TW201105792A - Prion disinfection - Google Patents

Description

201105792 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 技術領域 本發明係有關用於令普恩蛋白去活性的組成物和方法 5以及觉到普恩蛋白或其結構類似蛋白污染的物品的消毒方 式。 背景技藝 歷史上地，感染病源體，諸如細菌，真菌，寄生蟲和 類病毒，白有建立好的控制方法，其包括不同形式的消毒 1〇和滅菌（例如蒸氣滅菌、乾熱滅菌、巴斯德滅菌、過渡除菌、 以環氧乙烧、戊二醜基酸、齡或其他的可滅菌化學物質處 理，輕射滅菌等）。以病毒為例，亦有建立好的方法，例如 降低PH值至4.0或更低，加熱鶴。c維持—段時間，或使用 高濃度的有機溶劑《此外，紫外線處理，使用曱醛和專一 15 性抗病毒之物質。 最近幾年，出現新的和目前種類不明的病原體，且已 刊登在公開科學文獻上，該病源體和普恩蛋白有關，且成 為面對今日健康照護工業最大的挑戰之一。普恩蛋白是感 染病源體，其和細菌以及目前的已知感染物不同。雖然沒 20有普恩蛋白正確結構的確實證據，許多人類和動物進來確 涊的疾病，是由普恩蛋白所引起的。如1>(：丁/1^〇〇/14353的 詳述内容中（其内容以引用的方式併入本文中），由普恩蛋白 所引起的人類疾病包括古魯症(Kuru)，古茲菲德_雅各氏病 (Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)，GSS 病（Gerstmann- 201105792

Straussler disease, GSS) > ^ ^ ’和致命性家族失眠症（Fatal

Familial Insomnia, FFI) ° 除了人類的普恩蛋白疾病之外，在已知的普恩蛋白疾 病群中亦包括動物的疾病’羊和山羊的搔4病應該是被研

究最多的動物普恩蛋白疾病。-些調查線索顯示變體CJD 和持續流㈣狂牛症是有_的。㈣沒有發展出成功的 治療方法，這麵㈣果t是致命性的，力吐潛伏 身上可長達轉’此„使科學家額傳染路 個重大的挑戰。 x句 10 彳能遭受感染風險的族群包括在手術時接觸遭到污汰 的醫療儀器的病人、研究感染物質的醫院職員、和負責: 潔和消毒儀器的健康照顧員工。有風險的族群可擴大至: 要在歐洲的獸醫、辱宰場工人、接觸牛隻或牛肉的肉販， 和最近較多的接受來自普恩蛋白疾病帶原者所提供的輪金 15 或器官移植的人。 普恩蛋白的結構曾是重點研究的主題，同時有不同的 看法。一些科學家相信它們是非常小的病毒，而多數的專 家目前相信普恩蛋自確實是沒有DNA或RNA核心的感染性 蛋白質。更特別地是目前認為哺乳類的PrP基因表現出可溶 20解、不具致病性、細胞型PrPc的蛋白質或是不易溶解的致 病型PrPSc蛋白質。許多證據指出普恩蛋白疾病是因正常細 胞型轉變成不正常？1*1>3«：型所引起。此二形式的胺基酸序列 並無明顯的不同。Prpe形是高度膜相關的33_35kDa蛋白質所 組成而會被蛋白嗨K消化而降解。然而PrPSc型有著不同的 201105792 構型’特別是有高比例的β-片狀結構。prpSc6<j 27-30kDa抗 蛋白酶核心之特性對於診斷感染性變異構蜇有幫助。另一 個區別性變異結構感染型的特徵是其有一疏水核心° |[先前技 5 傳統的消毒和滅菌劑在可接受的時間範園内對普恩蛋 白並無明顯的作用。當欲去除普恩蛋白活性和/或消毒被污 染的表面時’其顯示出不尋常的抵抗性。所需的情況通常 過於嚴重以至於不適用於規律性的消毒，不光是指時間和 Φ 金錢方面，而是在造成物質損壞和職業上的健康傷害。舉 10 例來說，在一項研究中，樣品經過5-15分鐘/6〇0°C乾熱法後 仍然彳貞測到具感染性的PrPSc粒子，雖然全部過程可在15分 鐘下達到1000°C，以及1-10小時内>20(TC。曾有申請以1莫 耳濃度具腐蝕性的小蘇打(pH14)處理3小時，但此過程非常 具有腐蝕性，對員工造成危險，同時對物質具破壞性。 15 US5633349中描述一處理生物類物質過程，其以6-8莫耳濃 度尿素或1-2莫耳濃度氰硫化鈉處理至少12小時（18小時較 # 佳）’亦有類似的缺點。 因為消毒方法的困難，曾提案說腦部手術使用的手術 儀器應該只使用一次，但這表示丟棄時的危險以及昂貴的 20 費用而並不適用一些儀器。PCT/US00/14353描述一種方法 使用多陽離子樹狀聚合物使普恩蛋白不具感染性，但並不 清楚此表面消毒過程是可逆的或永久的或是商業上可行 的。 雖然焦點都放在PrPc型和PrPSc型上，仍暗示此蛋白質 5 201105792 可存在—有^片狀之中間型介於主要是α螺旋結構的PrPc 型和主要是0·>ί狀結構的prpSe型，其在變性劑不存在下仍 可溶解。 正常可溶解性蛋白質變成結構變異之不可溶解性蛋白 質之凝集或無法凝集被認為或暗示是許多疾病的原因。雖 然本發明在此處的描述是針對普恩蛋白，可理解其亦可應 用在其他W解性或抗酵素性之構龍異蛋白質所引起的 疾病上。 則述普恩蛋白技藝之討論不能被解釋為在澳洲 10 性知識。 t菊^明内容L】 本發明的目的是提供改善、或至少其它的方法消毒普 恩蛋白污染過的表面。在特定較佳具體實施例，本發明可 以更有效地消毒普恩蛋白，這裡是說和之前所提的方法比 15較’在-定時間内更有效率，或是在較短的時間具有同樣 的效果。在特定更佳具體實施爿，本發明可達到在6代下 60女鐘内減少普恩蛋白超過4個對數值(bg)。在—些具體實 施例中本發明也可應.用在不只是表面的普恩蛋白例如在 固態、液態或氣態培養基或生物系統的懸浮液中，所以有 20除了活體外和活體内之外的使用法。本發明在一些具體實 施例的目的為提供改良之檢測工具，而在其他具體實施例 中則為提供新的抗原決定基以製備抗體。 此處“普恩蛋白”(pri〇n protein)的定義包括變異體、片 段、融合體和類似物，其與完整長度的普恩蛋白序列有部 201105792 分相同的反應或活性，但其可能更方便來使用同時包括了 各種形式的二級結構。此處的定義也包括普恩蛋白等同 體，即蛋白質本身不是普恩蛋白但有與類似普恩蛋白的社 構或表現出類似的行為，而可使用來模擬或預測普恩蛋白 在特定情形下的表現。PrPSc普恩蛋白蛋白質有著同樣廣泛 的定義，但限定於普恩蛋白蛋白質其二級或三級結構為抗 酵素性同時包括構型亦有相同的抗酵素性。 發明詳細敘述

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關於第一態樣’本發明係提供一種方法，其包含經prpsc 普恩蛋白蛋白質污染過的表面的處理步驟，和—由（1)—咬 多個有效將普恩蛋白切割成無感染力的分子量片段的酵素 和(2)—或多個選擇的作用因子其易使Prpsc普恩蛋白蛋白 質構型去摺疊化但不會使該一或多種酵素變性之組人。 關於第二態樣，本發明係提供一種方法，其根據第一 方面更包括(3)—或多個促進或防止一或多種酵素摺疊化而 不會防礙普恩蛋白之切割的選定作用因子。 目前接受分子量少於27kDa之蛋白質是無感染力且安 全的’根據本發明的方法可將普恩蛋白消化或分解成至少 =的片段、較佳為至少98%低於27kDa，較佳為低= kDa ’或更佳為低於23kDa。然而，如果未來發現少於 2^Da的蛋*質是有錢力的，本發明之方法可用來將蛋白 ^成#何安全大小的片段。 <作用因子”的定義為包括化學試劑例如陰離子介 舌! 生劑、調整pH的試劑、和非化學性作用因子，其影響 20 201105792 物理和/或熱動力狀況，例如壓力、溫度、輻射和其他能量 影響因素促進摺疊或去摺疊。摺疊作用因子有時指"再摺疊 "作用因子。去摺疊作用因子有時是指“變性’’作用因子。 關於第三方面，本發明根據第一和第二方面提供一方 5 法，其於此處提到一或多種選擇傾向將結構去摺疊的作用 因子，係由下列各物組成之群中選出；包括一或多種輻射、 電場、磁場、能量波動和燃燒。 本發明之高度較具體實施例，為應用化學和物理作用 因子的組合，例如步驟(2)的作用因子中包括陰離子介面活 10 性劑和超音波的組合。 較佳的情形是在處理的過程中以超音速範圍的音波處 理普恩蛋白。然而去摺疊過程可經由其它形式的輻射來加 強或幫助，例如微波輻射、無線電頻率輻射、紅外線、可 見光或紫外光波、可聽的或較低頻的聲波、機械儀器的能 15 量震動例如磁性或旋轉擾動。其它形式的能量加入包括從 電子束照射，雷射照射，或電解。 至於其他方面，本發明可延伸至包括此方法的使用組 成，由此方法生產的新的普恩蛋白片段及從該片段生產的 新抗體。 20 根據本發明，一受污染的表面，例如受白污染 的手術儀器，以（1)一或多種有效將普恩蛋白切成不具感染 力分子量（目前是指低於27kDa)之片段的酵素，和(2)—或多 種選擇使普恩蛋白構型去摺疊的作用因子的組合來處理。

PrPSe蛋白的特徵為抗酵素攻擊性，其包括蛋白水解 201105792 梅不被目前所知的理論所限制住。本發明者假設prpSc蛋 白的抗酵素性是來自於摺疊的構型(相對於^螺旋結構，其 有著兩比率的片狀二級結構)。本發明的觀念為選擇—或 多種作用因子在選擇的形況下，促成去摺疊prpk蛋白而使 5 酵素有效分解卩叩^蛋白是可行的。 許多蛋白當失去它們的原來的三度空間摺合形狀(‘‘二 及二級結構”)會變為多孔的而“變性，，，變性包括了失去分子 間的作用因子，尤其是氫鍵和雙硫鍵，而失去幾乎所有正 常蛋白質，至少部分分子都有的二級結構，而其通常負責 蛋白質的活性。 則述技藝使用的技巧其酵素本身為蛋白質而容易因接 觸到促使蛋白質去摺疊的作用因子而變性。 15 20 目前並不確定是因為去摺疊試劑和酵素結合，防止酵 素和目標產物結合’或是因為去摺疊試劑促使酵素構型結 構去掏叠’導致其失去活性或“變性，，或此結果的組合。prpsc 蛋白在另一方面是高度抗㈣疊性。迄今認為形成-系統 而=素在去摺疊仙因子有效影響難處理的的蛋白如时s。 〜此維持活性;可㈣。本發明者料地發現任何…特 掏疊仙因子選擇性地去摺疊或放肋pS。蛋白而不去 可^吏變性)—選擇的酵素或是⑻摺疊和去摺疊作用因子 活性，以結合其㈣仙111子轉性祕進或維待酵素 使酵=去指疊作用因子選擇性且充分地去指疊普恩蛋白 、成停止普恩蛋白之目標。 發明藉由分類促進“摺疊，，或‘‘去摺疊，，作用因子然後 201105792 5 10 測試他們對酵素和PrPSe蛋白或其等同體的相對影響力而達 成了此本身並不一致的所希望之情形。 表面首先以—或多種作用因子處理然後加入一或多種 酵素’但較佳具體實施例為表面由兩者同時進行處理。 酵素以蛋白質溶解酶較佳。適合的酵素有： -非專一性蛋白質酶：_例如絲氨酸_酶、天門氨酸-酶、 金屬蛋白酶· -較專一性蛋白酶_例如角蛋白酶、膠原蛋白酶等 -任何其他表現蛋白溶解活性之酵素 此一或多種選擇可使普恩蛋白構型去摺疊化的作用因 子可促使酵素有效地對普恩蛋白作用。一般來說多肽鏈的 摺疊-去摺疊是熱動力地可逆或是不可逆的平衡過程。 舉例來說’促使去摺疊（變性）的作用因子包括：_ (1)熱-溫度增加到15〇。(：。

15 (2)pH-值低於3和大於9(因彳艮多支鏈殘基接觸溶液而離 子化所造成之全部影響）或在—些分子的特定基(例如絲氨 酸蛋白賴基上之N·端絲)之離子化所造成的部分影響。

(3)選擇的有機溶#丨其傾向變性、溶解或改變蛋白質。 -般來說產物不完全去料和形成—蚊的構型是根據原 20 始狀態而不同。傾向螺旋構型（如去指 疊化）的溶劑其典型有 N-二甲基甲醯胺、甲醯胺、 啶、二氣乙烯、2-氣乙醇。 傾向之溶劑如醇類、乙醇、 甲苯酚、二噁烷、氯仿、π比 此*群體亦包括有微弱形成氫鍵 正丙醇、甲醇（尤其是和〇〇1% 氮氣酸(HC1)之混合液）。同時，溶賴向解除結構如高濃度 10 201105792 之二曱亞砜(DMSO)、二氣醋酸和三氟醋酸以及其他親電子 性溶液。 (4) 特定有機溶液和混變劑·例如尿素、胍氫氣酸 (GuHCl)。除了一些特別安定的蛋白外，68莫耳濃度的 5 GuHC1在室溫下可將蛋白質轉變成隨易彎曲的多肽。^此 δ式劑會顯著地受到溫度、pH、其他試劑和狀況的影塑。 (5) 特定介面活性劑·離子介面活性劑傾向和蛋白質結 合和初步去摺疊其三級結構。陰離子介面活性劑是非常： 的變性劑。例如十二綠硫賴(SDS)當濃度接近臨界膠團 10 的濃度時可完全去摺疊許多（但非全部）蛋白質。十二苯磺酸 也是一變性劑。這些變性劑並不需要導致完全去摺疊，因 為在一些情況介面活性劑出現疏水部分可能會和有序結構 的蛋白質起作用形成膠團區域。陽離子介面活性劑通常去 摺疊的效果較陰離子為弱。十二乙氧硫酸鹽傾向使牛血清 15蛋白(BSA)變性，當乙氧基增加時效果會減低，而乙氧基超 過六個時該作用則消失。 (6) 可引起蛋白質構型轉變的無機鹽。例如溴化鋰、氯 化鈣、氰硫化鉀、碘化鈉、溴化鈉、疊氮化鈉皆是強變性 劑。雖然這些鹽類並不需要將蛋白質完全變性，原來構型 20的殘基會因能量輸入如溫度增加而遭到破壞。陰離子如氰 硫離子>碘離子>溴離子>硝酸根離子〉氣離子>醋酸根 離子>硫酸根離子顯示與胍離子鹽和三級烷胺鹽相似的表 現。然而硫酸二胍氫((GuH)2S〇4)已被發現可防止特定蛋白 質變性。 11 201105792 (7) 破壞雙硫鍵的作用因子，諸如硫二甘醇。 (8) 其他會與胺基酸上親水或疏水殘基有強烈親和性的 物質。 (9) 特定表面和接觸面，包括沸石、氣/液態間的接觸面 5 的吸收。 (10) 超音波能量、紅外線和微波輻射、高壓、和受到電 和/或磁場中粒子的作用可促使去摺疊（再摺疊），甚至搖動 或攪動也具有影響力。 本發明較佳的形式為使用作用因子例如一介面活性劑 10 和/或一適合的溶劑同時加上超音波的組合。目前並不清楚 能量的加入例如從超音波，在協助導向指疊/去指疊平衡上 傾向將PrPSe蛋白去摺疊化的速率較使酵素變性者為大，或 僅是對作用於普恩蛋白的作用因子或酵素提供協助，或是 其對活化酵素有效果。另一應用能量的方法包括低頻範圍 15 聲波的應用。然而能量震動可經由其他電機械輻射或機械 方式如磁力或旋轉攪拌來的的能量震動形式。其他形式的 能量加入可包括電子束照射、雷射或電解。 如同之前所提到的，大部分所討論的去摺疊力量預期 會使酵素變性。去摺疊力量和其使用狀況必須小心地選擇 20 而可以消化PrPSe蛋白或其等同體而不會使酵素變性，或是 不平常地結合去摺疊力量和一摺疊的力量。 適合的摺疊作用因子包括 12 201105792 (1) 親核溶劑和高度氫鍵有機溶劑。這是胜肽氫鍵的能 量和溶劑分子間氫鍵強度的競爭。當溶劑分子以強氫鍵聯 結時平衡式導向胜肽氫鍵的安定。溶劑如二噁烷、乙腈、 二甲基甲醢胺、吡啶和低濃度的二甲亞颯(DMSO)，此等為 5 好的質子接受者但為弱質子提供者，有非常弱的傾向去破 壞胜肽間氫鍵同時可傾向維持構型，尤其是球狀蛋白。 (2) 安定溶劑如多元醇(例如甘油、乙二醇、和丙二醇、 蔗醣和其相似物），此等為弱質子性’同時在其存在下蛋白 質易於維持構型安定而可被使用為安定劑。 10 (3)非離子介面活性劑如烷基、苯基或烷乙氧酯、丙氧 酯或前述之共聚物、葡萄糖苷等、肌胺鹽(例如(N_月桂醯) 肌胺醯鈉）不會改變蛋白質的三級結構而當其存在區域發 生去摺疊情況時介面活性劑之非專一性合作作用因子結合 開始顯著的增加。SDS所造成的的影響可藉由加人非離子 15性或酸鹼兩性的介面活性劑而減低。 (4)離子兩性和酸鹼兩性介面活性劑， ()π>;農度的緩衝溶液，（例如碌酸鹽、醋酸鹽、摔樣酸 鹽、硼醆鹽） 丁 (6)表面活性之同'、共.、或嵌段聚合物其在不同的排 20列下包含弱疏水性和弱親水性區域。 ⑺保4作用g)子，諸如硫酸鹽化合物 基葡萄歸_。如果—知入& 孔膽鹽胺 s包含摺疊劑和—去摺疊⑽性)劑， 田 #去摺疊或至少職酵素可有㈣作用於普恩蛋 白時，作用因子必須谐@ + / 、 頁選擇去保護或再摺疊酵素。舉例來說， 13 201105792 pH和/或溫度可以撰摆 選擇所以摺疊劑選擇性地表現在酵素 上，而當去摺疊劑選擇性地表相一c 本發明的最佳表現方式 有问3里球蛋白的牛清蛋白（Sigma產品A7906)，β-半 乳糖苗酶(G7279)、和兔子的肌球蛋白(Μ㈣3)使用作為低 溶解性和含有高β·片狀結構的蛋白質模式。上述蛋白質的 刀子量顯著地tt普恩蛋自為;^胜肽片段的分子量在酵素

’肖化過後較谷易確認’本實驗所使用的蛋㈣分子量(2〇 35 kDa)和普恩蛋白類似。 10 十一烷基硫酸鈉-膠體電泳（SDS-PAGE)是以英國的

Laemmh所述之方法，自然期刊，227，第68〇 685頁，（197〇)。

蛋白質溶液在含有2% SDS樣本緩衝溶液中煮沸2分鐘。1.5 毫米的聚丙稀酿胺膠片（8_12%)上每條跑道注入1〇微升的 蛋白質’在非還原的狀態下（例如樣品緩衝溶液中無β_氫硫 15 乙醇的存在）。電泳條件為150伏特跑1小時，直到染色劑前 端到達膠片的底部。膠片移開而蛋白質帶以考馬西氏藍 R-250(Sigma)或銀染（Bi〇-Red)來呈色。蛋白質的分子量以 預先染色的低分子量標記(Bi〇_Ra(i)經由校正曲線計算取 得。 在去摺疊作用因子和酵素之組合的作用之後若沒有偵 測到大於39.8KDa的分子量片段，就被認為是有效的蛋白質 切割。顯示該處理在等同體上是有效的。 當分子量大於39.8Kda的胜肽片段存在時，結果顯示為 14 201105792 陽性。 未證明本發明之方法可用來去除普恩蛋白的活性，而 不僅僅是切割等同體，於是使用Pri〇nins aG所發展出來的 普恩蛋白偵測試驗。 5 “普恩蛋白檢驗劑，，(PrioniW-Check)是一種免疫上的測 試用來偵測動物組織上的普恩蛋白，其使用一由pRI〇NICS AG所發展出來的新抗體。當prpsc存在於反應物中會被抗體 結合而被與抗體一起的酵素所偵測出來。 # 【實施方式】 10 表一描述的100毫升溶液分量大致如下。1微克的重組 普恩蛋白和普恩蛋白檢驗(pri〇njcs Check)以附錄1描述的 步驟先行製備。 當PrPSe在酵素消化過後被偵測到，結果以陽性表示。 表1顯示在對照實驗1-1到6-1中偵測到分子量大於 15 39.8kDa和PrpSc的片段。然而在實驗1-2到6-2中並無偵測到 分子量大於39.8kDa的片段和PrPsW存在。 籲 1 _ 1和1 -2不同的地方在於加入一去摺疊劑（3%DOBS) 顯示在70°C下30分鐘内有效。 2-2和3-2與2-1和3-1的不同在於考慮加入超音波。在2-2 2〇 中一去摺疊作用因子3%DOBS和25% Terric 164(—指疊劑） 在25 C下加上40kHz的超音波是有效的。在3-2之中以 10%SDS作為去摺疊劑和一兩性離子介面活劑作為摺疊作 用因子在2.6mHz下獲得一相似的結果 4-2和4-1不同的地方在於在更高的溫度下結合5〇1_狀與 15 201105792 SDS。 5- 2和5-1的不同在於硼不存在下結合dobs和Triton X-100 6- 2和6-1不同的地方在於增加DMSO的濃度從町逆地 去摺疊(0.05%)至不可逆地去摺疊(〇·5%) 5 本發明此處提供出現的技巧可在不破壞此發明所述的 觀念下使用其他作用因子的組合。 Μ 編號 溶液 SDS-PAGE 清蛋白 SDS-PAGE SDS-PAGE 肌球蛋白 Prionics Check 1-1 蒸德水 加熱至7〇t 7〇°C的熱水浴中30分鐘，每毫升 15單位的蛋白酶活性’ pH9 冷卻 十 + + 丨—j + 1-2 3% DOBS和蒸傲水稀釋至1 :i〇〇 加熱至70°C 7〇°C熱水浴中30分鐘，每毫升15 單位的蛋白酶活性，pH9 冷卻松。。 2Λ 3%DOBS，25%Teric 164稀釋至 1:100 每毫升15單位的蛋白酶活性， pH9 25〇CT30^t 十 + 十 2-2 3%DOBS , 25%Teric 164稀釋至 1:100 每毫升15單位的蛋白酶活性 以40千赫茲的超音理 25°C下30分鐘 3-1 10% SDS 10% Empigen BS/AU(兩性離子介面活性劑)稀 釋至1:100 每毫升15單位的蛋白酶活性， pH9 25°C下30⑽ + + + ———— + 3-2 10% SDS 10% Empigen BS/AU(兩性離子介面活性劑)稀 釋至1:100 每毫升15單位的蛋白酶活性， pH9 25 C下以2.6毫赫茲超音波處理 30分鐘 4-1 10% SDS，4% borax稀^至1:1⑻ 每毫升15單位的蛋白路活枓， + + + + 16 201105792 pH9 25〇CT30^f 4-2 10% SDS，4% borax#釋至 1:100 每毫升15單位的蛋白酶活性， pH9 55。(：下30分鐘 5-1 15% DOBS > 5% Triton X100 > 4% Borax# 釋至1:100 每毫升15單位的蛋白酶活性， pH9 25。。下30分鐘 + + + + 5-2 15% DOBS - 5% Triton X100## 至 1:100 每毫升15單位的蛋白梅活性， pH9 25t下30分鐘 6-1 0.05% DMSO 每毫升15單位的蛋白酶·活性， pH9 25〇CT30^f + + + + 6-2 0^% DMSO 每毫升15單位的蛋白酶活性， pH9 25°C下30分鐘 DOBS=十二烷基苯硫酸(Sigma產品No.D2525) DMSO=二曱亞颯(Sigma 產品 No. D5879) 蛋白酶=枯草桿菌蛋白酶Carlsberg (Sigma產品No. D5380) 40千赫茲超音波處理以UNISONICSPtyLtd•的超音波浴較佳 5 2.6毫赫茲超音波處理以DisonicsPtyLtd.的超音波喷霧器較佳。 附錄1 PRIONICS檢查測試方法 以下列出流程使用PrPSci抗蛋白酶核心，由一已知可 10 表現自然發生感染物之重組來源。實驗上已證明普恩蛋白 的抗蛋白酶核心不具感染力，但顯示感染物的存在。 1·秤1微克的PrPSe或含有相同來源的1微克(mcg)PrPSe的受 狂牛症感染的動物腦部加入1毫升的去離子水 2·加入10毫升的測試溶液並使用適當的去活性流程 15 3.取10微升的測試溶液並將其加入10微升的樣本緩衝溶液

4.製備好的SDS-PAGE 17 201105792 -沒有經處理的PrPSe溶液用來作記號(正對照組） -處理過的溶液 所有的蛋白質或蛋白質片段依其大小在一電場中分 離。小的蛋白質移動得較大的蛋白質為快。經過一段時間 5 之後當具抗性之PrPSe片段出現在膠片的下半部時，最小的 普恩蛋白分解片段會移動出膠片外面。在對照組中當普恩 蛋白仍然具抗蛋白酶性質時，沒有切除過的PrPSe分子仍然 在膠片的上面。 1 ·以西方墨點法（Western blotting)將蛋白質從膠片轉移到 10 硝化纖維膜上。 2. 加入單株抗體(Prionics產品No. 01-020) 3. 使其和蛋白質結合同時洗掉沒有結合的抗體。

4. 辣根過氧化酶和一次抗體結合而可以和化學螢光受質 (由AMERSHAMECL生命科學提供的ECL產品No· RPN 15 2209)反應 5. 將該膜暴露於X光底片下，沖洗底片。 6. 評估普恩蛋白是否存在。當抗體紀錄在普恩蛋白分子量 的相對位置時結果以陽性表示。 20 【圖式簡單說明】 無 【主要元件符號說明】 無 18

Claims (1)

1. 201105792 七、申請專利範圍： 1. 一種消毒方法，包含同時地利用一組合來處理一受PrPSe 普恩蛋白（prion)所污染之表面、懸浮液或溶液的步驟， 該組合包含 5 (1) —種或多種能有效地將普恩蛋白切割成不具感染力 之分子量片段的酵素； (2) —種陰離子介面活性劑，其係經選擇以令prpSe普恩 蛋白構型易於去摺疊而不會使該一種或多種酵素變性； • (3)—種或多種因子，其係經選擇以促進或保護該一種或 10 多種酵素之摺疊，而不會妨礙該普恩蛋白卩仆^的切割； 以及 (4)其中條件係經選擇以易於去摺疊而不是再摺疊，並且 其中該一種或多種酵素、該陰離子介面活性劑，以及一 種或多種因子之組合係經選擇以有效地切割一普恩蛋 15 白等同體，該普恩蛋白等同體為一具有高程度厶-片狀 之蛋白質。 2·如申請專利範圍第1項之方法，其中該處理步驟係經選 定以於切割後可導致一預定百分比的蛋白質片段具有 低於一預定分子量之分子量。 20 3.如申請專利範圍第1項之方法，其中至少90%的蛋白質 片段在切割後具有低於27kDa之分子量。 4·如申請專利範圍第1項之方法，其中至少90%的蛋白質 片段在切割後具有低於25kDa之分子量。 5·如申請專利範圍第1項之方法，其中至少90%的蛋白質 19 201105792 片段在切割後具有低於23kDa之分子量。 6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中該條件 係經選擇以保護或再摺疊該一或多種一或多種酵素，同 時不可逆地去摺疊或至少鬆開普恩蛋白至足以為該酵 5 素所接近。 7. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其進一步包 括結合一或多種因子，其係選自於由輻射、電場、磁場、 能量震動和此等組合所構成的群組中的作用因子。 8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該能量震動為超音 10 波、電磁或機械震動中之一或多者。 9. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中該一或 多種酵素是選自於絲氨酸蛋白酶、天門氨酸蛋白酶、金 屬蛋白酶、角蛋白酶、膠原蛋白酶，以及具有蛋白質分 解活性的酵素。 15 10.如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其進一步包 括結合一或多種經選定以促進去摺疊化的作用因子，其 係選自於由熱、pH、易使蛋白質變性之有機溶劑、混變 劑、易結合蛋白質的介面活性劑、作為蛋白質強效變性 劑之無機鹽、可導致S-S鍵斷裂的作用因子、對胺基酸 20 親水殘基具有強烈親和力的物質、對胺基酸疏水殘基有 強烈親和力的物質、促進表面吸收的物質、陰離子介面 活性劑和此等之組合所構成的群組中。 11.如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中經選擇 以促進或保護該一或多種酵素之摺疊的該一或多種因 20 201105792 子，係選自於由親核溶劑、弱質子性安定溶劑、非離子 介面活性劑、離子介面活性劑、兩性和酸驗兩性介面活 性劑、緩衝劑、表面活性之同-、共-、或嵌段-聚合物、 硫酸鹽化合物、去氧膽鹽、胺基葡萄烯醣，及其等之組 5 合所構成的群組中 11 一種用以處理一經？4&普恩蛋白或其等同體所污染之 表面的組成物，其包含 (1) 一種或多種能有效地將普恩蛋白切割成不具感染力 # 之分子量片段的酵素； 10 (2) —種陰離子介面活性劑，其係經選擇以令PrPSe普恩 蛋白構型易於去摺疊而不會使該一種或多種酵素變性； (3)—種或多種因子，其係經選擇以促進或保護該一種或 多種酵素之摺疊，而不會妨礙該普恩蛋白PrPSe&切割； 以及 15 (4)其中條件係經選擇以易於去摺疊而不是再摺疊，並且 其中該一種或多種酵素、該陰離子介面活性劑，以及一 ® 種或多種因子之組合係經選擇以有效地切割一普恩蛋 白等同體，該普恩蛋白等同體為一具有高程度/5-片狀 之蛋白質。 20 13.如申請專利範圍第12項之組成物，其中該陰離子介面活 性劑及一或多種因子，係經選定以於切割後可導致一預 定百分比的蛋白質片段具有低於一預定分子量之分子 量。 M.如申請專利範圍第12項之組成物，其中該陰離子介面活 21 201105792 性劑及該一種或多種因子，係經選定以於切割後可導致 至少90%的蛋白質片段在切割後具有低於27kDa之分子 量。 15. 如申請專利範圍第13項之組成物，其中該陰離子介面活 5 性劑及該一種或多種因子，係經選定以於切割後可導致 至少90%的蛋白質片段具有低於25kDa之分子量。 16. 如申請專利範圍第13項之組成物，其中該陰離子介面活 性劑及該一種或多種因子，係經選定以於切割後可導致 至少90%的蛋白質片段具有低於23kDa之分子量。 鲁 10 17. —種用以處理被PrPSc普恩蛋白或其等同體所污染之表 面的方法，其中該表面係以如申請專利範圍第12至16項 中任一項之組成物來處理。 18.如申請專利範圍第17項之方法，其中該表面是指醫療或 手術儀器的表面。 15 19.如申請專利範圍第15項之方法，其中該表面是指食物烹 調或醫院工作的表面。 22 201105792 四、指定代表囷： (一) 本案指定代表圖為：第（無）圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 無 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：