1 3 3把混合物饋送到蜿蜒組態之受熱微通道2 1 0， 其提供一用以容納試樣之培育室以進行限制性消化及連接 子接合（見第1 3及14圖）。

第23、24、25、26、27、28及29圖顯示第6圖之插圖 AB內的LOC裝置301之膜層。各圖係在顯示諸膜層之依序 增添過程來形成CMOS + MST層48及頂蓋46之結構。插圖AB 爲培育區114的終點及擴增區112的起點。如第14及23圖最 佳顯示地，液流會一直流進培育區1 1 4之微通道2 1 0直到抵 達沸騰-起動閥106爲止，於該處液流會停下來且進行擴散 。如以上所討論地，該沸騰-起動閥106上游之微通道210 會變成含有試樣、限制性內切酶、接合酶及連接子的培育 室。而後加熱器154會被啓動且於一段特定時間內維持著 恆定的溫度以進行限制性消化及連接子接合。

熟悉此技術之工作者應瞭解此培育步驟291 (見第4圖 )爲可隨意選擇的且只有某些核酸擴增檢定類型才會需要 。再者，於某些例子中，在培育期結束時可能會需要一加 熱步驟以將溫度促升到高於培育溫度。溫度促升使得限制 性內切酶及接合酶在進入擴增區112前失活化。當採用等 溫核酸擴增法時該限制性內切酶及接合酶之失活化特別重 要。 培育之後，沸騰-起動閥106會被啓動（打開）且液流 重新進入擴增區112。參考第31及32圖，混合物會不斷地 -62- 201209406 流入蜿蜒組態之受熱微管道158 (其會構成一或多個擴增 室）直到液流抵達該沸騰-起動閥1〇8爲止。如第30圖之示 意剖面圖最佳顯示地，擴增混合物（dNTPs、引子、緩衝 液）會從貯存器60中釋出且接著聚合酶從貯存器62釋出而 進入連接培育區及擴增區（分別爲11 4及112)之中間MST 通道212。

第35至51圖顯示第6圖之插圖AC內的LOC裝置301之膜 層。各圖係在顯示諸膜層之依序增添過程來形成 CMOS + MST裝置48及頂蓋46之結構。插圖AC爲擴增區112 的終點及雜合及偵測區52的起點。經過培育之試樣、擴增 混合物及聚合酶會流過微通道158抵達沸騰-起動閥108。 在擴散混合一段充裕時間後，微通道158內之加熱器154被 啓動以開始熱循環或等溫擴增。擴增混合物經過一既定次 數之熱循環或既有擴增時間以擴增足夠的目標DNA。在核 酸擴增流程之後，沸騰-起動閥108會打開且液流重新流入 該雜合及偵測區52。該沸騰-起動閥之運作將在梢後作更 詳細的說明。 如第52圖顯示地，該雜合及偵測區52具有雜合室陣列 110»第52、53、54及56圖係顯示雜合室陣列110及詳細地 個別的雜合室180。該雜合室180之入口處爲擴散屏障175 ，其可防止目標核酸、探針股鏈及雜合探針在雜合期間於 雜合室180間擴散，以避免錯誤的雜合偵測結果。該擴散 屏障175與流路等長，其長得足以在探針及核酸雜合及信 號偵測期間防止目標序列及探針從一室擴散出來而污染到 -63- 201209406 另一室，如此一來即可避免錯誤的結果·> 另一種預防錯誤讀取之機制爲於數個雜合室中使用同 樣的探針。CMOS電路86會從對應含有同樣探針之雜合室 180之光二極體184得到單一結果。於單一結果推導時，將 不合理的結果淘汰或作不同的加權。

雜合所需之熱能係由CMOS-控制之加熱器182 (以下 將詳細說明）來提供。在加熱器被啓動後，互補的目標-探針序列間會發生雜合。於CMOS電路86中的LED驅動器 29會對位於測試模組10內之LED 26發出信號使其發光。此 等探針在雜合發生時會發出螢光，如此一來可免除移去未 結合股鏈典型需要的清洗及乾燥步驟。如同稍後將更詳細 說明地，雜合迫使該FRET探針186之莖環結構打開，打開 的結構允許該螢光團對LED激發光線發出反應而放出螢光 能量。螢光可藉著襯於各雜合室180底部之CMOS電路86內 的光二極體184來偵測（見以下雜合室之說明）。所有雜 合室之光二極體184及相關的電子零件集合地構成光感測 器44(見第59圖）。於其它具體例中，該光感測器可爲一 電荷耦合裝置陣列（CCD陣列）。來自光二極體184之偵 測信號可被放大且轉變成數位輸出，其可用測試模組讀取 器1 2來分析。稍後將說明該偵測方法更多細節。 LOC裝置之更多細節 設計之模組化 該LOC裝置301具有許多功能區，包括試劑貯存器54 -64- 201209406 、56、58、60及62，透析區70、胞溶區130、培育區114及 擴增區1 1 2、多種閥類型、濕化器及濕度感測器。於該 LOC裝置之其它具體例中，此等功能區可被省略，可添加 其它功能區或該等功能區可被用於以上所述之其它目的。

舉例來說，該培育區Π4可被用來當作串聯擴增檢定 系統之第一擴增區112，且化學胞溶試劑貯存器56可用來 添加引子、dNTPs及緩衝液之第一擴增混合物，試劑貯存 器58可用來添加逆轉錄酶及/或聚合酶。如果要將試樣作 化學性胞溶，可把化學胞溶試劑與擴增混合物一起加到貯 存器56中；另一選擇地，可藉著把試樣加熱一段既定時間 而於培育區中進行熱胞溶。於某些具體例中，如果需要進 行化學胞溶並讓該引子、dNTPs及緩衝液之混合物與化學 胞溶試劑分開，那麼可在緊接著該引子、dNTPs及緩衝液 混合物之貯存器58上游處加入更多貯存器。 在某些情況下可能會需要省略某一步驟，例如培育步 驟291。於此例中，可以特別地製造一LOC裝置以省略該 試劑貯存器58及培育區114;或者簡單地不在貯存器中裝 入試劑；或者若有主動閥，可不啓動主動閥來把試劑配送 到試樣流內，從而該培育區簡單地變成把試樣從胞溶區 13 0輸送到擴增區1 12之通道。加熱器係獨立運作的，當反 應依賴熱時（例如熱胞溶）可啓動加熱器；但是在不需熱 胞溶之LOC裝置中，可用程式控制該加熱器，以確保此步 驟期間加熱器不會被啓動且熱胞溶不會發生。該透析區70 可位於微流體裝置內微流體系統之起點如第4圖所顯示， -65- 201209406

或者可位於該微流體裝置內之任何其它地方。舉例來說， 在某些例子裡透析係在擴增期292之後進行，以於雜合及 偵測步驟294之前先行除去細胞殘渣，這樣會比較有利。 另一選擇地，可在整個LOC裝置之任何地方合倂兩或多個 透析區。類似地，也可以合倂更多擴增區1 1 2，如此一來 可讓多個目標物在以特異性核酸探針作雜合室檢定110進 行偵測之前，先於該等擴增區內同時地或連續地擴增。爲 了分析無需透析之試樣例如全血試樣，可以簡單地從LOC 設計之試樣置入及製備區28 8中省略掉透析區70。於某些 實例中，即使在分析時不需要透析，也不用從LOC裝置中 刪除透析區70。如果透析區的存在不會造成幾何性阻礙， 即使試樣置入及製備區中含有透析區70之LOC仍可使用而 不會損失所需的功能性。

進一步地，該偵測區294可含有蛋白質組室檢定，其 與雜合室檢定相同不過係裝入設計來與未擴增試樣內之試 樣目標蛋白質接合或雜合之探針，而非設計來與目標核酸 序列雜合之核酸探針》 應瞭解地用於此診斷系統之L 0 C裝置乃是依據特定 LOC應用而選擇之功能區之不同組合》對於許多LOC裝置 而言絕大部份的功能區很常見，具有新穎應用之另外的 LOC裝置設計只不過是從既存LOC裝置內所用之功能區作 徹底的選汰並編輯適當的功能區組合。 於此說明中只展示少數的LOC裝置，有更多裝置係示 意地顯示此系統所用之LOC裝置之設計彈性。熟悉此技術 -66 - 201209406 之人士可輕易地了解此等說明顯示之L0C裝置並沒有完全 列舉出來且許多另外的L 0 C設計則有關如何編輯適當的功 能區組合。 試樣類型

LOC變化型可接受及分析多種液體形式之試樣類型的 核酸或蛋白質內容物，此等液體試樣包括但不限於血液及 血液製品、唾液、腦脊髓液、尿液 '精液、羊水、臍帶血 、乳汁、汗、胸腔積液、淚水、心包液、腹水、環境水試 樣及飲料試樣等。從宏觀核酸擴增法得到之擴增子可使用 該LOC裝置來分析；於此例中，所有的試劑貯存器將是空 的或被配置成不會釋出其內容物，該透析、胞溶、培育及 擴增區僅用來把試樣從試樣置入口 68運送到雜合室180以 作核酸偵測，如以上所述。 某些試樣類型會需要預處理步驟，例如在把精液及黏 液放進LOC裝置以前，該精液可能會需要先行液化而黏液 可能需要先用酶預處理以降低黏性。 試樣置入 參考第1及1 2圖，試樣被加到測試模組1 〇之大貯槽24 中。該大貯槽24爲一截頭圓錐，試樣可經由毛細作用流到 該LOC裝置301之置入口 68。在此，試樣會流入該64 μηι寬 χ60 μηι深之頂蓋通道94中，於該處試樣同樣透過毛細作用 被拉向抗凝血劑貯存器54。 -67- 201209406 試劑貯存器

使用微流體裝置之檢定系統（例如LOC裝置301 )所 需試劑的體積很小，使得該試劑貯存器即使只有很小體積 也能含納生化處理所需之所有試劑。此體積可輕易地少於 1，000,000,000立方微米，於大部份的例子來說少於 300,000,000立方微米，典型地少於70,000,000立方微米且 於圖式中顯示之LOC裝置301則少於20,000,000立方微米。 透析區

參考第15至21、33及34圖，病原體透析區70被設計成 能從試樣中濃縮出病原性目標細胞。如先前所描述地，複 數個位於頂壁層66內呈直徑3微米孔洞164形式之小孔可從 試樣主體中過濾出目標細胞。當試樣流過直徑3微米小孔 164時，微生物性病原體會通過該等孔洞進入一系列透析 MST通道204且經由16μιη透析上導孔168流回該目標物通道 74 (參見第33及34圖）。試樣的剩餘部份（紅血球等等） 會留在頂蓋通道94中。在病原體透析區70的下游，頂蓋通 道94變成把廢棄物導到廢棄物貯存器76之廢棄物通道72。 對於會產生實質份量廢棄物之生物試樣類型，可把測試模 組10外殻13內之發泡體插圖或其它有孔元件49配置成能與 該廢棄物貯存器76流體連通（見第1圖）。 該病原體透析區70完全靠流體試樣之毛細作用來發揮 功能。該病原體透析區70上游端之直徑3微米小孔164具有 -68- 201209406 毛細管起動特徵構造（CIFs )1 66 (見第33圖），因此可 把流體拉引到下方的透析MST通道204。目標物通道74之 第一上導孔198也具有CIF 202 (見第15圖）以避免液流簡 易地把彎液面固定在整個透析上導孔168之孔口上。

於第70圖示意地顯示之小型成分透析區682可具有類 似於該病原體透析區70之構造。該小型成分透析區可藉由 不同大小（若有需要，藉由不同形狀）之小孔來把所有小 型目標細胞或分子從試樣中分離出來，以允許小型目標細 胞或分子通過且進入目標物通道及繼續作進一步分析。較 大細胞或分子會被移到廢棄物貯存器766。因此，該LOC 裝置30 (見第1及85圖）並不限於只能分離出尺寸小於3微 米之病原體，也可用來分離任何所需大小之細胞或分子。 胞溶區 回去參考第7、11及13圖，試樣中之遺傳性物質可藉 由化學性胞溶法從細胞中釋出。如同以上討論地，來自胞 溶貯存器56之胞溶試劑會在該胞溶貯存器56之表面張力閥 128下游之目標物通道74內與試樣流混合在一起。然而， 某些診斷檢定更適合採用熱胞溶法，甚至於把目標細胞結 合化學胞溶及熱胞溶來處理。該LOC裝置301可藉著培育 區Π4之受熱微通道210來因應此一問題。試樣流流入該培 育區114且於沸騰-起動閥106處停下來。培育微通道210可 把試樣加熱到細胞膜瓦解之溫度。 於某些熱胞溶之應用中，化學胞溶區130內無需酵素 -69- 201209406 反應且熱胞溶完全取代了化學胞溶區130內之酵素反應。 沸騰起動閥 如以上討論地，該LOC裝置3 0 1具有3個沸騰起動閥 126、106及108。此等閥之位置係示於第6圖。第31圖單獨 顯示位於擴增區112之受熱微通道158末端之沸騰起動閥 108的放大平面視圖。

試樣流1 19藉由毛細作用沿著受熱微通道158被拉引到 沸騰起動閥108。該試樣之前導流彎液面120固定在閥入口 146之彎液面錨98上。該彎液面錨98之幾何性會令前進之 彎液面停止下來以而制止毛細流動。如第3 1及3 2圖顯示地 ，該彎液面錨98爲一從MST通道90通往頂蓋通道94之上導 管開口的小孔。彎液面1 2 0之表面張力令該閥關閉。一環 狀加熱器152圍在閥入口 146的四周，該環狀加熱器152係 透過沸騰起動閥加熱器接點153來由CMOS-控制。

爲了打開閥，該CMOS電路86把一電流脈衝送到該閥 加熱器接點1 53。該環狀加熱器1 52持續地加熱直到液態試 樣119沸騰爲止。沸騰瓦解了閥入口 146之彎液面120且引 發頂蓋通道94濕化。一旦頂蓋通道94開始濕化，毛細流動 重新開始。流體試樣1 1 9充滿頂蓋通道94，流經閥下導管 150到達閥出口 148，於該處毛細驅動液流繼續沿著擴增區 出口通道160進入雜合及偵測區52。液體感測器174則放置 在該閥之前或之後以供診斷。 應瞭解一旦沸騰起動閥被打開，就無法再關上。不過 -70- 201209406 ，由於該LOC裝置301及測試模組10爲用過即丟裝置，所 以也無需再關閉此等閥》 培育區及核酸擴增區

第6、 7、 13、 14、 23、 24、 25、 35至 45、 50及51圖係 顯示培育區114及擴增區112。培育區114，於從下導管開 口 134連到沸騰起動閥106之MST通道層1〇〇中，具有一條 蝕刻成蜿蜒圖型之單一受熱培育微通道210 (參見第13及 14圖）。對培育區114之溫度控制令酵素反應以更佳效能 來進行。類似地，該擴增區11 2有一條從沸騰起動閥106連 到沸騰起動閥1 0 8且呈蜿蜒組態之受熱擴增微通道1 5 8 (見 第6及1 4圖）。此等閥能制止流動，使得目標細胞留在受 熱培育或擴增微通道210或158以進行混合、培育及核酸擴 增。該微通道之蜿蜒圖案亦加快（某些程度地）目標細胞 與試劑之混合。 於培育區1 14及擴增區1 12中，試樣細胞及試劑係採用 脈波寬度調變（PWM)之CMOS電路86調控之加熱器154加 熱。受熱培育微通道210及擴增微通道158之蜿蜒組態的各 個曲徑皆有三個可各別操作之加熱器154於個別的加熱器 接點156間延伸（見第14圖），該等接點可對輸入熱通量 密度作二維調控。如第51圖最佳顯示地，加熱器154係由 頂壁層66來支撐且埋置於下封條64中。加熱器材料爲TiAl 不過也可採用其它導電金屬。該等細長形加熱器154與各 通道區的縱向部份（其構成該蜿蜒形狀之寬曲徑）平行。 -71 - 201209406 於擴增區112中，各個寬曲徑可透過個別的加熱器調控當 作各別的PCR室操作。 採用微流體裝置之檢定系統例如LOC裝置301所需之 擴增子體積很微小，使得擴增區1 1 2進行擴增之擴增混合 物之體積也很小。此體積輕易地可低於400奈升，於絕大 部份的例子中係低於1 70奈升，典型地低於70奈升，於 L Ο C裝置3 0 1之例中則在2奈升到3 0奈升之間。

較高加熱速率及更佳的擴散混合

各通道區之橫切面小可增加擴增流體混合物之加熱速 度。所有流體與加熱器154間保持著相對較短的距離。把 通道切面（此爲擴增微通道1 5 8之切面）縮小到小於 100,000平方微米比採用更“大尺寸”之設備者有更高的加熱 速率。蝕刻製造技術可令擴增微通道158與液流垂直之橫 切面積小於1 6,000平方微米，其提供實質上更高的加熱速 率。藉著蝕刻技術可輕易地提供大小1微米左右之特徵構 件。如桌需要極小擴增子（如於L O C裝置3 0 1之例），那 麼橫切面積可被縮小到低於2,5 00平方微米。對於位於LOC 裝置上含有1, 〇 〇 〇至2，0 0 0個探針且從“試樣置入’，到“結果輸 出”必需短於1分鐘之診斷檢定而言，較佳地其與液流垂直 之橫切面積大小宜介於400平方微米到1平方微米之間。 擴增微通道158內之加熱元件可用每秒超過8〇開（ Kelvin (K))之速度，於大部份的情況下用每秒超過1〇〇 開之速度加熱該核酸序列。典型地該加熱元件可用每秒超 -72- 201209406 過1，000 K之速度加熱該核酸序列，於許多例子中用每秒 超過1 0,000 Κ之速度加熱該核酸序列。常見地，基於檢定 系統之需求，該加熱器可用每秒超過100,000 Κ、每秒超 過1，000,000 Κ、每秒超過10,000,000 Κ、每秒超過 20.000. 000 Κ、每秒超過40，000,000 Κ、每秒超過 80.000. 000 Κ及每秒超過160，000,000 Κ之速度來加熱核酸 序列。

小橫切面面積之通道在把任一試劑與試樣流體擴散混 合時也更有利。在擴散混合完成以前，一液體擴散到另一 液體之擴散作用係在兩者交界處最快。濃度隨著與交界面 間的距離增加而降低。採用與流動方向垂直之橫切面較小 之微通道，可使兩種流體皆貼近交界面流動而能更快速地 擴散混合。把通道橫切面縮小到小於1 00,000平方微米比 採用更“大尺寸”之設備者有更佳的混合速率。蝕刻製造技 術可製得與流路垂直之橫切面積小於1 6,000平方微米之微 通道，其實質地提供更高的混合速率。如果需要微小的體 積（如於LOC裝置301之例），那麼橫切面積可被縮小到 低於2,500平方微米。對於位於1^0(：裝置上含有1，0()0至 2,000個探針且從“試樣-裝入”到“結果-讀出”必需少於1分 鐘之診斷檢定而言，該通道與液流垂直之橫切面積在400 平方微米到1平方微米之間爲適當的。 短暫的熱循環時間 保持試樣混合物貼近加熱器且使用極微小的流體體積 -73- 201209406

可讓核酸擴增期間有快速的熱循環。對於最多150個鹼基 對（bp )長之目標序列而言，每一回熱循環（即變性、結 合及引子延長）係於少於30秒內完成。在大部份的診斷檢 定中，個別的熱循環時間少於1 1秒，大部份會少於4秒。 具有某些最常見之診斷檢定之LOC裝置30對於最長150 bp 之目標序列的熱循環時間爲0.4 5秒到1 . 5秒之間。此速度之 熱循環可令測試模組在遠少於1 0分鐘內，通常在少於2 2 0 秒內完成核酸擴增流程。對多數的檢定來說，該擴增區可 於少於80秒內從進入試樣置入口之試樣流體中產生足夠的 擴增子。對於極多檢定來說，可於30秒內產生足夠擴增子 在完成目前次數之擴增循環後，擴增子可透過沸騰起 動閥1 〇 8被饋送到雜合及偵測區5 2。 雜合室

第52、53、54、56及57圖顯示雜合室檢定110之雜合 室180。該雜合及偵測區52具有24x45個雜合室180之陣列 110，各雜合室皆具有雜合反應性FRET探針186、加熱器 元件182及整合之光二極體184。光二極體184被合倂以偵 測目標核酸序列或蛋白質與FRET探針186雜合產生之螢光 。各光二極體184經由CMOS電路86獨立地控制》介於該 FRET探針186及光二極體184之間的任何物質對該放射光 線來說必需是透明的。據此，該探針186及光二極體184間 的壁區97對該放射光線來說亦爲光學透明的。於LOC裝置 -74- 201209406 301中，壁區97爲一層二氧化矽薄層（約0.5微米）》

直接在各雜合室180底下合併光二極體184可令探針-目標物雜合體之體積很小同時仍能產生可偵測之螢光信號 (見第54圖）。微小的份量允許雜合室有微小的體積。可 偵測量之探針一目標物雜合體需要在雜合前有一份量之探 針，其量輕易地少於270微微克（相當於900,000立方微米 )，於絕大部份的例子中爲少於60微微克（相當於 200,000立方微米），典型地少於12微微克（相當於40,000 立方微米）、且於後附圖式中之LOC裝置301則少於2.7微 微克（相當於9，0 00立方微米）。當然，縮減雜合室大小 允許雜合室密度較高且因而該LOC裝置上可有更多探針。 於LOC裝置301中，該雜合區在1500微米乘以1500微米之 區域內有超過1 000個室（亦即，每室面積少於2250平方微 米）。較小的體積也縮短反應時間，使得雜合及偵測更快 。各室所需之少量探針之另一優點爲製造LOC裝置期間只 需要把極少量探針溶液滴入各室即可。於本發明之LOC裝 置之具體例中可點加1微微升或更少體積之探針溶液。 於核酸擴增後，沸騰起動閥108被啓動且擴增子沿著 流路176流入各雜合室180中（見第52及56圖）。當雜合室 180充滿擴增子時，一端點液體感測器ι78會顯示此現象且 加熱器182被啓動。 經過一段充裕的雜合時間後，該LED 26(見第2圖） 會被啓動。各雜合室180之開口提供一視窗136好讓FRET 探針186暴露在激發輻射下（見第52' 54及56圖）》讓 -75- 201209406 LED 26照射一段夠長的時間以引發來自探針之高強度螢光 信號。激發期間，光二極體1 84被縮短。經過一段程式化 前延遲300(見第2圖），該光二極體184會被激活且在沒 有激發光時偵測螢光放射現象。光二極體184之活性區域 185 (見第54圖）之入射光會被轉變成光電流，其而後用 CMOS電路86來測量。

各雜合室1 80皆裝有用來偵測單一目標核酸序列之探 針。若有需要，各雜合室180可裝有能偵測超過1 000種不 同目標物之探針。另一選擇地，可於許多或所有的雜合室 中裝入同樣探針以重覆地偵測同一目標核酸。於整個雜合 室陣列1 1 0中以此方式重覆裝入此等探針可以增加所得結 果之可信度；若有需要，此結果可與鄰近此等雜合室之光 二極體結合以提供單一結果。熟悉此技術之人士將瞭解視 檢定之規格而定，雜合室陣列1 10上可有1個到超過1 000個 不同探針。

以電化學發光偵測之雜合室 第78、90、115及116圖顯示於L0C裝置之ECL變化型-LOC變化型L 729-採用之雜合室180。於此L0C裝置之具體 例中，該雜合室180之24x45陣列110 (各室皆有雜合反應 性ECL探針23 7 )係搭配整合於CMOS內之對應的光二極體 1 84陣列來安置。以一種類似採用螢光偵測之LOC裝置之 型式，各個光二極體1 84被合倂以偵測目標核酸序列或蛋 白質與ECL探針237雜合產生之ECL。各個光二極體184係 -76- 201209406 獨立地由CMOS電路86控制。再次地，介於探針t 86及光二 極體184之間的透明壁區97對於放射光線而言是透明的。

與各個雜合室180緊鄰之光二極體184在即使探針—目 標物雜合體之量很小時仍能產生可偵測之ECL信號（見第 78圖）。微小的份量可讓雜合室有微小的體積。可偵測量 之探針-目標物雜合體需要在雜合前有一份量之探針，該 份量輕易地爲小於270微微克（相當於900,000立方微米之 室體積），於絕大部份的例子中爲少於60微微克（相當於 200,000立方微米），典型地少於12微微克（相當於40,000 立方微米），且於後附圖式顯示之LOC裝置中則爲少於2.7 微微克（相當於9,000立方微米之室體積）。當然，縮減 雜合室大小允許雜合室密度較高且因而該LOC裝置上可有 更多探針。於所示之L0C裝置中，該雜合區在1500微米乘 以1500微米之面積內可有超過1000個室（亦即，每室面積 少於22 5 0平方微米）。較小的體積也會縮短反應時間，使 得雜合及偵測更快。各室所需之探針量小之另一優點爲製 造LOC裝置期間只需要把極少量探針溶液點加到各室即可 。於圖式顯示之LOC裝置之例中，探針所需份量可用1微 微升或更少的溶液體積點加進來。 於核酸擴增後，沸騰起動閥1 08被啓動且擴增子沿著 流路176流入各雜合室180中（見第52及116圖）。當雜合 室180充滿擴增子時，終點液體感測器178會指示，而可將 加熱器182啓動。 經過一段充裕的雜合時間後，該光二極體184可被激 -77- 201209406 活並收集該ECL信號。該ECL激發驅動器39(見第86圖） 會活化ECL電極860及870化一段既定長短的時間。在ECL 激發電流停止之後，該光二極體184仍繼續活化一段短暫 的時間好讓信號-對·雜訊比値最大。舉例來說，如果光二 極體184保持活性的時間爲發光放射衰減壽命的五倍，那 麼該信號衰減量會低於初始値的1 %。光二極體1 84之入射 光會被轉變成光電流，其而後可用CMOS電路8 6來測量。

濕化器及濕度感測器

第6圖之插圖AG指出濕化器196之位置。該濕化器可 防止試劑及探針於LOC裝置301操作期間揮發。如第55圖 之放大圖最佳顯示地，一貯水器188會與三個蒸發器190以 流體相連。該貯水器188會在製造期間裝入分子生物學-級 水並密封。如第55及60圖最佳顯示地，水被拉入三條下導 管194且藉著毛細作用沿著個別的供水通道192流入蒸發器 190之3條上導管193組。彎液面固定於各個上導管193以保 留水。該蒸發器具有環形加熱器191，其圍住該上導管193 。該環狀加熱器1 9 1藉著連通到金屬頂層1 95之傳導管柱 376連接到CMOS電路86 (見第37圖）。當環狀加熱器191 被啓動時’該加熱器會加熱水而造成蒸發且濕化該裝置之 周圍部份》 濕度感測器2 3 2之位置亦示於第6圖。然而，如第5 8圖 插圖AH之放大圖最佳顯示地，該濕度感測器具有電容性 梳狀結構。一用蝕刻技術蝕刻之第一電極296及另一用蝕 -78- 201209406 刻技術蝕刻之第二電極29 8彼此面對面且其突指交錯間插 。相反的電極形成具有一電容量之電容器，其可用CMOS 電路86來監控。當濕度增加時，電極間空氣間隙的介電常 數會增加，因此電容量也會增加。該濕度感測器232與雜 合室陣列1 10相鄰，於該處濕度測量是最重要的以減緩含 有已暴露探針之溶液的蒸發現象。

反饋感測器 把溫度及液體感測器合倂到整個LOC裝置301中以於 裝置運作期間提供反饋及診斷。參考第35圖，有9個溫度 感測器170散佈在整個擴增區112。類似地，培育區114也 有9個溫度感測器1 70。這些感測器皆係使用雙極性接面電 晶體（BJTs)之2x2陣列來監測流體溫度及對CMOS電路86 提供反饋。該CMOS電路86使用此反饋以精確地控制核酸 擴增期間溫度的循環及熱胞溶及培育期間的加熱作用。 於雜合室180中，CMOS電路86係使用雜合加熱器182 作爲溫度感測器（見第56圖）。該雜合加熱器1 82之電阻 與溫度相關且CMOS電路86利用此特性來得到各個雜合室 180之溫度讀數。 該LOC裝置301也有數個MST通道液體感測器174及頂 蓋通道液體感測器208。第35圖顯示受熱微通道158內每條 間隔曲徑末端處之一排MST通道液體感測器174。如第37 圖最佳顯示地，該MST通道液體感測器174爲由CMOS結構 86之金屬頂層195之暴露區域形成之一對電極。液體會關 -79- 201209406 閉電極間的電路而指出在感測器的位置液體其存在。 第25圖顯示頂蓋通道液體感測器208之放大立體圖。 相反電性之TiAl電極對218及22 0被沉積在頂壁層66上。於 電極218及220之間爲無液體時可保持電路連通之間隙222 。液體之存在會關閉該電路且CMOS電路86採用此反饋來 監測液流。

重力不相關性

測試模組10係與方位不相關的（orientation independent )。它們無需固定在平穩表面上操作。以毛細 驅動液流流動且無外接管路連接輔助設備，使得該模組具 有真正的可攜帶性且可簡單地插入類似的可攜式手持讀取 器例如行動電話。具有與重力不相關之操作性意指該測試 模組在所有實用層級上亦與加速度不相關。它們能耐劇烈 震蕩及擺動且可於移動交通工具上或者於行動電話被帶著 到處走時仍可操作。 透析變化型 具流動通道之透析區以防止截留氣泡 以下說明爲被稱爲L0C變化型VIII 518之LOC裝置的 具體例且示於第64、65、66及67圖。該L0C裝置具有一透 析區，其內充滿流體試樣且沒有截留於通道內之氣泡° L0C變化型VIII 518還有額外一層被稱爲界面層5 94之材料 層。該界面層594係位於CMOS + MST裝置48之頂蓋通道層 -80- 201209406 80及MST通道層100之間。該界面層594可在不增加矽基材 8 4大小下允許試劑貯存器及M S T層8 7間有更複雜的流體互 連》

參考第65圖，旁路通道600係設計來於流體試樣流從 界面廢棄物通道604流到界面目標物通道602時導入時間延 遲。此時間延遲使得該流體試樣流經透析MST通道204而 來到固定有一彎液面之透析上導管168。透過從旁路通道 600通往界面目標物通道6 02之上導管之毛細起動特徵構件 (CIF ) 202，試樣流體會從來自透析MST通道204之所有 透析上導管168之上游之一點開始充滿界面目標物通道6 02 沒有該旁路通道600時，該界面目標物通道602仍會從 上游端開始充塡，不過向前推進的彎液面最後仍會到達且 越過尙未裝滿之MS Τ通道之上導管，而將空氣截留於此點 。被截留的空氣會降低試樣流流經白血球透析區328之流

核酸擴增變化型 平行PCR 數種LOC裝置之變化型具有多個平行運作之擴增區。 例如，第63圖顯示之LOC變化型VII 492具有112.1到112.4 之平行擴增區，其可允許多個核酸擴增檢定同時進行。 第74圖顯示之LOC變化型XI 746亦具有平行擴增區 112.1至112.4，不過另外還有平行培育區114.1至114.4, -81 - 201209406 因此試樣在擴增前可作不同的處理。其它LOC變化型像是 第69圖示意顯示的LOC XIV 641，則顯示出平行擴增區的 數目可爲“X”數，X僅受限於該LOC裝置之大小。可製造較 大的LOC裝置以容納較多數目的平行擴增區。 獨立的擴增區可被配置成對特定的目標物大小或特別 的擴增混合物成分以不同循環時間及/或溫度來處理。當 有數個擴增區平行地運行時，該LOC裝置可於各區執行多 重核酸擴增流程或單一（unipl ex )擴增流程。於多重核酸 擴增法中，係把一個以上之目標序列用一對以上之引子來 擴增。具有“m”個室之平行核酸擴增系統可執行相當於n-重擴增，其中 n = n(l) +n(2) +...+ n(i) +...+ n(m )，且η ( i )爲於室“i”中執行之多重擴增法所用之不同引 子對之數目，應牢記於平行擴增系統中該SNR (信號雜訊 比）係高於單一室系統執行之η-重擴增法。於n ( i )= 1之 特殊例中，室“i”之擴增法變成單一擴增法。

直接PCR 傳統地，PCR需要在製備反應混合物前將目標DNA作 徹底的純化。然而，藉由適當的.變更化學性質及試樣濃度 ，可以在些微DN A純化後進行核酸擴增或者直接進行核酸 擴增。當核酸擴增流程爲PCR時，此方法被稱爲直接PCR 。當LOC裝置中其中核酸擴增係在控制的恒定溫度下進行 時，此方法爲直接等溫擴增法。直接核酸擴增技術用於 LOC裝置時有相當多的優點，尤其是關於所需流體設計之 201209406 簡化方面更是如此。直接PCR或直接等溫擴增法對擴增化 學性質之調整包括增加緩衝液強度、使用具有高活性及連 續效能之聚合酶，以及可螯合可能的聚合酶抑制劑之添加 劑。試樣內抑制劑之稀釋也很重要。

爲了利用直接核酸擴增技術，該LOC裝置之設計倂入 了兩個額外的特徵構件。第一個特徵構件爲試劑貯存器（ 例如第8圖之貯存器5 8 )，其大小剛好可供應足夠份量之 擴增混合物或稀釋劑，因此可能會干擾擴增化學之試樣成 分之終濃度會低得足以成功的進行核酸擴增。非細胞之試 樣成分所需的稀釋程度爲5X到20X的範圍。當能適當地確 定目標核酸序列之濃度被維持在足以擴增及偵測之高程度 時，可採用不同的LOC結構例如第4圖之病原體透析區70 。於此具體例（進一步地於第6圖中顯示）中，試樣萃取 區290之上游有一透析區，其能有效地濃縮小得足以進入 擴增區292之病原體，並排除較大細胞而送至廢棄物貯槽 76。於另一具體例中，係使用透析區來選擇性地除去血漿 中的蛋白質及鹽類而保留欲硏究之細胞。 第二個能支持直接核酸擴增之LOC構造特性爲通道寬 高比之設計以調整試樣及擴增混合物成分之混合比例。舉 例來說，爲了確保單一混合步驟可將試樣中伴隨之抑制劑 稀釋到較佳的5X到20X之範圍，所以試樣及試劑通道之長 度及橫切面都經過設計，於開始發生混合之位置上游處的 試樣通道造成的流動阻抗高出試劑混合物流動通道之流動 阻抗4X到1 9X。對微通道內流動阻抗之控制可透過設計幾 -83- 201209406 何性的控制輕易地達成。當橫切面大小一定時’微通道之 流動阻抗隨著通道長度而線性地增加。對混合設計很重要 地，微通道之流動阻抗更主要地視最小的橫切面尺寸大小 而定。例如，當寬高比非常不一致時’具有長方型橫切面 之微通道的流動阻抗係與最小正交尺寸之立方體呈反比。 逆轉錄酶PCR ( RT-PCR)

當被分析或萃取之試樣核酸物種爲RN A例如來自RN A 病毒或信使RNA之RNA時，在進行PCR擴增前必需先把該 RNA逆轉錄爲互補DNA ( cDNA )。該逆轉錄反應可於進行 PCR之同一室進行（單步驟RT-PCR)或其可以分隔開來的 初反應來進行（兩步驟RT-PCR)。於在此所述之LOC變化 型中，單步驟RT-PCR可簡單地藉著把逆轉錄酶以及聚合 酶加到試劑貯存器62中且以程式控制該加熱器1 54，使得 溫度循環先適於進行逆錄步驟而後再進行核酸擴增步驟。 兩步驟RT-PCR亦可輕易地藉著使用試劑貯存器58儲存及 配送緩衝液、引子、dNTPs及逆轉錄酶且於培育區1 14進行 逆轉錄步驟，接著以正常方式於擴增區112進行擴增來達 成。 等溫核酸擴增 對於某些應用來說，等溫核酸擴增爲一種較佳的核酸 擴增方法，其將擴增區維持在一恒定溫度（典型地約37°C 到4 1°C )而避免以不同的溫度循環重覆地循環加熱反應成 -84- 201209406 分之需求。現在已有數種等溫核酸擴增法已被描述，包括 股置換擴增（SDA )、轉錄媒介擴增法（TMA )、仰賴核 酸序列擴增法（NASBA )、重組酶聚合酶擴增法（RPA ) 、解旋酶-依賴等溫DNA擴增法（HDA)、滾環式擴增法 (RCA )、網狀分枝擴增法（RAM )及環媒介等溫擴增法 (LAMP )，任何一種此等等溫擴增法或其它等溫擴增法 皆可用於在此所述之LOC裝置之詳細具體例中。

爲了進行等溫核酸擴增，臨近擴增區之試劑貯存器60 及62中部再裝入PCR擴增混合物及聚合酶而替代地裝入用 特定等溫方法之適當試劑。例如，就SDA方法而言，試劑 貯存器60含有擴增緩衝液、引子及dNTPs而試劑貯存器62 則含有適當的切口酶及Exo_DNA聚合酶。就RPA方法而言 ，試劑貯存器60含有擴增緩衝液、引子及dNTPs而試劑貯 存器62則含有股替換性DNA聚合酶例如Bsu。類似地’ HDA方法而言，試劑貯存器60含有擴增緩衝液、引子及 dNTPs而試劑貯存器62則含有適當的DNA聚合酶及解旋酶 以代替熱來把雙股DNA鏈解開來。熟悉此.技術人士將瞭解 所需的試劑可以適合該核酸擴增方法之任何方式分置於兩 個試劑貯存器中。 對於來自RN A病毒例如HIV或C型肝炎病毒之病毒性核 酸的擴增而言，NASBA或TMA方法很適合因爲它們不需要 先把RNA轉錄成cDNA。於此實例中，試劑貯存器60內裝 有擴增緩衝液、引子及dNTPs而試劑貯存器62則裝有RNA 聚合酶、逆轉錄酶及任意地RNase H。 -85- 201209406 就某些形式之等溫核酸擴增法來說’在維持溫度以進 行等溫核酸擴增之前可能會需要先有一初步的變性循環來 把雙股DNA模板分離開來。於在此所述之所有LOC裝置之 具體例中此目的可以很容易地達成，因爲擴增區Π2內之 混合物之溫度可由擴增微通道1 5 8內之加熱器1 54小心地控 制（見第1 4圖）。

等溫核酸擴增法對於試樣內可能的抑制劑較有耐受性 ，因此當需要從試樣作直接核酸擴增時此等方法通常較爲 適合。故而，等溫核酸擴增法有時可用在LOC變化型XLIII 673、LOC變化型XLIV 674及LOC變化型XLVII 677，此等 變化型分別見於第71、72及73圖。直接等溫擴增法亦可結 合一或多個擴增前（pre-amplification)透析步驟70、686 或6 82 (如第71及73圖所示）及/或雜合前（prehybridization) 透 析步驟 682 ( 如第 72圖所示 ）， 分 別有助 於在核酸擴增前部份地濃縮試樣內的目標細胞或者在試樣 進入雜合室陣列1 1 0前除去不要的細胞殘渣。熟悉此技術 者應瞭解可採用任何擴增前透析及雜合前透析之組合。

等溫核酸擴增如第63、68及69圖示意表示般也可在平 行擴增區中進行，多重等溫核酸擴增法及某些等溫核酸擴 增法例如LAMP則可與最初的逆轉錄步驟相容來擴增RNA 光二極體 第54圖顯示整合於該L0C裝置301之CMOS電路86之光 -86- 201209406 二極體184。該光二極體184是在沒有額外遮罩或步驟下當 作CMOS電路86之部件來製造。這是CMOS光二極體優於 CCD之一項顯著的優點，CCD爲另一種感測技術，其可使 用非標準加工步驟整合到同一晶片上或者做在鄰近晶片上 。晶片上偵測的成本很低且可縮小該檢定系統之尺寸。較 短的光學路徑可減少周圍環境之雜訊以有效地收集螢光信 號及消除對傳統的透鏡及濾鏡之光學組件之需求。

光二極體184之量子效率爲撞擊在活化區185之光子（ 其有效地被轉變成光-電子）的分率。對於標準矽製程來 說，量子效率於可見光下係在0.3到0.5之範圍，視方法參 數例如該覆蓋層之份量及吸收性質而定。 光二極體184之偵測閾値可決定被偵測之螢光信號之 最小強度。該偵測閾値也能決定光二極體1 84之大小，因 此也決定了雜合及偵測區52中雜合室180的數目（見第52 圖）。室的大小及數目爲受到LOC裝置尺寸大小（於LOC 裝置301之例中，該尺寸爲1 760 μιη X 5824 μηι)限制之技 術參數，實際的估計値在其它功能性模組例如病原體透析 區70及（一或多個）擴增區11 2倂入後才能得知。 對於標準矽製程來說，光二極體184可偵測到最少5個 光子之最小量。然而，爲了確保可信的偵測，其最小量可 設爲10個光子。故而在量子效率爲0.3到0.5之範圍時（如 以上所討論地），探針的螢光發射應爲最少17個光子，不 過就可信的偵測而言應視爲3 0個光子以倂入適當的誤差邊

-87- 201209406 以電化學發光作爲另一偵測方法 電化學發光（ECL )涉及電極表面化學物種之產生， 其而後會進行電子-轉移反應以形成可發射光線之激發狀 態。電化學發光與常見的化學發光不同，其中受激物種的 形成係仰賴電極上的發光團或共反應物之氧化或還原反應 。於此內容中，共反應物爲添加到ECL溶液之額外試劑， 其能增強ECL發射效能。於常見的化學發光中，受激物種 純粹是透過適當試劑之混合來形成。發射性原子或錯合物 傳統地被稱爲發光團。簡要地，ECL係仰賴發光團激發狀 態的產生，於激發狀態會發射出光子。當採用任一種此等 製程時，該激發狀態也可能會採行另一路徑而無法產生所 需之光線放射（即，淬熄）。 使用ECL代替螢光偵測之測試模組之具體例不需要激 發LED。電極係裝置於雜合室內以提供電脈衝來產生ECL 且用光感測器44來偵測光子。該電脈衝之持續時間及電壓 大小會受到控制；於某些具體例中，係以對電流進行控制 來取代控制電壓。 發光團及淬熄物 釕錯合物[Ru ( bpy ) 3]2+，如前文所述係用來當作探 針內的螢光播報器，亦可用來當作雜合室內ECL反應之發 光團，且以TPrA (三正丙胺（CH3CH2-CH2 ) 3N )作爲共 反應物。共反應物ECL的優點爲在光子發射後該發光團並 -88- 201209406 不會被消耗掉且試劑可供此方法重覆地進行。再進一步地 ，該[Ru ( bpy ) 3]2 + /TPrA ECL系統於水溶液內生理相關之 pH條件下仍可提供良好的信號量。可以產生與TPr A及釕 錯合物同樣的或更好的結果之另一種共反應物爲N-丁基二 乙醇胺及2-(二丁胺基）乙醇。

第76圖顯示在以[Ru ( bpy ) 3]2 +爲發光團864及TPrA爲 共反應物866之ECL方法中發生之反應。[Ru( bpy) 3]2 + /TPrA ECL 系統之 ECL 發射 862 係尾隨在[Ru(bpy) 3]2 + 及TPrA兩者於陰極8 60氧化之後。該反應如下：

(2) (3) (4)

Ru(bpy)32+ -e' Ru(bpy)33+ TPrA -e* -> [TPrA*]+ -> TPrA* + H+ Ru(bpy)33+ + TPrA· 4 Ru(bpy)3’2+ + 產物 Ru(bpy)3*2+ Ru(bpy)32+ +ho 發射光線862之波長約爲620 nm且該陰極電勢相對於 Ag/AgCl參考電極約爲 1.1 V。對於[Ru ( bpy ) 3]2 + /TPrA ECL系統，不論是前文所述之黑洞淬熄物（Black Hole Quencher ’ BHQ 2)或愛荷華黑 RQ ( Iowa Black RQ)都是 適當的淬熄物。於在此所述之具體例中，淬熄物爲一開始 就附著在探針上之官能基團，不過在其它具體例中淬熄物 可爲游離在溶液中之個別分子。 ECL偵測之雜合探針 -89- 201209406 反.m - 由 合爲 雜且 示標 顯指 圖子 4 h 9 分 及爲 93稱 第被 常 通 應 單 生 產 ^酸 E , 性核 '股 針 探 針其 探’ 等針 此探 。 環 37莖 之 在雜合到互補核酸時會發光。第93圖顯示與目標核酸序列 23 8雜合前之單一ECL探針237。該探針具有環240、莖242 、於5’端之發光團864及於3’端之淬熄物248。環240係由與 目標核酸序列23 8互補之序列所構成。於探針序列兩邊之 互補序列相互結合在一起而形成莖242。 在沒有互補目標序列時，該探針如第93圖所示般保持 著閉合。莖242使得發光團-淬熄物配對彼此很接近，因此 這兩者間可發生明顯的共振能量轉移，而實質地消滅了發 光團在電化學激發後發射光線的能力。 第94圖顯示打開或雜合組態之ECL探針23 7。在雜合到 互補目標核酸序列23 8以後，該莖環結構會瓦解，螢光團 864及淬熄物248在空間上分隔開來，因此發光團864重獲 發射光線之能力。ECL發射862可光學地偵測到而作爲該探 針已雜合之指標。 由於探針之莖螺旋係設計成比起不互補之單一核苷酸 的探針-目標物螺旋更穩定，所以此等探針會以極高的特 異性與互補目標物雜合。因爲雙股DNA相對地較剛硬，所 以探針-目標物螺旋及莖螺旋共存就空間上來說是不可能 的。 引子-連結之ECL探針 引子-連結之莖環探針及引子-連結之線性探針（另以 -90 - 201209406

蠍探針爲人所知）爲另一種分子指標且可用於LOC裝置之 即時及定量核酸擴增。即時擴增係在L0C裝置之雜合室中 直接進行。使用引子連結探針的好處是探針元件會物理性 地連結上引子，因此在核酸擴增期間只需發生單一雜合事 件而不需要將引子及探針各別雜合。如此一來可確保本反 應比使用各別的引子及探針能更有效地立即發生且產生較 強的信號、較短反應時間及更好的鑑別能力。該探針（以 及聚合酶及擴增混合物）在製造期間被沉積在雜合室180 內，故而該LOC裝置上不需要擴增區。另一選擇地，可將 該擴增區保留不用或者用於其它反應。 引子·連結之線性ECL探針 第95及96圖分別顯示於首輪核酸擴增期間該引子-連 結之線性ECL探針693以及後續核酸擴增期間雜合組態之 ECL探針。參考第95圖，該引子-連結之線性ECL探針693 具有雙股之莖節段242。其中一股會倂入已與引子連接之 探針序列696，其與目標核酸696之一區域同源且於其51端 用發光團864標記，於31端則透過擴增阻斷物694連接到一 寡核苷酸引子7〇〇。該莖242之另一股於3'端用淬熄物分子 248標記。在首輪核酸擴增完成後’該探針會再圈成環狀 且現在藉互補序列698雜合到延伸股上。在首輪核酸擴增 期間，該寡核苷酸引子7〇〇會結合到目標DN A 23 8上（見第 95圖）且然後延伸，形成同時含有探針序列及擴增產物之 DN A股鏈。擴增阻斷物694會防止聚合酶讀取並拷貝探針 -91 - 201209406

區域696。於後續的變性過程中，延伸的寡核苷酸引子 700/模板雜合體會脫離，同樣地該引子-連結之線性探針之 雙股莖部242也會脫離以釋出該淬熄物24 8。一旦溫度降低 以進行結合及延伸步驟時，該引子-連接之線性ECL探針之 引子連接探針序列696會捲曲起來且雜合到該延伸股上之 擴增互補序列69 8且光線發射被偵測到而顯示有目標DNA 存在。未延伸之引子連接之線性ECL探針則保有它們的雙 股莖部且光線發射仍維持在淬熄狀態。此偵測方法特別適 合快速偵測系統，因爲它依靠單-分子流程。 引子連結之莖環ECL探針

第97A至97F圖顯示引子·連結之莖環ECL探針705之操 作。參考第97A圖，該引子-連結之莖環ECL探針705具有 互補之雙股DNA的莖部242及合倂探針序列之環部240。其 中一股莖部股708於5’端用發光團864標記。另一股71 0於3' 端用淬熄物248標記且攜有擴增阻斷物694及寡核苷酸引子 700。於最初變性期期間（見第97B )，目標核酸23 8之雙 股彼此分離，該引子-連接之莖環ECL探針705之莖部242亦 如此。當溫度在結合期冷卻時（見第97C圖），於引子-連 接之莖環ECL探針705上之寡核苷酸引子700會雜合到該目 標核酸序列23 8。於延伸期間（見第97D圖），該目標核酸 序列2 3 8之互補體706被合成且形成含有探針序列705及擴 增產物之DNA股。該擴增阻斷物694可防止聚合酶讀取及 拷貝該探針區域705。當探針於變性之後結合（見第97E圖 -92- 201209406 )時，該引子-連接之莖環ECL探針705之環節段240之探針 序列（見第97F圖）會結合到延伸股上的互補序列706。此 組態把發光團864留在離淬熄物248相對較遠處，使得光線 發射顯著提高。 ECL控制探針

雜合室陣列110包含一些具有正向及反向ECL控制探針 之雜合室180以供檢定品質控制。第98及99圖示意地顯示 不含發光團之反向控制ECL探針786，且第100及101圖則爲 不含淬熄物之正向控制ECL探針787之略圖。該正向及反向 控制ECL探針具有類似以上所述ECL探針之莖環結構。然 而，不論該等探針係雜合成爲打開組態或保持閉鎖，一 ECL信號862 (見第94圖）總是由正向控制ECL探針787發 射出來且反向控制ECL探針786不會發射ECL信號862。 參考第98及99圖，反向控制ECL探針786不具發光團（ 及可以或不可具有淬熄物248)。因此，不論該目標核酸 序列23 8係與第99圖顯示之探針雜合，或者該探針仍保持 著如第98圖所示之莖部242及環部240組態，該ECL信號皆 可忽略。另一選擇地，反向控制ECL可被設計成總是保持 著淬熄狀態。例如，可令該探針具有不會雜合到硏究試樣 內之任何核酸序列之人造探針（環）序列240，使得該探 針分子之莖部242與自己再雜合且發光團及淬熄物維持著 很接近而不會有可察覺的ECL信號被偵測到。此反向控制 可解釋任何淬熄不完全而發生之低量發射。 -93- 201209406 相反地，該正向控制ECL探針78 7如第100及101圖所示 地被建構成不含淬熄物。不論該正向控制探針787是否與 目標核酸序列2 3 8雜合，沒有任何東西會淬熄來自發光團 864 之 ECL 發射 862。

第91及92圖顯示建構正向控制室之另一種可能性。於 此例中，可在密封以避免接觸擴增子（或任何含有目標分 子之液流）之校準室3 82中裝入ECL發光團溶液，使得電極 處總能偵測到正信號。 類似地，該控制室可爲反向控制室，由於該控制室缺 乏入口所以可防止任何目標物接觸探針，從而永遠不會偵 測到ECL信號。

第52圖顯示遍佈於雜合室陣列110之該正向及反向控 制探針（分別爲3 7 8及380 )之可能分佈。對ECL而言，正 向及反向控制ECL探針786及78 7分別可用控制螢光探針378 及3 80來取代。該控制探針可沿著雜合室陣列1 10之斜對角 線安置於雜合室1 80中。不過，陣列內控制探針之配置是 隨意的（如同雜合室陣列Π 0之組態般）。 ECL偵測之校準室 該光二極體1 84 (其對任何存在於感測器陣列之周圍 光線以及來自陣列其它位置之光線有反應）之電學特性之 不一致性會引入背景雜訊且偏移到輸出信號內。此背景會 透過雜合室陣列1 10內之校準室3 82從各輸出信號中除去， 該陣列可以不含任何探針、含有無ECL發光團之探針或者 -94- 201209406 含有具發光團及淬熄物但設計成總在淬熄狀態之探針。遍 佈雜合室陣列之校準室382的數目及配置係隨意的。不過 ，如果光二極體184由較接近的校準室382來校準時，校準 會比較正確。參考第116圖，該雜合室陣列110於每八個雜 合室180就有一個校準室382。亦即，校準室3 82係位於排 成3x3正方形形狀之雜合室180的中央。於此組態中，雜合 室18 0係由緊鄰之校準室382來校準。

第75圖顯示一微分影像器電路（differential imager circuit ) 788，其可把施加電脈衝之後對應於校準室382之 光二極體184所產生之信號從周圍雜合室180之ECL信號中 扣除下來。該微分影像器電路78 8會從像素790及“虛擬”像 素792中採樣信號。由室陣列區域之周圍光線產生的信號 也會被扣除下來。來自像素790之信號很微弱（即，接近 暗信號），在沒有暗程度之參考時很難區別是背景信號或 者是極弱信號。 使用期間，“讀取列（read_row ) ”794及“讀取列d ( read_row_d) ”795被活化且M4 797及MD4 801電晶體被啓 動》開關807及809被關閉，使得來自像素790及“虛擬”像 素792之輸出分別被儲存於像素電容器803及虛擬像素電容 器8 05中。在像素信號被儲存以後，開關8 07及8 09會被失 活化。而後該“讀取行（read_col) ”開關811及虛擬“讀取 行”開關813會被關閉且輸出之切換式電容放大器815會放 大該微分信號8 1 7。 -95- 201209406 ECL量及信號效率 ECL之正常的效率度量値爲每一“法拉第”電子（即， 每一參與電化學之電子）得到之光子數。該ECL效率以 ♦ ECL表不： Φεα = [ΐάτ

其中I爲每秒光子強度’ i爲電流安培數，F爲法拉第常 數及NA爲亞佛加厥常數。 共反應物ECL之效率

湮沒（annihilation ) ECL於去氧、非質子溶液（例如 ’氮沖洗之乙腈溶液）簡單得足以作效率測量，且φΕ(：Ι^之 —致許可値爲約5%。然而，一般認爲共反應物系統無法有 意義的直接測量效率。替代性地，發射強度係藉著與易製 備之標準溶液例如以同樣格式測量之Ru ( bpy ) 32 +比對來 衡量。此文獻（見於例如J. K. Lei and and M. J. Powell， J. El ectrochem. Soc.，137，3 1 2 7 ( 1 990 )，以及 R. Pyati and Μ. M. Richter > Annu. Rep. Prog. Chem. C, 103，12-78 (2007 ))指出（沒有促進劑例如界面活性劑）：RU ( bpy ) 32 + ECL與TPrA共反應物之效率峰値相當於湮沒ECL 於乙腈見到程度之5% (例如2%效率；見於I. Rubinstein & A. J . Bard，J. Am . Chem. Soc., 1 03 5 1 2 - 5 1 6 ( 1 9 8 1 ))。 -96- 201209406 ECL電位

Ru(bpy) 32 + /TPrA系統之工作電極之電壓爲約+1.1 V (於文獻中一般係相對於Ag/AgCl參考電極來測量）。這 麼高的電壓會縮短電極壽命，不過這對於用過即丟裝置例 如本發明診斷系統所用之LOC裝置而言並不是問題。

陰極及陽極間的理想電壓視溶液成分及電極材料之組 合而定。選擇正確的電壓需要在最高信號量、試劑及電極 穩定性，及活化不良副反應（例如室內之水之電解）間取 捨妥協。在緩衝的水性Ru ( bpy ) 32 + /共反應物溶液及鉑電 極之測試中，該ECL發射最高是2.1-2.2 V(視共反應物之 選擇而定）。當電壓在低於1.9V及高於2.6V時發射強度會 跌到<75%峰値，當電壓在低於1.7V及高於2.8V時發射強度 會跌到<50%峰値。因此，此類系統中ECL運作時較佳的陰 極-陽極電壓差爲1.7-2.8¥，以1.9-2.6¥的範圍爲特佳。 如此一來可讓與電壓呈函數關係之發射強度達到最高，而 避免會在電極處造成明顯的氣體逸失之電壓。 ECL發射波長 ECL發射光862之波長具有約620 nm (於空氣或真空測 得）之強度峰値，且該發射涵蓋相當廣的波長範圍。顯著 的發射係在約5 50 nm到700 nm之波長。再者，高峰發射波 長因活性物種周圍的化學環境不同可有約1 〇%之變動。在 此所述之LOC裝置具體例，其不含波長-特異之濾鏡，對於 -97- 201209406 捕捉這類廣幅又會變動之光譜的信號有兩個優點。第一個 優點爲靈敏性：任何波長的濾鏡（即使在其通頻帶內）都 會減少光線穿透，所以不包含濾鏡時效率會改善。第二個 優點爲彈性：在作些許試劑改變之後就無需調整濾鏡通頻 帶，且信號比較不依賴輸入試樣之非目標成分之些微差異

參與ECL之溶液體積 ECL係依賴溶液內發光團（及共反應物）之可利用性 。然而，如第78圖顯示地，受激物種868只在接近電極860 及870之溶液872中產生。於在此所示之模組中該參數邊界 層之深度爲可產生受激物種868之電極860周圍之溶液872 層之深度。 此爲一種簡化結果，因爲溶液動力學特性會導致可利 用濃度升高或降低：

可利用性升高：擴散及電泳效應可容許與較多溶液互 換。 可利用性降低：試劑吸附在電極上且變得無法用於 ECL過程中。 當邊界層深度値爲0.5 μηι時，可觀察到以下現象： 在結合使用直徑最大4.5 μπι之磁珠來把發光團864吸 引到陰極860上之實驗中可以觀察到ECL。 在指狀叉合之電極陣列中，可以發現到與電極間距呈 函數關係之Ru ( bpy ) 32 + /TPrA ECL發射862係在電極間距 -98- 201209406 0.8 μηι時最大。當電極間距約爲2 μηι時，水性溶液8 72有 共反應物866之需求會提高。此現象顯示受激物種868會擴 散數微米，其暗示著該受激物種係以類似於基態的尺度來 進行擴散性交換。 穩定狀態及脈衝式操作

在電極860及870脈衝式活化期間，該ECL發射862強度 (見第94圖）一般會高於該電極於穩定狀態活化時發射 862之強度。據此，電極860及870之活化信號係由CMOS電 路 86 來作脈寬調制（pulse-width modulated (PWM))。 試劑再循環及物種壽命 在Ru ( bpy ) 32 + /TPrA ECL系統中Ru錯合物並不會被 消耗掉，因此發射8 62之強度並不會隨著後續反應循環而 降低。該速率限制性步驟之壽命約爲0.2毫秒且可提供約1 毫秒之總反應循環時間。 電泳效應及其它限制 鑑於雜合室中溶液之複雜性，當ECL電壓啓動時會有 多種現象發生。巨分子電泳、歐姆傳導及小離子遷移之電 容性效應會同時發生》 寡核苷酸（探針及擴增子）之電泳會使得探針-目標 物雜合體之偵測變得複雜，因爲DNA帶有很強的負電荷且 被吸附在陰極860上。此種活動之時間尺度典型地很短（ -99- 201209406 以毫秒尺度來論）。即使電壓強度只有中等強度（約1 v )電泳效應還是很強，因爲陰極860及陽極870間分隔距離 很小。 在某些LOC裝置之具體例中電泳會增進ECL發射862且 降解其它發射。此現象體現在增加或縮減電極間距時電泳 效應會相隨地增加或減少。於光二極體184上方之陰極860 及陽極8 70之指狀交合代表此等間距最小之極端例。此等 配置即使碳電極860及870間沒有共反應物8 66也可以產生 ECL 〇 歐姆加熱（D C電流） 把ECL電壓維持在約2.2 V所需之電流可參考第79圖示 意顯示之ECL電池874來決定。 流經室之DC電流係由兩種阻抗來決定：電極860及870 與溶液主體間之界面電阻Ri，及衍生自主體溶液導電度及 傳導路徑幾何性質之溶液電阻Rs。對於離子強度與該LOC 裝置之條件相關之溶液而言，室電阻係由電極8 60及8 70之 界面電阻來主宰而Rs可被忽略。 界面電阻之影響係透過度量於該LOC裝置之電極幾何 性質下通過類似溶液之巨視電流量來估計。 所採用的是使用鈾電極、通過類似溶液之電流密度之 巨視測量法。與採用最差實例（高電流）方式一致地，測 試溶液中整體離子強度及ECL反應物濃度係高於LOC裝置 所使用者。陰極面積小於陽極面積，且由具有環幾何性質 -100- 201209406 之相當面積之陽極來圍繞。對於直徑2 mm圓形所組成之陰 極而言，測得的電流爲1 · 1 mA，可產生3 5 0 A/m2之電流密 度。 於加熱模式中，該電極面積爲第79圖示意顯示之正方 形環狀幾何性質。陰極爲寬1 μηι及厚1 μηι之環。表面積爲 1 9 6平方微米且因而計算電流1 = 69 ιιΑ。

加熱（功率=V2/R )係以最差實例爲模型來設計，於 該最差例中所有的熱都用來提高室內水的溫度。如果不讓 LOC裝置主體排除熱，那麼此現象會以5.8°C/s的速率加熱 室內容物且有2.2 V之電壓差。 以約20°C加熱諸室會使大部份的雜合探針變性。對於 用於突變偵測之高特異性探針而言，最好進一步地把加熱 限制在4°C或更低。以此種程度之溫度穩定性，使用適當 的設計序列可以達到單鹼基錯誤配對-靈敏性雜合。此舉 可允許偵測突變及單核苷酸多形性層次之等位基因差異。 因此該DC電流會被施加到電極8 60及870爲時0.69秒以把加 熱限制在4°C。 通過室之約69 ιιΑ之電流係難以當作微莫耳濃度之ECL 物種之法拉第電流來容納。故而，電極860及870之低功 率-循環脈衝（l〇w-duty-cycle pulsing )可進一步地減少加 熱（降至1°C或更少）同時維持足夠的ECL發射862，並不 會引入與試劑耗竭相關之混亂。於其它具體例中，電流會 降至〇. 1 nA，其除去電極以脈衝活化之需求。即使電流低 如0.1 nA，ECL發射8 62仍具發光團-限制性。 -101 - 201209406 室及電極幾何性質 使ECL發光及光感測器間達最佳光學耦合 產生ECL發光最直接的化學前驅物係在離工作電極幾 奈米範圍內產生。再次參考第78圖’光發射（受激物種 868) —般係在離該位置數微米或更短的距離內發生。因 而緊鄰工作電極（陰極860 )之體積可被該光感測器44對 應之光二極體184感受到。據此，電極860及870直接緊鄰 著光感測器44內對應之光二極體184之活性表面區域185。 進一步地，該陰極860會被塑造成可增加被光二極體184“ 感測到”之側邊長度之形狀。此目的在於令可被襯底之光 二極體184偵測到之受激物種86 8的體積達到最大。 第77圖示意地顯示該陰極860之3個具體例。梳狀結構 之陰極878具有平行之突指880可與陽極870之突指指狀交 合之優點。該指狀交合之組態示於第84圖，於第90及92圖 爲LOC布局之部份視圖。該指狀交合之組態提供較窄（1 至2微米）之均勻介電隙（dielectric gap) 8 76 (見於第78 圖）且該指狀交合之梳狀結構對於蝕刻製法來說相對地簡 單。如以上所討論般，電極860及8 70間相對較窄之介電隙 876可排除某些溶液8 72對共反應物之需求，因爲受激物種 8 6 8會在陰極及陽極間擴散。排除掉對共反應物之需求可 除去共反應物對不同檢定化學性質可能的化學性衝擊且提 供更廣範圍之可能檢定方案。 再次參考第77圖，陰極860之某些具體例具有蜿蜒組 -102- 201209406 態8 82。爲了在邊長大時仍能保有耐受製造錯誤之能力， 很省事地就是做成寬的矩形曲徑8 84。

若有需要或者想要，陰極可具有更複雜的組態8 8 6。 例如’其可具有細圓齒區888，分支結構890或這兩者之組 合。倂有分支結構890之LOC設計之部份視圖示於第1 15及 11 6圖。更複雜的組態例如886可提供長側邊，因爲要把緊 密相間之對向陽極圖型化更爲困難，所以此組態最適合採 用共反應物之溶液化學。 電極厚度 大致上，ECL電池涉及從外面看起來呈平坦狀之工作 電極。同樣地，傳統的金屬層之微製造技術易形成金屬厚 度約1微米之平坦結構。如同稍早指出且示意地顯示於第 77、80及81圖地，增加側邊長度可加強ECL發射及光二極 體184間的耦合。 進一步提高光二極體184對發射光線8 62 (見第94圖） 之收集效率之第二種策略爲增加陰極8 60之厚度。此示意 地示於第78圖。緊鄰工作電極壁之參與體積892之部份爲 最有效率地耦合到光二極體184之區域。故而，對於一既 定寬度之工作電極860而言，發射光線862之總收集效率可 藉著增加該等電極之厚度來提高。再者，由於不需要高電 流攜帶電容，所以只要實用上可行那麼工作電極860之寬 度可予以縮小。電極860及8 70之厚度不可以無限制地增加 。應注意該特徵構件及電極之分離尺度大約在1微米之等 -103- 201209406 級，且液體充塡對寬度比深度更大之間隙不利，而電極之 最佳實用厚度爲0.25微米到2微米。 電極間距 電極860及870間之間距對於LOC裝置（尤其是電極爲 指狀交合之具體例）內信號之品質很重要。於陰極860呈 分支結構之具體例如第7 7及8 1圖所示，相鄰元件間之間距 也很重要。ECL發射效率及發射光線之收集效率兩者皆應 達到最大。 電極間距在1微米或更小之層級對ECL發射之發生最有 利。當ECL係在沒有共反應物之存在下進行時，間距小特 別有利。該間距相當於發射光線862之波長之事實的重要 性有限。故而，在諸多具體例中（其放射光線8 62 (見第 94圖）之測量係在無需光線在電極860及8 70間傳遞之位置 時），其目標通常爲讓電極間距在實用允許範圍內儘量地 小。然而，於放射光線862必需在電極8 60及8 70間傳遞之 具體例中，除了考慮ECL發射過程以外，還要考慮光的波 動性質。 來自Ru(bpy) 32+之ECL的發射光線862之波長爲約 620 nm，且故而於水中爲460 nm( 0.46微米）。於光二極 體184及ECL受激物種868係位於該電極結構之不同側且該 電極結構爲金屬質之具體例中，該發射光線862必需通過 金屬結構之元件間的間隙。如果該間隙相當於該光線之波 長，那麼繞射通常會降低到達光二極體1 84之傳播光線之 -104- 201209406 強度。然而，於該發射光線862係以大角度入射到該間隙 時，衰減模態耦合（evanescent mode couPling)可被用來 改善收集信號之強度。LOC裝置採用兩個措施以增強光二 極體184及發射光線862間的耦合效能。 首先，金屬元件間的間隔不可小於發射光線於水之波 長，即約0.4微米。再結合與指狀交合電極間之微小間距 相關之其它觀察値時，則表明電極間距之最佳範圍爲〇·4

到2微米。 其次，令元件到光二極體1 8 4間之間隙距離最小化。 於在此所述之LOC裝置之具體例中’此一要求指出電極 860及870與光二極體184間之膜層總厚度宜爲1微米或更小 。於諸電極與光二極體間有多個膜層之具體例中’將其厚 度安排成四分之一波長或四分之三波長還具有抑制發射光 線8 62之反射作用的額外好處。 電極模式 第78圖爲雜合室中電極860及870之示意性部份橫切面 圖。佈滿受激物種868之陰極860之側周邊周圍的體積有時 被稱爲參與體積8 92。在陰極860上方之遮斷區域8 94可以 忽略，因爲其對光二極體184之光耦合是微不足道的。 一種決定某一特殊電極組態是否能對襯底之光二極體 184提供ECL發射862基礎之技術將參考第79、80及81圖說 明如下。 第79圖爲一種環狀幾何結構，其中陰極860圍繞著光 -105- 201209406 二極體184之周緣。於第80圖中，陰極860位於光 184邊緣內。第81圖顯示一種更複雜的組態，其中 8 6 0具有一系列平行突指8 8 〇以增加其側緣之長度。 對於以上所有之組態，模式計算如下。 就溶液之參與體積892 VECL而言，發射器之有 N e m 爲· Nem = N|um.Tp/TECL = VECLCLNA-tp/TECL (6) 其中發光團之參與數目Nlum= VeclClNa，τΕ EC L過程之壽命，CL爲發光體濃度，τρ爲脈衝持續 及Να爲亞佛加厥數。 等向發射光子之數目^^^^爲： Nphot = <l>ECL Nem (7) 其中<))ecl爲ECL效率，其定義成單一發光團之 應發射之光子平均數目。 而後，來自光二極體之電子信號計數S爲 S_Nph〇t.<|)〇<|)q， （8) 其中爲光耦合效率（光二極體184吸收之光 )及Φς爲光二極體量子效率。故而信號爲： S = VECLCLNA^EMq (9) TECL 對於第79及80圖之電極組態而言，φ。爲： (|)。= ( 2 5% :導向光二極體184之光子量） X ( 10%:未反射之光子量） 即對於第79及80圖顯示之組態而言，Φ。= 2.5% 二極體 該陰極 效數目 CL爲該 時間， ECL反 子數目 -106- 201209406 對於第81圖之電極組態而言，有50%光子朝向光二極 體184之方向發射，不過爲角度之函數之吸收效率是不變 的，因此 φ。= ( 50% :導向光二極體之光子量） X ( 10%:未反射之光子量） 即對第8 1圖之組態而言，φ。= 5%。

參與體積8 92視該電極組態而定，且其詳細說明見於 對應章節中。 諸項計算的輸入參數列示於下： 表 5 : 輸入參數

參數 數値 評論 發光團濃度CL 2.89 μΜ 先前計算之探針濃度 ECL循環期(壽命)τΕα 1 ms 發光團諸反應步驟之合倂壽命 邊界層深度D 0.5 μιη 參與ECL之溶液之有效體積 (包括擴散及電泳） 電流施加持續時間τρ 0.69 s 選擇把歐姆加熱限制在4°C 洳先前所述） 室X尺寸 28 μιη 室Υ尺寸 28 μπι 室高度Ζ 8 μιη 光二極體X尺寸 16 μιη 光二極體Υ尺寸 16 μιη 電極厚度 (即，暴露緣高度） 1 μηι 電極層最小寬度及間隙 1 μπι 製程臨界尺寸 電極界面電流密度 350 A/m2 0於歐姆加熱 溶液體積電阻 0.5 Ω. m 用於歐姆加熱 施加之電壓差(工作電極-相反電極） 2.2 V -107- 201209406 光二極體周圍之環幾何結構 參考第79圖，陰極860爲環繞光二極體184周圍之環。 於此組態中，該參與體積892爲： VECL = 4χ[(電極壁旁的膜層） + (電極壁上方之四分之一圓柱）] 計算結果： 從0.5 μιη邊界層產生之光子數：3.1Μ05 光二極體之電子計數： 2.3χ103 此信號可輕易地被LOC裝置光感測器44之襯底光二極 體184偵測到。 增加周緣長度之附加突指 參考第81圖，於整個陰極8 60加上平行突指880 »只有 圖式中之水平緣提供參與體積892，以避免重覆計數垂直 緣。因而該參與體積892爲： VECL=(8x2) X [(電極壁旁的膜層）+ (電極壁上方 之四分之一圓柱）] 第8 1圖組態計算之結果： 從0.5 μιη邊界層產生之光子數：1.1Μ06 光二極體184之電子計數： 8.〇χ1〇3 此信號可輕易地以光二極體1 84測得。 -108- 201209406 完全覆蓋

第82及83圖顯示之組態可當作最大表面區域耦合之極 限例。在實務上，電極表面區域與光二極體184之活性表 面區域185間有90%或更佳耦合就已達到近乎最佳結果，即 使光二極體活性表面區域185對電極表面區域只有50%耦合 也能提供完全覆蓋組態之大部份優點。完全覆蓋可由兩具 體例來達成：第一具體例，如第82圖示意顯示地，係採用 一透明陰極860，該陰極係置於與該光二極體184之平面平 行的平面上且有一面積區域與該光二極體184之面積區域 匹配，將該陰極緊鄰該光二極體184安置，使得發射光線 862可通過該陰極到達光二極體上。於第83圖示意顯示之 第二具體例中，再次地陰極860與該光二極體區域平行且 該陰極與該光二極體區域配準（registered with the photodiode area)，不過有溶液872塡滿陰極860及光二極 體1 84間之空洞之處。爲了建立完全覆蓋組態之信號模式 ，陰極被假設爲該光二極體184上方之一層完整層，其有 —半光子被導向光二極體184 (吸收效率仍爲10%)。 從0.5 μιη邊界層產生之光子量：7.7 MO5 光二極體之電子計數： 1.2Χ104 可使用界面活性劑及把探針固定在陰極上來改善該信 號及檢定而超越以上模式。 ECL探針及光二極體間之最大間距 -109- 201209406

晶片上之雜合偵測可避免經由共焦顯微鏡來偵測之需 求（見發明背景）。此舉悖離傳統偵測技術乃爲本系統節 省時間及成本之重要因素。傳統偵測需要使用透鏡或彎曲 鏡面來光學成像。藉著採用非光學成像，該診斷系統可避 免對複雜及龐大光學元件串之需求。把光二極體緊密地置 於探針旁具有提供極高收集效率之優點：當探針及光二極 體間之材料厚度係在1微米之層級時，該發射光線之收集 角度會高達174°。此角度係考慮從最接近該光二極體（其 具有與該雜合室表面平行之平坦活性表面）之雜合室表面 的形心處之探針發射出之光線來計算。光線可被光二極體 吸收之發射角圓錐係定義成以發射探針爲頂角且感測器角 落爲其平坦面之周界。對於16微米χ16微米之感測器而言 ’此圓錐之頂角角度爲170°;於極限例中（其中光二極體 擴展開來，使其面積能匹配28微米χ26·5微米雜合室之面 積），該頂角角度爲174°»可以輕易地令室表面與光二極 體活性表面間有1微米或更小的間距。 採用非光學成像方案需要光二極體184與雜合室非常 接近以收集足夠的螢光發射之光子。光二極體及探針間最 大間距可用以下方式決定。 使用一钌螯合發光團及第8 1圖之電極組態，我們計算 出個別雜合室之16微米X16微米感測器吸收了 27,000個光 子，假設感測器量子效率爲30%則可產生8000個電子。在 進行此計算時，我們假設雜合室之集光區具有與感測區相 同之底面積，全部的雜合光子中有四分之一的角度朝向感 -110- 201209406 測器，未從感測器-介電界面散射掉之光子的比率保守地 估計値爲1 〇%。亦即，該光學系統之光線蒐集效率 = 0.025。 更精確地我們可以寫出也=[(雜合室集光區之底面 積）/ (光偵測器面積）][Ω /4π][10%被吸收量]，其中Ω = 雜合室基底代表點上之光偵測器對向之立體角。對於正四 角錐幾何來說：

Ω = 4arcsin ( a2/ ( 4d〇2 + a2))，其中 d〇 =該室與光二 極體間之距離，且a爲光二極體之尺寸》 各雜合室可釋出1. 1 X 1 〇6光子。所選之光偵測器之偵測 閾値爲17個光子，當dQ値大於感測器大小之10倍時（即， 基本上爲正入射時）感測器表面未反射之光子的比率可從 10%增加到90%。故而，所需之最小光學效率爲： φ0 - 17/ ( 1.1χ106χ〇.9) - 1.72xl0's 該雜合室180之發光區的底面積爲29微米χ19.75微米

求解d〇，我們得到雜合室底面及光偵測器間的最大極 限距離dQ = 1 600微米。於此限制內，以上定義之收集圓 錐角度只有0.8°。應注意此分析忽略折射的些微影響。 LOC變化型 在此所述及以上完全顯示之LOC裝置301只是許多可 能之LOC裝置設計的其中之一而已。使用上述不同功能區 進行不同組合之LOC裝置變化將從試樣置入到偵測一路描 -111 - 201209406 述下來及/或以示意流程圖來顯示以展現一些可能的組合 。在適當的情況下’該流程圖會被區分成試樣置入及製備 階段2 8 8、萃取階段290、培育階段291、擴增階段292、雜 合前階段293及偵測階段294。對於以上簡述或僅以示意形 式表示之所有LOC變化型而言’爲求簡潔明瞭’並沒有顯 示所有隨同的完整佈局。同樣地爲求清楚起見’並沒有顯 示較小的功能性單元例如液體感測器及溫度感測器’不過 應理解於各個以下LOC裝置設計中此等單元已被併入適當 的位置。 具有透析裝置、LOC裝置及互連性頂蓋之微流體裝置 一具有透析裝置784、LOC裝置785及互連性頂蓋51之 微流體裝置78 3能提供更好的模組性及更高的靈敏度。相 對於組合所有功能（例如第89圖之LOC變化型729 )之LOC 設計，把透析功能從LOC裝置分離出來可容許開發出不同 的特製化透析裝置7 84以選取不同目標物。此等特製化透 析裝置784與一LOC裝置7 85及一互連性頂蓋51組合而構成 完整的檢定系統。再者，還可開發出最適合不同檢定策略 之不同LOC裝置78 5且與不同透析裝置7 8 4協作，如此一來 可提供極有效及彈性的方法來開發系統。也可以發展無透 析裝置之LOC裝置以供特殊應用，或者組合多個LOC裝置 785 〇 該微流體裝置783之各個表面-微機電晶片構造可採用 最佳及最具成本效益之製造方法來製備。例如，透析區 -112- 201209406 7 84不需CMOS電路及可用較便宜材料及較少製程步驟來製 造。進一步地，較大及最適化之透析裝置7 84可提供檢定 系統較佳靈敏度、信號對雜訊比及動態範圍。

如第102圖圖解顯示地，該微流體裝置783可利用12個 各別的擴增室（Ϊ 12.1至112.12)來製備試樣288，然後萃 取290，培育291、擴增292及偵測294病原性DNA。該組件 採用複數個擴增室以增加檢定靈敏度及改善信號對雜訊比 »此1^〇0：裝置使用雜合室陣列110.1至110.12之丑(：1^來偵測 探針-目標物雜合體。系統模組化可讓不同透析裝置7 84 被採用以偵測液體試樣內之其它目標物，例如白血球、紅 血球、病原體或者分子像是游離蛋白質或DNA，雖然目前 的說明係描述病原性DN A之偵測，不過熟悉此技術者應理 解該微流體裝置783不限於只能偵測這一個目標物。 第103圖顯示具有透析裝置784、LOC裝置785及互連 性頂蓋51之微流體裝置78 3。互連性頂蓋51係由貯存器層 78、頂蓋通道層80及界面層594所組成。該界面層594係位 於該CMOS + MST裝置48之頂蓋通道層80及MST通道層100 之間。界面層5 94可不增加矽基材84之尺寸下讓試劑貯存 器及MST層87間有更複雜的流體互連》第104圖重疊貯存 器、上通道及界面通道以顯示該界面層5 94造成之更複雜 的管路系統。 參考第1〇4及105圖，試樣（例如血液）進入試樣置入 口 68及毛細作用把血液沿著頂蓋通道94拉引到抗凝血劑表 面張力閥118。如第105圖最佳顯示地，該抗凝血劑表面張 -113- 201209406 力閥118於界面層594有兩個界面通道596及598。貯存器-側之界面通道5 96用下導管92連接到貯存器出口，試樣-側 之界面通道598以頂蓋通道94連接到上導管96。來自貯存 器54之抗凝血劑透過貯存器-側之界面通道5 96流過MST通 道90直到彎液面被固定在上導管96爲止。沿著頂蓋通道94 流動之試樣流浸潤試樣-側之界面通道5 9 8而除去彎液面， 使得抗凝血劑在血液試樣繼續流往病原體透析區70時與該 血液試樣合倂。 參考第104及105圖，於此具體例中該病原體透析區 含有界面目標物通道602及界面廢棄物通道604，其透過複 數個具有既定閩値大小之孔洞來流體耦合。位於透析區70 最上游之孔洞與其下游之孔洞不同；下游孔洞爲直徑小於 8.0微米之孔，所選擇之此大小可讓目標物得以通過而進 入界面目標物通道602。於目前的具體例中’該小孔爲直 徑3.0微米之孔洞164，所選擇之此大小可讓病原體通過而 進入界面目標物通道602»病原體透析區7〇被配置成能使 試樣於毛細作用下流經該等通道及小孔。 參考第104及105圖，血液試樣流過頂蓋通道94來到界 面廢棄細胞通道604之上游端。該界面廢棄細胞通道60 4連 到通往透析MST通道204之直徑3.0微米之小孔1 64。各透析 MST通道204把直徑3.0微米之小孔1 64連到各別的透析上導 孔168。該透析上導孔168通往界面目標物通道602 °不過 ，該上導管係配置成會固定彎液面而非令毛細驅動流繼續 流動。 -114- 201209406

該病原體透析區7〇倂有旁路通道600以充塡該流動通 道結構而不截留氣泡。位於病原體透析區70最上游端之旁 路通道600具有CIF (毛細起動特徵構件）202以促使毛細 驅動流從旁路通道600流到界面目標物通道602 (見第104 及105圖）。該旁路通道亦具有寬曲徑以延長界面廢棄細 胞通道604到界面目標物通道602之流路。較長的流路會延 阻試樣流，使得在彎液面於最上游透析MS T通道204處形 成時試樣流能塡滿該界面目標物通道602。該試樣流始於 該上游端且當該液流沿著界面廢棄物通道6 02向下游移動 時會瓦解固定在各個透析上導孔168上之彎液面。此舉確 保在透析區充塡時該透析底通道會充滿試樣流。若沒有旁 路通道600，或沒有配置成用以固定彎液面之透析上導管 168，那麼有些透析MST通道204可能會無法充滿。類似地 ，界面目標物通道602內可能會形成氣泡。於任一例中， 流過透析區之液流實質上已被阻斷了。 界面廢棄物通道604會流到廢棄物通道72及界面目標 物通道602會流到目標物通道74 (見第104及105圖）。五 個透析區透過頂蓋通道72及74串聯地連結在一起以增加透 析流程之效率。在第五透析區的出口處，含有目標物之試 樣流藉由毛細作用沿著頂蓋通道層內之目標物通道74從透 析裝置784被拉引到LOC裝置78 5 »該廢棄物通道72會流入 廢棄物貯存器76(見第103圖）。 LOC裝置785亦可當作一獨立式微流體裝置，其具有 另一適合單一裝置之頂蓋，且於此組態中可採用任意的抗 -115- 201209406 凝血劑貯存器55來供應抗凝血劑。此獨立用途之LOC裝置 785之一個實例爲其於全血分析之用途。參考第1〇6及107 圖，目標物會沿著頂蓋通道74流入LOC裝置78 5。其流經 任意地抗凝血劑表面張力閥1 1 7 (其被用來加入任意地抗 凝血劑貯存器55之內容物）’繼續向前直到抵達胞溶表面 張力閥1 2 8爲止。於在此所述之組態中，任意地貯存器及 表面張力閥並未使用且並沒有影響試樣流動或該LOC裝置 之操作。 在有以上所述之抗凝血劑表面張力閥118時，該胞溶 表面張力閥128具有一胞溶貯存器-側之界面通道606及胞 溶-試樣側之界面通道60 8(見第107圖）。胞溶試劑透過 頂蓋通道94從貯存器5 6流到該胞溶貯存器-側之界面通道 606。該試劑會流入下導管92，通過MST通道90流到以試 劑構成臂液面之上導管96 (見第107圖）。來自目標物通 道74之試樣流會充滿該胞溶試樣-側之界面通道608。該試 樣流會除去上導管96處之彎液面及當試樣流入化學胞溶區 13 0時該胞溶試劑會與試樣混合在一起。 於化學胞溶室區1 3 0，胞溶試劑擴散地混入液流中以 胞溶目標細胞及釋出其內之基因物質。該試樣流在混合區 出口閥206處停下來。該混合區出口閥爲一沸騰起動閥206 。閥上游之液體感測器174在試樣流即將抵達該閥206時會 提供反饋。如果CMOS電路86以程式控制延遲起動以確保 目標細胞已徹底胞溶，那麼該液體感測器之反饋就會引發 該延遲期。渡過任何延遲期後，沸騰起動閥206會被啓動 -116- 201209406 且下游的液體感測器174則會註記該液流已重新沿著MS Τ 通道90開始流動。

胞溶之試樣流繼續流往限制性內切酶、接合酶及連接 子表面張力閥132。該表面張力閥132之運作與梢早對抗凝 血劑表面張力閥1 18所述相同。參考第107圖，當已胞溶試 樣流抵達固定在表面張力閥132處之彎液面時，限制性內 切酶、接合酶及連接子引子會從貯存器58中釋出且與試樣 流混合在一起。該試樣而後流經MST通道90來到培育區 114之受熱微通道。參考第107及108圖，該培育區11 4係由 被加熱器154加熱之蜿蜒微通道210所組成。 參考第108圖，該試樣流會停在培育器出口閥207處一 段充裕的時間。該培育器出口閥207爲一種類似該混合區 出口閥206之沸騰起動閥。於培育區開端之液體感測器174 ，搭配流速感測器740 (見第112圖）及CMOS電路86，可 引發培育時間延遲。在經過充份培育後，該培育器出口閥 2 07會啓動且液流重新沿著MST培育出口通道63 0流到聚合 酶表面張力閥140(見第109圖）。來自貯存器62之聚合酶 在試樣流流過擴增輸入通道63 2之蜿蜒路徑時混入該試樣 流。 參考第108及109圖，擴增輸入通道63 2導引該試樣流 流經12個擴增混合表面張力閥138。於各個擴增混合貯存 器60.1 -60.1 2之擴增混合物（見第109圖）流經各別的頂蓋 通道94於擴增混合表面張力閥138處固定彎液面。該試樣 流會輪流打開各個表面張力閥，來自各別的擴增混合物貯 -117- 201209406 存器60.1-60.12之擴增混合物被載入試樣流中且流到12個 擴增室112.1-112.12各室。該LOC裝置具有CMOS電路，其 可透過溫度感測器及加熱器對擴增區作操作性的控制。

參考第110圖，該12個擴增室112.1-112.12之各室分別 具有一擴增出口閥207 »該擴增出口閥207爲類似培育出口 閥207之沸騰起動閥。試樣流會停在各個擴增出口閥207處 。在擴增以後，該擴增出口閥207會打開好讓擴增子流到 含有探針之雜合室陣列110.1-110.12中，該等探針被設計 成能與目標核酸序列（在此爲病原體DNA )形成探針一目 標物雜合體。該試樣沿著流路1 76流經各個個別的陣列 110.1-110.12且經由各別的擴散屏障入口 175進入各個雜合 室180 (見第90及1 1 1圖）。

參考第91及111圖，當試樣流抵達末端液體感測器178 時，該雜合加熱器1 82會在經過一段時間延遲後被啓動以 促進探針-目標物雜合體之產生。該流速感測器740 (見 第112圖）係包含在病原體培育區114中以決定時間延遲長 短。經過一段適當的延遲以供雜合後，施加到ECL電極860 及870之激發電流（見第111及114圖）會使得該探針一目 標物雜合體發射出光線光子，其可用襯底CMOS電路86內 之光感測器44來偵測。該光感測器係由緊鄰各雜合室之光 二極體184陣列所組成。

第113及114圖顯示校準室382。如本專利說明書於其 它處說明地，校準室係用來校準光二極體184以調整系統 雜訊及背景値。同樣地，正向ECL控制探針7 87及反向ECL -118- 201209406 控制探針786被置於某些雜合室180中以作檢定品質控制。 具有指狀交合之ECL電極之校準室382之變化型示於第92圖 濕化器196及濕度感測器2 32被用來控制LOC裝置785 (尤其是雜合室陣列11〇)中的蒸發及冷凝作用。第110圖 顯示該濕化器196、貯水器188及蒸發器190之主要構件。

參.考第109圖，蒸發不警器（evaporation-based telltale) 189能指示儲存期間該裝置之包裝受否受損及該 微流體裝置之完整性及可靠性是否已不足。於製造期間， 會把一小滴液體加到該蒸發示警器189中央之液體感測器 174內》如果儲存期間包裝密封有破損，那麼那滴液滴就 會蒸發掉。該液體是否存在可以用液體感測器1 74偵測且 藉此指示微流體裝置密封之完整性。 結論 在此所述之裝置、系統及方法能促使人們於看護地點 以低成本快速地進行分子診斷測試》以上所述之系統及其 構件純粹是顯示用且熟悉此領域之技術人士能輕易知曉不 悖離本發明廣闊發明槪念之精神及範疇之眾多變化及修正 【圖式簡單說明】 本發明之較佳具體例現在將參考後附圖式藉由實施例 來說明，其中： -119- 201209406 第1圖顯示採用螢光偵測之測試模組及測試模組讀取 器： 第2圖爲採用螢光偵測之測試模組內電子構件之示意 槪視圖； 第3圖爲該測試模組讀取器內電子構件之示意槪視圖 » 第4圖爲該LOC裝置之整體結構之示意代表圖；

第5圖爲該LOC裝置之立體圖； 第6圖爲LOC裝置及其相互層疊之全部膜層之特徵構 件及結構之平面圖； 第7圖爲單獨顯示出頂蓋結構之LOC裝置平面圖； 第8圖爲該頂蓋之頂視立體圖且以虛線表示內部通道 及貯存器； 第9圖爲該頂蓋之分解頂視立體圖且以虛線表示內部 通道及貯存器；

第1 〇圖爲顯示頂蓋之上通道組態之底視立體圖： 第11圖爲單獨顯示該CMOS + MST裝置之結構之LOC裝 置平面圖； 第12圖爲該LOC裝置於試樣置入口之示意剖面圖； 第13圖爲第6圖所示之插圖AA之放大圖； 第14圖爲第6圖所示之插圖AB之放大圖； 第15圖爲第13圖所示之插圖AE之放大圖； 第16圖爲顯示該LOC裝置於插圖AE內之層狀結構之部 份立體圖； -120- 2012〇94〇6

爲顯示該LOC裝置於插圖AE內之層狀結構之部 爲顯示該LOC裝置於插圖AE內之層狀結構之部 舄顯示該LOC裝置於插圖AE內之層狀結構之部 舄顯示該LOC裝置於插圖AE內之層狀結構之部 舄顯示該LOC裝置於插圖AE內之層狀結構之部 第2 2陶 111舄第21圖顯示之胞溶劑貯存器之示意剖面圖； 箄 23 tei H _舄顯示該L〇C裝置於插圖AB內之層狀結構之部 份从鳍ϋ : ^ 2 4 fei ~ 松丄 _舄顯示該L0C裝置於插圖AB內之層狀結構之部

第 份立鵝_ ; 第 份立體_ ; 第2〇_ 份立體鞫； 第21_ 份立镀_ ; ^立韆_ ; 第2 5 ϋλ _ _舄顯示該LOC裝置於插圖ΑΙ內之層狀結構之部 第26陶 格… _舄顯示該L0C裝置於插圖AB內之層狀結構之部 第27_似 份+ _爲顯示該LOC裝置於插圖AB內之層狀結構之部 从鳍陶； 第2 8隱似 份 _爲顯示該LOC裝置於插圖AB內之層狀結構之部 •饑 _ ; 第29 111舄顯 示該LOC裝置於插圖AB內之層狀結構之部 -121 - 201209406 份立體圖； 第30圖爲該擴增混合物貯存器及聚合酶貯存器之示意 剖面圖； 第31圖單獨顯示一沸騰起動閥之特徵構件； 第32圖爲該沸騰起動閥從第31圖顯示之線33 -3 3處切 開來之示意剖面圖： 第33圖爲第15圖顯示之插圖AF之放大圖；

第34圖爲從第33圖顯示之線35-3 5處切開來之透析區 上游端之示意剖面圖； 第35圖爲第6圖顯不之插圖AC之放大圖： 第36圖爲插圖AC內該擴增區之進一步放大圖： 第37圖爲插圖AC內該擴增區之進一步放大圖； 第38圖爲插圖AC內該擴增區之進一步放大圖； 第39圖爲第38圖顯示之插圖AK內部之進一步放大圖

第40圖爲插圖AC內該擴增室之進一步放大圖； 第41圖爲插圖AC內該擴增區之進一步放大圖： 第42圖爲插圖AC內該擴增室之進一步放大圖； 第43圖爲第42圖顯示之插圖AL內部之進一步放大圖； 第44圖爲插圖AC內該擴增區之進一步放大圖： 第45圖爲第44圖顯示之插圖AM內部之進一步放大圖 第46圖爲插圖AC內該擴增室之進一步放大圖； 第47圖爲第46圖顯示之插圖AN內部之進一步放大圖 -122- 201209406 第48圖爲插圖AC內該擴增室之進一步放大圖； 第49圖爲插圖AC內該擴增室之進一步放大圖； 第50圖爲插圖AC內該擴增區之進一步放大圖； 第51圖爲該擴增區之示意剖面圖； 第52圖爲該雜合區之放大平面圖； 第53圖爲單離出兩雜合室進一步放大之平面圖··

第54圖爲單一雜合室之示意剖面圖； 第55圖爲第6圖顯示之插圖AG內之濕化器之放大圖； 第56圖爲第52圖顯示之插圖AD之放大圖； 第57圖爲該LOC裝置插圖AD內之分解立體圖； 第58圖爲示於第6圖之插圖AH內之濕度感測器之放大 圖， 第5 9圖爲顯示該光感測器之光二極體陣列之部件之示 意圖， 第60圖爲示於第55圖之插圖AP內之蒸發器之放大圖； 第61圖爲連接子-帶頭PCRClinker-primed PCR)之圖 第62圖爲一具刺血針之測試模組之示意代表圖； 第63圖爲LOC變化型VII之整體結構之圖解代表圖； 第64圖爲LOC變化型VIII及其相互層疊之全部膜層之 特徵構件及結構之平面圖； 第65圖爲示於第64圖之插圖CA之放大圖； 第66圖爲第64圖顯示之LOC變化型VIII插圖CA內之層 -123- 201209406 狀結構之部份立體圖； 第67圖爲示於第65圖之插圖CE之放大圖； 第68圖爲LOC變化型VIII之整體結構之圖解代表圖； 第69圖爲LOC變化型XIV之整體結構之示意圖； 第70圖爲LOC變化型XLI之整體結構之示意圖； 第71圖爲LOC變化型XLIII之整體結構之示意圖： 第72圖爲LOC變化型XLIV之整體結構之示意圖； 第73圖爲LOC變化型XLVII之整體結構之示意圖； 第74圖爲LOC變化型XI之整體結構之圖解代表圖； 第75圖爲微分影像器（differential imager)之電路圖

I 第76圖表示電化學發光（ECL)過程中發生之反應； 第7 7圖示意地顯示三種不同陰極組態； 第78圖爲雜合室內陰極及陽極示意的部份剖面圖； 第79圖示意地顯示該光二極體邊緣附近之環狀陰極； 第80圖示意地顯示光二極體邊緣內之環狀陰極； 第8 1圖示意地顯示具有一系列突指以增加側緣長度之 陰極； 第82圖示意地顯示透明陰極令表面區域耦合及ECL信 號偵測最佳化之用途： 第83圖示意地顯示固定在雜合室頂壁之陰極令表面區 域耦合及ECL信號偵測最佳化之用途； 第84圖示意地顯示與陽極指狀交合之陰極； 第85圖顯示一採用ECL偵測之測試模組及測試模組讀 -124- 201209406 取器； 第86圖爲採用ECL偵測之測試模組內之電子構件之示 意槪略圖； 第8 7圖顯示一測試模組及另一測試模組讀取器； 第8 8圖顯示一測試模組及測試模組讀取器以及存放不 同資料庫之主機系統；

第89圖爲顯示相互層疊之所有特徵構件及顯示插圖 GA至GL之位置之LOC變化型L之平面圖； 第90圖爲第89圖所示之插圖GD之放大圖； 第91圖爲第89圖所示之插圖GG之放大圖； 第92圖爲第89圖所示之插圖GH之放大圖·， 第93圖爲密閉組態中電化學發光共振能量轉移探針之

第94圖爲開放及雜合組態中電化學發光共振能量轉移 探針之圖；

第95圖爲初始回次擴增期間之引子-連結之發光線性 探針之圖； 第96圖爲後續擴增循環期間之引子-連結之發光線性 探針之圖； 第97 A至97F圖圖解顯示一發光之引子連結莖環探針之 熱循環； 第98圖示意地顯示一呈莖環組態之反向控制之發光探 針； 第99圖示意地顯示呈開放組態之第98圖之反向控制發 -125- 201209406 光探針； 第100圖示意地顯示一呈莖環組態之正向控制之發光 探針； 第101圖示意地顯示呈開放組態之第1 00圖之正向控制 發光探針；

第102圖爲一具有透析裝置、LOC裝置、互連性頂蓋 及電化學發光（ECL )偵測之微流體裝置之整體結構之圖 解代表圖； 第103圖爲一具有透析裝置、LOC裝置及互連性頂蓋 之微流體裝置之立體圖； 第104圖爲顯示該微流體裝置之透析裝置之特徵構件 及顯示插圖JA位置之平面圖； 第105圖爲第104圖所示之插圖JA之放大圖； 第106圖爲顯示該微流體裝置之LOC裝置之特徵構件 及顯示插圖JB至JJ位置之平面圖； j

第107圖爲第106圖所示之插圖JB之放大圖； 第108圖爲第106圖所示之插圖JC之放大圖； 第109圖爲第106圖所示之插圖JD之放大圖； 第110圖爲第106圖所示之插圖JE之放大圖： 第111圖爲第106圖所示之插圖JF之放大圖； 第112圖爲第1〇6圖所示之插圖JG之放大圖； 第113圖爲第1〇6圖所示之插圖之放大圖； 第114圖爲第1〇6圖所示之插圖之放大圖； 第115圖爲LOC變化型L之雜合室之放大圖； -126- 201209406 第1 16圖爲LOC變化型L之雜合室陣列並顯示校正室分 佈之放大圖； 【主要元件符號說明】

1 〇 :測試模組 1 1 :測試模組 1 2 :測試模組讀取器 1 3 :外殻 14 :微型-USB插頭 15 :電感器 1 6 :微型-USB埠 17:用戶界面（UI)觸控螢幕 1 8 :顯示螢幕 1 9 :按鈕 20 :開始鈕 21 :蜂巢式無線電台 22 :無菌密封膠帶 2 3 :無線網路連線 24 :大貯槽 25 :衛星導航系統

26 ： LED 27 :資料存儲器 28 :行動電話/智慧型手機 29 ： USB-相容LED驅動器 -127- 201209406 30 ： LOC裝置 3 1 :電源調節器 3 2 :電源供應電容器 33 :時鐘 3 4 :控制器 35 :暫存器 36 : USB裝置驅動器 3 7 :驅動器

38 ： RAM 39 : ( ECL激發）驅動器 40 :程式和資料快閃記憶體 41 :暫存器 42 :處理器 4 3 :程式儲存器 44 :光感測器 4 5 :指示器 46 :頂蓋 47 :唯USB電源/指示器模組 48 : CMOS + MST晶片（裝置） 49 :發泡體插圖或其它有孔元件 5 1 :互連性頂蓋 52 :中間MST通道 5 4 :(抗凝血劑）貯存器 5 6 :(胞溶試劑）貯存器 -128- 201209406 57 :印刷電路板（PCB ) 5 8 :貯存器 60 :貯存器 62 :貯存器 64 :下封條 66 :頂壁層 6 8 :試樣置入口

7 〇 :透析區 72 :廢棄物通道 74 :目標物通道 76 :廢棄物單元（廢棄物貯存器、廢棄物貯槽） 7 8 :貯存器層 80 :頂蓋通道層 8 2 :上封條層 84 :矽基材 86 ： CMOS 電路 87 ： MS， 8 8 ’·鈍化層 90 : MST通道 92 :下導管 94 :頂蓋通道 96 :上導管 97 :壁區 98 :彎液面錨 -129- 201209406 1 00 : MST通道層 106 :沸騰-起動閥 107 :電子書讀取器 108 :沸騰-起動閥 109 :平板電腦

1 1 〇 :雜合室陣列 1 1 I :流行病學資料 1 1 2 :擴增區 1 1 3 :基因資料 1 1 4 :培育區

115 :電子健康記錄（HER) 1 1 6 :抗凝血劑 1 1 7 :表面張力閥 1 1 8 :表面張力閥 1 1 9 :試樣流 1 2 0 :彎液面 1 2 1 :電子病歷（EMR ) 122 :排氣孔 123 :個人健康記錄（PHR) 125 :網路 126 :沸騰-起動閥 1 28 :表面張力閥 1 3 0 :化學胞溶區 1 3 1 :混合區 -130- 201209406 132 :表面張力閥 1 3 3 :培育器入口通道 134 :下導管（開口）

1 3 6 :視窗 140 :表面張力閥 146 :閥入口 1 4 8 :閥出口 1 5 0 :閥下導管 152 :加熱器 153 :沸騰-起動閥加熱器接點 154 :加熱器 1 5 6 :加熱器接點 158 :微通道 160:擴增區出口通道 164 :小孔 168 :透析上導管孔 170 :溫度感測器 174 :液體感測器 175 :擴散屏障 176 :流路 178 :液體感測器 180 :雜合室 1 8 2 :加熱器 184 :光二極體 -131 - 201209406 1 8 5 :活化區 186: FRET探針 1 8 8 :貯水器 189 :示警器

190 :蒸發器 1 9 1 :加熱器 192 :供水通道 1 93 :上導管 1 94 :下導管 1 9 5 :金屬頂層 196 :濕化器

1 9 8 :第一上導管孔 202 ： CIF 204 :透析MST通道 206 :混合區出口閥

207:培育區出口閥 208 :頂蓋通道液體感測器 210 :微通道 212:中間MST通道 2 1 8 : T i A1 電極 2 2 0 : T i A1 電極 2 2 2 :間隙 2 3 2 :濕度感測器 2 3 4 :加熱器 -132- 201209406 237: ECL探針 23 8 :目標核酸序列 240 ：環 242 ：莖 2 4 8 :淬熄物 288 :試樣置入及製備 290 :核酸萃取

291 :核酸培育 292 :核酸擴增 294 :偵測及分析 2 9 6 :第一電極 298 :第二電極 3 00 :程式化前延遲 301 : LOC裝置 3 2 8 :白血球透析區 3 76 :傳導管柱 3 7 8 :正向控制探針 3 8 0 :反向控制探針 3 82 :校準室 3 90 :刺血針 3 9 2 :刺血針釋放鈕 408 :膜封條 410 :護膜罩

492 ： LOC變化型 VII 201209406 518 : LOC變化型 VIII 5 9 4 :界面層 5 96 :界面通道 5 98 :界面通道 600 :旁路通道 602 :界面目標物通道 604 :界面廢棄物（廢棄細胞） 606 :界面通道 608 :界面通道 630:培育出口通道 63 2 :擴增輸入通道

641 : LOC XIV

673 : LOC變化型 XLIII 674 ： LOC變化型 CLIV 677 : LOC變化型 XLVn 6 8 2 :透析區 6 86 :擴增前透析步驟 693 :線性ECL探針 694 :擴增 6 96 :引子連接探針 6 9 8 :已擴增之互補序列 700 :寡核苷酸引子 7 05 ： ECL探針 706 :互補序列 通道

-134- 201209406 708 :莖股鏈 710 :另一股 729 ： LOC變化型 740 :流速感測器 766 :廢棄物貯存器 783 :微流體裝置 784 :透析裝置

785 ： LOC裝置 786 :反向控制ECL探針 7 87 :正向控制ECL探針 788 :微分影像器電路 7 9 0 :像素 792 : “虛擬”像素 7 9 4 : “讀取列” 795 : “讀取列d” 797 : M4電晶體 801 : MD4電晶體 803 :像素電容器 805 :虛擬像素電容器 8 07 :開關 8 0 9 :開關 811 : “讀取行”開關 813 :虛擬“讀取行”開關 815 :電容放大器 -135 201209406 8 1 7 :微分信號 846 :發光團

860: ECL激發電極（陰極） 8 62 ： ECL發射（ECL信號） 864 :發光團 8 66 :共反應物 8 68 :受激物種 8 70 : ECL激發電極（陽極） 8 7 2 :溶液 8 74 ： ECL電池 8 7 6 :介電隙 878:梳狀結構陰極 8 8 0 :平行突指 8 82 :蜿蜒組態 8 8 6 :更複雜組態 8 8 8 ：細圓齒區 8 9 0 :分支結構 8 92 :參與體積 8 9 4 :遮斷區域 -136-

Claims (1)

1. 201209406 七、申請專利範圍： 1. 一種用來濃縮生物試樣內之病原體之測試模組，該 測試模組包含： 一具有用於收納試樣之貯槽之外殼； 一與該貯槽流體連通（fluid communication)且被配 置成能把病原體與試樣中之其它成分分離之透析裝置；以 及

   一與該透析裝置流體連通且被配置成能分析該等病原 體之晶片上實驗室（LOC)裝置。 2.如申請專利範圍第1項之測試模組，其中該透析裝 置具有一用以接受該生物試樣之第一通道、一第二通道及 複數個小孔，該第二通道經由該等小孔與該第一通道以流 體相連，使得病原體可從該第一通道流到該第二通道而生 物試樣內之較大成分則留在該第一通道內。 3 .如申請專利範圍第2項之測試模組，其中該透析裝 置還有一系列於該第一通道及第二通道間延伸之毗連通道 ，其中諸小孔係位在該等毗連通道之上游端，各毗連通道 被配置成能固定一試樣彎液面以阻滯該第一通道與第二通 道間之毛細流動；及一介於該第一通道及第二通道間之旁 路通道，該旁路通道匯入毗連通道上游之第二通道且被配 置成能提供不中斷的毛細驅動液流從第一通道流往第二通 道；其中於使用期間，在彎液面形成之後，來自旁路通道 之液流在抵達固定於各毗連通道之彎液面時，該液流會依 序地除去各個彎液面，且該試樣液流經由該等毗連通道及 -137- 201209406 旁路通道從第一通道流往第二通道。 4.如申請專利範圍第3項之測試模組，其中該第二通 道係供作目標物通道且該第一通道係供作廢棄物通道，該 目標物通道被配置成能以毛細驅動液流流到該L Ο C裝置。 5 .如申請專利範圍第4項之測試模組，其中該病原體 含有目標核酸序列，及該LOC裝置有一核酸擴增區以擴增 該等目標核酸序列。

   6 ·如申請專利範圍第5項之測試模組，其中該l 0 C裝置 有一胞溶區以胞溶該等病原體而釋出其內之目標核酸序列 7.如申請專利範圍第5項之測試模組，其中該LOC裝置 有一具有雜合探針陣列之雜合區，該探針可與目標核酸序 列雜合而形成探針-目標物雜合體。

   8 _如申請專利範圍第7項之測試模組，其中該探針被 設計成能與目標核酸序列形成探針-目標物雜合體，該探 針-目標物雜合體被設計成能對激發電流產生反應而發射 出光線之光子。 9.如申請專利範圍第8項之測試模組，其中該LOC裝置 具有互補式金氧半導體（CMOS )電路以操作性控制聚合 酶連鎖反應（PCR )區，該CMOS電路具有一光感測器用 來感測該探針一目標物雜合體發射之光子。 1〇·如申請專利範圍第9項之測試模組，其中該雜合區 有一雜合室陣列，該等雜合室含有能與目標核酸序列雜合 之探針。 -138- 201209406 11. 如申請專利範圍第1 〇項之測試模組，其中該光感 測器爲一光二極體陣列，而該等光二極體則分別與各雜合 室緊鄰。 12. 如申請專利範圍第1 1項之測試模組，其中該CMOS 電路具有一用來儲存流體處理相關資料之數位記億體，該 等資料包括探針詳細說明及各個探針於雜合室陣列之位置

   13. 如申請專利範圍第12項之測試模組，其中該CMOS 電路具有至少一溫度感測器以感測雜合室陣列之溫度。 14. 如申請專利範圍第13項之測試模組，其中該LOC裝 置有一受CMOS電路控制之加熱器，該CMOS電路利用來自 溫度感測器之反饋來把探針及目標核酸序列維持在雜合溫 度之下。 15. 如申請專利範圍第14項之測試模組，其中該等光 二極體離對應之雜合室不到1 600微米。 16. 如申請專利範圍第15項之測試模組，其中該探針 具有於激發狀態會發射出光子之電化學發光（ECL )發光 團。 17.如申請專利範圍第16項之測試模組，其中該等雜 合室具有電極以用電流激發該ECL發光團。。 1 8 .如申請專利範圍第1 7項之測試模組，其中各E C L探 針皆有一發光團及一貼近該發光團用以淬熄該發光團發射 之光子之淬熄物，當該探針與一目標核酸序列雜合時會移 動該淬熄物遠離發光團而使得光子不再被淬熄。 -139- 201209406 1 9 ·如申請專利範圍第1 8項之測試模組， 電路具有接合塾（bond-pads)以電子連接一 被配置成能把來自光二極體之輸出轉變成指 已與目標核酸序列雜合之指示信號，且把該 等接合墊以傳輸到外部裝置。 2 0.如申請專利範圍第13項之測試模組， 置及透析裝置係透過一頂蓋以流體相連，該 —通道與該透析裝置與L0C裝置間流體連通 容納加入試樣之液體試劑之貯存器。 其中該CMOS 外部裝置，且 示該ECL探針 信號提供給該 其中該LOC裝 頂蓋具有至少 ，以及複數個 -140-