TW201134480A - CLUAP1 peptides and vaccines including the same - Google Patents

Description

201134480 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於生物科學領域，更特別對於癌症治療領 域。特別是’本發明係關於新穎之胜肽，其當作癌症疫苗 及治療與避免腫瘤之藥物為非常有效。 【先前技術】 已證實CD8陽性細胞毒殺性T淋巴球辨認來自建造於 主要組織相容性抗原複合體（ma jor histocompatibi 1 ity complex, MHC) class I分子上之腫瘤相關抗原 (tumor-associated antigens，TAAs)的抗原決定位胜肽， 且之後殺死腫瘤細胞。自從發現黑色素瘤抗原（melanoma antigen，MAGE)家族為腫瘤相關抗原之第一個例子，藉由 免疫方法，已發現許多其他腫瘤相關抗原（Boon T，Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80(NPL 1); Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9(NPL 2))’且這些腫瘤相關抗原的一些目前在臨床發展的過程中 作為免疫治療標的。 能誘導有效且專一之抗腫瘤免疫反應的新腫瘤相關抗 原的辨認成為於多種形式癌症中之胜肽疫苗接種策略 (vaccination strategies)之更進一步發展與臨床研究的 根據為正進行著（Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20)： 1442-55(NPL 3); Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42(NPL 4); Vissers 201134480 JL et al.，Cancer Res 1 999 Nov 1，59 (2 1 ): 5554-9 (NPL 5); van der Burg SH et al. , J Immuno 1 1 996 May 1，156(9): 3308-14CNPL 6)； Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8CNPL 7); Fu j ie T et al. , Int J Cancer 1 999 Jan 1 8, 80 ( 2 ): 1 69-72 (NPL 8); Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66(NPL 9); Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94(NPL 10))。迄今已報導許多使用這些腫瘤相關抗原衍生胜肽的 臨床S式驗。不幸地，許多目前癌症疫苗試驗已顯示一低的 客觀反應率（objective response rate) (Belli F et al.， J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80(NPL 11)； Coulie PG et al. , Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42(NPL 12); Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9)： 9 0 9-1 5 (NPL 13))。因此’仍然需要新穎之腫瘤相關抗原作 為免疫治療標的。 為此目的’藉由使用含有23,040個基因之基因體寬度 cDNA微陣列之大腸直腸癌（colorectal cancer)表現輪廊 的分析’已鑑定出CLUAP1 ( GenBank獲得編號NM_0 1 5041 或 NM_024793 )，簇蛋白相關蛋白質

Kclusterin-associated protein 1)，為在大腸癌中常被 轉移活化（transactivated)的基因（Takahashi M et al Oncogene. 2004 Dec 9;23(57): 9289-94(NPL 14))。已觀 察到CLUAP1的表現被逐步增加於細胞週期之s相晚期至 G2/M相，回復至於G0/G1相中的基礎程度。此外，藉由siRfu 201134480 之CLUAP1的抑制已顯示導致在轉染腫瘤細胞中之成長遲 延。CLUAP1的過度表現也於骨肉瘤（〇ste〇sarc〇ma)、卵巢 與肺癌中被觀察到（IshikuraHetal.，IntJOncol. 2007 Feb; 30(2): 461-7(NPL 15))。綜上所述，這些事實建議， 在多種癌症中，CLUAP1可為癌症免疫治療的一有效目標。 【引用文獻】 非專利文獻（Non Patent Literature) [NPL 1]

Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80 [NPL 2]

Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1 996 Mar 1, 183(3): 725-9 [NPL 3]

Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20)： 1442-55 [NPL 4]

Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42 [NPL 5]

Vissers 几 et al·，Cancer Res 1 999 Nov 1，59(21): 5554-9 [NPL 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 6 201134480 156(9): 3308-14 [NPL 7]

Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20)： 4465-8 [NPL 8]

Fujie T et al., Int J Cancer 1 999 Jan 18, 80(2): 169-72 [NPL 9]

Kikuchi M et al., Int J Cancer 1 999 May 5, 81(3): 459-66 [NPL 10]

Oiso M et al.， Int J Cancer 1999 May 5， 81(3): 387-94 [NPL 11]

Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 1 5, 20 (20 ): 4169-80 [NPL 12]

Coulie PG et al. , Immunol Rev 2002 Oct, 1 88: 33-42 [NPL 13]

Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15 [NPL 14]

Takahashi M et al., Oncogene. 2004 Dec 9;23(57): 9289-94 7 201134480 [NPL 15]

Ishikura H et al.， Int J Oncol. 2007 Feb; 30(2):461-7 【發明内容】 本發明至少部分基於發現新穎的胜肽，其可作為免疫 治療之標的。由於腫瘤相關抗原（tumor-associated antigens, TAAs)有時被免疫系統感知為“自身”且因此 常不具有免疫抗原性（i mmunogen i c i ty )，所以適合標的的 發現極度重要。如上所提到，已確認CLUAP1(由GenBank獲 得編號0_015041或關_024793 (例如，序列辨識號：44) 之基因所編碼出的序列辨識號：45 )在包括，但不限於乳 癌（breast cancer)、子宮頸癌（cervical cancer)、大腸 直腸癌（colorectal cancer)、食道癌（esophageal cancer)、胃癌（gastric cancer)、瀰漫型胃癌（gastric di f fuse-type cancer)、淋巴癌（lymphoma)、神經母細胞 瘤（neuroblastoma)、胰臟癌（pancreatic cancer)的癌症 中為向上調控。因此’本發明聚焦於CLUAP1為一癌症/腫 瘤免疫治療之標的的候選物。 本發明更關於具有誘導專一於CLUAP1之細胞毒殺性τ 淋巴球之能力的CLUAP1之基因產物的特定抗原決定位胜 狀的確認。詳細如下所討論，使用與HLA (人類白血球組 織抗原）-A* 2402或HLA-A* 0201結合之來自CLUAP1的候 選胜肽來刺激自健康提供者獲得之周邊血液單核球細胞 201134480 (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。之後建 立細胞毒殺性T淋巴球，其具有抗（against)經各候選胜肽 脈衝（pul sed)之HLA-A24或HLA-A2陽性目標細胞的專一細 胞毒性。這些結果證明這些胜肽為HLA-A24或HLA-A2限制 的抗原決定位胜肽，其可誘導強而專一之抗表現CLUAP1之 細胞的免疫反應。此外，結果指出CLUAPI為強效致免疫性 且其抗原決定位為癌症/腫瘤免疫治療之有效目標。 因此’本發明一目的為提供與HLA抗原結合之經分離 的胜肽’特別是包括CLUAP1 (序列辨識號：45 )或其免疫 活性片段的那些。這些胜肽被預期具有細胞毒殺性T淋巴 球誘發能力且因此可被用於叩誘導細胞毒殺性τ淋 巴球或被投予一個體以誘導抗癌症’例如乳癌、子宮頸癌、 大腸直腸癌、食道癌、胃癌、瀰漫型胃癌、淋巴癌、神經 母細胞瘤、胰臟癌的免疫反應。較佳胜肽為九胜肽或十胜 狀’且更佳為具有擇自序列辨識號：2至23與25至43中 之胺基酸序列的那些。在這些中，具有擇自序列辨識號·· 3、 4 、 5 、 8 、 9 、 1。 、 14 、 15 、 16 、 18 、 23 、 30 、 33 、 34 、 35 、 36與38中之胺基酸序列的胜肽顯示強的細胞毒殺性丁淋 巴球誘發能力，且因此為特別被喜愛。 本發明胜肽包括其中一、二或多個胺基酸被取代、刪 除或加人的那些’只要所產生經修飾之胜肽維持最初之細 胞母殺性Τ淋巴球誘發能力。本發明也提供編碼出任何本 發明胜肽之經分離的多核㈣。這些多核苦酸可用以誘導 或製傷具有細胞毒殺,性τ淋巴球誘發能力之抗原呈現細 201134480 胞’或如本發明胜肽可被投予至一個體以誘導抗癌之免疫 反應。 當投予一個體時’本發明胜肽較佳被表現於抗原呈現 細胞之表面以便誘導將分別之胜肽做為目標之細胞毒殺性 τ淋巴球。因此，本發明一目標為提供誘導細胞毒殺性τ 淋巴球之組合物或物質，此種組合物包括一或多個本發明 胜肽或編碼出此類胜肽的多核苷酸。本發明更考慮包括一 或多個本發明胜肽或編碼出此類胜肽的多核苷酸之藥學組 合物’此組合物被配製用於癌症之治療及/或預防，與其手 術後復發的避免’此類癌症包括’但不限於乳癌、子宮頸 癌、大腸直腸癌、食道癌、胃癌、瀰漫型胃癌、淋巴癌、 神經母細胞瘤、胰臟癌。除了本發明胜肽或多核苷酸外/ 代替本發明胜肽或多核苷酸，本發明藥學組合物或物質可 包括呈現任何之本發明胜肽的抗原呈現細胞或外吐小體為 活性成分。 本發明之胜肽與多核苷酸可誘導於其表面呈現HLa抗 原與本發明胜肽之複合物的抗原呈現細胞，例如，藉由將 來自一個體之抗原呈現細胞與此胜肽接觸或將編碼出本發 明一胜肽的多核苦酸引入抗原呈現細胞。此種抗原呈現細 胞具有问的抗目標胜狀之細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力且 因此提供用途於癌症免疫治療中。因此，本發明考慮誘導 具細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的方法與 藉由此方法獲得之抗原呈現細胞兩者。 本發明也提供誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法，方法 201134480 包括將CD8陽性細胞與表現一或多個本發明胜肽於其表面 之抗原呈現細胞或外吐小體共培養之步驟，或引入包括編 碼出與本發明胜肽結合之τ細胞受體（T ceu receptQF， TCR)次單元多胜肽之多核苷酸的基因的步驟。藉由此種方 法獲得之細胞毒殺性T淋巴球可在癌症之治療與避免中提 供用途，癌症之例子包括，但不限於乳癌、子宮頸癌、大 腸直腸癌、食道癌、胃癌、瀰漫型胃癌、淋巴癌、神經母 細胞瘤、胰臟癌。因此，本發明包括藉由本發明方法獲得 之細胞毒殺性Τ淋巴球。 本發明另一目標提供於一需要之個體中誘導抗癌症之 免疫反應的方法，此方法包含投予一包括CLUApi多胜肽或 —其免疫活性片段、編碼出CLUAP1多胜肽之多核苷酸，與 呈現CLUAP1多胜肽之外吐小體或抗原呈現細胞之組合物 或物質至此個體的步驟。本發明之應用性擴展至一些關於 或起因於CLUAP1過度表現的疾病的任一個，例如癌症，示 例之癌整包括’但不限於乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、 食道癌、胃癌、瀰漫型胃癌、淋巴癌、神經母細胞瘤、胰 臟癌。 更具體地，本發明提供下列事物： [1 ] 一種經分離的胜肽，具有細胞毒殺性τ淋巴球誘 發能力’其中該胜肽係由CLUAP1之胺基酸序列或一其免疫 活性片段所組成。 [2] [1]之經分離的胜肽，其中該胜肽包括一胺基酸序 列’其係擇自由序列辨識號：2至23與25至43所組成之 201134480 群組。 [3] [1]與[2]之任一項所述之匈;八μ 1 κ經分離的胜肽，其中1、 2或數個胺基酸被取代、刪除或加入。 [4] [3]之經分離的胜肽，其中力 丹甲在人類白血球組織抗原 -Α24背景下，該胜肽具有下列特徵之—戋兩者· (a) 來自Ν端之第二個胺某酴 耿巷酸為經修飾為一胺基酸， 其係擇自由苯丙胺酸、酷·胺酸、甲访1 τ硫丁胺酸或色胺酸所組 成之群組；以及 ⑻C端胺基酸為，或經修錦為一胺基酸其係擇自 由苯丙胺酸、白胺酸、#白胺酸、色胺酸或甲硫丁胺酸所 組成之群組。 [5] [3]之經分離的胜肽’其中在人類白血球組織抗原 -Α2背景下，該胜肽具有下列特徵之—或兩者： (a) 來自Ν端之第二個胺基酸為係擇自由白胺酸與甲 硫丁胺酸所組成之群組；以及 (b) C端胺基酸為係擇自由纈氨酸與白胺酸所組成之 群組。 [6 ][ 1 ]至[5 ]之任一項所述之經分離的胜肽，其中該 胜狀為九胜狀或十胜狀。 [7 ] —種經分離之多核苷酸，其編碼出[丨]至[6 ]之任 一項所述的該胜肽。 [8 ] —種誘發細胞毒殺性τ淋巴球之組合物，其中該 組合物包括[1]至[6]之任一項所述之—或多個該胜肽，或 [7]所述之一或多個該多核苷酸。 12 201134480 [9 ] 一種藥學組合物’用於癌症之治療及/或預防，及 /或其手術後復發的避免，其中該組合物包括[1]至[6]之任 一項所述之一或多個該胜肽，或所述之一或多個該多核 苷酸。 [1 0 ][ 9 ]之藥學組合物，被配製來用以投予一個體， 其人類白血球組織抗原為人類白血球組織抗原-A24或人類 白血球組織抗原-A2。 [11] [9]或[10]之藥學組合物，其中該組合物被配製 來用於癌症之治療。 [1 2 ] —種誘導具有細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力之 抗原呈現細胞的方法，其中該方法包括一步驟，其係擇自 由下列所組成之群組： (a) pyiro、以或“ 將一抗原呈現細 胞與[1]至[6]之任一項所述之該胜肽接觸；以及 (b) 將編碼出[1 ]至[6 ]之任一項所述之該胜肽的一多 核苷酸引入一抗原呈現細胞。 [13 ] —種誘導細胞毒殺性τ淋巴球的方法，藉由包括 擇自由下列所組成之群組的一步驟的方法： (a) 將CD8陽性T細胞與抗原呈現細胞共培養，抗原 呈現細胞表現一人類白血球組織抗原與[1 ]至[6 ]之任一項 所述之該胜肽的複合物於其表面上； (b) 將C D 8陽性T細胞與外吐小體共培養，外11土小體 表現一人類白血球組織抗原與[丨]至[6 ]之任一項所述之該 胜肽的複合物於其表面上；以及 13 201134480 (C)將一包括編碼出一 T細胞受體次單元多胜肽之多 核苦酸的基因引入一 Τ細胞，該τ細胞受體次單元多胜月太 與[1]至[6]之任一項所述的該胜肽結合。 [14 ] 一種經分離之抗原呈現細胞，其表現一人類白血 球組織抗原與[1]至[6]之任一項所述之該胜肽的複合物於 其表面上。 [15] [14]之抗原呈現細胞’其藉由[12]之方法來誘 導。 [1 6 ] —種經分離之細胞毒殺性τ淋巴球，其以[丨]至 [6]之任一項所述之該胜肽為標的。 [1 7 ] [ 1 6 ]之細胞毒殺性τ淋巴球，其藉由[丨3 ]之方法 來誘導。 [18] —種於一個體中誘導一抗癌症之免疫反應的方 法，其中該方法包括投予該個體一組合物，該組合物包括 [1]至[6]之任一項所述之一胜肽、一其免疫活性片段或一 編碼出該胜肽或該片段多核苷酸。 [19] 一種抗體或其片段，其抗[丨]至[6]之任—項所述 之該胜狀_的任一個。 [2〇] —種載體，包括編碼出[n至[6]之任一項所述之 該胜肽的一核苷酸序列。 [21] —種宿主細胞，其被以[2]之一表現載體所轉形 或轉染。 [22] 一種診斷套組，包括[丨]至[6]之任一項所述之 該胜肽、[7]之該核苷酸或[19]之該抗體。 14 201134480 [23 ] [ 1 ]至[6 ]之任一項之經分離的胜肽，其係擇自 由序列辨識號：3、4、5、8、9' 10、14、15、16、18、23、 30、33 ' 34、35、36與38所組成之群組。 需瞭解的是’本發明前述發明内容與下列詳細敘述兩 者為不範之實施例，並不限制本發明或本發明其他替代實 施例。 除了上述’當以下詳細說明被閱讀並結合伴隨之圖式 與貫施例，本發明之其他目的與特徵會變的更完全地明 白。然而，可瞭解的是’上面之本發明内容與以下之詳細 說明兩者為示範之實施例，並不限制本發明或本發明其他 替代實施例。特別當關於一些特定實施例於此敘述之 本發明，可以瞭解的是，敘述為本發明之說明且並不建 構為本發明之限制。各種修飾與應用可被熟悉此技藝人士 想到’而無背離本發明精神與範，如所时請專利範圍 所述。同樣地，本發明之其他 此内容與下述之特定實施例， 藝人士而言可立即明白。此種 上述結合伴隨實施例、資料、 隨著考慮引入於此之參考文獻 楚的。 目的、特徵、好處與優點自 為清楚的，且對於熟悉此技 目的、特徵、好處與優點自 圖式與所有要被自其單獨或 而描述的所有合理推論為清 【實施方式】 雖然於本發明實施例之實施 ^ λ ^ , °飞干可使用相似或箄 同於在此敘述之那些的任何方 寻 〃材枓，但是現在敘述較 15 201134480 佳之方法、元件輿奸 其 、〃 ° ‘，，；而在敘述本發明材料與方法之 則，需瞭解的是，★议 本發明並不限於敘述於此之特定大小、 形狀、尺寸、材料、方 法學、步驟等，例如按照慣例實驗 法及/或最佳化可將1變 町”i更。也需瞭解的是，於此敘述中 用之專門用語僅县兔7 &丄 疋為了敘述特別之變化形式或實施例，且 不傾向限制僅會受限於 限於所附上之申請專利範圍的本發明範 圍。於本說明書φ担Hi ^及之所有刊物、專利或專利申請於此 以其内容被具體弓丨入為i去—虹 1八马參考文獻。然而，於此並沒有被解 釋為承認本發明由^^ 1 ± 由於先則發明之效力不被給予先於這些揭 露之權力。 I.定義 除非特別定義’於此使用屬與本發明之所有技術或科 學用語為與熟悉此技藝人士所通常瞭解之意義相同。然 而，若發生抵觸，本發明說明書，包括定義將會控制。 於此使用之單字“一 ”與“該”意指“至少一，，除非 以別的方式明確指出。 於此可替換使用之用語“多胜肽”、“胜肽，，與‘‘蛋 白質意指胺基酸殘基之一聚合物。此用語適用於胺基酸 聚合物’於其中一或多個胺基酸殘基可為經修飾之殘基或 非自然發生之殘基’例如對應自然發生胺基酸之人工化學 模仿物’與自然發生胺基酸聚合物。 於此使用之用語“胺基酸”意指自然發生與合成之胺 基酸，及胺基酸類似物與胺基酸模仿物，其與自然發生之 16 201134480 胺基酸起相似作用。胺基酸可為L-胺基酸或D-胺基酸。自 然發生胺基酸為基因密碼所編碼的那些與於細胞中在轉譯 後被修飾的那些（例如經脯胺酸（hydroxyproΠne)、τ -羧基谷胺酸（gamma-carboxyglutamate)與0-磷絲胺酸 (Ο-phosphoserine))。措辭“胺基酸類似物”意指具有與 自然發生胺基酸相同之基礎化學結構（一 <2碳鍵結至一 氫、一羧基、一胺基與一 R基）的化合物，但具有一或多 個經修飾之R基或經修飾之骨架（例如，同絲胺酸 (homoserine)、降亮胺酸（norieucine)、甲硫胺酸 (methionine)、亞砜（sulf〇xide)、甲基硫氨磺（methi〇nine methylsulfonium))。措辭“胺基酸模仿物，’意指化學化 合物其與一般胺基酸具有不同結構，但有相似的功能。 可藉由由 IUPAC-IUB Biochemical N〇menclature Commission所建議之其一般所知的三字母符號或一字母符 號來指出於此處之胺基酸。於此可替換使用用語“基 因”、“多核苷酸”、“核苷酸”與“核酸，’，且除非以 別的特別：¾式指ώ，相似於胺基s复其以它們一般被接受的 單一字母編碼來指出。 此處使用之用語“組合物，’意指包括一產物，其包括 於特疋里中特定成分’與任何產物其直接或間接來自於特 定量之特定成分的組合。此用語肖“藥學組合物，，相關， 意指包括m包括—活性成分與形成載體的惰性成 刀’及任何產物其直接或間接來自任兩個或多個成份之組 合、複合或聚集’或來自一或多個成分之解離或來自— 17 201134480 或多個成分之反應或相互作用的复 ’、 升^ 式0 因 Ή Jr StS- 明内容中，用語“藥學組合物，，音 匕，在本發 物盘筚學上戍生理上可接… 藉由混合本發明化合 视一樂子上及玍理上了接受之載體所 如此處所使用之措辭“藥學上、何組合物。 予上』接文之載體” 可接受之載體”意指藥學上或生理 4生理上 铷铷哲々# 丨Λ,, 接又之材料 '組合 物、物質或載劑，包括，但不限於一 固體埴右、 稀釋劑、賦形劑、溶劑或套膜材料，1 具兄 /、，、自一器官或身體 之一部分攜帶或運輸受支配支 〆 又朱樂效團（scaffolded polypharmacophores)至另-器官或 | ㈡吕次身體之—部分相關。 除非以別的方式定義，用語‘‘癌 n 意指過度表現 CLUAPI基因之癌症或腫瘤，其例子 田六妁卞巴栝，但不限於乳癌、 子宮頸癌、大陽直陽癌、食道癌 '胃I 、猫成、 $逕屈胃癌、瀰漫型胃癌、淋 巴癌、神經母細胞瘤、姨臟癌。除非以別的方式定義，於 此可替換使用且以別的方式特別指出用語“細胞毒殺性τ 淋巴球、“細胞毒殺性Τ細胞，’肖“CTL”以意指τ淋巴 球之次族群，且除非以別的方式指出，意指τ淋巴球之次 群組（SUb-group)可辨認非自身細胞（例如，腫瘤/癌症細 I被病毒感染之細胞），且誘導這些細胞死亡。除非特 別疋義，用5吾HLA-A24”意指包含次型，例如HLA_A* 2402 之HLA-A24。除非特別定義，用語“HU_A2，，如此處所使 用代表性意指次型，例如HLA-A*0201與HLA- A*0206。 除非特別定義’於此使用之用語“套組，，被使用於關 於4劑與其他材料之組合。與此考慮之套組包括微陣列、 晶片、標誌等《並無打算使用語“套組，，限制於試劑及/ 18 201134480 或材料之特定組合。本發明之方法與組合物之範圍提供用 途於癌症之治療之内容中，一治療被視為“有效”， 若其導致臨床優點，例如於CLUAP1基因之表現中的減少、 或於個體中癌症之大小、普遍程度（prevalence)4轉移潛 力的減少。當治療為預防性（pr〇phylacticaUy)提供時， “有效”意、指減緩或避免癌症形成，或避免或減輕癌症之 臨床症狀。有效性被確認於相關之診斷或治療特定腔瘤形 式的任何已知方法。 本發明之方法與組合物之範圍提供用途於癌症之“避 免/、預防之内谷中，此類用詞為與此交替使用意指 任何活性，其減少死亡率之負載或來自疾病之死亡率。避 免與預防可發生於“初期、第二期與第三期避免層級”。 初期避免與預防避免了疾病之發展，@第二期與第三期層 級之避免與預防包括藉由恢復功能與減少疾病相關併發 症，以疾病之發展與症狀之浮現及減少已建立之疾病之負 向發展的避免與預防為目的。 由分 ^或者，治療或避免可包括一 廣砣圍之預防疾病治療，其 ^冉以減緩特別疾病之嚴重度為目 標，例如減少腫瘤之增殖與轉移。 在本發明内容中，癌症 ^ ^ 〈化療及/或預防，或，及/岑 其手術後復發的避免包括任何 ^ 下列步驟，例如癌細胞之手 術移除、似癌細胞之生長抑制、 .^ w疋哀退或退化、癌絡 生之減緩與抑制的誘導、Μ 生,“ 腫•退化與與轉移之減少盘抑 制。癌症之有效治療及/戋 ’、抑 之個體的預後、減低癌症標 …有癌症 °己於血液中的程度與減緩伴隨 19 201134480 著癌症之可偵測症狀。例如，症狀之減輕或改善構成有效 治療及/或預防，其⑽1Q%、2()%、3()%或更加減輕， 或穩定疾病。 在本發明内容中，用語“抗體，，意指免疫球蛋白與其 片段，其專一與選定蛋白質或其片段反應。一抗體可包括 人類抗體、靈長類抗體、嵌合抗體（chimeric antib〇dy)、 雙專一抗體（bispecific antibody)、人源化抗體、與其他 蛋白質或放射標誌融合之抗體，與抗體片段。此外，此處 之抗體被使用於最大效用且特別包含完整單株抗體、多株 抗體、形成自至少兩個完整抗體之多專一抗體 (multispecific antibody)(例如雙專一抗體）與抗體片 段，只要其存在所需生物活性。“抗體”意指所有之種 類（例如，IgA、IgD、IgE、IgG 與 IgM)。 除非特別疋義，於此使用屬與本發明之所有技術或科 學用語為與熟悉此技藝人士所通常瞭解之意義相同。 11.胜肽 為了證明來自CLUAPI之胜肽作用如一被細胞毒殺性τ 淋巴球（CTLs)所辨認之抗原，分析來自CLUAP1之胜肽（序 列辨識號：45 )以確定是否其為由一般遇到jjLA對偶基因 (&116 16)之111^(人類白血球組織抗原）-入24或八2所限制 之抗原決定位（Date Y et al·，Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al. , J Immunol 155: 4307-12, 1 995; Kubo RT et al·，J Immunol 1 52: 391 3-24, 1 994)。 20 201134480 確認來自CLUAP1之HLA-A24結合胜肽的候選物，根據 其對HLA-A24之結合親和力。候選胜肽被認為是下列胜肽： CLUAP1-A24-9-244 (序列辨識號：2)、 CLUAP1-A24-9-255 (序列辨識號：3)、 CLUAP1-A24-9-283 (序列辨識號：4)、 CLUAP1-A24-9-31 (序列辨識號·· 5)、 CLUAP1 -A24-9-8 (序列辨識號：6)、 CLUAP1-A24-9-26 (序列辨識號：7)、 CLUAP 1 -A24-9-1 68 (序列辨識號：8)、 CLUAP1-A24-9-64 (序列辨識號：9)、 CLUAP 1-A24-9-216 (序列辨識號：10)， CLUAP1-A24-9-335 (序列辨識號：11)、 CLUAP1-A24-9-86 (序列辨識號：12)、 CLUAP1-A24-9-71 (序列辨識號：13)、 CLUAP1-A24-9-154 (序列辨識號：14)、 CLUAP1-A24-10-91 (序列辨識號：15)、 CLUAP1-A24-1 0-1 04 (序列辨識號：16)、 CLUAP1-A24-10-31 (序列辨識號：17)、 CLUAP1-A24-10-125 (序列辨識號：18)、 CLUAP卜A24-10-17 (序列辨識號：19)、 CLUAP1-A24-1 0-289 (序列辨識號：20)、 CLUAP1-A24-10-258 (序列辨識號：21)與 CLUAP1-A24-1 0-63 (序列辨識號：22) ° 21 201134480 此外’ //7 F/ 藉由以這些胜肽脈衝（載有）之樹犬 細胞（dendr i t i c ce 11, DC)刺激Τ細胞後，使用下列胜狀 之各個成功建立細胞毒殺性T淋巴球： CLUAP1-A24-9-151-255 (序列辨識號：3)、 CLUAP1-A24-9-1 52-283 (序列辨識號：4)、 CLUAP卜A24-9-1 53-31 (序列辨識號：5)、 CLUAP1-A24-9-156-168 (序列辨識號：8)、 CLUAP卜A24-9-157-64 C 序列辨識號：9)、 CLUAP1-A24-9-158-216 (序列辨識號：10)、 CLUAP卜A24-9-163-154 (序列辨識號：14)、 CLUAP1-A24-1 0-166-91 (序列辨識號：15)、 CLUAP卜A24-10-167-104 (序列辨識號：16)與 CLUAP卜A24-1 0-1 69-125 (序列辨識號：18) 確認來自CLUAP1之HLA-A2結合胜肽的候選物’根據 其對HLA-A2之結合親和力。候選胜肽被認為是下列胜狀： CLUAP1-A2-9-34 (序列辨識號： 23)、 CLUAP1-A2-9-95 (序列辨識说· 25)、 CLUAP1-A2-9-85 (序列辨識號： 26)、 CLUAP1-A2-9-290 (序列辨識號 :27)、 CLUAP1-A2-9-265 (序列辨識號 :28)、 CLUAP1-A2-9-297 (序列辨識號 :29)、 CLUAP1-A2-9-99 (序列辨識號： 30)、 CLUAP1-A2-9-188 (序列辨識號 :31)、 22 201134480 CLUAP1-A2-9-96 (序列辨識號：32)、 CLUAP1-A2-10-153 (序列辨識號 :33)、 CLUAP1-A2-10-85 (序列辨識號： 34)、 CLUAP1-A2-10-34 (序列辨識號： 35)、 CLUAP1-A2-10-33 (序列辨識號： 36) ' CLUAP1-A2-10-72 (序列辨識號： 37)、 CLUAP1-A2-10-80 (序列辨識號： 38) ' CLUAP1-A2-10-41 (序列辨識號： 39)、 CLUAP1-A2-10-233 (序列辨識號 :40)、 CLUAP1-A2-10-183 (序列辨識號 ：41)、 CLUAP1-A2-10-343 (序列辨識號 :42)與 CLUAP1-A2-10-222 (序列辨識號 :43) 之樹突 列脞肽 此外，//? f/ 藉由以這些胜肽脈衝（載有） 細胞（dendritic cel 1，DC)刺激Τ細胞後，使用下 之各個成功建立細胞毒殺性T淋巴球： CIjUAP1~A2~9-34 (序列辨識號：23)、 aUAPl~A2-9-99 (序列辨識號：30)、 CLlMPl-A2 —1〇_153 (序列辨識號：33)、 CLUAP卜A2-10 — 85 (序列辨識號：34)、 CLUAPi-A2~i〇 —34 (序列辨識號：35)、 CLUAPi~A2-i〇 —33 (序列辨識號：36)與 CLUAPl-A2~l〇-8〇 (序列辨識號：38) 23 201134480 這些被建立的細胞毒殺性τ淋巴球顯示強而專一之抗 經分別之胜狀脈衝之目標細胞的細胞毒殺性τ淋巴球活 性。此處這些結果證明CLUAP1為一由細胞毒殺性τ淋巴球 所辨認之抗原，且被測試之胜肽為由HLA_A24或HLA_A2限 制之CLUAP1的抗原決定位胜肽。 由於CLUAP1基因於癌症細胞與組織，包括，但不限於 例如乳癌、子宮頸癌。、大腸直腸癌、食道癌、胃癌、瀰漫 型胃癌、淋巴癌、神經母細胞瘤、胰臟癌的那些之中被過 度表現，且不在大部分正常器官中，所以其代表一良好之 免疫治療標的。因此，本發明提供對應於來自CLUApi之細 胞毒殺性T淋巴球辨認之抗原決定位的九胜肽（胜肽由九 個胺基酸殘基所組成）與十胜肽（胜肽由十個胺基酸殘基 所組成）。或者，本發明提供經分離之胜肽，其與HLA抗 原結合且誘導細胞毒殺性T淋巴球活性，其中胜肽具有序 列辨識號：45之胺基酸序列或為一其免疫活性片段。特別 是，本發明九胜肽與十胜肽之較佳實施例包括具有擇自於 序列辨識號：3、4、5、8、9、10、U、15、16、18、23、 30、33、34、35、36與38中之胺基酸序列的那些胜肽。 通常可使用現今於例如網路可得之軟體程式’例如於 Parker KC et al. , J Immunol 1 994 Jan 1, 152(1)： 163-75 與 Nielsen M et al.’ Pr〇tein Sci 2003; 12: 1007-17

中所敘述的那些，來計算//7 介於各種胜肽與HLA 抗原間之結合親和力。例如，如於概述於，例如，Ufuente EM et al., Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 24 201134480 3209-3220 中之 parker KC et al.，J Immunol 1 994 Jan 1， 1 52( 1 ): 1 63-75, Kuzushima K et a 1. , Blood 2001, 98(6): 1872-81, Larsen MV et a 1. BMC Bioinformatics. 2007 Oct 31; 8: 424，Buus Set al. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003, Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 1 2: 1 007-1 7 與 Nielsen M et al. PLoS ONE 2007; 2: e796 中所述可 測里與HLA抗原之結合親和力。測量親和力之方法欽述 於，例如於 Journal of Immunological Methods, 1 995, 1 85: 18卜190 與 Protein Science， 2000， 9: 1838-1846 中。 所以使用此種軟體程式可選擇來自CLUAP1的片段，其具有 與HLA抗原之南結合親和力。因此藉由此類已知程式本發 明包括由來自CLUAP1之任何片段所組成之胜肽，其與hla 結合。此外’此類胜肽可包括CLUAP1之全長胜肽。 本發明之九胜肽與十胜肽可於側面具有額外之胺基酸 殘基，只要所產生之胜肽維持它們的細胞毒殺性T淋巴球 誘發能力。額外之胺基酸殘基可由任何種類之胺基酸所組 成’只它們不減少原始胜肽之細胞毒殺性τ淋巴球誘發能 力°因此’本發明包含具有對HLA抗原之結合親和力的胜 肽’其包括來自CLUAP1之胜肽。此種胜肽，例如小於約 個胺基酸’時常小於約20個胺基酸，通常小於約1 5個 胺基酸。 —般而言，於一胜肽中一、二或多個胺基酸之修飾， 不會影響胜肽的功能’且在一些例子中，甚至增強原始蛋 白質所需之功能。事實上，已知經修飾之胜肽（即，當與 25 201134480 原始參考序列比較時，包括胺基酸序列之胜肽’其中一、 二或多個胺基酸殘基已被修飾（即，取代、加入、刪除或 插入））維持原始胜肽的生物活性（Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1 984, 81: 5662-6; Zoller and Smith,

Nucleic Acids Res 1982， 10: 6487-500;

Dalbadie-McFarJand et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1 982, 79: 6409-13)。因此，於一實施例中，本發明胜肽具有細 胞毒殺性T淋巴球誘發能力與擇自序列辨識號：3、4、5、 8、 9、 10、 14、 15、 16、 18、 23、 30、 33、 34、 35、 36與 38中之胺基酸序列兩者’其中加入、刪除及/或取代一、 二甚至更多個胺基酸。 熟悉此技藝人士認定改變一單一胺基酸或一小百分比 之胺基酸的個別加入、刪除或取代至一胺基酸序列傾向產 生保存原始胺基酸支鏈的特性。因此，它們常被意指為“保 守取代（conservative substitutions)” 或“保守修飾 (conservative modifications)” ，其中一蛋白質之改變 導致一具有類似原始蛋白質之功能的經修飾蛋白質。提供 功能相似胺基酸之保守取代表已為本技術領域所熟知。所 需保守之胺基酸支鏈的特徵的例子包括，例如疏水胺基酸 (A，I，L, M, F，P，W，Y，V)、親水胺基酸（r，卩，n，C, E, Q, G，H，K’ S，T)與具有下列共同官能基或特徵之支 鏈：一脂肪族支鏈（G，A，V，L，丨，p); 一含經基支鏈（s， Τ，Y)，含硫原子支鏈（C，M);含羧酸與胺基支鏈（D，N，E， Q)，含驗支鏈（R，K，H)，以及含芳香族支鏈（h, f，γ，w)。 26 201134480 此外， 下列 八個知群各包含於本技術領域中被接受為 保 守 取代之 胺基 酸： 1) 丙 胺酸（A)、甘胺酸（G); 2) 天 門冬胺酸（D)、麵胺酸（E); 3) 天 門冬醯胺（N)、麵胺醯胺（Q); 4) 精 胺酸（R)、離胺酸（K); 5) 異 白胺酸（I)、白胺酸（L)、曱硫丁胺酸（M)、 纈 胺 酸（V); 6) 苯 丙胺酸（F)、酪胺酸（γ)、色胺酸（w); 7) 絲 胺酸（S)、蘇胺酸（T);以及 8) 半 胱胺酸（C)、甲硫丁胺酸（μ)(參見， 例 如 Creighton, Proteins 1984)。 此 種經 保守修飾胜肽也被視為本發明之胜肽。然 而 本發明 之胜 肽並不限於此’且可包括非保守修飾，只 要 經 修飾之 胜肽 維持原始胜肽之細胞毒殺性τ淋巴球誘 發 能 力。更 進- 一步而言，經修飾之胜肽不排除多形 變 體 (polymorph ic variant)之細胞毒殺性τ淋巴球誘發 的 胜 肽、種 間同 質體（interspecies homologues)與 CLUAP1 對 偶基因 (all e 1 e s )。為了維持必須之細胞毒殺性τ淋巴 球誘 發能力 ，可 修飾（插入、加入、刪除及/或取代）一小 數 S (例如 一、二或數個）或小百分比之胺基酸。此處用語 “ 數 個”指 5或 更少個胺基酸’例如4個、3個或更少。 被修 飾之胺: 基酸 之百分比較佳為2 0 %或更少，例如，15 % 或 更 少，且- 甚至 更佳為’ 10%或更少或1至5%。 27 201134480 當使用於文中之免疫治療時，本發明之胜肽應被表現 於一細胞或外吐小體之表面上，較佳作為一具有HLA抗原 之複合物。因此，較佳為選擇胜肽其不止誘導細胞毒殺性 T淋巴球也具有對HLA抗原之高親和力。為達此目的，胜 肽可藉由胺基酸殘基之取代、插入及/或加入來修飾以產生 具經改善之結合親和力的經修飾之胜肽。除了自然表現之 胜肽外，由於已知藉由結合至HLA抗原表現之胜肽序列的 規則（J Immunol 1 994，152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1 994，155: 4307)，可將基於此規則 之修飾引入本發明之致免疫性胜肽。 例如，為了增加HLA-A24結合親和力，可需要以苯丙 胺酸、路胺酸、曱硫丁胺酸或色胺酸取代N端的第二個胺 基酸，及/或以苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或甲 硫丁胺酸取代位於C端之胺基酸。因此，本發明也包括具 有擇自序列辨識號：1至22中之胺基酸序列的胜肽，其中 胺基酸序列之N端的第二個胺基酸被苯丙胺酸、酪胺酸、 甲硫丁胺酸或色胺酸取代，及/或其中胺基酸序列之C端胺 基酸被苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或曱硫丁胺 酸取代。 或者’為了增加HLA-A2結合親和力，可需要以白胺酸 或曱硫丁胺酸取代N端的第二個胺基酸，及/或以纈胺酸或 白胺酸取代位於C端之胺基酸。因此，本發明也包括具有 擇自序列辨識號：23與25至43中之胺基酸序列的胜肽， 其中所述序列辨識號之胺基酸序列之N端的第二個胺基酸 28 201134480 勢 被白胺酸或甲硫丁胺酸取代’及/或其中所述序列辨識號之 胺基酸序列之c端胺基酸被纈胺酸或白胺酸或甲硫丁胺酸 取代。 可將取代引入不止於末端胺基酸，也可於胜肽之潛在 TCR辨認位置。一些研究已證實於一具有胺基酸取代之胜 肽可具有等於或比原來更好的功能，例如CAP 1、p53 ¢264- 2 7 2 h

Her-2/neu U 6 9 - 3 7 7 )或 gplOO ( 2 0 9 - 2 1 7) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47., S. 0. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 and S. 〇. Dionne et al. Cancer Immunology,

Immunotherapy (2004) 53，307-314^ 本發明也考慮一、 一個或數個胺基酸也可被加至本發明胜肽之N及/或c端。 本發明也包括具有高HLA抗原結合親和力且維持細胞毒殺 性T淋巴球誘發能力之此種經修飾的胜肽。 然而’當胜狀序列與—具有不同功能之内生或外生蛋 $質之胺基酸序列的一部份相同時，可能誘導副作用，例 如自體免疫疾病或抗特定物質之過敏症候群。因此，較佳 為使用可知之貝料庫執行同源搜尋以避免胜肽之胺基酸序 列符合其他蛋白質之 疋扣基酸序列的情況。當與目標胜肽比 較時不只存在具有—忐 4兩個胺基酸不同之胜肽的同源搜砰 變得清楚時，為了辦Λ ^Θ加其與HLA抗原之結合親和力，及/ 或增加其細胞毒殺性 夂& 1淋巴球誘發能力而不具副作用之任 何危險，可修飾目標胺基酸。 29 201134480 雖然如上述之具有對HLA抗原高結合親和力的胜肽被 預期為高效能’但根據作為指示之高親和表現而被選擇之 候選胜肽’更進一步被測試細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力 的表現。此處措辭“細胞毒殺性T淋巴球誘發能力”意指 當表現於抗原呈現細胞時’胜肽誘導細胞毒殺性T淋巴球 的能力。此外，“細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力”包括胜 肽誘導細胞毒殺性τ淋巴球活化、細胞毒殺性τ淋巴球增 殖、促進細胞毒殺性τ淋巴球分解目標細胞與增加細胞毒 殺性T淋巴球IFN- 7產生的能力。 藉由誘導攜帶人類MHC抗原之抗原呈現細胞（例如B-淋巴球、巨嗟細胞與樹突細胞）或更專一地來自人類周邊 血液單核細胞之樹突細胞，並在以胜肽刺激之後與CD8陽 性細胞混合，且之後測量由抗目標細胞之細胞毒殺性T淋 巴球產生並釋放之IFN- r來達成細胞毒殺性T淋巴球誘發 能力的確定。如此反應系統，可使用已被產生來表現人類 HLA之基因轉殖動物（例如，於BenMohamed L，KrishnanR, Longraate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependent on MHC (HLA) class II restricted T(H) response中的描述）^例如可以51Cr放射標示目標細胞， 且可從自目標細胞釋放出的放射活性計算細胞毒殺活性。 或者在攜帶經固定之胜肽之抗原呈現細胞存在下，藉由測 30 201134480 量由細胞毒殺性τ淋巴球產生並釋放的IFN-r，且使用抗 IFNi單株抗體來使於培養基上之抑制區可見來分析細胞 毒殺性T淋巴球誘發能力。 由於如上述測試胜肽之細胞毒殺性τ淋巴球誘發能 力’發現擇自由序列辨識號：3、4、5、8、9、1〇、14、15、 ^ 18、23、30、33、34、35、36與38所指出的胺基酸 序列中之九胜肽或十胜肽顯示特別高之細胞毒殺性τ淋巴 球誘發能力與對HLA抗原之高結合親和力。因此這些胜肽 為本發明之較佳實施例。 此外，同源分析之結果顯示那些胜肽不與來自任何其 他已知人類基因產物之胜肽有顯著之同源性。因此當用於 免疫治療時，降低了未知或不需要之免疫反應提升的可能 性。因此，也來自此態樣，這些胜肽提供在癌症病患中引 起抗CLUAP1免疫反應的用途。因此本發明之胜肽較佳為具 有擇自序列辨識號：3、4、5、8、9、10、14、15、16、18、 23、30、33、34、35、36與38之胺基酸序列的胜肽。 除了上述修飾之外’本發明胜肽也可連接其他胜肽， 只要所產生之經連接的胜肽維持原始胜肽之細胞毒殺性τ 淋巴球誘發能力。適合胜肽的例子包括：本發明胜肽或來 自其他腫瘤相關抗原之細胞毒殺性Τ淋巴球誘導胜肽。適 合之胜肽内（inter-peptide)連結器為被本技術領域所熟 知與包括，例如 AAY (P. M. Daftarian et al·，J Trans Med 2007, 5:26) ^ AAA > NKRK (R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000，165: 7308-731 5)或 K (S. Ota el; al 31 201134480

Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J

Immunol. 2002， 168: 5709-5715)。 例如’也可實質同時使用非CLUAP1腫瘤相關抗原胜肽 以增加經由HL A class I及/或class II之免疫反應。其 已相當確認，癌症細胞可表現多於一個腫瘤相關基因。因 此，其為在對於熟悉此技藝人士例行實驗之範圍中以確認 是否一特定個體表現額外腫瘤相關基因，且之後包括來自 此類基因之表現產物的HLA class I及/或class II結合 胜肽於根據本發明之CLUAP1組合物或疫苗中。 HLA class I與HLA class II結合胜肽之例子對於熟 悉此技藝人士而言為已知（例如，參見C〇ui ie，stem Cel Is 13:393-403，1 995 )，且可以一如此處所揭露之那些的類 似方式被使用於發明中。因此，使用分子生物之標準程序， 熟悉此技藝人士可立即製備包括一或多個CLUAP1胜肽與 一或多個非CLUAP1胜狀的多胜肽，或編碼出此類多胜肽的 核酸。 上述此類連結胜肽於此處意指為“多面體 (poly tope)即’兩個或多個潛在免疫原性（immunogeni c) 或免疫反應刺激胜肽的群組’胜肽可互相連接以多種排列 (例如，連成一串或部分重疊）。多面體（或編碼出多面 體的核酸）可以一標準免疫步驟被投予，例如至動物，以 測試多面體於刺激、增強及/或誘導一免疫反應之功效。 胜狀可被直接連接或經由使用位於側面之序列以形成 多面體，且多面體為疫苗之用途為本技術領域所熟知（參 32 201134480 見，Thomson et al·， Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849, 1995; Gilbert et al., Nature

Biotechnol. 15(12):1280-1284, 1997; Thomson et al.， J Immunol. 157(2):822-826, 1996； Tarn et al., J Exp. Med. 1 71 ( 1 ):299-306, 1 990 )。製備並含有抗原決定位之 不同數目與組合的多面體並為了藉由細胞毒殺性T淋巴球 的辨認與為了於增加免疫反應中之功效將其進行測試。 本發明之胜肽可被連接至其他物質，只要所產生之連 結維持原始胜肽之必不可少之細胞毒殺性T淋巴球誘發能 力。適合之物質的例子包括，胜肽 '脂質、糖與糖鏈、乙 醯基，天然與合成之聚合物等。本發明胜肽可包含修飾， 例如醣基化、支鏈氧化及/或磷酸化，其提供修飾不損壞原 始胜肽之生物活性。此修飾可被執行以授予額外之功能（例 如目標功能與傳送功能）或穩定多胜肽。例如，為了 增加多胜肽之穩定度，本技術領域已知引入D_胺基酸、胺 基酸模仿物或非天然胺基酸；此内容也適合本發明之多胜 肽。可以一些方法分析一多胜肽的穩定度。例如，可使用 肽酶與多種生物培養基’例如人類血漿與血清來測試穩 定度（參見，例如 Verhoef et al., Eur j Drug _ Pharmacokin 1986， 11: 291-302)。 、此外如上所提到，在藉由_、二或數個胺基酸殘基 取代刪除或加人之經修飾的胜肽中，可筛選或選擇盘原 :胜肽：較具有相同或較高之活性的那些。因此本發明也 β ’、4選或選擇與原始相較具有相@或較高之活性的經 33 201134480 修飾胜肽的方法 a :將至少一 加入， 說月之方法包括下列步驟： 個本發明胜肽之胺基酸殘基取代、刪除或 b :確定胜肽的活性，與 c:選擇與原始相較具有相同或較高之活性的胜肽。 此處，要被分析之活性可包括MHC結合活性、抗原呈 現細胞或細胞毒殺性T淋P社噠旅处丄… 淋巴球誘發能力與細胞毒性活性。 此處’本發明之胜狀_ "όΓ ϋ 、+，4 « λί 肱乜可被描述為CLUAP1胜肽，，或 “CLUAP1多胜肽”。 III. CLUAP1胜肽之製備 使用熟知之技術可製備本發明之胜狀。例如，使用重 組DNA技術或化學合成可以合成方法地製備胜狀。本發明 胜肽可單獨合成或為包括兩或多個胜肽之較長多胜肽。之 後可分離此胜肽’即純化或分離以使其實質上無其他自然 發生之宿主細胞蛋白質與其片段或任何其他化學物質。本 發明胜肽可包含修飾，例如醣基化、支鏈氧化或磷酸化， 其提供修飾不損壞原始胜肽之生物活性。其他修飾包括可 用來’例如增加胜肽之血清半衰期之D_胺基酸或其他胺基 酸模仿物的合併。 藉由根據經選擇之胺基酸序列的化學合成可獲得本發 明之胜肽。適合此合成之一般胜肽合成方法的例子包括： (i)胜狀合成（peptide Synthesis) Interscience， New York, 1966； 34 201134480 (ii)蛋白質（The Proteins), Vol. 2， Academic Press, New York, 1976; (iii) 胜肽合成（Peptide Synthesis)(in Japanese), Maruzen Co. , 1975; (iv) 胜肽合成之基礎與實驗（Basics and Experiment of Peptide Synthesis) (in Japanese), Maruzen Co., 1985; (v) 藥學的發展（Development of Pharmaceuticals) (second volume) (in Japanese), Vol. 14 (peptide synthesis), Hi rokawa, 1991; (vi) W099/67288 ;以及 (vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2， Solid Phase Peptide Synthesis, Academic Press, New York， 1980， 100-118。 或者’藉由適應任何已知產生胜肽之基因工程方法可 獲得本發明之胜肽（例如，Morrison J，J Bacteriology 1977, 132: 349-51； Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983， 101: 347-62)。 例如，首先製備一適合之載體’其懷有一多核苷酸其編碼 出目標胜肽於一可表達的形式中（例如，調控序列之下游 相當於啟動子序列）’並將載體轉殖進入適合之宿主細胞。 此種載體或宿主細胞也由本發明所提供。之後培養宿主細 胞以產生感興趣之胜狀。使用一 a W加轉譯系統可μ 產生胜肽。 35 201134480 IV ·多核苦酸 本發明也提供-多核苦酸，其編碼出任何本發明上述 之胜肽。這些包括來自自然發生之⑽以基因（GenBank

Accession No. NMJ)1 5041 或關_〇24793 (例如，序列辨識 號：44))的核苦酸序列與具有其之保守修飾之核苦酸序 列的那些。此處措辭“保守修飾之核苷酸序列，，指序列其 編碼出相同或實質上相同之胺基酸序列。由於基因密碼的 退化，一大份之功能相同之核酸編碼出任何已知蛋白質。 例如，密碼GCA、GCC、GCG與GC"編碼出胺基酸丙胺 酸。因此，於藉由一密碼具體指定丙胺酸之每個位置，可 改變密碼《為任何上述不會改變編碼出《胜肽的對應密 碼。此核酸變化為“沈默變化（silent variati〇n)” ，其 為保守修飾變化的一種。此處編碼出一胜肽之每個核酸序 列也描述核酸之每種可能的沈默變化。熟悉此技藝人士明 白於-核酸中各密碼（除了 AUG，其原本為甲硫胺酸之唯 一密碼、與TGG其原本為色胺酸之唯一密碼）可被修飾以 產生一功能相同分子。因此編碼出一胜肽之核酸的各沈默 變化係為於各所揭露之序列中被暗示性描述。本發明之多 核苷酸可由DNA、RNA或其衍生物所組成。如本技術領域所 熟知，DNA分子由鹼基所組成，例如自然發生之鹼基a、τ、 C與G，而T於RNA中為U所取代。熟悉此技藝人士可瞭解 非自然發生驗基也被包含於本發明中。 本發明之多核苷酸可編碼出本發明之多個胜肽，具有 36 201134480 s /、有’丨於中間之胺基酸序列。例如介於中間之胺基酸 序列可提供多核苦酸或經轉譯之胜肽—裂解位（例如酵素 辨 < 序列）。更進—步而言，多核苷酸可包括任何額外之 序列至編碼出本發明胜肽之編碼序列。例如，多核苦酸可 為一重組多核苷酸，其包括胜肽表現所需之調控序列，或 可為一具有標誌基因與此類之表現載體（質體）。一般而 。可製備此重組多核苷酸，藉由經由使用一般重組技術， 例如聚合酶與内切酶之多核苷酸操作。 可使用重組與化學合成技術兩者以產生本發明之多核 苷酸。例如，藉由插進入一適合之載體可產生一多核苷酸， 當轉染進入一勝任細胞時，其可被表現。或者，使用PCR 技術或表現於適合的宿主可將一多核苷酸放大（參見，例 如 Sambrook et al.， Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989) °或者，使用固態技術如於BeaucageSL&IyerRP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984，3: 801-5中所敘述，可合成多核苷酸。 V·外吐小體（exosomes) 本發明進一步地提供稱為外吐小體的胞間囊泡 (intracel lular vesicles)，其呈現形成於本發明之胜肽 與人類白血球抗原表面之間的複合物。利用例如Japanese Patent Application Kohyo Publications Nos. He i 1 1 -5 1 0507與W099/03499所詳述的方法以及從接受治療和 37 201134480 戈預防之病人所#的抗原表現 ^ |備外吐小體。本發 月之外吐J、體可如疫苗般地接種 之方弋 似於本發明的胜肽 包含在複合物中的人類白血球抗原形式必須血需要户 療和/或預防之個體的人類白血球抗原形式相符。例如，於 日本族群中，HLA-A24與HLA_A2,特別是hu_a*24〇2斑 HU-A*〇2〇mA_A*〇2()6為普遍且因此對於日本人病患 的治療而言為適合的。高度表現於日本人與高加索人之中 的A24型或A2型之使用有助於獲得有效的結果，且次型a * 2402與^ 0201與a* 0206也提供用途。一般在臨床上， 需接受治療之病患的人類白血球抗原形式係進行預先的研 究，這可適當地選擇對此抗原具有高度結合親合力的胜肽 或經由抗原表現具有細胞毒性T淋巴細胞誘發性的胜狀。 此外’為了獲得具有高度結合親合力與細胞毒性τ淋巴細 胞誘發性兩者的胜肽’可以天然產生之CLUAP1部分胜肽的 胺基酸序列為基礎，然後進行1、2或數個胺基酸的取代、 插入、刪除及/或添加。 當對本發明外吐小體使用A24型HLA抗原時，具有擇 自序列辨識號：1至22中之序列的胜肽提供用途。或者， 當對本發明外吐小體使用A2型HLA抗原時，具有擇自序列 辨識號：23與25至43中之序列的胜肽提供用途。 VI.抗原呈現細胞

本發明也提供抗經分離之原呈現細胞，其表現以HLA 38 201134480 抗原與本發明胜肽形成的複合物於其表面◦抗原呈現細胞 可來自受到治療及/或避免之病患，且藉由其本身或與包括 本發明之胜肽、外吐小體或細胞毒殺性τ淋巴球之其他藥 物結合可被投予如一疫苗。抗原呈現細胞並不限於特定種 類之細胞，且包括樹突細胞、蘭格罕細胞（Langerhans ce 11 )、巨嗜細胞、B細胞與活化之T細胞，已知其表現蛋 白質（proteinaceous)抗原於其細胞表面以被淋巴球所辨 認。由於樹突細胞為一典型抗原呈現細胞，其於抗原呈現 細胞中具最強之細胞毒殺性T淋巴球誘導作用，樹突細胞 供給使用如本發明之抗原呈現細胞。 例如，藉由誘導來自周邊血液單核細胞之樹突細胞與 之後//? F/ ίΓσ、以F/ FO或7·/7 W叩以本發明胜肽接觸（刺 激）其可獲得一抗原呈現細胞。當本發明之胜肽投予至一 個體’於個體身體内誘導表現本發明胜肽之抗原呈現細 胞。措辭“誘導抗原呈現細胞”包括以本發明之胜肽或編 碼出本發明胜肽之核苷酸接觸（刺激）一細胞，以表現形 成於HLA抗原與本發明胜肽之間的複合物於細胞表面。因 此，藉由在將本發明胜肽投予至一個體後，自此個體收集 抗原呈現細胞可獲得本發明之抗原呈現細胞。或者，藉由 將自個體收集之抗原呈現細胞與本發明胜肽接觸可獲得本 發明之抗原呈現細胞。 可將本發明之抗原呈現細胞投予至一個體以誘導於個 體中之抗癌免疫反應’藉由其本身或與包括本發明之胜 肽、外吐小體或細胞毒殺性Τ淋巴球之其他藥物結合。例 39 201134480 如，^ F/ 投予可包括步驟： a :自一第一個體收集抗原呈現細胞， b .以胜肽接觸步驟a之抗原呈現細胞，以及 c .將步驟b之抗原呈現細胞投予一第二個體。 第一個體與第二個體可為相同個體或可為不同個體。 或者，根據本發明，提供本發明胜肽於製造一誘導抗原呈 現細胞之藥學組合物的用途。此外，本發明提供製造誘導 抗原呈現細胞之藥學組合物的方法或製程。更進一步，本 發明也提供用於誘導抗原呈現細胞之本發明胜肽。自步驟 b獲付之抗原呈現細胞可一為疫苗，用以治療及/或預防癌 症，例如乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、食道癌、胃癌、 瀰漫型胃癌、淋巴癌、神經母細胞瘤、騰臟癌。 根據本發明一方面，本發明之抗原呈現細胞具高程度 細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。在用語“高程度細胞毒殺 性T淋巴球誘發能力”中，高程度相對於藉由抗原呈現細 胞沒有與胜狀接觸或與無法誘導細胞毒殺性T淋巴球之胜 肽接觸的程度。藉由包括k 將編碼出本發明胜肽之 ^核苷Si轉移至抗原呈現細胞的步驟的方法與上述之方 法’可製備此種具高程度細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之 抗原呈現細胞。此經引入之基因可為DNA $ RNA形式。引 入方法的例子包括，並無特別限制，可使用各種於此領域 一般被執行的方法，例如可使用脂質體轉染 (lipofecti on)、電穿孔法（electroporaUon)或碳酸妈方 法更特別地’可執行其如Cancer Res 1996，56: 5672-7; 40 201134480 * J Immunol 1998， 161: 5607-13; J Exp Med 1996， 184: 465-72; Published Japanese Translation 〇f International Publication No. 2000-509281 中所述。 藉由轉移基因進入抗原呈現細胞，基因遭遇轉錄、轉譯與 此類於細胞中’且之後所獲得之蛋白質藉由MHC C1 ass I 或C1 ass 11處理’並經由一呈現途徑進行以與呈現胜肽。 VII.細胞毒殺性T淋巴球 抗任何本發明胜肽誘導之細胞毒殺性T淋巴球增強加 叩以癌症細胞為標的之免疫反應，且因此就其本身而 言，可使用為疫苗以相似於胜肽之方式。因此本發明提供 經分離之細胞毒殺性T淋巴球其藉由任何本發明之胜肽專 一地被誘導或活化。可獲得此種細胞毒殺性τ淋巴球，藉 由（1)將本發明胜肽投予至一個體；或（2)將來自個體之 抗原呈現細胞與CD8陽性細胞或周邊血液單核淋巴球與本 發明之胜肽h κ/π接觸（刺激）或（3)將CD8陽性細胞 或周邊血液單核淋巴球與表現HU抗原與胜肽之複合物： 其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體接觸或（4)引入勺括 編碼出與與本發明胜肽結合之了細胞受體 夕^ 入平儿夕胜肽的 多核皆酸的基因。藉由上述方法可製備此類抗么 或外吐小體’且⑷之方法之詳細被敘述於下$ 、、、田胞 細胞受體（TCR)”的段落中。 Π· Τ 本發明細胞毒殺性Τ淋巴球可來 避免之m藉由其身或與包括本發明之胜^ /或 4芍了調 41 201134480 節作用之外吐小體的其他藥物結合可被投予。所獲得之細 胞毋殺n τ淋巴球起專一抗目標細胞的作用，#目標細胞 其表現本發明胜肽，例如用於誘導之相同胜肽。目標細胞 可為’’’田I其内生性表現，例如癌細胞，或被以 CLUAP1基因轉殖之細胞；且由於藉由胜肽刺激表現本發明 胜肽於細胞表面之細胞，也可做為經活化之細胞毒殺性τ 淋巴球攻擊的目標。 νπ I. τ細胞受體（TCR) 本發明也提供一組合物其包括由編碼出可形成Τ細胞 受體之次單位之多胜肽的核酸，與其使用方法。Τ細胞受 體之次單位具有能力形成τ細胞受體，其授與專一性至抗 腫瘤細胞的Τ細胞，腫瘤細胞表現CLUAP1。藉由使用本技 術領域所知的方法可確認作為細胞毒殺性Τ淋巴球之τ細 胞受體次單元之α -與沒-支鏈的核酸，而細胞毒殺性τ淋 巴球以一或多個本發明之胜肽所誘導W02007/032255與 Morgan et al·，J Immunol, 171，3288 (2003)。例如， 喜好以聚合酶鏈鎖反應方法來分析T細胞受體次單元。用 於分析之聚合酶鍵鎖反應引子可為，例如5’ -R引子 (5， -gtctaccaggcattcgcttcat-3’ ）為 5’ 端引子（序 列 辨識號 ： 46 ) 與 3-TRa-C 引 子 (5，-tcagctggaccacagccgcagcgt-3’ )專一於 T 細胞受 體alpha鏈C區（序列辨識號：47) 、3-TRb-Cl引子 (5，-tcagaaatcctttc1;cttgac-3’ ）專一於 T 細胞受體 42 201134480 beta鏈Cl區（序列辨識號：48 )或3-TRbeta-C2引子（5，- ctagcctctggaatcctttctctt-3’ ）專一於 T 細胞受體 beta 鏈C2區（序列辨識號：49 )為3’ 端引子，但不限於其。 引出之τ細胞受體可以高親合力結合表現CLUAP1胜肽之目 標細胞’且視需要FO與ίΓΟ居中有效殺死表現 CLUAP1之目標細胞。 編碼出Τ細胞受體次單位的核酸序列可合併進入適合 之載體’例如反轉錄病毒載體。這些載體為本技術領域所 熟知。通常包含其之核酸或載體可被轉移至一 Τ細胞，例 如一來自一病患之Τ'細胞。有用地，本發明提供一現成 (off-the-shelf)的組合物允許快速修飾病人所擁有之τ 細胞（或其他哺乳動物之那些）以快速簡單產生具有優秀 之癌症細胞殺死特性的經修飾T細胞。 特定之T細胞受體可專一地辨認本發明之一胜肽與 HLA分子之複合物，當T細胞受體於τ細胞表面時給予τ 細胞抗目標細胞之專一活性。藉由任何已知方法可確認上 述複合物之專一辨認’其較佳例子包括使用HLA分子與本 發明胜肽之HLA多聚體染色（muitimer staining)分析，與 ELISP0T分析。藉由執行ELISp〇T分析，其可確認表現τ 細胞受體於細胞表面上之τ細胞藉由τ細胞受體辨認一細 胞，且訊息傳送於細胞内。當複合物存在於τ細胞表面時 藉由已知方法也可執行上述複合物可給予一 τ細胞細胞毒 性活性的確認。較佳方法包括，例如，抗HLA陽性目標細 胞之細胞毋性活性測定，例如鉻（chr〇m丨um)釋放分析。 43 201134480 本發明也提供細胞毒殺性τ淋巴球，其藉由以編碼出 在HLA-24存在下與例如序列辨識號：3、4、5、r η 0、y、1 〇、 14、15、16與18之CLlJAP1胜肽結合，與以編碼出在h以1 存在下與序列辨識號：23、30、33、34、35、36與38之 胜肽結合的T細胞受體次單位多胜肽的核酸轉導來製備。 經轉導之細胞毒殺性T淋巴球可//? 叩自引導至癌 症、屈胞，且可藉由熟知的培養方法4 叩擴張（例=

Kawakami et al. , J Immunol., 142, 3452-3461 (ig89)} 〇 本發明細胞毒殺性T淋巴球也可用來形成一致免疫組合 物，其於一需要治療或保護之病患中治療或避免癌症為有 效（W02006/031221 )。 避免與預防包括任何活性，其減少死亡率之負載或來 自疾病之死亡率。避免與預防可發生於“初期、第二期與 第一期避免層級”。初期避免與預防避免了疾病之發展， 而第-期與第三期層級之避免與預防包括藉由恢復功能與 減少疾病相關併發症，以疾病之發展與症狀之浮現及減少 已建立之疾病之負向發展的避免與預防為目的。或者，治 療或避免包括一廣範圍之預防疾病治療，纟以減緩特別疾 病之嚴重度為目標，例如減少腫瘤之增殖與轉移、減少血 管新生。 癌症之治療及/或預防，或，及/或其手術後復發的避 免〇括任何下列步驟，例如癌細胞之手術移除、似癌細胞 =生長抑制、腫瘤之衰退或退化、癌發生之減緩與抑制的 έ導腫瘤退化與血管新生抑制的誘導。癌症之有效治療 44 201134480 及/或預防減少致死率與改善具有 瓜屁之個體的預後、減低 癌症輮記於血液中的程度與減緩 牛隨者癌症之可偵測症 狀。例如，症狀之減輕或改善構成有效治療及/或預防，其 包括_、2。％、30%或更加減輕，或穩定疾病。、 ΪΧ.藥學物質或組合物 由於與正常組織相較，CLUAP1表現於癌症中特別被提 尚’癌症的例子包括’但不限於乳癌、子宮頸癌、大腸直 腸癌、食道癌、胃癌、瀰漫型胃癌、淋巴癌、神經母細胞 瘤、騰臟癌，本發明之胜狀或編碼出此類胜肽之多核皆酸 可用於癌症之治療及/或預肖，及/或避免其手術後之復 發。因此’本發明提供一藥學物質或組合物用來治療及/ 或避免其手術後之復發，此類組合物包括_或多個本發明 胜肽或多料酸作為活性成分。或者，本發明之胜肽可表 現於任何前述外吐小體或細胞表面，例如抗原呈現細胞， 以用來作為藥學物質或組合物。此外，上述以本發明任何 胜肽為標的之細胞毒殺性T淋巴球也可用來作為本發明藥 學：質或組合物之活性成分。本發明之藥學物質與組合物 也提仏使用如疫田。在本發明内文中措辭“疫苗，，（也 指-致免疫組合物）意指一物質，其藉由接種至動物具有 誘導抗腫瘤免疫力。 本發明之藥學物質或組合物可用於治療及/或避免癌 症，及/或其手術後復發的避免於一個體或病患中，個體或 病患包括人類與任何其他偶動物，#包括，但不限於小 45 201134480 ’綿羊、山羊、諸、牛、 一商業上重要動物或被 鼠、大鼠、天竺鼠、兔子、猶、狗 馬、猴子、狒拂與黑猩猩，特別是 馴養了的動物。 在另一實施例中， 症或腫瘤之藥學組合物 其擇自： 本發明也在製造用以治療或避免癌 或物質中提供一活性成分的使用， (a) 本發明胜肽； (b) 於一可表現之形式， Λ 編碼出如此處揭露之此種胜 肽的核酸； (c) 表現本發明一胜肽於复^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ 丹衣面上之抗原呈現細胞或 外吐小體；以及 (d) 本發明之細胞毒殺性τ淋巴球。 或者，本發明更提供—用 用以治療或避免癌症或腫瘤的 活性成分擇自： (a) 本發明胜肽； (b) 於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜 肽的核酸； (c) 表現本發明-胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或 外吐小體；以及 (d) 本發明之細胞毒殺性τ淋巴球。 或者，本發明更提供-製造用以治療或避免癌症或腫 瘤之藥學組合物或物質的方法或製程，其中方法或製程包 括將-藥學上或生理上可接受之載體與一活性成分一起配 製的步驟，活性成分擇自： 46 201134480 (a) 本發明胜肽； (b) 於一可表現之形式，編碼 出如此處揭路之此種胜 肽的核酸； (c) 表現本發明—胜狀於1矣二 胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或 外吐小體；以及 (d) 本發明之細胞毒殺性τ淋巴球， 為活性成分。 在另貫施例中，本發明也提供—製造用以治療或避 免癌症或腫瘤之藥學組合物或物質的方法或製程，盆中方 法或製程包括將一藥學上戋生 次玍理上可接受之載體與一活性 成分一起混合的步驟’其中活性成分擇自： (a) 本發明胜肽； (b) 於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜 肽的核酸； (c) 表現本發明—胜狀於其表面上之抗原呈現細胞或 外吐小體；以及 (d) 本發明之細胞毒殺性τ淋巴球。 根據本發明’已發現具有擇自序列辨識號：2至2 2中 之胺基鲅序列的胜肽為hla_A24限制之抗原決定位胜肽或 候選物，且也已發現具有序列辨識號：23與25至43之胺 基鲅序列的胜肽為HLA_A2限制之抗原決定位胜肽或候選 物，其可誘導強而專一之免疫反應。因此包括任一具有序 列辨識號· 3、4、5、8、9、10、14、15、16、18 與 23、 30、33、34、35、％、38之胺基酸序列之胜肽的本發明藥 47 201134480 學物質或組合物特別適合投予HU抗原為分別HLA — 心與 HLA A2之個冑相同的東西提供至包含編碼出任何這些胜 肽之多核皆酸（即，本發明之多核苷酸）㈣學物質絲 合物。 由本發明藥于物質或組合物治療之癌症不限於且包括 其中關於CLUAP1 (例如，為過度表現）之任何之癌症，包 括’例如乳癌、子宮頸癌…大腸直腸癌、食道癌、胃癌、 瀰漫型胃癌、淋巴癌、神經母細胞瘤、胰臟癌。 本發明藥學物質或組合物可包括除了上述活性成分 外’具有誘導細胞毒殺性τ淋巴球抗似癌細胞之能力的其 他胜肽、編碼出此其他胜肽之其他多核苷酸、其他表現此 其他胜肽之細胞或此類。於此，具有誘導細胞毒殺性τ淋 巴球抗似癌細胞之能力的其他胜肽由癌症專一抗原所例示 (例如，經定義之腫瘤相關抗原），但不限於此。若需要， 本發明之藥學物質或組合物可視需要包括其他治療物質為 活性成分，只要此物質不抑制活性成分之抗腫瘤功效， 活性成分例如任何本發明胜肽。例如，配方可包括抗發炎 物質或組合物、止痛劑、化學治療與其類似。除了其他治 :物質於藥劑其本身中’也可將本發明之藥劑與一或多個 〃他藥學物質或組合物相繼或同時投予。藥劑與藥學物質 $組合物的量依照，例如使用何種藥學物質或組合物、要 》台療之疾病與投藥的計畫與方式。 ^應瞭解的是，除了此處特別提及之成分外，本發明之 '于物質或組合物可包括本技術領域一般之其他物質或組 48 201134480 合物，其具有關於討論中之配 中，本發明之缠& 己方形式。在本發明一實施例 二本：月之樂學物質或組合物可被包含於製造之商品* 套組，其包含對於要被治療之 /、 yk m ^ 、扃例如癌症的病理情況 有用之材枓。製造之商品可 藥與铷哲—人 匕括八有一標織之任何本發明 與試管。容的合盗包括瓶、小瓶（V1al) °° 乂成自各種材料，例如玻璃或塑膠。於容 器上之標籤需指出物質或組合物為用來治療或避免疾病之 或多個情況。標籤也可指出投藥指示等。 除了上述容器外’套组包括本發明藥學物質或組合物 可視需要更進一步包括一第二容器，其儲藏一藥學上可接 受之稀釋液。其可更包括商業或使用者觀點需要之其他材 料’包括其他緩衝溶液、稀釋液、濾器、針、注射器與具 有使用說明之包裝插入物。藥學組合物若需要可被呈現於 包（pack)或一分配器，其可包含含有活性成分之一或多 單位劑量形式。包裝可例如包括金屬或塑膠羯，例如一泡 棉箱（blister pack)。包或分配器可伴隨著投藥指示。 (1 )藥學物質或組合物包含胜肽作為活性成分 可直接投予本發明胜肽為一藥學物質或組合物，若需 要的話，其已被一般配方方法所配製。在之後的例子，除 了本發明胜肽外、若適合可包括載體、賦形劑與原始做為 藥物使用之此類而無特別限制。上述載體的例子為滅菌水 生理食鹽水、磷酸緩衝溶液與培養液體（culture nuid) 與此類。更進一步而言，若必須，藥學物質或組合物可含 49 201134480 t疋劑、懸液劑、防腐劑、界面活性劑與此類。本發明之 藥學物質或組合物可用來抗癌目的。 可將本發明之胜肽製備為一組合，其由兩或更多個本 發明之胜肽所組成’以j/2 h叩誘導細胞毒殺性T淋巴球。 胜肽組合可以雞尾酒形式執行或可使用標準技術彼此結 合。例如，胜肽可被化學連接或表現如一單—融合多胜肽 序列’其可具有一或數個胺基酸為連接器（例如，Lysine linker： K. S. Kawamura et al. J. Immunol. 2002, 168: 5709 5715)。結合之胜肽可為相同或不同。藉由投予本發 明之胜肽，藉由HLA抗原，高密度呈現胜肽於抗原呈現細 胞上’之後對形成於呈現胜肽與HLA抗原之間的複合物專 一反應之細胞毒殺性ΐ淋巴球被誘導。或者，抗原呈現細 胞（例如，樹突細胞）自一個體移出且之後以本發明胜肽 刺激以獲得表現任何本發明之胜肽於其細胞表面之抗原呈 現細胞。將這些抗原呈現細胞再投予至該個體以於該個體 中誘導細胞毒殺性Τ淋巴球，且因此可增加朝向腫瘤相關 内皮的侵犯。 驭組合物，其包含 療及/或 發明之胜肽為活性成分，也可包含一已知為有效建立細 免疫力之佐劑。或者藥學組合物可與其他活性成分一起 技予，或以配製成細粒被投予。佐劑指一任何化合物、 f或組合物，當與具有免疫活性之蛋白質一起投予（或 次）時，其增強抗蛋白質之免疫反應。於此考慮之佐劑 i 括於文獻（Clin Microbiol Rev 1 994，7: 277 89)中 50 201134480 描述的那些。適合之佐劑的例子包括，但不限於磷酸鋁、 氮氧化紹、明濛、霍亂毒素、沙門氏菌毒素、佛氏不完全 佐劑（Incomplete Freund，s adjuvant, IFA)、佛氏完全佐 劑（Complete Freund’s adjuvant, CFA)、 ISCOMatrix、 GM_CSF、CpG、0/W乳劑與其類似物。 此外’於微脂體（1 i posome )配方與細粒配方中，胜肽 連結至幾個微米直徑之小珠，且於配方中，可便利地使用 連結至胜肽之脂質。在本發明另一實施例中，本發明胜肽 也可以一藥學上可接受之鹽類被投予。鹽類之較佳例子包 括具有驗金屬之鹽、具金屬之鹽、具有機鹼之鹽、具有機 酸之鹽與具無機酸之鹽。如此處所使用“藥學上可接受之 鹽類意指維持化合物生物有效性與特性及獲得自與無機 酸或鹼，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、曱基磺 酸（methanesulfonic acid)、乙基磺酸（ethanesulfonic acid)、對曱苯磺酸（p — toluenesulf〇nic aCid) ' 水楊酸 (salicylic acid)與其類似物反應的那些鹽。 在一些實施例中，本發明之藥學物質或組合物可更包 括一成分其啟動細胞毒殺性T淋巴球。已定義脂質為可如 以叩啟動抗病毒抗原之細胞毒殺性T淋巴球的物質或組合 物。例如’可將棕橺酸殘基黏附至離胺酸殘基之ε _與以_ 胺基，且之後連結至本發明之一胜肽。之後脂質胜肽可被 直接投予於微胞或顆粒中、併入微脂體或乳化於一佐劑 中。如脂質啟動細胞毒殺性Τ淋巴球反應之另一例子，$ 脂蛋白’例如三軟脂酸-S甘油半胱氨酰—絲氨酰基絲 51 201134480 氨酸（tripalmitoyl-S-giyCerylCySterny_sery卜serine) 可使用來啟動細胞毒殺性T淋巴球，當共價附加至一合適 之胜肽（參見，例如 Deres et al.，Nature 1 989，342: 56 卜 4)。 投藥之方法可為口服、皮膚内、皮下、靜脈内注射或 此類’以及全身投藥或局部投藥至標的位置的鄰近區域。 可執行單次投樂或藉由多次投藥追加。本發明之胜肽劑量 可適合地調整根據要治療之疾病、病患年紀、體重、投藥 方法、與此類，且本發明之胜肽劑量一般為〇. 〇(n mg至 1 0 0 0 mg ’例如0. 1 mg至10 mg，且可於數天至數個月投 藥认。熟悉此技藝人士可適合地選擇一合適的劑量。 (2)藥學物質或組合物包含多核苦酸為活性成分 本發明之藥學物質或組合物也可包含編碼出此處揭露 之胜狀的核酸於一可表達之形式中。此處措辭“於一可表 達之形式中 意指多核普酸，當引入一細胞，//? 會

被表現成一誘導抗腫瘤免疫力之多胜肽。在一代表實施例 中’感興趣之多核苷酸的核酸序列包括對於表現多核苷酸 而言必須之調控要素。可裝配多核苷酸以達到穩定插入目 標細胞之基因體（參見，例如敘述同源重組盒式载體 (cassette vector)的 Thomas KR & Capecchi MR，Cell 1 987, 51: 503-12。也參見，例如 Wolff et al.，Science 1 990， 247: 1465-8; U.S. Patent Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739，118; 5,736,524; 5,679,647;與 WO 52 201134480 98/04720 )。舰輸送技術的例子包括“裸D·”、經促進 (buPiVacaine、聚合物、胜肽居中之）之輸送、陽離子脂 質複合物與顆粒居中之（“基因搶”）或壓力居中之傳送 (參見’例如 U.s. Patent No. 5,922,687 )。 本發明之胜肽也可藉由病毒或細菌載體來表現。表現 載體的例子包括減弱病毒宿主，例如牛痘或禽痘。此方法 包括使用牛痘病毒，例如為一載體以表現編碼胜肽之核苷 酸序列。#由引入一宿主，此重組之牛痘病毒表現致免疫 胜肽且因此引起一免疫反應。於免疫步驟中為有效之牛痘 載體與方法敘述於，例如u_s. Patent N〇. 4,722,848。 另一載體包括 BCG (Baci lie Calmette Guerin)。BCG 載體 敘述於 Stover et al.，Nature 1 991, 35 1: 456-60 中。 對於治療投藥或免疫有用之其他多種載體，例如腺與腺病 毋相關之載體、反轉錄病毒載體、傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhi)載體、經解毒之炭疽毒素載體與其類 似為明顯的。參見，例如Shata et al.，Mol Med Today 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al.， In Vivo 2000， 14: 571_85。 輸送多核苷酸進入一病患可為直接，於其例子中，病 患直接暴露於一攜帶多核苷酸之載體，或為間接，於其例 子中’細胞首先//? f/ 以感興趣之多核苷酸轉形，之後 將細胞轉殖進入病患。此兩方法分別為已知，為 與ez p/fo基因治療。基因治療之方法之大體回顧，參見 Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993，\ 2 . 488-505 53 201134480

Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan,

Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993，11(5): 155-215)。於重組DMA技術中一般熟知的方 法其也可用於本發明’例如，欽述於編者A u s u b e 1 e t a 1., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons’ NY, 1993; and Kr i eger, Gene Transfer and

Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1 990。 投藥之方法可為口服、皮膚内、皮下、靜脈内注射或 此類，以及全身投藥或局部投藥至標的位置的鄰近區域提 供使用。可執行單次投藥或藉由多次投藥追加。於適合載 體中或於以編碼出本發明之胜肽的多核苷酸轉形之細胞中 的多核苷酸的劑量可適合地調整，根據要治療之疾病、病 患年紀、體重、投藥方法、與此類，且本發明之胜肽劑量 一般為〇.001邶至1 000邶，例如0.001邶至1 000 mg， 例如0. 1 mg至10 mg，且可於每數天一次至每數個月一 次投藥。熟悉此技藝人士可適合地選擇一合適的劑量。 X.使用胜肽、少卜吐小體、抗原呈現細月包與細胞毒殺性 τ淋巴球的方法

現細胞與細胞毒殺性T淋巴球。 甘毁來製備或誘導抗原呈 也可使用本發明之外吐小 54 201134480 體與抗原呈現細胞來誘導細胞毒殺性τ淋巴球。胜肽、多 核苦酸、外吐小體與抗原呈現細胞可與任何其他化合物: 合使用’只要化合物不抑制其細胞毒殺性τ淋巴球誘發能 力。因此，任何上述之本發明藥學物質或組合物可用來誘 導細胞毒殺性Τ淋巴球，且除此之外，包括胜肽與多核皆 酸的那些也可用來誘導抗原呈現細胞，如於下所討論。 (1)誘導抗原呈現細胞的方法 本發明提供使用本發明之胜肽或多核苷酸來誘導具有 高細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的方法。 本發明之方法包括h F/FO或7.刀Fi>0將抗原 呈現細胞與本發明胜肽接觸的步驟。例如，h 或“ 將抗原呈現細胞與胜肽接觸的方法可包括步驟： a :自一個體收集抗原呈現細胞；以及 b:將步驟a之抗原呈現細胞與胜肽接觸。 抗原呈現細胞並不限於特定種類之細胞，且包括樹突 細胞、蘭格罕細胞（Langerhans cel 1)、巨嗜細胞、B細胞 與活化之T細胞’已知其表現蛋白質（pr〇teinaceous)抗原 於其細胞表面以被淋巴球所辨認。較佳為可使用樹突細 胞，由於它們於抗原呈現細胞中具有最強的細胞毒殺性丁 淋巴球誘發能力。可使用本發明任何胜肽以它們本身或與 本發明其他胜肽一起。 另一方面，當投予本發明一胜肽至一個體時，抗原呈 現細胞//7 F/ 與胜肽接觸，因此於個體之體内誘導具有 高細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞。因此， 55 201134480 本發明包括投予本發明胜肽至一個體。相似地，當本發明 之多核苷酸投予至-個體於一可表達之形式"，本發明 -胜肽被表現且/…。與抗原呈現細胞接觸以因此於 個體之體内誘導具有高細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力之抗 原呈現細胞。因此’本發明也包括投予本發明多核普酸至 -個體。“可表達之形式，，被定義於上述段落“ιχ•藥學 物質或組合物、⑺藥學物質或組合物包含多核普酸為活 性成分”中。 本發明也可包括將本發明一多核苷酸引入一抗原呈現 細胞以便誘導具有細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力之抗原呈 現細胞的步驟。例如，方法可包括步驟： a ·自一個體收集抗原呈現細胞；以及 b :將編碼出本發明胜肽之一多核皆酸引入。 可如前述段落“ VI ·抗原呈現細胞，’中所述來執行步 驟b。或者本發明提供一製備一專一誘導抗clUAP 1之細胞 毒殺性T淋巴球活性的抗原呈現細胞的方法，其中該方法 可包括下列步驟之一： (a) 將抗原呈現細胞與本發明一胜肽μ F/iro、α κ/ κσ或/·/? κ/ π接觸；以及 (b) 將編碼出本發明胜肽之一多核苷酸引入抗原呈現 細胞。 (2 )誘導細胞毒殺性τ淋巴球的方法 本發明也提供使用本發明胜肽、多核苷酸、外吐小體 56 201134480 或抗原呈現細胞來誘導細胞毒殺性τ淋巴球的方法。 本發明也提供使用編碼出一多胜肽之多核苦酸來誘導 細胞毒殺性τ淋巴球的方法，此多胜肽具形成一 τ細胞受 體次單位的能力，而此Τ細胞受體次單位辨認一本發明胜 肽與HLA抗原之複合物。較佳為，誘導細胞毒殺性Τ淋巴 球的方法可包括至少一步驟擇自由下列之中： a) 將一 CD8陽性Τ細胞與一抗原呈現細胞及/或一外 吐小體接觸，該抗原呈現細胞及/或該外吐小體表現一 HLA 抗原與本發明胜肽之複合物於其表面，以及 b) 將一多核苷酸引入一 CD8陽性T細胞，其中該多 核苷酸編碼出一多胜肽，該多胜肽具形成一 T細胞受體次 單位的能力，而該T細胞受體次單位辨認一本發明胜肽與 HLA抗原之複合物。 當本發明之胜肽、多核苷酸、抗原呈現細胞或外吐小 體被投予至一個體時’於個體體内誘導細胞毒殺性T淋巴 球’且以癌細胞為目標之免疫反應的強度增強。因此，本 發明方法包括將本發明之胜肽、多核苷酸、抗原呈現細胞 或外吐小體投予至一個體的步驟。 或者，藉由ez f/ fo使用它們，也可誘導細胞毒殺性 T淋巴球，且在誘導細胞毒殺性τ淋巴球後，經活化之細 胞毒殺性T淋巴球可返回至個體。例如，方法可包括步驟： a :自一個體收集抗原呈現細胞； b :將步驟a之抗原呈現細胞與胜肽接觸；以及 c :將步驟b之抗原呈現細胞與CD8陽性細胞共培養。 57 201134480 於上述步驟C中要與CD8陽性細胞共培養之抗原呈現 細胞也可藉由將-包括本發明多料酸之基因轉移進入抗 原呈現細胞’如於前述段落“VI•抗原呈現細胞，，中所述 來製備；然而，本發明並不限於此，1包括任何有效表現 HLA抗原與本發明胜肽之複合物於其表面的抗原呈現細 胞。代替此種抗原呈現細胞’也可使用呈現一 h l a抗原與 本發明胜肽之複合物於其表面的外吐小體。換句話說，本 發明也包括’與呈現一 HLA抗原與本發明胜肽之複合物於 其表面的外吐小體共培養之步驟。此種外吐小體可藉由前 述於段落V.外吐小體”中之方法來製備。 此外藉由將一包括編碼出與本發明一胜肽結合之τ 細胞受體次單元的多核苦酸的基因引入CD8陽性細胞也可 誘導細胞毒殺性τ淋巴球。如於前述段πΠΙ. τ細胞 受體（TCR)中所述可執行此轉導。此外，本發明也提供製 造-誘導細胞毒殺性了淋巴球之藥學物質或組合物的方法 或製程，#中該方法包括將本發明之胜肽與藥學上接受之 載體一起混合或配製的步驟。 (3)誘導免疫反應的方法 又’本發明提供誘導抗CLUAP1相關疾病之免疫反應的 方法。適合的疾病包括癌症，其例子包括，但不限於乳癌、 子宮頸癌、大腸直腸癌 '食道癌、[癌、瀰漫型胃癌、淋 巴癌、神經母細胞瘤、胰臟癌。 本發明方法可包括投予含任何本發明胜肽或編碼出其 58 201134480 之夕核苷酸的物質或組合物 们’驟。本發明方法也考慮投 予表現任何本發明胜肽之 Α β “ 卜吐J體或抗原呈現細胞。細節 參見 Ιχ·藥學物質哎组人私，， 之項目，特別是敘述本發 明物質或組合物為疫苗之 κ w㈣分。此外，可被使用於 本發明誘導免疫反廄之古 〜 的本發明外吐小體與抗原呈現 細胞’被詳細描述在前“ 牡引之於ν.外吐小體，，、“νι抗 原呈現細胞”與“ x # m u , al .使用胜肽、外吐小體、抗原呈現細胞 與細胞毒殺性T淋巴球的方法，，之⑴與⑺的項目。本發 明也提供製造—誘導免疫反應之藥學物質或組合物的方法 或製私丨中該方法包括將本發明之胜肽與藥學上接受之 載體一起混合或配製的步驟。 或者本發明方法可包括投予-疫苗或藥學組合物的 步驟，疫苗或藥學組合物包含： (a) 本發明胜肽； (b) 於-可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜 肽的核酸； )表見本毛明⑯肽於其表面上之抗原呈現細胞或 外吐小體；或 (d)本發明之細胞毒殺性τ淋巴球。 在本^明中’以這些活性成份可治療過度表現i 之癌症。此類癌症的例子包括，但不限於乳癌、子宮頸癌、 大腸直腸癌' 食道癌、胃癌、瀰漫型胃癌、淋巴癌、神經 母細胞瘤、騰臟癌。因此，I包括活性成分之疫苗或藥學 組合物的投予前，其較佳為確認與相同器官之正常組織相 59 201134480 較’ CLUAP1之表現程度於要被治療之細胞或組織中是否被 提高。因此，在一實施例中，本發明提供在—需要的病患 中/〇療（過度）表現CLUAP1之癌症的方法，此類方法可包 括步驟： 1)測定獲得自具有癌症要治療之個體的細胞或組織 中的CLUAP1表現程度； i i )與正常控制組比較CLUAP1表現程度；以及 111)投予擇自由上述（a)至（d)所組成之群組的至少一 成份至與正常控制組相較具有過度表現CLUApi之癌症的 個體。 或者，本發明也可提供包含擇自上述（3)至（(1)中之群 組的至少一成份的疫苗或藥學組合物，其要被投予至具有 過度表現CLUAP1之癌症的個體中。換句話說，本發明更提 供鑑定要被以本發明CLUAP1多胜肽治療之個體的方法，此 類方法匕括測疋來自個體之癌細胞或組織中的API表 現程度的步驟’其中與基因之正常控制組相較，此程度增 加指出個體可具有可以本發明 CLUAP1多胜肽治療之癌 症 本發明之治療'癌的方法於以下更詳細敛述。 可將任何源自個體之細胞或組織用於αυΑρι表現之 測定，只要其包括α随之目標轉㈣轉譯產物。適合樣 本的例子包括’但不限於身體組織或液體、例如血液、唾 與尿液較佳為，生物樣本包含一細胞族群，其包括一 上皮細胞’更佳為源自個體之細胞或組織包含一細胞族 群，其包括-上皮細胞，更佳為一癌症上皮細胞或一來自 60 201134480 被懷疑癌化之組織的上皮細胞。此外，若需要，細胞可自 所獲得之身體組織或液體被純化’且之後使用為源自個體 之樣本。 本發明之内容中’測定自已知為非癌症之生物樣本的 控制組程度被意指為一 “正常控制組程度”。另一方面， 控制組程度測定自一癌的生物組織，其意指為一“癌的控 制組程度。可將介於樣本表現程度與控制組程度間的不 同標準化至控制核酸的表現程度，例如管家基因 (housekeeping gene) ’根據細胞之癌症與非癌程度已知其 表現程度並無不同。示範之控制基因包括，但不限於点肌 動蛋白（beta actin)、甘油醛j磷酸去氫酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydr〇genase)與核糖蛋 白P1。要藉由本發明治療之個體較佳為一哺乳類動物。示 範之哺乳類動物包括，但不限於，例如，人類、非人類靈 長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬與牛。 根據本發明，測定獲得自一個體之細胞或組織中的 CLUAP1表現程度。使用本技術領域已知方法可於轉錄（核 酸）產物程度測定表現程度。例如，藉由雜合方法（例^ 北方雜合）使用探針可將CLUAP1的mRNA定量。 曰 μ 士 J "、日日 片、-陣列如此類或執行❹丨。陣列之使用可較佳為用於 偵測CLUAP1表現程度。利用CL_的序列資訊熟 技藝人士可製備此種探針。例如，CLUApi #⑽可被 用為探針。若需要，可以適合之標誌來標誌探針，例如汰 劑、榮光物質與同位素’且基因的表現程度可被侦測二 61 201134480 合標誌的強度。此外，藉由擴大偵測方法 (amplification-base detectin meth〇d)(例如，RT-pcR) 使用引子可將CLUAP1 (例如，序列辨識號：44)的轉錄產 物進行定量。根據基因之可獲得序列資訊可製備此種引子。 特別是’用於本方法之探針或引子於嚴厲 (stringent)、適度嚴厲、低嚴厲條件下雜合至cluapi的 mRNA。如此處使用，措辭“嚴厲（雜合）條件，，意指在此 在條件下探針或引子會雜合至其目標序列，而不是其他序 列。嚴厲條件為序列依賴（seqUence_dependent)，且在不 同環境下會不同。比起較短之序列，於較高溫度下觀察到 較長序列之特定雜合。一般而言，在一定義之離子強度與 pH下所選擇之嚴格條件的溫度為低於一特定序列之熔點 (Tm)約5C °Tm為溫度（在一定義之離子強度與與核酸 濃度下），於其下在平衡下50%之互補至目標序列的探針 雜合至目標序列。由於目標序列通常存在過量，所以於Tm , 在平衡下50%之探針被佔據。一般而言，嚴苛條件為於其 中鹽濃度低於1.0 Μ鈉離子，一般約〇.〇1至1.〇 μ鈉離 子（或其他鹽）於pH 7. 0至8. 3，且對於短探針或引子（例 如’ 10至50個核苷酸）而言溫度為至少約30〇c，對於較 長探針或引子而言溫度為至少約60°C。也可以添加去穩定 物質（destabilizing substances)，例如曱醜胺 (for mam ide)來達到嚴苛條件。 探針或引子可為特定大小。大小的範圍始於至少1 〇個 核苷酸、至少12個核苷酸、至少15個核苷酸、至少20個 62 201134480 =酸、至少25個核Μ、至少3Q個核賴，且探針盘 引子延伸大小始於5,個核普酸、1(M5個核芽酸、Μ。 個核㈣、2G —25個核普酸與25-30個核苷酸。 或者為了本發明之診斷可偵測轉譯產物。例如，可 偵測CLUAP1蛋白質（序列辨識號：45)或其免疫片段之量。 測定作為轉錄產物之蛋白質的量的方法包括免疫分析方 法’其使用-抗體專-辨認此蛋白質。抗體可為單株或多 株此外，抗體之任何片段或修飾C例如嵌合型抗體 (chimeric antlbody) 、 scFv 、 Fab ' F(ab’ ）2 、 π 等）可 被用來偵測，、要片&或經修飾之抗體維持對蛋白 質的結合能力。本發明也提供此類抗本發明胜肽與其片段 之此類抗體。這些用於蛋白質读測之這些種類的抗體的製 備方法為本技術領域所熟知，且任何方法可被使用於本發 明中以製備此種抗體與其等同物（equivalent)。 如根據CLUAP1基因轉譯產物偵測CLUApi基因之表現 程度的另一方法，使用抗CLUAP1蛋白質之抗體經由免疫組 織化學（immunohistochemical)分析可測量到染色強度。 即，於此測量中，強的染色指出蛋白質/程度之增加的存 在，且同時CLUAP1基因之高表現程度。可確認於癌症細胞 中包括CLU API基因之目標基因的表現程度為被提升，若其 相較於目標基因之控制組程度（例如，於正常細胞中的程 度）增加’例如10%、25%、或50%，或增加大於11倍、 大於1.5倍、大於2.0倍、大於5.0倍、大於ι〇·〇倍或更 多。 63 201134480 藉由使用先前自一個體/其疾 ,a A 庆届卩1焱（癌的或非癌的） 二一 的個體收集並儲存的樣本控制組之程度可與癌細胞 同時測疋。此外，獲得自具有癌症要被治療之一器官的非 :區=:細胞被使用為正常控制組。或者，根據獲得 自刀析先則測定之來自其疾病 ΓτΠΛβ1 ^ m 1卸體之樣本中之 CLUAP1基因的表現程度的結果， 稽田統s十方法，可測定控 制，.且之程度。此外，控制組程 ^ ± J兩采自自先前測試細胞 之表現輪廓的資料庫。並且，根 很骒本發明—方面於一生物 樣本中之CLUAP1基因的表現鞀许^ > ^ 又，可與多個控制組程度比 較，其控制組程度被測定自多個 .Λ 夕1固翏考樣本。較佳為使用一 控制組程度測定自一參考樣本， 本，、來自—組織形式相似於 源自個體生物樣本之組織 心式此外，較佳為使用具有已 知疾病階段之群組中的CI I丨A Ρ1甘m

Pi基因的表現程度的標準值 cStandard value)。標準值可獾 ρ ώ u 知早值了獲侍自本技術領域任何已知 的方法。例如，平均值+/_?妒 • Z ‘準差或平均值+/-3標準差， 了被使用為標準值。當與正常控制組程度相較CLUAP1基因 科表現程度被增加或相似/等同於癌控制組程度，可診斷個 體為具有癌症要被治療。 本發明也提供（i)啥齡β τ U) 0斷疋否一個體被懷疑具有要被治 療之癌症，及/或（ϋ )准 選擇要癌症治療之個體的方法，其 方法包括步驟： 、 a)測定在癌症細胞或組織中，cl随的表現程度， 癌症細胞或組織獲得自 破敗疑具有要被治療之癌症的個 體； 64 201134480 b)與正常控制組比較CLUAP1之表現程度； 加 :丨)若CLUAP1之表現程度與正常控制組程度相較被增 則診斷個體為具有要被治療之癌症；以及 d)若個體於步驟）中祜峰 症 鄉C;〒破5乡斷為具有要被治療之癌 JJ選擇要癌症治療之個體。 或者，此種方法可包括步驟： a) 測定在癌症細胞或組織中，⑽Αρι的表現程度， 癌症細胞或組織獲得自 體； 敗疑“要被治療之癌症的個 b) 與癌症控制組比較CLUAP1之表現程度； 度 )右CLUAP1之表現程度相似或等於癌症控制組程 則診斷個體為具有要被治療之癌症；以及 症 d)若個體於步驟c)中被診斷為具有要被治療之癌 則選擇要癌症治療之個體。 本發明也提供-診斷套組以診斷或測定一個體其為或 被懷疑遭受可被以本發明_多胜肽治療之癌症，盆也 在㈣癌症之預後（㈣卿叫及/或監控癌症治療的功效 與適用性中為提供用途，特 行钔馮癌症免疫治療。適合癌症 之說明例子包括，但不限於乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、 食道癌、胃癌、瀰漫型胃癌、淋巴癌、神經母細胞瘤、騰 臟癌。更特別的是，套組較佳包括 王v 用以偵測來自個 體癌細胞中之謝U因的表現程度的試劑，此 被擇自： (〇 —試劑用以偵測CLUApi基因的mRNA; 65 201134480 (b) —試劑用以偵測CLUAP1蛋白質或其免疫活性片 段；以及 (c) 一試劑用以偵測CLUAP1蛋白質的生物活性。 適合用以偵測CLUAP1基因之mRNA之試劑的例子可包 括核酸其專一結合或辨認CLUAP1 mRNA，例如，具有對於 CLUAP1 mRNA之一部分互補的序列的寡核苷酸。這些種類 之寡核苷酸以專一於CLUAP1 mRNA之引子與探針為例子。 根據本技術領域所熟知的方法可製備這些種類之寡核苷 酸。若需要，用以偵測CLUAPl mRNA之試劑可被固定於固 體基質（matrix)上。此外，大於一個之用以偵測 mRNA的試劑可被包含於套組中。 另一方面，適合用以偵測CLUAP1蛋白質或其免疫活性 片段之試劑的例子可包括對於CLUAP1蛋白質或其免疫活 性片段的抗體。抗體可為單株或多株。此外，抗體之任何 片段或修飾（例如嵌合型抗體（chimeric antib〇dy)、 scFv、Fab、F(ab’ ）2、Fv等）可被用來作為試劑，只要片 段或經修飾之抗體維持對CLUAP1蛋白質或其免疫活性片 段的結合能力。這些用於蛋白質偵測之這些種類的抗體的 製備方法為本技術領域所熟知，且任何方法可被使用於本 發明中以製備此種抗體與其等同物（equivalent)。另外， 可以訊號產生分子經由直接連接或一間接標誌技術來將抗 體進行標誌。標誌與標誌抗體之方法與偵測抗體對其目標 的結合為本技術領域所熟知，且任何標誌、與方法可被使用 於本發明。另外’大於一個之用於偵測CLUAP1蛋白質的試 66 201134480 劑可被包括於套組中。 且可包含多於一個之前述試劑。套組可更包括用以 、=口對於CLUAP1基因之探針或對於CLUApi胜肽之抗體的 體土質與试劑、用以培養細胞之培養基與容器、正與負 控制組試劑與用以偵測對於CUApi 肽之抗體的二次抗 體例如，獲得自沒有癌症或遭受癌症之個體的組織樣本 可作為有用的控制組試劑。本發明之套組可更包括商業或 者角度所4之其他材料，包括緩衝溶液、稀釋液、濾 裔/主射針、主射器與具有使用之操作指南的包裝插入物 (例如’書面、磁帶或。卜_等）。這些試劑或此類可保 持於-具有標誌之容器。適合之容器包括瓶子、小玻璃瓶 (V1al)與試驗試管。容器可形成自多樣化之材料，例如玻 璃或塑膠。 在本發明一實施例中，當試劑為抗CLUApi 之探 針時’試劑可被固定於—固體基質上，例如一多孔條 (P㈣US strip)以形成至少—㈣位。多孔條之測量或債 測區可包括複數個位置，各含有—㈣（探針）。一測試 條也可含有負及/或正控制組的位置。或者’控制組之位置 可位於與測試條分離之一條。視需要而定不同之偵測位 可包含不同量之經固定之核冑’即一較高量於第一偵測位 中且-較低含量於隨後之位置中。藉由測試樣本的加入， 顯示可㈣訊號之-些位置提供—於樣本巾⑽ρι雜 存在之量較量指示。偵測位可被設置於任何適合之可偵 測形狀且-般為在橫跨-測試條之寬度的條狀物或點的形 67 201134480 狀中。 本發明之套組可更包括一正控制組樣本或CLUAP1標 準樣本。藉由收集CLUAP1正之樣本可製備本發明之正控制 組樣本且之後分析它們的CLUAP1程度。或者，可將經純化 之CLUAP1蛋白質或多核苷酸加至不表現αυΑρι之細胞以 形成正樣本（positive sample)或CUApi標準樣本。於本 發明中，經純化之CLUAP1可為重組蛋白質。正控制組樣本 之CLUAP1程度為，例如，大於臨界值（cut vaiue)。 在-實施例中’本發明更提供一診斷套組，包括一蛋 白質或其-部份蛋白質’專__辨認本發明抗體或其片段之 能力。此處所考慮之本發明之蛋白質之部分胜肽與免疫活 性片段的例子包括多胜肽，其係由在本發明蛋白f之胺基 酉夂序列中之至）8個，較佳15個、更佳2Q個連續胺基酸 所組成。冑用本發明之一蛋白質或—胜肽（多胜肽），藉 由偵測於-樣本（例如，血液、組織）中之一抗體可診斷 癌症。製備本發明胜肽或蛋白質的方法如上所述。 如上所述，藉由測定介於抗CLUAP1抗體與其在對應控 制、、且中之的量的^異可執行本發明診斷癌症之方法。若個 體之細胞或組織含有抗基因之表現產物（CLUApi)抗體且抗 CLUAP1抗體的量被測定大於在相較於其在正常控制組之程 度中的截斷值時，被體被懷疑遭受癌症。 在另一實施例中，本發明之診斷套組可包括本發明之 胜肽與結合至其之HLA分子。使用抗原胜肽與HLA分子摘 測抗原專一細胞毒殺性τ淋巴球的適合方法已被建立（例 68 201134480 如，Altman JD et al.’ Science. 1 996, 274(5284)： 94-6 )。因此，本發明之胜肽與HLA分子的複合物可應用 至偵測腫瘤抗原專一細胞毒殺性τ淋巴球的偵測方法，藉 此使早期偵測癌症之復發及/或轉移為可能。此外，其可被 用來個體之篩選，個體適合包含本發明胜肽為一活性成分 的藥物，或藥物治療功效的評估。特別是，根據已知方法 (參見，例如 Altman JD et al·，Science. 1996，274(5284): 94 6)可製備放射標諸之HLA分子與本發明胜肽之寡聚 複合物，例如四聚體。可使用複合物來對來自被懷疑遭受 癌症之個體的周邊血液淋巴球（peripheral bl〇〇d lymphocytes)中之抗原-胜肽專一細胞毒殺性τ淋巴球進 行定量。 本發明更k供藉由使用此處敘述之胜肽抗原決定位， 用以評估免疫反應之診斷試劑。在本發明一實施例中，如 上述之HLA限制胜肽被使用為評估或預測一個體之免疫反 應的試劑。藉由將免疫抗原（immun〇gen)與免疫活性細胞 (immUnocompetent)/；7 或 “汴^接觸可誘導要被 評估之免疫反應。在較佳實施例中，用以評估一免疫反應 的免疫活性細胞可選擇自周邊血液、周邊血液淋巴球 (PBL)、與周邊血液單核細胞（PBMCh收集或分離此類免疫 活性細胞的方法為本技術領域所熟知。在特定實施例中， 使用為試劑之物質或組合物可為任何物質或組合物其可導 致抗原專-細胞毒殺性T淋巴球的產±，細胞毒殺性了淋 巴球辨認與結合至胜肽抗原決定位。胜肽試劑必須不被使 69 201134480 用為免疫抗原。用於此類分析之分析系統包括相當新近之 技術發展，例如四聚體，對細胞内淋巴激素（lymph〇kines) 之染色與干擾素釋放分析或EL I SPOT分析。在較佳實施例 中’要與胜肽試劑接觸之免疫活性細胞可為包括樹突細胞 之抗原呈現細胞。 例如’本發明胜肽可使用於四聚體染色分析以評估為 了抗原專一細胞毒殺性τ淋巴球存在之周邊血液單核細 胞’在暴露至腫瘤抗原或一免疫抗原後。Hla四聚體複合 物可被使用來直接顯現抗原專一細胞毒殺性T淋巴球（參 見’例如 〇gg et a 1.，Science 279: 2103-2106，1998; and Altman et al，Science 174 : 94-96，1996 )，並測定於 周邊血液單核細胞之樣本中的抗原專一細胞毒殺性T淋巴 球族群的頻率。使用本發明胜肽之四聚體試劑可如下被產 生。 在對應之HL Α重鏈與/S2-微球蛋白存在下重新折疊結 合至HLA之胜肽，以產生三分子複合物。在複合物中，重 鏈之縮端為經生物素化於一預先設計進入蛋白質之位置。 將卵白素加至複合物以形成由三分子複合物與印白素 (streptavidin)所組成之四聚體。藉由以螢光標誌卵白 素’可使用四聚體來對抗原呈現細胞染色。之後可鑑定細 胞，例如藉由流式細胞技術。此類分析可被用於診斷與預 後（prognostic)目的。藉由此程序之細胞鑑定也可備用於 治療目的。

本發明也k供5乎估免疫收回反應（immune recaH 70 201134480 responses)之試劑（參見’例如 Bert〇ni et al，J. Clin Invest. 100: 5〇3-5i3，1 997 與 penna ai，j EXp. 174: 1565-1 570，1991 )，其包括本發明之胜肽。例如， 為了抗原-專一細胞毒殺性T淋巴球，使用特定專一胜肽， 可分析來自具有要被治療之癌症之個體的病患PBMC樣 本。藉由培養PBMC與以本發明胜肽刺激細胞可評估含單核 細胞之金液樣本。在適合之培養期間後，例如為了細胞毒 殺性T淋巴球活性，分析經擴張之細胞族群。 胜肽也可使用為評估一疫苗功效之試劑。使用例如上 述方法可分析獲自一以一免疫抗原接種之病患的PBMC。病 患為經HLA分型’且選擇辨認表現於病患中之對偶基因 (allelespecific)分子的胜肽抗原試劑以分析。藉由於 PBMC樣本中之抗原決定位-專一細胞毒殺性τ淋巴球的存 在’可h出疫苗之免疫抗原性（immun〇geni City)。本發明 之胜狀也可用來製造抗體，使用本技術領域已熟知的技術 (參見’例如，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY， Wiley/Greene， NY;與 Antibodies A Laboratory Manual,

Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1 989 ) ’其可有效作為診斷、偵測或監測癌症之試劑。此 類抗體可包括辨認於HLA分子内容中之胜肽的那些，即， 結合至胜肽-MHC複合物的抗體。 本發明胜肽或組合物具有一些額外之用途，其之一些 為此處所述。例如，本發明提供診斷或偵測以CLUAPi免疫 活性胜狀之表現為特徵的一疾病。此類方法包含測定於一 71 201134480 生物樣本中之CLUAPl HLA結合胜肽的表現或CLUAPl HLA 結合胜肽之一複合物與HLA class I分子。藉由以對於胜 肽或複合物之結合伙伴（binding partner)分析可測定或 偵測一胜肽之表現或胜肽與HLA class I分子之複合物。 在一較佳實施例中’對於胜肽或複合物之結合伙伴可為一 抗體其辨且專一結合至胜狀。藉由使用CLUAPl引子之標 準PCR放大步驟也可測試於一生物樣本，例如一腫瘤切片 中之CLUAP1的表現。腫瘤表現之例子於此被呈現且示範之 用於CLUAPl放大的條件與引子的更進一步揭露可被發現 於 W02003/27322 中。 較佳診斷方法包含將分離自一個體的生物樣本與專一 於CLUAPl HLA結合胜肽之一試劑接觸以偵測於生物樣本中 之CLUAPl HLA結合胜肽的存在。如此處所使用“接觸”意 指以有效接近試劑方式放置生物樣本且在適合之例如，濃 度、溫度 '時間、離子強度條件下，以允許介於試劑與存 在生物樣本中之CLUAPl HLA結合胜肽的專一互相作用。一 般而言’將試劑接觸生物樣本之條件為熟悉此技藝人士所 知之條件以促進介於分子及於生物樣本中之其同類物 (cognate)(例如，一蛋白質與其受體同類物、一抗體與其 蛋白質抗原同類物、一核酸與其互補序列同類物）之間的 專一互相作用。促進介於分子與其同類物之間的專一互相 作用的不範條件敘述於Low et al所提出之u s. p^ent

No. 5, 1 08, 921。 可在切或以F/ 之一或兩者執行本發明之診 72 201134480 斷方法。因此，在太發明φ + 隹I贫明中生物樣本可位於/77以⑺或 中。例如，生物樣本可為一如組織且專—於 CLUAP1免疫活性多胜肽的試劑可被用來偵測於組織中此類 分子的存在d或者’可//7 _收集或分離生物樣本（例 如血液樣本、腫瘤切片、組織萃取物）。在一特別較佳實 施例中，生物樣本可為一含細胞樣本，更佳為一樣本含有 收集自要被診斷或測試之個體的腫瘤細胞。

或者，藉由使用一方法可執行診斷，此方法藉由以螢 光素（fluoresce in)標誌HLA多聚複合物染色允許抗原一專 一 T細胞的直接定量（例如’ Ai tman, J. D. et al.，1996， Science 274 : 94; Altman, J. D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad· Sci. USA 90 : 1 0330)。也已提供細胞内淋 巴激素（lymphokines)之染色與干擾素釋放分析或ELISPOT 分析。多聚體染色、細胞内淋巴激素染色與EL I SPOT分析 皆顯露比一般分析靈敏至少多10倍（Murali-Krishna，K. et al. , 1 998, Immunity 8 : 177; Lalvani, A. etal., 1997, J. Exp. Med. 186: 859; Dunbar, P. R. etal., 1998, Curr. Biol. 8: 413)。也可使用五聚體（例如，US 2004-209295A )、右聚體（dextramer)(例如，WO 02/072631)、鏈聚體（st rep tamer)(例如，Nature medicine 6· 631-637 (2002))。 例如，在一些實施例中，本發明提供診斷或評估被投 予本發明至少一 CLUAP1胜肽之個體的免疫反應的方法’方 法包括步驟： 73 201134480 (a) 在適合誘導專一於免疫原之細胞毒殺性T淋巴球 的條件下，將免疫原與免疫活性細胞接觸； (b) 偵測或測定於步驟（a )中所誘導之細胞毒殺性τ 淋巴球的誘導程度；以及 (c) 使個體之免疫反應與細胞毒殺性Τ淋巴球的誘導 程度互相關連。 在本發明中，免疫原為擇自序列辨識號：2至23與25 至43之胺基酸序列中的CLUAP1胜肽、具有此種胺基酸序 列的胜肽與具有此種胺基酸序列於其中已被以卜2或更多 胺基酸取代所修飾的胜肽的至少一個。於期間，適合誘導 免疫原專一之細胞毒殺性Τ淋巴球的條件為本技術領域所 熟知。例如，可i η ν i t ro培養免疫活性細胞在免疫存在下 以誘導免疫原專一之細胞毒殺性T淋巴球。為了誘導免疫 原專一之細胞毒殺性T淋巴球’可加入任何刺激因子於細 胞培養物中。例如’ IL-2為細胞毒殺性τ淋巴球誘導之較 佳刺激因子。 在一些實施例中’可在治療前、期間及/或後執行監測 或s平估要被以胜肽癌症治療之個體的免疫反應的步驟。一 般而言，在癌症治療的程序中，一再地將免疫原性胜肽投 予至要被治療的個體。例如，可每週投予免疫原性胜肽達 3 1 〇週。因此，在癌症治療程序期間可評估或監測個體 之免疫反應。或者，對於癌症治療之評估或監測的步驟可 在~療程序元成時。根據本發明，當與控制組相較時，經 增強之免疫原專一之細胞毒殺性τ淋巴球的誘導指出要被 74 201134480 評估或診斷之個體免疫性地對已被投予之免疫原反應。用 以評估s疫反應之適合的控制組包括，例如當免疫活性細 胞未與胜肽接觸或與具有除了任冑cLUApi胜肽之胺基酸 序列的控制組胜肽（例如，隨機胺基酸序列）#觸時的細 胞毒殺性τ淋巴球的誘導程度。 在一較佳實施例中，藉由將介於投予至個體之各個免 疫原間的免疫反應進行比較，以序列專—方式來評估個體 之免疫反應。特別是，甚至當將CLUAP1胜肽之一些種類的 此合物投予至個體時，依據胜肽免疫反應可成多樣化。在 此例子巾冑由將介於各個胜肽間的免疫反應進行比較， 可確認出對於其個體顯示較高反應之胜肽。 XI.抗體 本發明提供抗體其結合至本發明胜肽。較佳抗體專一 結合至本發明胜肽且不會結合（或微弱結合）至非本發明 胜肽。或者抗體結合本發明胜肽與其同源物（h〇m〇1〇gs)。 抗本發明胜肽之抗體可提供用途於癌症診斷與預後分析及 成像方法（丨1^§丨叱1^讣〇(1〇1(^45)。相似地，對於在癌症 病患中也表現或過度表現CLUAP1程度而言，此類抗體可提 供使用於其他癌症之治療、診斷，及/或預後。此外，細胞 内表現之抗體（例如，單鏈抗體）可在治療與CLUApi之表 現相關的癌症中提供治療用途，與CLUApi之表現相關的癌 症例子包括，但不限於，乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、 食道癌、胃癌、瀰漫型胃癌、淋巴癌、神經母細胞瘤、胰 75 201134480 臟癌。 本發明也提供CLUAP1蛋白質（序列辨識號：45)或其 片段之偵測或定量的各種免疫活性分析，CLUAP1蛋白質（序 列辨識號：45)或其片段包括具有擇自序列辨識號：3'4、 5、8、9、10、14、15、16、18、23、30、33、34、35、36 與38中之胺基酸序列之多胜肽。此類分析可包括一或多個 具辨認及結合CLUAP1蛋白質或其片段之能力之抗CLUAP1 抗體為適當的。在本發明内容中，與CLUAP1多胜肽結合之 抗CLUAP1抗體，較佳為辨認一多胜肽，此多胜肽為具有擇 自序列辨識號：3、4、5、8、9、10、14、15、16、18、23、 30、33、34、35、36與38中的胺基酸序列。以抑制測試 (inhibition test)可確認抗體之結合專一性。其為，在具 有擇自序列辨識號：3、4、5、8、9、10、14、15、16、18、 23 ' 30、33、34、35、36與38中之胺基酸序列之任何片 段多胜肽存在下’當介於要被分析之抗體與全長之CLUAP1 胜肽之間的結合被抑制時，其顯示此抗體專一結合至片 段。在本發明内容中，在包括，但不限於放射免疫分析 (radioimmunoassays)、 免疫色層分析技術 (immuno-chromatgraph technique)、酵素連結免疫吸附分 析（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)、酵素 連結免疫螢光分析（enzyme- linked immunofluorescent assays，ELIFA)專之多種本技術領域熟知之免疫分析形式 中執行此類免疫分析。 本發明之關於免疫，但非抗體分析也可包括T細胞致 76 201134480 免疫性分析（immunogenicity assay)(抑制或刺激）與主 要組織相容性複合物（ma jor hi stocompat ibi 1 i ty CQmpiex 結合分析。此外’本發明考慮具偵測表現CLUAP1之癌症之 能力的免疫成像分析，其例子包括，但不限於使用本發明 之經標誌的抗體的放射顯像成像（radio sCintigFaphie 11^§丨叫）方法。此類可分析在（^1^?1表現之癌症谓測、監 控與預後中提供臨床用途，CLUAP1表現之癌症，其例子包 括’但不限於’乳癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、食道癌、 月癌、/彌漫型月癌、淋巴癌、神經母細胞瘤 '胰臟癌。 本發明也提供結合至本發明胜肽的抗體。本發明抗體 可使用於任何形式中’例如單株或多株抗體，且可更包括 獲得自將動物，例如兔子，以本發明胜肽進行免疫之抗血 清、所有類型之多株或單株抗體、人類抗體與由基因重組 產生之人源化抗體。使用為一抗原以獲得一抗體之本發明 胜肽可來自任何動物種類，但較佳為來自哺乳動物例如， 類老鼠或大鼠’更佳為一人類。人類來源胜狀可獲得 自此處揭露之核苷酸或胺基酸序列。 根據本發明，使用為免疫抗原之胜肽可為一完整之蛋 白質或部分胜肽之蛋白冑。部分胜肽可包括，例如，本發 明之一胜肽之胺基（N)端或羧基（C)端片段。此處，一抗體 被定義為-蛋白質其與CLUApi胜肽之全長或片段反應。在 車又佳實鈿例中，本發明之抗體辨認CLUApi片段胜肽其 具有擇自序列辨識號：3、4、5、8、9、10、14、15、16: M 、35、36與38中的胺基酸序列。合 77 201134480 成券胜狀的方法為本技術領域所熟知。在合成後’在使用 為免疫抗原（immunogen)前，胜肽可視需要被純化。在本發 明内容中，寡胜肽（例如9或員）可與載體結合或連結 以增強致免疫性。鑰孔血藍蛋白（Keyhol卜limpet hemocyanin，KLH)被熟知為載體。結合鑰孔血藍蛋白與胜 狀的方法為本技術領域所熟知。 或者’可將編碼出本發明一胜肽或其片段的一基因插 入一已知的表現載體’其之後被轉形至一宿主細胞，如於 此所敘述。藉由任何標準方法，所需之胜肽或其片段可自 宿主細胞之外部或内部被重新獲得，且之後可被使用為一 抗原。或者，可將表現胜肽之整個細胞或其細胞萃出物或 一化學合成胜肽使用為抗原。 可以抗原將任何哺乳動物進行免疫，但較佳為考慮與 用來細胞融合之親代細胞的相容性。一般而言使用嚅齒 目（Rodentia)、兔形目（Lagomorpha)或靈長目 (Primates)。嗡齒目的動物包括，例如小鼠、大鼠與倉鼠。 兔形目的動物包括，例如兔子。靈長目的動物包括，例如 狹鼻類（舊世界猴），子，例如馬來猴（Macaca fascicularis)、獼猴（rhesus monkey)、聖狒狒（sacr d baboon)與黑猩猩（chimpanzees)。 以抗原免疫動物之方法為本技術領域所熟知。抗原之 腹腔内注射（intraperit〇neai injecti〇n)或皮下注射 (subcutaneous in jection)為免疫哺乳動物之一標準方 法。更特別地，可將抗原稀釋或懸浮於一適合量的：酸鹽 78 201134480 緩衝/合液、生理食鹽水等。若需要可將抗原懸浮液與適 合量之標準佐劑，例如佛氏完全佐劑（Freund's complete d juvant)/tti合，製成乳狀液（emuisi〇n)並且之後投予至哺 乳動物。較佳為其之後投予與適合量之佛氏不完全佐劑 (Freund’s incomplete adjuvant)混合的抗原每 4 至 21 天也可使用一適合之載體來免疫。於上述免疫後，藉由 為了增加所需之抗體量標準方法可檢驗血清。 藉由自被檢驗以增加於血清中之抗體量的經免疫動物 收集血液解藉由以任何一般方法自血液分離血清，可製備 抗本發明胜肽之多株抗體。多株抗體包括含多株抗體的血 β，與含可自血清分離多株抗體的部分（fracti〇n)。例如 使用與本發明胜肽結合之親合管柱且更進一步使用蛋白質 或蛋白質G管柱純化此部分，可自僅辨認本發明胜肽之 部分純化免疫球蛋白G或Μ。 為了製備單株抗體，自如上所述經以抗原免疫並確認 於血清中所需抗體之增加程度的哺乳動物收集免疫細胞且 使免疫細胞遭遇細胞融合。用來細胞融合之免疫細胞，較 佳為獲自脾臟。其他要被與上述免疫細胞融合之親代細胞 匕括例如’哺乳動物之骨髓瘤（mye 1 oma)，且較佳為具有 乂藥物筛選之融合細胞之獲得特性的骨髓瘤細胞。根據已 法例如 Milstein et al. (Galfre and Milstein，

Methods Enzym〇i 73: 3-46 (1981 ))的方法，可將上述免 疫細胞與骨髓瘤細胞融合。 獲自細胞融合之產生的融合瘤，藉由將它們培養於標 79 201134480 準篩選培養基，例如hat培養基（含亞黃嘌呤 (hypoxanthine)、氨蝶呤（amin〇pterin)和胸腺嘧啶 (thymidine)之培養基），可被篩選。通常持續細胞培養於 HAT培養基數天至數週，時間為允許除了所需融合瘤外之 其他細胞（非融合細胞）死亡。之後，可執行標準限制稀 釋以篩選並複製產生所需抗體之融合瘤。 除了於其中為了製備融合瘤、以一抗原免疫一非人類 動物的上述方法，可以胜肽、表現胜肽之細胞或其細胞萃 取物//7 hiro免疫人類淋巴細胞，例如被eb病毒感染的 那些。之後，將經免疫之淋巴細胞與具不明確分裂能力之 來自人類之骨髓瘤’例如U266融合，以產生一產生所需人 類抗體之融合瘤，所需之人類抗體可與可被獲得之胜肽結 合（Unexamined Published japanese Patent AppUcati〇n No. Sho 63-17688)。 將所獲得之融合瘤之後轉植進入小鼠之腹腔且萃取腹 水。可純化所獲得之單株抗體，藉由例如硫酸銨沉殿、一 蛋白質A或蛋白質G管柱、DEAE離子交換色層分析或一與 本發明胜肽結合之親和管柱。本發明抗體不只可被使用來 純化偵測本發明胜肽，也可作為本發明胜肽之促進劑與拮 抗劑的候選物。 或者，一產生抗體之免疫細胞，例如一經免疫之淋巴 細胞可藉由一致癌基因以永生或被使用來製備單株抗體。

也可使用基因工程技術來重組製備因此獲得之單株抗體 (參見，例如 B〇rrebaeck and UrHck，TherapeutU 80 201134480

Monoclonal Antibodies, published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD ( 1 990))。例如， 一編碼出抗體的DNA可自一免疫細胞，例如產生抗體之— 融合瘤或一經免疫的淋巴細胞被複製，插入一適合之載 體’且引入一宿主細胞以製備重組抗體。本發明也提供如 上述製備之重組抗體。 此外，本發明抗體可為一抗體之片段或經修飾之抗 體’只要其結合一或多個本發明之胜肽。例如，抗體片段 可為Fab、F(ab )2、Fv或單鍵Fv (scFv)，於其中來自重 與輕鏈的Fv片段藉由合適的連結器來連接（Hustcm et

Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 ( 1 988))。更特別 是’藉由以酵素例如木瓜酵素或胃蛋白酶處理抗體可產生 抗體片段。或者’編碼出抗體之基因可被構築、插入一表 現載體且表現於一適合的宿主細胞中（參見，例如C〇 e t a J . J Immunol 152: 2968-76 (1994); Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986); Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991))。藉由與各種分子， 例如聚乙二醇（polyethylene glyc〇i，PEG)結合可修飾抗 體。本發明提供此類經修飾之抗體。藉由化學修飾一抗體 可獲知·經修飾之抗體。這些修飾方法為本技術領域中所常 見。 81 201134480 或者’本發明之抗體可被獲得為嵌合抗體，介於來自 非人抗體之可變區與來自人類抗體之固定區之間，或為人 源化抗體’包括來自非人抗體之互補決定區、架構作用區 (frame work region，FR)與來自人類抗體之固定區。根據 已知方法可製備此類抗體。藉由齧齒類互補決定區之序列 取代人類抗體對應之互補序列可執行人源化（參見，例如

Verhoeyen et al·， Science 239:1534-1536 (1988))。 因此，此類人源化抗體為嵌合抗體，其中實質上少於完整 之人類可變區已被以來自非人種類之對應序列取代。 也可使用包括人類可變區、架構作用區與固定區的全 人類抗體。使用各種本技術領域所知的技術可產生此類抗 體。例如，in vitro方法包括呈現於噬菌體上之人類抗體 片段的重組資料庫的使用（例如，H〇〇genb〇〇m & Winter， Μ〇1· Biol· 227:381 ( 1 991 ))。相似地，藉由將人類免疫 球蛋白基因座（l〇ci)引入轉殖動物，例如於其中内生免疫 球蛋白基因已被部分或完全去活化的小鼠，可製造人類抗 體。此方法被敘述，例如於U. s. Patent Nos. 6, 1 50, 584, 5’545,807; 5, 545, 806; 5, 569, 825; 5, 625, 126； 5, 633, 425; 5, 661，016。 獲自上述之抗體可被純化至同質（homogenei ty)。例 如，根據用於一般蛋白質的分離與純化方法可執行抗體之 分離與純化。例如，藉由合適地選擇與結合管柱色層分析、 過濾超過濾、鹽析、透析、對鈉十二烷基的硫酸鹽聚丙 烯酰胺凝膠電泳（SDS polyacrylamide gel 82 201134480 electrophoresis)、等電焦集法（isoelectric focusing) 的使用可分開與分離抗體（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988))，但不限於此。蛋白質A管柱與蛋白 質G管柱A可被使用為親合管柱。要被使用之示範的蛋白 質 A 管柱包括，例如 Hyper D、P0R0S 與 Sepharose F. F. (Pharmacia) ° 除了親合，示範之色層分析包括，例如離子交換色層 分析、疏水色層分析、膠體過濾、逆向色層分析、吸附色 層分析等（Strategies for Protein Purification and

Characterization： A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1 996))。藉由液相色層分析’例如Ηριχ 與FPLC可執行色層分析步驟。 例如，可使用吸收之測量、酵素連結免疫吸附分析 (ELISA)、酵素免疫分析（EIA)、放射免疫分析及/或免疫螢 光以測量本發明抗體之抗原結合活性。在酵素連結免疫吸 附分析中，本發明抗體為固定於一培養盤上，提供本發明 胜肽至一培養盤，且之後提供含所需抗體之樣本，如，產 生抗體之細胞的培養懸浮液或經純化的抗體。之後，提供 辨認第一抗體且被標誌酵素，例如鹼性磷酸酶之第二抗 體，且之後培養培養盤。接著在清洗後，將酵素受質，例 如對硝基苯磷酸（P-nitr〇phenyl ph〇sphate)，加至培養 盤，並測量吸收以評估樣本之抗原結合活性。胜肽之片段， 83 201134480 例如c端或N端之片段可被使用為抗原以評估抗體結合活 隹根據本發明，可使用BIAcore (Pharmacia)來評估抗 體的活性。 上述方法允許本發明胜肽之偵測或測量，藉由露出本 發明抗體至假定含本發明胜肽之樣本並偵測或測量由抗體 與胜肽所形成之免疫複合物。由於根據本發明之偵測或測 量方法可專一偵測或測量胜肽，方法在使用胜肽之各種實 驗中為有用的。 X11 ·載體與宿主細胞 本發明也提供載體與宿主細胞，於其中將編碼出本發 明胜肽之核苷酸引入。本發明之載體可用於維持本發明核 苷酸，特別是DNA於宿主細胞中以表現本發明胜肽，或為 基因治療以投予本發明本發明核苷酸。

當E. coli為宿主細胞且載體被放大且大量製造於E coll (例如，JM109、DH5 alpha、HB101 或 XLlBlue)中時， 載體具有要被放大於E_ c〇li中之“ori”且篩選轉形E. c〇li之標誌基因（例如，藉由安比西林（ampiciUin)、四 環黴素（tetracycline)、卡那黴素（kanamycin)、氯黴素 (&1〇1^111汕611泌〇1)或類似物篩選之一抗藥基因）。例如， 可使用M13-系列載體、PUC-系列載體、pBR322、 pBlueScript、pCR-Script 等。此外，pGEM_T、pDIRECT 與 pT7也可被用來次複製與萃取cDNA與上述載體。當載體被 用來產生本發明蛋白質時，一表現載體可提供使用。 84 201134480 例如，要被表現於E. col i中之一表現載體應具有上 述特徵以被放大於E. col i中。當使用E. c〇i i，例如 JM109、DH5 alpha、HB101 或 XLlBlue 為宿主細胞時，載 體應具有啟動子（promoter)，例如iacz啟動子（Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989); FASEB J 6: 2422-7 (1992)) 、araB 啟動子（Better et al.， Science 240: 1041-3 (1988))、T7啟動子或類似物，其可有效表現所需 基因於E. col i.中。基於那方面，可使用，例如pGEpsxi (Pharmacia), "QIAexpress system" (Qiagen)、pEGFP 與 PET(於此例子，宿主較佳為BL21，其表現T7RNA聚合酶）， 取代上述載體。另外’載體也可含用於胜肽分泌之訊號序 列。一引導要被分泌之胜肽至E. col i的胞膜間區 (periplasm)的示範之訊號序列為pelB訊號序列（Lei et al·，J Bacteriol 1 69: 4379 ( 1 987))。將載體引入目標 宿主細胞的方式包括，例如，氯化辦方法，與電穿孔 (electroporation)方法。 除了 E. col i，例如來自哺乳動物之表現載體（例如 pcDNA3 (Invitrogen)與 pEGF-BOS (Nucleic Acids Res 18( 1 7): 5322 ( 1 990))，PEF，PCDM8)、來自昆蟲細胞之表 現載體（例如、"Bac-to-BAC桿狀病毒表現系統 (baculovirus expression system)" (GIBC0 BRL)、 pBacPAK8)、來自植物之表現載體（例如，pMH1、pMH2)、 來自動物病毒之表現載體（例如、PHSV、pMV、pAdexLcw )、 來自反轉錄病毒之表現載體（例如，pZipne0)、來自酵母 85 201134480 菌之表現載體（例如，"Pichia Expression Kit” (Invitrogen)、pNVU、SP-Q〇i )與來自枯草桿菌（Baci i lus subtilis)之表現載體（例如，pPL6〇8，pKTH5〇)可被用 來產生本發明之多胜肽。 為了在於動物細胞’例如CH0、C0S或NIH3T3細胞中 表現載體，載體應具有表現於此類細胞中所必須的啟動 子，例如 SV40 啟動子（Mul 1 igan et al.，Nature 277: 108 ( 1 979))、MMLV-LTR 啟動子、EF1 alpha 啟動子（Mizushima et al.’ Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)) 、 CMV 啟 動子等，與篩選轉形物的標誌基因（例如藉由藥物篩選（例 如，新黴素（neomycin)、G418之抗藥基因）較佳。具又這 些載體特徵的已知載體的例子包括，例如pMAM、pDR2、 pBK-RSV 、 pBK-CMV 、 pOPRSV 與 p0P13 。 呈現下列實施例以說明本發明與以協助熟悉此技藝人 士製造與使用本發明。實施例並不傾向於在其他方面限制 本發明範圍任何方式中。 【實施例】 材料與方法 細胞株

HLA-A 外匕母細胞株 (lymphoblastoidcell line)為購自職細胞與基因銀行 (SeaUie，WA)q2、HLA_A*〇2〇1陽性人類b淋巴母細胞 株與C0S7、非洲綠猴腎細胞株為自ATCC所購得。 86 201134480 來自CLUAPI之胜肽的候選物選擇 使用 結合預 測 軟 體 "BIMAS" (www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind) (Parker et al.(J Immunol 1994， 152(1): 163-75)， Kuzushima et al.(Blood 2001， 98(6): 1872-81))與"NetMHC 3.0" (www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) (Buus et a 1. (Tissue Antigens., 62:378-84， 2003)， Nielsen et al. (Protein Sc i., 1 2:1 007-1 7, 2003, Bio i nformat i cs, 20(9):1388-97, 2004))預測來自 CLUAP1 之 9 員與 10 員胜 狀’其結合至HLA-A 2402或HLA_A*0201分子。這些胜狀 係根據一標準固相合成方法由Biosynthesis (Lewisville, TX)來合成且藉由逆相高效能液體層析（reverse(j phase high performance liquid chromatography, HPLC)來純 化。分別藉由分析型HLPC與質譜分析確認這些胜肽之純度 (>90%)與身份（identity)。將胜肽溶解於二曱基亞砜 (dimethylsulfoxide, DMS0)中於 20 mg/ml 且儲存於 -80〇C。 I n v i t r 〇細胞毒殺性τ淋巴球誘導 使用來自單核白血球之樹突細胞做為抗原呈現細胞以 誘導抗表現於人類白血球組織抗原（HLA)上之胜肽的細胞 毒殺性T淋巴球反應。//?".⑽產生樹突細胞如別處所述 (Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14)： 87 201134480 4112 8)特別地，由 Ficol 1-Plaque (Pharmacia)溶液分 離自一正常自願者（Hla-A* 2402或HLA-A* 020 1陽性）之周 邊血液單核細胞，藉由貼附至一塑膠組織培養盤（Becton Dickinson)來分離以豐富其如一單核白血球部分。將經豐 s單核白血球之族群培養在1〇〇〇 u/ml之人類顆粒-巨噬細 胞群落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor， GM-CSF) (R&D System)與 1 000 U/ml 之白細胞介素（inter ieukin，IL)_4 (R&1) System) 存在下於含2%之熱去活性自身取得血清（aut〇1〇g〇us serum, AS)之 AIM-V 培養基（invi trogen)中。培養 7 天後， 於AIM-V培養基中，於3 μ g /ml之召-2微球蛋白（beta 2-microglobulin)存在下以20 vg/ml之各合成胜肽脈衝 (pulsed)細胞激素誘導之樹突細胞3小時於37°c。 所產生之細胞顯示表現樹突細胞相關分子，例如 CD80、CD83、CD86與HLA Class 11於其細胞表面（資料 未顯示）。之後以X-射線（20 Gy)將這些胜肽脈衝之樹突 細胞去活性且將其以1 : 2 0之比例與自身取得c D 8陽性T 細胞混合’ CD8陽性T細胞藉由以CD8 P〇sitive Isolatiori Ki t (Dynal)正選擇獲得。這些培養物設置於48孔盤 (Corning);各孔含1. 5 X 104胜肽脈衝之樹突細胞、3 χ ι〇5 CD8 陽性 Τ 細胞與 1 0 ng/ml 之 IL-7 (R&D System)於 0· 5 ml之AIM-V/2%自身取得血清培養基中。三天之後，以 IL_2(CHIR0N)添加至培養物至終濃度為20 IU/mh第7天 與第14天更以自身取得胜狀脈衝之樹突細胞進一步刺激τ 88 201134480 細胞。 以與上述相同之方法每次製備樹突細胞。於第21天， 第三輪之胜肽刺激後，將細胞毒殺性T淋巴球進行抗胜肽 脈衝之TISI細胞（A24)或T2細胞（A2)測試（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al.，Cl in Cancer Res 2004 Dec 15，10(24): 8577-86;

Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9； Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8)： 498-506)。 細胞毒殺性T淋巴球擴張步驟 使用與由 Riddel letal. (Walter EAetal.，N Engl J Med 1 995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddel 1 SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23)敘述之相似方法於培養 中擴張細胞毒殺性T淋巴球。全部5 x 1 〇4細胞毒殺性τ 淋巴球懸浮於25 ml之含有由MMC去活化之兩種人類β類 淋巴母細胞株之AIM-V/5%自身取得血清培養基，在40 ng/ml之抗-CD3單株抗體（Pharmingen)存在下。在開始培 養1天後，120IU/ml之IL-2加入培養中。於第5、8、11 天以新鮮之含30 IU/ml之IL-2的AIM-V/5%自身取得血清 培養基提供給培養物（Tanaka H et al.，Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1)： 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 200 1 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer 89 201134480

Res 2004 Dec 1 5, 1 0(24): 8577-86; Suda T et al. , Cancer

Sci 2006 May, 97(5): 41 卜9; Watanabe T et al.，Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。 細胞毒殺性T淋巴球複製（ci〇ne)的建立 稀釋以使細胞毒殺性T淋巴球以0. 3、1與3細胞毒 殺性Τ淋巴球/孔的含量於96圓底（round-bottomed)微效 價盤（Nalge Nunc International)中。細胞毒殺性τ淋巴 球與1 X 104細胞/孔之2種兩種人類B類淋巴母細胞株、 30 ng/ml之抗-CD抗體與125 U/ml之IL-2於全部150 μ 1 /孔之含5%自身取得之血清的AIM-V培養基中一起培養。 10天後將50 // 1/孔之IL-2加入培養基中以達到i25U/ml IL-2之終濃度。於第14天測試細胞毒殺性τ淋巴球之活 性，且使用上述相同方法擴張細胞毒殺性T淋巴球複製 (Uchida N et al. , Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。 專一之細胞毒殺性T淋巴球活性 為了測試專一之細胞毒殺性T淋巴球活性，執行 IFN-τ酵素結合免疫斑點（ELISp〇T)分析與酵素結 合免疫吸附（ELISA)分析。特別地’製備胜肽脈衝之 TISKA24)或T2(A2)(1 X i〇4/weii)為刺激細胞。培養之細 201134480 胞於48孔中做為應答細胞。在製造商步驟下執行ifn— γ 酵素結合免疫斑點分析與IFN_ r酵素結合免疫吸附分析。 強有力地表現目標基因與HLA_24或Hu_A2任一或兩 者的細胞的建立 藉由PCR將編碼出目標基因之開放讀框或hla_a24或 HLA-A2之cDNA放大。將PCR放大產物複製進一載體。使 用 lipofectamine 2000 (invitrogen)，根據製造商建議 步驟將質體轉染進C0S7，其為一目標基因與HU_A24與A2 無效細胞株。於自轉染後2天，以versene (Invitr〇gen) 收集經轉染的細胞且使用為細胞毒殺性τ淋巴球活性分析 之目標細胞（5 X l〇4/well)。 結果1 於癌症中增強之CLUAP1表現 使用c-DNA微陣列獲得自各種癌症之廣泛基因表現概 况（profile)顯示 CLUAPl ( GenBank Accession No. 匪一01 5041或NM—024793;例如，序列辨識號：44)被提升。 與對應之正常組織比較，乳癌中7 7個有17個、子宮頸癌 中1 9個有1 5個、大腸直腸癌中1 9個有12個、食道癌中 19個有12個、胃癌中25個有7個、瀰漫型胃癌中5個有 5個、淋巴癌中18個有5個、神經母細胞瘤中16個有2 個、騰臟癌中9個有4個，有根據地提升CLUAP1表現（表 1) ° 91 201134480 表1、與對應之正常組織比較，於癌症組織中觀察到 CLUAP1之向上調控之例子的比例 癌症/腫瘤 比 乳癌 17/77 子宮頸癌 15/19 大腸直腸癌 12/19 食道癌 12/19 _胃癌 7/25 觸漫型胃癌 5/5 淋巴癌 5/18 神經母細胞瘤 2/16 騰臟癌 4/9 結果2 來自CLUAP1之HLA-A24結合胜肽的預測 表2a與2b以最高之結合親和力之順序顯示CLUAP1之 HLA-A24結合9員與1〇員胜肽。藉由BIMAS來預測序列辨 識號：1至11與序列辨識號：15至22的胜肽而藉由 NetMHC3. 0來預測序列辨識號：12至14的胜肽。總共22 個具有潛在HLA-A24結合能力之胜狀被選擇且將其試驗以 確定抗原決定位胜肽。 92 201134480 表2a、來自CLUAP1之HLA-A24結合9員胜肽 起始位置 胺基酸序列 分數 序列辨識號 258 TYLEKFQNL 518. 4 1 244 EYEKTEEEL 330 2 255 QYDTYLEKF 110 3 283 RFEEAKNTL 86. 4 4 31 NFGLVSEVL 28 5 8 NFTEMMRAL 24 6 26 NFRTPNFGL 20 7 168 RTEAIARPL 16. 8 8 64 FFIKAIAQF 15 9 216 KIEKRKLEL 13. 2 10 335 KPQTAMEML 12 11 起始位置 胺基酸序列胜肽 Kd (nM) 序列辨識號 86 LYQADGYAV 473 12 71 QFMATKAHI 1477 13 154 LYDLLGMEV 1564 14 表2b、來自CLUAP1之HLA-A24結合10員胜肽 起始位置 胺基酸序列 分數 序列辨識號 91 GYAVKELLKI 55 15 104 LYNAMKTKGM 37. 5 16 31 NFGLVSEVLL 20 17 125 KFKFDLGSKI 13. 2 18 17 GYPRHISMEN 11. 6 19 289 NTLCLIQNKL 11. 1 20 158 TYLEKFQNLT 10. 8 21 63 VFFIKAIAQF 10 22 起始位置指自CLUAP1之N端的胺基酸殘基數目。結合 分數與分離常數（dissociation constant)[Kd (nM)]來自 “BIMAS” 與 “NetMHC3. 0” 。 93 201134480 以HLA- A* 2402限制之來自CLUAP1之預測胜肽誘導細 胞毒殺性T淋巴球 根據敘述於“材料與方法”之步驟產生對於那些來自 CLUAP1之胜肽的細胞毒殺性τ淋巴球。藉由IFN_ γ酵素 結合免疫斑點分析測定胜肽專一細胞毒殺性τ淋巴球活性 (第1 a- j圖）。與控制組孔洞相較，下列孔洞編號顯示強 而有力的IFN-r產生：以CLUAP卜A24-9-255 (序列辨識 號：3)刺激之孔洞編號#6 (a)、以CLUAP1-A24-9-283 (序 列辨識號：4)刺激之#2 (b)、以CLUAP1-A24-9-31 (序列 辨識號：5 )刺激之#2 (c)、以CLUAP1-A24-9-168 (序列 辨識號：8)刺激之#4 (d)、以CLUAP卜A24-9-64 (序列辨 識號：9)刺激之#4 (e)、以CLUAP卜A24-9-216 (序列辨 識號：10)刺激之#1 (〇、以CLUAP1-A24-9-1 54 (序列辨 識號：14)刺激之#6 (g)、以CLUAP1-A24-10-91 (序列辨 識號：15)刺激之#2 (h);以CLUAP卜A24-10-104 (序列 辨識號：16)刺激之#4 (i)與以CLUAP1-A24-1 0-125 (序 列辨識號.18)刺激之#5 (j)。另一方面，藉由以顯示於 表2a與表2b中之其他胜肽刺激沒有測定出專一之細胞毒 殺性T淋巴球活性’儘管那些胜肽具有與HLA-A* 2402之可 能結合活性。如負資料的典型例子，從以CLUAP1-A24-9-258 (序列辨識號：1)刺激之細胞毒殺性T淋巴球，並無觀察 到專一的IFN- r產生（第lk圖）。因此，其指出筛選出 來自CLUAP1之10個胜肽為可誘導強而有力之細胞毒殺性 T淋巴球的胜肽。 94 201134480 抗C L U A P1衍生胜肽之細胞毒殺性τ淋巴球細胞株與複 製的建立 藉由IFN- 7"酵素結合免疫斑點分析偵測，於以 CLUAP1-A24-9-255 (序列辨識號：3 )刺激之孔洞編號#6 (a)、以CLUAP卜Α24-9-1 68(序列辨識號：8 )刺激之(b)、 以CLUAP1-A24-9-64 (序列辨識號：9)刺激之#4 (c)、以 CLUAP1-A24-9-1 54 (序列辨識號：14)刺激之#6 (d)與以 CLUAP1-A24-10-91 (序列辨識號：15)刺激之#2 (e)中顯 示胜肽專一細胞毒殺性T淋巴球活性的細胞被擴張，並藉 由限制稀釋來建立細胞毒殺性τ淋巴球細胞株，於上方段 落“材料與方法”中所述。藉由IFN-T酵素結合免疫吸附 分析來測定那些細胞毒殺性T淋巴球細胞株的細胞毒殺性 T淋巴球活性（第2a-e圖）。與無胜肽脈衝之目標細胞相 較’所有細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示強的抗以對應胜 肽脈衝之目標細胞的IFN- r產生。此外，如於“材料與方 法所述藉由來自細胞毒殺性τ淋巴球細胞株的限制稀釋 建立細胞毒殺性T淋巴球複製，且藉由IFN_ r酵素結合免 疫吸附分析測定來自抗經胜肽脈衝目標細胞之細胞毒殺性 T淋巴球複製的IFN- r產生。在第3圖中，從以 CLUAP1-A24-9-255 (序列辨識號：3) 、CLUAP1-A24-9-64 (序列辨識號：9)與CLUAP1-A24-10-91 (序列辨識號： 1 5 )刺激之細胞毒殺性T淋巴球複製測定出強的丨FN_ γ產 生0 95 201134480 抗外生表現CLUAP1與HLA-A* 2402之目標細胞的專一 細胞毒殺性T淋巴球活性 檢驗經提升抗這些胜肽之所建立的細胞毒殺性T淋巴 球細胞株其對於辨認内生表現CLUAP1與HLA-A5" 2402分子 之目標細胞的能力。使用由對應之胜肽提升的細胞毒殺性 T淋巴球細胞株做來測試抗C0S7細胞的專一細胞毒殺性T 淋巴球活性，而C0S7細胞經全長之CLUAP1與HLA-A* 2402 分子基因轉染（對於外生表現CLUAP1與HLA-A# 2402基因 之目標細胞的特定模式）。COS7細胞以全長CLUAP1基因 或HLA-A* 2402轉染製備為控制組。於第4圖中，以 CLUAP1-A24-9-255 (序列辨識號：3)刺激之細胞毒殺性T 淋巴球顯示強的抗表現CLUAP1與HLA-A# 2402兩者之COS7 細胞的細胞毒殺性T淋巴球活性。另一方面，沒有偵測到 抗控制組之顯著專一之細胞毒殺性T淋巴球活性。因此， 這些資料清楚證明CLUAP1-A24-9-255 (序列辨識號：3 ) 被自然表現於具有HLA-A* 2402分子之目標細胞上且由細 胞毒殺性T淋巴球所辨認。這些結果顯示此來自CLUAP1之 胜肽為可適合為具CLU API表現之腫瘤之病患的癌症疫苗。 抗原胜肽之同源分析 以 CLUAP1-A24-9-255 (序列辨識號：3 )、 CLUAP1-A24-9-283C 序列辨識號：4)、CLUAP卜A24-9-31 (序 列辨識號：5)、 CLUAP1-A24-9-1 68 (序列辨識號：8)、 96 201134480 CLUAP1-A24-9-64 (序列辨識號：9)、 CLUAP1-A24-9-216 (序列辨識號：10)、 CLUAP卜A24-9-1 54 (序列辨識號： 14 ) 、 CLUAP1-A24-10-91 (序列辨識號：15 )、 CLUAP1-A24-10-104 (序列辨識號：16 )與 CLUAP1-A24-1 0-1 25 (序列辨識號：1 8 )刺激之細胞毒殺性 T淋巴球顯示顯著且專一之細胞毒殺性T淋巴球活性。此 結果可能起因於CLUAP1-A24-9-255 (序列辨識號：3)、 CLUAP 卜 A24-9-283 (序列辨識號：4)、 CLUAP1-A24-9-31 (序列辨識號：5)、 CLUAP1-A24-9-1 68 (序列辨識號： 8)、CLUAPl-A24-9-64(序列辨識號：9)、CLUAP1-A24-9-216 (序列辨識號：10 )、 CLUAP1-A24-9-1 54 (序列辨識號： 14 ) 、 CLUAP卜A24-10-91 (序列辨識號：15 )、 CLUAP1-A24-10-104 (序列辨識號：16)與 CLUAP卜A24-1 0-1 25 (序列辨識號：18)之序列為與源自已 知使人類免疫系統敏感之其他分子的胜肽同源的事實。為 了排除此可能性，對於使用為關鍵字向BLAST演算法 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)查詢 之這些胜肽序列執行同源性分析，而BLAST演算法顯示沒 有序列顯示顯著之同源性。同源性分析之結果指出 CLUAP卜A24-9-2 55 (序列辨識號：3)、CLUAP卜A24-9-283 (序列辨識號：4)、CLUAP卜A24-9-31 (序列辨識號：5)、 CLUAP卜A24-9-168 C 序列辨識號：8)、 CLUAP卜A24-9-64 (序列辨識號：9)、CLUAPl-A24-9-216(序列辨識號：10)、 CLUAP卜A24-9-1 54C 序列辨識號：14)、CLUAP卜A24-10-91 97 201134480 (序列辨識號：15)、 CLUAP卜A24-1 0-1 04 (序列辨識號： 16)與CLUAP1-A24-1 0- 1 25 (序列辨識號：18)之序列為 獨特的，且因此只有很小可能性分子會對於一些非相關分 子提高非傾向之免疫反應。 因此，確認新穎之來自CLUAP1之HLA-A24抗原決定位 胜肽。此外此處結果證明CLUAP1之抗原決定位胜肽對使用 於癌症免疫治療中而言可為適合的。 結果3 來自CLUAP1之HLA-A02結合胜肽的預測 表3a與3b以最高之結合親和力之順序顯示CLUAPI之 HLA-A02結合9員與10員胜肽。總共21個具有潛在HLA-A02 結合能力之胜肽被選擇且將其試驗以確定抗原決定位胜 肽0 表3a、來自CLUAP1之HLA-A02結合9員胜肽 起始位置 胺基酸序列 分數 序列辨識號 34 LVSEVLLWL 164. 809 23 58 TEQDRVFFI 61.024 24 95 KELLKITSV 40.281 25 85 KLYQADGYA 39.784 26 290 TLCLIQNKL 21.362 27 265 NLTYLEQQL 21.362 28 297 KLKEEEKRL 10. 729 29 99 KITSVLYNA 5. 499 30 188 AIKEILTQV 3. 156 31 96 ELLKITSVL 2. 431 32 98 201134480 表3b、來自CLUAP1之HLA-A02結合10員胜肽 起始位置 胺基酸序列 分數 序列辨識號 153 SLYDLLGMEV 912.522 33 85 KLYQADGYAV 778. 982 34 34 LVSEVLLWLV 731. 711 35 33 GLVSEVLLWL 270.234 36 72 FMATKAHIKL 70.971 37 80 KLNTKKLYQA 39. 992 38 41 WLVKRYEPOT 34.279 39 233 TLQSVRPCFM 27. 324 40 183 KVMRIAIKEI 27. 19 41 343 LMQGRPGKRI 12. 809 42 222 LELERNRKRL 10. 712 43 起始位置指自CLUAP1之N端的胺基酸殘基數目。結合 分數來自“BIMAS” 。 以HLA- A* 020 1限制之來自CLUAP1之預測胜肽誘導細 胞毒殺性T淋巴球 根據敘述於“材料與方法”之步驟產生對於那些來自 C L U A P1之胜肽的細胞毒殺性T淋巴球。藉由IF N - γ酵素 結合免疫斑點分析測定胜肽專一細胞毒殺性Τ淋巴球活性 (第5a-g圖）。與控制組孔洞相較下列孔洞編號顯示強而 有力的IFN- r產生：以CLUAP1-A02-9-34 (序列辨識號： 23 )刺激之孔洞編號#3 (a)、以CLUAP1-A02-9-99 (序列 辨識號：30)刺激之#6(13)、以（^1^?卜六02-1 0-1 53 (序 列辨識號：33)刺激之#2 (c)、以CLUAP卜A02- 1 0-85 (序 列辨識號：34)刺激之#3 (d)、以CLUAP1-A0 2- 1 0-34 (序 99 201134480 列辨識號：35)刺激之#2 (e)、以CLUAP卜A02-1 0-33 (序 列辨識號：36)刺激之#2 (f)與以CLUAP卜A02-1 0-80 (序 列辨識號.38)刺激之#5 (g)。另一方面’藉由以顯示於 表3a與表3b中之其他胜狀刺激沒有測定出專一之細胞毒 殺性T淋巴球活性，儘管那些胜肽具有與HLA-A* 0201之可 能結合活性。如負資料的典型例子，從以CLUAP1-A02-9-58 (序列辨識號：24 ) (h)刺激之細胞毒殺性T淋巴球，並無 觀察到專一的IFN- 7產生。因此，其指出篩選來自CLUAP1 之7個胜肽為可誘導強而有力之細胞毒殺性T淋巴球的胜 肽。 抗CLUAP1衍生胜肽之細胞毒殺性T淋巴球細胞株與複 製的建立 藉由IFN- r 酵素結合免疫斑點分析偵測，於以 CLUAP1-A02-9-34 (序列辨識號：23 )刺激之孔洞編號#3 (a) 、以 CLUAP卜A02-9-99 (序列辨識號：30 )刺激之#6 (b) 、以 CLUAP1-A02-10-1 53 (序列辨識號：33)刺激之#2 (c) 、以CLUAP卜A02-1 0-85 (序列辨識號：34)刺激之#3 (d) 、以 CLUAP1-A02-10-34C 序列辨識號：35)刺激之#2 (e) 與以CLUAP 1-A02-1 0-33 (序列辨識號：36)刺激之#2 (f) 中顯示胜肽專一細胞毒殺性T淋巴球活性的細胞被擴張， 並藉由限制稀釋來建立細胞毒殺性T淋巴球細胞株，於上 方段落“材料與方法，’中所述。藉由IFN-τ酵素結合免疫 吸附分析來測定這些細胞毒殺性T淋巴球細胞株的細胞毒 100 201134480 殺性T淋巴球活性（第6a-f圖）。與無胜肽脈衝之目標細 胞相較，細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示強的抗以對應胜 狀脈衝之目標細胞的IF N - τ產生。此外，如於“材料與方 法”所述藉由來自細胞毒殺性T淋巴球細胞株的限制稀釋 建立細胞毒殺性T淋巴球複製，且藉由IFN- 7酵素結合免 疫吸附分析測定來自抗經胜肽脈衝目標細胞之細胞毒殺性 T淋巴球複製的IFN-r產生。從以CLUAP1-A02-9-34 (序 列辨識號：23) (a)、CLUAP1-A02-9-99 (序列辨識號： 30 ) (b)、CLUAP1-A02-1 0-1 53 (序列辨識號：33 ) (c)與 CLUAP卜A02-1 0-85 (序列辨識號：34) (d)刺激之細胞毒 殺性T淋巴球複製測定出強的ifn- 7產生（第7a-d圖）。 抗外生表現CLUAP1與HLA-A* 020 1之目標細胞的專一 細胞毒殺性T淋巴球活性 檢驗經提升抗各胜肽之所建立的細胞毒殺性T淋巴球 細胞株與複製其對於辨認内生表現CLUAP1與HLA-A* 0201 分子之目標細胞的能力。使用由對應之胜肽提升的細胞毒 殺性τ淋巴球細胞株與複製做為影響細胞來測試抗c〇S7細 胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性，而c〇S7細胞經全長之 CLUAP1與HLA-A* 0201基因轉染（對於外生表現CLUApi與 HLA-A* 020 1基因之目標細胞的特定模式）。c〇S7細胞以全 長CLUAP1或HLA-A* 0201轉染製備為控制組。 於第8圖中，以CLUAP1-A24-9-255 (序列辨識號：3 ) 刺激之細胞毒殺性τ淋巴球細胞株顯示強的抗表現CLUAP1 101 201134480 與HLA-A* 0201兩者之C0S7細胞的細胞毒殺性τ淋巴球活 性。另一方面，沒有偵測到抗控制組之顯著專一之細胞毒 殺性 Τ淋巴球活性。因此’這些資料清楚證明 CLUAPl-A24-9-255 (序列辨識號：3)被内生處理並表現於 具有H L A _ A * 0 2 0 1分子之目標細胞上且由細胞毒殺性τ淋巴 球所辨認。這些結果顯示這些來自CLUAP1之胜肽為可得以 提供具CLUAP1表現之腫瘤之病患的癌症疫苗。 抗原胜肽之同源分析 以 CLUAP1-A02-9-34 (序列辨識號：23 )、 CLUAP卜A02-9-99C 序列辨識號：30)、CLUAP卜A02-10-153 (序列辨識號：33)、 CLUAP卜A02- 1 0-85 C序列辨識號： 34 ) 、 CLUAP1-A02-10-34 (序列辨識號：35 )、 CLUAP1-A02-1 0-33C 序列辨識號：36)與 CLUAP1-A02-10-80 (序列辨識號：38 )刺激之細胞毒殺性T淋巴球顯示顯著 且專一之細胞毒殺性T淋巴球活性。此結果可能起因於 CLUAP1-A02-9-34 C 序列辨識號：23)、 CLUAP卜A02-9-99 (序列辨識號：30 )、 CLUAP1-A02-1 0-1 53 (序列辨識號： 33 ) 、 CLUAP1-A02-1 0-85 (序列辨識號：34 )、 CLUAP1-A02-1 0-34(序列辨識號：35)、CLUAP卜A02-10-33 (序列辨識號：36)與CLUAP1-A02-1 0-80 (序列辨識號： 3 8 )之序列為與源自已知使人類免疫系統敏感之其他分子 的胜肽同源的事實。 為了排除此可能性，對於使用為關鍵字向BLAST演算 102 201134480 法(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)查 詢之這些胜肽序列執行同源性分析，而BLAST演算法顯示 沒有序列顯示顯著之同源性。同源性分析之結果指出 CLUAP1-A02-9-34C 序列辨識號：23)、CLUAPl-A02-9-99 (序 列辨識號：30)、CLUAP1-A0 2-1 0-1 53 C 序列辨識號：33)、 CLUAP卜A0 2-1 0-85(序列辨識號：34)、CLUAP卜A0 2-10-34 (序列辨識號：35)、 CLUAP1-A02- 1 0-33 C序列辨識號： 36 )與CLUAP1-A02-1 0-80 (序列辨識號：38 )之序列為獨 特的，且因此只有很小可能性分子會對於一些非相關分子 提高非傾向之免疫反應。 因此’我們確認新穎之來自CLUAP1之HLA- A* 020 1 抗原決定位胜肽。此外，其證明CLUAP1之抗原決定位胜肽 對癌症免疫治療而言可為適用。 產業利用性 本發明提供新的腫瘤相關抗原，特別是來自CLMpi的 那些，其可誘導強且專一的抗腫瘤免疫.反應，且對於癌症 形弋之廣泛種類而&具有應用性。此腫瘤相關抗原可提供 效用為抗與CLUAPI相關之疾病的胜肽疫苗與AH相 關之疾病，例如癌症，更拉&丨a a十 文特別疋礼癌 '子宮頸癌、大腸直 腸癌、食道癌、胃癌、瀰漫型f ^又i月届、淋巴癌、砷經母細胞 瘤、騰臟癌。 當於 此詳述本#明與提及其特定實施例時 需瞭解的 103 201134480 是’前述敘述本質為示範與解釋且意為說明本發明與其較 佳實施例。於例行實驗之中，熟悉此技藝人士可立即瞭解 在不脫離本發明之精神下其可實行各種改變與修飾。因此 本發明不被前述所定義，而被下列申請專利範圍與其等同 物所定義。 【圖式簡單說明】 [第la-f圖] 第la-f圖由一系列照片，（a)至（f)所組成，其顯示在 以來自CLUAP1之胜肽誘導之細胞毒殺性τ淋巴球上之 IFN-τ 酵素結合免疫斑點分析（ELISP0T)的結果。與控制 組孔洞相較，於下列孔洞編號中之細胞毒殺性T淋巴球顯 示強的IFN- r產生：以CLUAP1-A24-9-255 (序列辨識號： 3)刺激之孔洞編號#6 (a)、以CLUAP卜A24-9-283 (序列 辨識號：4)刺激之#2 (b)、以CLUAP卜A24-9-31 (序列辨 識號：5)刺激之#2 (c)、以CLUAP1-A24-9-168 (序列辨 識號：8)刺激之#·4 (d)、以CLUAP1-A24-9-64 (序列辨識 號：9)刺激之#4 (e)與以CLUAP1-A24-9-216 (序列辨識 號：10 )刺激之#1 (f)。以矩形盒狀所指出於孔洞中之細 胞被擴張來建立細胞毒殺性T淋巴球細胞株。相對的，如 負資料的典型例子，其未顯示來自以CLUAP1-A24-9-258C序 列辨識號：1)刺激之細胞毒殺性T淋巴球之專一的IFN- γ 產生（k)。於圖中，“ 指出抗以適合之胜肽脈衝的目標 細胞的IF N - 7產生，而“’指出抗未以任何胜肽脈衝的 104 201134480 目標細胞的IFN- T產生。 [第lg-k圖] 第1 g _ k圖由·一糸列照片’（g)至（k)所組成，其顯示在 以來自CLUAP1之胜肽誘導之細胞毒殺性τ淋巴球上之 IFN-τ酵素結合免疫斑點分析（ELISP0T)的結果。與控制 組孔洞相較，於下列孔洞編號中之細胞毒殺性T淋巴球顯 示強的IFN-τ產生：以CLUAPl-A24-9-154(序列辨識號： 14)刺激之孔洞#6 (g)、以CLUAP1-A24-10-91 (序列辨識 號：15)刺激之#2 (h)、以CLUAP卜A24-1 0-104 (序列辨 識號：16)刺激之#4 (i)與以CLUAP1-A24-1 0-125 (序列 辨識號：1 8 )刺激之#5 ( j)。以矩形盒狀所指出於孔洞中 之細胞被擴張來建立細胞毒殺性T淋巴球細胞株。相對 的，如負資料的典型例子’其未顯示來自以 CLUAP1-A24-9-258 (序列辨識號：1)刺激之細胞毒殺性T 淋巴球之專一的IFN-γ產生（k)。於圖中，“+”指出抗以 適合之胜肽脈衝的目標細胞的IFN- τ產生’而“指出 抗未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN- τ產生。 [第2圖] 第2圖由一系列線圖，（a)至（e)所組成’顯示IF N - 7 酵素結合免疫吸附分析偵測的結果，其顯示以 CLUAP1-A24-9-255 (序列辨識號：3 ) (a)、以 CLUAP1-A24-9-168 (序列辨識號：8 ) (b)、以 105 201134480 CLUAP卜A24-9-64 (序列辨識號：9 ) (c)、以 CLUAP1-A24-9-154 (序列辨識號：14 ) (d)與以 CLUAP卜A24-10-91 (序列辨識號：15) (e)刺激之細胞毒殺 性T淋巴球細胞株的IFN- τ產生。結果顯示與控制組相 較’藉由以各胜肽刺激建立之細胞毒殺性T淋巴球細胞株 顯示強而有力之IFN- r產生。於圖中，“ +，，指出抗以適 合之胜肽脈衝的目標細胞的IFN- 7產生，而“指出抗 未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN- 7產生。 [第3圖] 第3圖由一系列線圖，（a)至（d)所組成，顯示IFN- 7· 酵素結合免疫吸附分析偵測的結果’其顯示藉由來自以 CLUAPl-A24-9-255(序列辨識號：3 ) (a)、CLUAP1-A24-9-64 (序列辨識號：9) (b)與CLUAP卜A24-10-91 (序列辨識 號：15 ) (c)刺激之細胞毒殺性τ淋巴球細胞株的限制稀 釋所建立之細胞毒殺性T淋巴球複製的IFN- 7產生。結果 顯示與控制組相較，藉由以各胜肽刺激所建立之細胞毒殺 性T淋巴球複製顯示強而有力之iFN_ 7產生。於圖中， 指出抗以適合之胜肽脈衝的目標細胞的丨FN_ 7產 生’而指出抗未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN_ γ 產生。 [第4圖]

第4圖為一線圖，其顯示抗外生表現CLUAP1與HLA-A 106 201134480 * 2402*之目標細胞的專一細胞毒殺性τ淋巴球活性。將以 HLA-A* 2402或全長之CLUAP1基因轉染之c〇 控制組。…―255 (序列辨識號 細胞毒殺性τ淋巴球細胞株顯示抗以cluapi肖心—c 2402兩者轉染之⑽7細胞的專—細胞毒殺性了淋巴球活 性（黑色菱形）。3 -方面’沒有相到顯著專—之細胞 毒殺性τ淋巴球活性，其抗表現HLA_A*24〇2 (三角形）或 CLUAP1 (圓形）任一的目標細胞。 [第5a-f圖] 第5a-f圖由一系列照片，（3)至（〇所组成，其顯示在 以來自CLUAP1之胜肽誘導之細胞毒殺性τ淋巴球上之 IFN-r酵素結合免疫斑點分析（ELISPOT)的結果。與控制 組孔洞相較，於下列孔洞編號中之細胞毒殺性T淋巴球顯 示強的IFN-T"產生：以CLUAP1-A02-9-34 (序列辨識號： 23 )刺激之孔洞編號#3 (a)、以CLUAP卜A02-9-99 (序列 辨識號：30)刺激之 #6 (b)、以 CLUAP1-A02-10-153 (序 列辨識號：33)刺激之#2 (c)、以CLUAP1-A02-1 0-85 (序 列辨識號：34)刺激之#3 (d)、以CLUAP1-A02-1 0-34 (序 列辨識號：35 )刺激之#2 (e)與以CLUAP1-A02-1 0-33 (序 列辨識號：36 )刺激之#2 (f)。以矩形盒狀所指出於孔洞 中之細胞被擴張來建立細胞毒殺性T淋巴球細胞株。相對 的，如負資料的典型例子，其未顯示來自以 CLUAP1-A02-9-58 (序列辨識號：24 ) (h)刺激之細胞毒殺 107 201134480 性τ淋巴球之專一的IFN_ r產生。於圖中，“ +”指出抗 以適合之胜肽脈衝的目標細胞的IFN- 7產生，而“指 出抗未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN- 7產生。 [第5g-h圖] 第5g-h圖由一系列照片所組成，（g)其顯示在以來自 CLUAP1之胜肽誘導之細胞毒殺性τ淋巴球上之IFN-7*酵 素結合免疫斑點分析（EL I SPOT)的結果。與控制組孔洞相 較’於下列孔洞編號中之細胞毒殺性T淋巴球顯示強的 IFN- γ產生：以CLUAP1-A02-1 0-80 (序列辨識號：38)刺 激之#5 (g)。以矩形盒狀所指出於孔洞中之細胞被擴張來 建立細胞毒殺性T淋巴球細胞株。相對的，如負資料的典 型例子’其未顯示來自以CLUAPh〇2 —9-58(序列辨識號： 2 4 ) (h )刺激之細胞毒殺性τ m丄 * , ’双汪i淋巴球之專一的IFN_ r產生。 於圖中，“ +”指出抗以说人 、5之胜肽脈衝的目標細胞的 IF N - 7產生，而“”指由 屯^未以任何胜肽脈衝的目標細 胞的IFN-γ產生。 [第6圖] 酵素結合免疫吸附分析 CLUAP卜A02-9-34 (序歹,】 CLUAP卜A02-9-99 (序歹,】 CLUAP卜A02-1 0-153 (序歹 顯示IF N - 7" 其顯示以 (a) 、以 (b) 、以 (c) 、以 第6圖由一系列線圖 (a)至（f)所組成， 偵測的結果， 辨識號：23 ) 辨識號：30 ) 辨識號：33 ) 108 201134480 CLUAP1-A02-10_85 (序列辨識號：34 ) (d)、以 CLUAP1-A02-1 0-34 (序列辨識號：35 ) (e)與以 CLUAPl-A02-10-33 (序列辨識號：36) (f)刺激之細胞毒殺 性T淋巴球細胞株之IF N_ 7"產生。結果顯示與控制組相 較，藉由以各胜肽刺激建立之細胞毒殺性T淋巴球細胞株 顯示強而有力之IF N - τ產生。於圖中，“ +，，指出抗以適 合之胜肽脈衝的目標細胞的IFN- 7產生，而“ 指出抗 未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN- γ產生。 [第7圖] 第7圖由一系列線圖，（a)至（d)所組成’其顯示藉由 來自以CLUAP1-A02-9-34 (序列辨識號：23) (a)、 CLUAP1-A02-9-99 (序列辨識號：3〇 ) (b)、 CLUAP1-A02-1 0-1 53 (序列辨識號：33 ) 與 CLUAPH02-1 0-85 (序列辨識號：34)⑷刺激之細胞毒殺 性τ淋巴球細胞株的限制稀釋所建立之細胞毒殺性τ淋巴 球複製的IFN- r產生。結果顯示與控制組相較藉由以各 胜肽刺激所建立之細胞毒殺性T淋巴球複製顯示強而有力 之IFN- r產生。於圖中，“ +”指屮扞丨、丨、*人 出抗以適合之胜肽脈衝 指出抗未以任何胜肽 的目標細胞的IF N - 7產生，而‘、 脈衝的目標細胞的IFN- τ產生。 [第8圖] (a)至（d)所組成，其顯示抗外 第8圖由一系列線圖 109 201134480 生表現CLUAP1與HLA-A* 020 1之目標細胞的專一細胞毒殺 性T淋巴球活性。將以HLA-A* 0201或全長之CLUAP1基因 轉染之COS7細胞製備為控制組。以CLUAP1-A02-9-99 (序 列辨識號.30) (a)、CLUAP1-A02-10-153 (序列辨識號： 33) (b)、CLUAP1-A02-1 0-85 (序列辨識號：34 ) (c) 與CLUAP1-A02-10-33 (序列辨識號·· 36) (d)建立之細 胞毒殺性τ淋巴球細胞株顯示抗以CLUApi與HLA_A* 兩者轉染之COS7細胞的專一 方形）。 一細胞毒殺性T淋巴球活性（正

任一的目標細胞。 淋巴球活* (圓形）任一 【主要元件符號說明】 益 ««»> 110 201134480 序列表 <110> 腫瘤療法·科學股份有限公司 <120> CLUAP1胜肽及其疫苗 〈130〉 0NC-A1011-TW 〈150〉 US 61/322,099 〈151〉 2010-04-08 <160〉 49 〈170〉 Patent In version 3.5 〈210〉 1 <211〉 9 〈212〉 PRT 〈213〉 人工序列 <220〉 <223〉 人工合成胜肽序列 〈400〉 1

Thr Tyr Leu Glu Lys Phe Gin Asn Leu 1 5 <210> 2 <211〉 9 <212〉 PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工合成胜肽序列 <400> 2

Glu Tyr Glu Lys Thr Glu Glu Glu Leu 1 5 <210〉 3 <211> 9 <212〉 PRT 〈213>人工序列 <220> 201134480 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 3

Gin Tyr Asp Thr Tyr Leu Glu Lys Phe 1 5 <210〉 4 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 4

Arg Phe Glu Glu Ala Lys Asn Thr Leu 1 5 <210〉 5 <211〉 9 〈212〉 PRT <213〉 人工序列 <220〉 <223〉 人工合成胜肽序列 <400〉 5

Asn Phe Gly Leu Val Ser Glu Val Leu <210〉 6 <211〉 9 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工合成胜肽序列 <400> 6

Asn Phe Thr Glu Met Met Arg Ala Leu 1 5 〈210〉 7 <211〉 9 2 201134480 <212> PRT 〈213>人工序列 <220> <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 7

Asn Phe Arg Thr Pro Asn Phe Gly Leu 1 5 <210〉 8 <211> 9 <212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 8

Arg Thr Glu Ala lie Ala Arg Pro Leu 1 5 〈210〉 9 <211〉 9 〈212〉 PRT <213〉人工序列 〈220> <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 9

Phe Phe lie Lys Ala lie Ala 6ln Phe 〈210〉 10 〈211〉 9 <212〉 PRT <213〉人工序列 〈220> <223〉人工合成胜肽序列 <400> 10

Lys lie Glu Lys Arg Lys Leu Glu Leu 3 201134480 <210> 11 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 11

Lys Pro Gin Thr Ala Met Glu Met Leu <210〉 12 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 12

Leu Tyr Gin Ala Asp Gly Tyr Ala Val 1 5 〈210〉 13 <211〉 9 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 13

Gin Phe Met Ala Thr Lys Ala His lie 1 5 <210> 14 〈211〉 9 <212〉 PRT 〈213〉 人工序列 〈220〉 〈223〉 人工合成胜肽序列 4 201134480 <400〉 14

Leu Tyr Asp Leu Leu Gly Met Glu Val 1 5 <210> 15 <211> 10 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工合成胜肽序列 <400> 15 6ly Tyr Ala Val Lys Glu Leu Leu Lys lie 1 5 10 <210> 16 <211> 10 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 〈223>人工合成胜肽序列 <400> 16

Leu Tyr Asn Ala Met Lys Thr Lys Gly Met 1 5 10 〈210〉 17 <211〉 10 <212〉 PRT 〈213>人工序列 <220> 〈223>人工合成胜肽序列 <400> 17

Asn Phe Gly Leu Val Ser Glu Val Leu Leu 1 5 10 〈210〉 18 〈211〉 10 <212〉 PRT 〈213〉人工序列 201134480 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 18

Lys Phe Lys Phe Asp Leu Gly Ser Lys lie 1 5 10 <210> 19 <211〉 10 <212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈220> 〈223>人工合成胜肽序列 <400> 19

Gly Tyr Pro Arg His lie Ser Met Glu Asn 1 5 10 〈210〉 20 <211〉 10 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 20

Asn Thr Leu Cys Leu Ile Gin Asn Lys Leu 1 5 10 <210〉 21 <211〉 10 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 21

Thr Tyr Leu Glu Lys Phe Gin Asn Leu Thr 1 5 10 6 201134480 * <210〉 <211> <212> <213〉 22 10 PRT 人工序列 <220> <223> 人工合成胜肽序列 〈400〉 22

Val Phe Phe lie Lys Ala lie Ala Gin Phe 1 5 10 <210> <211〉 <212> <213> 23 9 PRT 人工序列 <220〉 <223〉 人工合成胜肽序列 <400> 23

Leu Val Ser Glu Val Leu Leu Trp Leu 1 5 〈210> 24 <211> <212> <213> 9 PRT 人工序列 〈220> <223〉 人工合成胜肽序列 <400> 24

Thr Glu Gin Asp Arg Val Phe Phe lie <210〉 25 <211> <212〉 <213> 9 PRT 人工序列 <220〉 <223> 人工合成胜肽序列 〈400〉 25 201134480

Lys Glu Leu Leu Lys lie Thr Ser Val 1 5 〈210〉 26 <211〉 9 <212〉 PRT 〈213>人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 26

Lys Leu Tyr Gin Ala Asp Gly Tyr Ala 1 5 <210〉 27 <211> 9 <212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220> 〈223>人工合成胜肽序列 <400〉 27

Thr Leu Cys Leu lie Gin Asn Lys Leu <210〉 28 <211〉 9 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 〈223>人工合成胜肽序列 <400〉 28

Asn Leu Thr Tyr Leu Glu Gin Gin Leu 〈210〉 29 <211〉 9 〈212〉 PRT <213〉 人工序列 8 〈220〉 201134480 • <223〉人工合成胜肽序列 <400> 29

Lys Leu Lys Glu Glu Glu Lys Arg Leu 〈210〉 30 <211〉 9 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220〉 〈223>人工合成胜肽序列 <400〉 30

Lys lie Thr Ser Val Leu Tyr Asn Ala 1 5 <210> 31 <211> 9 〈212〉 PRT <213〉 人工序列 <220〉 <223〉 人工合成胜肽序列 〈400〉 31

Ala lie Lys Glu lie Leu Thr 6ln Val 1 5 <210〉 32 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉 人工序列 <220〉 <223〉 人工合成胜肽序列 <400〉 32

Glu Leu Leu Lys lie Thr Ser Val Leu 1 5 <210〉 33 〈211〉 10 201134480 <212〉 PRT 〈213>人工序列 <220> <223〉人工合成胜肽序列 <400> 33

Ser Leu Tyr Asp Leu Leu Gly Met Glu Val 1 5 10 <210〉 34 <211> 10 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 34

Lys Leu Tyr Gin Ala Asp Gly Tyr Ala Val 1 5 10 <210〉 35 <211〉 10 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 35

Leu Val Ser Glu Val Leu Leu Trp Leu Val 1 5 10 <210〉 36 <211> 10 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 36

Gly Leu Val Ser Glu Val Leu Leu Trp Leu 1 5 10 10 201134480 <210> 37 <211> 10 <212> PRT 〈213〉人工序列 <220> 〈223>人工合成胜肽序列 <400〉 37

Phe Met Ala Thr Lys Ala His lie Lys Leu 1 5 10 〈210〉 38 〈211〉 10 <212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 38

Lys Leu Asn Thr Lys Lys Leu Tyr Gin Ala 1 5 10 〈210〉 39 〈211〉 10 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220> 〈223>人工合成胜肽序列 <400> 39

Trp Leu Val Lys Arg Tyr Glu Pro Gin Thr 1 5 10 <210〉 40 <211> 10 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 201134480 <400〉 40

Thr Leu Gin Ser Val Arg Pro Cys Phe Met 1 5 10 <210> 41 <211〉 10 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 41

Lys Val Met Arg lie Ala lie Lys Glu lie 1 5 10 <210〉 42 〈211〉 10 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 42

Leu Met Gin Gly Arg Pro Gly Lys Arg lie 1 5 10 <210〉 43 <211〉 10 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 43

Leu Glu Leu Glu Arg Asn Arg Lys Arg Leu 1 5 10 <210〉 44 <211〉 1681 <212> DNA <213〉人類 12 201134480 參 <400> 44 gccgtccaag ggtccattgg ttgccataga aggggcgagc agttgcgacc ctgggctcct ctccgcaatt tcacagagat gatgagagcc aatttccgta cacccaattt tggacttgta tatgagcccc agactgacat cccgcctgac attaaggcaa ttgcccagtt catggccacc ctttatcaag cagatgggta tgcggtaaaa aatgctatga agaccaaggg gatggagggc ttcaagtttg atcttggctc aaagattgca gaaatcacct ccaaaggagc atctctgtat gaaatgagaa cagaagccat tgccagacct agaattgcaa taaaagagat tttgacacag gtggcctctg atgaagctaa tttagaagcc agaaatcgga agcgactaga gactctgcag gagaagactg aggaagaatt acaaaagcag ctgacttatc tggaacaaca gcttgaagac gaagctaaaa acactctctg cctgatacag ctcaagagtg gaagtaacga tgactcggac agtgagttgg aagaaaggcg gctgcccaag ggaagacctg gcaaacgcat tgtgggcacg gactcggagg agagtgaaat tgacatggaa gacgagagca tttctctctc accaaccaag ctggatgaga gtgacaatga cttctgaccc cctcagactt gtaggtaaat gggaacttag actaagctgg ctggactcat gatcactgaa gatcgtcgag cgctgggcct gtgatcgctg 60 ggggacctga gcgttatgtc tttccgcgac 120 ctgggatacc ctcgacatat ttctatggaa 180 tctgaagtgc ttctctggct tgtgaaaaga 240 gtggatactg aacaggaccg agttttcttc 300 aaggcacata taaaactcaa cactaagaag 360 gagctgctga agatcacatc tgtcctttat 420 tctgaaatag tagaggaaga tgtcaacaag 480 gatttgaagg cagccaggca gcttgcgtct 540 gacttgctcg gcatggaagt agagttgagg 600 ctggaaataa acgagactga aaaagtgatg 660 gttcagaaga ctaaagacct gctcaataat 720 aaaatcgaaa agagaaaatt agaactggaa 780 agtgtcaggc catgttttat ggatgagtat 840 tatgacactt atctggagaa atttcaaaat 900 catcatagga tggagcaaga aaggtttgag 960 aacaagctca aggaggaaga gaagcgcctg 1020 atagacatcc aggaggacga tgaatccgac 1080 ccacagacag ccatggagat gctcatgcaa 1140 atgcaaggtg gagactccga tgacaatgag 1200 gatgatgatg acgaggatga cgatttggaa 1260 cccaatcgaa gggtccggaa atctgaaccc 1320 ttttgccaag ggaccctggc agattaaaac 1380 aaggttagga aggtaacccc tgttttgttt 1440 gcaatactta tttctgcttt agcctcctat 1500 13 201134480 gtttgcattc catgaagctt aaataagaat tgaagcaaat ccctaagatt tatttttttc 1560 caccttattt atcttctaaa acttgaggaa tgcatgtgtt cttagtgatt cacatccacg 1620 ggacaaaaac tcaagaagaa ataagagctg acgccacaca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 a 1681 3 T類 5 1 R 4 4 p > > > > 0 12 3 1— 1— 2 2 2 2 <400> 45

Met Ser Phe Arg Asp Leu Arg Asn Phe Thr Glu Met Met Arg Ala Leu 1 5 10 15

Gly Tyr Pro Arg His lie Ser Met Glu Asn Phe Arg Thr Pro Asn Phe 20 25 30

Gly Leu Val Ser Glu Val Leu Leu Trp Leu Val Lys Arg Tyr Glu Pro 35 40 45

Gin Thr Asp lie Pro Pro Asp Val Asp Thr Glu Gin Asp Arg Val Phe 50 55 60

Phe lie Lys Ala lie Ala Gin Phe Met Ala Thr Lys Ala His lie Lys 65 70 75 80

Leu Asn Thr Lys Lys Leu Tyr Gin Ala Asp Gly Tyr Ala Val Lys Glu 85 90 95

Leu Leu Lys lie Thr Ser Val Leu Tyr Asn Ala Met Lys Thr Lys Gly 100 105 110

Met Glu Gly Ser Glu Me Val Glu Glu Asp Val Asn Lys Phe Lys Phe 115 120 125

Asp Leu Gly Ser Lys lie Ala Asp Leu Lys Ala Ala Arg Gin Leu Ala 130 135 140 14 201134480

Ser 6lu lie Thr Ser Lys Gly Ala Ser Leu Tyr Asp Leu Leu 6ly Met 145 150 155 160

Glu Val Glu Leu Arg Glu Met Arg Thr Glu Ala lie Ala Arg Pro Leu 165 170 175

Glu lie Asn Glu Thr Glu Lys Val Met Arg lie Ala lie Lys Glu lie 180 185 190

Leu Thr Gin Val Gin Lys Thr Lys Asp Leu Leu Asn Asn Val Ala Ser 195 200 205

Asp Glu Ala Asn Leu Glu Ala Lys lie Glu Lys Arg Lys Leu Glu Leu 210 215 220

Glu Arg Asn Arg Lys Arg Leu Glu Thr Leu Gin Ser Val Arg Pro Cys 225 230 235 240

Phe Met Asp Glu Tyr Glu Lys Thr Glu Glu Glu Leu Gin Lys Gin Tyr 245 250 255

Asp Thr Tyr Leu Glu Lys Phe Gin Asn Leu Thr Tyr Leu Glu Gin Gin 260 265 270

Leu Glu Asp His His Arg Met Glu Gin Glu Arg Phe Glu Glu Ala Lys 275 280 285

Asn Thr Leu Cys Leu lie Gin Asn Lys Leu Lys Glu Glu Glu Lys Arg 290 295 300

Leu Leu Lys Ser Gly Ser Asn Asp Asp Ser Asp lie Asp Me Gin Glu 305 310 315 320

Asp Asp Glu Ser Asp Ser Glu Leu Glu Glu Arg Arg Leu Pro Lys Pro 325 330 335

Gin Thr Ala Met Glu Met Leu Met Gin Gly Arg Pro Gly Lys Arg lie 340 345 350 15 201134480

Val Gly Thr Met Gin Gly Gly Asp Ser Asp Asp Asn Glu Asp Ser Glu 355 360 365

Glu Ser Glu lie Asp Met Glu Asp Asp Asp Asp Glu Asp Asp Asp Leu 370 375 380

Glu Asp Glu Ser lie Ser Leu Ser Pro Thr Lys Pro Asn Arg Arg Val 385 390 395 400

Arg Lys Ser Glu Pro Leu Asp Glu Ser Asp Asn Asp Phe 405 410 <210〉 46 <211〉 22 <212〉 DNA <213〉人工 <220〉 〈223>人工序列 <400〉 46 gtctaccagg cattcgcttc at 22 <210> 47 <211〉 24 <212〉 DNA 〈213〉人工 <220〉 〈223>人工序列 <400〉 47 tcagctggac cacagccgca gcgt 24 <210〉 48 <211〉 21 <212〉 DNA <213〉人工 〈220〉 〈223>人工序列 <400〉 48 tcagaaatcc tttctcttga c 21 16 201134480 ^ <210〉 <211> 〈212〉 <213〉 49 24 DNA 人工 <220〉 <223> 人工序列 <400> 49 ctagcctctg gaatcctttc tctt 24 17

Claims (1)

1. 201134480 七、申請專利範圍： 1. 一種經分離的胜肽，具有細胞毒殺性τ淋巴球誘發 能力，其中該胜肽係由CLUAP1之胺基酸序列或一其免疫活 性片段所組成。 2. 如申請專利範圍第1項所述之經分離的胜肽，其中 該胜肽包括一胺基酸序列，其係擇自由序列辨識號：2至 2 3與2 5至4 3所組成之群組》 3. 如申晴專利範圍第1與2項之任一項所述之經分離 的胜肽’其中1、2或數個胺基酸被取代、删除或加入。 4. 如申請專利範圍第3項所述之經分離的胜肽，其中 在人類白血球組織抗原-A24背景下，該胜肽具有下列特徵 之一或兩者： (a) 來自N端之第二個胺基酸為經修飾為一胺基酸， 其係擇自由苯丙胺酸、酪胺酸、曱硫丁胺酸或色胺酸所組 成之群組；以及 (b) C端胺基酸為，或經修飾為—胺基酸，其係擇自 由苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或甲硫丁胺酸所 組成之群組。 5.如申請專利範圍第 在人類白血球組織抗原-A2 之一或兩者： 3項所述之經分離的胜肽，其中 背景下’該胜肽具有下列特徵 一〜π邮伴日田白胺醆孕 硫丁胺酸所組成之群組；以及 (b) C端胺基酸為係擇自由绅 伴目由纈虱酸與白胺酸所組居 201134480 > 群組。 6.如申請專利範圍第1至5項之任一項所述之經分離 的胜肽，其中該胜肽為九胜肽或十胜肽。 7· 一種經分離之多核苷酸，其編碼出如申請專利範圍 第1至6項之任一項所述的該胜肽。 8' 一種誘發細胞毒殺性T淋巴球之組合物，其中該組 合物包括如申請專利範圍第丨至6項之任一項所述之一或 夕個該胜肽，或如申請專利範圍第7項所述之一或多個該 多核苷酸。 9. 一種藥學組合物’用於癌症之治療及/或預防，及/ 或其手術後復發的避免，其中該組合物包括如申請專利範 圍第1至6項之任一項所述之一或多個該胜肽，或如申請 專利範圍第7項所述之—或多個該多核苦酸。 如申明專利範圍第9項所述之藥學組合物，被配 製來用以投予一㈣，其人類白血球組織抗原為人類白血 球組織抗原-A24或人類白血球組織抗原_八2。 U·如申凊專利範圍第9或10項所述之藥學組合物， 其中該組合物被配製來用於癌症之治療。 12. -種誘導具有細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力之抗 原呈現細胞的方法’其中該方法包括一步驟，其係擇自由 下列所組成之群組： (a) in vitro、 胞與如申請專利範圍 觸；以及 α ~叩或//? 將一抗原呈現細 第1至6項之任一項所述之該胜肽接 201134480 (b) 將編碼出如申請專利範圍第1至6項之任—項戶 述之該胜肽的一多核苷酸引入一抗原呈現細胞。 斤 13. —種誘導細胞毒殺性了淋巴球的方法，藉由包括 擇自由下列所組成之群組的一步驟的方法： (a)將CD8陽性Τ細胞與抗原呈現細胞共培養，抗原 見、··胞表現人類白血球組織抗原與如申請專利範圍第 1至6項之任一項所述之該胜肽的複合物於其表面上； ⑻將CD8陽性τ細胞與外吐小體共培養，外吐小體 表現人類白血球組織抗原與如申請專利範圍第丨至6項 之任一項所述之該胜肽的複合物於其表面上；以及 (c) 將一包括編碼出一 τ細胞受體次單元多胜肽之多 核苷酸的基因引入一 τ細胞，該τ細胞受體次單元多胜肽 與如申凊專利範圍第1至6項之任一項所述的該胜肽結合。 it 一種經分離之抗原呈現細胞，其表現一人類白血 球組織抗原與如巾請專利範圍第丨至6項之任—項所述之 該胜肽的複合物於其表面上。 15. 如申請專利範圍第14項所述之抗原呈現細胞，其 藉由如申請專利範圍第12項所述之方法來誘導。 16. —種經分離之細胞毒殺性τ淋巴球，其以如申請 專利範圍第1至6項之任一項所述之該胜肽為標的。 17. 如申晴專利範圍第丨6項所述之細胞毒殺性T淋巴 球，其藉由如申請專利範圍第13項所述之方法來誘導。 18. —種於一個體中誘導一抗癌症之免疫反應的方 法，其中該方法包括投予該個體一組合物，該組合物包括 3 201134480 :广申請專利範圍第1至6項之任—項所述之-胜肽、-其 免疫活性片段’或編碼出該胜肽或該片段之—多核苷酸。 19·—種抗體或其片段，其抗"請專利範圍第u 6項之任一項所述之該胜肽的任一個。 2〇. -種載體，包括編碼出如申請專利範圍第）至6 項之任一項所述之該胜肽的一核苷酸序列。 21. 一種宿主細胞，其被以如申請專利範圍第20項所 述之一表現載體所轉形或轉染。 22. -種診斷套組，包括如中請專利範圍第m項 之任一項所述之職肽、t請專利範圍第7項之該核苦酸 或申請專利範圍第19項之該抗體。 23. 如申請專利範圍第4 6項之任一項所述之經分 離的胜肽，其係擇自由序列辨識號：3、4、5、8、9、丨Q、 14、15、16、18、23、30、33、34、35、36 與 38 所組成 之群組。 4