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TW201139666A - Novel antibody having modification site introduced therein, and antibody fragment - Google Patents

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TW201139666A
TW201139666A TW100110498A TW100110498A TW201139666A TW 201139666 A TW201139666 A TW 201139666A TW 100110498 A TW100110498 A TW 100110498A TW 100110498 A TW100110498 A TW 100110498A TW 201139666 A TW201139666 A TW 201139666A
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TW
Taiwan
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antibody
monoclonal antibody
fragment
antibody fragment
substituted
Prior art date
Application number
TW100110498A
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English (en)
Inventor
Motoo Yamasaki
Yasuhisa Shiraishi
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kirin Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
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Description

201139666 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本土月係關於帛具有可有效率地與親水性或兩親性之 高分子修飾基鍵結的新顆半胱胺酸殘基（以下記載為印殘 基）的抗體或該抗體片段。又，本發明係關於一種經該Cys 殘基化學修飾之㈣之抗體修飾體或抗體片段修飾體。 【先前技術】 抗體由於具有高結合親和性、結合特異性及血中之高穩 0 疋性，故而作為針對人類之診斷藥、治療藥之應用不斷推 進（非專利文獻1)。於抗體醫藥之應用向前發展之背景下， 可列舉運用基因工程來製作人類型嵌合抗體、人類化抗體 (非專利文獻2〜5)。關於人類型嵌合抗體，其抗體可變區 域係由人類以外之動物之抗體構成，而恆定區域係由人類 抗體構成。 關於人類化抗體，其抗體可變區域中，互補決定區域 ◎ (eomplementarity-determining region、CDR)係由人類以外 之動物之抗體構成’而其他架構區域（frainework region、 FR)及悝定區域係由人類抗體構成。藉此，解決了非人類 型動物抗體之高免疫原性、低效應活性之問題。 但是’此種抗體係分子量超過10萬之巨大分子，自血中 向組織之轉移極為緩慢。因此，目前正研究經低分子化而 增大生物體内轉移性之抗體片段。抗體療法之高特異性與 親和性可由抗體可變區域之CDR決定。 作為具有抗體可變區域之抗體片段，已知有Fv、Fab、 155030.doc 201139666
Fab'、F(ab’）2、單鏈抗體（seFv)、二聚化 v區域（diab〇dy)、 二硫鍵穩定性V區域（dsFv)等多種形狀，低分子化所伴隨 的較短之血中半衰期已成為較大課題。 作為本課題之解決方法，現提供有一種經聚乙二醇 (PEG)等親水性高分子基或兩親性高分子基修飾之抗體片 段修飾體。藉由增加PEG之平均分子量，可將血中半衰期 調節為數分鐘至數小時’若為Fab，則藉由與分子量為4〇 kDa之PEG進行結合，亦可獲得與抗體同等之血中半衰期 (非專利文獻6)。 利用PEG修飾Fab片段之現有方法為：將參與Fab片段之 C末端側之二硫鍵的Cys殘基用作結合部位之方法；或使
Fab片段之C末端側進一步延長至鉸鏈區域，並將參與鉸鏈 區域之二硫鍵的Cys殘基用作結合部位之方法。但是，古亥 等片段均難以於表現、純化步驟中以游離狀態獲得殘 基。因此，作為PEG修飾之前處理，需要進行還原步驟（非 專利文獻6)。 另一方面，作為利用抗體之高結合特異性的新穎抗體衍 生物，目前抗體-藥物複合物（Antib〇dy_Drug c〇njug咖、 ADC)備受矚目（非專利文獻7、8)。ADC可利用由抗體結合 引起的靶抗原之内呑作用，將作為抗體衍生物内所承載之 功能性分子之一的藥物特異性輸送至靶細胞内。 抗體之效應功能具有經由免疫系細胞之細胞外之作用機 制，相對於此，ADC具有細胞内之作用機制，因此可根據 靶抗原之生物學特性而靈活應用。例如，美國之 155030.doc 201139666
Mylotarg( ”主冊商;^ )(Gemtuzumab 〇zogamicin)作為 ADc 製 劑而首次被世界所承認。又，於曲妥珠單抗 (Tratsuzumal^DMl針對Her2陽性之進行性乳癌患者之第 二期臨床試驗中，25%之患者可見癌之縮小。因此，ADc 之開發狀況之進展顯著，作為今後之新穎醫藥品形態而備 受期待。 由使用細胞株之研究結果顯示，ADC之藥效與所承載之 藥物之藥效強度、結合數相關。但是，於疏水性藥物之情 形時’於使用動物個體之藥效試驗中，出現如下問題：因 取決於藥物的疏水性之增加，導致血中之穩定性明顯降低 (非專利文獻9)。 PEG具有尚水合性，藉由調節分子量，可實現與使用藥 物對應之疏水性改善。作為本課題之解決方法，現已開始 開發含有PEG等親水性高分子或兩親性高分子之藥物，預 測親水性或兩親性分子之開發在ADC之藥效增強方向會有 較大進展（專利文獻1、2)。 現有之ADC製劑係經由抗體分子或抗體片段分子内之N 末端之α-胺基、離胺酸（LyS)殘基之ε_胺基、或Cys殘基之 硫醇基而進行共價鍵結。但是，通常對1分子抗體導入複 數種藥物之情形時，由於需要與反應性不同之胺基酸殘基 鍵結，故而依賴於反應規模或當量數等反應條件，會形成 藥物個數不同之不均勻之混合物。因此，於生產製程之構 建方面亦存在困難。 於天然胺基酸中，Cys殘基所具有之硫醇基即使於中性 155030.doc 201139666 pH區域亦具有高反應性，係於緩和之條件下進行反應之理 想宫能基。一般而言，針對親電子性之反應試劑，由於 Cys殘基所具有之硫醇基之反應性高於胺基末端之&胺基 或源自蛋白質内部之Lys殘基之ε_胺基、源自絲胺酸（Ser) 殘基或蘇胺酸（Thr)殘基之羥基，故而反應部位之控制較為 容易。 因此，藉由於抗體或抗體片段之特定部位、尤其是恆定 區域内導入1個以上之穩定之游離Cys殘基，於利用pEG等 親水性高分子或兩親性高分子、或者藥物等功能性分子化 學修飾抗體或抗體片段之情形時，可期待更有效率之化學 修飾、步驟數之減少、避免由還原操作引起之二硫鍵破壞 所伴隨之結構不穩定化。 先前，於大腸桿菌之周質空間或真核細胞之培養上清液 中表現蛋白質時’由於源自蛋白質之Cys殘基或人工置換 胺基酸殘基而導入之CyS殘基會受到分子間之二硫鍵之形 成或S-麩胱苷肽化等之影響，故而對具有反應性之游離 Cys殘基之置換較為困難（非專利文獻1〇、u)。 進而，關於抗體分子中之對Cys殘基之置換，報告有抗 體分子之内部之游離Cys殘基之比例高於抗體分子之表面 的情況，游離Cys殘基相對於全部置換Cys殘基的比率最大 為50%左右（非專利文獻12、專利文獻3)。 另一方面，亦報告有如下方法：基於結構資訊，將溶劑 可接觸面積之比例較高之結構區域或Ser殘基或Thr殘基等 結構與Cys殘基類似之殘基置換為游離Cys殘基的方法（專 155030.doc 201139666 利文獻4〜6)，但取得游離Cys殘基需要還原操作。 又，藉由使用模糊系統之PHESELECTOR分析，發現了 作為低分子之馬來醯亞胺-生物素體以60%〜100%之高效率 獲得修飾的置換為游離Cys殘基之部位（非專利文獻13、專 利文獻7)，但並未揭示PEG等親水性高分子基或兩親性高 分子基之修飾效率。 先前技術文獻 專利文獻 專利文獻1 :美國專利第6638509號說明書 專利文獻2:國際公開第2009/134952號 專利文獻3:美國專利第5219996號說明書 專利文獻4:國際公開第2008/020827號 專利文獻5:國際公開第2008/038024號 專利文獻6:國際公開第2009/092011號 專利文獻7 :國際公開第2006/034488號 非專利文獻 非專利文獻 1 : Monoclonal Antibodies : Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., (1995) 非專利文獻2 : Nature, 312, 643-646 (1984) 非專利文獻 3 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81，6851-6855 (1984) 非專利文獻4 : Nature, 321，522-525 (1986) 非專利文獻 5 : Nature，332, 323-327 (1988) 非專利文獻 6 : Protein Eng. Des. Sel.，20, 227-234 (2007) 155030.doc 201139666 非專利文獻 7 : Cancer J·，14，154-169 (2008) 非專利文獻 8 : Acc ChemRes., 41，98-107 (2008) 非專利文獻 9 : Clin. Cancer Res.，10，7063-7070 (2004) 非專利文獻 10 ·· Eur. J. Biochem., 267, 4928-4944 (2000) 非專利文獻 11 : Biochem. Biophy. Res. Commun·，242，1-9 (1998) 非專利文獻 12 : Protein Eng.，3, 703-708 (1990) 非專利文獻 13 : J. Immunol· Methods, 3 32, 41-52 (2008) 【發明内容】 發明所欲解決之問題 因此，本發明之目的在於提供一種抗體或抗體片段，其 係不易受到分子間之二硫鍵之形成或S-麩胱苷肽化等之影 響’且可以高效率利用PEG等親水性高分子基或者兩親性 高分子基、或藥物等功能性分子進行修飾的置換為穩定之 游離Cys殘基者。 更具體而s ’本發明係提供恒定區域内之1個以上之胺 基酸被置換為半胱胺酸殘基之單株抗體或該抗體片段、產 生该單株抗體或該抗體片段之融合瘤、編碼該單株抗體或 s亥抗體片段之DNA、含有該DNA之載體、將該載體導入宿 主細胞而獲得之轉形株、使用該融合瘤或該轉形株之單株 抗體或該抗體片段之製造方法、至少〗個所置換之半胱胺 酸殘基經化學修飾之該單株抗體或該抗體片段。 解決問題之技術手段 本發明之主旨如下。 155030.doc 201139666 •種單株抗體或該抗體片段，其係含有恆定區域者，且 該怪定區域内之丨個以上之胺基酸被置換為半胱胺酸殘 基。 2. 如上述第1項之單株抗體或該抗體片段，其中存在於輕 鏈匣疋區域之1個以上之胺基酸被置換為半胱胺酸殘基。 3. 如上述第1項之單株抗體或該抗體片段，其中存在於重 鏈〖亙疋區域之1個以上之胺基酸被置換為半胱胺酸殘基。 ❹ 4·如上述第3項之單株抗體或該抗體片段，其中存在於cH1 區域之1個以上之胺基酸被置換為半胱胺酸殘基。 5_如上述第1項至第4項中任一項之單株抗體或該抗體片 段，其中欲置換為半胱胺酸殘基之胺基酸之溶劑可接觸面 積之比率為30%以下。 6. 如上述第丨項至第5項中任一項之單株抗體或該抗體片 段’其中上述單株抗體之類型為免疫球蛋白G(IgG)。 7. 如上述第1項至第6項中任一項之單株抗體或該抗體片 ◎ #又’其中上述恆定區域為源自人類抗體之恆定區域。 8. 如上述第1項至第7項中任一項之單株抗體或該抗體片 丰又，其中上述單株抗體之類型為人類Ig(}，且選自下述 (1)〜（6)中之至少丨個以上之胺基酸被置換為半胱胺酸殘 基， (1) Kabat編號中人類igG之輕鏈區域之第124號之胺基酸 (2) Kabat編號中人類lgG之輕鏈區域之第198號之胺基酸 (3) Kabat編號中人類IgG之輕鏈區域之第2〇1號之胺基酸 (4) EU編號中人類IgG之重鏈區域之第14〇號之胺基酸 155030.doc 201139666 (Kabat編號中人類IgG之重鏈區域之第138號之胺基酸） (5) EU編號中人類IgG之重鏈區域之第147號之胺基酸 (Kabat編號中人類IgG之重鏈區域之第145號之胺基酸） (6) EU編號中人類IgG之重鏈區域之第183號之胺基酸 (Kabat編號中人類IgG之重鏈區域之第188號之胺基酸）。 9. 如上述第1項至第8項中任一項之單株抗體或該抗體片 段’其中至少1個所置換之半胱胺酸殘基經化學修飾。 10. 如上述第1項至第9項中任一項之單株抗體或該抗體片 段’其中所置換之半胱胺酸殘基係藉由非還原條件下之化 學修飾反應進行化學修飾。 11. 如上述第1項至第1〇項中任一項之單株抗體或該抗體片 段’其中所置換之半胱胺酸殘基之4〇%以上經化學修飾。 12. 如上述第9項至第π項中任一項之單株抗體或該抗體片 段’其中上述化學修飾為半胱胺酸殘基之硫醇基與含有親 水性高分子或兩親性高分子之修飾基之鍵結。 13·如上述第12項之單株抗體或該抗體片段，其中上述親 水性高分子或兩親性高分子為聚氧烷烯、多元醇或多糖。 14. 如上述第9項至第13項中任一項之單株抗體或該抗體片 段’其中上述化學修飾為半胱胺酸殘基之硫醇基與含有功 能性分子之修飾基之鍵結。 15. 如上述第14項之單株抗體或該抗體片段，其中上述功 能性分子為藥物、生理活性肽、生理活性蛋白質、核酸、 放射性標記化合物、糖鏈、脂質或螢光化合物。 16. 如上述第丨5項之單株抗體或該抗體片段，其中上述功 155030.doc 201139666 能性分子為核酸。 17·如上述第15項之單株抗體或該抗體片段，其中上述藥 物為抗腫瘤劑、抗生素或抗病毒劑。 18. 如上述第12項至第17項中任一項之單株抗體或該抗體 •片段’其中每1個修飾基之分子量為50〇 Da以上。 19. 如上述第丨項至第18項中任一項之單株抗體或該抗體片 段’其具有細胞毒殺活性。 20. 如上述第19項之單株抗體或該抗體片段，其中上述細 〇 胞毋殺活性為抗體依賴性毒殺活性或補體依賴性毒殺活 性。 21. 如上述第1項至第2〇項中任一項之抗體片段，其中上述 抗體片段為選自Fab、Fab'及F(ab，）2中之抗體片段。 22_如上述第1項至第21項中任一項之抗體或該抗體片段， 其中上述早株抗體為基因重組抗體。 23. 如上述第22項之抗體或該抗體片段，其中上述基因重 Q 組抗體為嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。 24. —種DNA’其編碼如上述第1項至第8項及第19項至第 23項中任一項之單株抗體或該抗體片段。 - 25.—種重組載體，其含有如上述第24項之DNA。 26. —種轉形株，其係將如上述第25項之重組載體導入宿 主細胞而獲得。 27. —種如上述第1項至第23項中任一項之單株抗體或該抗 體片段之製造方法，其包括將如上述第26項之轉形株於培 養基中進行培養，並自培養物中採集抗體或該抗體片段。 155030.doc 201139666 28.種如上述第9項至第23項中任一項之單株抗體或該抗 體片^又之製造方法，其包括藉由化學修飾反應對自上述培 養物採集之抗體或該抗體片段之半胱胺酸殘基進行化學修 飾。 發明之效果 本發明之早株抗體或該抗體片段含有野生型之恆定區域 内之1個以上之胺基酸殘基被置換為半胱胺酸殘基的恆定 區域，藉由含有野生型之恆定區域内之特定胺基酸殘基被 置換為半胱胺酸殘基的恆定區域作為較佳態樣，可不依賴 抗體之可變區域之胺基酸序列而以高效率利用pEG等親水 I*生回分子基或兩親性高分子基進行修飾，於低分子化之情 形時可防止血中半衰期之降低。藉由與以藥物等為代表之 功能性分子進行結合，可實現單株抗體或該抗體片段之高 功能化。又，所置換之Cys殘基於游離狀態下穩定，無需 作為利用PEG等之修飾之前處理的還原步驟，非常有用。 【實施方式】 本發明係關於一種含有恆定區域之單株抗體或該抗體片 段、該恆定區域内之1個以上之胺基酸殘基被置換為^”殘 基之單株抗體或該抗體片段（以下亦稱為置換為Cys殘基之 單株抗體或該抗體片段）。 抗體係包含約150 kDa之異二聚物，係由稱為重鏈（以下 亦稱為Η鏈）及輕鏈（以下亦稱為l鏈）之多肽所構成。又，H 鏈係自N末端側起由可變區域（以下亦稱為vH)、恒定區域 (CH)構成，l鏈係自N末端側起由可變區域（以下亦稱為 155030.doc 201139666 VL)、恆定區域（CL)構成。CH進而自N末端側起由CHI、 鉸鏈、CH2、CH3之各區域構成。又，將CH2與CH3並稱 為Fc區域。 作為抗體之類型，例如可列舉：免疫球蛋白G(IgG)、免 疫球蛋白A(以下亦稱為IgA)、免疫球蛋白E(以下亦稱為 IgE)、及免疫球蛋白Μ(以下亦稱為IgM)。作為本發明之單 株抗體或該抗體片段，較佳為IgG。進而，作為IgG之亞 型，可列舉：IgGl、IgG2、IgG3、及 IgG4。 本發明之單株抗體之恆定區域之來源並無特別限定，較 佳為源自哺乳動物。作為哺乳動物，例如可列舉：源自人 類、小鼠、大鼠、倉鼠、或兔之抗體等。作為本發明之單 株抗體或該抗體片段之恆定區域之來源，較佳為人類。 抗體之恆定區域可根據Kabat等人之編號（Kabat編 號）[Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242 (1991)]，規定為自 N 末端起之胺基酸殘基之編號。 例如，人類IgGl之CL規定為Kabat編號中第108-211號之 胺基酸序列，CH1規定為EU編號中第118〜215號之胺基酸 序列，鉸鍵區域規定為EU編號[Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242 (1991)]中第216~230號之胺基酸序列，CH2規定為 EU編號中第231〜340號之胺基酸序列，CH3規定為EU編號 中第341〜447號之胺基酸序列。 [置換為Cys殘基] 155030.doc -13- 201139666 本發明之單株抗體或該抗體片段係將天然存在之抗體 (以下記載為WT)之怪定區域中之1個以上之胺基酸殘基置 換為Cys殘基而成者。 將恆定區域中之1個以上之胺基酸殘基置換為Cys殘基， 可使用公知之部位特異性突變導入法[例如，Molecular Cloning ’ A Laboratory Manual，Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、
Nucleic Acids Research，10, 6487 (1982)、Proc.Natl. Acad. Sci. USA，79, 6409 (1982)、Gene, 34, 3 15 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985) ' Proc.Natl. Acad. Sci. USA，82, 488 (1985)]。 例如’可使用QuikChange II定點突變試劑套組 (Stratagene公司）等，根據質體之形狀，將WT之恆定區域 中之1個以上之胺基酸直接置換為Cys殘基，而製作本發明 之單株抗體或該抗體片段。 作為另一製作方法，可設計預先將WT之恆定區域中之1 個以上之胺基酸置換為Cys殘基的合成DNA序列，利用適 當之制限酶將其切斷，並插入至抗體或抗體片段之表現質 體中’而製作恆定區域中之1個以上之胺基酸殘基被置換 為Cys殘基的本發明之單株抗體或抗體片段。 本發明之欲置換為Cys殘基之胺基酸殘基係位於抗體之 怔定區域的胺基酸殘基，較佳為位於CL及CH之至少一方 的胺基酸殘基’更佳為位於CH1之胺基酸殘基。 155030.doc -14- 201139666 本發明之欲置換為CyS殘基之胺基酸殘基的數量並無特 別限定，較佳為1個〜數十個，更佳為例如丨〜⑼個。又更 佳為1個〜數個’更佳為例如1〜6個。 就另一觀點而言，欲置換為Cys殘基的WT之恆定區域中 之胺基酸殘基，其溶劑可接觸面積之比率較佳為3〇%以 下，更佳為25%以下，更佳為2〇%以下。藉由將溶劑可接 觸面積之比率為30%以下之胺基酸殘基置換為Cys殘基， 〇 可使忒Cys殘基之結構之可接觸較低，可期待導入Cys殘基 時不易形成二硫鍵，不易發生其他氧化反應。 溶劑可接觸面積可利用protein data bank(pDB)中所登錄 之抗體或抗體片段之結晶結構分析資料檔案（以下記載為 PDB 檔案），藉由 DSSP 程式[Biop〇lymers 22，2577-2637 (1983)]而容易地計算。 目標之胺基酸殘基之溶劑可接觸面積之比率可藉由用上 述所算出之抗體結構上之溶劑可接觸面積除以丙胺酸·χ_ ❹ 丙胺酸表示目標之胺基酸殘基）之溶劑可接觸面積而算 出。再者’有時1種蛋白質存在複數個PDb檔案，本發明 中可使用其任一者。 本發明中，於單株抗體之類型為人類IgG時，作為本發 明之單株抗體或該抗體片段，具體而言，較佳為含有將選 自wt之恆定區域内之下述（1)〜(6)中之至少丨個以上之胺基 酸置換為半胱胺酸殘基之恆定區域的單株抗體或該抗體片 段。 (1) Kabat編號中人類IgG之輕鏈區域之124號之胺基酸 155030.doc -15· 201139666 (2) Kabat編號中人類IgG之輕鏈區域之198號之胺基酸 (3) Kabat編號中人類IgG之輕鏈區域之201號之胺基酸 (4) EU編號中人類IgG之重鏈區域之140號之胺基酸 (Kabat編號中人類IgG之重鏈區域之138號之胺基酸） (5) EU編號中人類IgG之重鏈區域之147號之胺基酸 (Kabat編號中人類IgG之重鏈區域之145號之胺基酸） (6) EU編號中人類IgG之重鏈區域之183號之胺基酸 (Kabat編號中人類IgG之重鏈區域之188號之胺基酸） 於人類IgG中，藉由含有將選自WT之恆定區域内之上述 (1)〜（6)中之至少1個以上之胺基酸置換為半胱胺酸殘基之 恆定區域，可不依賴於可變區域之胺基酸序列而以高效率 藉由化學修飾反應進行修飾，同時可與WT同等以上之抗 原活性。 即，藉由含有選自將WT之恆定區域内之上述（1)〜（6)中 之至少1個以上之胺基酸置換為半胱胺酸殘基之恆定區 域，無論組合何種胺基酸序列之可變區域而獲得抗體或抗 體片段，所獲得之抗體或抗體片段均可以高效率藉由化學 修飾反應進行修飾。 又，所置換之Cys殘基於游離狀態下穩定，無需pEG等 之修飾之前處理’故而非常有用。進而，由於該Cys殘基 於游離狀態下穩定’故而具有如下優點：+易受到分子間 之一石瓜鍵之形成及S -越胱普肽化等之影響。 本發之單株L體或遠抗體片·^較佳為保持有與置換為 印殘基之前之WT同等以上之抗原結合活性。抗原結合活 155030.doc -16· 201139666 性可藉由例如結合試驗、螢光抗體法[Cancer Immunol. Immunother·，36，3 73 (1993)]或使用 Biacore 系統等之表面 離子體共振法等方法進行測定。
作為本發明之單株抗體或該抗體片段，例如可列舉：識 別腫瘤相關抗原之單株抗體或該抗體片段、識別與過敏或 炎症相關之抗原的單株抗體或該抗體片段、識別與循環器 官疾病相關之抗原的單株抗體或該抗體片段、識別與自身 免疫性疾病相關之抗原的單株抗體或該抗體片段、及識別 與病毒或細菌感染相關之抗原的單株抗體或該抗體片段 等。 作為腫瘤相關抗原，例如可列舉：CDla、CD2、CD3、 CD4、CD5、CD6、CD7、CD9、CD10、CD13、CD19、 CD20 、 CD21 、 CD22 、 CD25 、 CD28 、 CD30 、 CD32 、 CD33、CD38、CD40、CD40 ligand(CD40L) ' CD44、 CD45、CD46、CD47、CD52、CD54、CD55、CD56、 CD59、CD63、CD64、CD66b、CD69、CD70、CD74、 CD80、CD89、CD95、CD98、CD105、CD134、CD137、 CD138、CD147、CD158、CD160、CD162、CD164、 CD200、CD227、腎上腺髓素（adrenomedullin)、血管生成 素相關蛋白 4(angiopoietin related protein 4、ARP4)、極光 激酶（aurora)、B7-H1、B7-DC、整合素（integlin)、骨髓間 質抗原 2(bone marrow stromal antigen 2、BST2)、CA125、 CA19.9、碳_ 酸酐酶（carbonic anhydrase 9、CA9)、#5 黏素 (cadherin)、CC 趨化因子受體（cc-chemokine receptor、 -17- 155030.doc 201139666 CCR)4、CCR7、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen、 CEA)、多半胱胺酸纖維母細胞生長因子受體1(〇>^16丨1^-rich fibroblast growth factor receptor-1、CFR-1)、c-Met、 c-Myc、膠原蛋白（collagen)、CTA、結締組織生長因子 (connective tissue growth factor、CTGF)、CTLA-4、細胞 角質蛋白 18(cytokeratin-18)、DF3、約黏素E(E-catherin)、 表皮生長因子受體（epidermal growth facter receptor、 EGFR)、EGFRvIII、EGFR2(HER2)、EGFR3(HER3)、 EGFR4(HER4)、内皮糖蛋白（endoglin)、上皮細胞黏附分 子（epithelial cell adhesion molecule、EpCAM)、内皮細胞 蛋白質 C 受體（endothelial protein C receptor、EPCR)、 ephrin、ephrin 受體（Eph)、EphA2、endotheliase-2(ET2)、 FAM3D、纖維母細胞激活蛋白（fibroblast activating protein、FAP)、Fc受體同源體l(FcRHl)、鐵蛋白 (ferritin)、纖維母細胞生長因子8(fibroblast growth factors' FGF-8) 、 FGF8 受體 、驗性 纖維母 細胞生 長因子 （basic FGF、bFGF)、bFGF 受體、FGF 受體（FGFR)3、FGFR4、 FLT1、FLT3、葉酸受體（folate receptor)、捲曲蛋白同源體 10(Frizzled homologue 10、FZD10)、捲曲蛋白受體 4(frizzled receptor 4、FZD-4)、G250、G-CSF受體、神經 節苷脂（例如 GD2、GD3、GM2 及 GM3 等）、globo Η、 gp75、gp88、GPR-9-6、乙酸肝素酶 I(heparanase I)、幹細 胞生長因子（hepatocyte growth factor、HGF)、HGF 受體、 HLA抗原（例如HLA-DR等）、HM1.24、人乳脂肪球（human 155030.doc -18- 201139666 milk fat globule、HMFG)、hRS7、熱休克蛋白 90(heat shock protein 90、hsp90)、遺傳型抗原決定位（idiotype epitope)、類胰島素生長因子（insulin-like growth factor、 IGF)、IGF 受體（IGFR)、介白素（IL-6、IL-15 等）、介白素 受體（例如IL-6R及IL-15R等）、整合素、基因轉位相關免疫 受體（immune receptor translocation associated-4、IRTA-4)、激肽釋放酶 l(kallikrein 1)、KDR、KIR2DL1、 KIR2DL2/3、KS1/4、溶酶體相關膜蛋白1、溶酶體相關膜 蛋白2、層黏蛋白5、Lewis y、sialyl Lewis X、淋巴毒素-β-受體（lymphotoxin-beta receptor、LTBR)、LUNX、黑色 素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚糖（melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan、MCSP)、間質蛋白 (mesothelin)、MICA、穆勒氏抑制物 II 型受體（Mullerian inhibiting substance type II receptor、MISIIR)、黏液素 (mucin)、神經細胞黏附分子（neural cell adhesion molecule 、NCAM) 、Necl-5 、Notchl 、骨橋蛋白 (osteopontin)、血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor、PDGF)、PDGF 受體、血小板因子 4(PF-4)、 璘脂質絲胺酸（phosphatidylserine)、攝護腺特異性抗原 (Prostate Specific Antigen、PSA)、攝護腺幹細胞抗原 (prostate stem cell antigen、PSCA)、攝護腺特異性膜抗原 (prostate speciHc membrane antigen、PSMA)、甲狀旁腺激 素相關蛋白 / 肽（Parathyroid hormone related protein/ peptide、PTHrP)、核因子κΒ受體活化子配體（receptor 155030.doc -19- 201139666 activator of NF-kappaB ligand、RANKL) ' 透明質酸介導 細胞移動受體（receptor for hyaluronic acid mediated motility、RHAMM) 、ROBOl 、 SART3 、導向蛋白 4B(SEMA4B)、分泌型白細胞蛋白酶抑制劑（secretory leukocyte protease inhibitor、SLPI)、SM5-1、神經勒氨醇 1 -磷酸鹽（sphingosine-1-phosphate)、腫瘤相關糖蛋白 72(tumor-associated glycoprotein-72、TAG-72)、轉鐵蛋白 受體（transferrin receptor、TfR)、TGF-beta、Thy-1、Tie-1、Tie2受體、T細胞免疫球蛋白區域與黏蛋白區域1(T cell immunoglobulin domain and mucin domain 1、TIM-1)、人 類組織因子（human tissue factor、hTF)、Τη抗原、腫瘤壞 死因子(tumor necrosis factor 、 TNF) 、 Thomsen-Friedenreich抗原（TF antigen)、TNF受體、腫瘤壞死因子 相關細胞凋亡誘導配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand、TRAIL)、TRAIL 受體（例如 DR4 及DR5等）、系統ASC胺基酸轉運蛋白2(ASCT2)、trkC、 TROP-2、TWEAK受體Fnl4、IV型膠原蛋白酶、尿激酶受 體（urokinase receptor)、血管内皮生長因子（vascular endothelial growth factor、VEGF)、VEGF 受體（例如 VEGFR1、VEGFR2 及 VEGFR3 等）、中間絲蛋白（Vimentin) 及VLA-4等。 作為識別腫瘤相關抗原之抗體，例如可列舉：抗GD2抗 體[Anticancer Res.，13, 331 (1993)]、抗 GD3 抗體[Cancer Immunol. Immunother., 36, 260 (1993)]、抗 GM2 抗體 155030.doc -20- 201139666 [Cancer Res·，54, 1511 (1994)]、抗 HER2 抗體[Proc.Natl· Acad. Sci. USA，89, 4285 (1992)、US5725856]、抗 CD52抗 體[Proc. Natl· Acad. Sci. USA，89, 4285 (1992)]、抗 MAGE 抗體[British J. Cancer，83，493 (2000)]、抗 HM1.24 抗體 [Molecular Immunol·，36，387 (1999)]、抗副甲狀腺激素相 關蛋白（PTHrP)抗體[Cancer，88，2909 (2000)]、抗 bFGF 抗 體、抗 FGF-8抗體[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86，9911 (1989)]、抗 bFGFR抗體、抗 FGF-8R抗體[J. Biol. Chem.， 265，16455 (1990)]、抗IGF抗體[J. Neurosci. Res·，40，647 (1995)]、抗 IGF-IR 抗體[J. Neurosci. Res·，40, 647 (1995)]、抗 PSMA 抗體[J. Urology, 160，2396 (1998)]、抗 VEGF 抗體[Cancer Res·，57, 4593 (1997)]、抗 VEGFR 抗體 [Oncogene, 19，2138 (2000)、國際公開第 96/30046號]、抗 CD20抗體[Curr. Opin. Oncol.，10, 548 (1998)、美國專利第 5 736 137號說明書]、抗CD 10抗體、抗EGFR抗體（國際公開 第96/402010號）、抗Apo-2R抗體（國際公開第98/51793 號）、抗八8(：丁2抗體（國際公開第2010/008075號）、抗€丑入 抗體[Cancer Res., 55(23 suppl) : 5935s-5945s，（1995)]、抗 CD38抗體、抗CD33抗體、抗CD22抗體、抗EpCAM抗體及 抗A33抗體等。 作為識別與過敏或炎症相關之抗原的抗體，例如可列 舉：抗介白素 6抗體[Immunol. Rev., 127，5 (1992)]、抗介 白素 6受體抗體[Molecular Immunol·，31，371 (1994)]、抗 介白素5抗體[Immunol. Rev·，127, 5 (1992)]、抗介白素5受 155030.doc -21 - 201139666 體抗體、抗介白素4抗體[Cytokine，3, 562 (1991)]、抗介白 素 4受體抗體[J. Immunol. Methods, 217，41 (1998)]、抗腫 瘤壞死因子抗體[Hybridoma，13, 183 (1994)]、抗腫瘤壞死 因子受體抗體[Molecular Pharmacol·，58，237 (2000)]、抗 CCR4 抗體[Nature, 400, 776，（1999)]、抗趨化激素抗體 (Peri et al·, J. Immunol.Meth.，174，249, 1994)及抗趨化激 素受體抗體[J. Exp. Med_，186, 1373 (1997)]等。 作為識別與循環器官疾病相關之抗原的抗體，例如可列 舉：抗GPIIb/IIIa抗體[J. Immunol.，152, 2968 (1994)]、抗 血小板源增殖因子抗體[Science, 253, 1129 (1991)]、抗血 小板源增殖因子受體抗體[J. Biol. Chem.，272, 17400 (1997)]、抗凝血因子抗體[Circulation, 101， 1158 (2000)]、抗IgE抗體、抗ανβ3抗體及α4β7抗體等。 作為識別與病毒或細菌感染相關之抗原的抗體，例如可 列舉：抗 gpl20 抗體[Structure, 8, 385 (2000)]、抗 CD4 抗體 [J. Rheumatology，25, 2065 (1998)]、抗CCR5抗體及抗類志 贺毒素抗體[J. Clin. Microbiol., 37, 396 (1999)]等。 作為本發明之單株抗體，例如可列舉：由利用含有抗體 基因之表現載體轉形而獲得之轉形體所生產的將WT之恆 定區域中之1個以上之胺基酸殘基殘基置換為Cys殘基的基 因重組抗體等。作為該基因重組抗體，可列舉藉由基因重 組技術製造之抗體。具體而言，例如可列舉人類型嵌合抗 體、人類化抗體及人類抗體等。 人類型嵌合抗體係指由人類以外之動物之抗體之VL及 155030.doc -22- 201139666 VH、與人類抗體之CL及CH所構成之抗體。作為人類以外 之動物，例如可使用小鼠、大鼠、倉鼠及兔等之任何種 類。 人類型嵌合抗體可藉由如下方式製造：自產生單株抗體 之融合瘤取得編碼VL及VH之cDNA，分別插入至具有編碼 如下人類抗體之CL及CH之DNA的動物細胞用表現載體 中，再導入至動物細胞中使之表現，該人類抗體係適宜藉 由上述方法等將WT之恆定區域中之1個以上之胺基酸殘基 置換為Cys殘基者。 又，人類型嵌合抗體亦可藉由如下方式製造：自產生單 株抗體之融合瘤取得編碼VL及VH之cDNA，分別插入至具 有編碼人類抗體之CL及CH之DNA的動物細胞用表現載體 中，進而構建適宜藉由上述方法等將WT之恆定區域中之1 個以上之胺基酸殘基置換為Cys殘基的人類型嵌合抗體表 現載體，並導入至動物細胞中使之表現。 作為人類型嵌合抗體所使用之WT之CH，只要屬於人類 免疫球蛋白（以下記為hlg)則可為任何種類，較佳為使用 hlgG型之CH，進而可使用屬於hlgG型之hlgGl、hIgG2、 hIgG3及hIgG4等亞型中之任一者。又，作為人類型嵌合抗 體之CL，只要為屬於hlg之CL則可為任意，可使用κ型或 者λ型之之CL。 人類化抗體係指將人類以外之動物之抗體之VL及VH之 CDR之胺基酸序列移植至人類抗體之VL及VH之適當位置 的抗體，亦稱為人類型CDR移植抗體、改形抗體 155030.doc -23- 201139666 (reshaped-antibody) % ° 人類化抗體可藉由如下方式製造：將由產生人類以外之 動物之單株抗體的融合瘤所產生之人類以外之動物之抗體 之VL及VH之CDR之胺基酸序列移植至任意之人類抗體之 VL及VH之架構（FR)上而獲得可變區域（V區域），構建編碼 該可變區域之cDNA，分別插入至具有編碼適宜藉由上述 方法等將WT之恆定區域中之1個以上之胺基酸殘基置換為 Cys殘基的人類抗體之CL及CH之DNA的動物細胞用表現載 體中，並導入至動物細胞中使之表現。 又，人類化抗體亦可藉由如下方式製造：將由產生人類 以外之動物之單株抗體的融合瘤所產生之人類以外之動物 之抗體之VL及VH之CDR之胺基酸序列移植至任意之人類 抗體之VL及VH之FR上而獲得V區域，構建編碼該V區域之 cDNA，分別插入至具有編碼人類抗體之CL及CH之DNA的 動物細胞用表現載體中，進而構建適宜藉由上述方法等將 WT之恆定區域中之1個以上之胺基酸殘基置換為Cys殘基 的人類化抗體表現載體，並導入至動物細胞中使之表現。 人類化抗體之VH及VL之FR之胺基酸序列只要為源自人 類抗體之VH及VL之FR之胺基酸序列，則可使用任何種 類。例如可使用：登錄在PDB等資料庫中之人類抗體之VH 及VL之FR之胺基酸序列、或Sequences of Proteins of Immunological Interest > US Dept.Health and Human Services (1991)等中所記載之人類抗體之VH及VL之FR之 各亞群之通用胺基酸序列等。 155030.doc -24- 201139666 作為人類化抗體所使用之WT之CH，只要屬於hlg則可為 任何種類’較佳為使用hlgG型之CH，進而可使用屬於 hlgG型之 hlgGl、hIgG2、hIgG3、或 hIgG4 等亞型之任— 者。 又，作為人類型CDR移植抗體之Cl，只要屬於hIg則可 .為任意者，可使用κ型或λ型之CL。 本發明之人類抗體係指人類體内天然存在之抗體，或由 〇 隨著基因工程學、細胞工程學、發育工程學之技術之進步 而製作之人類抗體噬菌體庫及人類抗體產生基因轉殖動物 所獲得之抗體等WT之恆定區域中之〖個以上之胺基酸殘基 被置換為Cys殘基的抗體。 人類體内存在之抗體例如可藉由如下方式獲得：藉由單 獨分離人類周邊血淋巴球，使之感染EB病毒等而進行不朽 化、選殖，可培養產生該抗體之淋巴球，並自培養物純化 該抗體。 〇 人類抗體噬菌體庫係藉由將由人類B細胞製備之抗體基 因插入至噬菌體基因中，使Fab、scFv等抗體片段表現於 噬菌體表面而獲得之基因庫。可將針對固相化之抗原的結 合活性作為指標，自該基因庫回收表現具有抗原結合活性 之抗體片段的噬菌體。可由該抗體片段轉化為包含兩條完 整之Η鏈及兩條完整之L鏈的人類抗體分子。 人類抗體產生基因轉殖動物係指細胞内組入有人類抗體 基因的動物。具體而言，可向小鼠ES細胞中導入人類抗體 基因，將该ES細胞移植至小鼠之初期胚胎後使之發育，藉 155030.doc •25- 201139666 此製作人類抗體產生基因轉殖小鼠[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722 (2000)]。 由人類抗體產生基因轉殖動物製作人類抗體之方法可採 用如下方法：藉由通常之對人類以外之哺乳動物進行之融 合瘤製作方法，取得人類抗體產生融合瘤，進行培養，使 人類抗體產生蓄積於培養物令，而製作人類抗體。 又，亦可採用如下方法：自人類抗體產生融合瘤取得編 碼VL及VH之cDNA，分別插入至具有編碼適宜藉由上述方 法等將WT之恆定區域中之1個以上之胺基酸殘基置換為 Cys殘基之人類抗體之CL及CH之DNA的動物細胞用表現載 體中，並導入至動物細胞中使之表現，而製造人類抗體。 或者可採用如下方法：自人類抗體產生融合瘤取得編碼 VL及VH之cDNA，分別插入至具有編碼人類抗體之CL及 CH之DNA的動物細胞用表現載體中，進而構建適宜藉由 上述方法等將WT之恆定區域中之1個以上之胺基酸殘基置 換為Cys殘基的人類抗體表現載體，並導入至動物細胞中 使之表現，而製造人類抗體。 作為人類抗體所使用之WT之CH，只要屬於hlg則可為任 何種類，較佳為使用hlgG型之CH，進而可使用屬於hlgG 型之hlgGl、hIgG2、hIgG3、hIgG4等亞型之任一者。 又，作為人類抗體所使用之WT之CL，只要屬於hlg則可 為任意者，可使用κ型或者λ型之CL。 抗體片段係由抗體之一部分所形成。作為本發明之抗體 片段，例如可列舉Fab、Fab1及F(aW)2等具有恆定區域之抗 155030.doc -26- 201139666 體片段。 本發明之抗體片段進而包括：源自駱駝、單峰駝、羊駝 及原駝等駱駝科之動物等之缺失輕鏈的抗體，結合有識別 複數個抗原決定位之抗體片段的多重特異性抗體片段，或 含有抗原結合部位及恆定區域之單鏈肽，異二聚物或同源 雙體等含有恆定區域之抗體片段[Trends Biotechnol.，21， 484 (2003)、國際公開第2004/058820號]等具有恆定區域之 抗體片段。
Fab係利用木瓜酶消化抗體而取得之片段中整條[鏈以二 硫鍵鍵結至Η鏈之N末端側之CH1的分子量約為5萬之具有 抗原結合活性之抗體片段。本發明之Fab可利用木瓜酶處 理單株抗體而獲得。 又’作為另一態樣’本發明之Fab可藉由如下方式製 造.構建編碼源自抗體分子之完整輕鏈區域與包含VH及 CH1之區域的cDNA，分別導入至原核細胞用表現載體或 真核細胞表現載體中，藉此構建Fab表現載體，再導入至 原核細胞或真核細胞中使之表現。 F(ab')2係利用作為蛋白質分解酶之胃蛋白酶處理之 鉸鏈區域之2個二硫鍵之下部而獲得之片段中2個？讣以鉸 鏈部分鍵結而構成的分子量約為丨〇萬之具有抗原結合活性 之抗體片段。 本發明之F(ab，）2可利用胃蛋白酶處理單株抗體而獲得。 又，亦可使下述Fab，利用硫醚鍵或者二硫鍵進行鍵結而製 造。進而，可將本發明之Fab，於適當條件下氧化而製造 155030.doc •27· 201139666 F(ab')2 〇 係將上述F(ab')2之鉸鏈區域之二硫鍵切斷而獲得之 刀子量、，勺為5萬之具有抗原 '结合活性的抗體片段。本發明 之Fat>可利用二硫代蘇糖醇等還原劑處理本發明之F(ab，)2 而獲得。 又，作為另一態樣，本發明之Fabi可藉由如下方式製 ^構建編碼源自抗體分子之完整輕鏈區域與包含vh、 CH1、鉸鏈之_部分之區域的cDNA，分別導入至原核細 胞表現載體或真核細胞表現載體中，藉此構建FA，表現載 體’並導入至原核細胞或真核細胞中使之表現。 [化學修飾] 本發明之單株抗體或該抗體片段較佳為恆定區域内之工 個以上之胺基酸被置換為Cys殘基，且至少丨個該置換Cys 殘基經化學修飾之衍生物（以下亦稱為單株抗體修飾體或 該抗體片段修餅體）。 上述化學修飾較佳為藉由非還原條件下之化學修飾反應 的化學修飾。又，較佳為上述所置換之cys殘基之4〇%以 上經化學修飾，更佳為60%以上、更佳為7〇%以上、尤佳 為80%以上、最佳為μ%以上經化學修飾。 上述非還原條件下之化學修飾反應之化學修飾只要為和 與本發明之單株抗體或該抗體片段之CyS殘基之硫醇基具 有反應性之分子的鍵結，則可為任何化學修飾。 上述與Cys殘基之硫醇基具有反應性之分子，只要為與 單株抗體或該抗體片段之Cys殘基之硫醇基具有反應性 155030.doc -28- 201139666 者，則可為任何分子。上述與Cys殘基之硫醇基具有反應 性之为子較佳為具有與本發明之單株抗體或該抗體片段之
Cys殘基之硫醇基具有反應性之硫醇反應性官能基。 作為上述硫醇反應性官能基，只要為與抗體分子之Cys 殘基之硫醇基具有反應性者，則可為任何分子^作為硫醇 反應性官能基’例如可列舉：馬來醯亞胺、i化乙醯基、
G ❹ 破化乙酿胺琥㈣亞胺基S旨、異硫氰酸自旨、氣續酸基及 2,6-二氯三畊基等。 (親水性高分子或兩親性高分子） 作為與單株抗料該抗W段之Cys殘基之硫醇基具有 反應性的分+ ,勒；杜& A 1 v 佳為3有親水性高分子或兩親性高分子 之分子。作為親水性古 血. Γ间刀子或兩親性高分子，例如可列 聚氧烧烯、多兀醇或含有多糖之分子等。 聚丙 作為聚减烯，例如可列舉：包含直鏈或支鏈之醜、 丙二醇、聚丙烯乙二醇等。 ::::醇’例如可列舉包含直鏈或支鏈之聚甘油等。 作為含有多糖之分 鏈益 刀子，例如可列舉：包含直鏈或支鏈之直 鏈歲粉、葡聚糖、並 且 等。 3魯闌多糖或肝糖等同質或異質多醣類 進而，作為親水性古八7 i 舉：聚楚胺酸、取/刀子或兩親性高分子，例如可列 素、丙基纖維素、 ，半Ύ G基纖維 纖維素、㈣基甲纖維素、經基纖維素、經烧基 緩曱基纖維素驗二ΓΓ經丙基殿粉、叫粉、 屬嚴、纖維素硫酸鹼金屬鹽、纖維素接 155030.doc -29- 201139666 枝聚合物、交聯明膠、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、澱粉-丙 稀酸接枝聚合物、鄰苯二甲酸酐改性明膠、破珀酸改性明 膠、聚乙烯醇、聚乙烯基。比咯烷酮、聚乙烯基曱基醚、甲 基乙晞醋、聚（曱基）丙烯酸鹽[例如聚（曱基）丙烯酸鈉]、叛 基乙烯基聚合物、乙烯基吡咯烷酮_(曱基）丙烯酸乙酯共聚 物、乙烯基。比略烧酮-苯乙浠共聚物、乙稀基D比洛烧__乙 酸乙浠s旨共聚物、聚乙酸乙烯酯_(甲基）丙烯酸（鹽）共聚 物、聚乙酸乙烯酯•巴豆酸共聚物、乙酸乙烯酯_ (甲基）丙 烯酸共聚物、乙酸乙烯酯-巴豆酸共聚物、聚績酸乙稀 酯、聚衣康酸、聚（甲基）丙烯酸羥乙酯、聚（甲基）丙烯醯 胺、苯乙稀-馬來酸酐共聚物、（曱基）丙烯醯胺_(曱基）丙烯 酸共聚物、聚（曱基）丙烯酸鉀及聚（曱基）丙烯酸鈉等聚（曱 基）丙烯酸（鹽）聚合物、聚（曱基）丙烯腈之皂化物、（曱基） 丙稀酸（鹽）/乙烯醇共聚物、澱粉/(甲基）丙烯酸（鹽）接枝共 聚物、澱粉/(甲基）丙浠腈接枝共聚物之皂化物、纖維素/(甲 基）丙烯酸（鹽）接枝共聚物、聚（甲基）丙烯醯胺及其部分水 解物、聚乙烯醇、澱粉-(曱基）丙烯酸（鹽）接枝共聚物中和 物、乙酸乙烯酯-(曱基）丙烯酸曱基共聚物皂化物之鈉鹽、 異丁烯-馬來酸酐共聚物、聚乙烯醇-馬來酸酯系共聚物、 (甲基）丙烯醯胺-(曱基）丙烯酸（鹽）共聚物、澱粉-聚（曱基） 丙烯腈接枝共聚物、聚環氧烷、乙烯酯-伸乙基系不飽和 羧酸共聚物、以及聚（甲基）丙烯酸、聚乙烯醇/馬來酸酐鈉 共聚物等高分子。 含有親水性高分子或兩親性高分子之分子之分子量並無 155030.doc -30- 201139666 特別限定’較佳為500 Da以上，更佳為例如500 Da〜100 kDa。 於本發明中’化學修飾反應之反應性可依據例如J. Bioehem·’ us，814 (1994)中所記載之計算方法而求得。作 為反應性之計算方法’例如可列舉：利用非還原SDS-PAGE ’將與親水性高分子或兩親性高分子之反應前後之 樣本展開’並利用GS_8〇〇校準型光密度掃描儀（Bi〇_Rad公 Q 司製造）進行計算之方法；將反應後之樣本供於凝膠過濾 層析’由所置換之Cys殘基經化學修飾之單株抗體或該抗 體片段、與未反應之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體 片段之波峰面積進行計算之方法等。 上這3有親水性高分子或兩親性高分子之分子較佳為含 有上述親水性高分子或兩親性高分子之修飾基。該修飾基 更佳為含有親水性高分子或者兩親性高分子或功能性分子 之修飾基。進而’該修飾基亦可為親水性高分子或兩親性 〇 高分子、及含有下述功能性分子雙方之修飾基。 (功能性分子） 作為與單株抗體或該抗體片段 之Cys殘基之硫醇基具有 應丨生的刀子’較佳為含有功能性分子之修飾基。作為功 月b性分子’例如可列舉：藥物、生理活性肽、生理活性蛋 白資 '核酸、放射性標記化合物、糖鏈、脂質或螢光化合 物等。 作為藥物’例如可列舉：抗腫瘤劑、抗生素及抗病毒劑 等。 155030.doc -31- 201139666 作為抗腫瘤劑，例如藉由包括激酶抑制、細胞週期抑 制DNA結合、DNA切斷、DNA之烧基化、微管蛋白結合 抑制《冑絲分裂抑制等之機制，而具有細胞毒殺活性或 細胞增殖抑制作用者等。 ^為抗腫瘤劑’例如可列舉：ADc所使用之抗腫瘤劑卡 奇黴素、多拉司他汀（D〇lastatin)、美登醇㈣^⑽如心) 及倍癌徽素（DU0carmycin)以及其等之衍生物[則⑽咖啡
Chem·, 21，5(2010)];氨磷汀（Ethy〇1)、順鉑達卡巴 畊（DTIC)、放線菌素（dactin〇mycin)、曱氮芬（氮芥卜鍵脲 菌素、環磷醯胺、卡氮芥（BCNU)、羅氮芥（CCNu)、多柔 比星（阿黴素）、微脂體小紅莓（D〇xil)、吉西他濱（健擇）、 道諾黴素、微脂體道諾黴素（Danu〇x〇me)、丙卡巴肼 (procarbazine)、絲裂黴素、阿糖胞苷、依託泊苷、甲胺喋 呤、5_氟尿嘧啶、長春花鹼、長春新鹼、博萊黴素、太平 洋紫杉醇（汰癌勝）、歐洲紫杉醇（剋癌易）、阿地白介素 (Aldesleukin)、天門冬醯胺酶、補束剋、卡鉑、克拉曲 濱、喜樹鹼、CPT-11、10-經基乙基喜樹鹼（SN38)、氟 苷、氟達拉濱、羥基脲、異環磷醯胺、依達比星、2_巯基 乙磺酸鈉、伊立替康、米托蒽醌、拓朴替康、亮丙瑞林^ 甲地孕酮、美法侖、毓嘌呤、普卡黴素、米托坦、培門冬 酶（pegaspargase)、喷司他丁、哌泊溴烷、鏈脲菌素、他莫 昔芬、替尼泊苷、睪内酯、硫鳥嘌呤、噻替派、尿嘧啶氮 芥、長春瑞濱、苯丁酸氮芥、潑尼松龍、長春地辛、尼莫 司汀、司莫司汀、卡培他濱、妥妙得適、阿紮胞苷、 155030.doc -32· 201139666 了：草ι鉑、吉米沙星(艾瑞莎）、伊馬替尼、 胺苯口丫唆、全反式視網酸、沙利寶邁、貝沙羅灯（塔革雷 ⑴'地m、阿那曲唾（安美達）及柳菩林以及其等之衍 生物等。 丁 作為抗生素’例如可列舉：青黴素系、頭孢系、大環内 西曰系及四環素系等之化合物以及其等之衍生物等。例如可 =舉：安比西林、頭孢氨$、頭孢克洛、建它黴素、鏈黴 Ο
G 、康黴素、兩性黴素、青黴素及頭抱嗤琳以及其等之行 生物等。 卞 < 何 作為抗病毒劑，例如可. 及其等之衍生物等。味.更曰洛羊及阿昔洛韋等以 作：上述衍生物，例如可列舉任意官能基經缺失、置 糖等之修飾加:::體’利用放射性同位素、藥劑及 所具有：為同樣具有未修飾之低分子化合物 作為生理活性肽或生理活性卷占标 質分解酶，胺基酸分解酶，列舉：蛋白 二：毒素及植物毒素等毒素，具有細胞膜毒殺活性 =:等具有細胞膜結合性或細胞膜穿透性之肽，其等
J如可列舉：天門冬醒胺酶、 A 尿酸酶、超氧化歧化酶、乳鐵蛋白精胺酸酶、 解酶、腺m > 蛋白、鏈激酶、纖維蛋白分 干擾素·"擾素-ω、干擾素_τ、：，α、干擾素-β、 ^ 顆粒性球細胞刺激因 155030.doc -33- 201139666 子、紅血球生成素、腫瘤壞死因子、企小板增加因子、可 羅索蛋白質、痩體素、織維芽細胞增殖因子1〜19、中期因 子、抑妈素、表皮生長因子、騰高血糖素、騰島素、騰島 素樣生長因子1、成骨蛋白1、幹細胞增殖因子、澱粉不溶 素、副甲狀腺素、纖溶酶原活性化因子類、血管内皮細胞 生長因子、轉形生長因子類、胰高血糖素樣肽類、生長激 素、利納利尿肽類、纖溶酶原、it管生成素、血管靜止蛋 白、内皮生長抑制素、新抑癌素、肝細胞生長因子、離胺 酸、黃麴毒素、假單胞菌外毒素、白喉毒素及霍亂毒素以 及其等之溶解性受體等。 作為具有細胞膜穿透性之肽，例如可列舉鹼性肽、兩親 性肽及疏水性肽。又，作為另一態樣，亦包括具有疏水性 跨膜序列之肽。將細胞膜穿透性肽之例示於表1。 [表1] 肽 胺基酸序列 參考文獻 Penetratin RQIKIWFQNRRMKWKK J. Neurosci” 24, 10040,（2004) 源自Tat之肽 GRKKRRQRRRPPQC J. Biol. Chem., 272, 16010, (1997) Transportan GWTLNSAGYLLKIN FASEB. J·，12, 67 (1998) Arg9 RRRRRRRRR J. Pep. Res., 56,318 (2000) 源自Rev之肽 TRQARRNRRRRWRERQR J. Biol. Chem, 276, 5836, (2001) C105Y CSIPPEVKFNKPFVYLI J. Biol. Chem., 281, 1233, (2006) MTS肽 KGEGAAVLLPVLLAAPG Cell, 50, 729 (1987) 作為肽之另一態樣，例如可列舉具有核内體脫離能力之 肽。參與核内體脫離之肽自病毒或細菌中大量發現，可藉 由膜融合、膜結構之崩散、聚集產生之膜狀之空控之形成 等機制，而實現自核内體膜之脫離[Trens Biotech., 26，267 (2008)]。將核内體脫離肽之例示於表2。 155030.doc • 34- 201139666 [表2] 肽 胺基酸序列 參考文獻 GALA AALEALAEALEALAEALEALAEAAAAGGC Biochemistry 26,2964 (1987) HA-2 GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG J. Biol. Chem·，269, 12918， (1994) KALA WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACE A Biochemistry 36, 3008 (1997) JTS-1 GLFEALLELLESLWELLLLEA Gene Ther., 3,448 (1996) 多組胺酸肽 CHK^HC Bioconjugate Chem., 11,901 (Histidine-rich) (2000) 作為核酸，只要為核苷酸或具有該核苷酸同等功能之分 子聚合而成之分子，則可為任何分子。 0 作為核苷酸，例如可列舉源自天然之DNA及RNA。又， 作為具有與該核苷酸同樣功能之分子聚合而成之分子，例 如可列舉源自天然或人工合成之各種核苷酸衍生物。作為 該核苷酸衍生物，例如可列舉：RNAi分子（例如siRNA、 microRNA及shRNA)、適體、肽核酸及核酸之至少一個核 苷酸被置換為具有與該核苷酸同等功能之分子的核苷酸聚 合物等。 作為具有與核苷酸同等功能之分子，例如可列舉核苷酸 〇 衍生物等。作為核苷酸衍生物，只要為對核苷酸施加修飾 而成之分子，則可為任何分子。例如與RNA或DNA相比， 為了提高核酸酶耐性或者實現穩定化，為了提高與互補鏈 核酸之親和性，為了提高細胞穿透性，或為了實現可見 化，較佳為對核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸施加修飾而成 之分子等。 作為核苷酸衍生物，例如可列舉：糖部修飾核苷酸、磷 酸二酯鍵修飾核苷酸、鹼基修飾核苷酸、以及經糖部、磷 155030.doc -35- 201139666 ι二酯鍵及鹼基中之至少一種修飾之核苷酸等。 作為糖部修錦核芽酸，只要為針對核芽酸之糖之化學結 構之-部分或全部，利用任意置換基進行修飾或者置換而 成者用任⑤原子進行置換而成者，則可為任何種 類，較佳為2，-修飾核苷酸。 作為2-修飾核苦酸，例如，核糖之2，_〇h基被置換為選 自，Η、OR3、R3、r3’〇r3、SH、sr3 呢、nhr3、 NR 2、Ns、CN、F、a、以及j所組成群（R3表示烧基或芳 基，較佳為碳數1〜6之烷基，R3,表示伸烷基，較佳為碳數 1〜6之伸烷基）中之置換基的2，_修飾核苷酸，其中較佳為& OH基被置換為f或曱氧基。 又，作為2’-修飾核苷酸，例如亦可列舉：經選自由2_ (甲氧基）乙氧基、3_胺基丙氧基、2_[(N，N_二甲基胺基）氧 基]乙氧基、3-(N，N-二甲基胺基）丙氧基、2_[2_(N,N_二甲 基胺基）乙氧基]乙氧基、2-(曱基胺基）_2·側氧基乙氧基、 2-(N-甲基胺甲醯基）乙氧基及2_氰乙氧基所組成群中之取 代基取代的2'-修飾核苷酸等。 又，作為糖部修飾核苷酸，例如可列舉：藉由對糖部導 入交聯結構而具有2個環狀結構之交聯結構型人工核酸 (Bridged Nucleic Acid)(BNA)。 作為上述糖部修飾核苷酸，具體而言，例如亦可列舉： 2位之氧原子與4'位之碳原子經由亞曱基交聯而成之鎖人 工核酸（Locked Nucleic Acid)(LNA)、伸乙基交聯結構型人 工核酸（Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid 155030.doc
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Research, 32，el75 (2004)]等。進而’亦可列舉：肽核酸 (PNA)[Acc. Chem. Res.，32，624 (1999)]、氧肽核酸 (OPNA)[J. Am. Chem. Soc.，123, 4653 (2001)]、肽核糖核 酸（PRNA)[J. Am. Chem. Soc.，122, 6900 (2000)]等。 作為磷酸二酯鍵修飾核苷酸，只要為針對核苷酸之磷酸 二酯鍵之化學結構之一部分或全部，利用任意置換基進行 修飾或者置換而成者、或利用任意原子進行置換而成者， 則可為任何種類。 例如可列舉：構酸二酯鍵被置換為硫代鱗酸酯鍵之核苦 酸、磷酸二酯鍵被置換為二硫代磷酸酯鍵之核苷酸、填酸 二酯鍵被置換為膦酸烷基酯鍵之核苷酸及磷酸二酯鍵被置 換為胺基磷酸酯鍵之核苷酸等。 作為驗基修飾核普酸，只要為針對核芽酸之驗基之化學 結構之一部分或者全部，利用任意置換基進行修飾或者置 換而成者、或利用任意原子進行置換而成者，則可為任何 種類。 作為上述驗基修飾核苷酸’例如可列舉：驗基内之氧原 子被置換為硫原子者、氫原子被置換為碳數之烷基 者、曱基被置換為氫或者碳數2〜6之院基者、胺基經碳數 1〜6之烷基及碳數卜6之烷醯基等保護基保護者。 進而，作為核苷酸衍生物，亦可列舉：對核苷酸或糖 部、磷酸二酯鍵或者鹼基之至少—個經修飾之核苷酸衍生 物附加脂質、磷脂質、啡畊、福來脫、啡啶、蒽醌、吖 啶、螢光素、若丹明、香豆素、色素等其他化學物質而成 155030.doc •37· 201139666 者。 作為上述核苷酸衍生物，具體而言，可列舉：5，-聚胺附 加核苷酸衍生物、膽固醇附加核苷酸衍生物、類固醇附加 核皆酸衍生物、膽汁酸附加核苷酸衍生物、維生素附加核 脊酸衍生物' Cy5附加核苷酸衍生物、Cy3附加核苷酸衍 生物、6-FAM附加核苦酸衍生物、Alexa Fluor、及生物素 附加核苷酸衍生物等。 又’核苷酸衍生物亦可與核酸内之其他核苷酸或核苷酸 衍生物形成伸烷基結構、肽結構、核苷酸結構、醚結構或 酿結構、及將該等之至少一種組合而成之結構等交聯結 構。 本發明中所使用之核酸’只要包含標靶基因之一部分驗 基序列的核酸與包含相對於該核酸之鹼基序列之互補鹼基 序列的核酸可形成雙鏈’則可為任意長度，可形成雙鏈之 序列之長度通常較佳為15〜27個驗基’更佳為15〜25個驗 基，更佳為15〜23個鹼基，尤佳為15〜21個鹼基，最佳為 1 5〜19個驗基。 作為本發明中所使用之核酸，係使用包含標靶基因之一 部分鹼基序列的核酸，亦可使用該核酸中較佳為i〜3個鹼 基、更佳為1〜2個鹼基、更佳為1個鹼基經缺失、置換或附 加而成者。 作為抑制標靶蛋白質之表現的核酸，只要為含有標靶基 因之一部之鹼基序列、與包含相對於該核酸之鹼基序列之 互補鹼基序列的核酸，且抑制標靶蛋白質之表現的核酸， 155030.doc -38· 201139666 則亦可使用單鏈核酸及雙鏈核酸等令之任一核酸，較 雙鏈核酸。 本發明中所謂雙鏈核酸，係指兩條鏈聯會而具有雙鍵形 成部之核酸。所謂雙鏈形成部，係指構成雙鏈核酸之核苦 H其衍生物構錢基對㈣成雙鏈之部分。雙鏈形成部 通常較佳為15〜27個驗基對，更佳為15〜25個驗基對，更佳 為15〜23個驗基對，尤佳為15〜川固驗基對，最佳為^七 個鹼基對。 〇 構成雙鏈核酸之單鏈核酸通常較佳為包含15〜30個鹼 基，更佳為包含15〜29個鹼基，更佳為包含15〜27個鹼基， 更佳為包含15〜25個鹼基，尤佳為包含17〜23個鹼基，最佳 為包含19〜21個鹼基。 本發明之雙鏈核酸中，具有繼雙鏈形成部之後在3·側或 5側未形成雙鏈之追加核苷酸或核苷酸衍生物之情形時， 將其稱為突出部（overhang)。於雙鏈核酸具有突出部之情 ◎ 料’構成突出部之核㈣可為核糖核絲、脫氧核糖核 苷酸或該等之衍生物。 作為具有突出部之雙鏈核酸，較佳為使用至少一條鏈之 3’末端或5'末端具有包含較佳為卜4個鹼基、更佳為i〜3個 鹼基' 更佳為2個鹼基之突出部者。作為包含2個鹼基之突 出部，較佳為包含dTdT或UU之突出部。 於雙鏈核酸中，突出部可僅存在於反義鏈，僅存在於正 義鏈，及存在於反義鏈與正義鏈之雙方，較佳為反義鏈與 正義鏈之雙方具有突出部。 155030.doc -39- 201139666 又，亦可使用雙鏈形成部之後之一部分或全部與標靶序 列一致的序列、或雙鏈形成部之後與標靶序列之互補鏈之 驗基序列一致的序列。 進而，作為本發明之雙鏈核酸，例如亦可使用：藉由 Dicer酶等核糖核酸酶之作用會生成上述雙鏈核酸的核酸 分子（國際公開第2005/089287號）、及不具有3,末端或5,末 端之突出部的雙鏈核酸等。 作為本發明之雙鏈核酸’亦可使用包含與標靶基因之鹼 基序列或其互補鏈之鹼基序列相同之序列的核酸，亦可使 用包含該核酸之至少一條鏈之5,末端或3,末端被去除個 鹼基的核酸、與包含相對於該核酸之鹼基序列之互補鹼基 序列之核酸的雙鏈核酸。作為該雙鏈核酸，可列舉雙鏈形 成部包含例如1 5〜1 9個鹼基對之雙鏈核酸。 又，作為本發明之核酸，亦可使用單鏈核酸。 作為本發明之核酸，亦可為將±述雙鏈核酸之正義鍵及 反義鏈經“隔序列連結而形成單鏈核酸者。作為該單鍵 =*較佳為藉由環結構而具有錢形成部之shRNA 個驗基=:具有莖'環結構之單鏈核酸通常較佳為5。， 作為本發明之核酸，亦可為設計為藉由 — 作用會生成上述單鏈核酸或雙 人/酉夂酶寻之 以下、更佳為5。驗基長度二鏈=較佳為7。驗基長度 核酸。 了 £佳為30鹼基長度以下之 作為製造本發明之核酸的方法，並無㈣限舉 155030.doc -40. 201139666 使用公知化學合成之方法、或者酶轉錄法等。作為使用公 知化學合成之方法，可列舉亞磷醯胺法、硫代磷酸酯法、 鱗酸二酯法、CEM 法[Nucleic Acid Research，35，3287 (2007)]等，例如可藉由ABI39〇〇高通量核酸合成機 (Applied Biosystems公司製造）而合成。合成結束後，進行 自固相之脫離、保護基之脫保護及目標物之純化等。 較佳為藉由純化獲得純度較佳為9〇%以上、更佳為95% 以上之核酸。於雙鏈核酸之情形時，可將合成、純化之正 義鏈、反義鏈以適當比率混合，例如相對於反義鏈丨當量 混合較佳為0.1〜1〇當量、更佳為0 5〜2當量、更佳為 0.9 1.1¾里、尤佳為等莫耳量之正義鏈後，進行退火而使 用，亦可省去將混合而成者進行退火之步驟而直接使用。 退火只要為可形成雙鏈核酸之條件，則可於任何條件下 進仃，通常藉由於將正義鏈、反義鏈以大致等莫耳量混合 後’於94。(：左右之溫度下加熱5分鐘左右，其後緩慢冷; 0 至室溫而進行。 作為製造本發明之核酸的酶轉錄法，例如可列舉：將具 有目標驗基序列之質體或DNA作為模板並藉由使用嗤菌體 RNA聚合酶（例如T7、T3或sp6RNA聚合酶）之轉錄的方 法。 RNA々子係含有具有編碼作為標乾之蛋白質的瓜職之 互補驗基序列的反義鏈的單鏈或雙鏈核酸分子。關於 RNAi分子，該反義鏈會與編碼標乾蛋白質之瓜謝進行特 異性結合而抑制此標乾蛋白質之表現（蛋白質合成）。作為 155030.doc 41 201139666 本發明之RNAi分子，例如可列舉siRNA、microRNA及 shRNA。 所謂siRNA，係指具有編碼標靶蛋白質的mRNA之互補 鹼基序列的反義鏈、與該反義鏈之互補正義鏈雜交而成之 低分子雙鏈RNA。 所謂microRNA(miRNA)係與由與同源性mRNA之相互作 用引起的基因表現之轉錄後控制相關之小分子非編碼 RNA，其藉由結合於源自蛋白質編碼基因之標靶mRNA之 互補部位而調節基因之表現。 所謂shRNA，係指上述反義鏈與正義鏈經由連結子部分 連結而成之單鏈RNA，該連結子部分藉由形成環而摺疊， 使該反義鏈與該正義鏈雜交而形成雙鏈部分。 於特定態樣中，siRNA及microRNA可藉由更長之雙鏈 RNA之加工、例如於Dicer酶或Drosha酶之存在下進行加工 而生成。Dicer酶及Drosha酶係特異性切斷dsRNA之 RNAselll樣核酸酶。使用Dicer酶及其他RNAi酶之方法及 組合物係記載於美國專利申請案公開公報第2004/0086884 號說明書中。 本發明之RNAi分子可基於標靶蛋白質之基因序列，藉 由公知方法、例如siRNA設計支援系統（siRNA Design Support System 、 TAKARA BIO股份有限公司）而言史言十。 所謂適體，係指與蛋白質之特定分子結合之RNA或DNA 之核酸配體。 適體可藉由製造包含多種核酸鏈之基因庫，自其中選擇 155030.doc -42- 201139666 可與標乾蛋白質結合之核酸鏈而取得。作為用於鑑定適體 之適宜方法，例如可列舉：利用指數富集之配體系統進化 (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment ^ SELEXTM)法（美國專利第527〇163號說明書）。 作為核酸之另一態樣，為了用於製備複合物，可修飾寡 聚核苷酸之3·末端及5,末端。此種修飾可為分子之3,末端、 5’末端或此雙方❶修飾可包括對末端磷酸整體或磷酸基之 原子之1個或複數個進行修飾或置換。 例如可將募聚核苷酸之3,末端及5,末端與標記部分、例 如螢光團（例如芘' TAMRA、螢光素' Alexa Flu〇r、Cy3 或Cy5染料）或保護基（基於例如硫基、矽基、硼基或酯基） 專其他功能性分子實體複合。可將該功能性分子實體經由 麟酸基及/或間隔基而與糖結合。 該間隔基之末端原子可與麟酸基之結合原子或糖之c_3, 或C-5’0、N、S或C基連結，或將該等置換。或者該間隔 基可與代替核苷酸（例如PNA)之末端原子連結，或將其置 換。 作為上述間隔基或連結子，例如可列舉：_(Cfj2)n_、
-(CH2)nN·、-(CH2)nO…_(CH2)nS·、_(CH2CH20)nCH2CH20H (例如n=3或6)、非驗性糖、醯胺、叛基、胺、經胺、經亞 胺、硫醚、二硫化物、硫脲、磺醯胺或嗎啉基、或生物素 试劑及螢光素試劑。 又’作為核酸之另一態樣，亦可針對置換為Cys殘基之 抗體修飾體或其抗體片段、該抗體片段抗體片段修飾體， 155030.doc -43- 201139666 經由非共價鍵而進行複合體化。 作為放射性標記化合物，為用於診斷或治療用途之核種 即可 ，例如 可列舉 ·· 3H、 14C、 32p 、 33 p、35S 、51Cr、 57CO ' 18F、 153Gd ' ,59Gd、 68Ge 、166Ho ' ,15In 、113In 、 n2In > niIn、 131j λ I25j ^ 123j 、121I 、140La 、mLu 、54Mn、 "Mo > 103Pd 、142Pr、 149Pm、 186Re 、188Re 、丨05Rh 、97Ru、 153Sm 、47Sc 、75Se、 85Sr、 99Tc、 201 丁i、 113Sn、 117Sn、 133Xe、 169Yb 、]75Yb、 90Y及 65Zn 等 、或含有上述核種之化 合物。又，與上述核種螯合而成之分子、例如d〇ta、pA. DOTA、TRITA及DTPA等亦包括在本發明之放射性標記化 合物中。 作為糖鏈，例如可列舉：含有岩藻糖、甘露糖、葡萄 糖、阿洛糖、酸糖、古羅糖、艾杜糖、半乳糖、塔羅糖、 核糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖、、赤藻糖、蘇 糖、纖維雙糖、麥芽糖、異麥芽糖、乳糖、脂阿拉伯甘露 聚糖、路易斯募糖X型三糖及唾液酸化之路易斯募糖 ㈣yl Lewis)x型四糖等之單糖、二糖類或寡糖等。 作為脂質，例如可列舉㈣酸與各種醇之岐作為盆類 似物之單純脂質（中性脂質）。例如可列舉：油脂（例如三酸 甘蝴、蠟(高級醇之脂肪酸酿)、固醇酿、膽固醇醋、唯 生素之脂肪酸醋等；除脂肪酸與醇以外亦具有填酸'糖、 硫酸、胺等極性基之複合脂質，例如璘脂質(甘油碟脂、 賴鱗δ旨等）及糖脂質（甘油糖 1糖脂等）；藉由單純脂質 及複合脂質之水解而生成之化合物中指代㈣性者之衍生 155030.doc -44 - 201139666 脂質，例如脂肪酸、高級醇、脂溶性維生素、類固醇、炉 等。 二 作為螢光化合物，例如可列舉：螢光素系列、若丹明系 列、Cy3、Cy5、曙紅系歹4、Alexa F1而系列及咖系列等 之螢光色素、以及、綠色f光蛋白質（GFp)等勞光性蛋白質 等。 貝 親水性高分子或兩親性高分子、及功能性分子可直接或 經由適當連結子而結合，作為連結子，例如可列舉：酯、 二硫化物、腙及二肽等。作為含有二肽之修飾基，例如可 列舉國際公開第96/35451號中所記載之修飾基。 作為修飾基為功能性分子之情形時之修飾體，例如可列 舉：以式1 : X-L-Y(l)[式中，X表示本發明之置換為Cys殘 基之早株抗體或該抗體片段，Y表示功能性分子，L表卞 與X之所置換之Cys殘基之硫醇基及功能性分子γ形成共價 鍵的連結子]表示，且以式2 : -L-Y(2)[式中，全部符號與 上述含義相同]作為修飾基’與本發明之置換為Cys殘基之 單株抗體或該抗體片段結合而成者。 親水性高分子或兩親性高分子亦可作為式1中之連結子L 而與功能性分子相連結。 連結子L係指作為2官能性分子之式3 : R，_l，-R，，[式中， R'及R·'相同或不同，表示-NH2、-C02H、-OH、or1(美 中，R1為羥基保護基）、-C〇2R2(基中，R2為2·羥基吡咬、 Ν-經基號拍酿亞胺、對硝基苯基、五氟苯基（pfp)、Me)或 其他活性酯、醯基°米α坐、馬來醯亞胺、三氟乙酸醋、二 155030.doc -45- 201139666 酮、醯亞胺酯、磺酸酯、亞胺、_CH〇、LI環己二酮、乙 二醛、磺醯_、α-鹵化嗣、疊氮等之官能基，並且l，表示 烷基或經取代之烷基]所表示之部分。 烷基鏈L，可利用鹵素（例如，I、Br、α、F)、羥基、氰 基、苯基、胺基、絲、烧基、&氧基等通常之取代基進 打取代。進而，連結子L，之伸烷基鏈可被丨個或丨個以上之 2價基、例如-〇-、_s-、-NH-、-CH=CH-、-〇C-、苯基、 -S〇2-等中斷。 進而，連結子L，可具有分支型結構，可與複數個功能性 分子並聯鍵結。但是，官能基尺，必須為於適當條件下可與 本發明之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段之所置 換之CyS殘基之硫醇基形成共價鍵者，又，官能基尺"必須 為於適當條件下可與功能性分子形成共價鍵者。 又，作為連結子L，之另一態樣，可列舉於細胞内可被切 斷之鍵結形式。作為較佳態樣，係與於血中相比，以丨〇倍 以上、較佳為100倍以上之速度分解。易被切斷之連結子 之結構樣式之特徵在於：pH值、氧化還原電位、或對以磷 酸酶、酯酶、肽酶或蛋白酶為代表之分解酶的敏感性較 高。
pH值敏感性之切斷連結子較佳為具有可於酸性條件下、 較佳為pH值6.5以下、更佳為1)11值6 〇以下、更佳為？11值 5.5以下切斷之鍵結形式。於血中之pH值為7 4，相對於 此’於細胞内之PH值較佳為稍低之7」〜7 3之範圍。進 而’於核内體内之pH值較佳為5 5〜6 〇，於溶小體内之pH 155030.doc -46- 201139666 值向酸性側位移，較佳為約5 .〇。作為pH值敏感性之鍵結 形式，已知有腙鍵結。 氧化還原電位敏感性之切斷連結子具有可於細胞内還原 環境下切斷之鍵結形式《於細胞内，還原型之三肽（麩胱 苷肽）係以1 mmol/L〜10 mmol/L之高濃度存在，而形成還 原環境。作為於該還原環境下具有敏感性之鍵結形式，已 知有二硫鍵。 Ο
作為對磷酸酶具有敏感性之鍵結形式，已知有磷酸酯 鍵°作為對酯酶具有敏感性之鍵結形式，已知有酯鍵。 作為對肽酶或蛋白酶、例如細胞内肽酶、或例如溶小體 蛋白酶或者核内體蛋白酶具有敏感性之鍵結形式，已知有 由識別特定酶之胺基酸序列所構成之募肽或多肽。作為該 酶，已知有組織蛋白B、C、及1)，存在複數種二肽切斷序 列’但並不限定於此。 於例示之實施形態中，連結子可為二肽連結子、例如纈 胺酸-瓜胺酸（val_cit)或苯丙胺酸_離胺酸（phe_iys)連結子。 又，作為另-態樣，功能性分子γ可經由連結子L而以 串聯或並聯之m结複數個，㈣為 組合，進而其順序亦可任意變更。進而，作為另-LI， 亦可不經由連結子而與功能性分子直接連結。 進而’可藉由將置換為Cys殘基之單株㈣或該抗體片 =所置換之Cys殘基之硫醇基與上述功能性分子之適當 吕忐基連結，而化學修飾該Cys殘基。 i«上述方法’可藉由於預先製備之置換為〜殘 155030.doc •47· 201139666 基之單株抗體或該抗體片段及預先製備之功能性分子之任 一者上鍵結連結基，繼而使剩餘一方與連結基鍵結，而化 學修飾該Cys殘基。 根據另一方法，亦可將適當之連結基前驅物與預先製備 之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段及預先製備之 功能性分子鍵結。繼而，可藉由使2個前驅物反應，而化 學修飾該Cys殘基。 本發明之置換為Cys殘基之抗體修飾體及該抗體片段修 飾體之每1個修飾基的分子量並無特別限定，較佳為5〇〇 Da以上，例如500 Da〜1〇〇 kDa。 作為上述修飾基，例如可列舉：馬來醯亞胺_聚乙二醇_ 绳胺酸-瓜胺酸-阿黴素（馬來醯亞胺_PEG_Val_cit_ADM) 等。 <細胞毒殺活性> 本發明之置換為Cys殘基之單株抗體及該抗體片段較佳 為具有細胞毒殺活性之單株抗體及該抗體片段。此處，作 為細胞毒殺活性’例如可列舉：抗體依賴性細胞毒殺 (ADCC)活性、活性補體結合細胞毒殺（CDC)活性等。 作為上述具有ADCC活性之單株抗體或該抗體片段，例 如可列舉：於Fc區域含有N-糖苷鍵複合型糖鏈，該fc區域 所鍵結之全長N-糖苷鍵複合型糖鏈中糖鏈還原末端之N—乙 醯基葡糖胺上未鍵結岩藻糖之糖鏈的比率為2〇%以上的單 株抗體及該抗體片段（國際公開第〇〇/61739號、國際公開第 02/31 140號），且含有將WT之恆定區域内之1個以上之胺基 155030.doc -48- 201139666 酸置換為半胱胺酸殘基之恆定區域的單株抗體及該抗體片 段。 又，作為上述具有CDC活性之單株抗體及該抗體片段， 例如可列舉：將人類IgGl抗體中含有恆定區域中之CH1區 域及CH2區域的多肽置換為包含Kabat等人之EU編號中分 別相當於人類IgG3抗體之相同位置之胺基酸序列的多肽而 獲得的單株抗體或該抗體片段（國際公開第2008/090958 號），且含有將WT之恆定區域内之1個以上之胺基酸置換 為半胱胺酸殘基之恆定區域的單株抗體及該抗體片段。 又，作為上述具有CDC活性之單株抗體及該抗體片段， 例如可列舉：含有將人類IgGl抗體中Kabat等人之EU編號 所示之第276號及第339號之胺基酸置換為其他胺基酸之 CH2區域，具有較高之CDC效果的單株抗體及該抗體片段 (國際公開第2008/090959號），且含有將WT之恆定區域内 之1個以上之胺基酸殘基置換為Cys殘基之恆定區域的單株 抗體及該抗體月段。 本發明之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段對抗 原陽性培養細胞株之CDC活性、或ADCC活性可藉由公知 測定方法[Cancer Immunol. Immunother.，36，373 (1993)]進 行評價。 [製造方法] 本發明之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段可藉 由 Molecular Cloning第 2版、Current Protocols in Molecular Biology ' Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring 155030.doc -49- 201139666
Harbor Laboratory (1988) ^ Monoclonal Antibodies:principles and practice, Third Edition, Acad. Press (1993)、Antibody
Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1996)等中所記載之方法，例如藉由以下 方式於宿主細胞中進行表現而取得。 又，例如可藉由以下方式製備本發明之置換為cys殘基 之單株抗體或該抗體片段，進而化學修飾該單株抗體或該 抗體片段之Cys殘基，而獲得抗體修飾體或抗體片段修飾 體。 1.置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段之表現載體之 構建 (1)置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段之表現載體之 構建 作為產生本發明之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體 片段的宿主細胞，只要為通常用於產生重組蛋白之宿主細 胞，則包括任何種類。 用於本發明之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段 之表現的表現載體可根據其目的適宜選擇使用，或適宜選 擇使用適合於導入該表現載體之宿主細胞。 於上述表現載體為重組載體之情形時，該重組載體分別 含有編碼適當啟動子所連結之CL及CH之DNA，較佳為於 本發明之聚核苷酸之下游含有轉錄終止訊號、即終止子區 域。 進而’上述重組載體亦可進而含有用於選擇轉形體之選 155030.doc -50- 201139666 擇標記基因（例如耐藥劑性基因、互補營養要求性突變之 基因等）。又，亦可含有編碼可用於分離、純化所表現之 蛋白質的標籤序列的序列等。 藉由於含有抗體基因之輕鏈及重鏈之表現卡匣之兩端插 入適當之制限酶識別序列，可組入原核細胞用抗體表現載 體與真核細胞用抗體表現載體之任一表現載體中。 於另一態樣中，為了構建可應對多樣之抗體可變區域的 表現載體，亦可採用設計為可於之後利用適當之制限酶僅 導入可變區域的表現載體。 於使用大腸桿菌等之原核細胞作為宿主細胞之情形時， 作為表現載體，只要為可組入並表現編碼上述抗體之基因 者，則可使用任何種類。例如可列舉：pFLAG-CTS[SIGMA公司、Journal of Molecular Recognition，5, 15 (2002)]、pET26b[Novagen公司、Molecular Immunology, 8, 44 (2007)]、pFabl、pFab2、pFab3 [Protein Expression and Purification, 2, 34 (2004)]等。 作為原核細胞用表現載體所使用之啟動子，例如可列 舉：Tac啟動子[Journal of Molecular Recognition, 5, 15 (2002)]及鼠李糖啟動子[Journal of Molecular Biology, 234, (1993)]等。 進而，上述載體中亦可含有用於分泌多肽之訊號序列。 命令大腸桿菌向周質（periplasm)分泌多肽分泌之訊號序列 之一例為 PelB訊號序列[J. Bacteriol. 169, 4379 (1987)]。 例如於使用大腸桿菌作為宿主細胞，使載體於大腸桿菌 155030.doc -51 - 201139666 (例如JM109、DH5tx、HB101、或XLlBlue)之内部大量擴 增及產生之情形時，載體需要具有用於大腸桿菌内之擴增 的「ori」、及用於選擇經轉形之大腸桿菌的標記基因（利用 例如安比西林、四環素、康黴素及氯黴素等藥劑所選擇之 抗藥劑性基因）。作為該標記基因，例如可列舉：M13系列 之載體、pUC系列之載體、pBR322及pBluescript等。 於使用真核細胞中之動物細胞作為宿主之情形時，作為 表現載體，只要為可組入並表現編碼上述置換為Cys殘基 之單株抗體及該抗體片段之基因者，則可使用任何種類。 作為上述表現載體，例如可列舉：pKANTEX93[Mol. Immunol., 37, 1035 (2000)]、pAGEl 07[曰本專利特開平 3-22979 號公報、Cytotechnology, 3, 133-140 (1990)]、 pAGE103[J. Biochem., 101, 1307 (1987)] ' pHSG274[Gene, 27, 223 (1984)] ' pKCR[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 1527 (1981)]、N5KG1-Val Lark 載體[IDEC Pharmaceuticals, N5KG1(美國專利第6001358號說明書）之改型載體]及 pSGipd2-4[Cytotechnology, 4, 173 (1990)]等。 作為動物細胞用表現載體所使用之啟動子與促進子，例 如可列舉：SV40之初期啟動子與促進子[J. Biochem.，101， 1307 (1987)]、莫洛尼鼠類白血病病毒之LTR[Biochem. Biophys. Res· Commun·, 149, 960 (1987)]以及免疫球蛋白 重鏈之啟動子[Cell，41，479 (1985)]與促進子[Cel1，33, 717 (1983)]等。 於使用酵母作為宿主細胞之情形時，作為表現載體，例 155030.doc •52- 201139666 如可歹丨J 舉：YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)及 YCp50(ATCC37419)等。 作為酵母用表現載體所使用之啟動子，只要可於酵母菌 株中表現者，則可使用任意者。例如可列舉：六碳糖激酶 等糖分解系之基因.之啟動子、PH05啟動子、PGK啟動 子、GAP啟動子、ADH啟動子、gal 1啟動子、gal 10啟動 子、熱休克蛋白質啟動子、MFal啟動子及CUP1啟動子 等。 於使用昆蟲細胞作為宿主細胞之情形時，作為表現載 體，例如可列舉：pVL1392、pVL1393 及 pBlueBacIII(均為 Invitorogen公司）等。 於使用植物細胞作為宿主細胞之情形時，作為表現載 體，例如可列舉：Ti質體及菸草嵌紋病毒載體等。 作為植物細胞用表現載體所使用之啟動子，只要為可於 植物細胞中表現者，則可使用任意者，例如可列舉：花椰 菜嵌紋病毒（CaMV)之35 S啟動子及水稻肌動蛋白1啟動子 等。 本發明之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段表現 用載體可使用抗體輕鏈及重鏈分別存在於獨立載體上之類 型或存在於同一載體上之縱列型之任意者[J. Immunol. Methods，167, 271 (1994)]。 作為縱列型之表現載體之構建方法，可列舉：使用適當 之制限酶位點，將編碼啟動子序列所結合之輕鏈及重鏈的 DNA進行連結之方法。例如關於縱列型之表現載體，可列 155030.doc -53- 201139666 舉：pKANTEX(國際公開第 97/10354 號）、pEE18 [Hybridoma，559 (1998)]、N5KG1-Val Lark 載體[IDEC Pharmaceuticals, N5KG1 (美國專利第6001358號說明書）之 改型載體]等。 作為對宿主細胞導入表現載體之方法，可列舉：轉形 法、電穿孔法[曰本專利特開平2-257891號公報、 Cytotechnology, 3, 133 (1 990)]、脂質體轉染法[Proc·Natl· Acad· Sci. U.S.A., 84, 7413 (1987)]等。 本發明之置換為Cys殘基可對上述所製作之載體藉由部 位特異性突變誘發法而進行。例如可使用QuikChange II定 點突變試劑套組（Stratagene公司）並依據說明書，設計將相 當於目標之置換為Cys殘基之部位的密碼子換為TGC的引 子，進行部位特異性突變誘發。 有無對TGC密碼子導入突變可藉由通常使用之鹼基序列 分析方法、例如進行Sanger等人之雙脫氧法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA·, 74, 5463 (1977)]等之反應，並利用鹼基 序列自動分析裝置、例如ABI PRISM377 DNA定序儀 (Applied Biosy stems公司製造）等驗基序列分析裝置進行分 析而確認。 所構建之本發明之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體 片段之表現用載體例如可用於以下之原核細胞或真核細胞 中之人類型嵌合抗體、人類化抗體或其等之抗體片段之表 現。 (2)編碼人類以外之動物之抗體之V區域的cDNA之取得 155030.doc -54- 201139666 編碼人類以外之動物之抗體、例如小鼠抗體之VL及VH 的cDNA可藉由如下方式取得。 使用自產生任意抗體之融合瘤細胞提取之mRNA作為模 板，而合成cDNA。將所合成之cDNA插入至噬菌體或質體 等載體中，而製作cDNA基因庫。 . 使用現有之編碼小鼠抗體之C區域或V區域的DNA作為 探針，自上述基因庫分別單獨分離具有編碼重鏈V區域之 cDNA的重組噬菌體或者重組質體、及具有編碼輕鏈V區域 η 之cDNA的重組噬菌體或者重組質體。 確定重組噬菌體或重組質體上之目標之小鼠抗體之VL 及VH之全長鹼基序列，由鹼基序列推測VL及VH之全長胺 基酸序列。 關於產生任意之人類以外之動物之抗體的融合瘤細胞， 可使用抗體所結合之抗原免疫人類以外之動物，依據周知 方法[Molecular Cloning 第 2 版、Current Protocols in Molecular Biology、Antibodies, monoclonal antibodies,
U
Antibody Engineering]，並利用經免疫之動物之抗體產生 細胞與骨髓瘤細胞來製作融合瘤。繼而，可選擇經單一細 • 胞化之融合瘤，將其進行培養，自培養上清液進行純化而 , 取得。 作為人類以外之動物，只要為例如小鼠、大鼠、倉鼠及 兔等可製作融合瘤細胞者，則可使用任何動物。 作為由融合瘤細胞製備全長RNA之方法，例如可列舉： 硫氰酸脈-三氟乙酸絶法[Methods in Enzymol.，1 54，3 155030.doc -55- 201139666 (1987)]等。 又，作為由全長RNA製備mRNA之方法，例如可列舉： 寡聚（dT)固定化纖維素管柱法[MolecularCloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York，1989]等。 又，作為由融合瘤細胞製備mRNA之試劑套組，例如可 列舉：Fast Track mRNA提取試劑套組（Invitrogen公司製 造）及Quick Prep mRNA純化試劑套組（Pharmacia公司製造） 等。 作為cDNA之合成及cDNA基因庫之製作法，可列舉：常 法[Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989 ; Current Protocols in
MolecularBiology, Supplement 1-34]、及使用市售之試劑 套組的方法等。作為市售之試劑套組，例如可列舉： cDNA合成及質體選殖用之Super ScriptTM質體系統 (GIBCO BRL公司製造）及ZAP-cDNA合成試劑套組 (Stratagene公司製造）等。 於製作cDNA基因庫時，組入以自融合瘤細胞提取之 mRNA作為模板而合成之cDNA的載體，只要為可組入該 cDNA之載體，則可使用任何種類。 作為上述載體，例如可列舉：ZAP Express [Strategies, 5, 58 (1992)] ' pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research, 17，9494 (1989)]、λΖΑΡ II(Stratagene公司製造）、λβί10、 Xgtll[DNA Cloning : A Practical Approach, I，49 (1985)]、 155030.doc -56- 201139666
Lambda BlueMid(Clontech 公司製造）、XExCell、pT7T3 18U(Pharmacia公司製造）、pcD2[Cell. Biol.，3, 280 (1983)] 及 pUC18[Gene, 33, 103 (1985)]等。 作為導入利用噬菌體或質體載體構建之cDNA基因庫的 大腸桿菌，只要為可導入、表現及維持該cDNA基因庫 者，則可使用任何種類。 作為上述大腸桿菌，例如可使用：XLl-Blue MRF' [Strategies, 5, 81 (1992)]、C600[Genetics, 39，440 (1954)]、Y1088、Y1090[Science，222，778 (1983)]、 NM522[J. Mol. Biol·, 166，1 (1983)]、K802[J. Mol. Biol.， 16, 118(1966)]及 JM105[Gene，38, 275 (1985)]等。 作為選擇編碼源自cDNA基因庫之人類以外之動物之抗 體之VL及VH的cDNA純系的方法，可藉由使用有經同位素 或者螢光等標記之探針的菌落雜交法或者噬菌斑雜交法 [Molecular Cloning : A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Lab· Press NewYork (1989)]進行選擇。 又，亦可製備引子，將cDNA或cDNA基因庫作為模板， 並藉由 PCR[Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, (1989) ' Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34]而製備編 碼VL及VH之cDNA。 可利用適當之制限酶等切斷藉由上述方法選擇之cDNA 後，選殖至pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造）等質體 上，藉由1-(1)中所記載之鹼基序列分析方法而確定該 155030.doc -57- 201139666 cDNA之鹼基序列。 根據所確定之鹼基序列推測VH及VL之全長胺基酸序 列，與已知之抗體之VL及VH之全長胺基酸序列 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]進行比較，藉此可確認 所取得之cDNA係編碼完全包含含有分泌訊號序列之抗體 之VL及VH的胺基酸序列。 進而，於抗體可變區域之胺基酸序列或編碼該可變區域 之DNA之鹼基序列已為公知之情形時，可使用以下方法而 製造。 於胺基酸序列為公知之情形時，可考慮密碼子之使用頻 率[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]而設計編碼該可 變區域之DNA序列，基於所設計之DNA序列，合成包含 100個鹼基左右之長度的數條合成DNA，使用其等進行 PCR法而獲得DNA。於鹼基序列為公知之情形時，可基於 其資訊，合成包含100個鹼基左右之長度的數條合成 DNA，使用其等進行PCR法而獲得DNA。 (3)人類以外之動物之抗體之V區域之胺基酸序列之分析 關於含有分泌訊號序列之抗體之VL及VH之完整之胺基 酸序列，可藉由與已知之抗體之VL及VH之胺基酸序列 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]進行比較，而推測分泌 訊號序列之長度及N末端胺基酸序列，進而可得知抗體所 155030.doc -58- 201139666 屬之亞群。又，VL及VH之各CDR之胺基酸序列亦可藉由 同樣方法找出。 (4) 置換為Cys殘基之人類型嵌合抗體或該抗體片段之表現 載體之構建 可於編碼ι-(ι)中所記載之置換為cys殘基之單株抗體或 該抗體片段之表現用載體之CL&CH的基因之上游，插入 編碼人類以外之動物之抗體之VL及VH的cDNA，而構建置 換為Cys殘基之人類型嵌合抗體或該抗體片段之表現載 體。 例如可將編碼人類以外之動物之抗體之VL及VH的 cDNA，分別與如下之合成DNA連結’該合成DNA包含人 類以外之動物之抗體VL及VH之3’末端側之鹼基序列與人 類抗體之CL及CH之5'末端側之驗基序列’且於兩端具有 適當之制限酶之識別序列。進而’可分別插入至編碼1 _(1) 中所記載之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段之表 現用載體之人類抗體之CL及CH的基因之上游，使其等以 適當形式進行表現，而構建置換為cys殘基之人類型嵌合 抗體或該抗體片段之表現載體。 (5) 編碼人類化抗體之V區域的cDNA之構建 編碼人類化抗體之VL及VH的cDNA可藉由如下方式構 建。首先，選擇移植目標之人類以外之動物之抗體之VL 及VH之CDR的人類抗體之VL及VH之FR之胺基酸序列。
作為人類抗體之VL及VH之FR之胺基酸序列，只要為人 類抗體者，則可使用任何種類。例如可列舉：登錄在PDB 155030.doc -59- 201139666 等資料庫中之人類抗體之VL及VH之FR之胺基酸序列、人 類抗體之VL及VH之FR之各亞群之通用胺基酸序列 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]等。其中，為了 製作具 有充分之活性的人類化抗體，較佳為選擇與目標之人類以 外之動物之抗體之VL及VH之FR之胺基酸序列具有儘可能 高之同源性（至少60%以上）的胺基酸序列。 其次，於所選擇之人類抗體之VL及VH之FR之胺基酸序 列上移植目標之人類以外之動物之抗體之VL及VH之CDR 之胺基酸序列，而設計人類化抗體之VL及VH之胺基酸序 列。將所設計之胺基酸序列轉化為考慮到抗體之基因之鹼 基序列中可見之密碼子之使用頻率[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]的DNA序列，而設計編碼人類化抗體之VL 及VH之胺基酸序列的DNA序列。 基於上述所設計之DNA序列，合成包含100個鹼基左右 之長度的數條合成DNA，使用其等進行PCR法。於該情形 時，就PCR之反應效率及可合成之DNA之長度而言，較佳 為設計重鏈、輕鏈均為4〜6條之合成DNA。 又，藉由於位於兩端之合成DNA之5'末端導入適當之制 限酶之識別序列，可容易地選殖至1 -(1)所構建之本發明之 置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段表現用載體上。 PCR後，將擴增產物選殖至pBluescript SK(-)(Stratagene 公司製造）等質體上，藉由1-(1)中所記載之鹼基序列分析 155030.doc -60- 201139666 方法確定鹼基序列，取得具有編碼所需之人類化抗體之 VL及VH之胺基酸序列的DNA序列的質體。 (6)人類化抗體之V區域之胺基酸序列之改形 關於人類化抗體，已知僅將人類以外之動物之抗體之 VL及VH之CDR移植至人類抗體之VL及VH之FR上時，其 抗原結合活性較原來之人類以外之動物之抗體有所降低 [BIO/TECHNOLOGY，9, 266 (1991)]。 認為其原因為：於原來之人類以外之動物之抗體之VL 及VH中，不僅CDR，FR之若干胺基酸殘基亦直接或者間 接地與抗原結合活性相關，此等胺基酸殘基隨著CDR之移 植，會變化為人類抗體之VL及VH之FR之不同胺基酸殘 基。 為了解決該問題，對於人類化抗體目前係採用如下方 法：鑑定人類抗體之VL及VH之FR之胺基酸序列中直接參 與和抗原之結合的胺基酸殘基、與CDR之胺基酸殘基相互 作用之胺基酸殘基、維持抗體之立體結構而間接地參與和 抗原之結合的胺基酸殘基等，將此等改形為源自原來之人 類以外之動物之抗體的胺基酸殘基，而使降低之抗原結合 活性上昇[BIO/TECHNOLOGY，9, 266 (1991)]。 於製作人類化抗體時，最為重要的是如何效率良好地鑑 定此等與抗原結合活性相關之FR之胺基酸殘基，為此目前 係進行藉由X射線結晶分析[J. Mol. Biol.，112, 535 (1977)] 或電腦分子模擬[Protein Engineering, 7, 1501 (1994)]等的 抗體之立體結構之構建及分析。 155030.doc -61 - 201139666 該等抗體之立體結構之資訊帶來了大量有助於製作人類 化抗體的資訊。然巾’尚未確立可應用於所有抗體之人類 化抗體之製作法。現狀為針對各抗體製作數種改形體，需 要研究各自與抗原結合活性之相關性等各種試行錯誤。 人類化抗體之VL及VH之FR之胺基酸殘基之改形可藉由 使用改形用合成DNA，進行本項丨之^)中所記載之pcR法 而實現。對於PCR後之擴增產物’藉由本項iid)中所記 載之方法確定驗基序列，而確認實施了目標之改形。 (7)置換為Cys殘基之人類化抗體或該抗體片段之表現載體 之構建 可於編碼1-(1)中所記載之置換為Cys殘基之單株抗體或 該抗體片段之表現用載體之人類抗體之CL及CH的基因之 上游’插入1-(5)及1-(6)中所構建之編碼人類化抗體之vL 及VH的cDNA，而構建置換為（：73殘基之人類化抗體或該 抗體片段之表現載體。 例如可於1-(5)及1-(6)中構建人類化抗體之vh及VL時所 使用之合成DNA中之位於兩端之合成DNA之5'末端，導入 適當之制限酶之識別序列，藉此插入至編碼本項1 丨）中所 記載之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段之表現用 載體之人類抗體之CH及CL的基因之上游，使其等以適當 形式進行表現’而構建置換為Cys殘基之人類化抗體或該 抗體片段之表現載體。 2.使用原核細胞之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片 段之製作 155030.doc •62· 201139666 作為於原核細胞中進行本項所記載之置換為Cys殘基之 單株抗體或抗體片段之恆定表現的方法，例如可將丨_ (句或 1_(7)中所記載之置換為Cys殘基之人類型嵌合抗體、人類 化抗體或其等之抗體片段之表現載體導入適當之原核細胞 中’藉此獲得穩定地產生置換為CyS殘基之人類型嵌合抗 體、人類化抗體或其等之抗體片段的轉形株。 作為導入置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段之表 現載體的原核細胞，只要為可產生基因重組抗體之原核細 胞’則可使用任何細胞。作為該原核細胞，例如可列舉大 腸桿菌、枯草菌、沙氏桿菌、沙雷氏桿菌屬及假單胞菌屬 等’其中較佳為大腸桿菌。 作為表現載體之導入方法，只要為向上述宿主細胞中導 入DNA的方法，則可使用任意方法。例如可列舉：使用舞 離子之方法[Proc· Natl. Acad. Sci· USA, 69, 2110 (1972)]、 Gene, 17，107 (1982)、Molecular&General Genetics, 168, 111 (1979)]中所記載之方法及電穿孔法[日本專利特開平2_ 257891 號公報、Cytotechnology，3，133 (1990)]等。 導入表現載體後’穩定地產生置換為CyS殘基之單株抗 體或該抗體片段的轉形株可利用含有安比西林等藥劑之原 核細胞培養用培養基進行選擇。 作為原核細胞培養用培養基，例如可列舉：Lb培養基 (Becton，Dickinson and Company公司製造）、NZYM GIT培 養基（曰本製藥公司製造）、Terrific Br〇th培養基 (Applichem公司製造）、SOB培養基（Applichem公司製造）、 155030.doc -63 - 201139666 SOC培養基（Ampliqon公司製造）、或向該等培養基中添加 安比西林等各種抗生素而獲得的培養基等。 藉由於培養基中培養所獲得之轉形株，可使置換為Cys 殘基之單株抗體或該抗體片段生產蓄積於培養上清液中。 又，轉形株於利用使用誘導性之啟動子作為啟動子之重組 載體進行轉形之情形時，亦可視需要向培養基中添加誘導 物。 作為上述誘導物，例如於培養利用使用tac啟動子之重 組載體進行轉形之微生物時，可列舉異丙基_p_D_硫代吡 喃半乳糖苷等，於培養利用使用trp啟動子之重組載體進行 轉形之微生物時’可列舉吲哚丙烯酸等。 原核細胞之轉形體之菌體、或培養上清液中之置換為 Cys殘基之單株抗體或該抗體片段之生產量及抗原結合活 性可藉由酶免疫抗體法[以下記為ELISA法，Antib〇dies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1998) . Monoclonal Antibodies ： Principles and
Practice, Academic Press Limited (1996)]等進行測定。 原t、’田胞之轉形體之菌體、或培養上清液中之置換為
Cys殘基之單株抗體或該抗體片段可自大腸桿菌提取液或 周質提取組分，藉由利用蛋白f G之親和性純化、或使用 恆定區域之C末端所結合之標籤、例如組胺酸標籤序列（包 :6個之連續之Hls的標籤序列，以下記載為多聚組胺酸標 籤）之親和性純化而進行純化。 又此外可使用通常用於蛋白質之純化的純化方法。例 155030.doc -64 - 201139666 如可組合進行凝膠過濾、離子交換層析法、疏水層析法及 超過濾等而進行純化。 經純化之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段之輕 鏈、重鏈或者抗體分子整體之分子量可藉由SDS改性聚丙 烯醯胺凝膠電泳（以下記為SDS-PAGE)[Nature，227，680 (1970)]及西方墨點法[Antibodies : A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory，Chapter 12 (1988)、
Monoclonal Antibodies · Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)]等而測定。 3.使用真核細胞之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體 片段之製作 作為於真核細胞中恆定表現本項所記載之置換為Cys殘 基之單株抗體或該抗體片段的方法，例如可藉由將1-(4)或 1-(7)中所記載之置換為Cys殘基之人類型嵌合抗體、人類 化抗體或其等之抗體片段之表現載體導入適當之真核細胞 中，而獲得穩定產生人類型嵌合抗體、人類化抗體或其等 之抗體片段的轉形株。 作為使用真核細胞中之動物細胞作為宿主之情形時之宿 主細胞，只要為可產生基因重組抗體之動物細胞，則可使 用任何細胞。例如可列舉：作為小鼠骨髓瘤細胞之NS0細 胞、SP2/0細胞、中國倉鼠卵巣細胞CHO/dhfr(-)細胞、 CHO/DG44細胞、CHO-K1細胞、大鼠骨髓瘤細胞YB2/0細 胞、IR983F細胞 '源自敍利亞倉鼠腎臟之BHK細胞、源自 人類腎臟之HEK293細胞、作為人類骨髓瘤細胞之那馬瓦 155030.doc •65- 201139666 細胞（Namalwacell)等。 該等中，較佳為作為中國倉鼠卵巣細胞之CHO/DG44細 胞、CHO-K1細胞、源自人類腎臟之HEK293細胞、大鼠骨 髓瘤YB2/0細胞等動物細胞。又，例如亦可使用國際公開 第00/61739號、國際公開第02/31 140號中所記載之表現 ADCC活性較高之基因重組抗體的細胞作為宿主細胞。 作為表現載體之導入法，只要為向上述宿主細胞中導入 DNA的方法，貝可使用任意者。例如可列舉··使用鈣離子 之方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA，69，2110 (1972)]、 Gene，17，107 (1982)、Molecular&General Genetics, 168, 111 (1979)]中所記載之方法、電穿孔法[曰本專利特開平2-257891 號公報、Cytotechnology, 3, 133 (1990)]及脂質體轉 染法[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.，84, 7413 (1987)]等。 導入表現載體後，穩定產生置換為Cys殘基之單株抗體 或該抗體片段的轉形株可依據日本專利特開平2-257891號 公報所揭示之方法，利用含有G41 8硫酸鹽（以下記為G41 8) (SIGMA公司製造）等藥劑之動物細胞培養用培養基進行選 擇。 作為動物細胞培養用培養基，可使用RPMI1640培養基 (日水製藥公司製造）、GIT培養基（曰本製藥公司製造）、 EX-CELL3 02培養基（JRH公司製造）、IMDM培養基（GIBCO BRL公司製造）、融合瘤-SFM培養基（GIBCO BRL公司製 造）、FreeStyleTM 293表現培養基（Invitrogen公司製造）、 FreeStyleTM CHO表現培養基（Invitrogen公司製造）或向該 155030.doc -66 - 201139666 等培養基中添加有太牛血清（以下記為FCS)等各種添加物 之培養基等。 又，轉形株可依據曰本專利特開平2-257891號公報中所 揭示之方法，利用DHFR基因擴增系等而提昇置換為Cys殘 基之單株抗體或該抗體片段之生產量。 可藉由於培養基中培養所獲得之轉形株，而使置換為 Cys殘基之單株抗體或該抗體片段生產蓄積於培養上清液 中〇 作為培養以動物細胞作為宿主而獲得之轉形體的培養 基，可列舉：通常使用之RPMI1640培養基[The Journal of the American Medical Association, 199，519 (1967)]、Eagle 之MEM培養基[Science，122，501 (1952)]、杜貝可改良 MEM 培養基[Virology，8，396 (1959)]、199 培養基 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)]、Whitten培養基[發育工程實驗指南-基因轉殖小 鼠之製作方法（講談社）勝木元也編纂（1987)]、FreeStyleTM 293表現培養基（Invitrogen公司製造）、FreeStyleTM CHO表 現培養基（Invitrogen公司製造）或向該等培養基中添加有太 牛血清等之培養基等。 培養較佳為於通常pH值6.0〜8.0、30〜40°C、5% C02存在 下等條件下進行1〜7天。 又，培養中亦可視需要向培養基中添加康黴素、青黴素 等抗生素。 培養上清液中之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片 155030.doc -67- 201139666 段之生產量及抗原結合活性可藉由ELASA法[Antibodies = A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
Chapter 14 (1998)、Monoclonal Antibodies : Principles and
Practice, Academic Press Limited (1996)]等而測定。 培養上清液中之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片 段可使用蛋白質A管柱，自轉形株之培養上清液進行純化 [Antibodies ： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8 (1988)、Monoclonal Antibodies · Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)] ° 又，此外可使用通常用於蛋白質之純化的純化方法。例 如可組合進行凝膠過濾、離子交換層析法、疏水層析法及 超過濾等而進行純化。 經純化之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段之輕 鏈、重鏈或抗體分子整體之分子量可藉由3〇5- PAGE[Nature，227, 680 (1970)]及西方墨點法[Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12 (1988) ' Monoclonal Antibodies · Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)]等而測定。 又，對於酵母、昆蟲細胞或植物細胞等其他真核細胞’ 可藉由與上述動物細胞相同之方法來製造置換為Cys殘基 之單株抗體或該抗體片段。 作為使用酵母之情形時之宿主細胞，例如可列舉：屬於 酒精酵母（Saccharomyces)屬、裂殖酵母（Schizosaccharomyces) 屬、克魯維酵母屬、絲孢酵母屬及許旺酵母屬 155030.doc -68- 201139666 (Schwanniomyces)等的微生物。作為該微生物，例如可列 舉：麵包酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母菌 (Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克魯維酵母菌 (Kluyveromyces lactis)及茁芽絲孢酵母菌（Trich〇sp〇r〇n pullulans)及 Schwanniomyces alluvius等。 作為表現載體之導入方法’只要為向酵母導入dNA之方 法，則可使用任意方法。例如可列舉：電穿孔法[Meth〇ds Enzymol.，194, 182 (1990)]、原生質球法[Pr〇c NaU Acad Sci，U.S.A，84, 1929 (1978)]及乙酸鋰法[j· Bacteri〇1〇gy， 153, 163 (1983)、Pr〇c. Natl. Acad· Sci. U.S.A，75, 1929 (1978)]等。
可藉由於培養基中培養以所獲得之酵母作為宿主細胞之 轉形體，使置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段生成 蓄積於培養物中’ it自該培養物t進行㈣，而製造置換 為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段。培養轉形體之方 法，可依據用於培養酵母之通常方法而進行。 作為培養以酵母作為 ,< ·/肌5贷丞，只 要為含有該生物可同化之碳源、氮源、無機鹽類等且可有 效率地培養轉形體的培養基，則可使用天然培養基、合成 培養基中之任一者。 作為碳源，為該生物可同化者即可，例如可列舉 糖、果糖、蔗糖、含有料之糖蜜、料及祕水解物等 J水化物、乙酸及丙酸等有機酸、以及乙醇及丙醇 155030.doc -69- 201139666 作為鼠源’例如可列嚴·与 η ^ 幻舉.氦、虱化銨、硫酸銨、乙酴蚀 及磷酸銨等無機酸戋 匕酸知 次有機酸之銨鹽、其他含氮化合物、 白腺、肉汁、酵母笠％ 龙 一 — 卒取物、玉米浸液、酪蛋白水解物、大 ’大Hjc解物、以及各種礙酵菌體及其消化物等。 作為無機鹽類，例如可列舉：磷酸二氣斜、鱗一 鉀、磷酸鎂、硫酸鋥、备& z ^ , u ~~ 、虱化鈉、硫酸鉄、硫酸錳、辟酸# 及碳酸鈣等。 ^鋼 培養料純料養H料氣㈣料料氣性條件 下進行。培養溫度較佳為15〜帆，培養時間通常較佳為 16小時〜7天。培養中之PH值較佳為保持在3.0〜9.0。pH值 較佳為使用無機或有機之酸m脲、碳㈣及氨等 進行調整。 中添加安比西林及四環素 又’培養中可視需要向培養基 等抗生素。 於該情形時，可於培養上清液中回收置換為Cys殘基之 單株抗體或該抗體片段。即，可藉由與上述相同之離心分 離等方法處理該培養物而取得培養上清液，使用與上述相 同之分離純化法自該培養上清液獲得置換為Cys殘基之單 株抗體或該抗體片段之純化標準品。 於使用昆蟲細胞作為宿主之情形時，例如可藉由Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34 ^
Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H.Freeman and Company, New York (1992) . Bi〇/
Technology，6, 47 (D88)等令所記载之方法而表現置換為 155030.doc -70- 201139666
Cys殘基之單株抗體或該抗體片段。 即，可將表現載體及桿狀病毒共同導入昆蟲細胞而於昆 蟲細胞培養上清液中獲得重組病毒後，進而使重組病毒感 染昆蟲細胞，而表現置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體 片段。 作為桿狀病毒，例如可列舉：作為感染夜蛾科昆蟲之病 毒的加州苜蓿夜蛾核型多角體病毒（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等 ° 作為使用昆蟲細胞之情形時之宿主細胞，例如可列舉： 作為秋夜盜蛾（Spodoptera frugiperda)之卵巣細胞的Sf9、 Sf21 [Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34 、 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)] ' 及作為粉斑夜蛾（Trichoplusia ni)之卵巣細胞的High 5 (Invitrogen公司）等。 用於製備重組病毒之向昆蟲細胞共同導入表現導入載體 與桿狀病毒的方法，例如可列舉：磷酸鈣法（日本專利特 開平2-227075號公報）及脂質體轉染法[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A·，84, 7413 (1987)]等。 可藉由於培養基中培養以所獲得之昆蟲細胞作為宿主細 胞之轉形體，使置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段 生成蓄積於培養物中，並自該培養物進行採集，而製造置 換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段。培養轉形體之方 法可依據用於培養昆蟲細胞之通常方法而進行。 155030.doc -71 - 201139666 作為培養以昆蟲細胞作為宿主而獲得之轉形體的培養 基’例如可列舉：通常使用之TNM-FH培養基（Pharmingen 么司）、Sf-900 II SFM培養基（Life Technologies 公司）、 ExCelMOO、ExCell405(均為 JRH Bi〇SCiences公司）AGrace 昆蟲培養基[Nature, 195，788 (1962)]等。 培養通常較佳為於pH值6_0〜7.0、25〜3(TC等條件下進行 1〜5天。 又 素 ，培養中可視需要向培養基中添加建它黴素等抗生 於該情形時，可於培養上清液中回收置換為Cys殘基之 單株抗體或該抗體片段。即，藉由與上述相同之離心分離 等方法處理該培養物而獲得料上清液，藉由與上述相同 之分離純化法自該培養上清液獲得置換為Cys殘基之單株 抗體或該抗體片段之純化標準品。 作為使用植物細胞之情形時之宿主細胞，例如可列舉： 源自煙卓、馬铃善、悉^ 4η ίί ^ 香力口胡蘿蔔、大豆、油菜、紫花苜 蓿、稻、小麥及大麥等之細胞等。 作為重組載體之導入方法，只要為向植物細胞中導入 魏的方法’則可使用任意方法。例如可列舉：使用農桿 菌（Agr〇baCterium)(日本專利特開昭59_14〇885號公報、日 本專利特開昭6G_7G_號公報、國際公開第94/_77號）、 電穿孔法(曰本專利特開昭6〇_25 1 887號公報)、使用粒‘搶 (基因槍）之方法（日本專利第纖㈣號、日本 2517813號）等。 币 155030.doc •72· 201139666 作為表現載體之導入方法，只要為向植物細胞中導入 DNA的方法，則可使用任意方法。例如可列舉：電穿孔法 [Cytotechnology, 3，133 (1990)]、構酸妈法（曰本專利特開 平2-227075號公報）、脂質體轉染法[Proc. Natl. Acad· Sci. U.S.A.，84, 7413 (1987)]、注射法[Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)]、使用粒子槍（基因槍）之 方法[日本專利第2606856號、日本專利第2517813號]、 DEAE-葡聚糖法[生物指南系列4-基因導入與表現、分析法 (羊土社）橫田崇、新井賢一編纂（1994)]及病毒載體法 [Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)]等。 可藉由於培養基中培養以所獲得之植物細胞作為宿主細 胞之轉形體，使置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段 生成蓄積於培養物中，並自該培養物進行採集，而製造置 換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段。培養轉形體之方 法可依據用於培養植物細胞之通常方法而進行。 以植物細胞作為宿主而獲得之轉形體可以細胞之形式， 或分化為植物之細胞或器官而進行培養。作為培養該轉形 體之培養基，例如可列舉：通常使用之MS(Murashige and Skoog)培養基及White培養基、或向該等培養基中添加有 植物生長素及細胞分裂素等植物激素之培養基等。 培養通常較佳為於pH值5.0〜9.0、20~40°C之條件下進行 155030.doc -73· 201139666 3〜60天。又，培養中可視需要向培養基中添加康黴素、潮 黴素等抗生素。 於該情形時’可於培養上清液中回收置換為Cys殘基之 單株抗體或該抗體片段。即，可藉由與上述相同之離心分 離等方法處理該培養物而取得培養上清液，並使用與上述 相同之分離純化法自該培養上清液獲得置換為cys殘基之 單株抗體或該抗體片段之純化標準品。 4.置換為Cys殘基之抗體修飾體或該抗體片段修飾體之製作 本發明之置換為Cys殘基之抗體修飾體或該抗體片段修 飾體可藉由如下方式獲得：藉由化學修飾反應，利用與該 Cys殘基之硫醇基具有反應性之修飾基對上述2或者3中所 獲得之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段進行修 飾。 上述與Cys殘基之硫醇基具有反應性之修飾基（以下亦稱 為修飾基）可藉由公知方法（國際公開第96/3545 1號、國際 公開第01/48〇52號）而製備。 藉由利用上述修飾基化學修飾置換為Cys殘基之單株抗 體或該抗體片段，而獲得作為至少1個所置換之Cys殘基經 化合物修飾之衍生物的單株抗體修飾體或該抗體片段修飾 體等。 置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段之化學修飾較 佳為對於每1 mol該抗體或該抗體片段使用較佳為丨〜⑺⑻ mol、更佳為1〜5〇 m〇i之上述修飾基進行反應而進行。 上述修飾基對單株抗體或該抗體片段之修飾之程度可藉 155030.doc -74- 201139666 由調節該修飾基相對於該抗體或該抗體片段之莫耳比、反 應溫度、pH值及反應時間等而任意選擇。 又，反應所使用之溶劑只要為不阻礙反應之溶劑，即可 使用任意者。例如’可自磷酸緩衝液、硼酸缓衝液、tHs_ 鹽酸緩衝液、碳酸氫鈉水溶液、乙酸鈉缓衝液、檸檬酸緩 衝液、水、N，N-二甲基曱醯胺、二甲基亞砜、曱醇、乙 腈、二亏烷及四氫呋喃等，以及該等之混合溶劑中選擇 [參照稻田佑二、前田浩編纂、續蛋白質雜交、共立出版 U (1988)]。 反應之溫度、pH值及時間，只要為無損化學修飾所使用 之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段、以及化學修 飾所使用之分子之活性的條件，則可為任意。例如較佳為 〇〜5(TC之範圍之溫度、10分鐘〜1〇〇小時、1^值4〜1〇。 上述化學修飾反應中所獲得之本發明之置換為…殘基 之單株抗體修飾體或該抗體片段修飾體可藉由依據常法， 〇 |獨或組合使用凝膠過德、離子交換層析法、反相高效液 相層析法、親和性層析法、疏水層析法及超過遽等而進行 純化。又，亦可藉由該等純化法，將任意化學修飾率之置 換為cys殘基之抗體修飾體或該抗體片段修飾體等區分純 ^純化之置換為Cys縣之抗體修飾體或該 飾體之結構例如可藉由質量分析、核磁用 胺基酸分析計之胺基酸組成分析而確認。X，例如： 利用反相高效㈣層析法（肌〇分_㈣ = 155030.doc -75- 201139666 儀進仃义德蒙降解而獲得之苯硫基乙内醯脲（pTH)胺基酸 的胺基酸序列分析等而確認。 5.、、、里純化之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段、置 換為CyS殘基之抗體修飾體或該抗體片段修飾體之活性評價 絰純化之本發明之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體 片奴、置換為Cys殘基之抗體修飾體或該抗體片段修飾體 之活性評價可藉由如下方式進行。 對抗原之結合活性例如可使用結合試驗、螢光抗體法 [Cancer Immunol. Immun〇ther，36，373 (1993)]及使用
Biacore系統等之表面離子體共振法等而測定。 作為抗原’係使用將含有編碼抗原之cDNa的表現載體 導入大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞及動物細胞等中而獲得之 基因導入細胞、重組蛋白質、或自人類組織獲得之純化多 肽或部分肽等。 於抗原為部分肽之情形時，係與BSA或KLH等載體蛋白 質製成複合物而使用。 將抗原分注至96孔培養盤等培養盤中，進行固相化後， 分注血清、融合瘤之培養上清液或純化單株抗體等試驗物 質作為第1抗體，使之反應。利用PBS或PBS_Tween等充分 清洗後，分注經生物素、酶、化學發光物質或放射線化合 物等標記之抗免疫球蛋白抗體，使之反應。利用pBS_ Tween充分清洗後，進行與第2抗體之標記物質對應之反 應，選擇特異性地與免疫原反應之單株抗體。 又，對抗原陽性培養細胞株之ADCC活性或CDC活性係 155030.doc -76- 201139666 藉由公知之測定方法[Cancer Immunol. Immunother., 36, 3 73 (1993)]而測定。 6.置換為Cys殘基之本發明之單株抗體或該抗體片段、置 換為Cys殘基之抗體修飾體或該抗體片段修飾體於醫藥方 面之應用 本發明之置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段、置 換為Cys殘基之抗體修飾體或該抗體片段修飾體例如可用 Ο
於診斷藥、治療劑等醫藥等。 含有置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段、置換為 Cys殘基之抗體修飾體或該抗體片段修飾體的醫藥，可作 為治療藥而單獨投予，但通常較佳為與藥理學所容許之一 種或者兩種以上之載體一併混合，並藉由製劑學之技術領 域所熟知之任意方法而製成醫藥製劑。 投予途徑較佳為使用治療時效果最好之途徑，可列舉： 經:投予，或口腔内、呼吸道内、直腸内、皮下、肌肉内 及靜脈内等非經口投予。於為抗體製劑之情形時，較佳為 靜脈内投予。 作為投予形態，例如可列邀_ .法费杰丨 j夕』羋.噴霧劑、膠囊劑、錠劑、
顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓 沾表L ^ m /主射劑、軟膏及貼劑等。 作為適合經口投予之智衣丨 裝劑例如可列舉：乳劑、糖漿 刎、膠囊劑、錠劑、散劑及顆粒劑等。 乳劑及糖漿劑之類的液體製借 狀姐表備物例如可使用水，蔗糖、 山梨糖醇及果糖等糖類，聚乙_ …、 —. —醉及丙二醉等二醇類，芏 麻油、撖欖油及大豆油等油類 寸田頌對羥基苯甲酸酯類等防腐 155030.doc -77· 201139666 劑χ及草母香料及胡椒薄荷等香料類等作為添加劑而製 造。 膠囊J錠劑、散劑及顆粒劑等可使用乳糖、葡萄糖、 嚴糖及甘露糖醇等賦形劑，澱粉及海藤酸納等崩散劑，硬 月曰i鎂及π石粉等潤滑劑’ &乙晞醇、經丙基纖維素及明 膠等黏σ冑’月日肪酸s旨等界面活性劑，以及甘油等塑化劑 專作為添加劑而製造。 作為適&非經口投予之製劑，例如可列舉：注射劑、栓 劑及喷霧劑等。 注射劑係使用包含鹽溶液、葡萄糖溶液、或兩者之混合 物的載體等而製備。或亦可依據常法將置換為cys殘基之 單株抗體或該抗體片段、置換為Cys殘基之抗體修飾體或 。亥抗體片段修飾體冷凍乾燥，並向其中添加氣化鈉，藉此 而製備粉末注射劑。 栓劑係使用可可油脂、氫化脂肪或羧酸等載體而製備。 又，噴霧劑係使用置換為Cys殘基之單株抗體或該抗體 片段、置換為Cys殘基之抗體修飾體或該抗體片段修飾體 本身、或者不會刺激接收者之口腔及呼吸道黏膜，且使置 換為Cys殘基之單株抗體或該抗體片段、置換為Cys殘基之 抗體修飾體或該抗體片段修飾體分散為微細粒子而使其變 得容易吸收的載體等而製備。 作為載體’具體可例示乳糖、甘油等。根據置換為Cys 殘基之單株抗體或該抗體片段、置換為Cys殘基之抗體修 飾體或該抗體片段修飾體及所使用之載體之性質，可採用 155030.doc -78- 201139666 氣霧劏及乾粉等製劑。又，於該等非經口劑中，亦可添加 經口劑中作為添加劑而例示之成分。 技予里或投予次數根據目標之治療效果、投予方法、治 療j間、年齡及體重等而有所不同，有效成分之量通常為 成人每天10 pg/kg〜2〇 mg/kg。 例如於用作抗腫瘤劑之情形時，作為研究置換為Cys殘 基之單株抗體或該抗體片段、置換為(：>^殘基之抗體修飾 ◎ 體或忒抗體片段修飾體對各種腫瘤細胞之抗腫瘤效果的方 法’可列舉藉由活體外實驗或活體内實驗之方法。. 作為活體外實驗，例如可列舉：細胞毒殺活性測定法、 CDC活性測定法及ADCC活性測定法等。又，作為活體内 實驗，可列舉：使用小鼠等實驗動物之腫瘤系的抗腫瘤實 驗等。 [實施例] 以下，藉由實施例說明本發明，但本發明並不限定於下 述貫施例。 [實施例1] 大腸桿菌用抗Her2人類化Fab表現載體之構建 ICys殘基置換用選殖載體之構建 大腸桿菌用抗Her2人類化Fab表現載體係藉由以下次序 而構建。作為大腸桿菌用表現載體之基本骨架，係使用市 售載體PFLG-CTS(SIGMA公司製造）。於抗Her2人類化抗 體之基因序列設計中，係基於曲妥珠單抗（贺癌平）之Fab輕 鏈區域之胺基酸序列（序列編號1)與Fab重鏈區域之胺基酸 155030.doc -79- 201139666 序列（序列編號2)[Proc. Natl· Acad. Sci. U.S.A.，89，4285 (1992)]而設計。 於包含Tac啟動子與Shine-Dalgarno序列之驗基序列（序 列編號3)之控制下，組入分別編碼與PelB分泌訊號（序列編 號4)連結的Fab之輕鏈與重鏈的基因序列，以將其縱列連 結之方式進行設計。 關於輕鏈，係採用於5’末端附加有Ndel制限酶識別序 列，且於3'末端附加有Hindlll制限酶識別序列之基因序列 (序列編號5)。關於重鏈，係採用於5'末端附加EcoRI制限 酶識別序列及包含Tac啟動子與Shine-Dalgarno序列之驗基 序列，且於3'末端含有多聚組胺酸標籤與Sail識別序列的 基因序列（序列編號6)。 輕鏈、重鏈之序列係藉由以20 bp至30 bp之驗基序列重 疊之方式設計合成DNA序列，並藉由PCR反應進行連結而 製備。關於輕鏈，係利用Ndel與Hindlll位點，對pFLAG-CTS進行導入，而製成pFLAG-HerFabL。關於重鏈，係利 用EcoRI與Sail位點，對pFLAG-CTS進行導入，而製成 pFLAG-HerFabH。將兩載體作為用於對輕鏈與重鏈導入 Cys殘基之選殖載體，實施Cys點突變之導入。 2. Cys點突變導入 基於QuikChange II XL定點突變試劑套組（Stratagene公 司）之說明書設計引子。輕鏈Q124C之導入係設計並利用 Q124C01(序列編號7)與Q124C02(序列編號8)，輕鏈H198C 之導入係設計並利用H198C01 (序列編號9)與H198C02(序列 155030.doc -80- 201139666 編號10)，輕鏈L201C之導入係設計並利用L201 CO 1(序列編 號11)與L201C02(序列編號12)，重鏈A140C之導入係設計 並利用A140C01(序列編號13)與A140C02(序列編號14)，重 鏈K147C之導入係設計並利用K147C01(序列編號15)與 K147C02(序列編號16)，重鏈S183C之導入係設計並利用 S183C01 (序列編號17)與S183C02(序列編號18)。 點突變導入反應液係使用向上述所製作之選殖載體1 0 ng、各引子125 ng中添加隨附之dNTPmix 1 pL、 QuikSolution試劑 3 pL、10 x 反應緩衝液 5 μι、PfuUltra HF DNA聚合酶1 pL，並利用滅菌水調節為50 pL而成者。 擴增反應係於95°C下加熱1分鐘後，以95°C下反應50秒 鐘、60°C下反應50秒鐘、68°C下反應7分鐘為1個循環，進 行18個循環，最後於68°C下進行7分鐘之增鏈反應。對所 獲得之反應液添加Dpn I 1 pL，於37°C下進行1小時之斷鏈 反應。 將所獲得之反應液供於瓊脂糖凝膠電泳，確認約7 kbp 之目標片段之擴增後，使用其中2 pL將隨附之XL1 0-Gold 轉形。 由所獲得之轉形株之純系製備各質體DNA，使用Big Dye Terminator循環定序試劑套組 v3.1(Applied Biosystems 公司製造）並依據隨附之說明書進行反應後，利用DNA定 序儀 ABI PRISM 3700 DNA分析儀（Applied Biosystems公司 製造）確認Cys點突變導入。將所獲得之導入有各Cys點突 變之載體分別命名為pFLAG-HerFabL-Q124C、pFLAG- 155030.doc -81 - 201139666
HerFabL-H198C、pFLAG-HerFabL-L201C、pFLAG-HerFabH-A140C、pFLAG-HerFabH-K147C、pFLAG-HerFabH-S183C。 3.抗Her2人類化Fab之表現載體之構建 導入有各Cys點突變之各抗Her2人類化Fab之表現載體係 使用導入有目標之點突變的輕鏈與重鏈，藉由利用Ndel與 Hindlll處理編碼輕鏈之載體而取得輕鏈片段，藉由利用 EcoRI與Sail處理編碼重鏈之載體而取得重鏈片段。於 Ligation High溶液（東洋紡績公司製造）中，依序將輕鏈片 段與重鏈片段連結至pFLAG-CTS載體上。 使用該反應液將大腸桿菌DH5a株轉形，由所獲得之轉 形株之純系製備各質體DNA，使用Big Dye Terminator循 環定序試劑套組ν3·1 (Applied Biosystems公司製造）並依據 隨附之說明書進行反應後，利用DNA定序儀ABI PRISM 3700 DNA分析儀（Applied Biosystems公司製造）確認輕鍵 片段與重鏈片段之插入。 將所獲得之野生型（以下簡稱為「WT」）、輕鏈Q124C、 輕鏈H198C、輕鏈L201C、重鍵A140C、重鏈K147C、重鏈 S183C之抗Her2人類化Fab之表現載體分別命名為奸1^0-HerFab ' pFLAG-HerFab-Q 124C ' pFLAG-HerFab-Hl98C ' pFLAG-HerFab-L201C、pFLAG-HerFab-A140C、pFLAG-HerFab-K147C、pFLAG-HerFab-S183C。 [實施例2] 抗Her2人類化Fab之WT及Cys殘基置換體之製備 藉由實施例1所構建之大腸桿菌Fab表現載體之基因導入 155030.doc -82- 201139666 係以大腸桿菌株\^3110(入丁(：(：：39936)作為宿主細胞而進 行。 將各種Fab表現載體以成為10 ng/ pL之方式懸浮於滅菌 蒸德水中，將3 gL添加至5 0 pL之勝任細胞中平穩地混 合，分注至微量離心管（Eppendorf tube)中並於冰上保持30 分鐘。繼而，於42°C之水浴中保持30秒鐘，再次於冰中靜 置2分鐘。 添加500 pL之滅菌LB培養基（DIFCO公司製造）後，利用 設定為37°C之培養箱進行60分鐘之振盪培養。培養後，將 全部量塗敷至添加有100 pg/mL安比西林（和光純藥公司製 造）之LB培養盤[1.5%(W/V)瓊脂糖]上。利用設定為37°C之 培養箱培養1晚後，選拔於培養盤上生長出之大腸桿菌株 作為基因導入株。 將所獲得之轉形株於37°C下使用LB培養基進行振盪培 養。以10 mL之規模培養1晚，將所獲得之菌體溶液接種至 添加有最終濃度為1 00 pg/mL之安比西林（和光純藥公司製 造）的 200 mL之 Super-Broth培養基[MOPS(Nacalai Tesque公 司製造）2 g、Tryptone(Difco公司製造）6 g、酵母菌萃取物 (Difco公司製造）4 g]中。 於37°C下進行振盪培養，於600 nm之吸光度（以下記載 為0D6Q())之值成為2.0之階段暫時停止培養，於室溫下靜置 15分鐘左右。添加最終濃度為1.0 mmol/L之異丙基-β-硫代 吡喃半乳糖苷（IPTG)(Nacalai Tesque公司製造），利用設定 為22°C之振盪培養箱以50 rpm之速度進行一晚之蛋白質表 155030.doc •83· 201139666 現誘導。 將培養一晚之大腸桿菌培養液離心分離[CR21E(日立製 作所公司製造）、5000 rpm、4°C、15分鐘]，稱量所獲得之 沈澱之重量，以10 mL之B-PER/g大腸桿菌重量作為標準， 添加B-PER細菌蛋白質萃取試劑（Thermo Fisher Scientific 公司製造）並充分懸浮，於室溫下一邊旋轉10分鐘一邊混 合。其後，進行離心分離[CR21E(日立製作所公司製造）、 7000 rpm、4°C、25分鐘]，將所獲得之上清液通入Sartolab 卩卩1\13(3壮1>1；014113 816(11111111^〇16(：11公司製造）而用於純化。 向Poly-Prep管柱（BI0-RAD公司製造）中填充TALON樹脂 (Clontech公司製造）0.5 mL，利用50 mmol/L之填酸緩衝液 (pH值6.7)與0.3 mol/L之NaCl之混合液10 mL進行清洗。該 混合液係藉由以下次序而製備。將磷酸二氫鈉二水合物 (NacalaiTesque公司製造）31.21g溶解至超純水lL中，而 製備0·2 mo 1/L之填酸二氫鈉溶液。 將磷酸氫二鈉十二水合物（純正化學公司製造）71.64 g溶 解至超純水1 L中，而製備0.2 mol/L之填酸氫二納溶液。 將NaCl(和光純藥公司製造）292.2 g溶解至超純水800 mL 中，而製備5.0 mol/L之NaCl溶液。分別製作50 mmol/L之 磷酸二氫鈉溶液與0.3 mol/L之NaCl之混合液、及50 mmol/L之碟酸氫二鈉溶液與0.3 mol/L之NaCl之混合液， 向磷酸氫二鈉溶液中，一邊測定pH值一邊添加磷酸二氫鈉 溶液而進行製備。 將上述所製備之Fab表現上清液通入管柱，利用50 155030.doc -84- 201139666 〇1111〇1/1^之構酸緩衝液（卩11值6.7)與0.3 111〇1/1^之仙。1之混合 液10 mL進行清洗，繼而利用50 mmol/L之填酸緩衝液（pH 值 6.7)、0.3 mol/L 之 NaCl、及5 mmol/Li^^(Nacalai Tesque公司製造）之混合液10 mL進行清洗。利用50 mmol/L 之磷酸緩衝液（pH 6.7)、0.3 mol/L 之 NaCl 及 150 mmol/L之口米口坐之混合液0.5 mL溶出3次，測定全部組分之 2 8 0 nm之吸收值後，使用第2次回收之組分。 使用Amicon Ultra-4 3 0K(Millipore公司製造），將緩衝液 換為20 mmol/L之#檬酸緩衝液（pH 6.0)、150 mmol/L之 NaCl及2 mmol/L之EDTA之混合液。一邊填充適量之緩衝 液，一邊離心濃縮[CR21E(日立製作所公司製造）、7000 g、4°C、4分鐘]3次，而交換緩衝液。最終樣本係進行離 心分離[CF15R(曰立製作所公司製造）、15000 rpm、4°C、 5分鐘]，回收上清液，用於以後之實驗。 針對所取得之Cys殘基置換抗Her2人類化Fab，藉由利用 非還原SDS-PAGE(10%PAGEL、Atto公司製造）進行展開而 分析單體含量。 上述表現、純化之結果為：藉由非還原SDS-PAGE選拔 出單體含量為90%以上者。其結果為：包括輕鏈Q124C、 輕鏈H198C、輕鏈L201C、重鏈A140C、重鏈K147C、重鏈 S183C在内，成功發現了複數個置換為Cys殘基之部位。所 發現之置換為Cys殘基之部位並不限定於Ser殘基、Ala殘 基、Val殘基之類的結構與Cys殘基類似之殘基，為多種多 樣。 155030.doc -85- 201139666 [實施例3] PEG化抗Her2人類化Fab之製備與PEG化效率之研究 將實施例2中所獲得之各Cys殘基置換抗Her2人類化Fab 調整為0.5〜1 mg/L之濃度。添加相對於Cys殘基置換抗 Her2人類化Fab相當於20當量之馬來醯亞胺型之PEG試劑 (平均分子量 20 kDa、SUNBRIGHT ME-200MAOB、日本油 脂公司製造），於室溫下反應2小時。利用非還原803-PAGE(10% PAGEL、Atto公司製造）展開反應前後之樣本， 藉由GS-800校準型光密度掃描儀（BI0-RAD公司製造）分析 PEG化物之生成率。 針對確認有約50%以上之生成率者，藉由凝膠過濾層析 法對反應液進行分析、純化。凝膠過濾層析法係使用 AKTApurifier(GE Healthcare公司製造），於管柱：Superose (註冊商標）12 10/300GL(GE Healthcare公司製造）、通塔 液：20 mmol/L之檸檬酸緩衝液（pH 6.0)與150 mmol/L之 NaCl之混合液、流速：0.5 mL/min、溫度：4°C之條件 下’—邊監控280 nm之吸收值一邊進行樣本溶出。 該通塔液係藉由以下次序而製備。將擰檬酸三鈉二水合 物（和光純藥公司製造）147 g溶解至500 mL之超純水中，而 製備1 .〇 mol/L之檸檬酸三鈉溶液。將檸檬酸（和光純藥公 司製造）19.2 g溶解至100 mL之超純水中，而製備1.0 mol/L 之檸樣酸溶液。 向檸檬酸鈉溶液中，一邊測定pH值一邊添加檸檬酸溶 液’而製備1.0 mol/L之檸檬酸鈉緩衝液（pH值6.0)。將1.0 155030.doc • 86 - 201139666 mol/L之棒檬酸納緩衝液（pH值6.0)20 mL與5.0 mol/L之 NaCl溶液30 mL混合，利用超純水定容為1 L，而獲得該通 塔液。計算PEG化體之波峰面積除以PEG化體與未反應單 體之波峰面積的值作為PEG化效率。 將各Cys殘基置換抗Her2人類化Fab之PEG化效率示於表 [表3] 導入Cys之Fab Q124C (輕鍵） H198C (輕鏈） L201C (輕鏈） A140C (重鍵） K147C (重鏈） S183C (重鏈） PEG化效率(％) 85 63 80 81 45 60 如表3所示，發現即使於不伴有Cys殘基之還原步驟之條 件下，輕鏈 Q124C(85%)、輕鏈 L201C(80%)、重鏈 A140C (81%)亦有80%以上之PEG化效率，可以高效率形成PEG化 體。其中，輕鏈Q124C係以85%以上之高效率形成PEG化 體。又，發現雖然輕鏈H198C、重鏈K147C、重鏈S183C 遜於先述3處之Cys殘基置換部位，但亦可以50%左右之效 率形成PEG化體。 [實施例4]
Cys殘基置換抗Her2人類化Fab中之Cys殘基之反應性之研究 依據 Arch. Biochem. Biophys.，119，41(1967)中所記載之 内容，於弱酸性條件下，使用4,4·-二硫代吡啶（4-PDS)評 價實施例2中所獲得之各Cys殘基置換抗Her2人類化Fab中 之Cys殘基之反應性。 各試劑之稀釋係使用20 mmol/L之檸檬酸緩衝液（pH 6.0)、2 mmol/L之乙二胺四乙酸（EDTA)及 150 mmol/L 之 155030.doc -87- 201139666
NaCl之混合液。該混合液係向實施例3中所製成之通塔液 100 mL中添加0.5 mol/L 之 EDTA(Nacalai Tesque公司製 造）400 μΐ^而製備。 校準曲線之製作係使用Ν-乙醯基-L-半胱胺酸（純正化學 公司製造）之稀釋溶液，對每個試驗區製作校準曲線。4-PDS(Nacalai Tesque公司製造）係適量溶解至甲醇中調整為 100 mmol/L之濃度後，利用上述檸檬酸缓衝液稀釋用混合 液稀釋為1 mmol/L而使用。 將N-乙醯基-L-半胱胺酸之稀釋溶液50 gL、或調整為10 μηιοΙ/L之實施例2中所獲得之各Cys殘基置換抗Her2人類化 Fab溶液50 μΕ與4-PDS稀釋溶液50 μί混合，於室溫下反應 30 分鐘後，利用 UV-VISIBLE SPECTROPHOTOMETER UV-1 700(島津製作所公司製造）測定藉由反應所生成之4-硫 代°比咬酮顯示最大吸收（ε=1.98χ 1 04)的324 nm之吸收值。 根據利用N-乙醯基-L-半胱胺酸之吸收值而製作之校準 曲線，算出1 mol/L之Cys殘基之理論值後，由各Cys殘基 置換抗Her2人類化Fab之吸收值算出Cys殘基置換抗Her2人 類化Fabl分子中所含之具有反應性之Cys殘基的數量。 將各Cys殘基置換抗Her2人類化Fabl分子中所含之具有 反應性之Cys殘基的數量示於表4。 [表4] 導入Cys之Fab WT Q124C (輕鏈） L201C (輕鏈） A140C (重鏈） A141C (重鏈） Cys反應性 0.36 1.34 1.19 1.17 1.30 如表4所示，關於Cys殘基對以4-PDS為代表之低分子的 155030.doc -88- 201139666 反應性，於上述實施例3中顯示出高PEG化效率之輕鏈 Q124C、輕鏈L201C、重鏈A140C亦顯示出1以上之高反應 性。另一方面，重鏈A141C雖然幾乎未形成PEG化物，但 於對4-PDS之反應性驗證中，可見1以上之高反應性。 因此，僅藉由以4-PDS為代表之低分子化合物之反應 性，尤其無法準確地預測針對高分子修飾基的化學修飾之 能力。然而，基於預測藉由置換而新導入之Cys殘基部位 作為化學修飾位點之可能性，認為藉由與上述實施例3中 所示之高分子連結子之化學修飾的直接研究係有效方法。 [實施例5]
Cys殘基置換抗Her2人類化Fab之抗原結合活性之研究 利用磷酸鹽缓衝食鹽水（PBS)(Nacalai Tesque公司製造） 稀釋依據 Protein Eng. Des. Sel·, 17, 455 (2004)中所記載之 内容而製備之Her2細胞外區域，而製成10 pg/mL，以50 jiL/孔添加至96孔之ELISA用培養盤（Greiner公司製造）中， 於4°C下固定一晚。利用PBS進行清洗後，以100 μυ孔添 加含有1%牛血清白蛋白（BSA)(SIGMA公司製造）之PBS， 於室溫下靜置1小時使之吸附。 利用PBS進行清洗後，以50 μί/孔添加實施例2中所獲得 之各Cys殘基置換抗Her2人類化Fab之稀釋溶液，於室溫下 反應1小時。反應後，利用含有0.05% Tween20(Nacalai Tesque公司製造）之PBS(PBST)進行清洗，將利用PBST稀 釋1000倍之過氧化酶標記山羊抗人類IgG(Fab’）2抗體溶液 (MP Biomedical公司製造）作為二次抗體溶液，以50 pL/孔 155030.doc -89- 201139666 進行添加，於室溫下反應1小時。 反應後，利用PBST進行清洗，以50 μΐ^/孔添加ELISA POD Substrate TMB Kit(Nacalai Tesque公司製造）之反應受 質溶液，於室溫下反應15分鐘後，以50 pL/孔添加反應停 止液。利用EnVision 2102 Multilabel Reader(Perkin Elmer 公司）進行測定，將自各孔之450 nm之吸光度減去600 nm 之吸光度之數值用作測定值，算出Cys殘基置換抗Her2人 類化Fab之抗原結合活性。 將各Cys殘基置換Fab之抗原結合活性示於圖1 '圖2。 如圖1及2所示，得知上述實施例3中顯示出高PEG化效 率之輕鏈Q124C、輕鏈H198C、輕鏈L201C、重鏈A140C、 重鏈K147C、重鏈S183C保持有與WT同等之抗原結合活 性。 [實施例6]
Cys殘基置換抗Her2人類化Fab-PEG-Val-Cit-ADM修飾體 (Fab-ADM)之製備 1.馬來醯亞胺-PEG-Val-Cit-ADM之製備 依據肽合成之操作說明書’例如肽合成之基礎與實驗、 丸善（1985)、實驗化學講座、第4版、第22卷、有機合成 IV酸·胺基酸•肽、丸善（1999)等，於載體樹脂（三苯二 氯曱烷樹脂、AnaSpec公司製造）上依序縮合Να-9-苐基曱氧 羰基-L-瓜胺酸（Fmoc-Cit-OH、渡邊化學公司製造）、Να-9-第基曱氧羰基-L-纈胺酸（Fmoc-Val-OH、渡邊化學公司製 造），而取得 H-Val-Cit-OH。 155030.doc -90- 201139666 將所獲得之H-Val-Cit-OH與NHS-PEG丨2-馬來醯亞胺 (Thermo Fisher Scientific公司製造）於二甲基甲酿胺、三乙 胺中進行混合後，依據J. Control. Release 69, 27 (2000)中 所記載之方法進行純化，而取得馬來醯亞胺-PEG-Val-Cit-OH。 依據 J· Control. Release 79，229 (2002)中所記載之方 法，將所獲得之馬來醯亞胺-PEG-Val-Cit-OH與阿黴素 (ADM)(和光純藥製）縮合，而取得馬來醯亞胺-PEG-Val-Cit-ADM。 2.Cys殘基置換抗Her2人類化Fab-PEG-Val-Cit-ADM修飾體 (Fab-ADM)之製備 向換為20 mmol/L之檸檬酸緩衝液（pH值7.0)之實施例2中 所獲得之各Cys殘基置換抗Her2人類化Fab中，利用 DMSO(和光純藥公司製造）溶解所獲得之馬來醯亞胺-PEG-Val-Cit-ADM後，相對於各Cys殘基置換抗Her2人類化Fab 而混合20當量，於室溫下反應2小時。 反應結束後，使用Superose(註冊商標）12 10/300GL(GE Healthcare公司製造）作為管柱，使用20 mmol/L之檸檬酸 緩衝液（pH 6.0)與150 mmol/L之NaCl之混合液作為通塔 液，進行凝膠過濾層析，除去未反應試劑。該通塔液係藉 由與實施例3相同之方法而製備。回收含有Cys殘基置換抗 Her2 人類化 Fab-PEG-Val-Cit-ADM修飾體（Fab-ADM)之組 分後，使用Amicon Ultra-4 30K(Millipore公司製造）進行濃 縮，分別獲得純化Fab-ADM。 155030.doc -91- 201139666 [實施例7]
Cys殘基置換抗Her2人類化Fab-PEG-Val-Cit-ADM修飾體 (Fab-ADM)之細胞毒殺活性評價 作為怒細胞株，係使用高表現Her2抗原之乳癌細胞株 SK-BR-3(ATCC : HTB-30)及低表現Her2抗原之乳癌細胞株 MCF-7(ATCC : HTB-22)。 向96孔之白色平底培養盤（Greiner公司製造）中分注靶細 胞株100 pL(5xl03個/孔），於37°C下於C02培養箱内培養一 晚。培養後，預先將實施例2中所獲得之Fab-ADM或者WT 稀釋為各種濃度，分別以50 μί/孔進行添加，進而於37°C 下培養5天。向各孔中添加50 μι之CellTiter-Glo試劑 (Promega公司製造），於室溫下1〇培養分鐘後，利用 EnVision 2102 Multilabel Reader(Perkin Elmer公司製造）檢 測發光，算出Fab-ADM及WT之細胞毒殺活性。 將各Fab-ADM之細胞毒殺活性示於圖3、圖4。 如圖3及4所示，確認到導入有重鏈A140C之抗Her2人類 化 Fab-PEG-Val-Cit-ADM 修飾體（ADM-A140C)對 SK-BR-3、MCF-7顯示出細胞毒殺活性。進而，導入有輕鏈L201C 之抗 Her2 人類化 Fab-PEG-Val-Cit-ADM 修飾體（ADM-L201C)亦同樣地對SK-BR-3顯示出細胞毒殺活性。因此， 提示本發明之置換為Cys殘基之抗體修飾體或該抗體片段 修飾體可以抗體-藥物複合物之形式用於醫藥。 [實施例8] 抗CD20嵌合Fab之WT及Cys殘基置換體之製備 155030.doc -92- 201139666 藉由與實施例1相同之方法，基於Rituximab(Rituxisan) 之Fab輕鏈區域之胺基酸序列（序列編號19)與Fab重鏈區域 之胺基酸序列（序列編號20)[Cancer Res·, 68，3863 (2008)] 進行抗CD20嵌合抗體之基因設計，分別製作WT、Cys殘 基置換體（輕鏈Q124C、輕鏈L201C、重鏈A140C)之表現載 體。 藉由與實施例2相同之方法，使用所獲得之WT、Cys殘 基置換體（輕鏈Q124C、輕鏈L201C、重鏈A140C)之表現載 體，分別表現、純化抗CD20嵌合Fab之WT及Cys殘基置換 體之蛋白質。 [實施例9]
Cys殘基置換抗CD20嵌合Fab之PEG化效率之研究 將實施例8中所獲得之各Cys殘基置換抗CD20嵌合Fab調 整為0.5〜1 mg/L之濃度。添加相對於Cys殘基置換抗CD20 嵌合Fab而相當於20當量之馬來醯亞胺型之PEG試劑（平均 分子量20 kDa、SUNBRIGHT ME-200MAOB、日本油脂公 司製造），於室溫下反應2小時。 藉由凝膠過濾層析法分析所獲得之反應液。凝膠過濾層 析法係使用Prominence(島津製作所公司製造），於管柱： G3000SWXL(Tosoh公司製造）、通塔液：20 mmol/L之擰樣 酸緩衝液（pH值6.0)與150 mmol/L之NaCl之混合液、流 速：0.5 mL/min、溫度：25°C之條件下，監控280 nm之吸 收值。計算PEG化體之波峰面積除以PEG化體與未反應單 體之波峰面積之值作為PEG化效率。 155030.doc -93· 201139666 將各Cys殘基置換抗CD20嵌合Fab之PEG化效率示於表 [表5] 導入Cys之Fab Q124C (輕鍵） L201C (輕鏈） A140C (重鏈） PEG化效率(％) 94 84 93 如表5所示，發現抗CD20嵌合Fab與實施例3之抗Her2人 類化Fab相同，輕鏈Q124C(94%)、輕鏈L201C(84%)、重鏈 A140C(93°/〇)有80%以上之PEG化效率，可以高效率形成 PEG化體。其中，輕鏈Q124C、重鏈A140C係以超過90%之 高效率形成PEG化體。 本結果提示，所發現之Cys導入部位不依賴抗體之可變 區域之胺基酸序列而具有高反應性。 [實施例10] 於5’末端分別進行SH修飾（S化）、FITC修飾之雙鏈 DNA(S化-FITC-dsDNA)之製備 設計並購買5'末端經S化之包含32 mer之DNA序列（序列 編號23)與51末端經FITC修飾之序列編號23之互補序列（序 列編號24)(Sigma-Aldrich公司製造）。利用10 mmol/L之 Tris 緩衝液（pH 8_0)、150 mmol/L 之 NaCl 及 2 mmol/L 之 EDTA之混合液（STE溶液）將兩單鏈DNA(ssDNA)調整為240 μπιοΙ/L。於90°C下加熱改性1 〇分鐘後，進行自然冷卻，而 進行退火反應。
雙鏈DNA(dsDNA)之形成係根據藉由TAE-PAGE之展 開、與藉由陰離子交換層析法控制各ssDNA而確認。TAE 155030.doc -94- 201139666 係利用超純水將UltraPure DNA Typing Grade 5〇xTAE緩衝 液（Gibco公司製造）稀釋50倍而使用。 關於陰離子交換層析法，係使用系統控制器：SCL-10Α、泵：LC-10Ai(島津製作所公司製造），於管柱： TSKgel DEAE-5PW(Tosoh 公司製造）、通塔液：A 10 mmol/L 之 Tris 緩衝液（pH 8.0)與 150 mmol/L 之 NaCl 之混合 液、B 10 mmol/L之 Tris缓衝液（pH 8.0)與 1 mol/L之NaCl之 混合液、流速：1 mL/min、溫度：25°C之條件下下，監控 260 nm、495 nm之吸收值。檢測器係使用SPD-M10A(島津 製作所公司製造）。 利用STE溶液將該dsDNA溶液調整為500 μ!^後，利用 0.04 mol/L之二硫代蘇糖酵（DTT、Nacalai公司製造）於室 溫下反應24小時。將S化部分之保護基還原。對該DNA溶 液添加3 mol/L之乙酸納緩衝液（pH值5.2)50 μί並進行混合 後，混合乙醇（和光純藥公司製造）1 mL，於-80°C下靜置20 分鐘。 進行離心分離[CF15R(日立製作所公司製造）、15〇〇〇 rpm、4°C、10分鐘]，除去上清液。對沈澱物添加預先冷 卻至-20°C之70%之乙醇溶液1 mL，進行離心分離 [CF15R(曰立製作所公司製造）、15000 rpm、4。(：、5分 鐘]，除去上清液。 所獲得之沈澱物係於進行真空乾燥後，溶解至20 mmol/L 之檸檬酸缓衝液（pH 6.0)、150 mmol/L 之 NaCl 及 2 mmol/L之EDTA之混合液中，製成S化-FITC-dsDNA而供於 155030.doc -95- 201139666 下一實施例。 [實施例11] 抗Her2人類化Fab-DNA複合物之製備 將實施例2中所獲得之Cys殘基置換抗Her2人類化 Fab(A140C)調整為0.5〜1 mg/L之濃度。對A140C添加相當 於20當量之二馬來醯亞胺試劑（BM(PEG)3、Thermo Fisher Scientific公司製造），於4°C下反應一晚。 該反應液係利用NAP5(GE Healthcare公司製造），利用通 塔液：20 mmol/L之檸檬酸緩衝液（pH 6.0)、150 mmol/L之 NaCl及2 mmol/L之EDTA之混合液除去未反應之 BM(PEG)3。經純化之馬來醯亞胺化A140C(Mal-A140C)係 利用 Ultrafree-0.5離心過濾裝置（30K NMWL、Millipore公 司製造）進行離心濃縮[CF15R(日立製作所公司製造）、 7000 rpm、4°C ]，而濃縮至5 mg/mL。藉由利用非還原 SDS-PAGE(5-20%PAGEL、Atto公司製造）進行展開，確認 未形成經由BM(PEG)3試劑之二聚物。 對Mal-A140C，以成為1/10當量之方式添加實施例10中 所獲得之S化-FITC-dsDNA，於4°C下反應一晚。將由反應 前之S化-FITC-dsDNA與Mal-A140C混合而成之S化-FITC-dsDNA分別利用 TAE-PAGE(15-20%PAGEL、Atto公司製造） 展開，並利用LAS4000檢測FITC之螢光。將所取得之圖像 示於圖5。 S化FITC-dsDNA消失，可確認形成了高分子量部分含有 FITC之新條帶，提示本發明之Cys殘基置換Fab亦可應用於 155030.doc -96- 201139666 與核酸之複合物體。 [實施例12] 抗Her2人類化Fab-Alexa Fluor 488複合物之製備 將實施例2中所獲得之Cys殘基置換抗Her2人類化 Fab(A140C)調整為0.5〜1 mg/L之濃度。對A140C添加相當 於20當量之Alexa Fluor 488 C5-馬來醯亞胺（Invitrogen公司 製造），於4°C下反應一晚。該反應液係利用NAP5(GE Healthcare公司製造），並利用通塔液：20 mmol/L之檸檬 酸緩衝液（pH 6.0)、150 mmol/L之NaCl及2 mmol/L之EDTA 之混合液而除去未反應之Alexa Fluor 488 C5-馬來酿亞 胺。 利用 UV-VISIBLE SPECTROPHOTOMETER UV-1700(島 津製作所公司製造），測定經純化之A140C-Alexa Fuor 488 之280 nm與495 nm之吸光度，依據由Invitrogen公司提供 之操作說明書算出修飾效率。其結果為，算出96%之高修 飾效率，提示本發明之Cys殘基置換抗Her2人類化Fab可展 開為與螢光試劑之複合物體。 [實施例13] 抗Her2人類化Fab-生物素複合物之製備與鏈黴抗生素蛋白 (SA)結合活性評價 向實施例2中所獲得之各Cys殘基置換抗Her2人類化Fab 中，利用DMSO(和光純藥公司製造）溶解馬來醯亞胺-PEG2-生物素（Thermo Fisher Scientific公司製造）後，相對 於各Cys殘基置換抗Her2人類化Fab混合20當量，於4°C下 155030.doc •97- 201139666 反應一晚。 反應結束後，使用Superose(註冊商標）12 10/300GL(GE Healthcare公司製造）作為管柱，使用20 mmol/L之擰檬酸 緩衝液（pH 6·0)與150 mmol/L之NaCl之混合液作為通塔 液，進行凝膠過濾、層析，除去未反應試劑。該通塔液係藉 由與實施例3相同之方法而製備。回收含有Cys殘基置換抗 Her2人類化Fab-生物素修飾體（Fab-生物素）之組分後，使 用Amicon Ultra-4 30K(Millipore公司製造）進行濃縮，分別 獲得純化Fab-生物素。 利用PBS稀釋鏈黴抗生素蛋白（New England Biolabs公司 製造）而製成5 pg/mL，以50 μί/孔添加至96孔之ELISA用 培養盤中，於4°C下固定一晚。利用PBS進行清洗後，以 100 pL/孔添加含有1% BSA之PBS，於室溫下靜置1小時使 之吸附。利用PBS進行清洗後，以50 μΐ^/孔添加本實施例 中所獲得之各Fab-生物素之稀釋溶液（0·2 pg/mL)，於室溫 下反應1小時。反應後，利用PBST進行清洗，以50 μυ孔 添加利用PBST稀釋1000倍之過氧化酶標記山羊抗人類 IgG(Fab’）2抗體溶液（MP Biomedical公司製造）作為二次抗 體溶液，於室溫下反應1小時。 反應後，利用PBST進行清洗，以50 μί/孔添加ELISA POD Substrate TMB Kit之反應受質溶液，於室溫下反應1 5 分鐘後，以50 μί/孔添加反應停止液。利用EnVision 2102 Multi label Reader進行測定，將自各孔之450 nm之吸光度 減去6 0 0 nm之吸光度之數值用作測定值，算出各Fab -生物 155030.doc -98- 201139666 素之SA結合活性。將各Cys殘基置換Fab之抗原結合活性 示於圖6。 如圖6所示，確認到實施例3中顯示出PEG化效率之輕鏈 Q124C、輕鏈L201C、重鏈A140C與野生型相比，具有更 強之SA結合活性。 [實施例14] 動物細胞用抗Her2人類化抗體及抗EGFR嵌合抗體表現載 體之構建 1.野生型表現載體之構建 動物細胞用抗Her2人類化抗體表現載體係藉由以下次序 而構建。作為動物細胞用表現載體之基本骨架，係使用 N5KG1-Val Lark載體[IDEC Pharmaceuticals，N5KG1(美國 專利第6001358號說明書）之改型載體）。 抗Her2人類化抗體之基因序列設計係基於曲妥珠單抗 (贺癌平）之Fab輕鍵區域之胺基酸序列（序列編號1)與Fab重 鏈區域之胺基酸序列（序列編號2)[Proc·Natl·Acad·Sci· U.S.A.，89, 4285 (1992)]進行設計。 抗EGFR嵌合抗體之基因序列設計係基於西妥昔單抗（爾 必得舒）之Fab輕鏈可變區域之胺基酸序列（序列編號25)與 Fab重鏈可變區域之胺基酸序列（序列編號26)[美國專利第 7060808號說明書]進行設計。 關於輕鏈，抗Her2人類化抗體（序列編號27)以及抗EGFR 嵌合抗體（序列編號28)係設計5'末端附加有Sail制限酶識別 序列、Bglll制限酶識別序列及訊號序列，且3'末端附加有 155030.doc -99- 201139666
EcoRI制限酶識別序列與BsiWI制限酶識別序列之基因序 列。 關於重鏈，抗Her2人類化抗體（序列編號29)以及抗EGFR 嵌合抗體（序列編號30)係設計5'末端附加有Sail制限酶識別 序列與訊號序列，且3'末端含有EcoRI制限酶識別序列與 Nhel制限酶識別序列之基因序列。 輕鏈、重鏈之序列係藉由以20 bp至30 bp之驗基序列重 疊之方式設計合成DNA序列，並藉由PCR反應進行連結而 製備。輕鏈係利用Sail與EcoR位點，對pFLAG-CTS進行導 入，分別製成pFLAG-TraLV、pFLAG-CetLV。 重鏈係利用EcoRI與Sail位點，對pFLAG-CTS進行導 入’分別製成pFLAG-TraHV、pFLAG-CetHV。藉由利用 Bglll與 BsiWI 處理 pFLAG-TraLV、pFLAG-CetLV，分別取 得輕鏈可變片段，藉由利用Sail與Nhel處理pFLAG-TraHV、pFLAG-CetHV，分別取得重鏈可變片段。 利用Ligation High溶液（東洋紡績公司製造），依序將輕 鏈可變片段與重鏈可變片段連結至N5KG1-Val Lark上。使 用該反應液將大腸桿菌DH5a株轉形，由所獲得之轉形株 之純系製備各質體DNA。 使用Big Dye Terminator循環定序試劑套組v3.1 (Applied Biosystems公司製造）並依據隨附之說明書使各質體DNA進 行反應後，利用DNA定序儀ABI PRISM 3700 DNA分析儀 (Applied Biosystems公司製造）確認輕鏈片段與重鏈片段之 插入。所獲得之表現野生型曲妥珠單抗、西妥昔單抗之載 155030.doc •100· 201139666 體分別命名為 N5KG1-Tra、N5KG1-Cet。 2.Cys點突變導入
基於QuikChange II XL定點突變試劑套組（Stratagene公 司）之說明書而設計引子。輕鏈Q124C之導入係使用 . Q124C01(序列編號7)與Q124C02(序列編號8)，輕鏈L201C 之導入係使用L201C01(序列編號11)與L201C02(序列編號 12)，重鏈A140C之導入係使用A140C01(序列編號13)與 A140C02(序列編號14)。 〇 點突變導入反應液係使用向N5KG1-Val Lark 10 ng、各 引子 125 ng 中添加隨附之 dNTPmix 1 pL、Quik Solution試 劑3 μΐ^、1〇χ反應緩衝液5 μί、PfuUltra HF DNA聚合酶1 pL，並利用滅菌水調整為50 pL者。 擴增反應係於95°C下加熱1分鐘後，以包含95°C下反應 50秒鐘、60°C下反應50秒鐘、68°C下反應9分鐘之反應作 為1個循環，進行18個循環，最後於68°C下進行7分鐘之增 鍵反應。 〇 對所獲得之反應液添加Dpn I 1 pL，於37°C下進行1小時 之斷鏈反應。將所獲得之反應液供於瓊脂糖凝膠電泳，確 - 認有約9 kbp之目標片段之擴增後，使用其中2 μΕ將隨附之 XLIO-Gold 轉形。 由所獲得之轉形株之純系製備各質體DNA，使用Big Dye Terminator循環定序試劑套組ν3·1 (Applied Biosystems 公司製造）並依據隨附之說明書進行反應後，利用DNA定 序儀 ABI PRISM 3700 DNA分析儀（Applied Biosystems公司 155030.doc -101- 201139666 製造）確認Cys點突變導入。所獲得之導入有各Cys點突變 之載體分別命名為N5KG1-Q124C、N5KG1-L201C、 N5KG1-A140C。 3. Cys殘基置換抗Her2人類化抗體及Cys殘基置換抗EGFR 嵌合抗體之表現載體之構建 A140C係利用N5KGl-A140C與N5KGl-Tra及N5KGl-Cet 而製作。藉由利用Nfel與BamHI處理N5KG1-A140C，而取 得具有A140C之突變的重鏈恆定區域片段，藉由利用Nfel 與BamHI處理N5KG1-Tra及N5KG1-Cet，而取得除去重鏈 恆定區域之片段。 利用Ligation High溶液（東洋紡績公司製造）連結所取得 之片段。使用該反應液將大腸桿菌DH5a株轉形，由所獲 得之轉形株之純系製備各質體DNA。 使用Big Dye Terminator循環定序試劑套組v3.1 (Applied Biosystems公司製造）並依據隨附之說明書使各質體DNA進 行反應後，利用DNA定序儀ABI PRISM 3700 DNA分析儀 (Applied Biosystems公司製造）碟認具有A140C之全長曲妥 珠單抗之鹼基序列以及全長西妥昔單抗之鹼基序列之插 入。所獲得之各Cys殘基置換抗體之表現載體分別命名為 N5KGl-Tra-A140C、N5KGl-Cet-A140C。 Q124C 係利用 N5KG1-Q124C 與 N5KG1-Tra及 N5KG1-Cet 而製作。藉由利用BsiWI與EcoRI處理N5KG1-Q124C，而 取得具有Q124C之突變的輕鏈恆定區域片段，藉由利用 BsiWI 與 EcoRI 處理 N5KG1-Tra 及 N5KG1-Cet，而取得除去 155030.doc -102- 201139666 輕鏈恆定區域之片段。 利用Ligation High溶液（東洋紡績公司製造）連結所取得 之片段。使用該反應液將大腸桿菌DH5a株轉形，由所獲 得之轉形株之純系製備各質體DNA，使用Big Dye Terminator循環定序試劑套組 ν3· 1 (Applied Biosystems 公司 製造）並依據隨附之說明書使之反應。 其後，利用DNA定序儀ABI PRISM 3700 DNA分析儀 (Applied Biosystems公司製造）確認具有Q124C之突變的全 長曲妥珠單抗之鹼基序列以及全長西妥昔單抗之鹼基序列 之插入。所獲得之各Cys殘基置換抗體之表現載體分別命 名為 N5KGl-Tra-Q124C、N5KGl-Cet-Q124C。 L201C係除使用 N5KG1-L201C代替 N5KG1-Q124C以外， 藉由與Q124C相同之方法而製備。所獲得之各Cys殘基置 換抗體之表現載體分別命名為N5KGl-Tra-L201C、 N5KGl-Cet-L201C。 [實施例15] 抗Her2人類化抗體及抗EGFR嵌合抗體之WT及Cys殘基置 換抗體之製備 實施例14中所構建之動物細胞用之抗體表現載體之基因 導入係以 CHO-K1、或 FreeStyleTM 293-F細胞（Invitrogen公 司製造）作為宿主細胞而進行。 於使用CHO-K1作為宿主細胞之情形時，係基於 FreeStyleTM MAX CHO表現系統（Invitrogen公司製造）之說 明書，由基因導入進行抗體之表現。將3!2.5 pg之表現載 155030.doc •103· 201139666 體質體與〇ptiProTM SFM(Invitrogen公司製造）混合，製成 合計5 mL。 將312.5 pL之FreeStyleTM MAX轉染試劑（Invitrogen公司 製造）與〇ptiProTM SFM混合，製成合計5 mL。將表現載體 質體溶液與FreeStyleTM MAX轉染試劑溶液混合，於室溫 下靜置10分鐘。於FreeStyleTM CHO表現培養基（Invitrogen 公司製造）中以1.〇χ1〇6 cells/mL之密度進行培養，向所獲 得之CHO-K1 250 mL添加全部量後，於37°C、8% C〇2、 1 35 rpm之設定條件下培養1〜5天。 於使用FreeStyleTM 293-F細胞作為宿主細胞之情形時， 係基於FreeStyleTM MAX 293表現系統（Invitrogen公司製 造）之說明書，自基因導入進行抗體之表現。將25〇 pg之表 現載體質體與Opti-MEM(註冊商標）（Invitrogen公司製造）混 合，而製成合計8.3 mL。將500 μί之293fectinTM (Invitrogen公司製造）與Opti-MEM(註冊商標）混合，而製成 合計8.3 mL，並靜置5分鐘。 將表現載體質體溶液與293£6(^1171^溶液混合，靜置20分 鐘。於FreeStyleTM 293表現培養基（Invitrogen公司製造）中 以l.OxlO6 cells/mL之密度進行培養，向所獲得之 FreeStyleTM 293-F細胞250 mL中添加全部量後，於37°C、 8% C02、125 rpm之設定條件下培養卜5天。 將細胞培養液離心分離[CR21E(日立製作所公司製造）、 2600 rpm、室溫、30分鐘]，回收上清液，通過0.22 μιη薄 膜過濾器（IWAKI公司製造），而用於純化。向Poly-Prep營 155030.doc 201139666 柱（BIO-RAD公司製造）中填充MabSelect樹脂（GE Healthcare公司製造）1 mL，利用 DPBS(Invitrogen公司製 造）20 mL進行清洗。 將上述所製備之Cys殘基置換抗體表現上清液通入管 柱，利用DPBS(Invitrogen公司製造）20 mL進行清洗。利用 20 mmol/L之檸檬酸緩衝液（pH值3.0)與50 mmol/L之NaCl 的混合液3 mL進行溶出，並回收全部組分。 使用 Vivaspin 20 30K(GE Healthcare公司製造），將緩衝 液換為20 mmol/L之檸檬酸缓衝液（pH 6.0)、150 mmol/L之 NaCl及2 mmol/L之EDTA之混合液。一邊填充適量之缓衝 液，一邊進行離心濃縮[Centrifuge 5810R(Eppendorf公司 製造）、3600 rpm、4°C、20分鐘]2次，而進行緩衝液交 換。最終樣本係進行離心分離[CF15R(日立製作所公司製 造）、15000 rpm、4°C ' 5分鐘]，回收上清液，而用於以後 之實驗。 [實施例16]
Cys殘基置換抗Her2人類化抗體及抗EGFR嵌合抗體中之 Cys殘基之反應性之研究 方法係依據實施例4而實施。將各Cys殘基置換抗體1分 子中所含之具有反應性之Cys殘基的數量示於表6。 [表6] 抗體 抗Her2人類d 匕抗體 抗EGFR嵌合抗體 Cys置換部位 WT Q124C (輕鍵） L201C (輕鍵） A140C (重鏈） Q124C (輕鏈） Cys反應性 0 1.67 1.61 1.61 1.94 155030.doc -105- 201139666 如表6所示，各Cys殘基置換抗體中之Cys殘基之反應性 顯示為1.6〜1.9。又’表6中，Cys殘基置換Fab確認到與顯 示出80%以上之PEG化效率之資料具有相關性的結果。 [實施例17]
Cys殘基置換抗EGFR嵌合抗體之PEG化效率之研究 將實施例15中所獲得之各Cys殘基置換抗EGFR喪合抗體 調整為0.5〜1 mg/L之濃度。對Cys殘基置換抗EGFR敌合抗 體添加相當於20當量之馬來醯亞胺型之PEG試劑（平均分子 量 20 kDa、SUNBRIGHT ME-200MAOB、日本油脂公司製 造），於室溫下反應2小時。 於100 μιηοΙ/LDTT條件下將所獲得之反應液還原後，利 用10% PAGEL(Atto公司製造）進行展開’確認目標條帶之 位移，藉此確認PEG化之進行。提示本發明之Cys殘基置 換抗體可展開為與PEG分子之複合物體。 [實施例18] 抗£0?11嵌合抗體-八16\3?111〇丨48 8複合物之製備 將實施例15中所獲得之Cys殘基置換抗EGFR礙合抗體 (Q124C)調整為3 mg/mL之濃度。對Q124C添加相當於20當 量之Alexa Fluor 488 C5-馬來醯亞胺（Invitrogen公司製 造），於4°C下反應一晚。該反應液係利用NAP5(GE Healthcare公司製造），並利用通塔液：20 mmol/L之擰檬 酸緩衝液（pH 值 6.0)、150 mmol/L 之 NaCl 及 2 mmol/L 之 EDTA的混合液除去未反應之Alexa Fluor 488 C5-馬來醯亞 胺。 155030.doc -106- 201139666 利用 UV-VISIBLE SPECTROPHOTOMETER UV-1700(島 津製作所公司製造），測定經純化之L201C-Alexa Fuor 488 之280 nm與494 nm之吸光度，並依據Invitrogen公司提供 之操作說明書算出修飾效率。 其結果為，相對於1分子Q124C確認有2,2分子之Alexa Fluor 488之結合，確認到與理論值（2.0)同等之修飾效率。 提示本發明之Cys殘基置換抗體可展開為與螢光試劑之複 合物體。 [實施例19]
Cys殘基置換抗EGFR嵌合抗體-PEG-Val-Cit-ADM修飾體 (Ab-ADM)之製備 馬來醯亞胺-PEG-Val-Cit-ADM之製備係依據實施例6而 實施。向實施例15中所獲得之Cys殘基置換抗EGFR嵌合抗 體（Q124C)中，利用DMSO(和光純藥公司製造）溶解所獲得 之馬來醯亞胺-PEG-Val-Cit-ADM後，對Q124C混合20當 量，於室溫下反應2小時。 反應結束後，使用Mono S(註冊商標）5/50GL(GE Healthcare公司製造）作為管柱，使用A缓衝液20 mmol/L 之乙酸緩衝液（pH 5.0)、B緩衝液20 mmol/L之乙酸缓衝液 (pH 5.0)與1.0 mol/L之NaCl之混合液作為通塔液，利用〇_ 1.0 mol/L之NaCl之濃度梯度進行陽離子交換純化’除去未 反應試劑。 上述通塔液係藉由以下次序而製備。利用1 L之超純水 稀釋乙酸（和光純藥公司製造）22.9 mL，製備0.4 mol/L之乙 155030.doc -107- 201139666 酸溶液。將乙酸鈉（和光純藥公司製造）32.8 g溶解至1 L之 超純水中，製備0.4 mol/L之乙酸鈉溶液。 將NaCl(和光純藥公司製造）233.8 g溶解至超純水1 L 中，製備4.0 mol/L之NaCl溶液。藉由將該乙酸溶液296 mL與該乙酸鈉溶液704 mL混合，而製備0.4 mol/L之乙酸 緩衝液（pH值5.0)。利用超純水將該乙酸缓衝液50 mL定容 為1 L，獲得A緩衝液。 將上述乙酸緩衝液50 mL與該NaCl溶液250 mL混合，利 用超純水定容為1 L，而獲得B缓衝液。回收含有源自ADM 之具有特性吸收（495 nm)之Cys殘基置換抗EGFR嵌合抗體 (Q124C)-PEG-Val-Cit-ADM 修飾體（Q124C-ADM)的組分 後，使用Amicon Ultra-4 30K(Millipore公司製造）進行濃 縮，獲得純化Q124C-ADM。 本發明雖使用特定態樣進行了詳細說明，但從業者明瞭 可在不脫離本發明之意圖與範圍之情況下實施各種變更及 變形。再者，本申請案係基於2010年3月26曰提出申請之 美國臨時申請案（61/31793 5號）及2010年10月5日提出申請 之美國臨時申請案（61/389887號）者，其全部内容引用至本 文中。 產業上之可利用性 根據本發明，可提供恆定區域内之1個以上之胺基酸被 置換為半胱胺酸殘基之單株抗體或該抗體片段、產生該單 株抗體或該抗體片段之融合瘤、編碼該單株抗體或該抗體 片段之DNA、含有該DNA之載體、將該載體導入宿主細胞 155030.doc -108- 201139666 而獲知之轉形株、使用該融合瘤或該轉形株之單株抗體或 該抗體片段之製造方法、該單株抗體或該抗體片段之至少 1個所置換之半胱胺酸殘基經化學修飾之抗體修飾體或該 抗體片段修飾體》 序列表自由内容 序列編號1-人工序列之說明：抗Her2人類化Fab輕鏈之胺 基酸序列 序列編號2-人工序列之說明：抗Her2人類化Fab重鏈之胺 基酸序列 序列編號3-人工序列之說明：包含Tac啟動子與Shine-Dalgarno序列之核酸之驗基序列 序列編號4-人工序列之說明：PelB分泌訊號之胺基酸序列 序列編號5-人工序列之說明：抗Her2人類化Fab表現載體 中之輕鍵之驗基序列 序列編號6-人工序列之說明：抗Her2人類化Fab表現載體 中之重鍵之驗基序列 序列編號7-人工序列之說明：輕鏈Q124C引子（Q124C01)之 驗基序列 序列編號8-人工序列之說明：輕鏈Q124C引子（Q124C02)之 鹼基序列 序列編號9-人工序列之說明：輕鏈H198C引子（H198C01)之 鹼基序列 序列編號10-人工序列之說明：輕鏈H198C弓丨子（H198C02) 之鹼基序列 155030.doc -109- 201139666 序列編號1卜人工序列之說明：輕鏈L201C引子（L201C01) 之鹼基序列 序列編號12-人工序列之說明：輕鏈L201C引子（L201C02) 之驗基序列 序列編號13-人工序列之說明：重鏈A140C引子（A140C01) 之鹼基序列 序列編號14-人工序列之說明：重鏈A140C引子（A140C02) 之鹼基序列 序列編號15-人工序列之說明：重鏈K147C引子（K147C01) 之鹼基序列 序列編號16-人工序列之說明：重鏈K147C引子（K147C02) 之驗基序列 序列編號17-人工序列之說明：重鏈S183C引子（S183C01) 之鹼基序列 序列編號18-人工序列之說明：重鏈S183c引子（S183C02) 之鹼基序列 序列编號1 9-人工序列之說明：抗CD20嵌合Fab輕鏈之胺基 酸序列 序列編號2 0 -人工序列之說明：抗cD2 0嵌合F ab重鍵之胺基 酸序列 序列編號2卜人工序列之說明：抗CD20嵌合Fab表現載體中 之輕鏈之鹼基序列 序列編號22-人工序列之說明：抗CD20嵌合Fab表現載體中 之重鍵之驗基序列 155030.doc -110- 201139666 序列編號23-人工序列之說明：複合物驗證用（5' S化）之鹼 基序列 序列編號24-人工序列之說明：複合物驗證用（5' FITC標 記）之驗基序列 序列編號25-人工序列之說明：抗EGFR嵌合抗體輕鏈可變 區域之胺基酸序列 序列編號26-人工序列之說明：抗EGFR嵌合抗體重鏈可變 區域之胺基酸序列 ^ 序列編號27-人工序列之說明：抗Her2人類化抗體表現載 體中之輕鏈可變區域之驗基序列 序列編號28-人工序列之說明：抗EGFR嵌合抗體表現載體 中之輕鏈可變區域之驗基序列 序列編號29-人工序列之說明：抗Her2人類化抗體表現載 體中之重鏈可變區域之鹼基序列 序列編號30-人工序列之說明：抗EGFR嵌合抗體表現載體 ^ 中之重鏈可變區域之鹼基序列 【圖式簡單說明】 圖1係表示源自抗Her2抗體之Cys殘基置換Fab對Her2之 結合性的圖。縱軸表示450 nm之吸光度，橫軸表示Fab之 濃度（Kg/mL)。野生型以虛線表示，輕鏈Q124C以▲表示， 輕鏈H198C以表示，輕鏈L201C以·表示。 圖2係表示源自抗Her2抗體之Cys殘基置換Fab對Her2之 結合性的圖。縱轴表示4 5 0 nm之吸光度，橫軸表示Fab之 濃度（pg/niL)。野生型以虛線表示，重鏈A140C以▲表示， 155030.doc -111 - 201139666 重鏈K147C以表示，重鏈S183C以·表示。 圖3係表示源自抗Her2抗體之Cys殘基置換Fab-阿黴素連 結子修飾體對SK-BR-3細胞之細胞毒殺活性的圖。縱軸表 示相對發光強度（RLU)，橫軸表示Fab-阿黴素連結子修飾 體之濃度bg/mL)。野生型以·表示，ADM-A140C以▲表 示，ADM-L201C以·表示。 圖4係表示源自抗Her2抗體之Cys殘基置換Fab-阿黴素連 結子修飾體對MCF-7細胞之細胞毒殺活性的圖。縱軸表示 相對發光強度（RLU)，橫軸表示Fab-阿黴素連結子修飾體 之濃度（pg/mL)。野生型以·表示，ADM-A140C以▲表示。 圖5係源自抗Her2抗體之Cys殘基置換Fab-DNA修飾體之 TAE PAGE分析的結果。泳道1表示僅有S化-FITC標記 dsDNA之樣本，泳道2表示源自抗Her2抗體之Cys殘基置換 Fab(A140C)與S化-FITC標記dsDNA之反應後之樣本。S化-FITC標記dsDNA以·表示，A140C-DNA修飾體以▲表示。 圖6係表示源自抗Her2抗體之Cys殘基置換Fab-生物素修 飾體對鏈黴抗生素蛋白（SA)之結合性的圖。縱軸表示450 nm之吸光度。泳道1表示野生型之結果，泳道2表示 A140C-生物素修飾體之結果，泳道3表示Q124C-生物素修 飾體之結果，泳道4表示L201C-生物素修飾體之結果。 155030.doc -112- 201139666 序列表 <no>日本協和醱酵麒麟股份有限公司 <120>導入新穎修飾部位之抗體及抗體片段 <130> W501911 <140〉 100110498 <141〉 2011-03-25 <150〉 61/317,935;61/389,887 <151> 2010-03-26;2010-10-05 <160〉 30
<170> Patentln 第 3.3 版 uRTj t 2 P人 V? V/ vy V/ ο ί z $ 1 1— 4f 2 2 2 2 c < < < <220> <223>抗1^2人類化Fab (輕鏈） <400> 1
Aep lie Gin Met Thr 0ln Ser Pro Ser Ser Leu $er Ala Ser Val Gly 15 10 t5
Asp Arg Val Thr lie Thr Cye Arg Ala Ser 6ln Aep Val Asn Thr Ala 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin 6ln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lye Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Pho Ser Qly 50 55 60
Ser Arg Ser Qly Thr Aep Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Sin Pro 65 70 75 80 155030-序列表.doc 201139666 S|u Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 6ln 6ln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Qly Gin 6ly Thr Ly? Yal Glu Its Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lye Ser Qly 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu hm Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140
Lys Val 6ln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser 6ln 145 150 155 160 6(u Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 彳70 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 〗80 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His 6ln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Qlu Cy« 210 zeRTj 2 2 p Λ V/ V/ vy o 1 z 3 1· 1— 1— 2 2 2 2 y\ ys y\ <220> <223〉抗Her2人類化Fab (重鏈) <400> 2 155030·序列表.doc 201139666
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Qln Pro Gly 6ly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser G(y Phe Asn lie Lys Asp Thr 20 2S 30
Tyr I Ιθ Hie Trp Val Arg Gin Ala Pro 6|y Lys Qly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Arg I\9 Tyr Pro Thr A?n Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr I le Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Qln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ser Arg Trp Sly Qly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Qln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Sar Thr Lys Qly Pro Sar Val 115 120 125 〇 Phe Pro Leu Ala Pro Ser $ar Lys Ser Thr Ser Sly 6ly Thr Ala Ala 130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 1 50 155 160
Trp Asn Ser 6ty Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175
Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 155030-序列表.doc 201139666
Ser Ser Ser Leu fily Thr Gin Thr Tyr IΙθ Cys Asn Val Asn His Lye 195 200 205
Pro Sar Asn Thr Lys Val A$p Lye Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220
Lys Thr 225 2 ^ ^ 3 7 D人 > > > o 1 z 3 n 1— 1— 2 2 2 2 <220> <223〉Tac啟動子與 Shine-Dalgamo 序列 <400> 3 gagctgttga caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggatqacaat 60 ttwcacagg ag 72 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213>人工 <220> <223> PelB分泌訊號 <400> 4 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 15 10 15
Ala Gin Pro Ala Met Ala 20
Ln727DNAAi o 1 csi 3 1J 1» 1— 1 2 2 2 2 y\ yN 155030-序列表.doc 201139666 <2Z0> <223>抗1^2人類化Fab (輕鏈） <400> 5 catatgaaat acctgctgcc gaccgctgct gctggtctgc tgctcotcgc tgocoagcog 60 5〇gatggccg atatcoagat gacccagtcc ccpectcco tytccgccto tgtgggcgat 120 aggitcaoca toacotgccg tgccagtcag gatgtgaata ctgctgtagc ctggtatoaa 180
Mgaaaccag gaaaagctoc gaaactactg etttaotcgg catcottcot ctactctgga 240 gtcoottitc gcttctctgg atccagatct gggacggatt tcactctgac catcagcagt 300 otgcagccgg aagacttcgc eacttattac tgtcagcaao attataotac tcotoccecg 360 ttcggaoagg gtaooaegfft ggagatcaaa cgtaoggtgg otgcaccatc tgtcttcatc 420 ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatot ggaactgcct ctgttgtgtg octgctgaat 480 aacttctatc ccagagagec caaagtecae tggeagfftgg ataacgccct ocaatcgggt 540 aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcage 6Q0 accctgacgc eeactacgag aaacacaaae tctacgcctg cgaagtcaco 660 catcagggoc tgagctcgco cgtcacaaag agettcaaca ggggagagtg ttaggttgog 720 caagctt 727 e862r, > Λ p o 1 z 3 if 4— 2 2 2 2 V V V < <220> <223〉抗Her2人類化Fab (重鏈） <400> 6 gaattctgaa atgagctgtt gacaattaat catcggotcg tataatgtgt ggaattgtga 邱 gcggataaca atttcacaca ggasatatca tatgaaatac ctgctgcoga ccgctgctec 120 tggtctgctg ctcctcgctg cccagccggc gatggccgag gttcagctgg tggagtctgg 180 cggtggcctg gtgeagccag ggggctcact ccgtttgtcc tgtgcagGtt cteecttcaa 240 155030-序列表.doc 201139666 cattaaagao aoctatatac zoteeeXeoe tcaggccccg ggtaag|gcc tggaatgggt 300 tgcaaggatt tatcctacga atg^ttatac tagatatgcc gatagcgtca a^gccgttt 360 cactataagc gcagacacat ccaaaaacao agcctgcctg cagatgaaca gcctgcgtgc 420 tgaggacact gccgtctatt attgttctag atggggaggg gacggottct atgctatgga 480 ctactgi^gt caaggaaccc tggtcaccgt ctcctcggcc tccaccaagg goccatcggt 540 cttcocpctg goaccctcct ccaagae«ac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct 600 ggtcaaggac tacttccocg aaccggtgac ggtgtcgteg aactcaggcg ccotgacoag 660 cggcgtgcgc accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactcco tcagcagcgt 720 ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacotsc atotgcqacg tgaatcacaa 780 gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcatca 840 tgaccatcat cattgagtcg «ic 862 ^ V/ Sr Sr 0 12 3 if 1— rf— Jf <2<2<2<2
<220> <223> 輕鏈Q丨24C引子（Q124C01) <400> 7 ccgccatctg atgagtgctt gaaatctgga actg： 34
<210> 8 <211> 34 <212> DNA <213>人工 <Z20> <Z23> 輕鏈Q124C引子（Q124C02) <400> 8 cagttccaga tttcaagcac tcatcagatg icgg 34 155030-序列表.doc 201139666 ZS. > yv 0 12 3 it 1— ΟΛ 2 2 c s? v < 9 35iu <220> <223> 輕鏈H198C引子（H198C01) <400> 9 cgcctgcgQa gtcacctgcc agggccteag: ctcgc > > & o 1 z 3 i— 1— l t— 2 2 2 2 r, Ο <220> <223> 輕鏈H198C引子（H198C02) <400> 10 35 gcgagctcag gccotggcag gtgacttcgc aggcg 16^^ I 3 D人 > > > > 0 12 3 II 1 ft <2<2<2<2 <2Z〇> <223〉輕鏈L201C引子（L201C01) <400> It 36 gtcacccatc agggctgcag ctcgcccgto acaaag <Z10> 12 <211> 36 <212> DMA <213>人工 <220> <223〉輕鏈L201C引子（L201C02) <400> 12 ctttfftgacg ggcgagctgc agccctgetg ggtgac 155030·序列表.doc 201139666
<210> 13 <211> 34 <212> DNA <213>人工 <220> <223〉重鏈A140C引子（A140C01) <400> 13 34 cacctctggg ggcacatgcg ccctgggctg cctg 44NAVX 1 3 D人 o 1 CvJ 3 It 1J. 2 2 2 2 /N < < <220> <223> 重鏈A140C引子（A140C02) <400> 14 caggcagccc agggcgcatg tgcccccaga ggtg 34 5 4^^ 1 3 D人 > /V > ΰ 1 z 3 1β 1* ft 2 2 «Λ ΛΖ ys c c <220> <223> 重鏈K147C引子（K147C01) <400> 15 ctgggotgco tggtotgcga ctacttccco gaac 34 1634DNAU yr s/ t>r V/ 0 12 3 1— I 1— 2 2 2 2 <220> <223〉重鏈K147C引子（K147C02) <400> 16 gttcggggaa gtagtcgcag accaggcagc ccag 34 155030-序列表.doc 201139666 psr, > > /s > o 1 z 3 1— 1f 2 2 2 2 < < <-/\ <220> <223〉重鏈S183C引子（S183C01) <400> 17 fgactctact ccctctgcag cetggtgaoc gtg 33 8 3^^ 1 3 D人 1» .^1 1t <2<2<2<2 0 <220> <223〉重鏈S183C引子（S183C02) <400> 18 cacggtcacc acgctgcaga gggdgtagag tcc 33 Ϊ 3,T工 1921阳人 sx- V/ > 0 12 3 nz ΛΖ 2 2 S? < < <220> <223>抗〔〇20嵌合Fab (輕鏈） <400> 19 ❾
Gin lie Val Leu $er Gin Ser Pro Ala lie Leu Sdr Ala $er Pro Gly 15 10 15
Qlu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr No 2Q 25 30
His Trp Phe Qln Qln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp He Tyr 35 40 45
Ala Thr S«r Asn Uu Ala Ser Qly Val Pro Vai Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 155030-序列表.doc 9- 201139666 fily Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Arg Val Glu Ala Qlu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Thr S^r Asn Pro Pro Thr 85 90 95
Phe Qly Gly Gly Thr Lye Leu 6lu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110
Ser Val Phe IΙθ Phe Pro Pro Ser Asp Qlu Gin Leu Lye Ser Qly Thr 115 120 125
Ata Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 6lu Ala Ly$ 130 135 140
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Qlu 145 150 155 160
Ser Val TTir Glu 6ln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Uu Ser Ser 165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lye Val Tyr Ala 180 185 190
Cys Glu Val Thr His 6ln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 20 <211> 227 <212> PRT <213〉人工 <220> -10- 155030-序列表.doc 201139666 <223>抗〔〇20嵌合Fab (重鏈） <400> 20
Gin Val Gin Leu Qln 6ln Pro Gly Ala Glu Lau Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ph© Thr Ser Tyr 20 25 30
Asn Met His Trp Val Lye Gin Thr Pro Qly Arg Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Qln Lys Phe 50 55 60
Lye Gly Lye Ala Thr Uu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser 6lu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 Θ5
Ala Ar? Ser Thr Tyr Tyr Qly Gly Asp Trp Tyr Phe A«n Val Trp Gly 100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lye 6ly Pro Ser 115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Qly Thr Ala 130 135 140
Ala Uu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160
Ser Trp Asn $©r Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 -11 - 155030-序列表.doc 201139666
Val Leu Gin Ser Ser Qly Leu Tyr Ser Leu Ser $er Val Val Thr Val 180 185 t90
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr II® Cye Asn Val Aen Hie 1&5 200 205
Lye Pro Ser Asn Thr Lys Val Aap Lye Lys Val Qlu Pro Lys Ser Cy$ 210 215 220
Asp Lys Thr 225 124NAj 2 7 D人 ^^^於 <21<21<21<21 <220> <223〉抗CD20嵌合Fab (輕鏈） <400> 21 catatgaaat Qcctgctgco gaecgctgct gctggtcteo tgctcctcsc tgcccagccg ¢0 gcgatggccc aaattgttct ctcccagtct ccagcaatcc tgtctgcatc tccaggggag 120 aagrtcacaa tgaottgcag ggccagctca agtgtaagtt acatccactg gttccagcag 180
aagccaggat cctcccccaa accctggatt tatgccacat ccaacctggc ttctggagtc 24Q cctgttcgct tcagtggcae tsEgtctggg aottcttact ctctcaccat cascagagtg 300 gaegotgaag atgctgccac ttattactgc cagcagtgga ctagtaaccc acccacgttc 360 sgagggggga ccaagctgga aatcaaaQgt acgftggctg caccatctgt cttcatcttc 420 ccgccatcte atgagcaett gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcot gotgeataac 4-80 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata aceccctcca atcgggtaac 540 tcccaggap gtgtcacaga ecaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcotgcga agtcaccoat 660 cagggcctsa gctcgcccft cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta ggttgcgcaa 720 155030·序列表.doc • 12- 201139666 got 724 269NA^ 2 8 D人 0>1>2>3> JT— 1i 1· <1 2 2 2 2 >✓ V/ SZ S/ Ο Ο <220> <223>抗CD20嵌合Fab (重鏈） <400> 22 gaattctgaa atgagctgtt gacaattaat gcfgataaca atttcaceca tgptctgctg ctcctcgctg cccagccggc ggctgagctg gtgaagcctg gggcotcagt atttaccaft tacaatatgc actgggtaaa tggagctatt tatcccggaa atggtgatac cacattgQct gcagacaaat cctccagcac tgaggaotct gcggtctatt actgtgcaag caatgtctgg ggogo^eu^ ccacggtcac ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt cagcggcftg cacaccttcc cggctgtcct cgtggtgacc gtgocctcca gcagcttetrg caagcocagc aaoacoaagg tggacaagaa tcatcaccat catcattgag tcgac catcggctcg tataatgtgt ggaattetge 60 tatgaaatac ctgctgccga ccgctgctgc 120 gatggcccag gtacaactgc agcagcctgg 180 gaagatgtcc tgcaaggctt ctggctacac 240 acdgacacct ggtcggggcc tggaatggat 300 ttcctacaat cagaagttca qasgcaaggc 360 agcctacatg cagctcagca gcctgacatc 420 atcgacttao tacgeoggtg aotggtactt 480 cgtctctgca gcctccacca agggcccatc 540 cacctctggg ggcacagegg cccteegctg 600 eacggtgtcg tgeaactcas gogccctgac 660 acagtcctca ggactctact ccctcagcag 720 cacccagaco tacatctgca acgtgaatca 7B0 aKttsagcco aaatcttgtg acaaaactca 840 865 saiAX 0>1>2>3> II 1» 49 <2<2<2<2 155030-序列表 doc -13- 201139666 <220> <223>驗證用之核苷酸序列（5’s化） <400> 23 gttttaattg aacttgggcc atcgccggct gg 32 smr, 0>1>'2>3> <1 J— <2<2<2<2 <220> <223>驗證用之核苷酸序列（5'FITC標記） <400> 24 coagccsecg atggcccaae ttQQQttaaq w 32 8 工 2stoPRAJ ^ yr sy >r o 1 z 3 it <i if 1/ z 2 2 z ^ y\ y\ <220> <223>抗£0卩11嵌合Fab (輕鏈可變區域） <400> 25
Asp lie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Val He Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Qlu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 lie His Trp Tyr 61n Gin Arg Thr Asn Qly Sar Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45
Lye Tyr Ala Ser Glu Ser lie S^r Gly 11« Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 56 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser lie Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 155030·序列表.doc 14- 201139666 6lu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Qln Asn Asn Aen Trp Pro Thr 85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 s119rl 1 1— 1 iB 2 2 2 2 <220> <223>抗EGFR嵌合Fab (重鏈可變區域） 〇 <400> 26
Gin Val Gin Leu Lye 6ln Ser Gly Pro Qly Leu Val Gin Pro Ser Gin IS 10 15
Ser Leu Sor Ile Thr Cye Thr Val Ser Sly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 6ly Val Hie Trp Val Arg 6ln Ser Pro Gly Lye 6ly Leu Glu Trp Leu 35 40 45
Gly Val lie Trp Ser Gly Qly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe TJir Q 50 55 60
Ser Arg Leu Ser lie Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Pho 65 70 75 80
Lye Met Asn Ser Leu Gin Ser Asn Asp Thr Ala He Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Qlu Phe Ala Tyr Trp Gly Qln Gly 100 105 110 155030-序列表.doc -15- 201139666
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115
<210> 27 <211〉 4t7 <212> DNA <213>人工 <220> <223>抗1^2人類化抗體（輕鏈可變區域） <400> 27 gtcgacagat ctctcaoc^t ggacatgagg gtcctcgctc agctcctEgg gQtcctgctg ctotgtttcc caggtgccag atgtgacatc cagatgjaiicc aftctccato otcactgtct gcatctgtag gagacagagt oaccetcact tgtcgggcga gtcaggaegt gaecaccgoc gtegcctegt atcagcagaa accaggcaaa gcccctaago tgctg^tcta ttccgcatcc ttcttgtaca gtggggtcco atcaaggttc agcggcagtc gatctgggac agatttcact ctcaccatca gcaecctgca gcctgaagat tttgcaactt attactgcca acagoactac gccaccccgc ccactttt辟 cceggggeoo aaggtggaga tc的acgtae 踩aattc <210> 28 <211> 407 <212> DNA <213>人工 <220> <223>抗丑〇?11嵌合抗體（輕鏈可變區域）
<400> ZB gtcgacasat ctccaccatg aagctgcccg tgcggctgct ggtgctgatg ttctegattc cogcoaecag cagogacatc ctgctgaccc agagccccgt satcctgagc gtgtcccctg gcgagcgggt gtccttcagc tgcagagcca gccagagcat cggcaccaac atccactggt atcagcascg gaccaecggc agccccagac tgctgattaa gtacgccagc gqgtccatca gcggcatccc cagccggttt agcggsagcg gctccggcac cgacttcacc ctgagcatca acagcgtgga aagcgaggat atcgccgact actactecoa gcasaacaac aactggccca 60 120 180 240 300 360 417 60 120 180 240 300 155030-序列表.doc -】6 - 360 201139666 ccaccttcgf agccggcacc aagctggaap tgaagcgtac ggaattc 407 3441Γ, 00^^ 1— 1— it 1f <2<2<2<2 <220> <223> Mer2人類化抗體（重鏈可變區域） <400〉 29 gtcgacacca ccatggagtt tgggctgagc tgggttttcc tcgttgQtct tttaagaggt 60 gtccagtgtg aestgcagtt ggtggagtct gggggaeEcc tggtccagcc tgggggctco 120 ctgagactct cctgtgcagc gtctggattc aaoatcaagg acacctaoat ocactgggtc 180 〇 cgccagsctc caggcaaggg gctggagtgg gtggcaogta tataccccac caacggctac 240 accagatatg cagactcogt gaagggccga ttcaccatct ccgccgacac ctccaagaac 300 acggcctato tgceaatgaa cagcctgasa gccgaegaca cgectftgta ttactgttcc 360 afatggKgcg gggacggctt ctacgccatg gQctactggg gccagggaac cctggtcacc 420 fftctcctcag ctaecgaett c 441 30437ONAU 0>1>2>3> t 11 1— J— <2<2<2<2 ◎ <220〉 <223>抗£0?尺嵌合抗體（重鏈可變區域） <400> 30 gtcgaccoec cQtgaacctg ggcctgagcc tgatcttcct ggccctgatc ctgaagggcg 60 tecagtgcca ggtgca^ctg aagcagagcg gccctggcct ggtgcagcct aeocagagcc 120 tgagcatcac ctgtaccgtK tccggcttca ecctgacoaa ctacegcgtg cactgggtcc 180 gacagagccc tggcaaegec ctggaatggc tgggagtgat ttgiagcegc ggcaacaccg 240 actacaacac ccccttcacc agccggctea gcatcaacaa ggacaacagc aagagccagg 300 155030-序列表.doc •17· 360 201139666 tgttcttcaa gatgaacagc ctgcagagca acgaoaccgc catctactac tgcgccagag ccctgaccta ctacgactac gagttcgcct actggggcca gggcaccctg gtcacagtgt ctgccgctag cgaattc 420 437 155030-序列表.doc 18-

Claims (1)

  1. 201139666 七、申請專利範圍·· 1· 一種單株抗體或該抗體月段，其係含有恆定區域者，且 該良疋區域内之1個以上之胺基酸被置換為半胱胺酸殘 基。 2·如°月求項1之單株抗體或該抗體片段，其中存在於輕鏈 恒疋區域之1個以上之胺基酸被置換為半胱胺酸殘基。 3.如°月求項1之早株抗體或該抗體片段，其中存在於重鏈 恆定區域之1個以上之胺基酸被置換為半胱胺酸殘基。 Ο 4·如°月求項3之單株抗體或該抗體片段，其中存在於cH1g 域之1個以上之胺基酸被置換為半胱胺酸殘基。 5.如請求項丨至4中任一項之單株抗體或該抗體片段，其中 被置換為半胱胺酸殘基之胺基酸之溶劑可接觸面積之比 率為30%以下。 6·如請求項1至5中任一項之單株抗體或該抗體片段，其中 上述單株抗體之類型為免疫球蛋白G(IgG)。 0 7.如請求項1至6中任一項之單株抗體或該抗體片段，其中 上述怪定區域為源自人類抗體之恒定區域。 8·如請求項1至7中任一項之單株抗體或該抗體片段，其中 上述單株抗體之類型為人類IgG，且選自下述（1)至中 之至少1個以上之胺基酸被置換為半胱胺酸殘基， (1) Kabat編號中人類IgG之輕鍵區域之第124號之胺基酸 (2) Kabat編號中人類IgG之輕鏈區域之第198號之胺基酸 (3) Kabat編號中人類IgG之輕鏈區域之第201號之胺基酸 (4) EU編號中人類IgG之重鏈區域之第140號之胺基酸 155030.doc 201139666 (5) EU編號中人類igG之重鏈區域之第147號之胺基酸 (6) Εϋ編號中人類igG之重鏈區域之第ι83號之胺基 酸。 9. 如請求項1至8中任一項之單株抗體或該抗體片段，其中 至少1個所置換之半胱胺酸殘基經化學修飾。 10. 如請求項1至9中任一項之單株抗體或該抗體片段，其中 所置換之半胱胺酸殘基係藉由非還原條件下之化學修部 反應進行化學修飾。 11·如請求項1至10中任一項之單株抗體或該抗體片段，其 中所置換之半胱胺酸殘基之40%以上經化學修飾。 12.如請求項9至11中任一項之單株抗體或該抗體片段，其 中上述化學修飾為半胱胺酸殘基之硫醇基與含有親水性 高分子或兩親性高分子之修飾基的鍵結。 13 ·如β求項12之單株抗體或該抗體片段，其中上述親水性 问分子或兩親性高分子為聚氧院稀、多元醇或多糖。 14.如請求項9至U中任一項之單株抗體或該抗體片段，其 中上述化學修飾為半胱胺酸殘基之硫醇基與含有功能性 分子之修飾基的鍵結。 15·如請求項14之單株抗體或該抗體片段，其中上述功能性 分子為藥物、生理活性肽、生理活性蛋白質、核酸、放 射性標記化合物、糖鏈、脂質或螢光化合物。 16. 如請求項15之單株抗體或該抗體片段其中上述功能性 分子為核酸。 17. 如請求項15之單株抗體或該抗體片段，其中上述藥物為 155030.doc 201139666 抗腫瘤劑、抗生素或抗病毒劑。 18. 如請求項12至17中任一項之單株抗體或該抗體片段，其 中每1個修飾基之分子量為500 Da以上。 19. 如請求項1至18中任一項之單株抗體或該抗體片段，其 具有細胞毒殺活性。 20. 如請求項19之單株抗體或該抗體片段，其中上述細胞毒 殺活性為抗體依賴性毒殺活性或補體依賴性毒殺活性。 21 _如請求項1至20中任一項之單株抗體或該抗體片段，其 Cv 中上述抗體片段為選自Fab、Fab'及F(ab，)2中之抗體片段。 22.如請求項1至21中任一項之單株抗體或該抗體片段，其 中上述單株抗體為基因重組抗體。 23·如請求項22之單株抗體或該抗體片段，其中上述基因重 組抗體為嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。 24· 種DNA，其編碼請求項1至8及19至23中任一項之單株 抗體或該抗體片段。 25. 一種重組載體’其含有請求項24之DNA。 26. —種轉形株，其係將請求項25之重組載體導入宿主細胞 而獲得。 27· —種睛求項1至23中任一項之單株抗體或該抗體片段之 製造方法，其包括將請求項26之轉形株於培養基中進行 培養’並自培養物採集抗體或該抗體片段。 28. —種凊求項9至23中任一項之單株抗體或該抗體片段之 製造方法，其包括藉由化學修飾反應對自上述培養物採 集之抗體或該抗體片段之半胱胺酸殘基進行化學修飾。 I55030.doc
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