TW201106969A - Adjuvant cancer therapy - Google Patents

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201106969 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明大體而言係關於治療人類疾病及病理學病狀。更 . 肖定言之，本發明係關於抗血管生成劑在輔助癌症治療中 之用途。 ‘ 本申請案主張2009年4月2〇曰申請之美國臨時申請案第 61/^71008號；2009年4月21日申請之美國臨時申請案第 61/m，318號；及2_年5月26日申請之美國臨時申請案第 6⑽U95號的㈣權及權益，各案之内容㈣引用的方 式併入本文中。 【先前技術】 癌症為人類健康的最致命威脅之一。僅在美國癌症每 年影響將近i30萬名新患者，且為繼心也管疾病之後第二 大死亡原因，每4例死亡中佔約丨例。實體腫瘤為造成大多 數此類死亡之原因。儘管某些癌症之醫療方面存在顯著進 展，但在以往20年中所有癌症之總體5年存活率僅已改良 約癌症或惡性腫瘤以不受控方式快速轉移及生長， 使得極難及時偵測及治療。 • 大夕數當前之癌症治療方法為相對非選擇性的且一般在 ' 癌症已進展至較惡性狀態之後乾向腫瘤。手術移除患病組 織；放射線治療縮小實體腫瘤；且化學治療迅速殺死在分 裂之細胞。化學治療尤其會導致眾多副作用，在一些情況 下，其嚴重程度會限制可給予之劑量且因此排除使用潛在 有效之藥物。此外，癌症經常對化學治療藥物產生抗性。 147729.doc 201106969 β對於大多數新近珍斷出患有可手術治療 之癌症的患者， f準治療為確定性手術，接著化學治療。此治療旨在儘可 :夕地移除原發性及轉移性疾病以防止復發及改良存活。 實務上A夕數此等患者在手術後不具有肉眼可見之殘餘 腫瘤跡象。然而，纟中許多患者以後將產生復發且可能最 終死於其所患疾病。例如當少量活腫瘤細胞在手術之前發 生轉移、避開手術㈣當前偵測技術之限制而在手術後無 法偵測到時，此情形可發生。 因此術後輔助治療成為手術之重要輔助手段，以在此 等殘餘的微小轉移性癌細胞再生且變得難治之前消除此等 細胞。在過去數十年中’輔助治療之進展—般為漸增的 (mCremental)，集中於使用不同的化學治療劑。許多化學 冶療方案已在輔助治療患有早期重大癌症適應症（諸如肺 癌、乳癌及結腸直腸癌）之患者時顯示臨床益處。Straps 等人，·/ C7b 〇„co/ 22:7〇19 (2〇〇4) ; 嶋！

Adjuvant Lung Cancer Trial Collaboration Group N Engl J

Med 350:351-60 (2004)。Moertel 等人，如㈣ 122:321-6 (1995) ； IMPACT Lancet 345:939-44 (1995)；

Citron等人，C/z« 0«co/ 21:1431-9 (2003) 〇 儘管基於化學（chemo-based)之輔助治療存在確定益處， 但與任何種類的化學治療皆相關之一個重大限制為顯著毒 性。化學治療藥物一般不靶向腫瘤部位，且不能區分正常 細胞與腫瘤細胞。在輔助背景下，因為治療持續报久且其 對患者之生活品質造成持續影響’故毒性問題尤其具有挑 147729.doc 201106969 戰=此外，辅助化學治療在具有較低復發風險之患者中 之處仍不清楚，使得可質疑該等患者是否值得承受化學 治療之副作用。 血管生成係指-系列重要之細胞事件，其中血管内皮細 胞經歷增殖、修剪及曹細& 重·，且以自先則存在之血管網路形成新 血吕。有明顯跡象表明’血管聯結發育（devei()pment & vasciUar supply)為正常及病理學增殖過程所必需。氧及營 養素之傳遞’以及分解代謝產物之移除代表在多細胞生物 體中發生的大多數生長過程中之限速步驟。 ，管誘導新血管被視為腫瘤血管生成之主要模式，但最 近資料已表明’―些腫瘤可藉由佔有現存宿主血管而生 長。所佔有之a管結構接著退化，使得腫瘤衰退，最終藉 由腫瘤邊緣處低氧誘導之血管生成而逆轉。 g 正常血管生成與異常血管生成之關鍵陽性調節劑之—為 血管内皮生長因子（VEGF)_A。VEGF_A為包括vegf b : ，VEGF-C、VEGF-D、VEGF_E ' VEGF^ 贿之基因家族 之-部分。VEGF-A主要結合於兩種高親和力受體路胺酸 激酶，即 VEGFR-l(Flt-l)及 VEGFR_2(Flk_1/KDR)，後者為 VEGF-A之血管内皮細胞有絲分裂信號之主要傳遞物。另 外，已鑑別出神經纖毛蛋白·Wneuropilind)為結合肝素之 VEGF-A同功異型物之受體，且可在血管發育中起作用”。之 VEGF為多效性生長因子，除為血管生成因子之外，其 亦在諸如内皮細胞存活及增殖、血管滲透性及血管擴張了 單核細胞趨化性及鈣流入之其他生理學過程中顯示夕 夕種 147729.doc 201106969 物效應。此外，其他研究已報導VEGF對諸如視網膜色素 上皮細胞、胰管細胞及許旺細胞（Schwann cell)之數種非内 皮細胞類型之有絲分裂效應。 由於VEGF被視為病理學病狀中血管生成之主要調節 劑’已多次嘗試在涉及病理學血管生成之條件下阻斷 VEGF活性。 在大部分惡性疾病中VEGF之表現上調，且VEGF過表現 係與許多實體腫瘤之較晚期或較差預後有關。因此，已使 用抑制VEGF信號傳導路徑之分子來治療已注意到病理學 血管生成之相對較晚期實體腫瘤。 因為癌症仍為最致命疾病之一，故可能需要額外治療， 諸如輔助治療。如在論述以下揭示内容之後將顯而易見， 本發明解決此等及其他需要。 【發明内容】 VEGF特異性拮抗劑與化學治療之組合使用已顯示在癌 症(例如轉移性結腸直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌等)患者 中有利，但對在輔助治療中使用抗體所知甚少。 本文中，纟發明係、關於在患有非轉矛多性結腸直腸癌之人類 個體中輔助使用AVASTIN®之臨床研究中獲得之結果。 因此，本發明提供一種輔助治療方法，其包含投與癌 患者有效量之VEGF特異性拮抗劑（例mvegf抗體）歷 -年以上。在-些實施财，輔助治療方法延長患者之 病存活（DFS)或總存活（〇s)。在—些實施财，在起始 療後約2至5年評估（例如分析卿或OS。亦提供一種輔 147729.doc 201106969 ~療方法其包含投與癌症患者有效量之特異性抄 抗劑’其中在以VBGF特異性拮抗劑積極治療期間癌錢 展經防止或延遲，且其中積極治療持續—年以上。在一些 實施例中，已停止以VEGF特異性结抗劑積極治療之後y 癌症進展經防止或延遲約3個月或6個月。本發明進一步提 供-種輔助治療方法’纟包含投與癌症患者有效量之 VEGF特異性拮抗劑，其巾在以VE(}f特異性拮抗劑積極治 療期間癌症復發經防止或延遲，且其中使用vegf特異性 拮抗劑之積極治療持續-年以上n實施财，已停 止以VEGF特異性抬抗劑積極治療之後，癌症復發經防止 或延遲約3、4、5或6個p在某些實施财，在確定性手 術後投與患者VEGF特異性括抗劑。在某些實施例中，包 含投與抗VEGF抗體之辅助治療在治療起始之後持續至少2 年、至少3年 '至少4年、至少5年、至少H)年或1〇年以 上0 本發明提供-種輔助治療方法，其包含投與已接受癌症 確定性手術的患者有效量之VE_錢拮抗劑以延長患 者之DFS或0S’纟中投與乂咖特異性括抗劑歷時一年以 上。在-些實施例中，在起始治療後約⑴年評估⑽或 〇S。亦提供一種輔助治療方法，其包含投與已接受癌症 (例如原發腫瘤）確定性手術的患者有效量之vEGm異性枯 抗劑’其中在以VEGF特異性拮抗劑積極治療期間癌症進 展經防止或延遲’且其中積極治療持續—年以上。在一些 實施例中’已停止以VEGF特異性拮抗劑積極治療之後y 147729.doc 201106969 癌症進展經防止或延遲約3、4、5或6個月。本發明進一步 提供一種輔助治療方法’其包含投與已接受癌症（例如原 發腫瘤）確定性手術的患者有效量之v E G F特異性拮抗劑， 其中在以VEGF特異性拮抗劑積極治療期間癌症復發經防 止或延遲，且其中使用VEGF特異性拮抗劑之積極治療持 續一年以上。在一些實施例中，已停止以veqf特異性拮 抗劑積極治療之後，癌症復發經防止或延遲約3、4、5或6 個月。在某些實施例中，包含投與抗VEGF抗體之輔助治 療在治療起始之後持續至少2年、至少3年、至少4年、至 少5年、至少1〇年或1〇年以上。 本發明進一步提供一種治療已接受癌症（例如原發腫瘤） 確疋性手術的患者之方法，其包含投與該患者包含有效量 之VEGF特異性拮抗劑的輔助治療以延長患者之dfs或 OS，其中投與VEGF特異性拮抗劑歷時一年以上。在一些 實施例中，在起始治療後約2至5年評估（例如分析）DFS或 OS。亦提供一種治療已接受癌症（例如原發腫瘤）確定性手 術的患者之方法，其包含投與該患者包含有效量之veqf 特異性拮抗劑的輔助治療，其中在以VEGF特異性拮抗劑 積極治療期間癌症進展經防止或延遲，且其中積極治療持 續一年以上。在一些實施例中’已停止以乂£(}1?特異性拮 抗劑積極治療之後’癌症進展經防止或延遲約3、4、5或6 個月。本發明進一步提供一種治療已接受癌症（例如原發 腫瘤）確定性手術的患者之方法，其包含投與該患者包含 有效量之VEGF特異性拮抗劑的輔助治療，其中在以vegf 147729.doc 201106969 特異性拮抗劑積極治療期間癌症復發經防止或延遲且其 中使用VEGF特異性拮抗劑之積極治療持續一年以上。在 一些實施例中，已停止以VEGF特異性拮抗劑積極治療之 後’癌症復發經防止或延遲約3、4、5或6個月。在某些實 施例十’該方法包含投與抗VEGF抗體，在治療起始之後 歷時至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少1〇年或 10年以上。 本發明亦提供一種防止或延遲患者癌症復發之方法，其 包含投與該患者有效量之VEGF特異性拮抗劑（例如抗 VEGF抗體）歷時一年以上，其中該投與VEGF特異性拮抗 劑（例如抗VEGF抗體）會防止癌症復發。本發明進一步提供 一種降低患者癌症復發之可能性的方法，其包含投與該患 者有效量之VEGF特異性拮抗劑（例如抗VEGF抗體）歷時一 年以上’其中該投與VEGF特異性拮抗劑（例如抗VEGF抗 體）會降低癌症復發之可能性。 在任一種本發明方法之一些實施例中，該投與VEGF特 異性拮抗劑會防止出現臨床上可偵測的腫瘤或其轉移，或 降低出現臨床上可侦測的腫瘤或其轉移之可能性。 在本發明各方法中，在起始治療之後持續投與VEGF特 異性拮抗劑（例如抗VEGF抗體）歷時至少2年、至少3年、至 少4年、至少5年、至少10年或1 〇年以上。在一些實施例 中’持續投與VEGF特異性拮抗劑（例如抗VEGF抗體）直至 死亡為止。 在本發明各方法中，抗VEGF抗體可經VEGF特異性拮抗 147729.doc 201106969 劑（例如，如下所述之VEGF受體分子或嵌合VEGF受體分 子）替代。抗VEGF抗體可為單株抗體、嵌合抗體、完全人 類抗體或人類化抗體。適用於本發明方法之例示性抗體包 括貝伐單抗（bevacizumab)(AVASTIN®)、G6-31、B20-4.1 及其片段。在一些實施例中，抗VEGF抗體含有包含以下 胺基酸序列之重鏈可變區： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGWINTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYPHYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 1) 及包含以下胺基酸序列之輕鏈可變區： DIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLT1SSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR (SEQ ID NO: 2)。 在本發明方法之某些實施例中，抗VEGF抗體為貝伐單 抗。 本發明各方法之實踐可能與包括（但不限於）癌瘤、淋巴 瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病之癌症的治療相關。此等癌 症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞 肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌 (hepatocellular cancer)、胃腸癌、胰腺癌、神經膠母細胞 瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌（liver cancer)、膀胱癌、肝 腫瘤（hepatoma)、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜 癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌（kidney cancer)、肝癌、前 列腺癌、腎癌（renal cancer)、陰門癌 '曱狀腺癌、肝癌 (hepatic carcinoma)、胃癌、黑色素瘤及各種類型之頭頸 部癌。在本發明方法之一些實施例中，個體患有非轉移性 147729.doc -10- 201106969 結腸直腸癌。在本發明方法之—些實施例中，個體患有轉 移性結腸直腸癌。在-些實施例中，個體患有可切除的n 期或III期結腸癌。 在個體已接受確定性手術之實_中，—般在個體已自 手術恢復-段時間之後投0EGF特異性拮抗劑（例如抗 VEGF抗體）。此時段可包括創口癒合或手術切口癒合所需 之時期、降低創口開裂的風險所需之時段，或個體恢復至 基本上類似於錢於手術前健康程度之健隸度所需之時 段。在完成確定性手術與首次投與抗VEGF抗體之間的時 期亦可包括藥物假日（drug holiday)所需之時期，其十個體 需要或要求各治療方案之間間隔一段時間。在完成確定性 手術與開始抗VEGF抗體治療之間的時段一般可包括小於 一週、1週、2週、3週、4週（28天）、5週、6週、7週、8 週、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個 月、10個月' η個月、i年、2年、3年或3年以上。在一個 實施例中，在確定性手術與投與抗VEGJ^^體之間的時段 大於2週且小於丨年^在一個實施例中，在確定性手術與投 與抗VEGF抗體之間的時段為至少28天。 上文各態樣可進一步包括監測個體之癌症復發。例如可 藉由s平估無病存活（DFS)或總存活（〇s)來實現監測。在— 個實靶例中’在起始治療後約2至5年評估DFS或OS。在一 個實施例中，個體在治療之後無病至少1至5年。 視疾病類型及嚴重程度而定，抗VEGF抗體（例如貝伐單 抗）之較佳劑量係描述於本文中且可介於約i 至約 147729.doc 201106969 mg/kg，最佳約5 mg/kg至約15 mg/kg之範圍内，包括（但不 限於）5 mg/kg、7.5 mg/kg或1〇 mg/kg。投與頻率將視疾病 類型及嚴重程度而變化。對於歷經數天或更久重複投與， 視病狀而疋，持續治療直至如藉由本文所述或此項技術中 已知之方法所量測，已實現所需治療效應為止。在一個實 例中，母週、母兩週或每三週一次投與本發明之抗Vegf 抗體劑里範圍為約5 mg/kg至約15 mg/kg，包括（但不限 於）5 mg/kg、7.5 mg/kg或1〇 mg/kg。然而，其他給藥方案 亦可能適用。藉由習知技術及檢驗容易地監測本發明治療 之進展。 在上文各態樣之其他實施例中，局部或全身性（例如經 或靜脈内）投與VEGF特異性拮抗劑，例如抗抗 體。在一些實施例中，延長使用抗VEGF抗體之治療，直 至患者已無癌症並保持選自由以下組成之群的時段為止： 1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、1〇 年、11年及12年。 在其他實施例中，使用VEGF特異性结抗劑之治療為單 療或如臨床醫師所評估或本文所述，持續時間為 VEGF特異性拮抗劑治療期之單一治療。 在其他實施例中，使用VEGF特異性拮抗劑之治療係與 括（彳不限於）以下之額外抗癌治療組合：手術' 放射治 干'。療、分化治療（differentiating therapy)、生物治 療免疫治療、血管生成抑制劑及抗增殖化合物。使用 VEGF特異性结抗劑之治療亦可包括以上各類型的治療方 147729.doc 12 201106969 案之任何組合。另外，細胞毒性劑、抗血管生成劑及抗增 殖劑可與VEGF特異性拮抗劑組合使用。在一個實施例 中’抗癌治療為化學治療。舉例而言，化學治療劑係選自 例如烷化劑、抗代謝物、葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤 類似物及相關抑制劑、長春花屬生物鹼、表鬼臼毒素、抗 生素、L-天門冬醯胺酶、拓撲異構酶抑制劑、干擾素、鉑 配位錯合物、蒽二酮取代之尿素、甲基肼衍生物、腎上腺 皮質抑制劑、腎上腺皮質類固醇、助孕素、雌激素、抗雌 激素、雄激素、抗雄激素、性腺釋素類似物等。在一些態 樣中，並行（concurrently)投與化學治療劑與特異性 抬抗劑。 在包括額外抗癌治療之實施例中，可在投與Vegf特異 |·生拮抗劑之刖 '期間（例如同時）或之後進一步以額外抗癌 治療治療個體。在一個實施例中，抗癌治療為包括投與奥 沙利鉑（oxaliplatin)、5_氟尿嘧啶、甲醯四氫葉酸或其組合 之化學治療。纟一個f施例+，無論單獨投肖或與抗癌治 療一起投與，VEGF特異性拮抗劑可以維持治療之形式投 與。 本發明方法亦宜防止腫瘤復發或腫瘤（例如在移除原發 腫瘤之後存留之休眠腫瘤）再生長，或宜減少或防止微小 轉移之出現或增殖。 在本發明之以上各態樣之其他實施例中，投與一定量的 VEGF特異性拮抗劑或投與該拮抗劑歷時—定時間⑽如對 於歷經- &時間之特$治療方案），讀高或延長已接受 147729.doc -13· 201106969 治療結腸直腸癌之確定性手術之個體的存活（例如達20%、 30% ' 40% ' 50% ' 60% ' 70% ' 80% > 90% > 100%或 100% 以上）。在一個實例中，以個體之DFS或OS量度存活，其 中在起始以VEGF特異性拮抗劑輔助治療後約2至5年評估 DFS或OS。在一些其他實施例中，使用VEGF特異性拮抗 劑來防止個體癌症復發或癌症進展或降低個體癌症復發或 癌症進展之可能性。 本發明之其他特徵及優勢將自以下實施方式、圖式及申 請專利範圍顯而易見。 【實施方式】 I.定義 術語「VEGF」或「VEGF-A」用以指165個胺基酸之人 類血管内皮細胞生長因子及相關的121、145、189及206個 胺基酸之人類血管内皮細胞生長因子（如例如Leung等人， Science, 246:1306 (1989)及 Houck 等人，Mol. Endocrin·， 5:1806 (1991)所述），以及其天然存在之對偶基因形式及經 處理形式。VEGF-A為包括 VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、 VEGF-E、VEGF-F及P1GF之基因家族之一部分。VEGF-A 主要結合於兩種高親和力受體酪胺酸激酶，即VEGFR-l(Flt-l)及VEGFR-2(Flk-l/KDR)，後者為VEGF-A之血管内 皮細胞有絲分裂信號之主要傳遞物。另外，已鑑別出神經 纖毛蛋白-1為結合肝素之VEGF-A同功異型物之受體，且 可在血管發育中起作用。術語「VEGF」或「VEGF-A」亦 係指來自諸如小鼠、大鼠或靈長類動物之非人類物種之 147729.doc -14- 201106969 VEGF。來自特定物種之VEGF有時由諸如針對人類VEGF 之hVEGF或針對鼠類VEGF之mVEGF的術語指示。術語 「VEGF」亦用以指包含165個胺基酸之人類血管内皮細胞 生長因子之胺基醆8至109或1至109的多肽截短形式或片 段。在本申請案中，對任何此等形式之VEGF之提及均可 例如以「VEGF(8-109)」、「VEGF(1-109)」或「VEGF165」 來鑑別。「截短」之天然VEGF之胺基酸位置係如天然 VEGF序列中所示來編號。舉例而言，截短之天然VEGF中 之胺基酸位置17(曱硫胺酸）亦為天然VEGF中之位置17(甲 硫胺酸）。截短之天然VEGF對KDR及Flt-Ι受體之結合親和 力與天然VEGF相當。 「抗VEGF抗體」為以足夠親和力及特異性結合於VEGF 之抗體。所選抗體通常將對VEGF具有結合親和力，例如 該抗體可以在100 nM-1 pM之間的Kd值結合hVEGF。舉例 而言，可藉由基於表面電漿共振之檢驗（諸如BIAcore檢 驗，如PCT申請公開案第WO 2005/012359號中所述）、酶 聯免疫吸附檢驗（EUSA)及競爭檢驗（例如RIA之競爭檢驗） 測定抗體親和力。在某些實施例中，本發明之抗VEGF抗 體可在靶向及干擾涉及VEGF活性之疾病或病狀時用作治 療劑。又，可對抗體進行其他生物活性檢驗，例如以評估 其作為治療劑之效用。此等檢驗在此項技術中為已知的且 視抗體之靶抗原及預定用途而定。實例包括HUVEC抑制 檢驗；腫瘤細胞生長抑制檢驗（例如在WO 89/06692中所 述）；抗體依賴性細胞毒性（ADCC)及補體介導之細胞毒性 147729.doc •15· 201106969 (CDC)檢驗（美國專利5,500,362);及促效活性或血細胞生 成檢驗（參看WO 95/27062)。抗VEGF抗體通常將不結合於 諸如VEGF-B或VEGF-C之其他VEGF同系物，亦不結合於 諸如P1GF、PDGF或bFGF之其他生長因子。 「VEGF拮抗劑」係指能夠中和、阻斷、抑制、消除、 降低或干擾VEGF活性（包括其結合於一或多種VEGF受體） 之分子。VEGF拮抗劑包括抗VEGF抗體及其抗原結合片 段、受體分子及特異性結合於VEGF藉此隔絕其結合於一 或多種受體之衍生物、抗VEGF受體抗體及VEGF受體拮抗 劑’諸如VEGFR酪胺酸激酶之小分子抑制劑。 「天然序列」多肽包含與源自自然界之多肽具有相同胺 基酸序列之多肽。因此，天然序列多肽可具有來自任何哺 乳動物之天然存在多肽的胺基酸序列。此類天然序列多肽 可由自然界分離’或可由重組或合成方式製得。術語「天 然序列」多肽特定涵蓋多肽之天然存在之截短或分泌形式 (例如細胞外域序列）、多肽的天然存在之變異體形式（例如 替代性剪接形式）及天然存在之對偶基因變異體。 多肽「變異體」意謂與天然序列多肽具有至少約8〇%胺 基酸序列一致性之生物學活性多肽^此等變異體包括例如 在多肽之N端或C端添加或缺失一或多個胺基酸殘基之多 肽。通常，變異體與天然序列多肽將具有至少約8〇%胺基 酸序列一致性、更佳至少約90%胺基酸序列一致性及甚至 更佳至少約95°/。胺基酸序列一致性。 術§吾「抗體」係以最廣泛含義使用且包括單株抗體（包 147729.doc -16 - 201106969 括全長或完整單株抗體）、多株抗體、多價抗體、多特異 性抗體（例如雙特異性抗體）及抗體片段（參看下文），前提 為其顯示所需生物活性。 在整個本說明書及申請專利範圍中，免疫球蛋白重鏈中 殘基之編號為如Kabat專人’ Sequences of Proteins of

Immunological Interest，第 5 版。Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，Md. (1991)中之 EU 索引的編號，該文獻係以引用的方式明確併入本文中。 「如Kabat中之EU索引」係指人類igG1 EU抗體之殘基編 號。 在一個實施例中’本發明之「Kd」或「Kd值」係藉由 放射性標記之VEGF結合檢驗（RIA)量測，該檢驗用Fab型 抗體及VEGF分子如以下檢驗所述來進行，該檢驗藉由在 滴定系列之未標記VEGF存在下以最小濃度之（丨25〗）標記之 VEGF(109)平衡Fab，接著以塗有抗Fab抗體之培養盤捕捉 結合之VEGF來量測Fab對VEGF之溶液結合親和力（Chen等 人，（1999) J. Mo/ 价〇/ 293:865-881)。為建立檢驗條件， 以含5 pg/ml捕捉性抗Fab抗體（Cappel Labs)之50 mM碳酸 鈉（pH 9.6)塗佈微量滴定盤（Dynex)隔夜，且隨後在室溫（約 23°C)下以2%(w/v)牛血清白蛋白之PBS溶液阻斷2至5小 時。在非吸附性培養盤（Nunc #269620)中，使100 ?1^或26 卩^1[1251]\^〇尸（109)與相關？&13(例如？313-12)之連續稀釋液 混合（Presta等人，（1997) Cawcer 及以.57:4593-4599)。接 著培育相關Fab隔夜；然而’培育可持續65小時以確保達 147729.doc 201106969 到平衡。此後，將混合物轉移至捕捉培養盤中以在室溫下 培育一小時。接著移除溶液且以0.1% Tween-20之PBS溶液 洗滌培養盤八次。當培養盤已變乾時，每孔添加150微升 閃爍體（MicroScint-20 ; Packard)，且在 Topcount γ計數儀 (Packard)上對培養盤計數10分鐘。選擇得到小於或等於 20%之最大結合的各Fab濃度用於競爭結合檢驗。根據另 一實施例，藉由使用表面電漿共振檢驗，在25°C下使用 BIAcoreTM-2000 或 BIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc.，Piscataway， NJ)，用固定hVEGF(8-1 09)CM5晶片在約1 0個反應單位 (RU)下量測Kd或Kd值。簡言之，根據供應商說明書以iV-乙基二曱基胺基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC)及iV-羥基丁二醯亞胺（NHS)活化羧甲基化聚葡萄糖生物感測器 晶片（CM5，BIAcore Inc.)。以 10 mM 乙酸納（pH 4.8)將人類 VEGF稀釋為5 pg/ml(約0.2 μΜ)，隨後以5微升/分鐘之流動 速率注射以獲得約10個反應單位（RU)之偶合蛋白。在注射 人類VEGF後，注射1 Μ乙醇胺以阻斷未反應之基團。為進 行動力學量測，在25°C下以約25 μΐ/min之流動速率注射含 0.05% Tween 20之PBS(PBST)中Fab之兩倍連續稀釋液（0_78 nM至500 nM)。使用簡單的一對一朗繆爾結合模型（one-to-one Langmuir binding model)(BIAcore評 估軟體3.2版） ，藉 由同時擬合締合與解離感測器圖譜來計算締合速率汴。„)及 解離速率（k。^)。以比率koff/k^計算平衡解離常數（Kd)。例 如參看 Chen，Y.等人，（1999) ·/· Μο/ Βζ·σ/ 293:865-881。若 藉由上文表面電漿共振檢驗得知締合速率超過106 M“ S·1， 147729.doc • 18 · 201106969 則可使用量測在25°C下20 nM抗VEGF抗體（Fab形式）之 PBS(pH 7.2)溶液的螢光發射強度（激發=295 nm ;發射= 3 40 nm，16 nm帶通）之增加或降低的螢光淬滅技術 (fluorescent quenching technique)，在如在光譜儀（諸如裝 備停流（stop-flow)之分光光度計（Aviv Instruments)或具有 經攪拌光析管之8000系列SLM-Aminco分光光度計 (ThermoSpectronic))中所量測漸增濃度之人類VEGF短形式 (8-109)或小鼠VEGF存在下測定締合速率。 「阻斷」抗體或抗體「拮抗劑」為抑制或降低所結合之 抗原之生物活性的抗體。舉例而言，VEGF特異性拮抗劑 抗體結合VEGF且抑制VEGF誘導血管内皮細胞增殖或誘導 血管滲透性之能力。較佳阻斷抗體或拮抗劑抗體完全抑制 抗原之生物活性。 除非另有指示，否則在整個本說明書中使用表述「多價 抗體」表示包含三個或三個以上抗原結合位點之抗體。舉 例而言，多價抗體係經工程改造以具有三個或三個以上抗 原結合位點且一般不為天然序列IgM或IgA抗體。 「抗體片段」僅包含完整抗體之一部分，一般包括完整 抗體之抗原結合位點且因此保留結合抗原之能力。本定義 所涵蓋之抗體片段的實例包括：（i)具有VL、CL、VH及 CH1域之Fab片段；（ii)Fab'片段，其為在CH1域之C端具有 一或多個半胱胺酸殘基之Fab片段；（iii)具有VH及CH1域 之Fd片段；（iv)具有VH及CH1域及一或多個在CH1域C端之 半胱胺酸殘基的Fd'片段；（v)具有抗體單臂之VL及VH域的 147729.doc •19· 201106969

Fv 片段；（vi)dAb片段（Ward等人，Wiwre 341，544-546 (1989))，其由VH 域組成；（Wi)分離之 cDR 區；（viii)F(ab，)2 片段’即包括兩個Fab'片段藉由鉸鏈區之二硫橋連接的二 價片段，（ix)单鍵抗體分子（例如單鍵Fv ; scFv)(Bird等

人 ’ Sc/ewce 242:423-426 (1988);及 Huston 等人，PAMS 85:5879-5883 (1988)); (X)具有兩個抗原結合位點之 「雙功能抗體」’其包含重鏈可變域（VH)與同一多肽鏈中 之輕鏈可變域（VL)連接（例如參看ΕΡ 404,097 ; WO 93/11161 ;及 Hollinger 等人，Ρπ % 仍乂， 90:6444-6448 (1993)) ; (xi)「線抗體」，其包含一對串聯Fd 區段（VH-CH1-VH-CH1)，該等區段連同互補輕鏈多肽一起 形成一對抗原結合區（Zapata等人，ZVoiek五ng. 8( 10): 1057-1062 (1995);及美國專利第 5,641，870號）。 如本文中所用，術語「單株抗體」係指獲自實質上同源 抗體群體之抗體’亦即構成該群體之個別抗體除可能存在 少量可能天然存在之突變外為相同的。單株抗體針對單一 k原具有尚度特異性。此外，與通常包括針對不同決定子 (抗原決定基）之不同抗體的多株抗體製劑相反，各單株抗 體係針對抗原上之單_決定子。不應將修飾語「單株」視 為需要藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言，欲根據本 發明使用之單株抗體可藉由Kohler等人，256:495 (1975)首先描述之融合瘤方法製得，或可藉由重組dna方 法（例如參看美國專利第4,816,567號）製得。亦可使用例如 在Clackson等人，352:624_628 (1991)或厘紅匕等 147729.doc -20- 201106969 人’ 乂抓/ϋ 222:581-597 (1991)中所述之技術自嗔菌 體抗體文庫中分離「單株抗體」。

Fv」片段為含有完整抗原識別及結合位點之抗體片 ί又。该區域係由一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域緊密締 合之二聚體組成’該等可變域本質上可為共價的，例如在 scFv中。在此組態中，各可變域之三個cdr相互作用以界 定vH-vL二聚體表面上之抗原結合位點。六個cDR或其子 集共同賦予抗體以抗原結合特異性。然而，甚至單一可變 域（或僅包3二個抗原特異性CDR的一半fv)亦具有識別及 結合抗原之能力’但其親和力通常低於整個結合位點。 如本文中所用，「抗體可變域」係指抗體分子之輕鏈及 重鏈中包括互補決定區（CDR ;亦即CDR1、CDR2及CDR3) 及構架區（FR)之胺基酸序列的部分β vH係指重鏈之可變 域。VL係指輕鏈之可變域。根據本發明中所用之方法，指 派給CDR及FR之胺基酸位置可根據Kabat(Sequences 〇f

Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health，Bethesda，Md., 1987及 1991))界定。抗體或抗原結 合片段之胺基酸編號亦係根據Kabat之編號。 如本文中所用，術語「互補決定區」（CDR ;亦即 CDR1、CDR2及CDR3)係指抗體可變域中對於抗原結合而 言必需存在之胺基酸殘基。各可變域通常具有三個經鑑別 為CDR1、CDR2及CDR3之CDR區。各互補決定區可包含 來自如由Kabat定義之「互補決定區」的胺基酸殘基（亦 即，輕鏈可變域中之約殘基24-34(Ll)、50-56(L2)及89- 147729.doc -21- 201106969 97(L3)，及重鏈可變域中之 31-35(H1)、50-65(H2)及 95-102(H3) ； Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological /«iereM，裏5廣。Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，MD. (1991))，及/或來自「高變環」 之殘基（亦即，輕鏈可變域中之約殘基26-32(Ll)、50-52(L2)及 91-96(L3)，及重鏈可變域中之 26-32(Η1)、53-55(H2)及 96-101(H3) ; Chothia 及 Lesk */· Μο/· 196:901-917 (1987))。在一些情況下，互補決定區可包括 來自根據Kabat定義之CDR區與-來自高變環之胺基酸。舉 例而言，抗體4D5之重鏈的CDRH1包括胺基酸26至35。 「構架區」（下文中為FR)為非CDR殘基之可變域殘基。 各可變域通常具有四個經鑑別為FR1、FR2、FR3及FR4之 FR。若CDR係根據Kabat定義，則輕鏈FR殘基位於約殘基 1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)及 98-107 (LCFR4)處，且重鏈FR殘基位於重鏈殘基中之約殘基卜 30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)及 103-113 (HCFR4)處。若CDR包含來自高變環之胺基酸殘基，則輕 鏈FR殘基位於輕鏈中之約殘基1-25(LCFR1)、33-49 (LCFR2)、53-90(LCFR3)及 97-107(LCFR4)處，且重鏈 FR 殘基位於重鏈殘基中之約殘基1-25(HCFR1)、33-52 (HCFR2)、56-95(HCFR3)及102-113(HCFR4)處。在一些情 況下，當CDR包含來自如Kabat定義之CDR之胺基酸與高 變環之胺基酸時，FR殘基將相應地經調節。舉例而言，當 CDRH1包括胺基酸H26-H35時，重鏈FR1殘基係在位置1- 147729.doc •22- 201106969 25且FR2殘基係在位置36-49。 「Fab」片段含有輕鏈之可變域及恆定域，及重鏈之可 變域及第一恆定域（CH1)。F(ab，）2抗體片段包含一對Fab片 段，此對片段一般藉由其間之鉸鏈半胱胺酸在接近其缓基 端處共價連接。此項技術中亦已知抗體片段之其他化學偶 合。 「單鍵Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體之^及％域， 其中此等域存在於單一多肽鏈中。Fv多肽一般進一步包含 在VH域與VL域之間的多肽連接子，其使scFv能夠形成供抗 原結合之所需結構。關於SCJ7V之回顧，參看pluckthun， Pharmacology 〇f Monoclonal Antibodies > 第 113 卷，

Rosenburg及 Moore編。Springer-Verlag，New York，第 269- 315頁（1994)。 術語「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗 體片段’該等片段包含重鏈可變域（Vh)與同一多肽鏈（Vh 及vL)中之輕鏈可變域（Vl)連接。藉由使用過短而無法使 同一鏈上兩個域之間配對的連接子，迫使該等域與另一鏈 之互補域配對且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體係較 充分地描述於例如EP 404,097 ; WO 93/11161 ;及 Hollmger等人，pr〇(；·勤"5ci•仍乂 9〇:6444_6448 (1993)中。 表述線抗體」係指Zapata等人，ZVo/ek , 8( 10): 1057-1062 (1995)中所述之抗體。簡言之，此等抗體包含 一對串聯Fd區段（VH-CH1-VH-CH1)，該等區段連同互補輕 147729.doc -23- 201106969 鏈多肽一起形成一對抗原結合區。線抗體可為雙特異性或 單特異性的。 本文中’單株抗體特定包括「嵌合」抗體（免疫球蛋 白）’其中重鏈及/或輕鏈之一部分係與源自特定物種或屬 於特定抗體種類或子類之抗體中的相應序列一致或同源， 而該鏈之其餘部分係與源自另一物種或屬於另一抗體種類 或子類之抗體中的相應序列一致或同源，以及此等抗體之 片段，前提為其顯示所需生物活性（美國專利第4,8 16,567 號；及Morrison等人，TVai/. 81:6851- 6855 (1984))。 非人類（例如鼠類）抗體之「人類化」形式為含有源自非 人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。人類化抗體一般 為人類免疫球蛋白（受體抗體），其中來自受體高變區之殘 基係經來自諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物之非 人類物種（供體抗體）之高變區的具有所需特異性、親和力 及能力之殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv 構架區（FR)殘基係經相應非人類殘基置換。此外，人類化 抗體可包含受體抗體或供體抗體中未見之殘基。進行此等 修飾以進一步改進抗體效能。人類化抗體一般將包含至少 一個且通常兩個可變域之實質上全部，其中所有或實質上 所有高變環均對應於非人類免疫球蛋白之高變環，且所有 或貫質上所有FR區均為人免疫球蛋白序列.之fr區。人類 化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區（Fc)之至少一部 分，通常包含人類免疫球蛋白恆定區之至少一部分。有關 147729.doc -24- 201106969 進一步細節，參看 Jones 等人，321:522-525 (1986) ; Riechmann等人，iVaiwre 332:323-329 (1988);及 Presta，Cwrr. Op. *S^rMci. βίο/· 2:593-596 (1992)。 「人類抗體」為具有對應於人類產生之抗體之胺基酸序 列的胺基酸序列及/或已使用任何如本文所揭示之製造人 類抗體之技術製得的抗體。人類抗體之此定義尤其排除包 含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。人類抗體可使用此 項技術中已知之各種技術製得。在一個實施例中，人類抗 體係選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫表現人類抗體 (Vaughan等人 ’ iVa/wre 14:309-314 (1996);

Sheets等人，/VW/· Jcai/· Scz·. 95:6157-6162 (1998);

Hoogenboom 及 Winter， J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks等人 ’《/· Mo/. 5ζ·ο/·，222:581 (1991))。人類抗體亦可 藉由將人類免疫球蛋白基因座引入内源性免疫球蛋白基因 已部分或完全失活之轉殖基因動物（例如小鼠）中而製得。 攻毒後，觀察人類抗體產生，其在所有方面均密切地類似 於人類中所見，包括基因重排、組裝及抗體譜。此方法係 描述於例如美國專利第5,545,807號；第5,545,806號；第 5,569,825 號；第 5,625，126 號；第 5,633,425 號；第 5,661，016號，及以下科學出版物中·· Marks等人， 扣10: 779-783 (1992) ; Lonberg等人，TVaiwre 368: 856-859 (1994) ； Morrison, Nature 368:812-13 (1994) ; Fishwild等人，iVaiwre 14: 845-51 (1996) ； Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)； 147729.doc -25- 201106969

Lonberg^ Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995) 〇 或者，可經由永生化人類B淋巴細胞，使得產生針對乾抗 原之抗體來製備人類抗體（此等B淋巴細胞可自個體回收， 或可能已經活體外免疫）。例如參看Cole等人，Monoclonal

Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，第 77 頁 (1985) ; Boerner等人，/· /ww⑽σ/·, 147 (1):86-95 (1991); 及美國專利第5,750,373號。 「親和力成熟」抗體為與不具有改變之親本抗體相比， 在一或多個CDR中具有一或多種改變，使得抗體對抗原之 親和力存在改良的抗體。較佳之親和力成熟抗體將對乾抗 原具有奈莫耳或甚至皮莫耳級之親和力。親和力成熟抗體 係藉由此項技術中已知之程序製造。Marks等人，

Bio/Technology 10:779-783 (1992)描述藉由 VH 及 VL 域改組 貫現親和力成熟。以下文獻描述CDR及/或構架殘基之隨 機突變誘發：Barbas 等人，/Voc iVai. Jcad. Se/, 91:3809-3813 (1994) ; Schier 等人，169:147-155 (1995) ; Yelton等人，155:1994-2004 (1995); Jackson 等人，《7. /wmwwo/· 154(7):3310-9 (1995);及 Hawkins等人，/. Mo/. 226:889-896 (1992)。 抗體之「功能性抗原結合位點」為能夠結合乾抗原之位 點。抗原結合位點之抗原結合親和力未必與引出該抗原結 合位點之親本抗體一樣強，但結合抗原之能力必須能使用 已知用於評估抗體結合於抗原之多種方法中的任一者來量 測。此外’本文中之多價抗體之各抗原結合位點的抗原結 147729.doc •26· 201106969 合親和力不需相同定量。對於本文中之多聚抗體，功能性 抗原結合位點之數目可使用超速離心分析來評估，如美國 專利申請公開案第20050186208號之實例2中所述。根據此 分析方法，合併不同比率之靶抗原與多聚抗體，且假設功 能性結合位點之數目不同來計算複合物之平均分子量。將 此等理論值與所得實際實驗值相比較’以評估功能性結合 位點之數目。 具有指定抗體之「生物學特徵」之抗體為具有該抗體之 一或多種生物學特徵的抗體，該等生物學特徵使其與結合 於相同抗原之其他抗體相區分。 為篩選結合於相關抗體所結合之抗原上之抗原決定基的 抗體，可進行常規交叉阻斷檢驗（er〇ss_bl〇cking assay)， 諸如 Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow及 David Lane 編（1988)中描述之檢驗。 「物種依賴性抗體」為對來自第一哺乳動物物種之抗原 的結合親和力強於其對來自第二哺乳動物物種之該抗原的 同系物之結合親和力的抗體。通常，物種依賴性抗體「特 異性結合於」人類抗原（亦即，具有不大於約1 X 1 〇-7 Μ、較 佳不大於約1 X 1 Ο·8 Μ且最佳不大於約1 X丨〇·9 μ之結合親和 力（Kd)值），但對來自第二非人類哺乳動物物種之該抗原之 同系物的結合親和力為其對該人類抗原之結合親和力之 1/(至少約50)，或1/(至少約5〇〇)，或ι/(至少約ι〇〇〇)。物種 依賴性抗體可為如上文所定義之各種類型抗體中之任一 者’但通常為人類化或人類抗體。 147729.doc -27- 201106969 如本文中所用，「抗體突變體」或「抗體變異體」係指 物種依賴性抗體之胺基酸序列變異體，其中物種依賴性抗 體之一或多個胺基酸殘基已經修飾。此等突變體與物種依 賴性抗體必定具有小於100%之序列一致性或相似性。在 一個實施例中，抗體突變體之胺基酸序列將與物種依賴性 抗體之重鏈可變域或輕鏈可變域之胺基酸序列具有至少 75%、更佳至少80°/。、更佳至少85%、更佳至少90%且最佳 至少95%之胺基酸序列一致性或相似性。相對於此序列之 一致性或相似性在本文中係定義為在比對序列且必要時引 入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，候選序列中與 物種依賴性抗體殘基一致（亦即，相同殘基）或相似（亦即， 來自基於共同側鏈特性的同一組之胺基酸殘基，參看下 文）之胺基酸殘基的百分比。可變域外部抗體序列中之N 端、C端或内部延伸、缺失或插入均不應解釋為影響序列 一致性或相似性。 為增加含有本發明之胺基酸序列之抗體或多肽的半衰 期’例如美國專利5,739,277中所述，可使救助受體結合抗 原決定基（salvage receptor binding epitope)連接至抗體（尤 其為抗體片段）。舉例而言，編碼救助受體結合抗原決定 基之核酸分子可以同框方式（in frame)連接於編碼本發明之 多肽序列的核酸’以致由經工程改造之核酸分子表現的融 合蛋白包含救助受體結合抗原決定基及本發明之多肽序 列。如本文中所用，術語「救助受體結合抗原決定基」係 指IgG分子（例如igG,、igG2、IgG3或IgG4)之Fc區中負責增 147729.doc • 28- 201106969 加IgG分子之活體内血清半衰期的抗原決定基（例如Ghetie 等/^，Ann. Rev. Immunol. 1 8:739-766 (2000)，表 1)。Fc區 中具有取代且血清半衰期增加之抗體亦描述於WO 00/42072、WO 02/060919 ; Shields 等人，Chem. 276:6591-6604 (2001) ； Hinton, J. Biol. Chem. 279: 6213-6216 (2004)中。在另一實施例中，亦可例如藉由連接其他 多肽序列來增加血清半衰期。舉例而言，可使適用於本發 明方法之抗體或其他多肽連接於結合於FcRn受體或血清白 蛋白結合肽之血清白蛋白或血清白蛋白之一部分，以致血 清白蛋白結合於該抗體或多肽，例如此等多肽序列係揭示 於WO 01/45746中。在一個實施例中，欲連接之血清白蛋 白肽包含DICLPRWGCLW之胺基酸序列。在另一實施例 中，藉由此等方法增加Fab之半衰期。關於血清白蛋白結 合肽序列，亦參看 Dennis等人，乂 277:35035- 35043 (2002)° 「嵌合VEGF受體蛋白」為具有源自至少兩種不同蛋白 質之胺基酸序列的VEGF受體分子，該至少兩種不同蛋白 質中至少一者為VEGF受體蛋白。在某些實施例中，嵌合 VEGF受體蛋白能夠結合於VEGF且抑制VEGF之生物活 性。 「分離之」抗體為已經鑑別且自天然環境之組分分離 及/或回收之抗體。其天然環境之污染物組分為會干擾抗 體之診斷或治療用途的物質，且可包括酶、激素及其他蛋 白質性或非蛋白質性溶質。在某些實施例中，抗體將純化 147729.doc -29- 201106969 ()至如勞立法（Lowry method)所測定大於95重量％之抗 體’且最佳大於99重量％之抗體，（2)至足以藉由使用旋杯 式序列分析儀獲得N端或内部胺基酸序列之至少15個殘基 的程度’或（3)至均質，如藉由SdS-PAGE，在還原或非還 原條件下’使用考馬斯藍（Coomassie blue)或銀染色（silver SUln)達成°由於抗體之天然環境之至少一種組分將不會 存在’分離之抗體包括原位處於重組細胞内之抗體。然 而’分離之抗體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。 「片段」意謂多肽或核酸分子之一部分，其較佳含有該 參考核酸分子或多肽之整個長度的至少1〇%、2〇0/〇、 30%、40。/〇、50%、60%、70%、80%、90%、95%或 95%以 上。片段可含有 10、20、30、40、50、60、70、80、90或 1〇〇、200、300、400、500、600 或 600個以上核苷酸，或 、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、 140、160、180、190、200 或 200個以上胺基酸。 「抗血管生成劑」或「血管生成抑制劑」係指直接或間 接抑制血管生成、血小管生成或不合需要之血管滲透性的 小分子量物質、聚核苷酸、多肽、分離之蛋白質、重組蛋 白、抗體’或其結合物或融合蛋白。應瞭解，抗血管生成 劑包括結合血管生成因子或其受體且阻斷其血管生成活性 的藥劑。舉例而言，抗血管生成劑為如上文所定義之血管 生成劑之抗體或其他拮抗劑，例如VEGF-A或VEGF-A受體 (例如KDR受體或Fit-】受體）之抗體、抗pDGFR抑制劑，諸 如GleevecT (甲績酸伊馬替尼（Imatinib Mesylate))。抗血 147729.doc •30- 201106969 s生成劑亦包括天然血官生成抑制劑，例如血管抑制素、 内皮抑制素等。例如參看Klagsbrun及D'Amore，J«账及ev 以州〇/·，53:217-39 (1991) ; Streit 及 Detmar，0«coge似， 22:3172-3179 (2003)(例如表3列出惡性黑色素瘤之抗血管 生成治療）；Ferrara及Alitalo, Me山ϋβ 5:1359-1364 (1999) ; Tonini等人 ’ 22:6549-6556 (2003)(例如 表2列出已知抗血管生成因子）；及Sat〇 j c⑽ 〇«co/·，8:200-206 (2003)(例如表1列出用於臨床試驗中之 抗血管生成劑）。 本文中，「速效劑量（loading dose)」一般包含投與患者 之治療劑的初始劑量’且繼之以其一或多個維持劑量。一 般投與單次速效劑量，但本文中涵蓋多次速效劑量。通 吊，所彳又與之速效劑量的量超過所投與之維持劑量的量， 及/或速效劑量之投與比維持劑量頻繁，以使達成治療劑 之所需穩態濃度早於維持劑量所能達成。 本文中，「維持」劑量係指歷經治療期或在治療期之後 投與患者之一或多劑治療劑。維持劑量通常以隔開之治療 時間間隔，諸如約每週、約每2週、約每3週或約每4週投 與。 「可手術治療之」癌症係指限於原發器官且適於手術之 癌症。 存活」係私患者保持活著，且包括無病存活（DFS)及 總存活（〇S)。存活可藉由卡普蘭·邁耶法（KapUn_Meier meth〇d)評估，且使用分層對數等級測試（stratified 1〇g 147729.doc 201106969 rank tes〇來計算任何存活差異。 無病存活（DFS)」係指患者在癌症未復發之情況下保 持活著疋時段，諸如自治療起始或自初始診斷起约j 年、約2年、約3年 '約4年、約5年、約10年等。在本發明 4〜樣中’根據治療意向原則（intent-to-treat pHncip⑷分析DFS，亦即基於患者之指定治療來評估患 者。DFS分析中所用之事件可包括癌症之局部、區域及遠 端復發、出現繼發性癌症，及無先前事件（例如結腸直腸 癌復發或第二種原發癌）之患者死亡原因。 「總存活」係指患者保持活著—定時段，諸如自治療起 始或自初始診斷起約巧、約2年、約3年、約_、約$ 年、約10年等。在本發明之 w九1F用於存活分析之事件 為死亡原因。 =存活」•「提高存活可能性」意謂相對於未經 療之患者（亦即相對於未以例如抗vegf抗體之Μ 性抬抗劑治療之患者）’或相對於對照治療方案（諸如僅 化學治療劑’諸如結腸直腸癌標準護理中所用者，例如 酿四氯葉酸、氣…、奥沙利麵、伊Π 叫或其組合治療），經治療之患 〇S或提高在-定時間點保持活著及/或無病之機率在 :治療後或在初始診斷後，監測存活至: 月、六個月、九個月，或至少約^，或至 少約3年，或至少約4年’或至少約5 或 等。 或至少約1 〇 147729.doc 32. 201106969 概要，：：中之：危險比率」為兩條存活曲線之間差異的 、"^追㈣間治療組較對照組死亡驗降低。危 險比率為事件+ > L φ ^ 十、，先計學定義。為本發明之目的，危險 比率係以表示在任何特 行疋f間點貫驗組中事件之機率除以 對照組中事件之機率所定義。 術語「並杆，a I + i m 在本文中用以指投與兩種或兩種以上治療 劑’其中至少—部分投與在時間上重疊。目此，並行投與 匕括在中止杈與-或多種其他藥劑之後繼續投與一或多種 藥劑之給藥方案。 單療」意謂包括在治療期過程期間僅單一治療劑 用於治療癌症或腫瘤之治療方案。使用vegf特異性枯抗 劑之單一治療意謂在治療期期間，在無其他抗癌治療存在 下投與VEGF特異性括抗劑。 本文中’「輔助治療」係指在確定性手術之後給予之治 療，其後無法偵測到殘餘疾病之跡象，以便降低疾病局部 或轉移性復發之風險。輔助治療之目標在於防止或延遲癌 症復發，且因此降低癌症相關死亡之可能性。 「維持治療」意謂為降低初始治療介入之有利結果後疾 病復發或進展之可能性而給予的治療方案。可提供維持治 療歷時任何時間長度，包括延長時段至個體之壽命。可在 初始治療之後或與初始治療或額外治療聯合提供維持治 療。用於維持治療之劑量可變化且可包括與其他類型治療 所用之劑量相比減小之劑量。 本文中’「標準護理」化學治療係指常規用以治療特定 147729.doc •33- 201106969 癌症之化學治療劑。 「確定性手術」之使用如同該術語在醫學社區（medico community)中所用，且通常係指結果為可能治癒之手術。 確定性手術包括例如使得腫瘤經移除或 其他程序，包括使得所有粗略可見之腫瘤均經2 = ^ 之程序。確定性手術包括例如完全或治癒性切除或完全整 體切除腫瘤。確定性手術包括在一或多個階段中發生之程 序，且包括例如多階段外科程序，其中一或多個外科程序 或其他程序係在腫瘤切除之前進行^確定性手術包括移除 或切除腫瘤（包括累及之器官、器官之部分及組織，以及 周圍器官，諸如淋巴結、器官之部分或組織）之程序。 術》a G症」及「癌性的」係指或描述哺乳動物中通常 特徵在於不受調節之細胞生長的生理學病狀。此定義包括 良性及惡性癌症以及休眠腫瘤或微小轉移。癌症之實例包 括（但不限於）癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。 此等癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、肺癌（包括小細 胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀癌）、腹膜癌、 肝細胞癌、胃癌（包括胃腸癌）、胰腺癌、神經膠母細胞 瘤、子S頸癌、印巢癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳癌、 結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌或子宮癌、唾液腺癌、 腎癌、肝癌、前列腺癌.、陰門癌、曱狀腺癌、肝癌及各種 類型之頭頸部癌’以及B細胞淋巴瘤（包括低級/濾泡性非 霍奇金氏淋巴瘤（non-Hodgkin，s lymphoma/NHL);小淋巴 細胞（SL)NHL ;中級/濾泡性NHL ;中級彌漫性NHL ;高級 147729.doc •34· 201106969 免疫母細胞NHL ;高級淋巴母細胞NHL ;高級小無裂細胞 NHL(high grade small non-cleaved cell NHL);巨大腫瘤 (bulky disease)NHL ;套細胞淋巴瘤；AIDS相關淋巴瘤； 及瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症（Waldenstrom's Macroglobulinemia));慢性淋巴細胞白血病（CLL);急性 淋巴母細胞白血病（ALL);毛細胞白血病；慢性骨髓母細 胞白血病；及移植後淋巴增生性病症（PTLD)，以及與母斑 細胞病、水腫（諸如與腦腫瘤相關之水腫）及梅格斯氏症候 群（Meigs' syndrome)相關之異常血管增生。 「轉移」意謂癌症自其原發部位擴散至體内其他位置。 癌細胞可離開原發腫瘤，滲入淋巴管及血管中，循環通過 血流，且在體内其他各處正常組織内之遠端中心生長（轉 移）。轉移可為局部或遠端的。咸信轉移為連續過程，視 腫瘤細胞離開原發腫瘤、穿過血流且停在遠端部位而定。 細胞在新部位建立血液供應且可生長以形成威脅生命之塊 狀物。腫瘤細胞内之刺激與抑制分子路徑均調節此行為， 且腫瘤細胞與返端部位宿主細胞之間的相互作用亦為顯著 的0 微小轉移」意謂少量細胞已自原發腫瘤擴散至身體其 他部分。筛選或診斷測試中可能偵測到或可能偵測不到微 小轉移。 本文中，「癌症復發」係指在治療之後癌症復發，且包 括癌症在原發器官中復發，以及癌症在原發器官外部復: 147729.doc •35- 201106969 處於「高癌症復發風險」下之個體為經歷癌症復發之可 能性較大的個體。例如相對較年輕個體(例如小於約5〇 歲）’有陽性淋巴結，尤其4個或4個以上累及淋巴結（包括 4-9個累及淋巴結，及10個或1〇個以上累及淋巴結)之個 體’及腫瘤直徑大於2 em(例如在乳癌患者中）之個體。個 體之風險程度可由熟練醫師測定。一般而言，此等高風險 個體將具有淋巴結累及(例如有4個或4個以上累及淋巴 然而，無淋巴結累及之個體例如在腫瘤大於或等於2 cm時亦具高風險。 、 「癌症復發風險降低」意謂相對於未經治療之患者（亦 即相對於未以例如抗VEGF抗體之VEGF特異性拮抗劑治療 之患者），或相對於對照治療方案（諸如僅用化學治療劑治 療，該化學治療劑諸如為結腸直腸癌標準護理中所用者， 例如曱醯四氫葉酸、5-氟尿嘧啶、奥沙利鉑、伊立替康或 其組合），降低經歷癌症復發之可能性。在起始治療後或 在初始診斷後，監測癌症復發歷時至少約兩個月、四個 月、六個月、九個月或至少約丨年，或至少約2年，或至少 約3年，或至少約4年，或至少約5年，或至少約10年等。 「起始治療」係指在手術移除腫瘤之後開始治療方案。 在一個實施例中，此可指在手術後投與一或多種化學治療 劑。或者’此可指初始投與VEGf特異性拮抗劑（例如抗 VEGF抗體）及一或多種化學治療劑。 本文中，「治癒」癌症意謂視癌症類型而定，在開始輔 助治療後約2、3、4或約5年無癌症復發。 147729.doc -36- 201106969 如本文中所用，「腫瘤」係指所有惡性或良性贅生性細 胞生長及增殖，及所有癌前及癌性細胞及組織。 「腫瘤休眠」意謂長久靜態，其中腫瘤細胞存在，但踵 瘤進展在臨床上不明顯。_選或診斷測試中可能偵測到或 可能偵測不到休眠腫瘤。 「個體」意謂哺乳動物，包括（但不限於）人類或非人類 哺乳動物，諸如牛、馬、犬、綿羊或貓科動物。個體較佳 為人類。患者在本文中亦為個體。 個體之「群體（population)」係指諸如在臨床試驗中或如 由腫瘤學家按照特定適應症之核准（例如FDA核准K諸如癌 症輔助治療）所見患有癌症的個體之組。 術5吾「抗癌治療」係指適用於治療癌症之治療。抗癌治 療劑之實例包括（但不限於）例如手術、化學治療劑、生長 抑制劑、細胞毒性劑、放射治療中所用之藥劑、抗血管生 成劑、細胞凋亡劑、抗微管蛋白劑，及其他治療癌症之藥 劑，諸如抗HER-2抗體、抗CD20抗體、表皮生長因子受體 (EGFR)拮抗劑（例如赂胺酸激酶抑制劑）、heri /EGFR抑制 劑（例如埃羅替尼（erlotinib)(Tarceva®))、血小板衍生生長 因子抑制劑（例如GleevecTM(曱磺酸伊馬替尼））、COX-2抑 制劑（例如塞内昔布（celec〇xib))、干擾素、細胞激素、結 合於一或多種以下革巴ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、 BlyS、APRIL、BCMA 或 VEGF 受體、TRAIL/Apo2 之拮抗 劑（例如中和抗體）’及其他生物活性劑及有機化學劑等。 本發明亦包括此等藥劑中兩者或兩者以上之組合。 147729.doc -37- 201106969 如本文中所用’術語「細胞毒性劑」係指抑制或防止細 胞功能及/或使細胞受到破壞之物質。該術語意欲包括放 射性同位素（例如 At211、I131、I125、γ9〇、Rei86、Rel88、

Sm153、Bi212、P32 ’及Lu之放射性同位素）、化學治療劑， 及毒素，諸如細菌、真菌 '植物或動物來源之小分子毒素 或酶促活性毒素，包括其片段及/或變異體。 「化學治療劑」為適用於治療癌症之化合物。化學治療 劑之實例包括適用於治療癌症之化合物。化學治療劑之實 例包括烷化劑’諸如噻替派（thiotepa)及CYTOXAN®環碟 酿胺；烧基續酸醋’諸如硫酸布他卡因（busulfan)、英丙 舒凡（improsulfan)及哌泊舒凡（pip0SUlfan);氮丙咬，諸如 苯唑多巴（benzodopa)、卡波醌（carboquone)、米特多巴 (meturedopa)及尤利多巴（uredopa);伸乙基亞胺及曱基三 聚氰胺，包括六甲蜜胺（altretamine)、三伸乙基蜜胺、三 伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基蜜胺；多 聚乙醯（acetogenin)(尤其布拉他辛（bullatacin)及布拉他辛 酮（bullatacinone));喜樹驗（camptothecin)(包括合成類似 物拓朴替康（topotecan));苔蘚蟲素（bryostatin);卡利斯達 汀（callystatin) ; CC-1065(包括其阿多來新（adozelesin)、卡 折來新（carzelesin)及比折來新（bizelesin)合成類似物）；自 念珠藻環肽（cryptophycin)(尤其自念珠藻環肽1及自念珠藻 環肽8);海兔毒素（dolastatin);多卡米辛（duocarmycin)(包 括合成類似物KW-2189及CB1-TM1); 艾榴素 (eleutherobin);盤克斯達 ί丁（pancratistatin);沙考的汀 147729.doc -38- 201106969 (sarcodictyin);海綿素（spongistatin);氮芥（nitrogen mustard)，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芬（chlornaphazine)、氣 碟醯胺（cholophosphamide)、雌莫司 丁（estramustine)、異 環峨醯胺、二氯甲二乙胺（mechlorethamine)、鹽酸二氣曱 二乙胺氧化物（mechlorethamine oxide hydrochloride)、美 法命（melphalan)、新恩比興（novembichin)、膽固醇對苯乙 酸 II 芬（phenesterine)、松龍苯芬（prednimustine)、曲破胺 (trofosfamide)、尿喊咬芥（uracil mustard);亞;G肖基脲，諸 如卡莫司 ί丁（carmustine)、氣脲黴素（chlorozotocin)、福莫 司、;丁（fotemustine)、洛莫司汀（lomustine)、尼莫司、;丁 (nimustine)及雷莫司汀（ranimnustine);抗生素，諸如烯二 快抗生素（例如刺孢黴素（calicheamicin)，尤其刺孢黴素γΐΐ 及刺孢徽素 ωΐΐ (例如參看 Agnew，C/zem /«ί/. 33: 183-186 (1994));達米辛（dynemicin)，包括達米辛 A ;雙 鱗酸鹽，諸如氣屈膦酸鹽（clodronate);斯培拉黴素 (esperamicin);以及新抑癌素發色團及相關色蛋白烯二炔 抗生素發色團）、阿克拉黴素（aclacinomysin)、放線菌素 (actinomycin)、蒽黴素（authramycin)、偶氮絲胺酸 (azaserine)、博萊黴素（bleomycins)、放線菌素 C(cactinomycin)、卡拉比辛（carabicin)、洋紅黴素 (carminomycin)、嗜癌菌素（carzin〇philin)、色黴素 (chromomycinis)、更生黴素（dactinomycin)、道諾黴素 (daunorubicin)、地托比星（detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN® 小紅莓（doxorubicin)(包括 147729.doc •39· 201106969 (N-嗎啉基）-小紅莓、氰基（N_嗎啉基）_小紅莓、2_(Ν_Π比咯 啉基）-小紅莓（2-pyrrolino-dox〇rubicin)及去氧小紅莓）、表 柔比星（epirubicin)、依索比星（es〇rubicin)、伊達比星 (idambicin)、麻西羅黴素（marceU〇mycin)、絲裂黴素 (mit〇mycin)(諸如絲裂黴素 c)、黴酚酸（myc〇phen〇lic acid)、諾加黴素（nogalamycin)、橄欖黴素（olivomycin)、 培洛黴素（peplomycin)、潑非徽素（p〇tfir〇mycin)、嗓呤徽 素（puromycin)、奎那黴素（quelamycin)、羅多比星 (rodorubicin)、鏈黑菌素（strept〇nigrin)、鏈脲黴素 (streptozocin)、殺結核菌素（tubercidin)、烏苯美司 (ubenimex)、淨司他丁（zinostatin)、左柔比星（z〇rubicin); 抗代謝物’諸如曱胺嗓吟（methotrexate)及5-氟尿喷咬（5-FU) ’葉酸類似物’諸如迪諾特寧（den〇pterin)、曱胺〇巣 吟、蝶羅。令（pteropterin)、三曱曲沙（trimetrexate);嗓吟類 似物’諸如敗達拉濱（fludarabine)、6-酼基°票吟（6_ mercaptopurine)、硫咪嘌呤（thiamiprine)、硫鳥嘌呤 (thioguanine);嘧啶類似物，諸如安西他濱（ancitabine)、 阿紫胞苦（azacitidine)、6-氮雜尿苦（6-azauridine)、卡莫氟 (carmofur)、阿糖胞苷（cytarabine)、雙去氧尿苦 (dideoxyuridine)、去氧氟尿苷（doxifluridine)、依諾他濱 (enocitabine)、氟尿苷（floxuridine);雄激素，諸如卡普睾 酮（calusterone)、丙酸屈他雄酮（dromostanolone propionate)、環硫雄醇（epitiostanol)、美雄烧 (mepitiostane)、睾内酯（testolactone);抗腎上腺劑，諸如 147729.doc -40· 201106969 胺魯米特（aminoglutethimide)、米托坦（mitotane) ' 曲洛司 坦（trilostane);葉酸補充劑，諸如夫羅林酸（frolinic acid); 醋葡醛内酯（aceglatone); 醛磷醯胺醣苷 (aldophosphamide glycoside);胺基乙醯丙酸 (aminolevulinic acid);恩尿嘯 °定（eniluracil);安 β丫咬 (amsacrine);倍思塔布（bestrabucil);比生群（bisantrene); 艾達曲克（edatraxate);得弗伐胺（defofamine);秋水仙胺 (demecolcine)；地0丫酿（diaziquone);依氟鳥胺酸 (elfornithine);依利醋敍（elliptinium acetate);艾普塞隆 (epothilone);乙環氧咬（etoglucid);硝酸鎵；經基服；香 益多糖（lentinan);羅尼達寧（lonidainine);美登素類 (maytansinoid) >諸如美登素（maytansine)及安絲菌素 (ansamitocin);米托胍腙（mitoguazone);米托蒽酿 (mitoxantrone)；莫派達醇（mopidanmol)；硝拉維林 (nitraerine);噴司他丁（pentostatin);苯來美特 (phenamet) ； °比柔比星（pirarubicin);洛索蒽醌 (losoxantrone);足葉草酸（podophymnic acid); 2-乙基醯 肼（2-ethylhydrazide);丙卡巴肼（procarbazine) ; PSK® 多 醣複合物（JHS Natural Products，Eugene，OR);雷佐生 (razoxane);根瘤菌素（rhizoxin);西佐糖（sizofiran);鍺螺 胺（spirogermanium);細交鏈孢菌酮酸（termazonic acid); 三亞胺醌（triaziquone) ; 2,2，,2”-三氣三乙胺；單端孢黴烯 毒素（trichothecene)(尤其T-2毒素、弗納庫林A(ve rracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及蛇形菌毒素（angUidine));胺 147729.doc •41 - 201106969 基甲酸醋（urethan);長春地辛（vindesine);達卡巴嗓 (dacarbazine);甘露莫司汀（mannomustine);二溴甘露醇 (mitobronitol)；二漠衛矛醇（mitolactol);旅泊漠烧 (pipobroman);曱托辛（gacytosine);阿拉伯糖 (arabinoside)(「Ara-C」）；環磷醯胺；噻替哌；紫杉烷類 (taxoid)，例如 TAXOL® 太平洋紫杉醇（Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton, N.J.)、ABRAXANE®無十六醇 聚氧乙稀醚（Cremophor)的白蛋白工程改造之太平洋紫杉 醇奈米粒子調配物（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)，及 TAXOTERE® 多西他赛 (doxetaxel)(Rh0ne-Poulenc Rorer，Antony，France);苯丁酸 氮芬（chloranbucil) ; GEMZAR® 吉西他濱（gemcitabine); 6_硫鳥嘌呤；酼基嘌呤；曱胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑 (cisplatin)、奥沙利 46 及卡銘（carboplatin);長春驗 (vinblastine);翻；依託泊苦（etoposide)(VP-16);異環攝 醯胺；米托蒽醌；長春新鹼（vincristine) ; NAVELBINE® 長春瑞賓（vinorelbine);諾凡特龍（novantrone);替尼泊戒 (teniposide);依達曲沙（edatrexate);道諾黴素；胺基蝶吟 (ami nopterin); 希羅達（xeloda)； 伊班膦酸鹽 (ibandronate);伊立替康（Camptosar，CPT-11)(包括伊立替 康與5-FU及甲醯四氫葉酸之治療方案）；拓撲異構酶抑制 劑RFS 2000 ;二氟曱基鳥胺酸（DMFO);類視黃素，諸如 視黃酸；卡培他濱（capecitabine);康柏斯達汀 (combretastatin);曱醯四氫葉酸（LV);奥沙利舶，包括奥 147729.doc -42- 201106969 沙利鉑治療方案（FOLFOX) ; PKC-α、Raf、H-Ras、 EGFR(例如埃羅替尼（Tarceva®))及VEGF-A之抑制劑，其減 少細胞增殖；及任一上述物質之醫藥學上可接受之鹽、酸 或衍生物。 此定義亦包括抗激素劑，其用以調節或抑制對腫瘤之激 素作用，諸如抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑 (SERM)，包括例如他莫昔芬（包括NOLVADEX®他莫昔 芬）、雷洛昔芬（raloxifene)、屈洛昔芬（droloxifene)、4-經 基他莫昔芬、曲沃昔芬（trioxifene)、克沃昔芬 (keoxifene)、LY117018 、奥那司 8^1 (onapristone)及 卩八1^丁01^.托瑞米芬（？八1^1'〇]^〇代11^1^);芳香酶抑 制劑，其抑制調節腎上腺中雌激素產生之酶芳香酶，諸如 4(5)-咪。坐、胺魯米特（aminoglutethimide)、MEGASE® 乙酸 曱地孕酮（megestrol acetate)、AROMASIN® 依西美坦 (exemestane)、福美絲坦（formestanie)、法屈 °坐（fadrozole)、 RIVISOR®伏羅唑（vorozole)、FEMARA® 來曲唑（letrozole) 及ARIMIDEX®阿那曲唑（anastrozole);及抗雄激素，諸如 氣他胺（flutamide)、尼魯米特（nilutamide)、比卡魯胺 (bicalutamide)、 亮丙立德（leuprolide)及戈舍瑞林 (goserelin);以及曲沙他濱（troxacitabine)( 1，3-二氧戊環核 苷胞嘧啶類似物）；反義寡核苷酸，尤其抑制涉及異常細 胞增殖之信號傳導路徑中之基因表現者，諸如PKC-ot、Raf 及H-Ras ;核糖核酸酶，諸如VEGF表現抑制劑（例如 ANGIOZYME®核糖核酸酶）及HER2表現抑制劑；疫苗，諸 147729.doc 43- 201106969 如基因治療疫苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、 LEUVECTIN® 疫苗及 VAXID® 疫苗；PROLEUKIN® rlL-2 ; LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH ;及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生 物。 術語「細胞激素」為由一個細胞群體釋放之作為細胞間 介體作用於另一細胞的蛋白質之通用術語。此等細胞激素 之實例為淋巴介質、單核球激素及傳統多肽激素。細胞激 素中包括生長激素，諸如人類生長激素、N-甲硫胺醯基人 類生長激素及牛生長激素；副曱狀腺激素；曱狀腺素；胰 島素；胰島素原；鬆弛素；鬆弛素原；醣蛋白激素，諸如 促濾泡素（FSH)、促曱狀腺素（TSH)及促黃體素（LH);表皮. 生長因子；肝生長因子；纖維母細胞生長因子；促乳素； 胎盤生乳素；腫瘤壞死因子-α及腫瘤壞死因子-β ;苗勒抑 制物質（mullerian-inhibiting substance);小鼠促性腺激素 相關肽；抑制素（inhibin);活化素；血管内皮生長因子； 整合素；血小板生成素（TPO);神經生長因子，諸如NGF-a; jk小板生長因子；轉化生長因子（TGF)，諸如TGF-α及 TGF-β ;類胰島素生長因子-I及類胰島素生長因子-II ;紅 血球生成素（EPO);骨生成誘導因子；干擾素，諸如干擾 素-a、干擾素-β及干擾素-γ ;群落刺激因子（CSF)，諸如巨 噬細胞-CSF(M-CSF);粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF); 及粒細胞-CSF(G-CSF);介白素（IL)，諸如 IL-1、IL-la、 IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL- 147729.doc -44 - 201106969 10、IL-ll、il-12 ;腫瘤壞死因子，諸如TNF-a或TNF-β ; 及其他多肽因子，包括LIF及kit配位體（KL)。如本文中所 用’術語細胞激素包括來自天然來源或來自重組細胞培養 物之蛋白質，及天然序列細胞激素之生物學活性等效物。 「生長抑制劑」在用於本文中時係指抑制活體外及/或 活體内細胞生長之化合物或組合物。因此，生長抑制劑可 為顯著降低S期細胞百分比者。生長抑制劑之實例包括阻 斷細胞週期進程（在除s期以外之位置）之藥劑，諸如誘導 G1停滯及Μ期停滯之藥劑。經典Μ期阻斷劑包括長春花屬 (vincas)(長春新鹼及長春鹼）、TAXOL®，及拓撲異構酶 II(topo II)抑制劑，諸如小紅莓、表柔比星、道諾黴素、 依託泊苷及博萊黴素（bleomycin)。使G1停滯之藥劑亦過剩 而引起S期停滯，例如DNA烷化劑，諸如他莫西芬、潑尼 松（prednisone)、遠卡巴嗪、二氯曱二乙胺、順鉑、曱胺喋 呤、5 -氟展嘧咬及ara_c。其他資訊可見於The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及Israel編，第 1章，標題為 「Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs」’ Murakami 等人（WB Saunders: Philadelphia, 1995)，尤其第13頁。 如本申請案中所用，術語「前藥」係指醫藥學活性物質 之鈿驅體或衍生形式，其與母體藥物相比對腫瘤細胞之細 胞毒性較小，且能夠酶促活化或轉化為更具活性之母體形 式。例如參看 Wilman，「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」 Biochemical Society Transactions，，第 3Ί5-3名2 展，第 147729.doc •45- 201106969 615屆會議，貝爾法斯特（615th Meeting Belfast)(1986)及 Stella等人，「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，」Borchardt 等人 (編），第 247-267頁，Humana Press (1985)。本發明之前藥 包括（但不限於）含磷酸酯基之前藥、含硫代麟酸酯基之前 藥 '含硫酸酯基之前藥、含肽前藥、經D-胺基酸修飾之前 藥、糖基化前藥、含β-内醯胺之前藥、含有視情況經取代 之苯氧基乙醯胺的前藥或含有視情況經取代之苯基乙醢胺 的前藥、5-氟胞嘧啶及其他5_氟尿苷前藥，其可轉化為更 具活性之細胞毒性游離藥物。可衍生為用於本發明之前藥 形式的細胞毒性藥物之實例包括（但不限於）上文所述之化 學治療劑。 「放射治療」意謂使用定向γ射線或β射線對細胞誘導足 夠破壞，以便限制細胞正常發揮功能之能力或完全破壞細 胞*應瞭解，此項技術中已知多種測定治療劑量及持續時 間之方式。以一次投與形式給予典型治療且典型劑量介於 每曰10至200單位（戈雷（Gray))之範圍内。 「降低或抑制」意謂引起較佳20%或20%以上，更佳 5〇% 或5〇%以上，及最佳 75%、85%、90。/。、95。/。或95% 以 上之總體降低的能力。降低或抑制可指所治療病症之症 狀、轉移或微小轉移之存在或尺寸、原發腫瘤之尺寸、休 眠腫瘤之存在或尺寸’或血管生成病症中血管之尺寸或數 目。 術浯靜脈内輸注」係指歷經超過約5分鐘，較佳在約 147729.doc •46· 201106969 3 0至9 0分鐘之間的時段將藥物引入至動物或人類朿 一 在之靜 脈中，但根據本發明，靜脈内輸注或者投與丨〇小時戋+ 10小時。 ν於 術5吾邊脈内團式注射（intravenous bolus)」或「靜财 推注（intravenous push)」係指將藥物投與至動物或人類之 靜脈中，使得身體在約15分鐘或少於15分鐘，較佳5分铲 或少於5分鐘内接收藥物。 術皮下投與J係指藉由自藥物容器相對較慢地持續 傳遞將藥物引入動物或人類患者之皮膚下，較佳皮膚與下 伏組織之間的囊（p()cket)内。該囊可藉由向上及遠離下伏 組織收縮（pinching)或提拉（drawing)皮膚而產生。 術°°皮下輸注」係指藉由自藥物容器相對較慢地持續 傳遞歷時包括（但不限於）3〇分鐘或少於3〇分鐘，或9〇分鐘 或少於9 0分鐘之時段將藥物引入動物或人類患者之皮膚 下，較佳皮膚與下伏組織之間的囊内。視情況，輪注可藉 由皮下植入藥物傳遞泵（植入動物或人類患者之皮膚下）來 進行，其中該泵傳遞預定量之藥物歷時預定時段，諸如3〇 分鐘、90分鐘，或跨越治療方案長度之時段。 術浯「皮下團式注射」係指將藥物投與至動物或人類患 者之皮膚下方，其中團式藥物傳遞較佳少於約15分鐘，更 佳少於5分鐘，且最佳少於6〇秒。較佳在皮膚與下伏組織 之間的囊内投與’其中該囊例如藉由向上及遠離下伏組織 收細或提拉皮膚而產生。 病症」為任何將得益於使用抗VEGF抗體之治療的病 147729.doc •47· 201106969 狀。其包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物易患 所討論之病症之病理學病狀。本文中待治療之病症的非限 制性實例包括癌症；良性及惡性腫瘤；白血病及淋巴惡性 疾病；神經元、神經膠質、星形膠質細胞、下視丘及其他 腺體、巨噬細胞、上皮、基質及囊胚腔病症；及發炎性病 症、血管生成病症及免疫學病症。 術語「治療有效量」係指有效治療哺乳動物疾病或病症 之藥物量。在癌症之情況下，治療有效量之藥物可減少癌 細胞數目；減小腫瘤尺寸；抑制（亦即在某種程度上減緩 且較佳停止）癌細胞浸潤至周邊器官中；抑制（亦即在某種 程度上減緩且較佳停止）腫瘤轉移；在某種程度上抑制腫 瘤生長，及/或在某種程度上減輕一或多種與病症相關之 症狀。對於治療腫瘤休眠或微小轉移，治療有效量之藥物 可減少微小轉移之數目或增殖；降低或防止休眠腫瘤生 長，或降低或防止腫瘤在治療或移除（例如使用抗癌治 療，諸如手術、放射治療或化學治療）之後復發。就藥物 可防止現有癌細胞生長及/或殺死現有癌細胞而言，其可 具有細胞生長抑制性及/或細胞毒性.對於癌症治療，可 例如藉由評估存活、無病存活（DFS)之持續時間、疾病進 展時間（TTP)、無進展存活（PFS)之持續時間、反應率 (RR)、反應持續時間、緩解時間及/或生活品質來量測活 體内功效。有效量可改良無病存活（DFS)、改良總存活 _、降低復發可能性、延長復發時間、延長遠端復發 (亦即原發部位外部之復發）之時間、治癒癌症、改良癌症 147729.doc -48- 201106969 症狀（例如使用癌症特定調查所判斷）、減少第 出現等。 逸之 「治療」係指治療性處理與防止性措施。需要治療者包 括已患有病症者以及欲防止病症者，包括欲防止 = 或復發者。 & 如本文中所用，「積極治療」係指投與患者治療藥物之 時段。舉例而·Τ，若每2週投與患者治療藥物歷經一年之 時期’接著無治療或其他治療’則使用治療藥物之積極治 療為一年時期，在此期間正投與患者該藥物。 … 詞「標記」在用於本文中時係指直接或間接結合於多狀 之可偵測化合物或組合物。標記本身可為可偵測的(例如 放射!·生同位素標記或螢光標記），或在酶促標記之情況下 可催化可偵測之受質化合物或組合物的化學變化。 本說明書中所提及之所有公㈣、專射請案及專利皆 以引用的方式併人本文中，其引用的程度如同特定且個別 地將各獨立公開案、專利或專利中請案以引用的方式併入 一般。 II.抗VEGF抗體及拮抗劑 ⑴VEGF抗原 仅用於製造抗體之VEGF抗原可為例如VEGF105分子以及 VEGF之其他同功異型物，或其含有所需抗原決定基之片 段。適用於產生本發明之抗VEGF抗體之其他VEGF形式將 對熟習此項技術者顯而易見。 藉由首先篩選自人類細胞製備之cDNA文庫，使用牛 147729.doc -49· 201106969 VEGF cDNA作為雜交探針來獲得人類VEGF。Leung等 人，（1989) 246:1306。藉此鑑別之一個 cDNA編碼 與牛VEGF具有大於95°/。同源性之165個胺基酸之蛋白質； 此1 65個胺基酸之蛋白質通常稱作人類VEGF(hVEGF)或 VEGF165。藉由在哺乳動物宿主細胞中表現人類VEGF cDNA來確認人類VEGF之有絲分裂活性。由以人類VEGF cDNA轉染之細胞調節之培養基促進毛細管内皮細胞增 殖，而對照細胞不促進毛細管内皮細胞增殖。Leung等 人，（1989)<Scie«ce，同上文。 儘管可自天然來源分離及純化血管内皮細胞生長因子以 用於後續治療用途，但濾泡細胞中相對較低之蛋白質濃度 與高成本（均就回收VEGF之努力及費用而言）證實商業上無 效。因此，進一步努力經由重組DNA技術選殖及表現 VEGF。（例如參看 Ferrara，Laboratory Investigation 72:615-618 (1995)，及其中所引用之參考文獻）。 VEGF係以多種由替代性RNA剪接產生之均二聚形式（每 個單體121、145、165 ' 189及206個胺基酸）表現於各種組 織中。VEGF 121為不結合肝素之可溶有絲分裂原；增長形 式之VEGF以逐漸增高之親和力結合肝素。肝素結合形式 之VEGF可藉由纖維蛋白溶酶在羧基端裂解以釋放可擴散 形式之VEGF。在纖維蛋白溶酶裂解後鑑別之羧基端肽之 胺基酸序列為Argn〇-Alam。以均二聚體形式分離之胺基 端「核心」蛋白VEGF(l-llO)以較之完整VEGF165均二聚體 類似之親和力結合中和性單株抗體（諸如稱作4 · 6.1及 147729.doc -50- 201106969 3.2£3.1.1之抗體）及可溶形式之乂£0?受體。 最近亦已鑑別若干與VEGF結構相關之分子，包括胎盤 生長因子（PIGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D 及 VEGF-E。Ferrara 及 Davis，Smyth (1987) Endocr. Rev.，同上文； Ogawa等人，J. 5/o/c^/ca/ C/zew· 273:3 1273-31281(1998); Meyer等人，£：M50 乂，18:363-374(1999)。受體酪胺酸激 酶Flt-4(VEGFR-3)巴經鑑別為VEGF-C及VEGF-D之受體。 Joukov等人，五Μ5ί9. ·/· 15:1751(1996) ; Lee等人，TVoc. dead. 5W. USA 93:1988-1992(1996) ; Achen等人， (1998) Proc. iVai/· Jcai USA 95:548-553。已顯示 VEGF-C涉及淋巴血管生成之調節。Jeltsch等人，Science 276:1423-1425(1997) ° 已鑑別兩種VEGF受體，即Flt-1(亦稱為VEGFR-1)及 KDR(亦稱為 VEGFR-2)。Shibuya等人，（1990) Owcogeae 8:519-527 ; de Vries等人，（1992) 255:989-991 ;

Terman 等人，（1992) A.oc/zem. Λα. Commun. 187:1579-1586。已顯示神經纖毛蛋白-1為選擇性VEGF受 體，能夠結合肝素結合性VEGF同功異型物（Soker等人， (1998) CW/ 92:735-45)。Flt-Ι與KDR均屬於受體酪胺酸激 酶（RTK)家族。RTK包含具有各種生物活性之跨膜受體之 大家族。目前，已鑑別至少十九（19)種不同的RTK子族。 受體路胺酸激酶（RTK)家族包括對於各種細胞類型之生長 及分化至關重要之受體（Yarden及Ullrich (1988) 57:433-478 ; Ullrich及 Schlessinger (1990) Ce// 147729.doc -51 - 201106969 61:243-25 4) 。 RTK之固有功能在酉己位體結合後經活化，使 得受體及多種細胞受質磷酸化，且隨後引起各種細胞反應 (Ullrich及 Schlessinger (1990) Ce// 61:203-212)。因此，藉 由與特異性生長因子（配位體）細胞外相互作用，通常繼而 進行受體二聚化、刺激内源蛋白質（intrinsic protein)赂胺 酸激酶活性及受體轉填酸化（receptor trans-p ho sphoryl at ion)來起始受體酪胺酸激酶介導之信號轉導。 藉此產生結合位點用於細胞内信號轉導分子且使得與一系 列（a spectrum of)有助於適當細胞反應（例如細胞分裂、分 化、代謝效應、細胞外微環境變化）之細胞質信號傳導分 子形成複合物，參看 Schlessinger及Ullrich (1992) 9:1-20。在結構上，Fit-1與KDR均具有七個在細胞外域中 之免疫球蛋白樣域、單一跨膜區，及雜有激酶插入域之一 致酷胺酸激酶序列。Matthews等人，（1991) ZVoc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9026-9030 ； Terman 等人，（1991) 6:1677-1683 o (ii)抗VEGF抗體 適用於本發明方法中之抗VEGF抗體包括任何以足夠親 和力及特異性結合於VEGF且可降低或抑制VEGF生物活性 之抗體或其抗原結合片段。抗VEGF抗體通常將不結合於 諸如VEGF-B或VEGF-C之其他VEGF同系物，亦不結合於 諸如P1GF、PDGF或bFGF之其他生長因子。

在本發明之某些實施例中，抗VEGF抗體包括（但不限 於）結合於與融合瘤ATCC HB 10709所產生之單株抗VEGF 147729.doc -52- 201106969 抗體A4.6.1情形下相同的抗原決定基之單株抗體；根據 Presta等人，（1997) Cancer Res. 57:4593-4599產生之重組 人類化抗VEGF單株抗體。在一個實施例中，抗VEGF抗體 為「貝伐單抗（BV)」，其亦稱為「rhuMAb VEGF」或 「AVASTIN®」。其包含突變之人類IgGl構架區，及來自 阻斷人類VEGF結合於其受體的鼠類抗hVEGF單株抗體 A.4.6.1之抗原結合互補決定區。貝伐單抗之胺基酸序列之 約93%(包括大部分構架區）源自人類IgGl，且該序列之約 7%源自鼠類抗體A4.6.1。 貝伐單抗及其他人類化抗VEGF抗體係進一步描述於 2005年2月26曰頒予之美國專利第6,884,879號中。其他抗 體包括G6或B20系列抗體（例如G6-31、B20-4.1)，如PCT公 開案第 WO 2005/012359號、PCT公開案第 WO 2005/044853 號及美國專利申請案60/991,302中所述，此等專利申請案 之内容係以引用的方式明確併入本文中。關於其他抗體， 參看美國專利第7,060,269號、第6,582,959號、第 6,703,020 號；第 6,054,297 號；WO 98/45332 ； WO 96/30046 ； WO 94/10202 ; EP 0666868B1 ;美國專利申請 公開案第2006009360號、第20050186208號、第 20030206899號、第 20030190317號、第 20030203409號及 第 20050112126 號；及 Popkov 等人，Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)。其他抗體包 括結合於人類VEGF上包含殘基F1 7、Μ1 8、D19、Y21、 Υ25、Q89、191、Κ101、丑103及(：104或者包含殘基卩17、 147729.doc -53- 201106969 Y21、Q22、Y25、D63、183及Q89之功能抗原決定基的抗 體。 在本發明之一個實施例中，抗VEGF抗體含有包含以下 胺基酸序列之重鏈可變區： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTYAADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 1) 及包含以下胺基酸序列之輕鏈可變區： DIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR (SEQ ID NO: 2)。 本發明之「G6系列抗體」為根據PCT公開案第WO 2005/012359號（其全部揭示内容係以引用的方式明確併入 本文中）之圖7、24-26及34-35中任一者的源自G6抗體或G6 來源抗體之序列的抗VEGF抗體。亦參看PCT公開案第WO 2005/044853號，其全部揭示内容係以引用的方式明確併 入本文中。在一個實施例中，G6系列抗體結合於人類 VEGF 上包含殘基 F17、Y21、Q22、Y25、D63、183 及 Q89 之功能抗原決定基。 本發明之「B20系列抗體」為根據PCT公開案第WO 2005/012359號（其全部揭示内容係以引用的方式明確併入 本文中）之圖27-29中任一者的源自B20抗體或B20來源抗體 之序列的抗VEGF抗體。亦參看PCT公開案第WO 2005/044853號，及美國專利申請案60/991,302，此等專利 申請案之内容係以引用的方式明確併入本文中。在一個實 施例中，B20系列抗體結合於人類VEGF上包含殘基F17、 147729.doc -54· 201106969 M18、D19、Y21、Y25、Q89、191、K101、E103 及 C104 之功能抗原決定基。 本發明之「功能抗原決定基」係指抗原中積極有助於結 合抗體之胺基酸殘基。抗原之任一積極作用性殘基之突變 (例如野生型VEGF之突變（藉由丙胺酸）或同系物突變）均將 破壞抗體之結合，使得抗體之相對親和力比率（突變型 VEGF之IC50/野生型VEGF之IC50)將大於5(參看WO 2005/0 12359之實例2)。在一個實施例中，藉由溶液結合噬 菌體呈現ELIS A測定相對親和力比率。簡言之，在4°C下以 欲在PBS中2 pg/ml濃度下測試之Fab形式抗體塗佈96孔 Maxisorp免疫培養盤（NUNC)隔夜，且在室溫下以PBS、 0.5% BSA及0.05% Tween20(PBT)阻斷2小時。首先在室溫 下在塗佈Fab之培養盤上培育噬菌體呈現hVEGF丙胺酸點 突變體（殘基8-109形式）或野生型1^£0?(8-109)於？81'中之 連續稀釋液歷時15分鐘，且以PBS、0.05% Tween20(PBST) 洗滌培養盤。以1:5000稀釋於PBT中之抗M13單株抗體辣 根過氧化酶（Amersham Pharmacia)結合物偵測結合之喔菌 體，以 3,3',5,5，-四甲基聯苯胺（TMB, Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD)受質顯色約 5分鐘，以 1.0 Μ H3P〇4 淬滅，且在450 nm下以分光光度法讀取。IC50值之比率 (IC50，ala/IC50，wt)表示結合親和力（相對結合親和力）之降 低倍數。 (iii) VEGF受體分子 兩種最佳表徵之VEGF受體為VEGFR1(亦稱為Flt-Ι)及 147729.doc -55- 201106969 VEGFR2(亦稱為鼠類同系物之KDR及FLK-1)。各VEGF家 族成員之各受體之特異性不同，但VEGF-A結合於Flt-Ι與 KDR。全長Flt-Ι受體包括具有七個Ig域之細胞外域、跨膜 域及具有酪胺酸激酶活性之細胞内域。細胞外域涉及結合 VEGF且細胞内域涉及信號轉導。 特異性結合於VEGF之VEGF受體分子或其片段可用於本 發明方法中以結合及螯合VEGF蛋白，藉此防止其信號傳 導。在某些實施例中，VEGF受體分子或其VEGF結合片段 為可溶形式，諸如sFh-1。該受體之可溶形式藉由結合於 VEGF對VEGF蛋白之生物活性發揮抑制作用，藉此防止其 結合於乾細胞表面上存在之其天然受體。亦包括VEGF受 體融合蛋白，其實例將於下文中描述。

嵌合VEGF受體蛋白為具有源自至少兩種不同蛋白質之 胺基酸序列的受體分子，該至少兩種不同蛋白質中至少一 者為VEGF受體蛋白（例如fit-1或KDR受體），其能夠結合於 VEGF且抑制VEGF之生物活性。在某些實施例中，本發明 之嵌合VEGF受體蛋白係由源自僅兩種不同VEGF受體分子 之胺基酸序列組成；然而，包含來自fit-1及/或KDR受體之 細胞外配位體結合區之一、二、三、四、五、六或所有七 個Ig樣域之胺基酸序列可與來自其他無關蛋白質之胺基酸 序列（例如免疫球蛋白序列）連接。Ig樣域所組合之其他胺 基酸序列將對一般技術者顯而易見。嵌合VEGF受體蛋白 之實例包括例如可溶Flt-1/Fc、KDR/Fc或FLt-1/KDR/Fc(亦 稱為VEGF Trap)。（例如參看PCT申請案公開案第WO 147729.doc -56- 201106969 97/44453 號） 本發明之可溶VEGF受體蛋白或嵌合VEGF受體蛋白包括 未經由跨膜域固定於細胞表面之VEGF受體蛋白。因此， 儘管可溶形式之VBGF受體（包括嵌合受體蛋白）能夠結合於 VEGF且使VEGF失活，但其不包含跨膜域且因此一般不會 與表現該分子的細胞之細胞膜締合。 III.治療用途 本發明提供一種輔助治療方法，其包含投與個體VEGF 特異性拮抗劑，例如抗VEGF抗體，歷時一年以上。在一 些實施例中，個體患有非轉移性結腸直腸癌。在該方法之 一些實施例中，在確定性手術之後投與VEGF特異性拮抗 劑。本文中所治療之個體一般處於癌症復發之風險中。 在一些實施例中，輔助治療方法延長患者之無病存活 (DFS)或總存活（OS)。在一些實施例中，在起始治療後約2 至5年評估（例如分析）DFS或OS。亦提供一種輔助治療方 法，其包含投與癌症患者有效量之VEGF特異性拮抗劑， 其中在以VEGF特異性拮抗劑積極治療期間癌症進展經防 止或延遲，且其中積極治療持續一年以上。在一些實施例 中，已停止以VEGF特異性拮抗劑積極治療之後，癌症進 展經防止或延遲約3、4、5或6個月。本發明進一步提供一 種輔助治療方法，其包含投與癌症患者有效量之VEGF特 異性拮抗劑，其中在以VEGF特異性拮抗劑積極治療期間 癌症復發經防止或延遲，且其中使用VEGF特異性拮抗劑 之積極治療持續一年以上。在一些實施例中，已停止以 147729.doc •57· 201106969 VEGF特異性拮抗劑積極治療之後，癌症復發經防止或延 遲’力3、4、5或6個月。在某些實施例中，在確定性手術之 後投與患者VEGF特異性拮抗劑。在某些實施例中，包含 技與抗VEGF抗體之辅助治療在治療起始之後持續至少2 年、至少3年、至少4年、至少5年、至少10年或1〇年以 上。 本發明提供—種輔助治療方法，其包含投與已接受癌症 (例如原發腫瘤）確定性手術的患者有效量之vegf特異性拮 抗劑以延長患者之DFS或〇S，其中投與VEGF特異性拮抗 齊J歷時年以上。在一些實施例中，在起始治療後約2至$ 年評估（例如分析）DFS或0S。亦提供一種輔助治療方法， 其包3杈與已接受癌症（例如原發腫瘤）確定性手術的患者 有效量之VEGF特異性拮抗劑，其中在以VE(JF特異性拮抗 劑積極治療期間癌症進展經防止或延遲，且其中積極^ 持續彳以上。在-些實施例中，已停止以vegf特異性 抬抗劑積極治療之後’豸症進展經防止&延遲約3、4、$ 或6個月。本發明進一步提供一種辅助治療方法，其包含 投與已接受癌症(例如原發腫瘤)確定性手術的患者有效量 之VEGF特異性拮抗劑，其中在以VEGF特異性拮抗劑積極 治療期間癌症復發經防止或延遲’且其中使用vegf特異 性结抗劑之積極治療持續一年以上。在一些實施例中，已 停止以VEGF特異性拮抗劑積極治療之後，癌症復發經防 止或延遲約3、4、5或6個月。在某些實施例中，包含投盥 抗VEGF抗體之輔助治療在治療起始之後持續至少作、至 147729.doc -58· 201106969 少3年、至少4年、至少5年、至少10年或ι〇年以上。 本發明進一步提供一種治療已接受癌症（例如原發腫瘤） 確定性手術的患者之方法’其包含投與該患者包含有效量 之VEGF特異性拮抗劑的輔助治療以延長患者之DFS或 〇S，其中投與VEGF特異性拮抗劑歷時一年以上。在一此 實施例中，在起始治療後約2至5年評估（例如分析）DFs或 〇s ^亦提供一種治療已接受癌症（例如原發腫瘤）確定性手 術的患者之方法，其包含投與該患者包含有效量之veqf 特異性拮抗劑的辅助治療，其中在以vegf特異性拮抗劑 積極治療期間癌症進展經防止或延遲，且其中積極治療持 續一年以上。在一些實施例中，已停止以VEGF^^異性拮 抗劑積極治療之後，癌症進展經防止或延遲約3、4、5或6 個月。本發明進一步提供一種治療已接受癌症(例如原發 腫幻教性手術的患者之方法，其包含投與該患者包含 有效ϊ之VEGF特異性拮抗劑的輔助治療，《巾在以V冊 特異性拮抗劑積極治療期間癌症復發經防止或延遲，且其 中使用VEGF特異性拮抗劑之積極治療持續一年以上。： 7些實施例中，已停止以VEGF特異性拮抗劑積極治療之 後’癌症復發經防止或延遲約3、4、5或6個月。在某些實 細•例中’該方法包含投愈括：Ρ·辨 ' s仅，、杬VEGF杬體，在治療起始之後 歷時至少2年、至少3年、至少 干王乂5年、至少10年或 10年以上。 舉例而言， 期之第一階段 種方法可包括以下步驟、)包含複數個週 其中各週期包含關定時㈣隔投與個體 I47729.doc •59- 201106969 有效量之VEGF特異性拮抗劑，例如抗彻F抗體，諸如貝 伐單抗，及視情況選用之至少-種化學治療劑’·及b)包含 複數個週期之第二階段，其中各週期包含投與個體有效量 之VEGF特異性拮抗劑，例如抗vegf抗體，諸如貝伐單 抗，而不以預定時間間隔投與任何化學治療劑；其中组合 之第-與第二階段在初始術後治療之後持續至少一年。在 -些實施例中’組合之第—與第二階段在初始術後治療之 後持續-年以上。在一些實施例中，第二階段在初始術後 治療之後持續1年以上、至少2年、至少3年至少4年、至 少5年或至少1〇年。在一個實施例中第—階段包含第— f數個治療週期’其中投與VEGF特異性抬抗劑（例如貝伐 早抗)及第一化學治療方案，接著為第二複數個治療週 期其中彳又與VEGF特異性结抗劑（例如抗VEGF抗體，諸 如貝伐單抗）及第二化學治療方案。 在個貫例中，3亥方法包括每1 4天1次投與經修飾之 FOLFOX6(奥沙利翻（85 mg/m2)與並行之甲醯四氫葉酸（構 mg/m2)及5-FU(400 mg/m2，靜脈内團式注射）（第i天）及5_ FU(2400 mg/m )(在第1天及第2天歷經46小時））歷時12個週 期（6個月）’外加在各化學治療週期之第1天在奥沙利鉑之 則技與貝伐單抗（5 mg/kg，靜脈内），每丨4天〗次歷時〗年或 1年以上。 在個投與時程中，本發明之輔助治療包含第一階段， 其中在複數個治療週期t投與患者VEGF特異性括抗劑（例 如杬VEGF抗體）及一或多種化學治療劑；及第二階段，其 147729.doc -60- 201106969 令在複數個維持週期中以單一 ,^ 乃丫 ^早樂劑形式使用VEGF特里 才口抗劑（例如抗VEGF抗體）。視特定 ，- 週期係由一週至三週組成。舉’、二各治療 伐單广祚盔〇 ’⑺療週期可包括貝 伐早抗作為VEGF特異性拮抗 ^ 了為二週，其意謂患者 =接=劑化學治療及—劑貝伐單抗。治療週 二週，其意謂患者每隔一週接受—劑化學治療及一劑貝 伐早抗。整個第-階段之治療可持續約化個週期。在第 一（即維持）階段期間，視特定週期之 ， 或每三週給予貝伐單广 、又& °母兩週 宜此一 貞伐早杬’且歷時總共約10-50個週期。在 某二貫施例中，輔肋、，二、底6，人 〜療自>α療（例如初始術後治療）起始 、續至少-年’且其後將追縱個體之進展。在—些實施 !中抗VEGF&體辅助治療自治療起始起持續！年以上、 年至夕3年、至少4年、至少5年或至少1〇年或直至 死亡為止。 視疾病類型及嚴重程度而定，抗vegf抗體之較佳劑量 係在約1 Kg/kg至，約50 mg/kg，最佳約5 mg/kg至約15 mg/kg之範圍内’包括(但不限於)7 5或mg/kg。 在-些態樣中，化學治療方案涉及傳統高劑量間歇式投 與。在-些其他態樣中，使用較小且較頻繁之劑量投與化 學治療劑而無預定中斷（「節拍化學治療(metr〇n〇mie motherapy)」）。藉由習知技術及檢驗容易地監測本發 明治療之進展。 與以化學治療（例如甲醯四氫葉酸、奥沙利鉑、5-FU、 伊立替康或其組合）單獨治療之個體相比，投與抗體及化 147729.doc 201106969 學治療可在癌症患者中降低疾病復發（原發器官之癌症復 發及/或遠端復發）之可能性。 在個J樣中本發明提供一種輔助治療方法，其包含 投與癌症患者以下確定性手術、有效量之抗VEGF抗體以 延長患者之無病存活（DFS)或總存活（OS)。可在起始治療 後約2至5年評估（例如分析）DFS或〇s ^在一些實施例中， 在起始治療後1、2、3、4、5、6、7、8、9或1〇年評估（例 如分析）DFS或OS。本發明亦提供一種防止患者癌症復發 之方法，其包含投與該患者有效量之抗VEGF抗體，其中 忒投與抗VEGF抗體會防止癌症復發，本發明進一步提供 一種降低患者癌症復發之可能性的方法，其包含投與該患 者有效量之抗VEGF抗體，其中該投與抗VEGF抗體會降低 癌症復發之可能性。在本發明方法之一些實施例中，該投 與VEGF特異性拮抗劑會防止出現臨床上可偵測的腫瘤或 其轉移，或降低出現臨床上可偵測的腫瘤或其轉移之可能 性。 對於輔助治療，可投與一定量的VEGf特異性拮抗劑或 投與該拮抗劑歷時一定時間（例如對於歷經一段時間之特 定治療方案），以降低（例如達20%、30%、40%、50%、 60%、70°/。、80%、90%或90%以上）或抑制腫瘤轉移；以降 低或抑制腫瘤生長或腫瘤細胞增殖；以降低或防止休眠腫 瘤生長；以降低或防止微小轉移生長或增殖；以降低或防 止腫瘤在治療或移除之後再生長；及/或在某種程度上減 輕一或多種與癌症相關之症狀。 147729.doc •62- 201106969 般在個體已自手術恢復一段時間之後投與VEGF特異 性拮抗劑。此時段可包括創口癒合或手術切口癒合所需之 時期降低創σ開裂的風險所需之時段，或個體恢復至基 本類似於或優於手術前健康程度之健康程度所需之時 & °在完成確定性手術與首次投與vegf特異性拮抗劑之 間的時期亦可包括藥物假曰所需之時期，#中個體需要或 要求各治療方案之間間隔一段時間。在完成確定性手術與 開始VEGF特異性拮抗劑治療之間的時段一般可包括小於 一週、1週、2週、3週、4週（28天）、5週、6週、7週、8 週、3個月'4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個 =、1〇個月、U個月、i年、2年、3年或3年以上。在一個 貫施例中，在確定性手術與投與VEgf特異性拮抗劑之間 的時段大於2週且小於1年。 在-個實例中，以有效延長無病存活（dfs)或總存活 (OS)之量投與VEGF特異性括抗劑，例如MEGF抗體。可 在初始投與抗體後約2至5年評估（例h分析）则或⑽。在 某些實施例中’在起始治療後或在初始診斷後約3·5年、 約4-5年或至少約4年’或至少約5年評估（例如分析）個體之 DFS或OS。 VEGF特異性拮抗劑可以單_藥劑形式投與。本發㈣ 提供使m種VE_異性结抗劑與_或多種其他抗 癌治療之組合。抗癌治療之實例包括(但不限於)手術、放 射治療（放射線l生m免疫治療、化學治療或 此等治療之組合。另外，細胞毒性劑、抗血管生成劑及抗 147729.doc -63- 201106969 增殖劑可與VEGF特異性拮抗劑組合使用。 在某些態樣十’ VEGF特異性拮抗劑係與一或多種化學 治療劑組合用於輔助治療以便在確定性手術之後治療結腸 直腸癌。多種化學治療劑可用於本發明之組合治療方法 中。所涵蓋之化學治療劑之例示性及非限制性清單提供於 本文中之「定義」部分下，或描述於本文中。 在一個實例中，本發明特徵為使用VEGF特異性拮抗劑 與或多種化學治療劑（例如混合物）。在癌症為結腸直腸 癌之y些實施例中，化學治療劑可為特定用於結腸直腸癌 之化學治療劑’包括(但不限於)甲醯四氫葉酸、5_氟尿嘧 啶、奥沙利鉑、伊立替康或兩種或兩種以上此等化學治療 劑之組合。'组合投肖包括使用冑別調配物或單一醫藥調配 物同時投與，及以任-順序連續投與，其中較佳有一時段 兩種（或所有）活性劑同時發揮其生物活性。此等化學治療 劑之製劑及給藥時程可根據製造商之說明書使用，或由熟 習此項技術者憑經驗決定。化學治療之製劑及給藥時程亦 ^it^Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & wukins，.Baltimore，Md. (1992)中。化學治療劑可在投與 VEGF特異性括抗劑之前或之後或同時給予。 組合投與包括使用個別調配物或單_醫藥調配物共投與 或並行投與’及以任-順序連續投與，其中視情況有一時 段兩種（或所有）活性劑同時發揮其生物活性。因此，化學 …療劑可在技與VEGF特異性拮抗劑（例&抗抗體）之 在此實―中，在至少一次投與化學治療 147729.doc -64 - 201106969 劑與至少一次投與vegf特異性拮抗劑（例如抗vegf抗體） 之間的時間較佳為約丨個月或少於丨個月，最佳為約3週、2 週或少於2週。或者，化學治療劑與抗VEGF抗體以單一調 配物或個別調配物並行投與患者。使用化學治療劑（例如 曱醯四氫葉酸、奥沙利鉑、5_FU '伊立替康或其組合）與 抗VEGF抗體（例如貝伐單抗）組合的治療可對患者產生協同 或大於加成之治療益處。 化學治療劑在投與時通常以其已知劑量投與，或視情況 因藥物之組合作用或由於投與抗代謝物化學治療劑而造成 之陰性副作用而降低劑量。此等化學治療劑之製備及給藥 時私可根據製造商之說明書使用或由熟習此項技術者憑經 驗確定。 在一些其他態樣中，適於與本發明之抗VEgF抗體一起 用於組合腫瘤治療之其他治療劑包括涉及腫瘤生長之其他 因子（諸如 EGFR、ErbB2(亦稱為 Her2)、ErbB3、ErbB4 或 tnf)之拮抗劑。有時，亦宜投與患者一或多種細胞激素。 在—較佳實施例中’抗VEGF抗體與生長抑制劑或細胞毒 性劑共投與。舉例而言，可首先投與生長抑制劑或細胞毒 性劑，接著投與抗VEGF抗體。然而，亦涵蓋同時投與或 首先投與抗VEGF抗體。生長抑制劑之適合劑量為目前所 用之劑量且可因生長抑制劑與抗VEGI^^體之組合作用（協 同作用）而降低。 如所治療之特定適應症所必需，本文中之調配物亦可能 含有一種以上活性化合物，較佳為具有不會對彼此造成不 147729.doc •65- 201106969 利影響之互補活性的活性化合物。舉例而言，可能需要在 一種調配物中進·一步提供結合於EGFR、VEGF(例如結合 VEGF上的不同抗原決定基之抗體）、VEGFR或ErbB2(例如 Herceptin®)之抗體。或者或另外，組合物可包含細胞毒性 劑、細胞激素、生長抑制劑及/或小分子VEGFR拮抗劑。 此等分子宜以有效達成預定目的之量組合存在。 在某些態樣中，適於與本發明抗體一起用於組合癌症治 療之其他治療劑包括其他抗血管生成劑。許多抗血管生成 劑已得到鑑別且在此項技術中為已知的，包括Carmeliet及 Jain，JVaiwre 407(6801):249-57 (2000)中所列者。本發明之 抗VEGF抗體較佳與以下組合使用：另一種VEGF拮抗劑或 VEGF受體拮抗劑，諸如VEGF變異體、可溶VEGF受體片 段、能夠阻斷VEGF或VEGFR之適體、中和性抗VEGFR抗 體、VEGFR酪胺酸激酶之低分子量抑制劑及其任何組合。 或者或另外，兩種或兩種以上抗VEGF抗體可共投與患 者。 對於輔助治療，VEGF特異性拮抗劑之適當劑量可視如 上文所定義之待治療疾病的類型、疾病嚴重程度及病程、 先前治療、患者之臨床病史及對VEGF特異性拮抗劑之反 應及主治醫師之判斷而定。VEGF特異性拮抗劑宜一次性 或歷經一系列治療投與患者。在組合治療方案中，本發明 之VEGF特異性拮抗劑及一或多種抗癌治療劑係以治療有 效或協同量投與。如本文中所用，治療有效量致使共投與 VEGF特異性拮抗劑與一或多種其他治療劑或投與本發明 147729.doc -66 - 201106969 ”且β物時如上所述之癌症有所減少或受到抑制。治療協 同里為協同或顯著防止癌症復發所必需之VEGF特異性拮 抗劑及一或多種其他治療劑之量。 VEGF特異性拮抗劑及—或多種其他㈣劑可以足以減 少或消除腫瘤、休眠腫瘤或微小轉移出現或復發之量及時 間同時或依次投與。VEGF特異性括抗劑及—或多種其他 …療劑可以維持治》療之形式投與以防止腫瘤復發或降低腫 瘤復發之可能性。 身又技術者應瞭解，化學治療劑或其他抗癌劑之適當劑 里舨將約為已用於臨床治療中之劑量，例如在臨床治療 中化學治療劑係'單獨投與或與其他化學治療劑組合投與。 視所治療之病狀而定，劑量將可能發生變化。投與治療之 醫師將能夠確定個別個體之適當劑量。 除上文治療方案之外，患者亦可經受放射治療。 在某些實施例中，所投與之抗VEGF抗體為完整之裸抗 體。然而，抗VEGF抗體可與細胞毒性劑結合。在某些實 %例中，所結合之抗體及/或其所結合之抗原係由細胞内 化，使得結合物在殺死其所結合之癌細胞方面之治療功效 提高。在一個實施例中，細胞毒性劑靶向或干擾癌細胞中 之核酸。此等細胞毒性劑之實例包括美登素類、刺孢黴 素、核糖核酸酶及DNA核酸内切酶。 IV.劑量及持續時間 VEGF特異性拮抗劑組合物將以與優良醫學規範一致之 方式經調配、給藥及投與。此情形中之考慮因素包括所治 147729.doc •67· 201106969 療之特定病症、所治療之特定個體、個別患者之臨床病 狀病因、藥劑傳遞部位、投與方法、投與時程安排 (scheduling)及馐務人員已知之其他因素。待投與之vegf 特異性拮抗劑的「治療有效量」將取決於此等考慮因素， 且為以下情形所必需之最小量：防止、改善或治療或穩定 化良性、癌前期或早期癌症；或治療或防止腫瘤、休眠腫 瘤或微小轉移出現或復發，例如在新漏（_adjuvant)背 景或輔助背景下。VEGF特異性拮抗劑不需（但視情況）與一 或多種目前用以防止或治療癌症或產生癌症之風險的藥劑 一起調配。此等其他藥劑之有效量視調配物中存在之 VEGF特異性结抗劑之量、病症或,療之類型及上文所討 論之其他因。此等藥劑一般以與上文所用相同之劑 里及投藥途徑使用或為此前所用劑量之約I %至9 9 %。 視疾病之類型及嚴重程度而定，約1 gg/h至1〇〇 mg/kg(例如0.1-20 mg/kg)VEGF特異性拮抗劑為投與患者 之初始候選劑量，例如藉由一或多次個別投與或藉由連續 輸注而投與。視上述因素而定，典型曰劑量可介於約1 pg/kg至約1〇〇 mg/kg或100 mg/kg以上之範圍内。尤其需要 之劑量包括例如7.5 mg/kg、10 mg/kg及15 mg/kg。對於歷 經數天或更久重複投藥，視病狀而定’持續治療直至如藉 由上文所述或此項技術中已知之方法所量測，癌症得到治 療為止。然而’其他給藥方案亦可能適用。在一個實例 中’若VEGF特異性拮抗劑為抗體，則每週、每兩週或每 三週一次以約5 mg/kg至約15 mg/kg之劑量範圍（包括（但不 147729.doc -68 · 201106969

Pf於）7.5 mg/kg或丨〇 mg/kg)投與本發明抗體。藉由習知技 術及檢驗容易地監測本發明治療之進展。 治=之持料間將持續與醫學上所指定一樣長之時間或 直至只現所需治療效應（例如本文所述之效應）為止。在一 些實施例+，治療持續—年以上。在某些實施例中， VEGF特異性拮抗劑治療持續2個月、4個月、6個月、$個 月、1〇個β Μ年、2年、3年、4年、5年，或歷時直至個 體壽命之數年時^在―些實施例中，繼續治療直至疾病 進展為止。在-些實施例中，在疾病未復發下繼續治療。 根據已知方法’諸如團式靜脈内㈣，或藉由連續輸注 一段時間，藉由肌肉内、腹膜内、腦脊髄内 (intraCerobrospinal)、皮下、關節内、滑膜内鞘内、經 口、局部或吸入途徑投與個體（例如人類患者）本發明之 VEGF特異性#抗劑。若廣泛副作用或毒性係與抬抗 作用相關，則尤其需要局部投藥。離體策略亦可用於治療 應用。離體策略包括以料VEGF括抗劑之聚料酸轉染 或轉導獲自個體之細胞。接著使經轉染或轉導之細胞返回 個體。細胞可為多種類财之任一者，包括（不限於）造血 細胞（例如骨髓細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細 胞、T細胞或B細胞）、纖維母細胞、上皮細胞、内皮細 胞、角質細胞或肌細胞。 舉例而言，若VEGF特異性拮抗劑為抗體，則該抗體可 藉由任何適合方式投與’包括非經腸、皮下、腹膜内、肺 内及鼻内，及必要時對於局部免疫抑制治療而言，包括病 147729.doc 69· 201106969 灶内投與。非經腸輸注包括肌肉β、靜脈内、動脈内、腹 膜内或皮下投與。另外，宜藉由脈衝輸注（pulse infusi〇n) 才又與杬體，尤其使用下降劑量之抗體。較佳藉由注射，最 佳藉由靜脈内或皮下注射給藥，部分地取決於投藥為短暫 的或長期的。 在另一實例中，當腫瘤之病症或位置允許時，例如藉由 直接注射來局部投與VEGF特異性拮抗劑化合物，且可定 期重複注射。亦可在手術切除腫瘤之後將VEgf特異性拮 抗劑全身性傳遞至個體或直接傳遞至腫瘤細胞，例如傳遞 至腫瘤或腫瘤床’以防止或降低例如休眠腫瘤或微小轉移 之局部復發或轉移。 或者，可將含有編碼VEGF特異性拮抗劑之核酸序列的 抑制性核酸分子或聚核苷酸傳遞至個體中之適當細胞。在 某些實施例中，可將核酸引導至腫瘤本身。 核酸可藉由任何適於所用載體之方式引入細胞中。此項 技術中熟知許多此類方法（Sambrook等人，同上文；及

Watson等人 ’ Recoinbinant DNA，第 2版第 12章，Scientific American Books, 1992)。基因傳遞方法之實例包括脂質體 介導之轉染、電穿孔、磷酸鈣/DEAE聚葡萄糖法、基因搶 及微注射。 V.醫藥調配物 根據本發明使用之抗體的治療調配物係使用此項技術中 已知之標準方法’例如藉由混合.具有所需純度之抗體與視 情況選用之生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑，而 147729.doc -70· 201106969 以來乾調配物或水溶液形式製備（Remingt〇n，s

Pharmaceutical Sciences (第 20版），A. Gennaro編，2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)。可接受 之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對受體無 毒’且包括緩衝劑’諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機 酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及曱硫胺酸；防腐劑（諸如 氯化十八烷基二甲基苄銨；氣化六羥季銨；氯化苯甲烴 錢、苄索氯錢（benzethonium chloride);苯紛、丁醇或苯曱 醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基 苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3 _戊醇；及間 甲酚）；低分子量（少於約1〇個殘基）多肽；蛋白質，諸如血 清白蛋白' 明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙 烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯 胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化 合物，包括葡萄糖 '甘露糖或糊精；螯合劑，諸如 EDTA，糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇； 成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物（例如Zn蛋白質錯合 物）’·及/或非離子界面活性劑，諸如tweenTM、 PLURONICS $聚乙二醇㈣。較佳之康乾抗 體調配物係描述於W0 97/04801中，該案係以引用的方式 明確併入本文中。 調配物視情況（但較佳地）含有醫藥學上可接受之鹽，該 鹽通常為例如氯化鈉，且較佳處於約生理學濃度下❶本發 明調配物可視情況含有醫藥學上可接受之防腐劑。在一些 147729.doc -71· 201106969 實施例中，防腐劑濃度介於0.1%至2 0%(通常為v/v)之範圍 内。適合之防腐劑包括醫藥技術中已知之防腐劑。苯曱 醇、苯酚、間甲酚、對羥基苯曱酸曱酯及對羥基苯甲酸丙 醋為防腐劑之實例。本發明調配物可視情況包括濃度為 0.005%至0.02%之醫藥學上可接受之界面活性劑。 在一個實施例中，在100 mg及4〇〇 mg無防腐劑之單次使 用小瓶中提供貝伐單抗以傳遞4 ml或16 ml貝伐單抗（25 mg/ml)用於治療用途。1〇〇 mg產物可在240 mg去水α，α-海 藻糖、23.2 mg磷酸鈉（一元，單水合物）、4.8 mg磷酸鈉（二 元’無水）、1.6 mg聚山梨醇酯20及注射用水（USP)中調 配。400 mg產物可在960 mg去水α，α-海藻糖、92.8 mg磷酸 鈉（一元’單水合物）、19.2 mg磷酸鈉（二元，無水）、6·4 mg聚山梨醇酯2〇及注射用水（USP)中調配。 如所治療之特定適應症所必需，本文中之調配物亦可能 含有一種以上活性化合物，較佳為具有不會對彼此造成不 利影響之互補活性的活性化合物。舉例而言，可能需要在 一種調配物中進一步提供結合於EGFR、VEGF(例如結合 VEGF上的不同抗原決定基之抗體）、vegFR或ErbB2(例如 Herceptin®)之抗體。或者或另外，組合物可包含細胞毒性 劑、細胞激素、生長抑制劑及/或小分子VEGFR拮抗劑。 此等分子宜以有效達成預定目的之量組合存在。 活性成份亦可覆埋於例如藉由凝聚技術或界面聚合製備 之微囊（例如分別為羥曱基纖維素或明膠微囊及聚（甲基丙 稀酸曱01 )微囊）' 膠體藥物傳遞系統（例如脂質體、白蛋白 147729.doc -72· 201106969 微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊）或巨乳液中。此 等技術係揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，同 上文。 可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含 有抗體之固體疏水性聚合物的半滲透基質，該等基質為成 形物品形式，例如膜或微囊》持續釋放基質之實例包括聚 酯、水凝膠（例如聚（2-羥乙基_曱基丙烯酸酯）或聚（乙烯 醇））、聚丙交酯（美國專利第3,773,919號）、L-麩胺酸與7乙 基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解之乙烯_乙酸乙烯酯、 可降解之乳酸_乙醇酸共聚物（諸wLUPR〇N dep〇tTM，由 乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙立德構成之可注射微球體） 及聚D-(-)-3-羥丁酸。儘管諸如乙烯·乙酸乙烯酯與乳酸-乙 醇酸之聚合物能使分子釋放超過丨⑼天，但某些水凝膠釋 放蛋白質之時段較短。當囊封抗體長時間保留於體内時， 其可能因在37°C下暴露於水分而變性或聚集，導致生物活 性損失及可能之免疫原性變化。視所涉及之機制而定，可 擬出合理之穩定化策略。舉例而言，若發現聚錢制為經 由硫基-二硫化物互換形成分子間s_s鍵，則敎化可藉由 修飾硫氫基殘基、自酸性溶液柬乾、控制水分含量、使用 適當添加劑及開發出特^聚合物基質組合物而達成。 欲用於活體内投與之調配物必須為無菌的。此易於藉由 經無菌濾膜過濾實現。 VI.治療功效 其中該治療在 本發明提供癌症患者 中之辅助治療方法 147729.doc -73· 201106969 未引起顯著毒性或不利效應之情況下產生有利抗癌效應。 本發明治療之功效可藉由各種常用於評估癌症治療之終點 來1測’該等終點包括（但不限於）存活持續時間、益病存 活、無進展存活、疾病進展時間'緩解時間及/或生活品 質。因為本發明之抗金管生成劑％向腫瘤丘管結構且未必 乾向贅生性細胞本身故其代表-類獨特之抗癌藥，且因 此可能需要對藥物之臨床反應進行獨特量測及定義。本發 明之抗VEGF抗體可能引起轉移性擴散之抑制或可能僅發 揮腫瘤抑制（t_uristatic)效冑。因此，應採用測定抗血管 生成治療之功效的新顆方法，白紅L / , 賴万汝包括例如經由放射成像量測 血管生成之血漿或尿標誌物及量測反應。 在一個實施例中，本發明提供防止人類患者癌症復發或 降低人類患者癌症復發之可能性的方法。 在一個實例中’以有效延長1)1^或〇8之量投與vegf特 異性拮抗劑，例如抗VEGF抗體，其中在初始投與抗體後 約2至5年評估（例如分析）DFSst〇s。在某些實施例中，在 起始治療後或在初始診斷後約3_5年、約4_5年或至少約4 年’或至少約5年’或至少約6年，或至少約7年，或至少 約8年’或至少約9年，或至少約1〇年評估（例如分析）個體 之DFS或OS。 在一個實施例中，本發明方法可用於增加易患或經診斷 患t症或癌症復發之個體的存活持續時間。存活持續時 H k疋義為自首次投與藥物至死亡之時間。存活持續時間 '、°藉由/α療組相對於對照組之分層危險比率（冊）量測， 147729.doc -74· 201106969 HR表示患者在治療期間死亡之風險。 在又一實施例中，本發明之治療顯著提高易患或經診斷 患有癌症且以各種抗癌治療加以治療之個體（例如人類患 者）之組的反應率，反應率係定義為對治療起反應之經治 療患者的百分比。在一個態樣中，與以手術、放射治療或 化學治療單獨治療之組相比，使用抗VEGF抗體與手術、 放射治療或一或多種化學治療劑的本發明之組合治療顯著 提咼經治療患者組的反應率。 VII·抗體產生 ⑴多株抗體 多株抗體較佳藉由多次皮下（sc)或腹膜内（ip)注射相關抗 原及佐劑而在動物體内產生。使用雙功能或衍生化試劑使 相關抗原與在待免疫物種内具有免疫原性之蛋白質結合可 能有用，該蛋白質為例如匙孔螺血氰蛋白、血清白蛋白、 牛曱狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑，該雙功能或衍生 化試劑例如為馬來醯亞胺基苯曱醯基磺基丁二醯亞胺酯 (經由半胱胺酸殘基結合）、N-羥基丁二醯亞胺（經由離胺酸 殘基結合）、戊二醛、丁二酸酐、s〇cl24RlN=c=NR(其中 R及R1為不同烷基）。 藉由將例如1〇〇 Pg或5 pg蛋白質或結合物（分別對於兔或 小鼠）與3體積之弗氏完全佐劑（Freund,s c〇mplete adjuyant) 組合且在多個部位經皮内注射該溶液來使動物對抗原、免 疫原性結合物或衍生物免疫。一個月後，藉由在多個部位 皮下庄射，用含1/5至1/1〇初始量之肽或結合物的弗氏完全 147729.doc -75- 201106969 佐劑使動物增強免疫。7至14天後，對動物抽血且檢驗血 清中之抗體力價。使動物增強免疫直至該力價平穩。動物 較佳係用相同抗原與不同蛋白質結合及/或經由不同交聯 試劑結合之結合物增強免疫^結合物亦可在重組細胞培養 物中以蛋白融合物之形式產生。又，宜使用諸如礬之聚集 劑來增強免疫反應。 (ii)單株抗體 此項技術中可獲得多種製造本文中之單株抗體之方法。 舉例而言，單株抗體可使用由Kohler等人， 256:495 (1975)首先描述之融合瘤方法製得，或可藉由重 組DNA方法（美國專利第4,8 16,567號）製得。 在融合瘤方法中’如上所述使小鼠或諸如倉鼠或獼猴之 其他適當宿主動物免疫以引發產生或能夠產生將特異性結 合於用於免.疫之蛋白質之抗體的淋巴細胞。或者，可於活 體外免疫淋巴細胞。接著使用諸如聚乙二醇之適合融合劑 將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤細胞（Goding， Monoclonal Antibodies: Principles and Practice > % 59-103 頁（Academic Press，1986))。 接種由此製備之融合瘤細胞且使其於較佳含有一或多種 抑制未融合之親本骨髓瘤細胞生長或存活之物質的適合培 養基中生長。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌 吟鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT或HPRT)，則融合瘤之培 養基通常將包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷（HAT培養 基），該等物質將防止HGPRT缺陷型細胞生長。 147729.doc •76· 201106969 較佳骨髓瘤細胞為有效融合、藉由所選之抗體產生細胞 支持抗體之穩定高含量產生且對諸如HAT培養基之培養基 敏感的骨髓瘤細胞。其中，較佳之骨髓瘤細胞株為鼠類骨 趙瘤細胞株’諸如源自可獲自沙克生物研究所細胞分佈中 心（Salk Institute Cell Distribution Center)(San Diego,

California USA)之MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤及可獲自美 國菌種保存中心（Rockville，Maryland USA)之 SP-2 或 X63-

Ag8-653細胞的骨髓瘤細胞株。亦已關於人類單株抗體之 製造描述人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株 (Kozbor，J. 133:3001 (1984); Brodeur等人’

Monoclonal Antibody Production Techniques and 却phcaizo似’第 51-63 頁（Marcel Dekker，Inc.，New York， 1987))。 檢驗生長融合瘤細胞之培養基中針對抗原之單株抗體之 產生。較佳藉由免疫沈澱或藉由活體外結合檢驗（諸如放 射免疫檢驗（RIA)或酶聯免疫吸附檢驗（ELIS A))來測定融 合瘤細胞所產生之單株抗體的結合特異性》 在鑑別出產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗 體的融合瘤細胞後’可藉由限制性稀釋程序次選殖純系且 錯由標準方法使其生長（Goding, 山'e·?:

Principles and Practice > 第 59-103 頁（Academic Press, 1986))。適於達成此目的之培養基包括例如d-MEM或 RPMI-1640培養基。另外，融合瘤細胞可在動物體内以腹 水腫瘤形式活體内生長。 147729.doc •77· 201106969 藉由習知免疫球蛋白純化程序，諸如蛋白質A_壤脂糖 (Sepharose)、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析 法’宜將由次純系分泌之單株抗體與培養基、腹水液或血 清分離。 編碼早株抗體之DNA易於使用習知程序（例如藉由使用 能夠特異性結合於編碼單株抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡 核苷酸探針）分離及測序。融合瘤細胞充當此DN A之較佳 來源。在分離出DNA後，即可將其置於表現載體中，該等 表現載體接著轉染至不會另外產生免疫球蛋白之宿主細胞 (諸如大腸桿菌（£. co/ί)細胞、猴COS細胞、中國倉鼠即巢 (CHO)細胞或骨髓瘤細胞）中，以實現重組宿主細胞中單株 抗體之合成。下文將較詳細地描述抗體之重組產生。 在另一實施例中，抗體或抗體片段可自使用McCafferty 等人，348:552-554 (1990)中所述之技術產生之抗 體嗤菌體文庫分離。Clackson等人，iVaiwre, 352:624-628 (1991)及 Marks 等人，义 Mo/. 5沁/_，222:581-597 (1991)分 別描述使用嗤菌體文庫來分離鼠類抗體與人類抗體。後續 出版物描述藉由鏈改組產生高親和力（nM範圍）人類抗體 (Marks 等人 ’ 5z’o/：Tec/mo/c»g;;，10:779-783 (1992))，以及描 述組合性感染及活體内重組作為構築極大噬菌體文庫之策 略（Waterhouse 等人’ Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))。因此，對於分離單株抗體，此等技術為傳統單株 抗體融合瘤技術之可行性替代技術。 DNA亦可例如藉由以人類重鏈及輕鍵恆定域之編碼序列 147729.doc • 78 · 201106969 取代同源鼠類序列（美國專利第4 816,567.號；]^〇打丨3〇11等 人 ’ iVoc. iVai/ &/·仍々 81:6851 (1984))，或藉由將 非免疫球蛋白多肽之全部或部分編碼序列共價連接於免疫 球蛋白編碼序列而經修_。 通常，以此等非免疫球蛋白多肽取代抗體之恆定域，或 以其取代抗體之一個抗原結合位點（antigen_c〇mbining site)之可變域，以產生包含一個對一種抗原具有特異性之 抗原結合位點及另一個對另一種抗原具有特異性之抗原結 合位點的嵌合二價抗體。 (iii)人類化抗體及人類抗體 人類化抗體具有一或多個自非人類來源引入其中之胺基 酸殘基。此等非人類胺基酸殘基常稱作r輸入」殘基，通 常獲自「輸入」可變域。可基本上按照Winter及同事之方 法（Jones 等人，iVaiMre，321:522-525 (1986) ; Riechmann 等 人 ’ TVaiwre，332:323-327 (1988) ; Verhoeyen 等人， 239:1534-1536 (1988))，藉由以齧齒動物 CDR或 CDR序列取代人類抗體之相應序列來進行人類化。因此， 此等「人類化」抗體為嵌合抗體（美國專利第4,816,567 號）’其中實質上一部分人類可變域已由來自非人類物種 之相應序列取代。實際上，人類化抗體通常為一些CDR殘 基及可能一些FR殘基經來自齧齒動物抗體之類似位點之殘 基取代的人類抗體。 欲用於製造人類化抗體之人類可變域（輕鏈與重鏈）之選 擇對於降低抗原性極為重要。根據所謂「最佳適配（best· 147729.doc -79· 201106969 fit)」方法’針對已知人類可變域序列之整個文庫來筛選 齧齒動物抗體之可變域序列。接著接受最接近於齧齒動物 序列之人類序列作為人類化抗體之人類構架（FR)(sims等 人，《/. /mmw⑽/·，151:2296 (1993) ; Chothia等人，《/· Mo/· 扪〇/·，196:901 (1987))。另一種方法使用源自特定輕鏈或 重鏈子群之所有人類抗體之共同序列的特定構架。同一構 •可用於右干不同的人類化抗體（Carter等人，尸r0c.爪… hd· M.C/以，89:4285 (1992) ; presta等人，j· /w_〇/， 151:2623 (1993)) 〇 更重要的是，抗體經人類化且保留對抗原之高親和力及 其他有利生物特性。為達成此目標，根據一較佳方法，藉 由使用親本及人類化序列之三維模型分析親本序列及各種 概念性人類化產物之方法來製備人類化抗體。三維免疫球 蛋白模型通吊可用且為熟習此項技術者所熟知。可用說明

要涉及影響抗原結合。

前，有可能產生在免疫後能夠在 不產生内源免疫球蛋 熟變異體描述於例如 879號中。 147729.doc 201106969 白之情況下產生完全人類抗體譜的轉殖基因動物（例如小 鼠）。舉例而言，巴描述嵌合及生殖系突變型小鼠中抗體 重鏈連接區（jH)基因之同種接合子缺失會導致内源抗體產 生焚到完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移 至此等生殖系突變型小鼠中將使得抗原攻毒後隨即產生人 通抗體。例如參看 Jakobovits等人，ΑΓαί/· dcail 5W. t/队 90:2551 (1993) ; Jakobovits等人，勤，⑽，362:255- 258 (1993) ; Bruggermarm等人，h /wmM„0.，7:33 (1993) ’ 及 Duchosal等人，iVa/wre 355:258 (1992)。 或者，可使用噬菌體呈現技術（McCafferty等人， 3 48:55 2-5 53 (1990))自來自未經免疫供體之免疫球蛋白可 變（V)域基因譜活體外產生人類抗體及抗體片段。根據此 技術’將抗體v域基因同框選殖至絲狀噬菌體（諸如M13或 fd)之主要或次要鞘蛋白基因中，且作為功能性抗體片段呈 現於噬菌體粒子之表面上。因為絲狀粒子含有噬菌體基因 組之單股DNA複本，故基於抗體功能特性之選擇亦導致選 擇編碼顯示彼等特性之抗體的基因。因此，噬菌體模擬b 細胞之一些特性。噬菌體呈現可以多種形式進行；關於其 回顧，例如參看 Johnson，Kevin S.及 Chiswell，David J.，

Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)。V 基因區段之若干來源可用於噬菌體呈現。clacks〇n等人， 352.·624-62$ (1991)自源於免疫小鼠脾臟之小型v 基因隨機組合文庫分離出各種抗噁唑酮抗體。可構築來自 未經免疫人類供體之V基因譜，且可基本上按照由肘犯“等 147729.doc • 81 - 201106969 k ’ J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)或 Griffith 等人， 五MBO 12:725-734 (1993)所述之技術來分離針對各種抗 原（包括自體抗原）之抗體《亦參看美國專利第5,565,332號 及第 5,573,905號。 如上文所討論’亦可藉由活體外活化之B細胞產生人類 抗體（參看美國專利5,567,610及5,229,275) » 人類單株抗VEGF抗體描述於1998年3月24日頒予之美國 專利第5,730,977號中。 (iv)抗體片段 已開發出各種製造抗體片段之技術。傳統上，此等片段 係經由完整抗體之蛋白水解消化得到（例如參看M〇rimoto 專尺，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-1 17 (1992)及 Brennan 等人，Sczewce，229:81 (1985))。然而，此等片段現可由重組宿主細胞直接產生。 舉例而言’抗體片段可自上文討論之抗體噬菌體文庫分 離。或者’ Fab'-SH片段可自大腸桿菌直接回收且以化學 方式偶合形成F(ab，）2片段（Carter等人，Bio/Technology 10:163-167 (1992))。根據另一種方法，F(ab，）2片段可自重 組宿主細胞培養物直接分離。製造抗體片段之其他技術將 為熟習此項技術者顯而易見。在其他實施例中，所選抗體 為單鍵Fv片段（scFv)。參看WO 93/16185。 (vi)其他胺基酸序列修飾 涵蓋本文所述之抗體之胺基酸序列修飾。舉例而言，可 能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物特性。抗體 147729.doc •82· 201106969 之胺基酸序列變異體係藉由將適當核苷酸變化引入抗體核 酸中或藉由肽合成來製備。此等修飾包括例如抗體之胺基 酸序列内殘基之缺失及/或插入及/或取代。缺失、插入及 取代可任意組合以獲得最終構築體，限制條件為最終構築 體具有所需特徵。胺基酸變化亦可能改變抗體之轉譯後過 程’諸如改變糖基化位點之編號或位置。 適用於鑑別抗體之某些殘基或區域為較佳突變誘發位置 之方去稱作丙版酸知描突變誘發」，如Cunningham及 Wells, 244:1081_1〇85 (1989)所述。此處鑑別一 個殘基或一組乾殘基（例如帶電殘基，諸如arg、asp、 his、lys及glu)且用中性或帶負電荷之胺基酸（最佳為丙胺 酸或聚丙胺酸）置換以影響胺基酸與抗原之相互作用。接 著藉由在取代位點或針對取代位點引入另外或其他變異來 改進顯示對取代具有功能敏感性之胺基酸位置。因此，儘 管供引入胺基酸序列變異之位點係預定的，但突變本身之 性貝無需預定。舉例而言，為分析既定位點之突變效能， 在靶密碼子或區域上進行ala掃描或隨機突變誘發，且針對 所需活性篩選所表現之抗體變異體。 胺基酸序列插入包括長度介於一個殘基至含有一百個或 一百個以上殘基之多肽之範圍内的胺基端及/或羧基端融 合物，以及單個或多個胺基酸殘基之序列内插入。末端插 入之實例包括具有N端曱硫胺醯基殘基之抗體或與細胞毒 陡多肽融合之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體 之Ν端或c端與增加抗體血清半衰期之酶（例如對於ADEpT) 147729.doc -83 - 201106969 或多肽的融合物。 另一類變異體為胺基酸取代變昇體。此等變異體在抗體 分子中具有至少一個胺基酸殘基經不同殘基置換。最關注 之供取代突變誘發的位點包括高變區，但亦涵蓋FR變化。 抗體生物特性之實質改變係藉由選擇取代實現，該等取 代對保持以下之效應顯著不同：（a)取代區域中多肽主鏈之 結構，例如呈摺疊或螺旋構形，（b)靶位點處分子之電荷或 疏水性，或（C)側鏈體積。胺基酸可根據其側鏈特性之相似 性分組（A. L. Lehningei’，AocAewij/r少，第 2版，第 73-75 頁，

Worth Publishers, New York (1975)): ⑴非極性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、 Phe(F)、Trp(W)、Met(M) (2) 不帶電極性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、 Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q) (3) 酸性：Asp(D)、Glu(E) (4) 鹼性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。 或者’天然存在之殘基可基於共同側鏈特性分組： (1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、lie ; (2) 中性親水性：cys、Ser、Thr、Asn、Gin ; (3) 酸性：Asp、Glu ; (4) 鹼性：His、Lys、Arg ; (5) 影響鏈取向之殘基：Gly、pro ; (6) 芳族：Trp、Tyr ' Phe。 非保守性取代將要求將此等種類之一的成員交換為另一 147729.doc • 84 · 201106969 種類》 不涉及保持抗體適當構形之任何半胱胺酸殘基均亦可經 取代，一般經絲胺酸取代’以改良分子之氧化穩定性且防 止異常交聯。相反地，半胱胺酸鍵可添加至抗體中以改良 其穩疋性’尤其當抗體為諸如Fv片段之抗體片段時。 尤其較佳類型之取代變異體涉及取代親本抗體（例如人 類化抗體或人類抗體）之一或多個高變區殘基。一般而 言，選擇用於進一步開發之所得變異體相對於產生其之親 本抗體將具有改良之生物特性。產生此等取代變異體之便 利方法包括使用噬菌體呈現之親和力成熟。簡言之，使若 干高變區位點（例如6-7個位點）突變以在各位點產生所有可 能之胺基取代。由此產生之抗體變異體以單價方式自絲狀 噬菌體粒子呈現為與封裝於各粒子内之M13之基因m產物 的融合物。接著針對如本文所揭示之生物活性（例如結合 親和力）篩選噬菌體呈現之變異體。為鑑別供修飾之候選 高變區位點，可進行丙胺酸掃描突變誘發以鑑別顯著有助 於抗原結合之高變區殘基，或者或另外，宜分析抗原-抗 體複合物之晶體結構以鑑別抗體與人類VEGF之間的接觸 點。根據本文詳述之技術，此等接觸殘基及鄰近殘基為候 選取代殘基。產生此等變異體之後，如本文所述對該組變 異體進行篩選，且可在一或多個相關檢驗中選擇具有優良 特性之抗體以供進一步開發。 抗體之另一類胺基酸變異體會改變抗體之原始糖基化模 式。改變意謂缺失_或多個在抗體中所見之碳水化合物部 147729.doc •85· 201106969 分’及/或添加一或多個在抗體中不存在之糖基化位點。 抗體之糖基化通常為N連接或〇連接。；^連接係指碳水化 合物部分連接至天冬醯胺殘基之側鍵。三肽序列天冬醯 胺-X-絲胺酸及天冬醯胺_x_蘇胺酸（其中X為除脯胺酸外之 任何胺基酸）為碳水化合物部分酶促連接至天冬醢胺側鏈 之識別序列。因此，多肽中存在任一此等三肽序列均會產 生潛在糖基化位點^ 0連接糖基化係指糖N_乙醯半乳胺 糖、半乳糖或木糖之一連接至羥基胺基酸，最通常連接至 絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5_羥基脯胺酸或5_羥基離胺 酸。 抗體中糖基化位點之添加宜藉由改變胺基酸序列使得其 含有一或多種上述三肽序列來實現（對於N連接糖基化位 點）。該變化亦可藉由將一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基添 加至原始抗體之序列中或由其取代原始抗體之序列來實現 (對於〇連接糖基化位點）。 當抗體包含Fc區時，可改變連接於其之碳水化合物。舉 例而言，美國專利申請案第us 2003/0157108 A1號（presta， L.)中描述具有缺乏海藻糖連接於抗體Fc區之成熟碳水化 合物結構的抗體。亦參看US 2004/0093621 Al(Kyowa

Hakko Kogyo Co.，Ltd)。WO 03/01 1878(Jean-Mairet等人） 及美國專利第6,602,684號（Umana等人）中提及在連接於抗 體Fc區之碳水化合物中具有對分N_乙醯葡糖胺（Gicnac)之 抗體。WO 97/30087(Patel等人）中報導在連接於抗體Fc區之 寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體。關於具有經改變 I47729.doc -86 - 201106969 碳水化合物連接於Fc區之抗體’亦參看w〇 98/58964(Raju, S.)及 WO 99/22764(Raju，S.)。 可能需要針對效應功能來修飾本發明抗體，例如以便增 強抗體之抗原依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC)及/或補 % 體依賴性細胞毒性（CDC)。此可藉由在抗體卩()區内引入一 • 或多個胺基酸取代來實現。或者或另外，可將半胱胺酸殘 基引入Fc區中’藉此使此區域中形成鏈間雙硫鍵。由此產 生之均一聚抗體可具有改良之内化能力及/或增加之補體 介導的細胞殺死及抗體依賴性細胞毒性（Adcc)。參看

Caron等人，乂心p 176:1191-1195 (1992)及 Shopes， B././wwwwo/. 148:2918-2922 (1992)。亦可使用如 |〇1订等 人，C⑽ 53:2560-2565 (1993)中所述之雜二官 能交聯劑來製備具有增強之抗腫瘤活性的均二聚抗體。或 者’可工程改造具有雙Fc區且可能藉此具有增強之補體溶 解及ADCC能力之抗體。參看Stevenson等人，yi/tH-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989) 〇 WO 00/42072(Presta，L.)描述在人類效應細胞存在下具 有改良之ADCC功能的抗體，其中該等抗體在其Fc區中包 ‘ 含胺基酸取代。具有改良之ADCC的抗體較佳在Fc區之位 . 置298、333及/或334(殘基之Eu編號）處包含取代。改變之

Fc區較佳為一、二或三個此等位置處包含取代或由取代組 成之人類IgGl Fc區。此等取代視情況與增加Clq結合及/ 或CDC之取代組合。 WO 99/51642、美國專利第6，1943551 B1號、美國專利第 147729.doc -87· 201106969 6,242，195 B1號、美國專利第6,528,624 B1號及美國專利第 6,5 3 8，124號（1«1113(^6等人）中描述（：14結合及/或補體依賴 性細胞毒性（CDC)發生改變之抗體。該等抗體在其卜區之 胺基酸位置 270、322、326、327、329、313、333 及 / 或 334(殘基之Eu編號）中的一或多處包含胺基酸取代。 例如美國專利5,739,277中所述，為增加抗體之血清半衰 期，可將救助受體結合抗原決定基併入抗體（尤其為抗體 片段）中。如本文中所用，術語「救助受體結合抗原決定 基」係指IgG分子（例如IgGi、IgG2、IgG3或IgG4)之Fc區中 負責增加IgG分子之活體内血清半衰期的抗原決定基。 WO 00/42072(Presta，L.)及 US 2005/0014934 Al(Hinton 等人）中描述對新生兒Fc受體（FcRn)之結合有所改良且半衰 期增加之抗體。此等抗體包含具有一或多個取代之Fc區， 該一或多個取代會改良Fc區與FcRn之結合。舉例而言，Fc 區可在位置 238、250、256、265、272、286、303、305、 307 、 311 、 312 、 314 、 317 、 340 、 356 、 360 、 362 、 376 、 378、380、382、413、424、428 或 434(殘基之 Eu 編號）中 的一或多處具有取代。FcRn結合有所改良的較佳之包含fc 區之抗體變異體在其Fc區之位置307 ' 3 80及434(殘基之Eu 編號）中的一、二或三處包含胺基酸取代。在一個實施例 中’抗體具有307/434突變。 亦涵蓋具有三個或三個以上（較佳為四個）功能性抗原結 合位點之工程改造抗體（美國申請案第US 2002/0004587 A1 號，Miller等人）。 147729.doc -88· 201106969 編碼抗體之胺基酸序列變異體之核酸分子係藉由此項技 術中已知之多種方法製備。此等方法包括（但不限於）自天 然來源分離（在天然存在之胺基酸序列變異體下），或藉由 對較早製備之變異體或非變異體型抗體進行寡核苷酸介導 的（或定點）突變誘發、PCR突變誘發及匣式突變誘發來製 備。 (v)免疫結合物 本發明亦係關於免疫結合物，其包含本文所述之抗體結 合於細胞毒性劑，諸如化學治療劑、毒素（例如細菌、真 菌、植物或動物來源之酶促活性毒素，或其片段）或放射 性同位素（亦即放射性結合物）。 上文已描述適用於產生此等免疫結合物之化學治療劑。 可使用之酶促活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉 毒素之無結合活性片段、外毒素A鏈（來自綠膿桿菌 «如、蓖麻毒素八鏈、相思子毒素 (abrin)A 鏈、莫迪素（m〇deccin)A 鏈、α 帚麴菌素（alpha-sarcin)、油桐蛋白（j/ewr/iej /orAz· protein)、康乃馨蛋白 (dianthin protein)、洋商陸蛋白awerz’cawa protein)(PAPI、PAPII 及 PAP-S)、苦瓜（momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白（curcin)、巴豆毒素 (crotin)、石鹼草（sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素、 有絲分裂素、侷限麴菌素（restrictocin)、酚黴素、伊諾黴 素（enomycin)及黴菌毒素。多種放射性核種可用於製造放 射性結合抗體。實例包括212Bi、131I、131In、90Y及l86Re。 147729.doc -89- 201106969 抗體與細胞毒性劑之結合物係使用多種雙功能蛋白質偶 合劑製造，該等蛋白質偶合劑為諸如3_(2_吡啶基二酼基) 丙酸N-丁一醯亞胺酯（spdp)、亞胺基硫雜環戊烷（IT)、醯 亞胺酯之雙功能衍生物（諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸 鹽）、活性酯（諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯）、醛類（諸如戊 一醛）、雙疊氮基化合物（諸如雙（對疊氮基苯甲醯基）己二 胺）、雙重氮衍生物（諸如雙·（對重氮苯甲醯基）_乙二胺）、 一異氰酸酯（諸如2,6-二異氰酸曱苯酯）及雙活性氟化合物 (諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯卜舉例而言，可如乂如似等 人，238: 1098 (1987)中所述製備蓖麻毒素免疫毒 素。經碳14標記之1-異硫氰基苯甲基_3_曱基二伸乙基三胺 五乙酸（MX-DTPA)為將放射性核苷酸結合於抗體之例示性 螯合劑。參看WO 94/11026 » 在另一實施例中，抗體可結合於「受體」（諸如抗生蛋 白鏈菌素）以用於腫瘤預靶向，其中投與患者抗體_受體結 合物，接著使用洗淨劑自循環中移除未結合之結合物且接 著投與結合於細胞毒性劑（例如放射性核苷酸）之「配位 體」（例如抗生物素蛋白）。 (vi)免疫脂質體 本文所揭示之抗體亦可調配為免疫脂質體。含抗體之脂 質體係藉由此項技術中已知之方法製備，該等方法諸如描 述於 Epstein 等人，/V〇c. Jed. 82:3688 (1985); Hwang等人 ’ /V〇c. iVai/ Jead. &/· tASJ，77:4030 (1980);及美國專利第4,485,045號及第4,544,545號中。美 147729.doc ·90· 201106969 國專利第5,013，556號中揭示循環時間增加之脂質體。 特別有用之脂質體可藉由逆相蒸發法使用包含磷脂醯膽 驗、膽固醇及經PEG衍生化之磷脂醯乙醇胺（peG-PE)之脂 質組合物產生。經由具有規定孔徑之過濾器擠出脂質體以 產生具有所需直徑之脂質體。本發明抗體之Fab，片段可經 • 由二硫化物互換反應結合於脂質體（如Martin等人，/. C/zem. 257: 286-288 (1982)中所述）。脂質體内視情況含有 化學治療劑（諸如小紅莓參看Gabizon等人，《/. ΑΓαίί〇„α/ /«“_ 81(19)1484 (1989)。 VIII.製品及套組 在本發明之另一實施例中，提供一種含有適用於治療上 述病症之物質的製品。該製品包含容器、標籤及藥品說明 書。適合之容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可自 諸如玻璃或塑膠之各種材料形成。容器容納有效治療病狀 之組合物且可具有無菌接取孔（access port)(例如，容器可 為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈内溶液袋或小 瓶）。組合物中之至少一種活性劑為抗VEGF抗體。容器上 或容器所附之標籤指示該組合物用於治療所選病狀。製品 . 可進一步包含第二容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝 液’諸如填酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液（Ringer,s solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者 觀點來看可需要之其他物質’包括其他緩衝劑、稀釋劑、 過濾器、針及庄射器。另外，製品包含具有使用說明之藥 品說明書’其包括例如不應將組合物與另一組合物組合使 147729.doc •91- 201106969 指示組合物使用者將抗VEGF抗體組合物單 獨或與抗癌組合物(例如甲醯四氫葉酸、5-FU、奥沙利 翻、伊立替康或其組合)組合投與患者。術語「使用說 明」意謂藉由任何方式，例如以書面形式，諸如以藥品說 明書或其他書面宣傳材料之形式提供可適用治療、藥物、 治療、治療方案及其類似物之指導。 VEGF特異性拮抗劑可單獨封裝或與其他抗 物組合封裝為套組。套組可包括有助於投與患者單位㈣ 之視情況選用的組件，諸如復原散劑形式之小舰、注射用 注射器、定製之靜脈内傳遞系統、吸入器等。另外，單位 劑量套組可含有製備及投與組合物之說明書。套組可製造 為供-個患者單次使用之單位劑量、供特定患者多次使用 之劑量（在艮疋劑量下或其中隨著治療進展，個別化合物

在效能方面可能戀外、.斗，* A )，或套組可3有適於投與多個患者 之次劑量（「散裝（bulk packaging)」）。套組組分可包裝 於紙箱、發泡包裝、瓶子、管及其類似物中。 本發明提供一種治療已接受癌症（例如原發腫瘤）確定性 Γ術之患者的包含封裝之套組，其中該封裝包含抗VEGF 抗體組合物及在輔助治療中使用抗乂卿抗體組合物之說 明書’其中該等說明書陳述接受輔助治療之患者在起始輔 助治療後I年之则為94 3，危險比率為〇 6〇。 材料寄存 以下融合瘤細胞株已依據布達佩斯條約 丁狗)之條款寄存於美國菌種保存中心（a取胸_咖， 147729.doc -92- 201106969 VA, USA)： 抗體名稱 ATCC編號 寄存曰期 A4.6.1 ATCCHB-10709 1991 年3 月 29 日 以下實例僅意欲說明本發明之實踐且不以限制方式提 , 供。 實例 實例1.結腸直腸癌患者之貝伐單抗輔助治療 此實例係關於對獲自在國家外科輔助乳房及胃腸計劃 (National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project)(NSABP C-08)臨床試驗中治療之結腸直腸癌個體 之結果的分析。該研究之主要目標在於確定向治療結腸直 腸癌之標準化學治療中添加貝伐單抗之臨床益處，如無病 存活（DFS)所量度。第二目標在於確定在延長總存活方面 是否存在臨床益處。此試驗中所用之標準化學治療為曱醯 四氫葉酸、5-氟尿嘧啶及奥沙利鉑之組合。此試驗評估貝 伐單抗（AVASTIN®)作為患有可切除的II期及III期結腸癌 之患者之輔助治療的功效。 研究設計 NSABPC-08研究之設計描繪於圖1及圖2中。 * 在NSABP C-08試驗中，使用以下治療方案： 隊組A/第1組：經修飾之FOLFOX6(mFOLFOX6 :奥沙利 翻（85 mg/m2)與並行之曱隨四氫葉酸（400 mg/m2)及5-FU(400 mg/m2，靜脈内團式注射）（第1天）及5-FU(2400 mg/m2)(在第1天及第2天歷經46小時）），每14天1次，歷時 147729.doc -93- 201106969 12個週期（6個月）； 隊’·、第且.經修飾之FOLFOX6，每14天1次，歷時12 個週期（6個月）’外加在各化學治療週期之第丄天在奥沙利 鉑之刖扠與貝伐單抗（5 mg/kg，靜脈内），每丨4天丨次歷時丄 年。 貝伐單抗（AVASTIN®)以下述兩種小瓶尺寸供應，呈透 月至微乳白色無菌液體形式以備用於非經腸投與：各1 〇〇 mg(25 mg/ml-4 ml填充）玻璃小瓶含有貝伐單抗與磷酸鹽、 海藻糖、聚山梨醇酯2〇及無菌注射用水（usp)，且各4〇〇 mg(25 mg/ml-16 ml填充）玻璃小瓶含有貝伐單抗與磷酸 鹽、海藻糖、聚山梨醇酯20及無菌注射用水（usp)。藉由 以下投與AVASTIN® :抽取5 mg/kg劑量之必需量且稀釋於 總體積為100 ml之〇·9%氯化鈉注射劑（s〇dium chloride Injection，USP)中，隨後靜脈内投與。 為適合於此等試驗，需要患者患有組織學上確認之結腸 腺癌，其滿足以下階段之一： (丨）11期癌（丁3*4、N〇、M〇)(腫瘤已經由固有肌層侵入漿膜 下層或侵入非腹膜化結腸周或直腸周組織（τ3);或已直接 侵入其他器官或結構及/或穿透腹膜髒層（丁4))，或 (2)111期癌（任何τ、Ni * 2、Μ〇)(腫瘤已侵入任何深度，累 及區域淋巴結）。 若滿足所有以下條件，則患有藉由自原發腫瘤直接擴展 而累及相鄰結構（例如膀胱、小腸、卵巢等）之Τ4腫瘤的患 者為合格的： 147729.doc -94- 201106969 (1) 相鄰結構之全部或— (2) 照外科醫生之看法 (「治癒性切除」）； 为與原發腫瘤一起移除； 所有粗略可見之腫瘤均完全切除 品之邊緣未受到惡性細 (3)病理學家之組織評估確認切除樣 胞累及；及 (4)將不會利用局部放射治療。 患有-種以上同步原發性結腸腫瘤之患者為合格的，分 期分類（staging classificati〇n)係基於較晚期原發腫瘤。 〜者須已藉由開腹術（0pen lapr〇t〇my)或腹腔鏡輔助之結 腸切除術進行了腫瘤全切術（en M〇e c〇mpUte resection)(治癒性切除）。合格患者具有兩階段手術程序， 首先知：供減壓結腸造口術（deC〇mpressive c〇l〇st〇my)且接 著在後一程序中具有確定性手術切除術。藉由内視鏡檢 法’自肛門邊緣（anal verge)起腫瘤之遠端範圍須大於或等 於12 cm。若患者不為内視鏡檢法之候選者，則如藉由外 科檢查所確定’自肛門邊緣起腫瘤之遠端範圍須大於或等 於 12 cm。 患者為18歲或18歲以上，其ECOG體能狀態（performance status)為0或1 ’且照研究者之看法須具有至少5年之預期 壽命（排除其癌症診斷）。 在隨機化時，患者之術後粒細胞絕對計數（absolute granulocyte count/AGC)須大於或等於 1500 mm3(或小於 1500/mm3，若照研究者之看法，此表示正常之種族 (ethnic/racial)變異）且其術後血小板計數須大於或等於 147729.doc -95· 201106969 患者亦具有正常之肝功能及腎功能。 100,000/mm3 * ,。有惡丨生疾病（包括結腸直腸癌）之患者已無病至 少5年且據其㈣認為處於低復發風險中，則該等患者為 口格的。已得到有效治療之患有皮膚鱗狀細胞癌或基底細 胞癌、原位黑色素瘤、子宮頸原位癌、結腸或直腸原位癌 之患者即使在隨機化之前5年内診斷出此等病狀亦為合格 的》 若患者具有任一種以下病狀，則其為不合格的：非腺癌 之結腸癌、直腸腫瘤、隔離之遠端或非鄰接腹内轉移（即 使切除）、惡性疾病所引發之全身性或放射治療、在進入 研九之剛6個月内與原發性結腸腫瘤無關之顯著性出血、 ，重或非癒合性創π、皮膚潰瘍或#折、由内視鏡檢法確 定為活動性之胃十二指腸潰癌、重大手術程序、切開活組 織檢查(open biopsy)或在隨機化之前28天内出現顯著外傷 性損傷、預期在試驗過程期間需要重大手術程序、核心活 組織檢查（⑽e bi〇psy)或其他小程序、排除在隨機化^前7 天内置放血管接取裝置(vascular access⑽岣、不受控制 之血壓（大於150/90 rrnnHg)、先前CNS腦血管局部缺血病 史、6個月内周邊動脈局部缺血病史、6個月内内臟動脈局 部缺血病史、伴隨之齒化抗病毒劑、隨機化時臨床上顯著 之周邊神經病（使用3.0版NCI不良事件常用術語準則…以 Common Terminology Criteria for Adverse Events Version 3.0)，2級或2級以上感覺神經或神經運動毒性）、將排除使 用試驗中所用的任-研究藥物之非惡性全身性疾病、隨機 147729.doc •96- 201106969 化時懷孕或哺乳、精神病症或上瘾性病症或照研究者之看 法將排除患者毅研究試驗要求之其他病狀、ρτ (inr) > 1.5，除非該患者在用全劑量抗凝▲劑且該個體對於穩定 劑量之華法林（Warfarin)或穩定劑量之低分子量肝素具有範 圍内（irwange)INR，且該個體未有活動性出血或與高出血 風險相關之病理學病狀。 此試驗之主要終點為無病存活（DFS)之持續時間。dfs 之事件包括結腸癌復發之第一記錄跡象、第二原發癌或任 何病因所致之死亡。第二終點為總存活（〇s)之持續時間及 與研究治療有關之毒性。總存活之事件包括任何病因所致 之死亡。 使用以下準則進行結腸癌復發之診斷。對於腹部及/或 骨盆部位：陽性細胞學或活組織檢查（若吻合）； 腹部、骨盆及腹膜後節點：G)陽性細胞學或活組織檢 查’（2)逐漸擴大之節點，如由以至少4週時間間隔分隔之 兩次CT或MRI掃描所顯示，（3)wCT或MRI掃描所記錄， 在塊狀物存在下輸尿管梗阻，或（4)單一 CT或MRI掃描顯 不明確塊狀物，藉由在該部位進行正PET掃描確認其為惡 性的。 腹膜（包括内臟及壁腹膜或網膜）：陽性細胞學或活組 織檢查，或（2)逐漸擴大之腹膜内固體塊狀物，如由以至少 4週時間間隔分隔之兩次CT或MRI掃描所顯示，或單一掃 描’藉由在該部位進行正PET掃描確認其為惡性的。 腹水：陽性細胞學 147729.doc •97· 201106969 肝臟：（1)陽性細胞學或活組織檢查，或（2)不與良性疾 病相關之以下各者中三者：（i)新近或進行性肝腫大、異常 肝臟外形（liver contour) ; (ii)陽性放射性核苷酸肝臟掃描 或聲波圖（sonogram) ; (iii)正PET掃描，其確認異常CT掃

描或MRI掃描且與上升之CEA相關；（iv)異常肝功能研 究；或（V)在具有正常術後CEA值之患者中，由以4週時間 間隔分隔之兩次測定所確認，CEA提高，亦即CEA力價持 續上升至10倍上限標準值（應由同一實驗室使用相同方法 進行測定P 未作另外規定（NOS)之骨盆塊狀物：（1)陽性細胞學或活 組織檢查’或（2)逐漸擴大之骨盆内固體塊狀物，如由以至 少4週時間間隔分隔之兩次CT或MRI掃描所顯示，或（3)根 據單一 CT掃描，藉由在該部位進行正PET掃描確認為固體 塊狀物。 腹壁、會陰（perineum)及疤痕：陽性細胞學或活組織檢查 非腹部及非骨盆部位： 骨架：對於所有僅骨之復發，均需要活組織檢查 肺.（1)陽性細胞學、吸出物（aspirate)或活組織檢查， 或（2)感覺與肺部轉移一致之多個肺部節結之放射跡象。 骨髓：陽性細胞學、吸出物、活組織檢查或MRJ掃描 中樞神經系統：（1)正CT或MRI掃描’通常在具有神經 症狀之患者中，或（2)活組織檢查或細胞學（對於腦膜累及 之診斷）。 147729.doc -98- 201106969 只要可能’均以組織學方式確認第二原發癌之診斷。 結果 此試驗之結果表明在第一年期間（對應於積極治療期）， 向化學治療中添加AVASTIN®較之單獨化學治療顯著增加 DFS。資料顯示，此顯著益處不與任何增加之毒性或不良 影響相關聯。 研究應計有2,710名患者（對照隊組ι,356名及實驗隊組 1,354名）由於無追蹤或陽性手術邊緣（p0Sitive surgical margin)，未針對功效評估對照隊組之丨8名患者及實驗隊組 之20名患者。另外，發現22名對照隊组患者及15名實驗隊 組患者因其他原因而不合格，但包括於分析中。因此對 照隊組及實驗隊組中分別有^列及^“名患者包括於此 等刀析中。中位追蹤為3 5.6個月。治療隊組使患者特徵實 現良好平衡。略超過一半之患者小於6〇歲，約15%大於7〇 歲且存在相等性別分佈。Π期患者佔約25%β 隨機化量測事件時間。除主要終點外，所有ρ值均評估 為顯著的(在〇.〇5程度下’兩側）。所有信賴區間均為 95%。自Cox模型計算危險比率（HR)且事件時間之ρ值係來 自對數等級測試。只要可能，取及卩值係藉由陽性節點之 數目來分層。藉由費雪精確方法⑺㈣心以⑽咖如句比 較各比例。主要分析係、基於治療意向原則，僅排除未追縱 患者及在隨機化時針對主要終點無風險之患者（已知具有 轉移或陽性手術邊緣）。藉由河仙^及Wang之方法 (BiQmetHeS 1994 5〇:61-76)計算潛在危險函數（underlying 147729.doc -99· 201106969 hazard function)之平滑估計值。藉由Gilbert等人之方法 (Biometrics 2002 58:773-80)計算潛在危險比率之平滑估計 值。 結果如下： 患者數 事件數 3 年 DFS(%) P值 mFOLFOX6 1338 312 75.5 mFOLFOX6+ 貝伐單抗 1334 291 77.4 0.15 對於患有II期疾病之患者，實驗隊組及對照隊組之3年 DFS 分別為 87.4% 及 84.7%(HR=0.82 CI 0.54-1.25 ； p = 0.35) 且對於III期疾病，實驗隊組及對照隊組之3年DFS分別為 74.2%及 72.4%(HR=0.90 CI 0.76-1.07 ; p = 0.23)。 最終危險比率（HR)為0.888，p值為0.146。如下隨時間評 估危險比率（HR)及p值： 起始治療 後之年數 1 1.25 1.5 2 2.5 3 HR 0.6 0.61 0.74 0.81 0.85 0.87 P值 0.0004 < 0.0001 0.004 0.02 0.05 0.08 對於以mFOLFOX6+貝伐單抗治療之患者，在起始治療 後1年之DFS為94.3，且對於以mFOLFOX6單獨治療之患 者，該DFS為90.7(HR為0.60，p值為0.0004)。在最初的 1.25年期間，貝伐單抗具有強效應（1111=0.6195%(：10.48-0.7 8，p<0.0001)。此等資料表明，向化學治療中添加貝伐 單抗會在投與患者貝伐單抗之積極治療期（起始治療後的 最初12個月）期間及此後不久賦予臨床上有意義且顯著之 147729.doc -100- 201106969 以上將有 益處。此等結果亦首次顯示，投與貝伐單^ 利於患者。 &年 根據前述描述’顯而易見可對本 也ltt 又所返之發明進行轡仆 及修改以將其用於各種用法及病狀中。 仃欠化 G寻貫施例亦為 下申請專利範圍之範疇内。 i在乂 【圖式簡單說明】 圖1描繪C-08試驗之治療方案。隞 丨豕組A :經修飾之 FOLFOX6(奥沙利鉑（85 mg/m2)與並行之ψ ,2、tt ， 仃之甲醯四氫葉酸（400 mg/m)及5-FU(400 mg/m2，靜脈内團式注射）（第 及$ FU(24〇0 mg/m2)(在第丄天及第2天歷經46小時》，每“幻 次，歷時12個週期（6個月）；隊组B:經修飾之阳^⑽， 每14天丨次，歷時12個週期，外加在各化學治療週期之第丄 天在奥沙職之前投與貝伐單抗（5 mg/kg，靜脈⑴，每Μ 天1次歷時1年； 圖2描繪NSABPC-08試驗之研究設計。第上組：經修飾 之F0LF0X6(奥沙利翻（85 mg/m2)與並行之甲酿四氯葉酸 (400 mg/m2)及5_FU(400 mg/m2，靜脈内團式注射）（第丄天） 及5-FU(24〇〇 mg/m2)(在第i天及第2天歷經46小時》，每μ 天1次，歷時丨2個週期（6個月）；第2組：經修飾之 FOLFOX6，每^天卜欠，歷時12個週期，外加在各化學治 療週期之第1天在奥沙利鉑之前投與貝伐單抗（5 mg/kg，靜 脈内），每1 4天1次歷時1年。 147729.doc -101 - 201106969 序列表 <110>美商建南德克公司 <120>輔助癌症治療 <130> P4196R1 W0 <140〉 099112369 <141> 2010-04-20 <150> 61/171,008 <151〉 2009-04-20 <150> 61/171,318 <151> 2009-04-21 <150> 61/181,195 <151> 2009-05-26 <160> 2 <210〉 1 <211> 123 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 1

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60

Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser 95 100 105

Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 110 115 120 147729.doc 201106969

Val Ser Ser <210> 2 <211〉 108 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>序列經合成 <400> 2

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Ser Ala Ser Gin Asp lie Ser 20 25 30

Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Val Leu lie Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90

Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 lie Lys Arg 147729.doc

Claims (1)

1. 201106969 七、申請專利範圍·· 1 · 一種VEGF特異性拮抗劑之用途，其用於製造供確定性 手術之後辅助治療癌症患者以延長該患者之無病存活 (DFS)或總存活（OS)的藥物，其中投與該藥物一年以 2. 如請求項1之用途，其中在使用該VE(}F特異性枯抗劑治 療起始後約2至約5年評估該DFS或〇s。 3. 如請求項1之用途，其中延長DFS或〇s包含防止或延遲 癌症復發，或防止或延遲第二原發癌出現。 4. -種VEGF特異性拮抗劑之用*，其用於製造供確定性 手術之後輔助治療癌症患者之藥物，其中在以該藥物積 極治療期間該癌症之進展經防止或延遲，且其中該積極 治療持續一年以上。 T仕以该樂物積極治療停 5 ·如請求項4之 該癌症之進展經防止或延遲約6個月 6. 一種VEGF特異性拮抗劑之料，其用於製造供確定性 手術之後輔助治療癌症患者之藥物，其中在以該藥物積 間該癌症之復發經防止或延遲，且其中該積極 >〇療持續一年以上。 7.=求項6之用途，其中在以該藥物積極治療停止後， §玄癌症之復發經防止或延遲約6個月。 8· I種VEGF特異性拮抗劑之用途，其用 療已接受癌症確定性手術之患者以延長該患者二 〇s的樂物’其中投與該藥物一年以上。 s 147729.doc 201106969 9·如請求項8之用途，其中在使用該藥 約5年評估該DFS或⑽。 療起始 < 約2至 如請求項8之料，其巾延長则或〇s 癌症復發，或防止或延遲第二原發癌出現/止或延遲 11. I種VEGF特異性#抗劑n其用 療已接受癌症確定性手術之患者的藥物，其中在= 物積極治療期間該癌症 人‘、 万止或延遲，且其中該 積極治療持續一年以上。 、 12. 13. 2求項U之料，其中在以«物龍治療停止後， 该癌症之進展經防止或延遲約6個月。 一種VEGF特異性拮抗劑之用途，其用於製造供輔助治 療已接受癌症確定性手術之患者的藥物，其中在以㈣ 物積極治療期間該癌症之復發經防止或延遲，且其中該 積極治療持續一年以上。 14. 如請求項13之用途，其中在以該藥物積極治療停止後， 該癌症之復發經防止或延遲約6個月。 15. -種VEGF特異性拮抗劑之用途，其用於製造供治療已 接受癌症確定性手術之患者以延長該患者之DFs或〇§作 為輔助治療的藥物，其中投與該藥物一年以上。 16. 如請求項15之用途，其中在使用該藥物治療起始後約2 至約5年評估該DFS或OS。 17·如請求項15之用途，其中延長DFS或〇8包含防止或延遲 癌症復發’或防止或延遲第二原發癌出現。 18. —種VEGF特異性拮抗劑之用途，其用於製造供治療已 147729.doc 201106969 接受癌^確定料術之患者作為輔助治療的藥物，其中 在以該藥物積極治療期間該癌症之進展經防止或延遲， 且其中該積極治療持續一年以上。 .19.如請求項18之用途’其中在以該藥物積極治療停止後， 該癌症之進展經防止或延遲約6個月。 20. -種VEGF特異性拮抗劑之用途，其用於製造供治療已 接受癌症確定性手術之患者作為辅助治療的藥物，其中 在以該藥物積極治療期間該癌症之復發經防止或延遲， 且其中該積極治療持續一年以上。 21·如4求項i至2〇中任—項之用途，其中投與該藥物防止 或降低出現或復發臨床上可偵測的腫瘤或其轉移之可能 性。 22. —種VEGF特異性拮抗劑之用途，其用於製造防止患者 癌症復發作為輔助治療之藥物，其中投與該藥物一年以 上。 23_ —種VEGF特異性拮抗劑之用途，其用於製造降低患者 癌症復發可能性作為輔助治療之藥物，其中投與該藥物 一年以上。 • 24·如請求項22或23之用途，其中該患者在投與該藥物之前 . 已接受確定性手術。 25. 如請求項1至24中任一項之用途，其中該患者經鑑別為 在確定性手術之後有癌症復發之風險或低存活可能性。 26. 如請求項1至24中任一項之用途，其中該治療進一步包 含投與該患者化學治療劑。 147729.doc 201106969 27.如請求項26之用途，其中該藥物治療係與該化學治療劑 治療並行。 2S.如請求項1至24中任一項之用途，其中該VEGF特異性拮 抗劑為抗VEGF抗體。 29.如請求項28之用途，其中在確定性手術之後至少28天投 與該患者該抗VEGF抗體。 3 0.如請求項28之用途，其中該抗VEGF抗體為貝伐單抗 (bevacizumab) ° 31. 如請求項30之用途，其中該抗VEGF抗體與融合瘤ATCC HB 10709所產生之單株抗VEGF抗體A4.6.1結合相同的抗 原決定基。 32. 如請求項30之用途，其中該抗VEGF抗體具有包含以下胺 基酸序列之重鏈可變區： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGWINTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYPHYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 1) 及包含以下胺基酸序列之輕鏈可變區： DIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR (SEQ ID NO: 2)» 33. 如請求項1至32中任一項之用途，其中該癌症為結腸直 腸癌、乳癌、肺癌、腎癌、胃癌、卵巢癌或神經膠母細 胞瘤。 34. —種治療已接受癌症確定性手術之患者之套組，其包含 一種封裝，其中該封裝包含抗VEGF抗體組合物及在輔 助治療中使用該抗VEGF抗體組合物之說明書，其中該 147729.doc 201106969 等說明書陳述接受該輔助治療之患者在起始該輔助治療 後1年DFS為94.3，危險比率為0.60。 147729.doc