TW201011106A - Glucuronyl transferase and polynucleotide encoding the same - Google Patents

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201011106 , 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關葡萄糖醛酸轉移酵素及編碼該轉移酵素 之多核苷酸，以及含有上述多核苷酸之載體、轉形體等。 【先前技術】 類黃 _ (flavonoid)乃類苯基丙烧（phenyl propanoid) 系之植物二次代謝產物之總稱，其中之一之花青素苷 (anthocyanin)乃決定紅、撥至藍紫色等花色之主要色素。 ❹ 同樣屬於類黃酮之一之黃酮或黃酮醇（fl avonol)之糖苷 (glucoside)，其本身雖然呈現淡黃色，但藉由跟花青素苷 形成複合體而給予花色很大影響，所以被稱為輔色素 (copigment)。一般，由輔色素所造成之花色移向藍色波長 之轉移被稱為輔色作用（copigmentation)。 唇形目（Lamiales)玄參科金魚草（Antirrhinum majus) 之花瓣中蓄積有黃酮之一之芹菜素（apigenin)之7位-葡 萄糖苷酸（glucuronide)(亦稱為葡萄糖醛酸糖苷，或葡萄 翁 糖醛酸接合體），並被認為扮演輔色素之功能（參照文獻1 :

Asen，S.等人，Phytochemistry 11，2739-2741，1972)。 另外，菊目菊科矢車菊（Centaurea cyanus)之藍色花瓣之 色素乃形成金屬錯合物’該錯合物中也發現有黃酮7位-葡萄糖苦酸之存在（參照文獻2: Shiono, M.等人，Nature 436， 791-792， 2005)。 唇形目唇形科黃答屬黃枣（Scute 11 aria baica lens is) 之根中蓄積有被稱為黃答普（baicalin)之具有消炎作用之 320590 201011106 黃酮7位-葡萄糖苷酸，該根係以做為具有健胃功能之中藥 (黃芩）而被利用（參照文獻3:Gao, Z.等人，Biochemicaet

Biophysica Acta 1472，643-650，1999)。從黃芩之根令 精製出對於黃芩素（baicalein)之7位進行轉移葡萄糖醛 酉文之酵素之SbUBGAT(或稱Sb7GAT)(參照文獻4:Nagashima S.等人，Phytochemistry 53，533-538，2000)，對應於該 Sb7GAT之基因已收存在基因庫中（access;[〇n No. AB042277)，然而其功能尚未確認。另外，日常食用之唇形 β 科之紫蘇（Perilla frutescens)之葉片中，最近也發現蓄 積有多種之黃酮之7位-葡萄糖苷酸，並被期待其人體健康 上之功邊（參照文獻5.Yamazaki, M.等人，Phytochemistry 62， 987-988， 2003)。 雖然’上述黃酮7位-葡萄糖苷酸在花色及健康食品領 域中成為受注目重視之植物二次代謝產物，但是其生合成 酵素（例如葡萄糖醛酸轉移酵素）尚有很多未知部分。 •[文獻] 1. Asen, S. et al. Phytochemistry 11, 2739-2741. 1972 2. Shiono, M. et al. Nature 436, 791-792. 2005 3. Gao, Z. et al., Biochemica et Biophysica Acta 1472， 643-650. 1999 4. Nagashima S. et al., Phytochemistry 53, 533-538, 2000 5. Yamazaki, M. et al. Phytochemistry 62, 987-998. 4 320590 201011106 '2003 【發明内容】 在上述情況下，要求能鑑別出基質特異性廣大且新穎 之葡萄糖醛酸轉移酵素及編碼該轉移酵素之基因。 本發明係有鑑於上述狀況而創製者，提供如下文所示 之葡萄糖醛酸轉移酵素及編碼該轉移酵素之多核苷酸、以 及含有上述多核苷酸之載體及轉形體等。 (1) 一種多核苷酸，係如下列（a)至（f)項中任意一項所記 〇 載： (a) —種多核苷酸，其含有由序列號碼：7所示鹼基序 列中第1至第1362之鹼基序列所構成之多核苷 酸； (b) —種多核苷酸，其含有編碼蛋白質之多核苷酸， 該蛋白質具有序列號碼：8所示胺基酸序列； (c) 一種多核苷酸，其含有編碼蛋白質之多核苷酸， ^ 該蛋白質係由序列號碼：8所示胺基酸序列中有1 至15個胺基酸發生缺失、取代、插入及/或加成 之胺基酸序列所構成，且該蛋白質具有UDP-葡萄 糖醛酸轉移酵素活性； (d) —種多核苷酸，其含有編碼蛋白質之多核苷酸， 該蛋白質係具有相對於序列號碼：8所示胺基酸序 列而言具備80%以上之同質性（homology)之胺基 酸序列，且該蛋白質具有UDP-葡萄糖醛酸轉移酵 素活性； 320590 201011106 . (e) —種多核苷酸，其係含有：在嚴苛條件下跟由序 列號碼：7所示鹼基序列之第1至第1362之鹼基 序列成為互補性的鹼基序列所構成之多核苷酸進 行雜交，且編碼具有UDP-葡萄糖醛酸轉移酵素活 性之蛋白質的多核苷酸；或 (f) 一種多核苷酸，其係含有：在嚴苛條件下跟由編 碼以序列號碼：8所示胺基酸序列所構成的蛋白質 之多核苷酸之鹼基序列成為互補性之鹼基序列所 ❹ 構成的多核苷酸進行雜交，且編碼具有UDP-葡萄 糖醛酸轉移酵素活性之蛋白質的多核苷酸。 (2)如上述（1)項所記載之多核苷酸，其係如下列（g)至（j) 項中任意一項所記載： (g) —種多核苷酸，其含有編碼蛋白質之多核苷酸， 該蛋白質係由序列號碼：8所示胺基酸序列中有 10個以下之胺基酸發生缺失、取代、插入及/或加 _ 成之胺基酸序列所構成，且該蛋白質具有UDP-葡 萄糖醛酸轉移酵素活性； (h) —種多核苷酸，其含有編碼蛋白質之多核苷酸， 該蛋白質係具有相對於序列號碼：8所示胺基酸序 列而言具備90%以上之同質性之胺基酸序列，且該 蛋白質具有UDP-葡萄糖醛酸轉移酵素活性； (i) 一種多核苷酸，其係含有：在高度嚴苛條件下跟 由序列號碼：7所示鹼基序列之第1至第1362之 鹼基序列成為互補性的鹼基序列所構成之多核苷 6 320590 201011106 酸進行雜交，且編碼具有UDP-葡萄糖醛酸轉移酵 素活性之蛋白質的多核苷酸；或 (j) 一種多核苷酸，其係含有：在高度嚴苛條件下跟 由編碼以序列號碼：8所示胺基酸序列所構成的蛋 白質之多核苷酸之鹼基序列成為互補性之鹼基序 列所構成的多核苷酸進行雜交，且編碼具有UDP-葡萄糖醛酸轉移酵素活性之蛋白質的多核苷酸。 (3) 如上述（1)項所記載之多核普酸，其含有由序列號碼： ❹ 7所示鹼基序列之第1至第1362之鹼基序列所構成之 多核普酸。 (4) 如上述（1)項所記載之多核苷酸，其含有編碼蛋白質之 多核苷酸，該蛋白質係由序列號碼：8所示胺基酸序列 所構成。 (5) 如上述（1)至（3)項中任意一項所記載之多核苷酸，·其 係 DNA 〇 Λ (6) —種蛋白質，係經上述（1)至（5)項中任意一項所記載 響 之多核苷酸所編碼。 (7) —種載體，其含有上述（1)至（5)項中任意一項所記載 之多核苷酸。 (8) —種轉形體，係導入有上述（1)至（5)項中任意一項所 記載之多核苷酸。 (9) 一種轉形體，係導入有上述（7)項所記載之載體。 (10) —種上述（6)項之蛋白質之製造方法，其特徵係：使用 上述（8)或（9)項所記載之轉形體而製造上述（6)項之 7 320590 201011106 蛋白質。 (11)一種葡萄糖醛接合體之製造方法，其特徵係：以上述 (16)項所記載之蛋白質作為觸媒，由UDP-葡萄糖醛酸 及糖受體基質而生成葡萄糖醛酸接合體。 本發明之多核苷酸，例如藉由導入至轉形體而有用於 製造新穎之葡萄糖醛酸轉移酵素。本發明之較佳形態之葡 萄糖醛酸轉移酵素具有廣大之基質特異性，且具有將多種 糖受體基質予以葡萄糖醛酸化之活性。

[序列表非關鍵詞] 序列號瑪： 1 :合成DNA '序列號碼： 2 :合成DNA 序列號碼： 3 :合成DNA 序列號碼： 4 :合成DNA 序列號碼： •5 :合成DNA 序列號碼： 6 :合成DNA 序列號碼： 9 :合成DNA 序列號碼： 10 :合成DM 序列號碼： 11 :合成DNA 序列號碼： 12 :合成DNA 序列號碼： 13 :合成DNA 序列號碼： 14 :合成DM 【實施方式】 就本發明之葡萄糖醛酸轉移酵素、編碼該酵素之多核 苷酸、以及含有上述多核苷酸之載體、轉形體等詳細說明 8 320590 201011106 形成藍色花的屬於唇形目玄參科婆婆纳屬之波斯婆婆 納（Veronica persica)的主要花青素苦色素為花翠素3-0 -(3-0-(6-0-香豆醯基）-葡萄糖基）_6-〇-番豆醯基-糖苷-5 -〇-糖苷（delphinidin 3-0-(3-0-(6-〇-coumaroy 1 )-glucos yl)-6-0-coumaroyl-gliicoside-5-0-glucoside) ’ 而主要 黃酮為芹菜素7-0-(3_0_葡萄糖醛酸基葡萄糖苷酸（apig enin 7-0-(3-0-glucuronosyl)-glucuronide)(參照類家 ❺ 美穗，曰本東洋大學碩士論文，平成15年度）。以該芽菜 素作為骨架之黃酮7位-葡萄糖苷酸係對於主要花青素苷 顯示明顯的輔色效果，所以被認為跟波斯婆婆納之花色有 關連。本發明研究者從源自波斯婆婆納花瓣之cDNA中，藉 由PCR而分離出類黃酮7位-葡萄糖醛酸轉移酵素（Fiav〇n 〇id 7-0- glucuronosyltransferase，簡稱為 F7GAT)之基 因，而獲知本發明之形態之一之多核苷酸（序列號碼：7) H 1.本發明之多核苷酸 一種含有由序列號碼：7所示鹼其.

本發明首先提供（a) — 320590 9 201011106 - 碼：8所示胺基酸序列中有1至15個胺基酸發生缺失、取 代、插入及/或加成之胺基酸序列所構成，且具有UDP-葡 萄糖醛酸轉移酵素活性的蛋白質。該蛋白質可列舉如：由 序列號碼：8所示胺基酸序列中，例如有1至15個、1至 14個、1至13個、1至12個、1至11個、1至10個、1 至9個、1至8個、1至7個、1至6個（1至數個）、1至5 個、1至4個、1至3個、1至2個、1個胺基酸殘基發生 缺失、取代、插入及/或加成之胺基酸序列所構成，且具有 ❹ UDP-葡萄糖醛酸轉移酵素活性的蛋白質。上述胺基酸殘基 之缺失、取代、插入及/或加成之數目，一般而言，愈少愈 佳。 又，機能相同之蛋白質之例可列舉如（d)具有相對於序 列號碼：8所示胺基酸序列而言具備80%以上之同質性之胺 基酸序列，且具有UDP-葡萄糖醛酸轉移酵素活性的蛋白 質；該蛋白質之例可列舉如：具有相對於序列號碼：8所 _ 示胺基酸序列而言具備約80%以上、81%以上、82%以上、 0 83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以 上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94% 以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、 99. 1%以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99. 4%以上、99.5% 以上、99. 6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上、99. 9%以上之 同質性之胺基酸序列，且具有UDP-葡萄糖醛酸轉移酵素活 性的蛋白質。上述同質性之數值，一般而言，愈高愈佳。 此處，「UDP-葡萄糖醛酸轉移酵素活性」乃指將類黃 10 320590 201011106 酮、二苯乙烯及木脂素（lignan)等糖受體基質之羥基加以 葡萄糖醛酸化（例如將類黃酮之7位之羥基加以葡萄糖酸 酸化）而催化產生葡萄糖盤·酸接合體之反應的觸媒活性。 UDP-葡萄糖搭酸轉移酵素活性’例如可將UDP-葡萄糖 搭酸及糖受體基質（例如黃酮）在作為評估對象之酵素存在 下進行反應’藉由HPLC等分析所得反應物質而測定之（更 具體内容請參照下述實施例所記載）。

❹ 又，本發明也包括（e)—種多核苷酸，其係含有：在嚴 苛條件下跟由序列號碼·· 7所示鹼基序列之第丨至第1362 之鹼基序列成為互補性的驗基序列所構成之多核苷酸進行 雜父，且編碼具有UDP-葡萄糖醛酸轉移酵素活性之蛋白質 :多核《 ;以及⑴―種多核苷酸’其係含有：在嚴苛條 :跟由編碼以序列號碼：8所示胺基酸序列所構成的蛋 的多:Si酸:驗基序列成為互補性之驗基序列所構成 ，進仃雜父，且編碼具有葡萄糖醛酸轉移酵 I性之蛋白質的多核苷酸。 以二中’「多核*酸」乃意指醒或疆。其中， 之鹼基序列成為/、”、. 7所不鹼基序列之第1至第1362 由跟編石馬序列紫補性之驗基序列所構成的多核普酸、或 序列成為互補性之^所不胺基酸序列之多核魏之驗基 分作為探針，序列所構成的多核㈣之全部或部 用集洛雜交法H轉交法（plaque 320590 11 201011106 hybridization)或南方雜交法（southern hybridization) 等而獲得之多核苷酸。雜交方法例如可利用文獻 Sarabrook & Russel 1, Molecular Cloning · A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001 、 Ausubel, Current Protocols in Molecular

Biology’ John Wiley & Sons 1987-1997” 等所記載之方 法0 本說明書中’「嚴苛條件」乃指低度嚴苛條件、中度嚴 © 苛條件及高度嚴苛條件中之任意條件^「低度嚴苛條件」乃 &例如 5xSSC、5x登哈特溶液（Denhardt’s solution)、 0· 5%SDS、50%甲醯胺、32°C之條件。又，「中度嚴苛條件」 乃指例如5xSSC、5x登哈特溶液、0. 5%SDS、50%曱醯胺、 42°C之條件。「高度嚴苛條件」乃指例如5xSSC、5χ登哈特 溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、5〇°c之條件。在該等條件中， 愈提焉溫度’愈可期待有效地獲得同質性高之DNA。但是 參就對於雜交之嚴苛性造成影響之因素而言，有溫度、探針 濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等複數要素， =以只要是同業者即可適度選擇此等要素而實現相同之嚴 又’當使用市販之套組來進行雜交時，例如可採用A1 kphos Direct Labelling ReagentsCAmersham Pharmaci a公司製品）。此時，可參照套組所隨附之協定書（pr〇t〇co 1)，跟經標記之探針進行保溫培養一夜後，在55它條件下， 以3有0. ；U(W/V)SDS之一次洗淨缓衝液洗淨膜後，檢測出 320590 12 201011106 經雜交之ΜΑ。 除了上述之外而可雜交之多核苷酸，可列舉例如··當 使用FASTA、BLAST等檢索同質性之軟體並以默認之參數 (default parameter)計算時，序列號碼：7所示鹼基序列 之第1至第1362之驗基序列之DNA，或跟編媽序列號碼： 8所示胺基酸序列之DNA具有約60%以上、約70%以上、71% 以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、 77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以 © 上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88% 以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、 94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以 上、99. 1 %以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99. 4%以上、99. 5% 以上、99· 6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上或99. 9%以上之 同質性之DNA〇 又，胺基酸序列或驗基序列之同質性，可使用卡林及 義 阿吉爾氏（人名）之演算法BLAST(參照Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 872264-2268，1990 ; proc Natl Acad Sci USA 90 : 5873，1993)而決定之。目前已研發出依據BLAST之演算法 而被稱為BLASTN或BLASTX之程式（參照Altschul SF，等 人；J Mol Biol 215 : 403, 1990)。使用 BLASTN 程式解析 驗基序列時，參數係採用例如score=100，wordlength=12。 另外，採用BLASTX程式解析胺基酸序列時，參數係使用例

如 score= 50，wordlength=3。採用 BLAST 及 Gapped BLAST 程式時，使用各程式之默認參數。 13 320590 201011106 上述本發明之多核苷酸也可藉周知之基因工程方法或 周知之合成方法製得。 2.本發明之蛋白質 本發明之另一實施形態亦提供被上述本發明之多核苷 酸所編碼之蛋白質。本發明之形態之―之蛋白質係由序列 號碼：8所示胺基酸序列所構成的蛋白質。本發明之另一 形fe之蛋白質係具有序列號碼：8所示胺基酸序列之蛋白 f。本發明之又另一形態之蛋白質係由序列號碼：8所示 胺基酸序列中有1至15個胺基酸發生缺失 、取代、插入及 /或加成之胺基酸序列所構成，且具有UDp_葡萄糖醛酸轉 移酵素活性的蛋白質。該蛋白質之例可列舉如：具有跟序 列號碼.8所示胺基酸序列具備如上述之同質性之胺基酸 序列，且具有UDP-葡萄耱醛酸轉移酵素活性的蛋白質。該 蛋白質可藉由文獻“3咖131'〇〇1^&1^^8&11，1|1〇16〇11&1·-Cloning ： A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring ❹ Harbor, Laboratory Press 2001^ > ^Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997” 、 “Nuc. Acids Res·, 10， 6487 (1982)” 、 “Proc· Natl. Acad. Sci. USA, 79， 6409 (1982)” 、 Gene, 34，315 (1985)” 、“Nuc. Acids. Res.，13，4431 (1985)” 、 “proc. Natl. Acad. Sci. USA， 82， 488 (1985)”等所記載之部位特異性變異導入方法而製成。 本發明之蛋白質之胺基酸序列中，所謂「有1個以上 (例如1至15個，以1〇個以下為佳）之胺基酸殘基發生缺 14 320590 201011106 失、取代、插入及/或加成」乃指同一序列中之任意且1個 或複數個胺基酸序列中之位置上，發生1個或複數個胺基 酸殘基之缺失、取代、插入及/或加成，且缺失、取代、插 入及加成中亦可同時有2種以上情形發生。 可互相取代之胺基酸殘基係如下所示。同一群所含有 之胺基酸殘基可互相取代。A群：白胺酸、異白胺酸、正 白胺酸（norleucine)、綠胺酸、正線胺酸、丙胺酸、2一胺 基丁酸、曱硫胺酸、鄰-曱基絲胺酸、第三丁基甘胺酸、第 〇 三丁基丙胺酸、環己基丙胺酸；B群：天冬胺酸（aspartic acid)、麩胺酸（glutamic acid)、異天冬胺酸、異麩胺酸、 2-胺基己二酸、2-胺基辛二酸；C群：天冬酿胺 (asparagine)、麩醯胺（glutamine) ; D群：離胺酸、精胺酸、 鳥胺酸、2, 4-二胺基丁酸、2, 3-二胺基丙酸；E群：脯胺 酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸；F群：絲胺酸、蘇胺 酸（threonine)、高絲胺酸（homoserine) ; G群：苯基丙胺酸、 Λ 酷胺酸。 另外’本發明之蛋白質也可藉Fmoc法（苐基甲氧羰基 法）、tBoc法（第三丁氧羰基法）等之化學合成方法而製成。 另外’也可利用 Advanced Chemtec 公司、Parkin-Elmer 公司、Pharmacia 公司、Protein Technology Instrument 公司、Synthservegar公司、Parseptive公司、島津製作 所等公司之肽合成機而進行化學合成。 此處，本發明之蛋白質係葡萄糖醛酸轉移酵素。該「葡 萄糖醛酸轉移酵素」可催化將葡萄糖醛酸殘基從糖供體移 320590 15 201011106 轉至糖受體基質而產生葡萄糖醛酸接合體之反應。本發明 中’糖受體基質係例如為類黃酿I、二苯乙婦、香豆素 (coumarin)及木脂素。又，糖供體係例如為UDp_g萄糖醛 酸。本發明之某一形態之蛋白質可催化將葡萄糖醛酸殘基 從UDP-葡萄糖醛酸轉移至糖受體基質而產生葡萄糖醛酸接 合體及UDP之反應。 糖受體基質之類黃酮係包括黃酮、黃酮醇、黃烷酮 (flavanone)、異黃酮、黃酮c糖苷、橙酮（aurone)及兒茶素 © (catechin)專。其中，黃_之例可列舉如黃答素、野黃答素 (scutellarein)、芹菜素、木犀草素（iute〇lin)、三粒小 麥黃酮（tricetin)、香葉木素（diosmetin)及金聖草素 (chrysoeriol)等。黃酮醇之例可列舉如獬皮酮 (quercetin)、揚梅黃酮（myricetin)及山奈紛（kaempfer〇1) 等。黃烧鋼之例可列舉如柚皮素（naringenin.)。異黃酮之 例可列舉如染料木素（genistein)、黃豆苷元（daidzein) ❹ 及刺芒柄花素（formononetin)。黃酮C糖苷之例可列舉如 牡荊素（vitexin)、異牡荊素（isovitexin)及荭草素 (orientin)。撥嗣之例可列舉如金魚草素（aureusidin)。 兒茶素之例可列舉如兒茶素及表兒茶素沒食子酸酯 (epigallocatechin gallate)。 二苯乙烯係包括白藜蘆醇（resveratrol)及其糖苷之 白藜蘆醇苷（piceid)。 木月曰素係包括（+)-松脂醇（（+)-pinoresinol)、（+)-辣薄荷醇（（+)~Piperitol)、（+)-芝麻素酚 16 320590 201011106 ((+)-sesaminol)、（ + )-亞麻舒木脂素 (( + )-secoisolariciresinol)、（+)-芝麻素兒茶盼 1(SC1) ((+)-sesamin catechol 1)、（+)_芝麻素兒荼酌· 2(SC2)、 (+)-表芝麻素兒茶酚2(EC2)及羅漢松脂素（matairesinol) 等。 本發明之形態之一中，糖受體基質為類黃。本發明 之另一形態中，糖受體基質為在B環4’位具有羥基之黃 酮。本發明之又另一形態中，糠受體基質為選自野黃答素、 ® 芽菜素、木犀草素、香葉木素、金聖草素、山奈酚及柚皮 素所構成群中之至少一種糖受體基質。 而例如由序列號碼：8之胺基酸序列所構成之葡萄糖 酸酸轉移酵素（VpF7GAT)，係在當糖受體基質為野黃答素、 更芩素、芹菜素、木犀草素、香葉木素及金聖草素等黃酮， 槲皮酮及山奈酚等黃酮醇，以及柚皮素等黃烷酮時顯示活 性；特別是在當糖受體基質為野黃荅素、芹菜素、木犀草 ❹素、香葉木素、金聖草素、山奈酚及柚皮素時，比起其他· 之糖受體基質顯示更強大之活性。 3.載體及導入該載體而成之轉形體 本發明在另一實施形態中，提供含有本發明之多核苷 酸之表現载體。本發明之表現載體含有本發明之多核普酸 (例如上述（a)至（〗）項中任意一項之多核苷酸）。其中，本 ^明，表現賴較佳係含有上述（g)至（]·)項巾任意一項之 A.苷酸本發明之表現載體更佳係含有如下述之多核苷 馱·一種多核魏，其含有由序列號碼：7所示驗基序列 320590 17 201011106 之第1至第1362之鹼基序列所構成之多核苷酸；或是一種 多核苷酸，其含有編碼蛋白質之多核苷酸，該蛋白質係由 序列號碼：8所示胺基酸序列所構成。 本發明之载體之構成，一般含有：（1)在宿主細胞内可 轉錄之啟動子（prom〇ter) ; (ii)結合在該啟動子之本發明 之多核苷酸（例如上述（a)至（j)項中任意一項之多核苷 酸）；以及（iii)與RNA分子之轉錄終止及多腺苷酸化 (polyadenylation)有關，且含有在宿主細胞内能發揮機能之 β 信號作為構成要素的表現框架（expression cassette)。按 知上述所構桌之載體係被導入至宿主細胞内。表現載體之 製備方法可採用利用質體（plasmid)、嗟菌體或黏接質體 (cosmid)等之方法’唯不侷限於上述方法。 载體之具體種類並無特別限制，可適當選擇在宿主細 胞中可表現之載體。亦即’隨宿主.細胞之種類，為了能確 實表現本發明之多核苷酸而選擇適當之啟動子序列，將其 ❹與本發明之多核苷酸組合在各種質體等而製成載體，再將 該載體當作表現載體使用即可。 本發明之表現載體係依賴所導入之宿主之種類，含有 表現調控領域（例如啟動子、終止子（terminator)及/或複 製起點等）。細菌用表現載體之啟動子，可使用常用之啟動 子（例如trc啟動子、tac啟動子、lac啟動子等）；酵母用 啟動子之例玎列舉如甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子、PH05 啟動子等；絲狀菌用啟動子之例可列舉如澱粉酶、trpC等。 又’動物細胞宿主用啟動子之例可列舉如病毒性啟動子（例 18 320590 201011106 如SV40初期啟動子、SV40後期啟動子等）。 表現載體係以至少含有一個選擇標記（selective marker)為較佳。該標記可利用營養缺陷型標記（ura5、 niaD)、耐藥性標記（潮霉素（hygromyCine)、Zeocin)、 Geneticin耐性基因（G418r)、耐銅性基因（CUPl)(Marin等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81，337，1984)、淺 藍菌素（cerulenin)耐性基因（fas2m，PDR4)(分別參照猪腰 淳飼等人，生化學，64, 660, 1992 ; Hussain等人，gene, ® 101，149，1991)等。 又’本發明提供一種導入有本發明之多核苷酸（例如導 入有上述（a)至（j)項中任意一項之多核苷酸）之轉形體。 轉形體之製造方法（生產方法）並無特別限制，可列舉 例如將上述重組载體導入至宿主中之轉形方法。此處所用 - ' 之宿主細胞並無特別限制，可.適度採用已往周知之各種細 胞。具體而言’例如可使用大腸菌（Escherichia coli)等 鲁 細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂 酵母 Schizosaccharomyces pombe)、線蟲（Caenorhabditis elegans)、非洲爪娃（xen〇pUS iaevis)之卵母細胞等。上 述宿主細胞所用之適當培養基及培養條件乃相關領域所周 知，不待說明。又，作為轉形對象之生物種類並無特別限 制，例如可使用上述宿主細胞所例舉之各種微生物、植物 或動物等。 宿主細胞之轉形方法可利用一般周知之方法。例如可 藉電穿孔法（匕16(：1：1'〇卩〇『&1：丨011)(參照“3〇1^1^^6〇.八等 320590 19 201011106 人，Appl. Environ. Microbiol·，66，4655-4661，2000)、 顆粒遞送法（particle delivery)(參照日本特開2005-287403「脂質生產菌之育種方法」中所記載方法）、原生質 球狀體（spheroplast)法（參照 proc. Natl. Acad. Sci. USA， 75 pl929 (1978))、乙酸鐘法（參照 j. Bacteriology, 153， pl63 (1983)) ^ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978)、Methods in yeast genetics，2000 年版：A Cold

Spring Harbor Laboratory Course Manual 等所記載之方 ❹ 法）而實施，唯非侷限於上述方法。 本發明之另一種形態中，該轉形體可為植物轉形體。 該實施形態之植物轉形體係藉由將含有本發明之多核苷酸 的重組載體，以使經該多核苷酸所編碼之多肽 (polypeptide)得以表現之方式導入至植物中而製得。 使用重組表現載體時，植物體之轉形所用之重組表現 載體，只要是在該植物體中能表現本發明之多核苷酸的載 ❹體則無特制。該賴之例可列舉如：具有在植物細胞 ^於構築上能表現多核普酸之啟動子（例如花椰菜花葉病 I之35S啟動子）的載體，或具有藉外加刺激而活化誘發性 之啟動子的载體。 本發明中作為供轉形對象之植物，係指植物體整體、 植物器官（例如葉片、花瓣、莖、根、種子等）、植物組織（例 势皮物皮部（ph 1 〇em)、薄壁組織（parenchyma)、木質部、 '..A束柵狀組織、海綿狀組織等），或植物培養細胞、或 各種形態之植物細胞（例如懸濁培養細胞）、原生質體 320590 20 201011106 (cal lus)等中之任一 可任意為單子葉植物 (protoplast)、葉之切片、癒傷組織 者。轉形所用之植物並無特別限制， 綱或雙子葉植物綱所屬之植物。 ^入基因至植物中之方法，可使㈣領域中同業者周 知之轉形方法（例如土壤桿菌法、基因搶法、PEG法、電穿 孔法等）。例如以藉由土㈣_進行之方法及直接導入植物 細胞中之方法為周知方法。使用土壤桿g法時，將已構築 之植物用表現載體導人至適佳之土壤桿g(例如根癌土壤 桿菌（Agrobacterium tumefaciens))中，再將該菌株依據 葉盤法（leaf-disk method)(參照内宮博文著，植物基 作手冊⑽0)，27至31頁，講談社科技，東京，日基本^ 感染於無菌培養葉片，而得轉形體植物。另外，也可採用

Nagel 等人之方法（參照 Micribiol. Lett. , 67，325 (1990))。該方法係首先，例如將表現載體導入至土壤桿菌 中，繼之’按照文獻 Plant Molecular Bi〇i〇gy Manuai (s. B. Gelvin 等人，Academic Press Publishers)所記載之 方法將該經轉形之土壤桿菌導入至植物細胞或植物組織中 的方法。此處，該「植物組織」係包括藉培養植物細胞所 得之療傷組織。使用土.壤桿菌法進行轉形時，可使用雙載 體（binary vector)(pBI121 或 pPZP202 等）。 又’直接將基因導入至植物細胞或植物組織中之方 法’已知有電穿孔法、基因槍法。使用基因搶時，可直接 使用植物體、植物器官、植物組織本身，也可調製成切片 後使用’亦可調製成原生質體後使用。經調製成之該試料 320590 21 201011106 可使用基因導入裝置(例如PDS_1000(BIO_RAD公司製品） 等）處理之。處理條件隨植物或試料而異，一般，在45〇至 2000psi左右之壓力，4至12cm左右之距離下進行。 經導入有基因之細胞或植物組織，首先，藉潮霉素耐 性等耐藥劑性加以選擇，繼之，按照預定之方法再生為植 物體。從轉形細胞成為植物體之再生方法，可隨植物細胞 種類而按照該領域周知之方法進行。 使用植物培養細胞作為宿主時，藉基因槍、電穿孔法 ❹將重組載體導入至培養細胞中而進行轉形。轉形之結果所 得之癒傷組織或茁發芽（sh〇〇t)、毛狀根等可直接使用於細 胞培養、組織培養或器官培養。又，可使用已往周知之植 物組織培養法’投予適當濃度之植物激素（植物生長素 (auxin)、細胞分裂素（cytokinin)、赤霉素（gibberellin)、 脫落酸（abscisi-c acid)、乙烯、蕓苔素内醋（brassinolide) 等）等而再生成為植物體。 ⑩ 基因是否確實導入植物内，可利用PCR法、南方雜交 法、北方雜交法（northern hybridization)等而確認之。 例如從轉形植物調製DM，並設計DM特異性引子而進行 PCR可在與調製上述質體時所使用之相同條件下進 行。然後’對於增殖產物進行瓊脂糖電泳、聚丙烯醯胺凝 膠電泳或毛細管電泳等，利用溴化乙錠（ethidium bi*〇mide)、SYBR綠色液等染色，藉由以一區帶檢測該增殖 產物而確認其轉形。又，亦可使用事先藉螢光色素等作標 5己之引子來進行PCR，而檢測出增殖產物。更可採用將增 22 320590 201011106 殖產物結合在微板（microplate)等固相，藉螢光或酵素反 應荨4認增殖產物之方法。 -旦若取得由本制之？核賊組合在基因組内而成 之轉形植物體，即可利用有性生殖或無性生殖而獲得該植 物體之後代。另外，可再由該植物體或其後代、或該等之 無性繁殖系(done)取得例如種子、果實、切穗、塊莖、塊 根:植株、癒傷組織、原生質體等，並以該等作為基礎而 大置生產該植物體。因此，本發明亦包括經導入有本發明 ©之多核普酸且可表現之植物體，或具有與該植物體相同之 性狀之該植物體之後代，或源自該等之組織。 又，已有對於各種植物之轉形方法之報告。本發明之 轉形體植物，可列舉例如芝麻、水稻、於草、大麥、小麥、 油菜馬鈴薯番知、白杨、香襄、尤力口利樹（卽㈤乂扣此）、 :藷:黃豆、t宿、羽扇豆（iupine)、玉求、花椰菜、薔 薇、菊花、香石竹（carnation)、金魚草、仙客來、蘭花、 ❹土耳其桔梗、小蒼蘭（freesia)、非洲菊、唐菖蒲 (gladiolus)、霞草（gypsophila)、洋吊鐘花（kaianch〇e)、 百合、天竺葵（pelargonium)、老鶴草（geranium)、矮牽牛 擬南芥（Arabidopsis thaliana)及日本百脈根（L〇tus corniculatusvar. japonicus)等，唯不侷限於上述範圍。 若依據本發明之形態之-，則該轉形植物體係機能性 食品材料用植物體。 若依據本發明之又另一形態，則該轉形植物體係花色 320590 23 201011106 =:::1色經改變之植物趙，花一 4·本發@之蛋自冑之製財法 本發明在另一實 本發明之蛋白f之方法〜、巾&供_上述轉形體製造 ❹ 或=胞’ _體或培 製可按照-般方法而進行。^之蛋㈣之分離、精 Ο 養細胎Γ二之’當本發明之蛋白質蓄積於培養菌體内或培 /、時，可在培養後，藉一般方法（例如超音波、溶菌 '東…融解等）使菌體或細胞破碎之後，再按照一般方法 (J離u、過濾等）取得本發明之蛋白質之粗萃取液。當 本發月之蛋白質蓄積於培養液中時，可在培養結束後，依 照一般方法（例如離心、過濾等）將菌體或細胞跟培養上澄 液刀開後，而獲得含有本發明之蛋白質之培養上澄液。 據上述方法所得之萃取液或培養上澄液中所含之本發 明之蛋白質之精製，可按照一般分離、精製方法而進行。 該分離、精製方法，例如可將硫酸銨沈澱法、凝膠過濾層 析法、離子交換層析法、親和層析法、逆相高速液體層析 法、透析法、超濾法等單獨或適度組合而利用。 5.葡萄糖藤酸接合體之製造方法 更加之，本發明尚提供使用本發明之蛋白質而製造葡 320590 24 201011106 萄糖醛酸接合體之方法。由於本發明之蛋白質可催化將葡 萄糖醛酸從糖供體（例如UDP-葡萄糖醛酸）轉移至糖受體基 質（例如類黃酮、二笨乙烯或木脂素）之反應，所以藉由使 用本發明之蛋白質，可將糖受體基質及糖供體作為原料， 而製造葡萄糖醛酸接合體。該糖受體基質係以類黃酮為佳。 例如可藉由調製含有lmM之糖受體基質、2mM之糖供 體、50mM之磷酸鈣緩衝液（pH 7 5)以及2〇/zM之本發明之 蛋白質的溶液，在3〇°c下反應30反鐘，而製造葡萄糖醛 ❹酸接合體。從該溶液中可藉周知方法分離、精製出葡萄糖 醛酸接合體。具體而言，例如可將硫酸銨沈澱法、凝膠過 慮層析法、離子父換層析法、親和層析法、逆相高速液體 層析法、透析法、超濾法等單獨或適度組合而使用。 據此所得之葡萄糖駿酸接合體可用於作為機能性食品 之原料、用以調查其在生體内之機能的試劑、或抗氧化劑 專（參照 Gao, Z.，Huang，K.，Yang, X.，and Xu, H. (1999) φ Biochimica et Biophysica Acta 1472， 643-650.)。 [實施例] 本發明藉下列實施例更詳細說明，唯非侷限於該範圍。 [實施例1 ] 基因選殖（gene cloning) 本實施例中所使用之分子生物學方法，除非另外詳 述，不然皆依照文獻Molecular Cloning(Sambrook等人、 Cold Spring Harbour Laboratory Press，2001)所記载之 方法。 25 320590 201011106

對於唇形科黃芩之葡萄糖醛酸轉移酵素SbUBGAT (NagashimaS.等人，Phytochemistry 53，533-538，2000) 依據藉Blast解析之同質性檢索，在胺基酸序列水平下， 發現顯示55%的序列同質性之玄參科金魚草之糖苷化酵素 基因（即AmUGTcglO、登記號碼AB362988)(參照Ono，E.等 人，Proc. Natl· Acad. Sci. USA 103，11075-11080， 2006) 〇 為了分離同樣屬於玄參科之波斯婆婆納之類黃酮7位 ❹ -葡萄糖醛酸轉移酵素VpF7GAT之編碼用基因，以同樣屬於 玄參科之金魚草之序列作為基礎，設計下列所示之兩種引 子（序列號碼1及2)。 序列號碼]

AmF7GAT-Fl : 5,-GTG ATA GAT TTC TTT TGC AAT-3， - 序列號碼2

AmF7GAT-R3 : 5’-ACC CTA TTC ATC CTC TGC TCC-3’ ❿ 使用RNeasy植物用迷你套組（QIAGEN公司製品），從 波斯婆婆納之花瓣萃取總RNA之後，按照製造業者所推薦 之條件使用 RT-PCR 用 Super Script First-Strand 合成系 統（Invitrogen公司製品），由l#g之總RNA合成cDNA。 以該cDNA為模板’藉由使用有上述序列號碼1及2之引子 的PCR來嘗試分離編碼vpF7GAT之基因。 具體而言，PCR反應液（50//1)係由波斯婆婆納cDNAl # 1、1 xExTaq 緩衝液（TaKaRa Bio 公司製品）、0. 2mM dNTPs、引子（序列號碼1及2)各〇. 4pmol/ μ 1、ExTaq聚 26 320590 201011106 合酶2. 5U所構成。PCR反應係在94°C下反應3分鐘後，以 在94°C下1分鐘、50°C下1分鐘、72°C下2分鐘作為_循 環而進行35次循環之擴增作用。 將該PCR反應液藉由0. 8%瓊脂糖電泳而分離之、纟士果， 在約1 · 0 kb大小處獲得擴增片段。將該擴增片段插入至p CR-T0P0II載體（Invitrogen公司製品）之多重選殖部位 (multi-cloning site)，使用 DNA 序列分析儀 31〇〇 型 ❿ （Applied Biosystems社製品）並依據使用合成募核皆酸引 子之引子步查法來決定插入片段之驗基序列。將所得之驗 基序列以 CLUSTAL-W 程式（MACVECT0R 7· 2. 2 軟體，Accerly 公司製品）分析之結果’顯示和金魚草AmUGTcg 1 〇及黃答 SbtiBGAT之序列同質性為面’故將此cDNA作為VpF7GAT之 .候補基因（candidate gene)。 然而，和AmlIGTcglO比對（alignment)之結果，所得之 參 cDNA擴增片段確知為缺失5’及3’領域之不完全之開放解 讀框架（Open Reading Frame，亦即0RF)。因此，使用基 因racer套組（11^1：1'€^11公司製品）並依照製造業者所推 薦之方法進行cDNA末端快速擴增反應（rapid amplification of cDNA end ’ 下文中簡稱為 RACE)，而擴 增cDNA片段之5’及3’領域。RACE係使用下列序列號碼3 至6所示之對於vPF7GAT基因具有特異性之引子套組。

GR-VpF7GAT-RV ： -TTC CAG GAG GGT TTC GAA CGG ACC 27 320590 201011106 ΑΤΑ-3， 序列號瑀4 GR-VpF7GAT-nest-RV: 5, -CTA GAG GTG CAA CGA ΑΤΑ AAA CTT-3， 序列號碼5 GR-VpF7GAT-Fw ： 5? -TAT GGT CCG TTC GAA ACC CTC CTG GAA-3’ 序列號碼6

® GR-VpF7GAT-nest-Fw : 5’ -AGG ATC CTG ACC TGG AAA CA-3， 對於RACE所得之擴增片段，依據使用合成寡核苷酸引 子之引子步查法來決定其鹼基序列，獲得含有完整長度之 0RF的VpF7GAT候補基因及其胺基酸序列（序列號碼：7 (VpF7GAT之cDNA序列），序列號碼：8(VpF7GAT之胺基酸 序列））。 ❸ 該VpF7GAT候補基因在胺基酸序列水平下，分別跟金 魚草AmUGTcgl0及黃答SbUBGAT顯示61%及51%之序列同質 性。 [實施例2] 表現裁體之構築 為了瞭解實施例1所得之VpF7GAT候補蛋白質（下文簡 稱為本酵素）之生化機能，構築會表現本酵素cDM之大腸 菌表現載體。將含有完整長度之〇卯的cDNA，藉由使用序 列號碼9及10所示之VpF7GAT候補基因特異性引子套組並 320590 28 201011106 • 以PCR法而擴增之。模板乃使用由上述波斯婆婆納之花瓣 所萃取之總RNA而合成之cDNA。 岸列號碼9 CACC-NdeI-VpF7GAT-Fw ： 5* -CAG CCA TAT GGA AGA CAC AAT CAT CCT-3’ 序列號碼10

XhoI-VpF7GAT-Rv : 5, -CTC GAG TTT TTA CCC AAT AAC CAA CTT GAT-3， O PCR反應（使用KOD Plus聚合酶，Τ0Υ0Β0公司製品） 係94°C下進行熱變性2分鐘後，以在94°C下15秒鐘、50 °C下30秒鐘、68°C下1. 5分鐘作為一循環而進行35次之 循環。將所擴增之DNA片段予以次選殖（subcloning)至 pCR-Blunt ΙΙ-Τ0Ρ0 載體（使用 Zero Blunt Τ0Ρ0 PCR 選殖 套組，Invitrogen公司製品）’並藉由ABI3100Avant基因 分析儀（Applied Biosystems公司製品）進行驗基序列之嫁 ▲ 認。 所得之質體係以Ndel與Xhol之限制酶完全消化，將 所產生的含有完整長度之0RF的約1. 5kb之DNA片段連接 在大腸菌表現载體pET-15b(Novagen公司製品）之Ndel及

Xhol部位，而得大腸菌表現载體。 [實施例3] 木一腸菌重盒蛋白質之表現为崎’ 使用上述各個所得之質體，按照預定之方法將大腸菌 BL2KDE3)®株予以轉形。將所得之轉形體在含有5_/ιη1 29 320590 201011106 •之安比西林（卿⑹叫之LB培養基（含有1〇§/1之膜蛋白 月東、5g/i之酵素萃取物、lg/1之氣化納）ω中，於沉 下振4培養-夜。將到達靜止期之培養液-接種在相同 組成成分之_之培養基中，在37t下振盈培養之，當 菌體濃度_00)大約到達〇. 7時，添加最終濃度為〇. μ 之IPTG ’在22°C下振盪培養2〇小時。 所有下列操作皆在4。(：下進行'。將培養之轉形體使用 離心機（7, 〇_，u分鐘）集菌，添加緩衝劑s[含有20mM 〇磷酸納緩衝液（PH7.4)、20視之^坐、0.5M之氯化納、i倾 之石-酼基乙醇]2ml/g細胞，而懸濁之。繼之，進行超音 波破碎處理（15秒鐘X8次）、離心處理（15，⑽〇xg，1〇分 鐘）。在所彳于上澄液中添加最終濃度為〇. 12%(w/v)之聚伸 乙亞胺並加以懸濁’靜置30分鐘。再進行離心處理（丨5, 〇〇〇 xg，10为鐘），回收上澄液做為粗酵素液。將·該粗酵素液 使用經緩衝劑S平衡化之His SpinTrap(GE Healthcare公 ⑩司製品）處理，再予以離心（70xg，30秒鐘）處理之。用6〇〇 β 1之緩衝劑S洗淨後，使用含有1〇〇、2〇〇、5〇〇mM咪唑 之緩衝劑S各600 // 1依階段性地洗提出結合在管柱之蛋白 質。使用Microcon YM-30型（Amicon公司製品）將各洗提 部分以20遽磷酸鉀緩衝液（|)117.5)、141^/5-酼基乙醇進 行緩衝劑取代。 經SDS-PAGE解析之結果’在200Mm味峻洗提部分中， 確認在由VpF7GAT之胺基酸序列所推定之約50kDa附近存 在有經精製之表現蛋白質，故將該部分使用於酵素解析（參 320590 30 201011106 照第1圖箭頭所示：目的蛋白質）。 [實施例4 ] 遵素反應 &準的反應條件如下。調製5〇# 1之反應液（含有2mM 之UDP-葡萄糖醛酸、1〇〇βΜ之糖受體基質、5〇mM之磷酸 鉀緩衝液（pH 7. 5)、酵素溶液），以添加酵素溶液而開始反 應，在3(TC下反應1分鐘。添加含有〇.5%TFA之氰化曱烷 5〇仏1而終止反應，使用逆相HpLC(LC—2〇1〇系統，島津製 作所製品）分析之。 該HPLC條件如下述。管柱係在管柱烘箱4〇〇c中使用

Develosil C30-UG-5 (4· 6mmxl50mni，野村化學公司製品）， 移動相A為0. 1% TFA/H2O，移動相β為〇. TFA/9〇%氰化 甲烷。洗提條件係在15分鐘之直線濃度梯度（B2〇%_B7〇%) 之後，再以B70%保持1分鐘。然後，再恢復至B2〇%，平衡 化處理20分鐘。流速以1ml/分鐘進行。檢測係使用spD一 © Ml〇A型Photodiode kray檢測儀（島津製作所製品）在波 長280nm及360nm下進行。本條件下，標準品之芹菜素（船 越公司提供）、由金魚草花瓣所精製之芽菜素7位_葡萄^ 苷酸及芹菜素7位-糖苷（船越公司製品）係分別在保持時 間約11· 75分鐘、8. 36分鐘及8· 22分鐘時洗提出（參照第 2圖（A):芽菜素，第2圖（C):序菜素7位一葡萄糖苷酸')。 以芽菜素作為糖受體基質且以UDP-葡萄糖醛酸作為糖 供體之酵素反應液經HPLC分析之結果，確認有跟標準品之 序菜素7位-葡萄糖苷酸之保持時間為一致之新生成物存 320590 31 201011106 ' 在（參照第2圖（B))。 LC-MS之條件係使用Develosil C30-UG-3管柱（野村 化學公司製品，3. 0mmxl50mm)，移動相A液係使用含〇 曱酸之水’ B液係使用含〇. 1%甲酸之1〇〇%乙腈。使用2〇 分鐘之直線濃度梯度（B液20%—70%)洗提，然後，用7〇%b 液進行5分鐘之等位洗提（isocratic elution)。（流速為 0· 2ml/分鐘’管柱烘箱溫度為4(TC)。 檢測係使用Photodiode Array檢測儀（SPD-Ml0A型， ❹ 島津製作所製品）收集波長230至500nm之資料，測定 A337nm之色譜。又，在pda檢測儀之後，連接T0F-MS檢 測儀（Q-TOF Premier, Micromass，UK),依照下列條件測 定生成物之分子量^ MS之測定條件係以負模式進行（離子 源為ESI，Lock spray reference :白胺酸腦啡肽仏即以此-Enkephalin)(m/z 554. 2615 [Μ-ΗΓ)，毛細管：2. 7kV，Cone : 30V，MS/MS 碰撞能量·· 2〇eV)。 ⑩ 該條件下，在保持時間為17.51分鐘時洗提出之基質 之芽菜素係賦予m/z 269. 0441 [Μ-ΗΓ之分子離子。另一方 面’在保持時間為11. 72分鐘時洗提出之生成物係賦予m/z 445. 0759[Μ-ΗΓ之分子離子，被確認為經加成一個葡萄糖 經酸於芹菜素而成者（參照第2圖（D))。又，依據MS/MS分 析’從該生成物之分子離子可檢測到跟芹菜素一致之m/z 269. 0450[M-H]之碎片離子（fragment i〇n)。 由上述結果顯示本酵素係具有波斯婆婆納之活 性之蛋白質。 32 320590 201011106 [實施例5] μι^ατ冬蹲jfc機能鮮也 按照文獻（MogU(：hi，A.等人，plant % 145_427, 2008/)所g載之方法’測定本酵素對於聊糖供體之選擇性 (糖受體基質為芽菜幻，結果以聊_葡萄祕酸作為1〇〇% 之相對活性，UDP-葡雜為5暑UDp_半乳糖為檢測界限 以下，而確認本酵素對於UDp—葡萄糖醛酸之高特異性。又， 本酵素對芽菜素及UDP-葡萄糖盤酸之基質特異性（Km)分別 為10. 7±1.7βΜ及36.6±8.7/zM，對於芹菜素之觸媒活性 (kcat)為 8. 64 S-1。 就本酵素之糖受體基質之選擇性（糖供體為UDp葡萄 糖醛酸）探討之結果，對於屬於内在性基質之芹菜素顯示最 尚之活性（參照第3圖）。以該對於芹菜素之活性作為1〇〇% 之相對活性，對於屬於黃酮之野黃荅素、黃芩素、木犀草 素香葉木素及金聖草素，屬於黃酮醇之樹皮_及山奈齡； ❺ 以及屬於黃烷酮之柚皮素分別為88.3%、13. 1%、14 9%、 12. 9%、34. 〇%、1. 〇%、13. 3%及 18. 0%。 特別是關於類黃酮之B環之4,位之羥基經甲基化之香 葉木素、或B環具有2個以上之羥基之類黃_，比起在4, 位具有單獨之經基者，本酵素之活性為較低。再者，因為 對於B環上不具有羥基之黃芩素之活性為低，故可知類黃 嗣之B環之4,位之羥基在用以辨識本酵素之糖受體基質方 面係極為重要。 又’在本酵素反應條件下，無法確認到對於屬於二苯 320590 33 201011106 乙烯之白藜蘆醇、屬於香豆素之七葉樹素（esculetin)、屬 於木脂素之芝麻素驗（sesaminol)、屬於異黃酮之黃豆苷 元、染料木素及屬於黃酮C糖苷之異牡荊素、荭草素的葡 萄糖醛酸轉移活性。因此，本酵素係對於類黃酮，其中特 別是B環之4’位具有羥基之黃酮顯示強力活性。 黃酮：芹菜素、木犀草素、香葉木素、金聖草素、黃 答素及野黃答素 黃酮C糖苦：異牡荆素、狂草素 ❹又，下文中Glc表示葡萄糖。

❿ 芽菜素 木犀草素 香葉木素 金聖草素 黃芩素 野黃芩素 異牡荊素 蘇草素 (R4’=0H) (R3’=0H，R4’=0H) (R3’=0H，R4’=〇CH〇 (R3’=OCH3，R4’=0H) (R6=0H) (R4, =0H，R6=0H) (R4’=0H，R6=C-Glc) (R3’=0H，R4’=0H，R8=C-Glc) 34 320590 201011106 ’ 黃酮醇：獬皮酮及山奈酚 R3,

山奈盼 （'R4’=0H) ❹ 槲皮酮 （R3’=0H，R4’=0H) 黃烧酮：柚皮素

OH 〇 ❿ 柚皮素 [實施例6]

VpF7GAT基因之表現解析 按照文獻（Noguchi, Α.等人，Plant J. 54，415-427, 2008)所記載之相同方法，依據使用有7500 Real Time PCR Systein(Applied Biosystems 公司製品）之定量 RT-PCR 法 來解析VpF7GAT基因之不同器官之表現形態。從波斯婆婆 納之各器官（亦即葉、花、果實、莖、根）按照實施例1所 35 320590 201011106 示相同方法萃取總讓，取其中⑻進行逆轉錄反應⑽ 而得各器官之cDNA，以此作為PCR之模板。 疋1 PCR所用之各基因特異性引子係使用pHmer

Express 3.0 程式（Applied Bi〇systems 公司製品）設計下 列4種。VpF7GAT特異性引子係使用序列號碼丨丨及12。内 部標準基因係採用波斯婆婆納之核糖體RNA(AF5〇9785)， 並使用下列之序列號碼13及14之基因特異性引子而擴增 之。 ❹ 序列號礁11 qVpF7GAT-Fw : 5’-GCG GTT TCG GCC TCT GT-3， 序列號踽 qVpF7GAT-Rv : 5’ -TCC GAT ATC TTC AGG GAT GAT TTC-3, 序列號礁 qVprRNA-Fw : 5’-GCG GAA GGA TCA TTG TCG AT-3’ 序列號瑪14 φ qVprRNA-Rv : 5’-CTA GCG GGC GGA GCT TAT TA-3’ 將VpF7GAT之表現量以内部標準基因之表現量加以標 準化，藉法（Applied Biosystems)獲得相對表現 量。其結果，顯示VpF7GAT基因在花瓣中係明顯地高度表 現（參照第4圖）。因為由本酵素所賦予之黃酮7位-葡萄糖 醛酸之蓄積部位和本酵素基因表現領域符合一致’故強力 佐證本酵素係介由輔色素之生成而參與波斯婆婆納之花色 表現。又，雖然在葉片中也確認到VpF7GAT之表現’然而 並不被認為是顯著之呈色，此現象可能係起因於比起花 36 320590 201011106 瓣，其主要色素為顯著少量之故。 萄糖=至可從波斯婆婆納分離出將葡 利用本酵素而育種出%_)°所以’可 發機能性食品以Γ色改變之植物體（例如藍色花）及研 [產業上之可利用性] 卢範葡萄祕酸轉移酵素，其基質特異性為 ❹ :發明之各種葡輪酸接合體。所以若利用 酸轉移酵素，即可研發例如花色改變之 植物體（例如藍色花）或機能性食品材料等。 【圖式簡單說明】 第1圖係表不已確認大腸菌表現蛋白 照片。Μ係表示大小標記（sizem ==2 (pellet)部分，C係表示相缺本▲ H不沈歲物 φ 分表示5_ W洗提二分q =表示非吸附部 洗提部分，5〇〇係表示_ ‘ 使大腸菌表現之目的蛋白f(Vpp7(^k^，箭頭係表示 第2圖（A)係顯示芹菜素之 八 圖⑻係顯示酵素反應液(序菜素果的圖。第2 HPLC分析結果的圖。第2圖 :久叫卜葡萄糖醛酸）之 糠苷酸之HPLC分析結果的圖G係顯示芹菜紊之7位-葡萄 液（芹菜素及UDP-葡萄糖酸龄、第2圖(D)係顯示酵素反應 圖。 ）藉由搬Ί收之結果的 第3圖係顯示VpF7GAT ^ ' 掩文縣質之基質特異性解 320590 37 201011106 ‘ 析結果的圖。 第4圖係顯示藉由定量RT-PCR將VpF7GAT基因之不同 器官之表現予以解析之結果的圖。 【主要元件符號說明】 無0 ❹ 〇 38 320590

Claims (1)

1. 201011106 七、申請專利範圍： 1. 一種多核苷酸，係如下列（a)至（f)項中任一項所記載： (a) —種多核苷酸，其含有由序列號碼：7所示鹼基 序列中第1至第1362之鹼基序列所構成之多核 苷酸； (b) —種多核苷酸，其含有編碼蛋白質之多核苷 酸，該蛋白質具有序列號碼：8所示胺基酸序 列的； O (c)—種多核苷酸，其含有編碼蛋白質之多核苷 酸，該蛋白質係由序列號碼：8所示胺基酸序 列中有1至15個胺基酸發生缺失、取代、插入 及/或加成之胺基酸序列所構成，且該蛋白質具 有UDP-葡萄糖醛酸轉移酵素活性； (d) —種多核苷酸，其含有編碼蛋白質之多核苷 酸，該蛋白質係具有對於序列號碼：8所示胺 _ 基酸序列而言具備80%以上之同質性之胺基酸 ❿ 序列，且該蛋白質具有UDP-葡萄糖醛酸轉移酵 素活性； (e) —種多核苷酸，其係含有：在嚴苛條件下跟由 序列號碼：7所示鹼基序列之第1至第1362之 鹼基序列成為互補性的鹼基序列所構成之多核 苷酸進行雜交，且編碼具有UDP-葡萄糖醛酸轉 移酵素活性之蛋白質的多核苷酸； (f) 一種多核苷酸，其係含有：在嚴苛條件下跟由 39 320590 201011106 ’ 編碼以序列號碼：8所示胺基酸序列所構成的 蛋白質之多核苷酸之鹼基序列成為互補性之鹼 基序列所構成的多核苷酸進行雜交，且編碼具 有UDP-葡萄糖醛酸轉移酵素活性之蛋白質的多 核普酸。 2.如申請專利範圍第1項之多核苷酸，其係如下列（g)至 (j)項中之任一項： (g) —種多核苷酸，其含有編碼蛋白質之多核苷 ❹ 酸，該蛋白質係由序列號碼：8所示胺基酸序 列中有10個以下之胺基酸發生缺失、取代、插 入及/或加成之胺基酸序列所構成，且該蛋白質 具有UDP-葡萄糖醛酸轉移酵素活性； (h) —種多核苷酸，其含有編碼蛋白質之多核苷 酸，該蛋白質係具有對於序列號碼：8所示胺 基酸序列而言具備90%以上之同質性之胺基酸 Λ 序列，且該蛋白質具有UDP-葡萄糖醛酸轉移酵 素活性； (i) 一種多核苦酸，其係含有：在高度嚴苛條件下 跟由序列號碼：7所示鹼基序列之第1至第1362 之鹼基序列成為互補性的鹼基序列所構成之多 核苷酸進行雜交，且編碼具有UDP-葡萄糖醛酸 轉移酵素活性之蛋白質的多核苷酸；或 (j) 一種多核苦酸，其係含有：在高度嚴苛條件下 跟由編碼以序列號碼：8所示胺基酸序列所構 40 320590 201011106 ^ 成的蛋白質之多核苷酸之鹼基序列成為互補性 的鹼基序列所構成之多核苷酸進行雜交，且編 碼具有UDP-葡萄糖醛酸轉移酵素活性之蛋白質 的多核誓酸。 3. 如申請專利範圍第1項之多核苷酸，其含有由序列號 碼：7所示鹼基序列之第1至第1362之鹼基序列所構 成之多核苷酸。 4. 如申請專利範圍第1項之多核苷酸，其含有編碼蛋白質 ® 之多核苷酸，該蛋白質係由序列號碼：8所示胺基酸序 列所構成。 5. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之多核苷酸， 其係脫氧核糖核酸（DM)。 6. —種蛋白質，其特徵為：經申請專利範圍第1項至第5 項中任一項之多核普酸所編碼。 7. —種載體，其特徵為：含有如申請專利範圍第1項至第 ^ 5項中任一項之多核苷酸。 馨 8. —種轉形體，其特徵為：導入有申請專利範圍第1項至 第5項中任一項之多核苷酸。 9. 一種轉形體，其特徵為：導入有申請專利範圍第7項之 載體。 10. —種蛋白質之製造方法，其特徵為：使用如申請專利範 圍第8項或第9項之轉形體而製造如申請專利範圍第6 項之蛋白質。 11. 一種葡萄糖醛酸接合體之製造方法，其特徵為：以如申 41 320590 201011106 請專利範圍第6項之蛋白質作為觸媒，由UDP-葡萄糖 醛酸及糖受體基質而生成葡萄糖醛酸接合體。 ❿ 42 320590 201011106 序列目錄 <110〉三得利股份有限公司 <120>葡萄糖醛酸轉移酵素及編碼該轉移酵素的多核苷酸 <130> G08-0075TW <160> 14 <170> Patent In version 3.4 <210> 1 <211> 21 〈212〉 DNA <213〉 人造序列 <220〉 <223〉 合成DNA

   <400> 1 21 gtgatagatt tcttttgcaa t <210〉 2 <211> 21 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220〉

   <223〉合成 DNA 〈400> 2 21 accctattca tcctctgctc c <210〉 3 <211> 27 <212〉 DNA 〈213〉人造序列 <220〉 <223〉合成 DNA 1 320590 201011106 ' <400〉 3 ttccaggagg gtttcgaacg gaccata 27 <210> 4 <211> 24 <212〉 DNA .<213〉人造序列 <220〉 <223〉合成 DNA <400〉 4 ctagaggtgc aacgaataaa actt 24 〇 <210〉 5 <211> 27 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉合成 DMA <400〉 5 27 tatggtccgt tcgaaaccct cctggaa <210〉 6 <211> 20 ❹ <212> DNA 〈213〉人造序列 <220〉 s <223〉合成 DNA <400〉 6 aggatcctga cctggaaaca 20 <210〉 7 <211> 1365 <212〉 DNA <213〉 Veronica persica 2 320590 48 201011106 <220> <221> CDS <222〉（1)..(1365) <400> 7 atg gaa gac aca ate ate etc tat get tea tee gtg cac ctg aac tet Met Glu Asp Thr lie lie Leu Tyr Ala Ser Ser Val His Leu Asn Ser 1 5 10 15 96 gtg eta gta ata gee aag ttc ata aac aaa cat cat cct tet ate tee Val Leu Val lie Ala Lys Phe lie Asn Lys His His Pro Ser lie Ser 20 25 30 144 ata ate ata etc age aat get cct gat tea gee gca tet tee att acc lie lie lie Leu Ser Asn Ala Pro Asp Ser Ala Ala Ser Ser Ile Thr

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