201026220 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於真姬離褶傘（玉簟離褶傘（^〇尸知" s/zz'mej·/))之菌床栽培方法。 本申請案係基於2008年11月28日提出申請之日本專利申 請案第2008-304138號，其全部内容皆以引用方式併入本 文中。 【先前技術】 真姬離褶傘係在白橡木林或白橡木與日本赤松之混交林 的土地上大約在十月中旬長的傘菌。在日本真姬離褶傘被 認為係食用菇中品質最高的傘菌。特定而言，其與松茸 (matsutake mushroom, TV/c/zo/oma mai5MiaA：e)—起，有「聞 貝1J 松茸，食則真姬益（matsutake mushroom for flavor， shimeji mushroom for taste)」之說法。最近幾年，已經設 想使用藉由將鋸屑與營養源（例如米糠、麥麩及諸如此類） 混合製得之培養基人工栽培食用菇之菌床栽培方法，該等 食用兹係（例如）金針蒜（enokitake mushroom， velutipes)、ψ ^ (hiratake mushroom, Pleurotus ostreatus) ' 滑兹（nameko mushroom，ΡΛο/ίοία nameAro)、鴻喜益（buna-shimeji mushroom，marworew·?)、舞兹（maitake mushroom，及諸如此類。由此，無論季節 如何均可全年穩定地收穫傘菌。由於真姬離褶傘亦係極為 美味的傘菌，因此期望建立其特有的人工栽培方法。然 而’真姬離褶傘係菌根真菌，而上述松茸及諸如此類係木 144919.doc 201026220 腐真菌。因此，業内認為難以達成真姬離褶傘之人工菌床 栽培方法。 然而’滋賀縣（Shiga Prefecture)森林研究中心（F〇rest Research Center)的太田博士（Dr. Ohta)已經首次成功實施 真姬離褶傘之人工菌床栽培。真姬離褶傘使用小麥或諸如 此類之菌床栽培方法揭示於專利文獻i (JP_a_〇7_U5844) 中’且在使用小麥或諸如此類之栽培用培養基上生成真姬 離褶傘子實體之測試揭示於非專利文獻丨（曰本真菌學會雜 諸（Journal of The Mycological Society of Japan)，第 39 卷，第 13-20 頁，1998)中。 此外，專利文獻2 (JP-A-06-153695)揭示菌根真菌使用 培養基之菌絲體栽培方法，該培養基使用泥炭作為基質材 料並將澱粉及諸如此類添加於其中。同一發明者已在非專 利文獻2(曰本真菌學會雜誌（J〇urnai ^ The
Society of japan)，第 35卷，第 192 195 頁，199句中報導關 於藉由培養基生成真姬離褶傘子實體之測試，該培養基使 用泥厌作為基質材料並將澱粉及諸如此類添加於其中。 然而，由於專利文獻！（JP_a_〇7_U5844)之方法中所用 培養基中使㈣小麥或諸如此類花費多而使得培養基的費 用高。此外，專利文獻2 (JP-A-06-153695)之發明者的方 法由於所生成子實體之產量較低而未達到工業生產的程 度。 最近幾年，已經揭示許多真姬離褶傘之栽培方法，其目 的係工業栽培真姬離褶傘。專利文獻3 (JP-A-2000- 144919.doc 201026220 106752)揭示用於菌床上栽培真姬離褶傘之培養基，其含 有黍屬（户⑽/⑶m)亞科植株，且揭示使用該培養基栽培真 姬離褶傘之方法。此外，專利文獻4 (Jp_A_2〇〇2_2479n) 揭示真姬離褶傘之菌床栽培方法，其中其子實體係藉由以 下生成.製備至少含玉米粉及闊葉樹鑛屑之混合培養基， 在潮濕條件下將真姬離褶傘之菌絲體接種於該混合培養基 上及將其在3〇°C或以下進行培養。 專利文獻5 (”-八-2005-27585)揭示真姬離褶傘之菌床栽 培方法，其中將粉碎的牡蠣殼與培養基混合，在潮濕條件 下接種真姬離褶傘之菌絲體並進行培養，可生成子實體。 此外’將培養基之pH調節至不超過7之範圍。 專利文獻6 (JP-A-2007-54044)揭示真姬離褶傘之菌床栽 培方法，其中混合培養基係藉由將少量小麥或諸如此類及/ 或稻米或諸如此類與含玉米及鋸屑之培養基混合物製得。 在潮濕條件下在該混合培養基上接種真姬離褶傘並培養之 後生成子實體。 在專利文獻1 (JP-A-07-1 15844)中，藉由將真姬離褶傘 之菌株於2 3 °C下培養7 0天且然後將溫度降至丨5 〇c來試驗是 否形成子實體之原基。此外，藉由用泥炭覆蓋培養基表面 、曰加子實體之形成比率。此外，在非專利文獻丨（日本真菌 學會雜誌（Journal 〇f The Mycological Society of Japan)， 第39卷，第13-20頁，1998)中，當傘菌菌絲體在22。〇下在 培養步驟期間已經延伸遍及整個培養基時藉由將泥炭添加 於培養基上至厚度為1 cm生成子實體。之後將培養基培養 144919.doc 201026220 2週且然後在培養完成之後轉移至設定為15〇c之生成室。 在非專利文獻2(日本真菌學會雜誌（j〇urnal The
Mycological Society of Japan)，第 35 卷，第 192-195 頁， 1994)中’將真姬離褶傘之菌株接種於培養基上且然後於 23C下培養並使其成熟，且然後在設定為16。匚之生成室中 實把生成作業’在之後第13天與第15天之間觀察到形成子 實體之原基。 ❶在專利文獻3 (JP-A-2000-106752)中，揭示瓶栽培方 法，其包含培養基製備、填充瓶子、滅菌、接種、培養、 萌發、生長及收穫之相應步驟，其中培養之後在萌發步驟 期間形成子實體之原基。此外，在各實例中，藉由用赤玉 土（Akadama soil)覆蓋來實施萌發步驟。 在專利文獻4 (JP-A-20〇2-247917)之實例中，將真姬離 褶傘之菌株在23它下培養60天且藉由用鹿沼土（Kanuma s〇U)覆蓋培養基之頂面進一步培養7天。此外，然後藉由 • 轉移至15°C之生成室中以加速子實體之生成。 在專利文獻5 (JP-A-2005-27585)之實例中，將真姬離褶 傘之菌株在23t下培養70天且然後轉移至設定為15<t之生 成室中。此外，當已形成小的子實體時去除蓋子，且當子 貫體生長至其菌傘已打開之階段時進行收穫。 在專利文獻6 (JP-A-2〇〇7-54〇44)之實例中，將真姬離褶 傘之菌株在23t下培養55天並利用鹿沼土（Kanuma s〇il)覆 蓋培養基之頂面進一步培養10天。然後藉由轉移至15〇c乏 生成室中以加速子實體之生成。 144919.doc 201026220 [專利文獻 1] Jp-A-07-115844 [專利文獻 2] JP-A-06-153695 [專利文獻 3] JP-A-2000-106752 [專利文獻 4] JP-A-2002-247917 [專利文獻 5] JP-A-2005-27585 [專利文獻 6] JP-A-2007-54044 [非專利文獻1]曰本真菌學會雜誌、（Journal of The
MycologicalSocietyofJapan)，第 39卷，第 13-20 頁，1998 [非專利文獻2]曰本真菌學會雜誌（journal 〇f The
Mycol〇gical Society of Japan)，第 35卷，第 192-195 頁， 1994 【發明内容】 本發明者已根據類似於上述專利文獻3中所揭示之技術 開始真姬離褶傘之商業栽培。然而，由於在實施大規模商 業栽培時需要穩定生產，因此該等技術需要進一步改良。 因此，鑒於上述情況，本發明目標中之一者係提供允許 穩定、大規模商業栽培真姬離褶傘之菌床栽培方法。 通常’業内認為在真姬離褶傘之菌床栽培方法，在從菌 絲體培養至子實體形成之時期期間需要保持良好的透氣性 ^非吉專利文獻1}。本發明者已實施栽培研究㈣驗錄因素 =姬離槽傘之菌床栽培之效應’且已深入地試驗了該等 用情模商業栽培之影響。結果，已驚舒地發現與習 間：非二二真_褶伞之菌床栽培方法的萌發步驟期 田义透乳性時而是當增加C〇2濃度時使兹蕾（幼 I44919.doc 201026220 蕾）之形成比率變高。此外，亦已發現，當在子實體之生 長步驟期間增加c〇2濃度時，子實體之產量增加。此外， 在過去難以控制的菌柄部分的空隙減少或甚至消失即使 當生長成真姬離褶傘特有之大子實體時亦如此。此外，可 抑制其菌傘打開，由此達成適於以高品質栽培大子實體之 方法。 因此，本發明之實施例係關於真姬離褶傘之菌床栽培方 φ 法其包3以下中之至少一者：在高c〇2濃度之環境條件 下實施一部分或整個萌發步驟及在高eh濃度之環境條件 下貫施一部分或整個子實體生長步驟。 因此，本發明之實施例涉及真姬離褶傘之菌床栽培方 法，其中萌發步驟期間之高c〇2濃度為2,500 ppm或以上、 較佳5,000 ppm或以上、更佳在5，_至35，_ 之範圍 内、進一步更佳在10,000-20,000 ppm之範圍内。本發明之 實施例涉及真姬離褶傘之菌床栽培方法，其中子實體生長 Φ 步驟期間之南C〇2濃度為5,000 PPm或以上、較佳在5 000 至35,〇〇〇咖之範圍内、更佳在1〇,〇〇〇2〇〇〇〇咖之範圍 内。此外，真姬離褶傘之該菌床栽培方法的萌發步驟可在 以上環境條件下實施至少1天、較佳1至10天、更佳3至6 天。此外，子實體生長步驟可在以上環境條件下實施至少 2天、較佳2至5天。此外，可在該等環境條件下實施萌發 或子實體生長步驟中之僅一者，或可在該等環境條件下實 施萌發與子實體生長步驟二者。 根.據本發明之實施例’提供藉由大規模商f栽培穩定生 144919.doc 201026220 產真姬離稽傘之真姬離褶傘菌床栽培方法。藉由使用本發 明，可穩定獲得具有良好形狀的真姬離褶傘之大子實體。 【實施方式j 下文詳細說明本發明之說明性實施例。 如本發明說明書中戶斤 晉甲所用術、「真姬離褶傘」係指在分 類學上歸為玉蕈離褶傘之傘菌。 本發明中所用真姬離褶傘之菌株並無料限制且可為可 適用於人工菌床栽培方法之任何菌株，其可為市售菌株或 從野生型子實體藉由使用諸如組織分離、選擇、雜交、細 胞融。it傳重組或諸如此類等方法繁殖獲得之菌株。舉 例而5 ’刊舉以下料作為適於栽培者：玉蕈離稽伞U 01-27 (FERM BP_10960)、玉蕈離褶傘La 〇i 2〇 (FERMBp_ 10959)、玉蕈離褶傘La 〇1_37 (FERM p_i7456)、玉輩離褶 傘La (H-45 (FERM P_17457)、玉蕈離褶伞La 〇1_ P-17458及其突變菌株。 對上述菌株並無限制且其可為可用於菌床栽培之任何菌 根據本發明說明性實施例之真姬離褶傘菌床栽培方法並 無特定限制且可為可在高c〇2濃度之環境條件下實施之2 何菌床栽培方法，纟因此可使用瓶栽培、袋栽培 : 及諸如此類。 ° 下文以瓶栽培作為實例闡述本發明說明性實施例之真姬 離褶傘菌床栽培方法，其中該方法包含以下步驟：製備讲 養基，填充於瓶子中，滅菌，接種，培養，（必要時可包 144919.doc -10 - 201026220 含真菌刮除（fungal scraping)，此係藉由刮除培養基之菌種 培養部分及培養基之表面來加速子實體原基形成的步 驟），形成原基，萌發（幼蕾之形成及生長），必要時可包含 截取部分（幼蕾）的分離及移植，從幼蕾生長為成熟子實 體，收穫成熟子實體，及諸如此類。其次，該等說明性步 驟係例示性闡述，但本發明之說明性實施例並不限於此例 示性描述之内容。 0 培養基之製備J係指稱量菌床栽培中所用的相應基質 材料並將其混合並添加水以將水分調節至適於真姬離褶傘 菌床栽培之潮濕條件的步驟。用於在真姬離褶傘菌床上栽 培之培養基（culture medium，亦稱為medium)並無限制且 可為可用於栽培中之任何材料，但玉米與鋸屑之組合較適 宜。關於鋸屑，可使用源自闊葉樹或針葉樹之鋸屑，且較 佳地’源自針葉樹之鋸屑，例如源自雪松…如，^抑㈣ 之鋸屑可作為例子。本發明說明書中所用之術語玉米並無 φ #定限制且可為含玉米種子之任何類型的玉米且例如， 斤4的玉米種子及乾燥、粉碎、輥軋或加熱並輥軋種子產 品可作為例子。 闡述在熱軋玉米與源自雪松（cedar，心以)之鋸屑作為 實例之情況下玉米與源自針葉樹之鑛屬的混合比。玉米與 原自針葉樹之鑛屬的混合比可為任何比率，只要在該比率 下可栽培真姬離褶傘即可。從實現高產量之角度而言，熱 軋玉米含量之下限以菌床栽培用培養基的乾重比計係40% 或更多、較佳50〇/〇或更多、更佳6〇%或更多。當熱軋玉米 144919.doc 201026220 含量之下限低於4〇%時，所得真姬離褶伞之產量將顯著下 降此係所不期望的。此外’由於熱軋玉米之水吸收性 低，當其在菌床栽培用培養基中之含量太高時，菌床栽培 用培養基的水分保持能力將降低且水留在培養瓶之底部部 分，此有時可導致菌絲體繁殖不佳。因此，熱軋玉米含量 之上限以菌床栽培用培養基的乾重比計為8〇%或以下、較 佳75%或以下、更佳70%或以下。 此外，亦闡述在熱軋玉米及雪松抑，eedar)之情況 下菌床栽培用培養基的水含量。根據熟悉此項技術者之常❹ 識，期望將菌床栽培用培養基的水含量調節至水不會留在 培養瓶底部部分之程度。水含量並無特定限制，但為例如 68重置％或以下、較佳66重量％或以下。然而，當水含量 超過64重量％時，培養基中之氣隙減少，有時因此造成菌 、’·糸體繁殖不佳’而使得在—些情況下所獲得子實體之產量 及品質降低。因此，更期望將水含量調節至M重量％或以 下。就此而言，當水含量太低時，由於培養基較乾及諸如 此類的影響，出現差的菌絲體繁殖及子實體之畸形或差的© 生成。換言之，較佳將水含量調節至5〇重量％或以上、更 佳55重置％或以上。水含量可視情況藉由考量水分經調節 培養基之狀況來設定。 填充於瓶子中」係將菌床栽培用培養基填充於瓶子巾-之㈣。作為例證，此係將通常用於瓶栽培之彻至2,3〇〇 容量的耐熱廣口培養瓶在塵力下用所製得菌床栽培用培 養土填充之步驟。舉例而言，在如容量瓶子之情況 144919.doc •12· 201026220 下’添加550至900 g、較佳600至850 g、更佳65〇至75〇 ^ 的所製得菌床栽培用培養基。此外，在壓力填充的菌床栽 培用培養基中鑽一或多個孔直徑大約丨至3 cm的孔洞（亦稱 為二/同），並將瓶子用塞子塞住。每一個瓶子孔洞的數量 可視情況根據瓶口的尺寸進行設定，但（例如）藉由在壓力 下填充的菌床栽培用培養基表面區域的中心部分中鑽一個 孔直徑1.5至2.0 cm的孔洞、且圍繞該中心孔洞鑽四個孔直 鲁 徑1 cm之孔洞可更適合實施真姬離權傘之培養。 「滅菌」可為消滅培養基中所有微生物之步驟。此在藉 由蒸氣分級壓力滅菌之情況下通常在98至i〇(Tc下實施4至 12小時’或在高壓滅菌之情況下於ι〇1至125它、較佳 118C下實施30至90分鐘。在本發明中在一些情況下以此 方式產生之培養基稱為栽培用培養基。 「接種」係在培養基滅菌後冷卻之後將菌種培養物種植 於其中之步驟。通常，使用藉由在液體培養基中培養真姬 • 離褶傘之菌絲體所製得之液體菌種培養物作為菌種培養 物。儘管用於生產液體菌種培養物之培養基並無特定限 制，但PGY液體培養基（其含有葡萄糖、蛋白鰊及酵母提 取物作為主要組份且補充有KH2P〇4、MgS〇4/7H2〇及諸如 此類）或1/2 PGY液體培養基、GY培養基（其含有葡萄糖及 酵母提取物作為主要組份）、1/2 GY培養基及諸如此類可 作為例子。可使用藉由將真姬離褶傘菌絲體接種於該液體 培養基中並例如於25。(：下培養10至15天所獲得之製備物作 為液體菌種培養物。液體菌種培養物之培養可使用燒瓶或 144919.doc 13 201026220 罐發酵器來實施。當將液體菌種培養物進行培養以實施大 規模栽培時，從可縮短天數同時另外獲得大體積之觀點來 說，罐發酵器適宜。儘管對於將菌種培養物接種於栽培用 培養基上所用液體菌種培養物之菌種培養物含量並無特定 限制，但以0.1至10 g/1 '較佳1至7 g/1、尤其佳2至5层”之 乾菌種培養物含量作為實例。而且，舉例而言，每一個 1，1〇〇 ml容量的廣口瓶大約5至3〇 mi之菌種培養物之接種 物體積可作為實例。此外，亦可使用習知固體菌種培養 物。舉例而言，可使用藉由將菌床栽培用培養基於25<t下 培養60至150天實現菌絲體繁殖所獲得之製備物作為固體 菌種培養物，該菌床栽培用培養基已經藉由上述步驟所獲 得之液體菌種培養物接種。舉例而言，每一個i，丨〇〇 ml容 量的廣口瓶可無菌接種約15 g此種固體菌株培養物。 「培養」係培養經菌種培養物接種之培養基的步驟，其 中涉及伸長、延伸於整個培養基中並使菌絲體成熟。通 常，在20至25°C之溫度下且在50至8〇%之濕度下菌絲體延 伸遍及整個經接種菌床栽培用培養基，並進一步使其成 熟。就此而言，可省略成熟步驟。培養步驟可視情況端視 培養基之體積來設定，且在使用LWO…容量的瓶子之情 況下，通常實施80至120天、較佳約1〇〇天。培養步驟可分 為預培養步驟及後培養步驟，且菌絲體旺盛伸長之後培養 步驟可在稍微較低溫度下進行管理。在此情況下，75至85 天元成預培養步驟’且25至35天完成後培養步驟。 「形成原基」係形成真姬離褶傘子實體之原基的步驟。 144919.doc -14 - 201026220 培養步驟完成之後，將培養混合物轉移至室中處於心 22°C、較佳約2〇t、濕度為6〇至嶋且照度為1，刪勒克斯 或以下之環境下’且藉由去除瓶蓋實施子實體原基之形 -成。形成原基之步驟需要1〇至2〇天。此外，子實體之原美 彳在上述後培養步驟期間（例如）藉由實施2()勒克斯_小時二 以上積分照度之光轄照在培養基之表面(栽培用培養基上 部部分之表面區域）上形成。 ❹ 「萌發」係從子實體之原基形成㈣（幼蕾：在自子實 體原基所分化的原基頂部形成灰白真菌菌伞的狀況）且遇 必要時加速益蕾（幼蕾）之生長的步驟。萌發步驟通常在Μ 至贼之間、較佳約饥下、在8〇%或更多、較佳在超過 1嶋之高度潮濕條件下且在ls_勒克斯之照度下實施5至 15天。由於在萌發步驟期間因潮濕而易於產生露滴，因此 菌床表面可用穿孔塑膠板、波紋板或諸如此類覆蓋，或可 藉由將培養叙倒置來實施培養以防止弄濕。此外，為加速 參㉔蕾之生長’遇必要時可使用適當覆土材料用土壤覆蓋菌 床表面。 下文中所闡述的「截取部分」仙欲用於㈣由萌發步 驟所獲得之幼蕾移植於g床栽培用培養基上以形 實體之作業中之分離幼蕾。當期望 “、、子 乃至展侍大子貫體及形狀一 致之子實體時，實施截取部分之分離㈣及截取部分之移 植步驟。 「截取部分之分離」係分離由萌發步驟所生長之子實體 的步驟。截取部分之分離可藉由根據栽培品種選擇最適宜 144919.doc 201026220 方法來實施。舉例而言，可手動或用自動撿拾器從菌床上 收集可容易地分離的幼蕾且當幼蕾難以分離時，可使用可 選工具（例如到刀、廚刀、抹刀或諸如此類）分離並收集合 意的幼蕾。 「截取部分的移植」係將藉由截取部分之分離步驟所獲 得之截取部分移植於培養基之可選位置上以生長子實體之 步驟。 用以移植截取部分之培養基可為分離截取部分中所用的 培養基（分離截取部分之後的培養基）或自該培養基單獨產❹ 生且傘菌菌絲體已延伸遍及整個培養基中之培養基，例如 培養步驟期間之培養基或萌發步驟期間之培養基。而且， 獲得成熟子實體之後可藉由將截取部分移植至該等培養基 中來重新使用該等培養基。可使用在菌絲體剛延伸遍及整 個培養基之後直至完全成熟之後期間的任何培養基作為培 養步驟期間之培養基，但較佳係在培養步驟之後經過7〇天 或X上更佳80至120天之培養混合物。另外，可使用在 剛開始萌發之後直至萌發完成之後期間的培養基中的任—〇 者作為讀發步驟期間的培養基。當欲用於移植之培養基上 已形成子實體之原基、幼蕾及諸如此類時，可在首先移除 =實體之該等原基、幼蕾及諸如此類之後將欲用作戴取部 · 刀之幼蕾移植至期望位置上。就此而言，可使用移除之幼 . 蕾作為用於移植之截取部分。 對移植方法並無特定限制，且可包括使所移植截取部分 生長並與菌床上之菌絲體融合之任何方法。而且，可將= 144919.doc • 16 · 201026220 取部分移植至培養基面上的可選位置上。舉例而言，可能 期望將其插入或裝入在培養步驟之前或在萌發步驟之前在 菌床上所形成之孔洞中（例如，接種孔洞、通風孔洞及諸 , #此類）。該等亦可插人在截取步驟之前新鑽的孔洞中。 ㈣孔洞之孔直徑可為能夠實現將截取部分插人之任何孔 直徑且因此並無特定限制，且該直徑通常可為2至別_、 較佳4至10 mm。當將一個截取部分（例如幼蕾）移植於培養 ❹基上的一個孔洞中並生長時，可產生具有良好形狀而不會 變成植株形狀之單獨的大尺寸子實體。就此而言，可將若 干幼蕾移植於-個孔洞中。在此情況下，各個子實體之基 部黏結並變成植株形狀，但由於黏結僅限於子實體基部之 小部分，因此其可容易地逐個分開，以獲得具有大尺寸及 好形狀之獨立成熟子實體，此類似於藉由將一個幼蕾移 植於-個孔洞中所獲得之子實體的情況。此外，可藉由將 欲用作截取部分之子實體的尺寸進行分類並將具有大約相 _ 5 的截取部分移植於培養基中並管理其栽培來獲得均 勻尺寸的成熟子實體。 ?尤此而5，當將截取部分（例如幼蕾）移植（例如插入）孔 β中夺期望以幼蕾直立且幼蕾之一部分接觸培養基之方 式插入。 從幼蕾生長成成熟子實體」係在除了照度通常改為 ’、，勒克斯或以下以外，幾乎在與萌發步驟相同之條件 、行至15天之步驟（本說明書中在一些情況下簡單地稱 為生長步驟）。由於在幼蕾生長成成熟子實體中幾乎不受 144919.doc •17- 201026220 露滴潤濕的影響’因此並不希望用穿孔塑膠板、波紋板或 諸如此類進行覆蓋。 在幼蕾至成熟子實體之生長步驟中，可在上述萌發步驟 之後，藉由去除除了培養基表面中心部分處之菇蕾（幼蕾） 以外的菇蕾、特定而言培養基表面邊緣（瓶子邊緣區域）之 益蕾來進行生長步驟，以在觀子的中心部分處穩定獲得植 株形狀（多重生長）成熟子實體。就此而言，當去除除了培 養基表面中心部分處之菇蕾（幼蕾）以外的菇蕾時，該等菇 蕾可沿瓶子邊緣區域以機械方式去除。藉由在該等處理之 後進行生長步驟，可有效生長成植株形狀成熟子實體。 此外，當上述萌發步驟或幼蕾至成熟子實體之生長步驟 的早期（直至第5天）再加上一個步驟（在該步驟期間在培養 基表面上形成菇蕾，選擇若干期望生長成成熟子實體之菇 蕾，並去除其他菇蕾）時，可獲得具有高市場價值的真姬 離褶伞之單獨生長的大尺寸子實體。就此而言’在選擇菇 蕾之步驟中，瓶子邊緣區域菇蕾之摘除可以機械方式進 打，且與此同時，遇必要時，培養基表面中心部分上所形 成之菇蕾亦可以機械方式摘除。藉由進一步摘除在該等處 理後不適於生長為子實體之菇蕾（幼蕾）並選擇剩餘幼蕾及 對其進行育種，可有效生長具有良好形狀之大尺寸真姬離 褶傘子實體。 本發明說明性實施例係藉由在高c〇2濃度之環境條件下 實施上述萌發步驟及/或生長步驟之一部分或所有部分來 達成。高c〇2濃度之環境條件係指c〇2濃度為2,5〇() 或 144919.doc 201026220 以上、較佳5,000 ppm或以上、更佳在5,〇〇〇至35〇〇〇 ppm 之範圍内、進一步更佳在10,000至20,〇〇〇 ρριη之範圍内的 環境條件。更特定而言，萌發步驟中之C〇2濃度為2,5〇〇 ppm或以上、較佳5,000 ppm或以上、進一步較佳在5,〇〇〇 至35,000 ppm之範圍内、且仍進一步較佳在1〇 〇〇〇至 20.000 ppm之範圍内。生長步驟中之c〇2濃度為5〇〇〇 ppm 或以上、較佳在5,000至35,000 ppm之範圍内、進一步較佳 在7,000至20,000 ppm之範圍内且仍進一步較佳在7 〇〇〇至 ❿ 8.000 PPm之範圍内。就此而言，上述高〇〇2濃度之環境條 件並不意味著恆定C〇2濃度之條件，而是包括c〇2濃度在 上述範圍内變化之條件。對調節c〇2濃度於高濃度之方法 並無特定限制且可為可將C〇2濃度保持在高濃度之任何方 法，且C〇2濃度可藉由控制實施萌發步驟及/或生長步驟之 地方（室）的通風來調節或該地方的c〇2濃度可使用源 (例如C〇2氣體或乾冰）及通風來調節。在萌發步驟中， 濃度可使用培養瓶蓋子調節。舉例而言，在培養步驟之後 且在進入萌發步驟之前’培養瓶蓋子之通氣部分可部分或 全部關閉或其可更換為具有低透氣性之蓋子。 就設定高C02濃度之環境條件之時期而言，萌發步驟可 在上述環境條件下實施萌發步驟中的至少α、較佳⑴0 =更=至6天。高co2濃度之時期可在萌發步驟開始時 開始。在尚C〇2濃度之環境條伴 兄條件下之明發步驟之後，萌發 步驟可在通常co2濃度（約J 0ί)Λ ^ 赞 s ^ ( ’000 _或以下）之環境條件下 丁至3天，y尤生長步驟中設定高c〇2濃度之環境 144919.doc •19- 201026220 條件之時期而言，其為生長步驟中的至少2天、較佳3至5 天。高C〇2濃度之時期可在生長步驟開始時開始。在高 C〇2濃度之環境條件下之生長步驟之後，成熟子實體之生 長可藉由在通常c〇2濃度（小於5,000 ppm)之環境條件下繼 續子實體之生長步驟來實施。 成熟子實體可藉由以上步驟獲得，且栽培之所有步驟可 藉由其收穫來完成。儘管已藉由瓶栽培方法闡述本發明， 但本發明可施用於任何真姬離褶傘之菌床栽培方法且並不 限於上述瓶栽培。 0 根據本發明說明書，濕度超過1〇〇%之高濕條件係指由 於在比餘和蒸氣量尚之潮濕下實施而使得水如同霧一樣漂 斤之條件。為以數字方式表示此一高度潮濕條件，使用
Saglnomiya Seisakush〇公司之裝置（商品名：η⑽w 100)用於量測。該裝置使用藉由加熱使空氣中之水分減少 並藉由濕度感測器量測且然後對因加熱所減少之部分進行 校正之方法。因此，數值與100%或以下之相對濕度一 致，但當其超過100%時，其變成其中空氣中所含之水含 © 量轉換成水蒸氣且由其與飽和水蒸氣量之比率表示的數 值。就此而言’就實施濕潤化之方法而言’可方便地使用 諸如超音波增滿器、蒸氣增濕器、喷霧增濕器或諸如此類 等之增濕器。 本發明之說明性實施例提供改良菇蕾（幼蕾）之形成比率 的真姬離稽傘菌床栽培方法。由於藉由本發明明顯改良幼 蕾之形成比率，故穩定產生真姬離褶傘使得商業栽培成為 144919.doc -20- 201026220 可月b。而且，由於幼蕾之形成比率經改良，穩定產生植株 形狀（多重生長）真姬離褶傘成為可能。在藉由將截取部分 之分離步驟與移植步驟的組合產生大尺寸真姬離褶傘之情 況下，穩定獲得大量優良截取部分成為可能。此外，在結 合菇蕾摘除步驟產生大尺寸真姬離褶傘之情況下，產生大 量菇蕾，此使得將菇蕾穩定保持在培養瓶中心部分（中心 部分係適於形成子實體之區域）的周圍成為可能，且在適 Φ 於生長大尺寸真姬離褶傘之培養基位置處變得明顯易於生 長及選擇優良兹蕾。因此’以改良產量穩定栽培真姬離摺 傘子實體變成可能。此外’由於成熟子實體菌傘之打開受 到本發明抑制，因此使得產生具有高市場價值形狀之真姬 離褶傘成為可能。 以下例示性實例用於進一步闡述本發明說明性實施例， 但本發明並不限於以下實例之範圍。 實例1 • 將玉蕈離褶傘La 〇1-27 (FERM BP-10960)之菌絲體接種 於100 ml PGY液體培養基（組成：葡萄糖2 〇% (w/v)、蛋白 脉 0.2% (W/V)、酵母提取物 〇 2% (w/v)、KH2p〇4 〇 〇5% (w/v)、MgS04.7H2〇 〇.〇5〇/0 (w/v))中，並在振盪（1〇〇 rpm) 的同時於25 C下培養7天。將2 ml培養混合物培養成2〇〇 ml 相同的培養基，並在振盪（100 rpm)的同時培養7天。此 外，將整個體積的培養混合物接種於裝填有16〇丨相同培養 基的200 1谷量罐發酵器（由K〇niatsukawa Seisakusho製造） 中並授拌培養6天（授拌速度：1〇〇 rpm，曝氣：^升化沁）， 144919.doc -21 - 201026220 由此製付液體菌種培養物。另一方面，礙碎的玉米（由 Iisaka Seibakusha製造）及針葉樹鋸屑（由 T〇m〇e Bussai^ 造）以2:1的乾重量比（碾碎的玉米：針葉樹鋸屑）混合並徹底 擾拌且藉由向其中添加水混合，所添加水的體積使得培養 基之最終水含量為62重量％。將混合物放入聚丙烯廣口瓶 (1,100 ml)(包括瓶子和蓋子在内總重量為8〇〇 g)中並在壓 力下裝填在壓力下裝填之材料表面之中心處鑽一個孔直 徑為2.0 cm的孔洞，在以壓力下裝填之材料表面之中心為 中心、直徑為4 cm的圓周上鑽四個各自孔直徑為i em且深 度為約10 cm的空洞且然後將培養瓶蓋上。將蓋好的培養 瓶於118C下咼壓滅菌30分鐘並自然冷卻至2〇它，製得菌 床栽培用培養基（固體培養基）。將約125 ml的上述液體菌 種培養物接種於此固體培養基上，將菌絲體於暗室中於溫 度為20°C且濕度為70至75%之條件下培養1〇5天（預培養8〇 天，後培養25天）且確認原基形成之後此步驟完成。 然後，將培養物分成一般方法（對照）組及高c〇2濃度萌 發步驟組，且每一組使用12個瓶子實施萌發。去除蓋子並 將瓶子倒置後，對照組之明發在萌發室中實施7天，在該 萌發室中溫度控制在16°c，且濕度為115至12〇%(如由x Humid Eye 1〇〇(由 Saginomiya Seisakush〇公司製造）所表 示）’且培養基表面上之照度為1〇〇勒克斯或以下（明暗間隔 為30分鐘）。另一方面，藉由在將栽培瓶蓋上的同時實施 萌發來將高C〇2濃度組設定為高c〇2濃度狀態。此測試組 中所用的蓋子係藉由在其中心位置鑽-個直徑6mm的通孔 144919.doc 22- 201026220 洞用於實施栽培瓶中co2濃度之量測並將其上側用乙烯膠 帶覆蓋來製備，且上述培養步驟完成之後將此蓋子替換為 所用的一般蓋子。在高co2濃度組中，萌發係在與對照組 ， 相同之萌發室中實施5天，此後將蓋子去除並將瓶子倒置 且然後將萌發進一步再實施2天。萌發室中之C02濃度係使 用VAISALA製造之C02計（類型：GMT 22〇系列）來實施且 高C02濃度組栽培瓶中之C02濃度係藉由將GASTEC製造之 • 檢測管（型號：No. 2L)插入通孔洞中來量測。對於藉由測 試管進行量測，每次均量測兩個栽培瓶中之co2濃度並使 用平均值作為量測值。每一萌發步驟期間之C02濃度係以 一天一次之頻率進行量測。C02濃度量測之結果展示於下 表1中。 [表1] 萌發天數 C〇2 濃度(ppm) 對照 南C〇2濃度組 第0天 1,040 28,500 第1天 900 11,000 第2天 850 10,050 第3天 750 12,500 第4天 820 16,500 第5天 840 19,000 平均 867 16,000 此後，使相應測試組之培養瓶恢復到正常位置並轉移至 生長室中，在該生長室中溫度控制在15 °C，且濕度為110 至 11 5%(如由 Humid Eye 100(由 Saginomiya Seisakusho公司 144919.doc -23- 201026220 製造）所表示之值），並使菇蕾在100勒克淅或、 (明暗間隔為30分鐘）下生長4天。之後，對每二以下之照度 養基表面上所形成之菇蕾（幼蕾）數量進行計數培養瓶之培 展示於下表2中。 。遠等結果 [表2] 瓶子編號 菇蕾(幼蕾)數量 對照 高C02濃度組 1 17 41 2 19 44 3 32 64 4 21 42 5 6 107 6 8 136 7 5 118 8 16 155 9 24 92 10 29 121 11 38 107 12 19 56 平均 20 90 如從表2中明顯看出，在對照組中菇蕾之平均數量為 2〇,而在高C〇2濃度組中益蕾之平均數量為9〇,此比對照 組高4.5倍。此外，高c〇2濃度组之兹蕾與對照組相比尺寸 均勻。 實例2 以與實例！相同之方式獲得完成培養步驟之培養混合 144919.doc -24- 201026220 物0 然後’將混合物轉移至萌發室中，在該萌發室中溫度控 制在16°C ’且濕度為115至120%(如由Humid Eye 100(由 • Saginomiya Seisakusho公司製造）所表示之值），並在50勒 .克斯或以下之照度（明暗間隔為3〇分鐘）下萌發7天。在此情 況下’藉由在不去除蓋子的情況下萌發〇、1、2、3、4、5 或6天且在去除蓋子並將瓶子倒置之後進一步繼續萌發7、 ❹ 6、5、4、3、2或1天來設定8個測試組（每一測試組丨2個瓶 子），完成萌發。萌發時期期間之c〇2濃度藉由實例】中所 討論之相同方法來量測。蓋子内之c〇2濃度在1〇〇〇〇至 25,000 Ppm之範圍内變化，且室内之平均c〇2濃度為1〇5() ppm。此後，使相應測試組之培養瓶恢復到正常位置並轉 移至生長室中’在該生長室中溫度控制在15t：，且濕度為 110至 115/。（如由 Humid Eye 100(由 Saginomiya Seisakusho 公司製造）所表示之值），並使菇蕾在1〇〇勒克斯或以下之照 # 度（明暗間隔為30分鐘）下生長2天。之後，對每一培養瓶之 培養基表面上所形成之兹蕾（幼蕾）數量進行計數並計算每 -測試組中蒜蕾之平均數量。結果示於下表3中。 [表3] 測試組 〜------- —平均數詈 蓋0天，倒置7天 ______ 64 蓋1天，倒置6天 _____87 蓋2天，倒置5天 ΊΑ 蓋3天，倒置4天 -—^_ 10ft --- 144919.doc -25- 201026220 蓋4天，倒置3天 113 蓋5天，倒置2天 119 蓋6天，倒置1天 117 根據以上結果，發現當在高c〇2濃度之環境條件下（其中 在萌發時期期間至少1天的c〇2濃度超過1〇 〇〇〇 ppm)實萌 發施時所獲得菇蕾之數量增加。 實例3 以與實例1相同之方式獲得完成培養步驟之培養混合 物。 然後，設定3個測試組進行萌發❹換言之，作為對照組 時，去除蓋子及將瓶子倒置之後，在萌發室中萌發7天， 在該萌發室中溫度控制在16。(：，且濕度為115至12〇%(如由
Humid Eye 1〇〇(由 Saginomiya Seisakusho公司製造）所表示 之值）且培養基表面上之照度為5 0勒克斯或以下（明暗間 隔為30分鐘）。其餘兩個測試組之設定中，一組在培養瓶 上加蓋（加蓋組），另一組用乙烯膠帶密封蓋子與培養瓶接 合區域的半圓部分（半密封組），並在與對照組相同之萌發 室中實施萌發。 萌發時期期間之C〇2濃度藉由與實例！中所討論之相同方 法量測。加蓋組之蓋子内平均c〇2濃度為2〇,〇〇〇 ppm。而 且，半密封組之蓋子内平均C〇2濃度為25 〇〇〇 ppm。此 外，至内平均C〇2濃度為i，〇〇〇 ppm。此後，去除蓋子並使 培養瓶恢復到正常位置，並轉移至生長室中，在該生長室 中溫度控制在15艺，且濕度為11〇至115%(如由Humid Eye 144919.doc -26- 201026220 100(由Saginomiya Seisakush〇公司製造）所表示之值），並 使菇蕾在100勒克斯或以下之照度（明暗間隔為3〇分鐘）下生 長2天，對每一培養瓶之培養基表面上所形成之菇蕾（幼蕾） , 數量進行計數，以計算每一測試組中每12個瓶子菇蕾之平 , 均數量。結果，當對照組之平均數量為60時，加蓋組之平 均數1為120且半密封組之平均數量為115，由此顯示，當 在高C〇2濃度環境下進行萌發時，菇蕾之數量會增加。 實例4 以與實例1相同之方式獲得完成培養步驟之培養混合 物。 然後，去除蓋子及將瓶子倒置之後，在萌發室中萌發7 天，在該萌發室中溫度控制在16t，且濕度為115至120% (如由 Humid Eye 100(由 Sagin〇miya Seisakush〇公司製造）所 表示之值）’且培養基表面上之照度為5〇勒克斯或以下（明 暗間隔為30分鐘）。藉由控制室之通風將萌發時期期間之 φ 平均 C〇2濃度調節至2,500 ppm、5,000 ppm及 7,0〇〇 ppm， 且汁算母一測試組每1 6個瓶子蒜蕾之平均數量。結果，兮 數量分別為45、68及92，由此揭示’當在高c〇2濃度環境 下實施萌發時菇蕾之數量增加。 實例5 以與實例1相同之方式獲得完成培養步驟之培養混合 物。 然後，去除母一培養混合物之蓋子及將瓶子倒置之後， 將瓶子轉移至萌發室中之後（在該萌發室中溫度控制在 1449I9.doc -27· 201026220 15°C，且濕度為 115 至 120°/"如由 Humid Eye 100(由 Saginomiya SeiSakush0&司製造）所表示之值），在i〇〇勒克 斯或以下之照度（明暗間隔為3〇分鐘）下萌發7天。此後，使 培養瓶恢復到正常位置並轉移至生長室中，在該生長室中 恤度控制在15 C ’且濕度為95至1〇5%(如由Humid Eye i 00(由saginomiya Seisakush〇公司製造）所表示之值），並 藉由使幼蕾在50至1()()勒克斯或以下之照度下生長2天獲得 用於截取部分之幼蕾。 此外’使用鑷子’將以上獲得之幼蕾作為截取部分逐個⑩ 地移植到制卩上所討論方法製備之另-固體培養基的4 個孔洞中（不包括培養基表面上之中心、）—直到培養步驟。 準備截取部分移植固體培養基之一種情形（16個瓶子）係8個 瓶子用實例1之高c〇2濃度組（測試組）之萌發中所用類似的 蓋子覆蓋，且其餘的8個瓶子未蓋上（對照組），使幼蕾在上 述生長室中在相同條件下生長，只是濕度設定為105至 120/〇 如由 Humid Eye 100(由 Saginomiya Seisakusho公司 製造）所表示之值。在測試組中，開始生長後第4天去除蓋 〇 子且第10天收穫子實體，在第10天收穫對照組的子實體， 並量測每一子實體之產量（g/瓶子）及空隙含量（％)。就此而 ‘ & ’生長室中之係C〇2濃度係使用Riken Keiki製造之C〇2 °十（類型· RI-85)來量測。測試組培養瓶中之C02濃度係使 用與實例1相同之方法來量測。而且，生長步驟期間C02濃 度之量測係以一天一次之頻率實施。結果，測試時期期間 至中之C〇2濃度為約小於5,000 ppm且培養瓶中之C02濃度 144919.doc 28 - 201026220 手均為约20,0〇〇 ρρπι。 結果，測試組中每一瓶子之平均產量從…增加 二且空隙含量(菌柄部分中生成空隙之子實體的 6/〇降至3%。此外，當拾杏益▲ ) *檢查菌傘打開（菌傘之邊緣不再捲 曲）之子實體比率時，在測試組中 2〇0/ T马3/° ’而在對照組中為 計且有在測試組中菌伞之打開明顯減少，因此使 獲侍具有優良形狀之子實體成為可能。 ❿ 根據本發明，提供—插结# :業栽培穩定產生真姬離褶傘。藉由使用該=== ==:r真姬離—= 場價值形狀==:制，產生具有高市 項參照其㈣施例闡述本發明，但熟習此 離本發::::。’可對其實施多… ❹ 144919.doc •29·