TW201206954A

TW201206954A - Hepcidin, hepcidin antagonists and methods of use

Info

Publication number: TW201206954A
Application number: TW100141324A
Authority: TW
Inventors: Barbra Sasu; Mitsuru Haniu; Thomas Charles Boone; Xiao-Juan Bi; Ki Jeong Lee; Tara Arvedson; Aaron Winters; Keegan Cooke; Zeqi Sheng
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2007-02-02
Filing date: 2008-01-30
Publication date: 2012-02-16
Also published as: CL2008000278A1; AU2008214386B2; US20140286953A1; TW200900420A; CA2676036A1; WO2008097461A3; US20130018176A1; AR065083A1; AU2008214386A2; PE20130588A1; AR082235A2; TW201307390A; EP2111412A2; US20080213277A1; PE20090722A1; JP2010517529A; MX2009008104A; US8629250B2; WO2008097461A2; JP2014221763A

Description

201206954 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於海帕西啶、海帕西啶拮抗劑（包括結合海帕西啶之抗體）及其調節海帕西啶活性之能力。本申請案主張2007年2月2曰申請之美國臨時申請案第 60/888,059號及2007年12月19日申請之美國臨時申請案第 61/015,138號之權利，其以引用的方式併入本文中。【先前技術】鐵為所有活的生物體生長發育所需之必需痕量元素。在哺乳動物中藉由控制鐵吸收、鐵再循環及鐵自儲存其之細胞中的釋放來調節鐵含量。鐵主要係在十二指腸及空腸上段中由腸上皮細胞吸收。存在如下反饋機制：在缺乏鐵之個體中增強鐵吸收且在鐵過量個體中降低鐵吸收（Andrews Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 1:75 (2000) ； Philpott, Hepatology 35:993 (2002) ; Beutler 等人， 29:495 (2001))。藉由骨趙中之網狀内皮巨噬細胞、肝庫弗細胞（hepatic Kupffer cell)及脾使鐵自經降解紅血球再循環。鐵釋放係由膜鐵轉運蛋白（ferroPortin)所控制，該膜鐵轉運蛋白為一種位於腸上皮細胞、巨噬細胞及肝細胞（能夠釋放鐵於血漿中之主要細胞）之細胞表面上的主要鐵輸出蛋白。海帕西啶與膜鐵轉運蛋白結合並藉由使其自細胞表面内化且發生降解而降低其功能活性。 (Nemeth^ Λ * Science, 306:2090-3, 2004 ； De domenico# 人 ’ Mol. Biol. Cell” 8:2569-2578，2007)。 159757.doc 201206954

海帕西咬為調節鐵穩態之關鍵信號（Philpott, /fepaio/ogy 35:993 (2002) ; Nicolas等人，尸roc. iVa". 5W. C/M 99:4396 (2002))。高含量之人類海帕西咬造成鐵含量降低且反之亦然。導致缺乏海帕西啶活性之海帕西啶基因突變與年輕型血色素沈著症（一種嚴重鐵過量疾病）相關（Roetto 等人，Nat. Genet.，33:21-22, 2003)。對小鼠之研究已證明海帕西啶在控制正常鐵穩態方面之作用（Nicolas等人， Nat. Genet·，34:97-101，2003 ; Nicolas等人，Proc·Natl· Acad. Sci. USA, 99:4596-4601，2002 ; Nicolas等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，98:8780-8785, 2001)。此外，不斷有資料暗示在發炎期間海帕西啶與鐵螯合 (參見例如 Weinstein 等人，Blood，100:3776-36781，2002 ; Kemna等人，Blood，106:1864-1866，2005 ; Nicolas等人， J. Clin. Invest., 110:1037-1044，2002 ; Nemeth 等人，J. Clin. Invest., 113:127卜 1276，2004 ; Nemeth等人，Blood， 101:2461-2463, 2003及Rivera等人，Blood，105:1797-1802, 2005)。已在誘發脊椎動物之先天免疫系統之急性期反應的炎性刺激（諸如感染）之後觀察到海帕西啶基因表現發生大力上調。在小鼠中，展示海帕西咬基因表現因脂多醣 (LPS)、松節油、弗氏完全佐劑（Freund’s comPlete adjuvant)及腺病毒感染而上調。海帕西啶表現係由發炎性細胞激素介白素-6(IL-6)誘發。海帕西咬表現與炎性貧血症之間的強相關性亦見於患有慢性炎性疾病（包括細菌、真菌及病毒性感染）之患者。 159757.doc 201206954 人類海帕西啶（一種具有抗微生物及鐵調節活性之25個胺基酸的肽）係由兩個新穎抗微生物肽研究小組獨立發現。（Krause 等人，Ze". 480:147 (2000) ; Park 等人，X C/zew. 276:7806 (2001))。其亦被稱為 LEAP- 1(肝表現之抗微生物肽）。隨後在尋找由鐵調節之肝特異性基因中鑑別在小鼠中編碼83個胺基酸之前導肽（prepropeptide) 以及在大鼠及人類中編碼 84個胺基酸之前導肽的海帕西啶cDNA(Pigeon等人，/.別〇/. CTzew. 276:7811 (2001))。首先使24個殘基之N-末端信號肽裂解以產生原海帕西咬（pro-hepcidin) ’隨後將其進一步加工以產生見於血液及尿中之成熟海帕西咬。在人類尿液中，儘管亦存在較短的22及20個胺基酸之肽，但主要形式含有25個胺基酸》值得注意的是，該成熟肽含有8個以4個二硫橋形式鍵聯之半胱胺酸殘基。Hunter等人（丄价〇/. Ch/n., 277:37597-37603 (2002))使用HPLC滯留時間與自尿純化之天然海帕西啶一致的化學合成海帕西啶藉由NMR而研究了海帕西啶的結構。Hunter等人報導其測定結果：海帕西啶摺疊成含有鄰位二硫鍵（C1-C8、C2-C7、C3-C6、C4-C5)之髮夹環結構。最近以來’亦報導使用Hunter等人之結構資訊及推理性NMR資料來推斷一致二硫鍵連接性分配，從而測定鱸魚海帕西啶之結構（Lauth等人，乂出〇/· C/zem.，280:9272· 9282 (2005))。然而，如本發明者在本文中所發現且揭示，碟定海帕西咬結構具有不同於先前技術所教示之二硫鍵連接性。 159757.doc 201206954 美國專利公開案第2003/0187228號、第2004/0096987 號、第 2004/0096990 號、第 2005/0148025 號、第 2006/ 0019339號、第 2005/0037971 號及第 2007/0224186號；美國專利第7,232,892號及第7,294,690號以及國際公開案第WO 02/98444號論述海帕西啶抗體，但未能揭示或提出本文中所揭示之海帕西咬之結構構形。因此，本說明書說明海帕西啶之結構的測定以及海帕西啶之中心作用及其在鐵調節及對感染之先天免疫反應方面的關鍵功能。此外，本申請案尤其提供生物活性海帕西啶、針對生物活性海帕西啶之單株抗體、製造該等物質之方法、測定生物活性海帕西咬之方法及調節海帕西咬活性或其表現之方法及治療鐵穩態失調症之方法以及海帕西啶括抗劑及海帕西唆促效劑。【發明内容】本發明之各種實施例大體而言係關於經純化之正確摺疊的人類海帕西啶、針對其之單株抗體、保留正確摺疊的人類海帕西啶之二硫鍵中之一或多者的海帕西啶變異體、製造該等物質之方法及使用該等物質偵測海帕西啶或調節海帕西啶活性之方法。咸信本申請案為關於在C1-C8、C2-C4、C3-C6及C5-C7 之間形成二硫鍵且預示緊湊及緊密摺疊之分子的生物活性人類海帕西啶二硫鍵連接性之首次報導。在一些實施例中，本發明提供具有與天然物質一致之二硫鍵連接性及等效生物活性的重組表現或合成產生之海帕西啶的大規模製 159757.doc 201206954 造。該重組或合成物質適用於治療需要其他海帕西啶之個體，且適用於製備偵測方法及套組中之已知海帕西啶標準物。正確摺疊的人類海帕西啶之大批製造亦使產生及測試與海帕西啶結合之單株抗體（尤其具高親和力及/或特異性之單株抗體）成為可能。該等單株抗體（例如）適用於海帕西啶偵測方法及診斷與治療方法。在一態樣中，海帕西啶活性拮抗劑為一種與正確摺疊之成熟生物活性人類海帕西啶（SEQ ID NO: 9)以所需親和力結合的單株抗體。亦提供一種結合海帕西啶（seq id n〇: 9)且抑制海帕西啶之鐵調節活性的單株抗體。在一實施例中，單株抗體在約10·8 M或以下之£(：5〇下降低細胞内鐵濃度且/或增加循環鐵濃度。在其他實施例中，單株抗體在哺乳動物中展現使紅血球計數（數目）或血紅素或血容比水平增加及/或使網狀血球計數、網狀血球平均細胞容積及/ 或網狀血球血紅素含量正規化的特性。在各種實施例中，單株抗體與海帕西啶之構形抗原決定基結合，該構形抗原決定基包含：SEq ID N〇: 9之胺基酸 1至5中之任一者（例如胺基酸丨、2、3、4或5)及/或沾卩1〇 NO: 9之胺基酸1〇至13中之任一者（例如胺基酸1〇、^、12 或13)及/或SEQ ID NO: 9之胺基酸14至22中之任一者（例如胺基酸 14、15、16、17、18、19、20、21或22)。在一相關態樣中’單株抗體與包含SEq ID NO: 9之位置1〇處之 Cys及SEQ ID NO: 9之位置13處之Cys的構形環及/或包含 SEQ ID NO: 9之位置14處之Cys及SEQ ID NO: 9之位置22 159757.doc 201206954 處之Cys的構形環結合。在各種實施例中，單株抗體可包括以下抗體中之任一者：抗體 Ab43、2.7、2.41、R9、1C9、1S1、1S2、1S3、 1S4、1S5、3B3、4E1、7A3、9D12、12B9、15E1、 18D8、19C1、19D12、19H6、23F11 及 26F11 ;或保留該等抗體之 CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2 或 CDRL3中之任一者、兩者、三者、四者、五者或六者且視情況包括該（等）CDR中之一或兩個突變的抗體；或保留該等抗體中之任一者之輕鏈或重鏈可變區的抗體；或結合於人類海帕西啶上與抗體Ab43、2.7、2.41、R9、1C9、 1S1 、 1S2 、 1S3 、 1S4 、 1S5 、 3B3 、 4E1 、 7A3 、 9D12 、 12B9、15E1、18D8、19C1、19D12、19H6、23F11 及 26F11相同之抗原決定基或與該等抗體競爭結合人類海帕西啶達至少75%的抗體。各種實施例亦提供編碼本文中所述之單株抗體中之任一者的核酸、包含該等核酸序列之載體及包含該等核酸或載體之宿主細胞《在一相關態樣中，提供重組產生該等單株抗體之方法，其包括培養上述宿主細胞使得核酸得以表現以便產生抗體且視情況自宿主細胞或培養基中回收該抗體。在一相關實施例中，提供一種由上述方法所產生之分離抗體或試劑。在另一態樣中，提供一種偵測試樣中之人類海帕西啶的方法，其包含使來自人類之試樣與上述抗體中之任一者在可使抗體與人類海帕西啶結合之條件下接觸且偵測經結合 159757.doc • 8 - 201206954 2體。在-實施例中’將海帕西唆之第一抗體固定於固體撐物上作為捕捉試劑且將海帕西咬之第二抗體用作偵測試劑。在-相關態樣中，藉由量測經結合抗體之量來量化海帕西唆在試樣中之量。該等谓測方法可用於多種診斷、預後及監控方法，其包括診斷海帕西咬相關病症之方法、區分炎性疾病與非炎性疾病之方法及監控使用海帕西咬括抗劑之療法的方法。在該等方法中，高於某一臨限值之^ 帕西啶含量與海帕西啶相關病症(諸如海帕西啶相關貧血症）之存在有關，而低於該臨限值之含量指示患者不可能患^帕西唆相關病症。同#，高於某_臨限值之海帕西啶3里與炎性疾病之存在有關，而低於該臨限值之含量指示患者不可能患有炎性疾病。在—些實施例中，該等方^ 將診斷患有缺鐵W症、炎性貧血症或混合性貧血症之患者。為監控旨在抑制海帕西咬含量之療法，低於某一臨限值之海帕西咬含量指示海帕西咬枯抗劑之劑量為治療有效的且高於該臨限值之含量指示海帕西咬拮抗劑之劑量不為治療有效的。在另一態樣中，提供包含治療有效量之本文中所述之抗體二任一者及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形二 2醫藥組合物。亦提供該等抗體用於製備供治療具有高含里海帕西啶、海帕西啶相關病症、鐵穩態失調症或貧血症之人類用之藥物的用途。各種實施例進一步提供使用該等抗體之方法，例如藉由投與治療有效量之該抗體來治療具有高含量海帕西啶或海 159757.doc 201206954 帕西咬相關病症或鐵穩態失調症之哺乳動物或患有貧血症之哺乳動物。在例示性實施例t，該哺乳動物為患有選自由以下各者組成之群之病狀的人類：非洲鐵過量症 (African iron overl〇ad)、α地中海貧血症、阿兹海默氏症 (Alzheimer’s diSease)、貧血症、癌性貧血症、慢性病貧血症、炎性貧血症、動脈硬化或動脈粥樣硬化（包括冠狀動脈病、腦血管疾病或周邊閉塞性動脈疾病）、共濟失調、與鐵有關之共濟失調、無鐵傳遞蛋白質貧血、癌症、血裝銅藍蛋白缺乏、化療誘發性貧血症、慢性腎病（ι、Η、 ΠΙ、IV或V期）（包括末期腎病或慢性腎衰竭）、肝硬化、典型血色素沈著症、膠原蛋白誘發性關節炎（CIA)、海帕西啶過量（高海帕西啶）之病狀、先天性紅細胞生成異常性貧血、充血性心臟衰竭、克羅恩氏病（Cr〇hn，s disease)、糖尿病、鐵生物分布失調症、鐵穩態失調症、鐵代謝紊亂、膜鐵轉運蛋白疾病、膜鐵轉運蛋白突變血色素沈著症、葉酸缺乏症、弗里德里希氏共濟失調（Friedrich，s ataxia)、索性脊髓病、格拉希氏症候群（gracile syndr〇me)、幽門螺旋桿菌（H. pylon)感染或其他細菌感染、哈勒沃登-施帕茨病 (Hallervordan Spatz disease)、血色素沈著症、由轉鐵蛋白觉體2突變引起之血色素沈著症、血紅素病、肝炎、肝炎 (Brock綜合征）、c型肝炎、肝細胞癌、遺傳性血色素沈著症、HIV或其他病毒性疾病、亨廷頓氏病（Huntington's disease)、尚鐵蛋白血症（hyperferritinemia)、低色素性小紅血球性貧金、血鐵過少症、抗胰島素症、缺鐵性貧血 159757.doc 201206954 症、缺鐵症、鐵過量症、海帕西唆過量之鐵缺乏病狀、年輕型血色素沈著症卿2)、多發性硬化症、轉鐵蛋白受體 2、HFE、血幼素（hem〇juveHn)、膜鐵轉運蛋白或其他鐵代謝基因之突變、新生兒血色素沈著症、與鐵有關之神經退化性疾病、骨質減少、骨質疏鬆症、胰腺炎 '泛酸鹽激酶相關之神线化性疾病、帕金森氏病（parkins〇n，s disease)、癩皮病、異食癖、紫質症、遲發性皮膚紫質症、假腦炎、肺血鐵質沈積症、紅血球病症、類風濕性關卽炎、敗血病、鐵粒幼紅細胞性貧血、全身性紅斑性狼瘡症、地中海貧血症、中間型地中海貧血、輸血性鐵過量、腫瘤、血管炎、維生素86缺乏症、維生素B12缺乏症及/或威爾遜氏病（Wilson's disease)。在另一態樣中，提供藉由以治療有效量投與（3)海帕西啶活性拮抗劑或海帕西啶表現抑制劑及（b)紅血球生成刺激劑來治療患有貧血·症之哺乳動物的方法。例示性海帕西咬活性拮抗劑包括結合人類海帕西啶之抗體。例示性海帕西啶表現抑制劑包括結合人類海帕西啶核酸之聚核苷酸或寡核苷酸。例示性紅血球生成刺激劑包括紅血球生成素、紅血球生成素促效劑變異體以及結合及活化紅血球生成素受體之肽或抗體。紅血球生成刺激劑包括（但不限於）依泊汀 α、依泊汀β、依泊汀δ、依泊汀ω、依泊汀i、依泊汀ζ及其類似物、模擬肽、模擬抗體及HIF抑制劑（參見美國專利公開案第2005/0020487號，其揭示内容全部以引用方式併入本文中）。詳言之，紅血球生成素包括（但不限於）如以下專 159757.doc 201206954 利或專利申請案中所揭示之紅血球生成素分子或其變異體或類似物’該等文獻各自以引用方式全部併入本文中：美國專利第 4,703,008 號、第 5,441，868 號、第 5,547,933 號、第 5,618,698 號、第 5,621，080 號、第 5,756,349 號、第 5’955,422 號及第 5,856,298 號；及 WO 91/05867、WO 95/05465、WO 00/24893 及 WO 01/81405。在某些例示性實施例中’紅〇k球生成刺激劑係選自由人類紅血球生成素 (SEQ ID NO: 72)及達貝泊灯（darbepoetin)a(SEQ ID NO: 73)組成之群。可根據該等方法治療之例示性貧血症形式包括炎性貧血症、癌性貧血症、化療誘發性貧血症、缺鐵性貧血症、鐵穩態失調症、膜鐵轉運蛋白疾病或由腎病引起之貧血症。亦提供治療患有對使用紅血球生成刺激劑之療法具有低反應性或甚至抵抗性之貧血症之哺乳動物的方法，其包含投與治療有效量之海帕西啶活性拮抗劑或者治療有效量之海帕西啶表現抑制劑。在另一相關態樣中，亦提供用於治療與高海帕西啶含量相關之病症或海帕西啶相關病症或鐵穩態失調症或患有貧血症之I乳動物的套組。在一例示性實施例中，該套組包括（a)海帕西啶活性拮抗劑或海帕西啶表現抑制劑及邙）紅血球生成刺激劑及（視情況）鐵。在另一例示性實施例中、，該套組包括海帕西啶活性拮抗劑或海帕西啶表現抑制劑及貼於容II上或與容器封裝於―起之標籤，該標籤描述海帕西唆活性拮抗劑或海帕西咬表現抑制劑連同紅血球生成刺激劑之用法。在另一例示性實施例中’該套組包括紅血球 159757.doc 12 201206954 生成刺激劑及貼於容器上或與容器封裝於一起之標籤，該標籤描述紅血球生成刺激劑連同海帕西咬活性結抗劑或= 帕西咬表現抑制劑之用法。亦提供海帕西❹性拮抗^ 海帕西啶表現抑制劑用於製備供連同紅血球生成刺激劑一起投與用之藥物的用途以及紅血球生成刺激劑用於製備供連同海帕西啶活性拮抗劑或海帕西啶表現抑制劑一起投與用之藥物的料》在該等套組或用途中之任—者中，海帕西啶活性拮抗劑（或海帕西啶表現抑制劑）及紅血球生成刺激劑可存在於獨立小瓶中或可一起被組合於單一醫藥組合物中。在另一實施例巾，海帕西„定活性拮抗劑（或海帕西啶表現抑制劑）或紅血球生成刺激劑或兩者可與鐵一起被組合於單一醫藥組合物中或可存在於獨立小瓶中。在一不同態樣中，提供一種包含3]^ ID N〇: 96的經純化之正確摺疊的生物活性非尿源性人類海帕西啶之組合物，其中在該組合物中至少80%、85%、90%、95%、98% 或99%之人類海帕西啶具有C2_C4:硫鍵、〇5{7二硫鍵、 C1-C8二硫鍵及C3-C6二硫鍵。在一些實施例中，人類海帕西咬已在細菌或其他非哺乳動物細胞中化學合成或產生。可藉由此項技術中已知之、方法（包括異核單量子相關 (heteronuclear single quantum correlation > HSQC), Morita 等人，Protein Science, 12(6)，1216-1221 (2003))量化正確摺疊的蛋白質在溶液中之量。在一相關實施例中，提供使用該等經純化之人類海帕西啶組合物之方法，例如用於產生或篩檢單株抗體，用於鑑別海帕西啶結合搭配物或用於 159757.doc • 13· 201206954 測試包含抗體或特異性結合劑之組合物結合人類海帕西啶的能力。抗體之產生涉及（例如）使產生免疫球蛋白之細胞與經純化之人類海帕西啶組合物接觸且分離由該細胞所產生之免疫球蛋白。對於抗體或特異性結合劑之篩檢通常涉及（例如）使候選海帕西啶結合搭配物與經純化之人類海帕西咬組合物接觸且偵測候選海帕西啶結合搭配物與組合物中之人類海帕西啶之間所形成的複合物。在另一相關實施例中，該方法進一步包含向哺乳動物投與候選海帕西啶結合搭配物。測試抗體或特異性結合劑結合人類海帕西咬之能力涉及（例如）使其與經純化之人類海帕西啶組合物或其保留適當指疊之片段接觸且偵測人類海帕西咬與該抗體或特異性結合劑之間所形成的複合物。在一相關態樣中，提供一種使包含SEQ ID NO: 96之人類海帕西啶多肽再摺疊成正確摺疊之生物活性形式的方法，其包含（a)在促進變性之條件下使人類海帕西啶多肽暴露於離液劑，及（b)在促進恢復成正確摺疊及生物活性形式之條件下使（a)之產物暴露於氧化劑，及（c)回收包含生物活性人類海帕西啶多肽之溶液，其中至少7〇%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少 88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少 93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%或至少99%或以上之人類海帕西啶多肽具有C2-C4二硫鍵及C5-C7二硫鍵。可藉由此項技術中已知之方法（包括異核單量子相關（HSQC)，Morita 等人，protein science， 159757.doc •14- 201206954 12(6)，1216-1221 (2003))量化正確摺疊的蛋白質在溶液中之量。在一實施例中，正確摺疊之生物活性海帕西啶在細胞基檢定中具有小於100 nMiECw。在另一實施例中，正確摺疊之生物活性海帕西啶在細胞基檢定中具有小於3〇 nM之ECw。在一相關實施例中，（b)進一步包含使人類海帕西啶多肽與除空氣以外之氧化劑接觸。在另一實施例中，氧化在大於8之pH值下且在含有低於〇1%乙酸之溶液中發生。在一不同態樣中，提供保留相同或相似二硫鍵連接性及 /或相同或相似預測三維結構之人類海帕西啶變異體。在例示性實施例中，該變異體保留所有8個半胱胺酸殘基且進一步保留C2-C4二硫鍵及/或C5-C7二硫鍵。該等變異體可展現促效劑或拮抗劑活性，亦即保留或抑制海帕西啶生物活性（抗微生物或鐵調節活性）。在例示性實施例中，提供一種包含在長度上與SEQ ID NO: 96至少70%、至少 75%、至少80%、至少85。/。、至少90。/。、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列的海帕西啶類似肽。海帕西啶變異體可展現下列特性中之一或多者：保留膜鐵轉運蛋白結合活性（亦即活化膜鐵轉運蛋白或抑制膜鐵轉運蛋白鐵運輸）、促進或抑制成熟人類海帕西啶（SEQ ID NO: 9)之鐵調節活性及/或降低或增加活體内循環鐵含量。在另一態樣中’提供一種可偵測作為主要條帶並具有低於6 kd(例如3 kd±2)之近似分子量（如藉由在還原條件下進 159757.doc 15- 201206954 行十二院基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS_page)所測定）的SEQ ID NO: 9之經純化成熟人類海帕西啶的抗體。以上概述並不意欲限定本發明之每個態樣，且在其他部分（諸如實施方式）中描述其他態樣。預期整個文件係以統一揭示内容來敍述，且應瞭解即使在此文件之同一句子或 &落或部分中並未發現本文中所描述之特徵一起的組合，亦涵蓋該等特徵之所有組合。除上述以外，作為另一態樣，本發明可包括在任何情況下在範疇上比由本文中特定段落所定義之變體窄的本發明之所有實施例。舉例而言，本發明之某些態樣被描述為屬，且應瞭解屬之各成員單獨地為本發明之態樣。亦應瞭解破描述為屬或對屬之成員進行選擇的態樣涵蓋該屬之兩個或兩個以上成員之組合。應瞭解儘管在各種情況下使用"包含"文字來介紹說明書中之各種實施例，但亦可使用"由……組成"或"由……基本上組成"文字來描述相關實施例。應注意術語"一”係指一或多個（種），例如"一個免疫球蛋白分子，，應被理解為表示一或多個免疫球蛋白分子。因而，術語，，一，，、，，一或多個 (種）"及”至少一個（種）”在本文中可互換使用。亦應瞭解當描述值之範圍時，所描述之特徵可為範圍内所見之個別值。舉例而言，"約pH 4至約pH 6之？11值"可為 (<~ 不限於）pH 4、PH 4.2、pH 4.6、pH 5.1、PH 5.5等及該等值之間的任何值。另外，，，約pH 4至約pH 6之阳值"不應被解釋為意謂所討論之調配物的P Η值在儲存期間在p H 4至 159757.doc 201206954 PH 6之範圍内變化2個pH值單位，而是意謂溶液之pH的值可選於彼範圍，且於約彼pH值下溶液保持緩衝。在一些實施例中，當使用術語"約”時，其意謂所列數字加上或減去所列數字之5。/。、、15%或以上。可根據上下文確定所欲之實際變化。儘管申請者創立本文中所述之本發明之全邻範疇，但申s青者並不意欲主張其他人之先前技術著作中所描述之標的。因此，在藉由專利局（patent 〇ffice)或其他實體或個體使得申請者關注處於申請專利範圍範疇内之法定先前技術的情況下，申請者保留在適用專利法下行使修正權利的權利以便重新定義此種申請專利範圍之標的從而明確將該法定先前技術或法定先前技術之明顯變化自此種申請專利範圍之範疇中排除。亦預期由該經修正的申請專利範圍所定義之本發明的變化為本發明之態樣。【實施方式】人類海帕西啶基因編碼84個殘基的前導肽（SEQ ID NO: 8) °相應cDNA及染色體組序列係分別示於SEQ ID NO: 7 及SEQ ID NO: 1〇〇中。首先使24個殘基的N-末端信號肽 (SEQ ID NO: 8之殘基1-24)裂解以產生原海帕西啶，隨後將該原海帕西啶進一步藉由使前結構域（SEq id NO: 8之殘基25-59)裂解而進行加工以產生25個殘基的成熟海帕西啶（SEQ ID NO: 8之殘基 60-84，在 SEQ ID NO: 9中所示）。除主要25個胺基酸形式之外，可在尿中鑑別出長度為20或 22個胺基酸之其他N-末端截短形式（20個胺基酸，SEQ ID NO: 96 ;及22個胺基酸，SEQ ID NO: 98)。成熟人類海帕 159757.doc • 17- 201206954 西啶含有八個在本文中依次被稱為clsC8(| N末端至c_ 末端編號）之半耽胺酸殘基。關於海帕西啶在本文中所報導之新穎二硫鍵連接性及相應模型化二維結構亦使產生保留相同或相似二硫鍵連接性且適用作海帕西啶生物活性之調節劑的海帕西啶變異體成為可能。舉例而言，可設計且產生與海帕西啶受體結合且使海帕西啶受體活化之分子、與膜鐵轉運蛋白結合且引起膜鐵轉運蛋白内化之分子或相對於海帕西啶充當競爭性抑制劑之分子》 I.經純化之正確摺疊的人類海帕西啶組合物可能需要使海帕西啶多肽"再摺疊"且氧化成適當三級結構且產生二硫鍵以便為生物學上有效的。可使用本文中所述之程序及此項技術中所熟知之其他程序實現再槽疊。該等方法包括（例如）在離液劑存在下使溶解多肽試劑暴露於通*咼於7之pH值環境^離液劑為包括（但不限於）以下各物之化合物：鹽酸胍（guanidine hydrochloride)(胍鹽酸鹽 (guanidinium hydrochloride)，GdnHCl)、硫酸胍、尿素、硫氰酸鈉、十二烧基肌胺酸納（SarC〇Syl)、十二烧基硫酸鈉、辛基硫酸納及/或其他能使蛋白質内之非共價分子間鍵結斷裂從而使多肽鏈呈現大體上無規構形的化合物。在大多數情況下，再摺疊/氧化溶液亦將含有特定比率之還原劑及其氧化形式以產生特定氧化還原電位，此使得二硫鍵改組（disuinde shuffling)可發生以便形成半胱胺酸橋鍵。還原劑能夠轉移電子且（在此種情況下）"還原"各種 I59757.doc -18- 201206954 原子之間的鍵。在本發明之各種實施例的情況下，還原劑將破壞分子内及分子間相互作用（尤其彼等涉及二硫橋之相互作用）。根據本發明之各種實施例，例示性還原劑包括一硫蘇糖醇、麵胱甘肽、二硫赤藻糖醇或P_锍基乙醇。一些常用氧化還原對包括半胱胺酸/胱胺、麩胱甘肽/二硫雙GSH、氣化銅 '二硫蘇糖醇DTT/二噻烷DTT&2_巯基乙醇（bME)/二硫bME。在許多情形下，可使用共溶劑來提高再指疊效率。常用共溶劑包括甘油、各種分子量之聚乙二醇及精胺酸》一旦再指疊後’可藉由此項技術中已知之多種技術來評估海帕西啶多肽之二硫鍵連接性。在一態樣中，該技術為 NEM部分還原烷基化；在另一態樣中，.其為傅立葉轉換質譜法（FT-MS)。在實例1及4中比較詳細地論述NEM部分還原烷基化及FT-MS。 FT-MS(傅立葉轉換質譜法）可用於評估二硫鍵連接性。如此項技術中所知，FT-MS係基於帶電粒子在強大穩定磁場中旋轉之原理。藉由偵測由旋轉離子所產生之電流，可使用傅立葉轉換來確定離子之m/z ^有利地，此程序使極高質量解析度及執行適宜聯合質譜分析實驗之能力成為可能。同時，其使蛋白水解片段在分析下之明確分配成為可能。（參見例如 Marshall等人，Mass Spectrometry Reviews 1.7:1-35，1998 ; Lewis等人，Proc Natl Acad Sci U S A 95:8596-601, 1998 ; Li 等人，Anal Chem，66:2077-83 1994)。在實例1及4中比較詳細地論述FT-MS。 159757.doc -19- 201206954 可藉由此項技術中已知之方法（包括異核單量子相關 (HSQC)，Morita等人，Protein Science，12(6)，1216-1221 (2 003))來量化正確指疊的蛋白質在溶液中之量。錯誤指疊的蛋白質（諸如海帕西啶）將在HSqC譜中具有獨特交又峰。原則上藉由對該等峰值求積分來量化錯誤摺疊百分數。 II·海帕西咬拮抗劑本發明之各種實施例提供兩種不同種類之海帕西啶拮抗劑的製法及用途：（a)海帕西啶活性拮抗劑或（15)海帕西啶表現抑制劑。如本文中所用，”海帕西啶活性拮抗劑"意謂一種抑制人類海帕西啶鐵調節活性但並不抑制海帕西啶基因或海帕西啶mRNA之表現的物質。如本文中所用，"海帕西啶表現抑制劑"意謂一種抑制海帕西啶基因或海帕西啶mRNAi表現的物質。 "儘管海帕西咬活性拮抗劑與海帕西絲現抑制劑皆歸入海帕西啶拮抗劑"之一般種類，但兩者為互斥種類。在-態樣中，海帕西咬活性拮抗劑可為—種例如藉由抑制海帕西咬與膜鐵轉運蛋白之間的結合、抑制受海帕西咬控制之細胞鐵滯留或促進膜鐵轉運蛋白依賴性鐵運輸來抑制海帕西咬之功能的物質。此類海帕西咬活性括抗劑包括結合海怕西咬且抑制其活性之基於抗體或肽之特異性结人劑，包括本文中所述之抗體中U —者；與臈鐵轉運蛋Z 結合但並不活化膜鐵轉運蛋白鐵運輸之海帕西咬變異體及 159757.doc •20· 201206954 其衍生物；及結合海帕西啶且抑制其活性的分子 /-Γ , 里优馆 >兄低於約1 〇〇〇道爾頓之小分子有機化合物。海帕西啶表現抑制劑包括與海帕西啶DNA或mRNA結合且抑制海帕西啶表現之聚核苦酸或寡核苦酸，包括抑ϋ 帕西啶表現之反義寡核苷酸、抑制性RNA、DNA酶、核糖核酸酶、適體或其醫藥學上可接受之鹽。 A.抗海帕西啶抗體及特異性結合劑本發明之各種實施例提供結合人類海帕西啶之抗體（包括單株抗體）、產生該等抗體之方法、使用該等抗體來债測海帕西啶之方法、包括該等抗體之醫藥調配物、製備該等醫藥調配物之方法以及用該等醫藥調配物（包括與如下所述之紅血球生成刺激劑的組合療法）治療患者之方法。亦乂供編碼該專抗體之核酸、包含該等核酸之載體及重組宿主細胞以及產生該等抗體之方法。術語"抗體"係以最廣泛意義使用且包括經完全裝配之抗體、單株抗體、多株抗體、多特異性抗體（包括雙特異性抗體）、可結合抗原之抗體片段（包括Fab，、F，（ab)2、Fv、單鏈抗體、雙功能抗體）及包含上述物之重組肽（其限制條件為該等者顯示所需生物活性）。涵蓋完整分子及/或片段之多聚體或聚集體，包括化學衍生抗體。涵蓋任何同型類或子類（包括 IgG、IgM、IgD、IgA及 IgE、IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgAl及IgA2)或任何異型之抗體。不同同型具有不同效應功能；舉例而言，IgG 1及IgG3同型具有抗體依賴性細胞毒性（ADCC)活性》 •21· 159757.doc 201206954 在一些實施例中’該等抗體展現所需特徵，諸如如由 kd(平衡解離常數）所衡量的對海帕西啶之結合親和力在 1χ1〇-6 Μ或以下之範圍内或範圍降至ΙΟ·16 Μ或更低（例如約 10·7、1〇·8、10·9、1〇·10、10'11、ΙΟ·"、1〇-ΐ3、1〇-14、1〇· 15' ΙΟ·16 Μ或以下）。可在溶液平衡檢定中使用BIAc〇re&/ 或KinExA測定平衡解離常數，諸如實例13及14中所述。在其他實施例中’抗體展現對於海帕西啶之特異性。如本文中所用’當與不同家族中之其他無關蛋白質相比，抗體對人類海帕西啶具有明顯較高之結合親和力且因此能夠區分人類海帕西啶時，該抗體對於人類海帕西啶"具有特異性％在一些實施例中，該等抗體亦可與其他物種之海帕西啶（諸如鼠類、大鼠或靈長類海帕西啶）交叉反應；而在其他實施例中，該等抗體僅與人類或靈長類海帕西咬結合而不與蓄齒動物海帕西咬明顯、结合。在例示性實施例中，抗體與人類及食蟹猴海帕西咬結合但不與餐齒動物海帕西咬明顯結合。在一些實施例中，對於海帕西咬具特異 f生之抗體與同一家族之其他蛋白質交又反應，而在其他實施例中’料抗體使海帕西対別於其他㈣家族成員 (包括防禦素（defensin)或小鼠hepc2)。在’、他實施例中，單株抗體在活體外且較佳亦在活體内抑制（或中和）海帕西咬鐵調節活性。該等海帕西咬中和抗體在α療上適用於海帕西咬相關病症或鐵穩態失調症。可經由若干指標（例如鐵蛋白/鐵含量、紅血球計數、紅血球特徵（▲紅素含置及/或細胞容積）、早期紅血球特徵（網狀 I59757.doc •22· 201206954 金球數目、血紅素含量或細胞容積KClinical Hematology，第三版，LiPPincott，williams 及 Wilkins ;編者Mary L· Turgeon，1999)、膜鐵轉運蛋白内化或鐵運輸）來量測海帕西咬中和活性。在一例示性實施例中，在約 ΙΟ8 Μ或以下之ECS()下，單株抗體降低細胞内鐵濃度且/或增加循環鐵濃度》在一些實施例中，如本文中所述之單株抗體拮抗人類海帕西咬之效應或抑制海帕西啶鐵調節活性。在一些實施例中，如本文中所述之單株抗體在約丨χ丨〇·8 M或以下或約 lxio 7 Μ或以下之ECso下發揮效應。舉例而言，如由鐵蛋白檢疋所測疋，抗體可在約1 X Μ或以下之ec5〇下降低細胞中之細胞内鐵含量或可在約lxl〇·8 Μ或以下之^(：50下降低鐵蛋白表現。在其他實施例中，如本文中所述之單株抗體可使游離血清海帕西啶含量降低至少約2〇%、至少約 30%、至少約40%、至少約5〇%、至少約6〇%、至少約 70%、至少約80%或至少約9〇%。在其他實施例中，如本文中所述之單株抗體可使紅血球計數（數目）、紅血球平均細胞容積或紅血球血紅素含量增加，使血紅素增加，使血容比增加，使Tsat增加，使循環（或血清）鐵含量增加且/或使網狀血球計數、網狀血球平均細胞容積、網狀血球血紅素含量或網狀血球數目增加或正規化。在特定例示性實施例中，本發明涵蓋·· 1)保留抗體 Ab43、2.7、2.41、R9、1C9、1S1、1S2、 1S3、1S4、1S5、3B3、4E1、7A3、9D12、12B9、15E1、 159757.doc •23· 201206954 18D8、19C1、19D12、19H6、23F11及 26F11 中之任一者的 CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2 或 CDRL3 中之任一者、兩者、三者、四者、五者或六者且視情況包括該（等）CDR中之一或兩個突變的單株抗體； 2) 保留抗體 Ab43、2.7、2.41、R9、1C9、1S1、1S2、 1S3、1S4、1S5、3B3、4E1、7A3、9D12、12B9、15E1、 18D8、19C1、19D12、19H6、23F11 及 26F11 中之任一者之所有CDRH1、CDRH2、CDRH3或重鏈可變區且視情況包括該（等）CDR中之一或兩個突變的單株抗體； 3) 保留抗體 Ab43、2.7、2.41、R9、1C9、1S1、1S2、 1S3、1S4、1S5、3B3、4E1、7A3、9D12、12B9、15E1、 18D8、19C1、19D12、19H6、23F11及 26F11 中之任一者之所有CDRL1、CDRL2、CDRL3或輕鏈可變區且視情況包括該（等）CDR中之一或兩個突變的單株抗體； 4) 結合於與抗體 Ab43、2_7、2.41、R9、1C9、1S1、 152、 1S3、1S4、1S5、3B3、4E1、7A3、9D12、12B9、 15E1、18D8、19C1、19D12、19H6、23F11 及 26F11 相同之成熟人類海帕西啶抗原決定基（例如如經由X射線晶體分析儀所測定）或包含SEQ ID NO: 9之胺基酸1-5内的胺基酸及/或由SEQ ID NO: 9之胺基酸10-13所形成之環内的胺基酸及/或由SEQ ID NO: 9之胺基酸14-22所形成之環内的胺基酸之構形抗原決定基的單株抗體；及 5) 與抗體 Ab43、2.7、2.41、R9、1C9、1S1、1S2、 153、 1S4、1S5、3B3、4E1、7A3、9D12、12B9、15E1、 159757.doc • 24· 201206954 18D8、19C1、19D12、19H6、23F11 及 26F11 競爭結合成熟人類海帕西啶達超過約75%、超過約80%或超過約8 1 %、 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91% ' 92%、93%、94°/。或 95%之單株抗體。在一實施例中，該抗體包含選自由SEQ ID NO : 16-21組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中，該抗體包含選自由SEQ ID NO : 28-33(2.7 CDR)組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中，該抗體包含選自由SEQ ID NO : 40-45(2.41 CDR)組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中，該抗體包含選自由SEQ ID NO : 52-57(R9 CDR)組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中，該抗體包含選自由SEQ ID NO: 111-116(1C9 CDR)組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中，該抗體包含選自由SEQ ID NO : 121-126(3B3 CDR)組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中，該抗體包含選自由SEQ ID NO : 131-136(4E1 CDR) 組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中，該抗體包含選自由SEQ ID NO : 141-146(7A3 CDR)組成之群的胺基 159757.doc -25- 201206954 酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列《在另一實施例中，該抗體包含選自由SEQ ID NO: 151-156(9D12 CDR)組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中’該抗體包含選自由SEQ ID NO : 161 _ 166(12B9 CDR)組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中，該抗體包含選自由SEQ ID NO : 171-176(15E1 CDR)組

成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中，該抗體包含選自由SEQ ID NO : 314-319(18D8 CDR)組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中，該抗體包含選自由SEQ ID NO : 324-329(1901 CDR)組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中，該抗體包含選自由SEQ ID NO : 294-299 (19D12 CDR)組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中’該抗體包含選自由SEQ ID NO : 304-309(19H6 CDR) 組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個 '四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中，該抗體包含選自由SEQ ID NO : 181-186(23F11 CDR)組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中，該抗體包含選自由SEq ID 159757.doc -26- 201206954 NO : 191-196(26F11 CDR)組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中，該抗體包含選自由SEQ ID NO : 203-205及 131-133(1S1 CDR)組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中，該抗體包含選自由SEQ ID NO: 214-216及144-146(1S2 CDR)組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中，該抗體包含選自由SEQ ID NO: 225-227及164-166(1 S3 CDR)組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中，該抗體包含選自由 SEQ ID NO: 236-238 及 174-176(1S4 CDR) 組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在另一實施例中，該抗體包含選自由 SEQ ID NO: 247-249及 184-186(1S5 CDR)組成之群的胺基酸序列中之至少一個、兩個、三個、四個、五個或所有胺基酸序列。在一些實施例中，該抗體包含所有三個輕鏈CDR、所有三個重鏈CDR或所有六個CDR。在一些例示性實施例中，抗體之兩個輕鏈CDR可與不同抗體之第三個輕鏈CDR組合。或者，尤其當CDR具有高度同源性時一抗體之CDRL1 可與不同抗體之CDRL2及另一抗體之CDRL3組合。同樣，抗體之兩個重鏈CDR可與不同抗體之第三重鏈CDR組合；或尤其當CDR具有高度同源性時，一抗體之CDRH1可與不 159757.doc -27- 201206954 同抗體之CDRH2及另一抗體之CDRH3組合。亦可使用一致CDR。在一例示性實施例中，該抗體包含在 SEQ ID NO: 74(XASNLES)、SEQ ID NO: 75(XQSNEE)及 SEQ ID NO: 76(QQXNEX) > SEQ ID NO: 28(RASESVDSYGNSFMH)' SEQ ID NO: 77(WINTXSGVPTYADDFXG) ' SEQ ID NO: 78(XXYYGX*A*Y)、SEQ ID NO: 19(TYGMS)、SEQ ID NO: 284(VIXYXXSNKYYADSVKG)、SEQ ID NO: 285 (WIXAXNGXXXXAXXXQX)、SEQ ID NO: 286(AQEGXAPDAFDI)、 SEQ ID NO: 287(QAWYSSTNVX)、SEQ ID NO: 288 (QAWDSSTAXX)、SEQ ID NO: 289(QSDYSSXXX")中所示之胺基酸序列中的一或多個胺基酸序列，其中X為任何胺基酸且*可缺失或可為任何胺基酸。在另一例示性實施例中，該抗體包含抗體之輕鏈及/或重鏈可變區，例如SEQ ID NO: 15(Ab43重鏈可變區）及/或 8£()1〇]^0:13(八543輕鏈可變區）；8丑(5 1〇]^0:27(2.7重鏈可變區）及/或SEQIDNO:25(2.7輕鏈可變區）；SEQID NO: 39(2.41重鏈可變區）及/或SEQ ID NO: 37(2.41輕鏈可變區）；或SEQ ID NO: 51 (R9重鏈可變區）及/或SEQ ID NO: 49(119輕鏈可變區）；8丑(）1〇1^〇:110(1€9重鏈可變區）及/ 或 SEQ ID NO: 108(1C9 輕鏈可變區）；或 SEQ ID NO: 120(3B3重鏈可變區）及/或SEQ ID NO: 118(3B3輕鏈可變區）；SEQ ID NO: 130(4E1 重鏈可變區）及 / 或 SEQ ID NO: 128(4E1輕鏈可變區）；或SEQ ID NO: 140(7A3重鏈可變區）及/或SEQ ID NO: 138(7A3輕鏈可變區）；或SEQ ID NO: 159757.doc -28 · 201206954 150(9D12重鏈可變區）及/或SEQ ID NO: 148(9D12輕鏈可變區）；SEQ ID NO: 160(12B9重鏈可變區）及/或 SEQ ID NO: 158(12B9輕鏈可變區）；SEQ ID NO: 170(15E1重鏈可變區）及 / 或 SEQ ID NO: 168(15E1輕鏈可變區）；SEQ ID NO: 313(18D8重鏈可變區）及/或SEQ ID NO: 311(18D8輕鏈可變區）；SEQ ID NO: 3 23( 19C1重鏈可變區）及 / 或 SEQ ID NO: 321(19C1輕鏈可變區）；SEQ ID NO: 293(19D12重鏈可變區）及 / 或 SEQ ID NO: 291(19D12 輕鏈可變區）；SEQ ID NO: 303( 19H6重鏈可變區）及/或SEQ ID NO: 301(19H6輕鏈可變區）；SEQ ID NO·· 180(23F11 重鏈可變區）及 / 或 SEQ ID NO: 178(23F11 輕鏈可變區）；SEQ ID NO: 190(26F11 重鏈可變區）及/或SEQ ID NO: 188(26F11輕鏈可變區）；或SEQ ID NO: 202(1 SI重鏈可變區）及/或SEQ ID NO: 128(1S1輕鏈可變區）；SEQ ID NO: 213(1S2輕鏈可變區）及/或SEQ ID NO: 140(1 S2重鏈可變區）；SEQ ID NO: 224(1 S3輕鏈可變區）及/ 或 SEQ ID NO: 160(1 S3 重鏈可變區）；SEQ ID NO: 235( 1S4 輕鏈可變區）及/或SEQ ID NO: 170(1S4重鏈可變區）；或 SEQ ID NO: 246(1S5輕鏈可變區）及 / 或 SEQ ID NO: 190(1S5重鏈可變區）。

在一些實施例中，提供一種包含具有與選自由以下各者組成之群的胺基酸序列至少約65%、70%、75%、80°/〇、 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95% ' 96%、97% ' 98%、 99%或99%以上一致之胺基酸序列之多肽的抗體：SEQ ID 159757.doc -29- 201206954 NO. 1 5(Ab 4 3重键可變區）、27(2.7重鍵可變區）、39(2.41重鏈可變區）、51(R9重鏈可變區）、ii〇(1C9重鏈可變區）、 120(3B3重鍵可變區）、π〇(4Ε1重鏈可變區）、i40(7A3重鍵可變區）、150(9D12重鏈可變區）、160(12B9重鏈可變區）、 170(15E1重鍵可變區）、313(18D8重鍵可變區）、323(19C1 重鍵可變區）、293(19D12重鏈可變區）、303(19H6重鍵可變區）、180(23F11重鏈可變區）、190(26F11重鍵可變區）、 202(181重鏈可變區）、13(入匕43輕鏈可變區）、25(2.7輕鍵可變區）、37(2.41輕鏈可變區）、49(R9輕鍵可變區）、 108(1C9輕鏈可變區）、118(3B3輕鏈可變區）、128(4E1輕鏈可變區）、138(7A3輕鏈可變區）、148(9D12輕鏈可變區）、 158(1289輕鍵可變區）、168(15£1輕鍵可變區）、311(1808 輕鏈可變區）、321(I9C1輕鏈可變區）、291(19D12輕鏈可變區）、301(19116輕鍵可變區）、178(23?11輕鏈可變區）、 188(26?11輕鏈可變區）、213(182輕鏈可變區）、224(183輕鏈可變區）、235(1 S4輕鏈可變區）及246(1 S5輕鏈可變區），該多肽進一步包含在5£(^1〇>10:16-21(八5430〇11)、28-33(2.7 CDR) ' 40-45(2.41 CDR) ' 52-57(R9 CDR) ' 111-116(1C9 CDR)、121·126(3Β3 CDR)、131-136(4E1 CDR)、 141-146(7A3 CDR)、151-156(9D12 CDR)、161-166(12B9 CDR) ' 171-176(15E1 CDR) ' 314-319(18D8 CDR) ' 324-329(19C1 CDR)、294-299(19D12 CDR)、304-309(19H6 CDR)、181-186(23F11CDR)、191-196(26F11CDR)、203-205 及 13 1-133(1S1 重鏈 CDR)、214-216及 144-146(1 S2輕鏈 159757.doc •30- 201206954 CDR)、225-227 及 164-166(1S3 輕鏈 CDR)、236-238 及 Μ-ΐ 76(1 S4 輕鏈 CDR) 以及 247-249 及 184-186(1 S5 輕鏈 CDR) 中所示之胺基酸序列中之至少一或多個胺基酸序列。在上述實施例之任一者中，該多肽包括包含一或兩個對SEQ ID NO: 16-21(Ab43 CDR)、28-33(2.7 CDR)、40-45(2.41 CDR)、52-57(R9 CDR)、111-116(1C9 CDR)、121-126(3B3 CDR)、131-136(4E1CDR)、141-146(7A3CDR)、151_ 156(9D12 CDR)、161-166(12B9 CDR)、171-176(15E1 CDR)、314-319(18D8 CDR) ' 324-329(19Cl CDR) ' 294-299(19D12 CDR) > 304-309(19H6 CDR) ' 181-186(23F11 CDR)、191-196(26F11 CDR)、203-205及 131-133(1S1 重鏈 CDR)、214-216 及 144-146(1S2 輕鏈 CDR)、225-227 及 164-166(1 S3 輕鏈 CDR)、236-238 及 174-176(1 S4輕鏈 CDR)以及 247-249及184-186(1 S5輕鏈CDR)中所示之胺基酸序列中的任一者之修飾的序列。亦提供抗體 1C9、3B3、4E1、7A3、9D12、12B9、 15E1、23F11及26F11中之每一者之全長輕鏈及重鏈的 cDNA及胺基酸序列。編碼抗體1C9、3B3、4E1、7A3、 9D12 ' 12B9、15E1、23F11、26F11、1S2、1S3、1S4及 1S5之全長輕鏈（包括恆定區）的cDNA序列係分別示於SEQ ID NO: 197 、 208 、 219 、 230 、 241 、 252 、 256 、 260 、 264、217、228、239 及 250 中。抗體 1C9、3B3、4E1、 7A3、9D12、12B9、15E1、23F11、26F11、1S2、1S3、 1 S4及1 S5之全長輕鏈（包括恆定區）之胺基酸序列係分別示 159757.doc 31· 201206954 於SEQ ID NO: 198(其中殘基wo相當於信號狀且其餘為成熟多狀）、209(其中殘基ι_19相當於信號肽且其餘為成熟多狀）、220(其中殘基卜“相當於信號肽且其餘為成熟多狀）、231(其中殘基U0相當於信號肽且其餘為成熟多狀）、242(其中殘基i_19相當於信號肽且其餘為成熟多狀）、253(其中殘基uo相當於信號肽且其餘為成熟多狀）、257(其中殘基i—20相當於信號肽且其餘為成熟多狀）、261(其中殘基卜19相當於信號肽且其餘為成熟多狀）、265(其中殘基丨_19相當於信號肽且其餘為成熟多狀）、21 8(其中殘基1_22相當於信號肽且其餘為成熟多狀）、229(其中殘基〗_22相當於信號肽且其餘為成熟多狀）、240(其中殘基丨-22相當於信號肽且其餘為成熟多肽）及251 (其中殘基丨—22相當於信號肽且其餘為成熟多狀）中。編碼抗體 1C9、3B3、4E1、7A3、9D12、12B9、15E1、 23F11、26F11及1S1之全長重鏈（包括恆定區^cDNA序列係分別示於 SEQ ID NO: 199、210、221、232、243、 254、258、262、266 及 206 中。抗體 1C9、3B3、4E1、 7A3、9D12、12B9、15E1、23F11、26F11 及 1“之全長重鍵（包括怪定區）之胺基酸序列係分別示於SEq ID NO: 2〇〇(其中殘基1-19相當於信號肽且其餘為成熟多肽）、 211(其中殘基1-19相當於信號肽且其餘為成熟多肽）、 222(其中殘基卜19相當於信號肽且其餘為成熟多肽）、 233(其中殘基丨-19相當於信號肽且其餘為成熟多肽）、 244(無信號肽）、255(其中殘基1-19相當於信號肽且其餘為 159757.doc -32- 201206954 成熟多肽）、259(其中殘基1-19相當於信號肽且其餘為成熟多肽）、263(其中殘基丨-20相當於信號肽且其餘為成熟多肽）、267(其中殘基丨-19相當於信號肽且其餘為成熟多肽）及207(其中殘基1-19相當於信號肽且其餘為成熟多肽）中。在本發明之一些實施例中，抗體包含SEQ m NO: 207(1S1 重鏈）之胺基酸 20-467 及 SEQ ID NO: 220(1S1 輕鍵）之胺基酸21-234;或SEQ ID NO: 233(1S2重鏈）之胺基酸 20-466 及 SEQ ID NO: 218(1S2 輕鏈）之胺基酸 23_234;或 SEQ ID NO: 255(1S3 重鏈）之胺基酸 20-466 及 SEQ ID NO: 229(1S3 輕鏈）之胺基酸 23-234;或 SEQ ID NO: 259(1S4 重鏈）之胺基酸20-466及SEQ ID NO: 240(1S4輕鍵）之胺基酸 23-234;或 SEQ ID NO: 267(1S5 重鏈）之胺基酸 2〇_466 及 SEQ ID NO: 251(1S5輕鏈）之胺基酸23-234。如本文中所用之術語•，單株抗體"係指獲自一群大體上同質之抗體之抗體（至於彼術語"抗體"係如本文中所定義），亦即無論由融合瘤產生還是由重組DNA技術所產生，構成該群之個別抗體除可以微量存在之可能天然存在之突變或替代性後轉譯修飾以外為一致的。單株抗體之非限制性實例包括鼠類、兔、大鼠、雞、嵌合、人類化或人類抗體、完全裝配之抗體、多特異性抗體（包括雙特異性抗體）、可結合抗原之抗體片段（包括Fab’、F，（ab)2、Fv、單鍵抗體、雙功能抗體）、最大抗體、奈米抗體及包含上述物之重組肽（其限制條件為該等者顯示所需生物活性）或其變異體或衍生物。人類化或修飾抗體序列使其更類似於人類之内容 159757.doc •33· 201206954 係描述於例如 Jones 等人 ’ Nature 321:522-525 (1986); Morrison等人，Proc. Natl· Acad. Sci·，U.S.A.，81:6851-6855 (1984) ； Morrison 及 Oi，Adv. Immunol., 44:65-92 (1988) ; Verhoeyer等人，Science 239:1534_1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991) ； Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169-217 (1994);及 Kettleborough, C.A·等人，Protein Eng. 4(7):773-83 (1991) ; Co，M. S.等人 (1994)，J. Immunol. 152，2968-2976 ; Studnicka等人Protein Engineering 7: 805-814 (1994)中：其每一者以引用方式全部併入本文中。一種分離人類單株抗體之方法為使用噬菌體展示技術。噬菌體展示法係描述於例如Dower等人，WO 91/17271、McCafferty 等人，WO 92/01047 及 Caton 與 Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-6454 (1990)中，其每一者以引用方式全部併入本文中。另一種分離人類單株抗體之方法使用不產生内源性免疫球蛋白且經工程化而含有人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物。參見例如 Jakobovits 等人，Proc· Natl. Acad· Sci. USA, 90:2551 (1993) ； Jakobovits 等人，Nature, 362:255-258 (1993) ; Bruggermann 等人，Year in Immuno·，7:33 (1993) ; WO 91/10741、WO 96/34096、WO 98/24893 或美國專利申請公開案第20030194404號、第2003003 1667號或第20020199213號；其各自以引用方式全部併入本文中。 "經分離"抗體係指已自其自然環境之組份中鑑別出且分離出的抗體（至於彼術語"抗體"係如本文中所定義）。其自 159757.doc • 34· 201206954 Μ境之污染物組份為會干擾抗體之診斷性或治療性用途的物質且可包括酶、激素及其他蛋白質性或非蛋白質性溶 f °在某㈣施例中’抗體將被純化⑴至大於抗體之95重量％且最佳超過99重量％，⑺至足以獲得至少15跡末端或内部胺基酸序列殘基之程度，或（3)至具有均一性（藉由在還原或非還原條件下使用庫馬斯藍（c〇〇massie Mue)或較佳銀染色之SDS-PAGE得知）。經分離之天然:存在的抗體包括重組細胞内之原位抗體，此係因為抗體自然環境中之至少一個組份將不會存在。然而，經分離之抗體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。 "免疫球蛋白"或"天然抗體”為四聚醣蛋白。在天然存在之免疫球蛋白中，每個四聚體係由兩對一致之多肽鏈組成，各對具有一個”輕，，鏈（約25 kDa)及一個，，重，，鍵（約5〇_7〇 kDa)。各鍵之胺基末端部分包括具有約1〇〇至11〇或更多個主要負責抗原識別之胺基酸的"可變"（"V")區。各鏈之緩基末端部分界定主要負貴效應功能之，(·亙定區。免疫球蛋白可視其重鍵之恆定域之胺基酸序列而被分成不同種類。重鏈被分類為謬（μ)、德耳塔（△)、伽馬（γ)、阿爾法（α)及厄普西隆（ε)且將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及 IgE。若干該等者可被進一步分成子類或同型，例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 及 IgA2。不同同型具有不同效應功能；舉例而言，IgG 1及IgG3同型具有抗體依賴性細胞毒性（ADCC)活性。人類輕鏈被分類為卡帕（κ)及拉姆達（λ)輕鏈。在輕鍵及重鍵之内，可變區及恆定區係由具 159757.doc •35· 201206954 有約12或更多個胺基酸之"J"區域接合，其中重鏈亦包括具有約10或更多個胺基酸之"D"區域。通常參見 Fundamental Immunology，第 7章（paui，W.編，第二版， Raven Press, N.Y. (1989))。異型為可具有免疫原性且在人類中由特定等位基因編碼之抗體序列上（通常為恆定區上）之變體。已鑑別出五種人類 IGHC 基因（IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHA2 及 IGHE基因）之異型且分別將其指定為Glm、G2m、G3m、A2m及 Em異型》已知至少18種Gm異型：nGlm(l)、nGlm(2)、

Glm(l、2、3、17)或 Glm(a、χ、f、z)、G2m(23)或 G2m(n)、G3m(5、6、10、11、π、14、15、16、21、 24、26、27、28)或 G3m(bl、c3、b5、b0、b3、b4、s、 t、gl、c5、U、v、g5)。存在兩種A2m異型八之爪。）及 A2m(2)。關於抗體之結構及產生之詳細描述，參見R〇th，DB及

Craig, N.L” Ce//，94:411-414 (1998)，該文獻以引用方式全部併入本文中。簡言之，產生編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白序列之DNA之過程主要發生於發育3細胞中。在重排及接合各種免疫球蛋白基因片段之前’通常發現¥、〇、了及恆定（C)基因片段在單個染色體上相對地緊密接近。在B細胞分化期間，V、D、J(或在輕鏈基因之情況下僅v及j)基因片奴之各適當家族成員中之一者經重組而形成重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因之功能重排可變區。此基因片段重排過程似乎為連續的。首先，使得重鏈〇與；接合，接著重鏈v 159757.doc • 36 - 201206954 與DJ接合且輕鏈V與J接合。除V、D及J片段重排之外，經由在輕鏈之V及J片段接合且重鏈之D及J片段接合之位置處的可變重組在免疫球蛋白重鏈及輕鏈之初級譜（repertoire) 中產生其他多變性。輕鏈中之該變化通常發生於V基因片段之最後密碼子及J片段之首個密碼子内。在D與JH片段之間的重鏈染色體上出現接合之相似不精確性且可能遍及多達10個核苷酸。此外，可將若干核苷酸插入並非由染色體組DNA所編碼之D與JH基因片段之間及VH與D基因片段之間。該等核苷酸之添加被稱為N區多樣性。可變區基因片段之該等重排及可在該接合期間出現之可變重組的淨效應為產生初級抗體譜。術語''高變"區係指互補判定區或CDR之胺基酸殘基（亦即如由 Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)所描述，輕鏈可變域中之殘基24-34(Ll)、50-56(L2)及89-97(L3)以及重鏈可變域中之 31-35(H1)、50-65(H2)及 95-102(H3))。甚至單個CDR儘管具有比含有所有CDR之完整抗原結合位點低之親和力，但其仍可識別且結合抗原。高變"環"之殘基的替代性定義係由Chothia等人，J. Mo/.別〇/· 79(5: 901-917 (1987)描述為輕鏈可變域中之殘基 26-32(Ll)、50-52(L2)及91-96(L3)以及重鏈可變域中之殘基 26-32(Η1)、53-55(H2)及 96-101(H3)。 ”構架”或FR殘基為除高變區殘基以外之彼等可變區殘 159757.doc -37- 201206954 基。 "抗體片段"包含完整免疫球蛋白之一部分（較佳完整抗體之抗原結合或可變區）且包括由抗體片段形成之多特異性 (雙特異性、三特異性等）抗體。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學裂解完整抗體來產生免疫球蛋白之片段。抗體片段之非限制性實例包括Fab、Fab·、F(ab')2、 Fv(可變區）、域抗體（dAb，含有VH域）（Ward等人，Nature 341:544_546，1989)、互補判定區（CDR)片段、單鏈抗體 (scFv，在單個多肽鏈上含有VH及VL域）(Bird等人， Science 242:423-426，1988 及 Huston 等人，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 85:5879-5883, 1988，視情況包括多肽連接子；且視情況具有多特異性，Gruber等人，J. Immunol. 152: 5368 (1994))、單鏈抗體片段、雙功能抗體（在單個多肽鏈上具有與另一鏈之互補VL及VH域成對之VH及VL 域）(EP 404,097 ; WO 93/11161 ;及 Hollinger 等人，卩1*〇(：· Natl· Acad. Sci. USA，90:6444-6448 (1993))、三功能抗體、四功能抗體、微型抗體（scFv經由肽連接子（無鉸鏈）或經由 IgG鉸鏈與 CH3 融合）（01afsen 等人，Protein Eng Des Sel. 2004年4月，17(4):315-23)、線性抗體（串聯Fd片段 (VH-CHl-VH-CHl)(Zapata#A，ProteinEng.，8(10):1057-1062 (1995)))、螯合重組抗體（crAb，其可結合於同一抗原上之兩個相鄰抗原決定基）(Neri等人，J Mol Biol. 246:367-73，1995)、雙抗體（bibody)(雙特異性 Fab-scFv)或三抗體（tribody)(三特異性 Fab-(scFv)(2))(Schoonjans 等 159757.doc -38· 201206954 人，J Immunol. 165:7050-57，2000 ; Willems 等人，J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786:161-76, 2003)、亦可包含在細胞内保留或指導抗體之細胞信號序列（Mhashilkar等人，EMBO J 14:1542-51，1995 ; Wheeler 等人，FASEB J. 17:1733-5，2003)的内抗體（Biocca等人， EMBO J. 9:101-108, 1990 ; Colby等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 101:17616-21，2004)、穿膜抗體（transbody)(含有與 scFv融合之蛋白轉導域（PTD)的可滲透細胞之抗體）(Heng 等人，Med Hypotheses. 64:1105-8, 2005)、奈米抗體（約 15 kDa重鏈可變域）（Cortez-Retamozo等人，Cancer Research 64:2853-57, 2004)、小分子免疫治療藥物（small modular immunopharmaceutical)(SMIP)(W003/041600、美國專利公開案20030133939及美國專利公開案20030118592)、抗原結合域免疫球蛋白融合蛋白、駱駝化抗體（camelized antibody)(其中VH與含有鉸鏈、CHI、CH2及CH3域之恆定區重組）(Desmyter 等人，J. Biol. Chem. 276:26285-90, 2001 ; Ewert等人，Biochemistry 41:3628-36，2002 ;美國專利公開案第20050136049號及第20050037421號）、含 VHH之抗體、重鏈抗體（HCAb，兩個具有H2L2結構之重鏈之同源二聚體）或其變異體或衍生物以及含有足以賦予多肽特異性抗原結合之免疫球蛋白之至少一部分（諸如CDR 序列）的多肽，其限制條件為抗體保留所需生物活性。術語"變異體"當與抗體結合使用時係指在可變區或相當於可變區之部分中含有至少一個胺基酸取代、缺失或插入 159757.doc -39- 201206954 之抗體的多肽序列，其限制條件為變異體保留所需結合親和力或生物活性。此外，如本文中所述之抗體可在恆定區中具有胺基酸修飾以改良抗體之效應功能，包括半衰期或 /青除率、ADCC及/或CDC活性。舉例而言，該等修飾可提高抗體藥物動力學作用或提高抗體在治療癌症時之有效性。參見Shields等人，J. Biol· Chem., 276(9):6591-6604 (2001) ’該文獻以引用方式全部併入本文中。在igGi之情況下，對恆定區（尤其鉸鏈或CH2區）之修飾可使效應功能 (包括ADCC及/或CDC活性）增加或降低。在其他實施例中’ IgG2恆定區被修飾以減少抗體-抗原聚集體形成。在

IgG4之情況下’對恆定區（尤其鉸鏈區）之修飾可減少半抗體形成。術語"修飾"當與本文中所述之抗體或多肽結合使用時包括（但不限於）一或多個胺基酸變化（包括取代、插入或缺失）；不干擾海帕西啶結合活性之化學修飾；藉由與治療劑或診斷劑接合進行之共價修飾；標記（例如使用放射性核種或各種酶）；共價聚合物連接，諸如聚乙二醇化（用聚乙二醇衍生化）；及藉由化學合成非天然胺基酸進行之插入或取代。在一些實施例中，本發明之經修飾多肽（包括抗體）將保留本發明之未經修飾分子之結合特性。術語"衍生物"當與本發明之抗體或多肽結合使用時係指藉由與治療劑或診斷劑接合、標記（例如使用放射性核種或各種酶）、共價聚合物連接（諸如聚乙二醇化）（用聚乙二醇衍生化）及經由化學合成非天然胺基酸進行之插入或取 159757.doc • 40· 201206954 代而被共價修飾的抗體或多肽。在一些實施例中，本發明之衍生物將保留本發明之未衍生化分子之結合特性。製造雙特異性或其他多特異性抗體之方法在此項技術中係已知的且包括化學交聯、使用白胺酸拉鏈[K〇stelny等人 ’ J. Immunol. 148:1547-1553，1992]、雙功能抗體技術 [Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, 1993] 、scFv二聚體[Gruber 等人，J· Immunol. 152: 5368, 1994] 、線性抗體[Zapata 等人，Protein Eng. 8:1057-62, 1995] 及螯合重組抗體[Neri等人，J Mol Biol. 246:367-73, 1995]。因此’可藉由此項技術中已知之技術來產生多種包含抗體之重鍵可變區或輕鏈可變區之一個、兩個及/或三個 CDR的組合物。抗體之重組產生亦提供視情況可操作地連接於為宿主細胞所識別之控制序列的編碼本文中所述之單株抗體之經分離核酸、包含該等核酸之載體及宿主細胞以及產生該等抗體之重組技術，該等技術可包含培養宿主細胞以便表現核酸且視情況自宿主細胞培養物或培養基中回收抗體。可藉由蛋白質直接定序來測定所關注之免疫球蛋白之相關胺基酸序列且可根據通用密碼子表設計適當編碼核苷酸序列。或者，可使用習知程序（例如藉由使用能夠與編碼單株抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針）自產生單株抗體之細胞中分離編碼單株抗體之染色體 159757.doc •41 · 201206954 組或cDNA且進行定序。使用標準技術進行選殖（參見例如Sambrook等人（1989)

Molecular Cloning: A Laboratory Guide，第 1-3 卷，Cold

Spring Harbor Press，該文獻以弓I用方式併入本文中）。舉例而言’可藉由反轉錄polyA+mRNA(較佳膜相關mRNA)來構建cDNA庫且使用對人類免疫球蛋白多肽基因序列具有特異性之探針篩檢該庫。然而在一實施例中，使用聚合酶鍵反應（PCR)來擴增編碼所關注之免疫球蛋白基因片段（例如輕鏈或重鏈可變片段）的cDNA(或全之部分）。可容易地將擴增序列選殖入任何適當載體（例如表現載體、小基因載體或嗔菌體展示載體）中。應瞭解，所用之特定選殖方法並非關鍵，只要有可能測定所關注之免疫球蛋白多肽之某些部分的序列即可。抗體核酸之一種來源為藉由自經所關注之抗原免疫之動物中獲得B細胞且使其與永生細胞融合而產生的融合瘤。或者，可自經免疫動物之B細胞（或整個脾）中分離核酸。編碼抗體之核酸的另-種來源為（例如）經由仙體展示技術所產生之該等核酸的庫。可藉由標準技術(諸如淘選 (panning))鑑別編碼所關注之肽（例如具有所需結合特徵之可變區肽）的聚核苷酸。可測定編碼免疫球蛋白多肽之整個可變區的序列；然而有時將適於僅定序可變區之一部分(例如編碼⑽之部分）。使用標準技術進行定庠疋序（參見例如Sambrook等人 (1989) Molecular Clonine· Α τ κ g. A Laboratory Guide ,第 1-3卷， 159757.doc •42- 201206954

Cold Spring Harbor Press 及 Sanger, F.等人（1977) proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467，該等文獻以引用方式併入本文中）。藉由比較經選殖核酸之序列與人類免疫球蛋白基因及cDNA之公開序列’熟習此項技術者將能夠容易地視所定序之區而確定（i)融合瘤免疫球蛋白多肽（包括重鏈之同型）之生殖系片段使用及（ii)重鏈及輕鏈可變區之序列，包括由N區添加及體細胞突變過程所產生之序列。免疫球蛋白基因序列資訊之一來源為國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information),

National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda，Md 0 如本文中所用，"經分離"核酸分子或"經分離"核酸序列為（1)自核酸之天然來源中通常與核酸分子締合之至少一種污染物核酸分子中鑑別出且分離出或（2)經選殖、擴增、標記或以別的方式使得有別於背景核酸以便可測定所關注之核酸之序列的核酸分子。經分離核酸分子在形式或背景方面不同於見於自然界之核酸分子。然而，經分離核酸分子包括含於通常表現抗體之細胞卡之核酸分子，其中（例如）核酸分子處於不同於天然細胞之染色體位置處。一旦分離後，可將DNA可操作地連接至表現控制序列或置於表現載體十，隨後將其轉染於不另外產生免疫球蛋白之伯主細胞中以便指導單株抗體在重組寄主細胞中之合成。抗體之重組產生在此項技術中係熟知的。表現控制序列係指對於可操作連接之編碼序列在特定宿 159757.doc -43- 201206954 主生物體中之表現所必需的DNA序列。適合於原核生物之控制序列（例如）包括啟動子、（視情況）操縱子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、多聚腺嘌呤信號及增強子。核酸當與另一核酸序列處於功能關係時為可操作連接的。舉例而言，若前序列或分泌前導序列2DNA被表現為參與多肽之分泌的前體蛋白質（prepr〇tein)，則可操作地將該前序列或分泌前導序列之DNA連接至多肽之DNA ;若啟動子或增強子影響序列轉錄，則可操作地將該啟動子或增強子連接至編碼序列；或若核糖體結合位點被定位以有助於轉譯’則可操作地將該核糖體結合位點連接至編碼序列。一般而言，"可操作地連接"意謂所連接之DNA序列為鄰接的，並在分泌前導序列之情況下為鄰接的且處於閱讀相（reading phase)。然而，增強子並非必定鄰接。藉由在適宜限制性位點處之連接來實現連接。若該等位點不存在，則根據習知做法使用合成寡核苷酸接頭（adapt〇r)或連接子。許多載體在此項技術中係已知的。載體組份可包括下列一或多者：信號序列（其可例如指導抗體之分泌）、複製起點、一或多個選擇性標記基因（其可例如賦予抗生素或其他藥物抗性，補足營養缺陷型缺陷或提供不可在培養基中獲得之關鍵營養素）、增強子元件、啟動子及轉錄終止序列’所有該等者在此項技術中係熟知的。細胞、細胞株及細胞培養物通常可互換使用且在本文中 159757.doc 201206954 所有該等名稱包括子代。轉型體及轉型細胞包括在不考慮轉移數之情況下源自其之主要個體細胞及培養物。亦應瞭解，所有子代可能歸因於有意或無意突變而在DNA含量方面並非精確一致《包括如針對在初始轉型細胞中所篩檢的具有相同功能或生物活性之突變體子代。例示性宿主細胞包括原核生物、酵母或高級真核生物細胞（亦即多細胞生物體）。原核宿主細胞包括真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科 (£«心〇hCieWaceae)，諸如埃希氏菌屬（心c/2eHc/n.a)(例如大腸桿菌（五.co/i))、腸桿菌屬（五、歐文氏菌屬 (Erwinia)、丸雷伯氏菌屦（Kiebsieua)、變形桿菌屬 (/Vo/ea·?)、沙門氏菌屬例如鼠傷寒沙門氏菌 (SalmoneUa typhimuriumY)、沙雪氏菌屣〈Serratia从例如黎質沙雷菌及志贺氏菌屬（57n.ge/⑷以及芽孢桿菌屬（Bacz7/〇(諸如枯草芽孢桿菌（反⑷及地衣芽孢桿菌（Β.丨icheniformis))、假單胞菌屬（Pseud〇m〇_) 及鏈黴菌屬（沿。真核微生物（諸如絲狀真菌或酵母）為重組多狀或抗體之適當選殖或表現宿主。在低級真核宿主微生物中最常使用釀酒酵母 ακνζϋβ)或常見烘焙酵母。然而，若干其他菌屬、菌種及菌株在本文中通常為可利用且適用的，諸如有畢赤酵母屬CPz'c/ni)(例如巴斯德畢赤酵母（ρ. pasiorb))、粟酒裂殖酵母（Sc/n’zoMcc/iarowycei po/Tifte);克魯維拉菌屬 (Kluyveromyces) » 亞羅酵母屬;念珠菌屬 159757.doc •45· 201206954 ;裏氏木黴reeha);粗縫脈抱菌 (iVewrospora crima);許旺酵母屬（iSe/zvvawm’o/Myces)，諸如西方許旺酵母（iSc/zwanm’omyce·? occWewiil/is);及絲狀真菌，諸如紅黴屬、青徽屬（/^«如7//«/»)、弯頸徽屬（7b/_ypoc/a山♦«/«)及麯黴屬（^4j/7ergz7/MS)宿主（諸如構巢麯黴（^4· mWawj)及黑麯黴（丄niger)) 〇表現糖基化多肽或抗體之宿主細胞可源自於多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別眾多桿狀病毒菌株及變異體以及來自諸如以下者之宿主之相應允許性昆蟲宿主細胞：草地黏蟲（5>〇^o;?iera! (毛蟲）、埃及伊蚊（Jedej (蚊子）、白紋伊蚊（dei/es a/bop/ciw·?)(蚊子）、黑腹果繩（·£^〇·5ί>/?/π7α me/anogaiier)(果蠅）及中國家蠶（Bom^jc wori)。多種適於轉染該等細胞之病毒株可公開獲得，例如苜蓿丫紋夜蛾 (Autographa californica)NPV 之 L-1變異體及中國家蠶NPV 之Bm-5菌株。脊椎動物宿主細胞亦為適當宿主且自該等細胞重組產生多肽或抗體已成為常規程序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為中國倉鼠卵細胞，包括CHOK1細胞（ATCC CCL61)、DXB-11、DG-44 及中國倉鼠卵細胞 /-DHFR (CHO，Urlaub等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980));由 SV40 轉型之猴腎臟 CV1 株（COS-7, ATCC CRL 1651);人類胚腎株（經次選殖而生長於懸浮培養物中之293 細胞，[Graham等人，·/· Kiro/· 35:59 (1977)];幼倉鼠 159757.doc •46· 201206954 腎臟細胞（ΒΗΚ，ATCC CCL 10);小鼠赛托利細胞（mouse sertoli cell)(TM4 » Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980));猴腎臟細胞（CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎臟細胞（VERO-76，ATCC CRL-1587);人類宮頸癌細胞 (HELA，ATCC CCL 2);犬腎臟細胞（MDCK，ATCC CCL 34);布法羅大鼠肝細胞（buffalo rat liver cell)(BRL 3A， ATCC CRL 1442);人類肺細胞（W138，ATCC CCL 75);人類肝細胞瘤細胞（Hep G2，HB 8065);小鼠乳房腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL 51) ； TRI 細胞（Mather 等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)) ; MRC5 細胞或 FS4 細胞；或哺乳動物骨髓瘤細胞。為了產生抗體，將宿主細胞以上述核酸或載體轉型或轉染且培養於適當時經改良之習知營養培養基中以誘發啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因。此外，具有多個經選擇性標記隔開之轉錄單位複本的新穎載體及經轉染細胞株尤其適用於表現抗體。可於多種培養基中培養用以產生本文中所述之抗體的宿主細胞。諸如漢姆氏F10(Ham's F10)(Sigma)、最低必需培養基（MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及達爾伯克改良伊格爾培養基（Dulbecco’s Modified Eagle's Medium)(DMEM，Sigma)之市售培養基適用於培養宿主細胞。此外.，於 Ham等人，Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes 等人，Anal. Biochem. 102:255 (1980)、美國專利第 4,767,704 號、第 4,657,866 號、第 4,927,762 號、第 159757.doc -47- 201206954 4,560,655 號或第 5,122,469 號、WO 90103430、WO 87/ 00195或美國專利參考案第3〇,985號中所描述之培養基中之任一者可用作宿主細胞之培養基。該等培養基中之任一者可根據需要補充以激素及/或其他生長因子（諸如騰島素、轉鐵蛋白或上皮生長因子）、鹽（諸如氣化鈉、約鹽、鎮鹽及磷酸鹽）、緩衝液（諸如HEPES)、核苷酸（諸如腺芽及胸普）、抗生素（諸如GentamycinTM藥）、痕量元素（其被定義為通常以微莫耳範圍内之最終濃度存在之無機化合物）及葡萄糖或等效能源。亦可包括熟習此項技術者已知之適當濃度的任何其他必需補充《培養條件（諸如溫度、 pH值及其類似條件）為彼等先前對於選擇用於表現之宿主細胞所用之條件且應為一般熟習此項技術者所顯而易見。一旦培養宿主細胞後，可於細胞内在周質空間中產生抗體或抗體可被直接分泌於培養基中。若在細胞内產生抗體’則作為第一步驟，（例如）藉由離心或超濾移除微粒碎片（宿主細胞或溶解片段）。可使用（例如）羥磷灰石層析、陽離子或陰離子交換層析或較佳親和層析（使用所關注之抗原或蛋白質A或蛋白質G 作為親和配位體）來純化抗體。蛋白質A可用於純化基於人類γΐ、γ2或γ4重鍵之抗體（Lindmark等人，/ww⑽0厂 Mei/i. 62:1-13 (1983))。對於所有小鼠同型及人類γ3推薦使用蛋白質 G(Guss等人，EMBO J. 5:1567-1575 (1986))。親和配位體所連接之基質大多數通常為瓊脂糖，但亦可利用其他基質。機械穩定性基質（諸如受控微孔玻璃或聚（苯乙 159757.doc -48- 201206954 烯二乙烯基）苯）相較於使用瓊脂糖可能達成之效果而言允許比較快之流動速率及比較短之處理時間。當抗體包含cH 3 域時，Bakerbond ΑΒΧΤΜ樹脂（J. T. Baker, Phillipsburg， N.J.)適用於純化。視欲回收之抗體而定，亦可能使用其他蛋白質純化技術，諸如乙醇沈澱、逆相HPLC、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。嵌合及人類化抗體因為相較於親本齧齒動物單株抗體而言，嵌合或人類化抗體在人類中之免疫原性較低，所以其可用於治療人類且過敏風險會低得多。因此，在涉及向人類活體内投藥之治療應用中涵蓋該等抗體。舉例而言，單獨地或以接合體形式反覆活體内投與人類之鼠類抗體將在接受者中導致免疫反應，有時將之稱為 HAMA反應（人類抗小鼠抗體）。若需要反覆投藥，則 HAMA反應可能限制醫藥之有效性。可藉由使用親水性聚合物（諸如聚乙二醇）對抗體作化學修飾或藉由使用遺傳工程法使抗體結合結構更類似於人類來降低抗體之免疫原性。如本文中所用，短語”嵌合抗體”係指含有源自兩種通常源自於不同物種之不同抗體之序列的抗體。嵌合抗體最通常包含與人類恆定Ig域融合之齧齒動物單株抗體之可變Ig 域。可使用此項技術中已知之標準程序產生該等抗體（參見 Morrison, S. L.等人（1984) Chimeric Human Antibody Molecules ; Mouse Antigen Binding Domains with Human 159757.doc -49- 201206954

Constant Region Domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6841-6855 ;及Boulianne, G. L.等人，Nature 312, 643-646. (1984))。儘管已證明一些嵌合單株抗體在人類中具有較低免疫原性，但齧齒動物可變Ig域仍能引起明顯的人類抗齧齒動物反應。短語"人類化抗體”係指源自非人類抗體之抗體，通常為齧齒動物單株抗體《或者，人類化抗體可源自嵌合抗體。可由多種方法獲得人類化抗體，包括（例如）：（1)將非人類互補判定區（CDR)接枝於人類構架及恆定區上（一種在此項技術中稱為經由"CDR接枝”進行人類化之方法）或（2)移植整個非人類可變域，但藉由置換表面殘基以類人表面來 "掩蔽"該等可變域（一種在此項技術中稱為"鑲飾 (veneering)"之方法）。該等方法揭示於（例如）J〇nes等人， Nature 321:522-525 (1986) ; Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci.，U.S.A.，81:6851-6855 (1984) ; Morrison及 Oi， Adv. Immunol” 44:65-92 (1988) ; Verhoeyer等人，Science 239:1534-1536 (1988) ； Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991).* Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169-217 (1994)；及 Kettleborough，C.A.等人，Protein Eng. 4(7):773-83 (1991)中，該等文獻各自以引用方式全部併入本文中。 CDR接枝涉及將來自小鼠重鏈及輕鏈可變Ig域之六個 CDR中之一或多者引入人類可變Ig域之適當構架區中。此技術（Riechmann，L.等人，Nature 332，323 (1988))利用保守構架區（FR1-FR4)作為支架（scaffold)以支撐主要與抗原 159757.doc •50· 201206954

接觸之CDR環《然而CDR接枝之明顯的不利之處為，因為構架區之胺基酸能促進抗原結合且因為CDR環之胺基酸會影響兩個可變Ig域之締合’所以CDR接枝可能產生具有比原始小鼠抗體顯著低之結合親和力的人類化抗體。為保持人類化單株抗體之親和力，可藉由選擇最為接近地類似於原始小鼠抗體之構架區的人類構架區且藉由由抗原結合位點之電腦模型化所輔助的構架或CDR内之單個胺基酸的定點犬變來改良CDR接枝技術（例如Co, M· S·等人（1994)，J

Immunol. 152, 2968-2976)。一種將抗體人類化之方法包含將非人類重鏈及輕鏈序列與人類重鏈及輕鏈序列比對，基於該比對進行選擇且以人類構架置換非人類構架’進行分子模型化以預測人類化序列之構形且與親本抗體之構形比較。在此方法之後為CDR 區中會干擾CDR之結構之殘基的反覆回復突變，直至人類化序列模型之所預測構形極為近似於親本非人類抗體之非人類CDR的構形為止。該等人類化抗體可經進一步衍生以促進吸收及清除率（例如經由Ashwell受體）（參見例如美國專利第5,53〇，1〇1號及第5,585,089號）。已報導若干藉由合理設計對小鼠單株抗體進行人類化的方法（參見例如2002年7月11日所公開之20020091240、WO 92/11018及美國專利第5,693,762號、美國專利第5,766 866 號）。人類工程化TM抗體紐語"人類工程化TM抗體"係指源自非人類抗體之抗體， 159757.doc -51- 201206954 通常為齧齒動物單株抗體或可能為嵌·合抗體》抗體可變域之人類工程化ΤΜ已由Studnicka[參見例如Studnicka等人，美國專利第 5,766,886 號；Studnicka 等人，Pr〇tein Engineering 7: 805-814 (1994)]描述為一種降低免疫原性同時保持抗體分子之結合活性的方法。根據該方法，已對各可變區胺基酸賦以取代風險。以下列三種風險中之一者區分胺基酸取代：（1)低風險變化為降低免疫原性之可能性最大但破壞抗原結合之機會最小的彼等變化；（2)中等風險變化為能進一步降低免疫原性但影響抗原結合或蛋白質摺疊之機會較大的彼等變化；（3)高風險殘基為對於結合或保持抗體結構而言係重要的但帶有會影響抗原結合或蛋白質摺疊之最高風險的彼等殘基。歸因於脯胺酸之三維結構性角色’即使脯胺酸處通常為低風險位置，仍通常認為該脯胺酸處之修飾為至少中等的風險變化。齧齒動物抗體之輕鏈及重鏈之可變區可藉由在經確定在人類環境中不可能不利影響抗原結合或蛋白質摺疊但可能降低免疫原性之位置處用人類胺基酸取代而進行人類工程化TM »儘管可使用任何人類可變區（包括個別VH或VL序列或人類一致VH或VL序列或個別或一致人類生殖系序列），但通常使用與齧齒動物序列具有最高一致性或同源性之人類序列來使取代數最小化《可改變在任何數目之低風險位置處或所有低風險位置處之胺基酸殘基。舉例而言，在經比對之鼠類及人類胺基酸殘基不同之各低風險位置處，引入胺基酸修飾以使用人類殘基置換齧齒動物殘基。此外， 159757.doc •52· 201206954 可改變在任何數目之中等風險位置處或所有中等風險位置處之胺基酸殘基。在例示性實施例中，使所有低風險位置及中等風險位置自齧齒動物序列變為人類序列。構建含有經修飾重鏈及/或輕鏈可變區之合成基因且使其與人類γ重鍵及/或κ輕鏈恆定區連接。任何類別或子類之任何人類重鏈及輕鏈恆定區可與人類工程化ΤΜ抗體可變區組合使用。來自經工程化而含有人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的抗體亦可使用不產生内源性免疫球蛋白且經工程化而含有人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物來產生海帕西咬之抗體。舉例而言’ WO 98/24893揭示具有人類Ig基因座之轉殖基因動物，其中該等動物歸因於内源性重鏈及輕鏈基因座之失活而不會產生功能性内源性免疫球蛋白。WO 91/741亦揭示能夠發動對於免疫原的免疫反應之轉瘦基因非靈長類哺乳動物宿主，其中抗體具有靈長類恆定區及/ 或可變區且其中編碼内源性免疫球蛋白之基因座經取代或失活。'\^〇 96/30498揭示使用&6/1^〇乂系統來修部》甫乳動物中之免疫球蛋白基因座’諸如以便置換所有或一部分恒·定區或可變區以形成經修飾抗體分子。WO 94/02602揭示具有失活内源性Ig基因座及功能性人類Ig基因座之非人類哺乳動物宿主。美國專利第5,939,598號揭示製造轉殖基因小鼠之方法，其中小鼠缺乏内源性重鏈且表現包含一或多個異種恆定區之外源性免疫球蛋白基因座。 159757.doc •53· 201206954 使用如上所述之轉殖基因動物，可產生針對所選抗原分子的免疫反應’並可自該動物取得產生抗體之細胞且用於產生分泌人類源性單株抗體之融合瘤。免疫方案、佐劑及其類似者在此項技術中係已知的，且用於使（例如）如w〇 96/3 3735中所述之轉殖基因小鼠免疫。可測試單株抗體抑制或中和相應蛋白質之生物活性或生理效應的能力。亦參見 Jakobovits等人，proc. Natl_ Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993) ; Jakobovits 等人，Nature，362:255-258 (1993)，Bruggermann 等人，Year in Immuno.，7:33 (1993);及美國專利第5,59i，669號、美國專利第5,589,369 號、美國專利第5,545,807號；及美國專利申請案第 20020199213號。美國專利申請案第20030092125號描述使動物之免疫反應偏向所需抗原決定基之方法β亦可由活體外活化Β細胞產生人類抗體（參見美國專利第5,567,61〇號及第 5,229,275號）。藉由噬菌體展示技術產生抗體製造重組人類抗體基因譜之技術及經編碼抗體片段於絲狀噬菌體表面上之展示法的進展已提供了另一種產生人類源性抗體之方法。嗤菌體展示法係描述於例如Dower等人，WO 91/17271、McCafferty 等人，WO 92/01047 以及 Caton及Koprowski，Proc· Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-6454 (1990)中，該等文獻各自以引用方式全部併入本文中。由噬菌體技術所產生之抗體通常係作為抗原結合片段 (例如Fv或Fab片段）產生於細菌中且因此缺乏效應功能。 159757.doc • 54- 201206954 可由以下兩種策略中之一者引入效應功能：可將該等片段工程化成完整抗體以表現於哺乳動物細胞中或工程化成具有忐夠觸發效應功能之第二結合位點的雙特異性抗體片段。通常，藉由PCR來獨立選殖抗體之Fd片段（Vh_Ch1)及輕鏈（Vl-Cl)且隨機重組於組合噬菌體展示庫中，隨後可針對與特定抗原之結合對其進行選擇。使抗體片段表現於噬菌體表面上，且經由若干輪抗原結合及再擴增（一種稱為淘選之程序）來實現藉由抗原結合選擇Fv*Fab(及因此含有編碼抗體片段之DNA之噬菌體）。富集對抗原具特異性之抗體片段且最終加以分離。亦可在用於將齧齒動物單株抗體人類化之方法（稱為，•定向選擇）中使用嗟菌體展不技術（參見Jespers，L. S.等人， Bio/Technology 12, 899-903 (1994))。對此，小鼠單株抗體之Fd片段可結合人類輕鏈庫被展示，且所得雜合Fab庫可隨後藉由抗原加以選擇。小鼠Fd片段藉此提供引導選擇之模板。隨後’使所選人類輕鏈與人類Fd片段庫組合。對所得庫之選擇獲得完完全人類類Fab。已描述多種關於自噬菌體展示庫獲得人類抗體之程序 (參見例如 Hoogenboom 等人，J. Mol. Biol.，227:381 (1991) ; Marks等人，J. Mol. Biol，222:581-597 (1991);美國專利第 5,565,332 號及第 5,573,905 號；Clackson, T.及

Wells J. A., TIBTECH 12, 173-184 (1994))。尤其是，源自噬菌體展示庫之抗體之活體外選擇及進化已成為一種有效 159757.doc •55· 201206954 手段（參見 Burton, D. R.及 Barbas III，C. F·，Adv. Immunol. 57，191-280 (1994);及 Winter, G·等人，Annu. Rev.

Immunol. 12，433-455 (1994);美國專利申請案第 20020004215 號及 WO 92/01047 ; 2003 年 10 月 9 日公開之美國專利申請案第20030190317號及美國專利第6,054,287 號；美國專利第5,877,293號）。

Watkins," Screening of Phage-Expressed Antibody

Libraries by Capture Lift," Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178: 187-193及2003年3月6曰所公開之美國專利申請公開案第 20030044772號描述藉由捕捉轉印（capture lift)(—種涉及使候選結合分子固定於固體支撐物上之方法）來筛檢噬菌體表現抗體庫或其他結合分子之方法。抗體片段如上所述，抗體片段包含完整全長抗體之一部分，較佳包含完整抗體之抗原結合或可變區且包括由抗體片段形成之線性抗體及多特異性抗體。抗體片段之非限制性實例包括 Fab、Fab’、F(ab’）2、Fv、Fd、域抗體（dAb)、互補判定區（CDR)片段、單鏈抗體（scFv)、單鏈抗體片段、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、微型抗體、線性抗體、螯合重組抗體、三抗體或雙抗體、内抗體、奈米抗體、小分子免疫治療藥物（SMIP)、抗原結合域免疫球蛋白融合蛋白、駱駝化抗體、含VHH之抗體或其突變蛋白或衍生物以及含有足以賦予多肽特異性抗原結合之免疫球蛋白之至少 159757.doc •56- 201206954 一部分（諸如CDR序列）的多肽，其限制條件為抗體保留所需生物活性。可藉由修飾全抗體產生該等抗原片段或使用重組DNA技術或肽合成重新合成該等抗原片段。術語"雙功能抗體"係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含在同一多肽鏈（VH VL)中與輕鏈可變域（VL)連接之重鏈可變域（VH) »藉由使用過短而使得同一鏈上之兩個域之間不可成對的連接子，迫使該等域與另一鏈之互補域成對，且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更充分地描述於（例如）EP 404,097、WO 93/11161及 Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90:6444-6448 (1993)中。 ”單鏈Fv”或” scFv"抗體片段包含抗體之VH域及VL域（其中該等域存在於單一多肽鏈中），且視情況包含介於VH域與VL域之間的多肽連接子，此使Fv能夠形成抗原結合所需之結構（Bird 等人，Science 242:423-426, 1988 及 Huston 等人，/Voc. dead· 5«^·. 85:5879-5883, 1988)。Fd片段由VH域及CH1域組成》其他抗體片段包括由VH域組成之域抗體（dAb)片段（Ward 等人，341:544-546, 1989)。 "線性抗體"包含一對$ - Fd片段（VH-CH1-VH-CH1)，其形成一對抗原結合區。線性抗體可具有雙特異性或單特異性（Zapata等人，Protein Eng. 8:1057-62 (1995))。由經由肽連接子（無鉸鏈）或經由IgG鉸鏈與CH3融合之 scFv組成的"微型抗體"已描述於Olafsen等人，Protein Eng 159757.doc •57- 201206954

Des Sel. 2004年 4 月；17(4):315-23 中。術語”最大抗體"係指與免疫球蛋白之Fc區共價連接之二價 scFv，參見例如 Fredericks 等人，Protein Engineering， Design & Selection, 17:95-106 (2004)及 Powers 等人， Journal of Immunological Methods, 251:123-135 (2001) ° 缺乏輕鏈之功能性重鏈抗體天然存在於某些動物物種 (諸如護士鯊、斑紋鬚鯊及駱駝科（Cawe/Wae)，諸如駱駝、單峰駝、羊駝及美洲駝）中。在該等動物中，抗原結合位點縮減至單個域（VHh域）。該等抗體僅使用重鏈可變區形成抗原結合區，亦即該等功能性抗體為僅具有結構 H2L2之重鏈同源二聚體（被稱為"重鏈抗體”或"HCAb")。據報導駱駝化VHH與含有鉸鏈、CH2及CH3域且缺少CH1域之 IgG2及IgG3恆定區重組。典型僅VH之片段難以以可溶性形式產生，但當將構架殘基改成更類似於VHh時可獲得溶解度及特異性結合方面之改良。（參見例如Reichman等人，J Immunol Methods 1999，231:25-38)。已發現路聪化 VHH 域以高親和力與抗原結合（Desmyter等人，*/. 5z_o/. C/ze/w. 276:26285-90, 2001)且在溶液中具有高穩定性（Ewert等人，41:3628-36，2002)。產生具有路馬它化重鏈之抗體之方法描述於例如美國專利公開案第 20050136049號及第20050037421號中。替代性支架可由較為接近地匹配鯊魚V-NAR支架且可為長穿透環結構提供構架之類人類可變域構成。因為重鏈抗體之可變域為分子質量僅為15 kDa之最小全 159757.doc -58 - 201206954 功能性抗原結合片段，所以此實體被稱為奈米抗體 (Cortez-Retamozo 等人，Cancer Research 6Α·.2込 2004) 〇可如 Conrath 等人C/zemoi/zer 45: 2807-12, 2001)中所述自經免疫單峰駝產生奈米抗體庫。内抗體為展現細胞内表現且可調控細胞内蛋白質功能之單鏈抗體（Biocca等人，五/· 9:101-108，1990 ; Colby 等人，Proc iVai/ Jcac/ C7 51 丄 101:17616-21, 2004)。可如 Mhashilkar 等人（ΕΜδΟ ·/ 14:1542-51，1995)及 Wheeler 等人17:1733-5. 2003)中所述產生包含保留細胞内區域中之抗體構建之細胞信號序列的内抗體。穿膜抗體為細胞可滲透性抗體，其中蛋白質轉導域（PTD)與單鏈可變片段（scFv)抗體融合（Heng等人，Med /fxpoi/zeses. ό^.ΙΗ^-δ, 2005) ° 另外涵蓋作為對靶標蛋白質具有特異性之SMIP或結合域免疫球蛋白融合蛋白的抗體。該等構建體為包含與為實現抗體效應功能所必需之免疫球蛋白域融合之抗原結合域的單鏈多肽。參見例如WO 03/041600、美國專利公開案 20030133939及美國專利公開案200301 18592。多價抗體在一些實施例中，可能需要產生多價或甚至多特異性 (例如雙特異性、三特異性等）單株抗體。該抗體可具有針對靶標抗原之至少兩個不同抗原決定基之結合特異性或者其可結合於兩個不同分子，例如結合於靶標抗原且結合於細胞表面蛋白或受體。舉例而言，雙特異性抗體可包括一 159757.doc -59- 201206954 結合於靶標之臂及另一結合於白血球上之觸發分子（諸如τ 細胞受體分子（例如CD2或CD3)，或IgG之Fc受體（FcyR)，諸如 FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)及 FcYRIII(CD16))的臂，以便使細胞防禦機制集中於表現靶標之細胞。在另一實例中’雙特異性抗體可用於使細胞毒性劑定位於表現乾標抗原之細胞。該等抗體具有乾標結合臂及結合細胞毒性劑 (例如沙泊寧（saporin)、抗干擾素_6〇、長春花生物鹼、萬麻毒素A鏈、甲胺喋呤或放射性同位素半抗原）之臂。可將多特異性抗體製備成全長抗體或抗體片段。另外’本文中所揭示之抗海帕西咬抗體亦可加以構建而摺疊成多價形式’該等形式可改善結合親和力、特異性及/ 或增加血液中之半衰期。可藉由此項技術中已知之技術製備抗海帕西啶抗體之多價形式。雙特異性或多特異性抗體包括交聯或"雜接合"抗體。舉例而言，雜接合形式之抗體之一者可與抗生物素蛋白偶合，另一者與生物素偶合。可使用任何適宜交聯法製造雜接合抗體。適當交鍵劑以及若干交聯技術在此項技術中係熟知的且被揭示於美國專利第4,676,98〇號中。設計另一種方法以藉由在scFv之C末端處添加抗生蛋白鏈菌素編碼序列來製造四聚體》抗生蛋白鏈菌素由四個亞單位組成，因此當摺疊scFv-抗生蛋白鏈菌素時，四個亞單位締合，從而形成四聚體（Kipriyanov 等人，Hum Antibodies Hybddomas 6(3): 93-1〇1 (1995)，該文獻之揭示内容以引用方式全部併入本文中）。 159757.doc -60- 201206954 根據另—種製造雙特異性抗體之方法，可將抗體分子對 1的界面工程化以使自重組細胞培養物回收之雜二聚體的百刀比最大化。-界面包含抗體怪定域之cH3域之至少口P刀。在該方法中，來自第一抗體分子之界面的一或多則、胺基酸側鍵經較大側鍵（例如路胺酸或色胺酸）置換。藉由以較小胺基酸側鏈（例如丙胺酸或蘇胺酸）置換大胺基酸側鍵而於第二抗體分子之界面上產生尺寸與大側鏈一致或類似之補償性”空腔"。此提供使雜二聚體之產率增加並超過其他不當最終產物（諸如同源二聚體）的機制。參見 1996年9月6日公襴之w〇 96/27011。自抗體片段產生雙特異性或多特異性抗體之技術亦已描述於文獻中。舉例而言，可使用化學鍵聯製備雙特異性或二特異性抗體。Brennan等人，Science, 229:81 (1985)描述一種使完整抗體發生蛋白水解分裂以產生F(ab,)2片段之程序。使該專片段在二硫醇錯合劑亞珅酸鈉存在下還原以使鄰近二硫醇穩定且防止分子間二硫鍵形成。隨後將所產生之Fab·片段轉化為硫硝基苯甲酸酯（TNB)衍生物。隨後藉由以巯基乙胺還原將Fab'-ΤΝΒ衍生物之一者再轉化成Fab，-疏醇且與等莫耳量之另一 Fab'-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產生之雙特異性抗體可用作選擇性固定酶之试劑。Better等人，Science 240: 1041-1043 (1988)揭示由細菌分泌功能性抗體片段（參見例如Better等人，Skerra等人 Science 240: 1038-1041 (1988))。舉例而言，Fab'-SH 片段可直接自大腸桿菌回收且以化學方式偶合以形成雙特異 159757.doc -61- 201206954 性抗體（Carter等人，Bio/Technology 10:163-167 (1992); Shalaby等人，J. Exp. Med. 175:217-225 (1992))。

Shalaby等人，J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)描述完完全人類類化雙特異性抗體F(ab')2分子之產生。由大腸桿菌獨立分泌各Fab’片段且使其經受活體外定向化學偶合以形成雙特異性抗體。由此所形成之雙特異性抗體能夠結合於過度表現HER2受體之細胞及正常人T細胞，且觸發人類細胞毒性淋巴細胞針對人類乳房腫瘤靶標之溶胞活性。亦已描述各種直接由重組細胞培養物製造及分離雙特異性或多特異性抗體片段之技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈（例如GCN4)產生雙特異性抗體。（通常參見Kostelny 等人，J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992))。藉由基因融合將來自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鏈肽連接於兩個不同抗體之Fab’部分。在鉸鏈區將抗體同源二聚體還原以形成單體且隨後再氧化以形成抗體雜二聚體。該方法亦可用於產生抗體同源二聚體。如上所述，雙功能抗體為雙特異性抗體之一實例。參見例如 Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)。可藉由二硫鍵使二價雙功能抗體穩定。亦可藉由非共價締合以（scFv2)2構型或雙四功能抗體形式產生穩定單特異性或雙特異性Fv四聚體。或者，兩個不同scFv可串聯接合以形成雙-scFv。亦已報導另一種藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚體製造雙特異性抗體片段之策略。參見Gruber等人，J. Immunol. 159757.doc -62- 201206954 152:5368 (1994)。一種方法為使用連接子或二硫鍵連接兩個 scFv 抗體（Mallender AVoss，J.Biol.Chem.269:199-2061994、WO 94Π3806及美國專利第5,989,830號，該等文獻之揭示内容以引用方式全部併入本文中）。戍者，雙特異性抗體可為如Zapata等人，Protein Eng. 8(10》1〇57-1〇62 (1995)中所述產生之”線性抗體簡言之，該等抗體包含一對串聯Fd片段（Vh-Ch1-Vh-Ch1)’其形成一對抗原結合區°、線性抗·體可具有雙特異性或單特異性。亦涵蓋兩價以上之抗體。舉例而言，可製備三特異性抗體。（Tutt等人 ’ J. Immunol. 147:60 (1991))。 "螯合重組抗體"為識別靶標抗原之相鄰及非重疊抗原決定基且具有足以同時結合於兩個抗原決定基之可撓性的雙特異性抗體（Neri 等人，·/Mo/价〇/. 246:367-73, 1995)。雙特異性Fab-scFv("雙抗體"）及三特異性Fab-(scFv)(2) ("三抗體"）之產生描述於Schoonjans等人（*/ 165:7050-57，2000)及 Willems等人（·/ β ylwa/yi 5W. 786:161-76，2003)中。對於雙抗體或三抗體而言，scFv分子與VL-CL(L)及VH-CHJFd)鏈之一或兩者融合（例如）以產生三抗體，其中兩個scFv與Fab 之C末端融合，而在雙抗體中一個scFv與Fab之C末端融合0 在另一種方法中，在將游離半胱胺酸引入親本蛋白質中之後產生二聚體、三聚體及四聚體。使用具有可變數目 159757.doc -63· 201206954 (兩個至四個）的馬來醯亞胺基團之肽基交聯劑來使所關注之蛋白質與游離半胱胺酸交聯（C0chran等人，Immunity 12 (3): 241-50 (2000)，該文獻之揭示内容全部併入本文中）。抗體篩檢法亦提供鑑別結合海帕西啶、交叉阻斷（cr〇ss_bl〇ck)本文中之例示性抗體及/或抑制海帕西咬活性之抗體的方法。該等方法可利用本文中所提供之經高度純化之生物活性正確摺疊非尿源性人類海帕西啶（在細菌或非哺乳動物細胞中化學合成或產生）的組合物。可針對結合親和力藉由此項技術中已知之方法篩檢抗體。舉例而言’可使用凝膠位移檢定、西方墨點法、放射性標S己競爭檢定、層析共分級（c〇_fracti〇nati〇n by chromatography)、共同沈澱法、交聯法、ELISA及其類似方法’該等方法描述於（例如）Current Protocols in

Molecular Biology (1999) John Wiley & Sons，NY中，該文獻以引用方式全部併入本文中。為對結合於靶標抗原上之所需抗原決定基的抗體作初始痛檢’可進行諸如描述於Antibodies，A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow 及 David Lane 編 (1988)中之常規交叉阻斷檢定。亦可使用常規競爭性結合檢定，其中未知抗體以其抑制靶標與本發明之靶標特異性抗體結合之能力為表徵。可使用完整抗原、其片段（諸如胞外域）或線性抗原決定基。抗原決定基定位描述於 Champe等人，J. Biol· Chem· 270: 1388-1394 (1995)中。 159757.doc • 64 - 201206954 在活體外結合檢定之一種變體中，提供一種方法，其包含（a)使經固定海帕西啶與候選抗體接觸，及（1))偵測該候選抗體與該海帕西啶之結合性。在一替代性實施例中，將候選抗體固定且偵測海帕西啶之結合性。使用此項技術中所熟知之方法中之任一者實現固定，包括共價結合至支撐物、珠粒或層析樹脂，以及非共價高親和力相互作用，諸如抗體結合’或使用抗生蛋白鏈菌素/生物素結合，其中經固定化合物包括生物素部分。可⑴使用未經固定之化合物上之放射性標記，（ii)使用非固定化合物上之螢光標記，（iii)使用對非固定化合物具有免疫特異性之抗體， (iv)使用非固定化合物上可激發經固定化合物所連接之勞光支撐物的標記以及此項技術中所熟知且常規實施之其他技術來實現結合之偵測。可藉由使海帕西啶與抗體接觸，在測試抗體存在及不存在之情況下比較海帕西啶活性且判定抗體之存在是否使海帕西啶之活性降低來鑑別抑制或中和人類海帕西啶活性之抗體。可使用適當動物模型（包括本文中所述之彼等者中之任一者）活體内評估特定抗體或抗體組合之生物活性。在例示性實施例中’本發明包括用於鑑別與標靶抗原相互作用或抑制標靶抗原之生物活性（亦即抑制磷酸化、二聚化、配位體誘發之受體活化或細胞内信號傳導等）之抗體的尚通：!：篩檢（high throughput screening ，HTS)檢定。檢定可以有效方式篩檢大量化合物。基於細胞之hts 系統係用於研究標靶抗原與其結合搭配物之間的相互作 159757.doc -65- 201206954 用。HTS檢定係設計用以鑑別具有所需特性之"化學把物 (hits)"或"先導化合物"，可由此設計修飾以改良所需特性。在本發明之另一個實施例中，採用對於標靶抗原多肽具有合適結合親和力之CDRs内的胺基酸具有1、2、3或3個以上修飾之CDRs或抗體片段的高通量篩檢。特異性結合劑

其他海帕西定特異性結合劑可以例如基於抗體之CDRs 或藉由各種肽或有機化合物庫中篩檢出展現所需對於人類海帕西啶之結合特性的肽或化合物來製備。海帕西啶特異性結合劑包括含有胺基酸序列與鼠類抗體Ab43(SEQ ID NO: 16-21)、鼠類抗體 2.7(SEQ ID NO: 28-33)、鼠類抗體 2.41(SEQ ID NO: 40-45)、大鼠抗體 R9(SEQ ID NO: 52-57)，或人類抗體1C9(SEQ ID NO: 111-116)、人類抗體 3B3(SEQ ID NO: 121-126)、人類抗體4E1(SEQ ID NO: 131-136)、人類抗體 7A3(SEQ ID NO: 141-46)、人類抗體 9D12(SEQ ID NO: 151-156)、人類抗體 12B9(SEQ ID NO·· 161-166)、人類抗體 15E1(SEQ ID NO: 171-176)、人類抗體 18D8(SEQ ID NO: 314-319)、人類抗體 19C1(SEQ ID NO: 324-329)、人類抗體 19D12(SEQ ID NO: 294-299)、人類抗體 19H6(SEQ ID NO: 304-309)、人類抗體 23F11(SEQ IDNO: 181-186)、人類抗體 26F11(SEQIDN0: 19 卜 196)或人類抗體1S1(SEQ ID NO: 203-205及131-133)或人類抗體 1S2(SEQ ID NO: 214-216 及 144-146)或人類抗體 1S3(SEQ 159757.doc • 66- 201206954 ID NO: 225-227 及 164-166)或人類抗體 1S4(SEQ ID NO: 236-238及 174-176)或人類抗體 1S5(SEQ ID NO: 247-249及 184-186)之一或多個001^至少80%、81%、820/。、830/〇、 84% ' 85% ' 86% ' 87% > 88% ' 89% ' 90% ' 91% ' 92% ' 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 99% 以上一致之肽。海帕西啶特異性結合劑亦包括肽抗體（peptibody)。術語 "肽抗體"係指包含連接於至少一個肽之抗體Fc域的分子。肽抗體之產生係大體描述於2000年5月4日公開之PCT公開案WO 00/24782中。任何該等肽可在存在連接子或不存在連接子之情況下串聯（亦即順次）連接》含有半胱胺醯基殘基之肽可與另一含有Cys之肽交聯，其中之任一者或兩者可與媒劑連接。具有一個以上Cys殘基之任何肽亦可形成肽内二硫鍵。可使任何該等肽衍生，例如可將羧基末端以胺基封端，可將半胱胺酸封端，或胺基酸殘基可經除胺基酸殘基以外之部分取代（參見例如Bhatnagar等人，J. Med. Chem. 39: 3814-9 (1996)及 Cuthbertson 等人，J. Med. Chem. 40: 2876-82 (1997)，該等文獻以引用方式全部併入本文中）。可類似於抗體之親和力成熟來優化肽序列，或者另外藉由丙胺酸掃描或無規突變或定點突變，接著篩檢以鑑別最佳結合物來改變肽序列。1^0评11^11,八1111.116乂· Biophys· Bio mol· Struct. 26: 401-24 (1997)。可將各種分子插入特異性結合劑結構中，例如插入特異性結合劑之肽部分本身内或特異性結合劑之肽與媒劑部分之間，同時保留 159757.doc • 67- 201206954 特異性結合劑之所需活性。可易於插入（例如）分子，諸如域或其片段；聚乙二醇或其他相關分子，諸如葡聚糖；脂肪酸、脂質、膽固醇群、小碳水化合物、肽、如本文中所述之可偵測部分（包括螢光劑、放射性標記，諸如放射性同位素）、寡醣、寡核苷酸、聚核苷酸、干擾（或其他）RNA、酶、激素或其類似物。熟習此項技術者應瞭解適合於以此方式插入之其他分子，且該等分子涵蓋於本發明之範疇内。此包括將（例如）所需分子插入於兩個視情況由適當連接子接合之連續胺基酸之間。亦涵蓋海帕西咬肽抗體之發展。蛋白質配位體與其受體之相互作用常常發生於相對較大之界面處。然而，如就人類生長激素及其受體而言所證明，在界面處僅少數關鍵殘基促成大部分結合能。Clackson等人，267: 383-6 (1995)。大多數蛋白質配位體僅在恰當拓撲結構中展示結合抗原決定基或起與結合無關之作用。因此，僅"肽"長度 (通常2至40個胺基酸）之分子可結合於給定較大蛋白質配位體之受體蛋白。該等肽可模擬大蛋白質配位體之生物活性 ("肽促效劑"）或經由競爭性結合抑制大蛋白質配位體之生物活性（"肽拮抗劑”）。嗤菌體展示技術已作為有效方法出現於鑑別該等肽促效劑及拮抗劑之過程中。參見例如Scott等人Science 249: 386 (1990) ; Devlin等人，Science 249: 404 (1990) ; 1993 年 6月 29曰頒布之美國專利第5,223,4〇9號；1998年3月31日頒布之美國專利第5,733,731號；1996年3月12曰頒布之美國專 159757.doc -68 - 201206954 利第5,498,530號；1995年7月11曰頒布之美國專利第 5,432,018號；1994年8月16日頒布之美國專利第5,338 665 號；1999年7月13日頒布之美國專利第5,922,545號；1996 年12月19日公開之WO 96/40987 ;及1998年4月16日公開之 WO 98/15 833(該等文獻各自以引用方式全部併入本文中）。在肽噬菌體展示庫中，可藉由與絲狀喔菌體之鞘蛋白融合來展示隨機肽序列《若需要，則可將所展示肽相對於受體之抗體固定胞外域進行親和性溶離》可藉由逐輪親和純化及再增殖而富集所保留噬菌體。可將最佳結合肽定序以鑑別肽之一或多個結構性相關家族内的關鍵殘基。參見例如 Cwirla等人，Science 276: 1696-9 (1997)，其中鑑別兩個不同家族。肽序列亦可能暗示哪個殘基可藉由丙胺酸掃描或DNA水平上之突變而被安全置換。可形成突變庫且對其篩檢以進一步優化最佳結合物之序列^ Lowman，

Ann. Rev· Biophys· Biomol. Struct. 26: 401-24 (1997) 〇蛋白質-蛋白質相互作用之結構分析亦可用來指出可模擬大蛋白質配位體之結合活性的肽。在此種分析中，晶體結構可顯示大蛋白質配位體之關鍵殘基之一致性及相對定位’可根據此设計狀。參見例如Takasaki等人，Nature

Biotech 15: 1266-70 (1997)。該等分析方法亦可用於研究受體蛋白與肽（由噬菌體展示所選擇）之間的相互作用，該相互作用可提示為提高結合親和力對狀作進一步修飾。在肽研究中其他方法與噬菌體展示展開競爭。肽庫可與乳糖抑制體之羧基末端融合且表現於大腸桿菌中。另一種 159757.doc -69· 201206954 基於大腸桿菌之方法允許藉由與肽聚醣關聯脂蛋白（pAL) 融合而展示於細胞外膜上。在下文中，該等及相關方法被總稱為••大腸桿菌展示"。在另一種方法中，在核糖體釋放之削停止隨機RNA之轉譯，從而產生仍與相關RNA連接之多肽庫《在下文中，此種及相關方法被總稱為"核糖體展示"。其他方法使用肽與RNA之化學鍵聯。參見例如

Roberts及 Szostak，Proc Natl Acad Sci USA，94: 12297-303 (1997)。在下文中，此種及相關方法被總稱為"rna_肽篩檢"。已開發出化學衍生肽庫，其中將肽固定於穩定非生物材料（諸如聚乙烯棒或溶劑可滲透性樹脂）上。另一化學衍生肽庫使用光微影來掃描固定於玻璃載片上之肽。在下文中，該等及相關方法被總稱為"化學_肽篩檢、化學-肽篩檢之有利之處可在於其允許使用D_胺基酸及其他非天然類似物以及非肽元件。生物方法與化學方法綜述於Wem 及Lowman，Curr. Opin. Biotechnol·，3: 355-62 (1992)中。

在概念上’可使用㈣體展示及如上所述之其他方法發現任何蛋自質之肽模擬物。該等方法已被用於抗原決定其定位以便㈣蛋白質_蛋自質相互作时之㈣胺基酸I 作為用以發現新治療劑之線索。參見例如c〇rtese等人， Cinr. Opin· Biotech. 7·’心-幻（1996)。目前將肽庫最常用於免疫研究’諸如抗原決定基定位。參見―吒I

Scientist 10(13):19-20 (1996) 〇可針對結合於本文中所述之海帕西啶多肽或調節增加或降低）本文中所述之海帕西❹肽之活性的能力筛 159757.doc •70· 201206954 檢之化合物的來源包括（1)無機及有機化學庫、（2)天然產物庫及（3)由隨機肽或模擬肽、寡核苷酸或有機分子組成之組合庫。化學庫可易於合成或可購自若干商業來源，且可包括已知化合物或經由天然產物篩檢鑑別為"化學靶物"或"先導物"之化合物的結構類似物。天然產物庫之來源為微生物（包括細菌及真菌）、動物、植物或其他植被或海洋生物，且可藉由以下方式形成用於篩檢之混合物庫：（1)自土壌、植物或海洋微生物礙酵且提取酿酵液或（2)提取生物體本身。天然產物庫包括聚酮化合物、非核糖體肽及其（非天然存在）變異體。關於綜述，參見 Science 282:63-68 (1998)。組合庫係由大量肽、募核苷酸或有機化合物組成且可易於藉由傳統自動合成法、PCR、選殖或專屬合成法製備。特別關注肽及寡核苷酸組合庫。所關注之其他庫包括肽、蛋白質、肽模擬物、多並行合成集合（multipara丨 synthetic collection)、重組物及多肽庫。關於組合化學及由此所產生之庫的綜述，參見Myers, Cwr. 5沁iec/mo/· 8:701-707 (1997)。關於肽模擬物庫之綜述及貫例’參見ΑΙ-Obeidi等人，Mo/. 9(3):205-23 (1998)，Hruby 等人 ’ Cwr/- C/zew 5,〇/，1(1):114-19 (1997) ; Dorner 等人，Bioorg Med Chem，4(5):709-15 (1996)(烷基化二肽）。海帕西啶特異性結合劑亦包括如由Hays等人 159757.doc 201206954 23(10):514-522 (2005)中所述之支架蛋白 (該文獻以引用方式全部併入本文中）及如美國公開案第 2006-0286603號及第2006-0223114號中所述之Avimer蛋白技術（兩文獻以引用方式全部併入本文中）。抗體或特異性結合劑之筛檢法亦提供鑑別結合海帕西啶及/或交叉阻斷本文中所述之例示性抗體及/或抑制海帕西啶活性之抗體或特異性結合劑的方法。該等方法可利用本文中所提供之經高度純化之生物活性正峰摺疊非尿源性人類海帕西咬（在細菌或非哺乳動物細胞中化學合成或產生）的組合物。可針對結合親和力藉由此項技術中已知之方法薛檢抗體或特異性結合劑。舉例而言，可使用凝膠位移檢定、西方墨點法、放射性標記競爭檢定、層析共分級、共同沈澱法、交聯法、ELISA及其類似方法，該等方法描述於（例如）Current Protocols in Molecular Biology (1999) John

Wiley & Sons, NY中，該文獻以引用方式全部併入本文中。為對結合於靶標抗原上之所需抗原決定基的抗體或特異性結合劑作初始篩檢，可進行諸如描述於Antib〇dies，a

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow 及David Lane編（1988)中之常規交叉阻斷檢定。亦可使用常規競爭性結合檢定’其中未知抗體以其抑制靶標與本發明之靶標特異性抗體結合之能力為表徵。可使用完整抗原、其片段（諸如胞外域）或線性抗原決定基。抗原決定其 159757.doc 72· 201206954 定位描述於Champe等人，J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995)中。在活體外結合檢定之一種變體中，本發明提供一種方法，其包含（a)使經固定海帕西啶與候選抗體或特異性結合劑接觸，及（b)偵測該候選抗體或特異性結合劑與該海帕西啶之結合性。在一替代性實施例中，將候選抗體或特異性結合劑固定且偵測海帕西咬之結合性。使用此項技術令所熟知之方法中之任一者實現固定，包括共價绪合至支撐物、珠粒或層析樹脂，以及非共價高親和力相互作用，諸如抗體結合，或使用抗生蛋白鏈菌素/生物素結合，其中經固定化合物包括生物素部分。可⑴使用未經固定之化合物上之放射性標記’（ii)使用非固定化合物上之螢光標記，（iii)使用對非固定化合物具有免疫特異性之抗體， (iv)使用非固定化合物上可激發經固定化合物所連接之螢光支撐物的標記以及此項技術中所熟知且常規實施之其他技術來實現結合之彳貞測。在一些實施例中，可藉由使海帕西啶與抗體（或特異性結合劑）接觸，在測試抗體（或特異性結合劑）存在及不存在之情況下比較海帕西啶活性且判定抗體（或特異性結合劑）之存在是否使海帕西啶之活性降低來鑑別抑制或中和人類海帕西啶活性之抗體或特異性結合劑。可使用適當動物模型（包括本文中所述之彼等者中之任一者）活體内評估特定抗體或特異性結合劑或抗體或特異性結合劑之組合的生物活性。 159757.doc -73- 201206954 在一些實施例中，本發明亦涵蓋用以鑑別與靶標抗原相互作用或抑制靶標抗原之生物活性（亦即抑制磷酸化、二聚化、配位體誘發受體活化或細胞内信號轉導等）之抗艘的高通量篩檢（HTS)檢定。HTS檢定使以有效方式篩檢大量化合物成為可能。為研究靶標抗原與其結合搭配物之間的相互作用，涵蓋細胞基HTS系統。對HTS檢定進行設計以鑑別具有所需特性之"化學靶物"或"先導化合物"’可根據此設計修飾以改良所需特性。在另一實施例中，採用針對對CDR(其對靶標抗原多肽具有合適結合親和力）内的胺基酸具有1、2、3或3個以上之修飾之CDR或抗體片段的高通量篩檢。 B.抑制性寡核苷酸可根據本文中所述之方法使用之海帕西啶表現抑制劑包括抑制劑寡核苷酸或聚核苷酸，包括其醫藥學上可接受之鹽，例如納鹽。非限制性實例包括：反義寡核苦酸 [Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 10: 117-121 (2000) ； Crooke, Methods Enzymol., 313: 3-45 (2000) '> Guvakova等人，《/· 5io/. C/ze/w., <270: 2620-2627 (1995); Manoharan, Biochim. Biophys · Acta, 1489: 117-130 (1999) ; Baker 等人，·/· C/zew·，272: 11994-12000 (1997) i Kurreck, Eur. J. Biochem., 270: 1628-1644 (2003) ； Sierakowska^ A 5 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 12840-12844 (1996) ； Marwick, J. Am. Med. Assoc. 280: 871 (1998) ; Tomita及 Morishita，Curr. Pharm. Des., ]〇: 159757.doc -74- 201206954 797-803 (2004) ; Gleave及Monia，iVoti. i?ev. Career, 5: 468-479 (2005)及 Patil，·/· 7: E61-E77 (2005)]、三鏈寡核普酸[Francois 等人，iV'wc/eic Λα·，76: 11431-11440 (1988)以及 Moser 及 Dervan，《Science, 238: 645-650 (1987)]、核糖核酸酶/脫氧核糖核酸酶（DNA酶）[Kruger等人，reira/zywewfl. Ce//, 37: 147-157 (1982) ; Uhlenbeck， Nature, 328: 596-600 (1987) ; Sigurdsson 及 Eckstein, 7Ve«<ii /3: 286-289 (1995) ; Kumar等人 ’ 772er.，7*2: 1486-1493 (2005) ; Breaker及 Joyce，C/iew. Bio/., 1: 223-229 (1994) ； Khachigian, Curr. Pharm. Biotechnol., 5: 337-339 (2004) ； Khachigian, Biochem. Pharmacol., 68: 1023-1025 (2004)以及 Trulzsch及 Wood, 55: 257-265 (2004)]、小干擾 RNA/RNAi[Fire 等人，iVaiwre， 391: 806-811 (1998) ； Montgomery#· A » Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95: 15502-15507 (1998) ； Cullen, Nat.

Immunol., 3 : 597-599 (2002) ； Hannon, Nature, 418: 244-251 (2002) ; Bernstein 等人，409: 363-366 (2001) ; Nykanen 等人，Ce//, /07: 309.321 (2001);

Gilmore 等人，《/· Drug Target., 12: 315-340 (2004)； Reynolds 等人，Nat. Biotechnol., 22\ 326-330 (2004); Soutschek 等人，TVaiwre, 432: 173-178 (2004) ; Ralph 等 A » Nat. Med., 11: 429-433 (2005) ； Xia# A » Nat. Med., 70: 816-820 (2004)及 Miller等人，TVwc/ez'c Λμ., 32: 661-668 (2004)]、適體[Ellington及 Szostak，·N'aiwre, 34(5: 159757.doc -75- 201206954 818-822 (1990) ; Doudna 等人，Proc. iVa，/. Jcai Sci. C/U., 2355-2359 (1995) ; Tuerk及 Gold，以夕: 505-510 (1990) ; White 等人，Mo/. 77zer.,次 567-573 (2001) ; Rusconi等人，#aiwre, WP: 90-94 (2002) ; Nimjee 等人，Mo/· 77^r·, 74: 408-415 (2006) ; Gragoudas等人，见 Engl. J. Med., 35J: 3805-2816 (2004) ； Vinores, Curr. Opin. Mo/· TTzer., 5673-679 (2003)以及 Kourlas及 Schiller 等人， C/z«· 77ier·, 36-44 (2006)]或誘餌寡核苷酸[Morishita 等 A > Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92: 5855-5859 (1995)； Alexander 等人，·/. . Med 2P4: 2446-2454 (2005) ; Mann 及 Dzau，·/. C/ίη. /«veW·，70(5: 1071-1075 (2000)以及 Nimjee 等人 > Annu. Rev. Med., 56: 555-583 (2005)]。上述文獻據此以引用方式全部併入本文中，特別強調與設計、製備及使用抑制性寡核苷酸之方法有關之文獻的彼等章節。諸如 Ambion Inc.(Austin，TX)、Darmacon Inc.(Lafayette, CO) 、 InvivoGen(San Diego， CA)及 Molecular Research Laboratories，LLC(Herndon，VA)之供應商製造定製siRNA分子。此外，可利用商用套組產生定製 siRNA分子，諸如 SILENCERtm siRNA構建套組（Ambion Inc” Austin，TX)或 psiRNA 系統（InvivoGen, San Diego, CA)。抑制性寡核苷酸可與靶標基因之編碼部分、基因中之3' 或5'未轉譯區或内含子序列或者靶標mRNA中之編碼或内含子序列互補。内含子序列通常保守性較低且因此可提供 159757.doc • 76- 201206954 較大特異性。在-實施例中，抑制性募核㈣抑制一種物種之基因產物之表現，但其在另-物種中之同系物並非如此，在其他實施例中，抑制性寡核苷酸抑制基因於兩個物種（例如人類與靈長類或人類與鼠類）中之表現。在一些實施例中，抑制性募核苷酸能夠與海帕西啶基因或 mRNA(SEQ ID NO: 99(小鼠）或 SEQ ID NO: 100(人類）或其反向股）之至少8、9、1〇、η或12個連續鹼基在適度或咼嚴格條件下雜交。在某些情況下，視互補區之長度而定，在不影響抑制功能之情況下可容許一個、兩個或兩個以上錯配《在一些實施例中，抑制性募核苷酸為反義寡核苦酸、抑制性RNA(包括siRNA或RNAi或shRNA)、DNA 酶、核糖核酸酶（視情況為錘頭狀核糖核酸酶）、適體或其邊藥學上可接受之鹽。在一實施例中，寡核苷酸與SEQ NO: 104之至少ι〇個鹼基互補。在一實施例中，寡核苷酸靶向位於海帕西,mRNA之3,未轉譯區附近之核苷酸。以抑制性寡核苷睃乾向之mRNA位點的選擇在寡核苷酸之設計中所使用之特異性序列可為含於靶標之經表現基因信使内之核苷酸的任何鄰近序列。可使用此項技術中已知之程式及算法來選擇合適靶標序列。此外，可利用經設計用來預測指定單股核酸序列之二級結構的程式且允許選擇彼等可能存在於摺疊mRNA之經暴露單股區中的序列來選擇最佳序列。用於設計合適寡核苷酸之方法及組合物可見於（例如）美國專利第6,251，588號中，該文獻内容以引用方式全部併入本文中。 159757.doc • 77- 201206954 已展示大多數mRNA含有若干二級及三級結構。RNA中之二級結構元件主要係由同一 RNA分子之不同區域之間的 Watson-Crick型相互作用形成。重要二級結構元件包括分子内雙股區、髮夾環、雙鏈體RNA中之突起（bulge)及内環。當二級結構元件彼此接觸或與單股區接觸而產生較複雜的三維結構時形成三級結構元件。若干研究者已量測大量RNA雙鏈體結構之結合能且已獲得一套可用於預測RNA 之二級結構的法則（參見例如Jaeger等人，1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706 ;及 Turner等人，1988, Annu. Rev. Biophys· Biop hys. Chem. 17:167)。該等法則適用於鑑別 RNA結構元件，且尤其適用於鑑別可為mRNA之片段的單股RNA區以確定siRNA、核糖核酸酶或反義技術之標靶。反義寡核苷酸已展示反義寡核苷酸於細胞中之組成性表現可能經由阻斷轉譯或防止拼接而抑制基因表現。適當抑制性寡核苷酸可為單股且含有（例如）長度為至少12、15或18個鹼基、與 mRNA或DNA分子充分互補且對mRNA或DNA分子具特異性之片段使得其與mRNA或DNA分子雜交且抑制轉錄、拼接或轉譯。通常少於30個鹼基之長度上的互補性係綽綽有餘的。支配抑制性寡核苷酸序列之靶標位點之因素包括寡核苷酸長度、結合親和力及靶標序列可及性。可針對序列抑制活性之效能藉由量測靶標蛋白質轉譯及靶標相關表型之抑制（例如細胞培養物中之細胞增殖之抑制）來活體外篩檢序 159757.doc -78- 201206954 列。通常已知可使用反義寡核苷酸靶向rna之大部分區域 (5'及3'未轉譯區、AUG啟始、編碼、拼接點及内含子）。可使用硫代填酸醋反義寡核苷酸。修飾雜環或糖之磷酸二酯鍵亦可使效率提高。使用硫代鱗酸酯來修飾鱗酸二酯鍵。已將N3'-P5'胺基磷酸酯鍵描述為使寡核苷酸對核酸酶穩定及增加與RNA之結合。肽核酸（PNA)鍵為核糖及磷酸二酯骨架之完全置換且對核酸酶穩定，提高對RNA之結合親和力且不允許為RNAse Η所裂解。其基本結構亦應經受修飾’此可使其作為反義組份最佳化。關於雜環之修姊，已證明某些雜環修飾在不干擾RNAse Η活性之情況下加強反義效應。該修飾之一實例為C-5噻唑修飾。最終，亦可顧及糖之修飾。在細胞培養物中及活體内2，_〇_丙基及2,_ 甲氧基乙氧基核糖修飾使寡核苦酸對核酸酶穩定。

預期具穩定性、具有對核酸酶之高抗性、具有適當藥物動力學性質以便允許以無毒性劑量運輸至靶榡組織位點且具有橫穿質膜之能力的抑制性寡核苷酸用作治療劑。短干擾RNA 短干擾（si)RNA技術（亦稱為RNAi)通常涉及由與特定序列同源之雙股RNA(dsRNA)所誘發的該序列之mRNA之降解，藉此"干擾”相應基因之表現。可藉由引入對應於任何所選基因之mRNA之所有或實質部分的dsRNA來壓製該基因。看來’當長dsRNA被表現時，其最初由核糖核酸酶m 加工成長度為少至21至22個鹼基對之較短dsRNA寡核苷酸。因此’可藉由引入或表現相對較短之同源dsRNA來獲 159757.doc -79- 201206954 得siRNA。例示性siRNA具有約21個核苷酸之有義鏈及反義鏈，其構成雙股RNA之約19個核苷酸並在各3'端處具有兩個核苷酸之懸垂物。實際上，使用相對較短之同源 dsRNA可具有某些優勢。哺乳動物細胞具有至少兩個受雙股RNA(dsRNA)影響之途徑。如上所述，在序列特異性siRNA途徑中，首先使起始dsRNA分裂為短干擾RNA。認為短干擾RNA提供使特異性信使RNA可被靶向以便降解的序列資訊。與此相反，藉由任何序列之dsRNA觸發非特異性途徑，只要其長度為至少約30個鹼基對即可。非特異性效應因dsRNA活化以下兩種酶而出現：PKR，呈其活性形式時使轉譯起始因子eIF2磷酸化以停止所有蛋白質合成；及2\5'-寡腺苷酸合成酶（2’，5’-AS)，其合成可活化RNase L(—種乾向所有mRNA之非特異性酶）之分子。非特異性途徑可使宿主呈現應激反應或病毒性感染反應且通常，較佳使非特異性途徑之效應最小化。重要地為，較長dsRNA似乎為誘發非特異性途徑所需且因此預期比約30 個鹼基對短之dsRNA藉由RNAi實現基因抑制（參見Hunter 等人，1975, J. Biol. Chem. 250:409-17 ; Manche 等人， 1992, Mol. Cell. Biol. 12:5239-48 ; Minks等人，1979，J. Biol· Chem· 254:10180-3 ;及 Elbashir 等人，2001，Nature 411:494-8) ° 已證明siRNA為降低多種細胞類型之基因表現之有效方法。siRNA通常使基因表現降低至比使用反義技術所獲低 159757.doc -80 - 201206954 之水平且常常完全消除表現（參見Bass, 2001，Nature 411··428-9)。在哺乳動物細胞中，siRNA在低於通常用於反義實驗之濃度若干數量級的濃度下為有效的（Elbashir等人，2001，Nature 411:494-8) ° 用以實現RNAi之雙股寡核苷酸較佳為小於30個鹼基對之長度，例如約 25、24、23、22、21、20、19、18 或 17個鹼基對或更小之長度且含有與靶標mRNA充分互補之片段以便允許與靶標mRNA雜交。視情況dsRNA寡核苷酸可包括Υ懸垂物末端。例示性2-核苷酸3'懸垂物可由任何類型之核糖核苷酸殘基組成且甚至可由2'-脫氧胸苷殘基組成，此可降低RNA合成成本且可增強siRNA在細胞培養基中及轉染細胞内之核酸酶抗性（參見Elbashi等人，2001，Nature 411:494-8)。例示性dsRNA可化學合成或使用合適表現載體活體外或活體内產生（參見例如Elbashir等人，2001， Genes Dev. 15:188-200)。在此項技術中已知，可由啟動子 (諸如T7 RNA聚合酶啟動子）轉錄較長RNA。在本發明之一些實施例中亦可使用50、75、100或甚至 500個鹼基對或更多之較長dsRNA。儘管可視所處理細胞之性質、基因靶標及熟習此項技術者可易於辨識之其他因素而定使用其他濃度，但用於實現RNAi之dsRNA之例示性濃度為約〇·〇5 nM、0.1 nM、0.5 nM、1.0 ηΜ、1·5 nM、25 nM或 100 nM。 siRNA技術之其他組合物、方法及應用提供於美國專利申請案第6,278,039號、第5,723,750號及第5,244,805號 159757.doc -81 - 201206954 中，該等申請案以引用方式全部併入本文中。

短髮夾RNA 與siRNA相比’ shRNA在沉默長壽及輸送選擇方面提供優勢。關於綜述’參見例如Hannon等人，Nature，431:371-378, 2004。已報導產生shRNA(其在細胞内被加工成具有類siRNA特性之短雙鏈體RNA)的載體（Brummeikamp等人，Science 296，550-553，2000 ; Paddison等人，Genes

Dev. 16, 948-958 (2002))。該等載體提供可在將载體穩定整合於宿主細胞基因組中之後調控持續基因沉默之基因沉默試劑的可再生來源。此外，可易於以經設計用來輸送允許異位mRNA表現之DNA構建體之無數方法中的任一種方法將核心沉默"髮夹"卡匣插入反轉錄病毒、豆狀病毒或腺病毒載體中’從而有助於shRNA輸送至寬範圍之細胞類型中（Brummelkamp 等人，Cancer Cell 2:243-247，2002 ; Dirac，等人，j· Biol. Chem. 278:11731-11734，2003 ; Michiels 等人，Nat. Biotechnol. 20:1 154-1157，2002 ; Stegmeie 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:13212-13217, 2005 ; Khvorova等人，Cell，115:209-216 (2003))。髮夾可以左手髮夾（亦即5，-反義-環-有義-3，）或右手髮夾 (亦即5’-有義-環-反義-3·)形式組織成。siRNA亦可視髮夾組織而定在有義股或反義股之5'或3,端含有懸垂物。較佳’若存在任何懸垂物，則其處於髮夾之3,端上且包含1至 6個鹼基。懸垂物可能未經修飾或可含有一或多種特異性或穩定化修飾，諸如2,位置之鹵素或Ο-烷基修飾或核苷酸 159757.doc -82- 201206954 間修飾，諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或膦酸曱醋修飾。該等懸垂物可為核糖核酸、脫氧核糖核酸或核糖核酸與脫氧核糖核酸之組合。另外，髮夾可進一步包含5'-最末端核苷酸上之磷酸醋基團。5'·最末端核苷酸之磷酸化係指存在一或多個連接於5，_ 末端核苷酸之糖部分之5'碳的磷酸酯基團。較佳，在將繼 Dicer加工之後形成反義股之區域之5,端上僅存在一個磷酸酯基團。在一例示性實施例中，右手髮夾可包括不具有5, 磷酸酯基團之51端（亦即有義區之游離5,端）或可具有以防止磷酸化之方式經修飾的有義區之游離5，_最末端核苷酸的5, 碳。此可藉由多種方法達成，包括（但不限於）添加磷酸化阻隔基團（例如5，-〇-烷基）或消除5，·0Η官能基（例如5，_最末端核苷酸為5’-脫氧核苷酸）。在髮夾為左手髮夾之情況下’較佳使5'-最末端核苷酸之5,碳位置麟酸化。具有比26個鹼基對長之莖長度的髮夾可由Dicer加工，使得某些部分不為促進mRNA降解之所得siRNA之部分。因此可包含有義核苷酸之第一區及可包含反義核苷酸之第二區亦可含有一段互補（或至少大體上彼此互補）但與靶標 mRNA相同或與熱標mRNA互補或不與靶標mRNA相同或不與靶標mRNA互補的核苷酸。儘管shRNA之莖可由除懸垂物外之互補或部分互補反義股及有義股組成，但可包括下列部分：⑴處於最終Dicer切割位點之遠端之分子部分，其含有大體上與靶標111{1]^八互補/同源之區域；及 (2)處於Dicer切割位點之近端之莖區域（亦即鄰近於環之區 159757.doc • 83 - 201206954 域）’其與靶標mRNA無關或僅部分相關（例如互補/同源）。可基於若干參數（包括（但不限於）熱力學特性或分布）來選擇該第一區域之核普酸含量。經修飾之shRNA可保留後Dicer加工之雙鏈體中之修飾。在例示性實施例中，在髮夾為於分子之3,端上含有2_6個核苷酸懸垂物之右手髮夾（例如5'-S-環-AS-3，）的情況下，可將2'-0-甲基修飾添加至在髮夾之5,端之位置2、位置1及2 或位置1、2及3處的核苷酸。具有該構型之髮夾之Dicer加工亦可保留完整有義股之5·端，因此保留後Dicer加工之雙鏈體中的化學修飾模式。呈該構型之3,懸垂物之存在可為尤其有利的，此係因為含有指定修飾模式之鈍端分子可進一步由Dicer以一定方式加工使得帶有2ι修飾之核苷酸被移除。在存在/保留3’懸垂物之情況下，帶有有義修飾之核苷酸之所得雙鏈體可就沉默特異性及功能性而言具有極度有利之特性。例示性修飾模式之實例詳細描述於美國專利申請案公開案第2005/0223427號、國際公開案第w〇 20〇4/〇9〇1〇5號及第W〇/2〇〇5/〇78〇94號中，該等文獻中之每一者的揭示内容以引用方式全部併入本文中。 shRNA可包含隨機或根據任何合理設計選擇程序選取之序列。舉例而t ’合理設計算法描述於國際公開案第觸 2004/045543 A2號、美國專利申請公開案第2〇〇5/〇255487 號中，該等文獻之揭示内容以引用方式全部併入本文中。另外’可能需要完全或部分基於内部穩定性平均分布 ("AISP")或内部穩定性區域分布("RISp")選擇可有助於細 159757.doc • 84 · 201206954 胞機器之接近或加工之序列。核糖核酸梅核糖核酸酶為能夠催化mRN A之特異性裂解從而防止轉譯之酶促RNA分子。（關於综述，參見R0ssi，1994, Current Biology 4:469-471)。核糖核酸酶作用機制涉及核糖核酸酶分子與互補靶標RNA之序列特異性雜交，接著涉及内切核普酸裂解事件。核糖核酸酶分子較佳包括（1)一或多個與乾標mRNA互補之序列及（2)造成mRNA裂解之所熟知催化序列或功能性等效序列（參見例如美國專利第5,093,246號，其以引用方式全部併入本文中）。儘管使mRNA在位點特異性識別序列處裂解的核糖核酸酶可用於破壞靶標mRNA，但或者可使用錘頭狀核糖核酸酶。錘頭狀核糖核酸酶使mRNA在由與靶標mRNA形成互補驗基對之側翼區所限定的位置處裂解。較佳，乾標 mRNA具有以下的兩個鹼基之序列：5，_UG_3,。錘頭狀核糖核酸酶之構建及製備在此項技術中係熟知的且更為充分地描述於Haseloff及 Gerlach，1988, Nature 334:585-591 ;及 PCT申請案第WO89/05852號中，該等文獻之内容以引用方式全部併入本文中。基因靶向性核糖核酸酶可含有與靶標mRNA之兩個區域互補之雜交區域，該兩個區域中之每一者為至少5、6、 7、8、9、10、η、12、13、14、15、16、17、18、_ 20個鄰接核苷酸（但其無需皆為相同長度）。可將錘頭狀核糖核酸酶序列嵌入穩定RN Α(諸如轉移 159757.doc •85· 201206954 RNA(tRNA))中以提高活體内裂解效率（Perriman等人， 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6175-79 ； de FeyteriL Gaudron, Methods in Molecular Biology，第 74卷，第 43 章，"Expressing Ribozymes in Plants"，由 Turner, P. C編， Humana Press Inc·, Totowa，N.J)。尤其為 tRNA融合核糖核酸酶之RNA聚合酶III所介導之表現在此項技術中係熟知的 (參見 Kawasaki等人，1998，Nature 393:284-9 ; Kuwabara 等人，1998，Nature Biotechnol. 16:961-5 ;及Kuwabara等人，1998, Mol. Cell 2:617-27 ; Koseki等人，1999, J. Virol 73:1868-77 ; Kuwabara等人，1999，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:1886-91 ； Tanabe 等人，2000, Nature 406:473-4)。通常在給定靶標cDNA序列内存在若干潛在錘頭狀核糖核酸酶裂解位點。核糖核酸酶較佳經工程化以便使裂解識別位點位於靶標mRNA之5'端附近以提高效率且最小化非功能性mRNA轉錄物之細胞内積累。此外，使用位於編碼靶標mRNA之不同部分之靶標序列中的任何裂解識別位點將允許選擇性靶向一個或其他靶標基因。本發明之核糖核酸酶亦包括RNA内切核糖核酸酶（"Cech 型核糖核酸酶"），諸如天然存在於嗜熱四膜蟲 (Tetrahymena thermophila)中之一者（稱為 IVS 或 L-19 IVS RNA)且已廣泛描述於 Zaug等人，1984，Science，224:574-578 ; Zaug等人，1986，Science 231:470-475 ; Zaug等人’ 1986，Nature 324:429-433 ;公開國際專利申請案第 W088/04300號；及 Been等人，1986，Cell 47:207-216 中。 159757.doc -86 - 201206954

Cech型核糖核酸酶具有8個鹼基對之活性位點，該活性位點與乾標RNA序列雜交’隨後發生乾標RNA裂解。本發明涵蓋彼等靶向存在於靶標基因或核酸序列中之8個鹼基對之活性位點序列的Cech型核糖核酸酶。核糖核酸酶可由經修飾寡核苷酸（例如就改良穩定性、乾向性等而言）組成且應能化學合成得到或經由表現載體產生。因為不同於反義分子之核糖核酸酶具有催化性，所以較低細胞内濃度係為效率所需的。在一些實施例中，可藉由首先鑑別足以由RNAi引起有效敲除之序列部分來設計核糖核酸酶。同一序列之諸部分可隨後被併入核糖核酸酶中。三重螺旋形成或者，可藉由靶向與基因之調節區域（亦即啟動子及/或增強子）互補之脫氧核糖核苷酸序列以形成可防止基因於體内靶標細胞中之轉錄的三重螺旋結構來降低靶標基因表現。（通常參見 Helene, C·, 1991，Anticancer Drug Des. 6:569-84 ; Helene，C.等人，1992，Ann. N.Y. Acad· Sci.， 660:27-36 ;及 Maher，L. J.，1992, Bioassays 14:807-15)。欲用於三重螺旋形成以抑制轉錄之核酸分子較佳為單股且由脫氧核糖核苷酸組成。該等寡核苷酸之鹼基組成應經由H〇ogsteen鹼基配對法則促進三重螺旋形成，此通常需要嘌呤或嘧啶之適當片段存在於雙鏈體之一股上。核苷酸序列可基於嘧啶，此將在所得三重螺旋之三個締合股上產生TAT及CGC三聯體。富含嘧啶分子向雙鏈體之單股之富 159757.doc -87· 201206954 含嗓呤區域在與該股平行之方位上提供驗基互補。此外， :選擇富含°票吟（例如含有-段G殘基）之核酸分子。該等刀子將與备含Gc對之DNA雙鏈體形成三重螺旋，其中大多數嘌呤殘基位於靶標雙鏈體之單股上，從而在三重螺旋之二個股上產生CGC三聯體。或者，可藉由產生所謂"之字形，，核酸分子來增加可就三重螺旋形成而言被靶向之靶標序列。以交替5，·3,、3，巧方式合成"之字形"分子，使得其與雙鏈體之第一股鹼基配對且隨後與另一股鹼基配對，從而消除適當嘌呤或嘧啶片段存在於雙鏈體之一股上的必要性。 DNA酶或者，可使用DNA酶來抑制靶標基因之表現。DNA酶包括有反義與核糖核酸酶技術之某些機械特徵。對dna酶進行設計以使其識別特定靶標核酸序列，此極為類似於反義寡核苷酸。然而其亦具有催化性且可特異性裂解靶標核酸。目前存在兩種基本類型之DNA酶，其兩者皆由Sant〇r〇及Joyce鑑別（參見例如美國專利第6，11〇,462號）。1〇_23 DNA酶包含連接兩臂之環結構.該兩臂藉由識別特定靶標核酸序列而提供特異性，而環結構在生理條件下提供催化功能。較佳，單一序列或大體單一序列為約丨8至22個核苷酸之 G/C富集序列。高G/C含量有助於確保dnA酶與乾標序列之間的較強相互作用。可使該酶乾向信使之特異性反義識 159757.doc -88- 201206954 別序列可分配於DNA酶之兩臂之間。製造及投與DNA酶之方法可見於（例如）美國專利第 6,11 〇,462號中。另外，熟習此項技術者將認識到，如同反義寡核苷酸，DNA酶可視情況經修飾以提高穩定性且改善對降解之抗性。抑制性寡核苷酸之輸送抑制性寡核苷酸可藉由經由已置有編碼具有適當調節序列（包括啟動子）之抑制性寡核苷酸之DNA的載體（包括病毒載體或質體）轉型或轉染而直接投與或輸送至細胞，以使抑制性寡核苷酸表現於所需細胞中。已知方法包括標準瞬時轉染、穩定轉染及使用範圍介於反轉錄病毒至腺病毒之病毒輸送。涵蓋藉由複製或複製缺陷型載體輸送核酸抑制劑。亦可由組成性或誘導性啟動子系統驅動表現（paddis〇n 等人，Methods Mol_ Biol. 265:85-100，2004)。在其他實施例中，表現可能處於組織或發育特異性啟動子之控制下。舉例而言’可藉由使用諸如脂質轉染胺 (Lip〇fectamine)2000(Life Technologies)或 Oligofectamine (Life Technologies)之載體組合物進行轉染而引入載體。對於在共轉染編碼hGFP之PAD3後的哺乳動物細胞株，可使用螢光顯微鏡術來檢查轉染效率（Kehlenback等人，1998, J. Cell Biol. 141:863-74)。輸送途徑將為提供如根據如上所述之標準所量測之最佳抑制效應者。藉由陽離子脂質體所介導之輸送、由反轉錄病毒載體輸送及直接輸送為有效的。 159757.doc -89- 201206954 其他已知輸送方法描述於以下標題為”基因療法⑼狀 Therapy)"之章節中。可在足以在抑制新蛋白質合成之後周轉（turnover)内源性庫之時間後藉由若干檢定中之任一者來評估抑制性寡核苷酸之有效性，該等檢定包括用於測定現有人類海帕西咬 mRNA含量之逆轉錄酶聚合酶鍵反應或北方墨點分析或使用識別人類海帕西咬蛋白之抗體之西方墨點分析。儘管海帕西啶含量之，，正常”範圍小於約25 ng/mL，但低於約1〇 ng/mL之量測值可指示海帕西啶之抑制。在另一實施例中海帕西咬3量之正常"範圍小於約1〇 ng/mi (如由質譜分析法所評估）且低於約2.5 ng/ml2量測值（如由質譜分析法所評估）可指示海帕西咬之抑制。 C·具有拮抗劑活性之海帕西咬多肽變異通就人類海帕西啶多肽而論，涵蓋包括一或多個相對於天然成熟人類海帕西啶序列而言之取代、插入或缺失但保留所有八個半胱胺酸且抑制海帕西啶生物活性（例如抗微生物及/或鐵調節活性）的拮抗劑變異體。變異體可保留C2_ CM及/或（：5-〇7二硫鍵且視情況亦保留C1_C8及C3_C6:硫鍵。亦涵蓋保留膜鐵轉運蛋白結合活性但不引起膜鐵轉運蛋白内化或降解之海帕西啶變異體以及保留海帕西啶受體結合活性但不活化膜鐵轉運蛋白受體之海帕西啶變異體。易於如第IV章節（多肽變異體之產生）中所述製備拮抗劑變異體’且可在本文中所述之活體外或活體内檢定中之任一者中針對抑制海帕西啶鐵調節活性之能力對其進行筛 159757.doc •90- 201206954 檢。 in.具有促效劑活性之海帕西啶多肽變異體亦涵蓋包括一或多個相對於天然成熟人類海帕西啶序列而言之取代、插入或缺失但保留所有八個半胱胺酸且保留海帕西啶生物活性（例如抗微生物及/或鐵調節活性）的人類海帕西啶多肽之促效劑變異體。變異體可保留C2_C4&/或 C5-C7二硫鍵且視情況亦保留（：1_以及(：3_(：6二硫鍵。亦涵蓋保留膜鐵轉運蛋白結合活性且/或保留海帕西啶受體結合活性之海帕西啶變異體。易於如第IV章節（多肽變異體之產生）中所述製備促效劑變異體，且可在本文中所述之活體外或活體内檢定中之任一者中針對海帕西啶鐵調節活性之保持力對其進行篩檢。 IV·多狀變異體及衍生物之產生可易於藉由一般熟習此項技術者所熟知之技術修飾本發明之海帕西啶多肽（包括海帕西啶變異體）或本發明之抗海帕西啶抗體》潛在突變包括一或多個殘基之插入、缺失或取代。插入或缺失較佳處於約丨至5個胺基酸、更佳丨至3個胺基酸且最佳1至2個胺基酸之範圍内。缺失變異體為任何胺基酸序列之至少一個胺基酸殘基被移除的多肽。可在蛋白質之一或兩個末端處實現缺失或藉由移除多肽内（内部）之一或多個殘基來實現缺失。製備缺失變異體之方法為此項技術中之常規方法。參見例如

Sambrook荨人，（1989) Molecular Cloning: A Laboratory

Guide 第 1 3 卷，Cold Spring Harbor Press，其揭示内容 159757.doc 201206954 以引用方式全部併入本文中。胺基酸序列插人包括長度範圍介於—個殘基至含有數百或更多個殘基之多肽之間的胺基及/或缓基末端融合以及 -或多個胺基酸之内部序列插人。如同本文中所述之不同變異體類型中之任-者-樣，插入型變異體可經設計使得所得多肽保留與其所源自之親本多肽相同之生物學特性或展現與其所源自之親本多肽無關之新穎物理、化學及/或生物學特性。製備插入變異體之方法在此項技術中亦為常規且熟知的（Sambrook等人，見上述）。包含本發明之多肽（包括海帕西〇定變異體）或本發明之抗體及異源性多肽的融合蛋白為由本發明所涵蓋之特定類型之插入變異體。可與所關注之多肽融合的異源性多狀之非限制性實例包括具有長循環半衰期之蛋白質，諸如（但不限於）免疫球蛋白值定區（例如Fc區域）；允許鑑別所關注之多肽之標記序列；有助於純化所關注之多肽之序列；及促進多亞基蛋白之形成之序列。製造抗體融合蛋白之方法在此項技術中係熟知的。參見例如美國專利第6,306,393號，其揭示内容以引用方式全部併入本文中。在本發明之某些實施例中，產生可包括使嵌合scFv抗體與異源性蛋白部分連接之可撓性連接子的融合蛋白。適當連接子序列為彼等並不影響欲識別之所得融合蛋白之能力且結合由蛋白之v域所特異性結合之抗原決定基的序列（參見例如W0 98/25965，其揭示内容以引用方式全部併入本文中）。 159757.doc •92- 201206954 取代變異體為多肽胺基酸序列中之s ^ ^ 』甲之至少—個殘基被移除且在移除該殘基之處插入不同殘基的彼等變異體。藉由選擇取代來實現多肽或抗體之生物特性之修飾，該等^代在其以下效應方面明顯不同、a)維持取代區域内多肽骨架之結構，例如呈摺疊或螺旋構形；(b)維持靶標位點處之：子之帶電性或疏水性；或（c)維持大部分侧鏈。在本發明之某些實施例中’設計取代變異體，亦即一或多個特定（與隨機相反）胺基酸殘基經特定胺基酸殘基取代。該等類型之典型變化包括保守性取代及/或以一殘基取代另一殘基（基於天然及取代殘基之相似特性）。保守性取代展示於表1中。在"較佳取代"標題下可見最保守性取代。若該等取代未導致生物活性之變化，則可引入較多實質性變化且篩檢產物。表1 始例示性較佳殘基取代 Ala (A) val、leu、ile val Arg (R) lys、gin、asn lys Asn (N) gin、his、asp、lys、gin arg Asp (D) glu ' asn glu Cys (C) ser 、 ala ser Gin (Q) asn 、 glu asn Glu (E) asp ' gin asp Gly (G) ala His (H) asn、gin、lys、arg 159757.doc •93· 201206954

He⑴ leu、val、met、ala、 leu phe、正白胺酸 Leu (L) 正白胺酸、ile、val、 ile met、ala、phe Lys (K) arg ' gin ' asn arg Met (Μ) leu、phe、ile leu Phe (F) leu、val、ile、ala、tyr Pro (P) ala Ser(S) thr Thr(T) ser ser Trp (W) tyr ' phe tyr Tyr (Y) trp、phe、thr、ser Phe Val (V) ile、leu ' met、phe leu ala、正白胺酸 Γ碍類。 ⑴疏水性··正白胺酸、met、ala、val、iei1 ., 1CU ' lie ; 具有共有側鏈特性之胺基酸殘基通常係如 (2) 中性親水性：cys、ser、thr ; (3) 酸性：asp、glu; (4) 驗性· asn、gin、his、lys、arg ; (5) 影響鍵取向之殘基：gly 、pro ;及 (6) 方族性：trp、tyr、phe。抗體變異體在某些實例中，製備抗體變異體，旨在修飾與抗原決基結合直接有關之彼等胺基酸殘基。在其他實施例中， 159757.doc •94- 201206954 於本文中所論述之目的’需要修飾不與抗原決定基結合直接有關之殘基或在任何情況下不與抗原決定基結合有關之殘基。涵蓋CDR區及/或構架區中之任一者内之突變。為確定哪些抗體胺基酸殘基對於抗原決定基識別及結合而言係重要的，可進行丙胺酸掃描突變以產生取代變異體。參見例如 Cunningham 等人 ’ Science，244:1081-1085 (1989) ’其揭示内容以引用方式全部併入本文中。在該方法中，以丙胺酸殘基一次一個地置換個別胺基酸殘基且相對於未修飾抗體而言根據結合特異性抗原決定基之能力對所得抗海帕西啶抗體進行篩檢。對結合能力降低之經修飾抗體定序以確定哪個殘基發生改變，此表明其在結合或生物學特性中之重要性。可藉由將隨機胺基酸變化引入親本抗體序列中之親和力成熟製備抗體之取代變異體。參見例如〇uwehand等人，

Vox Sang 74(增刊 2):223-232，1998 ; Rader 等人，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 95:8910-8915，1998 ; Dall’Acqua等人，Curr. Opin. Struct. Biol· 8:443-450，1998，其揭示内容以引用方式全部併入本文中。親和力成熟涉及製備及篩檢抗海帕西啶抗體或其變異體且涉及自所得變異體中選出相對於親本抗海帕西啶抗體而言具有改良生物學特性（諸如增加之結合親和力）的彼等變異體。產生取代變異體之一種適宜方式為使用噬菌體展示之親和力成熟。簡言之，使若干尚變區位點突變以在各位點處產生所有可能之胺基取代。因此所產生之變異體以單價方式被表現於絲狀噬菌 159757.doc -95· 201206954 體顆粒表面上，其中該等變異體與封裝於各顆粒内之Ml3 之基因III產物融合。隨後根據生物活性（例如結合親和力）篩選噬菌體展示之變異體。參見例如WO 92/01047、WO 93/112366、WO 95/15388及 WO 93/19172。當前抗體親和力成熟方法屬於兩種突變類別：隨機與非隨機。易錯PCR、增變菌株（Low等人，·/· Mo/· 260, 359-68，1996)及飽和突變（Nishimiya等人，《/. 5ζ·ο/. C/zew. 275:12813-20, 2000 ； Chowdhury, P. S. Methods Mol. Biol. 178，269-85，2002)為隨機突變法（Rajpal等人，Proc ¢/ 5 A 102:8466-71，2005)之典型實例。非隨機技術常常使用丙胺酸掃描或定點突變來產生特定突變蛋白之有限集合。以下進一步詳細描述某些方法。經由淘選法進行之親和力成熟-通Λ在邋咸i之抗脉存在下經由對候選抗體之若干輪淘選進行重組抗體之親和力成熟。遞減每輪抗原之量選出對抗原具有最高親和力之抗體，藉此自一大堆起始物質中獲得高親和力抗體。經由淘選進行之親和力成熟在此項技術中係熟知的且（例如）描述於 Huls 等人(Cancer /wmwwoi/zer. 50:163-71, 2001) 中。使用噬菌體展示技術之親和力成熟法描述於本文中別處且在此項技術中係已知的（參見例如Daugherty等人，尸附/ 如· t/ S A 97:2029-34, 2000)。精確突變（Look-through mutagenesis)-綠碟突變（UIM) (Rajpal等人，Proc iVa// /cad Scz· i 102:8466-71， 2005)提供一種迅速定位抗體結合位點之方法。對於 159757.doc -96- 201206954 LTM，選取9個代表由20個天然胺基酸所提供之主要側鏈化學性質的胺基酸以便剖析在抗體之所有六個CDR中之每一位置處對結合之功能性側鏈貢獻。LTM於CDR内產生一系列單個位置突變，其中各"野生型"殘基經9個所選胺基酸之一者有系統地取代。將突變CDR組合以在不會阻止所有突變蛋白之定量展示的情況下產生複雜度及尺寸遞增之組合性單鏈可變片段（scFv)庫。在陽性選擇之後，對具有改良結合性之純系定序且定位有益突變。 #鎧尸Cf易錯PCR涉及核酸於不同選擇輪次之間的隨機化。隨機化因所用聚合酶之固有誤差率而以較低比率發生，但可藉由使用在轉錄期間具有高固有誤差率之聚合酶 (Hawkins等人，J Mol Biol. 226:889-96，1992)進行易錯 PCR(Zaccolo等人，J. Mol. Biol. 285:775-783, 1999)而得以增強。在突變週期之後，使用此項技術中之常規方法選擇對抗原具有改良親和力之純系。利用基因改組及定向進化之技術亦可用於製備抗海帕西啶抗體或其變異體且根據所需活性對其進行篩檢。舉例而言，Jermutus等人，Proc Natl Acad Sci U S A.，98(1):75-80 (2001)展示將所定製之基於核糖體展示之活體外選擇策略與藉由DNA改組達成之活體外多樣化組合以推算出scFv之解離速率或熱力學穩定性；Fermer等人，Tumour Biol. 2004年1月-4月；25(1-2):7-13報導組合使用噬菌體展示與 DNA改組使親和力提高幾乎三個數量級。Dougherty等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 年 2 月 29 日； 159757.doc -97· 201206954 97(5):2029-2034報導⑴功能性純系以出人意料之高頻率存在於超突變庫中；（ii)功能增強的突變體良好呈現於該等庫中’且（iii)導致較咼親和力之大多數scpv突變對應於遠離結合位點之殘基。或者或另外，分析抗原抗體複合物之晶體結構以鑑別抗體與抗原之間的接觸點或使用電腦軟體模擬該等接觸點可為有益的。根據本文中所詳述之技術，該等接觸殘基及鄰近殘基為用於取代之候選者。一旦產生該等變異體後，如本文十所述使其經受篩檢且可選取在一或多個相關檢定中具有優良特性之抗體用於進一步開發。具有經修飾碳水化合物之抗體亦可產生相對於親本抗體而言具有經修飾糖基化模式之抗體變異體’例如添加或刪除結合於特異性結合劑或抗體之碳水化合物部分中之一或多者且/或添加或刪除特異性結合劑或抗體中之一或多個糖基化位點。多肽（包括抗體）之糖基化通常為N-連接或〇_連接β N•連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺酸殘基之侧鍵連接。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸_χ_蘇胺酸（其中 X為除脯胺酸外之任何胺基酸）為碳水化合物部分與天冬酿胺酸側鏈之酶促連接的識別序列。該等三肽序列中之任一者於多肽中之存在產生潛在糖基化位點。因此，Ν_連接糖基化位點可藉由改變胺基酸序列使得其含有該等三肽序列中之一或多者而添加至特異性結合劑或抗體中。〇_連接糖基化係指糖Ν-乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者與羥 159757.doc -98- 201206954 基胺基酸的連接，該羥基胺基酸最常為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。〇_連接糖基化位點可藉由使一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基插入或取代至初始特異性結合劑或抗體之序列中而添加至特異性結合劑或抗體中。經改變之效應功能可將半胱胺酸殘基移除或引入抗體或含有Fc之多肽之以區域中，藉此消除或增加該區域内之鏈間二硫鍵形成。因此所產生之同源二聚特異性結合劑或抗體可具有改良之内化能力及/或增加之補體介導性細胞殺死及抗體依賴性細胞毒性（ADCC)。參見Caron等人，J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)及 Shopes，B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)。同源二聚特異性結合劑或抗體亦可如评〇1订等人，

Cancer Research 53:2560-2565 (1993)中所述使用異雙功能

交聯劑來製備。或者’特異性結合劑或抗體可經工程化，其具有雙重Fc區域且藉此可具有增強之補體溶解及adCC 能力。參見 Stevenson 等人，Drw笤 Dejz.gw 3:219-230 (1989)。已顯示CDR内之序列可導致抗體與]viHC II類結合且觸發不當輔助性T細胞反應。保守性取代可使特異性結合劑或抗體保留結合活性但降低其觸發不當T細胞反應之能力。亦涵蓋移除重鏈或輕鏈之N-末端20個胺基酸中之一或多在一些實施例中’本發明亦涵蓋產生具有改變的碳水化 159757.doc •99· 201206954 合物結構從而導致效應因子活性改變之抗體分子，包括展現改良ADCC活性之海藻糖化不存在或減少之抗體分子。多種實現此舉之方法在此項技術中係已知的。舉例而言，藉由使抗體分子與FcyRIII受體結合來介導ADCC效應因子活性，已顯示此取決於在CH2域之Asn-297處N-連接糖基化之碳水化合物結構。非海藻糖化抗體以增加的親和力結合此受體且比天然海藻糖化抗體更有效觸發FcyRIII所介導之效應功能。舉例而言，非海藻糖化抗體在已敲除α-1，6-海藻糖基轉移酶之CHO細胞中的重組性產生導致ADCC活性增加 100 倍的抗體（Yamane-Ohnuki 等人，Biotechnol Bioeng. 2004年9月5日；87(5):614 -22)。可經由降低此酶或其他酶在海藻糖化途徑中之活性（例如經由siRNA或反義 RNA處理）、使細胞株工程化以敲除該（等）酶或以選擇性糖基化抑制劑培養來實現相似效應（Rothman等人，Mol Immunol. 1989年 12 月；26(12): 1113-23)。某些宿主細胞株 (例如Lecl3或大鼠融合瘤YB2/0細胞株）天然產生具有較低海藻糖化程度之抗體。Shields等人，J Biol Chem. 2002年 7月 26 曰；277(30):26733-40 ; Shinkawa等人，J Biol Chem. 2003年1月31日；278(5):3466-73。亦已（例如經由在過度表現GnTIII酶之細胞中重組性產生抗體）確定對分碳水化合物含量之增加使ADCC活性增加。Umana等人，Nat Biotechnol. 1999年2月；17(2):176-80。已預期僅缺乏兩個海藻糖殘基中之一者可足以提高ADCC活性。Ferrara等人，J Biol Chem. 2005年 12月 5 曰）。 159757.doc -100- 201206954 其他共價修飾多肽或抗體之共價修飾亦包括於本發明之範疇内。若可適用，則其可藉由化學合成或藉由酶促或化學裂解多肽戋抗體來達成。可藉由使所無向胺基酸殘基與能夠與所選側鏈或N或C末端殘基反應之有機衍生試劑反應來類型之共價修飾。八他最通常使半胱胺醯基殘基與α_自代乙酸鹽（及相應胺）（諸如氯乙酸或氣乙醢胺）反應以得到羧甲基或羧醯胺基甲基衍生物。亦藉由與溴代三氟丙酮、α_溴·β(5咪唑基）丙酸、氣乙醯基磷酸鹽、Ν-烷基馬來醯亞胺、3_硝基_2•吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氣汞基苯曱酸鹽、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯_7_硝基苯并_2_氧雜_丨，3_二唑反應而得到半胱胺醯基殘基。因為焦碳酸二乙酯對於組胺醯基侧鍵相對具有特異性，所以藉由與該试劑在pH 5.5-7.0下反應而得到組胺酿基殘基。對 >臭本甲醯甲基溴化物亦適用；該反應較佳在〇 1 Μ 二曱胂酸鈉中在pH 6·0下進行。離胺酿基及胺基末端殘基與丁二酸或其他羧酸酸酐反應。使用該等試劑來衍生化具有逆轉離胺醯基殘基之電荷的效應。其他適用於衍生化含α_胺基之殘基的試劑包括諸如°比啶甲醯亞胺酸曱酯之亞胺基酯、磷酸吡哆醛、吡哆路、氣硼氫化物、三硝基苯磺酸、〇_曱基異脲、2,4-戊二酮及與乙醛酸鹽之轉胺酶催化反應。藉由與一或數種習知試劑（其中有笨甲醯甲醛、2,3-丁二 159757.doc •101- 201206954 酮、1，2-環己二酮及茚三酮）反應來修飾精胺醯基殘基。精胺酸殘基之衍生化由於胍官能基之高pKa而需要在鹼性條件下進行反應。此外，該等試劑可與離胺酸基團以及精胺酸ε-胺基反應。可進行酪胺醯基殘基之特異性修飾，特別關注藉由與芳族重氮化合物或四确基甲烧反應而將光譜標記引入赂胺酿基殘基中。最通常，使用Ν-乙醯D米峻及四石肖基甲烧來分別形成0-乙醯基酪胺醢基物質及3-硝基衍生物。使用以^或 1311碘化酪胺醯基殘基以製備用於放射免疫檢定之標記蛋白。藉由與碳化二亞胺（R-N.dbd.C.dbd.N-R’）反應來選擇性修飾羧基側基（天冬胺醯基或麩胺醯基）’其中R及R·為不同院基’诸如1-環己基-3-(2-嗎淋基-4-乙基）碳化二亞胺或1_乙基-3-(4-氮鏽·4,4-二甲基戊基）碳化二亞胺◦此外，將天冬胺酿基及麩胺醯基殘基藉由與銨離子反應轉化成天冬醯胺醢基及麵醯胺醯基殘基。常常分別將麩醯胺醯基及天冬醯胺醢基殘基去醯胺化以形成相應麵胺醯基及天冬胺醯基殘基。該等殘基係在中性或驗性條件下被去醯胺化。該等殘基之去醯胺化形式屬於本發明之範疇。其他修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯基或羥丁胺醯基殘基之羥基之磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化（τ. E. Creighton，Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co.，San 159757.doc •102· 201206954

Francisco，第79-86頁（1983))、N-末端胺之乙醯化及任何C 末端羧基之醯胺化。另一類型之共價修飾涉及使醣苷與特異性結合劑或抗體化學或酶促偶合。該等程序為有利的，因為其並不需要在具有N-或〇-連接糖基化之糖基化能力之宿主細胞中產生多肽或抗體。視所用偶合模式而定，糖可連接於（a)精胺酸及組胺酸、（b)游離羧基、（c)游離硫氫基（諸如半胱胺酸之彼等硫氫基）、（d)游離羥基（諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸之彼等羥基）、（e)芳族殘基（諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之彼等殘基）或（f)麩醯胺酸之醯胺基。該等方法描述於1987年9月11日公開之WO 87/05330以及Aplin及Wriston， CRC Crit. Rev. Biochem. ’ 第 259-306頁（1981)中。可以化學或酶促方式實現任何存在於多肽或抗體上之碳水化合物部分的移除。化學去糖基化需要將特異性結合劑或抗體暴露於化合物三氟甲烷磺酸或等效化合物。該處理導致除連接糖（N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳胺糖）外之大部分或所有糖裂解，同時使特異性結合劑或抗體保持完整。

Hakimuddin專人 ’ Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) 及 Edge等人，Anal，Biochem.，118: 131(1981)描述化學去糖基化。可如由 Thotakura等人，Meth. Enzymol. 138: 350 (1987)所描述藉由使用多種内切糖苷酶及外切糖苷酶來實現特異性結合劑或抗體上之碳水化合物部分的酶促裂解。對本發明之海帕西啶活性拮抗劑（包括抗海帕西啶抗體或海帕西啶變異體）的另一類共價修飾包含使多肽、特異 159757.doc -103- 201206954 性結合劑或抗體與多種非蛋白質聚合物（例如聚乙二醇、聚丙一醇、聚乙氧基化多元醇、聚乙氧基化山梨糖醇、聚乙氧基化葡萄糖、聚乙氧基化甘油、聚環氧烷或多醣聚合物（諸如葡聚糖））中之一者連接。該等方法在此項技術中係已知的，參見例如美國專利第4,640,835號、第4,496,689 號、第 4,301，144號、第 4,670,417號、第 4,791，192號、第 4，179,337 號、第 4,766,106 號、第 4，179,337 號、第 4,495,285號、第 4,609,546號或 EP 315 456。 V.基因療法可藉由使用此項技術中已知之任何合適方法經由離體、原位或活體内進行基因療法而實現將海帕西啶促效劑或拮抗劑輸送至適當細胞。舉例而言，對於活體内療法而言，可將編碼所需海帕西咬活性拮抗劑或海帕西咬表現抑制劑之核酸單獨地或與載體、脂質體或沈澱物結合直接注入個體中，且在一些實施例中可注入需要表現海帕西啶活性拮抗劑或海帕西咬表現抑制劑之位點處。對於離體治療而言，移出個體細胞’將核酸引入該等細胞中，且將經修飾細胞直接或（例如）以囊封於植入患者中之多孔膜内的方式返回至個體體内。參見例如美國專利第4,892,538號及第 5,283，187號。存在多種可用於將核酸引入活細胞中之技術。該等技術視是否將核酸活體外轉移至培養細胞中或活體内轉移至所欲宿主之細胞中而變化。適用於將核酸活體外轉移至哺乳動物細胞中之技術包括使用脂質體、電穿孔、顯微注射、 159757.doc -104· 201206954 細胞融合、化學處理、DEAE-葡聚糖及磷酸鹽沈澱法。其他活體内核酸轉移技術包括使用病毒載體（諸如腺病毒、疱疹單純I病毒、腺相關病毒或反轉錄病毒）轉染及基於脂質之系統。核酸及轉染試劑視情況與微粒締合。例示性轉染試劑或方法包括磷酸鈣或氣化鈣共同沈澱、DEAE-葡聚糖所介導之轉染、第四銨兩性DOTMA((二油醯氧基丙基）三曱銨溴化物，由GIBCO-BRL以脂質體（Lipofectin)形式商品化）（Felgner等人，（1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417 ; Malone等人，（1989) Proc. Natl Acad. Sci· USA 86，6077-6081);具有側接三甲銨頭部之親脂性麩胺酸二醋（Ito等人，（1990) Biochem. Biophys. Acta 1023, 124-132);可代謝親本脂質，諸如陽離子脂質二（十八烷基）酿胺基甘胺酿基精胺（DOGS, Transfectam, Promega)及二棕櫚醯基磷脂醯基乙醇戊基精胺（DPPES)(J. P. Behr (1986) Tetrahedron Lett. 27，5861-5864 ; J· P. Behr等人， (1989) Proc. Natl. Acad. Sci_ USA 86, 6982-6986);可代謝第四銨鹽（DOTB、曱基硫酸N-(l-[2,3-二油醯氧基]丙基）-N，N，N-三甲錄（DOTAP)(Boehringer Mannheim)、聚（伸乙基亞胺）（PEI)、二油醯酯、ChoTB、ChoSC、DOSC)(Leventis 等人，（1990) Biochim. Inter· 22，235-241); 3β[Ν-(Ν'，Ν，-二曱基胺基乙烷）-胺曱醯基]膽固醇（DC-Chol)、二油醯基磷脂醯基乙醇胺（ϋΟΡΕ)/3β[Ν-(Ν’,Ν’_二甲基胺基乙烷）-胺甲醯基]膽固醇（DC-Chol)—比一混合物（Gao等人，（1991) Biochim. Biophys. Acta 1065, 8-14);精胺、亞精胺、脂多 159757.doc -105- 201206954 胺（lipopolyamine)(Behr等人，Bioconjugate Chem，1994，5: 382-389);親脂性聚離胺酸（LPLL)(Zhou等人，（1991) Biochim. Biophys. Acta 939，8-18);具有過量構脂醯膽驗/ 膽固醇之[[(1，1，3,3-四甲基丁基）曱苯氧基]乙氧基]乙基]二甲基苄銨氫氧化物（DEBDA氫氧化物）(Ballas等人，（1988) Biochim. Biophys. Acta 939，8-18);漠化十六烧基三曱基銨（CTAB)/DOPE 混合物（Pinnaduwage 等人，（1989) Biochim. Biophys. Acta 985，33-37);與填脂醢乙醇胺混合之麩胺酸與DOPE、CTAB、DEBDA、溴化二（十二烷基）銨 (DDAB)及十八胺之親脂性二酯（TMAG)(Rose等人，（1991) Biotechnique 10，520-525) ； DDAB/DOPE(TransfectACE, GIBCO BRL·)及帶有月旨質之寡半乳糖。提高轉移效率之例示性轉染增強子試劑包括（例如）DEAE-葡聚糖、聚凝胺、溶酶體分裂性肽（Ohmori N I等人，Biochem Biophys Res Commun 1997年6月27曰；235(3):726-9)、基於軟骨素之蛋白聚糖、硫酸化蛋白聚糖、聚伸乙基亞胺、聚離胺酸 (Pollard Η等人，J Biol Chem，1998 273 (13):7507-11)、整合素結合性肽CYGGRGDTP、直鏈葡聚糖壬醣、甘油、••繫栓"於寡核苷酸之3'-末端核苷間鍵處之膽留醇基（Letsinger, R. L. 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:(17):6553-6)、溶血磷脂、溶血磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯乙醇胺及1-油醢基溶血構脂酿膽驗。在某些情形下，可能需要使用將含核酸之載體引至靶標細胞之試劑來輸送核酸。該等"靶向"分子包括對靶標細胞 159757.doc -106- 201206954 上之細胞表面膜蛋白具特異性的抗體或靶標細胞上之受體的配位體。當使用脂質體時，、结合於與内飲作用相關之細胞表面膜蛋白的蛋白質可用於靶向及/或促進吸收。該等蛋白質之實例包括對特定細胞類型具有嗜性之衣殼蛋白及其片段、在循環中經受内化之蛋白質之抗體及靶向細胞内定位且增強細胞内半衰期之蛋白質。在其他實施例中，可使用受體所介導之内飲作用。該等方法描述於（例如）贾口等人，1987或Wagner等人，1990中。關於目前已知之基因標記及基因療法方案之综述，參見Anders〇n 1992^亦參見 WO 93/25673及其中所引用之參考文獻。關於基因療法技術之其他綜述，參見Friedmann，Scienee，244 1275 1281 (1989) ; Anderson，Nature，增刊第 392卷，第 6679號，第 25-30 頁（1998) ; verma，Scientific American: 68_84 (1990) ;及Miller，Nature，357: 455460 (1992)。 VI.海帕西啶相關病症之診斷方法及使用海帕西啶拮抗劑之療法的監控亦提供用於診斷海帕西啶相關病症（諸如海帕西啶相關貧血症或其他海帕西啶過量或海帕西啶缺乏之疾病）的方法，及監控療法（包括使用海帕西啶活性拮抗劑或海帕西定表見抑制劑之療法）對於該疾病之有效性的方法。為確足海帕西啶相關貧血症之存在或不存在，使來自患者之生物試樣與本文中所揭示之抗海帕西啶抗體中之一或多者在足以允許形成免疫複合物之條件下及時間内接觸。隨後偵測抗海帕西啶抗體與生物試樣中之海帕西啶之間所形成的 159757.doc •107· 201206954 免疫複合物。藉由量測抗體與海帕西啶之間所形成的免疫複合物之量來量化試樣中海帕西咬之量。在某些方法中，將生物試樣自患者分離且以本文中所揭示之抗海帕西啶抗體中之一或多者培育，且高於某一臨限值之抗體_海帕西啶複合物之量與海帕西啶相關貧血症之存在相關聯，且低於該臨限值之量指示該患者不可能具有海帕西啶相關貧血症。舉例而言，正常範圍内之量指示患者不可能具有海帕西啶相關貧血症。當由某些檢定（亦即共同擁有之美國專利申請案第11/880,313號及國際專利申請案第 PCT7US2007/016477號中所描述的質譜分析技術，該等文獻之揭示内容以引用方式全部併入本文中）測定時血清海帕西啶之正常範圍通常小於1〇 ng/m卜但將視檢定及所測試群體之子集而變化。亦知:供區分炎性疾病與非炎性疾病之方法。為確定炎性疾病之存在或不存在，使來自患者之生物試樣與本文中所揭示之抗海帕西啶抗體中之一或多者在足以允許形成免疫複合物之條件下及時間内接觸。可使用此項技術中已知之各種免疫檢定，包括（但不限於）：使用諸如放射免疫檢定、ELISA(酶聯免疫吸附檢定）、"夾心"免疫檢定、免疫放射檢定（immunoradiometric assay)、凝膠擴散沈澱反應、免疫擴散檢定、原位免疫檢定（例如使用膠體金、酶或放射性同位素標記）、西方墨點法、沈澱反應、凝集檢疋（例如凝膠凝集檢定、血球凝集檢定）、補體固定檢定、免疫螢光檢定、蛋白質A檢定及免疫電泳檢定等之技術的 159757.doc •108· 201206954 競爭性及非競爭性檢定系統。在一實施例中，藉由偵測第一抗體上之標記來偵測抗體結合。在另一實施例中，藉由偵測第二抗體或試劑與第一抗體之結合來偵測第一抗體。在另一實施例中，標記第二抗體。許多用於偵測免疫檢定中之結合的方法在此項技術中係已知的且處於本發明之範嘴内。Harlow & Lane之Antibodies: A Laboratory Manual (1988)或最近版本；immunoassays: A Practical Approach, Oxford University Press, Gosling，J. P.(編）(2001)或最近版本；及 /或 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人）’其定期更新。該等檢定之實例通常涉及連接於表面或基質之抗體、所添加之患者血清及允許複合物形成所用之時間；用以移除未結合複合物之適當洗滌程序、繼之以允許複合物之偵測之第二抗體的添加（夾心EUSA)或用以偵測抗體表面上之自由海帕西啶結合位點的海帕西啶之可偵測型式（競爭ELISA)。如由上述方法所偵測，高於某 -臨限值之海帕西咬含量與炎性疾病之存在有關且低於該臨限值之含量指示患者*可能患有炎性錢^當海帕西啶含量在正常範圍内時患者不可能患有炎性疾病。西咬含量超過正常範圍(例如2〇 ng/ml)時，詳 ^ 2〇與1刪物1之間時患者可能患有炎性疾病。例: 海帕西咬相關炎性疾病包括癌性貧血症症、炎性貧血症、化療嘮狢& I 屄貧血

期、III期、IV期或V期）、東届（I期、II

— 末期腎病、慢性腎衰蝎、夯U 心臟衮竭、癌症、類充血性 &關郎炎、全身性紅斑性狼瘡 159757.doc •109- 201206954 症、克羅恩氏病、幽門螺祐押试β 门螺旋柃菌感染或其他細菌感毕、型肝炎、HIV及其他病毒性疾庙叙叱 ^ 疾病、動脈硬化、動脈粥樣硬化、肝硬化、胰腺炎、敗血滤、血病血管炎、鐵缺乏、低色素性小紅血球性貧血及海帕西啶過量病狀。在其他方法中，測試獲自患者之生物試樣的海帕西咬含量。使用本文中所揭示之抗海帕时抗體中之—或多者在足以允許形成免疫複合物之條件下及時間内培育生物試樣。隨㈣測生物試樣中海帕㈣與特異性結合於海帕西啶之抗體之間所形成的免疫複合物。用於該等方法中之生物試樣可為獲自患、者且預期含有海帕西咬之任何試樣。適當生物試樣包括血液、血清、血漿、尿及骨髓。適當抗體包括來自人類細胞、齧齒動物、兔、山羊、駱駝或任何其他物種之抗體。將生物試樣與抗體一起以反應混合物形式在足以允許於海帕西啶與對海帕西啶具有免疫特異性之抗體之間形成免疫複合物的條件下及時間内進行培育。舉例而言，可將生物試樣及一或多種抗海帕西啶抗體在4。〇下培育24_48小時。繼培育之後，測試反應混合物中免疫複合物之存在與否。可藉由多種已知技術（諸如放射免疫檢定（RIA)及酶聯免疫吸附檢定（ELISA))實現對抗海帕西啶抗體與存在於生物試樣中之海帕西啶之間所形成之免疫複合物的偵測。適當檢定在此項技術中係熟知的且詳細描述於學術文獻及專利文獻（Harlow及Lane, 1988)中。可使用之檢定包括（但不 159757.doc -110- 201206954 限於）雙單株抗體夾心免疫檢定技術（美國專利第4,376,1 10 號）；單株-多株抗體夾心檢定（wide等人，197〇); ”西方墨點方法（美國專利第4,452,901號）；標記配位體之免疫沈殿（Brown等人’ 1980);酶聯免疫吸附檢定（Raines&R〇ss, 1982);免疫細胞化學技術，包括使用螢光染料（]31>〇〇1^等人’ 1980)，及活性中和法（B〇wen_p〇pe等人，1984)。其他免疫檢定包括（但不限於）描述於美國專利第3,817,827號、第 3,850,752 號、第 3,9〇1，654 號、第 3,935,074 號、第 3,984’533 號、第 3,996,345 號、第 4 〇34 〇74 號及第 4,098,876號中之彼等免疫檢定。出於偵測目的，抗海帕西啶抗體可經標記或未經標記。未標記抗體可用於凝集檢定或與結合於免疫複合物之經標記偵測試劑（例如抗免疫球蛋白、蛋白質G、蛋白質A或凝集素及第二抗體或其抗原結合片段，該等者能夠與特異性結合於海帕西啶之抗體結合）組合使用。若抗海帕西啶抗體經標記，則報導基團（reporter gr〇up)可為此項技術中已知之任何適當報導基團，包括放射性同位素、螢光基團 (例如螢光素或若丹明（rhodamine))、發光基團、酶、生物素及染料顆粒。本身可直接偵測之標記包括螢光或發光染料、金屬或金屬螯合物、電化學標記、放射性核種（例如 32P、14C、1251、3H或1311)、磁性標記或珠粒（例如 DYNABEADS)、順磁性標記或比色標記（例如膠體金、有色玻璃或塑性珠粒）。該等可偵測標記可直接與抗海帕西啶抗體或偵測試劑接合或可與連接於抗海帕西啶抗體或偵 159757.doc 201206954 測試劑之珠粒或顆粒締合。可經由結合經標記特異性結合搭配物而制之標記包括生物素、異經基洋地黃毒武元 (digoxigenin)、麥芽糖、寡組胺酸、苯、苯基砂酸鹽、SSDNA或dsDNA。可藉由產生可㈣反應產物而間接偵測之間接;^ s己包括此項技術中所熟知之各種酶，諸如鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、黃嘌呤氧化酶、葡萄糖氧化酶或其他畴氧化酶或可分解適當受質以形成有色或螢光反應產物之螢光素酶。在某些檢疋中，將未標記抗海帕西啶抗體固定於一固體支撐物上以用作捕捉生物試樣中之海帕西啶之"捕捉劑"（或試劑）。固體支撐物可為一般熟習此項技術者已知之可連接抗體之任何物質。舉例而言，固體支撐物可為微量滴定盤中之測試孔或硝化纖維素或其他適當膜。或者，支撐物可為管狀物、珠粒、顆粒或盤狀物，諸如玻璃、玻璃纖維、乳膠或塑性材料（諸如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯或聚氣乙烯）或多孔基質。其他物質包括瓊脂糖、葡聚糖、聚丙烯醯胺、耐綸（nylon)、葡聚糖凝膠（Sephadex)、纖維素或多醣。支撐物亦可為磁性顆粒或纖維光學感應器，諸如揭示於（例如）美國專利第5,359,681號中之彼等支撐物。經固定之抗海帕西啶抗體可為多株抗體或一或多種單株抗體（諸如彼等本文中所述者）或多株抗體與一或多種單株抗體之組合。可使用多種熟習此項技術者已知之技術將抗體固定於固體支撐物上，該等技術詳細描述於專利及學術文獻中。在本發明之内容中，術語"固定"係指非共價締合（諸 159757.doc •112· 201206954 如吸附）及共價連接（其可為支撐物上之官能基與抗原之間直接鍵結或可為經由交聯劑鍵結）。涵蓋藉由吸附固定至微量滴定盤中之孔上或固定至膜上。在該等情況下，可藉由使抗海帕西啶抗體與固體支撐物在適當緩衝液中接觸適當長的時間來實現吸附。接觸時間隨溫度而變化，但通常為約1小時與約1天之間。一般而言，使塑料微量滴定盤 (包括聚苯乙烯或聚氣乙烯）之孔與量之範圍介於約1〇叫至約10 pg且較佳約100 ng至約1 的肽接觸足以固定足量之肽。繼固疋之後，通常將支撺物上之剩餘蛋白質結合位點阻斷。可使用一般熟習此項技術者已知之任何適當阻斷劑，包括牛血清白蛋白、TweenTM 2〇TM(sigma Chemical c。，st

Louis，Mo.)、熱鈍化正常山羊血清（NGSrbl〇tt〇(亦含有防腐劑、鹽及消泡劑之脫脂奶粉緩衝溶液p隨後使用懷疑含有海帕西啶之生物試樣培育支撐物。可應用純試樣，或更通常，可將試樣稀釋，通常稀釋於含有少量（〇1 重i /〇-5.0重量％)蛋白質（諸如BSA、NGS或之缓衝溶液中。一般而言，適當接觸時間（亦即培育時間）為一段足以偵測對於含有海帕西啶之試樣内之海帕西啶具有免疫特異性的抗體或抗原結合片段之存在的時間。較佳，接觸時間足以獲得為在結合與未結合抗體或抗體#段之間平衡時所獲得之結合水平《至少約95%的結合水平。一般熟 S此項技術者將s忍識到，可易於藉由檢定在一段時間内發生之結合的水平來確定實現平衡所必需之時間。在室溫 159757.doc •113· 201206954 下’約30分鐘之培育時間通常係足夠的。可隨後藉由使用適當緩衝液（諸如含有0.1% TweenTM 20 之PBS)洗滌固體支撐物來移除未結合試樣。結合於免疫複合物（藉由使捕捉劑與來自試樣之海帕西啶結合所形成）中之海帕西咬的偵測試劑可隨後被添加。該偵測試劑可為多株抗體或一或多種單株抗體（諸如彼等本文中所述者）或多株抗體與一或多種單株抗體（諸如彼等本文中所述者）或任何抗體之Fab部分之組合。偵測試劑可經直接標記，亦即其包含至少一種第一可偵測標記或"報導"分子。或者，偵測試劑可為未標記抗海帕西啶抗體。隨後藉由使經標記第二抗體或試劑與第一抗體結合來偵測此未標記抗海帕西啶 (第一）抗體《舉例而言，若第一抗體為鼠類免疫球蛋白，則第一抗體可為經標記抗鼠類免疫球蛋白抗體。同樣，若第一抗體為兔免疫球蛋白，則第二抗體可為經標記抗兔免疫球蛋白抗體。將偵測試劑與免疫複合物一起培育一段足以偵測結合抗體或其抗原結合片段之時間。可通常藉由檢定在一段時間内發生之結合的水平來確定適當的時間長度。隨後移除未結合標記或偵測試劑且使用適當檢定或分析儀器來偵測結合標§己或偵測試劑。用於偵測報導基團之方法視報導基團之性質而定。對於放射性標記，閃爍計數或自動放射攝影法通常為適當的。光譜法可用於偵測染料、發光或化學發光部分及各種色原體、螢光標記及類似物。可使用與不同報導基團（通常放射性或螢光基團或酶）偶合之抗生物素蛋 159757.doc -114- 201206954 白偵測生物素。通常可藉由添加受質（通常歷時特定一段時間）’接著對反應產物進行光譜或其它分析來偵測酶報導基團（包括辣根過氧化物酶、半乳糖㈣、驗性填酸酶及葡萄糖氧化酶與所用特定方法無關，大於本底（亦即對於獲自具有正常海帕西咬含量之個體之生物t式樣所觀測的含量）至少兩倍之結合偵測試劑的含量指示與海帕西啶之表現相關的病症之存在。在替代ϋ實施例中，試樣及偵測試劑可同時與捕捉劑接觸’而非依序添加。在另一替代性實施例中，可將試樣及偵測試劑一起預培育，隨後添加至捕捉劑中。其它變化易於為一般熟習此項技術者所瞭解。在另-實施例中，藉由競爭性結合檢^敎存在於試樣中之海帕西$的量。競爭性結合檢定依賴於經標記標準物 (例如海帕西咬多肽或其免疫反應性部分）與測試試樣分析物（海帕西咬多肽）競爭結合有限量之抗海帕西咬抗體的能力。在分離游離海帕西啶與結合海帕西啶之後，藉由經結合/未結纟海帕西啶與已知標準物之相_比率纟量化海帕西咬。測賴樣巾之海帕西❹肽之4與結合於抗體之標準物之量成反比。為便於測定經結合之標準物之量，通常將抗體固定於固體支撐物上以便可便利地使結合於抗體之標準物及分析物與保持未結合之標準物及分析物分離。因此’在或等實施例中，本發明涵蓋使生物試樣與經標記成熟海帕西。定(或其保留海帕西啶之抗原性之經標記片段)及結合於成熟海帕西蚊抗體接觸到貞測所形成之抗體標記 159757.doc •115· 201206954 海帕西啶複合物之量》製備與固體支稽·物或可偵測標記之接合物通常包含使用化學交聯劑。交聯試劑含有至少兩個反應性基團且通常被分成同官能交聯劑（含有相同反應性基團）與雜官能交聯劑 (含有不同反應性基團）》可經由胺、硫氫基偶合或非特異性反應之同雙官能交聯劑可獲自許多商業來源。馬來醯亞胺、烷基及芳基函化物、α__醯基及吡啶基二硫化物為硫醇反應性基團。馬來醯亞胺、烷基及芳基齒化物及^鹵醯基與硫氫基反應以形成硫醇喊鍵，而„比咬基二硫化物與硫氫基反應以產生混合型二硫化物。吡啶基二硫化物產物可裂解。亞胺基酯亦極適用於蛋白質-蛋白質交聯。雜雙g此交聯劑具有兩個或兩個以上允許依序與蛋白質之特定基團接合從而使不當聚合或自接合最小化之不同反應性基團》當胺之修飾成問題時亦使用雜雙官能試劑。胺有時可見於大分子之活性位點處且對於該等胺之修飾可能導致活性喪失。其他部分（諸如硫氫基、羧基、苯酚及碳水化合物）可為更合適之靶標。兩步策略允許偶合可容許使胺修飾成具有其他可及基團之蛋白質的蛋白質。多種雜雙s能交聯劑（為成功接合各自組合不同屬性）可市面上購得。在一端具㈣反應性且在另一端具有硫氮基反應性之交聯劑為十分普通的。若使用雜雙官能試劑，則最不穩定基團通#首先發生反應以確保有效交聯且避免不當聚合。如本文在實例27_28中所示’可用於診斷某些疾病病況 (諸如炎性貧血症及癌性貧血症）的指標為成熟海帕西咬 159757.doc • 116 - 201206954 (SEQ ID N0: 8之胺基酸6〇84)之含量而非原海帕西咬（卿 ID NO: 8之胺基酸25，之含量。因此，在―較佳實施例中，將結合於正確摺疊之成熟海帕西啶（SEQ ID N〇: 9)之抗體用作捕捉劑與偵測試劑。亦可使用結合於天然存在之末端截短型式(例如缺少成熟海帕西啶之至多兩個或至多五個N•末端胺基酸）的抗體。涵蓋捕捉劑與偵測試劑之不同組合。舉例而言，捕捉劑可為結合於成熟海帕西咬之第一抗原決定基之單株抗體且偵測試劑可為結合於成熟海秘西啶之第二抗原決定基之不同單株抗體。較佳使用對於海帕西咬之不同抗原決定基具有特異性之抗體以便最小化捕捉劑與偵測試劑之間的競爭或干擾。或者，捕捉劑可為結合於成熟海帕西咬之多株抗體且伯測試劑可為單株抗 ^ 4乍為另—替代性實施例，捕捉劑可為結合於成熟海帕。之早株抗體且偵測試劑可為多株抗體。在前述實施例之任一者中’捕捉劑或偵測試劑可為多株抗體與單株抗體之組合。捕施例中’將成熟海帕西咬特異性單株抗體用作 3劑或谓測試劑或用作兩者。成熟海帕西咬特異性抗體合原海帕西唆或以使得抗體可區分成熟海帕西咬海帕西咬之較低親和力結合於原海帕西唆。舉例而吕社此種單株抗體可結合於成熟海帕西咬之N-末端，或其了結合在原海帕西咬中不可偵測出（例如歸因於受前域遮蔽）的成熟海帕西啶之抗原决定基。、在利用結合於存在於成熟海帕㈣與原海帕㈣中之抗 159757.doc -117· 201206954 ==2抗體的實施例中，涵蓋視情況"的改二= —試樣中之總海帕西咬(原海… )之量中減去存在於試樣t之原海帕西咬之量來確定單獨成熟海帕西啶之述之彼等者之技了藉由在如同如上所株抗體來確定原海帕西咬之量。原海帕西咬特異性抗= 全不結合成熟海帕西咬或以使得抗體可區分原海帕西咬與成熟海帕西0定之較低親和力結合於成熟海帕西咬。舉例而言’該等抗體可結合於唯存在於海帕西咬之前結構域⑽q ID NO: 8之胺基酸25，中的線性或構形抗原蚊基。在該等實施例中’可依序或同時測定總海帕西。定及原海帕西咬之量°因為原海帕西々在▲清中迅速降解成海帕西咬，所以在某些實施例中將弗林（fudn)抑制劑添加至生物試樣中以防止或減少原海帕西咬的降解。㈣用結合於25·胺基酸成熟海帕西蚊單株抗體的一些實施例中’單株抗體並不結合降解產物(亦即海帕西啶-22及海帕西咬_20)。在用以偵測總海帕西啶及原海帕西啶之同時檢定的一個實施例中，捕捉劑為結合於存在於成熟海帕㈣與原海帕西咬中之抗原決定基之抗體’且同時使用兩㈣測試劑。第一偵測試劑為結合於存在於成熟海帕西啶與原海帕西啶中之抗原決定基之經標記抗體且第二偵測試劑為經不同標記之原海帕西啶特異性抗體。舉例而言，第一彳貞測試劑係以可在第一波長下偵測出之螢光染料標記，而第二偵測試 159757.doc -118- 201206954 劑係以可在第二波長下偵測出之螢光染料標記。因此，在此種實例中，捕捉劑將結合試樣令之總海帕西啶（成熟海帕西啶加原海帕西啶）’第一偵測試劑將偵測總海帕西啶之量且第一偵測試劑將偵測原海帕西啶之量。自總海帕西啶之量t減去原海帕西啶之量將獲得成熟海帕西啶之量。在其他替代性實施例中，可使用兩種不同捕捉劑·結合於存在於成熟海帕西啶與原海帕西啶中之抗原決定基之第一捕捉劑及作為原海帕西啶特異性抗體之第二捕捉劑，視情況使用結合存在於成熟海帕西啶與原海帕西啶中之抗原決定基之偵測試劑。關於進行同時檢定之其他實施例在此項技術中係熟知的，包括（例如）Khan等人，Clin_ Vaccine Immun〇1，13 ⑴ 45-52 中所描述之多路系統，其涉及差異編碼之螢光微珠套組。關於在單個表面上進行多個同時檢定之其他實施例包括具有複數個不連續、可尋址位置以便偵測複數個不同分析物之表面。該等格式包括蛋白質微陣列或 "蛋白質晶片"（參見例如Ng及Ilag，j Cell Mol. Med. 6. 329-340 (2002))及毛細管裝置（參見例如美國專利第 6,019,944號）。在該等實施例中，各不連續表面位置具有固定不同分析物於各位置處以便偵測之不同抗體。表面可或者具有一或多個固定在表面之不連續位置處之不連續顆粒（例如微粒或奈米顆粒），其中各組顆粒含有.針對不同分析物之不同捕捉劑。互補抗體對（結合於海帕西啶上之不同抗原決定基使得 I59757.doc -119- 201206954 配對適合於用於夾心檢定之抗體）係難以鑑別的。使用使競爭或干擾最小化之互補對可提高檢定之敏感度達20倍至 50倍。在一些實施例中，本發明之免疫檢定能夠量測範圍介於0.01 ng/mL至10 pg/mL之海帕西咬含量。適用於夾心免疫檢定之抗體對包括下列抗體對： (1) 當配對之一抗體為結合於與抗體1S1相同之抗原決定基或與抗體1S1競爭結合於SEQ ID NO: 9之成熟人類海帕西啶達至少約75%、80%、85%、90%或以上的抗體時，適當第二抗體可為： (a) 結合於與抗體23F11相同之抗原決定基或與抗體 23F11競爭結合於SEQ ID NO: 9之成熟人類海帕西啶達至少約75%、80%、85%、90%或以上的抗體；或 (b) 結合於與抗體15E1相同之抗原決定基或與抗體 15E1競爭結合於SEQ ID NO: 9之成熟人類海帕西啶達至少約75%、80%、85%、90°/。或以上的抗體；或 (c) 結合於與抗體12B9相同之抗原決定基或與抗體 12B9競爭結合於SEQ ID NO: 9之成熟人類海帕西啶達至少約75%、80%、85%、90%或以上的抗體； (2) 當配對之一抗體為結合於與抗體12B9相同之抗原決定基或與抗體12B9競爭結合於SEQ ID NO: 9之成熟人類海帕西啶達至少約75%、80%、85%、90%或以上的抗體時，適當第二抗體可為： (a)結合於與抗體18D8相同之抗原決定基或與抗體 18D8競爭結合於SEQ ID NO: 9之成熟人類海帕西啶違·•至少 159757.doc •120- 201206954 約75%、80%、85%、90°/。或以上的抗體；或 (b) 結合於與抗體19C1相同之抗原決定基或與抗體 19C1競爭結合於SEQ ID NO: 9之成熟人類海帕西啶達至少約75%、80%、85%、90%或以上的抗體；或 (c) 結合於與抗體19D12相同之抗原決定基或與抗體 19D12競爭結合於SEQ ID NO: 9之成熟人類海帕西啶達至少約75%、80%、85%、90%或以上的抗體；或 (d) 結合於與抗體19H6相同之抗原決定基或與抗體 19H6競爭結合於SEQ ID NO: 9之成熟人類海帕西啶達至少約75%、8 0%、85%、90%或以上的抗體；或 (e) 結合於與抗體1S1相同之抗原決定基或與抗體1S1 競爭結合於SEQ ID NO: 9之成熟人類海帕西啶達至少約 75%、80%、85%、90%或以上的抗體；或 (3)當配對之一抗體為結合於與抗體23F11相同之抗原決定基或與抗體23F 11競爭結合於SEQ ID NO·· 9之成熟人類海帕西啶達至少約75%、80%、85%、90%或以上的抗體時，適當第二抗體可為： (a) 結合於與抗體1 8D8相同之抗原決定基或與抗體 18D8競爭結合於SEQ ID NO: 9之成熟人類海帕西啶達至少約75%、80%、85%、90%或以上的抗體；或 (b) 結合於與抗體19C1相同之抗原決定基或與抗體 19C1競爭結合於SEQ ID NO: 9之成熟.人類海帕西啶達至少約75%、80%、85%、90%或以上的抗體；或 (c) 結合於與抗體19D12相同之抗原決定基或與抗體 159757.doc -121 - 201206954 19D12競爭結合於SEQ ID NO: 9之成熟人類海帕西啶達至少約75°/。、80%、85%、90%或以上的抗體；或 (d) 結合於與抗體19H6相同之抗原決定基或與抗體 19H6競爭結合於SEQ ID NO: 9之成熟人類海帕西啶達至少約75%、80%、85%、90%或以上的抗體；或 (e) 結合於與抗體1S1相同之抗原決定基或與抗體4E1 競爭結合於SEQ ID NO: 9之成熟人類海帕西啶達至少約 75%、80%、85%、90%或以上的抗體；或 (f) 結合於與抗體3B3相同之抗原決定基或與抗體3B3 競爭結合於SEQ ID NO: 9之成熟人類海帕西啶達至少約 75%、80%、85%、90%或以上的抗體； (4)當配對之一抗體為結合於與抗體15E1相同之抗原決定基或與抗體15E1競爭結合於SEQ ID NO: 9之成熟人類海帕西啶達至少約75%、80%、85%、90%或以上的抗體時，適當第二抗體可為： (a)結合於與抗體1S1相同之抗原決定基或與抗體1S1 競爭結合於SEQ ID NO: 9之成熟人類海帕西啶達至少約 75%、80%、85%、90%或以上的抗體。在一些實施例中，用於監控使用海帕西啶拮抗劑之療法之有效性的方法包括監控試樣中或動物（諸如人類患者）中之海帕西咬含量的變化。監控海帕西咬含量之方法可包含 (a)培育在使用本文中所揭示之抗海帕西啶抗體中之一或多者進行治療之前獲自患者的第一生物試樣，其中在足以允許免疫複合物形成之條件下及時間内進行培育；（b)偵測生 159757.doc -122- 201206954 物試樣中之海帕西啶與特異性結合海帕西啶之抗體或抗原結合片段之間所形成的免疫複合物；及視情況（c)在隨後時間（諸如繼使用本文中所揭示之抗海帕西啶抗體中之一或多者進行治療之後）使用采自患者之第二生物試樣重複步驟（a)及（b);及（d)比較對於第一及第二生物試樣所偵測之免疫複合物的數量β 其他監控方法包括量測海帕西啶與治療劑之間的複合物之血液（例如血清或血漿）循環含量及視情況存在於循環中之游離海帕西啶之量。舉例而言，可使用結合於複合物之治療抗體部分的抗人類F c抗體及結合於複合物之海帕西啶部分之"成對"抗海帕西啶抗體的Fab片段偵測海帕西啶與治療抗體之間的複合物。或者，可使用抗遺傳型抗體替代抗人類Fc抗體。作為另一替代性實施例，可使用含有非人類Fc(例如人類Fc經鼠類&置換）之抗海帕西啶抗體替代Fab片段。作為另-實例，可在自生物試樣中移除海帕西咬治療抗體複合物之後使用已固定於固體支㈣上之抗人類&抗體或抗遺傳型抗㈣測游離海帕西咬^隨後量測保持不與固體支撑物結合之游離海帕西咬之量。游離海帕西咬之該人量可反映·冶療抗體在移除可得循環海帕西咬方面之有^ 用於該等方法中之生物試樣可為獲自患者並將預期含有海帕西啶之任何試樣。例示性生物試樣包括血液血漿'尿及骨髓。可在開始治療之前或在治療方案之中途 159757.doc •123- 201206954 獲仵第一生物試樣。應以類似方式睹艏锟笙_ ^ ^ 在其他治療之後的某物試檨: °可在治療完柄或中途獲得第二生 =:制條件為至少一部分治療在第-與第二生物试樣的分離之間進行。如上所述進行兩種試樣之培育及_程序。第二 :樣中之免疫複合物之數量相對於第—試樣有所減少指示 :帕西s a量降低且反映治療成功。亦可以類似方式分析游離血清海帕西咬，且游離血清海帕西咬之減少指示治療成功。診斷方法或監控方法可適用之海帕西仙關病症、炎性疾病及鐵穩態疾病或病症包括（但不限於）非洲鐵過量症、 «地中海貧血症、阿兹海默氏症、貧灰症、癌性貧血症、 it眭病貧血症、炎性貧血症、動脈硬化或動脈粥樣硬化 (包括冠狀動脈病、腦血管疾病或周邊閉塞性動脈疾病）、共濟失調、與鐵有關之共濟失調、無鐵傳遞蛋白質貧血、癌症血漿銅藍蛋白缺乏症、化療誘發性貧▲症、慢性腎/ 腎病（I ' II、III ' IV或V期）（包括末期腎病或慢性腎衰竭）、肝硬化、典型血色素沈著症、膠原蛋白誘發性關節炎（CIA)、海帕西啶過量（高海帕西啶）之病狀、先天性紅細胞生成異常性貧血、充血性心臟衰竭、克羅恩氏病、糠尿病、鐵生物分布失調、鐵穩態失調症、鐵代謝紊亂、膜鐵轉運蛋白疾病、膜鐵轉運蛋白突變血色素沈著症、葉酸缺乏症、弗里德里希氏共濟失調、索性脊髓病、格拉希氏症候群 '幽門螺旋桿菌感染或其他細菌感染、哈勒沃登-施 159757.doc •124· 201206954 帕茨病、血色素沈著症、由轉鐵蛋白受體2突變引起之血色素沈著症、血紅素病、肝炎、肝炎（Br〇ck綜合征）、c型肝炎、肝細胞癌 '海帕西啶缺乏症、遺傳性血色素沈著症、mv或其他病毒性疾病、亨廷頓氏病、高鐵蛋白血症、低色素性小紅血球性貧血、血鐵過少症、抗騰島素症缺鐵性貧血症、缺鐵症、鐵過量症、海帕西啶過量之鐵缺乏病狀、年輕型血色素沈著症（HFE2)、多發性硬化症、轉鐵蛋白受體2、刪、企幼素、膜鐵轉運蛋白或其他鐵代謝基因之突變、新生兒血色素沈著症、與鐵有關之神經退化性疾病、骨質減少、骨質疏鬆症、胰腺炎、泛酸鹽激酶相關之神經退化性疾病、帕金森氏症、癩皮病 '異食癖、紫質症、遲發性皮膚紫質症、假腦炎、肺血鐵質沈積症、紅血球病症、類風濕性關節炎、敗血病、鐵粒幼紅細胞性貧血、全身性紅斑性狼瘡症、地中海貧血症、中間型地中海貧血、輸血性鐵過量、腫瘤、血管炎、維生素86 缺乏症、維生素B12缺乏症及/或威爾遜氏病。設定對於診斷本文争所述之疾病病況之合適臨限值及如本文中所述之預後監控的方法在此項技術中係熟知的。舉例而s，使用相同方案相對於來自充分代表性數目之患病個體（例如確認具有疾病或病狀之群體）之海帕西啶含量分析來自充分代表性數目之正常個體（例如未偵測出病狀的健康群體）之流體試樣令的海帕西啶含量。可確定使得區分大多數正常群體與大多數患病群體之臨限值截止點。或者，可根據資料確定陰性、不確定性及陽性結果之適用終 159757.doc -125- 201206954 點值。舉例而言，可確定包括大多數正常群體之海帕西咬但排除幾乎所有患病群體之正常範圍（指示陰性結果）。相應地，可確定包括大多數患病群體之海帕西啶但排除幾乎所有正常群體之範圍（指示陽性結果）。同樣，可確定使得區分患有炎性貧血症之群體中之海帕西咬含量與患有缺鐵性貧血症之群體中之海帕s咬含量的臨限i。適用終點值可指示患者患有炎性貧血症、缺鐵性貧血症或混合性貧血 ^臨限值之0適終點值可經確定以優化所需特異性或敏感性且亦可考慮到全部醫學及流行病學因素。欲考慮之因素包括實驗室測試之臨床目標及是否有必要有高陽性預測值或高陰性預測值以及疾病在測試群體中之流行率。 VII.海帕西啶活性拮抗劑之治療用途亦提供結合人類海帕西啶之海帕西啶活性拮抗劑（包括本文中所述之單株抗體）用以治療有需要之個體的用途。在例示性實施例中，該個體可能處於高海帕西啶含量、海帕西啶相關病症、鐵穩態失調症或貧血症風險之下或患有海帕西啶相關病症、鐵穩態失調症或貧血症。如本文中所用治療，，係指對於處於疾病或病症之風險之下或具有患上疾病或病症之傾向之個體的預防性治療與對於患有疾病或病症之個體的治療性治療。在預防性方法中投與治療劑可發生在不當疾病或病症之症狀表現之刖’使得該疾病或病症得以預防或其進展得以延緩。因此，當與預防性方法結合使用時，術語"治療有效性”意謂在治療之後少數個體（平均）出現不當疾病或病症 159757.doc -126- 201206954 或症狀之嚴重程度出現進展。、當與涉及在個體表現疾病或病症之症狀後投與治療劑的治療性方法結合使用時，術m时效性，，意謂在治療之後疾病或病症之-或多種病徵或錄得㈣善或消除。為達成治療目的，"哺乳動物，，係指任何歸類為哺乳動物之動物，包括人類、家畜及農畜以及動物園動物、競技動物或玩賞動物’諸如狗、馬、貓、牛等。該哺乳動物較佳為人類。如本文中所用，"海帕西咬相關病症"係指由破壞鐵穩態之異常海帕西咬含量（例如㈣於t血程度或所儲存鐵之海帕西啶過量或海帕西啶缺乏)所引起或與其相關聯的病狀。鐵穩態破壞可反過來導致繼發疾病，諸如f血症。急性或慢性發炎病狀可引起海帕西絲現上調，此可導致循環鐵含量降低且該循環鐵含量降低可導致貧血症或使現有貧血症惡化”列示性海帕西啶相關炎性疾病包括癌性貧血症、慢性病貧血症、炎性貧血症、化療誘發性貧血症 '慢性腎病（I期、Η期、m期、IV期或V期）、末期腎病、慢性腎衰竭、充血性心臟衰竭、癌症、類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡症、克羅恩氏病、間彻❹❹或其他細菌感染、C：型肝炎、及其他病毒性疾病、動脈硬化、動脈粥樣硬化、肝硬化、胰腺炎、敗血病、血管炎、鐵缺乏、低色素性小紅血球性貧血及海帕❸定過量病狀。如本文中所用’短語”鐵穩態疾病(或病症)"係指個體鐵含量需要調節之病狀。其包括海帕西咬相關病症；與高含 I59757.doc -127· 201206954 量海帕西啶不相關然而將受益於海帕西咬活性抑制之病狀，諸如不由海帕西啶所引起之鐵穩態破壞；當異常鐵吸收、再循環、代謝或排泄導致正常鐵血液含量或組織分布遭受破壞時所產生之疾病；當鐵失調為另一疾病或病狀 (諸如發炎、癌症或化療）之後果時所產生之疾病；由異常鐵血液含量或組織分布引起之疾病或病症；及可藉由調節鐵含量或分布而治療之疾病或病症。可導致海帕西咬過量之該等鐵穩態疾病或病症、海帕西咬相關病症及發炎病狀的非限制性實例包括非洲鐵過量症、α地中海貧血症、阿兹海默氏症、貧血症、癌性貧血症、慢性病貧血症、炎性貧血症、動脈硬化或動脈粥樣硬化（包括冠狀動脈病、腦血管疾病或周邊閉塞性動脈疾病）、共濟失調、與鐵有關之共濟失調、無鐵傳遞蛋白質貧血、癌症、血漿銅藍蛋白缺乏症、化療誘發性貧血症、慢性腎/腎病(1、n、m、w 或期?(包括末期腎病或慢性腎衰竭)、肝硬化、典型血色 1 '症膠原蛋白誘發性關節炎（CIA)、海帕西D定過量 (南海帕西咬）之症扯届狀、先天性紅細胞生成異常性貧Α、充血性心臟衰竭、吞s m 兄撕禮能& 兄羅恩氏病、糖尿病、鐵生物分布失調、鐵穩態失調症、4揉運蛋白空I 棄亂、膜鐵轉運蛋白疾病、膜鐵轉逆赏曰犬變血色去、、士 — 、此耆症、葉酸缺乏症、弗里德里希氏乒濟失調、索性脊髓， ^ ^ ^ ^ '、格拉希氏症候群、邊/7蜞漩#磨咸呆双卉他細菌感迅 *、、5勒沃登·施帕茨病、血色素沈菩症、由轉鐵蛋白I ^考 ^ ^ 又體2突變引起之血色素沈著症、血紅素病、肝炎、肝炎m 、、Ur〇ck綜合征）、c型肝炎、肝細胞癌、遺 159757.doc 201206954 傳性血色素沈著症、HIV或其他病毒性疾病、亨廷頓氏病、高鐵蛋白血症、低色素性小紅血球性貧血、血鐵過少；抗胰島素症、缺鐵性貧也症、缺鐵症、鐵過量症、海帕西咬過量之鐵缺之病狀、年輕型血色素沈著症（翻2)、多發性硬化症、轉鐵蛋白受體2、HFE、血幼素、膜鐵轉運蛋白或其他鐵代謝基因之突變、新生兒血色素沈著症、與鐵有關之神經退化性疾病、ff減少、骨f疏鬆症、肤腺炎、泛酸鹽激酶相關之神經退化性疾病、帕金森氏症、癩皮病、異食癖、紫質症、遲發性皮膚紫質症、假腦炎、肺血鐵質沈積症、紅血球病症、類風濕性關節炎、敗血病、鐵粒幼紅細胞性貧血、全身性紅斑性狼瘡症'地中海貧血症、中間型地中海貧血、輸血性鐵過量、腫瘤、血管炎、維生素B6缺乏症、維生素B12缺乏及/或威爾遜氏病。與鐵調節破壞有關之非炎性病狀包括（但不限於）維生素 B6缺乏、維生素312缺乏、葉酸缺乏症、癩皮病、索性脊髓病、假腦炎、巴金森氏病（Fasano等人，J. 謂 96:909 (2006)及 Kaur 等人’3:327 (2004))、阿茲海默氏症、冠心病、骨質減少及骨質疏鬆症 (Guggenbuhl等人，/«ί· 16:1809 (2005))、血紅素病及其他紅血球代謝病症（Papanikolaou等人， 105:4103 (2005))及周邊閉塞性動脈疾病。各種其他鐵指標及其濃度正常範圍列於表2中。 159757.doc -129- 201206954 表2 鐵指標 -- --- 正常含量（範圍）血清鐵 50-170 pg/dL --- 血紅素 11.5-18 g/dL --- 血容比 37-54% ~~~~~' 紅血球計數(RBC) 4.6-6.2 X 1012細胞/公升(男性）〜-4.25-5.4 X 1012細胞/公升(女性）平均红血球血紅素量(MCH) 27-32 pg 〜' :红血球血紅素平均濃度(MCHC) 32-36% - 紅血球平均體積(MCV) 80-96 fL --- 紅血球分布寬度(RDW) 11.5-14.5%(電阻抗法)或 l〇.2-ll.8%(雷射^Γ 網狀血球計數 18-158 X 10'細胞/公升 (對於男性0.8-2.5% ;對於女性〇_8-40/〇) 總鐵結合力(TIBC) 250-450 pg/dL 轉鐵蛋白鐵飽和百分率(Tsat) 15-50% 鐵蛋白 12-120 pg/L 葉酸 3-16 ng/mL(血清)及 130-628 ng/mL(紅血球）維生素B12 200-900 pg/ml 患者之鐵指標含量超出表2中所列正常範圍指示該患者可受益於使用海帕西啶活性拮抗劑之治療。因為海帕西啶在鐵穩態中具有重要作用，所以海帕西唆含量及活性將與鐵穩態之破壞及/或鐵指標相關聯。高海帕西咬含量與低於表2中所示正常範圍之血清鐵含量、低血紅素及血容比、低或正常Tsat及高或正常鐵蛋白值、及c-反應性蛋白 (CRP)升高或其他發炎標記所測得之高發炎病況相關聯。如本文中所用，短語海帕西咬活性拮抗劑之"治療有效量’'係指造成所需治療效應（亦即提供"治療功效"）之量。例示性治療效應包括循環鐵含量增加或鐵利用性提高、紅血球計數提高、紅血球平均細胞容積增加、紅血球血紅素含量提高、血紅素增加（例如增加20.5 g/dL)、血容比提高、 Tsat提高、網狀血球計數提高、網狀血球平均細胞容積提 159757.doc •130· 201206954 间或正常化、網狀血球血紅素含量提高、或血清或血漿中之游離海帕西啶含量降低、或上述參數之任一者正常化。 :類參數恢復至正常範圍不為治療功效所必需；舉例而言，在正常方向上可測量之變化（提高或降低）可由臨床醫師考慮為所需之治療效應。當用於個別活性成份單獨投與時，該術語係指該單獨成份。當用於組合時，該術語係指產生治療效應之各活性成份之組合量，無論是組合、連續或同時投與舉例而言，在海帕西咬活性拮抗劑（或海帕西啶表現抑制劑）與紅血球生成刺激劑連合投與之態樣中’治療有效量意純高或正常化上述參數之任n组合量。為f於診斷患者，諸如圖9B之決策樹可用於解釋海帕西咬含量’ 可用α輔助使用纟或解釋者決定治療療程及濃度讀數之顯著性。_海帕西錢在具有炎症鐵過量及膜鐵轉運蛋白疾病之患者中升高，在患有血色素沈著症、血紅素病及其他红血球病症之患者中受到抑制。圖9Β之決策樹顯示海帕西啶含量之測量如何簡化懷疑患有鐵代謝病症之患者的診斷及/或評估。圖9八展示在不測量海帕西唆2 量之情況下的決策樹評估。用於本文中所述之治療之組合物及本文申个又甲所述之治療方法可利用-或多帛單紹吏用或與其他治療劑組合使用以獲得所需效應的海帕西啶活性拮抗劑（或海帕西咬表現抑制劑）。 Ρ ’ 組合療法 159757.doc •131· 201206954 另外可有利地將兩種或兩種以上抗體（其結合於相同或不同靶標抗原）共同混合或將本發明之抗體與第二治療劑共投與以提供改良功效。同時投與兩種治療劑並不需要同時或藉由相同途徑投與該等試劑，只要在該等試劑發揮其治療效應期間的時段存在重疊即可。涵蓋同時或依序投與，如在不同日或週投與。在例示性實施例中，本發明之方法包括投與單個抗體以及不同抗體之組合或"混合物"。該等抗體混合物可由於其含有利用不同效應機制之抗體而具有某些優勢。該等呈組合形式之抗體可展現協同治療效應。尤其涵蓋使用海帕西啶活性拮抗劑（或海帕西啶表現抑制劑）及紅血球生成刺激劑之組合療法。在各種實施例中，海帕西啶活性拮抗劑（或海帕西啶表現抑制劑）及紅血球生成刺激劑可用於改善患有貧血症之患者的治療。詳言之，對尤其諸如紅血球生成素或其類似物（依泊汀α、依泊汀β、達貝泊汀(X)之紅血球生成刺激劑療法具有低反應性 (包括無反應）之患者將受益於使用海帕西啶活性拮抗劑或海帕西啶表現抑制劑的聯合治療。在一實施例中，組合療法包括使用至少一種結合於人類海帕西啶之抗體及至少一種紅血球生成刺激劑的治療。亦涵蓋使用海帕西啶活性拮抗劑（或海帕西啶表現抑制劑）及鐵螯合劑（使鐵儲存量於體内進行再分配）之組合療法。鐵螯合劑為能夠結合鐵且自組織或循環中移除鐵之試劑。實例包括去鐵胺（DeSferal®)及去鐵斯若（deferasir〇x) 159757.doc •132· 201206954 (Exjade®)及去鐵酮（1，2-二甲基_3_羥基吡啶_4酮）。在一些實施例中，海帕西啶活性拮抗劑（或海帕西咬表現抑制劑）及紅血球生成刺激劑可用於改善患有繼發於輸血依賴性鐵過量之鐵負荷病症或具有鐵分布不均病症（諸如弗里德里希氏共濟失調）之患者的治療。如本文中所用，”紅血球生成刺激劑"意謂直接或間接導致紅血球生成素受體活化（例如藉由結合於受體且導致受體之二聚化或藉由刺激内源性紅血球生成素表現）之化合物。紅血球生成刺激劑包括結合於紅血球生成素受體且活化紅血球生成素受體之紅企球生成素及其變異體、類似物或衍生物；結合於紅血球生成素受體且活化該受體之抗體；或結合於紅血球生成素受體且活化紅血球生成素受體之肽；或視情況分子量小於約1000道爾頓且結合於紅血球生成素受體且活化紅血球生成素受體之小分子有機化合物。紅企球生成刺激劑包括（但不限於）依泊汀α、依泊江 β、依泊灯δ '依泊汀ω、依泊汀〖、依泊汀ζ及其類似物、聚乙二醇化紅血球生成素、胺曱醯基化紅血球生成素、模擬肽（包括EMPl/hematide)、模擬抗體及HIF抑制劑（參見美國專利公開案第2005/0020487號，其揭示内容以引用方式全部併入本文中）。例示性紅血球生成刺激劑包括紅血球生成素、達貝泊汀（darbepoetin)、紅血球生成素促效劑變異體及結合且活化紅血球生成素受體之肽或抗體（且包括美國專利申請公開案第2003/0215444號及第2006/0040858 號中所報導之化合物，該等文獻中之每一者之揭示内容以 159757.doc -133· 201206954

引用方式全部併入本文中）以及如以下專利或專利申請案中所揭示之紅血球生成素分子或其變異體或類似物，該等文獻各自以引用方式全部併入本文中：美國專利第 4,703,008 號、第 5,441，868 號、第 5,547,933 號、第 5,618,698 號、第 5,621,080 號、第 5,756,349 號、第 5,767,078 Μ 、第 5,773,569 號、第 5,955,422 號、第 5,830,851 號、第 5,856,298 號、第 5,986,047 號、第 6,030,086 號、第 6,310,078 號、第 6,391,633 號、第 6,583,272 號、第 6,586,398 號、第 6,900,292 號、第 6,750,369 號、第 7,030,226 號、第 7,084,245 號、第 7,217,689 號；PCT 公開案第 WO 91/05867 號、第 WO 95/05465號、第 WO 99/66054號、第 WO 00/24893號、第 WO 01/81405號、第 WO 00/61637號、第 WO 01/36489號、第 WO 02/014356號、第 WO 02/19963號、第 WO 02/20034 號、第 WO 02/49673 號、第 WO 02/085940 號、第 WO 03/029291號、第 WO 2003/055526號、第 WO 2003/084477 號、第 WO 2003/094858號、第 WO 2004/002417號、第 WO 2004/002424 號、第 WO 2004/009627 號、第 WO

2004/024761 號、第 WO 2004/033651 號、第 WO 2004/035603 號、第 WO 2004/043382 號、第 WO 2004/101600 號、第 WO 2004/101606 號、第 WO 2004/101611 號、第 WO 2004/106373 號、第 WO 2004/018667 號、第 WO 2005/001025 號、第 WO 2005/001136 號、第 WO 2005/021579 號、第 WO 159757.doc -134- 201206954

2005/025606 號第 WO 2005/032460 號、第 WO 2005/051327 號第 WO 2005/063808 號第 WO 2005/063809 號、第 WO 2005/070451 號第 WO 2005/081687 號 \ 第 WO 2005/084711 號第 WO 2005/103076 號第 WO 2005/100403 號、第 WO 2005/092369號、第WO 2006/50959號' 第 WO 2006/02646 號、第WO 2006/29094 號 :及美國公開案第 US 2002/0155998 號第 US 2003/0077753 號 % 第 US 2003/0082749 號第 US 2003/0143202 號第 US 2004/0009902 號 > 第 US 2004/0071694 號第 US 2004/0091961 號第 US 2004/0143857 號第 US 2004/0157293 號、第 US 2004/0175379 號第 US 2004/0175824 號第 US 2004/0229318 號第 US 2004/0248815 號第 US 2004/0266690 號第 US 2005/0019914 號第 US 2005/0026834 號、第 US 2005/0096461 號第 US 2005/0107297 號第 US 2005/0107591 號第 US 2005/0124045 號第 US 2005/0124564 號第 US 2005/0137329 號第 US 2005/0142642 號、第 US 2005/0143292 號、第 US 2005/0153879 號、第 US 2005/0158822 號、第 US 2005/0158832 號第 US 2005/0170457 號 > 第 US 2005/0181359 號第 US 2005/0181482 號第 US 2005/0192211 號第 US 2005/0202538 號第 US 2005/0227289 號、第 US 2005/0244409 號 > 第 US 159757.doc -135- 201206954 2006/0088906號、第 US 2006/0111279號。紅血球生成素包括（但不限於）包含如SEQ ID NO: 72中所示之胺基酸序列的多肽。SEQ ID NO: 72之胺基酸1至165 構成任何命名為依泊汀之分子（例如依泊汀α、依泊汀β、依泊汀δ、依泊汀ω、依泊汀ι、依泊汀γ、依泊汀ζ及其類似物）之成熟蛋白質。另外，依泊汀亦包括經一或多種水溶性聚合物（諸如聚乙二醇（包括PEG-EPO-β))化學修飾的上述依泊汀中之任一者。亦涵蓋與SEQ. ID NO: 72具有 65% ' 70% ' 75% ' 80% ' 85% ' 90% ' 91% ' 92% ' 93% ' 94%、95%、96%、97%、98%或99%—致性且仍保持紅血球生成活性之紅血球生成素類似物。重組性人類紅血球生成素之例示性序列、製造、純化及用途描述於若干專利公開案中，包括（但不限於）Lin美國專利4,703,008及Lai等人美國專利4,667,016，該等專利中之每一者以引用方式全部併入本文中。達貝泊汀為在 rHuEPO之胺基酸序列中具有向兩種其他碳水化合物鏈提供之五個變化的高糖基化紅血球生成素類似物。更特定言之，達貝泊汀α在SEQ ID NO: 72之胺基酸殘基30及88處含有兩種其他N-連接碳水化合物鏈。達貝泊汀及其他紅血球生成素類似物之例示性序列、製造、純化及用途描述於若干專利公開案中，包括Strickland等人，91/05867、Elliott 等人，WO 95/05465、Egrie等人，WO 00/24893 及 Egrie 等人，WO 01/81405，該等公開案之每一者以引用方式全部併入本文中。天然存在或類似多肽之衍生物包括彼等經化 159757.doc •136· 201206954 學修飾以（例如）連接水溶性聚合物（例如聚乙二醇化）、放射I·生核種或其他診斷性或靶向性或治療部分之衍生物。術浯紅血球生成活性"意謂如在活體内檢定（例如低氧紅血球增生小鼠檢定）中所證明之刺激紅血球生成之活性。參見例如 Cotes及Bangham，心⑼〜191:1〇65 (1961)。醫藥調配物之投與及製備在某些實施例中，可將用於實施本發明之方法之海帕西才α抗劑或抗體調配於包含適合於所需輸送方法之載劑的醫藥組合物中。合適載劑包括#與海帕西咬活性括抗劑或抗體組合時保持海帕西啶之高親和力、结合性且不與個體免疫系統反應的任何物質。實例包括（但不限於）若干標準醫藥載劑（諸如無菌磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液、抑菌水及其類似物）中之任一者。可使用多種水性載劑，例如水、緩衝水、0.4%生理食鹽水、〇 3%甘胺酸及其類似物且可包括經受適度化學修飾之穩定性增強之其他蛋白質（諸如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等）或其類似物。調配物中之例示性抗體濃度可介於約〇·1 mg/ml至約18〇 mg/ml或約〇」mg/mL至約5〇 mg/mL、或約〇5 25 mg/mL或者約2 mg/mL至約10 mg/mL·之範圍内。可在pH 緩衝溶液中（例如在pH值範圍介於約4.5至約6.5或約4.8至約5.5或者約5.〇時）製備抗體之水性調配物。適合於此範圍内之PH值之緩衝液的實例包括乙酸鹽（例如乙酸鈉）、丁二酸鹽（諸如丁二酸鈉）、葡糖酸鹽、組胺酸、檸檬酸鹽及其他有機酸緩衝液。緩衝液濃度視（例如）緩衝液及調配物之 159757.doc •137- 201206954 所需等滲性而可為約丨mM至約· mM或約1G瘦至約6〇 mM。亦可使抗體穩定之滲透劑可包括於調配物中。例示性滲透劑包括多元醇’諸如甘露糖醇、蔗糖或海藻糖。儘管高滲或低滲溶液可為合適的，但水性調配物較佳為等滲的。調配物中之彡元醇之例示性濃度可介於約1 w/v%至約15 W/V°/。之範圍内。亦可將界面活性劑添加至抗體調配物中以降低所調配抗體之聚集且/或最小化微粒於調配物中之形成且/或降低吸附。例不性界面活性劑包括非離子界面活性劑，諸如聚山梨醇酯（例如聚山梨醇酯2〇或聚山梨醇酯8〇)或泊洛沙姆 (p〇loxamers)(例如泊洛沙姆188)。界面活性劑之例示性濃度可介於約0.001 w/v%至約0 5 w/v%或約〇〇〇5 。至約 0.2 w/v%或者約〇·〇〇4 w/v%至約0.01 w/v%之範圍内。在一實施例中，調配物含有以上所確定之試劑（亦即抗體、緩衝液、多元醇及界面活性劑）且基本上不含一或多種防腐劑，諸如苄醇、苯盼、間甲酚、氯丁醇及苄索氣録 (benzethonium C1)。在另一實施例中，防腐劑可（例如）以範圍介於約0.1%至約2%或者約0.5%至約1%之濃度包括於調配物中。一或多種其他醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑（諸如彼等描述於Remingt〇n，s pharmaceutieal Sciences第16版，〇s〇i，八.編（1980)中者）可包括於調配物其限制條件為其並未不利地影響調配物之所需特徵。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對受 159757.doc -138· 201206954 體無毒性且包括：其他缓衝劑；共溶劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；螯合劑，諸如EDTA ;金屬複合物 (例如Zn_蛋白複合物）；可生物降解聚合物，諸如聚酯；及/ 或鹽形成性平衡離子，諸如鈉。藉由使具有所需純度之抗體與可選生理上可接受之栽劑、賦形劑或穩定劑（Remingt〇n.s pharmaceutical以“如以第16版，〇sol，a.編（198〇))混合來製備海帕西啶活性拮抗劑或抗體之治療調配物以便呈凍乾調配物或水溶液形式儲存。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對觉體無毒性且包括：緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氡化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐齊U諸如十八烷基二甲基苄基氣化銨；氯化六羥季銨丨氣节烷錄、f纽錄n 丁醇或㈣；絲對經基苯甲酸酯，諸如對經基苯曱酸甲醋或對經基笨甲酸丙酿；兒茶紛；間苯二盼；環己醇；3·戊醇；及間甲紛）；低分子量 (低於約10個殘基）多肽；蛋白質，諸如企清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶嗣；胺基 I，諸如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單酿、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、麥芽糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA ;糖類’諸如庶糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；鹽形成性抗衡離子’諸如鈉；金屬複合物(例如Zn_蛋白複合物广及/ 或非離子表面活性劑，諸如TWEENTM、PLUR0NICSTM或聚乙二醇(PEG)。 159757.doc •139· 201206954 在一實施例中，合適調配物含有與滲透化且穩定化之滲透劑（諸如多元醇、山梨糖醇、蔗糖或氣化鈉）組合之等滲緩衝液（諸如磷酸鹽、乙酸鹽或TRIS緩衝液）。該滲透劑之一實例為5%山梨糖醇或蔗糖。此外，調配物可視情況包括界面活性劑以便防止聚集且穩定在〇〇1至〇〇2重量/體積 %下。調配物之pH值可介於4.5_6.5或4.5-5.5之範圍内。抗體之醫藥調配物之其他例示性描述可見於us 2003/0113316及美國專利第6，171，586號中，該等專利各自以引用方式全部併入本文中。本文中之調配物亦可含有一種以上為所治療之特定適應症所必需的活性化合物，較佳含有彼等具有彼此並無不利影響之互補活性的活性化合物。舉例而言，可能需要進一步提供免疫抑制劑。該等分子適當以組合形式以對所欲目標有效之量存在。亦可（例如）分別藉由凝聚技術或界面聚合將活性成份包埋於所製備之微膠囊（例如經曱基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸曱酯）微膠囊）中，包埋於膠狀藥物輸送系統（例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米囊劑）或巨乳液中。該等技術揭示於Remingt()n，s

Pharmaceutical Sciences，第 16版，Osol，A.編（1980)中〇亦涵蓋抗體之懸浮液及晶體形式。製造懸浮液及晶體形式之方法為熟習此項技術者已知。欲用於活體内投藥之調配物必須為無菌的。在一些實施例中’本發明之組合物可藉由習知熟知殺菌技術殺菌。舉 159757.doc -140- 201206954 例而言’易於藉由經由無菌過濾膜進行過濾來實現殺菌。所得溶液可經封裝以供使用或在無菌條件下過濾且凍乾，在投與之前將凍乾製劑與無菌溶液組合。通常使用冷凍乾燥過程以穩定多肽以便長期儲存，尤其當多肽在液體組合物中相對不穩定時。冷凍乾燥循環通常由三步組成：冷凍、第一次乾燥及第二次乾燥；Williams 及 Polli，Journal of Parenteral Science and Technology，第 38卷’第2期，第48-59頁（1984)。在冷凍步驟中，冷卻溶液直至其充分冷凍。在此步驟時溶液中之體積水形成冰。在藉由使用真空降低腔室壓至低於冰之蒸氣壓來進行之第一次乾燥階段冰昇華。最終，在第二次乾燥階段在低腔室厘及南存放溫度下移除吸附水或結合水，該過程產生稱為凍乾塊之物質。此後可在使用之前將該塊復水。儘管抗菌劑之稀溶液有時用於產生用以非經腸投藥之藥物，但凍乾物質之標準復水規範為添回大量純水（通常相當於在冷凍乾燥期間所移除之體積）；Chen，Drug

Development and Industrial Pharmacy，第 18卷，第 11 及 12 期，第 1311-1354頁（1992)。在某些情況下已指示賦形劑充當凍乾產物之穩定劑； Carpenter 等人 ’ Developments in Biological Standardization，第 74 卷，第 225_239 頁（1991)。舉例而言’已知賦形劑包括多元醇（包括甘露糖醇、山梨糖醇及甘油）；糖（包括葡萄糖及蔗糖）；及胺基酸（包括丙胺酸、甘胺酸及麩胺酸）。 159757.doc -141 - 201206954 此外’多元醇及糖亦通常用以保護多肽免於冷凍及乾燥所引發之損傷且以乾燥狀態增強儲存期間之穩定性。一般而吕’糖（詳言之雙醣）在冷凍乾燥過程中與在儲存期間為有效的。亦報導其他類別之分子（包括單醣及雙醣及諸如 PVP之聚合物）作為凍乾製品之穩定劑。為用於注射，醫藥調配物及/或藥物可為適合於以如上所述之適▲溶液復水之粉末。該等實例包括（但不限於）冷凍乾燥、旋轉乾燥或喷霧乾燥粉末、非晶形粉末、顆粒、沈澱物或微粒。為用於注射，調配物可視情況含有穩定劑、pH調節劑、界面活性劑、生物可用性改質劑及該等試劑之組合。可製備持續釋放性製劑。持續釋放性製劑之合適實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物的半透性基質，該等基質呈成型物品形式，例如薄膜或微囊。持續釋放性基質之實例包括聚酯、水凝膠（例如聚（2_羥乙基_甲基丙烯酸酯）或聚（乙烯醇））、聚乳酸交酯（美國專利第3 773,919號）、^麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解伸乙基-乙酸乙烯酯、諸如Lupron Depot™(由乳酸_乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林（leuprolide acetate)組成之可注射性微球體）之可降解乳酸-乙醇酸共聚物及聚_D-(-)_3_經丁酸。儘管諸如伸乙基-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物能夠經1〇〇天釋放分子，但某些水凝膠經更短時限釋放蛋白質。當膠囊化抗體長時間保留於身體内時’其可由於暴露於37〇c下之濕氣而變性或凝集從而導致生物活性喪失及免疫原性可能 159757.doc -142- 201206954 之變化。可視所涉及之機制而設計合理方案以便穩定化。舉例而言，若發現聚集機制為經由硫代二硫化物互換而形成分子間υ鍵，則可藉由修飾硫氫基殘基、；東乾酸性溶液、控制水份含量、使用適當添加劑及產生特定聚合物基質組合物來實現穩定化。在某些實施例中，本發明之調配物可經設計成短效、快速釋放、長效或如本文中所述之持續釋放。因此，醫藥調配物亦可經調配以便控釋或緩释。組合物之治療有效量將變化且視疾病之嚴重程度及欲治療之個體之體重及全身狀況而定，但通常介於每次施用約 Μ 至·約⑽mg/kg或約1Q柯心至約％或約〇 i mg/kg至約10 mg/kg或約i mg/kg至約ι〇體重之範圍内。可根據需要視病症或病狀之反應及個體對療法之耐受性而每曰、隔曰、每週、每月兩次、每月或在頻率上更多或更少投藥。可需要經較長時間(諸如4、5、6、7、8、Μ 或㈣或更長時間）之維持劑量直至病症症狀之所需抑制發生且可根據需要調節劑量。該廉法之進展易於藉由習知技術及檢定加以監控。可視疾病之病狀、個體之年齡、體重、全身健康狀況、 :別及飲食、投藥間隔時間、投藥途徑、排出率及藥物組。而調卽特㈣量。含有有效量之以上劑型之任_者較佳處於常規實驗之範圍内且因此較佳處於本發明之料内。藉^任何合適方式全身或局部投與耗西咬活性枯抗劑或抗體’該等方式包括經由非經腸、皮下、腹膜内、肺内 159757.doc •143· 201206954 及鼻内且若局部療法需要，則進行病 ::包括靜脈内、動脈内、腹膜内、硬膜外、勒内卜’可適當藉由脈搏注射尤其以特異性結 =劑量投與特異性結合試劑或抗體。較㈣心射，最 =靜脈内或皮下注射（部分視投藥是否為暫時性或持續性而定）進行投藥。涵蓋其他投藥方勺皮)、經黏膜、經直腸、經：尤其經 ▲ 口或局部投樂，例如經由安置於所需部位附近之導管。在某些實施例中，以範圍介於 _叫/㈣_叫七之劑量以範圍介於每日至每週至每月（例如每天、每隔一天、每隔兩天或每週2、3、4、5或6 次）之頻次，較佳範圍介於_45 mg/kg、〇或CM至H)mg/kg之劑量以每週2或3次之頻次或一月一次至多45 mg/kg靜脈内投與呈生理溶液形式之本發明之特異性結合試劑或抗體。 VIII.診斷及治療套組為方便起見’可以套組（亦即預定量之試劑與進行診斷檢定之用4說明書之封裝組合)形式提供本文中所揭示之抗體。當抗體經酶標記時，該套組將包括酶所需之受質及輔因子（例如提供可偵測發色團或螢光團之受質前驅體）。此外，可包括其他添加劑，諸如穩定劑、緩衝液（阻斷緩衝液或溶胞緩衝液）及其類似物。各種試劑之相對量可在很大程度上變化以提供大體上優化檢定之敏感度之試劑溶液濃度。特定言之，該等試劑可以包括賦形劑之乾粉（通常凍乾）形式提供，該等乾粉呈溶解時將提供具有合適濃 159757.doc • 144- 201206954 度之試劑溶液。亦知_供適用於多種診斷檢定（包括例如免疫檢定，諸如 ELISA(夾心式或競爭形式））之診斷試劑及包含一或多種該等試劑之套組。在某些實施例甲，該等套組可包括至少一種本發明之第一肽（視情況為如本文中所述之經正確摺疊成熟海帕西啶標準物）或第一抗體或抗原結合片段、其功能性片段或其混合物及產生信號之構件。當使用該套組時套組之組份可經預先附著於固體支撐物上或可經塗佈於固體支撐物之表面上。在某些實施例中，信號產生構件可與本發明之抗體預先相關聯或可需要在使用前與一或多種組份（例如緩衝液、抗體-酶結合物、酶受質或其類似物）組〇。套組亦可包括其他試劑，例如用於降低對固相表面之非特異結合性的阻斷試劑、絲試劑、酶受質及其類似物固相表面可呈管、珠粒、微量滴定盤、微球體或其他適合於固定蛋白質、肽或多肽之物質之形式。較佳，催化化學發光或顯色產物形成或化學發光或顯色受質降低之酶為U產生構件之組份。該等酶在此項技術中係熟知的。套組可包含本文中所述之捕捉劑及偵測試劑之S —者。視情㈣套組亦可包含實現本發明之方法之用法說明書。亦提供一種包含封裝於容器（諸如小瓶或瓶）中之海帕西咬活性括抗劑（或海帕西咬表現抑制劑）及紅血球生成刺激 t以進r.步包含附著於或封裝於容器上之標籤的套組，該 ^鐵，述容器之内容物且提供適應症及/或關於使用容器物α療如本文中所述之一或多種疾病病況的用法說 159757.doc -145- 201206954 明書。在一態樣中，該套組係用於治療與海帕西啶含量升高相關聯之病症且包含海帕西啶活性拮抗劑（或海帕西啶表現抑制劑）及紅血球生成刺激劑。該套組可視情況進一步包括用於經口或非經腸（例如靜脈内）投藥之鐵◦在另一態樣中，該套組包含海帕φ咬活性枯抗劑（或海帕㈣表現抑制劑）及附著於或封裝於容器上之標籤，該標籤描述海帕西咬活性拮抗劑（或海帕西咬表現抑制劑）與紅血球生成刺激劑之用法。在另-態樣中，該套組包含紅血球生成刺激劑及附著於或封裝於容器上之標蕺，該標籤描述紅血球生成刺激劑與海帕西啶活性拮抗劑（或海帕西啶表現抑制劑）之用法在某些貫施例中，海帕西啶活性拮抗劑（或海帕西啶表現抑制劑）及紅血球生成刺激劑及（視情況）鐵係呈獨立小瓶形式或共同組合於同一醫藥組合物中。在另一態樣中海帕西啶活性拮抗劑（或海帕西啶表現抑制劑）與鐵以早個醫藥組合物形式組合β在另一實施例中紅血球生成刺激劑與鐵以單個醫藥組合物形式組合。如以上組合療法章節中所討論，同時投與兩種治療劑並不需要同一時間或藉由同一途徑投與該等試劑，只要在該等°式劑發揮其治療效應期間存在時間上之重疊即可。涵蓋同時或依序投與，如在不同日或週投與。亦可氯備本文中所揭示之治療及診斷套組，其包含本文中所揭示之抗體、肽、抗原結合片段或聚核苷酸之至少一使用、·且α物作為診斷試劑或治療劑之用法說明書。適 159757.doc -146- 201206954 用於該等套組之容器可通常包含至少— 瓶、瓶、注射器或其他合適容器，該(等)診斷及合物之一或多者可置於其中且較佳適當等分於其t。當亦提供第二治療_，該套組亦可含有第：不同容器，此第二診斷及/或治療組合物可置於其中。或者，可將複數種化合物製備成單㈣藥組合物且可將其封裝於單個容器構件(諸如小航、燒瓶、注射器、瓶或其他合適單個容器) _本發明之套組通常亦將包括以緊密封閉方式含有該 (等)小瓶以便商業銷售的構件，諸如該(等)所需小瓶保留於其中之注射或吹塑容器。當放射性標記、產色、螢光生成或其他類型之可偵測標記或债測構件包括於該套組中時可將私°己忒劑提供於與診斷或治療組合物本身相同之容器中或可將其或者置於第二不同容器構件中此第二組合物可置於且適當等分於該第二不同容器構件中。或者，可將谓測4劑及標記製備於單個容器構件中且在大多數情况下’該套組通常亦將包括以緊密封閉方式含有該（等）小瓶以便商業銷售及’或便利封裝及輸送之構件。亦提供實現本文中所述之診斷或監控方法之器件或裝置”亥裝置可包括一試樣可輸入其中之腔室或管、一流體處理系統（視情況包括使該試樣直接流至該器件之間門或見if况自金液中分離血讓或叙清之過濾器、用於添加捕捉劑或㈣試劑之混合室）及（視情況卜用於 <貞測與捕捉劑免疫複合物結合之可偵測標記之量的檢測器件。試樣可為被動式/瓜動（例如藉由毛細管、靜水或一旦施用於試樣 159757.doc •147· 201206954 後並不需要進-步操作器件之其他力)或主動式流動(例如藉由施加經由機械泵、電滲透系、離^力或高氣壓所產生之力）或藉由主動力與被動力之組合而流動。在相關實施例中，亦提供一處理器、一電腦可讀内存及儲存於sf算機可讀内存上且適合於在處理^上執行以完成本文中所述之方法之任一者及/或以計算結果形式得到海帕西啶之偵測含量及認為"正常"之臨限值位準之臨限值或範圍使得在••正常，，範圍外之含量與如本文中所述之病狀之一或多者相關聯的常用程序。在某些實施例中，本發明進一步提供含有完成類似功能之程序或常用程序的電腦可讀介質。合適計算系統、環境及/或組態之實例包括個人電腦、服務器電腦、手持式或膝上型設備、多處理機系統、基於微處理機之系統、視訊轉接器、可編程消費者電子設備、網絡pc、逑你計算機、大型計算機、包括以上系統或設備之任一者之分布式計算環境或此項技術中已知之任何其他系統。海帕西啶活性拮抗劑之非治療用途本文中所揭示之抗體可用作靶標抗原之親和純化試劑或用於靶標抗原之診斷檢定中，例如偵測其於特定細胞、組織或血清中之表現。該等抗體亦可用於活體内診斷檢定。一般而言，為了達到該等目的，將抗體以放射性核種（諸如 ’Π、1、％、131l、125l、3H、321>或、標記以便可使用免疫閃爍攝影術定位位點。本文中所揭示之抗體可用於任何已知檢定方法，諸如競 159757.doc • 148- 201206954 爭性結合檢定、直接及間接夾心檢定（諸如ELISA)及免疫沈殿檢定 ° Zola, Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques，第 147-158 頁（CRC Press，Inc. 1987)。該等抗體亦可用於免疫組織化學分析以便使用此項技術中已知之方法標記細胞試樣。實例實例1--自尿純化海帕西啶 .雄/6 .·人類海帕西咬係自敗血病患者之尿（經金黃色葡萄球菌（51. 及肺炎鍵球菌（51. peMwowiare)感染，商業上獲得且使用由 Park等人，Journal Biol. Chem_, 276:7806-7810，2001所描述之方法純化）中分離。簡言之，將約2 L 冷凍尿融解且經0.45及0.22 μ過濾器過濾，且裝填於10 mL 柱床體積CM macroprep(BioRad)管柱上且使其與流速為每小時80 mL之PBS平衡。將管柱以PBS洗滌直至溶離劑之〇D280低於0.1。將海帕西啶以5%於水中之乙酸溶離。因為溶離劑含有數種其他肽，所以將該物質進一步藉由RP-HPLC(C18)使用含有0.1°/。TFA之乙腈相對於0.1% TFA水溶液之梯度純化。使用質譜儀分析含有海帕西啶之HPLC溶離份* 腐.·在Agilent 1100高效液相層析（HPLC)系統上使用來自 Antek Instruments(Houston，TX，USA)16 之 7000型 CLND氮特異性偵測器進行CLND分析。於Agilent C3逆相管柱（5 μιη，0.2 cmx5 cm)上使用緩衝液B相對於A之線性梯度（Α=0·04% TFA水溶液；B=含有 0.04% TFA 之 MeOH)、 159757.doc 149· 201206954 0-80% B經14分鐘以0.5毫升/分鐘之流速實現層析分離。 CLND條件為1050°C熱解溫度、PMT電壓700 V、範圍25 X 及檢測器輸出1 V ;在214 nm下偵測UV吸光度。使用溶解於DMSO中之咖啡鹼標準物（99%，Sigma-Aldrich)(標準物：8、80、160、320、640、1280、1920及 4480奈克（ng) 氮等效物）製備CLND反應校準曲線。將海帕西啶試樣溶解於已知體積之（50% Me0H/H20)中且由CLND反應與海帕西啶注射體積及氮計數之數學相關性來確定濃度。此方法用於量化所有後續海帕西咬製備方法。實例2--CHO源性重組人類海帕西啶（rhHepc)表現及純化藉由使用包含SEQ ID NO: 101並編碼人類原海帕西啶 (SEQ ID NO: 102)之DNA轉染AM-1/細胞週期蛋白D中國倉鼠卵巢（AM-1/D CHO)細胞（參見美國專利第6,210,924號，其以引用方式全部併入本文中）來穩定表現人類海帕西啶。根據製造商建議使用Lipofectamine™ 2000(LF2000)試劑（Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)進行轉染。簡言之，將4χ106個AM-1/D CHO細胞在轉染於l〇〇-mm直徑塑料 BD-Falcon™ 皮氏（Petri)培養皿（BD Biosciences，Bedford， ΜΑ)中之前塗佈於10 mL補充以5%胎牛血清、lx青黴素-鏈黴素及麩醯胺酸（Invitrogen)、非必需胺基酸（Invitrogen)、丙酮酸納及次黃嗓吟納/胸苷（HT)補充劑（Invitrogen)之達爾伯克改良伊格爾培養基（Dulbecco's Modified Eagle’s Medium)(D-MEM，Invitrogen)中歷時24小時。將約30 pg人類原海帕西咬質體DNA使用限制酶Pvu I(New England 159757.doc -150- 201206954

Biolabs, Inc.，Ipswich, ΜΑ)線性化且稀釋於 2 mL OptiMEM(Invitrogen)中。將經稀釋之DNA與稀釋於2 mL OptiMEM中之75 μί LF2000混合且將混合物在室溫下培育 20分鐘。將DNA-LF2000混合物添加至細胞中且培育隔夜以供轉染。在第二天，添加新鮮生長培養基且將細胞在 3 7°C下以5% C02培養48小時且隨後以1:20及1:50之稀釋度塗佈於HT選擇培養基中。在轉染之後約2週，存活細胞為藉由極限稀釋選殖於96 孔板中之單細胞。使用抗原海帕西啶多株抗體測定純系之海帕西啶表現。基於西方分析，擴增純系11 8-34以供大規模產生。將約2-3x107個細胞用以接種一個Corning® CellBIND® 850 cm2聚苯乙稀滾瓶（Corning Incorporated, Corning, NY)，且隨後使細胞以1:10擴增。將各滾瓶以250 mL高葡萄糖DMEM、10%經透析胎牛血清（FBS)、lx麩醯胺酸、1 X非必需胺基酸及1 X丙酮酸鈉（皆來自Invitrogen)接種。將10% C02/平衡空氣於培養基中鼓泡2-3秒，隨後封閉各滾瓶。將滾瓶在37°C下以0.75轉數/分（rpm)旋轉之輥筒架培育。當該等細胞為約85-90%長滿率時（在培養約5-6 天之後），丟棄生長培養基且將該等細胞以1〇〇 mL磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)及200 mL生產培養基洗滌，該生產培養基由50% D-MEM/50% Ham's F12、lx麩醯胺酸、lx非必需胺基酸、lx丙酮酸納（全部來自In vitro gen)及1.5%二曱亞石風 (Sigma-Aldrich，St. Louis，MO)組成。將含有人類海帕西啶之改良性培養基每7天採集一次且 159757.doc -151 - 201206954 隨後經0.45/0.1 μιη乙酸纖維素過濾器（C〇niing

Incorporated)過渡於 10 ml柱床體積 CM macroprep(Bi〇Rad) 管柱上，且與流速為每小時80 ml之PBS平衡。將管枉以

PBS洗滌直至溶離劑之ODuo低於0.1。將海帕西啶以於水中之乙酸溶離。藉由分析性RP-HPLC(C4管柱）檢定CM 溶離份。债測具有一内片之rhHepc 25、rhHepc 24、 rhHepc 22、rhHepc 21、rhHepc 27及rhHepc 24 » 將人併 CM裝填於半製備性C4 Vydac管柱（10x250 mm)上。將溶離份收集且藉由分析性RP-HPLC/MS檢定。根據靜質量及滞留時間合併rhHepc 25溶離份。實例3 —大腸桿菌源性重組人類海帕西啶表現及再摺整將包含SEQ ID NO: 101並編碼人類原海帕西咬（SEq ID NO: 102)之DNA表現於大腸桿菌中。在培養之後，將細胞藉由離心收集，藉由微流化劑溶解且洗滌。將來自大腸桿菌糊狀物之包涵體以1:10之重量與體積比在室溫下溶解& 6 Μ鹽酸胍、50 mM Tris-HCl、6 mM DTT(pH值為 8.5)中 1 小時。隨後將混合物以1:25在4°C下稀釋於2 Μ尿素、50 mM Tris-HCl、160 mM精胺酸、3 mM半胱胺酸（pH值為 8.5)中並攪拌3-4天。將該溶液藉由0·45 μΜ過濾淨化立51 至5 mM檸檬酸鹽中，隨後使用濃HC1降低pH值至3.〇。以3 MWCO膜進行10倍濃縮且與2 Μ尿素、5 mM檸檬酸化1_1值為3.0)交換緩衝液。再次將混合物藉由離心淨化且以NaOH 調節至pH值為4.5，隨後裝填於S-HP管柱。將管枉以20 mM乙酸鈉、250 mMNaCl、2M尿素（pH值為4.5)運作。運 159757.doc -152· 201206954 作達750 mM NaCl之梯度，同時藉由RP-MS檢定溶離份且根據預期質量及滯留時間合併。藉由以經由添加每mg原海帕西咬3 mU蛋白酶所獲之Kex蛋白酶培育而酶促分解蛋白質之前區段。將混合物在室溫下於包含30 mM TRIS(pH值為7.0)及5 mM CaCl2之緩衝液中培育1.5小時。將合併物再次使用逆相HPLC純化。實例4 —海帕西啶之化學合成、純化及特性化使用 ABI433 合成儀（Applied Biosystems, Foster City, CA)採用使用1·〇 Μ Ν,Ν·-二環己基碳化二亞胺（DCC)/1-羥基苯并三唑水合物（ΗΟΒΤ)(1:1)偶合化學處理與N-甲基-吡咯啶酮（NMP)及20%(v/v)哌啶/NMP去保護化學處理的Να-Fmoc/側鏈lBu正交保護策略（E. Atherton及R.C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford，1989)化學合成人類海帕西啶肽序列（扇-DTHFPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT-游雜鑀，SEQ ID NO: 9)。將單胺基酸偶合循環（1 mmol標度）用於合成，且由58 分鐘偶合時間及3 + 15分鐘Fmoc-去保護時間組成。將Fmoc-ThrGBiO-Wang樹脂（0.12 mmol當量標度，Novabiochem)用於合成。將下列側鏈保護策略與Na-Fmoc-保護胺基酸 (Novabiochem)—起使用：AspGBu)、Asn(Trt)、Gln(Trt)、 Thri'Bu)、His(Trt)、Cys(Trt)、Arg(Pbf)、SerCBu)及 Lys(Boc)。繼樹脂上鏈裝配及移除N-末端Fmoc基團之後，將經側鏈保護及樹脂結合之人類海帕西啶肽衍生物以二氣曱烷（DCM)洗滌且乾燥。藉由以總體積為20 mL之三氟乙 159757.doc -153- 201206954 酸（TFA)/H2〇/三異丙基石夕烧（TIS)/3 6二氧雜·18辛烷-二硫醇（DODT)(v/v為92.5:2.5:2·5:25)之新近製備的混合物Z 緩慢攪拌（通常2至3小時）下處理來實現側鏈去保護及自固體支撐物力解。將溶液過濾以移除聚合固體支樓物且隨後蒸發》將殘餘物以冰冷乙醚（50 mL)處理且將沈澱肽藉由離心（在2,000 rpmT10分鐘）收集，隨後傾析醚溶液且在真空中乾燥該肽。將乾燥肽在攪拌及超音波處理下於純TFa(2 mL)中複配’且隨後在攪拌下逐滴稀釋於由6 Μ胍（pH值為4·5)與6 Μ胍/0.5 M Tris/20 mM EDTA(pH值為 8.5)之 1:1 組合所製備的新鮮緩衝溶液（1〇〇 mL)中。將Tris(2-羧基乙基）膦鹽酸鹽 (TCEP，1 mmol)添加至溶液中且授拌2小時。隨後將經縮減之含有人類海帕西峻的溶液裝填於Phenomenex Jupiter 10 μιη 300 A C18 250x21.2 mm管柱上以便製備性純化。使用含有0.1% TFA之乙腈相對於0.1 % TFA水溶液之線性梯度實現層析分離。溶離梯度法為在20毫升/分鐘之流速下10-25% Β歷時15分鐘，接著25-40% Β歷時30分鐘。藉由 LC/MS分析使用 Waters Acquity UPLC-LCT Premier 系統（Ζ-喷霧電離偶合飛行時間（TOF)質譜儀；管柱：Agilent Eclipse XDB-C18 2.1 x50 mm，1.8 mm)鑑別含有預期分子黉量之經縮減人類海帕西11定及低於3〇%之任何其他質量可偵測之雜質的溶離份且加以合併。滯留時間（Rt)=5.27分鐘；（：113111781^34〇3189，計算分子量=2795.09 〇&(單一同位素）；實驗觀測分子量=2795.70 Da。隨後將集合溶離份以 159757.doc -154· 201206954 水及乙腈稀釋至1 L以提供25%(v/v)之近似最終乙腈組合物。在麩胱甘肽/二硫化麩胱甘肽（GSH/GSSG)氧化還原系統（300 mg GSSG及152 mg GSH)存在下在pH值為 8.0〜8.3(經28-30% ΝΗ4ΟΗ調節之溶液，Baker)時伴以50-60 RPM攪拌實現二硫鍵形成歷時16-24小時。由分析性 LC/MS監控二硫鍵形成之進展。在16-24小時摺疊之後，隨後將含有人類海帕西啶之溶液以純TFA調節至pH值為2且蒸發乙腈溶劑組份。隨後將含有人類海帕西咳之粗製指疊溶液裝填於Phenomenex Jupiter 10 μιη，300 A ’ C18，250x21.2 mm管柱上以便製備性純化。溶離線性梯度法為在20毫升/分鐘之流速下1 〇-25%緩衝液B歷時15分鐘，接著25-35%緩衝液B歷時40分鐘。藉由LC/MS 於 Waters Acquity UPLC-LCT Premier 系統上分析溶離份，且合併含有>95%人類海帕西啶之溶離份並將之凍乾。將含有分子量相當於摺疊人類海帕西啶之物質但具有不良LC純度（50-95%)之溶離份合併，凍乾，再懸浮於不含TFA之30%乙腈/水（濃度為約0.1毫克肽/毫升）中，以飽和碳酸銨調節至pH值為7.5-8.0且保持24小時。使用 Phenomenex Jupiter 10 μιη，300 A，Cu，250x10 mm管柱以5毫升/分鐘進行此第二人類海帕西啶集合物之半製備性規模純化，且合併含有>95%人類海帕西啶之溶離份並將之凍乾。人類海帕西啶之總產率為35 mg。滯留時間 (Rt)=5_05 分鐘；Cii3Hi7〇N34〇3iS9，計算分子量=2787.03 Da(單一同位素）；實驗觀測分子量=2787.70 Da。藉由還原 159757.doc -155- 201206954 性烷基化-肽作圖法以及傅立葉轉換離子回旋共振質譜分析(Fourier-transform ion cyclotron resonance mass spectrometry analysis)測定化學合成之人類海帕西咬之二硫鍵連接性。實例5--合成、重組及尿海帕西啶之分析及比較為證明天然、重組及合成物質之等效性，將如實例1中所述自尿純化之人類海帕西啶相對於CHO源性重組生成物質（實例2)、大腸桿菌源性重組生成物質（實例3)及化學合成物質（實例4)進行比較。比較IRMPD碎裂譜（圖1)。儘管直接序列分配對於所有觀測片段而言係不可能的，但所有試樣之MS/MS指紋圖譜係一致的。亦藉由碰撞活化解離 (CAD)以及ECD使試樣解離且譜圖對於所有製備物而言係一致的。甚至生物分子離子之結構之少許變化可極大地改變其串聯質譜《因此，藉由該等不同解離技術所獲之所有四種海帕西啶製備物之等效性表明二硫鍵連接性對於所分析的所有四種形式之海帕西啶係一致的。亦在圖2中比較所有四種海帕西咬製備物之一維nmr 譜且證實所有製備物係等效的。在實例2中說明所用方法。uhHepc之iD譜上之少量差異歸因於試樣之間的pH及鹽輕微錯配；此在組胺酸環質子共振及來自兩個非常接近於羧基之側接蘇胺酸殘基之共振上具有最顯著效應且與不同構形形式有關。某些試樣展示在順式構形中具有脯胺酸殘基之少量形式的小峰。當在純化過程期間酶促分解义末鳊天冬胺酸時，CHO源性rhHepc含有少量（<5%)24-殘基 159757.doc •156· 201206954 肽。合成、重組表現及天然海帕西n定之結構一致性允許製備大批量正確指疊製品以用於抗體生成及測試。實例6--活體外海帕西啶活性鐵蛋白檢定在活體外細胞檢定中針對鐵調節生物活性檢定根據實例 1、2、3及4所純化或產生之人類海帕西咬。誘導表現於 293細胞中之膜鐵轉運蛋白刺激鐵輸出且降低細胞内鐵含量且由此降低鐵蛋白含量（Nemeth等人，Science 306:2090-2093, 2004)。可以劑量依賴性方式藉由海帕西啶處理降低膜鐵轉運蛋白之作用》已顯示此作用歸因於海帕西咹誘發性内化及膜鐵轉運蛋白降解且由此降低鐵輸出。將表現四環素誘導性膜鐵轉運蛋白基因之293細胞以每孔50,000個細胞（70-80%密度）塗佈於96孔BioCoat塗佈有聚 D離胺酸之板中的補充以5%胎牛血清及青黴素/鏈黴素/麵醢胺酸補充劑（Gibco BRL)之DMEM中。在以5% C02在 37°C下培育隔夜之後，將該培養基置換為檢定培養基（如上所述，但補充以用於海帕西啶誘導之2.5 gg/mi多西環素 '用於鐵補充孔之2.5 pg/ml擰檬酸鐵及用於海帕西咬處理孔之1 pg/ml海帕西咬）。將該板如上所述進一步培育17· 2〇小時，隨後於冷PBS中洗滌該等孔且溶解於冰上的ι2〇 μΐ之1% Triton溶解缓衝液中歷時15分鐘。將1〇〇 μ丨溶解產物用於鐵蛋白分析（Olympus AU4 00臨床化學分析儀）且1〇 μΐ溶解產物用於BCA蛋白質檢定（Pierce)。將鐵蛋白結果根據蛋白質含量進行正規化。 159757.doc •157- 201206954 以尿、重組或合成海帕西啶處理該等細胞皆使得鐵保持力提高’此表明所有三種製備物具有生物學活性。因為所有三種製備物展現相同二硫鍵連接性及生物活性，所以其可被視為等效物’從而允許使用合成及重組製備物用於抗體製造及測試。實例7—藉由部分還原性烷基化進行尿海帕西啶之二硫鍵定位使用兩種不同技術（NEM部分還原性烷基化及傅立葉轉換質譜分析（FT-MS))研究自尿純化之内源性人類海帕西咬肽之二硫鍵連接性。簡言之，人類海帕西啶係由如下所述之敗血病患者之尿純化。使用3 mM TCEP之部分還原使海帕西啶中之二硫鍵隨時間逐步還原。由TCEP處理而化學還原之二硫鍵易於由NEM烷基化’且可藉由肽之序列分析鑑別neM-烷基化半胱胺酸。此技術證明’海帕西咬之二硫鍵連接性不同於由Hunter等人（前述）所推斷之二硫鍵連接性。經直接測定之海帕西啶二硫鍵連接性C1-C8、C2-C4、C3-C6及C5-C7 提供緊湊及緊密摺疊的分子。才法.·將經純化之海帕西啶（20-30 pg)溶解於〇.1 Μ擰檬酸鹽緩衝液（100 μ1)(ρΗ 3.0)或 0.1% TFA(100 μ1)(ρΗ 2.0)中且以3 μΐ 0.1 Μ參-(2-羧基乙基）膦鹽酸鹽（TCEP)處理。 TCEP之最終濃度為3 mM。在37°C下還原8分鐘。將部分還原海帕西啶立即以20 μΐ 0_5 MNEM處理，接著添加30 μΐ 1 M Tds緩衝液（ΡΗ 7.0)及100 μΐ 8 Μ鹽酸胍。溶液之ΡΗ值保 159757.doc •158· 201206954 持低於6以防止二硫鍵重排。在室溫下進行NEM-烷基化20 分鐘。使反應物直接經受使用Vydac C18管柱（2.1x150 mm)之逆相HPLC以純化烷基化肽。將經NEM改良之肽以 25% B至50% B之線性梯度經30分鐘在每分鐘0.25 ml之流速下對於溶劑A使用0.1% TFA且對於溶劑B使用90%乙腈-0.1% TFA進行溶離。將NEM-衍生物收集，乾燥且在溶於 15 μΐ 0.2% TFA-50%乙腈中之後由MALDI質譜儀分析。將試樣之一等份裝填至不鏽鋼板或金板上且與基質a-氰基-4 羥基肉桂酸（4-HCCA)共結晶。使用裝備有337-nm氮雷射器之Voyager DE-STR飛行時間質譜儀（Perkin-ElmerBiosystems Inc.)獲得MALDI質譜。以線性模式用通常設定為25000 V之加速電壓以及95%之柵極電壓、0.05% 之導線及150 ns之提取延遲時間進行量測。藉由使用氧化胰島素8鏈（]^11+=3496.96)之標準物進行外部校準實現飛行時間與質量的換算。對於各種NEM衍生物，選取含有2-NEM-Cys之衍生物來測定優先還原之半胱胺酸且對進一步還原的試樣進行如下序列分析：將2-NEM-衍生物溶解於20 μΐ 0.05% TEA中且以0.5 μΐ 2-巯基乙醇在45°C下還原20分鐘。使試樣直接經受肽定序。經NEM-標記之半胱胺酸歸因於異構形式而表現為PTH-Pro與PTH-Met之間的雙重峰。整合兩個峰以便量化NEM-Cys。將含有4至6種海帕西咬之NEM-衍生物之溶離份組合且以蛋白分解方式消化。將乾燥試樣再次於 0.1 M Tris緩衝液中復水且以嗜熱菌蛋白酶（1 pg)消化。在 159757.doc -159- 201206954 37°C下消化隔夜。使試樣經受使用Vydac C18管柱（2.1x150 mm)之逆相HPLC。將肽以2% B至35% B之線性梯度純化30 分鐘且最終以60% B洗滌。將熱分解肽乾燥且於0.2% TFA-50%乙腈（15 μΐ)中復水。將試樣之一等份（1 μΐ)裝填於該板上且乾燥。添加上述基質4-HCCA且使其結晶以便進行 MALDI質譜分析。將剩餘試樣定序以確定ΝΕΜ-標記之位點。 _赛#譜分法）：使用在7特斯拉下運作之改良 Bruker Q-FTMS獲取所有FTMS(傅立葉轉換質譜分析）資料。該儀器裝備有置於磁場之邊緣場中並距離離子單元之背面收集板約0.3 m之陰極電子長絲。以PEG300/600溶液使用標準Francel方程式外部校準該儀器。各校準物離子之計算質量相對於量測值的誤差低於1 ·〇 ppm。使用前端四極子分離個別離子；在FTMS單元中採用以氬氣作為碰撞氣體之氣體輔助式動態捕獲來捕獲離子。為進行IRMPD(紅外多光子解離）實驗，在15%-40%之雷射器功率下開啟Synrad C02雷射器200 ms。使用直接偵測模式在900 kHz之獲取頻寬下偵測離子且採集512 K數據點。將時域信號零充填一次且使用正弦視窗切趾，隨後進行幅度模式傅立葉轉換。 ' 對於ECD(電子捕獲解離）串聯MS實驗，將電子長絲以 1.8 A(V)加熱。相對於捕獲板上之電壓將+0.5 V偏壓施加於長絲上。對於MS3實驗，在IRMPD之後將所關注之子離子以CHEF線性調頻脈衝分離，其中對應於所關注離子之 I59757.doc -160- 201206954 回旋頻率之RF振幅下有凹陷（notch)。藉由”低能量"ECD使經分離之子離子進一步破碎；在開始電子輻照時將氬氣脈衝於離子單元中。 .结耒.·將海帕西啶以pH值為2之TCEP部分還原，引起僅一個二硫鍵之初級還原（分解）且形成兩個緊密溶離峰，兩者在分子量上相當於2NEM烷基化產物（指定為2a及2b，圖 3 A)。為測定峰2a及2b中之NEM標記位點，藉由Edman降解法定序經純化之肽。對在位置C5處之PTH-NEM-半胱胺酸的偵測證明此殘基經還原且烷基化。亦發現C7之烷基化，但C8亦似乎經烷基化。序列殘留（一種通常對在所標記殘基後（尤其在較長定序產物中）之殘基賦予假陽性信號之所熟知現象）大概歸因於海帕西啶之高半胱胺酸及脯胺酸含量而為此分析中之明顯障礙（Grant等人，Meth. Emzymol·，289:395-419, 1997 ; Hunkapiller等人，Methods in protien sequence analysis. Clifton, New Jersey: Humana Press; 1982)。為檢驗第二NEM-標記位點，將經定序試樣於玻璃纖維過濾器上以溴化氰（CNBr)處理且再次定序。該等結果展示C7(而非C8)由NEM明顯烷基化。因此，推斷C5 及C7為主要烷基化物質且由此C5-C7鍵在還原之前已存在。在峰2a中C4未經完全標記，其表明不存在存在於内源性人類海帕西啶之主要物質中之C4-C5鍵。對峰2b進行類似分析。將C2明確確定為第一 NEM烷基化位點且偵測出C4與C5具有大量烷基化產物。斷定C5位置處院基化之存在係由如上所述之殘留現象所引起。由顯示 159757.doc -161 - 201206954 未發現C2-C5或C4-C5鍵之先前資料消除C2-C5鍵之可能性。該等結果與以下事實一致：若相鄰半胱胺酸C4與C5 之間的二硫鍵存在於内源性海帕西啶製備物中，則其將必須以過低而不可偵測之濃度存在。此資料表明C2及C4為主要NEM-烷基化形式，藉此表明C2-C4二硫鍵連接性。為還原更多二硫鍵，將試樣進一步以pH值為3之3 mM TCEP處理。MALDI質譜分析表明，層析譜中之主峰分別對應於4-、6-及8-NEM烷基化產物（圖3B)。部分還原及烷基化4-及6-NEM產物仍含有完整二硫鍵，而8-NEM產物為完全烷基化形式且由此不適用於分析。為測定殘餘二硫鍵，將該等4-及6-NEM衍生物組合且進一步以嗜熱菌蛋白酶在pH值為6.6下消化（保持低於pH 7以防止二硫鍵重排且因此分離仍含有二硫鍵之片段或由二硫鍵接合在一起之肽）。藉由Edman定序鑑別部分烷基化肽片段。在未經NEM 標記之經分離肽片段中所鑑別之半胱胺酸對在烷基化之後仍與二硫鍵形成有關。肽Th-Ι展示兩個對應於IC(SEQ ID NO: 9 之殘基 6-7)及 GMCCKT(SEQ ID NO: 9 之殘基 20-25) 之序列。展示殘基22(C7)經NEM標記且由此不與連接兩個肽之雙硫橋有關。殘基7及23(C1及C8)皆未經標記，其表明兩個肽之間的鍵為C1-C8。肽Th-2展示單個序列 (IFCCGCCHRSKC ; SEQ ID NO: 9 之殘基 8-19)，其中將殘基10、13及14(C2、C4及C5)以NEM修飾且由此不由二硫鍵連接。將殘基11及19(C3及C6)偵測為未經修飾半胱胺酸。因為單體肽經分離，所以消除肽間二硫鍵之可能性且表明 159757.doc -162- 201206954 存在C3-C6二硫鍵。該等肽之MALDI分析證明該等標識。部分還原性烷基化肽產物之FTMS分析亦確認二硫鍵連接性且不對由Ednam降解所發現之殘留現象敏感。圖6展示根據所有NEM部分烷基化分析所得到之複合二硫鍵連接性標識，其證明在人類尿海帕西啶中，天然二硫鍵連接性為 C1-C8、C2-C4、C3-C6 及 C5-C7。亦使用評估FTMS二硫鍵連接性。所得譜較為複雜且因為不直接觀測出標準b/y離子系列，所以直接序列標識有困難。其係大概歸因於肽中之四個完整二硫鍵。可基於精確質量量測假定數種標識。舉例而言，觀測到雙倍帶電離子具有698.7794之m/z，相當於1395.5443 Da之中性粒子質量。該精確質量表明此片段含有由單二硫鍵接合之兩個内部肽片段（DTHFPIC，SEQ ID NO: 9 之殘基 1-7 及 MCCKT， SEQ ID NO: 9之殘基21-25)。此片段之理論單一同位素質量為1395.5444(0.1 ppm質量一致）。不可假定與此質量一致之其他碎體離子（在不存在内部重排之情況下）超過10 ppm。通常使用低能量碎裂法（諸如IRMPD)並未觀測到内部碎體離子之形成。大概藉由在似乎引起新碎裂過程之完整分子中由四個二硫鍵所誘發之環狀結構而有助於觀測該等内部片段。在二硫鍵完全還原物質之IRMPD譜中未觀測到該等内部片段。後續低能量ECD MS3實驗顯示m/z為698.7794之雙倍帶電子離子。在此MS3譜中所觀測之主要片段為兩個m/z為 83 1.3585及550.212之單獨帶電離子，其分別對應於兩個内 159757.doc -163- 201206954 ΜΠ 9之殘基 1-7)及 MCCKT(SEQ 部片段DTHFPIC(SEQ ϊρ Μ。· 介如.t丨丨刻對應於SH基图喪失之較 ID NO: 9之殘基21-25)。亦觀別 Λ -句：銮雨個肽區域在完整結構中低強度離子。該等標識0 由二硫鍵連接；其表明C1與。或08連& 妨含於多電荷之離子進行類似1^33 對IRMPD譜中之大多雾田不' ^ 多：目丨丨，將MS3片段指定為内部狀實驗。根據精確質量責'則將 X # 某14-18)及 MCC(SEQ ID NO: 9 CHRSK(SEQ ID NO: 9之殘&1 4耸在如圖6中所示之完整分子中之殘基21-23)，其暗示該寺狀在沪人類海帕西咬之三維結構的所提出由二硫鍵連接。

具有二硫鍵連接性I 模型描述於圖7(右）中。實例8—人類海帕西啶之NMR二硫鍵及結構分析亦藉由NMR光譜法測定人類海帕西啶之結構。該等其中於形成二硫鍵之所有半胱胺酸殘基之質子之間直接觀測到 NOE(核奥氏效應）的資料揭示如下二硫鍵連接性：與先前所引述之部分烷基化還原結果一致之C7_C23(C1-C8)、 C11-C19(C3-C6)、Cl〇-C13(C2-C4)及 C14-C22(C5-C7)。該等實驗觀測結果允許確定海帕西啶之三維結構與先前所公開結構（Hunter等人，2002)有顯著差別。由CHO源性重組人類海帕西啶得到之結果顯示在用於該等實驗中之濃度及溫度條件下隨時間之最佳穩定性分布，其對於高品質溶液 NMR研究具有重要作用。穩定性指示參數為如由展禾於圓 2中之NMR 1H線寬所量測之物質聚集百分數及分子於溶液中之單分散性程度。 159757.doc 164· 201206954 铽廣及實發··藉由將5% D20添加於獲自最後純化步驟之uhHepc水溶液中來製備NMR試樣。為便於NMR結構研究，製備CHO源性rhHepcidin於90% H2O/10% D20及 99.999% D2〇(Sigma-Aldrich)中之 1 mM溶液。使未經調節之pH值接近3。使用裝備有TXI超低溫探針之Bruker DRX-600儀器在325 K下進行所有實驗。藉由標準2D NMR方法獲得譜標識及大多數NOE限制（參見Wuthrich, John Wiley & Sons, 1986)。根據2D 13C HSQC譜獲得α及β-碳原子之 13C化學位移。該等譜標識得以進一步確認且由分析2D 1H-13C HMBC實驗獲得立體特異性標識（參見Hansen， Biochemistry, 30:10457-66，1991)。根據2D NOESY或雜交 TOCSY-NOESY實驗獲得半胱胺酸間NOE(Kessler等人， Angew. Chem. Int. Edn Engl., 27:564, 1988)。根據以高數位分辨率（0.5 Hz)記錄之2D TOCSY實驗獲得3JHNHa(三鍵J 偶合）。基於鄰近Ηα-Ηβ及C'-Ηβ及兩鍵Ca-Ηβ偶合模式獲得所有殘基（除C22以外）之立體特異性質子標識。C22顯示具有排除此殘基之立體特異性標識之簡併化學位移的Ηβ質子。藉由在將來自Η20之CHO源性rhHepc復水於D20溶液中之後記錄1D質子譜來追蹤Η-D交換》藉由使用激發雕刻脈衝序列獲得水抑制。所有NMR譜之外部參比物為在〇. 〇 ppm下之DSS(2,2-二甲基-2-石夕雜戊烧-5-確酸納鹽）。二處邀連#艋.·藉由同核2D T0CSY與2D NOESY實驗之組合完全標識CHO源性rhHepc之質子譜；依序連接性標識展示於圖4中。藉由化學交換增寬屬於C13及C14之共振 159757.doc •165- 201206954 (圖2)且僅在高溫及低pH值下可易於觀測。將NOESY譜使用NMRPipe處理且使用Sparky軟件套件分析。將二維資料在維數上充零一次且使用貝爾正弦位移平方切趾函數（shifted sine-bell squared apodization function) 進行傅立葉變換。基於N0ESY峰體積且藉由使用"分離旋轉對近似值來校準距離限制。根據與Stoke法則相符之在 293 K下為〜1.5 ns之亞甲基質子與在325 K為〜65 ns之亞曱基質子之間的交叉驰豫估算翻滾時間。該 1^293 x 325 ) 等相關時間對應於單分子於水溶液中之翻滾且證明雙旋轉近似值正確。 C7-C23(C1-C8)及 C11-C19(C3-C6)二硫鍵之二硫鍵連接性表現為相應Ηα質子之間的極強（2.1 A)NOE相互作用。因為在肽中高度充斥β質子共振，所以通常難以觀測到該等質子之間的直接ΝΟΕ連接性。然而，在TOCSY-NOESY中繼實驗中，Ηβ-Ηβ ΝΟΕ峰呈現遠離對角線且可經明確標識。此實驗中所觀測之C10(HP)-C13(HP)(C2-C4)及 C14(HP)-C22(Hp)(C5-C7)NOE相互作用展示於圖5中。亦在pH值為〜7及321 K下所記錄之2D NOESY譜中觀測到相對較強（〜2.7 人)C10(HP)-C13(HP)(C2-C4)NOE交叉峰，其中 Ηβ共振經充分分離（〜60 Hz)。C14(Hp)-C22(Hp)(C5-C7) 中繼NOE峰對於在2D N0ESY中出現較短混合時間之微弱直接C14(Ha)-C22(Hp)(C5-C7)相互作用具有較小貢獻。為移除此貢獻，在500 ms N0ESY混合時間期間使用Ha共振 159757.doc • 166 · 201206954 之預飽和進行2D TOCSY-NOESY實驗。此實驗展示幾乎相同C14(HP)-C22(HP)(C5-C7)交叉峰強度，此現象證實其主要由Hb質子（<3人）之間的相互作用引起。在不同半胱胺酸殘基對之間未觀測到其他NOE連接性。總而言之，該等結果證明圖6中所揭示之二硫鍵連接性且反驳先前所報導之二硫鍵連接性（Hunter等人，2002)。摩妨西啶之溶放,结禕：3維結構計算基於質子間 NOE限制，φ角之三鍵J-偶合常數（3JHNHa)及對於使用 TALOS軟件套件獲自Ca及CP化學位移值之Y角的寬鬆角限制。藉由 CYANA 2.1(參見 Guntert，Meth. Mol. Biol. 278:353-78，2004)根據擴展幾何學計算結構且允許該等結構基於20,000步扭轉角動力學基模擬退火收斂。在計算後期，在實現收斂之後，基於經確定處於慢交換中之醯胺 (獲自2H交換實驗）併入氫鍵限制。此時，接著根據所提出連接性模式添加二硫鍵限制。在圖7中將由20個最低能量結構所計算之海帕西啶平均結構與獲自先前所公開結構集合（Hunter等人，2002，前述）之平均結構進行比較。兩個試驗展示類似β-摺疊組件且顯示β-髮夾環。兩種結構之間的最顯著差異為此環之卷曲，該卷曲在吾等結構中很可能由C2-C4及C5-C7二硫鍵確定。根據彼所報導之結構上之此顯著差異將對與分子結合之抗體表現徹底不同抗原決定基。實例9 —海帕西啶變異鱧之合成及活性根據實例4中所描述之一般程序化學合成多種海帕西啶 159757.doc •167- 201206954 變異體。合成在N末端處缺少5個胺基酸之海帕西啶變異體’稱為"海帕西啶20"或"hepc2〇"。亦合成其中所有8個半耽胺酸殘基經2-胺基丁酸置換而因此完全破壞形成二硫鍵之能力之線性海帕西啶變異體。亦合成C1_C8、C3-C6海帕西咬變異體，其中半胱胺酸2、4、5及7經2-胺基丁酸取代以便允許形成僅兩個二硫鍵^^以及^·^)。與所公開結果（Nemeth等人，Blood，107:328-333，2006) 一致’ N-末端截短變異體hepc2〇具有嚴重減弱生物活性。其中所有8個半胱胺酸殘基經替換之線性海帕西啶變異體亦為失活的。當分子處於完全還原態（亦即無二硫鍵連接性）時’使用含有天然半胱胺酸殘基之海帕西啶亦產生類似結果。然而’此還原物質不穩定且生物活性隨時間恢復。實例10-·針對KLH-接合物質之鼠類抗人類海帕西啶單株抗體的製備在如下小鼠中產生人類海帕西啶特異性單株抗體 (mAb)2.7及2.41。使用標準EDC化學處理使重組性表現及再指疊人類海帕西啶與載體蛋白KLH結合，隨後投與動物。簡言之，將超過4倍莫耳量之EDC(Pierce)直接添加至含有等量人類海帕西啶及KLH之MES緩衝溶液中。使反應在RT下進行2小時。隨後將人類海帕西啶_KLH結合物乳化於1:1比例之完全傳氏佐劑（Complete Freund’s Adjuvant)(Pierce)或 RIBI(Sigma)與 PBS(Gibco)中。在頸背及後腿處以皮下方式使用50 pg海帕西啶-KLH/乳化佐劑使 159757.doc -168· 201206954 BDF1小鼠及C57BL/6免疫。14天後，皮下以及腹膜内輸送 25 pg於RIBI佐劑中之人類海帕西啶-KLH以便進行第二次免疫。繼此免疫之後10天，抽血以評估抗人類海帕西啶血清濃度。繼滴定抽血之後約2週，將1個C57B1/6小鼠腹膜内補充以75 pg懸浮於PBS中之人類海帕西啶。繼此補充之後5 天，將脾臟無菌地移除且處理以便融合。簡言之，將脾臟破壞成單細胞懸浮液且溶解RBC。將SP2/0.AG14骨髓瘤細胞與脾細胞以SP2/0與脾細胞之1:2.5比率混合。隨後使用電融合技術融合此細胞懸浮液。將所得融合瘤塗佈於使用富集生長培養基且藉由2個完全培養基互換來維持之96孔板中。在第二個培養基變化之後3天，根據抗人類海帕西啶特異性IgG經由ELISA篩檢融合瘤。簡言之，將100奈克/ 孔之Neutravidin(Pierce)塗佈於標準ELISA板上。將該等板洗滌且隨後以於PBS中之1% BSA、1% gt血清、0.5% Tween 20溶液阻斷。隨後將1奈克/孔之生物素標記人類海帕西啶添加至板中且培育1小時。在洗滌之後，將50 μΐ相關融合瘤上清液自培養板轉移於篩檢板上且將該等者再次培育1小時。在洗滌之後，使用多株山羊抗mu IgG Fc特異性HRP標記Ab偵測鼠類IgG-人類海帕西啶複合物。在適當洗滌之後，使用TMB(Pierce)目測複合物。隨後將藉由此方法所鑑別之陽性純系轉移至48孔板上以便擴增。實例11 —藉由病毒性免疫製備鼠類抗人類海帕西啶單株抗體 Ab43 159757.doc -169· 201206954 藉由下列病毒性免疫法在小鼠中產生人類海帕西啶特異性單株抗體Ab43。使用ViraPower腺病毒表現系統（產品目錄號 K4930-00，Invitrogen，Carlsbad，CA)產生腺病毒表現性人類海帕西啶。帶有人類海帕西啶cDNA(rAd-hHepc)之重組性腺病毒構建如下：簡言之，藉由將人類海帕西啶基因插入pENTRl A(Invitrogen)中來構建 pENTR-hHepc。使所得人類海帕西啶基因與attP DNA片段側接以便允許在 pAd/CMV/V5-DEST 中與 attB DNA片段重組。藉由pENTR-hHepc與pAd/CMV V5-DEST使用LR選殖酶之間的重組反應構建 PAd/CMV-hHepc。為產生 rAd-hHepc，將 pAd/CMV-hHepc藉由Pac I線性化且使用Lipofectamine 2000轉染於 293T細胞中。將經轉染293T細胞培養直至觀測到約80%細胞病變效應（CPE)。經轉染細胞展示擴大且呈圓形形態，細胞溶解及可見噬菌斑。將含有RAd-hHepc之細胞收集且用於rAd-hHepc之擴增。將RAd-hHepC藉由CsCl梯度法純化且使用Adeno-X快速滴定套組（BD Biosciences，Palo Alto, CA)滴定。將C57B1/6小鼠以50 μΐ 1.25χ109個感染單位（i.f.u)之rAd-hHepc於兩者後腿之四頭肌中得以免疫。在 rAd-hHepc 免疫之後10天將脾臟無菌地移除且處理以便融合。實例12 —大鼠抗人類海帕西啶單株抗體R9之產生使用經改良之RIMMS法在大鼠中產生人類海帕西啶特異性單株抗體（mAb)。簡言之，使兩個8-10週齡雌性Lewis大鼠（Charles River Laboratory)各自在11天療程内接受5輪使 159757.doc • 170- 201206954 用人類海帕西咬-KLH結合蛋白之免疫。在每次免疫之前’將大鼠以氧氣與異氟烷之氣體混合物麻醉β對於在第〇天進行第一次免疫’將10 pg抗原於體積為6〇〇 μ1之傅氏完全佐劑（DIFCO)中乳化’將300 μΐ該抗原混合物沿大鼠之背部以50微升/部位皮下投與6個與沒皮淋巴結鄰近之部位’其中兩個部位處於頸背且兩個部位在腹股溝及小腿之兩側。將另外300 μΐ抗原混合物沿腹部投與至6個此連部位’其中兩個在腋窩、大腿及小腿之兩側。除始終使用 RIBI(C〇rixa CORP,目錄號R700)佐劑之外，在第3天、第6 天、第8天及第11天以類似方式提供加強免疫。在最後一次免疫之後一天，藉由使用二氧化碳窒息對大鼠施加無痛致死術。將兩側腿彎部、表面腹股溝、腋窩及鰓部淋巴結無菌地分離且使用2χ青黴素-鏈黴素-麩醯胺酸 (Gibco)BD培養基洗滌兩次。將淋巴細胞自淋巴結中釋放且再次於BD培養基中洗滌單細胞懸浮液，隨後與小鼠骨髓瘤細胞 Sp2/0-Agl4(ATCC，CRL-1581)以 2.5:1 之比率藉由電融合進行融合。簡言之，將細胞洗滌且以1x1 〇7細胞/ 宅升再懸浮於2 ml Cytofusion培養基C(Cytopulse Sciences) 中且轉移至融合室中。藉由使用具有增強器400之ECM 2001(BTX Inc. San Diego)施加 3 個 1500 V 之脈衝 30 gs，接著施加60 V之脈衝3秒來進行電融合。將細胞在RT下回收’ 30分鐘後以3xl04細胞/孔平缓再懸浮且接種於96孔板中，將該板置於100 μΐ補充以1〇〇/0 FBS、5% Origen選殖因子（BioVeris™)、lx青黴素-鏈黴素-麩醯胺酸（Gibco)及 159757.doc -171- 201206954 ΙχΟΡΙ(草酿乙酸、丙酮酸及胰島素）（Sigma)之BD培養基中。在培養24小時之後，將100 μΐ 2XHAT(0.1 mM次黃嗓呤、0.16 mM胸苷、4 mM胺基喋呤）(Sigma)添加至各自孔中。5天後更換培養基且在培育1週之後收集改良性培養基以便初步篩檢。將陽性純系擴增，單細胞選殖且由多重檢定確認。實例13--完全人類抗體之產生將 Xenomouse™ IgG2icX及 IgG4icX小鼠以 KLH-接合之人類海帕西啶（SEQ ID NO: 9)使用標準方法免疫。以針對固定至板上之生物素標記人類海帕西啶之單一濃度篩檢 23,040 IgG2上清液及11，520 IgG4上清液》根據此篩檢，使用抗體捕捉ELISA測試617 IgG2及1013 IgG4上清液關於與人類與小鼠生物素標記海帕西啶之結合性，其中所捕捉抗體之量限於使上清液之間的濃度差效應最小化。在抗體濃度範圍内量測溶液相海帕西啶抗體結合性之橋接ELISA 中進一步表徵一流試樣（70 IgG2及110 IgG4)。此檢定提供抗體結合性之相對親和力分級。

來自IgG2及IgG4板之每一者之上清液指定如下： 1C9(SEQ ID NO: 107-116)' 3B3(SEQ ID NO: 117-126)' 4E1(SEQ ID NO: 127-136)、7A3(SEQ ID NO: 137-146)、 9D12(SEQ ID NO: 147-156) ' 12B9(SEQ ID NO: 157-166) ' 15E1(SEQ ID NO: 167-176)、18D8(SEQ ID NO: 310-319) ' 19C1(SEQ ID NO: 320-329) ' 19D12(SEQ ID NO: 290-299)、19H6(SEQ ID NO: 300-309)、23F11(SEQ 159757.doc •172· 201206954 ID NO: 177-186)及 26F11(SEQ ID NO: 187-196)。由BIAcore測定該等抗體與人類海帕西啶之結合親和力，若如由BIAcore所估算之KD低於100 pM，則由KinExA 確認。引導抗體之KD為1 pM與大於400 pM之間的範圍内。藉由競爭ELISA測定與Hepc20(SEQ ID NO: 96)之相對物種交叉反應性及結合性。結果表明與人類海帕西啶相比之相對結合性為：低於食蟹猴海帕西啶（SEQ ID NO: 6)2倍、低於小鼠海帕西啶（SEQ ID NO: 80)500至>1000倍及低於犬海帕西啶（SEQ ID NO·· 92) 150至 >1500倍。實例14--抗體與人類及小鼠海帕西啶之結合性分析使用BIAcore進行溶液平衡結合性分析以研究R9、八543、2.7及2.41抗體與重組性小鼠海帕西啶（8£(^10 1^0: 80)及人類海帕西啶（SEQIDNO:9)之相互作用。裘瀠B/Jcore磊，4面.·根據製造商之用法說明書將蛋白質以10微升/分鐘之運作緩衝液（DPBS : Dulbecco磷酸鹽緩衝液 SalinelX, GIBCO 14190，具有 0.005% Biacore 界面活性劑P-20)流速固定至BIAcore上。首先以100 pL EDC(75 mg/mL於水中之N-乙基-N-(二曱胺-丙基）碳化二亞胺，來自BIAcore)與NHS( 11.5 mg/mL於水中之N-經基琥珀醯亞胺，來自Biacore)之1:1混合物之注射液活化感應器晶片之羧化基質。以30微升/分鐘注射180 μΐ^重組性人類海帕西啶或重組性鼠類海帕西啶（〜20 pg/ml於10 mM乙酸鈉（Ph值為 4.0)中）以固定於感應器晶片上。以100 pL乙醇胺注射液 159757.doc -173 - 201206954 (1.0 Μ，來自Biacore)使感應器晶片之過量反應性基團失活。於經固定海帕西啶表面上之抗體/海帕西啶相互作用之乎衡.结合餒分#.·將固定濃度之抗體以各種濃度之海帕西啶在室溫下培育數小時，隨後穿過經固定海帕西啶表面。在每次試樣注射之後，藉由注射30 μί 10 nM甘胺酸（pH值為1.5)使表面再生。所獲結合信號與在溶液中呈平衡狀態之游離抗體成正比。使用一或雙曲線一位點式同源結合模型（KinExA™軟件，Sapidyne Instruments Inc.，Boise ID)由競爭曲線之非線性回歸分析計算平衡解離常數（KD)。表3 概述與重組性小鼠及人類海帕西啶之R9、Ab43、2.7及 2.41結合性的結果。表3

抗體人類海帕西咬 95% Cl 小鼠海帕西咬 95% Cl R9 21 nM 13-28 nM 20 nM 13-27 nM Ab43 560 pM 400-700 pM 14 nM 12-16 nM 2.7 110 pM 80-150 pM 40 nM 27-44 nM 2.41 50 pM 20-90 pM 30 nM 24-38 nM 實例15 —抗人類海帕西啶抗體至重組性犬海帕西啶之結合性下列實例描述針對重組性犬海帕西咬（rcyno)之各種抗體的KinExA及BIAcore結合性分析。 A)與rcynoHepc之mAb 2.7及2.41結合性的KinExA溶液平衡.结合從分於。根據製造商之用法說明書將反應性凝膠6x 珠粒（Pierce, Rockford, IL)預先塗以 rcyno海帕西咬（SEQ ID NO: 6)且以BSA阻斷。將固定濃度之抗體2·7及2.41以各種濃度之rcyno海帕西啶在室溫下培育8小時，隨後穿過塗有 159757.doc -174- 201206954 rcyno海帕西咬之珠粒。藉由經螢光（Cy5)標記之山羊抗鼠類 IgG(H+L)抗體（Jackson Immuno Research，West Grove, PA)量化與珠粒結合之抗體之量。結合信號與呈平衡狀態之游離抗體之濃度成正比》使用雙曲線一位點式同源結合模型（KinExA™ Pro軟件）根據競爭曲線之非線性回歸獲得平衡離解常數（KD)。該等結果闡明於表4中。表4

抗體 Κ〇(對於 rcynohepc) 95% CI 2.7 ~16 pM 11-23 pM 2.41 ~9 pM 6 〜14 pM 與rcynoHepc之mAb R9及Ab43結合性的BIAcore溶液平 #,结含從分#。抗體表面固定：將抗體R9及Ab43固定於 CM5晶片上。根據製造商之用法說明書以10微升/分鐘之運作緩衝液（DPBS : Dulbecco磷酸鹽緩衝液SalinelX， GIBCO 14190，具有 0.005% BIAcore 界面活性劑 P-20)流速進行固定。首先以1〇〇 μΐ EDC(75 mg/mL於水中之N-乙基-N-(二甲胺-丙基）碳化二亞胺，來自BIAcore)與NHS(11.5 mg/mL於水中之N-經基玻拍醢亞胺，來自BIAcore)之1:1混合物注射液活化感應器晶片之羧化基質。以30微升/分鐘注射180 μΐ^抗體（〜20 pg/ml於10 mM乙酸鈉（pH值為4.0)中）以固定於感應器晶片上。以1〇〇 μΕ乙醇胺注射液（1.0 Μ ’ 來自BIAcore)使感應器晶片之過量反應性基團失活。 BIAcore分析：將固定濃度之rcynoHepc以各種濃度之 mAb R9及Ab43在室溫下培育數小時，隨後穿過經固定抗體表面。所獲結合信號與在溶液中呈平衡狀態之自由 159757.doc •175· 201206954 rcynoHepc成正比。使用一曲線一位點式同源結合模型 (KinExATM軟件，Sapidyne Instruments Inc·，Boise ID)由競爭曲線之非線性回歸分析計算平衡解離常數（KD)。R9與 Ab43顯示對rcyno海帕西啶之顯著結合親和力。該等結果闡明於表5中。表5

抗體 Kd(對於 rcynohepc) 95% CI R9 〜10 nM 9~12nM 43 〜100 pM 60-160 pM 實例16--在酶聯免疫吸附檢定（ELISA)中表徵海帕西啶特異性單株抗體結合活性將96孔E.I.A./R.I.A.平底板（Costar 359)使用於0.1 Μ乙酸納（pH值為5.5)中之經生物素結合重組性人類海帕西咬或經生物素結合鼠類海帕西咬以100至1000 ng/ml在4 °C下塗佈隔夜。將該等板以含有2% BSA及0.2%山羊血清（GIBCO)之 PBS在室溫下阻斷1小時《在洗滌該等板之後，將50 μΐ融合瘤改良性培養基添加至各孔中且於震盪器上在RT下培育 2小時。將該等板以洗滌液（0.05°/。於PBS中之Tween-20)洗滌3次且以50微升/孔之辣根過氧化物酶結合性山羊抗大鼠 IgG(Chemicon)在RT下培育30分鐘。在洗滌該等板3次之後，添加50微升/孔之TMB受質（KPL)且使其在RT下培育5-10分鐘。經由添加50 μΐ 0.5 N H2S04停止反應且於微定量盤式讀取器中在450 nm下讀取該板。將經免疫大鼠之抗血清用作陽性對照抗體且將僅培養基用作本底對照。鑑別大鼠單株抗體R9對人類與鼠類海帕西啶具有特異 159757.doc -176- 201206954 性。經由細胞分選儀（Becton Dickinson, FACSDiva)以每孔 1個細胞分選融合瘤細胞株以便次選殖。實例17--抗海帕西啶抗體識別不同結構抗原決定基藉由評估抗體在與不同海帕西啶變異體形成前複合物之後結合成熟人類海帕西啶（SEQ ID NO: 9)之能力來評價抗人類海帕西啶抗體之抗原決定基特異性。根據製造商之用法說明書將重組性海帕西啶以10微升/ 分鐘之運作緩衝液（DPBS : Dulbecco磷酸鹽緩衝液 SalinelX，GIBCO 14190，具有 0.005% BIAcore界面活性劑 P-20)流速固定至CM5晶片上。首先以1〇〇 pL EDC(75 mg/mL於水中之N-乙基-N-(二曱胺_丙基）碳化二亞胺，來自BIAcore)與NHS(11.5 mg/mL於水中之N-羥基琥珀醯亞胺，來自BIAcore)之1:1混合物之注射液活化感應器晶片之羧化基質。以30微升/分鐘注射18〇 rhHepc2〇㈣/⑹於 10 mM乙酸鈉（PH值為4.0)中）以固定於感應器晶片上。以 1〇〇 KL乙醇胺注射液（1.〇 M’來自則八⑶代）使感應器晶片之過量反應性基團失活。用於前複合物之㈣㈣形式為：作為陽性對照之正確指疊海帕西唆’ C1-C8、C3-C6海帕西咬變異體（參見實例 )海帕西定20(N-末端截短形式，參見實例及線性海帕西咬（貫例9)。將1 nM抗體溶洛〇瓶冷夜（2.41 ' 2.7、43 及 R9)以 10 nM各抗原在室溫下預典吉。月數小時，隨後穿過經固定海帕西啶表面。所獲結合信號盥 ^ Α 一在/合液中呈平衡狀態之游離抗濃度成正比。該等結果閣明於表6中。 159757.doc •177· 201206954 表6 與海帕西咬表面之結合性抗體無競爭摺疊海帕西咬 C1-C8 C3-C6 Hepc20 線性海帕西咬 R9 100% 79% 63% 88% 100% Ab43 100% 11% 25% 100% 100% 2.7 100% 2% 3% 3% 100% 2.41 100% 0% 1% 1% 99% 表7中闡明對表6中之資料的解釋以提供不同抗海帕西啶抗體結合不同抗原決定基之能力的表述。表7 與溶液抗原決定基之結合性抗體摺壘海帕西啶 C1-C8 C3-C6 Hepc20 線性海帕西咬 R9 + + + • Ab43 -H-+ - - 2.7 -H-+4* -H-f+ +-H- - 2.41 ++++ ++++ +-H- - 結合性範圍介於++++(對海帕西啶表面之〇%抗體結合性且因此受溶液中之海帕西啶100%抑制）至（對海帕西啶表面之100%抗體結合性且因此不受溶液中之海帕西啶抑制）。該等資料指示就抗原性而言所有抗體需要摺疊肽。某些抗體在分子之N-末端處需要5個胺基酸（例如Ab43及在更小程度上為R9)。對於某些抗體（例如R9)，消除C2-C4及C5-C7 二硫鍵極大降低海帕西啶分子之抗體識別作用。實例18--在鐵反應性p-内醯胺酶檢定中可由抗海帕西啶抗體中和活體外海帕西啶活性海帕西啶使膜鐵轉運蛋白内化且自細胞表面中移除，藉此抑制鐵釋放且提昇細胞内鐵濃度。活體外評價抗人類海帕西咬抗體對此海帕西。定所介導之鐵螯合的效 159757.doc -178- 201206954 應。構建含有多西環素（doxy cy cline)誘導性膜鐵轉運蛋白（Fpn)表現構築體以及含有來自具有下列調節mRNA 轉譯之核苷酸序列之鐵蛋白之5'鐵反應元（IRE)之一複本之β-内醯胺酶（BLA)表現構築體的293細胞株： (tcggccccgcctcctgccaccgcagattggccgctagccctccccgagcgccctg cctccgagggccggcgcaccataaaagaagccgccctagccacgtcccctcgcag ttcggcggtcccgcgggtctgtctcttgcttcaacagtgtttggacggaacagatccg gggactctcttccagcctccgaccgccctccgatttcctctccgcttgcaacctccgg gaccatcttctcggccatctcctgcttctgggacctgccagcaccgtttttgtggttag ctccttcttgccaacc)(SEQ ID NO: 103) 〇將該等采自 70-80%長滿培養物之293/Fpn/BLA細胞以2.8χ 105細胞/毫升塗佈於含有 5% FBS(Invitrogen目錄號 10099-141)及PSQ(Invitrogen目錄號 10378-016)之 DMEM(Invitrogen 目錄號 11965)中，接著以90微升/孔（25,000細胞/孔）塗佈於BioCoat聚D離胺酸塗佈板（Becton-Dickinson 目錄號 35-6640)中且在 37°C 下以 5% C02培育。在同一天結束時，製得具有100 pg/mL多西環素之檢定培養基溶液（DMEM 5% FBS PSQ)，將其以10微升/ 孔添加至該板中且將該板培育隔夜或培育至少20小時。次曰，將培養基自孔中移除且置換為DMEM 5% FBS PSQ、 2.5 pg/mL檸檬酸鐵、50 ng/mL合成人類海帕西啶及抗體連續稀釋液（2.7、2.41及Ab43，其如以下實例8及9中所述般產生）之預製得混合物，將所有物質製備於96孔聚丙烯深孔阻斷板中，隨後立即添加至檢定板上。將混合物以1〇〇微升/孔添加且在37°C及5°/❶C02下於細胞培養恆溫箱中培 159757.doc •179- 201206954 月隔夜。隨後將板自恆溫箱中移出且平衡至室溫1〇分鐘，隨後以20微升/孔添加經製備之GeneBlazer CCF4 A/Μ顯影試劑（invitrogen 〖it# K1085)且在黑暗中培育90分鐘。亦將顯影試劑添加至含有100 μΐ^檢定培養基 (DMEM 5% FBS PSQ)之不具有細胞之對照檢定板之16孔中且培育相同時間。隨後使用Envision Multilabel讀取器 (Perkin-Elmer lnc.)藉由在409 nm下激發且在447 nm(藍色）及520 nm(綠色）下讀取發射光來讀取藍色及綠色螢光信號。該等結果描述於圖8-10中。確定mAB 43、2.7及2.41 分別在 1.380X10·8、ι.700χ10-8及丨 636 1〇-8之ECs。下降低細胞内鐵濃度。實例19--抗海帕西啶抗體中和小鼠中之人類海帕西啶在以足以產生低鐵反應之量投與人類海帕西啶之小鼠中活體内s平價抗人類海帕西咬抗體之活性。在第〇天時，使用抗人類海帕西啶之鼠類單株抗體（Ab2.7)對雌性C57BL/6 小鼠進行皮下注射。對照小鼠接受鼠類IgG1作為同型對照。在第3天時’使小鼠接受25 pg大腸桿菌源性重組人類海帕西啶（rhHepc)之單次腹膜内注射。兩個小時後分析血清鐵含量。以生理食鹽水處理之對照動物具有正常血清鐵含量’而以海帕西啶及同型對照抗體處理之動物展示血鐵過少症。結果闡明於圖11中。1 mg與0.5 mg mAb2.7提供統計上顯著預防作用而免於低鐵反應。儘管在〇 25 mg劑量之Ab 2.7下觀測到血鐵過少症減少，但將較低劑量（〇,25 及0.1 mg)定義為非中和劑量》統計表表示具有將所有組與 159757.doc • 180 - 201206954 生理食鹽水對照進行比較之Dunnett事後檢驗的ANOVA。實例20—經AAV運載之海帕西啶之抗體中和作用使正常早期紅血球特徵恢復在小鼠中AAV所介導之人類海帕西啶表現產生與鐵喪失一致之低色性小紅血球性貧血。在該等過度表現人類海帕西啶之小鼠中活體内評價抗人類海帕西啶抗體之活性。給雄性C57B1/6小鼠注射含有人類海帕西啶或β-半乳糖苷酶 (β-gal)之表現卡匣之AAV(1.5xl012顆粒/小鼠，靜脈内）以便作為陰性對照。將小鼠保持兩週以便組成性產生 huHepc，隨後使用1毫克/小鼠之Ab 2.7或同型對照 (muIgGl)以如圖12A中所示之各種投與頻次（每週1次、兩次及4次）進行處理。在第五天抽血以便測定血清鐵含量及早期紅企球（網狀血球）特徵（網狀企球計數、網狀血球血紅素含量（CHr)及網狀血球平均細胞容積（Retic. MCV》。結果闡明於圖12B-12E中。在接收4次投與Ab2.7之小鼠中血清鐵含量恢復至正常，但對於同型對照確未恢復。所有接收Ab2.7之小鼠展示網狀血球產生提高。在給予4次及 2次投與Ab 2.7之小鼠中網狀血球血紅素含量（cHr)為正常，但仍在使用1次投與之組或同型對照組中發現低色性。以4次及2次投與Ab2.7進行處理使網狀血球（Retic. MCV)恢復至正常體積’但小紅血球症仍存在於1次投與組及同型對照組中。與使用同型對照處理之注射有p_gal之動物進行統計比較以確定尋找正常紅血球特徵恢復（具有 Dunnett事後檢驗之ANOVA)。 159757.doc -181- 201206954 實例21 —病毒性海帕西啶過度表現引起對紅血球生成素之低反應性下列實例研究海帕西啶及海帕西啶活性拮抗劑對紅血球生成素低反應性小鼠之作用。如圖13B中所示，在小鼠中aav所介導之人類海帕西啶表現之滴定導致血清海帕西啶含量及劑量依賴性血鐵過少症提尚。選擇AAV-人類海帕西啶之劑量以便提供紅血球生成素抵抗表型且於與在先前研究中在癌症患者試樣中所偵測之類似範圍内表現海帕西啶含量（如共同申請中並共同擁有之美國專利申請案第11/880,3 13號及國際專利申請案第PCT/US2007/016477號中所述，其揭示内容以引用方式全部併入本文中）。給雄性C57BL/6小鼠注射表現人類海帕西咬或GFP之AAV作為表現對照（每組n=4)。經由尾部靜脈給小鼠注射（人類海帕西啶，lxl 012至3 χΙΟ12顆粒/小鼠； GFP，3x10 2顆粒/小鼠）。使蛋白質表現以便發育兩週，隨後收集。在㈣時，自錢巾收集血清且敎鐵及海帕西 °定含量。結果報導於圖138中。為評價海帕西啶對紅血球生成素抵抗之效應，給雄性 C57BL/6小鼠注射含有人類海帕西啶或GFp之表現卡匣之 AAV(3x 10 2顆粒/小鼠，肝門靜脈輸送）以便作為陰性對照 (每組n=5)。將小鼠保持3週以便組成性產生人類海帕西。定’且隨後抽切敎基線血紅素_含4 m週時將小鼠以達貝泊叫⑽微克/公斤/小鼠）或生理食鹽水處理作為陰性對照。在第5週時，再次量測i紅素含量。結 159757.doc 201206954 果展示於圖13A中。過度表現人類海帕西啶之小良對高劑量之達貝泊汀α具有抗性。對達貝泊汀α之抗性顯示高海帕西啶含量足以引起對紅血球生成素之低反應性。實例22 —在病毒性海帕西啶過度表現模型中使用海帕西啶活性括抗劑與紅血球生成刺激劑之組合療法以抗海帕西啶抗體處理具有紅血球生成素抵抗表型之小鼠使對使用達貝泊汀α進行處理之反應性恢復。給雄性 C57BL/6小鼠注射含有編碼人類海帕西啶或GFp之基因之 AAV(5 X 10顆粒/小鼠，靜脈内）以便作為表現對照（每組 n=5)。在保持兩週以形成組成性蛋白表現之後，給小鼠抽血以測定基線血紅素（Hb)含量，隨後使用Ab 2_7(1毫克/小鼠）或同型對照以各種投與頻次處理。在第一次投藥次曰’將該等鼠以達貝泊汀a(l〇〇 pg/kg，皮下）處理。投藥時程之示意圖發表於圖15A中。海帕西咬之中和作用使對達貝泊汀α之反應性恢復。週一-週三-週五投與抗體導致如由Hb含量之增量所量測之對達貝泊汀α處理的部分反應；使用相同抗體投與但不進行達貝泊汀α處理之組未展示Hb含量升高。（參見圖15B)在每日（週一至週五）接收Ab 2.7投與之小鼠中獲得對達貝泊汀以之最大反應。（參見圖15C)。如由Hb含量所量測，兩份及二份劑量抗體與達貝泊汀α處理組合導致部分反應β (參見圖15D)。如圖15Ε中所示，對達貝泊汀α處理之抗體劑量及近似抗體劑量影響對抗海帕西啶抗體處理之整個Hb反應 (結果不同於對照’其中使用Dunnett事後檢驗之ANOVA之 159757.doc •183· 201206954 ρ<0·01以雙星號註釋）。因此，海帕西啶之抗體所介導之中和作用展示對於由海帕西啶含量升高所引起之貧血症的有效治療。實例23--鼠類海帕西啶1之siRNA之設計及合成虞廯弟釤西啶/ hi?见4活邀♦痧撿.，將CHO-mHepcidin穩定細胞（Helen Kim)以3 0,000細胞/孔接種於96孔板中。第二天，藉由移除培養基且添加100 μΐ轉染複合物來轉染細胞。如下製造轉染複合物：將1 μΐ 100 μΜ siRNA添加至於管 A 中之 125 μΐ Opti-MEM(Invitrogen #31985)中。在管 B 中，將15 μΐ TransIT-TKO轉染試劑（Mirus #MIR-2154)添加至125 μΐ Opti-MEM中。將兩個管在室溫下培育12分鐘。將兩管之内容物混合且在室溫下培育15分鐘，隨後添加至該等細胞中。在18小時後轉染後，移除培養基且使用100 μΐ lxQuantiGene溶胞混合物（Panomics # QG 0502)溶解細胞。使用分支DNA檢定（QuantiGene檢定套組，Panomics # QG0003)分析溶解產物之 mHepcidin 及 mCyclophilin A mRNA含量。參見表8關於CHO-mHepcidin細胞中之siRNA 序列及mRNA敲除°/〇。 siRNA祛6及#10轉換至pENTR-U6-shRNA表現構築體•·藉由2階段重疊PCR產生pENTR-U6-shRNA表現構築體。步驟 1經由5’-PCR反應及3’-PCR反應產生2個重疊序列。5'-PCR 反應產生含有attBl重組位點、hU6啟動子、siRNA有義序列、環及siRNA反義序列之序列。總體積為10 μΐ之反應如下：lxPCR Supermix(Invitrogen #10572-014)、1 μΜ attB- 159757.doc •184- 201206954 111-U6 正向引子（5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGC AGGCTTAGATCTGAATTCAATTTACGCGTGGGATCCAAG GTC-3' > SEQ ID NO: 105)、0· 1 μΜ REV-U6-shRNA 引子（對於 #6 ： 5丨-CTTTTCTCATGAAAAAGGCTGCAGCT CTGTAGCGGTGTTTCGTCC-3，(SEQ ID NO: 63)及#10 : 5·- TACATCTCATGAATGTAGTCTGTC TCATCTGTCGGTGTTTCGTCC-3’(SEQ ID NO: 67)具有唯一性）及 0.5 ng(l gl)pSuppressor 模板質體（IMGENEX #IMG-700)。3'-PCR反應產生含有 shRNA有義、環及反義序列、PolIII終止子及attB2重組位點之序列。總體積為10 μΐ之反應如下：lxPCR Supermix(Invitrogen #10572-014) ' 1 μΜ AttB-202反向引子(GGGGACCACTTTGTACAA GAAAGCTGGGTAAAAA， SEQ ID NO: 106)、0.1 μΜ FW-U6-shRNA引子（對於#6 : 5，·

CTTTT TCATGAGAAAAGGCTGCAGCTCTGTAGCTTTTTACCCAGC-3' (SEQ ID NO: 63)及 #10 : 5'-TACATTCATGAGATGTAGT CTGTCTCATCTGTCTTTTTACCCAGC-3'(SEQ ID NO: 67) 具有唯一性）。兩個反應之PCR條件如下：3分鐘95°C循環1 次、95°C 45 s、52°C 45 s、72°C 45 s循環 30次及 5 分鐘 72°C循環1次。PCR之步驟2組合來自步驟1之5’及3’PCR產物用於退火/填充反應以產生全長序列：attBl-hU6啟動子-有義-環-反義-終止子-attB2。總體積為20 μΐ之反應如下：將來自步驟1之PCR產物：5’及3'PCR反應液混合且在熱循環器中使用下列條件運作_· 95°C 2分鐘、52°C 2分鐘、 72°C 2分鐘（循環5次）加72°C 10分鐘。 159757.doc -185· 201206954 藉由如下將Gateway BP重組於pDONR221中以產生 pENTR構築體來重組PCR產物：將7.5 ng(l μΐ) pDONR221(Invitrogen #12536-017)、1 μΐ 5χΒΡ反應緩衝液 (Invitrogen #52891)、1 μΐ .BP 選殖酶（Invitrogen #11789-013)及2.5 μΐ重疊PCR產物混合在一起且在室溫下培育2小時。隨後添加1 μΐ蛋白酶K(Invitrogen #52895)且在37°C下培育10分鐘。將整個6 μΐ重組反應液轉移至One Shot ToplO化學感受態細胞（Invitrogen #C4040-03)中且塗佈於 LB-卡那黴素（LB-kanamycin)板上。選擇且擴增菌落。藉由使用M13FW及M13REV定序引子對U6-shRNA區域進行 DNA定序來確認質體DNA。表8 siRNA 編號 siRNA序列(有義，5’-3，）在 CHO-mHepcidin 細胞中藉由siRNA之 1111^^敲除％在HEK293細胞中藉由AAV-shRNA 之 mRNA 敲除％ SEQ ID NO: 1 UGUAAAUGC UGU AACAAUU 95 58 2 GCU GUA AAU GCU GUAACAA 95 59 3 GUG UGG UAU CUG UUG CAAA 96 60 4 GCAGACAUUGCG AUACCAA 90 61 5 AUACCAAUGCAG AAGAGAA 94 62 6 CUACAGAGC UGC AGC CUU U 95 69 63 7 GAAGAGAGACAC CAACUUC 88 64 8 ACU UCC CCAUCU GCAUCUU 27 65 9 CUGAGCAGCACC ACC UAU C 86 66 10 ACAGAUGAGACA GACUACA 96 81 67 159757.doc •186· 201206954 11 CAAUGCAGAAGA GAAGGAA 86 68 12 AAUUCC CAGUGU GGUAUCU 65 69 實例24--在炎性貧血症之小鼠模型中使用海帕西啶表現抑制劑與紅血球生成刺激劑之組合療法在如下之鼠類炎性貧血症模型中評價使用海帕西啶表現抑制劑與紅血球生成刺激劑之組合療法。產生鼠類海帕西咬抑制之聚核苷酸海帕西°定表現抑制劑製備如下。在如實例23中所述之AAV表現系統中將經證明具有針對海帕西啶之活體外特異活性的siRNA(siRNA 6 CUACAGAGCUGCAGCCUUU(SEQ ID NO: 70) ； siRNA 10 ACAGAUGAGACAGACUACA(SEQ ID NO: 71))轉化成 shRNA。給小鼠以門靜脈方式注射含有陰性對照shRNA(抗螢光素酶，2xl012顆粒/小鼠）或特異性抗海帕西啶 shRNA(shRNA 6，5χ10η顆粒/小鼠=低劑量；2χ1012顆粒 / 小鼠=培養基劑量；及shRNAlO，2χ1012顆粒/小鼠=高劑量）之AAV病毒。在該等小鼠中藉由以流產布氏桿菌 (Brucellaabortus)(BA)(5xl08 顆粒/小鼠，提供 7天，隨後採集）處理來誘發發炎。亦評價無發炎誘發及無shRNA處理之對照小鼠以測定未經處理動物中之平均海帕西啶含量。使用MALDI-TOF質譜分析測定小鼠海帕西啶含量。使用MSIA-tips(具有經固定之抗小鼠海帕西啶抗體R9之親和性移液管）自小鼠血清中提取海帕西啶。將經提取之海帕西啶溶離於MALDI靶標上以供飛行時間質譜檢測。將人類 159757.doc -187- 201206954 海帕西啶用作定量之内標物。在;主射shRNA之後25天測定企清海帕西咬及也清血紅素含量。以抗海帕西啶shRNA處理之小鼠展示海帕西啶含量對非發炎性水準之抑制。參見圖丨4A。海帕西咬A含量與彼等血清海帕西咬之含量一致。給平行組中之小鼠注射如上所述之病毒（陰性對照或海帕西啶特異性shRNA)且1 8天後以流產布氏桿菌處理以誘發炎性貧血症。在第19天時，給動物注射1〇〇 gg/kg Aranesp以刺激促紅血球形成性反應且一週以後（如上所述之同一採集時點）測定血紅素（Hb)含量。圖14B展示不進行發炎性處理之對照動物通常對AraneSp響應並伴有Hb升高 3-4 g/dL ’而以BA處理之動物對Aranesp反應遲純。與此相反’進行B A處理並接受海帕西。定表現抑制劑之小鼠展示對Aranesp響應。因此，以海帕西啶表現抑制劑進行處理以抑制海帕西啶至前發炎性水準並與AraneSp處理組合產生正常血紅蛋白含量。參見圖14β。該等結果展示以海帕西啶表現抑制劑進行處理恢復對Aranesp之反應性。實例25 —在炎性貧血症之小鼠模型中使用抗海帕西啶抗體與紅血球生成刺激劑之組合療法在如下之鼠類炎性貧血症模型中亦評價使用海帕西啶活性结抗劑與紅血球生成刺激劑之組合療法。產生小鼠使得鼠類海帕西啶1經敲除且置換為人類海帕西啶。在第0天給雌性小鼠（人類海帕西啶表現與野生型同窩仔對照之純合子）注射流產布氏桿菌（2xl〇8顆粒/小鼠， 159757.doc •188· 201206954 腹膜内）且隨後在第6天抽血以評估血紅素含量。隨後在第 6天至第9天以抗體2.7或同型對照抗體〇毫克/小鼠/天）處理小鼠。在第7天投與達貝泊汀α(100微克/公斤/小鼠）且在第 13天評價Hb含量。此方案之示意圖展示於圖16八中。仍具有小鼠海帕西咬1基因之野生型對照小鼠在存在或不存在Ab 2.7之情況下並不響應達貝泊汀αβ (參見圖 16Β)。如由維持穩定血紅素含量所示，以抗體2 7處理之人類敲入型小鼠顯示對達貝泊汀α處理之反應性恢復。（參見圖16C)。該等結果證明海帕西啶活性拮抗劑可用於在海帕西咬過量之條件下中和海帕西咬且在海帕西咬所介導之貧血症 (諸如炎性貧血症）中恢復對紅血球生成試劑之反應性。實例26—量測患者中之海帕西咬含量如先前在同在申請中並共同擁有之美國專利申請案第 11/880,313號及國際專利申請案第？(：171；82007/016477號中所述般量測人類患者中之海帕西啶含量，該等文獻之揭示内容以引用方式全部併入本文中。以下再現該方法。自患有癌性貧血症之患者（獲自ProteoGenex)或志願者 (對照）採集試樣。藉由SPE使用Oasis HLB mElution 96孔板（Waters，Milford，ΜΑ)提取100 μί各試樣、血清空白及由 7 個非零濃度（10、25、50、100、250、500、1〇〇〇 ng/mL)組成之一式兩份校準標準物。洗滌溶劑為3 0%曱醇/ 水，且以氫氧化銨調節pH值為約10。溶離溶劑為90%曱醇 /水溶液’且以乙酸調節pH值為約5。將SPE板以500 pL曱 159757.doc • 189- 201206954 醇活化且以500 pL水調節，隨後將100 pL血清試樣及200 μί内標物裝填於溶離板上，以350 μί水及350 μί洗滌溶劑洗滌。使用100 μί溶離溶劑進行溶離且以100 μί水稀釋。藉由LC-MS/MS分析所得200 pL溶離液。將20 μΐ各提取試樣注入Polaris C18A，5 μιη HPLC管柱 (2.1 x50 mm，Varian)中。LC流速設定為300微升/分鐘。 HPLC移動相A為5:95甲醇/水且移動相B為95:5甲醇/水，兩者皆含有0.1 %曱酸。梯度條件設定如下：0-0.1分鐘，等度 2〇/〇8/98°/。八；0.1-4.5分鐘，2%8至95%6;4.5-4.9分鐘， 95% B ; 4.9-5.0 分鐘，95% B 至 2% B ; 5.0-6.0 分鐘，等度 2% B。將來自 Applied Biosystems(Foster City，CA)之具有 Turbo ESI源之Sciex API4000三重四極質譜儀以離子躍遷為m/z 930.60至110.15之MRM模式用於海帕西啶偵測。藉由將海帕西啶及内標物之LC峰面積之比率與獲自一系列標準物之比率進行比較來實現量化，其中已知海帕西啶及内標物之量。此實驗允許測定假定含有大量健康個體之對照群體中之海帕西咬的血清含量以及罹患癌性貧血症（AoC)之患者之海帕西咬的血清含量。該等結果展示於圖18中。

隨後分析各患者試樣之其他鐵指標濃度以確定患者是否患有發炎或缺鐵性貧血症（圖19)。該等參數量測如下：於 Olympus AU400臨床實驗室分析儀上使用標準程序量測血清鐵、UIBC、鐵蛋白及CRP ;使用標準ELISA方法（R & D 159757.doc -190- 201206954 系統）量測sTfR。實例27--市售DRG原海帕西啶Elisa並不偵測成熟海帕西咬下列實例證明市售原海帕西啶ELISA套組（DRG Inti. Inc.，Germany)不能夠偵測試樣中之成熟海帕西啶。產生多種合成及重組海帕西啶製備物（包括合成產生之海帕西啶（如實例3中所述）、重組產生之海帕西啶（如實例2 中所述）及自尿中分離之海帕西咬（如實例丨中所述））以便評價與重組性原海帕西啶相比各海帕西啶製備物之反應性。海帕西啶試樣之每一者顯示活體外及活體内生物活性。市售原海帕西啶ELISA套組（DRG Inti. Inc.，Germany)偵測重組性原海帕西啶（圖20A)，但不偵測多種成熟海帕西啶製備物（圖20B)。亦使用DRG原海帕西啶ELISA套組測試其他形式之海帕西啶，包括shHepc(合成產生之摺疊人類海帕西啶）、rhHepc(以前肽形式重組性表現於大腸桿菌十隨後摺疊且分解之物質）、shHepc20(在N-末端處缺少5個胺基酸之海帕西啶變異體）、shHepc ABU(由5_胺基丁酸（abu) 取代半胱胺酸殘基以消除二硫鍵形成之海帕西啶線性型式）、尿海帕西啶（自敗血病患者尿中純化）&C1C8、c3_ C6海帕西啶（歸因於在C2、C4、C5&C7處之ABu取代而缺少兩個二硫鍵連接之分子形式），與根據成熟海帕西啶所觀測之結果類似，該等形式之海帕西啶不受DRG原海帕西啶ELIS A偵測。以上資料證實市售DRG原海帕西啶ELISA套組不能偵測 159757.doc •191· 201206954 成熟海帕西咬。實例28-·在癌性貧血症（AoC)患者中海帕西啶（但非DRG原海帕西啶）與發炎相關聯已嘗試使用DRG原海帕西啶ELISA套組來使海帕西啶與發炎性病況相關聯。（參見例如Hsu等人，Blood

Purification, 24:311-16，2006 ; Kemna 等人，Blood， 106:1864-66，2005 ; Ouz 等人，Anadolu Kardiyoloji Dergisi，6:239-42, 2006 ; Taes等人，Clinical Chemistry & Laboratory Medicine，42:387-89，2004 ; Theurl 等人， Blood，107:4142-48, 2006)。然而，此實例顯示使用DRG原海帕西咬ELISA套組所量測之原海帕西咬含量並不與患者之成熟海帕西啶含量相關聯，原海帕西啶含量亦不與患者之發炎性病況相關聯。為可靠評估原海帕西啶濃度，在一系列不同緩衝液或血清中在25°C下培育60分鐘之後量測原海帕西啶標準物。藉由夾心免疫檢定使用用於捕捉之嫩7(施7债測成熟海帕西啶中之抗原決定基)及用於偵測之生物素標記兔抗原海帕西咬多株抗體(其偵測前區段令之抗原決定基)來測定原海帕西啶濃度。展示於圖21中之結果證明在血清中原海帕西啶係不可债測的’此表明其迅速發生降解。西方墨點法實驗確認除非添加弗林抑制劑，否則原海帕西咬在血清中發生降解(圖叫。將原海帕西咬(2 mg)在 =下培育12小時或立即添加，隨後在存在或不存在弗林抑制劑之情況下使僅培養基或含有㈣胎牛i清之培養基 159757.doc •192· 201206954 跑凝膠。將未還原試樣使用NuPage 4-12% Bis-Tris凝膝分離，點墨於硝化纖維素膜上且使用兔抗海帕西啶多株抗血清、接著抗兔HRP-接合之第二抗體偵測。假定在血清中原海帕西啶具有不穩定性質，在患者試樣中使用DRG原海帕西咬ELIS A套組所偵測之原海帕西咬含量升向可能反映原海帕西咬或另一蛋白質之末端部分分解。為確定血清原海帕西啶含量是否與血清海帕西啶含量相關，在對照供體及癌性貧血症（Aoc)患者之血清中量測海帕西啶及原海帕西啶含量。使用同在申請中並共同擁有之美國專利申請案第11/880,313號及國際專利申請案第 ?(3171；82007/016477號中所述之基於質譜分析之定量方法測定海帕西啶濃度’該等申請案之揭示内容以引用方式全部併入本文中。在AoC患者（r=0.1014 ; NS)或對照供體（r= -0.1128 ; NS)中於由基於質譜分析之定量方法所量測之海帕西啶含量與由DRG原海帕西啶ELISA套組所量測之原海帕西啶含量之間未發現顯著相關性。（圖19)。因此，.如由 DRG原海帕西啶ELISA套組所量測之原海帕西啶含量升高不能用作海帕西咬含量之替代者。為確定在患有發炎之患者中如由DRG原海帕西啶ELIS A 套組所量測之海帕西啶或原海帕西啶含量是否升高，將兩個指標與患者血清中之C-反應性蛋白（CRP)含量相比。 CRP為發炎之公遇標記。在癌性貧血_症患者中觀測到crp 與海帕西啶含量之間的強相關性（圖24Α)，但在該等患者中未觀測到CRP與DRG原海帕西咬之間的相關性（圖24Β)。 159757.doc -193- 201206954 正常供體展示CRP與海帕西啶或DRG原海帕西啶之間無顯著相關性，但在該等供體中CRP含量並未顯著升高，從而使相關性難以彳貞測。海帕西咬（但非原海帕西咬）展示在癌性貧血症患者中與CRP之相關性且因此可用作發炎之標記。因為大多數常用實驗室參數受急性期反應影響，所以使區分炎性貧血症（AI)與缺鐵性貧血症（IDA)及混合性貧血症 (AI與IDA之要素）複雜化。使用可溶性轉鐵蛋白受體（sTfR) 及鐵蛋白（Ft)值之比已於文獻中描述為一種用以提供較為精確之診斷的方法。參見Punnonen等人，Blood, 89:1052-57，1997。炎性貧血症特徵在於低sTfR/log Ft商（值低於 1)，而高比值預示IDA。因此，sTfR/log Ft比值當與發炎性標記組合以輔助診斷混合性貧血症與純IDA時可充當三種病狀之精確預測值。測試如由DRG原海帕西咬ELISA套組所量測之海帕西咬與原海帕西咬的輔助此診斷之能力。在AI中如由sTfR/log Ft所測定之海帕西咬含量升高。在AoC患者中海帕西咬含量與 sTfR/log Ft 值強烈有關（r=-0.6407 ; P<0.0001)。因此，在AoC患者中海帕西咬含量與sTfR/log Ft值強烈相關，此展示清楚相關性且輔助患者診斷（圖25A)。對於 DRG原海帕西啶，未發現該相關性（圖25B)。使用組合作為發炎之標記之CRP及sTfR/log Ft的決策樹，可將癌性貧血症患者再分成彼等患有AI、混合性貧血症、IDA及未知病因貧血症（稱為”其他類型"）之患者（圖 159757.doc -194- 201206954 17A)。觀測到具有高海帕母帕西咬含量之患者全部患有AI或混合性貧血症。（圖26)。觀測到具有低或無海帕西咬含量之。者〜有IDA或未知病因貧血症。如同在中請中並共同擁有之美國專利申3月案第11/88〇,313號及國際專利申請案第 PCT/US2007/016477號 Φ 新 _、+- α 让现〒所描述且以上詳細論述之基於質譜刀析之疋量方法所量測的海帕西咬含量可用力診斷炎性貧血症，該等文獻之揭示内容以引用方式全部併入本文中。實例29-·海帕西啶之夾〇ELISA中之多株抗體因為多株抗體表示針對免疫原之不同抗體之複雜混合物，所以其表示一種偵測存在於蛋白質中之所有可能之抗原決定基的方法。為確定針對海帕西啶之單株抗體夾心 ELISA為可能的，使用針對KLH•接合之成熟人類海帕西啶之多株抗體進行初步實驗。將來自多株兔抗血清之IgG塗佈於微量滴定盤上，將成熟海帕西啶稀釋且添加至該板上且使用來自相同來源之生物素標記IgG偵測經結合海帕西啶。所有抗體以丨〇 μβ/ηι丨之濃度使用。如圖27所示，此實驗能夠偵測經結合海帕西。定，其表明其可能量測呈夾心格式之海帕西啶。然而此檢定之敏感度較低，其表明兩種抗體同時結合海帕西咬之能力可能為罕見情況。實例30--海帕西咬之夾心免疫檢定中之單株抗趙下列實例描述一種用以測定試樣中之海帕西啶含量的炎心免疫檢定。 159757.doc -195- 201206954 使用Biacore分析’測試經抗體1 s丨塗佈之表面上的海帕西啶與另一抗體之同時結合（圖28)β根據製造商之用法說明書使用0.005% P-20/PBS緩衝液連續流將抗Uepc抗體1S1 固定於感應器晶片表面上。簡言之，藉由注入6〇叫含有 0.2 Μ N-乙基-N，-(二甲基胺基丙基）碳化二亞胺（EDC)及 0.05 Μ N-羥基琥珀醯亞胺（NHS)之混合物來活化感應器晶片表面上之羧基。接著注入濃度為2〇 μ§/ιη[的稀釋於j 〇 mM乙酸鹽（pH值為4·0)中之1S1。藉由注入6〇叫丄M乙醇胺使表面上之過量反應性基團失活。對於Ab 1S1表面而言，最終固定水平為5,000-6,000共振單位（ru)。亦於感應器晶片上製備空白模擬偶合參考表面。將2〇 nM大腸桿菌源性人類海帕西啶注射於1S1抗體表面上且與其結合。隨後將50 nM抗體2_7、23F11、26F11及1S1注射於海帕西咬 /1S1表面上。在抗體注入之後，藉由注入3〇 1C) mM HCl(pH值為2.0)使該等表面再生。對於複合物形式之結合存在高選擇性。用於上述競爭性檢定中之鼠類抗體2.7不能與1S1形成夾心對，且相較於 23F11而言，26F11顯示與1S1同時結合於海帕西啶之能力顯著較低。

實例31--針對成熟海帕西啶之單株抗體可用於構建夾心 ELISA 根據實例30中所獲之Biacore結果，針對與1 s 1"成對"之能力對先前已證明對海帕西咬具有反應性之11 〇〇種抗體進行篩檢。僅鑑別出11種抗體或約1%抗體為合適的。因此看 159757.doc •196· 201206954 來形成可用於展開海帕西咬之臾心檢定之"斟" 野的忐力較為罕見。當將1S1及23F11裝配成夾心ELISA格式時，用於偵測海帕西啶含量之免疫檢定之敏感度得以改良5〇件。如圖 29中所示’該檢定證明能夠在5〇倍預先稀釋步驟之後量測正常企清中之海帕西咬含量。轴線表示海帕西咬含量預先稀釋度。實例32--競爭性結合檢定下列實例描述一種用以測定海帕西咬含量之競爭性纟士人檢定。在一方案中，存在於血清中之未標記海帕西啶與生物素標記海帕西啶競爭結合抗海帕西啶抗體（例如抗體 2.7)。使用不同濃度（1.4-300 ng/ml)之攙入緩衝液（5% BSA:i_ 阻斷緩衝液）、兔血清或混合人類血清中之海帕西咬標準物測定海帕西啶含量。將海帕西啶添加至等體積4〇 ng/mL 之Ab2.7中且培育120分鐘。將25微升/孔之混合溶液添加至塗有1-2 gg/mL GxM捕捉抗體之黑色半區域板中。以 0.25 nM添加25微升/孔之生物素標記海帕西啶。將板以板薄膜密封物覆蓋且在室溫（25°c )下於約S2〇〇 rpm之板式震盪器上培育約60分鐘。洗務該板且隨後添加50微升/孔之 P〇ly辣根過氧化物酶擴增試劑（1:2〇〇〇)。使該板靜置3〇分鐘且隨後以板式洗滌器使用PBS或KPL緩衝液洗滌6次。將該板輕拍乾燥且迅速添加發光受質（Femto或Pico)。以光度计（購自.1^11^\ 340)使用？611^〇或？4〇受質對該板讀數，歷時1秒°結果表明在兔血清與緩衝液中海帕西啶在1_1〇〇 159757.doc •197· 201206954 ng/ml之漠度範圍内皆為可量測的。（圖3〇)。混σ人類血清看來似乎具有大於2〇 ng/ml之現有海帕西咬含量。#測定對於各種隨機所選帛的血清，A類血清中之海帕西咬3量大體上在卜3〇之範圍内變化（圖 31) 〇使用上述所測定之兔▲清中之海帕西啶標準物，測試24 種來自正常人類個體之隨機血清。海帕西咬含量自不可偵測至超過50 ng/ml變化。參見圖32。該等值與經由同在申請中並共同擁有之美國專利申請案第11/88〇,313號及國際專利申請案第PCT/US2007/016477號中所述的基於質譜分析之疋量方法所量測的海帕西α定含量之結果不符，後者通常給出低得多之值，其中該等專利申請案之揭示内容以引用方式全部併入本文中。實例33 —對獲得生物試樣中之海帕西啶濃度之各種方法的比較結果對藉由各種技術（包括質譜分析（實例25)、競爭性 ELISA(實例32)及央心ELISA(實例30-3 1))所獲之海帕西咬含量進行比較。結果示於圖33中。為了揭示案之完整性起見，明確將本文中所引用之所有專利文件及文獻文章以引用方式全部併入本說明書中。僅為了說明本發明而闡述了以上描述及實例，而並非意欲存在限制性。因為熟習此項技術者可想到對體現本發明之精神及實質的所述實施例進行修改，所以應將本發明廣泛地解釋為包括屬於隨附申請專利範圍及其等效體之範嘴 159757.doc •198· 201206954 内的所有變化。【圖式簡單說明】圖1展示人類海帕西啶之所有四種製劑的IRMPD FTMS 譜’其顯示所有三種合成及重組製劑與尿海帕西啶之等效性。圖2展示人類海帕西啶之四種製劑的idNMR譜，其顯示所有三種合成及重組製劑與尿海帕西啶之等效性。圖3 A展示經部分還原及烷基化之海帕西啶在pH值為2時之HPLC分析。圖3B展示經部分還原及烷基化之海帕西啶在pH值為3時之HPLC分析。圖4展示重組人類海帕西啶之主鍵指紋區之二維 NOESY(深色）-TOCSY(淺色）覆蓋圖，其顯示主鏈共振分配。圖5展示如實例8中所論述之ωΐ-解耦2D 丁0€8丫及①丨-解耦2D TOCS Y-NOES Υ實驗的覆蓋圖》Ηα質子之共振位置標有不完整箭頭。星號表示摺疊偽影（folding artifact)。圖6為人類海帕西咬多肽之示意圖，其指示由兩種部分烷基化還原技術測定且由NMR確認之各種二硫鍵。圖 7展示由 Hunter等人所獲（J. Biol. Chem·，277:37597-603，2002)(左側）及如實例8中所測定（右側）之人類海帕西啶的一般主鏈結構。圖8展示鼠類抗海帕西啶抗體Ab 43在β-内醯胺酶鐵反應檢定中降低細胞内鐵濃度之功能能力。圖9展示鼠類抗海帕西啶抗體2.7在内醯胺酶鐵反應檢 159757.doc •199· 201206954 定中降低細胞内鐵濃度之功能能力。圖10展示鼠類抗海帕西啶抗體2.41在β-内醯胺酶鐵反應檢定中降低細胞内鐵濃度之功能能力。圖11顯示抗海帕西啶抗體中和注射於小鼠中之人類海帕西咬。圖12顯示對人類海帕西咬病毒性表現小鼠之抗體中和作用使正常早期紅血球特徵恢復。圖13 Α展示海帕西啶之病毒性過度表現導致對紅血球生成素之低反應性。圖13 B展不腺病毒相關病毒（A AV )所介導之海帕西咬表現與所得血清鐵濃度的滴定結果。圖14展示在炎性貧企症模型中抑制海帕西咬使對 Aranesp®(達貝泊汀α)之反應性恢復。圖15Α展示實例22之實驗程序之示意圖。圖15Β-Ε顯示在病毒性過度表現海帕西咬之小鼠中抗海帕西啶抗體使對紅血球生成素之反應性恢復。圖16展示在患有炎性貧血症之人類海帕西啶敲入（kn〇ck_ in)小鼠中由抗海帕西啶抗體治療對海帕西啶之中和作用使對紅血球生成素之反應性恢復。圖17A展示關於在無海帕西啶量測之情況下評估患者之鐵指標及疾病病況的決策樹。圖17B展示關於使用海帕西啶含量量測來評估患者之理論決策樹。圖18顯示海帕西啶含量在癌性貧血症（AoC)患者中升 159757.doc -200- 201206954 高，但在正常患者中並不升高。圖19顯示海帕西啶含量與炎性貧血症之診斷有關而與缺鐵性貧血症之診斷無關。圖20展示市售DRG原海帕西啶ELISA不能偵測成熟海帕西咬。圖21展示由夾心免疫檢定所量測之原海帕西咬濃度，其顯示原海帕西咬在血清中不可彳貞測。圖22展示原海帕西咬西方墨點法（western blot)結果，其指示除非藉由弗林抑制劑（furin inhibitor)之存在加以保護，否則原海帕西啶在血清中發生降解。圖23展示在患者試樣中海帕西咬含量與原海帕西唆含量 (如由市售DRG原海帕西啶ELISA所量測）並不相關。圖24A-B展示海帕西啶含量與如由C反應性蛋白所評估之炎性病況有關（A)，而原海帕西咬含量與如由C反應性蛋白所評估之炎性病況無關（B)。圖25 A-B展示海帕西啶含量有助於炎性貧血症之診斷 (A) ，而原海帕西啶含量並不有助於炎性貧血症之診斷 (B) ° 圖26A-B顯示海帕西啶含量與炎性貧血症之診斷有關 (A)，而原海帕西啶含量與炎性貧血症之診斷無關（B)。圖27顯示針對成熟海帕西啶之多株抗體可用於構建夾心 ELISA。圖28展示Biacore實驗結果，其顯示兩種單株抗體可立即與海帕西咬結合。 159757.doc -201 - 201206954 圖29顯示可使用針對成熟海帕西啶之單株抗體構建夾心 ELISA。圖3 0展示如由競爭性結合檢定所測定之存在於緩衝液、兔血清及混合人類血清中之海帕西啶的濃度。圖3 1顯示海帕西啶在人類血清中之量測結果。圖32顯示使用競爭性結合檢定所量測之存在於正常人類血清中之海帕西咬的濃度。圖33展示使用夾心ELISA、競爭性ELISA及質譜技術所量測且於隨機人類供體中所偵測之海帕西啶含量的比較結果。圖34顯示具有高海帕西啶含量之AoC患者亦具有高C反應性蛋白（CRP含量）。 159757.doc -202- 201206954 序列表 <110>美商安美基公司 <丨2〇>海帕西啶(HEPCIDIN)、海帕西啶拮抗劑及使用方法 <130> A-1156 <140> 097103507 <141> 2008-01-30 <150> 60/888,059 /61/015,138 <151> 2007-02-07 /2007-12-19 <160> 329 <170> Paientln version 3.4 <210> 1 <211> 249 <212> DNA <213>个家鼠 <400> 1 60 120 180 240 249 atggcactca gcactcggac ccaggctgcc tgtctcctgc ttctcctcct tgccagcctg agcagcacca cctatctcca tcaacagatg agacagacta cagagctgca gcctttgcac egggaagaaa gcagggcaga cattgcgata ccaatgcaga agagaaggaa gagagacacc aacttcccca tctgcatctt ctgctgtaaa tgctgtaaca attcccagtg tggtatctgt tgcaaaaca <210> 2 <211> 83 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 2

Met Ala Leu Ser Thr Arg Thr Gin Ala Ala Cys Leu Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Leu Ala Ser Leu Ser Ser Thr Thr Tyr Leu His Gin Gin Met Arg Gin 20 25 30

Thr Thr Glu Leu Gin Pro Leu His Gly Glu Glu Ser Arg Ala Asp lie 35 40 45

Ala He Pro Met Gin Lys Arg Arg Lys Arg Asp Thr Asn Phe Pro lie 50 55 60

Cys lie Phe Cys Cys Lys Cys Cys Asn Asn Ser Gin Cys Gly lie Cys 65 70 75 80

Cys Lys Thr <210> 3 <2!1> 252 <212> DNA <213>褐家鼠 <400> 3 60 atggcactaa gcactcggat ccaggclgcc tgtctcctgc ttctcctccl ggccagcctg agcagcggtg cctatctccg gcaacagacg agacagacta cggctctgca gccttggcat 159757-序列表.doc 120 180201206954 ggggcagaaa gcaagactga tgacagtgcg ctgctgatgc tgaagcgaag gaagcgagac accaacttcc ccatatgcct cttctgctgt aaatgctgta agaattcctc ctgtggtctc igttgcataa ca 240 252 <210> 4 <211> 84 <212> PRT <213>褐家鼠 <400> 4 Met Ala Leu Ser Thr Arg He Gin Ala Ala Cys Leu Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Leu Ala Ser Leu Ser Ser Gly Ala Tyr Leu Arg Gin Gin Thr Arg Gin 20 25 30

Thr Thr Ala Leu Gin Pro Trp His Gly Ala Glu Ser Lys Thr Asp Asp 35 40 45

Ser Ala Leu Leu Met Leu Lys Arg Arg Lys Arg Asp Thr Asn Phe Pro 50 55 60

He Cys Leu Phe Cys Cys Lys Cys Cys Lys Asn Ser Ser Cys Gly Leu 65 70 75 80

Cys Cys lie Thr <210> 5 <211> 78 <212> DNA<2丨3>食蟹猴 <400> 5 gacacccact tccccatctg cattttcigc tgcggctgct gtealegate aaagtgtggg atgtgctgca ggaegtag 60 78 <210〉 6 <211> 25 <2】2> PRT <213>食蟹猴 <400> 6 Asp Thr His Phe Pro He Cys He Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg I 5 10 15

Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Arg Thr 20 25 <210> 7 <21]> 252 <212> DNA <2!3>令人 <400> 7 atggcactga gctcccagat ctgggccgct tgcctcctgc tcctcctcct cctcgccagc ctgaccagtg gctctgtttt cccacaacag acgggacaac ttgeagaget gcaaccccag 60 159757·序列表.doc 2- 120 201206954 gacagagctg gagccagggc cagctggatg cccatgttcc agaggcgaag gaggcgagac acccacttcc ccatctgcat tttctgctgc ggctgctgtc atcgatcaaa gtgtgggatg tgctgcaaga eg 180 240 252 <210> 8 <2I1> 84 <2I2> PRT <213>智人 <400> 8 Met Ala Leu Ser Ser Gin lie Trp Ala Ala Cys Leu Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Leu Leu Ala Ser Leu Thr Ser Gly Ser Val Phe Pro Gin Gin Thr Gly 20 25 30

Gin Leu Ala Glu Leu Gin Pro Gin Asp Arg Ala Gly Ala Arg Ala Scr 35 40 45

Trp Met Pro Met Phe Gin Arg Arg Arg Arg Arg Asp Thr His Phe Pro 50 55 60

He Cys He Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg Ser Lys Cys Gly Met 65 70 75 80

Cys Cys Lys Thr <210> 9 <211> 25 <212> PRT <213>智人 <400> 9 Asp Thr His Phe Pro lie Cys lie Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg 15 10 15

Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Lys Thr 20 25 <210> 10 <400> 10 000 <210> 11 <400> 11 000 <210> 12 <211> 330 <212> DNA <213>智人 <400> 12 aacatcgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttat gcactggtac cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 60 120 180 159757·序列表.doc -3- 201206954 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattgat cctgiggagg ctgatgatgc tgcaacctat tactgtcagc aaaataatga ggatcggacg ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa 240 300 330 <210> 13 <211> Π0 <212〉 PRT <213>智人 <400> 13 Asn lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Gin Arg Ala Thr He Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu lie Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60

Arg Phc Scr Gly Scr Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Asp 65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Asn 85 90 95

Glu Asp Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 14 <21]> 357 <212> DNA <213>看人 · <400> 14 cagatccagt tggtacagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc tcctgcaagg ctictgggta taccttcaca acctatggaa tgagctgggt gaaacaggct ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct actctggagt gccaacatat gctgatgaci tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagcttatgg tactacggia gggcctttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 60 120 180 240 300 357 <210> 15 <21]> 119 <212> PRT <213>智人 <400> 15 Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 159757·序列表.doc -4- 201206954

Gly Met Ser Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Cly Leu Lys Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin lie Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Ser Leu Trp Tyr Tyr Gly Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 15 <212〉 PRT <213>智人 <400> 16

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His 15 10 15 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 17

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser <210> 18 <21l> 8 <212> PRT <213>奢人 <400> 18

Gin Gin Asn Asn Glu Asp Arg Thr <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213>智人 <400> 19

Thr Tyr Gly Met Ser 1 5 <2)0> 20 <211> 17 <212> PRT <213>智人 <4G0> 20 159757·序列表.doc 201206954

Trp He Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 15 10 15

Gly <2)0> 21 <211> 10 <212> PRT <213>智人 <400> 21

Leu Trp 丁yr Tyr Gly Arg Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 22 <400〉 22 000 <210〉 23 <400> 23 000 <210> 24 <211> 330 <212> DNA <2]3>智人 <400> 24 gacaltgtgc tgacccaalc tccagcttct 丨tggcigtgl ctctagggca gagggccacc atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttat gcactggtac cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcacc aaagtaatga ggagtacacg ttcggagggg ggaccaagct ggaaaiaaaa <210> 25 <211> 110 <212> PRT <213>智人 <400> 25

Asp He Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn 65 70 75 80 •6- 159757-序列表.doc 201206954

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Ser Asn 85 90 95

Glu Glu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 ' 110 <210> 26 <211> 354 <212> DNA <2]3>智人 <400> 26 60 120 180 240 300 354 cagatccagt tggtacagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca acctatggaa tgagctgggt gaaacaggct ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaatacct actctggagt gccaacatat gcigatgact tcaagggacg gtttgccttc tctitggaaa cctctgccag cactgcctat tigcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgg aagagaccac tactacgggg aggttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca <210> 27 <211> 118 <212> PRT <213>舍人 <400> 27

Gin lie Gin Leu Val Gin Scr Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu ]5 10 15

Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin lie Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Gly Arg Asp His Tyr Tyr Gly Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Leu Va] Thr Val Ser Ala 115 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213>会人 <400> 28

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His 159757·序列表.d〇c 201206954 5 10 15 <210> 29 <21]> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 29

Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213>智人 <400> 30

His Gin Ser Asn Glu Glu Tyr Thr <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213>智人 <400> 31

Thr Tyr Gly Met Ser <2】0> 32 <211> 17 <212> PRT <213>智人 <400> 32

Trp lie Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 15 10 15

Gly <210> 33 <211> 9 <2]2> PRT <213>智人 <400> 33

Asp His Tyr Tyr Gly Glu Val Ala Tyr <210> 34 <400> 34 000 <210> 35 <400> 35 000

<210> 36 <211〉 330 <212> DNA -8 - 159757-序列表.doc 201206954 <213>智人 <400> 36 gacaugtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttttggca atagttttat gcactggtac cagctgaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat cctgtggagg ctgatgatgt tgcaatttat tactgtcagc aaagtaatga ggagtacacg ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa <210> 37 <2U> 110 <212> PRT <213>智人 <400> 37

Asp He Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Scr Leu Gly 15 10 15

Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala Scr Glu Scr Val Asp Ser Phe 20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gin Leu Ly$ Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Scr Gly lie Pro Ala 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn 65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala He Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn 85 90 95

Glu Glu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 38 <211> 354 <212> DNA <213>智人 <400> 38 cagatccagt tggtacagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca acctatggaa tgagctgggt gaaacaggct ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct cctctggagt gccaacatat gctgatgact tcatgggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat ttgeagatea acaacctcaa aaatgaggac aeggetaegt atttctgtgc aagagaccgc tactacgggg aggit£Ctta ctggggccaa gggactctgg tcaccgtctc tgea <210>. 39 <211> 118 <212> PRT <213>智人 159757·序列表.doc 201206954 <400> 39

Gin Me Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Asn Thr Ser Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60

Met Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin He Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Gly Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213>智人 <400> 40

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Phe Gly Asn Ser Phe Met His 15 10 15 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 41

Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser <210> 42 <211> 8 <2)2> PRT <213>智人 <400> 42

Gin Gin Ser Asn Glu Glu Tyr Thr <210> 43 <211> 5 <212> PRT <213〉# 人 <400> 43

Thr Tyr Gly Met Ser 10· 159757-序列表.doc 201206954

<210> 44 <211> 17 <212> PRT <213>舍人 ' <400> 44

Trp lie Asn Thr Ser Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Met 15 10 15

Gly 459£智 > > > > 012 3 2222 <400> 45

Asp Arg Tyr Tyr Gly Glu Val Ala Tyr ] 5 <210> 46 <400> 46 000 <210> 47 <400> 47 000 <210> 48 <211> 317 <212> DNA <213>會人 <400> 48 acatccagat gacccagtct ccttcactcc tgtcagcatc tgtgggagac agagtcactc tcagctgcaa agcaagtcag aatatttaca agtacttaaa ctggtatcag caaaagcltg gagaagctcc caaactcctg atatattata caaacagttt gcaaacgggc atcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct ggtacagatt tcacacttac catcagcagc ctgcagcctg aagatgttgc cacatattac tgctatcagi ataacagtgg gcccacgttt ggagctggga ccaagctgga actgaaa <210> 49 <211> 106 <212> PRT <213>智人 <400> 49

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asn lie Tyr Lys Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 •11· 159757·序列表.doc 201206954

TyrTyr Thr Asn Ser Leu Gin G.y lie Pro Ser Arg Phe Ser G.y

Scr Cly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Clu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gin Tyr Asn Ser Gly Pro Thr 85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 50 <21I> 372 <2)2> DNA <2丨3>智人 <400> 50 caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cttcccagac cctcagtctg acttgctctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tatgtgtgag ctggattcgt cagccticag ggaagggtct ggagtggctg gcaactattt gttgggagga tagtaagggc tacaaccctt ctctgaagaa ccggctcaca atctccaagg acacctccaa caaccaagca ttcctcaaga icaccagtgt ggacactgca gataccgcca tatactactg tgctcggccc cttaactacg gagggtatag tgagctagaa ttggattact ggggccaagg agtcatggtc acagtctcct ca <2I0> 51 <21]> 124 <212> PRT <213>智人 <400> 51

Gin Val Thr Leu Lys Glu Scr Gly Pro Gly lie Leu Gin Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Scr Leu Thr Cys Ser Phe Scr Gly Phe Scr Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly lie Cys Val Scr Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala Thr lie Cys Trp Glu Asp Ser Lys Gly Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Asn Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gin Ala 65 70 75 80

Phe Leu Lys He Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala lie Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Pro Leu Asn Tyr Gly Gly Tyr Ser Glu Leu Glu Leu Asp 100 105 110

Tyr Trp Gly Gin Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser •12· 60 120 180 240 300 360 372 159757-序列表.doc 201206954 115 120 <210> 52 <21I> Π <212> PRT <213〉$ 人 <400〉 52

Lys Ala Ser Gin Asn He Tyr Lys Tyr Leu Asn 1 5 10 <210〉 53 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 53

Tyr Thr Asn Ser Leu Gin Thr <210> 54 <211> 8 <2\2> PRT <213>智人 <400> 54

Tyr Gin Tyr Asn Ser Gly Pro Thr <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 55

Thr Ser Gly lie Cys Val Ser I 5 <210> 56 <211> 16 <212> PRT <213>智人 <400> 56

Thr lie Cys Trp Glu Asp Ser Lys Gly Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn 15 10 15 <210> 57 <211> 14 <212> PRT <2】3>智人 <400> 57

Pro Leu Asn Tyr Gly Gly Tyr Ser Glu Leu Glu Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 58 <211> 19 <212> RNA <213>智人 <400> 58 -13· 159757-序列表.doc 201206954 uguaaaugcu guaacaauu <210> 59 <211> 19 <2】2> RNA <213>智人 <400> 59 gcuguaaaug cuguaacaa <210> 60 <2]1> 19 <2I2> RNA <2丨3>智人 <400> 60 gugugguauc uguugcaaa <210〉 61 <211> 19 <212> RNA <213> 智人 <400> 61 gcagacauug cgauaccaa <210> 62 <211〉】9 <212> RNA <2】3>智人 <400〉 62 auaccaaugc agaagagaa <2]0> 63 <211〉 19 <232> RNA <213〉智人 <400> 63 cuacagagcu gcagccuuu <210> 64 <211〉 19 <212〉 RNA <213> 智人 <400> 64 gaagagagac accaacuuc <210> 65 <21!> 19 <212> RNA <213>智人 <400> 65 acuuccccau cugcaucuu <210> 66 <21l> 19 <212> RNA <2丨3>智人 <400> 66 cugagcagca ccaccuauc 159757·序列表.doc 201206954 <210> 67 <211> 19 <212> RNA <213>智人 <400> 67 acagaugaga cagacuaca <2I0> 68 <211> 19 <212> RNA <213>智人 <400> 68 caaugcagaa gagaaggaa <210> 69 <211> 19 <212> RNA <213>智人 <400〉 69 aauucccagu gugguaucu <2I0> 70 <400> 70 000 <210> 71 <400〉 71 000 <210> 72 <211> 193 <212> PRT <213>智人 <400> 72

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 15 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45

Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60

Asn lie Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Ττρ Lys Arg 65 70 75 80

Met Glu Val Gly Gin Gin Ala Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu 85 90 95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110

Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 -15- 159757-序列表.doc 201206954

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gin Lys Glu 130 135 140

Ala lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Scr Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie 145 150 】55 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190

Arg <210> 73 <21!> 193 <212> PRT <213> % 人 <400> 73

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 15 10 15

Leu Ser Leu Pto Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30

He Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45

Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60

Asn lie Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80

Met Glu Val Gly Gin Gin Ala Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu 85 90 95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110

Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gin Lys Glu 130 135 140

Ala lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie 145 150 155 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu 丁yr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 •16· 159757·序列表.doc 201206954

Arg <210> 74 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <220> <221> misc feature <222> (1).7(1) <223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸 <400> 74

Xaa Ala Ser Asn Leu GIu Ser <210> 75 <211> 6 <212> PRT <2]3>智人 <220> <221> misc_feature <222〉（1).:(1) <223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸 <400> 75

Xaa Gin Ser Asn Glu GIu <210> 76 <211> 6 <212> PRT <2丨3>智人 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸 <220> <221> misc—feature <222> <6)..(6) <223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸 <400> 76 Gin Gin Xaa Asn Glu Xaa 1 5 <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213〉智人 <220> <221> mi sc feature <222> (5). Γ(5) <223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸 <220> <221> misc feature <222> (16)..(16) -17 159757-序列表.doc 201206954 • <223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸<400> 77 Trp lie Asn Thr Xaa Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Xaa15 10 15

Gly <210> 78 <211> 10 <212> PRT <213>智人 <220> <221> MISC FEATURE <222> (1)..(2)<223> Xaa可為任何胺基酸 <220> <221> MISC.FEATURE <222> (6)..(6)<223> Xaa可為任何胺基酸 <220> <221> MISC.FEATURE <222> (7)..(7)<223> Xaa可為任何胺基酸或不存在 <220> <221> MISC.FEATURE <222> (9)..(9)<223> Xaa可為任何胺基酸或不存在 <400> 78 Xaa Xaa Tyr Tyr Gly Xaa Xaa Ala Xaa Tyr 1 5 10 <210> 79 <211> 75 <212> DNA <213>小家鼠 <400> 79 gacaccaact tccccatctg catcttctgc tgtaaatgct gtaacaattc ccagtgtggt 60 atctgltgca aaaca 75 <210〉 <211> <212> <213> <400> 05 82 鼠 PRTl

Asp Thr Asn Phe Pro lie Cys lie Phe Cys Cys Lys Cys Cys Asn Asn ] 5 10 15

Ser Gin Cys Gly He Cys Cys Lys Thr 20 25 <210> 81 <21]> 75 <212> DNA <2】3>褐家鼠 159757-序列表.doc -18- 201206954 <400> 81 gacaccaact tccccatatg cctcttctgc tgtaaatgct gtaagaattc ctcctgtggt ctctgttgca taaca <210〉 82 <211> 25 <212> PRT <2I3>褐家鼠 <400> 82

Asp Thr Asn Phe Pro lie Cys Leu Phe Cys Cys Lys Cys Cys Lys Asn 15 10 15

Ser Ser Cys Gly Leu Cys Cys He Thr 20 25 <210> 83 <211> 78 <212> DNA <213>綠猴 <4〇0> 83 gacacccact tccccatctg cattttctgc tgcggctgct gtcatcgatc aaagtgtggg atgtgctgca ggacgtag <210> 84 <211> 25 <212> PRT <213>綠猴 <400> 84

Asp Thr His Phe Pro lie Cys lie Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg 15 10 15

Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Arg Thr 20 25 <210> 85 <211> 75 <212> DNA <213>穴:龙 <400> 85 gacacccact tccccatctg catcttctgc tgcagctgct gtaggaattc aaaatgtggg atctgctgca agacc <210> 86 <211> 25 <212> PRT <213>穴兔 <400> 86

Asp Thr His Phe Pro lie Cys lie Phe Cys Cys Ser Cys Cys Arg Asn 1 5 10 15

Ser Lys Cys Gly lie Cys Cys Lys Thr 20 25 <210> 87 <211> 75 •19- 159757-序列表.doc 60201206954 <2】2> ΚΊΑ <213> 狗 <400> 87 gacacccact tccccatctg catattctgc tgtggctgct gtaaaacacc gaagtgtggg cictgctgca taaca 75 <210〉 88 <21]> 25 <212> PRT <213> 狗 <400> 8S Asp Thr His Phe Pro lie Cys lie Phe Cys Cys Gly Cys Cys Lys Thr 1 5 10 15

Pro Lys Cys Gly Leu Cys Cys lie Thr 20 25 <210> 89 <21】> 75 <212> DNA <213> 狗 <400> 89 gacacccact tccccatctg catattctgc tgtggctgct gtaaaacacc gaagtgtggg ttctgctgca ggacg 60 75 <210> 90 <211> 25 <212> PRT <213> 狗 <400> 90 Asp Thr His Phe Pro lie Cys lie Phe Cys Cys Gly Cys Cys Lys Thr 15 10 15

Pro Lys Cys Gly Phe Cys Cys Arg Thr 20 25 <210> 91 <21l> 75 <212〉 DNA <213> 狗 <400> 91 gacacccact tccccatctg catattctgc tgtggctgct gtaaaacacc gaagtgtggg ttgigctgca agacg 60 75 <210> 92 <211> 25 <212> ?RT <213> 狗 <400> 92 Asp Thr His Phe Pro lie Cys lie Phe Cys Cys Gly Cys Cys Lys Thr 15 10 15

Pro Lys Cys Gly Leu Cys Cys Lys Thr 20 25 159757-序列表.doc -20- 201206954 <210〉 93 <211> 180 <212> DNA <213>智人 <400> 93 tctgttttcc cacaacagac gggacaactt gcagagctgc aaccccagga cagagctgga gccagggcca gctggatgcc catgttccag aggcgaagga ggcgagacac ccacttcccc atctgcatti tctgctgcgg ctgctgtcat cgatcaaagt gtgggatgtg ctgcaagacg 60 120 180 <210> 94 <211> 60 <212> PRT <213>會人 <400> 94 Ser Val Phe Pro Gin Gin Thr Gly Gin Leu Ala Glu Leu Gin Pro Gin 15 10 15

Asp Arg Ala Gly Ala Arg Ala Ser Trp Mel Pro Met Phe Gin Arg Arg 20 25 30

Arg Arg Arg Asp Thr His Phe Pro lie Cys lie Phe Cys Cys Gly Cys 35 40 45

Cys His Arg Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Lys Thr 50 55 60 <210> 95 <211> 60 <2I2> DNA <213>看人 <400> 95 atctgcattt tctgctgcgg ctgctgtcat cgatcaaagt gtgggatgtg ctgcaagacg 60 <210> 96 <211〉 20 <212> PRT <213〉智人 <400> 96 lie Cys lie Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg Ser Lys Cys Gly 15 10 15

Met

Cys Cys Lys Thr 20 <210> 97 <211> 66 <212> DNA <213>智人 <400> 97 ttccccatct gcaitttctg ctgcggctgc tgtcatcgat caaagtgtgg gatgtgctgc aagacg 60

<210> 98 <211> 22 <212> PRT 159757-序列表.doc 21- 66 201206954 <213>智人 <400> 98

Phe Pro He Cys lie Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg Ser Lys Cys 15 10 15

Gly Met Cys Cys Lys Thr 20 <2)0> 99 <21丨> 1650 <212> DNA <2丨3>小家鼠 <400> 99 agtccttaga ctgcacagca gaacagaagg catgatggca ctcagcactc ggacccaggc 60 tgcctgtctc ctgcttctcc tccttgccag cctgagcagc accacctatc tccatcaaca 120 ggigagcacc ccaggcccat tgtggtggga gagccaggtc ccaggcaggc aggagctgct 180 caccacigag tagttagaat ggctcaggag tgatggcagc tgctgacaag gaagagggtg 240 gtccttagtg ggagctggga agctgcacag gtgtccttga atagctactc tgttgtccta 300 ctgtggaaaa tgaagcatgg tgggagccaa acaaaagtgt tccttggctg tcccaccccg 360 (cagggcatt ctttaagcag cctttacatg agtattttat aaagaattac tgtggatagt 420 acaaaagaca atgggcagaa aaactctaat gaggaaggac cagaggtggg gctaagaggc 480 tgacagccag gcaaagtatt ctatgagaaa atgatacaga agtcgggcag tggtggcaca 540 tgcctttaat cccagcattt gggaggcaga ggcaggtgga tttctgagtt tgaatccagc 600 ctggtctaca aagtgagttt caagacagcc agggctacac agagaaatcc tgtctgaaaa 660 aaaaaaaaaa acaaaaaaag aaaaaaaaaa tgatacagaa gggtctggag agatggctta 720 gctgttagga acatttgatg cttgtgcata ggacctagag tcagttccca gcacccatgt 780 ggtggatcac aaccatcctg aactctactt ccagggtacc tgatgccttc tgccctagat 840 ggcagtcagc agtaagcatg catatgatac acataggcac tcaaggcaat cacaagaccc 900 ttggggactg tagggtctga taagtgaagc cagtgttggc aataaagggc tgtagaggtt 960 ctgctgtgcc gagctttgtg gacagctgtg cagatgatga tctgtcctgg aaagccacaa 1020 tccagatgaa tgtgctataa gcctttgtgc tatggggtga cctggttata agagataaga 1080 tgcagggaaa actgtccgga gtgtgcaaaa gcaaagaaag tgggtgcttt taggagcatc 1140 caaggaatgg igaggggaca cagggcagta ggagcccttc tagaaattct gtctaagcac 1200 agtccctaaa tctctgggga gaagctggca gagaaaagtc aggaagctat gccgggtact 1260 ccacaagatt caatacctct tctgctttca cagatgagac agactacaga gctgcagcct 1320 ugcacgggg aagaaagcag ggcagacatt gcggtaagag catctgggac tccctccctg 1380 atccccagcc tctcccatgc ccaagctagg ctgcttacct ctctttcttt acacagatac 1440 caatgcagaa gagaaggaag agagacacca acttccccat ctgcatcttc tgctgtaaat 1500 gctgtaacaa ttcccagtgt ggtatctgtt gcaaaacata gcctagagcc acatcctgac 1560 ctctctacac ccctgcagcc cctcaacccc attatttatt cctgccctcc ccaccaatga 1620 ccttgaaata aagacgattt tattttcaaa 1650 -22- 159757·序列表.doc 201206954 <2IO> 100 <211> 2637 <212> DNA <213> #人 <400> 100 gactgtcact cggtcccaga caccagagca agctcaagac ccagcagtgg gacagccaga 60 cagacggcac gatggcactg agctcccaga tctgggccgc ttgcctcctg ctcctcctcc 120 tcctcgccag cctgaccagt ggctctgttt Icccacaaca ggtgagagcc cagtggcct£ 180 ggtccttagc agggcagcag ggatgggaga gccaggcctc agcctagggc actggagaca 240 cccgagcact gagcagagct caggacgtct caggagtact ggcagctgaa caggaaccag 300 gacaggcacg gtggctcatg cctgtaatcc cagcactttg ggaggttgag gcaggcagcc 360 cacttgaggt cagtttgaga ccagcctggc caacatggta aaaccccgtc tctactaaaa 420 atacaaaagt tagccaggct tggtggcagg tgcctgtaat cccagctact cgggagactg 480 aggcaggaga attgcttgaa cccgcaaggt ggaggttgca cagtgagctg agattgcacc 540 actgcactcc agcctggcaa cagagcaaga ctccatctcc aaaaaagaac agaaatcaat 600 gaagcaccga gtgacaggga ctggaaggtc ctaattccat gggtatttac ggaaccccta 660 cgccgtgtgg agtcttattc tagacagtgg ggacgaggcc atgaacaagg tagatgagag 720 aggagatttc tccatcctgg tcagggaatt tgttaaagac tgatgaaaac atgaataaat 780 aaugtgtct agtacattc丨 attcgtgaat ctcataacag acagtggtag agtgaccgtg 840 acccatlcgc cacacagtag a&tcactttt ttggtttgtt ttttagagac agggtcltcc 900 tctgttgctg aggctggagt gcagtggtgc agtcatagtt cactgcagcc tcaacctcct 960 gtgctcaagc aatcctccca cctcagcgtc ccaagtagct gggacagcag gcacatgcca 1020 cgggttgggg gaccacaggc atggtcaagg ggctggcagt caagcaagtg tttcatgaga 1080 aagtgacagt tgaccttcgt cttggagggt gagagatgga ggcagcaaag acctaaggag 1140 aggacaagcc agcatagccc agggtcaggc tgaacaagag gagatggtgg gacttgggga 1200 taaggctgag gggtgggcag tccctaagtc ttgtgggcaa ccatgcagac actgattttt 1260 ccttggaata aagaggaagc ccccataagc tttttttttt ttttctgaga tagggtctcg 1320 ctctgtcgtt caggctggtg tgcagtggca tcatctgggc tcactgcaac ctccgcctcc 1380 cgggttcaag caattctcct gcctcagctt cccgagcagc igggattaca ggcggctgcc 1440 accacgcccg gctaattttt gtttttttag tagagacagg gtttcaccat gttggccaga 1500 ctggtcitga actcctgacc tcaggtgatt ctcccacctc ggcttcccaa agtgctggga 1560 ttacaggcgt gagccactgc gcccagcctc ctgtaggttt ttaaaatgga gaaaaccaca 1620 atctcactgg ccatgtttta aaaaacttaa tctgccagtc aggcaccatg gctcacacct 1680 gtaatcccag agttttggga ggccaaggta ggaagatcag ttgagcccag gagttcaaga 1740 ccagcttggg caacacaacc agaccccacc tctacaaaaa attaaaaaat tagccgggtg 1800 tggtggcgtg cacctgctgt cccagctact cgggaagctg aggcgggagc atcgcttgag 1860 cacaggaggt caaggctgca gggagctatg actgtgccac tgcactctgg cctgggcaac 1920 agaggaagac tctgtctaaa aaacaaacaa aaaaagtgac tctgctgtgt ggcaaatgga 1980 ttgaggggca agaatgcagg gaggtgtgtt aggaggctgg cactggcatc caggcagggg 2040 aaggtgatat cccaaagaag agtagcagct gtggaaagag gaggaggcgg atctgggagg 2100 •23· 159757·序列表.doc 201206954 tttttttttt taggaaaagc cgcccatggg aaggtgagca gaagcaagaa agcaaggccc ctcctaagag tccatttgag ctctgggttt aaaccacttg gagaggagca ggttgccggg agccagtctc agaggtccac tgggccccct gccatcctct gcaccccclt ctgctttcac agacgggaca acttgcagag ctgcaacccc aggacagagc tggagccagg gccagctgga tggtgagcgc aacagtgatg cctttcctag ccccctgctc cctccccatg ctaaggccgg ttccctgctc acattccctt ccttcccaca gcccatgttc cagaggcgaa ggaggcgaga cacccacttc cccatctgca ttttctgctg cggctgctgt catcgatcaa agtgtgggat gtgctgcaag acgtagaacc tacctgccct gcccccgtcc cctcccttcc ttatttattc ctgctgcccc agaacatagg tcttggaata aaatggctgg ttcttttgtt ttccaaa <210> 101 <211> 180 <2]2> DNA <213>智人 <400> 101 tctgttttcc cacaacagac gggacaactt gcagagctgc aaccccagga cagagctgga gccagggcca gctggatgcc catgttccag aggcgaagga ggcgagacac ccacttcccc atctgcatit tctgctgcgg ctgctgtcat cgatcaaagt gtgggatgtg ctgcaagacg 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2637 60 120 180 <2I0> 102 <211> 61 <212> PRT <213>智人 <400> 102 Gly Ser Val Phe Pro Gin Gin Thr Gly Gin Leu Ala Glu Leu Gin Pro 15 10 15

Gin Asp Arg Ala Gly Ala Arg Ala Ser Trp Met Pro Met Phe Gin Arg 20 25 30

Arg Arg Arg Arg Asp Thr His Phe Pro He Cys lie Phe Cys Cys Gly 35 40 45

Cys Cys His Arg Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Lys Thr 50 55 60 <210> 103 <21]> 301 <212> DNA <2丨3>智人 <400> 103 tcggccccgc ctcctgccac cgcagattgg ccgctagccc tccccgagcg ccctgcctcc gagggccggc gcaccataaa agaagccgcc ctagccacgt cccctcgcag ttcggcggtc ccgcggglct gtctcttgct tcaacagtgt ttggacggaa cagatccggg gactctcltc cagcctccga ccgccctccg atttcctctc cgcttgcaac ctccgggacc atcttctcgg ccatctcctg cttctgggac ctgccagcac cgtttttgtg gttagctcct tcttgccaac c 60 120 180 240 300 30】 159757-序列表.doc 24· 201206954 <210> 104 <211> 75 <2I2> DNA <213>备人 <400〉 104 gacacccact tccccatctg cattttctgc tgcggctgct gtcatcgatc aaagtgtggg atgtgctgca agacg <210〉 105 <211> 66 <212> DNA <213>智人 <400> 105 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt agatctgaat tcaatttacg cgtgggatcc aaggtc <210> 106 <400> 106 000 <210> 107 <211> 336 <212> DNA <213〉智人 <400> 107 gatattgtga tgacccagtc cccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtgatg gatacaacta tttggattgg tacctgcaga agtcagggca gtctccacag cgcctgatct atatgggttc taatcgggcc tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc agcagagtgg aggctgagga tgttgggglt tattactgca tgcaagctct acaaactccg cicactatcg gcggagggac caaggtggag atcaaa <210> 108 <211> 112 <2I2> PRT <213>畲人 <400> 108

Asp lie Va] Met Thr Gin Scr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30

Asp Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Ser Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Arg Leu He Tyr Met G.y Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Mel Gin Ala 85 90 95 -25· 159757·序列表.doc 201206954

Leu Gin Thr Pro Leu Thr lie Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105 110 <210> 109 <21l> 366 <212> DNA <213>智人 <400> 109 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agttatggca tgcactgggt ccgtcaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atttcatatg atggaagtaa tgaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtat attactgtgt gagagatgtg 300 t£gttcgggg agtccctcca cggtttggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tccica 366 110 »>>·>>*> Q ] ΛΖ 3 o n n «I u 2222 4 < < < < <

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phc Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val lie Scr Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phc Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Mel Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Val Arg Asp Val Trp Phe Gly Glu Ser Leu His Gly Leu Asp Val Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11) <211> 16 <212> PRT <213> %人 <400> ]11

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp » 5 10 15 26· 159757·序列表.doc 201206954 <210> 112 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 112

Met Gly Ser Asn Arg Ala Ser <210> 113 <211> 9 <212> PRT <213>智人 <400> 113

Met Gin Ala Leu Gin Thr Pro Leu Thr <210> 114 <211> 5 <212〉 PRT <2]3>智人 <400> 114

Ser Tyr Gly Met His ] <210> 115 <211> 17 <212> PRT <213>智人 <400> 115

Val He Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 】 5 10 15

Gly <210> 136 <211> 13 <212> PRT <213>智人 <400> 116

Asp Va! Trp Phe Gly Glu Ser Leu His Gly Leu Asp Val 1 5 10 <210> Π7 <21]> 333 <212> DNA <213>智人 <400> 117 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcactg ictggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggggcagctc caacatcggg tcaggttttg ctatatactg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tttggtgaca acattcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctccgcct ccctggccat cactgggctc 240 -27- 159757-序列表.doc 300201206954 caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg gttttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc eta 333 <210> 118 <211> 111 <212> PRT <2〗3>智人 <400> 118 Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Leu Ser Gly Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Arg Val Thr lie Ser Cys Thr Gly Gly Ser Ser Asn lie Cly Ser Gly 20 25 30

Phe Ala lie Tyr Trp Tyr Gin G!n Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45

Leu lie Phe Gly Asp Asn lie Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu 65 70 75 80

Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 119 <211> 351 <212> DNA <213>智人 <400〉 119 caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaage ctggggcctc agtgaaggtc tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtga aaaaaacact gcacagaaac tccagggcag agtcaccatg accacagaca caiccacgag cacagcctac atggagctga ggagcctgag atetgaegae acggccgtgt attactgtgc gagagaggaa ctaggggctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc a 60 120 180 240 300 351 <210> 120 <211> 117 <212> PRT <213>智人 <400> 120 Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Giy Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Gly lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 159757-序列表.doc • 28- 201206954 35 40 45

Gly Trp lie Ser Ala Tyr Asn Gly Glu Lys Asn Thr Ala Gin Lys Leu 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Glu Leu Gly Ala Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 121 <211> 14 <212> PRT <213>智人 <400> 121

Thr Gly Gly Ser Ser Asn lie Gly Ser Gly Phe Ala lie Tyr 1 5 10 <210> 122 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 122

Gly Asp Asn lie Arg Pro Ser <210> 123 <211> 11 <212> PRT <213>智人 <400> 123

Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val 1 5 10 <210> 124 <211> 5 <212> PRT <213> &人 <400> 124

Ser Tyr Gly He Ser 1 5 <210> 125 <211> 17 <212> PRT <213>智人 <400> 125

Trp lie Ser Ala Tyr Asn Gly Glu Lys Asn Thr Ala Gin Lys Leu Gin -29- 159757-序列表.doc 201206954 5 10 15

Gly <210> 126 <211> 8 <212> PRT <213>智人 <400> 126

Glu Glu Leu Gly Ala Phe Asp lie 1 5 <210> 127 <21]> 321 <212> IM <213>智人 <400〉 127 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc clctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaactaci tagcctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcacic tcatcatcag cagactggag cctgaagatt ttgiagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcactcac tttcggcgga gggaccaagg tggagatcaa a <210> 128 <21]> 107 <212> PRT <213>智人 <400> 128

Glu Me Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Asn 20 25 3〇

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

He Tyr Gly Ala Scr Ser Arg Ala Thr Gly He Pr〇 Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Scr Cly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu lie I]e Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Val Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Va丨 Glu lie Lys 100 105

<210> 129 <211> 366 <212> DNA -30· 60 120 180 240 300 321 159757·序列表 tdoc 201206954 <213>智人 <400> 129 caggttcagc tggtgcagtc tggagatgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttatc aagtatggaa tcagttgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcggcgctt tcaatggtaa cacagactat 180 gcacggaacc tccaggccag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtat attactgtgc gagagagggc 300 tggaacgacg actacttctg cggtttggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tccica 366 <210> 130 <211> 122 <212> PRT <213>智人 <400> 130

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Asp Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe lie Lys Tyr 20 25 30

Gly lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 G.yTrpneGlyAlaPhe Asn Gly Asn Thr Asp Tyr A,a Arg As, Leu

Gin Ala Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

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CyG.nGjyThrThrVa.ThrValSer Ser <210> )31 <211> 12 <212> PRT <213>智人 <400> 13]

Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu Ala 1 5 l〇 <210> 132 <21 ]> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 132 -31 - 159757-序列表.doc 201206954 G.y A,a Ser Ser Arg Ala Π,γ <210> 133 <211> 8 <212> PRT <213> + 人 <400> ]33

Gin Gin Tyr Giy Ser Ser Leu Thr l>> Λ > o 12 <21<2I<21<21 <400> 134 5 PRT 智人 134

Lys Tyr Gly He Ser 5 T人 5 1317PR智13 <2)0> <211> <212> <213> <400>

Trp lie Gly Ala Phe Asn Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Arg Asn Leu Gin 1 5 10 15

Ala <210〉 136 <2I1> 13 <212> PRT <213>智人 <400> 136

Glu Gly Trp Asn Asp Asp Tyr Phe Cys Gly Leu Asp Val 1 5 10 <210> 137 <2Π> 318 <212> DNA <213>智人 <400〉 137 tatgagctga ctcagccacc ctcagtgtcc gtgtccccag gacagacagc cagcctcacc 60 tgctctggag ataaattggg ggatagatat gcttcctggt atcagcagaa gccaggccag 120 icccctgigc tggtcatcta tcaagatagc aagcggccct cagggatccc tgagcgattc 180 tctggctcca actctgggaa cacagccact ctgaccatca gcgggaccca ggctatggat 240 ga^gctgact aitacigtca ggcgtgggac agcagcactg catgtgtctt cggaactggg 300 accaaggtca ccgtccta 318 <210> 138 <21]> 106 <212> PRT <213>智人 -32- 159757·序列表.doc 201206954 <400> 138

Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin Thr 15 10 15

Ala Ser Leu Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Arg Tyr Ala Ser 20 25 30

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Val Leu Va] lie Tyr Gin 35 40 45

Asp Ser Lys Arg Pro Ser Cly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn 50 55 60

Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr He Ser Gly Thr Gin Ala Met Asp 65 70 75 80

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Cys Val 85 90 95

Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 139 <21 b 363 <212> DNA <213>智人 <400> 139 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc tcctgtgcag cgtctggatt caccctcagi agctatggca tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atgaaagtaa taaatactat gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgttgaat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctttgt attactgtgc gagagccggt atagcagcag cccttgatgc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctct tea <210> 140 <211> 121 <212> PRT <213>智人 <400> 140

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg l 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val lie Trp Tyr Asp Glu Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 33· 60 120 180 240 300 360 363 159757-序列表.doc 201206954

Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ala Gly lie Ala Ala Ala Leu Asp Ala Phe Asp lie Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 141 <211> 11 <2)2> PRT <2丨3>智人 <400> 14]

Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Arg Tyr Ala Ser 1 5 10 <210> 142 <21I> 7 <212〉 PRT <213>智人 <400> 142

Gin Asp Ser Lys Arg Pro Ser <210> 143 <211> 10 <2]2> PRT <2丨3>智人 <400> 143

Gin Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Cys Val 10 <210> 144 <2]1> 5 <212> PRT <213>智人 <400> 144

Ser Tyr Gly Met His <210> 145 <21)> 17 <212> PRT <213>智人 <400> 145

Val lie Trp Tyr Asp Glu Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly 34- 159757·序列表.doc 201206954 <210〉 146 <211> 12 <212> PRT<213>智人 <400> 146 Ala Gly He Ala Ala Ala Leu Asp Ala Phe Asp lie 1 5 10 <210> 147 <211> 333 <212> DNA <213> 士人 <400> 147 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcactg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc tcctgcactg ggggcagctc caacatcggg tcaggttttg ctatatactg gtaccagcag cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtgaca acattcggcc ctcaggggtc ccigaccgat tctctggcic caagtctggc acctccgcct ccctggccat cactgggctc caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc eta 60 120 180 240 300 333 <210> 148 <211> 111 <212> PRT <213> ‘人 <400> 148 Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Leu Ser Gly Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Arg Val Thr lie Ser Cys Thr Gly Gly Scr Ser Asn He Gly Ser Gly 20 25 30

Phe Ala lie Tyr Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45

Leu lie TyT Gly Asp Asn lie Arg Pto Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu 65 70 75 80

Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Scr 85 90 95

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 149 <211> 351 <212> DNA <2丨3>智人 <400> 149 caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaage ctggggcctc agtgaaggtc tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 60 159757-序列表.doc -35- 120 180 201206954 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtga aacaaacact gcacagaaac tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagaggaa ctaggggctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc a <210> 150 <211> 117 <212> PRT <213>智人 <400> 150

Gin Val Gin Leu Val Gin Scr Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phc Thr Ser Tyr 20 25 30

Gly lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Ser Ala Tyr Asn Gly Glu Thr Asn Thr Ala Gin Lys Leu 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

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Thr Gly Gly Ser Ser Asn lie Gly Scr Gly Phe Ala lie Tyr 1 5 10 <210> 152 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 152

Gly Asp Asn lie Arg Pro Ser <210> 153 <21]> 11 <2!2> PRT <213>智人 36- 240 300 351 159757·序列表.d〇c 201206954 <400> 153

Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Va] 1 5 10 <2】0> 154 <21i> 5 <212> PRT <213>智人 <400〉 154

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Gly <210> 156 <211> 8 <212> PRT <213>智人 <400> 156

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Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 1 5 10 15

Thr Ala Thr lie Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Glu Arg Tyr Ala 20 25 30 •37- 159757-序列表.doc 201206954

Cys Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Gin Asp lie Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

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Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Ala Trp Tyr Ser Ser Thr Asn Val 85 90 95

Leu Phe Gly Cly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 159 <2]1> 363 <212> DNA <213> ^ 人 <400> 159 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg ctgaaagtaa taaatactac gcagaciccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagcccag gagggtatag cccctgacgc ttttgatatc tggggccaag gaacaatggt caccgtctct tea

<210> 】60 <211> 123 <212〉 PRT <2丨3>智人 <400〉 160

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val lie Trp Tyr Ala Glu Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ala Gin Glu Gly lie Ala Pro Asp Ala Phe Asp lie Trp Gly 38- 60 120 180 240 300 360 363 159757·序列表.doc 201206954 100 105 110

Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 >>>>> 012 3 2222 v<< < 1— 16ns <400> 161

Ser Gly Asp Lys Leu Gly Glu Arg Tyr Ala Cys 1 5 10 <210> 162 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 162

Gin Asp He Lys Arg Pro Ser <2!0> 163 <211> 10 <212> PRT <213>智人 <400〉 163

Gin Ala Trp Tyr Ser Ser Thr Asn Val Leu ] 5 10 <210> 164 <2!1> 5 <212> PRT <2]3>智人 <400> 164

Ser Tyr Gly Met His <210> 165 <211> 17 <212> PRT <2丨3>智人 <400〉 165

Val lie Trp Tyr Ala Glu Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <2】0>丨66 <21]> 12 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 166

Ala Gin Glu Gly He Ala Pro Asp Ala Phe Asp He 1 5 10 •39- 159757-序列表.doc 201206954 <210> 167 <211> 321 <212> m <213>智人 <400> 167 tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac agccaccatc acctgctctg gagataaait gggggaaaga tatgcgtgtt ggtatcagca gaggccaggc cagtcccctg tactggtcat ctatcaagat agcaagcggc cctcagggat ccctgagcga ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca teagegggae ccaggctatg gatgaggetg actatttctg tcaggcgtgg tacagcagca ccaatgtgct tttcggcgga

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Gin Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

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Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Ala Trp Tyr Ser Ser Thr Asn Val 85 90 95

Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 169 <211> 363 <212> DNA <213>智人 <400> 169 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agetatggea tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg ctgaaagtaa taaatactac gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag ageegaggae acggctgtgt attactgtgc gagagcccag gagggtatag cccctgacgc ttttgatatc tggggccaag gaacaatggt caccgtctct tea • 40· 159757-序列表.doc 201206954 <210> 170 <211> 121 <212> PRT <213>智人 <400> 170

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 】 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phc Thr Phc Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ala Gin Glu Gly lie Ala Pro Asp Ala Phe Asp lie Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 171 <211> 11 <212> PRT <213>智人 <400> 171

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Gin Asp Ser Lys Arg Pro Ser <210> 】73 <211> 10 <212> PRT <213>智人 <400> 173

Gin Ala Trp Tyr Ser Ser Thr Asn Val Leu 1 5 10 <210> 174 -41· 159757-序列表.doc 201206954 <211> 5 <212> PRT <213>智人 <400> 174

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Gly <210> 176 <211> 12 <212> PRT <213>智人 <400> 176

Ala Gin Glu Cly He Ala Pro Asp Ala Phe Asp He 1 5 10 <210> 177 <211> 330 <2I2> DNA <213>智人 <400> 177 aattttatgc igactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agctactatg tgcagtggta ccagcagcgc ccgggcagit cccccaccac tgtgatctat gaggatagcc agagaccctc tggggtccct gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga cigaagactg aggacgaggc tgactattat tgtcagtctt atgatagcag caatgtggta ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta <210> 】78 <211> 110 <212〉 PRT <213>智人 <400> 178

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Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val 35 40 45 lie Tyr Glu Asp Ser Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser -42- 60 120 180 240 300 330 159757-序列表.doc 201206954 50 55 60

Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Gly 65 70 75 80

Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser 85 90 95

Ser Asn Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <2I0> ]79 <211> 366 <212> DNA <213>智人 <400> 179 caggiacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagte ctgcttggaa ctggatcagg cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggttt aatgattatg cagtatctgt gcaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca agagggattg tcttctccta egetatggae gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctca <210> 180 <21l> 122 <212〉 PRT <2丨3>智人 <400> 180

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 1 5 l〇 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala lie Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp lie Arg Gin Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45

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Val Ser Val Gin Ser Arg lie Thr lie Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80

Gin Phe Scr Leu Gin Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly He Val Phe Ser Tyr Ala Met Asp Val Tn> 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Scr 115 120 -43· 60 120 180 240 300 360 366 159757-序列表.doc 201206954

<210〉 181 <211> 13 <212> PRT <2I3>智人 <400> 181

Thr Arg Ser Ser Gly Ser lie Ala Ser Tyr Tyr Val Gin ] 5 10 <210> 182 <2I1> 7 <212> PRT <2】3>智人 <400> 182

Glu Asp Ser Gin Arg Pro Ser <210> 183 <211> 9 <212> PRT <2】3>智人 <400> 183

Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Asn Val Val <210> 184 <21]> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 184

Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn > > > > 0 12 3 2222 <400> 185 18 PRT智人 185

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Gly lie Val Phe Ser Tyr Ala Met Asp Val 1 5 10 <210> 187 <21]> 321 <212> DNA <2丨3>智人 •44· 159757·序列表.doc 201206954 <400> 187 tcctatgagc tgactcagcc cccctcagtg tccgtgtccc caggacagac agccagcatc 60 acctgttctg gagataaaat gggggaaaga tatgcttgct ggtatcagca gaagccaggc 120 cagtccccta tactggtcat ctatcaagat accaagcggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240 gatgaggctg actattactg tcaggcgtgg tacagcagca ccaatgtggt attcggcgga 300 gggaccaagc igaccgtcct a 321 <210> 188 <211> 107 <212> PRT <213>智人 <400> 188

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly Asp Lys Met Gly Glu Arg Tyr Ala 20 25 30

Cys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro lie Leu Val lie Tyr 35 40 45

Gin Asp Thr Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

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Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ala Trp Tyr Ser Ser Thr Asn Val 85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105

<210> 189 <2Π> 363 <2!2> DNA <213>智人 <400> 189 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt aactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg ttggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag ageegaggae acggctgtgt attactgtgc gagagcccag 300 gagggtatgg cccctgatgc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctct 360 tea 363 。1^人 1912PR1智 > > > > 012 3 22,2 2 45- 159757-序列表.doc 201206954 <400> 190

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Va) lie Trp Tyr Val Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ala Gin Glu Gly Met Ala Pro Asp Ala Phe Asp lie Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 191 <211> 11 <212〉 PRT <213>智人 <400> 191

Ser Gly Asp Lys Met Gly Glu Arg Tyr Ala Cys 1 5 10 <210> 192 <211> 7 <212> PRT <2】3>智人 <400> 192

Gin Asp Thr Lys Arg Pro Ser <230> 193 <21]> 10 <212> PRT <213>智人 <400> 193

Gin Ala Trp Tyr Ser Ser Thr Asn Val Val ] 5 10 <210> 194 <211> 5 <212> PRT <213>智人 <400> 194

Asn Tyr Gly Met His • 46- 159757-序列表.doc 201206954

<210> 195 <211> 17 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 195

Val lie Trp Tyr Val Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly 6 T人6 1912PR智19 10>π>!2>13> 21212 2 <4A11 e phlo a p As o pr m t c M 5 <210> 197 <2Π> 717 <212> DNA <2丨3>智人 <400> 197 atgaggctcc ctgcicagct cctggggctg ctaatgctct gggtctctgg atccagtggg 60 gatattgtga tgacccagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc ]20 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtgatg gatacaacta tttggattgg 180 tacctgcaga agtcagggca gtctccacag cgcctgatct atatgggttc taatcgggcc 240 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 300 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 360 ctcactatcg gcggagggac caaggtggag atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540 tcgggtaaci cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ciacagcctc 600 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 717 <210> 198 <211> 239 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 198

Mel Are Leu Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser 1 5 10 15

Gly Ser Ser Gly Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 -47- 159757-序列表.doc 201206954

Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser 35 40 45

Leu Leu His Ser Asp Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys 50 55 60

Ser Gly Gin Ser Pro Gin Arg Leu lie Tyr Met Gly Ser Asn Arg Ala 65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95

Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110

Cys Met Gin Ala Leu Gin Thr Pro Leu Thr lie Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125

Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro 130 135 140

Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp 165 170 175

Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp 180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin 210 215 220

Gly Leu Scr Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Ar£ Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 199 <211> 1401 <212> DNA <213>智人 <400> 199 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac cttcagtagt tatggcatgc actgggtccg tcaggctcca ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttatt tcatatgatg gaagtaatga atactatgca gactccgtga agggeegatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gctgtatatt actgtgtgag agatgtgtgg ttcggggagt ccctccacgg tttggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tcagcctcca ccaagggccc ateggtette cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg •48· 159757·序列表.doc 201206954 tcgtggaact caggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccagctgt cctacagtcc icaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcaactt cggcacccag acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gacagttgag cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccagcaccac ctgtggcagg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcagttcaa ca£cacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaag£ cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cacctcccat gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a <210> 200 <211> 467 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 200

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Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Va) Glu Ser G!y Gly Cly Val Val Gin 20 25 30

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Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Va) Arg Gin Ala Pro Gly Lys Giy Leu 50 55 60

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Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Me Scr Arg Asp Asn Scr Lys Asn 85 90 95

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Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Val Trp Phe Gly Glu Ser Leu His Gly Leu 115 120 125

Asp Va] Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Scr Ala Scr Thr 130 135 140 159757·序列表.doc • 49· 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1401 201206954

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 145 150 155 160

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190

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Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys 210 215 220

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Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala 245 250 255

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Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300

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Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Va] Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 •50· 159757-序列表.doc 201206954

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe lie Lys Tyr 20 25 30

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Ala Arg Glu Gly Trp Asn Asp Asp Tyr Phe Ser Gly Leu Asp Val Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 203 <211> 5 <212> PRT <213> 士人 <400> 203 •51· 159757-序列表.doc 201206954

Lys Tyr Gly lie Ser

<210> 204 <211> 17 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 204

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Ala <210> 205 <211> 13 <212> PRT <213>智人 <400> 205

Glu Gly Trp Asn Asp Asp Tyr Phe Ser Gly Leu Asp Val 1 5 10 <210> 206 <211> 1401 <212> DNA <213> ^人 <400> 206 atggactgga cctggagcat ccttttcttg gtggcagcag caacaggtgc ccactcccag gttcagctgg tgcagtctgg agatgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc tgcaaggctt ctggttacac ctttatcaag tatggaatca gttgggtgcg acaggcccct ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc ggcgctttca atggtaacac agactatgca cggaacctcc aggccagagt caccatgacc acagacacat ccacgagcac agcctacatg gagctgagga gcctgagatc tgacgacacg gccgtatatt actgtgcgag agagggctgg aacgacgact acttctccgg ttiggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc icagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccagctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcaactt cggcacccag acciacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gacagttgag cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccagcaccac ctgtggcagg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcglggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggac £gcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcagttcaa cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgttgtgcac caggaciggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 159757-序列表.doc -52- 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 Π40 201206954 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cacctcccat gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a <2)0> 207 <211> 467 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 207

Met Asp Trp Thr Trp Ser lie Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 15 】0 15

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Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu -53· 1200 1260 1320 1380 1401 159757·序列表.doc 201206954 225 230 235 240

Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala 245 250 255

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Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val •57- 159757-序列表.doc 201206954 305 310 315 320

Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser 340 345 350

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Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 405 410 415

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Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro 165 170 175

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn 180 185 190

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser 丁yr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys 】95 200 205

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Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 <210> 219 • 60· 600 660 702 159757·序列表.doc 201206954 <211> 702 <212> DNA <213>智人 <400> 219 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gegccagtca gagtgttagc agcaactact tagcctggta ccagcagaaa 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcatcatcag cagactggag 300 cctgaagatt ttgtagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcactcac tttcggcgga 360 gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 702 <210> 220 <21i> 234 <212> PRT <2B>智人 <400> 220

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Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Val Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 100 105 110

Gly Ser Ser Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 115 120 125

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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 •61 - 159757-序列表.doc 201206954

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175

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Met Asp Trp Thr Trp Ser lie Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15

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Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn 210 215 220

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Ser Gly Asp Lys Leu Gly Glu Arg Tyr Ala Ser I 5 10 <210> 237 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 237

Gin Asp Ser Lys Arg Pro Ser <210> 238 <211> 10 <212> PRT <213>智人 -71 - 159757·序列表.doc 201206954 <400> 238

Gin Ala Trp Tyr Ser Ser Thr Asn Val Leu 1 5 10 92 A人 2370w智 ^ > > > 0123 2222 < < < < <400> 239 atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcc 60 agatgttatg agctgactca gccaccctca gtgtccgtgt ccccaggaca gacagccacc 120 atcacctgct ctggagataa attgggggaa agatatgcgt cttggtatca gcagaggcca 180 ggccagtccc ctgtactggt caictatcaa gatagcaagc ggccctcagg gatccctgag 240 cgattctctg gctccaactc tgggaacaca gccactctga ccatcagcgg gacccaggct 300 atggatgagg ctgactattt ctgtcaggcg tggtacagca gcaccaatgt gcttttcggc 360 ggagggacca agctgaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 420 ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 480 ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 540 gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 600 agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 660 gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt ca 702 <210> 240 <211> 234 <212> PRT <2I3>智人 <400> 240

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Gly Thr Gin Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Ala Trp Tyr loo 105 no

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Gly Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 130 135 140

Glu Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu He Ser Asp 145 150 155 160

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Ser Trp Ala Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Leu Ser Gly Ala 20 25 30 -73- 159757·序列表.doc 201206954

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Gly Thr Gin Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ala Trp Tyr 100 105 110 • 78 - 159757·序列表.doc 201206954

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Gly Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 130 135 140

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Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 405 410 415

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Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460

Gly Lys 465 <210> 256 <211> 696 <212> DNA <2]3>智人 <400> 256 atggcatgga tccctctctt cctcggcgtc cttgcttact gcacaggatc cgtggcctcc 60 latgagctga ctcagccacc ctcagtgtcc gtgtccccag gacagacagc caccatcacc 120 tgctctggag ataaattggg ggaaagatat gcgtgttggt atcagcagag gccaggccag 180 tcccctgtac tggtcatcta tcaagatagc aagcggccct cagggatccc tgagcgattc 240 tctggctcca actctgggaa cacagccact ctgaccatca gcgggaccca ggctatggat 300 gaggctgact atttctgtca ggcgtggtac agcagcacca atgtgctttt cggcggaggg 360 accaagctga ccgtcctagg tcagcccaag gcigccccct cggtcactct gttcccgccc 420 tcctctgagg agcttcaagc caacaaggcc acactggtgt gtctcataag tgacttctac 480 ccgggagccg igacagtggc ctggaaggca gatagcagcc ccgtcaaggc gggagtggag 540 accaccacac cctccaaaca aagcaacaac aagtacgcgg ccagcagcta tctgagcctg 600 acgcctgagc agtggaagtc ccacagaagc tacagctgcc aggtcacgca tgaagggagc 660 accgtggaga agacagtggc ccctacagaa tgttca 696 <210> 257 <211> 232 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 257

Met Ala T:p lie Pro Leu Phe Leu Gly Val Leu Ala Tyr Cys Thr Gly ] 5 10 15

Ser Val Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser 20 25 30

Pro Gly Gin Thr Ala Thr He Thr Cys Scr Gly Asp Lys Leu Gly Glu 35 40 45

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Val lie Tyr Gin Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe 65 70 75 80

Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr -83· 159757·序列表.doc 4 201206954

Gin Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Ala Trp Tyr Ser Ser 100 105 Π0

Thr Asn Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly Gin 115 120 125

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 130 135 140

Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu He Ser Asp Phe Tyr 145 150 155 160

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Ala Ala Ser Ser Tyr Lea Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser His 195 200 205

Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 210 215 220

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 <210> 258 <211> 1398 <2I2> DNA <213>智人 <400> 258 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgicag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggaticac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgctg aaagtaataa atactacgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gcigtgtatt actgtgcgag agcccaggag 360 gglatagccc ctgacgcttt tgatatctgg ggccaaggaa caatggtcac cgtctcttca 420 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 480 agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540 tggaactcag gcgcictgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 600 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 660 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 720 aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 960 -84- 159757·序列表.doc 201206954 gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa <210> 259 <211> 466 <212> PRT <213>智人 <400> 259

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 15 10 15

Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30

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Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Va] His Thr 180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 85- 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1398 159757·序列表.doc 201206954

Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn 210 215 220

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg 225 230 235 240

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Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335

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Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 405 410 415

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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460

Gly Lys 465 <210〉 260 <2!1> 705 <212> DNA <213>智人 <400> 260 -86 - 159757·序列表.doc 201206954 atggcctggg ctccactact tctcaccctc ctcgctcact gcacaggttc ttgggccaat tttatgctga ctcagcccca ctctgtgtcg gagtctccgg ggaagacggt aaccatctcc tgcacccgca gcagtggcag cattgccagc tactatgt&c agtggtacca gcagcgcccg ggcagttccc ccaccactgt gatctatgag gatagccaga gaccctctgg ggtccctgat cggttctctg gctccatcga cagctcctcc aactctgcct ccctcaccat ctctggactg aagactgagg acgaggctga ctattattgt cagtcttatg atagcagcaa tgtggtattc ggcggaggga ccaagctgac cgtcctaggt cagcccaagg ctgccccctc ggtcactctg ucccgccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt gacttctacc cgggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctat ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gttca <210> 261 <211> 235 <2)2> PRT <213>智人 <400> 261

Met Ala Trp Ala Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ala His Cys Thr Gly 15 10 15

Ser Trp Ala Asn Phc Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser 20 25 30

Pro Gly Lys Thr Val Thr He Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser lie 35 40 45

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Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp SeT Ser 165 170 175 159757·序列表.doc 201206954

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<2I0> 263 <21I> 468 <212〉 PRT • 88 · 159757·序列表.doc 201206954 <213>智人 <400> 263

Met Ser Val Ser Phe Leu lie Phe Leu Pro Val Leu Gly Leu Pro Trp 15 10 15

Gly Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Va] 20 25 30

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Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu GIu Gin Phe Asn Ser Thr 305 310 315 320

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Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415

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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460

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Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys Tyr 180 185 190

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Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 210 215 220

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Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190

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Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 245 250 255

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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285

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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg 305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Vai Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu 340 345 350

Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 355 360 365 -93- 159757-序列表.doc 201206954

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 370 375 380

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Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445

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Gly Lys 465 <2!0> 268 <21I> 711 <212> DNA <2丨3>小家鼠 <400> 268 atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60 aacatcgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120 ataiccigca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagmtal gcactggiac 180 cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 240 ggggtccctg ccagettcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattgat 300 cctgtggagg ctgatgatgc tgcaacctat taccgtcagc aaaataatga ggatcggacg 360 ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc 420 ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac 480 aacitctacc ccaaagacat caatgtcaag tggaagattg atggcagtga acgacaaaat 540 ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac agcaaagaca gcacctacag catgagcagc 600 accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa cgacataaca gctatacctg tgaggccact 660 cacaagacat caacttcacc cattgtcaag agcttcaaca ggaatgagtg t 711 <210> 269 <2J1> 237 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 269

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15

Gly Ser Thr Gly Asn lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala -94· 159757-序列表.doc 201206954

Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser 35 40 45

Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 50 55 60

Gly Gin Pro Pto Lys Leu Leu lie Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 85 90 95

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Tyr Cla Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser 210 215 220

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Met Gly Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gin Ser l 5 10 15

Ala Gin Ala Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30

Pro Gly Glu Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45

Thr Thr Tyr Gly Met Ser Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

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Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Trp Tyr Tyr Gly Arg Ala Phe Asp Tyr Trp 115 120 125

Gly Gin Cly Thr Thr Leu Thr Val Scr Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro 130 135 140 159757-序列表.doc •96· 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1419 201206954

Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser 145 150 155 160

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175

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Ala Leu Leu Gin Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val 195 200 205

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Tyr Lys Asn Thr Ala Thr Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met 420 425 430

Tyr Ser Lys Leu Arg Val Gin Lys Ser Thr Trp Glu Arg Gly Ser Leu 435 440 445 •97- 159757·序列表.doc 201206954

Phc Ala Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His Leu Thr Thr 450 455 460

Lys Thr lie Ser Arg Ser Leu Gly Lys 465 470 <210> 272 <211> 711 <2)2> DNA <213>小家鼠 <400> 272 atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atatcctgca gagccagtga aagigttgat agttatggca atagttttat gcactggtac cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcacc aaagtaatga ggagtacacg ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc itcccaccat ccagtgagca gitaacatct ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aact tctacc ccaaagacat caatgtcaag tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag agcttcaaca ggaatgagtg t <210> 273 <21]> 237 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 273

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro I 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30

Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser 35 40 45

Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phc Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 50 55 60

Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80

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Leu Thr lie Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 •98- 159757-序列表.doc 201206954

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Ala Gin Ala Gin He Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30

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Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp He Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30

Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser 35 40 45

Val Asp Ser Phe Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gin Leu Lys Pro 50 55 60

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Glu Arg Gin Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gin Asp Ser Lys 180 】85 190

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Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser 210 215 220

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Met Gly Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gin Ser 15 10 15

Ala Gin Ala Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys -103· 159757·序列表.doc 201206954 20 25 30

Pro Gly Glu Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45

Thr Thr Tyr Gly Met Ser Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

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Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 130 135 140

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Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175

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Val Leu Gin Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro 195 200 205

Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Va] Ala His Pro 210 215 220

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys lie Val Pro Arg Asp Cys Gly 225 230 235 240

Cys Lys Pro Cys lie Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe lie 245 250 255

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Val Thr Cys Val Val Val Asp lie Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gin 275 280 285

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Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu 305 310 315 320 -104- 159757-序列表.doc 201206954

Pro lie Met His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Are 325 330 335

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Me Glu Lys Thr lie Ser Lys 340 345 350

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Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gin Lys Ser Asn Trp Glu 420 425 430

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn 435 440 445

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 280 <211> 696 <212> DNA <213>褐家鼠 <400> 280 atggctccag tccaacttct agggcttttg ctgctctgcc tccgagccat gagatgtgac 60 atccagatga cccagtcicc ttcactcctg teageatetg tgggagacag agtcactctc 120 agctgcaaag caagtcagaa tatttacaag tacttaaact ggtatcagca aaagcttgga 180 gaagctccca aactcctgat atattataca aacagtttgc aaacgggcat cccatcaagg 240 ttcagtggca gtggatctgg tacagatttc acacttacca tcagcagcct gcagcctgaa 300 gatgttgcca catattactg ctatcagtat aacagtgggc ccacgtttgg agctgggacc 360 aagctggaac tgaaacgggc tgatgctgca ccaactgtat ctatcttccc accatccacg 420 gaacagttag caactggagg tgcctcagtc gtgtgcctca tgaacaactt ctatcccaga 480 gacatcagtg tcaagtggaa gattgatgge actgaacgac gagatggtgt cctggacagt 540 gttactgatc aggacagcaa agacagcacg tacagcatga gcagcaccct ctcgttgacc 600 aaggctgact atgaaagtea taacctctat acctgtgagg ttgttcataa gacatcatcc 660 tcacccgtcg tcaagagctt caacaggaat gagtgt 6.96 <210> 281 <211〉 232 <212> PRT <213>褐家鼠 <400> 281

Met Ala Pro Val Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Leu Arg Ala •105· 159757-序列表.doc 201206954 15 10 15

Met Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala 20 25 30

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asn lie 35 40 45

Tyr Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys 50 55 60

Leu Leu He Tyr Tyr Thr Asn Ser Leu Gin Thr Gly lie Pro Ser Arg 65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser 85 90 95

Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gin Tyr Asn Ser 100 105 110

Gly Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Clu Leu Lys Arg Ala Asp 115 120 125

Ala Ala Pro Thr Val Ser lie Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gin Leu Ala 130 135 140

Thr Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 145 150 155 160

Asp lie Ser Val Lys Trp Lys lie Asp Gly Thr Glu Arg Arg Asp Gly 165 170 175

Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 180 185 190

Met Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Clu Ser His Asn 195 200 205

Leu Tyr Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro Val Val 210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 <210> 282 <211> 1395 <212> DNA <213>褐家鼠 <400> 282 atgggcaggc ttacttcctc attcctgctg ctgattatcc ctgcatatgt cttgtctcag gtiactctga aagagictgg ccctgggata ttgeageett cccagaccct cagtctgact tgctctttct ctgggttttc actgagcact tctggtatat gtgtgagctg gattegteag cclicaggga agggtctgga gtggctggca actatttgtt gggaggatag taagggctac aacccttctc tgaagaaccg gctcacaatc tccaaggaca cctccaacaa ccaagcattc -106- 159757·序列表.doc 201206954

Leu Leu Leu He lie Pro Ala Tyr 10 15 GIu Scr Gly Pro Gly lie Leu Gin 25 30 Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu 45 Trp He Arg Gin Pro Ser Gly Lys 60 ctcaagatca ccagtgtgga cactgcagat aactacggag ggtatagtga gctagaattg gtctcctcag ctgaaacaac agccccatct aaaagtaact ccatggtgac ccigggatgc accgtgacct ggaactctgg agccctgtcc cagtctggac tctacactct caccagctca caggccgtca cctgcaacgt agcccacccg gtgccaaggg aatgcaatcc ttgtggatgt ttccccccaa agaccaaaga tgtgctcacc gtggtagaca ttagccagaa tgatcccgag gaagtccaca cagctcagac tcatgccccg gtcagtgaac tccccatcgt gcaccgggac gtcaacagtg gagcattccc tgcccccatc ccacgaggtc cacaggtata caccatggcg gtcagtatca cctgcatggt aaaaggcttc atgaacgggc agccacagga aaactacaag agttacttcc tctacagcaa gctcaatgta ttcacgtgtt ctgtgctgca tgagggcctg cactctccgg gtaaa <2I0> 283 <211> 465 <212> PRT <213>褐家鼠 <400> 283

Met Gly Arg Leu Thr Scr Ser Phe 1 5

Val Leu Scr Gin Val Thr Leu Lys 20

Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr 35 40

Ser Thr Ser Gly lie Cys Val Ser 50 55 accgccatat actactgtgc tcggcccctt gattactggg gccaaggagt catggtcaca gtctatccac tggctcctgg aactgctctc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtc agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg gtgactgtac cctccagcac ctgg'tccagc gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt acaggctcag aagtatcatc tgtcticatc atcactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt gtccggttca gctggtttat agatgacgtg gagaagcagt ccaacagcac tttacgctca tggctcaatg gcaagacgtt caaatgcaaa gagaaaagca tctccaaacc cgaaggcaca cctcccaagg aagagatgac ccagagtcaa tatcccccag acatttatac ggagtggaag aacactccac ctacgatgga cacagatggg aagaaagaaa catggcagca gggaaacact cacaaccacc atactgagaa gagtctctcc 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1395

Gly Leu Glu Trp Leu Ala Thr lie Cys Trp GIu Asp Ser Lys Gly Tyr 65 70 75 80

Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Asn 85 90 95'

Asn Gin Ala Phe Leu Lys lie Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala 100 105 Π0

He Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Leu Asn Tyr Gly Gly Tyr Ser Glu Leu •107· 159757-序列表.doc 201206954 115 120 125

Glu Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140

Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala Leu 145 150 155 160

Lys Ser Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe 165 170 175

Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser Gly 180 185 190

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Thr 195 200 205

Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Ser Ser Gin Ala Val Thr 210 215 220

Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys lie 225 230 235 240

Val Pro Arg Glu Cys Asn Pro Cys Gly Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser 245 250 255

Ser Va) Phe Me Phe Pro Pro Lys Thr Lys Asp Va) Leu Thr lie Thr 260 265 270

Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp lie Ser Gin Asn Asp 275 280 285

Pro Glu Val Arg Phe Ser Trp Phe lie Asp Asp Val Glu Val His Thr 290 295 300

Ala Gin Thr His Ala Pro Glu Lys Gin Ser Asn Ser Thr Leu Arg Ser 305 310 3]5 320

Val Ser Glu Leu Pro lie Val His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Thr 325 330 335

Phe Lys Cys Lys Val Asn Ser Gly Ala Phe Pro Ala Pro He Glu Lys 340 345 350

Ser lie Ser Lys Pro Glu Gly Thr Pro Arg Gly Pro Gin Val Tyr Thr 355 360 365

Met Ala Pro Pro Lys Glu Glu Met Thr Gin Ser Gin Val Ser lie Thr 370 375 380

Cys Met Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp lie Tyr Thr Glu Trp Lys 385 390 395 400

Met Asn Gly Gin Pro Gin Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met 405 410 415 -108- 159757·序列表.doc 201206954

Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phc Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys 420 425 430

Glu Thr Trp Gin Gin Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu 435 440 445

Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly 450 455 460

Lys 465 <210> 284 <211> 17 <212> PRT <213>智人 <220> <221> misc-feature <222> (3).7(3) <223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸 <220> <221> misc feature <222> (5)..(6) <223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸 <400> 284

Val lie Xaa Tyr Xaa Xaa Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210> 285 <211> 17 <212> PRT <213〉七人 <220> <221> misc feature <222> (3)..(3) <223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸 <220> <221> misc feature <222> (5)..(5) <223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸 <220> <221> misc_feature <222〉（8)..(11) <223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸 <220> <221> misc_feature <222> (13)7.(15) <223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸 <220〉 <221> misc_feature <222> (17)7.(17) <223> X叫可為任何天然存在之胺基酸 <400> 285 109· 159757·序列表.doc 201206954

Trp lie Xaa Ala Xaa Asn Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Gin 15 10 15

Xaa <210> 286 <2]1> ]2 <212> PRT <213>智人 <220> <221> <222> <223> misc feature (5)..(5)

Xaa可為任何天然存在之胺基酸 <400> 286

Ala Gin Glu Gly Xaa Ala Pro Asp Ala Phe Asp lie 1 5 10 <210> 287 <211> 10 <212> PRT <213>智人 <220> <221> mi sc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸 <400> 287

Gin Ala Trp Tyr Ser Ser Thr Asn Val Xaa 1 5 10 <210> 288 <2]1> 10 <2I2> PRT <213>智人 <220> <221> misc feature <222> (9)..(10) <223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸 <400> 288

Gin Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Xaa Xaa 1 5 10 <210> 289 <21]> 11 <212> PRT <213>智人 <220> <221> MISC FEATURE <222> (7)..(9) <223> Xaa可爲任何胺基酸 <220>

<221 > MISC FEATURE <222> (10)..(11) i <223> Xaa可為任何胺基酸或不存在 •110· 159757·序列表.doc 201206954 <400> 289 Gin Ser Asp Tyr Ser Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 290 <211> 330 <212> DNA <213>智人 <400> 290 cagtctgtgc tgacicagcc accctcaacg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc tcttgttctg gaagcaactc caacatcgga agtcaaactg ttaactggta ccagcaactc ccaggaacgg cccccaaact cctcatcttt agtcatcatc accggccctc aggggtccct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggtgtggta ttcggcggag ggaccaaact gaccgtccta 60 120 180 240 300 330 <210> 291 <211> 110 <212> PRT <213>智人 <400> 291

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser

Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gin 10 15

Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn lie Gly Scr Gin 20 25 30

Thr Val Asn Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Phe Ser His His His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Ser Gly Leu Gin 65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95

Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 292 <211> 375 <212> DNA <213>智人 <400> 292 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc tcctgtgcag cctctggatt cacctccagt gacgcctgga tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca aaactgatgg tgggacaaca gaciicgctg cacccgtgaa aggeagatte accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg ctgtatctgc aaatgaacag ccigaacacc gaggacacag cagtgtatta ctgtacctca 60 120 180 240 300 159757-序列表.doc -111 - 360 201206954 375 tctcatagca gcgcctggta cggctacitc ggtatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca <210> 293 <211> 125 <212> PRT <213>智人 <400> 293

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Giy Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Scr Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Arg lie Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Phe Ala Ala 50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Asn Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95

Tyr Cys Thr Ser Ser His Ser Ser Ala Trp Tyr Gly Tyr Phe Gly Met 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210〉 294 <211> 13 <212> PRT <2]3>智人 <400> 294

Ser Gly Ser Asn Ser Asn lie Gly Ser Gin Thr Val Asn 1 5 10 <210> 295 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 295

Ser His His His Arg Pro Ser <210> 296 <211> Π <212> PRT <213>智人 <400> 296

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Val Val -112· 159757-序列表.doc 201206954 5 l〇

<210> 297 <211> 10 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 297

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp Met Ser 1 5 10 <210> 298 <211> 19 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 298

Arg lie Lys Scr Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Phe Ala Ala Pro 15 10 15

VaI Lys Gly <210> 299 <211> 14 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 299

Ser His Ser Ser Ala Trp Tyr Gly Tyr Phe Gly Met Asp Val 1 5 10 <2)0> 300 <211> 330 <212> DNA <213>令人 <400> 300 cagtctgtgc tgactctgtc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc tcttgttctg gaagcacctc caacatcgga agtaatactg taaattggtt ccagcagctc ccaggaacgg cccccaaact cctcatcttt agtaataatc agcggccctc aggggtccct gaccgattit ctgcctccaa gtclggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag tctgaggatg aggcigatta ttactgtgca gcgtgggatg acagcctgaa tggtgtggta tteggeggag ggaccaagct gaccgtccta <210> 301 <211> 110 <212> PRT <213>智人 <400> 301

Gin Ser Val Leu Thr Leu Scr Pro Scr Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gin 15 10 15

Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn lie Gly Ser Asn 20 25 30

Thr Val Asn Trp Phe Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu • 113· 159757·序列表.doc 201206954 35 40 45

He Phe Scr Asn Asn Gin Arg Pro Scr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Ala Ser Lys Scr Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Ser Gly Leu Gin 65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95

Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Cly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 302 <211> 375 <212> DNA <213>智人 <400〉 302 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc Uggtaaagc ctggggggtc ccttagactc tcctgtgcag cctctggaal cactltcagt aacgcctgga igagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt atcaaaagca agactgatga tgggacaaca gactacgctg cacccgtgaa aggeagatte accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaccaca tetgatagea gcggctggta cggctactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccg丨ct cctca 60 120 180 240 300 360 375 <210> 303 <21]> 125 <212> PRT <213>智人 <400> 303

Glu Val Gin Leu Val

Glu Scr Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly He Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30

Tro Met Scr Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Arg Me Lys Scr Lys Thr Asp Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95

Tyr Cys Τ.Γ T,r Ser Asp Ser Ser G.y Trp Tyr Gly Tyr Tyr Gly Met 159757·序列表 d〇c -114· 201206954

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 304 <2]]> 13 <212> PRT <213>智人 <400> 304

Ser Gly Ser Thr Ser Asn He Gly Ser Asn Thr Val Asn 10 <210> 305 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 305

Ser Asn Asn Gin Arg Pro Ser <210> 306 <211> 11 <212> PRT <213>智人 <400〉 306

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Val Val 1 5 10 <210> 307 <211> 10 <212> PRT <213〉_ 人 <400> 307

Gly lie Thr Phe Ser Asn Ala 丁rp Mel Ser 1 5 10 <210> 308 <21I> 19 <212> PRT <213>智人 <400> 308

Arg lie Lys Ser Lys Thr Asp Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro 15 10 15

Val Lys Gly <210> 309 <211> 14 <212> PRT <213>智人 <400> 309

Ser Asp Ser Ser Gly Trp Tyr Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210〉 310 115· 159757·序列表.doc 201206954 <211> 330 <212> WA <213>智人 <400> 310 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc tcttgttttg gaagcagctc caacatcgga agtaattctg taaactggta ccagcagctc ccaggaacgg cccccaaact cctcatcttt agtaatgatc agcggccctc aggggtccct gaccgattct ctgggtccaa gtctggcacc tcagattccc tggccatcag tgggctccag tctgaggatg aagctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggtgtggta ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta <210> 311 <211> 110 <212> PRT <213> %人 <400> 311

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Scr Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gin 15 10 15

Arg Val Thr lie Ser Cys Phe Gly Ser Ser Ser Asn He Gly Ser Asn 20 25 30

Ser Val Asn Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Phe Ser Asn Asp Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Scr 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Asp Ser Leu Ala lie Ser Gly Leu Gin 65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95

Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 312 <211> 375 <212> DNA <213>智人 <400> 312 gaggtgcagc tgitggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc icctgtgcag cctctggatt cactttcagt aatgcctgga tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca aaactgatgg tgggacaaca gactacgctg ctcccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaagacacg ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaccaca tctgatagca gcggctggtt cgggtactac ggaatggacg ictggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca <210> 313 • 116· 159757·序列表.doc 201206954 <211> 125 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 313

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu SeT Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Cly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Arg lie Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asp Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Clu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Ser Asp Ser Ser Gly Trp Phe Gly Tyr Tyr Gly Met 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 314 <211> 13 <212> PRT <2n>智人 <400> 314

Phe Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ser Asn Ser Val Asn 1 5 10 <210> 315 <211> 7 <212> PRT <213>智人 <400> 315

Ser Asn Asp Gin Arg Pro Ser <210> 316 <2il> 11 <212> PRT <213>智人 <400> 316

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Giy Val Val i 5 10 <210> 317 <211> 10 <212> PRT <213>智人 117- 159757·序列表.doc 201206954 <400> 317

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser 1 5 10 <210> 318 <211> 19 <212> PRT <213>智人 <400> 318

Arg lie Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro 15 10 15

Val Lys Gly <2]0> 319 <211> 14 <212> PRT <213>智人 <400> 319

Ser Asp Ser Ser Gly Trp Phe Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 320 <211> 330 <212> DNA <213>智人 <400> 320 cagtctgtgc tgacicagcc accctcaacg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccaic tcttgttttg gaagcaactc caacatcgga agtcaaactg ttaactggta ccagcaactc ccaggaacgg cccccaaact cctcatcttt agtcatcatc accggccctc aggggtccct gaccgattct ctggctccaa £tctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag tcigaggatg aggctgatta uacigtgca acatgggatg acagcctgaa tggtgtggta ttcggcggag ggaccaaact gaccgtccta <210> 321 <211> 110 <m> prt <213>智人 <400> 321

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gin 15 】0 15

Arg Va) Thr lie Ser Cys Phe Gly Ser Asn Ser Asn Me Gly Ser Gin 20 25 30

Thr Val Asn Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45

He Phe Ser His His His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 -118 · 159757·序列表.doc 201206954

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Ser Gly Leu Gin 65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95

Asn Gly Val Val Phc Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 HO <210> 322 <2U> 375 <212> DNA <213> &人 <400〉 322 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc tcctgtgcag cctctsgatt cactttcagt gacgcctgga tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg gactggggtg ggttggccgt attaaaagca aaactgatgg tgggacaaca gacttcgctg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtacctca tctcatagca gcgcctggta cggctacttc ggtatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca <210> 323 <21]> 125 <212> PRT <213〉％人 <400> 323

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Cly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gly Trp Val 35 40 45

Gly Arg lie Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Phe Ala Ala 50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phc Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95

Tyr Cys Thr Ser Ser His Ser Ser Ala Trp Tyr Gly Tyr Phc Gly Met 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210> 324 <211> 13 <212> PRT 119· 159757·序列表.doc 201206954 <213>智人 <400> 324

Phe Gly Ser Asn Ser Asn lie Gly Ser Gin Thr Val Asn 1 5 10 <210> 325 <211> 7 <212> PRT <2]3>智人 <400> 325

Ser His His His Arg Pro Ser <2)0> 326 <211> II <212> PRT <2丨3>智人 <400> 326

Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Val Val 1 5 10 <210> 327 <211> 10 <212> PRT <213>智人 <400> 327

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp Met Ser ] 5 10 <210> 328 <211> ]9 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 328

Arg He Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Phe Ala Ala Pro ] 5 10 15

Va] Lys Gly <210〉 329 <211> 14 <212> PRT <2】3>智人 <400> 329

Ser His Ser Ser Ala Trp Tyr Gly Tyr Phe Gly Met Asp Val 1 5 10 120- 159757-序列表.doc

Claims

201206954 七、申請專利範圍：種包a SEQ ID NO: 96中所示之胺基酸序列的生物活性 ’屯化非尿源非哺乳動物之人類海帕西咬的組合物，其中至少75%之該人類海帕西啶具有C2-C4二硫鍵、C5-C7二硫鍵、C1-C8二硫鍵及C3_C6二硫鍵。 2. —種鑑別與人類海帕西啶結合之化合物的方法，盆包含： ’、使候選化合物與如請求項1之組合物接觸；及偵測該候選化合物與該組合物中之人類海帕西啶之間的複合物，其中複合物之偵測指示該候選化合物與人類海帕西咬結合。 3. 一種鑑別與人類海帕西啶結合之化合物的方法，其包含：使候選化合物與如請求項1之組合物接觸；俄測該候選化合物與該組合物中之人類海帕西咬之間的複合物’其中複合物之偵測指示該候選化合物與人類海帕西咬結合；及將該候選化合物製成適於投與哺乳動物之藥物。 4_ 一種活體外產生人類海帕西啶之抗體的方法，包含：使產生免疫球蛋白之細胞與如請求項214之組合物接觸；及分離由該細胞所產生之免疫球蛋白。 5. 一種測試包含抗體之組合物結合人類海帕西啶之能力的方法，其包含： 159757.doc 201206954 使該包含抗體之組合物與如請求項1之組合物接觸；及偵測該抗體與人類海帕西啶之間的複合物，其中複合物之偵測指示該抗體與人類海帕西咬結合。 6. —種使包含SEQ ID NO: 96中所示之胺基酸序列之人類海帕西啶多肽再摺疊成生物活性形式的方法，其包含： (a) 在促進變性之條件下使人類海帕西啶多肽暴露於離液劑（chaotropic agent); (b) 在促進恢復成正確摺疊及生物活性形式之條件下使 (a)之產物暴露於氧化劑；及 (0回收包含該生物活性人類海帕西啶多肽之溶液，其中至少75〇/〇之該人類海帕西&多肽至少具有c2_c4二硫鍵及C5-C7二硫鍵。 7·如請求項6之方法’其中(b)包含使該人類海帕西啶多肽與空氣以外之氧化劑接觸。 8. 如請求項6之方法’其中該氧化劑包含麵胱甘肽。 9. 如請求項6之方法，其中⑷在低於5之pH發生。 1〇·如請求項6之方法’其中(b)在含有低於〇.1%乙酸之溶液中發生。 U.如請求項6之方法，其中（b)在大於8之pH發生。 12. 如請求項6夕古、+ 万法，其中該離液劑為胍或其鹽。 13. 如請求項12之古 ’其中δ玄胍係以範圍介於約4 Μ至約6 Μ之濃度存在。如月求項6-13中任一項之方法，其進一步包含純化該人 159757.doc 201206954 類海帕西咬多肽。 I5· 一種海帕西啶肽類似物，包含一個胺基酸序列與SEQ ID NO: 96中所示之胺基酸序列至少7〇%一致，其保留所有8 個半胱胺酸且另保留C2_C4二硫鍵。 1 種海帕西咬肽類似物，包含一個胺基酸序列與seQ ID NO: 96中所示之胺基酸序列至少7〇%一致，其保留所有8 個半胱胺酸且另保留C5-C7二硫鍵。 Π.如請求項16之海帕西啶類似肽，其進一步保留^_以二硫鍵。 18. 如吻求項15-17中任一項之海帕西咬類似肽，其保留膜鐵轉運蛋白結合活性。 19. 如請求項18之海帕西啶類似肽，其活化膜鐵轉運蛋白。 20. 如明求項15-17中任一項之海帕西咬類似肽，其降低活體内循環鐵含量。 21. 如請求項18之海帕西啶類似肽，其抑制膜鐵轉運蛋白鐵運輸。 22. 如明求項15-17中任一項之海帕西唆類似肽，其抑制sEq ID NO: 9之成熟人類海帕西啶之鐵調節活性。 23_如請求項15-17中任一項之海帕西啶類似肽，其增加活體内循環鐵含量。 159757.doc