TW201039832A - Use of lanostane and Poria extract in treating cachexia - Google Patents

Description

201039832 ' 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種用於預防及治療消耗性疾病（諸如 惡病質及厭食）’尤其是癌症引起的惡病質，之醫藥組合 物。本發明之醫藥組合物包含羊毛固醇化合物作為有效成 分。此羊毛固醇化合物的一合適來源為茯苓萃取物。此外， 冬蟲夏草、樟芝及靈芝亦為可能之羊毛固醇化合物的來源。 Ο 【先前技術】 惡病質（Cachexia)表示處於一種不好的虛弱的狀態，常 源自於疾病造成厭食和内分泌及免疫系統改變，而出現疲 勞，肌肉及内臟蛋白減少，最終造成體重減輕。 • 惡病質在慢性病患或重症病患是常見的症狀，在癌症 病心尤其㊉見於胃癌和胰臟癌病患之中，約有百分之七十 的病患會出現這樣的症狀。在癌症末期，不論是何種癌症， Q 約有百分之八十的病患會出現惡病質的症狀，其特徵為就 算病患增加進食的量或提高營養的攝取，也無法預防或阻 止患者體重的持續下降。在治療上常使用荷爾蒙食慾促進 齊J (如 Megestrol, medr0Xypr0gester0ne acetate)，但實際上 有些人認為是暫停性體重增加（只是水分及脂肪增加），身 體肌肉量並沒有增加，活動能力、體能也未見改善。相反 的，一些藥物副作用如血栓、水腫、出血、高血糖、高血 壓會出現。 分解代謝性（catabolic)消耗或惡病質是一種特徵為不 3 201039832 自主進行性消耗脂肪及骨骼肌、頑固性體重減輕以增加營 養輸入、靜態能量消耗（REE)增加、蛋白質合成降低、碳水 化合物代謝改變（柯氏循環（Cari cycle)活性增加）、肌肉逯 過蛋白質溶解之ATp —泛素（ubiquhin) —依賴型蛋白酶體 路徑過度分解代謝、及脂肪組織透過脂肪溶解過度分解代 謝之症候群（Body JJ,Curr Opin 〇nc〇i η : 255 __ 60,1999,Muscaritoli M,et al ： Eur J Cancer 42 ： 31-

41,2006)。通常，在病患已減輕至少5%或$碎的罹病前體 重後才被診斷為惡病質。大約一半的所有癌症病患經歷某 種程度的分解代謝性消耗，較高發生率見於肺、姨及胃腸 道惡性疾病之病例（Dewys WD，et a丨：Am j MM 69 : A”〜 7，1980)。該症候群亦可見於免疫不全疾病諸如細s之病 患以及罹患細菌性及寄生蟲性疾病、類風濕性關節炎及 腸、肝、腎、肺和心之慢性疾病的病患中。惡病質亦與厭 食有關，其可為老化所表現之狀況或因為身體傷害及燒傷 造成。惡病質症候群降低病患之功能性能力及生活品質， 使潛在狀況惡化並降低對藥物之耐受性。惡病質之程度與 病患存活時間呈反比’其通常代表預後不良。近年來：二 化相關疾病與失能已經成為主要的健康關注及重要性。 厭食⑽示食慾喪失之醫學名詞）係許多惡性疾病之亞 化表現’可見於癌症、感染性疾病、慢性器官衰竭及創傷 病患。厭食是-種嚴重的症候群，因為它導致卡洛里攝取 降低及營養不良。厭食之表現包括對食物之味覺及嗅覺降 低、早飽、饑餓感降低及甚至完全厭惡食物’也可能出現 4 201039832 噁心及°區吐之症狀。對厭食的原因了解不多，·而有效的治 療l擇有限。有些研究指出荷爾蒙、社會及心理因素< & 合可能是該症候群發生及進展之重要因素。 μ '

’、、《事霄上…、病貝經常與癌症有關，但尚未證實惡病 質發生與腫瘤大小、疾病階段及惡性疾病之種類或時期 之間具有-致關係。然@ ’癌症惡病質經常與卡洛里攝取 減少、靜態能量消耗增加、及蛋白質、脂肪及碳水化合物 代謝：變有關。舉例來說，一些在碳水化合物代謝上之顯 ，異常包括u萄糖轉換率增加'肝臟糖質新生上升、 葡萄糖不耐及血糖上升。也經常發現脂肪溶解增加、游離 脂肪酸及甘油轉換增加、高脂血症、及脂蛋白脂酶活性下 降。重要的是’與癌症惡病質有關之體重減輕不僅是因為 身體脂肪儲存減少所致，也與身體總蛋白質質量減少及廣 泛骨骼肌消耗有關。蛋白質轉換增加及胺基酸氧化調節不 良亦可能是該症候群惡化之重要因素。此外，因應癌症所 m特定宿主源性因素’例如’發炎前細胞激素（腫瘤壞 死因子i(TNF—a)、介白素一 1、介白素—6、及丫―干擾 素）、急性期蛋白質（諸如〇反應蛋白）、及特定前列腺素似 乎亦與癌症惡病質有關。 在傳統中國醫學中建議給老年人天天食用茯苓中藥， 則老年人除了不容易生病外，且有助於延緩老化而長壽。 本案申請人於EP 1535619 A1揭示了 _種用以提昇人 體免疫力之醫藥組合物，此組合物含羊毛固醇（ian〇stane) 化合物作為有效成分，能提昇免疫力，用於病毒感染預防 201039832 及治療。另一方面，茯荟萃取物及其純化物（lanostanes)能 抑制免疫力，用於IgE引起過敏（氣喘）之預防及治療，此抑 制作用揭示於我國第97123189號及PCT/CN2008/001218 專利申請案。從這兩篇專利申請案顯示茯苓萃取物及其羊 毛固醇成分（lanostanes)可調節免疫力。本案申請人另於我 國第97111791號及PCT/CN2008/000749專利申請號揭示人 之腸細胞可受茯苓萃取物及其純化物羊毛固醇（lan〇stanes) 作用而增強吸收營養素；葡萄糖、胺基酸、維他命（葉酸） 因此我們認為获荟萃取物成分，特別是羊毛固醇化合 物（lan〇StaneS)有可能有助於與營養及免疫有關之惡病質的 文善或療。於本發明中以人肺癌細胞移植於小鼠進行實 驗來也明茯令卒取物成分及羊毛固醇化合物是否能對惡病 有σ療效果，觀察人肺癌細胞移植小鼠是否與正常小鼠 -樣有正常食慾而且體重也正常並無日漸減輕現象。

【發明内容】 發月之主要目的即在提供-種用於治療預防及治療 ^耗性疾病（諸如惡病質及厭食），尤其是癌症引起的惡病 質’之醫藥組合物。 取物用I月之另一目的即在提供一種從茯苓製備的茯苓萃 =用;：治療預防及治療消耗性疾病（諸如惡病質及厭 尤其是癌症引起的惡病質，之用途。 本發明之另一目的即在提供一種羊毛固醇（1_stane) 201039832 用於治療預防及治療消耗性疾 a 展病（啫如惡病質及厭食），尤 其是癌症引起的惡病質，的新用途。 本&月揭不-種預防及治療哺乳類動物（例如人類）之 消耗性疾病（諸如惡病f及厭食）的醫藥組合物，包含一預 防及治療消耗性疾病有效量作為有效成分的具下列化學式 (I)的羊毛固醇或其醫藥容許鹽：

其中 Ri 為 Η或 CH3 ; R2為 OCOCH3, =0 或 OH ; R3 為 Η或 OH ; R4 為-C(=CH2)-C(CH3)2Ra，其中Ra為H或 OH，或 -CH=C(CH3)-Rb，其中 Rb為 CH3或 CH2OH ; 115為 Η或 OH ;及 116為 CH3 或 CH2OH。 較佳的，該羊毛固醇（I)具有具下列化學式： 7 201039832

8 201039832 HOOC,

ϋ Ο 較佳的，本發明的組合物其含有0160重量％的羊毛固 醇（I)或其醫藥容許鹽。 較佳的’本發明的組合物為口服的。 本發明的又—目的係使用—茯荟萃取物作為該羊毛固 醇⑴的來源，該获苓萃取物包含！，重量％的具前述式⑴ 的羊毛固醇且實質上不含開環羊毛固醇。 較佳的，該获荼萃取物係由包含下列步驟的方法所製 備： '以一水，甲醇，乙醇或它們的混合溶劑萃取获荼菌的代 謝物，茯荟菌的醱酵產物或茯苓菌菌絲； b)》辰縮步驟a) %取所獲得的液體； Ο將步驟a)所獲得的濃縮物導入一矽膠管柱； 句以-低極性沖提劑(eluent)沖提該秒膠管柱：及 生的溶離液（eluate);及 、 e)濃縮步驟d)的溶離液。 較佳的，從步驟e)所獲得的溶離液 層層析法分析具有-層析值（Rf)^Q」，、物以石夕备薄 蛾作檢側，展開液為二氯甲炫：甲醇紫外光燈及 9 201039832 較佳的，步驟a)的萃取所使用的溶劑為95%酒精。 較佳的，步驟a)包含以、;弗水萃取茯苓菌的代謝物，茯 芬菌的酸酵產物或茯荼菌菌絲；加入一驗至該萃取水溶液 至其p Η值9 -11，分離出該給帕^、、六γ* · 芦®通鹼1'生水洛液，加入—酸至該鹼性 水溶液至其ΡΗ值4-7,以產生沈殺物；分離出該沈殿物；再 以酒精萃取該沈澱物，並分離出萃取液體。 較佳的，步驟b)的濃縮物被進一步以一體積比為以的 Ο Ο ㈣V/V甲醇水溶液及正己烧的兩相溶劑萃取；分離出甲醇 層，及》農縮該甲醇層，戶斤嫌AA A#*» »1 償㈣仔㈣縮物被用作為步驟c)的 石夕膠管柱的進料。 一#較佳的’步驟d)的低極性沖提劑為體積比為Μ、”的 二氯甲貌及甲醇的混合溶劑。 :交佳的’該获荟萃取物包含5_35重量％的羊毛固醇⑴。 較佳的，本發明的組合物進_ 结结址 ^ ^ 3 營養素’例如 葡萄糖、胺基酸、維生素或其組合。 較佳的，本發明的消耗性疾病係指惡病質，·更佳的， 該惡病質係因癌症而引起’例如肺癌、胃癌、胰臟癌、直 腸癌、乳癌、口腔癌或鼻咽癌。 較佳的，本發明的消耗性疾病係指因癌症、厭食、老 化、因為身體傷害或燒傷而引起。 >較佳的，本發明醫藥組合物對人的投予劑量 固醇⑴每日的投予劑量不低於8.4 mg。 、Λ 較佳的，本發明的醫藥組合物— 載體或稀釋劑。 "包含-醫藥容許 201039832 本發明以具式（η ()的平毛固醇或其醫藥容許鹽， 茯苓萃取物作為癌症串 』达 〜者R怒不振、體重嚴重下降的产 療。與惡病質有關之、庄、广〜^ ° 疾病除癌症外，尚有愛滋病、老化、 類風濕性關節炎、肺社枋 . * 胛…核、纖維囊腫、克隆氏症、感染疾 病等所引起之惡病質。丰 負手術或癌症病人（接受化療或放射療 Ο 法）造成身體虛弱，急需要補充營養素（胺基酸、㈣糖、 維他命）來改善。本發明的有效成分可以被添加在奶粉、飲 料、食品作為營養補充目的，也可作成醫藥品，如錠劑、 膠囊、顆粒劑、液劑、注射劑等形式出現，用於醫療目的。 【實施方式】 惡病質（Caclexu)表示人體處於一種衰弱狀態，造成惡 • 病貝之原因，有多種不同說法，但無一個確切之機轉。目 • 則所迠知道的是以癌症而言，癌細胞釋放因子或人體對癌 細胞之免疫反應釋放各種因子直接或間接造成厭食，體内 〇 之内分泌及免疫系統發生改變。因而使得人體之脂肪及肌 肉中之蛋白質逐漸減少而導致患者不喜歡飲食，身體曰漸 虛弱及體重日漸減輕的現象。 與惡病質有關之疾病有癌症、感染疾病（如肺結核、愛 滋病），自體免疫病（類風濕性關節炎），老年人，纖維囊腫、 克隆氏病。在癌症病患，尤其常見於胃癌和胰臟癌病患之 中’約有百分之七十的病患會出現這樣症狀。另外，在癌 症末期，不論是何種癌症，約有百分之八十病患會出現惡 病質症狀。在治療上如增加進食或其他經由灌食或靜脈注 11 201039832 • 射營養素’也無法預防或阻止患者體重的持續下降。在治 療上常使用荷爾蒙食惩促進劑（如]\4egestrol，medoxy progesterone) ’但實際上有些人認為是暫停性體重增加（只 是水分及脂肪增加）’身體肌肉量並沒有增加，活動能力也 未見改善。相反的’ 一些藥物副作用如血检、水腫、出血、 高血糖、高血壓會出現。 本發明所揭不之從茯苓製備具有治療惡病質的有效成 分的一合適方法例如為前述EP 1535619 A1所揭示的方 〇 法，包括利用傳統萃取法萃取茯苓得到一粗萃取物，再經 由層析法，分成極性小之羊毛固醇（lan〇stane)類部位（以二 氯甲烷.甲醇（96:4)為沖提液）和極性大之開環羊毛固醇 (sec〇ian〇stane)類部位（以二氣甲烷：甲醇（9〇:1〇或…1〇〇) * 為沖提液），其中，制石夕膠薄層層析法，顯示出羊毛固醇 (lanostane)類部位之所在位置，即展開溶媒為二氣甲烷—甲 醇（96:4)時，層析值（Rf)為匕〇1 ;至於開環羊毛固醇 O (secolanostane)類成分，則層析值小於0.1。用矽膠管柱層 析法可進一步分離該羊毛固醇類部位，其中沖提液使用二 氣甲烧.甲醇（97.3至95:5)，分離出數種羊毛固醇（1311__) 類化合物。 下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述，但不 以此限制本發明。 實施例一 以260升含75%酒精，加熱萃取 雲南產茯苓26公斤 12 201039832 三次’合併酒精萃取液，經減壓濃縮後可得225.2克萃取 物。萃取物經定量分析知道每一克萃取物可得76.27毫克 之羊毛固醇（lanostanes) ’ 其中 K1 (Pachymic acid) 33_4 亳 克 ’ Kl-1 (dehydropachymic acid) 9.59 亳克，K2-1 (Tumulosic acid) 19.01 亳克 ’ K2-2 (dehydrotumulosic acid) 6,75 晕克，K3 (Poylporenic acid C) 5.06 mg，K4 (3-epidehydrotumulosic acid) 2_46 亳克。 o ^ 實施例二 實施例一酒精萃取物125克以1 ·3升二氯甲烧萃取6 次’合併二氯甲烷萃取液，經濃縮後可得22.26克之萃取 物。以95%熱酒精溶解二氯曱烷萃取物，放冷後過濾不溶 • 物’濾液以水少量加入直到酒精含量為45%為止，此時會 有沉澱產生，用離心方式取沉澱物，可得丨7.4克沉澱物。 經定量分析可得知每克沉澱物含有264.78毫克羊毛固醇 ◎ Uanostanes)，其中 Κ卜 1 (pachymic acid) 159.7 毫克，Κ1-2 (dehydropachymic acid) 56.96 毫克，K2-1 (Tumulosic acid) 24·43 毫克，K2-2 (dehydrotumulosic acid) 8.8 毫克，K3 (polyporenic acid) 9.84 宅克 ’ Κ4 (3-epidehydrotumulosic acid) 5.05毫克。該沉澱物經石夕膠薄層層析法檢測證明其不 含有開環羊毛固醇。 實施例三 茯茶藥材100公斤以800公斤水煮沸3小時後，靜置 13 201039832 冷卻至50 C，以5N Na〇H調節溶液至pH n，再攪拌溶浪 3小時。接著以離心機分離液體和固體，固體再以8⑽公 斤水加入，同上述方法，以NaOH調至ΡΗ 11、攪拌和離心 機分離，去掉固體。合併兩次液體，在50Ό將液體真空濃 縮至1 〇〇公斤溶液，再加入3N HC1至pH 6.5，產生沈澱物。 分離出該沈澱物，再以40 L H20清洗，接著以離心機分離 出沈歲物’加入8 L水喷霧乾燥（spray dry)，得到約3 8 0 g ^ ;末再以4 ^之酒精萃取該粉末三次，合併萃取液並漠 縮可得238_9克酒精萃取物。該萃取物經矽膠薄層層析法 (TLC)檢測垃明其不含有開環羊毛固醇。該萃取物再經過 HPLC刀離’每克該萃取物可得主成分為K2 214 mg，K3 23 mg ’ K4 24 mg及少量成分K1 4.52 mg，即萃取物每克約含 265 mg 羊毛固醇（lan〇stanes)。 • 或以4 L之5 0°/°酒精水溶液萃取該粉末，去除50%酒 精水溶液部份收取不溶之粉末，重覆三次可得245.7克之 〇 5〇%酒精水溶液不溶物，經TLC法檢測顯示該不溶物不含 開環羊毛固醇，再經過HPLC純化分離該不溶物，每克可 得主成分為K2 214mg，K3 23 mg，K4 24 mg及少量成分 mg 即举取物每克約含261 mg羊毛固醇 (lanostanes) ° 實施例四 以雲南產茯苓30公斤，磨成粉後，利用ι2〇 [酒精（濃 度95 /。）萃取24小時，及過濾分離。再重復前述萃取及固 14 201039832 液分離三:欠。合併㈣’並將之濃縮後得錢萃取物2⑴ 克。再利用-兩相萃取劑（己燒：95%甲醇叫：1)對該乾燥 萃取物進行分配萃取。取出甲醇層並加予濃縮後得到乾燥 固體246.9克。利用石夕膠管柱層析對該乾燥固體進行分離， 該石夕膠管柱填充有該乾燥固體重量1()，倍时膠，係構 自Merck公司，Silica⑽6〇, 7〇_23〇⑽化。以二氯τ…

甲醇混合液作為沖提劑（ehient)，依序以96:4、9g:ig 〇⑽ 比例的混合液進行沖提，溶離液（eluate)以㈣薄層層析法 (™nLayerChr_〇graphy)(紫外光燈及峨作檢測展開 液為二氯甲烷：甲醇=96:4)檢測成分，將相同成分合併。 以-氯甲烧-甲醇（96:4)混合液進行⑦膠管柱層析，可 得到屬本發明的茯苓萃取物之PCM部份78克。PCM部份 依上述妙膠薄層層析法可明顯看到6個跡點。以二氯甲 烧：甲醇（9G:1G)及（G:1⑼）沖提液層析合併可得到pcw 168 克 〇 、PCM部份進—步以二氯f览：甲醇（96 5:3 5)作為沖提 劑進行矽膠管柱層析（同上述矽膠管柱），進一步分離可得 屯化之羊毛固醇（lanostane)類成分K1 (KM及κι_2), Μ (2 1 及 Κ2-2)，Κ3, Κ4, K4a, K4b，Κ5, K6a 及 K6b。詳細分 離步驟及鐘定分析數據請參見EP 1535619 A1。 上述之K1至K6b化合物，其結構如下： 15 201039832

Kl-l: R2 = OCOCH3 (pachymic acid) Kl-2: R2 = OCOCH3 (微量） K2-1: R2 = OH (tumulosic acid) (dehydropachymic acid) Ο K2-2:R2 = OH (微量） (dehydrotumulosic acid)

❹ K3 ： R6=CH3 R5 = H (polyporenic acid C)

K4a ： R6=CH2OH R5 = H K6a ： R6 = CH3 R5 = OH

K4:R2= a-OH R5 = H (3-epidehydrotumulosic acid) K4b:R2= yS-OCOCH3 R5 = OH

K5 16 201039832 從PCM部份分離出來羊毛固醇化合物K1至K6b的產 量如下表所示。PCM部份含有約1 5重量％的羊毛固醇化合 物K1至K6b。 K1 K2 K3 K4 K4a K4b K5 K6a K6b 3.0 g 6.2 g 1.93 g 0.55 g 66 mg 86.8 mg 47.6 mg 21.4 mg 90.7 mg 實施例五··膠囊製備 依下列組成製備含有實施例四所製得的茯苓萃取物 PCM成份的膠囊： 成份 每膠囊 每30,000膠囊 以實施例四方法製備的茯苓萃取物 PCM (含約15 wt°/〇的K1-K6化合物） 11.2 mg 336.0 g 石夕 #呂酸納(Sodium silicoaluminate) 5.0 mg 150.0 g 馬铃薯殿粉（Starch Potato) 378.8 mg 11,364.0 g 石更脂酸鎂(Mangensium Sterate) 5.0 mg 150.0 g 小計 400 mg 12,000.0 g 將茯苓萃取物PCM與矽鋁酸鈉分別以#80目（mesh) 篩網過篩，馬鈴薯澱粉以# 60目篩網過篩，硬脂酸鎂以# 40目篩網過篩後，置入混合機攪拌均勻，接著填充入壹號 空膠囊，每顆膠囊含有約1.68 mg (0.42 wt°/〇)的有效成份 17 201039832 K1-K6。 實施例六 以本發明之實施例二及實施例三所製備的茯苓萃取物 分別調配如表一的藥劑做為試驗物質，來評估動物因癌症 引起之體重、攝食情況與血清中蛋白質量之改變，以及癌 症引起之惡病質病人服用茯苓萃取物萃取物之整體營養狀 況。 ❹ 表一：試驗物質所含茯荟萃取物的劑量 藥劑 茯苓萃取物* 羊毛固醇動物劑量 相當人用劑量 PC-A 實施例二 17.6 mg/kg 33.6 mg/70 kg PC-B 實施例二 8.8 mg/kg 16.8 mg/70 kg PC-C 實施例二 4.4 mg/kg 8.4 mg/70 kg PC-D 實施例三 8.8 mg/kg 16.8 mg/70 kg ❹ *茯苓萃取物含26%羊毛固醇化合物 實施例七 本實施例為以表一的藥劑來治療癌症引起之惡病質的 動物試驗。以人肺癌細胞移植於小鼠進行實驗來證明茯苓 萃取物是否能對惡病質有治療效果，觀察人肺癌細胞移植 小鼠與正常小鼠的體重、攝食量及血清白蛋白濃度變化， 來評估其治療癌症惡病質的藥效。 實驗動物 18 201039832 試驗用老鼠分別自台大動物中心購進六至八週齡 CB- 1 7 SCID小鼠，分別飼養於不鏽鋼蘢中。室溫控制於 25±2°C，濕度範圍40-70%，12小時光照/黑暗交替，飲水 不限制。購入後於動物房先給予適應期，逢機祥重後，以 亂數方式將相近體重者編為同一組後，以統計分析確認各 組間之體重無顯著性差異。 人體肺癌細胞株Η 4 6 0培春 自液態氮筒取出保存之Η460細胞株，在37<t水浴槽 内解凍’並在操作檯内加入8 ml之1 〇%FBS DMEM媒介 液，並以1200 rpm離心10分鐘後’取出上清液後將細胞 加入8 ml培養液，培養於we、5%c〇2的培養箱中，直到 所需的細胞量。 - -小鼠原位（orthotopic)棺入肺癌細胞株H460 將小鼠以戊巴比妥（pentobarbital)深度麻醉後，用29 號（gauge) 0.5 ml騰島素（insulin)針，於小鼠胸肋腔内植入 Ο H46〇細胞株〇· 1 (1x1 〇6/ml) ’植入細胞後，將小鼠置回 原小鼠籠，讓其自行恢復。 藥物處理 實施例二製備的茯苓萃取物精稱67.7 mg以加入無菌 水定量至1 〇 mb使用超音波處理使該萃取物成懸浮狀態存 在於溶液中即成PC-A藥劑，定量5 ml PC-A藥劑以無菌水 定量至10 m卜即成PC-B藥劑，定量5 ml PC-B藥劑以無 菌水定量至1 〇 m卜即成PC-C藥劑。小鼠依各別體重進行 餵食，每小鼠體重25 gm管餵0.25 CC之藥劑，完成表一 19 201039832 的齊J量”兩_人進行試驗；正常小鼠組（blank)以蒸德水银 食正常小A (用培養液pBs替代H46Q注人胸腔之小鼠）。對 照組（_ίΓ〇1) ’則以蒸顧水餵食肺癌小鼠。傲食方式是以注 射針筒（1 cc)接上1 8號（長5公分）鋼管，管银時以左手握開 鼠雙口腔，再輕將管健鋼管小心置入胃部，再管㈣劑或 蒸餾水，每次體積以不超過〇3 cc為限。 第一-人6式驗分正常組（blank)，對照組（⑶加⑺〗）及三組 〇 給藥組（給予不同羊毛固醇劑量），共計五組，每組9隻小 鼠。給藥組三組分別為顧食實施例二製備的茯荟萃取物的 藥劑PC-A、PC-B及PC-C給予肺癌小鼠，小鼠每公斤體重 被分別施予羊毛固醇17.6mg, 8 8叫及44邮，如表一所 示。 第一次试驗分正常組（blank )，對照組（control )及 給樂組-組’共計三組，每組3隻小鼠。給藥組為餵食實 施例三製備的茯苓萃取物的藥劑p c _ D給予肺癌小鼠，小鼠 〇 每公斤體重被施予羊毛固醇8.8 mg，如表一所示。 血清白蛋白血樣品收隼 於第22天從小鼠眼角採集全血，血樣於室溫靜置}小 時。以3,000 rpm速度離心2次，收集血清儲存於_2〇它， 待曰後測定血清白蛋白之含量分析。 血清白蛋白濃盾測定 使用鼠血蛋白ELISA (Mouse albumin ELISA)試劑套組 (Bethyl Laboratories Inc·，Texas, US)進行分析試劑套組分 析。抗鼠血蛋白（Anti-mouse albumin)以TBS稀釋loo倍， 20 201039832 被覆100 μΐ/well井於微滴盤中’在室溫下作用1小時。以 TBST清洗3次後’以1 % BSA 200 Ml/weii井做阻擔 (blocking) ’在室溫下作用1小時，再以tBST清洗3次。 加入樣品及標準液’在室溫下作用1小時，以TBST清洗5 次，再加入100 μΐ/well井的羊抗血蛋白-hrp共軛（G〇at anti-mouse albumin-HRP conjugate)稀釋液（以含 1 % BSA 及 0.05 % Tween 20之TBS稀釋l〇,000倍）於室溫下作用i小 ❹ 時。以TBST清洗5次’加入1 〇〇 μΐ的基質液tmb (3,3’，5,5’-tetramethylbenzidine)，在室溫下避光反應 μ 分 鐘’加入ΙΟΟμΙ/well井的2NHC1終止反應，測定A45〇nm 之吸光值。 統計方法 - 數據結果以_平均值it標準差來表示。統計原則首先以單 向變異分析（one-way ANOVA)來檢定組間變異，若P< 〇 〇5, 再以Dunnett’s multiple range t-test來進行各組間之差異 〇 比’此種方式則是各組與控制組分別進行比較為原則。 體重及攝含量變化 觀察第一次及第二次試驗的每一組小鼠之攝食量的變 化及體重變化情形。 結果 小鼠之體重變化 第一次試驗’肺癌小鼠在進行管餵茯苓萃取物過程 中’體重變化情形如圖一所示。對照組（contr〇i)小鼠在植入 H460肺癌細胞之後’體重明顯下降，相較於植入肺癌細胞 21 201039832 Ο ❹ 小鼠’再給予茯荟萃取物低劑量PC-C (4.4 mg/kg)及PC-B (8.8 mg/kg) ’二者並無區別’即無改善惡病質症狀。但如 加大劑量至17_6 mg/kg (PC-A)則可看到小鼠對體重之下降 有明顯趨缓之現象，因此茯苓成分能改善植入H460肺癌細 所引起體重下降之現象。使用不同茯苓萃取物進行第二次 試驗，萃取物PC-D (8.8 mg/kg)，對肺癌小鼠體重變化如圖 二所不。如同圖一，對照組（control)小鼠在植入H46〇細胞 後，體重明顯下降，而正常老鼠（Blank)(不植入H46〇細胞） 則體重略加而已，而給予茯苓萃取物的pc_D組則發現能夠 持續維持在試驗起始時之體重，因此茯茶能治療惡病質 症’應該可以由此得到證明。 罹癌小鼠之攝食量變化 肺癌】、执在進行管餵茯苓萃取物後，食物攝取量變化 情形如圖三所示。對照組小鼠在植人η偏肺癌細 胞之後’食物攝取量逐漸下降。相較於植入肺癌細胞小鼠 再給予茯茶萃取物（PC_D)的給藥組小鼠，攝取食物不會呈 現逐漸下降情形，反而與正常組（Mack)小鼠一樣（未植入 H46二肺癌細胞)，二組小鼠的攝取食物量並無區別。因此 茯令萃取物能改善或治療惡病質引起攝食不佳之病症。 肺癌小鼠血清中白蛋白含量變化 第人及第大試驗的每一組小鼠之灰清中白 量變化情形如圖四及閽$仏_ 3 及圖五所不。對照組（control)之植入肺癌 細胞H460)的小鼠相對於τ火a , 具有血清中白蛋白右 幻小鼠（不接種H46〇) 有下降的趨勢。在餵食茯苓萃取物的給 22 201039832 藥組（PC-A、B、 « ^ ^ ^ 、L)可觀察到隨著羊毛醇劑量增加會增加小 鼠的血中之白蛋白 3里在給予PC-A 17·6 mg/kg之劑量可 觀察到有顯著$极4 义〜加。在給予茯苓萃取物的給藥組PLD (8·8 mg/kg 劑量）， }也侍到相同顯著效果。 於動物體對肺癌細胞會產生發炎反應，此反應會改 變肝細胞蛋白暂 貝裏造情形，有些蛋白質會減少製造，有些 蛋（或誘‘出蛋白質）的製造會增加。因此，惡病質除觀 察老鼠體重及攝食量變化外，另外一個方式可測量血中白 蛋 血中白蛋白如下降’顯示動物受肺癌細胞影響使肝 、、、胞所製&的白蛋白減少，故釋放到血中白蛋白減少。如 圖四及圖五所示，惡病質小鼠其血中白蛋白含量減少，但 施予获荟萃取物的惡病質小鼠其血中白蛋白含量並不會減 少’茯茶萃取物顯然具有治療惡病質之作用。 實施例八： 〇 茯苓萃取物治療癌症引起之惡病質的人體臨床研究： (一） 觀察病人整體營養狀況改善。 (二） 觀察病人體重改善。 (A)癌症病人分組及給藥： 15個癌症病人體重持續性減輕，分屬於胃癌（3人）、 跋臟癌（3人）、直腸癌（3人）、乳癌（4人）、口腔癌（1人）及 鼻咽癌（1)，隨機分成3組，每組各5人，第一組給予低劑 量茯苓萃取物（萃取物源自實施例三’ 16.8 mg/每顆）’每曰 一顆膠囊。第二組給予較高劑量茯苓萃取物’每曰二顆膠 23 201039832 囊。第三組不給予茯苓萃取物僅服用化療藥物作對照目的。 (B) 治療過程：15個病人化療6週，第一/二組病人服 用茯荼且服用4週（5/6週僅化療），每週記錄體重/營養狀 況評估表。 (C) 治療結果（―）：癌症患者體重改善，治療結束後（第 六週或42天後）將病人體重與治療第1天體重作比較結果 如下： 組別 治療方式（化療） 體重增 加 體重不變 體重減輕 第一組 加入16.8 mg茯苓萃取物 3 1 1 第二組 加入33.6 mg茯苓萃取物 3 1 1 第三組 1 0 4 從治療結果可以看出給予化療藥物與茯苓萃取物組 (/一組）其對於體重維持不變或改善體重優於對照之第三 、’且（僅、、Ή予化療而不給予茯苓），此組體重可以觀察到體重 會減輕，仍低於治療第1天之體重。 (D)治療結果（二）病人整體營養狀況改善 癌症患者整體營養狀況之評估是依據臨床醫生使用之 P G - S C1 Α 〇 3 置表（Patient-Generated Subjective Global Assessment)，評估 一組病人在（1)體重改善（2)飲食改善（3)症狀困擾改善及（4) 體此改善所得綜合分數，如下列圖六、圖七及圖八所示， 圖’、為第—組患者（化療+茯苓萃取物膠囊1顆），圖七為第 24 201039832 二組患者（化療+茯苓萃取物膠囊2顆）’圖八為對照組患者 (化療）°PG-SGA分數愈低病人改善程序愈佳，整體趨向於 健康。 從治療結果來看，給予茯荼萃取物併用化療藥物治療 對於惡病質患者之健康/生活品質改善遠遠超越僅給予化 療惡病質患者，而且在統計學上呈現顯著意義 從本實施例的結果可以發現茯苓萃取物與化療藥物併 〇 用能阻止癌症病人體重減輕，同時病人整體營養狀況改 善’很顯著優於只給予化療的癌症病人。 圖式簡單說明 圖一顯示實施例七的第一次試驗的每一組小鼠之體重 — 變化，其中+代表正常組（blank”黑圓點代表控制組

(control);菱形、方形及三角形分別代表給藥組pc_A、pc_B 及pc-c，小鼠每公斤體重被分別施予羊毛固醇17.6 mg， Q 8.8 mg 及 4.4 mg。 圖二顯示實施例七的第二次試驗的每一組小鼠之體重 變化其中菱形代表正常組（Mank);方形代表控制組 (control)，及二角形代表給藥組pc_D，小鼠每公斤體重被 施予羊毛固醇8.8 mg。 圖三顯示實施例七的第二次試驗的每一組小鼠之攝食 量文化丨中菱形代表正常組（blank);三角形代表控制組 (control) ’及圓形代表給藥組pc_D ’小鼠每公斤體重被施 予羊毛固醇8.8 mg。 25 201039832 圖四顯示實施例七的第一次試驗的每一組小鼠之小鼠 於第22天之血中白蛋白濃度。 圖五顯不貫施例七的第二次試驗的每一組小鼠之小鼠 於第22天之血中白蛋白濃度。 圖六為實施例八的第一組癌症患者（化療+茯苓萃取物 膠囊1顆）之整體營養狀況之評估，其是依據臨床醫生使用 之 PG-SGA 評量表（Patient-Generated Subjective Global Assessment)進 行評估。 圖七為實施例八的第二組癌症患者（化療+茯苓萃取物 膠囊2顆）之整體營養狀況之評估，其是依據臨床醫生使用 之PG-SGA評量表進行評估。 圖八為實施例八的對照組癌症患者（化療）之整體營養 狀況之評估，其是依據臨床醫生使用之PG-SGA評量表。 ❹ 26

Claims (1)

1. 201039832 七、申請專利範圍： 1. 一種預防及治療哺乳類動物之消耗 , 疾病的醫藥組合 物’包含-預防及治療消耗性疾病有效量、： 的具下列化學式（I)的羊毛固醇或其醫藥容許_ •效、刀

   (I) 於式中R1為H或CH3; R2為OCOCH3, =0或OH ; R3為Η或OH ; R4 為-C( = CH2)-C(CH3)2Ra，其中1^為11 或 OH，或 -CH=C(CH3)-Rb，其中 Rb為 CH3 或 CH2OH ;尺5為 Η或 OH ;及 Κ·6 為 CH3 或 CH2OH。 2.如申請專利範圍第1項的醫藥組合物，其中該羊毛固醇⑴ 具有具下列化學式： 27 201039832

   28 201039832

   〇 3.如申明專利麵圍第1項的醫藥組合物，其中該醫藥組合物 含有〇.1-60重量％的羊毛固醇。 4_如中§青專利範圍第1項的醫f組合物，其中該醫藥組合物 為口服的。 ' 5_如申請專利範圍第1項的醫藥組合物，其中的消耗性疾病 為惡病質。 G 6.如申清專利範圍第1項的醫藥組合物，其中該哺乳類動物 為人類。 7‘如申請專利範圍第1項的醫藥組合物，其包含一茯苓萃取 物，該茯苓萃取物包含1_6〇重量％的具申請專利範圍第J 項的羊毛固醇（1)且實質上 3開環羊毛固醇。 如申請專利範圍第7項的醫藥组 、S物’其包含5-35重量％ 29 201039832 ' 的羊毛固醇（i)。 9.如申請專利範圍第7項的醫藥組合物，其中該羊毛固醇（I) 具有具下列化學式：

   〇

   30 201039832

   I 0.如申請專利範圍第5項的醫藥組合物，其中該惡病質係 因癌症而引起。 II ·如申請專利範圍第1 0項的醫藥組合物，其中該癌症為肺 癌、胃癌、胰臟癌、直腸癌、乳癌、口腔癌或鼻咽癌。 12.如申請專利範圍第1項的醫藥組合物，其中該消耗性疾 病係因癌症、厭食、老化、因為身體傷害或燒傷而引起。 1 3 ·如申請專利範圍第6項的醫藥組合物，其中該羊毛固醇（I) 每曰的投予劑量不低於8.4 mg。 14.如申請專利範圍第1項的醫藥組合物，其進一步包含一 醫藥容許載體或稀釋劑。 31