TW201016233A

TW201016233A - Methods of treating autoimmune diseases using CD4 antibodies

Info

Publication number: TW201016233A
Application number: TW098123765A
Authority: TW
Inventors: Rong Deng; Paul J Fielder; Henry Lowman; Eric Stefanich; Ya-Nan Zheng
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2008-07-15
Filing date: 2009-07-14
Publication date: 2010-05-01
Also published as: WO2010009129A2; WO2010009129A3; AR077718A1; US20100021460A1

Description

201016233 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明提供利用單獨或與其他化合物組合之非消耗性抗 CD4抗體治療哺乳動物個體之自體免疫病症的方法。本申明案主張20 08年7月15曰申請之美國臨時申請案第 61/08 i，012號之優先權，該案以全文引用之方式併入本文中〇【先前技術】罄自體免疫疾病，尤其諸如狼瘡、重症肌無力、多發性硬化（MS) '類風濕性關節炎（RA)、牛皮癬、發炎性腸病、哮喘及特發性血小板減少性紫癜在臨床上仍為人類之重要疾病0 狼瘡為涉及侵襲結締組織之抗體的自體免疫疾病。估計該疾病感染近1百萬美國人，主要為年齡介於2〇_4〇歲之間的女性。狼瘡之各種形式已知，包括（但不限於）全身性紅鲁斑狼瘡（SLE)、皮膚型紅斑狼瘡（CLE)、狼瘡腎炎（LN)e因為狼瘡自侵襲皮膚及關節發展至侵襲内部器官（包括肺、 J 心臟及腎（腎病受到主要關注）），所以未治療之狼瘡可具致 . 命性。 » k 當前，對於已診斷患有SLE之患者無法進行治癒性治療。通常，患者係以多種任何有效免疫抑制藥物治療，諸如间劑量皮質類固醇，例如強的松（prednisone)或硫嗤嘌呤 (azathioprine)或環碟醯胺（Cyei〇ph〇sphamide)。此等藥物多數對所治療之患者具有潛在有害之副作用。另外，此等免 141616.doc 201016233 疫抑制藥物干擾人產生所有抗體而非僅自身反應性抗DNA 抗體之能力。免疫抑制劑亦削弱人體抵禦其他潛在病原體之抵抗力，從而使得患者極易感染及罹患其他潛在致命性疾病，諸如癌症。在一些此等情況下，當前治療方式之副作用與疾病之持續低度表現，可造成嚴重損傷及過早死亡。某些新近治療性方案包括環磷醯胺、黴酚酸酯 (mycophenolate mofetil，MMF)、甲胺嗓呤、抗癔劑、激素治療（例如DHEA)及抗激素治療（例如抗促乳素劑溴麥角環肽（bromocriptine))。用於治療涉及抗DNA抗禮之SLE的方法亦已描述（美國專利第4,690,905號；美國專利第 6,726,909號）° 亦已使用高劑量靜脈内免疫球蛋白（IVIG)輸注來治療某些自體免疫疾病。以IVIG治療SLE迄今均得到混合效果，包括狼瘡腎炎之消退（Akashi等人，J. Rheumatology 17:3 75-379 (1990))與有時候蛋白尿及腎損傷之加重（Jordan 等人，Clin. Immunol. Immunopathol. 53: S164-169 (1989))。多發性硬化（MS)為感染腦及脊髓之中樞神經系統病症。 MS之當前治療包括皮質類固醇、β干擾素（BETAFERON®、 AVONEX®、REBIF®)、醋酸格拉替雷（glatiramer acetate) (COPAXONE®)、曱胺喋呤、硫唑嘌呤、環填醯胺、克拉曲濱（cladribine)、氣苯胺丁酸（baclofen)、替紮尼定 (tizanidine)、阿米替林（amitriptyline)、痛痙寧 141616.doc 201016233 (carbamazepine)(Berkow 等人（編），1999，見上）及那他珠單抗（natalizumab)(TYSABRI®)。類風濕性關節炎（RA)為一種慢性全身性自體免疫發炎性疾病，在美國該疾病感染者介於130萬至210萬之間。已使用各種藥物治療RA症狀。該等治療皆不能明顯中止關節破壞進程（Harris E D. Rheumatoid Arthritis: The clinical spectrum. In Textbook of Rheumatology [Kelley等人編]W B Saunders，Philadelphia第 915-990頁，1985)。 RA為病因不明之自體免疫病症。大部分RA患者罹患慢性疾病過程，即使使用當前可用之治療，仍會引起進行性關節破壞、畸形、殘疾及甚至過早死亡。每年9百萬例以上之門診（physician visit)及250,000例以上之住院治療起因於RA。RA治療之目標為預防或控制關節損傷、預防功能喪失及減少疼痛。因為在RA期間，身體產生腫瘤壞死因子a(TNFa)，所以已使用TNFa抑制劑治療RA。例示性TNFa抑制劑包括依那西普（etanercept)(以商標名ENBREL®出售）、英利昔單抗 (infliximab)(以商標名REMICADE®出售）、阿達木單抗 (adalimumab)(以商標名HUMIRA®出售）、戈利木單抗 (golimumab)(以商標名SIMPONItm出售）及塞妥珠單抗 (certolizumab pegol)(以商標名 CIMZIA®出售）。在各種情況下，投與治療劑治療RA會迅速誘發不良副作用或事件，包括（但不限於）發燒、頭痛、噁心、嘔吐、呼吸困難及血壓變化。重度及/或危急生命之感染風險增 141616.doc 201016233 加尤其與投與TNFa抑制劑有關。此等不利事件限制可給與之藥物或治療化合物之量，繼而限制可在較高藥物劑量下達成之療效。儘管努力促進RA治療，但許多患者在炎症及關節損傷方面未達成臨床上有意義之反應。另外，臨床實踐及登記之許多患者由於對當前治療之不耐受性或禁忌症而不能繼續治療。目前，對於已對包括DMARD及/或生物藥劑之治療具有不充分反應之患者而言，存在有限之治療替代方法，表明此等患者相對較大之需求未得到滿足。為試圖解決此未滿足之需求，許多團體已開發且報導各種抗CD4 mAb作為潛在治療劑（評述於Choy等人，Br. J. Rheumatol. 37:484-490，1998 中）。第一種抗CD4 mAb為鼠類抗CD4 mAb且初始臨床研究因免疫原性而中止 (Keystone, E.C., 2003, Current Opinion in Rheum. 15:253-25 8)。亦開發嵌合mAb及人類化mAb。投與嵌合mAb未展示臨床功效且與初始投藥後之不利事件相關（Keystone, E.C., 2003, Current Opinion in Rheum. 15:253-258)。向牛皮癣及類風濕性關節炎患者靜脈内投與人類化抗CD4單株抗體會誘發發燒、寒戰、低血壓及胸悶（Isaacs等人，1997 Clin Exp Immunol，110, 158-166)。此治療向下調節 CD4表現且使得循環CD4陽性T細胞數目減少，引發嚴重的外周血液 CD4 淋巴細胞減少症（Keystone，E.C.，2003，Current Opinion in Rheum. 15:253-258) ° 隨後，開發多種非消耗性或近似非消耗性（near-non- 141616-doc 201016233 depleting)抗CD4抗體且在臨床試驗中測試。該等非消耗性或近似非消耗性抗CD4抗體包括〇KTcdr4a(Schulze-Koops 等人，J. Rheumatol. 25:2065-76, 1998) ; 4162W94(Choy等人，Rheumatol. 41:1142-1148，2002);及克立昔單抗 (clenoliximab)(Idec 1 5 1 )(Reddy 等人，2000，J. Immunol. 164:1925-1933 ;美國專利第 5,756,096 號、第 6,136,310 號、第 7,338,658 號；Mould 等人，Clin Pharmacol Ther 66:246-57，1999 ; Hepburn等人，Rheum. 42:54-61，2003 ; Luggen等人，2003年歐洲風濕、病學年會（2003 Annual European Congress of Rheumatology)上提出之摘要，入!111· Rheum. Dis. ΟΡΟ 110)。此等抗體之臨床測試最多展示較短持續時間之適度療效。另外，觀察到多種不良副作用，諸如CD4淋巴細胞減少症及皮疹（Schulze-Koops等人，J. Rheumatol. 25:2065-76，1998 ; Choy 等人，Rheumatol. 41:1142-1148，2002，Mould 等人，Clin Pharmacol Ther 66:246-57，1999 ; Hepburn等人，Rheum. 42:54-61，2003 ; Luggen等人’ 2003年歐洲風濕病學年會（2003 Annual European Congress 〇f Rheumatology)上提出之摘要，Ann. Rheum. Dis. OPO110)。另一種非消耗性抗CD4單株抗體為由T〇ieRx開發之TRX j 且其在I期研究中在健康人類志願者中測試（Ng等人，

Pharm. Research 23:95-103，2006)。在該研究中，個體接受多達10毫克/公斤TRX1之單次靜脈内輸注。該TRX丨投與仍與瘙癢性皮疹有關（同上）。 141616.doc 201016233 總而0之，雖然對靜脈内所投與之非消耗性抗CD4抗體之早期臨床研究在某些安全參數及可能功效方面鼓舞人 4〜者仍經歷一些不利事件，諸如瘙疼性皮療，且靜脈内…藥方案需要高劑量及/或高頻次給與抗體以提供治療效益’以達到在所報導之試驗中觀察到任何效益之程度。 :因而’彼等抗體對於治療有效性皮下給藥方案而言不為最4的另外，所測試之使用彼等抗體之靜脈内給藥方案不可直接轉變為最佳皮下給藥方案。因此，先前所報導之非消耗性抗CD4抗體以及先前所報導之給藥方案皆無法作為基於皮下投藥之治療有效性高效給藥方案。本發明解決與先前心療有關之問題且提供由下列詳細描述而顯而易見之額外優勢。【發明内容】本發明提供治療類風濕性關節炎及其他自體免疫疾病 (包括例如狼瘡、多發性硬化（MS)及其他疾病）之有效治療方案。本發明亦提供達成治療功效、同時將毒性及不利事件降至最低之治療方法4外，本發明之治療性分子及療法相對易於投與，且在由患者自投藥之能力範_。本發明提供治療哺乳動物個體（例如人類個體）之自體免疫疾病之方法。在該等方法中，與未經㈣之非消耗性 ⑽抗體相比，皮下投與治療有效量之經修飾之該抗體可延長該抗體之血清半衰期。在整篇說明書中本發明之抗體稱呼不…可稱作「非消耗性CD4抗體」及「非消耗性 141616.doc 201016233 抗CD4抗體」。應瞭解，如本文中所用，此等術語同義且可互換。在一態樣中，抗體係以介於毫克/公斤與1〇毫克/公斤之間的劑量皮下投與。在另一態樣中，抗體係以介於〇·3毫克/公斤與7·〇毫克/公斤之間的劑量皮下投與。在另一態樣中，抗體係以選自〇 3毫克/公斤、1〇毫克/公斤、 1.5毫克/公斤、2·〇毫克/公斤、2 5毫克/公斤、3 〇毫克/公斤、3.5毫克/公斤、5 〇毫克/公斤及7〇毫克/公斤之劑量皮下投與。在另一態樣中’抗體係以固定劑量皮下投與。在某些實施例中，該固定劑量係介於150毫克與350毫克之間。在某些實施例中，該固定劑量係介於2〇〇毫克與3〇〇毫克之間。在某些實施例中，該固定劑量係介於225毫克與 275毫克之間。在某些實施例令，該固定劑量為毫克。本發明亦提供如下治療哺乳動物個體（例如人類個體）之自鳢免疫疾病之方法：向該個體皮下投與治療有效量之經心飾之非消耗性CD4抗體以延長血清半衰期（與未經修飾之該抗體相比）之首次投藥及向該個體皮下投與經修飾之非消耗性CD4抗體之至少一次隨後投藥。在一態樣中，首次投藥劑量介於0.05毫克/公斤與35毫克/公斤之間且隨後各次投藥劑量與首次投藥相同。在另一態樣中，首次投藥及隨後各次投藥劑量介於15毫克/公斤與5 〇毫克/公斤之間。在另態樣中，首次投藥及隨後各次投藥劑量選自1.5毫克/a斤、2.0毫克/公斤、3〇毫克/公斤、35毫克/公斤及 5·〇毫克/公斤。在另一態樣中’首次投藥及隨後各次投藥劑量為固定劑量。在某些實施例中，固定劑量介於丨5〇毫 141616.doc 201016233 克與350毫克之間，或介於2〇〇毫克與3〇〇毫克之間或介於225毫克與275毫克之間。在某些實施例中，該固定劑量為250毫克。在另一態樣中，隨後各次投藥係在前次投藥後第5天與第9天《間投與’或在前次投藥後第6天與第8天之間投與’或.在前次投藥後第7天投與。在—態樣中，非消耗性CD4抗體係每週―次皮下投與。在某些該等實施例中，非消耗性CD4抗體係在長期基礎（例如，至少丨年或至少2年或至少5年或至少1〇年或該個體之終生）上每週1次投與。在某些實施例中’提供治療狼瘡的方法，狼瘡包括全身 1±，、工斑狼瘡、腎外/狼瘡腎炎及皮膚型紅斑狼瘡。亦提供治療多發性硬化的方法，多發性硬化包括復發-緩解型多發性硬化、繼發-進行性多發性硬化及原發_進行性多發性硬化。本發明亦提供治療類風濕性關節炎、牛皮癬及牛皮癬性關節炎之方法。在一態樣中，該等方法提供對抗體之修飾，此修飾使該抗體與FcRn之結合增強（相對於未經修飾之抗體與FcRn之結合）’以延長血清半衰期。在某些該等實施例中，經修飾之抗體與FcRn之結合比未經修飾之抗體與FcRn之結合增強2.0倍與4.5倍之間。在其他實施例中，經修飾之抗體與以1^之結合增強3.〇倍與4〇倍之間。在其他實施例中，經修飾之抗體與FcRn之結合增強3 3倍與3 7倍之間。在一實施例中，經修飾之抗體與FcRn之結合比未經修飾之抗體與FcRn之結合增強3.5倍。在另一態樣中，與未經修飾之 141616.doc •10· 201016233 抗體的血清清除率相比，經修飾之抗體具有降低之血清清除率。在某些實施例中，經修飾之抗體之血清清除率與未經修飾之抗體之血清清除率相比降低至少38%。在某些實施例中，經修飾之抗體之血清清除率與未經修飾之抗體之血清清除率相比降低38%與59%之間。在另一態樣中，該等方法提供除含有延長企清半衰期之修飾外、亦含有進一步修飾的非消耗性CD4抗體，與未經進一步修飾之抗體相比，該進一步修飾減少與Fey受體之結合。在一實施例中，非消耗性CD4抗體之恆定區來源於人類IgGl抗體。在某些實施例中，非消耗性CD4抗體包含無糖基化之Fc區。在另一實施例中，非消耗性CD4抗體包含不含有糖基化位點之恆定區。在一態樣中，非消耗性 CD4抗體包含具有至少一個胺基酸取代之Fc區。在某些該等實施例中，非消耗性抗體包含如SEQ ID NO.: 4、5及6中所示之N297A取代。在其他實施例中，非消耗性CD4抗體進一步包含如SEQ ID NO·: 5中所示之N434A取代或如SEQ ID NO.: 6中所示之N434H取代。在一類實施例中，非消耗性CD4抗體為抗人類CD4抗體。在一態樣中，非消耗性CD4抗體為人類化抗體。在某些該等實施例中，非消耗性CD4抗體包含SEQ ID NO.: 1中所述之輕鏈胺基酸序列；SEQ ID NO.: 2中所述之輕鏈胺基酸序列；SEQ ID NO·: 1中所述之輕鏈可變區胺基酸序列； SEQ ID NO·: 2中所述之輕鏈可變區胺基酸序列；SEQ ID NO.: 1中所述之輕鏈CDR胺基酸序列；或SEQ ID NO.: 2中 141616.doc 201016233 所述之輕鏈CDR胺基酸序列。在一類實施例中，非消耗性CD4抗體包含SEQ ID NO.: 5 中所述之重鏈胺基酸序列；SEQ ID NO·: 6中所述之重鏈胺基酸序列；SEQ ID NO.: 5中所述之重鏈可變區胺基酸序列；SEQ ID NO.: 6中所述之重鏈可變區胺基酸序列；SEQ ID NO_: 5中所述之重鏈CDR胺基酸序列；或SEQ ID NO·: 6中所述之重鏈CDR胺基酸序列。在一類實施例中，非消耗性CD4抗體具有SEQ ID NO·: 1 中所述之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO.: 5中所述之重鏈胺基酸序列；SEQ ID NO.: 1中所述之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO.: 6中所述之重鏈胺基酸序列；SEQ ID NO·: 2中所述之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO.: 5中所述之重鏈胺基酸序列；或SEQ ID NO·: 2中所述之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO.: 6中所述之重鏈胺基酸序列。在一類實施例中，非消耗性CD4抗體包含SEQ ID NO··· 1 中所述之輕鏈可變區胺基酸序列及SEQ ID NO.: 5中所述之重鏈可變區胺基酸序列；SEQ ID NO.: 1中所述之輕鏈可變區胺基酸序列及SEQ ID NO·: 6中所述之重鏈可變區胺基酸序列；SEQ ID NO·: 2中所述之輕鏈可變區胺基酸序列及 SEQ ID NO.: 5中所述之重鏈可變區胺基酸序列；或SEQ ID NO.: 2中所述之輕鏈可變區胺基酸序列及SEQ ID NO·: 6中所述之重鏈可變區胺基酸序列。在一類實施例中，非消耗性CD4抗體包含SEQ ID NO·: 1 中所述之輕鏈CDR胺基酸序列及SEQ ID NO.: 5中所述之重 141616.doc -12- 201016233 鏈CDR胺基酸序列；SEQ ID NO.: 1中所述之輕鏈CDR胺基酸序列及SEQ ID NO.: 6中所述之重鏈CDR胺基酸序列； SEQ ID NO.: 2中所述之輕鏈CDR胺基酸序列及SEQ ID NO·: 5中所述之重鏈CDR胺基酸序列；或SEQ ID NO.: 2中所述之輕鏈CDR胺基酸序列及SEQ ID NO.: 6中所述之重鏈 CDR胺基酸序列。在一類實施例中，非消耗性CD4抗體包含CDRL1(SEQ ID NO.: 7) ' CDRL2(SEQ ID NO.: 8)及 CDRL3(SEQ ID NO·: 9) »在一類實施例中，非消耗性CD4抗體包含 CDRH1(SEQ ID NO.: 10)、CDRH2(SEQ ID NO.: 11)及 CDRH3(SEQ ID NO.: 12)。在一類實施例中，非消耗性 CD4抗體包含 CDRL1(SEQ ID NO.·· 7)、CDRL2(SEQ ID NO.: 8)' CDRL3(SEQ ID NO.: 9) > CDRH1(SEQ ID NO.: 10)、CDRH2(SEQ ID NO.: 11)及 CDRH3(SEQ ID NO.: 12)。在一態樣中，本發明提供如下治療哺乳動物個體（例如人類個體）之自體免疫疾病之方法：將如上所述之非消耗性CD4抗體與至少一種第二化合物組合投與。在某些實施例中，第二化合物為疾病緩解性抗風濕病藥物（diseasemodifying anti-rheumatic drug ， DMARD) 、皮質類固醇或非類固醇消炎藥（NSAID)。合適DMARD包括（但不限於）甲胺嗓呤、來氟米特（leflunomide)、柳氣石黃胺0比咬 (sulfasalazine)及經基氯唾（hydroxychloroquine)。在另一態樣中，提供治療哺乳動物個髏（例如人類個體） 141616.doc -13- 201016233 之上述自體免疫疾病的方法，該個體先前已接受至少一種生物藥劑是無效的。在某些實施例中，該生物藥劑為阿達木單抗、依那西普、英利昔單抗、戈利木單抗、塞妥珠單抗、利妥昔單抗（rituximab)或奥克麗珠單抗（ocrelizumab)。在另一態樣中’提供治療哺乳動物個體（例如人類個體）之上述自體免疫疾病的方法，該個體先前已接受至少一種 DMARD疋無效的。在某些實施例中，dmaRD為甲胺嗓呤、來氟米特、柳氮續胺n比咬或經基氣喧。本發明亦提供如下治療哺乳動物個體（例如人類個體）之自趙免疫疾病的方法：將治療有效量之經修飾以延長血清半衰期（與未經修飾之抗體相比）之非消耗性CD4抗體以〇 2 毫克/公斤與10毫克/公斤之間的劑量與間質藥物分散劑組合投與（皮下投與）。在另一態樣中，本發明提供如下治療哺乳動物個體（例如人類個體）之自體免疫疾病的方法：將治療有效量之經修飾以延長血清半衰期（與未經修飾之抗體相比）之非消耗性CD4抗體以150毫克與350毫克之間的固疋劑量與間質藥物分散劑組合投與（皮下投與）。在某些實施例中間質藥物分散劑為可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白’包括（但不限於）rHupH2〇。另外，本發明提供如下治療哺乳動物個體（例如人類個體）之自體免疫疾病的方法：以介於〇〇5毫克/公斤與35毫克/公斤之間的劑量向該個鱧皮下投與治療有效量之經修飾以延長金清半衰期（與未經修飾之抗體相比）之非消耗性 CD4抗體之首次投藥，及以與首次投藥相同之劑量向該個 141616.doc 201016233 體皮下投與該經修飾之韭咕知ω 投藥，其中“ 抗體之至少一次隨後 ^ Υ各次投藥係在前次投藥後第5天與第9天之

Sr t人投藥及隨後各次投藥皆與間質藥物分散劑組口 &、° 3夕卜’本發明提供如下治療哺乳動物個體（例如人類個體）之自體免疫疾病的方法：以介於⑽毫克與㈣毫克之間的固定劑量向該個體皮下投與治療有效量之經修飾乂延長血，月半衰期（與未經修飾之抗體相比）之非消耗性抗趙之i -人投藥，及以與首次投藥相同之劑量向該個體f下投與該經修飾之非消耗性⑽抗體之至少一次隨後投藥八中隨後各次投藥係在前次投藥後第$天與第9天之間投與’首次投藥及隨後各次投藥皆與間質藥物分散劑組合投與。在某些實施例中，間質藥物分散劑為可溶性甲性活性玻尿酸酶醣蛋白，包括（但不限於）rHupH2〇。〜樣中本發明&供_種調配物其包含治療有效量之經修飾以延長血清半衰期（與未經修飾之抗體相比）之非消耗性CD4抗體及間質藥物分散劑。在某些實施例中’調配物中之非消耗性CD4抗體之治療有效量係介於 150毫克與350毫克之間，或介於2〇〇毫克與3〇〇毫克之間，或介於225毫克與275毫克之間。在某些實施例中，調配物中之非消耗性CD4抗體之治療有效量為25〇毫克。在某些實施例中，調配物中之間質藥物分散劑為可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白，包括（但不限於）rHuPH2〇。在某些實施例中，調配物為醫藥調配物。在另一態樣中’本發明提供如下治療哺乳動物個體（例 1416l6.doc 15 201016233 如人類個體）之自體免疫疾病的方法：以介於㈣克/公斤與ίο毫克/公斤之間的劑量用自助注射裝置皮下投與治療有效量之經修飾以延長血清丰务爱，月平农期（與未經修飾之抗體相比)之非消耗性CD4抗體。在另 '態樣中，本發明提供如下治療哺乳動物個例如人_體）之自體免疫疾病的方法：以介於150毫克與350毫克之間的固定劑量用自助注射裝置皮下投與治療有效量之經修娜以延長血清半衰期（與未經修飾之抗體減）之非消耗性CD4抗體。在某些實施例中’自助注射裝置包括（但不限於）預裝藥品式注射器、微針裝置及無針注射裝置。在另一態樣中，本發明提供如下治療哺乳動物個體（例如人類個體)之自體免疫疾病的方法：以介於〇〇5毫克/公斤與35毫克/公斤之間的劑量用自助注射裝置皮下投與治療有效$之經修飾以延長血清半衰期（與未經修飾之抗體相比）之非消耗性CD4抗體之首次投藥，及以與首次投藥相同之劑量用自助注射裝置皮下投與該經修飾之非消耗性 CD4抗體之至 > —次隨後投藥，丨中隨後各次投藥係在前次投藥後第5天與第9天之間投與。在另一態樣令，本發明知:供如下/α療哺乳動物個趙（例如人類個體）之自體免疫疾病的方法：以介於150毫克與35〇毫克之間的固定劑量用自助注射裝置皮下投與治療有效量之經修飾以延長血清半衰期（與未經修飾之抗體相比）之非消耗性CD4抗體之首次投藥，及以與首次投藥相同之劑量用自助注射裝置皮下投與該經修飾之非消耗性CD4抗體之至少一次隨後繼投藥，其 141616.doc 201016233 中隨後各次投藥係在前次投藥後第5天與第9天之間投與。在某些實施例中，自助注射裝置包括（但不限於）預裝藥品式注射器、微針裝置及無針注射裝置。本發明亦提供一種用於治療哺乳動物個體之自體免疫疾病的非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，該治療包含以介於〇·2 毫克/ Α斤與10毫克/公斤之間的劑量向該個體皮下投與治 • 療有效量之該抗體。另外，本發明提供非消耗性匚〇4抗體之用途，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使企清半衰期延長之修飾，該非消耗性CD4抗體係用於製備供治療哺礼動物個體之自體免疫疾病之藥物，其中該藥物係以介於〇.2毫克/公斤與1〇毫克/公斤之間的劑量皮下投與。本發明仍進一步提供供皮下投與之調配物，其包含劑量介於 0-2毫克/公斤與10毫克/公斤之間的非消耗性cd4抗體，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之 φ 修飾。在某些實施例中，該劑量係選自1.5毫克/公斤、2.〇毫克/公斤、3.0毫克/公斤、3.5毫克/公斤及5.0毫克/公斤。本發明亦提供一種用於治療哺乳動物個體之自體免疫疾病的非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，該治療包含以介於i5〇毫克與350毫克之間的固定劑量向該個體皮下投與治療有效量之該抗體。本發明進一步提供非消耗性CD4抗體之用途’其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，該非消耗性CD4抗體係用於製備供治療哺乳 141616.doc 201016233 動物個體之自體免疫疾病之藥物，其中該藥物係以介於 150毫克與350毫克之間的固定劑量皮下投與。另外，本發明提供供皮下投與之調配物，其包含固定劑量介於15〇毫克與3 5 0毫克之間的非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾。在某些實施例中’固定劑量係介於200毫克與3〇〇毫克之間。在某些實施例中，固定劑量係介於225毫克與275毫克之間。在某些實施例中，固定劑量為250毫克。在另一態樣中，本發明提供一種用於治療哺乳動物個體之自體免疫疾病的非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該治療包含向該個體皮下投與治療有效量之該抗體，其中該抗體之投與包含首次投藥及至少一次隨後投藥，其中首次投藥劑量介於0.05毫克/公斤與35毫克/公斤之間且隨後各^ 投藥劑量與首次投藥相同，其中隨後各次投藥係在前次投藥後第5天與第9天之間投與，且其中首次投藥及隨後各次投藥係皮下投與。本發明亦提供非消耗性（：1)4抗體之用途，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使企清半衰期延長之修飾，該非消耗性CD4抗體係用於製備供治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之藥物，其中該藥物投與包含首次投藥及至少-次隨後投藥，其中首次投藥劑量介於〇〇5 毫克/公斤與35毫克/公斤之間且隨後各次投藥劑量與首次投藥相同’其中隨後各次投藥係在前次投藥後“天與第9 天之間投與，且其中首次投藥及隨後各次投藥係皮下投 141616.doc 201016233 與。本發明進一步提供供皮下投與之調配物，其包含劑量介於0.05毫克/公斤與35毫克/公斤之間的非消耗性cd4抗體’其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使丘清半衰期延長之修飾。在某些實施例中，該劑量係選自15毫克/公 . 斤、2.〇毫克/公斤、3.0毫克/公斤、3.5毫克/公斤及5.0毫克/ 公斤。在另一態樣中，本發明提供一種用於治療哺乳動物個體中之自體免疫疾病的非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使金清半衰期延長之修飾，其中該治療包含向該個體皮下投與治療有效量之該抗體，其中該杬體之投與包含首次投藥及至少一次隨後投藥，其中首次投藥係以介於150毫克與35〇毫克之間的固定劑量進行且隨後各次投藥劑量與首次投藥相同，其中隨後各次投藥係在前次投藥後第5天與第9天之間投與，且其中首次投藥及隨後各次投藥係皮下投與。本發明亦提供非消耗性CD4抗體 φ 之用途，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，該非消耗性CD4抗體係用於製備供治療 . 哺乳動物個體之自體免疫疾病之藥物，其中該藥物之投與 ' 包含首次投藥及至少一次隨後繼投藥，其中首次投藥係以 ' 介於150毫克與350毫克之間的固定劑量進行且隨後各次投藥劑量與首次投藥相同，其中隨後各次投藥係在前次投藥後第5天與第9天之間投與，且其中首次投藥及隨後各次投藥係皮下投與。在某些實施例中，固定劑量係介於2〇〇毫克與300毫克之間，或介於225毫克與275毫克之間。在某 141616.doc -19- 201016233 些實施例中，該固定劑量為250毫克。本發明亦提供一種如上所述使用之非消耗性CD4抗體，且其中該抗體係與至少一種選自DMARD、皮質類固酵及 NS AID之第二化合物組合投與。另外，本發明提供非消耗性CD4抗體用於製備上述藥物的用途，其中該藥物係與至少一種選自DMARD、皮質類固醇及NSAID之第二化合物組合投與。在另一態樣中，本發明提供非消耗性cD4抗體與至少一種選自DMARD、皮質類固醇及NSAID之第二化合物組合用於製備供治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之藝藥物的用途，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該藥物係以介於〇2毫克/公斤與1 〇毫克/公斤之間的劑量皮下投與。本發明進一步提供非消耗性CD4抗體與至少一種選自DMARD、皮質類固醇及NS AID之第二化合物組合用於製備供治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之藥物的用途’其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該藥物係以介於150毫克與350毫克之間的固定劑量皮下投與。 ® 在另一態樣中，本發明提供非消耗性CD4抗體與至少一種選自DMARD、皮質類固醇及NSAID之第二化合物組合用於製備供治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之藥物的用途，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該藥物之投與包含首次投藥及至少—次隨後投藥，其中首次投藥劑量介於〇〇5毫克/公斤與Μ毫克/ △斤之間且隨後各次投藥劑量與首次投藥相同，其中隨後 141616.doc -20- 201016233 各次投藥係在前次投藥後第5天與第9天之間投與，且其中首次投藥及隨後各次投藥係皮下投與。在某些實施例中，該劑量係選自1.5毫克/公斤、2.〇毫克/公斤、3〇毫克/公斤、3.5毫克/公斤及5.〇毫克/公斤。另外，本發明提供非= 耗性CD4抗體與至少一種選自DMARD、皮質類固醇及 NSAID之第二化合物組合用於製備供治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之藥物的用途，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該藥物之投與包含首次投藥及至少一次隨後投藥，其中首次投藥係以介於150毫克與350毫克之間的固定劑量進行且隨後各次投藥劑量與首次投藥相同，其中隨後各次投藥係在前次投藥後第5天與第9天之間投與，且其中首次投藥及隨後各次投藥係皮下投與。在某些實施例中，固定劑量係介於2〇〇毫克與300毫克之間，或介於225毫克與275毫克之間。在某些實施例中，固定劑量為250毫克。鲁在另態樣中，本發明提供一種用於治療嗜乳動物個體之自體免疫疾病的非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該治療包含將治療有效量之該抗體以介於0 2毫克/公斤與丨〇毫克/公斤之間的劑量與間質藥物分散劑組合投與（皮下投與） S亥個體。亦提供一種用於治療哺乳動物個體之自體免疫疾病的非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該治療包含以介於 0.2毫克/公斤與1〇毫克/公斤之間的劑量向該個體皮下投與 141616.doc 201016233 治療有效量之該抗體，丨中該治療進—步包含與間質藥物分散劑組合投^在另—態樣中，本發明提供—種與間質藥物分散劑組合用於治療哺乳動物個體之自體免疫疾病的非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其巾該治療包含以介於0.2 毫克/公斤與1 〇毫克/公斤之間的劑量向該個體皮下投與治療有效量之該抗體。在某些實施例中，該劑量係選自15 毫克/么斤、2.0毫克/公斤、3〇毫克/公斤、3·5毫克/公斤及 5.0毫克/公斤。在另態樣中，本發明提供一種用於治療哺乳動物個體之自體免疫疾病的非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該= 療包含將治療有效量之該抗體以介於15〇毫克與35〇毫克之間的固定劑量與間質藥物分散劑組合投與（皮下投與）該個體。亦提供一種用於治療哺乳動物個體之自體《疫疾病的非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該治療包含以介於15〇毫克與350毫克之間的固定劑量向該個體皮下投與治療有效量之該抗體，其中該治療進一步包含與間質藥物分散劑組合投藥。在另一態樣中，本發明提供一種與間質藥物分散劑組合用於治療哺乳動物個體之自體免疫疾病的非消耗性CD4抗體，其中該抗艎含有與未經修飾之抗體相比使企清半衰期延長之修飾，其中該治療包含以介於15〇毫克與 350毫克之間的固定劑量向該個體皮下投與治療有效量之 141616.doc -22- 201016233 該抗體。在某些實施例中，固定劑量係介於2〇〇毫克與3〇〇毫克之間，或介於225毫克與275毫克之間。在某些實施例中’固定劑量為250毫克。亦提供非消耗性CD4抗體用於製備供治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之藥物的用途’其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使企清半衰期延長之修飾，其中該藥物係以介於0.2毫克/公斤與10毫克/公斤之間的劑量與間質藥物分散劑組合投與（皮下投與）。在另一態樣中，本發明提供非消耗性CD4抗體與間質藥物分散劑組合用於製備供治療哺礼動物個體之自體免疫疾病之藥物的用途，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使金清半衰期延長之修飾，其中該藥物係以"於0.2毫克/公斤與1〇毫克/公斤之間的劑量皮下投與。在某些實施例中，該劑量係選自丨5毫克/公斤、 2.〇毫克/公斤、3.〇毫克/公斤、3 5毫克/公斤及5 〇毫克/公斤。亦知:供非’肖耗性CD4抗體用於製備供治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之藥物的用途，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該藥物係以介於150毫克與350毫克之間的固定劑量與間質藥物分散劑組合投與（皮下投與）。在另一態樣中，本發明提供非消耗性CD4抗體與間質藥物分散劑組合用於製備供治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之藥物的用途，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該藥物係以介於150毫克與350毫克之間的固定劑量皮下投與。 141616.doc -23. 201016233 在某些實施例中’固定劑量係介於200毫克與300毫克之間’或介於225毫克與275毫克之間。在某些實施例中，固定劑量為250毫克。在另一態樣中’本發明提供一種用於治療哺乳動物個體之自體免疫疾病的非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該治療包含向該個體投與治療有效量之該抗體，其中該抗體之投與包含首次投藥及至少一次隨後投藥，其中首次投藥劑量介於0.05毫克/公斤與35毫克/公斤之間且隨後各次投藥劑量與首次投藥相同’其中隨後各次投藥係在前次投藥後第5天與第9天之間投與，且其中首次投藥及隨後各次投藥係與間質藥物分散劑組合投與（皮下投與）。本發明亦提供非消耗性CD4抗體用於製備供治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之藥物的用途，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該藥物之投與包含首

其中隨後各次投藥係在前次投藥後第5天與第9 之β受、，且其中首次投藥及隨後各次投藥係與間質藥物分散劑組合投與（皮下投與）。在某些實施例令該劑量

之自體免疫疾病的非消耗性CD4抗體，種用於治療哺乳動物個體抗體’其中該抗體含有與 141616.doc •24- 201016233 未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該治療包含向該個體投與治療有效量之該抗體，其中該抗體2 投與包含首次投藥及至少一次隨後投藥，其中首：：藥係以介於150毫克與350毫克之間的固定劑量進行且隨後各欠投藥劑量與首次投藥相同，#中隨後各次投藥係在前次投天與第9天之間投與，且其中首次投藥及隨後各次投藥係與間質藥物分散劑組合投與（皮下投與）。本發明亦提供非消耗性CD4抗體用於製備供治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之藥物的用途，#中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修m該藥物之投與包含首次投藥及至少-次隨後投藥，其中首次投藥係以介於 150毫克與35G毫克之間的固定劑量進行且隨後各次投藥劑量與首次投藥相同，其中隨後各次投藥係在前次投藥後第 5天與第9天之間投與，且其中首次投藥及隨後各次投藥係與間質藥物分散劑組合投與（皮下投與）。在某些實施例中，固定劑量係介於200毫克與300毫克之間，或介於225 毫克與275毫克之間。在某些實施例中’固定劑量為25〇毫克。在另-態樣中，本發日錄供—種詩治療哺乳動物個體之自體免疫疾病的非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該治療包含連合自助注射裝置、以介於〇·2毫克/公斤與1〇毫克^ 公斤之間的劑量向該個體皮下投與治療有效量之該抗體。亦提供一種用於治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之方法 1416I6.doc -25- 201016233 中的非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有與未經修飾之抗趙相比使血清半衰期延長之修飾，其中該治療包含以介於 0.2毫克/公斤與1〇毫克/公斤之間的劑量向該個體皮下投與治療有效量之該抗體’其中該治療進一步包含連合自助注射裝置投藥。在另一態樣中，本發明提供一種連合自助注射裝置用於治療哺乳動物個體之自體免疫疾病的非消耗性 CD4抗體’其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該治療包含以介於〇2毫克/公斤與1 〇毫克/公斤之間的劑量向該個體皮下投與治療有效量之該抗體。在某些實施例中，該劑量係選自1 5毫克/公斤、2.0毫克/公斤、3.〇毫克/公斤、3 5毫克/公斤及5 〇毫克/ 公斤。在另一態樣中，本發明提供一種用於治療哺乳動物個體之自體免疫疾病的非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該治療包含連合自助注射裝置、以介於15〇毫克與35〇毫克之間的固疋劑量向該個體皮下投與治療有效量之該抗體。亦提供一種用於治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之方法中的非消耗性CD4抗鱧，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該治療包含以介於15〇毫克與3 5 0毫克之間的固定劑量向該個體皮下投與治療有效量之該抗體，其中该治療進一步包含連合自助注射裝置投藥。在另一瘧樣中，本發明提供一種連合自助注射裝置用於冶療哺乳動物個體之自體免疫疾病的非消耗性CD4抗 141616.doc • 26 - 201016233 體’其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾’其中該治療包含以介於150毫克與350毫克之間的固定劑量向該個體皮下投與治療有效量之該抗體。在某些實施例中，固定劑量係介於200毫克與300毫克之間，或介於225毫克與275毫克之間。在某些實施例中，固定劑量為250毫克。亦提供非消耗性CD4抗體用於製備供治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之藥物的用途’其中該抗體含有與未經修 •飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該藥物係連合自助注射裝置、以介於〇·2毫克/公斤與10毫克/公斤之間的劑量皮下投與。在另一態樣中，本發明提供非消耗性 CD4抗體連合自助注射裝置用於製備供治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之藥物的用途，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期增加之修飾，其中該藥物係以介於0.2毫克/公斤與10毫克/公斤之間的劑量皮下投與。在 φ 某些實施例中，該劑量係選自1.5毫克/公斤、2.0毫克/公斤、3.0毫克/公斤、3.5毫克/公斤及5〇毫克/公斤。亦提供非消耗性CD4抗體用於製備供治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之藥物的用途，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該藥劑係連〇自助注射裝置、以介於150毫克與350毫克之間的固定劑量皮下投與。在另一態樣中，本發明提供非消耗性CD4抗體連口自助沒射裝置用於製備供治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之藥物的用途，其令該抗體含有與未經修飾之抗 141616.doc -27- 201016233 體相比可使血清半衰期延長之修飾，其中該藥物係用於以介於150毫克與350毫克之間的固定劑量皮下投與。在某歧實施例中，固定劑量係介於200毫克與300毫克之間，或介於225毫克與275毫克之間。在某些實施例中，固定劑量為 250毫克。在另一態樣中，本發明提供一種用於治療哺乳動物個體之自趙免疫疾病的非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使血清半衰期延長之修飾，其中該治療包含向該個體投與治療有效量之該抗體，其中該抗體之投與包含首次投藥及至少一次隨後投藥，其中首次投藥劑量介於0.05毫克/公斤與35毫克/公斤之間且隨後各次投藥劑量與首次投藥相同，其中隨後各次投藥係在前次投藥後第5天與第9天之間投與，且其中首次投藥及隨後各次投藥係連合自助注射裝置皮下投與。本發明亦提供非消耗性 CD4抗體用於製備供治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之藥物的用途，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比使企清半衰期延長之修飾，其中該藥物之投與包含首次投藥及至少一次隨後投藥，其中首次投藥劑量介於〇〇5毫克/公斤與35毫克/公斤之間且隨後各次投藥劑量與首次投藥相同，其中隨後各次投藥係在前次投藥後第5天與第9天之間投與，且其中首次投藥及隨後各次投藥係連合自助注射裝置皮下投與。在某些實施例中，該劑量係選自15毫克/公斤、2_〇毫克/公斤、3·〇毫克/公斤、3 5毫克/公斤及5 〇毫克/ 公斤。 141616.doc -28- 201016233 在另釔樣中，本發明提供一種用於治療哺乳動物個體之自體免疫疾病的非消耗性CD4抗體，其t該抗體含有虚未經修飾之抗體相比可使血清半衰期延長之修飾，其中該治療包含向該個體投與治療有效量之該抗體，其中該抗體 .. 4投與包含首次投藥及至少一次隨後投藥，其中首次投藥係以介於150毫克與350毫克之間的固定劑量進行且隨後各次㈣劑量與首次投藥相同，其中隨後各次投藥係在前次投藥後第5天與第9天之間投與，且其中首次投藥及隨後各次投藥係連合自助注射裝置皮下投與。本發明亦提供非消耗性CD4抗制於製備供治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之藥物的用途，其中該抗體含有與未經修飾之抗體相比可使血清半衰期延長之修飾’其中該藥物之投與包含首次投藥及至少-次隨後投藥，其中首次投藥係以介於15〇毫克與350毫克之間的固定劑量進行且隨後各次投藥劑量與首人投藥相同，其中隨後各次投藥係在前次投藥後第$天鲁肖第9天之間投與’且其中首次投藥及隨後各次投藥係連合自助注射裝置皮下投與。在某些實施例中，固定劑量係介於200毫克與300毫克之間，或介於225毫克與275毫克之間。在某些實施例中’固定劑量為25〇毫克。【實施方式】本發明提供結合CD4之經分離抗體及使用該等抗體例如診斷或治療包括（但不限於）狼瘡、多發性硬化及類風濕性關節炎之自體免疫病症之方法。 Ϊ.某些定義 141616.doc -29- 201016233 除非另外定義’否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所瞭解之含義相同之3義。下列定義補充此項技術中之彼等定義且針對本申清案且不應納入任何相關案或不相關案，例如納入任何共同擁有之專利或申請案。類似或等效於本文中所述之任何方法及材料可用於本發明之測試實務甲，且本文中描述非限制性材料及方法。因此，本文中所用之術語僅出於描述特定實施例之目的且並不意欲具有限制性。除非上下文中另外明確規定，否則如本說明書及隨附之申請專利範圍中所使用’單數形式「一」及「該」包括複數個指示物。因此，例如，提及「一蛋白質」包括複數個蛋白質；提及「一細胞」包括細胞混合物及其類似者。本說明書及隨附之申請專利範圍中所提供之範圍包括兩個端點及端點之間的所有點。因此，例如2〇至3〇之範圍包括2.0、3 ·0及2.0與3.0之間的所有點。術語「自體免疫疾病」係指由個體自身組織或器官產生及/或針對個體自身組織或器官之疾病或病症，或其共分離（co-segregate)或表現，或由其產生之病狀。通常，自體免疫疾病可存在多種臨床及實驗標記，包括（但不限於）高7 球蛋白血症、高含量自體抗體、組織中之抗原-抗體複合物沈積物、皮質類固醇或免疫抑制治療所產生之臨床益處，及受侵襲組織中之淋巴細胞聚集體。「狼瘡」係指涉及侵襲結締組織之抗體的自體免疫疾病或病症。狼瘡之主要形式為全身性狼瘡：全身性紅斑狼瘡 141616.doc •30· 201016233 (SLE)，其有時候包括皮膚型紅斑狼瘡。如本文中所用之「狼瘡」包括SLE以及其他類型狼瘡（包括例如皮膚型紅斑狼瘡（CLE)、狼瘡腎炎（LN)、腎外狼瘡、狼瘡腦炎、小兒狼瘡、非腎狼瘡、盤狀狼瘡及禿頭狼瘡）。「多發性硬化（MS)」為一種自體免疫脫髓鞘病症。MS 一般展現復發-緩解過程或慢性進行性過程。如本文中所用，「復發-緩解型MS(RRMS)」特徵在於發病後部分或完全恢復。術語繼發-進行性MS(SPMS)」係指呈穩定進行性之 MS之復發-緩解過程。發病及部分恢復可繼續出現。術語「原發-進行性MS(PPMS)」係指自發病開始呈進行性之MS。患有PPMS之患者之症狀一般不緩解，亦即強度降低。類風漁性關節炎（RA)」係指慢性全身性自艘免疫發炎性疾病’其主要涉及多個關節之滑膜，對關節軟骨造成損 φ 傷，導致關節破壞。RA之主要表現症狀為一或多個關節疼痛、僵硬、腫脹及/或功能喪失。在本文中，「個體」通常為人類。在某些實施例中，個體為非人類之哺乳動物。例示性非人類之哺乳動物包括實驗動物、馴養動物、寵物動物、運動型動物及家畜，例如小鼠、描、狗、馬及母牛。通常，該個體適用於治療，例如自體免疫病症之治療、與組織移植有關之治療或其類似者。如本文中所用，個體之「壽合及> 命」係指開始治療後之個體 141616.doc - 31 - 201016233 剩餘壽命。個體之「治療」係指治療性處理。治療亦指預防性 (prophylactic/preventative)措施。需要治療之彼等個體包括已患有自體免疫疾病（諸如狼瘡、MS、類風濕性關節炎或發炎性腸病）之個體以及欲預防自體免疫疾病之個體。因此’該個體已診斷患有自體免疫疾病（諸如狼瘡、、類風濕性關節炎或發炎性腸病）或可易患自體免疫疾病。如本文中所用之術語「改善」係指病狀、疾病、病症或表型（包括異常或症狀）減少、減輕或消除。疾病或病症（例如自體免疫疾病，諸如狼瘡、MS、類風濕性關節炎）之r症狀」為個體所經歷且指示疾病之不同於正常結構、功能或感覺的任何病理現象或偏差。表述「治療有效量」係指有效預防、改善或治療疾病或病症（例如狼瘡、Ms、類風濕性關節炎或發炎性腸病）之量。舉例而言，抗體之r治療有效量」係指有效預防、改善或治療特定疾病或病症之抗體之量。同樣，抗體與第二化〇物組合的「治療有效量」係指以組合形式有效預防、改cr或~療特定疾病或病症之抗體量及第二化合物之量。應瞭解術語兩種化合物之「組合」不意謂該等化合物須以相互混合之形式投與。因此，使用該種組合之治療涵蓋 1匕口物之此合物或化合物之單獨投與，且包括在同日或不同日杈與。因1^ ’術語「組合」意謂個別地或以相互混合之形式使用兩種或兩種以上之化合物來治療。當將抗體與第一化0物例如組合投與個體時，抗體存在於個體中的同 14l616.doc 201016233 時，第二化合物亦存在於個體中，不論抗體與第二化合物個別地或以混合形式投與向個體。在某些實施例中，在抗體投與之前投與除抗體以外之化合物。在某些實施例中，在抗體投與之後投與除抗體以外之化合物。 CD4抗原或「CD4」為在T淋巴細胞以及某些其他細胞表面上表現之膽蛋白。CD4在此項技術中之其他名稱包括分化群（cluster of differentiation)* 及 L3T4。CD4描述於（例如）全球資訊網www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim之人類孟德爾遺傳學線上數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man database)之登錄項 186940 中。「CD4抗體」或「抗CD4抗體」或「結合CD4之抗體」係指能夠以足夠親和力結合CD4之抗體，因此該抗體適用作靶向CD4之診斷劑及/或治療劑。在某些實施例中，抗 CD4抗體與不相關非CD4蛋白之結合度比抗體與CD4結合度小約10%，如藉由（例如）放射免疫檢定（RIA)所量測。在某些實施例中，結合CD4之抗體具有£1 μΜ、$100 nM、 $10 nM、nM或$0.1 nM之解離常數（Kd)。在某些實施例中，抗CD4抗體結合在不同種之CD4中具保守性之CD4抗原決定基。如本文中所用，「CD4抗體」、「抗CD4抗體」及「抗CD4」為等效術語且可互換使用。可與「非消耗性抗CD4抗體」互換使用之「非消耗性 CD4抗體」為消耗50%以下之CD4+細胞的CD4抗體。CD4+ 細胞藉由此項技術中已知之各種方法（例如流式細胞術，例如如本文實例中所述之流式細胞術）定量。在某些實施 141616.doc •33· 201016233 例中，非消耗性CD4抗體消耗25%以下之CD4+細胞。在某些實施例中’非消耗性CD4抗體消耗10%以下之cD4+細胞。在某些實施例中，亦即在臨床配置中，用非消耗性 CD4抗體治療不會使得CD4+T-細胞數低於250個細胞/立方毫米。相反’可與「消耗性抗CD4抗艘」互換使用之「消耗性CD4抗體」為消耗50%或50%以上之CD4+細胞，或甚至75%或75%以上或90%或90%以上之CD4+細胞之CD4抗體。CD4+細胞之消耗（例如經抗體治療之個體中之循環 CD4+細胞含量降低）可由各種機制達成，諸如抗體依賴性參細胞介導之細胞毒性、補體依賴性細胞毒性 '抑制τ_細胞增殖及/或誘導Τ-細胞死亡。術語「抗體」在本文中係在最廣泛意義下使用且特別涵蓋單株抗體、多株抗體、由至少兩種完整抗體所形成之多特異性抗體（例如雙特異性抗體）、嵌合抗體、人類抗體及抗體片段’只要其展現所需生物活性（例如CD4結合）即可。抗體為包含一或多個實質上或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段所編碼之多肽的蛋白質。已知之免 © 疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε及μ恆定區基因以及無數免疫球蛋白可變區基因。「經分離」抗體為已鑑別且自其天然環境組份中分離及/ 或回收之抗體。其天然環境之污染物組份為干擾抗體之研究、診斷性或治療性使用之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白性溶質或非蛋白性溶質。在_些實施例中，抗體純化至：（1)大於抗體之95重量％且在一些實施例中，大於99 141616.doc •34· 201016233 重量/0，如藉由（例如）羅瑞法（L〇Wry meth〇d)所測定；（2) 足以獲得N-末端或内部胺基酸序列之至少15個殘基之程度，如使用（例如）旋杯式定序儀（spinning eup sequenat〇r) 所測定；或（3)同質，如在還原或非還原條件下、使用（例如）庫馬斯藍（Coomassie blue)或銀染色、藉由SDS_PAGE所測定。由於抗體天然環境之至少一種組份將不存在，故經分離抗體包括原位處於重組細胞内之抗體。然而，經分離抗體通常藉由至少一個純化步驟製備。「天然抗體」通常為約150,000道爾頓（dah〇n)之異質四聚體醣蛋白，其由兩條相同輕鏈（L)及兩條相同重鏈（H)構成。各輕鏈係藉由一個共價二硫鍵與重鏈連接，而在不同免疫球蛋白同種型之重鏈中，二硫鍵之數目可變。各重鏈及輕鏈亦具有規則間隔之鏈内二硫鍵。各重鏈在一端具有了變域（VH) ’繼之為多個怪定域。各輕鏈在一端具有可變域（vL)且在其另一端具有恆定域；輕鏈恆定域與重鏈之第鲁一恆定域對準且輕鏈可變域與重鍵可變域對準。咸信特定胺基酸殘基形成輕鏈與重鏈可變域之間的界面。「抗體片段」包含完整抗體之一部分。在某些情況下，抗體片段包含完整抗體之抗原結合區。抗體片段之實例包括Fab ' Fab’、F(ab’）2及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多特異性抗體。凡整抗體」為包含重鏈可變域及輕鏈可變域以及Fc區之抗體。抗體之「可變區」或「可變域」係指抗體之重鏈或輕鏈 141616.doc •35- 201016233 之胺基末端結構域。重鏈之可變域可稱作「VH」。輕鍵之可變域可稱作「VL」。該等結構域一般為抗體之最可變部分且含有抗原結合位點。術語「可變」係指可變域之某些部分之序列在不同抗體中廣泛不同且用於各特定抗艎特異性結合其特定抗原。然而’可變性並非均勻遍布於抗體可變域中》其集中於輕鏈可變域與重鏈可變域之三個稱作高變區之片段中。可變域之較高度保守部分稱作構架區（FR)。天然重鏈及輕鏈之可變域各包含4個FR ’該等FR主要採用β摺疊構型，經三個兩變區連接，形成使β摺疊結構連接且在一些狀況下形成β 摺疊結構之一部分的環。各鏈中之高變區藉由FR緊密結合在一起，且與其他鏈之高變區一起促成抗體之抗原結合位點之形成（參見 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版。Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，Md. (1991))。恆定域不直接涉及抗體與抗原結合，但展現各種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞介導之細胞毒性。抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個稱作「Fab」片段且各具有單一抗原結合位點之相同抗原結合片段，及殘餘「Fc」片段（其名稱反映其易於結晶之能力）。胃蛋白酶處理產生F(ab，）2片段，其具有兩個抗原結合位點且仍能夠與抗原交聯。「Fv」為含有完整抗原識別及抗原結合位點之最小抗體片段。此區由一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域緊密非共 141616.doc -36 - 201016233 價結合之二聚體組成。在此構型中，各可變域之三個高變區相互作用以界定vH-vL二聚體表面上之抗原結合位點。總體而言，6個高變區賦予抗體以抗原結合特異性。然而，甚至單一可變域（或僅包含三個對抗原具有特異性之商變區的半個Fv)亦具有識別及結合抗原之能力，儘管其親和力比完整結合位點低。

Fab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一怪定域 (CH1)。Fab'片段與Fab片段不同之處在於重鍵chi域之竣基末端處添加包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸的數個殘基。Fab'-SH為本文中對恆定域之半胱胺酸殘基帶有至少一個游離硫醇基之Fab，的命名。F(ab，)2抗體片段最初以其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab，片段對形式產生。抗體片段之其他化學偶合亦已知。其他抗體片段之更詳細描述’請參見例如Fundamental Immunology, W.E. Paul編， Raven Press, N.Y. (1999)。雖然各種抗體片段係根據對完整抗體之消化來定義，但熟習此項技術者應瞭解該等片段可以化學方式或使用重組 DNA方法重新合成。因此，如本文中所用，術語抗體包括藉由修飾整個抗體所產生或使用重組DNA方法重新合成之抗體或其片段。來自任何脊椎動物物種之抗體（免疫球蛋白）之r輕鏈」可基於其恆定域之胺基酸序列歸屬兩種明顯不同類型（稱作K及λ)之一。抗體視其重鏈之恆定域之胺基酸序列而定可歸屬不同類 141616.doc -37- 201016233 別。完整抗體存在5種主要類別：IgA、IgD、IgE、Ig(J、及IgM，且此等類別中多者可進一步分為亞類（同種型），例如 IgGl、IgG2、lgG3、IgG4、IgA及 IgA2。與不同抗體類別相對應之重鏈恆定域分別稱作α、δ、ε、7及μ。不同類別之免疫球蛋白之次單位結構及三維構型已熟知。如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上同種抗體群獲得之抗體，亦即構成該群體之個別抗體除可少量存在之可能突變（例如天然存在之突變）外皆相同。因此，修飾語「單株」指示抗體不為離散抗體之混合物的特徵。在某些實施例中，該單株抗體通常包括包含結合標靶之多肽序列之抗體，其中獲得標靶結合多肽序列的方法包括自複數個多肽序列選擇單個標靶結合多肽序列。舉例而言，選擇方法可為自複數個純系（諸如融合瘤純系池、噬菌體純系池或重組DNA純系池）中選擇獨特純系。應瞭解，所選擇之標靶結合序列可經進一步改變，以例如改良對標靶之親和力、使標靶結合序列人類化、改良其在細胞培養物中之產生、減少其活體内免疫原性、形成多特異性抗體等，且包含經改變之標靶結合序列之抗體亦為本發明之單株抗體。與通常包括針對不同決定子（抗原決定基）之不同抗體的多株抗體製劑相反，單株抗體製劑中之各單株抗體係針對抗原上之單個決定子。除特異性之外，單株抗體製劑有利之處亦在於其通常未受到其他免疫球蛋白污染。修飾语「單株」指不抗體係自實質上同種抗體群獲得之特徵且不應視作需要藉由任何特定方法產生抗體。舉例而 141616.doc -38· 201016233 言，根據本發明使用之單株抗體可由多種技術製成，包括例如融合瘤法（例如 Kohler及 Milstein，· iVaiwre，256:495-97 (1975) ; Hongo等人，14 (3): 253-260 (1995); 專尺，Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 2版 1988) ; Hammerling ^ A » Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-• 681 (Elsevier, N.Y., 1981))、重組DNA方法（參見例如美國專利第4,816,567號）、噬菌體呈現技術（參見例如(：1&^^〇11 ❿ 等人，iVaiwre，352: 624-628 (1991) ; Marks等人，/· Mo/.

Biol. 222: 581-597 (1992) ; Sidhu 等人，《/_ Μσ/.价〇/. 338(2): 299-310 (2004) ; Lee 等人，/· Mo/· Biol. 340(5): 1073-1093 (2004) ； Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)及 Lee 等人，X /www«o/·

Methods 284(1-2): 119-132(2004))及在具有編碼人類免疫球蛋白序列之部分或所有人類免疫球蛋白基因座或基因之動物中產生人類抗體或擬似人類抗體之技術（參見例如WO

1998/24893 ； WO 1996/34096 ； WO 1996/33735 ； WO 1991/10741 ; Jakobovits等人，/Voc. iVai/· iScz·· tASJ 90: 2551 (1993) ; Jakobovits 等人，Nature 362: 255-258 (1993) ; Bruggemann等人，year iw 7:33 (1993); 美國專利第 5,545,807 號、第 5,545,806 號、第5,569,825 號、第 5,625,126 號、第 5,633,425 號及第 5,661，016 號； Marks等人，10: 779-783 (1992) ; Lonberg # A > Nature 368: 856-859 (1994) ； Morrison, Nature 368: 141616.doc -39- 201016233 812-813 (1994)，Fishwild等人 ’ iVaii/re B/oiec/zwo/· 14: 845-851 (1996) ； Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)及 Lonberg及 Huszar，/wtwmwo/· 13: 65-93 (1995)) 〇本文中之早株抗體特別包括「後合」抗體（免疫球蛋白），其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或亞類之抗體的相應序列相同或同源，而鏈之剩餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或亞類之抗體以及該等抗體之片段的相應序列相同或同源，只要其展現所需生物活性即可（美國專利第4,816,567號； Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。本文中相關嵌合抗體包括primATIZED®抗體，其包含來源於非人類靈長類動物（例如舊世界猴（Old World Monkey)，諸如狒狒、恆河猴或獼猴）之可變域抗原結合序列及人類恆定區序列（美國專利第5,693,780號）。非人類（例如鼠類）抗體之「人類化」形式為含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。在一實施例中，人類化抗體為人免疫球蛋白（受體抗體），其中受體抗體之HVR殘基置換為具有所需特異性、親和力及/或容量之非人類物種（供體抗體）（諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物）之HVR殘基。在一些情況下，人免疫球蛋白之 FR殘基係置換為相應非人類殘基。此外，人類化抗體可包含不存在於受體抗體或供體抗體中之殘基。可進行此等修飾以進一步改良抗體效能。一般而言，人類化抗體將包含 141616.doc -40- 201016233 實質上所有之至少—個且通常兩個可變域，其中所有或實質上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環，且所有或實質上所有FR為人免疫球蛋白序列之FR。人類化抗體亦將視情況包含免疫球蛋白怪定區（Fe)(通常為人類免疫球蛋白恆定區）之至少一部分。欲知詳情，參見例如J〇nes 等人，編㈣ 321:522-525 (1986) ; Riechmann 等人， 332:323.329 (1988); &Presta，c„rr 办汾出〇/. 2.593-596 (1992)。亦參見例如 vaswani 及 Hamiiton，

Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)； Harris, Biochem, Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)； Hurle 及 Gross, Cwrr. 5:428-433 (1994);及美國專利第6,982,321號及第7,087,409號。「人類抗體」為一種抗體’其具有對應於人類所產生之抗體之胺基酸序列的胺基酸序列且/或已使用如本文所揭示之製備人類抗體之任何技術製備^人類抗體之此定義特別排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術產生，該等技術包括噬菌體呈現文庫（Hoogenboom 及 Winter，*/· Μσ/.丑ζ·ο/.， 227:381 (1991) ； Marks ψ Λ > J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。亦可用於製備人類單株抗體之方法描述於c〇ie等 A » Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss ’ 第 77 頁（1985) ; Boerner 等人，丄 Immunol., 147(1):86-95 (1991)中。亦參見van Dijk及van de Winkel，

Cwrr. 户/^广历^⑶/·，5: 368_74 (2〇〇1)〇人類抗體可藉 141616.doc •41 _ 201016233 由向轉殖基因動物投與抗原來製備’該轉殖基因動物經改造可回應抗原攻毒而產生該等抗體，但其内源基因座已失能，例如經免疫之轉殖基因小鼠（xenomice)(參見例如關於 XENOMOUSEtm技術之美國專利第6,075,181號及第 6,150,5 84號）。關於經由人類B-細胞融合瘤技術所產生的人類抗體，亦參見例如Li等人，Proc. iVai/· 5W. 103:3557-3562 (2006)。術語「高變區」、「HVR」或「HV」當在本文中使用時係指序列高變且/或形成結構上限定之環的抗體可變域之區域。一般而言，抗體包含六個HVR ;三者在VH中（H1、 H2、H3)且三者在VL中（LI、L2、L3)。在天然抗體中，H3 及L3呈現六個HVR中之最高多樣性，且咸信尤其H3在賦予抗體以精細特異性方面起獨特作用。參見例如Xu等人’ Immunity 13:3 7-45 (2000) ； Johnson A Wu, in Methods in Mo/ecw/ar 248:1-25 (Lo編 ’ Human Press, Totowa， NJ，2003)。實際上，僅由重鏈組成之天然存在之駱駝抗體在不存在輕鏈下亦具功能性及穩定性。參見例如Hamers-Casterman 等人，iVaiMre 363:446-448 (1993) ; Sheriff 等人，iVaiMT-e iSirwci. 5ζ·σ/. 3:733-736 (1996) 〇本文中使用且涵蓋多種HVR描述。Kabat互補決定區 (CDR)係基於序列可變性且最常使用（Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，MD. (1991))。Chothia相反指出結構環之位置 141616.doc -42- 201016233

(Chothia及 Lesk 乂 Mo/.价〇/. 196:901-917 (1987))。AbM HVR表示Kabat HVR與Chothia結構環之間的妥協，且被 Oxford Molecular之AbM抗體構模軟體使用。「接觸」HVR 係基於對可用複雜晶體結構之分析。此等各HVR之殘基註解如下。環 Kabat AbM Chothia 接觸 L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 HI H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Kabat 編號） HI H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia編號） H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

HVR可包含如下「擴展HVR」：VL中之24-36或24-34(L1)、46-56 或 50-56(L2)及 89-97 或 89-96(L3)，及 VH 中之 26-35(Η1)、50-65 或 49-65(H2)及 93-102、94-102 或 95-102(H3)。對於該等各定義而言，可變域殘基係根據Kabat 等人（同上文）來編號。「構架」或「FR」殘基為除如本文中所定義之HVR殘基以外之彼等可變域殘基。術語「如Kabat中之可變域殘基編號」或「如Kabat中之胺基酸位置編號」及其變化形式係指Kabat等人（同上）中用於編譯抗體之重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用 141616.doc -43· 201016233 此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有與可變域之FR或 HVR之縮短或插入對應的較少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可包括H2殘基52後之單個胺基酸插入（殘基 5 2a，根據Kabat)及重鏈FR殘基82後之插入殘基（例如殘基 82a、82b及82c等，根據Kabat)。可藉由在抗體序列之同源區與「標準」Kabat編號序列比對來確定特定抗體之殘基的Kabat編號。當提及可變域中之殘基（大致為輕鏈殘基1-107及重鏈殘基1-113)時，一般使用Kabat編號系統（例如Kabat等人， Sequences of Immunological Interest ，第 5 版。Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。當提及免疫球蛋白重鏈恆定區中之殘基時，一般使用「EU編號系統」或「EU索引」（例如Kabat等人（同上）中所報導之EU索引）。「如Kabat中之EU索引」係指人類 IgGl EU抗體之殘基編號。除非本文中另外說明，否則提及抗體可變域中之殘基編號意謂藉由Kabat編號系統進行殘基編號。除非本文中另外說明，否則提及抗體恆定域中之殘基編號意謂藉由EU編號系統進行殘基編號（關於EU編號，例如參見國際專利申請案第PCT/US05/047072號[國際公開案第WO 2006/073941號]之圖式）。「親和力成熟」抗體為一或多個HVR中具有一或多個可使抗體對抗原之親和力得以改良之變異（與不具有彼等變異之親本抗體相比）的抗體。在一實施例中，親和力成熟抗體對乾抗原具有奈莫耳（nanomolar)或甚至皮莫耳 141616.doc 201016233 (picomolar)親和力。親和力成熟抗體可使用此項技術中已知之某些程序產生。舉例而言，Marks等人，幻；10:779-783 (1992)描述藉由VH及VL域改組所得之親和力成熟。HVR及/或框架殘基之隨機突變描述於例如 Barbas 等人iVoc 91:3809-3813 (1994); Schier等人 Gewe 169:147-155 (1995); Yelton等人 «/· 155:1994-2004 (1995) ; Jackson 等人，/. /wwwwo/· 154(7):3310-9 (1995)及 Hawkins 等人，*/. Afo/. 226:889-896 (1992)中。術語「Fc區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈之c-末端區’包括天然序列Fc區及變異Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可不同，但人類1§0重鏈Fc區通常定義為自位置Cys226或Pro230之胺基酸殘基延伸至其羧基末端。 Fc區之C-末端離胺酸（殘基447，根據EU編號系統）可（例如）在抗體產生或純化期間移除或藉由重組式工程改造編碼抗體重鏈之核酸來移除。因此，完整抗體之組合物可包含移除所有K447殘基之抗體群、未移除&447殘基之抗體群及具有存在K447殘基之抗體與不存在K447殘基之抗體之混合物的抗鱧群。「功能性？〇區」具有天然序列Fc區之「效應功能」。例示性「效應功能」包括Clq結合、CDC、Fc受體結合、 ADCC、吞噬作帛、向τ調節細胞表面受體(例細胞受體，BCR)等功能。該等效應功能一般需要&區與結合域 (例如抗體可變域）組合且可使用如（例如）本文定義中所揭 141616.doc •45· 201016233 示之各種檢定來評定。「天然序列Fc區」包含與天然存在之Fc區之胺基酸序列一致的胺基酸序列。天然序列人類F c區包括天然序列人類 IgGl Fc區（非A及A同種異型）、天然序列人類IgG2 Fc區、天然序列人類IgG3 Fc區及天然序列人類IgG4 Fc區以及其天然存在之變異體。「變異Fc區」包含因至少一個胺基酸修飾（例如一或多個胺基酸取代）而不同於天然序列Fc區之胺基酸序列的胺基酸序列。在某些實施例中，與天然序列Fc區相比或與親本多肽之Fc區相比，變異Fc區具有至少一個胺基酸取代，例如天然序列Fc區中或親本多狀之FC區中之約1個至約1〇個胺基酸取代或約1個至約5個胺基酸取代。在某些實施例中，本文中之變異Fc區與天然序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區將具有至少約80%同源性、至少約90%同源性或至少約95%同源性。「Fc受體」或「FcR」描述一種結合抗體之Fe區的受體。在一些實施例中，FcR為天然人類FcR。在一些實施例中’ FcR為結合IgG抗體的受體（γ受體）且包括FciyRI、 FqRII及FqRin亞類之受體，包括彼等受體之對偶基因變異體及替代剪接形式。FcyRII受體包括以丫幻认（「活化受體」）及FcYRIIB(「抑制受體」），該等受體具有相似的胺基酸序列，不同之處主要在於其細胞質域。活化受體 FcyRUA在其細胞質域中含有基於免疫受體絡胺酸之活化基元（ITAM)。抑制受體Fey麵在其細胞f域中含有基於 141616.doc •46· 201016233 免疫受體酷·胺酸之抑制基元（ΙΤΪΜ)。（參見例如DaSron, Annu. Rev. Immunol. 1 5:203-234 (1997)) o FcR評述於例如 Ravetch及 Kinet，/wzwwwo/ 9:457-92 (1991); Capel 等人，/wmwwomei/zoi/·? 4:25-34 (1994)及 de Haas 等人，《/. ΙαΖ). C"«. Med. 126:330-41 (1995)中。本文中之術語「FcR」涵蓋其他FcR，包括有待於將來鑑別之FcR。術語「Fc受體」或「FcR」亦包括新生兒受體FcRn，其有時候負責將母體IgG傳遞至胎兒（Guyer等人，乂 Immunol. 117:587 (1976)及 Kim 等人，乂 Immunol. 24:249 (1994))及免疫球蛋白之穩恆調節。量測與FcRn之結合的方法已知（參見例如Ghetie及Ward.，/wmwrto/· Today 18(12):592-598 (1997) ； Ghetie 等人，Nature 15(7):637-640 (1997) ; Hinton 等人，乂 Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004) ； WO 2004/92219 (Hinton 等人））。可（例如）在表現人類FcRn之轉殖基因小鼠或經轉染之人類細胞株申，或在投與具有變異Fc區之多肽的靈長類動物中檢定人類FcRn高親和力結合多肽與人類FcRn之活體内結合及血清半衰期。WO 2000/42072(Presta)描述與FcR之結合經提高或減弱之抗體變異體。亦參見例如Shields等人，·/·价£>/. C/zew. 9(2):6591-6604 (2001)。術語「血清清除率」係指投與抗體後、該抗體自個體血清中消失之藥物動力學量度。測定清除率之各種方法已知於此項技術中，包括本文實例中所述之彼等方法。 I41616.doc -47· 201016233 抗體之「CD4結合片段」為保持結合CD4之能力的抗體片段。如所述，該片段視情況藉由消化完整抗體來產生或重新合成。「抗原決定基」為結合抗體之抗原分子之特定區域。如本文中所用，片語「實質上相似」或「實質上相同」表示兩個數值（通常，一個數值與本發明之抗體相關而另一個數值與參考/比較抗體相關）之間的相似度足夠高，以致熟習此項技術者認為兩值之間的差異在依該等值（例如 Kd值）所量度之生物學特性之範圍内具有很小或不具有生參物學及/或統計顯著性。基於參考/比較值，該兩值之間的差異例如小於約50%、小於約4〇%、小於約3〇%、小於約 20%及/或小於約。如本文所用之片語「實質上降低」或「實質上不同」表示兩個數值（通常，一個數值與分子相關且另一個數值與參考/比較分子相關）之間的差異度足夠高，以致熟習此項技術者認為兩值之間的差異在依該等值（例如Kd值）所量度之生物特性之範圍内具有統計顯著性。基於參考/比較分© 子之值’該兩值之間的差異例如大於約10%、大於約 20%、大於約30%、大於約4〇%及/或大於約50〇/〇。抗體對抗原之「結合親和力」一般係指分子（例如抗體）之單個結合位點與其結合搭配物（例如抗原）之間的非共價相互作用之總強度。除非另外指示，否則如本文所使用，「結合親和力」係指反映結合對（例如抗體與抗原）成員之間1:1相互作用之固有結合親和力。分子χ對其搭配物Y之 141616.doc •48- 201016233 親和力一般可由解離常數（Kd)表示。親和力可藉由此項技術中已知之常用方法（包括本文中所述之彼等方法）來量測。低親和力抗體一般緩慢結合抗原且容易解離，而高親和力抗體一般快速結合抗原且傾向於保持較長時間的結合。量測結合親和力之多種方法已知於此項技術中，該等任何方法可用於達成本發明之目的。下文描述特定說明性實施例β 在一實施例中’本發明之「Kd」或「Kd值」係藉由放射性標記之抗原結合檢定（RIA)來量測，該檢定係用相關抗體之Fab形式及其抗原進行，如量測Fab對抗原之溶解結合親和力之以下檢定所述：在滴定系列之未標記抗原存在下以最低濃度之[1251]標記抗原平衡Fab，接著以塗有抗 Fab抗體之板捕捉所結合之抗原（Chen等人，（1999) J. Mol Biol 293:865-881)。為確立檢定條件，用含於50 mM碳酸鈉（pH 9.6)中之5微克/毫升捕捉抗;Fab抗體（Cappel Labs)塗覆 MICROTITER® 多孑 L 板（Thermo Scientific)隔夜，且隨.後在室溫（約23°C )下用2%(w/v)牛血清白蛋白之PBS溶液阻斷 2至5小時。在無吸附劑板（Nunc #269620)中，將1〇〇 pM或 26 pM[125I]-抗原與相關Fab之連續稀釋液混合（例如，與

Presta等人，（1997) Cancer Res. 57:4593-4599 中之抗 vegf 抗體Fab-12之評定一致）。接著將相關Fab培育隔夜；然而，培育可持續一段較長之時間（例如65小時）以確保達到平衡。然後，將混合物轉移至捕捉板中以在室溫下培育 (例如1小時）。接著移除溶液且用0.1% Tween-20之PBs溶 141616.doc -49- 201016233 液洗滌該板8次。當板已乾燥時，每孔添加150微升閃爍體 (MicroScintTM-20; Packard)，且經由 Topcount® γ計數器 (Packard)對該等板計數10分鐘。產生小於或等於20%最大結合之各Fab濃度選用於競爭性結合檢定。根據另一實施例，Kd或Kd值係藉由在25°C下使用表面電漿共振檢定、使用具有約10個反應單位（RU)之固著化抗原CM5晶片的 BIAcore®-2000 或 BIAcore®-3000(BIAcore，Inc，，Piscataway NJ)量測。簡而言之，根據供應商之說明書用N-乙基-N，-(3-二曱基胺基丙基）-碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC)及N-羥基丁二醯亞胺（NHS)使羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片（CM5 BIAcore Inc.)活化。以10 mM乙酸鈉（pH 4.8)將抗原稀釋成 5微克/毫升（約0.2 μΜ)，然後以5微升/分鐘之流速注射，以獲得約1 〇個反應單位（RU)之偶合蛋白。注射抗原後，注射1 Μ乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測而言，在25°C下以約25微升/分鐘之流速注射Fab於0.05%

Tween 2〇之PBS溶液（PBST)中之2倍連續稀釋液（0 78 nly[至 500 nM)。結合速率（kon)及解離速率（koff)係使用簡單的 1:1朗谬爾結合模型（one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore®評估軟體3·2版）、藉由同時擬合結合及解離感測器圖譜來計算。平衡解離常數（Kd)係依比率koff/kon計算。參見例如 Chen等人，（1999) J. Mol Bi〇i 293:865-881。若藉由上述表面電漿共振檢定測定之結合速率超過 106 M—1 S·1，則可在濃度遞增之抗原存在下，藉由使用榮光淬滅技術量測20 nM抗抗原抗體（Fab形式）之pBS(pH 7.2) 14J6J6.doc -50- 201016233 溶液在25°C下之螢光發射強度之增加或減少（激發波長 =295奈米；發射波長=340奈米，16奈米帶通）來測定結合速率，如以分光計（諸如裝備滯流器（stop-flow)之分光光度計（Aviv Instruments)或具有授拌比色管之8000系列SLM-Aminco® 分光光度計（ThermoSpectronic))所量測。本發明之「結合速率」或「」亦可如上文所述使用 BIACORE®-2000 或 BIACORE®-3000 系統（BIAcore，Inc., Piscataway, NJ)測定。抗體對受體（例如FcR)之例如「結合」反映相對結合親和力且可以IC50值表示。測定IC50之各種方法已知於此項技術中，包括本文實例中所述之彼等方法。具有「改變」之FcR結合親和力或ADCC活性之抗體變異體為FcR結合活性及/或ADCC活性比親本或未經修飾之抗體或包含天然序列Fc區之抗體更強或更弱的抗體變異體。與親本或未經修飾之抗體相比或與包含天然序列Fc區之抗體相比，「呈現與FcR之結合增強」的抗體變異體以更高之親和力結合至少一個FcR。與親本或未經修飾之抗體相比或與包含天然序列Fc區之抗體相比，「呈現與FcR之結合減弱」的抗體變異體以更低之親和力結合至少一個 FcR。呈現與FcR之結合減弱的該等變異體可很弱或不明顯地結合FcR，例如與天然序列IgG Fc區相比、0%-20°/〇之 FcR結合，例如本文實例中所測定。與親本或未經修飾之抗體相比或與包含天然序列Fc區之抗體相比，以「更高親和力」或更強「結合親和力」結合 141616.doc -51 - 201016233

FcR(例如FcRn)之抗體變異體為當結合檢定中抗體變異體之量與親本或未經修飾之抗體之量基本上相同時，與親本或未經修飾之抗體相比以相當高之親和力結合以上所鑑別之任一種或多種FcR(例如FcRn)的抗體變異體。舉例而言，與親本或未經修飾之抗體相比，具有提高或增強之 FcR結合親和力之抗體變異體可呈現115倍與1〇〇倍之間，或1.2倍與50倍之間，或1>5倍與1〇倍之間，或2〇倍與求5倍之間的FcR結合親和力提高，其中FcR結合親和力（例如 FcRn結合親和力）係（例如）如本文實例中所揭示來測定◊在某些實施例中，結合親和力為相對親和力，其藉由相對於親本或未經修飾之抗體與受體之結合定量變異抗體與受體 (例如FcRn)之結合所測定。在某些該等實施例中，結合為 IC50值，如本文實例中所揭示。視上下文而定，「胺基酸序列」為胺基酸殘基之聚合物 (蛋白質、多肽等）或表示胺基酸聚合物之字符串。如本文中關於治療所用之術語「免疫抑制劑」係指用於抑制或遮蔽本文中經治療之哺乳動物之免疫系統的物質。其包括抑制細胞激素產生、向下調節或抑制自身抗原表現或遮蔽MHC抗原之物質。料免疫抑制劑之實㈣包括_ 基-6·芳基-5-取代之嘴咬（參見美_專利第4,665,〇77號）；非類固醇消炎藥(购D);更昔洛韋、他克莫司（taCr〇HmUS)、糖皮質激素（諸如皮質醇或搭固酮 (ald〇Ster〇ne))、消炎劑（諸如環加氧酶抑制劑、5-脂肪加氧酶抑制劑或白細胞三稀受體括抗劑）；嗓吟结抗劑，諸如 141616.doc •52- 201016233 硫唑嘌呤或黴酚酸酯（MMF);烷化劑，諸如環磷醯胺；溴隱定（bromocryptine);達那唾（danazol);達普松 (dapsone);戊二醛（其遮蔽MHC抗原，如美國專利第 4，120,649號中所述）；]^11(：抗原及]^11(：片段之抗遺傳型抗體（anti-idiotypic antibody);環孢素A ;類固醇，諸如皮質類固醇或糖皮質類固醇或糖皮質激素類似物（例如強的松、甲基強的松龍（methylprednisolone)及地塞米松 (dexamethasone));二氫葉酸還原酶抑制劑，諸如曱胺喋呤（經口或皮下）；羥基氣喹；柳氮磺胺啦啶；來氟米特；細胞激素或細胞激素受體抗體，包括抗干擾素-α、抗干擾素-β或抗干擾素-γ抗體、抗腫瘤壞死因子-α抗體（戈利木單抗、塞妥珠單抗、英利昔單抗或阿達木單抗）、抗TNF-α免疫黏附素（依那西普）、抗腫瘤壞死因子-β抗體、抗介白素-2抗體及抗IL-2受體抗體；抗LFA-1抗體，包括抗CDlla及抗CD 18抗體；異種抗淋巴細胞球蛋白；泛T抗體，包括抗 CD3 ;含有LFA-3結合域之可溶性肽（1990年7月26日公開之 WO 1990/08187);鍵激酶（streptokinase) ; TGF-β ;鏈球菌去氧核糖核酸酶（streptodornase);宿主之RNA或DNA ; FK506 ; RS-61443 ;去氧斯匹胍素（deoxyspergualin);雷帕黴素（rapamycin) ; T-細胞受體（Cohen等人，美國專利第 5,114,721 號）；T-細胞受體片段（Offner等人，Science，251: 430-432 (1991) ; WO 1990/11294 ; Ianeway，Nature，341: 482 (1989);及 WO 1991/01133);及 T-細胞受體抗體（EP 340，109)，諸如 T10B9。 141616.doc -53· 201016233 如本文中所用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞破壞之物質。該術語意欲包括放射性同位素（例如 At211、I131、I125、Y9〇、Re!86、Re】88、

Sm153、Bi212、P32及Lu之放射性同位素）、化學治療劑及毒素（諸如小分子毒素，或細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素，或其片段）。術語「細胞激素」為一個細胞群體所釋放之作為細胞間介體作用於另一細胞的蛋白質之通用術語。該等細胞激素之實例為淋巴激素；單核球激素；介白素（IL)，諸如Κ- ΐ 、 IL-Ια 、 IL-2 、 IL-3 、 IL-4 、 IL-5 、 IL-6 、 IL-7 、 IL-8 、 IL-9、IL-11、IL-12、IL-15 ;腫瘤壞死因子，諸wTNF a 或TNF-β ;及其他多肽因子，包括LIF及kh配位體（KL)。如本文中所用’術語細胞激素包括來自天然來源或來自重組細胞培養物之蛋白質及天然序列細胞激素之生物活性等效物’包括合成產生之小分子實體及其醫藥學上可接受之衍生物及鹽。術語「激素」係指多肽激素，其一般由具有導管之腺器官分泌。該等激素包括（例如）生長激素，諸如人類生長激素、N-甲硫胺酿基人類生長激素，及牛生長激素；甲狀旁腺激素’曱狀腺素；胰島素；騰島素原；鬆弛素；鬆他素原；醣蛋白激素，諸如卵泡刺激素（FSH)、曱狀腺刺激素 (TSH)及促黃體素（LH);促乳素、胎盤生乳素、小鼠促性腺激素相關肽、抑制素；活化素；繆勒管抑制物質 (mullerian-inhibiting substance);及血小板生成素。如本 141616.doc •54- 201016233 文中所用，術語激素包括來自天然來源或來自重組細胞培養物之蛋白質，及天然序列激素之生物活性等效物，其包括合成產生之小分子實體及其醫藥學上可接受之衍生物及鹽〇術語「生長因子」係指促進生長之蛋白質，且包括（例如）肝生長因子；纖維母細胞生長因子；血管内皮生長因子；神經生長因子，諸如NGF-β ;血小板衍生生長因子；轉化生長因子（TGF)，諸如TGF-α及TGF-β ;類胰島素生長因子-I及類胰島素生長因子-II ;紅血球生成素（EPO);骨生成誘導因子（osteoinductive factor);干擾素’諸如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ ;及群落刺激因子（CSF) ’諸如巨噬細胞-CSF(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF) 及粒細胞-CSF(G-CSF)。如本文中所用，術語生長因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養物之蛋白質，及天然序列生長因子之生物活性等效物，其包括合成產生之小分子實體及其醫藥學上可接受之衍生物及鹽。出於本文中之目的，「腫瘤壞死因子-a(TNF-a)」係指人類 TNF-α 分子，其包含 Pennica 等人，Nature, 312:721 (1984)或 Aggarwal等人，JBC，260:2345 (1985)中所述之胺基酸序列。本文中之「TNF-α抑制劑」為一般經由結合TNF-α且中和其活性而在某種程度上抑制TNF-a之生物功能的藥劑。本文中特別涵蓋之TNF抑制劑之實例為依那西普 (ENBREL®)、英利昔單抗（REMICADE®)、阿達木單抗 141616.doc -55- 201016233 (HUMIRA®)、戈利木單抗（SIMPONItm)及塞妥珠單抗 (CIMZIA®)。「非類固醇消炎藥」或「NSAID」之實例為乙醯柳酸 (acetyl sal icy lie acid)、布洛芬（ibuprofen)、萘普生 (naproxen)、叫丨 n朵美辛（indomethacin)、舒林酸（sulindac)、托美汀（tolmetin)(包括其鹽及衍生物）等。術語「整合素」係指受體蛋白，其允許細胞結合且回應細胞外基質且其涉及多種細胞功能，諸如創口癒合、細胞分化、腫瘤細胞之歸巢（homing)及細胞凋亡。其為涉及細胞-細胞外基質及細胞-細胞相互作用之細胞黏附受體大家族的一部分。功能性整合素由兩個跨膜醣蛋白次單位組成，稱作α及β，其係非共價結合。A次單位彼此皆共有一些同源性，β次單位亦如此。受體始終含有一條α鏈及一條 β鏈。實例包括α6β1、α3β1、α7β1、LFA-1等。如本文中所用，術語整合素包括來自天然來源或來自重組細胞培養物之蛋白質，及天然序列整合素之生物活性等效物，其包括合成產生之小分子實體及其醫藥學上可接受之衍生物及鹽。「α4-整合素」為在除嗜中性白血球以外之白血球表面上所表現之α4-β1及α4-β7整合素的α4次單位。

本文中之「整合素拮抗劑或抗體」之實例包括LFA- 1抗體，諸如可麟自Genentech之依法珠單抗（efalizumab) (RAPTIVA®);或α4整合素抗體（例如「α4-整合素抗體」為結合α4-整合素之抗體），諸如可購自Biogen之那他珠單抗 (TYSABRI®);或二氮雜環苯丙胺酸衍生物（WO 141616.doc -56- 201016233 2003/89410)、苯丙胺酸衍生物（w〇 2003/70709、WO 2002/28830、WO 2002/16329及 WO 2003/53926)、苯基丙酸衍生物（WO 2003/10135)、烯胺衍生物（WO 2001/ 79173)、丙酸衍生物（WO 2000/37444)、烷酸衍生物（WO 2000/32575)、經取代之苯基衍生物（美國專利第6,677,339 號及第6,348,463號）、芳族胺衍生物（美國專利第6,369,229 號）、ADAM去整合素域多肽（US 2002/0042368)、ανβ3整合素之抗體（ΕΡ 633945)、氮雜橋聯雙環胺基酸衍生物（WO 2002/02556)等。「皮質類固醇」係指具有模擬或增大天然存在之皮質類固醇之作用之類固醇之一般化學結構的多種合成或天然存在之物質中之任一者。合成皮質類固醇之實例包括強的松、強的松龍（包括甲基強的松龍）、地塞米松、曲安西龍 (triamcinolone)及倍他米松（betamethasone)。本文中之「B-細胞表面標記」或「B-細胞表面抗原」為一種抗原，其表現於結合其之拮抗劑所靶向之B細胞的表面上。例示性B-細胞表面標記包括CD10、CD19、CD20、 CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、 CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、 CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、 CD85及CD 86白jk球表面標記（有關描述請參見The Leukocyte Antigen Facts Book，第 2版，1997, Barclay 等人編，Academic Press, Harcourt Brace & Co.，New York)。其他B-細胞表面標記包括RP105、FcRH2、B-細胞CR2、 141616.doc -57· 201016233 CCR6 、 P2X5 、 HLA-DOB 、 CXCR5 、 FCER2 、 BR3 、 Btig 、 NAG14 、 SLGC16270 、 FcRHl 、 IRTA2 、 ATWD578、FcRH3、IRTA1、FcRH6、BCMA 及 239287。與哺乳動物之其他非B-細胞組織相比，尤其關注之B細胞表面標記優先表現於B細胞上，且可表現於前驅B細胞及成熟B細胞上。「結合B-細胞表面標記之抗體」為一種分子，其結合B-細胞表面標記後，破壞或消耗哺乳動物體内之B細胞及/或干擾一或多種B -細胞功能（例如減小或阻止B細胞所引起之體液反應）。抗體有時候能夠消耗其所治療之哺乳動物體内之B細胞（亦即降低循環B-細胞含量）。該消耗可藉由各種機制達成，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性 (ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性（CDC)，抑制B細胞增殖及/或誘導B細胞死亡（例如經由細胞凋亡）。「拮抗劑」係指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾特定或指定蛋白質之活性（包括在配位體之狀況下結合一或多個受體或在受體之狀況下結合一或多個配位體）的分子。拮抗劑包括抗體及其抗原結合片段、蛋白質、肽、醣蛋白、醣肽、醣醋、多醋、寡醣、核酸、生物有機分子、肽模擬物、藥劑及其代謝物、轉錄及轉譯控制序列及其類似物。拮抗劑亦包括蛋白質之小分子抑制劑及融合蛋白質、特異性結合蛋白質從而隔斷其與其標靶結合的受體分子及衍生物、蛋白質之拮抗劑變異體、針對蛋白質之反義分子、RNA適體及針對蛋白質之核糖核酸酶。 141616.doc -58- 201016233 「B-細胞表面標記拮抗劑」為一種分子，其結合B-細胞表面標記後，破壞或消耗哺乳動物體内之B細胞及/或干擾一或多種B-細胞功能（例如減小或阻止B細胞所引起之體液反應）。拮抗劑有時候能夠消耗其所治療之哺乳動物體内之B細胞（亦即降低循環B-細胞含量）。該消耗可經由各種機制達成，諸如ADCC及/或CDC、抑制B-細胞增殖及/或誘導B-細胞死亡（例如經由細胞凋亡）。例示性拮抗劑包括結合B-細胞標記、視情況與細胞毒性劑結合或融合的合成或天然序列肽、融合蛋白質及小分子拮抗劑。實例包括（但不限於）例如CD20抗體、BR3抗體（例如WO 0224909)、 BR3-Fc 等。 CD20抗體之實例包括：「C2B8」，其現稱作「利妥昔單抗」（「RITUXAN®」）（美國專利第5,736，137號）；可購自 IDEC Pharmaceuticals, Inc.、稱作「Y2B8」或「替伊莫單抗（Ibritumomab Tiuxetan)」（ZEVALIN®)之紀-[90]標記之 2B8鼠類抗體（美國專利第5,736，137號；2B8於1993年6月22 曰以寄存編號HB11388寄存於ATCC);可購自Corixa之鼠類IgG2a「B1」，亦稱作「托西莫單抗（Tositumomab)」，視情況標記1311以產生「131I-B1」或「碘I131托西莫單抗」抗體（BEXXARTM)(亦參見美國專利第5,595,721號）；鼠類單株抗體「1F5」（Press等人，Blood 69(2):584-591 (1987)) 及其變異體，包括「構架修補（framework-patched)」或人類化 1F5(W0 2003/002607，Leung, S. ; ATCC寄存號HB-96450);鼠類2H7及嵌合2H7抗體（美國專利第5,677,180 141616.doc -59- 201016233 號）；人類化2H7(參見例如W004/056312 ; US 20060024295) ； HUMAX-CD20™ 抗體（Genmab，

Denmark); WO 2004/035607(Teeling 等人）中所述之人類單株抗體；AME-133tm 抗體（Applied Molecular Evolution); A20抗體或其變異體，諸如嵌合或人類化A20抗體（分別為 cA20、hA20)(US 2003/0219433，Immunomedics);及可自國際白血球分型研習會（International Leukocyte Typing Workshop)得到之單株抗體L27、G28-2、93-1 B3、B-C1或 NU-B2(Valentine等人，Leukocyte Typing III (McMichael 編，第 440頁，Oxford University Press (1987)))。「疾病緩解性抗風濕藥物」或「DMARD」之實例包括羥基氣喹、柳氮磺胺吡啶、曱胺喋呤（加上經口及皮下投與之甲胺喋呤）、來氟米特、硫唑嘌呤、D-青黴胺（D-penicillamine)、金（經口）、金（肌肉内）、二甲胺四環素 (minocycline)、環孢素、葡萄球菌蛋白A免疫吸附劑，包括其鹽及衍生物等。「CTLA4」表現於活化T淋巴細胞上且涉及免疫反應之向下調節。CTLA4在文獻中之其他名稱包括細胞毒性T-淋巴細胞相關抗原4、細胞毒性T-淋巴細胞相關蛋白4、細胞分化抗原CD1 52及細胞毒性T-淋巴細胞相關顆粒絲胺酸蛋白酶4。「間質藥物分散劑」係指能夠降解間質基質之藥劑，諸如酶。術語「可溶解性中性活性玻尿酸酶醣蛋白」或 141616.doc -60- 201016233 sHASEGP」係指玻尿酸酶，一種能夠降解葡糖胺聚糖之酶。一種該玻尿酸酶為PH20，其為哺乳動物測試中之主要玻尿酸酶。PH20為中性pH活性玻尿酸酶且在生理條件下降解葡糖胺聚糖。「rHuPH20」為缺少糖基-磷脂醯肌醇部分之人類玻尿酸酶之重組及可溶解形式。「自助注射裝置」係指用於自投與（藉由患者或家庭護理者投與）治療劑之醫療裝置。自助注射裝置包括自動注射器裝置及以針對自投藥所設計之其他裳置。多個其他術語定義或以其他方式表徵於本文中。 Π.組合物及方法本發明提供結合CD4之抗體。本發明之抗體適用於 (例如）診斷或治療自體免疫病症。在某些實施例中，本發明之抗體適用於診斷或治療狼瘡、多發性硬化或類風濕性關節炎。在某些實施例中，本發明之抗體為非消耗性抗體。 CD4為主要表現於τ淋巴細胞系（包括大部分胸腺細胞及外周T細胞之亞類）之細胞表面上的醣蛋白。一些非淋巴細胞亦低量表現CD4，然而該種發散式細胞分布之功能意義未知。在成熟T細胞上，CD4經由與抗原呈遞細胞所表現之MHC II類分子相互作用而發揮共識別功能。CD4+T細胞主要構成輔助細胞亞類，其在針對病毒、細菌、真菌及寄生蟲感染之T細胞依賴性反應期間調節τ細胞及B細胞功能。在自體免疫疾病發病期間，尤其當對自體抗原之耐受瓦 141616.doc 201016233 解時，CD4 + T細胞可引起導致關節及組織破壞之發炎性反應。此等過程係由例如造血系之炎性細胞之募集、抗體、發炎性細胞激素及介體之產生及殺手細胞之活化來促成。 CD4+T細胞已涉及狼瘡之發病。舉例而言’ CD4+T細胞存在於絲球體腎炎之部位中。據報導SLE患者之CD4+T細胞在活體外對抗原具有過度反應性且抗細胞调亡。可支持 B細胞產生自體抗體之自體抗原特異性CD4+T細胞（產生 IFN-γ之效應/記憶CD4+細胞）存在於SLE患者體内。另外，觀察到MHC II類對偶基因與SLE風險之間存在強相關性。 CD4+T細胞類似地涉及MS之發病。舉例而言，CD4 +輔助T細胞涉及MS及相應實驗模型（實驗性過敏性腦脊髓炎 (EAE))之發病且耗乏T細胞之實驗動物展現發展EAE之能力喪失（Steinman等人之標題為「Method of treating autoimmune diseases that are mediated by Leu3/CD4 phenotype T cells」之USPN 4,695,459 ; Traugott等人’ (1983) 「Multiple sclerosis: distribution of T cell subsets within active chronic lesions」 Science 219:308-310 ; Arnason 等人，(1962) 「Role of the thymus in immune reaction in rats: II. Suppressive effect of thymectomy at birth on reactions of delayed (cellular) hypersensitivity and the circulating small lymphocyte」J Exp Med 116:177-186 ;及 Gonatas and Howard (1974) 「Inhibition of experimental allergic encephalomyelitis in rats severely 141616.doc -62- 201016233 depleted of T cells」 Science 186:839-841)。CD4+及 CD8+T細胞存在於MS病變中；已知兩者產生發炎性細胞激素，但兩者對發病之相對作用尚未確定。觀察到髓鞘特異性CD4+細胞在MS患者血液中之出現率增加4倍。咸信當前用於或大部分將用於治療MS之多種藥物可經由其作用於T細胞來部分地起作用；例如Tysabri®(那他珠單抗，α-4 整合素抗體）、CAMPATH®(阿來組單抗（alemtuzumab)， CD52抗體）及達利珠單抗（daclizumab)(IL-2Rcx抗體）。另外，MS風險增加與MHC II類對偶基因相關（3.6倍）且以較低程度與I類對偶基因相關（2倍）。另外，CD4+T細胞已涉及RA之發病。RA特徵在於該疾病患者之滑膜與滑膜外部位中之細胞介導免疫反應。RA 患者之滑膜組織被大量淋巴細胞及單核細胞滲入。在T-細胞滲透物中，表現CD4之彼等細胞似乎為主要亞型 (Janossy 等人，Lancet 2 (8251):839-42, 1981 ; Pitzalis 等人，Clin. Immunol. Immunopathol. 45:252-52, 1987 ;

Pitzalis等人，Eur. J. Immunol· 21:369-76, 1991)。此等T細胞顯示經由表現活化標記活化之跡象，該等活化標記諸如介白素-2(IL-2)受體、MHC II類分子及CD69。經由Τ-細胞活化及與其他炎性細胞之相關相互作用，亦存在發炎性細胞激素之產生增加。R A之動物模型已顯示T細胞在疾病表現中之重要性以及可使用抗T細胞療法緩解疾病（Chu及 Londei, J. Immunol. 157:2685-89，1996)。在 RA患者中，針對表現CD4之T細胞的先前療法（消耗性單株抗體與非消耗 141616.doc -63- 201016233 性單株抗體）已展現免疫調節效果及臨床改善之跡象（Ch〇y 等人 ’ Rheumat〇i· 41:1142-1148，2002 ; Mason等人，j. Rheumatol. 29:220_29, 2002; Luggen 等人，2〇〇3 年歐洲風濕病子年會上所提出之摘要，Ann. Rheum ο。 ΟΡΟΙ 10) ° 在態樣中，本發明提供如下治療自體免疫疾病之方法.將非消耗性CD4抗體單獨或與臨床上或實驗上用於治療自體免疫疾病之另一種化合物組合投與。如本文中所用，自體免疫疾病係指由個體自身組織或器官所產生及/ φ 或針對個體自身組織或器官之疾病或病症，或其共分離或表現，或由其產生之病狀。通常，自體免疫疾病可存在多 =臨床及實驗室標記’包括（但不限於）高7球蛋白血症、高含量自體抗體、組織中之抗原·抗體複合物沈積物、皮質類固醇或免疫抑制治療所產生之臨床益處，及受侵襲組織中之淋巴細胞聚集體。自體免疫病症可為器官特異性疾病(亦即，免疫反應係特别針對一種器官系統’諸如内分泌系統、造血系統、皮© ^心肺系統、胃腸及肝系統、腎系統、甲狀腺、耳、神 Λ肉系、·充中樞神經系統等）或可影響多個器官系統之： ^身性疾病（例如全身性紅斑性狼瘡症（SLE)、類風濕性關卽炎、多肌炎等）。例示性疾病包括自體免疫性風濕病症 (諸如類風濕性關節《、修格蘭氏症候群⑽呂代n，s 丫 r〇me)、硬皮病、狼瘡（諸如SLE及狼瘡腎炎）、多肌炎/ 皮肌A 4球蛋白血症、抗鱗脂抗體症候群及牛皮癖性關 141616.doc •64· 201016233 節炎）、自體免疫性胃腸及肝病症（諸如發炎性腸病（例如潰癌性結勝炎及克羅恩氏病（Crohn's disease))、自體免疫性胃炎及惡性貧血、自體免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎及乳糜瀉）、血管炎（諸如anca 陰性血管炎及ANCA相關性企管炎，包括丘_施二氏血管炎 (Churg-Strauss vasculitis)、韋格納氏肉芽腫病（Wegener，s granulomatosis)及顯微鏡下多脈管炎（micr〇sc〇pic polyangiitis))、自體免疫性神經病症（諸如多發性硬化、眼陣攣肌陣攣症候群、重症肌無力、視神經脊髓炎、帕金森氏病（Parkinson’s disease)、阿茲海默氏病（Alzheimeris disease)及自體免疫性多發性神經病變）、腎病症（諸如絲球體腎炎、古德帕斯徹氏症候群（Goodpasture's syndrome)及貝爾氏病（Berger's disease))、自體免疫性皮膚病症（諸如牛皮癖、風疹、蓴麻疹、尋常天疱瘡、大皰性類天疱瘡及皮膚型紅斑狼瘡）、血液病（諸如血小板減少性紫癜、血栓性血小板減少性紫癜、輸血後紫癜及自體免疫溶血性貧血）、動脈粥樣硬化、葡萄膜炎、自體免疫聽力疾病（諸如内耳疾病及聽力喪失）、貝西氏病（Behcet’s disease)、雷諾氏症候群（Raynaud’s syndrome)、器官移植及自體免疫性内分泌病症（諸如糖尿病相關自體免疫疾病，諸如胰島素依賴性糖尿病（IDDM)、艾迪森氏病（Addison’s disease)及自體免疫性甲狀腺疾病（例如格雷氏病（Graves，disease)及甲狀腺炎））。如本文中所定義之其他自體免疫病症之特定實例（在一 141616.doc • 65- 201016233 些狀況下涵蓋上列彼等病症）包括（但不限於）：關節炎（急性及慢性類風濕性關節炎，包括青少年發作型類風濕性關節炎及階段，諸如類風濕性滑膜炎、痛風或痛風性關節炎、急性免疫性關節炎、慢性發炎性關節炎、退化性關節炎、π型膠原蛋白誘發性關節炎、感染性關節炎、萊姆關節炎（Lyme arthritis)、增生性關節炎、牛皮癬性關節炎、斯蒂爾氏病（Still’s disease)、脊椎關節炎、骨關節炎、慢性進行性關節炎（arthritis chr〇nica 、變形性關節炎（arthritis deformans)、慢性原發性多關節炎、反應性關節炎、絕經期關節炎、雌激素耗盡性關節炎及強直性脊椎火/類風濕性脊椎炎）、自體免疫淋巴組織增生性疾病、發炎性過度增生性皮膚病、牛皮癬（諸如斑塊狀牛皮癬滴狀牛皮癬（gutatte psoriasis)、膿皰性牛皮癬及指甲牛皮癖）、異位性皮膚炎（包括異位性疾病，諸如花粉熱及約伯氏症候群（Job's Syndrome))、皮炎（包括接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、剝脫性皮炎、過敏性皮炎、過敏性接觸性皮炎、蓴麻疹、疱疹樣皮炎、豸幣狀皮炎、脂溢性皮炎、非特異性皮炎、原發刺激性接觸性皮炎及異位性皮炎）、X性聯高 IgM症候群（x_iinked hyper IgM syndr〇me)、過敏性眼内發炎性疾病、風疹（諸如慢性過敏性風疹及慢性特發性風療，包括慢性自體免疫性風療）、肌炎、多肌炎/皮肌炎、青少年型皮肌炎、中毒性表皮壞死松解症、硬皮病（包括全身性硬皮病）、硬化（諸如全身性硬化；多發性硬化（MS)，諸如脊髓-眼MS、原發進行性Ms(ppMS)及 141616.doc 201016233 復發緩解型MS(RRMS);進行性全身性硬化；動脈粥樣硬化；動脈硬化；播散性硬化；共濟失調性硬化）、視神經脊髓炎（NMO)、發炎性腸病（IBD)(例如克羅恩氏病；自體免疫介導之胃腸疾病；胃腸炎症；結腸炎，諸如潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis/comis ulcerosa)、顯微鏡下結腸炎、膠原性結腸炎、息肉性結腸炎、壞死性小腸結腸炎及透壁性結腸炎，及自體免疫性發炎性腸病）、腸炎、壞疽性膿皮病、結節性紅斑、原發性硬化性膽管炎、呼吸窘迫 ❹ 症候群（包括成人呼吸窘迫症候群或急性呼吸窘迫症候群 (ARDS))、腦膜炎、全部或部分葡萄膜炎症、虹膜炎、脈絡膜炎、自體免疫性血液病、移植物抗宿主疾病、血管性水腫（諸如遺傳性血管性水腫）、腦神經損害（如在腦膜炎中）、妊娠疱疹、妊娠期類天疱瘡、陰囊瘙癢、自體免疫性卵巢早衰、因自體免疫病狀所致之突發性聽力喪失、 IgE介導之疾病（諸如過敏反應及過敏性及異位性鼻炎）、腦 ❹ 炎（諸如拉斯馬森氏腦炎（Rasmussen's encephalitis)及邊緣及/或腦幹腦炎）、葡萄膜炎（諸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎肉芽腫性葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄膜炎（phac〇antigenic uveiUs)、後葡萄膜炎或自體免疫性葡萄膜炎）、伴有及不伴有腎病症候群之絲球體腎炎（GN)(諸如慢性或急性絲球體腎炎，諸如原發性gN、免疫介導之GN、膜性GN(膜性腎病）、特發性膜性GN或特發性膜性腎病、膜性增生性GN(MPGN)(包括I型及I〗型），及急進性gn(rpGN))、增生性腎炎、自體免疫性多腺内分 141616.doc -67- 201016233 泌衰竭、龜頭炎（包括漿細胞性侷限性龜頭炎（balanitis circumscripta plasmacellularis)、龜頭包皮炎）、遠心性環狀紅斑（erythema annulare centrifugum)、持久性色素異常性紅斑（erythema dyschromicum perstans)、多形紅斑、環狀肉芽腫、光澤苔蘚（lichen nitidus)、硬化萎縮性苔蘚 (lichen sclerosus et atrophicus)、慢性單純性苔蘚、小棘苔蘚、扁平苔癣、板層狀魚鱗病、表皮鬆懈性角化過度、惡變前角化症、壞疽性膿皮病、過敏性病狀及反應、食物過敏、藥物過敏、昆蟲過敏、罕見過敏性病症（諸如肥大細胞增多症）、過敏反應、濕疹（包括過敏性或異位性濕疹、皮脂缺乏性濕疹、出汗障礙性濕疹及水泡性掌跛濕療）、哮喘（諸如支氣管哮喘（asthma bronchiale/bronchial asthma) 及自體免疫性哮喘）、涉及T細胞滲入及慢性發炎性反應之病狀、針對外來抗原（諸如懷孕期間胎兒Α_Β_〇血型）之免疫反應、慢性肺炎病、自體免疫性心肌炎、白血球黏附缺陷症、狼瘡（包括狼瘡腎炎、狼瘡大腦炎、小兒狼瘡、非腎狼瘡、腎外狼瘡、盤狀狼瘡及盤狀紅斑狼瘡、禿頭狼瘡、SLE(諸如皮膚型SLE或亞急性皮膚型SLE)、新生兒狼瘡症候群（NLE)及播散性紅斑狼瘡）、青少年發作型（1型）糖尿病（包括小兒IDDM)、成人發作型糖尿病⑴型糖尿病）、自體免疫性糖尿病、特發性尿崩症、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性腎病、糖尿病性結腸炎、糖尿病性大動脈病症、與細胞激素及Τ淋巴細胞所介導之急性及遲發型超敏反應相關之免疫反應、結核病、類肉瘤病、肉芽腫病（包 141616.doc -68· 201016233 括淋巴瘤樣肉芽腫病）、粒性白血球缺乏症、血螯炎（包括諸如風濕性多肌痛及巨細胞（高安氏（Takayasu's))動脈炎之大血管血管炎、諸如川请氏病（Kawasaki's disease)及纟士節性多動脈炎/結節性動脈周圍炎之中血管血管炎、免疫血管炎、CNS血管炎、皮膚血管炎、超敏性血管炎、諸如纖維素樣壞死性血管炎及全身性壞死性血管炎之壞死性血管 ' 炎、ANCA陰性血管炎，及諸如徹奇-斯特勞斯症候群 (Churg-Strauss syndrome，CSS)之 ANCA相關性灰管炎、韋 . 格納氏肉芽腫病及顯微鏡下多脈管炎）、顳動脈炎、再生障礙性貧血、自體免疫性再生障礙性貧血、庫姆斯陽性貧血（Coombs positive anemia)、戴布二氏貧血（Diamond Blackfan anemia)、溶血性貧血或免疫溶血性貧血（包括自體免疫性溶血性貧血（AIHA))、惡性貧血（anemia perniciosa)、艾迪森氏病、純紅細胞貧血或再生障礙 (PRCA)、第八因素缺陷（Factor VIII deficiency)、A型血友病、自體免疫性嗜中性球減少症、血細胞減少症（諸如全 ❹ 血細胞減少症、白血球減少症）、涉及白血球滲出之疾 ' 病、CNS發炎性病症、阿茲海默氏病、帕金森氏病、多器 - 官損傷症候群（諸如繼發於敗血症、創傷或出血之多器官 . 損傷症候群）、抗原-抗體複合物介導之疾病、抗腎小球基底膜疾病、抗磷脂抗體症候群、單神經炎、過敏性神經炎、貝西氏病/症候群、卡斯特萊曼氏症候群（Castleman's syndrome)、古德帕斯徹氏症候群、雷諾氏症候群、修格蘭氏症候群、史蒂芬-缓森症候群（Stevens-Johnson 141616.doc -69- 201016233 syndrome)、類天疱瘡或天疱瘡（諸如大皰性類天疮瘡、瘢痕性（黏膜）類天癌療、皮膚類天疮瘡' 尋常天癌瘡、副腫瘤性天疱瘡、落葉型天疱瘡、天疱瘡黏膜類天疱瘡及紅斑性天疱瘡）、後天性大皰性表皮鬆懈、眼部炎症（包括過敏性眼部炎症，諸如過敏性結膜炎、線性IgA大皰性疾病、自體免疫誘發性結膜炎症）' 自體免疫性多内分泌病變、萊特氏病（Reiter's disease)或萊特氏症候群、因自體免疫病狀所致之熱損傷、子癲前症、免疫複合病症（諸如免疫複合性腎炎）、抗趙介導之腎炎、神經發炎性病症、多發性神經病變、慢性神經病變（諸如IgM多發性神經病變或IgM 介導之神經病變）、血小板減少症（例如心肌梗塞患者所產生之血小板減少症）（包括血检性血小板減少性紫瘋（ττρ)、輸企後紫瘕（PTP)、肝素誘發性血小板減少症及自體免疫性或免疫介導之血小板減少症（包括例如特發性血小板減少性紫癜（ITP) ’包括慢性或急性ITP))、鞏膜炎（諸如特發性角狀鞏膜炎、鞏膜外層炎）、睪丸及卵巢之自體免疫疾病（包括自體免疫性睪丸炎及卵巢炎）、原發性甲狀腺功能低下、甲狀旁腺功能減退'自體免疫性内分泌疾病（包括曱狀腺炎’諸如自體免疫性甲狀腺炎、橋本氏病 (Hashimoto's disease) '慢性甲狀腺炎（橋本氏甲狀腺炎 (Hashimoto’s thyroiditis))或亞急性曱狀腺炎）、自體免疫性曱狀腺疾病、特發性甲狀腺功能低下、格雷氏病（Graye，s disease)、格雷氏眼病（Grave’s eye disease)(眼病變或甲狀腺相關眼病變）' 多腺症候群（諸如自體免疫性多腺症候 141616.doc •70- 201016233 群’例如i型（或多腺内分泌病症候群））、副腫瘤症候群（包括神經性副腫瘤症候群，諸如蘭伯特-伊頓肌無力症候群 (Lambert-Eaton myasthenic syndrome)或伊頓-蘭伯特症候群（Eaton-Lambert syndrome)、僵硬人症候群）、腦脊趙炎 (諸如過敏性腦脊髓炎（allergic encephalomyelitis/ encephalomyelitis allergica)及實驗性過敏性腦脊髓炎 (EAE))、重症肌無力（諸如胸腺瘤相關性重症肌無力）、小

腦退化、神經性肌強直、眼陣攣肌陣攣症候群（〇MS)及感覺神經病變、多灶性運動神經病變、席漢氏症候群 (Sheehan's syndrome)、自體免疫性肝炎、慢性肝炎、狼瘡樣肝炎、巨細胞肝炎 '慢性活動性肝炎或自體免疫性慢性活動性肝炎、肺炎（諸如淋巴間質性肺炎（LIp))、阻塞性細支氣管炎（非移植）抗NSIP、古立安_白瑞症候群（GuiUain_

Barre syndrome)、貝爾氏病（IgA腎病）、特發性IgA腎病、線性IgA皮膚病、急性發熱性嗜中性皮膚病、角質層下膿皰性皮膚病、暫時性棘層鬆懈性皮膚病、硬化（諸如原發性膽汁性肝硬化及肺硬化）、自體免疫性腸病症候群、乳糜填、腹寫（麵質性腸病）、難治性腹寫、特發性腹寫、冷球蛋白血症（諸如混合型冷球蛋白企症）、肌肉萎縮性㈣硬化（ALS ;洛蓋赫里格氏病（L〇u㈣邮心咖)）、冠狀動脈疾病、自體免疫性耳病（諸如自體免疫性内耳病 (A剛、自體免疫性聽力喪失)、多軟骨炎(諸如難治性或復發性多軟骨炎)、肺泡蛋白沈積症、角膜炎(諸如柯剛氏症候群（C〇gan，s syndr〇me)/非梅毒性間質性角膜炎）、貝爾 141616.doc -71 · 201016233 氏麻痒（Bell’s palsy)、斯戚特氏疾病/症候群（Sweet，s disease/syndrome)、自體免疫性紅斑痤瘡、帶狀疱疹相關性疼痛、澱粉樣變性病、非癌性淋巴細胞增多症、原發性淋巴細胞增多症（其包括單株B細胞淋巴細胞增多症（例如良性單株γ球蛋白病及意義未明之單株丫球蛋白病， MGUS))、外周神經病變、副腫瘤症候群、通道病變（諸如癲癇症、偏頭痛、心律不整、肌肉病症、耳聾、失明、週期性麻痹及CNS通道病變）、自閉症、發炎性肌病、局灶性或節段性或局灶性節段性腎小球硬化（FSGS)、内分泌性眼病、葡萄膜視網膜炎、脈絡膜視網膜炎、自體免疫性肝病、肌肉纖維疼痛、多内分泌衰竭、施密特氏症候群 (Schmidt's syndrome)、腎上腺炎、胃萎縮、早老性癡呆、髓鞘脫失病（諸如自體免疫性髓鞘脫失病及慢性發炎性髓鞘脫失多發性神經病變）、覺斯樂氏症候群（Dressler,s syndrome)、斑禿、全禿、CREST症候群（鈣質沈著、雷諾氏現象（Raynaud’s phenomenon)、食管蠕動異常、指趾硬化及毛細管擴張）、男性及女性自體免疫性不孕症（例如因抗精子抗體所致）、混合型結缔組織疾病、查加斯氏病 (Chagas· disease)、風濕熱、反覆流產、農夫肺、多形性紅斑、心臟切開術後症候群、庫欣氏症候群（Cushing，s syndrome)、養鳥人肺、過敏性肉芽腫性脈管炎、良性淋巴細胞性脈管炎、亞伯氏症候群（Alp〇rt,s syndr〇me)、肺泡炎（諸如過敏性肺泡炎及纖維化肺泡炎）、間質性肺病、輸液反應、麻瘋病、癔疾、寄生蟲病（諸如利什曼病 141616.doc -72- 201016233 (leishmaniasis)、錐蟲病（kypanosomiasis)、血吸蟲病、細蟲病、麴菌病、山普特氏症候群（Sampter's syndrome)、卡普蘭氏症候群（Caplan's syndrome)、登革熱（dengue))、心内膜炎、心内膜心肌纖維化、彌漫性間質性肺纖維化、間質性肺纖維化、纖維性縱隔感染、肺纖維化、特發性肺纖維化、囊腫性纖維化、眼内炎、持久隆起性紅斑（erythema elevatum et diutinum)、胎兒紅血球母細胞增多症、嗜酸性筋膜炎、舒爾曼氏症候群（Shulman's syndrome)、費爾蒂氏症候群（Felty's syndrome)、絲蟲病、睫狀禮炎（諸如慢性睫狀體炎、異色性睫狀體炎、虹膜睫狀體炎（急性或慢性）或富克氏睫狀體炎（Fuch's cyclitis))、亨諾-舒萊紫癜 (Henoch-Schonlein purpura)、人類免疫缺乏病毒（HIV)感染、SCID、後天免疫缺乏症候群（AIDS)、艾柯病毒感染 (echovirus infection)、膿毒病（全身性發炎反應症候群 (SIRS))、内毒素血症、腺腺炎、甲狀腺中毒症、細小病毒感染、風疹病毒感染、疫苗接種後症候群、先天性風疹感染、艾伯斯坦-巴爾病毒感染（Epstein-Barr virus infection)、腿腺炎、伊文氏症候群（Evan's syndrome)、自體免疫性腺衰竭、西德納姆氏舞蹈病（Sydenham's chorea)、鏈球菌感染後腎炎、血栓閉塞性脈管炎、甲狀腺毒症、脊髓療（tabes dorsalis)、脈絡膜炎、巨細胞多肌痛、慢性超敏性肺炎、結膜炎（諸如春季結膜炎、乾躁性角膜結膜炎及流行性角膜結膜炎）、特發性腎病症候群、微小腎病變、良性家族性及缺血-再灌注損傷、移植器官 141616.doc •73· 201016233 再/霍注、視網膜自體免疫、關節炎、支氣管炎、慢性阻塞性氣管疾病/慢性阻塞性肺病、矽肺病、口瘡、鶴口瘡口炎（aphthous stomatitis)、動脈硬化性病症（腦血管功能不全）（諸如動脈硬化性腦病及動脈硬化性視網膜病變）、精子生成缺乏症（aspermiogenese)、自體免疫性溶血、波克氏病 (Boeck's disease)、冷球蛋白血症、杜僕特倫氏攣縮 (Dupuytren's contracture)、晶狀體過敏性眼内炎 (endophthalmia phacoanaphylactica)、過敏性腸炎、麻瘋結節性紅斑、特發性面神經麻痹、慢性疲勞症候群、風濕性發熱、哈曼-里查氏病（Hamman-Rich，disease)、感覺神經性聽力喪失、陣發性血紅蛋白尿症、性腺機能減退、侷限性回腸炎、白血球減少症、傳染性單核細胞增多症、橫貫性脊髓炎、原發性特發性黏液水腫、腎病、交感性眼炎、新生兒眼炎、視神經炎、肉芽腫性睪丸炎、胰腺炎、急性多神經根炎、壞疽性膿皮病、曲梵氏曱狀腺炎（Quervain，s thyreoiditis)、後天性脾萎縮、非惡性胸腺瘤、淋巴樣濾泡性胸腺炎、白癲風、中毒性休克症候群、食物中毒、涉及 τ細胞滲入之病狀、白血球黏附缺陷症、與細胞激素及7淋巴細胞所介導之急性及遲發型超敏反應相關之免疫反應、涉及白血球滲出之疾病、多器官損傷症候群、抗原-抗體複合物介導之疾病、抗腎小球基底膜疾病、自體免疫性多内分泌腺病、卵巢炎、原發性黏液水肢、自體免疫性萎縮性胃炎、風濕病、混合型結締組織疾病、腎病症候群、狹島炎、多内分泌腺衰竭、自體免疫多腺症候群（包括j型多 141616.doc • 74· 201016233 腺症候群）、成人發作型特發性甲狀旁腺功能減退 (AOIH)、心肌症（諸如擴張型心肌症）、後天性大皰性表皮鬆懈（EBA)、血色素沈著病、心肌炎、腎病症候群、原發性硬化性膽管炎、化膿性或非化膿性竇炎、急性或慢性竇炎、篩骨、額骨、上頜骨或蝶骨竇炎、過敏性竇炎、嗜伊紅Α球相關病症（諸如嗜伊紅血球增多症、肺浸潤嗜伊紅血球增多症、嗜伊紅血球增多性肌痛症候群、羅弗勒氏症馨候群（Loffler’s Syncirome)、慢性嗜伊紅血球肺炎、熱帶肺嗜酸性粒細胞增多症、支氣管肺炎性麴菌病、麴菌腫或含有嗜伊紅企球之肉芽腫）、過敏症、脊椎關節病、血清陰性脊椎關節炎、多内分泌腺自體免疫疾病、硬化性膽管炎、鞏膜炎、鞏膜外層炎、慢性皮膚黏膜念珠菌病、布魯頓氏症候群（Bruton’s Syndrome)、嬰兒暫時性低丫球蛋白血症、威斯科特_奧爾德里奇二氏症候群（Wiskott-Aldrich syndr〇me)、共濟失調毛細血管擴張症候群、血管擴張粵症、與膠原蛋白疾病相關之自體免疫病症、風濕病（諸如慢性關節風濕病）、淋巴結炎、血壓反應下降、血管功能障礙、組織損傷、心血管局部缺血、痛覺過敏、腎局部缺血、腦局部缺血，及伴隨血管形成之疾病、過敏性超敏性 j症、絲球體腎炎、再灌注損傷、缺血再灌注病症、心肌或其他組織再灌注損傷、淋巴瘤性氣管支氣管炎' 發炎性皮膚病、伴有急性發炎成分之皮膚病、多器官衰竭、大皰 *生疾病、腎皮質壞死、急性化腹性腦膜炎或其他中棍神經系統發炎性病症、眼部及眼窩發炎性病症、粒細胞輸血相 141616.doc -75- 201016233 關症候群、細胞激素誘發之毒性、嗜眠病、急性嚴重性炎症、k性難治性炎症、腎盂炎、動脈内膜增生、消化性潰瘍、瓣膜炎’及子宮内膜異位症。在態樣中，本發明亦提供如下治療狼瘡（包括SLE及狼瘡腎炎）之方法：將非消耗性CD4抗體單獨或與臨床上或實驗上用於治療狼瘡之另一種化合物組合投與。本發明之另一態樣提供如下治療狼瘡腎炎（包括中期至晚期疾病）之方法.投與使腎功能改善及/或使蛋白尿或活性尿沈殿減少的非消耗性CD4抗體。在一態樣中，個體適於狼瘡治療，包括SLE或狼瘡腎炎之治療。出於本文中之目的，該適合個體為經歷或已經歷狼瘡之一或多個徵兆、症狀或其他指標或已診斷患有狼瘡 (無論例如新近經診斷、先前經診斷而新近發作或長期類固醇依賴而新近發作）或處於發展狼瘡之風險的個體。適於狼瘡治療之個體可視情況鑑別為經腎活組織檢查所篩檢及/或使用偵測自體抗體之檢定所篩檢之個體，諸如下文所說明之個體，其中以定性及/或定量方式來評定自體抗體產生。在適於SLE治療之患者的狀況下，SLE可與抗核抗體、循環免疫複合物產生及補體系統活化相關。在2〇歲與60歲之間的女性中，SLE具有約七百分之一之發病率。 SLE可感染任何器官系統且可引起嚴重組織損傷。在SLE 中存在特異性不同之多種自體抗體。SLE患者常常產生具有抗DNA、抗R〇及抗血小板特異性且能夠引發疾病（諸如絲球體腎炎、關節炎、漿膜炎、新生兒心臟傳導完全阻塞 141616.doc -76- 201016233 及血液異常）之臨床特徵的自體抗體。此等自體抗體亦可能與中柩神經系統失調有關。Arbuckle等人描述自體抗體產生後，SLE臨床發作（Arbuckle等人，（2003) N. Engl. J. Med. 349(16):1526-1533)。對雙股天然DNA具有免疫反應性之抗體的存在常用作SLE之診斷標記。與SLE相關之例示性該等自體抗體為抗核抗體（Ab)、抗雙股DNA (dsDNA)Ab、抗Sm Ab、抗細胞核核糖核蛋白Ab、抗鱗脂 Ab、抗核糖體 P Ab、抗 Ro/SS-A Ab、抗 Ro Ab及抗 La Ab。可如此項技術中所確定來診斷狼瘡（及判定是否適合治療）。舉例而言，可根據美國風濕病學會（American College of Rheumatology，ACR)之現行標準來診斷SLE。如 Brunetta之標題為「Method for treating lupus」之美國專利申請公開案2006/0024295中所應用，活動性疾病可藉由一種大不列顛群島狼瘡活動性組織（British Isles Lupus Activity Group，BILAG)之「A」標準或 2個 BILAG「B」標準來定義。用於診斷SLE之一些徵兆、症狀或其他指標 (依據 Tan等人，（1982)「The 1982 Revised Criteria for the Classification of SLE」Arth Rheum 25:1271-1277所改編）可為顴部皮疹（諸如面頰上之皮疹、盤狀皮疹或凸起紅斑）、光敏感性（諸如對日光反應引起皮疹形成或增加）、通常不疼痛之口部潰瘍（諸如鼻或口之潰瘍）、關節炎（諸如涉及兩個或兩個以上外周關節之非侵蝕性關節炎（關節周圍之骨骼未破壞之關節炎）、漿膜炎、胸膜炎或心包炎、腎病（諸如尿中蛋白質過量（蛋白尿，每天大於0.5公克（g)或 141616.doc -77- 201016233 測試棒上3+)及/或細胞管型（來源於尿及/或白細胞及/或腎小管細胞之異常成份））、神經學徵兆、症狀或其他指標、癲癇發作（抽搐）及/或精神病（在不存在藥物下）或已知造成該等影響之代謝障礙及血液學徵兆、症狀或其他指標（諸如溶血性貧血或白血球減少症（每立方毫米白細胞計數低於4,000個細胞）或淋巴細胞減少症（每立方毫米少於個淋巴細胞）或血小板減少症（每立方毫米少於1〇〇,〇〇〇個血小板）。須在2個或2個以上時刻偵測白血球減少症及淋巴細胞減少症。須在已知誘發血小板減少症之藥物不存在下偵測血小板減少症。本發明不限於狼瘡之此等徵兆、症狀或其他指標。腎臟狼瘡加劇可定義為1)在1個月期間内Scr增加>3〇%或 2)腎病症候群復發或出現或3)尿蛋白増加3倍（基線蛋白尿大於1公克/24小時）’或可如美國專利申請公開案2〇〇6/ 0024295中所說明來定義。對於狼瘡腎炎而言，治療合格性之憑據可為如腎臟標準所定義之腎炎發作，如美國專利申請公開案2006/0024295中所說明。如 Weening 專人（2〇〇4) 「The classification of glomerulonephritis in systemic lupus erythematosus revisited」Kidney International 65:521-530 中所述，狼瘡腎炎係視情況診斷及分類為例如ISN/WHO第I類、第II類、第III類、第IV類、第V類或第VI類狼瘡腎炎。本發明之另一態樣提供如下治療多發性硬化（MS)之方法：將非消耗性CD4抗體視情況與臨床上或實驗上用於治 141616.doc -78- 201016233 療MS之另一種化合物組合投與。MS為咸信具有τ淋巴細胞依賴性之自體免疫性髓鞘脫失病症^ MS—般展現復發-緩解過程或慢性進行性過程。復發_緩解型MS(RRMS)特徵在於發病後部分或完全恢復。繼發_進行性MS(SPMS)為呈穩定進行性之復發-緩解過程。發病及部分恢復可繼續出現。原發-進行性MS(PPMS)自發病開始呈現進行性。 PPMS患者之症狀一般不緩解，亦即強度降低。 MS之共同徵兆及症狀包括一或多個肢端、軀幹或一側面部感覺異常；腿或手無力或笨拙；或視覺障礙（諸如一隻眼睛部分失明及疼痛）、視覺模糊或盲點。其他共同早期症狀為引起複視（dipl〇pia)之眼麻痹、一或多個肢端暫時性無力、肢體輕微僵硬或反常易疲勞性、輕微步態失調、膀胱控制困難、眩暈及輕度情感障礙（Berk〇w等人，（編）， 1999, Merck Manual of Diagnosis and Therapy :第 17版）。 MS之病因未知，然而病毒感染、遺傳易感性、環境及自 φ 體免疫似乎皆會促成該病症。MS患者之病變含有滲入之主要T淋巴細胞介導之小膠質細胞及滲入性巨噬細胞。 CD4+T淋巴細胞為此等病變處存在之主要細胞類型。病變之標st'為MRI掃描中所見之斑塊，與常見白質明顯有別之髓鞘脫失區域。Ms斑塊之組織學表現會隨疾病之不同階段而變化。在活動性病變中，血腦障壁受損，從而允許血清蛋白外滲進入細胞外間隙中。炎性細胞可見於血管周圍官及整個白質中。CD4-T-細胞，尤其Thl積聚於斑塊邊緣處之毛細血管後小靜脈周圍且亦散布於白質中。在活 141616.doc -79· 201016233 動性病變中，亦已觀察到黏附分子及淋巴細胞及單核細胞活化標記（諸如IL2-R及CD26)上調。活動性病變中之髓鞘脫失不伴有寡樹突神經膠質細胞之破壞。相反，在疾病之慢性階段期間，病變特徵為寡樹突神經膠質細胞損失及因此血液中存在髓鞘寡樹突神經膠質細胞醣蛋白（MOG)抗體。本發明之另一態樣提供如下治療RA之方法：將非消耗性CD4抗體視情況與臨床上或實驗上用於治療RA之另一種化合物組合投與。在某些態樣中，提供如下治療RA之方法：將非消耗性CD4抗體視情況與臨床上或實驗上用於治療RA之另一種化合物組合投與先前接受至少一種生物治療性化合物治療是無效的患者。本發明之另一態樣提供如下治療RA之方法：將非消耗性CD4抗體視情況與臨床上或實驗上用於治療RA之另一種化合物組合投與先前接受至少一種疾病緩解性抗風濕藥物（DMARD)治療是無效的患者。類風濕性關節炎（RA)為一種慢性全身性自體免疫發炎性疾病，其主要涉及多個關節滑膜，對關節軟骨造成損傷，導致大部分患者關節破壞及最終殘疾。（Lawrence等人， Arthritis Rheum. 41:778-99，1998 ; Helmick等人，Arthritis Rheum. 58(1):15-25, 2008 ; Pincus等人，Arthritis Rheum. 27(8):864-72, 1984 ; Corbett 等人，Br. J. Rheumatol. 32(8):717-23, 1993)。RA之主要表現症狀為疼痛、僵硬、腫脹及功能喪失（Bennett J C, The etiology of rheumatoid 141616.doc • 80 - 201016233

arthritis, Textbook of Rheumatology [Kelley W N, Harris E D, Ruddy S，Sledge C B ’ 編]W B Saunders, Philadelphia第 879-886頁，1985)。發病機制具有T淋巴細胞依賴性且與類風濕因子（針對自身IgG之自體抗體）之產生相關，因此形成在關節流體及血液中達到高含量之免疫複合物。關節中之該等複合物可誘導淋巴細胞及單核細胞大量滲入滑膜中及隨後明顯之滑液變化，隨著大量嗜中性白血球之添加，類似細胞滲入關節間隙/流體中。所感染之組織主要為關節，常常呈對稱型。然而關節外疾病亦以兩種主要形式出現。一種形式為形成關節外病變伴不間斷進行性關節疾病及肺纖維化、血管炎及皮膚潰瘍之典型病變。關節外疾病之第二種形式為所β的費爾蒂氏症候群（Feltyis syndr〇me)，其在RA疾病過 ❿ 程後期㈣，有時在關節疾病已變為遏制狀態之後出現，且包括嗜中性白血球減少症、血小板減少症及脾腫大之存在此形式可伴隨多個器官之血管炎，並形成梗塞、皮膚 f瘍及壞殖。患者通常亦在皮下組織巾形成覆蓋所感染關節之類風濕結節；料結節後期具有由混合炎性細胞滲透 :所包圍之壞死中心。RA中可出現之其他表現包括：心、胸膜九、冠狀動脈炎、出現肺纖維化之間質性肺 ''主乾躁性角膜結膜炎及類風濕結節。牲恭年陵14關節炎為常常在年齡小於16歲時開始之慢性性疾病。其表型與RA具有某些相似性；呈類 ’’’、陽眭之—些患者歸類為青少年類風濕性關節炎。 141616.doc 201016233 該疾病細分為3個主要類別：少關節型（pauciartieular)、多關節型及全身型。關節炎可為嚴重的且通常具破壞性且導致關節僵硬及生長遲緩《其他表現可包括慢性前葡萄膜炎及全身性澱粉樣變性病。脊椎關節病為具有一些共同臨床特徵且與HLA_B27基因產物之表現共同相關之一組病症。例示性病症包括：強直性脊椎炎、萊特氏症候群（反應性關節炎）、發炎性腸病相關關節炎、牛皮癬相關脊椎炎、青少年發作型脊椎關節病及未分化型脊椎關節病。區別特徵包括伴有或不伴有脊椎炎之骶髂關節炎；發炎性不對稱關節炎；與HLA_B27(血清學疋義之I類MHC之HLA-B基因座之對偶基因）相關；眼部炎症及缺乏與其他類風濕性疾病相關之自體抗體。涉及誘發疾病之最關鍵細胞為CD8+T淋巴細胞’該細胞靶向由 I類MHC分子所呈遞之抗原。CD8+T細胞可針對1類1^^對偶基因HLA-B27反應，恰如其為子所表現之外源肽。已假設HLA-B27之抗原決定基可模擬細菌或其他微生物抗原之抗原決定基且從而誘導CD8+T細胞反應。在某些情況下，若患者滿足美國風濕病學會（acr)之某些標準’則診斷為RA。標準包括在最大改善之前晨起關節中及周圍僵硬持續至少i小時；3個或3個以上關節區域之關節炎：至少3個關節區域同時具有醫師所觀察到之軟組織腫脹或流體（不僅僅骨過度生長）；14個可能關節區= (右及左）為近側指骨間（PIP)關節、掌指（MCp)關節、腕關節、肘關節、膝關節、踝關節及腋趾(Μτρ)關冑；手關節 141616.doc •82· 201016233 之關節炎：以上腕關節、MCP關節或pip關節中至少一個關節區域腫脹’對稱關節炎：同時涉及身體兩側之相同關節區域（以上3個或3個以上關節區域之關節炎）（不必絕對對稱，涉及雙側PIP、MCP或MTP關節為可接受的）；類風濕結節：醫師所觀察到之骨隆凸或伸肌表面上或近關節區中之皮下結節，血清類風濕因子：藉由任何方法證明血清類風濕因子之量異常：在低於5%的正常對照患者中血清類風濕因子呈陽性即為異常；放射照相變化：類風濕性關節 ❹ 炎之典型放射照相變化（後前手及腕X-射線），其須包括侷限於或最緊鄰於所涉及關節之侵餘或明確骨脫j弓（僅骨關節炎變化不夠條件）。若患者滿足上述標準中之至少四者，則通常診斷為RA。 R A之初始治療通常包括投與一或多種下列藥物：非類固醇消炎藥（NSAID)、糖皮質激素（經由關節注射）及低劑量強的松。參見"Guidelines for the management of ❹ rheumatold arthritis，" Arthritis & Rheumatism 46(2): 328- 346(2002年2月）。大多數新近診斷為rA之患者在診斷3個月内開始進行疾病緩解性抗風濕藥物（dn1ARD)治療。常用於RA之DMARD為羥基氣喹、柳氮磺胺吡啶、甲胺喋呤（加上經口及皮下投與曱胺喋呤）、來氟米特、硫唑嘌呤、D-青黴胺、金（經口）、金（肌肉内）、二曱胺四環素、環孢素'葡萄球菌蛋白A免疫吸附劑。在某些情況下，已使用TNFa抑制劑治療RA。例示性 TNFa抑制劑包括依那西普（以商標名ENBREL®出售）、英 141616.doc 83 - 201016233 利昔單抗（以商標名REMIC ADE®出售）、阿達木單抗（以商標名HUMIRA®出售）、戈利木單抗（以商標名SIMPONITMa 售）及塞妥珠單抗（以商標名CIMZIA®出售）。依那西普（以商標名ENBREL®出售）為在美國獲准用於治療活動性RA之可注射藥物。依那西普結合TNFa且用以自關節及血液移除大部分TNFa，從而防止TNFa促進炎症及其他類風濕性關節炎症狀。依那西普為由人類75 kD(p75) 腫瘤壞死因子受體（TNFR)之細胞外配位體結合部分與人類 IgGl之Fc部分連接而組成的「免疫黏附素」融合蛋白。該藥物已與包括嚴重感染及膿毒病之消極副作用及諸如多發性硬化（MS)之神經系統病症有關。參見例如 www.remicade-infliximab.com/pages/enbrel_embrel.html。以商標名REMICADE®出售之英利昔單抗為指定用於治療R A及克羅恩氏病之免疫抑制藥物。英利昔單抗為結合 TNFa且藉由靶向及結合弓|起炎症之TNFa而減輕體内炎症之嵌合單株抗體。英利昔單抗已與某些致命反應（諸如心臟衰竭）及感染（包括結核病）以及引起MS之髓鞘脫失有關。參見例如 www.remicade-infliximab.com。在2002年，阿博特實驗室（Abbott Laboratory)得到FDA 批准銷售阿達木單抗（以商標名HUMIRA®出售）（先前稱作 D2E7)。阿達木單抗為結合TNFa之人類單株抗體且獲准用於在對於一或多種傳統疾病緩解性DMARD已無足夠反應、患有中度至重度活動性RA之成人中減輕徵兆及症狀且抑制結構破壞進程。 141616.doc -84- 201016233 2009年 4月，Centocor Ortho Biotech Inc.得到 FDA 批准銷售戈利木單抗（以商標名SIMPONItm出售）以用於患有中度至重度RA、牛皮癖性關節炎及強直性脊椎炎之患者。戈利木單抗為對於人類TNFa具有特異性之人類IgGlK單株抗體且由患者每月一次皮下自投與。戈利木單抗結合TNFa 之可溶性形式及跨膜生物活性形式。類似於抑制TNFa之其他藥劑，戈利木單抗已與某些不良事件有關，諸如感染風險，包括重度及危急生命之真菌感染。

2009年5月，塞妥珠單抗（以商標名CIMZIA®出售）獲FDA 批准用於治療RA患者。其由保健專業者在誘導期間每兩週且接著在維持期間每四週皮下注射來投與。聚乙二醇化塞妥珠單抗（Certolizumab pegol)為對人類TNFa具有特異性之重組人類化抗體Fab'片段與約40kDa聚乙二醇 (PEG2MAL40K)之結合。類似於其他TNFa抑制劑，聚乙二醇化塞妥珠單抗亦已與某些安全風險有關，諸如增加之重度感染風險。在某些情況下，利妥昔單抗抗體（以商標名RITUXAN®出售）已用於治療RA。利妥昔單抗為針對CD20抗原之經遺傳工程改造之嵌合鼠類/人類單株抗體。利妥昔單抗為1998 年4月7日頒布之美國專利第5,736,137號（Anderson等人）中之抗體，稱作「C2B8」。另一種抗CD20抗體為奥克麗珠單抗。奥克麗珠單抗為抗CD20抗體2H7之人類化變異體。該人類化2H7變異體描述於例如國際公開案第WO 2004/0563 12號（國際申請案第 141616.doc -85 - 201016233 PCT/US2003/040426號）中。本發明之另一態樣提供如下治療患有自體免疫疾病（諸如哮喘、牛皮癖、發炎性腸病（例如克羅恩氏病及潰癌性結腸炎）及修格蘭氏症候群）之移植物接受者或個體之方法：將非消耗性CD4抗體視情況與臨床上或實驗上用於治療自體免疫疾病之另一種化合物組合投與。 A. CD4抗體已描述多種消耗性CD4抗體與非消耗性CD4抗體。亦已報導該等抗體誘導對抗原（包括自體抗原）之耐受性之用途。參見，例如 USPN 4,695,459 ； Cobbold 及 Waldmann 之標題為「Non-depleting anti-CD4 monoclonal antibodies and tolerance induction」之 USPN 6,056,956 ; Cobbold 及 Waldmann之標題為「Monoclonal antibodies for inducing tolerance」之 USPN 5,690,933 ; Cobbold 等人之標題為「Monoclonal antibodies and their use」之歐洲專利申請公開案 0240344 ; Hanna 等人之標題為「Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy」之 USPN 6,136,310 ; Newman等人之標題為「Recombinant antibodies for human therapy」之 USPN 5,756,096 ; Newman 等人之標題為「Recombinant antibodies for human therapy」之 USPN 5,750,105 ； Kung 及 Goldstein 之標題為「Monoclonal antibody to human helper T cells and methods of preparing same 」之 USPN 4,381,295 ； Waldmann (1989) 「Manipulation of T-cell responses with monoclonal 141616.doc • 86 · 201016233 antibodies」Ann Rev Immunol 7:407-44 ;及 Wofsy 及 Seaman (1987)「Reversal of advanced murine lupus in NZB/NZW FI mice by treatment with monoclonal antibody to L3T4」J Immunol 138:3247-53。特定而言，非消耗性 CD4抗體及其用於誘導耐受性之用途已描述於Frewin等人之標題為「TRX1 antibody and uses therefor」之美國專利申請公開案2003/0108518及Frewin等人之標題為「Compositions and methods of tolerizing a primate to an antigen」之美國專利申請公開案2003/0219403中，該等各文獻以引用之方式併入本文中。適用於某些方法中之例示性非消耗性CD4抗體包括（但不限於）Frewin 等人之標題為「TRX1 antibody and uses therefore」之美國專利申請公開案2003/01085 1 8及Frewin 等人之標題為「Compositions and methods of tolerizing a primate to an antigen」之美國專利申請公開案2003/ 0219403中所述之TRX1抗體。此等抗體為包括人類抗體之經修飾恆定區、人類抗體之輕鏈及重鏈框架區及來源於小鼠單株抗體之輕鏈及重鏈CDR的人類化抗體。適用於某些方法中之其他例示性非消耗性CD4抗體包括 (但不限於）經修飾以改變效應功能（包括（但不限於）ADCC、CDC及血清半衰期）之非消耗性CD4抗體。在某些該等實施例中，經修飾之非消耗性CD4抗體相對於未經修飾之抗體具有以增強之結合與FcRn結合之能力。在某些實施例中，經修飾之非消耗性CD4抗體包括重鏈位置 141616.doc -87- 201016233 434(包括（但不限於）N434A及N434H)處之取代。在某些實施例中，經修飾之非消耗性CD4抗體包括重鏈位置297(包括（但不限於）N297A)處之取代。在某些實施例中，非消耗性CD4抗體包括重鏈位置297處之取代及重鏈位置434之取代。在某些實施例中，非消耗性CD4抗體為如實例1之表2中所示之抗體中之任一者。抗體可具有SEQ ID NO: 1中所述之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 3中所述之重鏈胺基酸序列、SEQ ID NO: 1中所述之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 4中所述之重鏈胺基酸序列、SEQ ID NO: 1中所述之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 5中所述之重鏈胺基酸序列或 SEQ ID NO: 1中所述之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 6中所述之重鏈胺基酸序列、SEQ ID NO: 2中所述之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 3中所述之重鏈胺基酸序列、SEQ ID NO: 2中所述之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO:4中所述之重鏈胺基酸序列、SEQ ID NO: 2中所述之輕鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 5中所述之重鏈胺基酸序列或SEQ ID NO: 2中所述之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 6中所述之重鏈胺基酸序列。在一類相關實施例中，抗體包含抗體之CD4結合片段，該CD4結合片段包含SEQ ID NO: 1中所述之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 3中所述之重鏈胺基酸序列、SEQ ID NO: 1中所述之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO:4中所述之重鏈胺基酸序列、SEQ ID NO: 1中所述之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 5中所述之重鏈胺基酸序列或SEQ ID NO: 141616.doc -88 - 201016233 1中所述之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 6中所述之重鏈胺基酸序列' SEQ ID NO: 2中所述之輕鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 3中所述之重鏈胺基酸序列、SEQ ID NO: 2中所述之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 4中所述之重鏈胺基酸序列、SEQ ID NO: 2中所述之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 5中所述之重鏈胺基酸序列或SEQ ID NO: 2中所述之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 6中所述之重鏈胺基酸序列。 • 包含一或多個來自非消耗性CD4抗體之CDR的抗體亦適用於該等方法中。因此，在一類實施例中，非消耗性CD4 抗體包含圖1A及1B中所示之輕鏈之CDR1(SEQ ID NO.: 7)、CDR2(SEQ ID NO.: 8)或 CDR3(SEQ ID NO·: 9)。抗體視情況包括圖1A及IB中所示之輕鏈之CDR1、CDR2及 CDR3(SEQ ID NO: 7-9)。同樣，在一類實施例中，抗體包含圖2A-D中所示之重鏈之CDR1(SEQ ID NO.: 10)、 CDR2(SEQ ID NO·: 11)或 CDR3(SEQ ID NO.: 12)。抗體視情況包括圖2A-D中所示之重鏈之CDR1、CDR2及 - CDR3(SEQ ID NO: 10-12)。在一類實施例中，抗體包含圖

1A及1B中所示之輕鏈之CDR1、CDR2及CDR3(SEQ ID NO: . 7-9)及圖2A-D中所示之重鏈之CDR1、CDR2及CDR3(SEQ ID NO: 10-12)。抗體視情況亦包括圖1A或圖1B中所示之輕鏈之FR1、FR2、FR3及/或FR4及/或圖2A、圖2B、圖2C 或圖2D中所示之重鏈之FR1、FR2、FR3及/或FR4。其他例示性抗體包括（但不限於）所結合之抗原決定基與 141616.doc •89- 201016233 如本文中所述之非消耗性CD4抗體（例如，實例丨之表2中所不之抗體中之任一者）所結合之抗原決定基相同的抗體。在某些實施例中，個體為人類且抗體為人類化或人類抗體。顯然，對於治療非人類哺乳動物而言，抗體視情況經修改以便用於彼動物，例如合併適當哺乳動物種之免疫球蛋白之構架區及恆定區序列。抗體視情況為單株抗體、完整抗體、抗體片段及/或天然抗體。抗體視情況具有減低之效應功能（例如與野生型人類 IgGl相比）’以使得其誘導補體活化及/或抗體依賴性細胞介導之細胞毒性的能力降低。舉例而言，在某些實施例中，抗體與Fey受體之結合減少（或不存在）。同樣，在某些實施例中，抗體具有去糖基化Fe部分。在某些實施例中，抗體為經修飾之非消耗性CD4抗體或變異型非消耗性CD4 抗體’其與FcRn之結合相對於未經修飾之抗體與FcRn之結合增強。 1·抗艘片段本發明涵蓋抗體片段。抗體片段可藉由傳統方式（諸如酶消化）或藉由重組技術產生。有時候使用抗體片段優於使用整個抗體。較小尺寸之片段允許快速清除。欲回顧某些抗體片段，參見Hudson等人，（2003) TVai. Mei 9:129-134 ° 已開發多種技術來產生抗體片段。傳統上，此等片段係經由蛋白水解消化完整抗體所獲得（參見例如Morimoto等 141616.doc -90- 201016233 尺、Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及 Brennan 等人，229:81 (1985))。然而’此等片段目前可由重組宿主細胞直接產生。Fab、Fv及ScFv抗體片段皆可表現於大腸桿菌（E c〇H) 中且由大腸才干菌分泌’從而易產生大量此等片段。抗體片段可自上述抗體盤函體文庫分離。或者，可自大腸桿菌直接回收Fab，-SH片段且化學偶合以形成F(ab，）2片段（Carter等人，幻；10:163-167 (1992))。根據另一種方法，F(ab’）2片段可自重組宿主細胞培養物中直接分離。包含補救受體結合抗原決定基殘基且活體内半衰期延長之 Fab及F(ab’)2片段描述於美國專利第5,869,〇46號中。用於產生抗體片段之其他技術對於熟習此項技術者而言顯而易見。在某些實施例中，抗體為單鏈FV片段（scFv)。參見w〇 93/16185、美國專利第5,571，894號及第5,587 458號。Fv及 SFv為缺少怪定區但具有完整組合位點之唯一種類；因此’其可適於在活體内使用期間減少非特異性結合。可構築SFv融合蛋白來獲得效應蛋白在scFv之胺基或羧基末端處之融合。參見νί/7价〇办 B〇rrebaeck編，同上。抗體片段亦可為「線性抗體」，例如如美國專利第 5,641，870號中所述之「線性抗體」。該等線性抗體可為單特異性或雙特異性抗體。 2·人類化抗體本發明涵蓋人類化抗體。人類化非人類抗體之多種方法在此項技術中為已知的。舉例而言，人類化抗體中可引入 141616.doc -91 - 201016233 非人類來源之一或多個胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基常稱作「輸入」殘基，其通常自「輸入」可變域獲得。人類化基本上可按照Winter及同事之方法（Jones等人， (1986) TVaiwre 321:522-525 ; Riechmann 等人，（1988) ΛΤαίΜπ 332:323-327 ; Verhoeyen 等人，（1988) 239:1534-1536)藉由用高變區序列取代人類抗體之相應序列來進行。因此，該等「人類化」抗體為嵌合抗體（美國專利第4,816,567號），其中實質上小於完整人類可變域已被非人類物種之相應序列取代。實務上，人類化抗體通常 © 為其中一些高變區殘基及可能一些FR殘基被齧齒動物抗體之類似位點之殘基取代的人類抗體。選擇用於產生人類化抗體之人類可變域（輕鏈與重鏈）對於降低抗原性而言為重要的。根據所謂之「最佳匹配」方法，針對已知人類可變域序列之整個文庫篩檢齧齒動物抗體之可變域序列。接著將最接近齧齒動物序列之人類序列當作人類化抗體之人類構架。參見例*Sims等人，（1993) ·/. /麵卿/· 1S1:2296 ; Ch〇thia等人，（⑼7) 乂偏細厂❹ 196:9〇1。另一種方法係使用來源於具有特定亞群之輕鏈或重鏈之所有人類抗體之共同序列的特定構架。多種不同人類化抗體可使用相同構架。參見例等人（Μ%) /Vw. Λ^/. Ad· 89:4285 ;卜以仏等人（Μ%)义 ·

Immunol., 151:2623。此外，一般需要使抗體在保持對抗原之高親和力及其他

有利生物特性之情況下人盤^ . L 類化為達成此目標，根據一種 1416I6.doc •92- 201016233 方法，使用親本序列及人類化序列之三維模型、藉由分析親本序列及各種概念性人類化產物的方法來製備人類化抗體。三維免疫球蛋白模型通常可獲得且為熟習此項技術者所热知。可獲得說明及呈現所選擇之候選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構的電腦程式。檢驗此等呈現允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列之功能中之可能作用，亦即，分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可選擇FR殘基並與接受及輸入序列組合，以便達成所需抗體特性’諸如對靶抗原之親和力增強。一般而言，商變區殘基直接且極其實質上涉及影響抗原結合。 3.人類抗體本發明之人類抗體可如上文所述藉由將選自人類來源噬菌體呈現文庫之F v純系可變域序列與已知人類恆定域序列組合來構築。或者，本發明之人類單株抗體可藉由融合瘤方法製成。用以產生人類單株抗體之人類骨趫瘤及小鼠_ 人類雜交骨婕瘤（heteromyeloma)細胞株已描述於例如

Kozbor «/. /www⑽/.，133: 3001 (1984) ; Brodeur等人，

Monoclonal Antibody Production Techniques and

Applications，第 51-63 頁（Marcel Dekker, Inc·, New York, 1987);及 Boerner 等人，《/. /wtwwwo/.，147: 86 (1991)中。目前可製備的轉殖基因動物（例如小鼠）能夠在免疫後在内源性免疫球蛋白不存在下產生全譜系人類抗體。舉例而言’已描述嵌合及生殖系突變小鼠中之抗體重鏈接合區 (JH)基因之同型接合缺失使得内源性抗體產生受到完全抑 141616.doc -93· 201016233 制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至該生殖系突變小鼠中將引起人類抗體產生（經抗原攻毒後）。參見例如 Jakobovits 等人，ZVoc. Jcail Scz· 90: 2551 (1993) ; Jakobovits 等人，iVaiwre, 362: 255 (1993); Bruggermann等人，Year in Immunol., 7: 33 (1993) ° 基因改組亦可用於自非人類（例如齧齒動物）抗體獲得人類抗體’其中人類抗體具有與初始非人類抗體相似之親和力及特異性。根據此方法（其亦稱作「抗原決定基印記法 (epitope imprinting)」），用人類V域基因譜系置換如本文中所述藉由噬菌體呈現技術所獲得之非人類抗體片段之重鏈或輕鏈可變區，形成非人類鏈/人類鏈scFv4Fab嵌合體群體。用抗原進行選擇導致非人類鏈/人類鏈嵌合scFv* Fab之分離，其中人類鏈使在移除原代噬菌體呈現純系中之相應非人類鏈後遭破壞的抗原結合位點得以恢復，亦即抗原決定基決定（印記）對人類鏈搭配物之選擇。當重複該過程以置換剩餘非人類鏈時，獲得人類抗體（參見1993年4 月1日公開之PCT WO 93/062U)。與傳統上藉由CDR移植來使非人類抗體人類化不同，此技術提供不具有非人類來源之FR或CDR殘基的完全人類抗體。 4·抗體變異髏在一些實施例中，涵蓋本文中所述之抗體的胺基酸序列修飾。舉例而t，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當變異引入編碼抗體之核苦酸序列中或藉由肽合成來製備。該 141616.doc •94· 201016233 等修飾包括抗體胺基酸序列内殘基之（例如）缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特性。可在製備序列時將胺基酸變異引入本發明之抗體胺基酸序列中。如 Cunningham及 Wells (1989) Sc/ewce，244:1081-1085所述，適用於鑑別抗體之作為用於突變誘發之有利位置之某些殘基或區域的方法稱作「丙胺酸掃描突變誘發」。其中，鑑別殘基或標靶殘基組（例如帶電殘基，諸如arg、 asp、his、lys及glu)且置換為中性或帶負電之胺基酸（例如丙胺酸或聚丙胺酸）以影響胺基酸與抗原之相互作用。接著藉由在取代位點處或針對取代位點引入另外或其他變異體來改進對取代顯現功能敏感性之彼等胺基酸位置。因此’當預定用於引入胺基酸序列變異之位點時，突變之性質本身無須預定。舉例而言，為分析指定位點處突變之效能’在標靶密碼子或區域處進行ala掃描或隨機突變誘發，且針對所需活性篩檢所表現之免疫球蛋白。胺基酸序列插入包括長度在1個殘基至含有1〇〇個或1〇〇個以上殘基之多肽範圍内的胺基末端及/或羧基末端融合物’以及單個或多個胺基酸殘基之序列内插入。未端插入之實例包括具有N-末端曱硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N-末端或C-末端與酶或多肽的融合物’從而延長抗體之血清半衰期。在某些實施例中’本發明之抗體經改變以使抗體糠基化 141616.doc -95- 201016233 之程度增加或降低。多肽之糖基化通常為N—連接型或〇_連接型。N-連接型係指碳水化合物部分與天冬醯胺酸殘基之側鍵連接。三肽序列天冬醯胺_χ_絲胺酸及天冬醯胺酸_X_ 蘇胺酸（其中X為除脯胺酸以外之任何胺基酸）為碳水化合物部分與天冬醯胺酸側鏈之酶促連接之識別序列。因此，多肽中存在此等三肽序列中之任一者可形成潛在糖基化位點。〇-連接型糖基化係指糖Ν-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者與羥基胺基酸（最常見為絲胺酸或蘇胺酸）連接’但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。 ® 抗體中添加或缺失糖基化位點宜藉由改變胺基酸序列從而形成或移除一或多個上述三肽序列（針對Ν_連接型糖基化位點）來達成。亦可藉由原始抗體序列中添加、缺失或取代一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基（針對〇_連接型糖基化位點）來達成改變。在抗體包含Fc區之情況下，可改變與其連接之碳水化合物。喝乳動物細胞所產生之天然抗體通常包含一般經N-鍵 Ο 聯與Fc區之CH2域之Asn297相連的分支化雙觸型 (biantennary)寡酿。參見例如 Wright 等人，（1997) 15:26-32。寡醣在雙觸型寡醣結構之「主幹」中可包括與GlcNAc連接之各種碳水化合物，例如甘露糖、 N-乙醯基葡糖胺（GleNAc)、半乳糖及唾液酸以及岩藻糖。在一些實施例中’可對本發明之抗體中之寡醣進行修飾以形成具有某些改良特性之抗體變異體。在抗體包含Fc區之情況下，可改變或移除與其連接之碳 141616.doc -96- 201016233 水化合物。舉例而言，在本文中之一個糖基化變異體中，在抗體之Fc區中引入一或多個胺基酸取代以消除一或多個糖基化位點。（例如）與野生型人類IgGl相比，該種去糖基化抗體可具有降低之效應功能，以使得其誘導補體活化及/ 或抗體依賴性細胞介導之細胞毒性的能力降低，且去糖基化抗體與受體之結合可減少（或不存在）。在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些而非全部效應功能的抗體變異體，使其成為多種應用之理想候選者，在該等應用中，抗體之活體内半衰期為重要的而某些效應功能 (諸如補體及ADCC)為不必要的或有害的。在某些實施例中，量測抗體之Fc活性以確保僅維持所需特性。可進行活體外及/或活體内細胞毒性檢定以證實CDC及/或ADCC活性降低/消耗。舉例而言，可進行Fc受體（FcR)結合檢定以確保抗體缺乏FcyR結合能力（因此可能缺乏ADCC活性）但保持FcRn結合能力。介導ADCC之原生細胞NK細胞僅表現 FcyRIII，而單核細胞表現FcyRI、FcyRII及FcyRIII。造血細胞上之FcR表現總結於Ravetch及Kinet, Annu. Rev. /wwwwo/. 9:457-92(1991)第464頁之表3中。評定相關分子之ADCC活性之活體外檢定之非限制性實例描述於美國專利第 5,500,362號（參見例如 Hellstrom, I.等人/Voc.

Wcflo?· Scz·· 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom，I·等人，

Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)； 5,821，337(參見 Bruggemann，M.等人，乂 Exp. Med. 166:1351-1361 (1987))中。或者，可使用非放射性檢定法 141616.doc -97- 201016233 (參見例如用於流式細胞術之ACTI™非放射性細胞毒性檢定（CellTechnology， Inc. Mountain View, CA);及 CYTOTOX 96®非放射性細胞毒性檢定（Promega，Madison， WI))。適用於該等檢定之效應細胞包括外周血液單核細胞 (PBMC)及天然殺手-(NK)細胞。或者或另外，可評定相關分子在（例如）動物模型（諸如Clynes等人尸roc. &厂ί/α 95:652-656 (1998)中所揭示之動物模型）中之活體内ADCC活性。亦可進行Clq結合檢定以證實抗體不能結合Clq且因此缺乏CDC活性。為評定補體活化，可進行 CDC 檢定（參見例如 Gazzano-Santoro 等人，/· Immunol. Methods 202:163 (1996) ; Cragg，M.S.等人，5/ood 101:1045-1052 (2003);及 Cragg, M.S.及 M.J. Glennie, 103:273 8-2743 (2004))。亦可使用此項技術中已知之方法來進行FcRn結合及活體内清除率/半衰期測定（參見例如 Petkova，S.B·等人，/«ί7· /wwwwo/. 18(12):1759-1769 (2006)) 〇提供具有一或多個胺基酸取代之其他抗體變異體。雖然用於取代性突變誘發的相關位點包括高變區，但亦涵蓋 FR改變。保守性取代展示於表1中「保守性取代」標題下。更多取代性變異（稱「例示性取代」）提供於表1中，或如下文參考胺基酸類別進一步描述。可將胺基酸取代引入相關抗體中且（例如）針對所需活性（諸如改良之抗原結合、降低之免疫原性、改良之ADCC或CDC等活性）來篩檢產物。 141616.doc -98- 201016233 表1 原始殘基例示性取代保守性取代 Ala (A) Val; Leu; lie Val Arg(R) Lys; Gin; Asn Lys Asn (N) Gin; His; Asp, Lys; Arg Gin Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln(Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gin Asp Gly(G) Ala Ala His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg He (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe ;正白胺酸 Leu Leu (L) 正白胺酸；lie; Val; Met; Ala; Phe lie Lys(K) Arg; Gin; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; lie Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; lie; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr(T) Val; Ser Ser Trp(W) Tyr; Phe Tyr Tyr⑺ Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) lie; Leu; Met; Phe; Ala ;正白胺酸 Leu 可藉由選擇取代來達成抗體生物特性之改變，該等取代影響：（a)多肽主鏈在取代區域中之結構（例如呈摺疊或螺 ® 旋構形）；（b)目標位點處之分子之電荷或疏水性；或（c)側鏈之大小。胺基酸可根據其侧鏈特性之相似性分類（A. L. Lehninger，Biochemistry，第二版，第 73-75 頁，Worth Publishers, New York (1975)中）： (1) 非極性：Ala (A)、Val (V)、Leu (L)、lie (I)、Pro (P)、Phe (F)、Trp (W)、Met (M) (2) 不帶電極性：Gly (G)、Ser (S)、Thr (T)、Cys (C)、 Tyr (Y)、Asn (N)、Gin (Q) 141616.doc -99- 201016233 (3) 酸性：Asp (D)、Glu (E) (4) 鹼性：Lys (K)、Arg (R)、His(H) 或者’天然存在之殘基可基於共同側鍵特性分類： (1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile ; (2) 中性疏水性：cys、Ser、Thr、Asn、Gin ; (3) 酸性：Asp、Glu ; (4) 驗性：His、Lys、Arg ; (5) 影響鍵取向之殘基：Gly、Pro; (6) 芳族：Trp、Tyr、Phe。非保守性取代將會使此等類別中之一者之成員交換成另一類別。亦可將該等經取代之殘基引入保守性取代位點中或引入其餘（非保守性）位點中。亦可取代（一般用絲胺酸取代）不涉及維持抗體之適當構形的任何半胱胺酸殘基以改良分子之氧化穩定性且防止異常交聯。反之，可將半胱胺酸鍵添加至抗體中以改良其穩疋性（尤其在抗體為諸如Fv片段之抗體片段之情況下）。取代變異體之一種類型涉及取代親本抗體（例如人類化或人類抗體）之一或多個高變區殘基。通常，選用於進一步開發之所得變異體相對於產生其之親本抗體而言具有經改變（例如經改良）之生物特性。例示性取代變異體為親和力成熟抗禮’其宜使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術來產生。簡言之，使多個高變區位點（例如6-7個位點）突變以在各位點處產生所有可能之胺基酸取代。使由此所產生之抗體以與封裝於各粒子内之噬菌體鞘蛋白（例如Ml 3之基 141616.doc •100· 201016233 因III產物）之至少一部分之融合物形式、自絲狀噬菌體粒子呈現。接著針對經噬菌體呈現之變異體之生物活性（例如結合親和力）篩檢經噬菌體呈現之變異體。為鏗別用於修飾之候選高變區位點，可進行掃描突變誘發（例如丙胺酸掃描）以鑑別對抗原結合起顯著作用之高變區殘基。或者或另外’分析抗原-抗體複合物之晶體結構可有益於鑑別抗體與抗原之間的接觸點。該等接觸殘基及相鄰殘基為根據此項技術中已知之技術（包括本文詳述之彼等技術）取代之候選殘基。一旦產生該等變異體，則使用此項技術中已知之技術（包括本文中所述之彼等技術）對該組變異體進行篩檢’且可在一或多個相關檢定中選擇具有優良特性之抗體供進一步開發。

具有經改變之Clq結合及/或CDC的抗體描述於WO 1999/51642及美國專利第6>194,551號、第6,242，195號、第 6,528,624號及第6,538，124號（Idusogie等人）中。抗體在其 Fc區之一或多個胺基酸位置270、322、326、327、329、 313、333及/或334包含胺基酸取代。包含該等胺基酸取代之非消耗性抗CD4抗體構成本發明之一實施例。為延長抗體之血清半衰期，可將補救受體結合抗原決定基併入抗體（或抗體片段）中，例如如美國專利第5,739,277 號中所述。如本文中所用，術語補救受體結合抗原決定基係指IgG分子（例如IgG!、IgG2、IgG3或IgG4)之Fc區之抗原決定基，此抗原決定基導致IgG分子之活體内血清半衰期延長。Fc區中具有取代且血清半衰期延長之抗體亦描述於 141616.doc -101 - 201016233 WO 2000/42072(Presta, L.)中。包含該種補救受體結合抗原決定基之非消耗性抗CD4抗體構成本發明之一實施例。本發明之任何非消耗性抗體可在Fc區中包含至少一個改良FcRn結合或血清半衰期之取代，例如非消耗性抗CD4變異抗體。舉例而言，本發明進一步提供一種包含變異Fc區之抗體，該抗體具有經改變之新生兒Fc受體（FcRn)結合親和力，例如增強之FcRn結合親和力或增強之FcRn結合。 FcRn在結構上類似於主要組織相容性複合體（MHC)且由與 β2-微球蛋白非共價結合之α-鏈組成。新生兒Fc受體FcRn 之多種功能評述於Ghetie及Ward (2000) Annu· Rev. Immunol. 18:39-766中。FcRn在免疫球蛋白IgG自母體被動傳遞至後代及調節血清IgG含量方面起作用。FcRn起補救受體之作用，從而結合細胞内之呈完整形式之胞飲IgG並轉運其跨越細胞，且經由預設降解路徑解救IgG。儘管負責補救IgG之機制仍不清楚，但認為未結合之IgG被導向在溶酶體中蛋白質水解，而結合之IgG再循環至細胞表面且釋放。此控制發生於位於整個成人組織中之内皮細胞内。 FcRn至少表現於肝、乳腺及成人腸中。FcRn結合IgG ; FcRn-IgG相互作用已經廣泛研究且似乎涉及IgG之Fc區之 CH2、CH3域界面處之殘基。此等殘基與主要位於FcRn之 α2域中之殘基相互作用。在本發明之某些實施例中，非消耗性抗CD4變異抗體可呈現增強之FcRn結合且在Fc區之以下任一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾：238 ' 256 ' 265 ' 272 ' 286 ' 303 ' 141616.doc -102- 201016233 305 ' 307 ' 311 ' 312 ' 317 ' 340 ' 356 ' 360、362、376 ' 3 78、3 80、3 82、413、424或434，其中Fc區殘基之編號為 EU索引之編號（如Kabat中）。參見例如美國專利6,737,056 及 Shields等人，J· Biol. Chem· 276: 6591-6604 (2001)。在本發明之一實施例中，抗體包含含有至少一個位於Asn 434之胺基酸取代（經His取代）(N434H)的變異IgG Fc區。在本發明之一實施例中，抗體包含含有至少一個位於Asn 434之胺基酸取代（經Ala取代）(N434A)的變異IgG Fc區。通常，與具有天然序列/野生型序列Fc區之多肽相比，此等變異體包含較高之FcRn結合親和力或呈現增強之FcRn結合。此等Fc變異多肽及抗體優先被補救及再循環而非被降解。此等非消耗性抗CD4變異抗體可用於本文中所提供之方法中。僅作為非消耗性CD4變異抗體之一實例，本文中所述之任何非消耗性抗CD4抗體可包括重鏈位置434處之取代，諸如N434A或N434H。如美國專利公開案第20040001827號（Dennis, M.)中所揭示’亦可藉由將血清白蛋白結合肽併入抗體中來延長抗體之血清半衰期。包含該等血清白蛋白結合肽之非消耗性抗 CD4抗體構成本發明之一實施例。可能需要將一或多個胺基酸修飾引入本發明之抗體之Fc 區中，從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置（包括鉸鏈半胱胺酸之位置）含有胺基酸修飾 (例如取代）的人類Fc區序列（例如人類IgG1、IgG2、IgG3或 IgG4 Fc 區）。 141616.doc •103· 201016233 編碼抗體之胺基酸序列變異體的核酸分子係藉由此項技術中已知之多種方法來製備。此等方法包括（但不限於）自天然來源分離（在天然存在之胺基酸序列變異體之狀況下）’或藉由募核苷酸介導（或定點）誘變、PCR誘變及匣式誘變早期製備之變異型或非變異型抗體來製備。 5·抗體衍生物本發明之抗體可進一步修飾以含有此項技術中已知且易獲得之其他非蛋白質部分。在某些實施例中，適於抗體衍生化的部分為水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括（但不限於）聚乙二醇（PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1，3-二氧戊環 '聚-υ，。三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸（均聚物或無規共聚物），及葡聚糖或聚（N-乙烯η比咯啶酮）聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙稀/氧化乙烯共聚物、聚乙氧基化多元醇（例如甘油）、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中之穩定性而可具有製造方面之優勢。聚合物可具有任何分子量，且可具分支或不分支。與抗體連接之聚合物數目可變化，且若連接一個以上之聚合物’則其可為相同或不同分子。—般而言，用於衍生化的聚合物數目及/或類型可基於以下考量因素來確定··包括（但不限於）待改良之抗體之特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於指定條件下之治療等因素。在另一實施例中，提供抗體與非蛋白質部分的結合物，該非蛋白質部分可藉由曝露於輻射而選擇性加熱。在—實 141616.doc -104· 201016233 施例中，非蛋白質部分為碳奈米管（Kam等人，尸roc. iV加/. Acad. Sc/. 102: 11600-11605 (2005))。該輻射可具有任何波長，且包括（但不限於）不損傷普通細胞的波長，但該等波長可將非蛋白質部分加熱至可殺死與抗體-非蛋白質部分鄰近之細胞之溫度。 B.製備抗艎之某些方法 1·某些基於融合瘤之方法本發明之單株抗體可使用融合瘤方法來製備，融合瘤方法首次描述於Kohler等人，Waiwre, 256:495 (1975)中且進一步描述於有關人類-人類融合瘤的以下文獻中：例如 Hongo^ A v Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995) ; Harlow 等人，Antibodies: A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 2 版，1988) ; Hammerling 等 A 5 Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y.， 1981);及 Ni， 26(4):265_268 (2006)。其他方法包括（例如）美國專利第 7,189,826號中所述之關於自融合瘤細胞株產生單株人類天然IgM抗體之彼等方法。人類融合瘤技術（三體雜交瘤技術 (Trioma technology)描述於 Vollmers 及 Brandlein， and Histopathology, 20(3):927-93 7 (2005)及 Vollmers 及

Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)^ °

關於各種其他融合瘤技術，參見例如US 2006/258841、 US 2006/183887(完全人類抗體）、US 2006/059575、US 141616.doc •105· 201016233 2005/287149、US 2005/100546、US 2005/026229及美國專利第7,078,492號及第7，153,507號。使用融合瘤方法產生單株抗體之例示性方案描述如下。在一實施例中，使小鼠或其他適當宿主動物（諸如倉鼠）免疫以誘使淋巴細胞產生或能夠產生將特異性結合用於免疫之蛋白質的抗體。藉由多次皮下（sc)或腹膜内（ip)注射包含CD4或其片段之多肽及佐劑（諸如單磷醯脂質A(MPL)/海藻糖二黴菌酸酯（trehalose dicrynomycolate，TDM)(Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton，MT))以在動物中產生抗體。包含CD4或其片段之多肽可使用此項技術中熟知之方法來製備，諸如重組方法，其中一些方法在本文中進一步描述。檢定經免疫動物之血清之抗CD4抗體且視情況投與加強免疫。自產生抗 CD4抗體之動物分離淋巴細胞。或者，可活體外使淋巴細胞免疫。接著使用合適融合劑（諸如聚乙二醇）使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成融合瘤細胞。參見例如Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice > 第 59-103 頁（Academic Press，1986)。可使用有效融合並支持所選抗體產生細胞穩定高量產生抗體且對諸如HAT培養基之培養基敏感的骨髓瘤細胞。例示性骨髓瘤細胞包括（但不限於）鼠類骨髓瘤細胞株，諸如可獲自美國索爾克學院細胞分配中心（Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego, California USA)之來源於MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤之細胞株及可獲自美國菌種保存中心（American Type Culture I4I616.doc • 106- 201016233

Collection，Rockville, Maryland USA)之 SP-2 或 X63-Ag8-653細胞。用於產生人類單株抗體的人類骨髓瘤及小鼠-人類雜交骨鶴瘤細胞株亦已描述（Kozbor, ·/. /m/wwwo/·, 133:3001 (1984) ; Brodeur 等人，Mo«oc/owa/ 办

Production Techniques and Applications ，第 5Ί-63 展 (Marcel Dekker，Inc” New York, 1987))。由此所製備之融合瘤細胞接種並生長於合適培養基（例如含有一或多種抑制未融合親本骨髓瘤細胞生長或存活之物質的培養基）中。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶（HGPRT或HPRT)，則融合瘤之培養基通常將包括次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷（HAT 培養基），該等物質防止HGPRT缺乏型細胞生長。在某些實施例中，如（例如）Even等人，反y， 24(3), 105-108 (2006)中所述，使用無血清融合瘤細胞培養方法可減少動物源血清（諸如胎牛血清）之使用。作為改良融合瘤細胞培養法之生產力之工具的寡肽描述於'pTaneli, Tfends in Monoclonal Antibody Research, 111· 122 (2005)中。特定而言，標準培養基富含某些胺基酸（丙胺酸、絲胺酸、天冬醯胺酸、脯胺酸）或富含蛋白質水解產物溶離份且由3至6個胺基酸殘基構成之合成募肽可顯著抑制細胞凋亡。肽以毫莫耳濃度或更高濃度存在。可檢定融合瘤細胞生長於其中之培養基是否產生結合 CD4之單株抗體。融合瘤細胞所產生之單株抗體之結合特異性可藉由免疫沈澱反應或藉由活體外結合檢定（諸如放 141616.doc -107- 201016233 射免疫檢定（RIA)或酶聯免疫吸附檢定（ELIS A))來測定。單株抗體之結合親和力可藉由（例如）斯卡查德分析 (Scatchard analysis)來測定。參見例如Muns〇n等人， 107:220 (1980)。在鑑別產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗體的融合瘤細胞後，可藉由限制稀釋程序次選殖該等純系且藉由標準方法生長。參見例如G〇ding(同上）。適用於此目的之培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，融合瘤細胞可以腹水性腫瘤形式活體内生長於動物中。次純系所分泌之單株抗體宜藉由習知免疫球蛋白純化程序、自培養基、腹水或血清中分離，該等純化程序諸如蛋白質 A·瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。一種自融合瘤細胞分離蛋白質之程序描述於仍 2005/176122及美國專利第6,919,436號中。該方法包括在結合過程中使用最少量鹽（諸如感膠離子鹽（ly〇tr〇pic salt) 以及在溶離過程中使用少量有機溶劑。 2.某些文庫篩檢法本發明之抗體可藉由使用组合文庫篩檢具有所需活性之抗體來製備。舉例而言，用於產生噬菌體呈現文庫及針對具有所需結合特性之抗體篩檢該等文庫的多種方法在此項技術中為已知的。該等方法一般性地描述於H〇〇genb〇〇m 等人 ATeAoA 178:1_37(〇，Brien 等人編，Human Press，Totowa，NJ，2001)中。舉例而言，一種產生相關抗體之方法係使用嗟菌體抗體文庫，如Lee等 141616.doc -108- 201016233 人，J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93 中所述。原則上，藉由篩檢噬菌體文庫來選擇合成抗體純系，該等噬菌體文庫含有呈現與融合噬菌體鞘蛋白融合之抗體可變區（Fv)之各種片段的噬菌體。針對所需抗原、藉由親和層析來淘選該等噬菌體文庫。表現能夠結合所需抗原之Fv 片段的純系吸附至抗原且從而與文庫中之非結合純系分離。接著自抗原溶離結合純系，且可藉由額外多輪抗原吸附/溶離進一步富集。本發明之任何抗體可如下獲得：設計合適抗原篩檢程序以選擇相關噬菌體純系，隨後使用來自相關嗟菌體純系之Fv序列及Kabat等人，iSegMencw 〇/ Proteins of Immunological /«iereW ，第五版，NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991)，第 1-3卷中所述之合適恆定區（Fc)序列構築全長抗體純系。在某些實施例中，抗體之抗原結合域係由兩個具有約 110個胺基酸之可變（V)區形成，該2個可變區各來自輕鏈 (VL)及重鏈（VH)，均存在三個高變環（HVR)或互補決定區 (CDR)。如 Winter 等人，dm Rev. Immunol., 12: 433-45 5(1994)中所述，可變域可以單鏈Fv(scFv)片段（其中VH 與VL係經由柔性短肽共價連接）形式或以Fab片段（其中VH 與VL各自與恆定域融合且以非共價方式相互作用）形式功能性地呈現於嗟菌體上。如本文中所用，編碼scFv之嗤菌體純系以及編碼Fab之噬菌體純系統稱為「Fv噬菌體純系」或「Fv純系」。如 Winter等人，及ev. /mmwwo/·，12: 433-455(1994)中 141616.doc -109- 201016233 所述，VH與VL基因譜系可藉由聚合酶鏈反應（PCR)單獨選殖，且在噬菌體文庫中隨機重組，接著可針對抗原結合純系搜尋。來自經免疫來源之文庫提供針對免疫原的高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，如Griffiths等人，五·/，12: 725-734 (1993)所述，可選殖天然譜系以提供針對大範圍之非自體抗原以及自體抗原的單一人類抗體來源而不進行任何免疫。最後，如Hoogenboom及Winter，乂 Mo/· 227: 381-388 (1992)所述，亦可以合成方式如下製備天然文庫：自幹細胞選殖未重排之V-基因區段且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高變CDR3區且完成活體外重排。在某些實施例中，使用絲狀噬菌體藉由與少量勒蛋白 pill融合來呈現抗體片段。該等抗體片段可（例如）如Marks 等人，J. Mo/·仏〇/·，222:581-597 (1991)所述，以單鏈卩乂片段形式呈現，其中VH域與VL域係藉由柔性多肽間隔基連接於同一多肽鏈上；或（例如）如Hoogenboom等人，斤此/ 心必心5.，19:4133-4137 (1991)中所述，以Fab片段形式呈現，其中一條鏈與ΡΙΠ融合而另一條鏈分泌進入細菌性宿主細胞周質内，在周質内藉由置換一些野生型鞘蛋白而組裝呈現於嗤菌邀表面上的Fab-賴蛋白結構。一般而言’編碼抗體基因片段之核酸係由自人類或動物所採集之免疫細胞獲得。若需要偏重於抗CD4純系之文庫，則以CD4使個體免疫以產生抗體反應，且回收脾細胞及/或循環B細胞及其他外周血液淋巴細胞（pBL)用於文庫 141616.doc •110· 201016233 構築。在一特定實施例中，偏重於抗CD4純系之人類抗體基因片段文庫係如下獲得：在帶有功能性人類免疫球蛋白基因陣列（且缺乏功能性内源性抗體產生系統）之轉殖基因小鼠中產生抗CD4抗體反應，以使得CD4免疫作用引起B 細胞產生針對CD4之人類抗體《下文描述產生人類抗體之轉殖基因小鼠的產生。可藉由使用合適篩檢程序分離表現CD4特異性膜結合抗體之B細胞（例如使用CD4親和層析分離細胞，或使細胞吸附至經螢光染料標記之CD4，隨後進行流式活化細胞分選 (FACS))來獲得抗CD4反應性細胞群體之額外富集。或者’使用未免疫供體之脾細胞及/或B細胞或其他pbl 以提供可能抗體譜系之良好呈現，且亦允許使用其中CD4 不具抗原性之任何動物（人類或非人類）種來構築抗體文庫。對於活體外合併抗體基因構築之文庫而言，自個體採集幹細胞以提供編碼未重排之抗體基因區段的核酸。相關免疫細胞可自多種動物物種獲得’諸如人類、小鼠、大鼠、兔、狼、犬、貓、豬、牛、馬及鳥物種等。自相關細胞回收編碼抗體可變基因區段（包括VH及VL區段）之核酸且使其擴增。在重排之VH及VL基因文庫之狀況下，所需DNA可如下獲得：自淋巴細胞分離基因組DNA或 mRNA，隨後用與重排之VH及VL基因之V及3’端匹配之引子進行聚合酶鍵反應（PCR)，如Orlandi等人，TVai/. Acad. 86:3833-3837 (1989)中所述，從而得到用於表現之各種V基因譜系。V基因可用編碼成熟V-域之 141616.doc -111 - 201016233 外顯子之5'端處的後向引子以及位於J-區段内之前向引子、自cDNA及基因組DNA擴増，如Orlandi等人，（1989) 及 Ward等人，341: 544-546 (1989)中所述。然而，自cDNA擴增時，後向引子亦可位於前導外顯子中，如 Jones等人，，9:88-89 (1991)中所述，且前向引子亦可位於怪定區内，如Sastry等人，/Voc. TVai/· &ζ_· (ΧΓΜ), 86:5728-5732 (1989)中所述。為使互補性最大化，引子中可合併簡併性，如Orlandi等人，（1989)或 Sastry等人，（1989)中所述。在某些實施例中，（例如）如 ® Marks等人，《/. Μο/_ 价£?/.，222: 581-597 (1991)之方法中所述或如 Orum 等人，Res., 21: 4491-4498 (1993)之方法中所述，文庫多樣性係藉由使用靶向各¥_基因家族的PCR引子擴增免疫細胞核酸樣本中所存在之所有可用之VH及VL排列來最大化。將經擴增之DNA選殖入表現載體中時’可如Orlandi等人（1989)所述，在一端處將罕見限制性位點作為標記引入PCR引子内；或如Clackson等人’ iVaiwre，352: 624-628 (1991)中所述，用經標記之引子 ® 進一步進行PCR擴增。合成性重排之V基因譜系可活體外來源於V基因區段。大部分人類VH-基因區段已選殖且定序（Tomlinson等人，j.

Mo/.价〇/·，22:776-:798 (1992)中所報導），且已繪出圖譜 (Matsuda等人，Gewei.，3:88-94 (1993)中所報導）；可使用此等經選殖區段（包括H1及H2環之所有主要構型）以及編碼具有各種序列及長度之H3環的PCR引子來產生各種 241616.doc -112- 201016233 VH 基因譜系，如 Hoogenboom 及 Winter, «/· Mol. Biol., 227:3 81-3 88 (1992)中所述。亦可產生所有序列多樣性皆集中於具有單一長度之長H3環中的VH譜系，如Barbas等 A > Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4457-4461 (1992)中所述。人類Vk及νλ區段已經選瘦且定序（Williams及Winter, «/· / 所 ww ㈣/.，23:1456-1461 (1993)中所報導）且可用於產生合成性輕鏈譜系。基於一定範圍之VH及VL摺疊及L3 及H3長度的合成性V基因譜系將編碼具有大量結構多樣性之抗體。擴增編碼V-基因之DNA後，生殖系V基因區段可根據 Hoogenboom 及 Winter, ·/. Mo/· 227: 381-388 (1992) 之方法活體外重排。可藉由以若干方式將VH與VL基因譜系組合於一起來構築抗體片段譜系。各種譜系可形成於不同載體中，及（例如）如 Hogrefe等人，128:119-126 (1993)中所述之活體外重組載體中；或經組合感染活體内重組之載體中，例如，Waterhouse 等人，iVwc/. Jc/办及以，21:2265-2266 (1993) 中所述之ΙοχΡ系統。活體内重組方法利用Fab片段之雙鏈性質來克服大腸桿菌轉型效率對文庫大小所施加的限制。分開選殖天然VH及VL譜系，一者選殖於噬菌體質體中且另一者選殖於噬菌體載體中。接著藉由噬菌體感染含有噬菌體質體之細菌來組合兩個文庫，從而使各細胞含有不同組合且使文庫大小僅受所存在細胞數目（約1 〇12個純系）限制。兩載體皆含有活體内重組信號，以便使VH及VL 基因重組於單個複製子上且共同封裝於噬菌體病毒粒子 141616.doc •113- 201016233 中。此等大型文庫提供大量具有良好親和力（K，1為約ίο·8 Μ)之各種抗體。或者，（例如）如 Barbas等人，ZVoc. iVai/· Acad. 5W. [/5^4, 88:7978-7982 (1991)中所述，可將該等譜系依序選殖入同一載體中；或（例如）如 Clackson等人，352:624-628 (1991)中所述，藉由PCR將該等譜系組裝在一起且接著選殖。亦可使用PCR組裝將VH及VL DNA與編碼柔性肽間隔基之DNA接合形成單鏈Fv(scFv)譜系。在另一種技術中，如 Embleton等人，iVWc/· 及20:3831-3837 (1992)中所述’使用「細胞内PCR組裝」、藉由PCR將VH與VL基因在淋巴細胞内組合且接著選殖已連接基因之譜系。由天然文庫所產生之抗體（天然或合成）可具有中度親和力（Kd為約106至ίο7 μ-1)，但亦可藉由構築第二文庫及自第二文庫再選擇來活體外模擬親和力成熟，如Winter等人 (1994)(同上）中所述。舉例而言，可藉由在Hawkins等人， ·/· Mo/·价〇/.，226: 889_8S>6 (1992)之方法中及Gram等人， ^/以，89: 3576_358〇 (1992)之方法中使用易錯 t 合酶（Leung等人 ’ 1: 11-15 (1989)中所報導）活體外隨機引入突變。另外，親和力成熟可如下進行：在選定的個別Fv純系中例如使用PCR使一或多個 CDR(該等CDR具有跨越相關CDR之隨機序列的引子）隨機突變且針對較高親和力純系篩檢。w〇 96〇7754(1996年3月 14曰公開）描述一種誘導免疫球蛋白輕鏈之互補決定區發生突變以形成輕鏈基因文庫的方法。另一種有效方法係如 141616.doc •114- 201016233

Marks等人 ’ 10:779-783(1992)中所述，將藉由嗟菌體呈現所選擇之VH域或VL域與自未免疫供體獲得之天然存在之V域變異體譜系重組且以多輪鏈改組針對較高親和力來篩檢。此技術可產生親和力為約Μ或10-9 Μ以下之抗體及抗體片段。可藉由此項技術中已知之多種技術完成文庫篩檢。舉例而言’可使用CD4塗布吸附板之孔，表現於附著至吸附板或用於細胞分選之宿主細胞上’或與生物素結合以便用塗有抗生蛋白鏈菌素之珠粒捕捉，或用於淘選噬菌體呈現文庫之任何其他方法中。在適合於噬菌體粒子之至少一部分與吸附劑結合之條件下，使噬菌體文庫樣本與固著之CD4接觸。通常選擇模擬生理條件的條件，包括pH、離子強度、溫度及其類似條件。洗滌與固相結合之噬菌體且接著藉由酸溶離，（例如）如 Barbas等人，proc· JVai/. Ααώ?. Scz· t/M，88:7978-7982 (1991)中所述；或藉由鹼溶離，（例如）如Marks等人，乂 Μ〇/_ ，222:581-597 (1991)中所述；或（例如）以類似於 Clackson等人，352:624-628 (1991)之抗原競爭方法之程序、藉由CD4抗原競爭來溶離。可在單輪選擇中富集20-1，〇〇〇倍之噬菌體。此外，可使所富集之噬菌體在細菌培養物中生長且進行其他輪之選擇。選擇效率視許多因素而定，包括洗滌期間之解離動力學及單個嗤菌體上之多個抗體片段可否同時與抗原接合。具有快速解離動力學（及弱結合親和力）之抗體可藉由使用短 141616.doc -115- 201016233 時間洗滌、多價噬菌體呈現及固相高密度塗布抗原來持留。高密度不僅經由多價相互作用使噬菌體穩定，且亦有利於使已解離之嗟菌禮再結合。藉由使用長時間洗滌及單價嗟卤體呈現（如 Bass等人，/Voiez.wj, 8: 309-314 (1990)及 WO 92/09690中所述）及低密度塗布抗原（如Marks等人，扪οία/2«0/.，10: 779-783 (1992)中所述）可有利於選擇具有緩慢解離動力學（及優良結合親和力）的抗體。可在對CD4具有不同親和力、甚至稍微不同之親和力的嗤菌體抗體之間選擇。然而，所選抗體之隨機突變（例參如’如以一些親和力成熟技術所進行）可產生許多突變體’其中大部分結合抗原且少數具有較高親和力。經由限制CD4，可決出極少數之高親和力噬菌體。為持留所有較高親和力突變體’可將噬菌體與過量的生物素結合之Cd4 一起培育’但其中生物素結合之CD4的莫耳濃度低於CD4 之目標莫耳親和力常數。接著可用塗有抗生蛋白鏈菌素之順磁珠粒捕捉高親和力結合噬菌鱧。該「平衡捕捉」允許根據抗體之結合親和力來選擇抗體，其中敏感性允許自顯 ® 著過量之具有較低親和力之噬菌體分離親和力僅高兩倍之突變體純系。亦可操控洗滌與固相結合之噬菌體中所用之條件以基於解離動力學進行區分。可基於活性來選擇抗CD4純系。在某些實施例中，本發明提供結合天然表現CD4之活細胞的抗CD4抗體。在一實施例中’本發明提供阻斷CD4配位體與CD4之間結合但不阻斷CD4配位體與第二蛋白質之間結合的抗CD4抗體。對 141616.doc -116- 201016233 應於該等抗CD4抗體之Fv純系如下選擇：（1)如上文所述自噬菌體文庫分離抗CD4純系，且視情況藉由使經分離之噬菌體純系群體在合適細菌宿主中生長來擴增該群體；（2)針對分別需要阻斷活性及非阻斷活性來選擇CD4及第二蛋白；（3)使抗CD4噬菌體純系吸附至固著之CD4 ; (4)使用過量之第二蛋白質溶離可識別與第二蛋白質之結合決定子重疊或共有之CD4結合決定子的任何非所要純系；及（5)溶離步驟（4)後仍吸附之純系。具有所需阻斷/非阻斷特性之純系視需要可進一步藉由將本文中所述之選擇程序重複一或多次來富集。編碼本發明之源自融合瘤之單株抗體或噬菌體呈現Fv純系的DNA容易使用習知程序分離且定序（例如使用設計成自融合瘤或噬菌體DNA模板特定擴增相關重鏈及輕鏈編碼區的寡核苷酸引子）。DN A —經分離便可置放於表現載體中，接著轉染至宿主細胞（諸如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢（CHO)細胞或骨髓瘤細胞）中（否則該等宿主細胞不產生免疫球蛋白），以在重組宿主細胞中獲得所需單株抗體之合成。關於在細菌中重組表現編碼抗體之 DNA的評述文章包括Skerra等人，Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) A Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992)。可將編碼本發明Fv純系之DNA與編碼重鏈及/或輕鏈恆定區之已知DNA序列（例如適當DNA序列可自Kabat等人（同上）獲得）組合以形成編碼全長或部分長度重鏈及/或輕鏈之 141616.doc -117- 201016233 純系。應瞭解’任何同種型之恆定區（包括IgG、igM、 IgA、IgD及IgE恆定區）可用於此目的，且該等恆定區可自任何人類或動物物種獲得。如本文中所用之「欲合」及「雜交」抗體之定義中包括自一種動物（諸如人類）物種之可變域DNA獲得Fv純系且接著與另一動物物種之怪定區 DNA融合以形成「雜交」全長重鏈及/或輕鏈之編碼序列。在某些實施例中，來源於人類可變域DNA之Fv純系係與人類恆定區DNA融合以形成全長或部分長度人類重鏈及/ 或輕鍵之編碼序列。編碼本發明之源自雜交瘤之抗CD4抗體的DNA亦可經修飾’例如用人類重鏈恆定域及輕鏈恆定域之編碼序列取代源自雜父瘤純系之同源鼠類序列（例如，如M〇rrison等人， Proc. dead. Sc/· t/SJ, 81: 6851-6855 (1984)之方法中）°可藉由使非免疫球蛋白多肽之所有或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價接合來進一步修飾編碼源自融合瘤或源自Fv純系之抗體或片段的DNA。以此方式，製備具有本發明之源自FV純系或雜交瘤純系之抗體之結合特異性的「嵌合」或「雜交」抗體。 3.載通、宿主細胞及重组方法在實施本發明中，視情況使用分子生物學、微生物學及重組DNA技術方面之多種習知技術。該等習知技術係關於載體、宿主細胞及重組方法。此等技術為熟知的且解釋於 (例如）Berger 及 Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology 第 152 卷 Academic 141616.doc •118· 201016233 ❹

Press, Inc” San Diego，CA ; Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual (第 3版），第 1-3 卷，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2000 及 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel 等人編，Current Protocols，Greene Publishing Associates, Inc.與 John Wiley & Sons，Inc.之間合資，（2006 年期間增補）中。關於（例如）細胞分離及培養（例如用於隨後核酸或蛋白質分離）之其他參考文獻包括Freshney (1994) Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，第 3 版，Wiley-Liss，New York及其中所引用之參考文獻； Payne等人，（1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY j Gamborg 及 Phillips(編）（1995) Plant Cell，Tissue and Organ Culture ; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York);及 Atlas及 Parks(編)The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press，Boca Raton，FL。製備核酸之方法（例如活體外擴增、自細胞純化或化學合成）、操控核酸之方法（例如定點突變誘發、限制性酶消化、接合等方法），及用於操控及製備核酸之各種載體、細胞株及其類似物描述於上述參考文獻中。另外，任何聚核苷酸（包括例如經標記或經結合生物素之多核苷酸）基本上可自任何各種商業來源定製或標準定購。 C.投藥 141616.doc -119- 201016233 負責治療之醫師將能夠判定適用於個別個體之劑量。與非消耗性CD4抗體組合投與之市售第二治療性化合物及其他化合物之製劑及給藥時程可根據製造商之說明書使用或可由熟習此項技術者憑經驗來決定。為預防或治療疾病，與非消耗性抗體組合投與之非消耗性抗CD4抗體及任何第二治療性化合物或其他化合物之人適劑量將視以下因素而定：欲治療之自體免疫疾病類型 (例如RA、SLE、MS)、疾病之嚴重度及過程、非消耗性抗體或組合是否針對預防性或治療性目的投與、先前治療、患者臨床病史及對抗體或組合之反應及主治醫師之判斷。非消耗性CD4抗體或組合通常宜一次或多次、經一系列治療投與患者。在某些實施例中，非消耗性CD4抗體係在8 週或6個月或1年或2年期間每週投與一次或在患者一生中長期投與。在某些實施例中，由患者自投藥治療。視疾病類型及嚴重度而定，約i微克/公斤至5〇毫克/公斤 (例如0.1-20毫克/公斤）之非消耗性(：〇4抗體為（例如）藉由或夕人單獨技藥或藉由連續輸注向患者投與之初始候選劑量在某些情況下，視上述因素而定，典型日劑量可在約1微克/公斤至約100毫克/公斤或1〇〇毫克/公斤以上之範圍内。對於多曰或更長時間重複投藥而言，視情況而定，持續治療直至疾病症狀出現所需之抑制。然而，其他給藥方案可適用*>通常，臨床醫師將投與本發明之抗體（單獨或與第一化合物組合）直至達到提供所需生物效應之劑量。本發明之治療進程容易藉由習知技術及檢定來監控。 141616.doc -120- 201016233 舉例而言，視情況投與非消耗性抗CD4抗體，如上文或美國專利公開案第2003/0108518號或美國專利公開案第 2003/0219403 號中所述。在某些實施例中，向需要治療之個體投與介於〇2毫克/ • 公斤與10毫克/公斤之間或介於〇·3毫克/公斤與7〇毫克/公斤之間或介於1.0毫克/公斤與5.〇毫克/公斤之間的非消耗性抗CD4抗體。在某些該等實施例中，所投劑量為〇 3毫克/ 公斤、丨‘0毫克/公斤、2·〇毫克/公斤、2.5毫克/公斤、3 〇毫克/公斤、3.5毫克/公斤或7.〇毫克/公斤。在某些實施例中，向需要治療之個體投與介於15〇毫克與35〇之間，或介於200毫克與300毫克之間或介於225毫克與275毫克之間的固定劑量之非消耗性抗CD4抗體。在某些該等實施例中，所投與之非消耗性抗CD4抗體之固定劑量為25〇毫克。非消耗性抗CD4抗體如本文中所述單獨或與至少一種其他化合物組合投與，且持續治療直至疾病症狀出現所需之抑 φ 制非’肖耗性杬CD4抗體視情況投與一段時間以在個體體内維持適當抗體含量（或若抗體與第二化合物組合使用時，為抗體與第二化合物之組合的合適含量）以達成且維持症狀抑制。非4耗性CD4抗體可以任何合適方式投與，包括非經，局。[5、皮下、腹膜内、肺内、鼻内及/或病灶内投藥。非經腸輸注包括肌肉β、靜脈内、動脈内、腹膜内或皮下投藥。亦涵蓋鞘内腔投藥（參見例如Gdll〇_L〇pez之美國專利公開案第2002/_9444號）。另外，抗體宜可藉由脈 I41616.doc -121- 201016233 衝式輸注（例如遞減抗體劑量）投與。在某些實施例中，靜脈内或皮下給藥。每次暴露可使用相同或不同投藥方式來提供。在一實施例中，每次暴露係藉由皮下投藥來提供。在某些實施例中，非消耗性抗CD4抗體係與間質藥物分散劑組合投與。間質藥物分散劑為能夠降低或減小間質基質黏性之樂劑。參見例如Bookbinder等人，j 〇f

Controlled Release } 14:230-241，2006。間質基質為複雜三維動態結構，其用作控制藥物流動速率之過濾器（同上）。其包含許多結構巨分子’包括例如膠原蛋白、彈性蛋白及纖維結合蛋白’其中葡糖胺聚糖與蛋白聚糖形成水合凝膠樣物質（同上）。諸如玻尿酸之葡糖胺聚糖經由其黏性及對水之水合作用而有助於阻斷容積流體流經間質膠原基質。玻尿酸為含有重複雙醣單元之兆道爾頓（mega_dah〇n)分子’其允許細胞外基質抵抗壓力（同上）。葡糖胺聚糖（包括玻尿酸）水解會降低間質基質之黏性，以便增強皮下投與之流體的分散及吸收且減少輸注部位腫脹。參見例如

Pirrello等人，J· 〇f Palliative Medicine 10:861-864, 2007。玻尿酸酶為葡糖胺聚糖降解酶家族。一種該玻尿酸酶為 PH20(哺乳動物睪丸中之主要玻尿酸酶）„ ph2〇為中性pH 活性玻尿酸酶且在生理條件下降解葡糖胺聚糖。rHuPH2〇為缺乏糖基-璃脂酿肌醇部分之人類玻尿酸酶之可溶性形式（Bookbinder等人，J. of Controlled Release 114:230-241， 2006)〇例示性間質藥物分散劑包括（但不限於）可溶性中性活性 141616.doc -122- 201016233 玻尿酸酶醣蛋白（sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如 rHuPH20(HYLENEX®， Baxter International，Inc.)。某些例示性 sHASEGP(包括 rHuPH20) 及使用方法描述於美國專利公開案第20050260186號及第 20060104968 號；及 Bookbinder 等人，J. of Controlled Release 114:230-241, 2006 ; Pirrello等人，J. of Palliative Medicine 10:861-864，2007 ;及 Thomas 等人，J. of Palliative Medicine 10:1312-1320，2007中。在一態樣中， sHASEGP係與一或多種其他葡糖胺聚糖酶（諸如硫酸軟骨素酶）組合。在一態樣中，在非靜脈内非經腸注射（諸如皮内、皮下、肌肉内及注入除維管結構以外空間中之注射）之情況下，藉由注射或輸注將含於一定體積液體（例如醫藥賦形劑或其他溶液）中之sHASEGP(及/或另一種葡糖胺聚糖酶）及另一種藥劑（例如共調配物或包含sHASEGP及非消耗性抗CD4抗體之混合物）引入體内之一或多個部位中。本發明之方法包括在投與非消耗性抗CD4抗體之前、同時或之後投與sHASEGP或含有sHASEGP之醫藥姐合物。投與sHASEGP多肽的部位可不同於投與非消耗性抗CD4抗體的部位，或投與sHASEGP的部位可相同於投與非消耗性抗CD4抗體的部位。在某些實施例中，sHASEGP為 rHuPH20，其係以介於0.1個單位與15,000個單位之間，或介於1個單位與1000個單位之間，或介於5個單位與500個單位之間，或介於50個單位與300個單位之間的劑量投與。包括rHuPH20之sHASEGP之酶活性（單位）可使用此項 141616.doc -123- 201016233 技術中已知之方法來測定，例如如Frost等人，Anal. Biochem. 251:263-269, 1997及美國專利第 20060104968號中所述之基於微量滴定之玻尿酸酶檢定。在某些實施例中，非消耗性抗CD4抗體係使用（例如）自助注射裝置、自動注射器裝置或針對自投藥所設計之其他裝置來投與。各種自助注射裝置（包括自動注射器裝置）為此項技術中已知的且在市面上有售。例示性裝置包括（但不限於）預裝藥品式注射器（諸如獲自Becton Dickinson之 BD HYPAK SCF®、READYFILLTM及 STERIFILL SCFTM ; 獲自Baxter之CLEARSHOTtm共聚物預裝藥品式注射器；及可獲自 West Pharmaceutical Services 之 Daikyo Seiko CRYSTAL ZENITH®預裝藥品式注射器）；一次性筆式注射裝置，諸如獲自Becton Dickinson之BD Pen ;超尖銳微針裝置（諸如獲自Becton Dickinson之INJECT-EASEtm及微輸注器裝置；及可獲自Valeritas之H-PATCHtm)以及無針注射裝置（諸如可獲自Bioject之BIOJECTOR®及IJECT® ;及可獲自Medtronic之SOF-SERTER®及貼片裝置）。可預見使用該等自助注射裝置共調配或共投與非消耗性抗CD4抗體及 sHASEGP，以及共調配或共投與非消耗性抗CD4抗體、 sHASEGP及/或至少一種第二治療性化合物。如所述，非消耗性抗CD4抗體可單獨或與至少一種第二治療性化合物組合投與。此等第二治療性化合物一般以相同劑量及慣用投藥途徑或以慣用劑量之約1 %至99°/〇使用。若使用該等第二化合物，則其在某些實施例中所用之量低 141616.doc •124· 201016233 於在不存在非消耗性抗CD4抗體下所用之量以消除或減少由此所引起之副作用。亦如所述，多種合適的第二治療性化合物為此項技術中已知的且該等第二治療性化合物之劑量及投與方法同樣已描述。僅作為一實例，非消耗性抗CD4抗體可與環磷醯胺組合投與用於治療狼瘡（或MS、類風濕性關節炎或發炎性腸病，或如本文中所述之其他病症）。多種環磷醯胺治療方案已描述於文獻中。例示性方案包括（但不限於）6個月期間每月一次靜脈内投與0.5公克/平方米-1.0公克/平方米，接著每3個月靜脈内投與一次，直至30個月；及3個月期間每2週靜脈内投與500毫克；12週或6個月期間每天經口投與1毫克/公斤-3毫克/公斤。參見例如Petri (2004) 「Cyclosphosphamide: new approaches for systemic lupus erythematosus」Lupus 13:366-371 及 Petri 及 Brodsky (2006) 「High-dose cyclophosphamide and stem cell transplantation for refractory systemic lupus erythematosus」 JAMA 295:559-560 ° 作為另一實例，非消耗性抗CD4抗體可與黴酚酸酯 (MMF)(例如由Roche所製造之CELLCEPT®)組合投與用於治療包括SLE及狼瘡腎炎之狼瘡。MMF已用於狼瘡腎炎之誘導與維持治療（Appel等人，Nature Clin. Practice 5:132-142 (2009) ； Ginzler等人，Lupus 14:59-64 (2005))° 已描述使用MMF治療狼瘡之各種治療方案，包括（但不限於）6 個月期間每天2.0公克，繼而6個月期間每天1.0公克，或3- 141616.doc -125- 201016233 24個月期限内每天0.5公克_2·〇公克之範圍；或每天〇5公克-3.0公克之範圍（同上）。在某些情況下，係與常用於冶療狼瘡之其他藥物（諸如環填醢胺、硫嗤嗓吟及/或類固醇（諸如強的松））組合投與（同上）。非消耗性抗CD4抗體與任何第二治療性化合物可例如以單一組合物形式或以兩種或兩種以上不同組合物形式、使用相同或不同投藥途徑同時投與。或者或另外，可以任何順序依序投藥。在某些實施例中，兩種或兩種以上組合物之投藥之間可存在數分鐘至數天至數週至數月範圍内的時⑩ 間間隔。舉例而言，可首先投與非消耗性抗CD4抗體，繼而投與第二治療性化合物。然而，亦涵蓋同時投與第二治療性化合物及非消耗性抗CD4抗體，或先於非消耗性抗 CD4抗體投與第二治療性化合物。如上所述，視情況與非消耗性CD4抗體及第二治療性化合物組合投與第三化合物、第四化合物等化合物。同樣，可向個體投與用於狼瘡（例如癌攣、失禁、疼痛、疲勞）或 MS、類風濕性關節炎、發炎性腸病或其他病狀或疾病之@ 繼發性或相關性症狀的療法’例如在非消耗性CD4抗體或· 組合治療期間。 D·醫藥調配物 •根據本發明所用之抗體之治療性調配物係藉由將具有所需純度之非消耗性CD4抗體與可選之醫藥學上可接受之載劑賦形劑或穩定劑混合、以冷滚乾燥調配物或水溶液之形式製備以便儲存（Remingt〇n，s phamaceuticai心_第 141616.doc -126· 201016233 16版’ CW，Α·編⑽〇))。可接受之載劑、職形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒且包括：緩衝液:諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及曱硫胺酸；防腐劑（諸如氣化十八烷基二甲基=甲

基銨，氯化六羥季銨（hexamethonium chloride);氣化苯甲烴銨（benzalkonium ehl〇dde)、$ 索氣錢（benze— chloride);苯盼、了醇或笨甲醇；對經基笨甲酸㈣，諸如對經基苯甲酸甲醋或對經基苯甲酸丙醋；兒茶紛；間苯二酚；環己醇；3·戊醇；及間甲酚）；低分子量(少於㈣個殘基)多肽；蛋白質’諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物’諸如聚乙烯料⑮基酸諸如甘胺酸、糙醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸’早_、雙at及其他碳水化合物，包括㈣糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖類，諸如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖醇；成鹽性抗衡離子，諸如鈉；金屬錯口物（例如Ζη·蛋白錯合物）；及/或非離子型界面活性劑，諸如 TWEEN®、PLUr〇nics® 或 PEG。。用於皮下投藥之調配物可（例如）為水性的或經冷凍乾燥。適於皮下投與之冷凍乾燥調配物描述於例如美國專利第6,267,958號（Andya等人）中。該等冷束乾燥調配物可用合適稀釋劑復原至高蛋白濃度，且祕復原調配物可向本文中欲治療之哺乳動物皮下投與。亦涵蓋抗趙之結晶形式。參見例如美國專利公開案第2〇〇2/〇i367i9Ai號 (Shenoy 等人）。 141616.doc .127- 201016233 需要時’本文中之調配物亦可含有至少一種用於治療特定適應症的第二化合物，諸如具有互補活性而彼此間無不寿J景響的第一化合物。舉例而言，調配物中可能需要進一步提供細胞毒性劑（例如甲胺喋呤、環磷醯胺或硫唑嗓吟）、化學治療劑、免疫抑制劑、細胞激素、細胞激素拮抗劑或抗體、生長因子、激素、整合素、整合素拮抗劑或抗體（例如LFA-1抗體、或α4整合素抗體（諸如那他珠單抗））、干擾素類藥物（諸如11^_0_1&或11^_0_1|5)、寡肽（諸如醋酸格拉替雷）、靜脈内免疫球蛋白（γ球蛋白）、淋巴細胞消耗性藥物（例如米托蒽g昆（mitoxantr〇ne)、環鱗酿胺、 CAMPATH®抗體或克拉曲濱）、非淋巴細胞消耗性免疫抑制藥物（例如MMF或環孢素）、「抑制素」類之膽固醇降低藥物、雌二醇、治療狼瘡、MS、類風濕性關節炎或發炎性腸病之繼發性或相關性症狀（例如痙攣、失禁、疼痛、疲勞）的藥物、TNF抑制劑、DMARD、NSAID、皮質類固醇（例如甲基強的松龍 '強的松、地塞米松或糖皮質激素）、左旋甲狀腺素、環孢素A、生長抑素類似物、抗代謝物、T-細胞或B-細胞表面拮抗劑/抗體等藥劑，或如上文所提及之其他藥劑。該等其他藥劑之類型及有效量視以下因素而定：例如調配物中存在之抗體量、所治療之狼瘡、 MS、類風濕性關節炎或其他病狀或疾病之類型及個體之臨床參數。活性成份亦可捕獲於微膠囊中，例如分別藉由凝聚技術或藉由界面聚合技術所製備之微膠囊，例如羥基曱基纖維 141616.doc -128· 201016233 素或明膠微膠囊及聚（甲基丙烯酸曱酯）微膠囊；捕獲於膠狀藥物傳遞系統（例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊）中或巨乳液中。該等技術揭示於例如 Remington's Pharmaceutical Sciences 第 16版，〇s〇i, A.編 (1980)中。可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之合適實例包括含有非消耗性抗體之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈成形物品之形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠（例如聚（甲基丙烯酸2·羥乙酯）或聚（乙烯醇））、聚丙交酯（美國專利第3,773,919號）、^麵胺酸與γ-乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、非降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物（諸如lUPR〇n DEPOT®(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林（ieupr〇nde acetate)組成之可注射微球體））及聚羥基丁酸。用於活體内投與之調配物須無菌。此容易藉由例如經無菌濾膜過濾來實現。 E·製品在本發明之另一實施例中，提供一種製品，其含有適用於治療狼瘡、MS、類風濕性關節炎、發炎性腸病或上述其他病狀或疾病之物質。該製品包含（a)容器，該容器内包含3有非消耗性CD4抗體及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑的組合物；及（b)關於將該抗體單獨或與至少一種第二化 ^物組合投與來治療個體之狼瘡、MS、類風濕性關節犬、發炎性腸病或其他病狀或疾病的包裝插頁說明書。 I41616.doc •129- 201016233 包裝插頁位於容器上或附荖 „ ;谷崙。合適容器包括例如 ::、小瓶、注射器等容器。容器可由多種璃或塑膠）形成。容器裝有或含有效治療狼瘡、繼、類; 濕性關節炎、發炎性腸病其他病狀或疾病之組合物且可且有無菌接取孔(例如，纟器可為靜脈内溶液袋或具有可由皮下注射針穿透之塞子的小瓶）。該組合物中之至少—種活性劑為非消耗性CD4抗體。x 仏〆體‘籤或包裝插頁指示該組合物係用於治療適於治療之個體外'x々瑕之狼瘡、MS、類風濕性關卽炎、發炎性腸病或其他病肤式届狀或疾病，以及關於抗體及所提供之任何其他藥物之給藥量及_㈣的特定指導。該製品可進一步包含含有醫藥與令晉樂學上可接受之稀釋緩衝劑二容器’該等稀釋緩衝劑諸如注射用抑菌水（BWFI)、峨酸鹽緩衝食鹽水、㈣氏溶液（Rin㈣，s sQiutiQn)及/或葡萄糖溶液。該製品視情況包含含有第二化合物(諸如本文中所述之彼等任何化合物)之第二或第三容器，其中該製品進-步包含關於用第二化合物治療個體之包裝插頁說明書。或者，包含非消耗性抗CD4抗體之組合物亦可包含第二化合物。該製品可進一步包括就商業及使用者立場而言所需要之其他物質’包括其他緩衝劑、稀釋劑、過滤 '器、針及注射器。 III·實例本發明之其他細料由下列非限制性實例說明。本說明書中之所有引用文獻之揭示内容係以引用之方式明確併入本文中。 141616.doc 130- 201016233 實例1 效應功能最小化及活體内清除率降低之非消耗性抗CD4變異體擔心抗CD4抗體乾向T細胞引起免疫抑制之顧慮已減少或消除。另外，如上文在[先前技術]部分中所論述，先前抗CD4抗體之臨床結果指示需要抗CD4抗體之更理想給藥方案。因此，抗CD4抗體變異體（參見下表2)經由在親本分子中進行某些胺基酸取代可工程改造成非消耗性抗CD4抗體變異體。特定而言，將重鏈中之胺基酸位置297處之天冬醯胺酸修改為丙胺酸（N297A)。此取代已展示可消除Fc 區之N-連接型糖基化，已展示此對於抗體結合Fey受體具重要作用（Burton 及 Dwek，Science 313:627-28，2006)。另外，已展示去糖基化抗體不能誘導活體外與活體内ADCC (Isaacs 等人，J. Immunol. 148:3062-71, 1992 ; Lund等人， Mol. Immunol. 29:53-9, 1992)。缺少 FcyR相互作用可因 T-細胞不消耗與輸注反應潛在降低（兩者皆經由Fey受體介導）而提供改良之安全性。另外，由於由CD4介導之消除所引起之快速清除，因此可能需要頻繁給藥以維持CD4下調及飽和。上文已展示經工程改造具有增強之FcRn結合的抗體在猴體内顯現延長之半衰期及較長時間之暴露（Hinton等人，J. Immunol. 176:346-56, 2006)。然而，此可能為測試經工程改造而缺乏糖基化且影響結合FcRn之抗體、特定而言抗CD4抗體對活體内半衰期之影響的首次研究。因此，非消耗性抗CD4 141616.doc -131 - 201016233 抗體變異體（參見下表2)亦經工程改造以影響與FcRn之結合。特定而言，將重鏈中之胺基酸位置434之天冬醯胺酸修改為丙胺酸（N434A)或組胺酸（N434H)。如下列實驗中所述，測試某些非消耗性抗CD4變異體與人類及非人類靈長類動物之CD4+T細胞之結合、與Fey受體及FcRn之結合，且亦評定該等抗CD4變異體之效應功能，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC)及補體依賴性細胞毒性 (CDC)。另外，如下文所述，活體内測試某些非消耗性抗 CD4變異體且監測該等變異體之清除率以及CD4 T細胞受體佔有率。表2 :抗CD4抗體變異體。

抗體變異體輕鏈 LC變異體AA 重鍵 HC變異體AA 位置 AA 位置 AA A LC1 117 P HC1 297 N (SEQ ID ΝΟ.:1) (SEQ ID NO.: 3) 434 N B LC1 117 P HC2 297 A (SEQ ID NO.: 1) (SEQ ID NO. :4) 434 N C LC1 117 P HC3 297 A (SEQ ID NO.: 1) (SEQ ID NO.: 5) 434 A D LC1 117 P HC4 297 A (SEQ ID NO.: 1) (SEQ ID NO.: 6) 434 H E LC2 117 L HC1 297 N (SEQIDNO.:2) (SEQ ID NO.: 3) 434 N F LC2 117 L HC2 297 A (SEQIDNO.:2) (SEQ ID NO.:4) 434 N G LC2 117 L HC3 297 A (SEQIDNO.:2) (SEQ ID NO·: 5) 434 A Η LC2 117 L HC4 297 A (SEQ ID NO.:2) (SEQ ID NO·: 6) 434 H 藉由平衡結合分析量測CD4結合親和力

Jurkat人類白血病T-細胞株表現CD4(參見圖4A)且在平衡結合分析中用於測定變異體B及變異體D對CD4之親和力。變異體B與變異體D相似，例外之處為變異體B在位置434 141616.doc -132- 201016233 攜載正常（野生型）胺基酸（N434)。平衡結合量測如下進行。在37°C下於5% C02中將CD4+Jurkat細胞培養於生長培養基中，該培養基含有補充有10%胎牛血清（FBS)、2 mM L-麩醯胺酸、lx青黴素·鏈黴素的RPMI 1640培養基。用結合缓衝液（50:50 DMEM/F12，具有2% FBS 及 50 mM Hepes(pH 7.2)洗滌細胞且以每孔約2.3 x 105個細胞（含於0.2毫升結合緩衝液中）置放於96孔板中。使用蛾分子法（Iodogen method)使非消耗性抗CD4抗體變異體（變異體B及變異體D) 碘化。藉由凝膠過濾使用NAP_5管柱自游離125I-NA純化放射性標記之抗體；經純化之變異體D抗體具有16.44 pCi/ 微克之比活性且變異體B抗體之比活性為13.37 pCi/微克。將含有固定濃度之碘化抗體及遞減濃度之經連續稀釋之未標記抗體的競爭混合物添加至細胞中且接著在4°C下培育4 小時。每次與細胞培育之碘化抗體的最終濃度為約25 pM (2.5xl04 cpm/0.25 mL)且與細胞培育之未標記抗體的最終濃度不同，開始為50 nM且11次連續稀釋以2倍遞減。重複競爭反應試驗三次。將細胞轉移至Millipore Multiscreen過濾板中且用結合緩衝液洗滌4次以使游離碘化抗體與結合之碘化抗體分離。用Wallac Wizard 1470γ計數器（Perkin Elmer Life and Analytical Sciences Inc.; Wellesley，MA)對過濾器進行計數。使用NewLigand軟體（Genentech)評估結合數據以測定抗體之結合親和力，該軟體使用Munson及 Rodbard，Anal. Biochem· 107:220-39, 1980之非線性回歸擬 141616.doc -133- 201016233 合演算法。產生且分析飽和結合曲線及經由數據線性轉換所獲得之斯卡查德（Scatchard)圖（數據未圖示）。經由對原始結合數據進行非線性回歸曲線擬合獲得變異體B及變異體D結合 Jurkat細胞的指定親和力或KD(Munson及Rodbard，Anal. Biochem. 107:220-39, 1980)。數據展示變異體D及變異體B 之平衡結合常數相當，分別為65 pM及62 pM且表明變異體 D中之胺基酸434之取代（N43 4H)不改變抗體與CD4結合。變異體D與人類、狒狒、獼猴及恆河猴CD4+T細胞之結合，如藉由流式細胞儀所量測為表徵變異體D與原生人類CD4+T細胞之結合且測定其與非人類靈長類動物種之CD4的交叉反應性，對人類、狒狒、獼猴及恆河猴之細胞進行飽和結合滴定實驗。如下文所述，藉由流式細胞儀分析及定量結合。新鮮人類血液係自健康人類捐獻者獲得。非人類靈長類動物血液係自San Antonio, Texas之西南生物醫學研究基金會（Southwest Foundation for Biomedical Research)獲得（亦即，狒狒、獼猴及恆河猴）。用等體積PBS稀釋各血液樣本，覆蓋於Ficoll(GE Healthcare; Princeton，NJ)上，接著離心以分離單核細胞。使用紅血球溶解緩衝液（Qiagen; Valencia, CA)溶解殘餘紅jk球且洗滌。使細胞結合連續滴定之變異體D抗體或對照單株抗體（該對照單株抗體含有類似於變異體D但缺少變異體D之修飾的人類IgGl Fc)，且在冰上培育30分鐘且洗滌。接著將細胞與20微克/毫升之Fey 141616.doc -134- 201016233 特異性人類IgG PE結合抗體（Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc·; West Grove, PA)在冰上再培育 30分鐘以偵測所結合之抗CD4抗體之量。洗滌細胞，接著用抗CD3 異硫氰酸螢光素（FITC)及抗CD8別藻藍蛋白（APC)(BD Biosciences)在飽和濃度下在冰上共染色30分鐘且接著洗滌。此等抗體對不受變異體D結合約束的CD4+T細胞提供選通方式。用FACSCalibur流式細胞儀（BD Biosciences)測試樣本且使用Flowjo軟體分析。對CD4染色之平均螢光強度（MFI)與結合期間所存在之變異體d之濃度的關係作圖。使用四參數曲線-擬合演算法（KaleidaGraphTM軟體）自結合曲線計算半數最大有效濃度（EC50)值。變異體D對人類CD4+T細胞之結合概況與對狒狒CD4+T 細胞之結合概況相對而言類似，其中在類似抗體濃度下出現CD4飽和（數據未圖示）。相比之下，使恆河猴及獼猴之T 細胞上之CD4飽和所需要的濃度比對於人類及狒狒所需之濃度高3個數量級（數據未示）。對照抗髏未展示與任何物種之CD4+T細胞之可偵測結合。對於大部分抗體/抗原相互作用而言，可自達成半數最大結合所需之抗體濃度（亦即EC50濃度）估算結合親和力 (Wessels等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9170-74, 1987 ; Neri等人，Trends in Biotechn. 14:465-70，1996)。如下表3中所示，變異體D對人類與狒狒CD4+T細胞之估算親和力（EC50值）分別為0.17 nM及0.14 nM，而對恆河猴及獮猴CD4之值大大提高（分別為180 nM及177 nM)。表3中 141616.doc •135· 201016233 所述之基於流式細胞儀所測之EC50值描述來自4次人類及狒狒細胞實驗之平均值及來自2次恆河猴及獼猴實驗之平均值。表3 基於流式細胞儀分析之變異體D對T細胞上之CD4之EC50值(nM) 物種變異體D 人類 0.17±0.08 狒狒 0.14±0.05 獼猴 180.6 恆河猴 177.7 aEC50=半數最大有效濃度

Fey受體結合在基於ELISA之配位體結合檢驗中使用各別重組Fey受體來量測各種抗體與FcyRIA、FcyRIIA、FcyRIIB 及 FcyRIIIA 之2個同種異型（FI 58及VI 5 8)之結合親和力。經純化之人類Fey受體係以含有在C末端與Gly/6xHis/麩胱甘肽S-轉移酶（GST)多肽標記連接之受體γ鏈之細胞外域的融合蛋白形式表現。抗體與彼等人類Fey受體之結合親和力係如下檢定。對於低親和力受體，亦即FcYRIIA(CD32A)、FcyRIIB (CD32B)及 FcyRIIIA(CD16)之兩個同種異型（F-158 及 V-15 8)，藉由以1:3抗體：交聯F(ab')2之近似莫耳比使抗體與山羊抗人類 κ 鍵之 F(ab')2 片段（ICN Biomedical; Irvine，CA) 交聯來測試呈多聚體形式之抗鱧。用抗GST抗體 (Genentech)塗覆各板且用牛血清白蛋白（BSA)阻斷。用 £1^4051^板洗蘇器（Biotek Instruments; Winooski, VT)以含有0.05% Tween-20之磷酸鹽緩衝食鹽水（PBS)洗滌後，將 141616.doc -136- 201016233

Fey受體以每孔25奈克添加至板中且在室溫下培育1小時。洗滌各板後，添加連續稀釋之呈多聚體複合物形式之測試抗體且將各板在室溫下培育2小時。洗滌板以移除未結合之抗體後，用辣根過氧化酶（HRP) 結合之山羊抗人類F(ab’）2之F(ab')2片段（Jackson ImmunoResearch Laboratories; West Grove，PA)摘測與 Fey 受體結合之抗體，繼而添加受質四曱基聯苯胺（TMB) (Kirkegaard & Perry Laboratories; Gaithersburg, MD)。視所測試之Fey受體而定，將各板在室溫下培育5-20分鐘，以允許顯色。用1 M H3P〇4終止反應且用微板讀取器 (SpectraMax®190，Molecular Devices; Sunnyvale, CA)量測 450奈米下之吸光度。藉由對雙重複之抗體稀釋液之平均吸光度值與抗體濃度之關係作圖來產生劑量-反應結合曲線。在使用SoftMax Pro(Molecular Devices)以4參數方程式擬合結合曲線之後，測定偵測到結合Fey受體所產生之最大反應之50%時的抗體有效濃度值（EC50)。對於高親和力受體（FcyRIA)而言’檢定呈無交聯之單體形式之抗體。其餘檢定程序與低親和力受體之彼等檢定程序相同。在如上所述之基於ELISA之配位體結合檢定中量測非消耗性抗CD4抗體變異體D(參見表2)(變異體D)與FcyRIA、 FcyRIIA、FcyRIIB 及 FcyRIIIA 之 2 個同種異型（F158 及 VI5 8)之結合親和力。作為陽性對照，測試2種不同對照單株抗體，每一者皆含有類似於變異體D但缺少變異體D之 141616.doc -137- 201016233 修飾的人類IgGl Fc。測試雙重複樣本且對各FcY受體進行總共3次獨立實驗。代表性實驗之結合曲線描繪於圖3 A-E 中。圖3A-E中所示之結果獲自變異體〇及2種對照單株抗體之活體外結合實驗之一代表性操作。對於結合FcyRl而 § ’檢定呈單體形式之抗體，且對於結合所測試之其他 FCY受體而言’檢定呈多聚體形式之抗體。收集雙重複試驗之所有數據點且對雙重複試驗之吸光度平均值與抗體濃度的關係作圖。如圖3 A-E中所示，2種對照單株抗體似乎 _ 類似地結合所測試之各種FcY受體，而變異體D展示與所測試之所有Fq受體之結合顯著降低。變異體d對FcY受體之、结合最1小符合關於在胺基酸297位置具有突變之人類IgGl 才几體所公布的結果（Lund等人，Mol. Immunol. 29:53-9, 1992 ’ Shields等人，j Biol· Chem. 276:659卜604, 2001)。此大變消除Fc區處之N_連接型糖基化，已展示此對於抗體、’Fey雙體具重要作用（Burton 及 Dwek，Science 313:627-28’ 2006)。合理推斷變異體〇係因胺基酸位置297經工程改⑩ 造式胺基酸取代而以顯著低於野生型人類IgGl抗體親和力之親和力結合FcyR。外周血液單核細胞之ADCC檢定使用來自健康捐獻者之外周血液單核細胞（PBMC)作為效應細胞及使用2種人類T-淋巴瘤細胞株Jurkat及Hut-78(美國菌種保存中心（American Type Culture Collection [ATCC])，Manassas, VA)作為標靶細胞來進行ADCC檢定。 141616.doc • 138· 201016233 為使FcyRIIIA之殘基158位置之同種異型差異所致的捐獻者變化最小化’捐血者限於攜帶異型接合Fc(yRIIIA同種異型（F/V158)之捐血者。簡育之，藉由Fic〇llpaqueTM(GE Healthcare，Sweden)密度梯度離心自健康人類捐獻者之新

❹ 鮮A液分離PBMC。將於檢定培養基（具有1% BSa及1〇〇單位/毫升青徽素/鍵徵素之rP]V[I_164〇)中製備之標靶細胞 (4 X 10 )接種於96孔圓底組織培養板之各孔中。將連續稀釋之抗體以50微升/孔泰加至含有標靶細胞之板中，繼而在 37C、5% C〇2下培育3〇分鐘以允許調理作用。在連續4倍稀釋後’抗體之最終濃度範圍為1〇〇〇〇奈克/毫升至〇〇〇38 奈克/毫升。培月後’將檢定培養基中之PBMC效應細胞 (1.〇 ίο )添加至各孔中直至25:1效應細胞：標把細胞之比率且將各板再培育4小時。在培f結束時將各板離心且使用細胞毒性偵測套魬（R〇che Diagn〇stics c〇rp〇rati〇n;

IndianaP〇liS，IN)檢定上清液之乳酸脫氫酶（LDH)活性。經由使用微板讀取器（sPeetraMax® 19〇, M〇lecular Devices; SUnnyVale，CA)量測切〇奈米下之吸光度來定量細胞溶解。僅含有標乾細胞之孔的吸光度用作本底對照（低對照广而 3有使用Triton XIGG所溶解之標把細胞之孔提供可獲得之最大信號(咼對照)。在未添加抗體之情況下在含有標靶細胞及效應細胞之孔中量測抗體不依賴性細胞之細胞毒性 (AICC)。具體ADCC程度係如下計算： %ADCC=100x^^t^lSIS) 141616.doc -139· 201016233 對雙重複抗體樣本稀釋液之平均adcc值與抗體濃度的關係作圖，且藉由使用SoftMax Pro將數據與4參數方程式擬合來產生EC5G值。對於流式細胞儀分析，自BD Biosciences(San Jose, CA) 獲得針對人類CD4之螢光素結合小鼠單株抗體（純系RPA-T4)及螢光素結合同種型對照物小鼠單株抗體MOPC-1。依製造商建議，用抗體將細胞染色。使用FACSCaliburTM流式細胞儀（BD Biosciences)自各樣本獲得5000個活選通事 ® 件（live-gated event)。使用 CellQuest™ 軟體程式（BD Biosciences)分析數據。 ADCC為公認之免疫效應功能，其中抗原特異性抗體導引先天免疫系統之效應細胞殺死表現抗原之標靶細胞。在此研究中，使用健康捐獻者血液之經純化PBMC評定變異體D之ADCC活性潛力。如上文所述，使用2種人類T-淋巴瘤細胞株Jurkat及Hut-78作為標乾細胞。藉由流式細胞儀 a ❿ 分析驗證CD4表現於2類型標靶細胞表面上（參見圖4A)。變異體A與變異體D相似，例外之處為變異體A含有不具胺基酸取代（亦即在位置297及434)之正常（野生型）人類IgGl Fc 區且作為陽性對照來測試。使用不同捐獻者之PBMC、以各標靶細胞株檢定抗體至少兩次。對ADCC百分比與抗體濃度的關係作圖且用4參數模型擬合數據。用Hut-78細胞檢定變異體A及變異體D之一代表性實驗之ADCC曲線描繪於圖4B中。雖然對於對照抗體（變異體A)觀察到ADCC，但 141616.doc -140- 201016233 對於高達10微克/毫升濃度之變異體D則未觀察到ADCC活性。在使用Jurkat細胞作為標靶細胞之實驗中獲得類似結果（數據未圖示）。此研究中變異體D缺乏ADCC之結果符合所公布之去糖基化抗體不能誘導活體外及活體内ADCC之結果（Isaacs 等人，J. Immunol. 148:3062-71，1992 ; Lund等人，Mol. Immunol. 29:53-9，1992)。補體依賴性細胞毒性檢定使用來源於人類企清之補體（Quidel Corporation; San Diego, C A)、以Hut-78或Jurkat細胞作為標把細胞來進行補體依賴性細胞毒性（CDC)檢定。抗體樣本於檢定培養基（補充有 20 mM Hepes(pH 7_2)、0.1% BSA及0.1 毫克/毫升慶大黴素之RPMI-1640培養基）中連續稀釋，且分配於96孔組織培養板（Costar® Corning Inc.; Acton，MA)中。添加人類血清補體（1:3稀釋於檢定培養基中）及標靶細胞（1〇5個細胞/ 孔）後，在37°C、5% C02下將板培育1-2小時。培育後，以每孔50微升添加AlamarBlueTM且將板再培育15-18小時。經由在530奈米激發波長下、在590奈米發射波長下用螢光板讀取器（SpectraMax GeminiXS，Molecular Devices)測定吸光度來定量測試抗體之CDC活性。藉由將數據與4參數方程式（SoftMax Pro)擬合來產生EC5〇值。補體依賴性細胞毒性（CDC)為一種細胞殺死機制，其中補體依賴性細胞溶解作為抗體結合Clq之結果出現，從而活化補體路徑。在此研究中，使用正常人類血清補體及在細胞表面上表現CD4之Hut-78及Jurkat人類T-淋巴瘤細胞株 141616.doc -141· 201016233 來評定變異體D誘導CDC活性之能力。變異體A含有不具胺基酸取代（亦即在位置297及/或434處）之正常（野生型）人類IgGl Fc區且作為陽性對照。在抗體及人類血清補體存在下用AlamarBlue™量測細胞存活率。AlamarBlue™為無毒指示劑染料，其回應活細胞之代謝活性產生比色變化及螢光信號。檢定信號與活細胞數目成正比；因此，信號降低度指示由抗體所誘導之細胞毒性之程度。在此研究中，進行3次獨立CDC檢定操作，2次用Hut-78作為標靶細胞且 1次用Jurkat作為標靶細胞。在所有3次實驗中，對於變異體A或變異體D而言，未觀察到可偵測CDC活性。在變異體D存在下缺乏CDC活性符合所公布之人類IgGl中之碳水化合物之消耗會中止其結合Clq且防止補體系統活化之報導（Tao及 Morrrison，J. Immunol. 143:2595-601, 1989)。在含有正常IgGl Fc區且在檢定中展示活性ADCC(參見上文）的變異體A存在下缺乏CDC活性在某種程度上難以解釋。已展示腫瘤細胞株對ADCC及CDC可呈現不同敏感性，且對CDC之敏感性可受多種因素影響，包括受體密度及補體調節蛋白之表現量（Gelderman 等人，1>611(!51111：〇11111〇1· 25:158-64, 2004 ; van Meerten等人，Clin. Cancer Res. 12:4027-35, 2006)。在此檢定系統中，Hut-78與Jurkat細胞均可耐受變異體A及變異體D抗體在所測試之濃度下所引起之CDC。然而，在研究中缺乏真實陽性對照而無法得到關於變異體D之潛在CDC活性之絕對結論。上述結果指示變異體D以最小親和力（基於結合曲線）結 141616.doc -142- 201016233 合Fey受體且不能誘導活體外ADCC或CDC。變異體D缺乏效應功能符合所公布之關於去糖基化抗體之結果。

FcRn結合進行下列實驗以評定某些非消耗性抗CD4變異體對人類及狒狒FcRn之相對親和力。所測試之變異體包括變異體B 及變異體D。變異體B與變異體D相似，例外之處為變異體 B在位置434攜有正常（野生型）胺基酸（N434)(參見表2)。變異體B及變異體D結合人類及狒狒FcRn之IC50係使用 BIAcore 3000表面電聚共振系統來量測（BIAcore Inc, Piscataway，NJ ; Lofas及 Johnsson 1990 ; Karlsson 等人， 1991)。用於將含有類似於變異體D但缺乏變異體D之修飾之人類IgGl Fc的對照單株抗體（對照抗體）固著於羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片（Sensor Chip CM5，BIAcore)上之胺偶合方法基本上如製造商說明書（BIAcore 1991; Johnsson 等人1991)中所述。簡言之，使用與N-羥基丁二醯亞胺 (NHS)混合之N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC HC1)來活化生物感測器晶片。將於10 mM乙酸鈉（pH 4)中稀釋至12微克/毫升之對照抗體注射至晶片上以獲得約3000 RU之固著抗體信號。接著經由注射1 Μ乙醇胺阻斷未反應之丁二醯亞胺基團，獲得約2000 RU之對照抗體之最終密度。使用熟習此項技術者所熟知之標準方法、經由在CHO細胞中短暫表現來產生可溶性組胺酸標記之人類FcRn(SEQ ID NO: 13)及可溶性組胺酸標記之狒狒FcRn(SEQ ID NO: 141616.doc -143- 201016233 14)。根據熟習此項技術者所熟知之方法、使用鎳管柱層析術純化各種組胺酸標記之FcRn多肽。純化後，組胺酸標記未自FcRn多肽移除。為簡單起見，組胺酸標記之FcRn 多肽隨後在下文檢定方法及結果之論述中稱作「FcRn」，但應瞭解，組胺酸標記仍與多肽連接。變異體B及變異體 D各自在操作緩衝液（含有0.05% Tween-20之PBS，pH 6)中連續稀釋，且在注射前，在室溫下與恆定濃度（100 nM)之 FcRn培育30分鐘。所用抗體之最終濃度在2.29 nM至5 μΜ範圍内。同時製作FcRn校正曲線（使用已知濃度之FcRn之連續稀釋液）。將 FcRn及抗體混合物注射於晶片上，且在開始注射後第50秒獲得報導點。使用空白緩衝液、FcRn不存在下之抗體結合及參考流動細胞作為陰性對照以調整報導點之值。接著使用FcRn校正曲線將結果換算為游離FcRn之濃度。在GraphPad Prism中對游離FcRn之濃度與抗體濃度之對數的關係作圖。結合之IC50係藉由將數據與4參數曲線 (Y=m4+(m3-m4)/(l + 10A((logIC50-X)*希爾斜率））擬合來測定，其中m3為最大信號，m4為最小信號且希爾斜率 (Hillslope)為斜率常數。重複實驗至少3次，且以平均標準誤差（SEM)報導IC50。結果展示變異體D結合人類FcRn的相對親和力與結合狒狒FcRn的相對親和力相似且在pH 6下比變異體B之結合親和力高約3.5倍。變異體D與人類FcRn及狒狒FcRn結合之 IC50值分別為144.1 nM及160.2 nM，而變異體B則展現明 141616.doc -144· 201016233 顯更高之值，分別為496.0 nM及557.9 nM(表4)。表4 在卩^^6.0下與人類及狒狒|^1^»之結合，如藉由81八〇^分析所量測 ~ 人類 FcRn lC50(nM) 狒狒 FcRn IC50(nM) 變異體 B 496.0±38.5 557.9±36.2 變異體 D___144.1 士 16.3_160.2±23.1_ 8值表示3次實驗之平均值非消耗性抗CD4變異體之活體内清除率進行下列實驗以評定某些非消耗性抗CD4變異體在狒狒 φ 體内之活體内清除率。所測試之變異體包括變異體B、變異體C及變異體D。變異體B與變異體D相似，例外之處為變異體B在位置434攜有正常（野生型）胺基酸（N434)(參見表 2)。變異體C與變異體D相似，例外之處為變異體C在位置 434攜有不同胺基酸取代（N434A)(參見表2)。物種在給藥前，將20隻雄性及20隻雌性有目的繁殖之未經藥物處理（drug-nalfve)之東非狒拂（olive baboon，非洲起源； ^ 西南生物醫學研究基金會（Southwest Foundation for Biomedical Research); San Antonio，TX)馴養至少 7天。動物為2_4歲且在研究前篩選時重5-1 2公斤。僅使用看似健康且無明顯異常之動物進行研究。研究設計動物隨機分為4組；各動物藉由缓慢静脉内輸注接受4個劑量之媒劑或測試物質。第1組動物（2隻雄性且2隻雌性）接受4.0毫升/公斤之媒劑。第2組、第3組及第4組動物（每組6 141616.doc •145- 201016233 隻雄性及6隻雌性)分別接受4〇毫克/公斤之變異體b、變異體C或變異體£)，以39臺并/八 M 升/公斤至41毫升/公斤劑量投與。2週期間每週給藥2次(第以、第斗天、第8天及第12 天）。劑量製備測試物以最終濃度製備於單次使用之小瓶中。投藥前，將冷凍之測試物小瓶（第2_4組）在經設定可保持2。(：_8^之溫度範圍的冰箱中融化隔夜。在劑量投藥之每天，在製備劑量溶液則，將融化之測試物及媒劑小瓶在環境溫度下平衡約30分鐘。輕緩旋動小瓶，接著將個別小瓶之内含物組合併於各給藥組特定之單個去熱原無菌玻璃容器中。劑量溶液在製備6小時内使用。劑量投藥在第1天、第4天、第8天及第12天，動物經由臂或腿之淺靜脈接受連續静脉内輸注（3_4毫升/分鐘）之測試物，繼而1毫升食鹽水沖洗。醴重量測在馴養期第7天、劑量投藥第7天及恢復第7天、第21 天、第35天、第45天及第56/57天採集個別動物體重。血液樣本採集藉由向外周靜脈中靜脈穿刺來採集各動物之企液樣本。樣本採集在下列時間點採集用於PK分析之血液樣本（1毫升）且轉移至血清分離管中： 141616.doc -146- 201016233 •在第1天、第4天及第8天，給藥前小時及給藥後1小時 •在第12天，給藥前y小時及給藥後1小時、6小時及12小時 •在第2、5、9、13、14、16、19、22、24、26、28、30、 33、36、40、43、47、54、57、61及64天 •在第68或69天，屍檢前。對於PK分析，時間點開始於第0天（研究第1天=PK第0 天）且記錄為第 0、0.042、1、2.958、3.042、4、6.958、 7.042、8、10.958、11.042、11.25、11.5、12、13、15、 18、21、23、25、27、29、32、35、39、42 ' 46、53、 56、60、63及67天（研究第68天）。血液樣本處理樣本處理使用於ΡΚ分析之樣本在室溫下凝結20-60分鐘。在採集i 小時内，在2°C-8°C下，以l，500_2,000xg之相對離心力將凝結樣本離心10-15分鐘。在離心結束約20分鐘内自樣本分離出約500微升血清且轉移至預先標記之EPPENDORF® 管中。將該等管保持於乾冰上或立即儲存於經設定可保持 -60°C至-86°C之溫度的冰箱中直至檢定樣本。檢定血清中抗CD4抗體濃度檢定（ELISA) 使用ELISA檢定來測定血清中抗CD4抗體之濃度。將於磷酸鹽缓衝食鹽水（PBS)中稀釋至1微克/毫升之人類可溶性 CD4(rCD4，Genentech)塗覆至聚苯乙稀 384孔 MaxiSorpTM 板（第 464718 號 ’ Nalgate NUNC®, Sigma-Aldrich; St 14l616.doc -147- 201016233

Louis, MO)上。16-120小時後，移除塗層且用阻斷緩衝液 (PBS/0.5%牛血清白蛋白（BSA)/Proclin)阻斷0.5-3小時。取自10微克/毫升標準儲備物之抗CD4變異體B標準物於檢定緩衝液（PBS/0.5% BSA/0.05% Tween 20/Proclin)中製成稀釋液（0.39奈克/毫升-50奈克/毫升）。使用3種含量的對照物監測檢定效能。藉由向狒狒血清中加入3種濃度之變異體B 來製成對照物。在每個檢定日，對照物以1:20於檢定緩衝液中稀釋。樣本以1:20之最小稀釋度於檢定緩衝液中稀釋，接著進一步稀釋至檢定範圍内。用洗滌緩衝液 (PBS/0.05% Tween 20)將經阻斷之板洗滌3次，且將標準物、對照物及樣本添加至合適檢定孔中。1.5小時培育後，洗滌板6次。藉由添加稀釋於檢定緩衝液中之吸附猴 IgG並結合辣根過氧化酶之兔抗人IgG抗體（第CUS1684.H 號，Binding Site; San Diego, CA)來债測所結合之變異體 B。培育1小時後，洗滌板6次且將受質（TMB受質第50-65-02號，KPL; Gaithersburg, MD)添加至所有檢定孔中。20分鐘後用1 Μ磷酸中止受質反應。使用620奈米參考波長、在 450奈米下讀取各板。藉由使用4參數曲線擬合演算法、將結果與標準比較來測定樣本濃度。檢定之定量極限（LOQ) 為0.016微克/毫升。 ΡΚ參數測定方法非代謝區（Noncompartmental)PK分析藉由静脉内輸注（3-4毫升/分鐘）8.25分鐘至12.26分鐘來對動物進行給藥。出於分析目的，使用靜脉内快速輸入模 141616.doc -148- 201016233 型（IV bolus model of input)(型號 201, WinNonlin-Pro，版本 5.0.1，Pharsight Corporation; Mountain View, CA)來分析各動物之血清濃度-時間數據。使用下列方法估算特定PK 參數： • AUCall=血清濃度-時間曲線下至最後觀察點之面積 •CL=清除率（劑量/AUCinf) • Fss=穩定狀態下之分布容積（MRTinf · CL) 血清中之非消耗性抗CD4抗體濃度平均（士SD)血清濃度概況描繪於圖5中。另外，藉由流式細胞儀量測外周血液T細胞上之CD4受體飽和及調節。與給藥前時間點相比，在變異體D之首次給藥後1小時，外周 T淋巴細胞上>98%之CD4受體飽和（數據未圖示）。另外，投與首次劑量後3天開始觀察到外周T淋巴細胞上之CD4受體下調30%-40%(數據未圖示）。第68/69天研究結束時， CD4受體飽和及CD4受體下調完全逆轉。 PK數據分析數據分析中使用標稱樣本採集時間及劑量。處於或低於 LOQ之血清濃度作為缺漏處理且不用於描述或分析PK數據。對於PK數據計算而言，將研究第1天轉換為PK第0天以指示給藥開始（參見血液樣本採集）。平均（士SD)PK參數描繪於表5中。 141616.doc -149- 201016233 表5 --- 變異體B、變異體C或變異體D静脉内輸注投與狒狒後，非代謝區pK參數估算值(平 _____均值土SD) _ PK參數變異艘B 40毫克/公斤静脉内給藥4次 (n=12) 變異體C 40毫克/公斤静豚内給藥4次 (n=12) 變異體D 40毫克/公斤静脉内給藥4次 (n=12) AUCa„(天數.微1/毫升） 30900±8240 46100+6090 60000土11900 CL(毫升/公斤/天） 5.53+1.46 3.53±0.501 2.77±0.615 vss(毫升/公斤） 69.5±18.1 58.0+6.23 48.6+9.71 AUCall=血清濃度-時間曲線下至最後觀察點之面積； CL=清除率；PK=藥物動力學；vss=穩定狀態下之分布容積。數據之非代謝區分析指示，與變異體B相比，在給與變異體C之動物的樣本中，CL降低36.2%且在給與變異體D之動物的樣本中，CL降低49.9%。此等CL值降低對應於變異體C及D之半衰期延長（與變異體B相比）。預期變異體B之半衰期由於受體介導之CL及所得非線性PK而具有濃度依賴性。與變異體B相比時，變異體C及D之CL降低引起變異體C及變異體D之暴露（AUC)分別增加49.3%及94.3%。與變異體B相比，變異體C與D之CL降低及AUC增加在統計上有顯著意義，P值4.001 (使用用於多重測試之塔基-克拉莫調整方案（Tukey-Kramer adjustment)來計算）。經由用於多重測試之塔基-克拉莫調整方案所計算之雙側95%信賴區間結果指示，與變異體B相比，變異體D之CL降低38%-59%。變異體C及D之分布容積範圍與變異體B相似（約50-70毫升/ 公斤），指示所有3種分子大部分仍存在於血液代謝區中。此結果符合40毫克/公斤劑量使CD4介導之CL飽和的先前 141616.doc • 150- 201016233 觀察結果。另外，經流式細胞儀評估CD4 T-細胞受體佔有。結果描繪於圖6中。早在變異體B、變異體C或變異體D之首次劑量投與後1小時，與給藥前基線量測相比，>98%之CD4 T-細胞受體被佔有。在媒劑組之狒狒中，在任何時間均未觀察到CD4 T-細胞受體佔有。對每隻狒狒之可用CD4 T-細胞 ‘受體與時間的關係作圖且擬合立方平滑樣條。此等擬合線用於計算無CD4部位之百分比越過10%線時之曰期，指示 ® CD4 T-細胞受體佔有率<90%。給與變異體B之動物喪失完全CD4 T-細胞受體佔有（<90°/〇之平均時間為28.6天。對於變異體C處理之動物而言，動物喪失去完全CD4 T-細胞受體佔有之平均時間為39.3天，且對於變異體D而言，動物喪失完全CD4 T-細胞受體佔有之平均時間為46.9天。當 CD4 T-細胞受體佔有率小於90%時，此等估算時間在變異體B、變異體C與變異體D處理之動物之間顯著不同（圖6)。 ^ 此等數據指示，與僅去糖基化之變異體B相比，去糖基化且對FcRn之親和力增強之變異體C及D具有降低之CL。 ‘ 此等數據因此（或許第一次）展示經工程改造成缺少糖基化 ·. 且具有增加之FcRn親和力的抗體與其僅缺少糖基化之對應 . 物相比顯現延長之活體内血清半衰期。受體介導之CL對於所有經測試之變異體而言應相同，因為變異體C及D對CD4 之親和力與變異體B對CD4之親和力相同，且分子之間 CD4受體飽和及下調程度相似。CL降低可歸於FcRn相互作用及與變異體B相比變異體C及D更有效地再循環至循環系 141616.doc -151 - 201016233 統中。再循環由變異艎C及D在低pH值下與上皮細胞中之 FcRn的結合增強、繼而經胞飲作用攝取抗體所引起（參見例如 Raghavan等人，Biochemistry 34:14649-57，1995)。由於變異體C及D在pH 7.4下對FcRn仍具有低親和力，所以 FcRn使抗體再循環至血清中而不是將其導引至溶酶體中降解。在CD4不飽和之情況下，CD4受體介導之CL視為主要消除路徑。在彼等情況下，FcRn介導之CL降低之益處可能具有劑量及濃度依賴性。另外，數據展示與變異體B相比，在經變異體C及D處理之動物中，CD4受體佔有時間延 ® 長。減小之變異體C及D清除率及因此延長之暴露時間及延長之CD4受體佔有時間可因為使得給藥頻率降低及/或劑量降低及/或非靜脈内投藥而為理想的。實例2

藉由靜脈内或皮下途徑活艘内投舆非消耗性抗CD4變異想D 每隔一週重複靜脈内（IV)或皮下（SC)注射8次（8週給藥期）向狒狒投與變異體D且測定血清變異體d濃度。將6〇隻未經處理之雄性及雌性狒狒（東非狒狒（Papi〇 anubis))分成 Θ 5個劑量組（6隻/性別/組）且8週期間每週一次投與對照物（變異體D媒劑）或者測試物（變異體D)，如下表6中所指示。總共30隻動物（第I-5組中每組3隻雄性及3隻雌性）在最後給藥後經歷10週恢復期。 141616.doc -152- 201016233 表6

靜脈内投藥（第1-4组）：對::組首先進行靜脈内注射，繼而皮下注射。在劑量 Φ 投藥前藉由剃毛準備劑量投藥部位。以3-4毫升/分鐘之連續静脉内輪注速率經由臂或腿上之淺靜脈對動物進行給藥預先準備蝶翼型輸注（butterfly infusion)以便不需要沖洗。皮下注射（第1组及第5級）：在劑量投藥前藉由剃毛及準備區域來準備劑量投藥部位。在背部軀幹（肩胛内區域）皮下投與測試物。使用永久性標記將劑量投藥區域分為大致給藥象限。部位標記為 SC-1、SC-2、SC-3及SC-4。在4個編號部位之間連續輪換給藥。一般血液採集程序、樣本處理及變異體D血清濃度檢定在所有也液採集期間給動物服用鎮靜劑。自外周靜脈藉由靜脈穿刺採集血液。自隔夜禁食之動物採集約1毫升企液’接著置放於血清分離管中。在第1、8、15、22、29、 36、43及50天採集所有動物之樣本。在第60、64、67、 71、78、85、92、99、107及120/121天採集恢復動物之樣 141616.doc -153- 201016233 本。在至皿下使樣本凝結20-60分鐘。在採集時間1小時内，於2 C -8 C下以l，500_2,000xg之相對離心力將所凝結之樣本離心10-15分鐘。在離心結束約2〇分鐘内自樣本分離血清且轉移至預先標記之Eppen(jorf管中（約5〇〇微升）。除非將各管立即儲存於經設定以將溫度維持於_6〇艽至_86t範圍内之冷床機中’否則將各管保持於乾冰上直至檢定樣本0 使用ELISA檢定（參見上文）來測定變異體〇於血清樣本中之濃度。在純血清中，檢定定量極限（L〇Q)為〇〇〇8微克/ 毫升。外周血液及组織之流式細胞術分析在以下時間自所有動物採集用於流式細胞術之血液樣本··剩養期間（第-12天及第-6天）兩次，第1、8、1 5、22、 29、36、43及50天給藥前，及恢復期間每週一次，同時採集血液學及毒動學樣本。在9週恢復期間不採集樣本。第 10週’在屍體解剖當天，在投與安樂死溶液之前，採集樣本。在屍艘解剖時自各動物採集脾' 腸系膜淋巴結及下頜淋巴結（右側）之代表性切片且製備細胞懸浮液以供流式細胞術分析。外周血液樣本及淋巴器官（淋巴結及脾）之流式細胞儀分析展示’投與變異體D引起外周血液及組織丁_細胞CD4受體之劑量依賴性飽和以及CD4受體下調。在5毫克/公斤、 15毫克/公斤及50毫克/公斤静脉内及50毫克/公斤皮下之變 141616.doc •154· 201016233 異體D下，在首次給藥後3天分別觀察到59%、85%、95% 及92%之外周血液CD4受體飽和。外周T淋巴細胞CD4受體飽和的同時，CD4表現下調20%-40°/〇 ;受體飽和及下調在恢復期期間完全取決於劑量依賴方式。在所研究之淋巴組織中，在最終屍體解剖時，在所有變異體D投藥組中觀察到約20% CD4 T-細胞飽和且在最終屍體解剖時，觀察到 CD4 T-細胞受體表現約20%-40%下調，其到恢復期屍體解剖時返回至對照水準。在恢復期屍體解剖時，未觀察到組織T淋巴細胞上之CD4受體佔有。與對照動物相比，變異體D投藥組的若干外周血液及組織淋巴細胞亞類之平均百分比減少。對於T-淋巴細胞亞類 (CD3、CD3 CD4、CD4 CD45RA及 CD4 CD45RA-)與 B-淋巴細胞亞類（CD20、CD20 CD21)均觀察到此發現。然而，此等亞類之絕對細胞計數不超出所有組之媒劑對照及給藥前值所確立之正常範圍。在組織中，在各組範圍内觀察到絕對細胞計數之較大可變性。一般而言，以5毫克/公斤、 15毫克/公斤或50毫克/公斤静脉内或以50毫克/公斤皮下投與變異體D不誘發外周血液或淋巴結及脾組織中之T-細胞及B-細胞淋巴細胞亞類或天然殺手（NK)細胞的任何實質變化。總之，在靜脉内或皮下每週一劑投與8劑後，在多達50 毫克/公斤之劑量下，狒狒良好耐受變異體D之投與。變異體D投與產生CD4+T-細胞受體飽和及下調之藥理學效應而不消耗T-細胞，該等結果與非消耗性抗CD4抗體相一致。 141616.doc -155- 201016233 i清中之變異體D濃度向狒狒每週一劑共八劑重複静咏内輸注5毫克/公斤、15 毫克/公斤及50毫克/公斤或50毫克/公斤之皮下劑量（分別為第2組、第3組、第4組及第5組）後的隨時間變化之血清變異體D濃度-時間概況描繪於圖7中。血清中之變異體D展示兩階段性傾向：快速分布階段，隨後長期消除階段。該等概況之最終階段亦呈現非線性，其特徵為劑量增加，斜率降低。 5毫克/公斤、15毫克/公斤及50毫克/公斤静脉内及5〇毫克/公斤皮下劑量組（分別為第2組、第3組、第4組及第5組）的變異體D之估計TK參數描述於表7中。變異體d之8次給藥後（參見表7) ’疋義為血清漢度-時間曲線下面積 (AUClast)之暴露在所測試之劑量範圍内以與劑量不成比例方式增加。5毫克/公斤、15毫克/公斤及5〇毫克/公斤静脉内劑量組之劑量校正入1；(：1叫值分別為871、151〇及192〇天. 微克/毫升/(毫克/公斤）。AUC缺乏劑量比例性與歸因於 CD4介導之消除的變異體d非線性藥物動力學相一致，變異體D在較高劑量下飽和。在各劑量組範圍内，所觀察到之Cmin值在整個給藥階段期間亦保持一致（數據未圖示）。不同性別之間，τκ概況亦似乎相似。在每週一劑8劑變異體D後’存在中度積聚，RCmin範圍為3至4。皮下投與5〇毫克/公斤後，變異體D之生物可用率為67 2%。各劑量組之平均（士SD)TK參數描述於表7中。 141616.doc -156- 201016233 表7 向狒狒每週一劑給與8劑5毫克/公斤' 15毫克/公斤或5〇毫克/公斤後，非代謝區τκ參數估計值(平均值+SD、 ΤΚ參數 5毫克/公斤 15毫克/公斤 50毫克/公斤静 50毫克/公斤静腺内静腺内咏内皮下 (n=12) Cn=12) (n=12) (n=12) AUC〇.7(天·微克/毫升） 375±51.6 1240+241 4430+413 2880+456 auc〇.52(天·微克/毫升） 4570土923 18700+3140 74900±9170 39600+5500 AUClast(天·微克/毫升） 4360±591 22700±4540 96200±16000 64700±8320 AUCQ.7/劑量 (天•微克/毫升/[毫克/公斤]) 75.1土10.3 82.6土 16.0 88.7±8.26 57.5 土9.13 aucq.52/劑量 (天.微克/毫升/[毫克/公斤]) 915 土 185 1250±209 1500±183 791 土 110 AUClast/劑量 (天•微克/毫升/[毫克/公斤]) 871±118 1510土303 1920土 321 1290土166 Obs Cmax(微克/毫升） — 204±41.4 777±133 2610±427 1640±252 48.7±2.11 44.0 士 8.15 44.0±5.53 49.8±2.62 Obs Cmin(微克/毫升） 14.9 87.5 399 330 4.01±0.920 3.57+0.856 3.06+0.724 3.23±0.531 上、^min_______—-—- F(%) - NA NA NA 67.2 auc〇.7=自〇時間至研究第8天（τκ第7天）之血清濃度-時間曲線下面積；AUC〇-52=自0時間至研究第53天（τκ第52天）之血清濃度-時間曲線下面積；AUC丨ast=血清濃度-時間曲線下面積（僅針對恢復組計算’ n=6) ; AUCg-7/劑量=依標稱劑量校正之自0時間至研究第8天（TK第7天）之血清濃度-時間曲線下面積；AUC〇·52/劑量=依標稱劑量校正之自0時間至研究第53天（TK第52天）之血清濃度-時間曲線下面積； AUClast/劑量=依標稱劑量校正之介於第0天1^與最後觀察濃度之間的血清濃度與時間關係曲線不面積（僅使用恢復 141616.doc -157- 201016233 組動物計算）；F=生物可用率；（AUCiast SC)+(AUClast IV)，僅使用恢復組動物之數據計算；〇bs Cmax=所觀察到之最大濃度；obs Cmin=給藥期間所觀察到之最小濃度； RCmin=積聚率（最後給藥（研究第5〇天[τκ第49天]最後給藥前之血清最低濃度除以第二次給藥（研究第8天[τκ第7天]) 則之血清最低濃度）；imax=觀察到最大濃度之時間。總之，上述數據展示在向狒狒静脉内投與5毫克/公斤、 15毫克/公斤或50毫克/公斤變異體D後，毒動學（τκ)概況呈現非線性。變異體D暴露或血清濃度-時間曲線下面積 (AUC)在所研究之劑量範圍（5毫克/公斤_5〇毫克/公斤）内不以與劑量成比例方式增加，與歸因於(：1)4介導之消除而呈非線性之變異體D藥物動力學相一致。在各組範圍内，所觀察到之Cmin值在整個給藥階段期間保持一致。不同性別之間，TK概況亦似乎相似。在每週一次變異體d給藥後，存在中度積聚率，RCmin範圍為3至4。在皮下投與5〇毫克/ 公斤後’變異體D之生物可用率為67.2%。結論以上實例中所描繪及論述之數據表明，與此項技術中先前所述之抗CD4抗體（包括先前所述之非消耗性抗CD4抗體）相比，變異體D具有改良之安全性且使治療自體免疫疾病之給藥方案更理想。擔心靶向胞而引起免疫抑制之顧慮已減少或消除》如上文所述經由位置297處之取代而缺少Fcry與變異體!；)之相互作用可由於τ_細胞不消耗與輪注反應潛在減少（均經由FcY受體介導）提供改良之安全性。 141616.doc •158· 201016233 另外’因為CD4介導之消除引起快速清除，所以可能需要頻繁給藥來維持CD4下調及飽和。與在位置434不具取代之野生型抗體相比，在彼位置具有胺基酸取代之變異體 D展示增強之FcRn結合且在狒狒體内之清除率降低5〇%。與使用此項技術中先前所述之抗CD4抗體可能出現的情況相比，此更長時間之變異體D暴露可容許給藥頻率降低及/ 或劑量降低及/或替代投藥途徑（例如皮下）。因此，數據支持如下文所述之例示性自體免疫疾病類風濕性關節炎之j 期臨床研究。實例3 向類風濕性關節炎患者藉由靜脈内或皮下途徑投與非消耗性抗CD4抗醴（變異體D)之I期研究研究設計此為在美國進行之丨期多中心研究且由雙盲（研究者及患者）、安慰劑對照、單一遞增劑量（SAD)階段，隨後使用與 SAD階段之患者不同之患者的雙盲（研究者及患者）、安慰劑對照、多遞增劑量（MAD)階段組成》MAD階段群體反映在未來研究中最可能接受變異體D之患者群。對年齡介於 18與80歲之間、患有ra之約65名成人患者進行研究。登記為SAD階段之患者將診斷為ra而無預先說明之疾病活動性°登記為MAD階段之患者將具有輕度至中度疾病活動性’該輕度至中度疾病活動性定義為觸痛及腫脹關節計數 23且對至少一種生物劑反應不足。單一劑量研究群組總結於下表8中。 141616.doc -159- 201016233 表8:單一劑量研究群组群組劑量(毫克/公階段斤）劑量總數投藥途徑患者數a 變異體D安慰劊 A SAD 0.3 1 靜脈内 4 1 B SAD 1.0 1 靜脈内 4 1 C SAD 1.0 1 皮下 4 1 D SAD 3.5 1 靜脈内 4 1 E SAD 3.5 1 皮下 4 1 F SAD 7.0 1 靜脈内 4 1 a必要時再登記5名患者（以4:1變異體D:安慰劑之比率），如劑量遞增規則（下文所述）中所說明。單一遞增劑量階段篩檢後，將3 0名患者依序登記入6個各具有5名患者之群組（4:1變異體D :安慰劑之治療配置；A-F群組；參見上表），該等群組使用4種靜脈内（IV)劑量（0.3毫克/公斤、1〇毫克/公斤、3.5毫克/公斤及7.0毫克/公斤）及2種皮下（sc) 劑量（1.0毫克/公斤及3·5毫克/公斤）。第一劑量群組（Α群組；0 · 3毫克/公斤靜腺内）將為變異禮 D之首次人類給藥；因此，初始群組中之至多丨名患者在任一天接受研究藥物（變異體D或安慰劑）。在對所有患者完成至）14天隨访後§平估A群組之安全性數據。若變里體d 在A群組中顯現可接受之安全性，則根據預先說明之劑量遞增規則，將隨後5名患者登記入B群組（1〇毫克/公斤静脉内）中。患者登記B群組後，立即登記c群組（1〇毫克/公斤皮下）。在對B群組所有患者完成至少14天隨訪後，進行安全性評估且可在C群組登記滿之後開始登記D群組（3 5毫克 /公斤静脉内）。在D群組登記後立即登記E群組（3·5毫克/公 141616.doc -160- 201016233 斤皮下）。在對D群組所有患者完成至少14天隨訪後，進行安全性評估且可在E群組已登記滿之後開始登記F群組（7〇毫克/公斤静脉内）。

各静豚内SAD群組中登記最少5名患者且最多1〇名患者。若經變異體D治療之4名患者中有一者出現劑量限制毒性（DLT) ’則彼群組中再登記5名患者（以變異體仏安慰劑之比率）。若8名經變異體D治療之患者中僅丨者經歷 0 DLT，則遞增劑量。若多於丨名經變異體D治療之患者經歷 DLT ’則中止劑量遞增且評估可用安全性數據。各皮下群組中登記總共5名患者。若皮下群組中多於1名經變異體D 治療之患者經歷DLT，則中止登記且評估可用安全性數據。在14天觀察期期間，可能會發生潛在急性中毒，諸如超敏反應、輸注反應或血清病型反應、注射部位反應、皮療等’且可能已消退。採集血液樣本以供PK、PD及抗治療 φ 抗體（ΑΤΑ)評定用。SAD階段中之所有患者將經歷36天之安全性隨訪（給藥後5週）。在MAD階段開始前，評估e群組中之所有患者在至少14天隨訪中、在SAD階段的所有可用安全性數據。安全性數據將包括白血球計數及全血球計數 (CBC)分型及流式細胞術測定之分化及τ_細胞亞類。多遞增劑量階段

此階段之目的為對在所建議之劑量範圍内（1.5毫克/公斤及3.5毫克/公斤皮下及5.0毫克/公斤静脉内）每週一劑給與八劑之變異體D之安全性及PK/PD特性進行表徵。在MAD 141616.doc -161 · 201016233 階段開始前，評估E群組所有患者之至少14天隨訪期間、在SAD階段中的所有可用安全性數據。另外，在登記mad 階段之Η群組前，評估f群組所有患者的至少丨4天安全性隨訪。安全性數據將包括白血球計數及全血球計數（CBC)及分型及藉由流式細胞術測定之分化及τ_細胞亞類。藉由委託方醫學監測器、瞭解治療分配及劑量之藥物安全性科學豕及生物統計學家對安全性及PK/pd數據進行不間斷評估。篩檢後’將總共35名患者依序登記為g群組至I群組3個群組（G、Η及I ;參見下表9)。G群組（1.5毫克/公斤皮下）及 Η群組（3.5毫克/公斤皮下）由隨機接受變異體〇之12名患者及接受安慰劑之3名患者組成。〗群組（5 〇毫克/公斤靜脉内）由隨機接受變異體D之4名患者及接受安慰劑之1名患者組成。登記為MAD階段之患者不同於登記為sad階段之患者；因此’在SAD階段給藥之患者不適於登記為mad階段。向患者皮下或靜脈内投與研究藥物，每週一劑總共8 劑。採集血液樣本以供PK、PD及ΑΤΑ評定用。MAD階段之所有患者將經歷113天之安全性隨訪。此時程估計，約 16名患者將基於預測暴露、以目標劑量或更高劑量之變異體D治療（3.5毫克/公斤皮下或5毫克/公斤静腺内）且在整個 MAD階段中總共約7名患者將接受安慰劑。在G群組（n=15 ; 1.5毫克/公斤皮下）已登記滿且至少6名患者已完成2週治療且已評估SAD階段之E群組之患者的安全性數據後，登記Η群組（n=l5 ; 3.5毫克/公斤皮下）。Η群 141616.doc •162- 201016233 組登記滿之後立即登記丨群組（n=5 ; 5 〇毫克/公斤静脉内）。若在SAD階段中觀察到最大耐受劑量，則可改變 MAD階段之劑量。表9:多劑量研究群組群組階段劑量(毫克/公斤）每週一劑之劑量總數投藥途徑患者數轡旦《tD容慰劊 G Η MAD MAD 1.5 3.5 8 皮下 12 3 I MAD 5.0 8 皮下 12 3 8 靜脈内 4 1 4週篩檢期内’對合格患者隨機進行SAD及MAD階段研究。評定不良事件、嚴重不良事件及實驗性異常之發生率及性質。納入標準對於SAD階段而言，SAD研究部分的目標候選者為可經歷穩定抗風濕治療方案（參見表1〇)的尺八患者。對於MAD階段而言，MAD研究部分的目標候選者為當前具有至少最小量之疾病活動性且對至少一種生物治療已 ❹無充分反應的RA患者。此等患者具有至少3個觸痛及腫脹關節（例如顳下頜關節、胸骨鎖骨關節、肩鎖關節、肩、財、腕、指節間關節、掌指關節、競、膝、踝及/或疏骨）之疾病活動性跡象，且可經歷穩定治療，如表1〇中所說明。至；一種生物劑無效定義為缺乏或喪失反應（在下文所和不之劑量下)或不耐受性。例示性生物劑包括抗TNF 劑，諸如阿達木單抗（每隔一週投與4〇毫克，歷時至少3個月）、依那西普（每週—次投與毫克[或每週2次投與25毫克]，歷時至少3個月）及英利昔單抗（以至少4次輸注投與>3 141616.doc -163- 201016233 毫克/公斤）。其他例示性生物劑包括利妥昔單抗（靜腺内投與至多2x1 〇〇〇毫克)及奥克麗珠單抗(靜脉内投與至多 2 X 10〇〇毫克）。排除標準滿足下列任何標準之患者不適於登記為s A D或m a d階段： •懷孕、計劃在研究期間懷孕或哺乳之女性患者。 •臨床上顯著異常之實驗值或ECG(例如肌酸酐>15χ正常值上限[ULN]、轉胺酶升高大於2 5xULN或由研究員判定為具臨床顯著性之合成功能測試異常）。 •過敏反應病史。 •C型肝炎抗體或b型肝炎表面抗原呈陽性。 •依定量聚合酶鏈反應，人類免疫缺乏病毒（HIV)血清測試呈陽性。 •純化蛋白衍生物（PPD ; >5毫米風疹塊）呈陽性（不僅僅具有反應性），無結核病治療跡象。 •除RA以外之自體免疫疾病病史（除繼發性修格蘭氏症候群以外）。 •RA顯著涉及全身，包括血管炎、肺纖維化或費爾蒂氏症候群。 •惡性腫瘤或先前惡性腫瘤’已切除之原位非黑素瘤皮膚癌或子宮頸癌除外。 •給與變異體D之前1個月内投與活減毒疫苗或預期在研究期間或在最後給藥後60天内需要該種活減毒疫苗。流感疫 141616.doc 201016233 苗應僅在流感季節（約1〇月至3月）期間接種。患者在隨機接受樂物之前30天内或在研究期間任何時候不可接受活減毒流感疫苗（例如FLUMIST®)。 •用任何T細胞針對性治療（例如阿巴西普㈣心⑽、凯利昔單抗（keiiximab)及伊巴麗珠單抗（ibaUzumab))之治療史。 •生物劑伴隨治療。 φ ·.在第1天前12週或研究藥劑5個半衰期（以更長時間為準）’預先暴露於變異體D或用任何研究藥劑治療。研究治療研究藥物非消耗性抗CD4單株抗體變異體D以及安慰劑係由Genentech製造且提供。在中國倉鼠印巢細胞中產生變異體D，純化且經受質量控制程序。藥物產品與安慰劑均為意欲用於皮下與靜脉内投與之無菌無防腐劑液體。安慰劑在组成方面與變異體D藥物產品相同，但不含變異體 ❹ D抗體。藉由静脉内輸注或皮下注射向患者投與單次用調配物來進行I期臨床試驗。用於静脉内投藥之活性研究藥物或安慰劑將以非經腸調配物形式提供於3_cc展六固樂典/歐洲藥典（USP/Ph. Eur.)l型玻璃小瓶中，該破璃小瓶具有13 毫米氟樹脂層壓塞且由具有塑膠易拉蓋之13臺半笔木鋁密封件加蓋密封。藉由群組分配及篩檢患者體重來判定變異體D劑量< 乂每公斤毫克數計）及投藥途徑。藉由互動式聲立鄕& 9誓應系統 (IVRS)使患者隨機接受活性研究藥物或安慰劑。 141616.doc -165- 201016233 對於分配接受静脉内注射之患者而言，研究藥物於生理食鹽水（0.9%)中稀釋後，使用輸注泵、藉由静脉内輸注、自食鹽水袋以靜脈内方式投與研究藥物。計算各患者之欲給與之研究藥物體積。對於分配接受皮下注射之患者而言，研究藥物皮下投與右臂或左臂之三角肌區域中。或者，若因醫學重要原因而排除在三角肌區域中投藥，則可在大腿上注射投藥。伴隨治療及臨床實務研究中之所有患者將允許用獲准之穩定劑量之皮質類固醇、疾病緩解性抗風濕藥物及非類固醇消炎藥繼續治療。若在至少下表10中所說明之時間不調整劑量及頻率，則伴隨藥物之劑量視作穩定劑量。在對各研究參與者之研究期間，保持在研究參與期間向患者所投與之任何其他伴隨藥物的記錄。伴隨治療包括在篩檢評價前30天與研究訪診結束之間由患者使用之任何處方藥物或非處方製劑。使用經口避孕藥、激素替代治療或其他維持治療之患者應繼續其使用。表10 :抗風濕治療隨機接受藥物前之穩定方案之最短持續時間最大允許劑量 DMARD ： 3 曱胺喋呤11 來氟米特15 柳氮磺胺°比啶羥基氯喹其他藥劑：強的松或等效物 NSAID(包括Cox-2選拔劑[昔布類藥物(coxibs)]) 週週週週週週 4 8 6 8 4 2 每週25毫克每曰20毫克每日3公克每曰400毫克每日口服10毫克依照處方資訊 141616.doc -166- 201016233 DMARD=疾病緩解性抗風濕藥物；NSAID=非類固醇消炎藥 3所允許之DMARD僅為上文所列之彼等DMARD。在至少上文所指示之期間不允許DMARD或劑量變化。患者可經歷兩種DMARD治療之組合，只要組合方案（包括每種個別藥物之劑量）在隨機接受藥物之前穩定至少4週，良好耐受，與顯著實驗異常無關且以研究者之觀點不會對患者造成額外風險或混淆研究終點數據之解釋即可。 b在研究之前或期間，不允許甲胺喋呤與來氟米特之組合。結果度量安全性結果度量研究之主要安全性結果度量為變異體D在SAD與]VIAD階段之安全性及可耐受性。安全性將依不良事件發生率來評定，該等不良事件係根據國家癌症學會不良事件之共同毒性標準（National Cancer Institute Common Toxicity Criteria for Adverse Events，NCI CTCAE)，3.0版來分等級。藥物動力學及藥效學結果度量下列PK參數來源於投與研究藥物後變異體D之血清濃度-時間概況。 •最大血清濃度（Cmax) •皮下給與之藥物的清除率（CL)或表觀CL(CL/F) •皮下給與之藥物的分布容積（K)或表觀分布容積（F/F) •總暴露（濃度時間曲線下面積[AUC]) •劑量比例性 141616.doc •167· 201016233 •皮下生物可用率（F) •抗治療抗體（ΑΤΑ)發生率，對於各患者使用在給藥前及給藥後多個時間點獲得之樣本。在投與變異體D後評定的Ρ D參數為藉由流式細胞術所測定之外周血液Τ細胞上之CD4表現及佔有。單一遞增劑量研究之結果藥物動力學特徵向R Α患者单一静腺内輸注〇.3毫克/公斤、1.〇毫克/公斤、3.5毫克/公斤及7.0毫克/公斤或皮下給藥ι〇毫克/公斤及3.5毫克/公斤後之血清變異體d濃度-時間概況展示於圖 10中。藥物動力學概況呈現非線性，其特徵為斜率隨時間推移或隨劑量減少而增加。所有劑量組之變異體D之估士十 PK參數描述於表11中。單一給與變異體d之後，定義為灰清濃度-時間曲線下面積（AUCall)之總暴露在所測試之劑量範圍内以與劑量不成比例之方式增加。AUC缺乏劑量比例性與因CD4介導之消除所致的變異體D之非線性藥物動力學相一致，變異體D在較高劑量下飽和。表11 :向RA患者單一給與變異體D後，非代謝區ρκ參數估計值（平均值土SD) PK參數静期 t内皮下 0.3毫克/公斤 (n=4) 1.0毫克/公斤 (n=4) 3.5毫克/公斤 (n=4) 7.0毫克/公斤 (n=4) 1.0毫克 /公斤 (n=4) 3.5毫克/公斤〇bsCmax (微克/毫升） 4.72 土 4.14 21.8 土 5.11 47.5 土 21.3 147 士 18.7 0.240 土 0.406 6.38 土 6.57 AUCall(天•微克/毫升） 4.70 土 4.71 39.9 土 11.7 201 ± 151 994 士 288 0.387 ± 0.671 33.0 士 36 5 AUCW劑量(天•微克/毫升/[毫克/公in) 15.7 土 15.7 39.9 土 11.7 57.3 土 43.2 142 士 41.1 0.387 土 0.671 9.42 ± 10.4 141616.doc •168· 201016233 〇bs Cmax=所觀察到之最大濃度；AUCa„=自第0天至最後所觀察之濃度的血清濃度-時間曲線下面積；AUCall/劑量=依標稱劑量校正之自第0天至最後所觀察之濃度的血清濃度與時間關係曲線下面積。藥效學反應進行流式細胞術分析以評價變異體D之PD作用。在給藥前且在單一劑量投與變異體D後第0、7、14、21、28及35 天採集血液樣本且使用標準臨床流式細胞術程序來分析淋巴細胞亞類。特定而言，所量測之pD反應為外周血液丁細胞上之CD4受體佔有及CD4受體表現。單一劑量群組之平均數據曲線繪製於圖11A及11B中。在單一劑量投與〇3毫克/公斤、1.0毫克/公斤、3·5毫克/公斤或7 〇毫克/公斤静豚内或1·〇毫克/公斤及3_5毫克/公斤皮下之變異體〇後觀察到 CD4 Τ細胞之劑量依賴性佔有（或游離CD4位點之減少百分比）（圖11A)。在ΐ·〇毫克/公斤、3 5毫克/公斤、7 7毫克/公斤静脉内及3.5毫克/公斤皮下劑量群組中劑量投與變異體 D後第24小時觀察到完全CD4佔有。此外，⑽佔有以劑量依賴性方式恢復，與其他劑量群組相比，在第Μ天後， 7·〇毫克/公斤静脉内劑量群組最後恢復。亦使用非阻斷抗 CD4 Ab來評定CD4於外周血液了細胞上之細胞表面表現。在單一劑量投與變異體0後，如同⑽ 表:見之劑量依賴性趨勢(圖叫。最大⑽下調為基線之 8〇/。，此在7.0毫克/公斤静脉内劑量群組令觀察到直至第 14天。 141616.doc •169- 201016233 除CD4佔有及表現外，亦由流式細胞術測定τ-淋巴細胞、CD4 Τ細胞、CD8 Τ細胞、全Β細胞、單核細胞及ΝΚ 細胞之總數。在單一劑量投與0.3毫克/公斤、1 _0毫克/公斤、3.5毫克/公斤或7.0毫克/公斤静脉内及1.〇毫克/公斤或 3.5毫克/公斤皮下之變異體D後，淋巴細胞計數在研究過程（36天）中保持穩定（數據未圖示）。此等結果因此表明變異體D不消耗CD4 Τ細胞。 t 對人饉之計劃目標給藥方案為預測變異體D多次注射於人體後之血清濃度及pd時間-概況，將表徵血清抗CD4濃度與總CD4表現及游離CD4 表現之間關係的受體介導之PK/PD模型同時與變異體D之單一遞增劑量研究之PK/PD數據擬合。基於TRX1 I期數據修改模型，如Ng等人，Pharm. Research 23:95-103, 2006中所報導。在此模型中，假定血漿藥物濃度均藉由非特異性消除（尺el)與特異性受體介導之胞吞作用消除。受體介導之胞吞作用模型化為藥物與游離CD4受體（ef)相互作用以經由可逆性（尺^及尤。^)結合形成藥物受體複合物（XR)，隨後細胞内化（&nt)。使用具有線性一級分布過程（火ct及尺tc)之組織代謝區來說明非特異性藥物結合或分布。為模擬皮下給藥，擴展Ng等人所述之模型以包括皮下吸收之動力學，其藉由吸收速率（尤a)及生物可用率（F)表徵。描述該模型之更新之不同方程式展示如下： dXsc/dt = - KaXsc dXc/dt = KaFXsc+RO - (Kel+Kct)Xc+KtcXt - (Kon(XcA^c)Rf-KoffXR)Vc 141616.doc -170- 201016233 dXt/dt = KctXc - KtcXt

dRf^dt = Ksyn - KdegRf - Kon(Xc/Vc)Rf+Kof£XR tJXR/dt = Kon(Xc/Vc)Rf - KofDCR - KintXR 其中Xsc、Xc及Xt分別為皮下、中心及組織代謝區中之游離抗體量；Rf及XR分別為游離CD4及抗體-CD4複合物濃度。使用ADAPT 5，5.0.28版本（南加州大學（University of Southern California)，可在 URL(HTTP 協定）bmsr.usc.edu 獲得）將此模型與平均PK及PD數據同時擬合以鑑別欠el、心及尸，同時保持其他參數固定於已公開之TRX1值。擬合參數值展示於表12中》表12 :基於擬合變異體D單一遞增劑量PKPD數據的估計模型參數參數描述模型估計值 W1) 中心代謝區之一級非特異性消除速率常數 0.0654 [ct (日]) 自中心代謝區至組織之一級分布速率常數 0.649 W1) 自組織至中心代謝區之一級分布速率常_數 0.874 Fc(毫升•公斤，中心代謝區之分布容積 41.7 W日，游離CD4受體之一級消除速率常數 0.694 (n(nM/日）結合速率常數 0.753 尺ofK日，解離速率常數 14.6 «a·1) CD4受體複合物之一級内化/降解速率常數1 3.93 《sy„(nM/日）游離CD4受體之零級合成速率常數 38.1 W1) 吸收速率 0.354 F(%) 生物可用率 58.3 基於擬合參數之模型模擬說明3.5毫克/公斤每週一次皮下劑量預計可使外周血液中之大於90% CD4飽和維持於穩定狀態（圖12)。如圖12中所示，預計可維持該>90% CD4飽和的變異體D血清濃度為6微克/毫升。因此，此數據支持每週一次皮下傳遞約3.5毫克/公斤目標劑量或約250毫克固 141616.doc -171 - 201016233 定劑量（假定平均體重為約70公斤）之變異體D以在人體外周血液中達成足夠CD4飽和。若患者群之體重及反應可變’考量醫藥調配物中典型之抗體濃度及通常可皮下投與之可行體積，則可在臨床中使用150毫克與350毫克之間的固定劑量範圍。臨床結果根據上述時程及參數來評價單一遞增劑量研究中之總共 30名患者（如上文所述，6個群組每組有5名患者）。以0.3毫克/公斤與7·〇毫克/公斤静脉内之間的劑量及1.0毫克/公斤與3.5毫克/公斤皮下之間的劑量投與變異體〇為安全的且可良好耐受。在接受變異體D之任何患者中未觀察到嚴重不良事件或劑量限制毒性。另外，不存在輸注反應且不存在細胞激素釋放症候群之跡象（11^18、11^-2、11^4、11^ 5、IL-6、IL-13、IFNY)。在接受變異體D之任何患者中未觀察到藥物相關性皮療。雖然在單一給藥後未觀察到臨床活性信號，但此並非出人意料，因為該研究設計之目的係評定PK/PD參數及安全性。本文所報導之pK/pD參數及安全性概況支持進一步臨床研究。實例4 變異體D在混合淋巴細胞反應中抑制人類Thl&Thl7 CD4+細胞在產生性刺激後，CD4+T細胞增殖且分化以使其功能兩極分化且可基於其所產生之細胞激素之概況分類為亞類。直至最近，以分泌干擾素_γ(ΙΙ?Ν_γ)為特徵之TM CD4 + t細 141616.doc 172- 201016233 胞視作與若干疾病（諸如RA、MS及IBD)相關之自體免疫病變之重要促成者。最近，CD4+T細胞之新鑑別亞類（基於其產生白介素-17(IL-17)而命名為Thl7細胞）已作為發病之主要驅動因素而涉及RA、MS及SLE(Garrett-Sinha等人， Curr. Op. Rheum. 20:519-525 (2008) ; Hsu等人，Nature Immunol. 9:166-175 (2008) ; Wong 等人，Clin. Immunol. 127:385-393 (2008) ； Jacob 等人，J. Immunol. 182:2532-2541 (2009))。除對發病之直接作用以外，Thl7細胞分泌 IL-17已展示在狼瘡中有助於胚芽中心形成且與BAFF協同增強B細胞存活及分泌抗體之細胞之分化。為測定Thl及 Thl 7 T細胞亞類依賴於用於其活化之CD4共受體功能之程度，在增加變異體D或對照抗體之濃度的條件下評定各亞類在混合淋巴細胞反應中之增殖能力，如下文進一步所述。人類Thl及Thl7反應細胞分別基於其對趨化激素受體 CXCR3及CCR4之不同表現、自白細胞去除之新鮮單核細胞製劑中分選。分選前，用PBS稀釋細胞，集結且用紅血球溶解緩衝液（Qiagen)溶解。CD4 + CD45RO+記憶T細胞藉由負向選擇來分離（根據製造商之說明書，Miltenyi Biotec 套組及SuperMACS XS管柱）。細胞接著用每種抗體每百萬個細胞 5 μΐ 之 CD25 FITC、CD45RA FITC、CCR4 ΡΕ-Cy7、CXCR3-APC 及 CCR6-生物素（BD Biosciences)於冰上染色20分鐘且洗滌。細胞接著用1:500稀釋之抗生蛋白鏈菌素-太平洋藍（streptavidin-Pacific Blue)(Invitrogen)於冰 1416J6.doc -173- 201016233 上染色15分鐘且洗滌。接著基於下列表面表現、在3種BD FACS Aria細胞分選器上分選Thl及Thl7細胞群：CD25/ CD45RA FITC陰性、CCR6生物素/太平洋藍陽性、CXCR3-APC陽性 CCR4-PE-Cy7陰性（Thl)及 CXCR3-APC陰性 CCR4-PE-Cy7陽性（Thl7)。如圖13A中所示，各細胞群在分選後具有最少95%純度。為依據細胞激素分泌來證實Thl及Thl7細胞群之身分，將新鮮分選之細胞靜置隔夜且次日用PMA(1奈克/毫升）及離子黴素（i〇nomycin)(l μΜ)及 GolgiPlug (BD Biosciences) 刺激5小時。將細胞固定且渗透（BD Bio sciences套組）且以細胞内 IFN-y-FITC(BD Biosciences，1:100稀釋）及 IL-17A-PE(eBioscience，每個樣本20 μΐ)染色。如基於有關Thl及 Thl7細胞分泌細胞激素之公開文獻所預期，經分選之Thl 細胞主要產生IFN-γ且產生極少IL-17A，如圖13B(左圖）中所示，而經分選之Thl7細胞主要產生IL-17A且產生極少 IFN-γ，如圖13B(右圖）中所示。對於混合淋巴細胞反應（MLR)檢定而言，自不同捐獻者之全血分離同種異體細胞。用PBS以相等體積稀釋血液且覆蓋於Ficoll(GE Healthcare)上以分離外周單核細胞 (PBMC)。溶解殘餘紅血球。以2500 rad照射PBMC。在96孔平底板中建立MLR檢定’其中每孔具有240 μΐ總體積、經變異體D或對照IgG抗體滴定的75,000個經分選 Thl細胞或75,000個經分選Thl7細胞至225,000個經照射 PBMC。培養基為RPMI、10%胎牛血清、1χ青黴素/鏈黴 141616.doc •174- 201016233 素、1χ慶大黴素、lxL-麩醯胺酸、lx丙酮酸鈉、1χ非必需胺基酸及20 mM HEPES。培養4天後，用每孔！ μα之氚化胸苷將細胞脈衝17小時，冷凍，解凍，收集且計數。數據展示於圖14中。結果展示Thl與Thl7 CD4+細胞之增殖被變異體D以劑量依賴性方式完全抑制。“對照物不能抑制Thl或Thl7細胞增殖（圖14p因此，此等數據表明變異體D在自體免疫疾病之情況下減弱此等完全分化之亞類之病原性活性的潛力。總之，如上文貫例中所例示，本發明之方法藉由使毒性及不良副作用（包括例如（但不限於）CD4淋巴細胞減少症及皮瘆）降至最低及谷許非靜脈内投藥（皮下投藥）方法而提供比習知療法及當前療法更高的治療指數。上述說明書視為足以使熟習此項技術者能夠實施本發明。實際上，除本文中所示及所述之潤飾外，經由以上描述，本發明之各種潤飾對於熟習此項技術者亦顯而易見且屬於隨附申請專利範圍之範壽内。【圖式簡單說明】圖1展示實例中所論述之非消耗性抗CD4輕鏈變異體。 CDR序列之胺基酸序列加下劃線。恆定區之第一個胺基酸以粗體展不且加下劃線。第i非消耗性抗CD4輕鏈變異體（SEQ ID NO.: 1) ; (b)第2非消耗性抗CD4輕鏈變異體 (SEQ ID NO.: 2); 圖2展示實例中所論述之非消耗性抗CD4重鏈變異體。 CDR序列之胺基酸序列加下劃線。第一恆定區之第一個胺 141616.doc -175- 201016233 基酸以粗體展示且加下劃線。（A)第1非消耗性抗CD4重鏈變異體（SEQ ID NO.: 3) ; (B)第2非消耗性抗CD4重鏈變異體（SEQ ID NO_: 4) ; (C)第3非消耗性抗CD4重鏈變異體 (SEQ ID NO·: 5) ; (D)第4非消耗性抗CD4重鏈變異體（SEQ ID NO.: 6)；圖3展示非消耗性抗CD4抗體變異體D及對照單株抗體與 Fey受體（FcyR)之結合曲線，如實例1中所述。（A)抗體與 FeyR IA之結合曲線；（B)抗體與FeyR IIA之結合曲線；（C) 抗體與FeyR IIB之結合曲線；（D)抗體與FcYR IIIA-F158之結合曲線；（E)抗體與FcyRIIIA-V158之結合曲線；圖4展示藉由流式細胞儀分析外周血液單核細胞及2種人類T-淋巴瘤細胞株Jurkat及Hut-78之ADCC檢驗結果，如實例1中所述。（A)藉由流式細胞儀所分析之CD4之細胞表面表現；（B)—個代表性實驗的ADCC曲線，其中用Hut-78細胞檢驗抗CD4變異體；圖5展示非消耗性抗CD4抗體變異體靜脈内投與狒狒後之體内清除率，如實例1中所述；圖6展示給與變異體B、變異體C或變異體D之狒狒體内之CD4 T-細胞受體位點達到10% CD4清除的平均及個別估計時間，如實例1中所述；圖7展示靜脈内或皮下重複投與抗體後，非消耗性抗 CD4抗體變異體D在狒狒體内之血清濃度與時間的關係，如實例2中所述；圖8展示實例中所論述之非消耗性抗CD4輕鏈及重鏈變 141616.doc -176- 201016233 異體之輕鏈及重鏈CDR序列。（A)非消耗性抗CD4 CDRL1(SEQ ID NO.: 7) ; (B)非消耗性抗CD4 CDRL2(SEQ ID NO·: 8) ; (C)非消耗性抗 CD4 CDRL3(SEQ ID NO·: 9); (D)非消耗性抗 CD4 CDRH1(SEQ ID NO·: 10) ; (E)非消耗性抗 CD4 CDRH2(SEQ ID NO.: 11); (F)非消耗性抗CD4 CDRH3(SEQ ID NO.: 12)；圖9展示FcRn結合親和力研究中所用之（A)組胺酸標記之人類FcRn(SEQ ID NO.: 13)及（B)組胺酸標記之狒狒 FcRn(SEQ ID NO.: 14)之胺基酸序列，如實例1中所述；圖10展示單一遞增劑量研究中之非消耗性抗CD4抗體變異體D在RA患者體内之血清濃度與時間的關係，如實例3 中所述。檢驗之LLOQ(定量之下限）指示於圖中；圖11展示單一遞增劑量研究中之RA患者之外周血液中 CD4受體佔有率相對於基線之百分比（A)及細胞表面CD4受體表現相對於基線之百分比（B)，如實例3中所述；圖12展示每週皮下注射3.5毫克/公斤之變異體D後’ RA 患者體内之變異體D之預測PK及PD時間概況，如實例3中所述；圖13展示自白細胞去除術新制之單核細胞製劑中分選 Thl及Thl 7細胞之結果（A)及由經分選之Thl及Thl7細胞分泌細胞激素之結果（B)，如實例4中所述；及圖14展示變異體D或對照Ig在混合淋巴細胞反應中抑制人類Th 1及Th 1 7 CD4+細胞，如實例4中所述。 141616.doc -177· 201016233 序列表 <n〇>美商建南德克公司 <i2〇>aCD4抗體治療自體免疫疾病之方法 <130> P4194R1 <140> 098123765 <141> 2009-07-14 <150> 61/081,012 <!51> 2008-07-15 <160> 14 <]?0> Patentln version 3.5 <210> 1 <2Π> 218 <212> PRT <213>人工序列

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Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300

Ser Va, Leu TTu Val L?g His G,n Asp Trp Leu Asn Gly Lys G!u Tyr

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thi 325 330 335 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn G]n Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365

Leu Vai Lys Gly Rie Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu 丁rp Glu Ser 370 375 380

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Pbc Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 141616-序列表.doc 201016233

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 42Q 425 430

Leu His His His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <2!3>人工序列 <220> <223>人工序列之說明：合成肽 <400> 7

Lys Ala Ser Gin Ser Va】Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn 15 10 15 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <21.3>人工序列

<220> <2幻>人工序列之說明：合成肽 <400> 8

Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser <210> 9 <211> 9 <212> PRT <2!3>人工序列 <220> <223>人工序列之說明：合成肽 <400> 9 _

Gin Gin Ser Leu Gin Asp Pro Pro Tht <210> 10 <211> 10 <212> <213>人工序列 <220> <223>人工序列之說明：合成肽

Phe Thr Ala Tyr Val lie Ser <210> 11

<2U> IS <212> PRT — · <213>人工序列 <220> _ <223>人工序列之說明：合成肽 oty^Glu^ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ser Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 15 10 15

Lys Gly <210> 12 9- 141616·序列表 _doc 201016233 <211> 8 <212> PRT <2】3>人工序列 <220> <223>人工序列之說明：合成肽 <400> 12

Gly Asp Gly Ser Arg Phc Val Tyr 1 5 <210> 13 <211> 280 <212> PRT <2】3>人工序列 <220> <223>人工序列之說明：合成多肽 <400> 13

Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu 丁yr His Leu Thr Ala Val Ser Ser 15 10 15

Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro 20 25 30

Gin Gin Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys 35 40 45

Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gin Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu 50 55 60

Thr Thr Asp Leu Arg lie Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys 65 70 75 80

Ala Leu Gly Gly Lys Gly Fro Tyr Thr Leu Gin Gly Leu Leu Gly Cys 85 90 95

Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Va) Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu 100 105 no

Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gin Gly Thr Trp Gly 115 120 125

Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala lie Ser Gin Arg Trp Gin GIti Gin 130 135 140

Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro 145 150 155 160

His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp 165 170 175

Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly 180 185 190

Phe Ser Va! Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu 195 200 205 G]n Leu Arg Phc Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala Gly Thr Gly Gin Gly 210 225 220

Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Giy Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu -10- 1416】6-序列表.doc 201016233 225 230 235 240

Thr Val Lys Ser Gly Asp GIu His His Tyr Cys Cys lie Val Gin His 245 250 255

Ala Gly Leu Ala Gin Pro Leu Arg Val Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys 260 265 270

Ser Ser His His His His His His 275 280 <210> 14 <211> 285 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之說明：合成多肽 <400> 14

Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Ser 15 10 15

Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Scr Gly Trp Leu Gly Pro 20 25 30

Gin Gin Tyr Leu Ser Tyr Asp Ser Leu Arg Gly Gin Ala Glu Pro Cys 35 40 45

Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gin Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu 50 55 60

Thr Thr Asp Leu Arg lie Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys 65 70 75 80

Ala Uu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Π,γ Leu Gin Gly Leu Leu Gly Cys

Glu Leu Ser Pro Asp Asn Thr Ser Va! Pro Tbr Ala Lys Phe Ala Leu 100 105 110

Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gin Gly Thr Trp Gly 115 120 125

Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala lie Ser Gin Arg Trp Gin Gin Gin 130 135 340

Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro 145 150 155 160

His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp 165 370 175

Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Gly Asn Pro Gly 180 185 190

Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu 195 200 205

Gin Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala Gly Thr Gly Gin Gly 210 215 220 • 11 - 141616-序列表.doc 201016233

Asp Phc Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu 225 230 235 240

Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys Cys lie Val Gin His 245 250 255

Ala Gly Leu Ala Gin Pro Leu Arg Val Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys 260 265 270

Ser Ser Gly Arg Ala His His His His His His His His 275 280 285 12- 141616-序列表.doc

Claims

201016233 七、申請專利範圍： 1. 一種治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有一修飾’相較不具有該修飾之抗體，具有該修飾之抗體可延長血清半衰期，且其中該抗體係以皮下方式投與介於0.2毫克/公斤與1〇毫克/公斤之間的劑量。 2. 如請求項1之方法’其中該劑量係介於〇·3毫克/公斤與7.0 ❹ 毫克/公斤之間。 3. 如請求項丨之方法，其中該抗體為抗人類cd4抗體且該個體為人類。 4. 如請求項2之方法，其中該劑量係選自〇.3毫克/公斤、1〇毫克/公斤、2.0毫克/公斤、2·5毫克/公斤、3 〇毫克/公斤、3·5毫克/公斤及7.0毫克/公斤。 5. 一種治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之方法，該方法 φ 包含向該個體投與治療有效量之非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有一修飾，相較不具有該修飾之抗體，具有該修飾之抗體可延長血清半衰期，且其中投與該抗體包含首次投藥及至少一次隨後投藥，其中該首次投藥劑量介於0.05毫克/公斤與35毫克/公斤之間，而隨後各次投藥劑量係與該首次投藥相同，其中隨後各次投藥係在前次投藥後第5天與第9天之間投與，且其中該首次投藥與隨後各次投藥係以皮下方式投與。 6. 如請求項5之方法，其中該首次投藥劑量介於15毫克/公 141616.doc 201016233 斤與5.0毫克/公斤之間。月求項5之方法，其中該抗體為抗人類cd4抗體且該個體為人类員。 8. 如請求項5之方法，其中隨後各次投藥係在前次投藥後第6天與第8天之間投與。 9. 如请求項8之方法，其中隨後各次投藥係在前次投藥後第7天投與。 10·如請求項6之方法，其中該首次投藥劑量係選自15毫克/ 公斤、2.0毫克/公斤、3 〇毫克/公斤、3 5毫克/公斤及5 〇毫克/公斤。 11.如請求項10之方法，其中該抗體每週投與一次。 12·如請求項丨丨之方法，其中該抗體係投與至少一段選自1 年、2年、5年及10年之時間。 13. 如請求項丨丨之方法，其中該抗體係投與該個體終生。 14. 如請求項丨或請求項5之方法，其中相對於該未經修飾抗體與FeRn之結合，該抗體之修飾會增強該抗體與FcRn之結合。 15·如凊求項14之方法，其中相對於該未經修飾抗體與FcRn 之結合，該經修飾抗體增強與FcRn之結合2〇倍與45倍之間。 16.如明求項丨5之方法，其中相對於該未經修飾抗體與之結合，該經修飾抗體增強與FcRn之結合3〇倍與4〇倍之間。月求項16之方法，其中相對於該未經修飾抗體與FcRn 141616.doc 201016233 之、、Ό σ ’該經修飾抗體增強與pcRn之結合3·3倍與3 7倍之間。 I8·如吻求項17之方法，其中相對於該未經修飾抗體與FcRn 之結合’該經修飾抗體增強與FcRn之結合3 5倍。 19. 如叫求項丨或請求項5之方法，其中相較該未經修飾抗體的血清清除率，該經修飾抗體具有經降低之血清清除率。 20. 如凊求項19之方法，其申相較該未經修飾抗體，該經修飾抗體的血清清除率係經降低至少38%。 21. 如凊求項2〇之方法，其中相較該未經修飾抗體，該經修飾抗體的血清清除率係經降低38%與59%之間。 22. 如請求項丨或請求項5之方法，其中該自體免疫疾病係選自狼瘡、全身性紅斑狼瘡、皮膚型紅斑狼瘡 '腎外/狼瘡腎炎、多發性硬化、復發-緩解型多發性硬化、繼發_進行性多發性硬化、原發_進行性多發性硬化、類風濕性關節炎、牛皮癬及牛皮癬性關節炎。 23. 如請求項22之方法，其中該自體免疫疾病係選自全身性紅斑狼瘡、皮膚型紅斑狼瘡及狼瘡腎炎。 24·如請求項22之方法，其中該自體免疫疾病係選自多發性硬化、復發-緩解型多發性硬化、繼發_進行性多發性硬化及原發·進行性多發性硬化。 25. 如請求項22之方法，其中該自體免疫疾病係選自類風濕性關節炎及牛皮癣性關節炎。 26. 如凊求項1或請求項5之方法，其中該抗體包含seq 141616.doc 201016233 NO·: 1之輕鏈CDR序列。 27_如請求項26之方法，其中該抗體包含SEQ ID NO.: 1之輕鏈可變區序列。 28. 如清求項27之方法’其中該抗體包含一輕鍵，該輕鍵包含SEQIDNO.: 1之序列。 29. 如請求項1或請求項5之方法，其中該抗體包含SEQ ID NO.: 6之重鍵CDR序列。 30. 如請求項29之方法，其中該抗體包含SEQ ID NO·: 6之重鏈可變區序列。 31. 如睛求項30之方法，其中該抗體包含一重鏈，該重鏈包含SEQ ID NO·: 6之序列。 32. 如請求項1或請求項5之方法，其中該抗體具有進一步之修飾’相較不具有該進一步修飾之抗體，具有該進一步修飾之抗體會降低與Fey受體結合。 3 3.如請求項32之方法’其中該抗體包含去糖基化之卜區。 34. 如請求項33之方法，其中該抗體包含不含有糖基化位點之恒定區。 35. 如請求項32之方法，其中該抗體包含具有至少一個胺基酸取代之Fc區。 36. 如明求項35之方法，其中該抗體包含如SEq ID no : 4、 5及6中所示之N297 A取代。 37. 如請求項36之方法，其中該抗體進一步包含如seq 1〇 NO.: 5中所示之N434A取代。 38. 如請求項36之方法，其中該抗體進一步包含如SEQ ID 141616.doc 201016233 NO.: 6中所示之N434H取代。 39. 如請求項28之方法，其中該抗體進一步包含選自SEQ ID NO·: 5及SEQ ID NO.: 6之重鏈。 40. 如請求項1或請求項5之方法，其中該抗體為人類化抗體。 41. 如請求項1或請求項5之方法，其中該抗體係與至少一種選自DMARD、皮質類固醇及NSAID之第二化合物組合投與。 W 42_如請求項41之方法，其中該DMARD係選自甲胺喋呤 (methotrexate)、來氟米特（leflunomide)、柳氮讀胺0比咬 (sulfasalazine)及經基氣啥（hydroxychloroquine) 〇 43. 如請求項1或請求項5之方法，其中該個體先前接受至少一種生物藥劑是無效的。 44. 如請求項43之方法，其中該生物藥劑係選自阿達木單抗 (adalimumab)、依那西普（etanercept)、英利昔單抗 (infliximab)、戈利木單抗（golimumab)、聚乙二醇化塞妥珠單抗（certolizumab pegol)、利妥昔單抗（rituximab)及奥 B 克麗珠單抗（ocrelizumab)。 ·. 45.如請求項1或請求項5之方法，其中該個體先前接受至少 .一種DMARD是無效的。 46. 如請求項45之方法，其中該DMARD係選自曱胺喋呤、來氟米特、柳氮磺胺°比啶及羥基氣喹。 47. —種治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之非消耗性CD4抗體，其 141616.doc 201016233 中該抗體含有一修飾，相較不具有該修飾之抗體，具有該修飾之抗體可延長血清半衰期，且其中該抗體係以皮下方式併與間質藥物分散劑組合投與介於〇·2毫克/公斤與1 〇毫克/公斤之間的劑量。 48. —種治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之非消耗性CD4抗體，其中該抗體一修飾，相較不具有該修飾之抗體，具有該修飾之抗體可延長血清半衰期，且其中投與該抗體包含首次投藥及至少一次隨後投藥，其中該首次投藥劑量介於〇.〇5毫克/公斤與35毫克/公斤之間且隨後各次投藥劑量係與該首次投藥相同，其中隨後各次投藥係在前次投藥後第5天與第9天之間投與，且其中該首次投藥及隨後各次投藥係以皮下方式併與組合投與間質藥物分散劑。 49. 如請求項47或請求項48之方法，其中該間質藥物分散劑為可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白。 5〇.如請求項49之方法’其中該可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白為rHuPH20。 51.種治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有一修飾，相較不具有該修飾之抗體，具有該修飾之抗趙可延長血清半衰期，且其中該抗體係使用自助注射裝置以皮下方式投與介於〇2毫克/公斤與⑺毫克/公斤之間的劑量。請求項51之方法，其中該自助注射裝置係選自預裝藥 14I616.doc 201016233 品式注射器、微針裝置及無針注射裝置。 53. -種治療哺㈣物個體之自體免疫疾狀方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有一修都’相較不具有該修錦之抗體，具有 ·. 該修飾之抗體可延長血清半衰期，且其中投與該抗體包含首次投藥及至少一-会睹你4Λ dsfe "人隨後投藥，其中該首次投藥劑量介j 〇5毫克/公斤與35毫克/公斤之間且隨後各次投藥 φ 劑$係與該首夂投藥相同’其令隨後各次投藥係在前次投藥後第5天與第9天之間投與，且其中該首次投藥及隨後各次投藥係用自助注射裝置以皮下方式投與。 •如-月求項53之方法，其中該自助注射裝置係選自預裝藥品式注射器、微針裝置及無針注射裝置。 55. -種治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之方法，該方法向該個體投與治療有效量之非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有-修飾，相較不具有該修飾之抗體，具有參該修部之抗體可延長血清半衰期，且其中該抗體係以皮下方式投與介於15〇毫克與35〇毫克之間的固定劑量。 56·如明求項55之方法，其中該固定劑量係介於200毫克與 300毫克之間。月长項56之方法，其中該固定劑量係介於225毫克與 275毫克之間。 58·如請求項57之方法，其中該固定劑量為250毫克。 59_如叫求項55之方法，其中該抗體為抗人類CD4抗體且該個體為人類。 141616.doc 201016233 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 一種治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有一修飾，相較不具有該修姊之抗體，具有該修倚之抗體可延長血清半衰期，且其中投與該抗體包含首次投藥及至少一次隨後投藥，其中該首次投藥係以介於150毫克與350毫克之間的固定劑量進行且隨後各次投藥劑量係與該首次投藥相同，其中隨後各次投藥係在前次投藥後第5天與第9天之間投與，且其中該首次投藥及隨後各次投藥係以皮下方式投與。如請求項60之方法，其中該固定劑量係介於2〇〇毫克與 3〇〇毫克之間。如請求項61之方法，其中該固定劑量係介於225毫克與 275毫克之間。如請求項62之方法，其中該固定劑量為25〇毫克。如請求項60之方法，其中該抗體為抗人類^^抗體且該個體為人類。如靖求項60之方法，其中隨後各次投藥係在前次投藥後第6天與第8天之間投與。如明求項60之方法，其中隨後各次投藥係在前次投第7天投與。 ' 如叫求項60之方法，其中該抗體每週投與一次。如请求項67之方法，其中該抗體係投與至少一段選自i 年、2年、5年及1〇年之時間。如味求項67之方法，其中該抗體係投與該個體終生。 141616.doc 201016233 70.如請求項55或請求項60之方法，其中相對於該未經修飾抗體與FcRn之結合，該抗體之修飾會增強該抗體與FcRn 之結合。 7 1.如請求項70之方法，其中相對於該未經修飾抗體與FcRn 之結合，該經修飾抗體與FcRn之結合增強2.0倍與4.5倍之間。 72. 如請求項7 1之方法，其中相對於該未經修飾抗體與FcRn 之結合，該經修飾抗體與FcRn之結合增強3.0倍與4.0倍之間。 73. 如請求項72之方法，其中相對於該未經修飾抗體與FcRn 之結合，該經修飾抗體與FcRn之結合增強3.3倍與3.7倍之間。 74. 如請求項73之方法，其中相對於該未經修飾抗體與FcRn 之結合，該經修飾抗體與FcRn之結合增強3.5倍。 75. 如請求項55或請求項60之方法，其中相較該未經修飾抗體的血清清除率，該經修飾抗體的血清清除率業已降低。 76. 如請求項75之方法，其中相較該未經修飾抗體，該經修飾抗體的血清清除率降低至少38%。 77. 如請求項76之方法，其中相較該未經修飾抗體，該經修飾抗體的血清清除率降低38%與59%之間。 78. 如請求項55或請求項60之方法，其中該自體免疫疾病係選自狼瘡、全身性紅斑狼瘡、皮膚型紅斑狼瘡、腎外/狼瘡腎炎、多發性硬化、復發-緩解型多發性硬化、繼發- 141616.doc 201016233 進订性多發性硬化、原發-進行性多發性硬化、類風濕性關節炎、牛皮癬及牛皮癖性關節炎。 79.如研求項78之方法，其中該自體免疫疾病係選自全身性紅斑狼瘡、皮膚型紅斑狼瘡及狼瘡腎炎。 80·如研求項78之方法’其中該自體免疫疾病係選自多發性硬化、復發-緩解型多發性硬化、繼發-進行性多發性硬化及原發•進行性多發性硬化。 81. 如清求項78之方法，其中該自體免疫疾病係選自類風濕性關節炎及牛皮癬性關節炎。 82. 如請求項55或請求項6〇之方法，其中該抗體包含seq NO.: 1之輕鏈CDR序列。 83. 如清求項82之方法，其中該抗體包含SEq m N〇 : 1之輕鏈可變區序列。 84. 如请求項83之方法’其中該抗體包含含有SEq ID no : 1 序列之輕鏈。 85. 如請求項55或請求項6〇之方法，其中該抗體包含seq⑴ NO.: 6之重鏈CDR序列。 86. 如請求項85之方法，其中該抗體包含SEQ m N〇 : 6之重鍵可變區序列。 87. 如請求項86之方法，其中該抗體包含含有SEQ出N〇 : 6 序列之重鏈。 88·如請求項55或請求項6〇之方法，其中該抗體具有進一步之修飾，相較不具有該進一步修飾之抗體，該具有進一步修飾之抗體會減低與受體結合。 141616.doc 201016233 89. 如請求項88之方法，其中該抗體包含去糖基化之Fc區。 90. 如請求項89之方法，其中該抗體包含不含有糖基化位點之恆定區。 91. 如請求項88之方法，其中該抗體包含具有至少一個胺基酸取代之F c區。 92. 如請求項91之方法，其中該抗體包含如SEQ ID NO.: 4、 5及6中所示之N297A取代。 93. 如請求項92之方法，其中該抗體進一步包含如SEQ ID ® NO.: 5中所示之N434A取代。 94. 如請求項92之方法，其中該抗體進一步包含如SEQ ID NO·: 6中所示之N434H取代。 95. 如請求項84之方法，其中該抗體進一步包含選自SEQ ID NO·: 5及 SEQ ID NO.: 6之重鏈。 96. 如請求項55或請求項60之方法，其中該抗體為人類化抗體。 ^ 97.如請求項55或請求項60之方法，其中該抗體係與至少一種選自DMARD、皮質類固醇及NSAID之第二化合物組合 * 投與。 98. 如請求項97之方法，其中該DMARD係選自甲胺喋呤、，來氟米特、柳氮磺胺°比啶及羥基氣喹。 99. 如請求項55或請求項60之方法，其中該個體先前接受至少一種生物藥劑是無效的。 100. 如請求項99之方法，其中該生物藥劑係選自阿達木單抗、依那西普、英利昔單抗、戈利木單抗、聚乙二醇化 141616.doc -11 - 201016233 塞妥珠單抗、利妥昔單抗及奥克麗珠單抗。 101. 如4求項55或請求項6〇之方法，其中該個體先前接受至少一種DMARD是無效的。 102. 如明求項1〇1之方法，其中該dmard係選自曱胺喋呤、來氟米特、柳氮磺胺。比啶及羥基氣喹。 1〇3_ —種治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之方法，該方法包3向該個體投與治療有效量之非消耗性CD4抗體，其中該抗體-修舞’相較不具有該修飾之抗體具有該修

飾之抗體可延長血清半衰期，且其中該抗體係以皮下方式併與間質藥物分散劑組合投與介於150毫克與350毫克之間的固定劑量。 1〇4·-種治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之方法

包3向該個體投與治療有效量之非消耗性[Μ抗體，中該抗體含有-修飾，相較不具有該修飾之抗體，具該修飾之抗體可延長也清半衰期，且其中投與該抗體含首次投藥及至少-次隨後投藥，其中該首次投藥劑介於150毫克與35Q毫克之間且隨後各次投藥劑量係與首次投藥相同’其中隨後各次投藥係在前次投藥後筹天與第9天之間投與，且其中該首次投藥及隨後各次藥係以皮下方式併與組合投與間質藥物分散劑。肌如請求項⑽或請求項ΠΜ之方法，其中該間質藥物分劑為可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白。胤如請求項1〇5之方法…該可溶性；性活性玻尿酸聽蛋白為rHuPH20。 141616.doc -12· 201016233 107. —種治療哺乳動物個體之自體免疫疾病之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之非消耗性CD4抗體，其中該抗體含有一修飾，相較不具有該修飾之抗體，具有該修飾之抗體可延長血清半衰期’且其中投與該抗體包含首次投藥及至少一次隨後投藥，其中該首次投藥劑量介於1 5 0毫克與3 5 0毫克之間且隨後各次投藥劑量係與該首次投藥相同，其中隨後各次投藥係在前次投藥後第5 天與第9天之間投與，且其中該首次投藥及隨後各次投藥係用自助注射裝置以皮下方式投與。 108. 如請求項107之方法，其中該自助注射裝置係選自預裝藥品式注射器、微針裝置及無針注射裝置。 109. —種包含治療有效量之非消耗性CD4抗體及間質藥物分散劑之調配物’其中該抗體含有一修飾，相較不具有該修飾之抗體相比’具有該修飾之抗體可延長血清半衰期。 ❿ 110·如請求項1〇9之調配物，其中該非消耗性CD4抗體之治療有效量係介於150毫克與350毫克之間。 111. 如請求項110之調配物’其中該非消耗性CD4抗體之治療有效量係介於200毫克與300毫克之間。 112. 如請求項111之調配物，其中該非消耗性CD4抗體之治療有效量係介於225毫克與275毫克之間。 113. 如請求項112之調配物，其中該非消耗性CD4抗體之治療有效量為250毫克。 114. 如請求項109之調配物，其中該間質藥物分散劑為可溶 141616.doc •13- 201016233 性中性活性玻尿酸酶膽蛋白。 115. 如請求項114之調配物，其中該可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白為rHuPH20。 116. 如請求項109之調配物，其中該調配物為醫藥調配物。 141616.doc 14-