TW201035111A - Antibiotic compositions for the treatment of gram negative infections - Google Patents

Description

201035111 六、發明說明： 此申請案主張於2008年12月23曰申請之美國臨時專利 申請案第61/140,408號的優先權，其全部内容於此併入以做為 參考。 【發明所屬之技術領域】 此申請案描述了抗菌化合物以及相關的治療方法與製造 方法 〇 〇 【先前技術】 對氨基糖苷（aminoglycoside)、β-内醯胺以及氟化奎林酮 類抗生素具抗藥性的革蘭氏陰性細菌越來越常見。這些細菌常 常只對錄i細（polymyxins)以及具有抗g雜的相關胜 肽具有敏感性。因此，對於使用多黏菌素類以治療人類中多重 抗藥性的革蘭氏陰性細菌感染再度有了興趣。 例如多黏菌素B以及相關黏菌素（c〇listin，多黏菌素E) 的胜肽已做為抗菌劑而被投予至人類。然而，因為它們的毒 性’它們的仙在先前已被限制。這些雌包含附接至環外三 胺基酸_七胺級環狀胜肽，其巾該環外賴n端胺連= 至「側鏈」或「尾部」。該尾部是醯基。 在一些使用所建議劑量之多黏菌素B的病人中已觀察到 了腎毒性。在具有受㈣魏的病人中也已麟到了神經毒性 或神經病變，在素的—個大型研究中報告出了具有大體上 約7.3/〇的發生率（見，例如，E刪，过此 洲W· 33:動67)。當醯基環外鏈以及鄰近的N端 145491.doc 201035111 2,4-二氨基丁酸（Dab)殘基被酵素作用而從多黏菌素移除時， 這產生了相應的多黏菌素九胜肽。多黏菌素B九胜肽的活體 内毒性顯著地低於多黏菌素B本身的毒性（見，例如，Kimura, etal.(1992)«/」—/< 45，742-749)。在細胞培養中的該九 胜肽毒性相較於多黏菌素B降低了約1〇〇倍。然而，該九胜 肽的抗菌活性相較於多黏菌素B也降低了約2-64倍（見， 例如，Duwe，et al. (1986) J油ϋ 30:340-341)。 ’ 〇 ❹ 為了獲得改進的抗麟性以及降低毒性的胜肽，已企圖對 多黏菌素以及賴素進行化學修飾。例如，先前已藉由結合固 相胜肽合成以麟線狀結構，接著藉由從賴脂移除以及在高 倍稀釋溶液中濃縮哺得該環狀雖結構，而完成多黏菌素 B以及四種類似物的全合成（見，例如，丁触巧(2刪）"如 22: 1675-1681)、然而，該衍生物的活性比多黏菌素b低。較 近期的多_素B與少數緊密補化合物的全合成只藉由 固相胜狀合成而完成（見，例如，DeVisser，et al (2003) J； PepMe Res. 61, 298-306 and Kline, et al. (2001) y. PepL Res^ 57. 175_187)。雖然這些固相全合成方法都可提供多黏菌素的 T生物’但由於所產生的抗生素量很小，且需要大量的胺基 酸刖驅物’這些方法似乎都有限制。對於臨床研究，這些方法 =任何按比例增加可證實是哪且過於昂貴的。再者，已知這 =3,生相較於多黏菌素B具有改良的抗菌與毒性特 徵的夕黏囷素新衍生物。 供此’有具有與錄时B的抗祕性等效但具顯著較 --例如腎毒性）的新胜肽化合物以及這種抗菌化合物之 145491.doc 201035111 製造方法的需要。 [發明内容】 分子式①抗菌化合物具有對抗廣泛革蘭氏陰性細菌的活 性，比多黏菌素化合物（例如多黏菌素B)出乎意料低的腎 毒性，其中R7是烧基基®，該燒基基團如異丁基或二級丁基。

阳入〇 (I) ❹ 本文揭露了包含該分子式（I)抗菌化合物的醫藥組合物，以 及製備該域化合物的方法、馳g化合物之驗保護的類似 物以及使用該抗菌化合物的方法。該分子式⑴的抗菌化合物可 何生自多黏菌素，例如多黏菌素Βι以及[Ile7]多黏菌素。包 含-或更多的分子式（I)化合物、或藥學上可接受的鹽類、及/ 或其何生物之醫藥組合物在，例如’治療各種革蘭氏陰性病原 體所造成的細菌感染中是有用的。用以在個體中治療感染的方 法包含將醫療有效量的至少一分子式（I)化合物或其藥學上可 145491.doc 201035111 接又的鹽類投予至該個體。該抗菌化合物也可用於製造治療感 染的藥劑。 【實施方式】 定義 如本文中所使用的，且除非另外指出，除了所使用的上下 文中另外指出的範圍，下述單字、措辭以及符號應具有下 供的意義。 攸 不在兩個字母或符號之間的破折號（「-」）用以指出取代 〇 基的附接點。例如，_C0NH2是經由該碳原子而附接。 如本文中所使用的，「氨基保護基」意指任何取代基，當 分子上的其他地方發生化學改變時，該取代基可用於預防該分 子上的氨基經歷化學反應。氨基保護基可在適當的化學條件下 被移除。許多氨基保護基是本領域的技術人員所熟知的，氨基 保濩基、它們的加成方法以及它們的移除方法的範例可於，例 如，「Protective Groups in Organic Synthesis」by Theodora W.

Greene, John Wiley and Sons，New York，1991 中找到’其揭露内 〇 容於本文中併入以做為參考。 如本文中所使用的，「氨基保護基試劑」意指可與氨基（例 如胜肽的N端）反應的加成試劑，藉此藉由加入氨基保護基 而化學修飾所述氨基。 & 如本文中所使用的，當提及氨基保護基包含至少一 「酸 性取代基」時，該用語「酸性取代基」意指包含可給予氫的氨 基保護基（例如，取代基）的一部分。示範性的酸性取代基包 145491.doc 201035111 含續酸基、硫酸鹽、磺酸鹽、羧基、羧酸鹽、酸鹽以及磷酸鹽 的酸形式。在-個具體實施财，該保縣包含芳基或以該酸 性取代基取代的雜芳基。 ❹

如本文中所使用的，該用語「水溶性的」意指具有足夠 水溶性而用於預期用途的化合物。具有氨基保護基的水溶性化 合物可具有第一水溶性，該氨基保護基具有酸性取代基，該第 一水溶性足以允許這種化合物在水溶液媒介中的 (例如：(U-5 g/L。較佳約為i讥或更高）。同樣地，水溶性抗 生素化合物可具衫二水雜，該第二水溶性以允許醫療有 效量的該抗生素化合物在醫藥組合物水溶液中的溶解(例如： 約 100-500 g/L，包括至少約 3〇〇 g/L)。 如本文中所使用的，「芳基」意指單碳環、雙碳環或其他 多碳環的芳香環系統’包括與—或更多個環_的芳香環系 統’該-或更多個環選自絲、環錄以及雜環基，以及具有 5-14元環的絲基1S。芳基的雜定範例包括苯基、萘基 苯以及蒽基。 如本文中所使用的，「鲮基」意指COOH自由基。 「Fmoc」是9-苐基甲氧羰基基團。 —，、J /以川/穴，眾 該用語「鹵素」包含氟、氯、溴以及硬。 如本文t統用的，「雜芳基」意指轉環、雙石炭環或直 他多碳環齡魏系統，該料職統具有〗至4個 ς 或包含-或更多個非碳原子的雜基，或以選自〇、Ν、贿、s 或so形成該芳香縣統中至少—位置之—部分的基團。雜芳 145491.doc 201035111 基環系統可具有，例如，5至15個環元素。雜芳基的非限定 範例包括吲哚基、吡啶基、噻唑基、噻二唑基、異喹啉基、吡 唾基、噁唑基、噁二唑基、三唑基以及吡咯基。 如本文中所使用的’「[lie7]-多黏菌素Bl」意指該分子式 化合物：

及其商業可得的鹽類，例如硫酸鹽。 如本文中所使用的，「多黏菌素Bi」意指該分子式化合物:

以及 其商業可得的鹽類，例如疏酸鹽。 「磺酸基」如本文中所使用的，意指-S03H基團。 如本文中所使用的，該用語「前驅藥」代表在活體内快 速轉化成本文中所描述之該抗菌化合物母化合物的化合物， 145491.doc -8 - 201035111 例如，藉由在血液中水解。在T. Higuchi and V. Stella， ^ Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the ACS Symposium Series 中以及在 Edward B. Roche，ed.，所orevem.We Cam.ers ZVt/g·

Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987中提供了討論’兩者都於本文中併入以做為參考。

如本文中所使用的，該用語「藥學上可接受的前驅藥」 代表本發明化合物的那些前驅藥’該前驅藥在健全的醫學判斷 範圍内，適合用於預期的醫療應用中（例如，適合用以與人類 以及較低荨動物的組織接觸）而不具過度的毒性、刺激、過敏 反應，相稱地具有合理的優點/風險比例，以及對它們預期的 用途疋有效的，以及抗菌化合物的離子（例如兩性離子）形式 與藥學上可接受的衍生物（例如，酯類）。 如本文中所使用的’該用語「藥學上可接受的鹽類」意 指藥學鹽類’該藥學鹽類在健全的醫學判斷範圍内，適合用ς 與人類以及較低㈣物的組織細而不具過度的雜、刺激以 及過敏反應，且相稱地具有合理的優點/風險比例。藥學上可 接受的鹽類是本技術領域所熟知的，例如硫㈣。例如，S. Μ.

Berge，et al.在職我贿，66:1_丨9中描述了藥學上可 接受的鹽類。 立如本文中所使用的，該措辭「藥學上可接受的載體」通常 =指溶劑、分散媒介物、賦形劑、包膜、基質、安定劑、緩 ，液吸收增進劑、佐劑、釋放控制媒介以及諸如此類，上述 t上可接又喊體與職的崎相容，例如藥學投予。這種 匕:錄物質載體的使用是本技術領域所熟知的。載體的非限 疋則L括玉米;|遍或g轉、乳糖、蔗糖、微晶型纖維素、高 i45491.doc 201035111 嶺土、甘路轉、磷酸二_、氯化細及驗。雜合物可包 含父聯叛甲基纖維素納、微晶型纖維素、玉米殺粉、叛甲殿粉 鈉以及藻酸。 如本文中所使用的，該用語「醫療有效量」意指抗菌化 合物的量’該#對於執行該研究者或臨縣生解求的功能是 有效的，而不過度地危害投予該劑之該個體的組織。 如本文中所使用的，該用語「個體」意指哺乳動物、植 物、較低等動物或細胞培養。在一個具體實施例中，個體是需 要抗菌治療的人類或其他動物病患。 除非另外指出’如本文中所使㈣下述縮寫具有下述意 義： ~ AUC =該曲線下的區域 ADME =吸收、分布、代謝、分泌 BID 天兩次，意指每天給予藥物兩次 BUN =血中尿素氮 cfti =菌落形成單位 CH3CN = 乙腈

Cmax =最大血漿濃度 CV =心血管的 CYP =細胞色素P450 ec5〇 = 一半的最大有效濃度 ED =有效劑量 EDTA = 乙二胺四醋酸

EtOH =乙醇 HOAc =醋酸 145491.doc -10· 201035111 HPLC =高壓液相層析儀 MeOH = 甲醇 MIC - 最小抑制濃度 MTD = 最大财受劑量 NaH2P04 =填酸納 NOAEL = 沒有可觀察到的不良影響值 PK = 藥物動力學 PMB = 多黏菌素B PME = 多黏菌素E (黏菌素） QD = 一天一次（每天）

抗菌化> 合物 抗菌組合物可包含分子式（I)化合物，以及其藥學上可接 受的衍生物或藥學上可接受的鹽類，其中r7是選自異丁基以 及二級丁基的烷基基團：

145491.doc -11 - 201035111 舉例而言，具有抗菌活性的醫藥組合物可包含一或更多的 分子式（I)化合物，例如分子式（la)的化合物、分子式⑽的 化合物、分子式（la)或(lb)的鏡像異構物或其任何組合，或其 藥學上可接受的鹽類(例如硫酸鹽)或衍生物（例如，酯類）：

分子式(la)的抗菌化合物的一個特定的範例以下列的为子 式(Ic)及分子式(Ic’)來描述。 145491.doc -12· 201035111 L-Leu7 — L-Dab8

D-Phe6

L-Dab L-Dsbs L-Thr10

L-Dab4 t L-Daba t L-Thr2 L-Dabi

(Ic)

(Ic，） 該分子式（I)的抗菌化合物具有對抗一系列革蘭氏陰性細 菌的抗菌活性，包括相似於某些多黏菌素化合物，例如黏菌素 (多黏菌素E)及/或多黏菌素B的抗菌活性以及光譜。例 145491.doc •13- 201035111 如，如同在範例中所討論的，分子式（i)化合物對於對黏菌素 敗氣的P· aeruginosa以反Acinetobacter spp.，包括多重抗藥議 株的是有效的’同時也具有對抗五· 、[ 以及 C7⑽如(妙ψ/λ的抗菌活性，以及對抗五咐spp分離物 的一些活性。如同在範例中所描述的，在使用#44 以及足從細菌#21的鼠類肺感染模式中，以及在使 - 用A Mww⑽《//#1570的鼠類大腿感染模式中的藥物學的研究 確έ忍了分子式（I)化合物可相比於多黏菌素B的活體内抗菌 活性。此外，該分子式（I)化合物對於對抗多重抗藥細菌與多 ❹ 黏菌素Β同樣地有效，或比多黏菌素β更有效。此外，在下 述範例中以化合物5標出的該分子式（I)化合物對於對抗細菌 感染與多黏菌素Β同樣地有效，該細菌感染可能是由ρ 泥rwgzVKWfl引起或惡化的。一較佳分子式①抗菌化合物為

(S)-4-氨基-ΛΗ(2\3Λ)-1-(⑶-4-氨基-1-氧代 _1_((35风 125； 15足 18S，21 *S)-6,9,18-三(2_ 氨基乙基)-15_ 苯甲基_3-((穴)小羥 基乙基)-12_ 異丁基 _2,5,8，ll,14，17,20-庚氧代-l,4,7，10,13,16,19-庚唑環三氣沙-21-基氨基)丁烷2-基氨基)-3-經基l-氧代丁烷 (J 2_基)-2_(3_(2-氯苯酚)脲基)丁醯胺。 令人驚訝的是，相較於分子式（II)的其他化合物以及多黏 菌素類’例如多黏菌素Β，該分子式（I)的抗菌化合物具有減 低的毒性。例如，在範例4的大鼠近端腎小管細胞培養細胞毒 性分析中，分子式(I)的某些化合物（即表1中的化合物5和6) 的毒性實質上遠低於多黏菌素Β或所以化合物4標出之結構 類似的3-氣苯基類似物。相較於多黏菌素β所測出之318 pg/mL的EC50值以及化合物4所測出之691 jig/mT,的EC50 145491.doc -14· 201035111 值，分子式（I)的化合物5和6具有〉】，_ 的㈣ 值。在範例6中細節描述之食蟹獮猴（Cy_ok>guS_key) 中的7天重·量安全性研究中，相較於多_素B，在表i 中以化合物5標出的分子式（1)化合物也顯示出了降低的腎 毒性。 化合物的合成 該分子式（Π)的化合物，包括分子式（1)中所描述的化合 物，可根據第1圖巾所示的合成方案*好賴狄始材料製 備：

其中：

Ri選自Η以及-C(0)NHRa，其中RA選自苯曱基以及苯 基’以及其中所述苯甲基以及苯基兩者都可隨選地以一或更多 的鹵素以及/或确基取代； 145491.doc -15- 201035111 R2 選自-ch2ch(ch3)2 以及-ch(ch3)ch2ch3 ;以及 R3 是 H。 如同範例中所示，某些分子式（II)的化合物對於對抗細菌 與多黏菌素Β同樣地有效或更加有效。此具體實施例的化合 物包括在下述範例中以化合物卜2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、13、14以及15標出的化合物。 該分子式（II)化合物可具有一或更多的掌性不對稱碳原 子’因此能展現光學活性。除非另外指出，分子式（11)描述了 在每個對掌性位置的化合物之消旋以及個別鏡像異構物及/或 非鏡像異構物形式，包括其消旋或鏡像異構地分辨的非消旋組 合物。除非另外指出’本文中所揭露的該化合物可以單一異構 物或以立體化學異構物形式的混合物來使用。例如，分子式 (la)的化合物可包括分子式⑽及分子式(Ic’)的化合物以及/或 其他以分子式(Ia)描述的非鏡像異構物。 第分子式(Π)的化合物可從分子式（111)之任何適合的脂肽 起始材料獲得’該分子式（111)包括具有多個2,4_二氨基丁酸殘 基以及一醯基端的環外尾部部分（T)的環部分：

其中Y1以及Y3是2,4-二氨基丁酸殘基；γ2是蘇胺酸 殘基’x、y以及z是獨立地等於〗的整數；^是苯曱基；尺7選 145491.doc -16 - 201035111 自異丁基以及二級丁基’以及R1〇是L經基_丨乙基；τ是 R'-(C=〇)-;以及R'是烧基或（例如’羥基）取代的烧基，例 如6-甲基辛醯基、6-甲基細基、辛酿基、庚酿基、魏基 或3-羥基·6_曱基辛醯基。適合起始材料的範例包括多黏菌素 Β或[lie7]-多黏菌素Β。該起始材料可為天然產生的多黏菌素 化合物’該多黏菌素化合物根據例如Hausmann，et al <ι954ρ 贏以概k 76, 4892-48%巾所描述的程序而分離自 Bacillus pofymyxa 的酸酵物。 參考第1圖，該多黏菌素Bl起始材料_與氨基保護 基4劑反應（步驟（a)) ’以形成被保護的起始材料（1化），該 被保護的起始材料（lib)包含附接至該起始材料贝^中該初級 氨基基團的氨基保護基（P)。較佳地，該氨基保護基（p)包 含酸性基團，以提供被保護的起始材料（IIb)，該被保護的起 始材料（lib)具有足夠的水溶性，以在水性媒介中與去醯化劑 反應（步驟（b))’以形成去醯化材料（IIc)。該去醯化材料（IIc) 可與加成試劑反應（步驟（c))，以形成被保護的抗菌化合物 (lid)。該氨基保護基（p)可從該被保護的抗菌化合物（nd)中 移除，以形成該分子式（II)的化合物，包括分子式①的化合 物。 分子式(Ila)、（lib)、（IIC)、（IId)以及分子式(1)化合物的水 溶性可不同，同時每個獨立地適合用於不同預期的用途。例 如，水溶性的被保護起始材料（例如，第i圖中的分子式（nb) 化合物）可包含具有酸性取代基（例如，第1圖中分子式（IIb) 中的「P」）的氨基保護基，該酸性取代基提供足夠的水溶性以 在水性媒介中以可接受的產率執行該被保護之起始材料的酵 145491.doc -17- 201035111 素催化去醯化作用（例如，第丨圖中的步驟（b))。產物材料 可為分子式（I)抗菌化合物，該分子式（1)抗菌化合物具有足夠 的水溶性，以形成醫藥組合物水溶液，該醫藥組合物水溶液包 含醫療有效濃度的該分子式（I)化合物。 可選擇該保護基（P)，以提供該被保護之起始材料（IIb) 中所想要水溶性程度。例如，該保護基（P)可包含芳基或雜 · 芳基基團以及至少一酸性取代基，該酸性取代基選自羧基、磺 酸基、硫酸鹽以及其鹽類。示範性的保護基包含以酸性取代基 或其鹽類取代的9-薙基甲氧幾基（Fmoc )，例如2-(石黃酸基)·9_ 0 第基曱氧羰基（HSOrFmoc)以及其鈉鹽類（NaSOrFmoc)、 2-羧基曱基-9-苐基曱氧羰基（2-綾基曱基-Fmoc )、2-羧基-9-苐 基甲氧羰基（2-羧基-Fmoc)以及4-羧基-9-苐基曱氧羰基（4-羧基-Fmoc)。較佳地，該保護基是9-第基甲氧羰基的磺酸， 例如2-磺酸基-9-第基曱氧羰基。額外的氨基保護基包括但不 限於在“Protective Groups in Organic Synthesis” by Theodora W.

Greene, John Wiley and Sons, New York, 1991 在 pp. 315-348 中所揭露的保護基’該揭露内容在本文中併入以做為參考。 〇 該被保護之起始材料（lib)可在水性媒介中與酵素催化的 去醯化劑反應’以形成該去酿化材料（He)。有用於該被保護 之起始材料（lib)的去醯作用的去醯化酵素的一個範例是由 Actinoplanaceae屬家族的某些微生物產生。一些已知的種類以 反此本族的變化包括 Actinoplanes philippinensis、Actinoplanes armeniacus 、 Actinoplanes utahensis 、 Actinoplanes missouriensis ' Spirillospora albida ' Streptosporangium roseum ' Streptosporangium vulgare、Streptosporangium roseum var 145491.doc -18· 201035111 hollandensi、Streptosporangium album 、Streptosporangium viridialbum ' Amorphosporangium auranticolor ' Ampullariella regularis、Ampullariella campanulata、Ampullariella lobata、 Ampullariella digitata、Pilimelia terevasa、Pimelia anulata、 Planomonospora parontospora、Planomonospora venezuelensis、

Planobispora longispora > Planobispora rosea Dactylosporangium aurantiacum 以及 Dactylosporangium thai丨andende。從Actinoplcmaceci家族獲得显產±該酵素的所有 Ο 天然或人工的變異與突變可在此發明中使用。該去醯化劑較佳 地是多黏菌素去酸酶酵素，其可從Jw如/獲得。 該去醯酶酵素可如同水溶性凍乾固體而獲得。在一個具體 貫施例中，該去酿酶是藉由酸酵故以⑼治、從該 醱酵培養基分離出該細胞、以水清洗該細胞、以pH8_n的驗 性緩衝液萃取該細胞約2〇分鐘、將該萃取物調整至pH 7_8以 及冷凍乾燥而獲得。此過程所導致之該粉末形式的該酵素可相 對穩定且立即地再溶解於水中以使用。進一步的純化物可藉由 〇 凝膠過濾、膜過濾或其他類型的層析法而獲得。此酵素可去醯 化，例如，N-[2-磺酸基-9-第基甲氧羰基]5多黏菌素3鈉鹽， 以獲得該已去醯化的被保護胜肽’該胜肽具有第丨圖中的分子 式（lie)。在其他的具體實施例中，來自 的酵素可以來自舗酵的全部培魏或以清洗過的細胞 而使用。 來自汾伽op/⑽烈的酵素也可如同水溶性化的 (water-solubilized)製備而使用。該水溶性化的酵素製備可藉 由以相對紐萃取該清洗後細胞，接·由將該清澈萃取物^ 145491.doc -19- 201035111 整至pH 7_8而獲得。可將此水溶性化的酵素製備冷束乾燥成 固體形式。

參照第1圖的步驟（c)，該去醯化材料(lie)與加成試劑反 應，該加成試劑被選擇用來與該去醢化材料（lie)環外部分 N-端上的一級氨基反應，藉此藉由該加成試劑的全部或一成分 的加成至該氨基而化學修飾該氨基。例如，加成試劑可為酿基 氣基試劑’例如R'-(C=0)-LG，或續酸化試劑例如 2-LG ’其中LG是可與氨基反應的脫離基。加成試劑也可為， 例如’異氰酸鹽、異硫氰酸鹽、活化醋、氣酸、續醢氯、活化 磺胺、活化雜環、活化雜芳基、氯甲酸鹽、氰甲酸鹽、硫醯酯、 氣化碟醯、氨基填酸醋（phosphoramidate)、醯亞胺酸鹽或内 酯。加成試劑也可為醛或酮，該醛或酮在還原條件下與胺反 應，以形成烷化胺。加成試劑也可為活化胺基酸或胺基酸以及 胜肽耦合試劑，例如，PyBOP ® (六氟磷酸苯並三唑_丨_基_ 氧基-三吡咯啶鱗）、HBtU(2-(lH_苯並三唑-1-基)-1，1，3,3-四甲 基脲六氟磷酸鹽）、HBtU/HOBt ( 2-(1Η-苯並三唑+ 基)-1，1，3,3-四曱基脲六氟磷酸鹽/ N-羥基苯並三唑）或DCC (二環己基碳二亞胺）。在第1圖的步驟（c)中所示出的該加成 反應中’可選擇各種加成試劑以反應地將該官能取代基 耦合至該去醯化材料（IIC)中的該一級胺，以形成分子式贝) 化合物，其中R】如範例中的表1所定義。 以加成劑處理該去醯化的PB胜肽-3導致形成被保護的修 飾PB胜肽-3化合物。胺與加成試劑的反應，如同本文中所定 義’疋本領域的技術人員所熟知的。例如，以異氰酸鹽處理去 酿化的被保護PB胜肽-3產生一化合物，在該化合物中 145491.doc -20· 201035111 是脲基。

藉由移除該被保護的抗菌化合物（IId)的該保護基（P) (例如’藉由使用標準方法去保護’例如在“pr〇tective Gr〇UpS in Organic Synthesis” by Theodora W. Greene，John Wiley and

Sons，New York，1991中所描述的方法，其揭露内容於本文中 併入以做為參考）’可將第1圖中被保護的抗菌化合物（lid) 轉變成分子式（II)化合物。如同本領域的技術人員可識別的， 在该過程（步驟a)的第一步驟中所使用之氨基保護基的選擇 將支配在移除所述氨基保護基中所使用的試劑以及程序。當用 於該化學修飾的試劑包含一或更多的保護基時，那些保護基也 可被移除。用在該化學修飾劑取代基上的保護基的選擇將支配 在移除所述保護基中所使用的試劑以及程序。當用在該修飾劑 取代基上的保護基與用在該被保護化合物的保護基相容時，該 保護基可在單一步驟中移除。然而，當該保護基不相容時，可 能需要多個步驟以移除所有的保護基。 在移除該氨基保護基（P)之後，可藉由凝膠過濾、色層分 析或逆相HPLC來純化該分子式⑴化合物。可藉由傳統方法 來分離非鏡像異構物，例如色層分析或結晶。可藉由根據傳統 過程的消旋混合物解析而獲得鏡像異構物，例如藉由以光學活 t"生酉欠或驗處理而藉由非鏡像異構物鹽類的形成來獲得。適當酸 的非限定範例包括酒石酸、二乙醯酒石酸、二苯曱醯酒石酸、 一曱笨曱醯酒石酸以及樟腦續酸。可藉由結晶、接著藉由從該 光學活性鹽釋出該光學活性鹼，而分離非鏡像異構物的混合 物。用以分離鏡像異構物的替代過程包括使用光學選擇的掌性 層析ί柱，以使β亥鏡像異構物的分離最大化，或者使用超臨界 145491.doc 201035111 流體色層分析(SFQ。舉絲說，分子式⑽的化合物可從具有 對應立體結構的起始材料(如多賴素&起始材料)獲得。另 一個方法藉由以富含鏡像異構物的酸的活化形式或以富含鏡 像異構物的異紐鹽處理本翻化合物’醉料價非鏡像異 構物分子的合成。可藉由傳財法分騎合成的非鏡像異構 物例如色層为析、蒸德、結晶或昇華，然後將該非鏡像異構 考勿火解以獲知虽含鏡像異構物的化合物。可同樣地藉由使用 光學活性起始材料而獲得光學活性化合物。這些異構物可為自 由酸、自由鹼、酯類或鹽類形式。 用於製備抗菌化合物的特定流程可包括下列步驟:(a)以包 含至少一酸性取代基的胺基保護基處理如多黏菌素B的多黏 菌素，以行程一被保護的化合物；（b)以去醯化劑處理被保護 的化合物，以形成具有以下分子式的至少一去醯化的被保護化 合物：

是異丁基且P是胺基保護基； (c)以異氰酸鹽處理至少一去醯化的被保護化合物，以形成 具有以下分子式的至少一醯化被保護的化合物： 145491.doc -22- 201035111

如上述分子式(Ic)及分子式(Ic，)的化合物。 範例中描述一個用於獲得分子式⑽及(Ic，)抗菌化合物的 合適方法。藉由利用HPLC的範例中的方法來純化抗菌化合物 可提供具有純度約98%的分子式(ic)及(Ic，)的化合物(例如：具 有最多1%的分子式(lb))。或者，使用低壓液相色層分析的類 似方法可用於產生具有純度約92%的分子式(ic)及分子式(Ic，) 的抗菌化合物(例如··具有最多3%的分子式(Ib))。 醫藥的抗.菌組合物 醫藥組合物可藉由結合分子式（1)化合物或其藥學上可接 文的衍生物或鹽類以及藥學上可接受的載體而形成，該藥學上 可接受的紐適合祕根雜物運送的已知方法而運送至接 受個體（例如，人類）。可配製抗菌醫藥組合物，該抗菌醫藥 組合物適合用於-或更多的分子式①化合物的投予。該分子 式（I)化合物及/或分子式（1)之藥學上可接受的_或衍生物 可與-或更多的紐-起被包含在藥學的抗菌組合物中。 分子式（I)化合物可被配製成各種鹽類或衍生物，以增進 該化合物的穩定性或毒物學概、增域減低溶解度、增進該 145491.doc •23- 201035111 化合物的藥物動力學效能（例如，Cmax4 AUC量度）或增 進醫藥組合物儲存特性（例如，以減低吸濕性）。可藉由傳統 方法’例如以適當的酸或鹼處理本發明的化合物，而從本發明 的相應化合物來製備出分子式①化合物的藥學上可接受鹽 類。描述藥用化合物的藥學上可接受鹽類之選擇以及形成的刊 物範例包括 Haynes, Delia A” et al.，“Occurrence of Pharmaceutically Acceptable Anions and Cations in the

Cambridge Structural Database,” Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 94, no. 10, 2111-2120 (October 2005)以及 Stahl, PH, 〇 et al，，Eds” “Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties， Selection and Use,” Weinheim/Zurich，Wiley-VCH/VHCA，於本 文中併入以做為參考。 分子式（I)化合物也可配製成醫藥組合物中的前驅藥。前 驅藥可包含本文所揭示的抗菌化合物，該抗菌化合物具有以 HSCVFmoc保護的一個或多個胺基酸基團及/或其他氨基保護 基（包含至少一酸性基）保護的抗菌前驅藥（例如，如第1圖 中分子式(lid)化合物中所示的「p」）。該HS〇rFm〇c基團可在 導入至動物後被切割，例如，哺乳動物，包括人類，並釋放該 生物活性化合物。做為該被保護前驅藥的生物活性化合物之投 予可導致该抗化合物的緩釋機制。其他適合的前驅藥可包含 分子式φ化合物的酯類。前驅藥的討論被提供於，例如，

Gershonov，et al. (2〇00)，J 43·· (13), 2530-2537 以及

Schechter, et al_ (20〇2)，MM C/^2· Μ: 〇9)，4264_427〇 中，其 全部併入以做為參考。 該醫藥組合物可被配製用於非口服的運送，包括靜脈内 145491.doc -24- 201035111 的、肌肉内的、腹腔内的、皮下的、眼内的、腦脊髓膜内的、 關節内的、關節滑液内的、腦池的、肝内的、病灶内的以及頭 蓋骨内的注射、輸注及/或吸入投予途徑，以用於醫學症狀的 醫療治療，例如細菌感染。 藥學製備可根據標準程序而製備，且以所選擇的劑量來投 予’以治療感染（見，例如 ’ Remington’s Pharmaceutical

Sciences, Mack Publishing Company，Easton, PA 以及 Goodman and Gilman's “The Pharmaceutical Basis of Therapeutics，，’ Pergamon Press，New York, NY，其内容於本文中併入以做為參 考，做為用以投予各種用於人類療法之抗微生物試劑的方法的 概括描述）。 如上所述’該醫樂組合物可包含一或更多的載體，以用於 預期的醫學用途。除了一或更多的下述成分之外：pH緩衝溶 液、佐劑（例如防腐劑、濕潤劑、乳化劑以及分散劑）微脂體 製劑、奈米粒子、分散物、懸浮物或乳化物以及在使用前用於 溶解至無菌可注射溶液或分散物中的無菌粉末，用於非口服注 射的醫藥組合物包含藥學上可接受的分子式（1)抗菌化合物之 水溶液或非水溶液。在一個特定實施例中，醫藥組合物包括具 有大約92-98%重量百分比為分子式(Ic)及分子式(Ic，)化合物的 活性成分的抗菌活性成分，以及具有〇_3%重量百分比(包括大 約0-1%、0-3%、1_3%、高達1%以及/或高達3%)的為分子式 (lb)化合物的活性成分’其中此活性成分加入醫藥組合物的其 他成分。一特定靜脈内製劑是藉由合併抗菌活性成分以及靜脈 内醫藥組合物的其餘成份而形成’其中該活性成分具有大約 98 /〇重量百分比為分子式(Ic)及分子式(Ic，)化合物以及約〇_工％ 145491.doc •25- 201035111 重量百分比的分子式(Ib)化合物。對於靜脈内的（ιν)使用， 該醫藥組合物可包含以輸注方式投押任何相的靜脈内流 體，例如生理食鹽水或林格㈤nger，s)溶液。用以在原處釋 放該抗菌_可注射式賴（Injeetable de_形式可藉由在 生物可分解㈣合物帽_物形成婦囊基f而製造:例如 聚乳酸-聚織乙酸。依_物對聚合__以及所使用之 特定聚合物的性質，可控制藥物釋放的速率。對於肌肉内的製 n 务明化合物的無菌製備或該化合物的適合可溶鹽類形 式’例如虱氯酸鹽，可被溶解並於藥學的稀釋液中投予，例如 注射用水（丽）、生理食鹽水或5%葡萄糖。 在二例子中’為了延長該藥物的效力，可能超要 或肌肉内敝賴谢轉_的魏。這用 溶性之結晶或非結晶材料的 冑用八不佳水 έ士曰㈣十产·科的液_夺物來完成。可獨自使用非 、、口日日材枓，或在需要時與安定劑 的吸收速率則取決於其溶解縣非L §_ 小以及結絲式。解4魏:人，可能取決於晶體大 ㈣射製劑滅菌，例如，藉由經由細菌保留過滤器 _體組合物的形式併人滅_，該益菌 =二前可溶解或分散於無菌水或其他無菌的可 學上粉末形式’以在運送時溶解於適當的藥 子上了接又載體中。在另―個具 劑量形式可為在無菌的密二μ化口物的早位 的無菌獅液中的分子或無_注射时溶於適合 ' (1) $亥抗菌化合物或其鹽類的溶液。 145491.doc •26- 201035111 使用抗菌組合物 本文所描述的抗菌化合物有用於抗菌醫藥組合物的製造 以及以些組合物對細菌的處理。特別是，該抗菌化合物有用 於治療以及消除革軌陰性細誠染。治療在健（例如，人 類以及動物）中細g感染的方法包含醫療有效量之該分子式 (I)抗生素A合物或其轉上可接受的鹽贼前輔的投予。 該分子式（I)抗菌化合物可在活體内使用，例如，用以治 療個體中的細ϋ感染，以及在試管内使用，例如用以處理培養 中的細胞（例如’細菌）’以消除或減少細胞培養中的細菌汗 染畺。在一個具體實施例中，至少一分子式（〗)化合物或其醫 藥組合物被投予至細胞培養，例如藉由投予於營養培養基中。 治療這種感染的方法包含將醫療有效量分子式（1)的抗 囷化合物技予至需要它的個體中。該化合物可被非口服地投予 至個體，§玄個體具有或懷疑具有細菌感染，例如革蘭氏陰性感 染。 該分子式（I)抗菌化合物較佳地在活體内使用，以藉由投 予醫藥組合物中之醫療有效量的分子式（I)化合物而治療個體 中的感染。該方法可包括將包含至少一分子式①化合物的醫 藥組合物非口服地投予至需要它的個體。醫藥組合物包含組合 物，該組合物包含含量足以達到預期用途的分子式①化合 物，即，感染疾病的治療或預防。該醫藥組合物中分子式①抗 菌化合物的量與濃度，以及投予至個體的該醫藥組合物量，可 基於臨床相關因素而選擇，例如該個體的醫學相關特徵（例 如’年齡、體重、性別、其他醫學條件以及諸如此類）、該醫 藥組合物中該抗菌化合物的溶解度、該抗菌化合物的效力與活 145491.doc -27- 201035111 性以及該醫藥組合物的投予方式。包含醫療有效量之分子式 (I)抗菌化合物的醫藥組合物可被靜脈内地投予至病患，而以 臨床上安全且有效的方式來治療革蘭氏陰性感染，包括一或更 多的該組合物分開投予。例如，可每天以一或更多的劑量將約 0.05 mg/kg至約5.0 mg/kg投予至個體(例如，約〇 〇5 mg/kg QD、0.10 mg/kg QD、0.50 mg/kg QD、1.0 mg/kg QD、1·5 mg/kg QD、2.0 mg/kg QD、2.5 mg/kg QD、3.0 mg/kg QD、〇·75 mg/kg BID、1.5 mg/kg BID或2.0 mg/kg BID的劑量）。對於某些抗生 素用途’分子式（I)化合物的總每曰劑量可為約0 05 mg/kg至 ❹ 約3.0mg/kg的一或多個分子式（I)化合物（一天一至三次以靜 脈内投予至個體，包括使用一天一次、一天兩次或一天三次 60分鐘的靜脈内灌注劑量的約〇 〇5_3 〇、〇1_3 〇、〇 5_3 〇、 1.0-3.0、1.5-3.0、2.0-3.0、2.5-3.0 以及 0.5-3.0 mg/kg/day 的分 子式(la)、分子式(ic)或分子式(Ic，)化合物的總每日劑量的投 予）。在一特定實施例中，抗生素醫藥組合物可以具有，例如

1_5 mg/kg、3,0 mg/kg、4.0 mg/kg的組合物的總每日劑量，具 有高達約92-98%的分子式(ia)、分子式(ic)或分子式(1〇化合 (J 物，一天兩次或一天四次靜脈内地投予至個體。每次投予的劑 量或投予的總量將取決於這些因素，如該感染的性質與嚴重 度、該病患的年齡與一般健康情況、該病患對該化合物與牽涉 該感染的該微生物的耐受度。 特別是’包含分子式（I)抗菌化合物的該醫藥組合物可用 以治療具有細菌感染的個體，其中該感染是由革蘭氏陰性細菌 所引起或惡化。這些革蘭氏陰性細菌包括但不限於

Acinetobacter 沖pX 包括 Acinet〇bacter baumannii )、Citrobacter 145491.doc -28- 201035111

Ο

spp. ' Enterobacter spp. ' Escherichia spp. itL括 Escherichia coli ) 、Haemophilus influenzae 、Morganella morganii、 Pseudomonas aeruginosa ' Klebsiella spp. ( 括 Klebsiella pneumoniae )、Salmonella spp.、Shigella spp.、Yersinia pseudotuberculosis 以反所有後類的 Enterobacter、Pasteurella、 Brucella、Bordetella、Proteus、Sermtia、Providencia 认瓦 Edwarcfek·。該細菌感染也可由革蘭氏陰性細菌引起或惡 化，該革蘭氏陰性細菌選自Pseudomonas aeruginosa、 Acinetobacter spp、Stenotrophomonas maltophilia、Escherichia coli 、 Klebsiella pneumoniae 、 Citrobacter spp VX 。在一個具體實施例中，至少一分子式（I)化合物 可用以治療多重抗藥性的細菌，例如多重抗藥性的（MDR) P. aeruginosa - Extended Spectrum Beta Lactamase (ESBL) K. pneumonia、ESBL E. coli 以反 A. baumemnii。 該醫藥組合物可用以治療體内由革蘭氏陰性細菌引起的 任何器官或組織的細菌感染。這些器官或組織不受限制地包 括，骨路肌、皮膚、血流、腎臟、心臟、肺臟以及骨頭。例如， 包含至少一分子式（I)化合物的醫藥組合物可被投予至個體， 以不受限制地治療皮膚與軟組織感染(例如，複雜性皮膚感 染）、菌企症、腹腔内的感染以及尿道感染(例如複雜性泌尿道 感染’ cUTI)。此外，分子式（I)化合物可用以治療社區感染型 呼吸道感染（community acquired respiratory infection )，包括 但不限於，中耳炎、鼻竇炎、慢性支氣管炎以及肺炎（包括社 區感染型肺炎、醫院感染型肺炎以及呼吸器相關肺炎），包括 由抗藥性//； k/w⑼zae引起的肺炎。至少一分子式（I)化合物 145491.doc -29- 201035111 可被投予至健療混合性絲，其包含不嶋型的 氏陰性細S，或其包含革蘭氏陽性以及革蘭氏紐細菌。這些 類型的感染包含腹腔喊染以及產科/婦概染。至少一分^ 式（I)化合物也可被投予至個體，以治療感染，包括但不限ς , =内膜炎、腎炎、敗血性關節炎、腹腔内的敗域、骨路與關 節感染以及骨髓炎。至少—分子式（1)化合物或其醫藥組合物 也可被直接地注射或奸至膿瘡、啤顏節。以氣霧劑投予 的醫藥組合物’用以治療肺炎或其他肺相_感染。在一個具 體實施例巾’域_的運送玉具是無水或乾粉的吸入器。 範例 如本文中所描述的’製備一系列根據分子式(II)的化合物：

(II) Α其中該取代基如同表丨所指出的來選擇。這些化合物包 子式⑴化&物（所指出的化合物5以及化合物6)以及 分子式（II)。 145491.doc * 3〇 · 201035111 表1 :分子式（II)化合物，包括分子式（I)化合物 化合物No. Ri r2 r3 1 -C(0)NH-苯基 -CH2CH(CH3)2 H 2 -C(0)NH-苯基 -CH(CH3)CH2CH3 H 3 -C(0)NH-4-氣苯基 -ch2ch(ch3)2 H 4 -C(0)NH-3-氣苯基 -ch2ch(ch3)2 H 5 -C(0)NH-2-氣苯基 -ch2ch(ch3)2 H 6 -C(0)NH-2-氣苯基 -CH(CH3)CH2CH3 H 7 -C(0)NH-2,6-二氣苯基 -ch2ch(ch3)2 H 8 -C(0)NH-2,6-二氣苯基 -CH(CH3)CH2CH3 H 9 -C(0)NH-4-溴苯基 -ch2ch(ch3)2 H 10 -C(0)NH-4-氟苯基 -ch2ch(ch3)2 H 11 -C(0)NH-五氟苯基 -ch2ch(ch3)2 H 12 -C(0)NH-2-氣苯甲基 -ch2ch(ch3)2 H 13 -C(0)NH-2-氣苯甲基 -ch(ch3)ch2ch3 H 14 -C(0)NH-2,4-二氣苯甲基 -ch2ch(ch3)2 H 15 -C(0)NH-2,4-二氣苯甲基 -ch(ch3)ch2ch3 H 16 -C(0)NH-2-氯-4-硝基苯基 -ch2ch(ch3)2 H 17 -C(0)NH-2-氯-4-硝基苯基 -CH(CH3)CH2CH3 H 18 -C(0)NH-苯基 -CH2CH(CH3)2 HS〇3_Fmoc 19 -C(0)NH-苯基 -CH(CH3)CH2CH3 HS〇3-Fmoc 20 -C(0)NH-4-氣苯基 -CH2CH(CH3)2 HS〇3-Fmoc 21 -C(0)NH-3-氣苯基 -ch2ch(ch3)2 HS〇3-Fmoc 22 -C(〇)NH-2-氣苯基 -CH2CH(CH3)2 HS〇3-Fmoc 23 -C(0)NH-2-氣苯基 -CH(CH3)CH2CH3 HS〇3-Fmoc 24 -C(0)NH-2,6-二氣苯基 -ch2ch(ch3)2 HS〇3-Fmoc 25 -C(0)NH-2,6-二氣苯基 -CH(CH3)CH2CH3 HS〇3_Fmoc 26 -C(0)NH-4-溴苯基 -ch2ch(ch3)2 HS〇3-Fmoc 27 -C(0)NH-4-氟苯基 -ch2ch(ch3)2 HS〇3-Fmoc 28 -C(0)NH-五氟苯基 -CH2CH(CH3)2 HS〇3-Fmoc 29 -C(〇)NH-2-氣苯曱基 -ch2ch(ch3)2 HS〇3-Fmoc 30 -C(0)NH-2-氯苯甲基 -CH(CH3)CH2CH3 HS〇3-Fmoc 31 -C(0)NH-2,4-二氣苯甲基 -ch2ch(ch3)2 HS〇3-Fmoc 32 -C(0)NH-2,4-二氯苯甲基 -ch(ch3)ch2ch3 HS〇3-Fmoc 33 -C(0)NH-2-氣-4-硝基苯基 -ch2ch(ch3)2 HS〇3-Fmoc 34 -C(0)NH-2-氣-4-硝基苯基 -CH(CH3)CH2CH3 HS〇3-Fmoc 35 Η -ch2ch(ch3)2 HS〇3_Fmoc 36 Η -CH(CH3)CH2CH3 HS〇3-Fmoc

除非另外指出，化合物的抗菌活性以它們對抗

Pseudomonas aeruginosa、Acinetobacter spp、Stenotrophomonas 145491.doc -31 - 201035111 maltophilia、Escherichia coli 、Klebsiella pneumoniae、 CzYrakcier沙/7以及的最小抑制濃度（MIC )在範 例中被指出。可藉由範例中以及Jarolmen, H. et al.，“Activity of

Minocycline Against R-Factor Carrying Enterobacteriaceae，’’ /«/ec如⑽ /mwwmXv，Vol. 1，No. 4, pp. 321-326, 1970 中所揭露的 條件決定MIC，其揭露内容於本文中併入以做為參考。 範例1 :該去醯酶的製備 e亥去酿_:是猎由在沉浸式有氧酸酵環境下培養 _/^«此NRRL 12052而產生。所使用的醱酵流程 是已知的（Boeck, L.D· et al., Journal of Antibiotics 41:(8), 1085-1092(1998)於本文中併入以做為參考）。將於_7〇〇c保存 於2〇%甘油中之該NRRL 12052變異的儲存培養（st〇ck culture)導入至具有玻棒與Morton closure的25 X 150 mm試 管中，該Morton closure包含10 mL的培養基，該培養基由去 離子水中的蔗糖2.0%、預煮過的燕麥片2.0%、酒粕與可溶 物 0.5〇/〇、酵母菌萃取物 〇 25%、κ2Ηρ〇4 〇 1%、κα 〇 〇5%、

MgS04.7H20 0.05%以及 FeS〇4.7H2〇 〇._2% 組成。在旋轉搖 盪器上以250 rpm轉動並於30。(：培養72小時後，將所產生 的il、、、糸懸浮物轉置至在250 mL錐形燒瓶（Erlenmeyer flask) 中之50mL的PM3培養基中。此培養基包含於自來水中的蔗 糖 2.〇%、花生粕丨.0%、ΚΛΗΡΟΙ 0.12%、KH2P04 0.05%以及 MgSO^O 0.025%。該燒瓶在30 〇c培養6〇至9〇小時。收 成的時間是以分析絲決定’該分析法牽涉在該輯作用期間 以全部的培養液進行於不同時間N-[2-磺酸基·9_第基甲氧羰 145491.doc -32- 201035111 基]5多黏菌素B之去醯作用的HPLC分析。 因為來自該培養物之親液膠體的單一菌落分離物在形態 學以及酵素製造能力均為異質的，進行選擇以獲得穩定、高產 .能的變異。一開始，使用來自菌株12052的接種體而進行多重 .醱酵作用。來自產出最佳去醯化活性之燒瓶的植物生長物被分 布在不同的瓊脂（CM)。CM瓊脂包含玉米浸液〇.5%、Bact0 蛋白腺（Bacto peptone) 0.5%、可溶澱粉 i.〇〇/0、NaCl 0_05%、 ❾ CaCl2’2H2〇 〇.〇5%以及Bacto瓊脂2.0%。然後選擇菌落用於 進—步的評估。No. 18分離物被選擇為小菌落類型，並顯示 為所有所選擇菌落的最佳去醯酶製造者。比較是基於被保護的 多黏菌素B轉變成去醯化的被保護多黏菌素B的轉變，該轉 變疋以HPLC決定。此分離物被常規地用於該去醯酶酵素的製 造。 範例2 :分子式ϊ化合物的製備 〇 步驟⑻:五斗(2_續酸基）雜曱氧減·多黏菌素B的製備。 將溶解於15 mL二氣甲燒的苐基甲氧錄&經基號拍 醯亞胺（l.Lg，3，分mm〇1)於冰浴中攪拌，使用u型管 Urierite tube)以維持乾燥的大氣。逐滴地加入於6虹二氯 甲燒中的氯雜⑽mL，3.15 mmd)溶液，以提供黃色的 溶液。讓混合物酬室溫，並授拌數小時。將所產生的白色沉 澱物過濾、並以環⑽·二氯甲燒（1:1)沖洗，然後通過五氧化 二磷在真空中乾燥’以提供9必續酸綱基曱氧雜N_經基 _醯亞胺（HS03Fm〇C-aSu)。產量U48 g，（㈣的白色 固體）。見，例如，Y. Shechter et T Μ ^ ier et al. J. Med. Chem” 43, 2530 14549l.doc ,, 201035111 (2000)。 將購自Sigma-Aldrich、包含多黏菌素$以及[ne7]多黏菌

素Βι( 1.0 g, 0.841 mmol)混合物的多黏菌素b溶解於25 mL 飽和碳酸氫鈉、25 mL水以及25 mL四氫呋喃的溶液中。在 45分鐘期間内分批加入於25 mL四氳呋喃中的2_續酸基_9_第 基曱氧基-N-經基破拍S藍亞胺（2.0 g, 4.8 mmol)溶液。在室溫 下隔夜攪拌反應混合物並以50的mL水稀釋。然後以大約％ mL的6N氫氣酸將反應混合物酸化至pH 〇.5 _ 1，以提供油 狀沉澱物。將混合物隔夜冷象，並輕輕倒出水層。將油狀殘餘 ❹ 物溶解於100 ml的乙醇，並在醋酸乙酯的幫助下，於真空中 (35 GC)蒸發乙醇。將所產生的固體以醋酸乙醋磨碎、過淚 並乾燥’以提供1.74 g的混合物’該混合物包含被保護的多黏 菌素氐以及[lie7]多黏菌素氏產物。 上述程序可使用具有相似結果的相應多黏菌素B硫酸 鹽（包含多黏菌素硫酸鹽以及[lle7]多黏菌素Βι硫酸鹽的 混合物）以及2-磺酸基-9_苐基甲氧羰基氣。

CJ 步驟（b):五-2-石黃酸基-9-荞基曱氧羰基-多黏菌素B的去醯作 用。

將五-2-磺酸基-9-g基曱氧羰基-多黏菌素b (1 g)溶解於 800 mL的0.02 Μ磷酸錢緩衝液(pH 7 2 )中，與2〇〇 mL Et〇H 以及7.44 g EDTA結合’然後以丨N Na〇H調整至pH 8。加入 EtOH以及EDTA，以防止轉變成被保護的九胜肽，以及做為 防腐劑。對這個所產生的溶液加入25 mg的去酿酶酵素，並於 pH 8進行反應’並在30 GC攪拌8 -16小時。然後以1 Ν Ηα 145491.doc -34 - 201035111 將反應物調整至pH 6，並如下一節所描述的，將被保護的多 黏菌素B十胜肽加至樹脂中。所產生的濾液包含該酵素。 將所完成的1 L去醯作用反應溶液調整至pH 6。加入 . Envi-Chrom P樹脂，將混合物攪拌丨小時，然後藉由過濾移 除樹脂。將樹脂置於管柱中，以於〇·〇2 M NaH2P04中的8〇 mL 的20%CH3CN沖洗’將緩衝液中大約40mL的22.50/〇CH3CN 以及缓衝液中80mL的25%CH3CN調整至pH6.8。然後以 在緩衝液中的40% CHfN從樹脂溶析出去醯化的被保護化合 © 物69以及70，收集8 mL的分液。結合分液4、5以及6， 將之蒸發，以移除CHsCN，並將剩餘的水溶液冷束乾燥，以 獲得704 mg的粗產物混合物。將粗產物混合物與2〇 mL的 MeOH混合，攪拌0.5小時，並以離心分離。將倒出物蒸發至 乾燥’將水加至殘餘物，並將該溶液冷凍乾燥，以獲得為非常 淺標色粉末的452 mg的去醯化被保護化合物69以及70。此 產物混合物包含約85%的去醯化的被保護化合物35以及 15%的去醯化的被保護化合物36。 〇 步驟（c):去醯化的被保護化合物69以及70的醯化 在室溫下將化合物69以及70的去酿化被保護混合物412 mg(大約0.16mmol)溶解於4mL的二曱基甲醯胺（DMF) 以及0.4 mL柯林驗/2MHC1 (5:1體積比），以產出清澈溶液， 取樣該清澈溶液用於HPLC以做為0時間反應參考物。將8〇 μΐ (0.66 mmol)的2-氯苯基異氰酸鹽緩慢地力口入擾摔溶液中。 在室溫攪拌30分鐘後，以分析型HPLC取樣該反應物，並發 現該反應物大約100%轉變成想要的為混合物的醯化被保護 145491.doc •35· 201035111 化合物22以及23。 步驟（d):醯化被保護化合物22以及23的去保護作用 將1.6 mL MeOH (以降低混合物黏度）以及0.4 mL的哌 啶加至步驟（c)中的反應混合物中，以移除保護基。在室溫將 混合物攪拌60分鐘。以80 mL的溶劑A (見下述）加上〇.28 mL HOAc (以確保中和過多的哌啶）稀釋該反應混合物，以 產出包含去保護的分子式（I)產物的清澈溶液，去保護的分子 式（I)產物被指定為化合物5 (即，R7是異丁基）以及化合物 6 (即，R7是二級丁基）。 範例3:化合物5和6的分離以及純化 CM-瓊脂糖凝塍營if (CM-SepharoseCartridge、沾芈』備 將Fast Flow羧基甲基瓊脂糖（即，以商品名CM-瓊脂糖 凝膠販售)泥（100 mL樣本）以大約100 mL的20% EtOH稀 釋。將大約30 mL的稀釋泥倒入60 mL的聚丙稀固相萃取管 中’並讓泥沉澱。將頂部熔塊小心的放在適當的地方，逐出氣 泡，以獲得22 X 26.5 mm的最終填充床尺寸。將過多的2〇%

EtOH輕輕倒出，並以60 mL的溶劑A的重力流動而潤洗填 充物。 產物分離 將所稀釋的反應混合物施加於管匣中，並讓該反應混合物 藉由重力流入。以60 mL的溶劑A潤洗裝載產物的管匣，然 後以pH 5.0的〇.〇5 Μ醋酸銨24 mL潤洗。以32 mL的〇 27 145491.doc -36- 201035111 硫酸鈉pH 2.3緩衝液（儲存緩衝液A的1:2稀釋，見下述） 汽提該管E。收集4mL分液（#4到#11)，並以hplc分析， 以評估產物内容數據。結合分液7到10 (包含大約99%的化 合物5與化合物6之混合物）。 備型HPLC純化 在室溫下以10 mL/分鐘、每次100 mL，依序以溶析液A、 溶析液B、溶析液D以及溶析液C潤洗管柱。以兩次連續的 〇 注射將所結合的CM-瓊脂糖凝膠分液注射到該管柱，每次大約 8 mL’每次以5.0 mL/分鐘、50 mL的溶析液C在該管柱潤洗。 然後開始梯度’且所有的溶析在室溫下完成。在281nm (大約 lcm的流式細胞路徑長）監控管柱洗出液。當化合物6開始 洛析時，開始收集分液。收集7.5 mL分液，直到主峰的頂端， 接著收集3 mL分液。以分析型HPLC評估分液，並結合適當 的分液。分液8-10包含化合物6，以及分液14-29包含實質 上純的化合物5。 〇 產物除鹽以及洽凌敫燥 如下述製備除鹽管匣：2.0 g的EnviChrom-P苯乙烯/二乙 烯苯樹脂在20 mL的50%乙腈中製成泥狀，然後倒入2〇 mL 的聚丙烯管匣。將頂部熔塊放在適當位置，並排掉過多的5〇% 乙腈。對所有隨後的步驟使用重力流動，以24mL的67%乙 腈潤洗填充物，然後以24 mL的蒸餾水潤洗。結合製備型 HPLC分液14到29 ’並在低於35 °C的真空下移除乙腈。將 去溶劑的分液結合施加於該管匣，並以多次2 mL的蒸餾水、 145491.doc -37- 201035111 然後以4 mL增量的蒸餾水（一共16 mL)潤洗加入的樹脂。使 用48 mL的67%乙腈從樹脂脫去除鹽的產物。在真空下於35 。(：以下從被脫去的分液移除乙腈’並將去溶劑的產物溶液冷 冰乾燥，以獲得119 mg的化合物5，由分析型HPLC，化合 物5是純的。以相似的方式處理包含化合物6的製備型HPLC 分液，以獲得15 mg的化合物6，由分析型hplC，化合物 6也是純的。 溶劑 A:65%MeOH0.04M 醋酸銨/〇·〇2Μ 醋酸 pH5.0、 650 mL HPLC 等級 MeOH，40 mL 1.00M 醋酸銨/0.50M 醋 酸、pH 5.0 (1:10稀釋）以及蒸餾水至i.〇〇l。 儲存緩衝液A :大約總計0.54 Μ的硫酸鹽（為硫酸鈉/ 硫酸氫鹽>^12.3(1:1〇稀釋），55.38(3〇11^)濃硫酸，76.4§ (50mL) 50%NaOH (大約20Μ)以及蒸餾水至i.〇〇l。 製備型HPLC的條件 儀器：具有Radial-Pak壓縮單位的Waters Prep 4000幫 浦、Waters Delta-Pak C18 radial-pak 管匣（100A 孔，2.5 X 21 cm)、熱交換器移除的ABI757UV偵測器、l〇mL迴路注射 器以及Pharmacia分液收集器。 溶析液A : 100%異丙酮，溶析液b : 20%異丙酮 溶析液C : 15%乙腈〇.〇4M於硫酸鈉（ΡΗ2·3)中、150 mL乙腈，80mL儲存緩衝液a以及蒸餾水至l.〇〇L。 溶析液C : 15%乙腈〇.〇4M於硫酸鈉（pH2.3)中、150 mL乙腈，80mL儲存緩衝液a以及蒸餾水至i.〇〇l。

溶析液D : 30%乙腈〇.〇4M於硫酸鈉（pH 2.3 )、300 mL 145491.doc -38- 201035111 乙腈，80 mL儲存緩衝液A以及蒸館水至i皿。 溶析梯度：_^驗^ 細 〇 45 45.1 100 67 67 0 33 33 10.010.0 5.0* *備註：降低流速以符合分液收集器的限制。 ❹ 使用類似錄例1·3巾所描述的轉，從城的商業可得 異氰酸鹽製造出另外的化合物。 範例4 :分子式（ic)及㈣化學結構的說明 分子式（Ic)及（Ic')(指冑為化合物5)的化學結構經測定 為包括與1G-絲酸胜肽的N端2紅氨基丁酸鍵結的2•氣苯 基氨基曱醯，化合物5的C端殘基(蘇胺酸)經由2,4_二氨基丁 酸的（X-胺基侧鏈上的醯胺鍵而與分子鍵結，且該化合物包含 10個胺基Ssl，這10個胺基酸為6個2,4-二氨基丁酸的殘基、2 個蘇胺酸的殘基、白胺酸及苯丙胺酸各一個，該化合物具有平 均分子量為1216.82且實驗式為C54h86Ni7〇]3C卜 分子式(Ic〇所示的結構是基於從已知起始材料合成的方 法導出且通過HPLC和光譜測量確認。 使用紫外光-可見光光譜儀來測定化合物5的電子吸收。 在水中，測得一個最大的吸收波長，此最大吸收波長為236 nrn ’消光係數為10565 M cm 1。以Agilent 8543紫外光可見 光系統獲得化合物5的紫外光·•可見光光譜，光譜是以吸收模 式收集，所使用的光路徑為1 cm。在進行測量之前，化合物5 145491.doc -39- 201035111 以最終;辰度0.0735 mg/mL溶解於水中。從紫外光_可見光光譜 中，可觀察到在236 nm有一個最大波長，化合物5在236㈣ 計算出的消光係數為10565 IV^cnr1。 使用紅外線光#醤術來描繪化合物5分子中出現的官能基 的特性。製備化合物5 FTIR樣本並以KBr法進行測量。以 Perkin-EhnerWOO系列FTIR獲得化合物5的紅外線光譜，該 光譜在400 cm·1及4000 cm·1之間進行記錄。在紅外線光譜中 觀察到的主要波段，與醯胺、胺類、及羥基延伸關聯的主要波 段為3271.7 cm—1 ’由於非對稱和對稱的CH延伸(分別為芳族 〇 與脂肪族)的主要波段為3066.8和2929.6 cm·1，與醢胺I和π 鍵延伸關聯的主要波段為1652.1和1539.0 cm-1，以及最後為 與酒精性CO延伸關聯的1108.0 cm-i波段。 發現化合物5的精確質量為1216.6350 Da ([M+H]+,理論， 1216.6352 Da) ’化合物5的精確質量是利用飛行式質譜儀的混 合四極桿/時間的Micr〇mass Q_T上的正離子電麗法高解析質 譜進行測量，化合物5的MS/MS數據是利用飛行式質譜儀的 Sciex Q-Star/Pulsar混合四極桿/時間上的奈米喷灑游離法以正 〇 離子離子化模式進行記錄。關於MS/MS試驗，指定為 [M+2H]2+的m/z _.86離子被選出。在▲ 7幻5觀察到的 y-型離子與化合物5的環狀胜肽部分結構相符，在963 6 以及989.6的y_型離子與連接到環狀胜肽的兩個胺基酸殘基 的存在相符’在m/z 662.5, 561 4, 461 3,以及361 3的訊號則 與化合物5的環狀胜肽中的胺基酸序列相符，在m/z254 i的 極強訊號與化合物5的N端的 eic^NHcoNHOica^a^Niyco酰化肽性的存在相符， I4549I.doc -40- 201035111 諸如m/z 202.1, 302.2 and 101.1的其他訊號則支持了化合物5 的序列分配。此胺基酸序列資訊確認了化合物5是由10個胺 基酸殘基組成。 化合物5的胺基酸分析是由與AccQ螢光試劑(6-氨基啥淋 -N-羥基琥珀醯亞胺基氨基曱酸脂)結合的反相HPLC以進行酸

水解和衍生化來測定。衍生的胺基酸在250 nm激發並監控在 395 nm。化合物5包括10個胺基酸，胺基酸組成物(比例)綜 合如下：蘇胺酸（2.0); 2,4-二氨基丁酸（5.7);白胺酸（1.1); 以及苯丙胺酸（1.1)。發現化合物5中的2,4-二氨基丁酸殘基 的量為5.7殘基’略小於預期量(6殘基），這是因為尿素基團 的部分水解所致，此結果與得自MS/MS分析的數據一致。 以串聯式質譜儀(tandem mass spectroscopy)及 NMR(2D NOESY)確認的化合物5的胺基酸序列落於下列順序：2_氣笨 基 胺 曱

lDab-2Thr-3Dab-4Dab-5Dab-6Phe-7Leu-8Dab-9Dab-10Thr，其

中，4Dab與lOThr連結形成環狀胜肽。化合物5的胺基酸組 成物(比例)以胺基酸分析進行測定。化合物5的胺基酸組成的 立體化學藉自LCMS使肖Marfey試舰行測定。在酸性條件 下，經由水解將胜肽轉縣其絲酸組成，以斷fey試_ 每-個胺基_生化並以LC/MS分析。齡化合物5水解物 的胺基酸謂化學並與各自的衍生化的絲酸參考標準進行 比較。胺級立魏學_賴由_ TM摘LC的每一個衍 生化胺基_質麵m㈣咖來達成。化合物5 N-2- 氯 苯基胺 甲

145491.doc .41 · 201035111

-N2-L-(2,4)-Dab-L-Thr-N2-L-(2,4)-Dab-N2-(4-&)-L-(2,4)-Dab-N 2-L-(2,4)-Dab-D-Phe-L-Leu-N2-L-(2,4)-Dab-N2-L-(2,4)-Dab-L-

Thr(&)。1H、COSY、TOCSY以及NOESY數據主要被用來分 配1H峰’同時13C、13C DEPT、HSQC以及HMBC則被用 來分配13C數據並用於證實1H分配。與從MS和AAA獲得 的數據一致的NMR的結果證實了化合物5的結構。 於顧客NMR服務(Ayer, MA)的600 MHz儀器於5 °C取得 核磁共振譜。獲得化合物5參考標準批別CG-01-003的一維 譜及二維COSY、TOCSY (混合時間60 ms)、NOESY (混合時 間 150 ms)、HSQC、HMBC。該樣本溶解於 90% H20 與 1〇〇/0 D2〇成濃度58 mg/mL、pH 6.5的150 nM填酸納緩衝液中。 1H、COSY、TOCSY以及NOESY數據主要被用來分配 1H峰，同時13C、13C DEPT、HSQC以及HMBC則被用來 分配13C數據並用於證實1H分配。化合物5中殘基的序列鑑 定是通過二維NOESY譜分析來實施。化合物5顯示出一個殘 基的骨幹NH到前面的殘基側鏈的NOE峰，這致能了殘基的 序列鑑定。表2A給出了化合物5的骨幹和側鏈的質子和碳化 學移位。 145491.doc -42- 201035111 表2A. 在5°C化合物5的1Η和13C峰分配11 殘基 NH c=o all (aC) βΗ 其他 尾部* 8.06 157.03 6.98(127.53). 6.87(126.72), 7.15(128.95). 6.90(128.28), C-NH 133.31，C-Cl 不可見 Dabl 7.11 173.67 ΐ 4.11 (51.24) 1.78,1.93 (28.38) γΗ 2.83 (35.82) Thr2 8.15 171.86 4.0| (58.63) 3.93 (66.30) γΗ 0.90 (18.20) Dab3 8.43 172.29 4.15 (50.51) 1.86,1.75 (27.60) γΗ 2.72 (35.80) Dab4 8_:，1 172.50 3.90 (50.80) 1.55(29.61) γΗ 3.05,2.80 (35.60). δΝΗ 7.44 Dab5 8.28 171.43 4.19 (49.76) 1.78.1.68 (29.03) γΗ 2.63.2.56 (35.43) Phc6 8.62 173.17 4.12 (55.98) 2.62,2.84 (35.60) 7.19(125.65), 7.15 (128.95), 7.05(128.28),6.87(126.14), YC 134.42 I.cu7 8.42 174.52 3.81 (50.80) 1.10. 0.95 (38.15) γΗ 0.03 (22.22). δΗΙ 0.32 (21.80)，δίΠ 0.23 (19.40) Dab8 7.90 170.96 3.99 (51.37) 1.95 (27.40) yH 2.87,2.78 (35.43) Dah9 8.31 173.01 3.89 (52.43) 1.61,1.88 (27.94) γΗ 2.74 (35.81) ThrlO 7.89 171.23 3.92 (65.43) 3.80 (59.18) γΗ 0.87 (18.51) 尾部：2-氣苯基胺甲醖

化合物5具有表2B中所列的物理特性。

表2B

外觀： 白色至灰白色非晶型固體 氣味ο ' 無味 ' β P ， pH: 5_9，於 5mg/mL水中 熔化/沸騰範圍： 260 °c 一— ，， v -, 解離常數（pKa): 8.17, 8.62. 9.01.9.41 以及9.71 旋光度： -107。 ， 、、、， 、 、、· - 溶解性曲線： 在水中>300g/L 145491.doc -43- 201035111

範例5:微生物學研究 為了評估分子式（I)化合物（即，指定為5和6的化合物） 的效力與光譜’進行研究，將一組455革蘭氏陰性菌株放在 一起’其包含多重抗藥性臨床分離株，該臨床分離株選自各種 監測計劃。表3A列出了包含在本研究中的菌株以及化合物 5、化合物6與黏菌素（多黏菌素E，縮寫為PME)的活性。 對黏菌素及/或碳青黴烯（carbapenem)及/或寬光譜頭孢菌素 (broad spectrum cephalosporin)具有獲得抗性的菌株被預選 擇，並包含在所有被評估的生物組中。 根據臨床與實驗室標準機構（CLSI) M7-A7 (2006)的培 養液i置稀釋法進行MIC測試。除非有表明，否則MIC值是 以每毫升微克的單位來提供。 測試的前一天，藉由晝在營養、非選性、具有5%溶解羊 血（TSAB)的胰酶大豆瓊脂上，在35_37〇c培養18_24小時 以分離出單獨的菌落。 碰觸3-5菌落於在Η mL管中的3 mL陽離子調整的 MuellerHim〇nBroth (caMHB)中而製備出培養物（根據製造 商的說明錢備出CaMHB)。在加人MIC分析法的密度調= 之m，培養物在37 °C 200 rpm下生長大約4小時。 。 測量生長培養物的〇D6GG，並在caMHB中將其調敫至每 14549l.doc • 44 - 201035111 mL大約ι〇5的菌落形成單位（CFu/mL)，以用於圓培養 (大約 0D_ 0.001)。 稀釋後的培養物用於在培養液微量稀釋分析法中的每個 孔（孔）中接種50 L (最終體積每孔1〇〇 μ1 ;以兩倍稀釋 製備化合物）。 將培養盤於37、200rpm的振盪培養 16-20小時。 測定每個孔的0D6。。。當QD_〉al時定義為生長。不產 生可見濁度的最低濃度（0〇6⑽<01)定義為MIC。 表合物（化f物5和6)的MICW微克/毫升) 菌種 #菌株 化合物6 化合物5 / «V J-VJ.1V^9 PMB ol儆兄/宅3 PME P. aeruginosa 100 8 2 2 2 Acinetobacter spp 81 2 4 2 4 S. maltophilia 25 16 >16 8 16 E. coli 80 4 2 2 2* K. pneumonia 81 4 4 2 4* Citrobacter spp. 20 1 0.5 1 0.5* Enterobacter 20 >16 >16 >64 >64* *有些測試菌株為多重抗藥性 如表3A所示，化合物5顯示了相似於黏菌素（PME)的 試管内活性以及光譜。其對於抗黏菌素敏感、包括多重抗藥性 囷株的P 以及如* spp.是有活性的。化合 物 5 對於對抗 R co!i、K. pneumonia、Citrobacter spp.也是有 活性的’且對於對抗spp.分離株具有一些活性。 化合物5顯示了對抗生物的有限活性，該生物本質上對黏菌 素具有抗性’例如ϋ引σ朵陽性的w/raM/s以及51. 145491.doc -45- 201035111 marcescans 0 如表3A所示’化合物6也顯示了相似於黏菌素（PME) 以及化合物5的試管内活性以及光譜。例如，化合物6對於 對抗對黏菌素敏感的Spp·(包括多重抗藥性菌 株）是有活性的’且對於對抗五.⑺//、尺.pwewmow/a spp.也具有活性。化合物6也具有類似於化合物5對抗 £«〖m^flcterspp.分離株的活性。然而，化合物6在對抗對黏 菌素敏感的尸的活性上顯示了大約降低4倍，而 化合物5展現了相似於黏菌素的活性。因此，由於至少此原 〇 因’儘管與化合物6具有相似的結構相似度，化合物5顯示 了令人驚言牙與未預料到的特性。 表3B··分子式（I)化合物（化合物3和的^%“微克/毫升） 種類 化合物3 化合物5 Acinetobacter baumannii 1570 8 4 E. coli 1699 4 2 Ρ· aeruginosa 44 4 1 A. pneumonia 21 4 2 如表3B所示，相較於化合物3，化合物5顯示優越的試 管内抗菌活性以及光譜。例如’相較於化合物3，化合物5對 於對抗 Acinetobacter baumannii，E. coli，R aeruginosa，和 K. /we腫ο細[的品系更具有活性，基於相較於化合物3的優越抗 囷特性’選擇化合物5以用於細胞培養的細胞毒性。 I?胞培養的細胞基枓公析 對具有比得上或是優於p〇lymyxin β1 (pMB)抗菌活性的 試管内抗菌特性分子式(II)化合物執行細胞培養的細胞毒性分 145491.doc -46- 201035111 析，如表四所示’出乎意料之外地，相較於結構上類似的2_ 氯苯基類似物(化合物5，EC5〇 >1000) ’ 3-氯笨基類似物(化合 物4)表現出較南的毒性(EC% 691)，同時，對於對抗尸 aerwgko似’這兩個化合物表現出可互相比較且可與p〇lymyxin B相比的抗菌活性(例如，表四中的MIC值2微克/毫升。 第1天：每個燒瓶接種lxlO5至2xl〇5個細胞（細胞株： LLC-PK1 ) ’包含4mL/T25燒瓶的培養基DMEM-F12 (50/50) ’培養基以l〇%FBS (胎牛血清）補充。然後在37°C、 〇 5% C02、80% RH下培養細胞。 第4天：檢查細胞培養，以測定80%細胞密度 (confluency)。為了將80%細胞密度的燒瓶以胰蛋白酶作用， 每個燒瓶製備了 4 mL的DMEM-F12-10%FBS培養基。從燒 瓶吸出培養基，並加入5 mL的Versene以潤洗燒瓶。吸出 Versene，並加入2 mL的三倍快速溶液（胰蛋白酶溶液）。在 室溫下將細胞培養5分鐘’並經由顯微鏡檢查細胞的變圓與 它們的分開。為了加快反應，可將燒瓶在37 X培養3分鐘。 〇 加入4 mL的培養基（DMEM_F12-10%FBS)以終止反應。使 用5mL吸量管’將完成的反應物吸上吸下，以確保細胞與燒 瓶以及其他細胞彼此適當地分離。使用血球計數玻片計數細胞 數。將100 pL的細胞懸浮液轉移至試管中，並加入100 μ]1的 台酚藍。96孔的接種原是每孔1〇,〇〇〇個細胞。對於一個96孔 盤’ 26.3pLxll〇孔=共2893 pL。將2.9mL的細胞懸浮液 與8.1 mL的培養基DMEM-F12-10o/〇FBS混合，並使用多爪 分注器將100 μί分配至每個孔中。然後在37 °C將該培養盤 培養24小時。 145491.doc -47- 201035111 第5天：將DMEM-F12 (沒有FBS)培養基分配至具有 該測试物的官中’以達到1〇〇〇 mg/mL、500 mg/mL、250 mg/mL 以及125 mg/mL的最終濃度。從培養箱中拿出該96孔盤，並 使用多爪分注器而將培養基從每個孔中移除。將80 pL序列稀 釋的分子式（I)化合物加至每個孔中。以三重覆完成每組濃 度。將培養基以及陽性控制組加至每個培養盤中，培養盤在 37 °C培養24小時。 第6天：從培養箱中拿出培養盤，從每個孔中移除培養 基，並加入100 pL的新鮮培養基DMEM-F12 (這相當於一 次潤洗’且可用PBS代替該培養基）。然後移除培養基，並加 入80 pL的細胞溶解溶液。5分鐘之後，將80 無菌過濾的 高品質水加至每個孔中。使用白色或黑色的96孔反應培養 盤’將 80 μί，25χ 稀釋的 ΑΤΡ 混合試劑（Sigma Bioluminescent Somatic Cell Assay Kit [cat # FL-ASC])加至一欄内。加入稀釋 的ATP標準品80 pL (使用的稀釋：250、500、1000、2000 以及4000)，並立刻在微量盤式轄射偵測儀（t0pC0unt)中以2 秒的讀取時間讀取該培養盤。在另一個白色或黑色的96孔反 應培養盤中，加入80 pL的25x稀釋ATP混合試劑（培養盤 A)，並將80 μί的溶解水溶液轉移至培養盤A的每一攔中。 然後立刻在微量盤式輻射偵測儀中以2秒的讀取時間讀取該 培養盤。對下個連續的培養盤重覆此過程，並計算某些分子式 Ϊ化合物的EC50，該EC5〇提供於表3中。 表3 :某些分子式（I)化合物的MIC以及EC5〇資料 145491.doc -48- 201035111 化合 物 No. Ri r2 r3 MIC P. aeruginosa (mg/ml) EC50大鼠 近端腎小管 細胞 (mg/ml) 1 -C(0)NH-苯基 -ch2ch(ch3)2 H 1 >1000 2 -C(0)NH-苯基 -CH(CH3)CH2CH3 H 2 >1000 3 -C(0)NH-4-氣苯基 -ch2ch(ch3)2 H 4 4 -C(0)NH-3-氣苯基 -CH2CH(CH3)2 H 2 691 5 -C(0)NH-2-氣苯基 -CH2CH(CH3)2 H 2 >1000 6 -C(0)NH-2-氯苯基 -CH(CH3)CH2CH3 H 1 >1000 7 -C(0)NH-2,6-二氣苯基 -CH2CH(CH3)2 H 2 >1000 8 -C(0)NH-2,6-二氣苯基 -CH(CH3)CH2CH3 H 2 9 -C(0)NH-4-溴苯基 -ch2ch(ch3)2 H 2 502 10 -C(0)NH-4-氟苯基 -ch2ch(ch3)2 H 2 >1000 11 -C(0)NH-五氟苯基 -ch2ch(ch3)2 H 2 738 12 -C(0)NH-2-氣苯甲基 -ch2ch(ch3)2 H 13 -C(0)NH-2-氣苯甲基 -CH(CH3)CH2CH3 H 2 14 -C(0)NH-2,4~ 二氯苯甲基 -CH2CH(CH3)2 H 1 269 15 -C(0)NH-2,4-二氯苯曱基 -CH(CH3)CH2CH3 H 1 267 16 -C(0)NH-2-氣-4-硝基苯基 -CH2CH(CH3)2 H 4 >1000 17 -C(0)NH-2-氣硝基苯基 -CH(CH3)CH2CH3 H PMB NA -ch2ch(ch3)2 H 2 318 如表4所示，化合物5顯示了可與多黏菌素B相比之對 145491.doc -49- 201035111 抗/> aerwg/mwa的功效。此外，當與具有EC50為318的多黏 菌素B相比時，化合物5大體上是毒性較低的（在大鼠近端 腎小管細胞中具有大於1000的EC% )。相信化合物5獨特 的，儘管其具有與其他鹵代或硝基苯基衍生物的結構相似度。 範例6:藥物學研究 在8個模型中以5個不同的革蘭氏陰性病原體測試了化合 物5的功效（小鼠模型以及大鼠模型）。在8個這些模型的其 中7個中證明了功效。在其中一個模型中，其中化合物5沒 有顯示出功效，多黏菌素化合物也沒有產生功效。在剩下的7 個模型中，化合物5顯示了可與多黏菌素B以及黏菌素相 比的功效。來自兩個代表性動物模型的資料在下面示出。 ik合物5在小鼠中對抗肺部感染的活艚内功妫 藉由aerw皮>?〇^#44的鼻腔内接種，將正常免疫力或嗜 中性白血球減少的小鼠誘導出感染。化合物5、多黏菌素b、 黏菌素、亞胺培南（imipenem)或環丙沙星（ciprofloxacin) 在感染後的1以及6小時被皮下地給藥。在感染後24小時， 小鼠被人道地安樂死，將小鼠的肺移除、均質化、序列稀釋， 並塗佈於瓊脂培養盤上，以估量帶菌量。評估化合物5、多黏 菌素B、黏菌素、環丙沙星以及亞胺培南相較於以水治療的 控制組小鼠對於減少來自肺之帶菌量的能力。

P. aeruginosa M4 氣 K. pneumoniae #2Y 於 37 °C、陽離子 調整的 Mueller Hinton Broth( caMHB )( catalog# B12322; Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)中生長。根據臨床與實驗室標準機構 [CLSI ’前臨床實驗室標準國家委員會（NCCLS)，Wayne，PAJ 14549I.doc •50- 201035111 對於培養液微量稀釋法的指導方針進行MIC測試。 將所有的測試化合物溶解於無菌水中，以皮下注射 給藥。將2NHC1小量地加至該溶液以溶解環丙沙星，直到所 有的粉末完全溶解。在水中製備測試化合物的序列稀釋。 在使用沿#44做為感染生物的肺感染模型中， 藉由在4天前以腹腔内（ip)給藥150mg/kg環磷醯胺，接著 在刖1天’以ip給藥第一劑的100 mg/kg環石粦酸胺，而使CD-1 小鼠的嗜中性白血球減少。在第〇天，將無菌食鹽水中分別相 富於1x10或2.5x10 CFU的稀釋的、對數期生長的尸 從⑼沿#44培養物，藉由鼻内途徑而接種於小鼠中。在接 種之前，以60mg/kg的戊巴比妥ip.將小鼠麻醉，接種體中的 實際細菌濃度由可實行的計數決定，並塗佈在胰蛋白大豆瓊脂 培養盤上的稀釋物而確認。在37。〇：培養16小時後，決定細 菌的CFU數。 對測試化合物的每個劑量以及媒液（水）控制組使用5隻 小鼠的組。在感染後1小時，每組接受測試化合物或媒液的 sc注射，然後在感染後6小時接受注射，共2劑。每個研究 中，每個測試化合物有3至5個劑量組。 在最後一次注射的18小時後，以（χ)2窒息而將小鼠安樂 死。將肺臟無菌地移除、在4mL的無菌蒸鶴水中均質化，並 將稀釋物塗盤於膜蛋白大豆瓊脂培養盤上，以定量細菌CFU。 在37 °C培養16小時後，測定肺中的細菌CFU數（每毫升均 質物的CFU)。 以幾何平均log10CFU/mL士標準差表示結果。備測的限制 為每mL肺均質物1〇 CFU。當在瓊脂上沒有偵測到CFU時， 145491.doc 51 201035111 視為肺是無菌的。比較在被感染以及治療的小鼠與以水治療的 控制組動物中所測量到的l〇glG CFU/mL數，來評估測試化合 物的功效。化合物5的功效也與多黏菌素B、黏菌素、環丙 沙星以及亞胺培南-西司他丁（cilastatin)之類的陽性對照抗生 素進行比較。 對每個分離物產生測試化合物的劑量反應曲線。在 MiCrosoftExcel中產生迴歸線，並用以計算劑量，當與水治療 組相比時，劑量預期會得到降低3 log1G的細菌數[ED_31_ (mg/kg, sc, BID)] 〇 根據CLSI (前NCCLS)對於培養液微量稀釋法的指導 方針進行MIC》則試。該化合物對抗p敝_續#44的MIC 示於表5中。 145491.doc -52- 201035111

表5 ·某些化&物對抗尸⑽#44以及尺. #21 的 MIC —^— 化合物 MIC(mg/ml)對抗 P. aeruginosa #44 5 1-2 黏菌素 -----— 2-4 多黏菌素B 1-2 亞胺培南-西司他丁 ^ 1-2 環丙沙星 0.25 __________

如表6中所示，化合物5造成感染小鼠的肺中尸 aeruginosa #44細菌數的藏少。 體円功效 小鼠/ 化合物5的每日總多 細菌1分離物 (mg/kg/天） 啥中性白血球減少的 8 16 P. aeruginosa 24 #44 32 40 肺均質物的 CFU/mL Logi〇 減少 1.0 1.7 2.4 4.0 4.0 在這些研究中，化合物5對抗小鼠中户#44肺 感染的功效有利地與多黏菌素B、黏菌素、環丙沙星或亞胺 培南•西司他丁比較（見表7)。 145491.doc -53- 201035111 表7 :化合物5以及對照抗生素對於嗜中性白血球減少的小 鼠中#44肺感染的功效 藥物 劑量 (mg/kg, BID)a

LogioCFU/mL 肺 均質物土 SD ED-3i〇gi〇 (mg/kg, BID) 化合物 4.0 8.0 12.0 16.0 20.0 5,49 ± 1.27 4.86± 1.18 4.13 ±1.46 2.56 ±0.34 2.51 ±0.70 9.05'

多黏菌素B 4.0 8.0 12.0 16.0 20.0 6.48 ± 1.59 5.73 士 1.92 3.47 ± 1.16 2.88 ± 1.07 2.71 ± 1.09 12.97 亞胺培南-西 司他丁 2.5 3.33 ±0.21 2.34 水 水 6.53 ±0.35 在感染後1和6小時的給_劑量。在第收成肺。 對於此批(#CG-01-002)的效力，劑量已被校正為=711咖 中lxfo^f的實際細菌湲度是每隻小鼠接種的0.1 mL無菌食鹽水 化合物5對抗小鼠中大腿感染的活艚内叫辞 藉由肌_接種至每隻小鼠的左大_而在嗜中性白血 球減少的小鼠中誘導感染。在感染後丨小時和6小時皮下地 ，藥化合物5或對照藥、多黏菌素B、關素或亞胺培南。 最後-次治療的18小時後，小鼠被人道地安樂死；將感 賴移除、均質化、序列稀釋，並塗盤於瓊脂上。然後藉由菌 落估量帶料。與財治療的控敝小鼠相比，評估化^ 145491.doc -54- 201035111 5、多黏菌素B、黏菌素以及亞胺培南減低感染大腿中的帶菌 量。 1 #1570 在陽離子調整的 Mueller Hinton

Broth ( caMHB ) ( catalog# B12322; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)中在37 °C生長。根據臨床與實驗室標準機構[CLSI，前 臨床實驗室標準國家委員會（NCCLS)，Wayne，PA]對於培養 液微量稀釋法的指導方針進行MIC測試。 將所有的測試化合物溶解於無菌水中，以用於皮下（sc) 注射的給藥。在無菌水中製備測試化合物序列稀釋。 藉由在4天前以ip給藥150 mg/kg環填醯胺，接著在前1 天以ip給藥第二劑的1〇〇 mg/kg環磷醯胺，使小鼠的嗜中性 白血球減少。在第〇天，將在0.2 mL的無菌食鹽水中分別相

當於lxl〇7或5xl〇4 CFU的稀釋的、對數期生長的A #1570培養物注射至清醒小鼠的左大腿中。接種體中的實際細 菌濃度是由可實行的計數決定，由塗佈在胰蛋白大豆瓊脂培養 盤上的稀釋而確認。在37。(：培養16小時後，測定細菌的CFU 數。 對測試化合物的每個劑量以及媒液使用5隻小鼠的組。在 感染後1小時，每組接受測試化合物或媒液的sc注射，然後 在感柒後6小時接受注射，共2劑。每個研究中，每個測試 化合物有3至5個劑量組。在最後一次注射的18小時後，以 %至息而將小鼠安樂死。將左大腿無菌地移除，在4以匕的 蒸顧水中均質化，並將轉物塗盤於胰蛋自大豆瓊脂培養盤 上’，定量細菌CFU。在37。(：培養16小時後，測定大腿中 的細菌CFU數（每毫料質物的CFU)。 145491.doc -55- 201035111 以幾何平均logl0 CFU/mL±標準差表示結果。偵測的限制 為母mL大腿均f物1〇 CFU。當在遭脂上沒有侧到cfu時， 視為大腿是無菌的。比較被雜的该與以媒液⑷治療的 控制、.且動物}所測量到的丨心〔彻眺數來評估測試化合 ，的功效。化合物5的功效也與多_素B、賴素、環丙 沙星以及亞胺培南-西司他丁之類的陽性對照抗生素進行比 較。 .對每個分離物產生測試化合物的劑量反應曲線。使用 Microsoft Excel產生迴歸線，並用以計算每天給藥2次的劑量 (BID) ’當與水治療控制組相比時，劑量預期會得到細菌數 降低 3 log1()[ED_3lQgl() (mg/kg，sc，BID)；]。 根據CLSI (前NCCLS)對於培養液微量稀釋法的指導 方針進行MIC測试。化合物對抗乂 &⑽μ%的MIC 示於表8中。

表8 :化合物對抗1 #1570的MIC 化合物 MIC (mg/ml)對抗 A. baumannii #\5Ί0 5 2-4 黏菌素 2 多黏菌素B 1-2 亞胺培南-西司他丁 1-2 如表9所示’化合物5產生由A 0awmflw?z7#1570所誘導 的感染大腿肌肉細菌數的劑量依賴減少。 145491.doc -56· 201035111 表9:嗜中性白血球減少的小鼠中化合物5對抗 #1570大腿感染的活體内功效 細菌分離物（研究 化合物5每日總劑量 大腿均質物CFU/mL 曰期） (mg/kg/天） 中的LoglO減少 A. baumannii 4.0 0.8 #1570 8.0 1.1 (10/30/07) 16.0 2.7 24.0 3.8 在這些研究，與多黏菌素B、黏菌素或亞胺培南_西司他 〇 丁對抗小鼠中的乂 MwwawwY#1570大腿感染相較，化合物5 較為有利。 表10 :化合物5以及對照抗生素對嗜中性白血球減少的小氣 〇 a b 中的A· bawmmnii #1570大腿感染的功效··研究2 藥物 劑量 Log 丨 〇 CFU/mL 大 腿均質物±SD ED.31ogl0 (mg/kg, (mg/kg, BID)3 BID) 化合物5 2.0 6.93 ± 0.56 4.0 6.64 ±0.55 6.4b 8.0 5.06 ±0.80 12.0 3.97 ±0.34 多黏菌素B 2.0 6·04± U0 4.0 4.94 ± 1.03 4.8 8.0 4.07 ±0.41 12.0 4.19 ±0.59 亞胺培南-西 2.0 7.41 ±0.15 4.0 6.83 ± 0.52 9.6 司他丁 8.0 4.99 ± 1.06 12.0 4.22 ± 0.40 水 水 7.75 ± 0.35 — 在感染後1和6小時的給藥劑量。在第24小時收成大腿。 對於此批(#CG-01-002)的效力，劑量已被校正為=711 pg/mg。 -57- 145491.doc 201035111 ό、、* Si 細菌漢度是10/30/07實施的此研究中在名售λΙ、 昧w主射的0.2mL的無菌食鹽水中5.3x1〇6cfuk。犯町此研九甲在母隻小 範例7:相較於多黏菌素B,化合物5降低的腎毒性 在石蟹獼猴中進行多黏菌素B以及化合物5之間比較性 的7天重覆劑量安全研究。 如下表所示，25隻雌性、未經處理的（naiVe)的石蟹獮 猴被分配至6種劑量組中的其中一組。動物為2 52吆至3 77蛣 且為4.2至5.7歲。在環境適應的_，將長献腿靜脈内 的導管植人所有_物巾，以允許連續的輸注。該大腿靜脈導 管以皮下路徑而經由肩胛間的準備切口穿出。動物穿著夾克， 夾克連接至可彎曲的不銹鋼栓繩，不銹鋼栓繩保護導管。

猴子每天以控制物（0.9%注射用氣化鈉，usp)、25000 IU/kg 化合物 5、37500 IU/kg 化合物 5 或 375〇〇 m/kg pMB (Alpharma，批號Ai4ll〇79)而按劑量給藥2或3次。每次 給藥是經由被標靶的30-分鐘靜脈内的輸注而提供。此實驗的 研究設計示於表11中。 表11 .石蟹獼猴中多黏菌素B以及化合物5之間的安全評估 研究設計 145491.doc -58- 201035111

Group 測試物 劑量頻 率 每曰總 劑量等 級 (iu/kg) 劑量/ 給藥 (mg/kg) 劑量/ 給藥(IU/kg) 動物數 (雌性） 1 控制物 T1D 0 0 0 5 2 化合物 ΒΠ) 75000 3.2 37500 5 5 3 1 化合物 TTD 1 75000 2.2 25000 4 5 4 化合物 HD 112500 3.2 37500 3 .. 5 5 多黏菌 BID 75000 3.8 37500 5 素B 6 多黏菌 TTD 112500 3.8 37500 3 ---- 素B 評估下述參數：控制組以及高劑量組的每日臨床觀察以及 疋性食物消耗、體重（第一次按劑量給藥前以及驗屍時）、尿 ❸ 液刀析、血液學、凝血、血清化學、毒物動力學粗略病理學、 器B重篁以及腎臟與注射處的組織病理學、以及肝臟與坐骨神 經的組織病理學。在7天的研究期間然後在最終評估動物。 在以核的藥物多黏囷素B的此比較性的7-天猴子研究 中，當在相等的抗菌活性劑量（？5,000至112,500IU/kg)下比 較該兩種藥物，明顯地觀察到化合物5具有較不嚴重的腎毒 性，雖然多黏菌素B有明顯較高的〇_以及AUC值。 化合物5以及多黏菌素B之間腎毒性的差異概述於第2 圖中。第2圖是不出為累積分數之所測量腎毒性資料的散佈 145491.doc -59· 201035111 圖，累積分數基於小管退化、小管新生、小管擴張以及小管管 也（cast)。母個種類基於每個發現的嚴重度而以〇到4的基 礎計分。 初步測試物相關改變發生在腎臟中，且以化合物5治療 的動物所發現的嚴重度低於以相同劑量的多黏菌素B治療的 動物。在接受75,000 IU/kg/天的動物中，化合物5的發現限於 非常少的組織變化（極少的腎小管退化、新生、管形或急性腎 t皮細胞壞疽）。當與所提到75,000 IU/kg劑量的效果相比 柃，在112,500 IU/kg/天的化合物5劑量中，組織的腎變化包 0 各皮貝與髓質小管數量增加以及嚴重度，該皮質與髓質小管包 3壞死或退化的細胞。相反地，75,〇〇〇 nj/kg/天的多黏菌素b 給藥導致在腎小管組織學上類似於來自接受112,5〇〇 IU/kg/天 的化合物5(觀察到增加的退化小管數）的動物上的發現。這 些發現伴隨著血清肌酸酐以及BUN濃度的輕微增加。在接受 112,500 IU/kg/天的多黏菌素b的動物中，組織發現的範圍進 展至牽涉包含壞死或退化細胞的大量皮質以及一些髓質小 管。這些發現與給予112,500 IU/kg/天的多黏菌素的動物中之 G 血清中肌酸酐以及血中尿素氮濃度的提高有關。 對於化合物5以及多黏菌素b的比較，腎毒性以基於小 管退化、小管新生、小管擴張以及小管管形的累積分數來測 量。每個種類基於每次發現的嚴重度而以〇到4的基礎計分， 且相應的猴子示於第2圖中。 在石蟹獼猴中的重覆劑量研究中，以臨床相關的劑量 (即’石蟹獼猴中S 75,〇〇〇 iu/kg)觀察，化合物5展示了一 致的以及劑量依賴的藥物動力學的數據。在較高劑量等級時， 145491.doc •60- 201035111 曝露（就）以及尖峰蝴農度（c_)中微高於劑 Ο

ί釋董12是明顯的。在這些較高的劑量下，清除的減低可 、。物5的非線性糸統性曝露。該清除（cl)比肝臟 ^低，其暗示化合物5對於肝萃取有極少的可紐。在所 有種類中的分佈量高於血量，暗示了化合物5的血管外分佈。 —當相較於多_素B的藥物動力學特徵時，化合物5的 樂物動力學㈣徵展現了不同，顯著地減低血清蛋白質的結 並增加轉的清除以及量的分佈，其可導致減低毒性的可 月b性:並經由較多的組織分佈而潛在地增強抗生素的功效。以 多黏菌素B治料致比在朗活性鮮化劑量下缝合物5 治療所觀察到還高2.5倍的系統性曝露（AUC)。在第丨天， 在，個化合物的37,500 IU/kg可比較活性劑量下，多黏菌素B 的最南血製濃度（C·)比化合物5濃度高了大約2倍。在 相等功效劑量等級下，當與化合物5相比時，在相同活性劑 里的多黏菌素B下，較高的系統性曝露可導致反效果的較高 可能性（腎毒性，以及可能的過敏性反應）。在第1天，多黏 菌素B的系統性清除是低於所觀察到化合物5的系統性清除 的2至3倍。此外，在多黏菌素b給藥之後所觀察到的分 佈量低於化合物5給藥之後所觀察到的大約2倍。在分佈量 上的不同暗示’相較於多黏菌素B，化合物5具有增加的組 織分佈’其可導致對細菌感染之有效治療的較高組織量（例如 在肺中）。化合物5以及多黏菌素B之間在清除以及分佈量 中的差異可能部分地與化合物5相較於多黏菌素B (〜56%) 有較低的蛋白質結合（〜30%)有關。 在化合物5的7天重覆IV給藥後，在雌性石蟹獼猴中的 145491.doc -61 - 201035111 腎臟發現在6 mg/kg BID、6 mg/kg QD以及9 mg/kg QD的劑 量上是明顯的’且在3以及4 5 mg/kg BID嚴重程度較輕。組 織病理學變化的特徵在於極少至輕微的小管上皮細胞退化/壞 疽與新生、腎小管的擴張、亞急性間質性發炎以及細胞性/顆 性性與蛋白性管形。在6 mg/kg BID、6 mg/kg qD劑量與展 現最大腎效應的9 mg/kg QD劑量在血中尿素氮（BUN)以及 血清中肌酸酐中有相關的增加。當以相等的抗微生物劑量給藥 時，在藉由靜脈内輸注的7天重覆給藥化合物5之後，猴子 中的腎發現顯著地比所銷售的對照多黏菌素B低。 雖然已不出並描述了一些具體實施例，可對其進行各種修 飾以及取代而不背離本發_精神以及範圍。例如，並不意指 此後所提及的申請專利範·理解為？於其文字語言，也^意 指說明書的補性具體實施例被解賴巾請專概^中 此’應了解的是，本發明已在本文中只以示_方式描述’且 這樣的描述不構賴申請專利範__限制。 145491.doc • 62 - 201035111

【圖式簡單說明】 第1圖是有用於製備分子式（I)化合物以及其他化合物 的合成方案。 第2圖是猴子中全腎組織病理學分數的散佈圖。 145491.doc -63·

Claims (1)

1. 201035111 七、申請專利範圍： 1. 一種醫藥組合物，包含具有下般子以抗菌化合物

   或其藥學上可接受的鹽類。 2.如申请專利範圍第1項所述的組合物，更包含一藥學上可接 受的載體，其中該抗菌化合物為（S)_4_氨基 -N-((2S，3R)-l_((S)-4-氨基-1-氧代 +((38,63,93, 128，15民188,218)-6,9，18-三(2-氨基乙基)-15-苯甲基-3-((11)-1-經基乙基）-12-異丁基-2,5,8，11，14，17,20-庚氧代

   -1，4,7，10，13，16，19-庚唑環三氣沙_21-基氨基）丁烷-2-基氨 基)-3-羥基-1-氧代丁烷_2_基)_2_(3-(2-氯苯紛)脲基)丁醯胺。 3.如申請專利範圍第2項所述的組合物，其中該組合物適用於 靜脈内給藥。 4.如申請專利範圍第1項所述的組合物，其中該抗菌化合物具 有下列分子式： 145491.doc 201035111 Cl

   Η H N N li^ O .

   o J^OH

   5. —種治療細菌感染的方法，該方法包括將一醫療有效量的一 醫藥組合物給藥至需要該醫藥組合物的一個體，該醫藥組合 物包含一分子式化合物：

   6. 如申請專利範圍第5項所述的方法’其中該個體是一人類、 一動物、一細胞培養或一植物。 7. 如申請專利範圍第5項所述的方法，更包括測定該細菌感染 中細菌的類型的步驟。 8. 如申請專利範圍第7項所述的方法，其中該細菌感染中的該 細菌的類型包含一革蘭氏陰性細菌。 145491.doc -2- 201035111 9. 如申請專利範圍第7項所述的方法，其中該細菌感染中的該 細菌的類型包含一敏感的或多重抗藥性的細菌。 10. 如申請專利範圍第7項所述的方法，其中該細菌感染中的該 細菌的類型包含 Pseudomonas aerugmosa、Acineiobacter spp、Stenotmphomonas maltophilia、Escherichia coli、 Klebsiella pneumoniae、Citrobacter spp、Enterobacter 良見 含該細菌至少其中之一的一混合物。

   11. 如申請專利範圍第7項所述的方法，其中該細菌感染中的該 細菌的類堡包含 Pseudomonas aeruginosa、Acinetobacter spp、Stenotrophomonas maltophilia、Escherichia coli、 Klebsiella pneumoniae、Citrobacter spp、Enterobacter、良 包含該細菌至少其中之一的一混合物。 12.如申請專利範圍第5項所述的方法，其中該抗菌化合物具有

   13. —種用以製備抗菌化合物的方法，該方法包括： 145491.doc 201035111 (a) 以一氨基保護基處理一多黏菌素B，以形成一被保護的 化合物，該多黏菌素B包括至少一酸性取代基； (b) 以一去醯化劑處理該被保護的化合物，以形成至少一去 醯化的被保護化合物； (c) 以一異氰酸鹽處理該至少一去醯化的被保護化合物，以 形成至少一醯化的被保護化合物；以及 (d)以一有機鹼處理該至少一醯化的被保護化合物，以形成 具有下列分子式的該抗菌化合物；

   14·如申請專利範圍第13項所述的方法，其中 a. s亥去醯化劑由產生；以及 b. 該保護基是2-磺酸基-9-苐基曱氧羰基。 15. —種使用具有下列分子式的化合物或其藥學上可接受的鹽 類製備一抗菌醫藥組合物的用途： '45491.doc 201035111 Ο

   Ο 16.如申請專利範圍第15項所述的用途，其中該醫藥組合物適 用於靜脈内給藥。 17. 如申請專利範圍第16項所述的用途，其中該藥學上可接受 的鹽類為一硫酸鹽。 18. 如申請專利範圍第17項所述的用途，其中該化合物具有下 列分子式：

   19. 一種具有下列分子式的化合物： 145491.doc 201035111

   或其鹽類。 20.如申請專利範圍第19項所述的化合物，其中該化合物為 (S)-4-氨基-N-((2S,3R)-l-((S)-4-氨基-1-氧代-1-((3S,6S,9S, 12S,15R,18S,21S)-6,9,18-三（2-氨基乙基）-15-苯曱基 -3-((R)-l-羥基乙基)-12-異丁基-2,5,8,11,14,17,20-庚氧代 -1,4,7,10,13,16,19-庚唑環三氣沙-21-基氨基）丁烷-2-基氨 基)-3-羥基-1-氧代丁烷-2-基)-2-(3-(2-氯苯酚)脲基）丁醯胺。 145491.doc -6-