TW201138651A - Agent for controlling the increase and decrease of lactobacillus bifidus in colon - Google Patents

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201138651 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種用以增加及/或抑制減少大腸中雙又 乳酸桿菌之製劑及方法。更具體而言，本發明係關於一種 用以增加及/或抑制減少大腸中雙叉乳酸桿菌之枯草桿菌 之芽孢菌體之用途。 【先前技術】 當前，報告指出成人腸内之優勢雙又乳酸桿菌種有青春 雙叉桿菌、鏈狀雙叉桿菌、假鏈狀雙又桿菌及龍根雙又桿 菌此4種菌（非專利文獻丨）。雙叉乳酸桿菌當然具有整腸效 果亦確認具有免疫系統之調節效果、血脂改善效果等有用 之效果。因此’進行增加腸内之雙又乳酸桿菌之嘗試，作 為該種方法’已知口服攝取耐胃酸之雙叉乳酸桿菌之益生 菌’及攝取寡糖等之益菌助生質之方法。 备剛’通常之做法為攝取乳酸菌或上述雙叉乳酸桿菌作 為益生菌（專利文獻1)。然而，關於益生菌，由於人之個體 差異較大、所攝取之菌株之保留率有差異，故而不會對所 有人造成相同之效果（非專利文獻2)。 又’於益菌助生質之情形時，例如攝取寡糖作為雙又乳 酉文杯菌之增殖因子，雖可見青春雙叉桿菌之增殖效果，但 關於腸内之龍根雙又桿菌則無法確認增殖效果（非專利文 獻3)。 再者’報告指出將益生菌與益菌助生質加以組合，將雙 又乳敲#菌製劑與雙叉乳酸桿菌之增殖劑一起投予之組合 153168.doc 201138651 物（專利文獻2)。 另一方面，對促進雙叉乳酸桿菌等腸内細菌之增殖之枯 草桿菌之有用性進行論述（專利文獻3及非專利文獻4)。然 而，該等報告中記載有枯草桿菌之已發芽之營養體對雙叉 乳酸桿菌之增殖有效果（非專利文獻4)，或枯草桿菌之芽孢 菌株於小腸内變成營養體（發芽菌），營養體促進腸内細菌 之增殖（專利文獻3)。 又，本申請人提出報告指出使家畜動物（豬及雞）僅直接 口服攝取枯草桿菌之芽孢菌而獲得之整腸作用等（例如專 利文獻4)。 [先前技術文獻] [專利文獻] [專利文獻1]曰本專利特開2007-91704號公報 [專利文獻2]曰本專利特開2009-296910號公報 [專利文獻3]日本專利特開平7_17〇975號公報 [專利文獻4]曰本專利第2528055號 [非專利文獻] [非專利文獻 l]Matsuki，T. et al.，Appl_ Environ.

Microbiol. 70 (1): 167-173, 2004年 [非專利文獻2]化學與生物47 (2): 78-80, 2009年 [非專利文獻3]淺野等人，曰本農藝化學會刊75 (10): 1077-1083, 2001年 [非專利文獻4]牛嶋，醫學與生物學128 (1): 9-14, 1994年 【發明内容】 153168.doc 201138651 [發明所欲解決之問題] 如上所述’該技術領域中，依然在尋求用以增加構成腸 内菌群之雙又乳酸㈣尤其是作為其主要菌之龍根雙又桿 菌之方法及機構。 本發明之目的在於提供—種用以有效增加大腸中雙又乳 酸桿菌之機構及方法。 [解決問題之技術手段] 本發明者為解決上述課題進行努力研究，結果獲得以下 見解.確認枯草桿菌之芽孢菌於通過消化道時其一部分會 發芽。又，枯草桿菌之芽孢菌有促進大腸中雙又乳酸桿菌 之增殖之效果’與其一部分會發芽之枯草桿菌相比，尤其 對龍根雙叉桿菌顯示出明顯之增加及抑制減少效果。本發 明係基於該等見解而完成。 因此，本發明如以下所述。 [1] 一種大腸中雙叉乳酸桿菌之增加及/或抑制減少劑，其 包含枯草桿菌之芽孢菌體’及用以將該芽孢菌體以維持芽 孢菌體之形態而傳送至受檢體之大腸中之機構。 [2] 如[1]之製劑，其實質上不含有或不含有枯草桿菌之發 芽菌體。 [3] 如[1]或[2]之製劑’其中枯草桿菌為枯草桿菌c_ 3102^£11]^8?-1096)或者其變異株或衍生株。 [4] 如[1]至[3]中任一項之製劑’其中雙又乳酸桿菌為龍根 雙叉桿菌。 [5] 如[1]至[4]中任一項之製劑’其係口服投予用及/或經腸 153168.doc 201138651 投予用。 [6] 如[1 ]至[5]中任一項之製劑，其係用於飲料食品、飼料 或醫藥品中。 [7] 如[1]至[6]中任-項之製劑，其係用作整腸劑、抗過敏 劑、或血脂改善劑。 [8] —種功能性飲料食品之製造方法，其包括以下步驟：製 備如[1]至[7]中任一項之製劑，及將該製劑調配於飲料食 品中。 [9] 一種功能性飲料食品，其調配有如[丨]至[7]中任一項之 製劑。 [10] —種增加及/或抑制減少受檢體之大腸中雙叉乳酸桿菌 之方法’其包括：將有效劑量之枯草桿菌之芽抱菌體以維 持芽孢菌體之形態而傳送至受檢體之大腸中，或將該芽孢 菌體直接投予至受檢體之大腸中。 [11] 如[10]之方法，其中受檢體為人或非人之動物。 [12] 如[1G]或[11]之方法，其中枯草桿菌為枯草桿菌「 3102(FERM BP-1096)或者其變異株或衍生株。 [13] 如[1G]至[12]中任-項之方法，其中雙叉乳酸桿菌為龍 根雙叉桿菌。 [14] 如[1()]至[13]中任-項之方法，其中將芽㈣體藉由口 服投予及/或經腸投予而投予至受檢體中。 [15] -種製劑’其包含用於增加及/或抑制減少大腸中雙又 乳酸桿菌之枯草桿菌之芽孢菌體，及用以將該芽抱菌體以 維持芽孢菌體之形態而傳送至受檢體之大腸中之機構。 153168.doc 201138651 [發明之效果] 根據本發明，提供一種具有優異之雙叉乳酸桿菌之增加 及/或抑制減少作用之製劑。本發明之製劑係藉由增加及/ 或抑制減少大腸中雙叉乳酸桿菌，而有助於促進宿主之健 康，並預防各種疾病。進而，即便於高溫處理後亦保持雙 又乳酸桿菌之增加/抑制減少作用。因此，本發明之製劑 可較佳用於功能性飲料食品及飼料中。 【實施方式】 以下，洋細說明本發明。本申請案係主張2010年3月12 曰提出申請之日本專利申請案第2〇1〇 〇55816號之優先權 者，且包含上述專利申請案之說明書及/或圖式中所記載 之内容。 本發明係關於一種用以增加及/或抑制減少大腸中雙又 礼酸柃菌之枯草桿菌之芽孢菌體的用途。如本說明書之實 施例2所不，於枯草桿菌之芽孢菌體直接口服投予之情形 時，確認通過胃腸時一部分會發芽。又，如實施例3所 不，與使用其一部分會發芽之枯草桿菌之情形不同，枯草 才干菌之芽孢菌體顯示出龍根雙叉桿菌之明顯之增加作用。 因此，於本發明中，藉由將枯草桿菌之芽孢菌體以維持芽 孢菌體之形態傳送至受檢體之大腸中，而增加及/或抑制 減少大腸中雙又乳酸桿菌尤其是龍根雙叉桿菌。 因此’本發明提供一種大腸中雙又乳酸桿菌之增加及/ 或抑制減少劑’其包含枯草桿菌之芽孢菌體，及用以將該 芽抱菌體以維持芽孢菌體之形態傳送至受檢體之大腸中之 153168.doc 201138651 機構。又，本發明提供一種增加及/或抑制減少受檢體之 大腸中雙叉乳酸桿菌之方法，其包括將有效劑量之枯草桿 菌之芽孢菌體以維持芽孢菌體之形態傳送至受檢體之大腸 中，或將該芽孢菌體直接投予至受檢體之大腸中。 本發明中所使用之枯草桿菌（Bacillus subtilis)只要為具 有作為芽孢菌體之形態，且顯示出目標之雙叉乳酸桿菌之 增加及/或抑制減少作用者，則可使用該技術領域中公知 之任意之枯草桿菌菌株。再者，考慮對動物之投予/攝 取，較佳為於動物中確認安全性之菌株。作為枯草桿菌之 具體之菌株，除枯草桿菌C-3102(FERM BP-1096)、枯草桿 菌BN株以外，亦有獨立行政法人理化學研究所 BioResource Center 中所保管之菌株（JCM2499 、 JCM11003、JCM20014、JCM20035、JCM20036、 JCM20038 、 JCM20057 、 JCM20073 、 JCM20083 、 JCM20085 、 JCM20086 、 JCM20094 、 JCM20095 、 JCM20096 、 JCM20105 、 JCM20108 、 JCM20118 、 JCM20127 、JCM20132 、 JCM20333 、 JCM20336 、 JCM20352 、JCM20353 、JCM20354 、 JCM20520 、 JCM21228)等。 於本發明中，所謂「雙叉乳酸桿菌之增加及/或抑制減 少作用」係指使大腸内存在之雙叉乳酸桿菌之菌體數量增 加，及/或抑制其菌體數量減少之能力。成為增加及/或抑 制減少之對象之雙叉乳酸桿菌，只要為屬於雙叉桿菌屬之 細菌則無特別限定，可列舉：龍根雙叉桿菌（B. longum)、 153168.doc 201138651 青春雙叉桿菌（B. adolescentis)、鏈狀雙又桿菌（Β· catenulatum)、角狀雙叉桿菌（B. angulatum)、兩歧雙叉桿 菌（B. bifidum)、短型雙叉桿菌（Β· breve)、齒雙叉桿菌（Β· dentium)、高盧雙叉桿菌（B. gallicum)、球雙叉桿菌（Β_ globosum)、嬰兒雙叉桿菌（B. infantis)、細長雙叉桿菌（B. subtile)、星狀雙叉桿菌（B. asteroides)、牛雙叉桿菌（B· bourn)、脉雙叉桿菌（B. choerinum)、棒狀雙叉桿菌（B. coryneforme)、兔雙叉桿菌（B. cuniculi)、雞雙叉桿菌（B. gallinarum)、印度雙叉桿菌（B. indicum)、大雙叉桿菌（B· magnum)、瘤胃雙叉桿菌（B. merycicum)、最小雙又桿菌 (B. minimum)、嗜冷好氣雙叉桿菌（B· psychraerophilum)、 雞（雛）雙叉桿菌（Β· pullorum)、反芻雙叉桿菌（Β· ruminantium)、斯卡爾多維雙叉桿菌（B. scardovii)、嗜熱 嗜酸雙叉桿菌之諸亞種（B. thermacidophilum subsp. porcinum)、嗜熱雙叉桿菌（B. thermophilum)等。於本發明 中，尤其意指對作為腸内菌群之主要菌之龍根雙叉桿菌之 增加及/或抑制減少作用。該作用可藉由以下方式確認： 例如將枯草桿菌之芽孢菌體與1種或複數種雙叉乳酸桿菌 共同以與大腸環境相同之條件下進行培養，並對該雙叉乳 酸桿菌之菌體數量之增減進行評價。作為具體之雙叉乳酸 桿菌之增加及/或抑制減少作用之測定方法，有使用實施 例 3 所示之微陣列或 Real-time PCR(Real-time Polymerase Chain Reaction，即時聚合酶鏈反應）之方法。 因此，於本發明中，只要為藉由如上所述之方法而評價 153168.doc 201138651 為具有雙叉乳酸桿菌之增加及/或抑制減少作用之枯草桿 菌菌株’則可使用任意之菌株。作為具有上述作用之較佳 之枯草桿菌，可列舉枯草桿菌C_31〇2(FERM BP-1096)。於 下述實施例中’確認該菌株使雙叉乳酸桿菌尤其是龍根雙 又桿菌明顯增加’又抑制其減少。該菌株已由本申請人於 昭和60年（1985年）12月25日以受託編號FERM BP-1096寄存 於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心 (舊通商產業省工業技術院微生物工業技術研究所）（〒 305-8566日本茨城縣築波市東〖條丨編號丨中央第6)，並可自 該中心獲取。該枯草桿菌C_3102具有腸内菌群改善作用、 肉質改善作用、整腸作用等，故而已有報告指出用於動物 (曰本專利特公平4_24〇22號，鈴木等人’腸内細菌學會 刊，第18卷第2號第93-99頁（2004)等），對包含人之動物確 認安全性。 又，於本發明中，只要上述具體之菌株之變異株或衍生 株亦具有雙叉乳酸桿菌之增加及/或抑制減少作用，則可 使用。 於本發明中，使用枯草桿菌之芽孢菌體。所謂芽孢，係 指細菌之孢子形態，具有對溫度或化學物質之耐受性。該 芽抱於適合細菌之增殖之條件下會發芽並發育而形成營養 細胞(發芽菌）。某枯草桿菌之菌株是否為芽孢菌體，可利 用其对熱性之性質，根據高溫處理後是否生存而罐認。於 本發明中，所使用之枯草桿菌之較佳為7〇%以上、更佳為 80%以上、尤佳為90%以上為芽抱菌體，僅含較佳為未達 153J68.doc 201138651 3〇%、更佳為未達20%、尤佳為未達1〇%之營養細胞（發芽 菌）。 枯草桿菌之芽孢菌體可藉由使用微生物之培養時通常所 使用之培養基，於適當之條件下進行培養而製備。培養時 所用之培養基只要為含有碳源、氮源、無機鹽類等，且可 有效地培養枯草桿菌之培養基，則可使用天然培養基或合 成培養基、液體培養基或固體培養基中之任意者，只要為 業者則可適當地選擇適合所使用之菌株之公知之培養基。 作為碳源可使用乳糖、葡萄糖、蔗糖 '果糖、半乳糖、廢 糖蜜等，作為氮源可使用蛋白脒、酪蛋白之水解物，乳清 蛋白水解物’大豆蛋白水解物等有機含氮物。又，作為無 機鹽類，可使用磷酸鹽、鈉、鉀、鎂等。作為適於培養括 草桿菌之培養基，例如可列舉TS(Trypticase s〇y，胰蛋白 酶大豆）瓊脂培養基、HI(heart infusion，心臟浸出液）填脂 培養基等。 又’枯草桿菌之培養係於20。(：〜5(TC下、較佳為3(Tc至 45 C下、尤佳為約37°C下，於好氣條件下進行。溫度條件 可藉由恆溫槽、加熱套、夾套等加以調整.培養之形式有 靜置培養、振盪培養、槽培養等。又，培養時間可設為12 小時〜7天、較佳為2天〜3天。較佳為培養開始時之培養基 之pH值維持在5〜9、較佳為6-8。 培養後，可直接使用所獲得之枯草桿菌培養物，亦可進 而視需要進行藉由離心分離等之粗略純化及/或藉由過廣 等之固液分離或殺菌操作。再者’本發明之製劑中使用之 153168.doc 201138651 枯草桿菌較佳為活菌體，其可為濕潤菌體或乾燥菌體。 又’亦可為死菌體。 =，可視所需，對枯草桿菌進行進一步之處理，獲得枯 草桿菌之處理物。以下記載該種處理之例。 將枯草桿_浮或稀釋於適當之溶财，藉此可製備懸 洋物或稀釋物。作為可使用之溶劑’例如可列舉：水、: 理鹽水、碟酸鹽緩衝生理鹽水（PBS，phQsphate崎 Saline)等。 又，藉由對枯草桿菌進行加熱處理，可製備加熱處理 物。製備加熱處理物時，持續一定時間，例如約1〇分鐘〜！ 小時（例如約H)〜30分鐘）’對枯草桿菌進行高溫處理（例如 ::⑽⑺二由於本發明中所使用之枯草桿菌為芽抱菌 ’故而尚溫處理後亦會生存’並保持目標之作用。 藉由對枯草桿菌進行殺菌處理，可製備殺菌處理物。對 =草杯菌進打殺菌處理時，例如可進行過滤殺菌、放射性 奴菌、過熱式殺菌、加壓殺菌等公知之殺菌處理。 又可將枯草杯菌乾燥而製成粉狀物或粒狀物。作為具 體之乾燥方法，並無特別限制，例如可列舉：喷霧乾燥、 轉筒乾燥、真空教條、、人、杰β ,、 1^ 冷凍乾餘等’可將該等方法單獨或 組合使用。此時，可涵 了視需要而添加通常所用之賦形劑。 上述處理可進行單一之處理，或亦可將複數個處理適當 口而進行力本發明中，進行該種處理之括草桿菌亦可 用於大腸g中雙又乳酸桿菌之增加及/或抑制減少。 由上述所仔之枯草桿菌若單獨地或與其他成分共同作為 153168.doc •12· 201138651 大腸中雙叉乳酸桿菌之增加及/或抑制減少劑，或調配於 飲料食品、飼料或者醫藥品中而攝取，則期待大腸中雙叉 乳酸桿菌之增加及/或抑制減少，及由此獲得之整腸作 用、抗過敏作用、或血脂改善作用。 本發明之雙叉乳酸桿菌之增加及/或抑制減少劑（以下， 亦稱為「本發明之製劑」）係含有上述枯草桿菌作為有效 成分者，可含有1種枯草桿菌，亦可含有複數種不同之枯 草桿菌，進而亦可將經不同處理之複數種枯草桿菌組合而 含有。 於本發明中，必需將括草桿菌之芽孢菌體以維持芽抱菌 體之形態傳送至受檢體之大腸中。因此，將枯草桿菌之芽 孢菌體與用於以維持芽孢g體之形態傳送至受檢體之大腸 中之機構加以組合而投予或使受檢體攝取，或者直接投予 至大腸中。 於本說明書中所謂「用以傳送至大腸中之機構」，係指 可使枯草;f干菌之芽孢菌體於胃及小腸令不發芽地傳送至大 (腸直腸）中之機構，例如有使枯草桿菌之芽孢菌體 於二及腸中之高營養下及/或低PH值環境下不發芽而以芽 …菌體之$ @通過胃及腸之機構等。該種傳送機構於該技 術領域中為眾所周知，並無限定，例如已知腸溶性包衣、 腸，性膠囊、腸溶性錠劑、脂質料。腸溶性包衣係為了 胃】腸内冷解、不崩解，其結構上之性質不發生變化 於製劑之組合物或組合物之組合。作為該種腸溶性 匕衣可列舉.聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、纖維素酯 153168.doc 13 201138651 衍生物（鄰苯二甲酸乙酸纖維素、羧甲基纖維素等）、纖維 素驗、海藻酸、丙烯酸曱酯共聚物、Eudragit(註冊商 標）L/S。可藉由使用該種腸溶性包衣包覆錠劑，而製造腸 溶性錠劑。又，使用腸溶性包衣包覆膠囊或由腸溶性包衣 之材料製備膠囊，並於該膠囊中裝入枯草桿菌之芽孢菌體 及適當之載體，藉此可製造腸溶性膠囊。關於該種傳送機 構，例如記載於 wo 2005/117921 號、w〇 2〇〇2/〇91833 號、WO 2004/014403號、曰本專利特開平11199494號公 報、WO 2008/114889號等中，只要為該項業者，則可容易 地理解傳送機構之種類、其製備方法、對枯草桿菌之芽孢 菌體之應用。 用以傳送至大腸中之機構可根據成為投予或攝取枯草桿 菌之芽抱菌體之對象的受檢體之種類、年齡、劑形等而適 當選擇，並進行設計以較佳傳送。 又’將枯草桿菌之芽抱菌體直接投予至大腸中之方法於 :技術領域中亦為公知，可使用經腸投予、直腸内注入 4。 芽抱菌體^ 劑f，除了作為有效成分之枯草桿菌之 下述…、傳送機構，只要不妨礙目標之作用，亦可將 ::Μ、枯草桿菌或雙叉乳酸桿菌之增殖促進劑、其 之整腸劑等單獨或組合複數種而添加。 、 膠糞#丨製劑之形態並無特別限制’例如可製成錠劑、 膠囊劑、顆舱翻也+ ^ ^ 劑、懸浮劑" 粉劑、糖漿劑、乾糖漿劑、液 ,’、 吸入劑等口服劑’經腸製劑，注入劑等劑 153168.doc 201138651 型。該等之中，較佳為製成口服劑。再者，液劑、懸浮劑 等液體製冑彳可為於將要服用#溶解錢浮於水或其他適當 之介質中之形態，又，於錠劑、顆粒劑之情形時，可以眾

谷匕 U α 0之方法包衣其表面。進而，本發明之製劑可使用該 技術項域中公知之技術，製成持續釋放製劑、延遲釋放製 劑或即時釋放製劑等控制釋放之製劑。 該種劑型之製劑可於上述成分中’視劑型而調配通常所 使用之賦形劑、崩解劑、結合劑、濕潤劑、穩定劑、緩衝 劑潤π劑、防腐劑、界面活性劑、甜味劑、調味劑、芳 香劑酸味劑、著色劑等添加劑，並依據通常之方法而製 造。例如，於將本發明之製劑製成醫藥組合物之情形時， 可調配4藥上容許之載體或添加劑。作為該種醫藥上容許 之載體及添加物之例’可列舉：纟、醫藥上容許之有機溶 劑膝原蛋白、聚乙燁醇、聚乙稀〇比0各烧嗣、叛乙稀聚合 物、海藻酸納、水溶性葡聚糖、水溶性糊精、缓甲基殿粉 鈉、果膠、三仙膠、阿拉伯膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、甘 ^丙一醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂 ,二人血清白蛋白、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、容許作為 语藥添加物之界面活性劑等，此外亦可列舉脂質體等人工 細胞結構物等。 处於本發明之製劑含有上述添加劑、或枯草桿菌或雙又乳 酸桿菌之增瘦促進劑、其他整腸劑等之情形時，作為有效 2分之栝草桿菌之芽跑菌體之含量依劑型而有所不同，通 常為〇.01〜99質量％、車交佳為0.1〜80質量％、更佳為(U〜75 】53168.doc 201138651 質量％之範圍，為了能夠攝取有效成分之希望之攝取量， 希望製成可管理母1天之攝取量之形態。又，例如本發明 之製劑中所含枯草桿菌之芽孢菌體之菌體數量為約104個/ 克〜約1 〇11個/克左右。 進而，於本發明之製劑中，可使製造醫藥品、飲料食 品、飼料中所使用之各種添加劑或其他各種物質共存。作 為該種物質或添加劑，可列舉：各種油脂（例如，大豆 油、玉米油、紅花油、橄欖油等植物油，牛油、鱗魚油等 動物油脂）、天然藥（例如蜂王漿、人蔘等）、胺基酸（例如 榖胺酸、半胱胺酸、白胺酸、精胺酸等）、多元醇（例如乙 二醇、聚乙二醇、丙二醇、丙三醇、糖醇(例如山梨糖 醇、赤藻糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、甘露醇等））、天然高 分子（例如阿拉伯膠、瓊脂、水溶性玉米纖維、明膠了 = 仙膠、酪蛋白、麩質或麩質水解物、印磷脂、澱粉、糊精 等）、維生素（例如‘维生素C、維生素B群等）、礦物質（例如 齊、鎂、鋅、鐵等）、膳食纖維（例如甘露聚糖、果膠、半 纖維素等)、界面活性劑(例如脂肪酸甘油醋、山梨醇酐脂 肪酸s旨等）、純化水、賦形劑（例如葡萄糖 '玉米殿粉、乳 糖、糊精等）、穩定劑、pH值調節劑、抗氧化劑、甜味 劑、滋味成分、酸味劑、著色料及香料等。例如，可選擇 對作為有效成分之枯草桿菌、或欲增加之雙又乳酸桿菌具 有增殖促進效果之物質。作為該種增殖促進因子，可列舉 枯草桿菌或雙叉乳酸桿菌之增殖培養基、寡糖、乳蛋白。 又’於本發明之製劑中，作為上述有效成分以外之功能 153168.doc -16· 201138651 性成刀或添加劑，例如可調配：牛磺酸、麩胱苷肽、肉 鹼肌馼、輔酶Q、葡糖醛酸、葡糖醛酸内酯、辣椒萃取 物、薑萃取物、可可萃取物、瓜拿納萃取物、藤黃果萃取 物、茶胺酸、γ_胺基丁酸、辣椒素、辣椒素酯、各種有機 酸、類黃酮類、多齡類、兒茶素類、黃嗓吟衍生物、果寡 糖等難消化性寡糖、聚乙稀吡咯烷酮等。 該等添加劑之調配量視添加劑之種類及所需之攝取量而 適當地決定，相對於本發明之製劑之總量，通常為 0·01〜90質量％之範圍，較佳為0.1〜50質量。/〇之範圍。 投予或攝取本發明之製劑之受檢體或對象為脊椎動物， 具體為哺乳動物，例如人、靈長類（猴、黑猩猩等）、家畜 動物（牛、馬、豬、羊等）、寵物用動物（狗、貓等）、實驗 動物（小鼠、大鼠等），並且為爬蟲類及鳥類。尤佳為需要 增加大腸中雙又乳酸桿菌之人。 本發月之製劑之彳又予或攝取量（有效劑量）依受檢體之年 齡及體重、投予/攝取路徑、投予/攝取次數而有所不同， 為了能達成目標之作用可由該項業者任意變更為大範圍。 例如，於口服投予或攝取之情形時，本發明之製劑中所含 之枯草桿菌之芽孢菌體之投予/攝取量通常為約1〇4個/天〜 約1011個/天左右。枯草桿菌之含有比例並無特別限定，只 要配合製造之容易性或較佳之一天投予量等而適當調節即 可。由於本發明之製劑係安全性較高者，故而亦可進而增 加攝取量。每1天之攝取量可以丨次攝取，亦可分成數次而 攝取。又，該投予或攝取之頻度亦無特別限定，可根據包 153168.doc 17 201138651 技予/攝取路、受檢體之年齡及體重、目標之效果(治 療預防等）之各種條件而適當地選擇。 發月之製劑之投予/攝取路徑並無特別限定，可列 舉:口服投予或攝取、或者非口服投予（例如經腸、直腸 内技予）等。本發明之製劑特佳為口服投予或攝取。 本發月之製劑係藉由增加及/或抑制減少大腸中對宿主 有益之腸内細®具體為雙又乳酸桿菌尤其是龍根雙叉桿 菌，而促進宿主之健康，並預防各種疾病。又，安全性較 门谷易長時間連續地攝取。因此本發明之製劑亦可用於 飲料食品及铜料中。 本發明之製劑可與其他醫藥、治療或預防法等併用。該 種其他醫藥可與本發明之製劑共同製成一種製劑，或者亦 可為不同之製劑並同時或錯開時間而投予。 進而，使用本發明之製劑時，於不對本發明之效果造成 二響之範圍内，可以先前之使用方法併用枯草桿菌之芽孢 菌體又，藉由與先前之使用方法加以組合而使用本發明 之製劑，而期待與單獨地使用相比獲得更明顯之效果。 如上所述，本發明之製劑係具有大腸中雙又乳酸桿菌之 增加/抑制減少作用，而且含有先前所使用之枯草桿菌 者，安全性較高無副作用之憂慮。又，由於作為有效成分 所含之枯草桿菌之芽孢菌體對高溫及化學物質具有耐受 性，故而於飲料食品之製造過程中之各種物理性及化學性 處理過程中較為穩定，又，其防腐性亦優異。進而，由於 即便添加於各種飲料食品中亦不妨礙飲料食品本身之味 153168.doc -18 - 201138651 道，故而可添加於各種飲料食品中並連續地攝取。 本發明之飲料食品含有上述本發明之製劑。含有本發明 之製劑之飲料食品中，包含藉由雙又乳酸桿菌之增加及/ :抑制減少作用而增進健康之健康食品、功能性食品、特 定保健用食品等，此外亦包含可調配本發明之製劑之所有 飲料食品。 作為含有本發明之製劑之飲料食品，尤佳為功能性飲料 食品。本發明之「功能性飲料食品」係指對生物具有一定 功能性之飲料食品，例如包含含有特定保健用食品（有條 件地包含特保[特定保健用食品])及營養功能食品之保健功 月匕食品、特殊用途食品、營養輔助食品、健康輔助食品、 補充品（例如，錠劑、包衣錠、糖衣錠、膠囊及液劑等各 種劑形者）及美容食品（例如減肥食品）等所謂健康食品之全 部。本發明之功能性飲料食品又包含應用基於藥典（FA〇/ WHO(F〇〇d and Agriculture Organization/World Health 〇rganization，糧農組織/世界衛生組織）聯合食品規格委員 θ )之食品規格之健康聲明（Health claim)之健康飲料食 品° 作為飲料食品之具體例，可列舉：經管腸内營養劑等流 食，模壓點心、錠劑、咀嚼錠、錠劑、粉劑、散劑、膠囊 劑、顆粒劑及飲料劑等製劑形態之健康食品及營養輔助食 品；綠茶、烏龍茶及紅茶等茶飲料，冷飲、果凍飲料、運 動飲料、乳飲料、碳酸飲料、蔬菜飲料、果汁飲料、醱酵 蔬菜飲料、醱酵果汁飲料、醱酵乳飲料（酸乳飲料等）、乳 153168.doc -19· 201138651 酸菌飲料、乳飲料（牛奶咖啡、果奶等）、粉末飲料、可可 飲料、牛奶及純化水等飲料；黃油、果醬、香松及人造奶 油等西點調料類；蛋黃醬、起酥油、乳蛋糕乳脂、沙拉調 料類、麵包類、米飯類、面類、意大利面、醬湯、豆腐、 酸乳飲料、湯或醬料類、點心（例如，餅乾或曲奇類、巧 克力、糖果、蛋糕、冰漠淋、口香糖、糖片）等。 本發明之飲料食品除本發明之製劑以外，亦可調配製造 該飲料食品時所使用之其他食品原材料'各種營養素、各 種維生素、礦物質、膳食纖維、各種添加劑(例如滋味成 分、甜味劑、有機酸等酸味劑、穩定劑、香料）等，並依 據通常之方法而製造。 於本發明之飲料食品中’考慮飲料食品之形態或要求之 口味或食感，業者可適當蚊本發明之製劑或枯草桿菌之 芽孢菌體之調配量。通常’所添加之枯草桿菌之芽孢菌體 之總量成為0.001〜100質量％、較佳為〇〇1〜8〇質量％、更佳 為0.01〜50質量％之本發明之製劑的調配量肖為適當。由於 本發明之製劑係、安全性較高者，故而可進而增加飲料食品 中之其調配量。為了能夠服用本發明之製劑之希望之攝取 量，較佳為製成能管理每1天之攝取量之形態。如此以能 夠管理本發明之製劑之希望之攝取量之形態服用本發明之 飲料食品’#此提供使用該飲料食品之大 菌之增加及/或抑制減少方法。 雙又技桿 只要藉由業者能夠利用之任意之適當方法使本發明之製 劑含有於飲料食品中即可。例如，可將本發明之製劑製備 I53I68.doc -20- 201138651 成液體狀、凝膠狀、固體狀、粉末狀或顆粒狀之後，將其 調配於飲料食品中。或者可將本發明之製劑直接混合或溶 解於飲料食品之原料中。本發明之製劑亦可塗抹、包覆、 滲透或喷附於食品上。可使本發明之製劑均勻地分散於食 品中，亦可使其分佈不均勻。可配藥裝有本發明之製劑之 膠囊等。可用可食性膜或食用被膜劑等包裹本發明之製 劑。又，亦可於本發明之製劑中添加適當之賦形劑等之 後，成形為錠劑等之形狀。含有本發明之製劑之飲料食品 可進而進行加工，該種加工品亦包含於本發明之範圍中。 製&本發明之飲料食品時，可使用飲料食品甲慣用之各 種添加物。作為添加物，並無限定，可列舉··顯色劑（亞 确酸納等）、著色料（槐子色素、紅1〇2等）、香料（橘子香料 等）、甜味劑（甜菊、阿斯巴甜糖等）、防腐劑（乙酸鈉、山 梨酸等）、乳化劑(硫酸軟骨素鈉、@二醇脂肪酸酯等）、抗 氧化齊！（EDTA(ethylenediaminetetraacetate，乙二胺四乙酸） 一鈉、維生素C等）、PH值調節劑（檸檬酸等）、化學調味料 (肌苷酸鈉等）、增黏劑(三仙膠等)、膨脹劑(碳酸鈣等卜消 泡劑(磷酸鈣等)、黏合劑(聚4酸鈉等)、營養強化劑(鈣強 化劑、維生素八等）、賦形劑（水溶性糊精等）等。進而，亦 可進而添加亞(參萃取物、刺五加萃取物、桉樹萃取物、 杜仲余萃取物等功能性原材料。 進而本發明之製劑不僅可調配於人用之飲料食品中，亦 可調配於家畜（緒、雞等）、赛馬、寵物等之飼料中。由於 除了受檢體為人以外，飼料與飲料食品大致相同，故而上 1531 邡.doc -21 · 201138651 述關於飲料食品之記載，亦可同樣適用於飼料。 以下，根據實施例進而具體地說明本發明，但本發明並 不限定於該等實施例。 [實施例1]芽孢菌體之製備 將枯草桿菌C-3102(FERM BP-1096)於固體培養基中進行 培養。若簡單地加以說明’使用商品名「TRYPTICASE SOY BROTH」（BBL公司）3〇 g/L中混合有瓊脂2〇/0之TS瓊脂 培養基，於37°C下將枯草桿菌C-3102培養2~3天，從而獲 得芽孢菌體。 [實施例2 ]使用人之人工腸道模型的枯草桿菌之發芽率之檢測 TNO營養食品研究所（荷蘭）所有之人工腸道模型（tno intestinal model : TIM-模型）之中’使用作為胃至小腸之再 現模型之TIM-1模型，對枯草桿菌之芽孢菌體之發芽率進 行評價。 右簡單地加以說明，使用TN〇開發之TIM_丨模型作為胃 至小腸之人工模型，並將各試驗群之樣品添加於該模型 中，每1小時進行取樣，經過6小時使其自胃通過至小腸， 對發芽率進行評價。關於該耵河丨模型，於Havenaar, &及

Minekus, M. Dairy Industries International 61: 17-23, 1996、Maneau, R et al· j Dairy % 8〇: i〇3i i〇37, 1996 中 記載有詳細情況。

將歐洲大陸式早餐（含蛋白質12%、脂肪32%、碳水化合 物56%)作為膳食成分而添加，並添加總計lx1G、CFU (C〇1〇ny-f〇rming unit，菌簇形成單位）之以實施例】中記載 153168.doc •22· 201138651 之方式製備而成之枯草桿菌C_31 〇2之芽孢菌體，將該群設 定為試驗群’並以11==2進行實驗。 關於發芽率之換算，利用芽孢菌體耐熱之性質，將以 65°C加熱處理30分鐘之菌體作為「芽孢菌」，將未加熱處 理之菌體作為「芽孢菌+發芽菌（營養細胞）」，將非加熱菌 體數量/添加菌體數量xl〇0(%)_加熱菌數/添加菌體數量 xl00(%)作為發芽率並進行評價。以平板法測定菌體數 量。 對經取樣之樣品，比較加熱處理菌體與非加熱處理菌體 之比例，以各小時之結果作為累積存活率（各小時之菌數/ 添加菌數X 100。/〇)並進行比較。結果示於表i中。 [表1] 樣品 添加之樣品(芽疱菌體IxlO10) 芽孢菌+發芽菌(未加熱） ϊόο%- 芽孢菌(加執） 100% 64% 回腸回收(~6小時） 74% 回腸回收(-6小時+殘留物） 99% _ 85% 根據表1所示之結果，經過6小時後之樣品與殘留物中之 菌體之發芽率（〇/〇)為 99/l〇〇xl〇〇-85/l〇〇xl〇〇=14%。因此， 可知枯草桿菌之芽孢菌體通過胃至小腸後，整體之大約 14%會發芽》 [實施例3]使用人之人工大腸模型的腸内菌群之變動 (1)藉由微陣列進行之腸内菌群菌之檢測 以與實施例2相同之方式，使用TN0營養食品研究所（荷 蘭）所有之人工腸道模型（TN〇 intestinal m〇del : tim_模型） 即作為胃至小腸之再現模型之麗」模型與作為大腸之再 153168.doc •23· 201138651 現模型之TIM-2，對人腸内菌群之變動進行评價。若簡單 地進行說明，使用ΤΝ0開發之ΤΙΜ_2模型作為大腸之人工 模型，以微陣列法對腸内菌群之變動進行評價❶對該TJM_ 2模型，於 Venema，K. et al. Nutrition 24 (12): 558-564, 2000中記載有詳細情況。又，微陣列中使用者為作為TN〇 所開發之腸内菌群解析用微陣列之IChip，搭載有人腸内 存在之 360種菌種（Maathuis，A. et al. FASEB J. 22 (Meeting Abstract Supplement): 1089.7, 2008)。 设疋貫施例2中回收之TIM-1模型6小時通過樣品（# i)與 相當於其對照群之膳食成分樣品（#2)，及添加總計丨χ 1〇10 個CFU之實施例1中製備之枯草桿菌之芽孢菌體的群（#3)與 相當於其對照群之無添加群（#4)作為試驗群。因此，# 1樣 品含有腾食成分（營養分）之消化物與芽孢菌體及發芽菌 體，#2樣品含有膳食成分之消化物，#3樣品含有培養基與 芽孢菌體，#4樣品僅為培養基。此處所謂之培養基之成分 為果膠0.6、木聚糖〇.6、阿拉伯半乳糖〇 6、支鏈澱粉〇 6、 支鏈澱粉0.6、酪蛋白3.0、澱粉5.0、吐溫80(Tween80) 2_16、胰化蛋白脒3.〇、膽汁〇 〇5(g/day)。 於TIM-2模型中接種荷蘭健康人之人腸内菌群，預培養 16小時’形成穩定之菌群後，添加來自各試驗群之樣品 (#1及#2，或#3及料），並使其作用72小時。關於各個試驗 群以n=2進行實驗。 自實驗前後之人工腸内内容物萃取RNA，以使用ichip 之微陣列法進行比較。尤其對構成腸内菌群之雙又桿菌屬 153l68.doc -24- 201138651 細菌’藉由螢光錢之增減將各試驗群之實驗邮小時）與 貫驗後（72小時）之菌體數量加以比較。以野照卵2或叫 及枯草㈣投予群⑷或#3)對其增減值進行比較，將以勞 光強度比可確認增減2倍以上之菌種判斷為存在菌體數量 之增減者。結果示於圖1(#1/#2)及圖2(#3/#4)中。 如圖i及圖2中所示，含有芽抱菌與發芽菌兩者之試驗群 ⑷）中，青春雙叉桿菌、角狀雙又桿菌、龍根雙又桿菌、 印度雙又桿菌、嗜熱雙又桿菌中菌體數量增加（圖…另一 方面，將芽抱菌直接投予至大腸模型之試驗群（#3)中，發 現僅龍根雙又桿菌中菌體數量增加，與含有芽孢菌及發芽 菌兩者之試驗群（#1)進行比較，確認其增加較為明顯（圖 2)。 根據該結果可知’藉由使枯草桿菌之芽抱菌體不發芽地 到達大腸中，與通過胃腸約14%會發芽之枯草桿菌之芽孢 菌體進行比較，尤其對龍根雙又桿菌具有增加效果。 (2)藉由Real-time PCR進行之腸内菌群菌之檢測 以苯酚-氣仿法自上述（1)中進行之試驗群的實驗前後之 人工腸内内容物萃取DNA。為確認龍根雙叉桿菌之増減， 參考龍根雙叉桿菌之16S rDNA序列中特異之引子序列（參 考 Malinen，E. et al. Microbiology 149: 269-277, 2003)，藉 由Real-time PCR測定i6S核糖體DNA之拷貝數。 結果示於表2及圖3(#3/#4)中。 153168.doc •25- 201138651 [表2] 龍根雙叉桿菌log(相 - C3102(#3) 對 0小時 6.01 5.80 72小時 5.00 4.05 減少率 -1.01 -1.75 根據表2及圖3所示之結果，藉由括草桿菌之芽抱菌體， 抑制龍根雙又桿菌之菌體數量之減少。一般認為對照群中 之龍根雙叉杯菌之菌數減少係由於在僅投予營養狀態並非 最適合之培養基成分之實驗條件下進行評價，顯示枯草桿 菌之芽抱菌體可明顯地抑制其減少…於可維持菌數之 狀況下，可期待增加龍根雙又桿菌之菌數。 根據以上⑴及（2)之結果可知，於未發芽之形態下，括 草桿菌之芽抱菌體增加大腸中雙叉乳酸桿g，尤其增加且 抑制減少龍根雙叉桿菌。 又’一般認為，枯草桿菌之芽孢菌體，即便對於其他雙 又桿菌屬，亦可藉由變更實驗條件而期待增加菌數。 本說明書中所引用之所有刊物、專利及專利申請案，以 參考之形式，其全文引用於本說明書中。 [產業上之可利用性] 根據本發明，提供一種具有優異之雙又乳酸桿菌之增加 及/或抑制減少作用之製劑。本發明之製劑增加及/或抑制 減少大腸中雙叉乳酸桿菌，從而有助於促進宿主之健康， 並預防各種疾病。進而，即便於高溫處理後亦保持雙又乳 酸桿菌之增加/抑制減少作用。因此，本發明之製劑亦可 153168.doc • 26· 201138651 較佳用於功能性飲料食品及飼料中。 【圖式簡單說明】 圖1係表示將枯草桿菌之芽孢菌及發芽菌投予至大腸模 . 型中後，藉由微陣列測定之雙又乳酸桿菌之增加的圖表。 圖2係表示將枯草桿菌之芽孢菌投予至大腸模型中後， 藉由微陣列測定之雙又乳酸桿菌之增加的圖表。 圖3係表示將枯草桿菌之芽孢菌投予至大腸模型中後’ 藉由Real-time PCR測定之龍根雙叉桿菌之減少的圖表。 153168.doc -27-

Claims (1)

1. 201138651 七、申請專利範圍： 1- 一種大腸中雙叉乳酸桿菌之增加及/或抑制減少劑，其包 含枯草桿菌之芽孢菌體，及用以將該芽孢菌體以維持芽 孢菌體之形態而直接傳送至受檢體之大腸中之機構。 2. 如μ求項1之製劑，其實質上不含有枯草桿菌之發芽菌 體。 3. 如明求項1或2之製劑，其中枯草桿菌為枯草桿菌c_ 3 l〇2(FERM BP-1096)或者其變異株或衍生株。 4·如叫求項1至3中任一項之製劑，其中雙叉乳酸桿菌為龍 根雙叉桿菌。 5·如請求項1至4中任一項之製劑，其係口服投予用及/或經 腸投予用。 6·如請求項1至5中任一項之製劑，其係用於飲料食品、飼 料或醫藥品中。 7. 如請求項丨至6中任一項之製劑，其係用作整腸劑、抗過 敏劑或血脂改善劑。 8. —種功能性飲料食品之製造方法，其包括以下步驟： 製備如請求項1至7中任一項之製劑，及 將該製劑調配於飲料食品中。 9. -種增加及/或抑制減少受檢體之切中雙叉乳酸桿菌之 方法’其包括：將有效劑量之枯草桿菌之芽孢菌體以維 持芽孢菌體之形態而直接傳送至受檢體之大腸中，或將 該芽抱菌體直接投予至受檢體之大腸中。 10. 如請求項9之方法，其中枯草桿菌為枯草桿菌c_3i〇2 153168.doc 201138651 (FERM BP-1096)或者其變異株或衍生株》 11.如請求項9或10之方法，其中雙叉乳酸桿菌為龍根雙叉 桿菌。 153168.doc