TW201000634A - Proline-specific protease - Google Patents

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201000634 六、發明說明： 【發明戶斤屬之技術領域:j 發明領域 本發明係相關於一種脯胺酸-專一性蛋白酶。本發明亦 相關於一種使用該脯胺酸-專一性蛋白酶之方法，以及使用 該脯胺酸-專一性蛋白酶之用途。 r:先前技術3 發明背景 脯胺酸-專一性蛋白酶為可於脯胺酸殘基或其附近切 割蛋白質或胜肽之酵素。 脯胺酸-專一性蛋白酶已假設可用於多種應用中，如在 蛋白質水解物製備過程中使異味產生降至最低、降低此類 水解物之抗原性，以及預防或降低飲料之混濁度。 目前需要一種可使用於食物或飲料中之酵素，其具有 適當之酸性pH最佳值，以及，較佳於使用其產生之最終製 備物中為非活性。因此，用於食物或飲料應用中之酵素可 依據希望輕易地失活。 【發明内容3 發明概要 本發明係相關於一種具有脯胺酸-專一性蛋白酶活性 之多胜肽，其包含如SEQ ID NO : 3之胺基酸序列，或由核 苷酸序列SEQ ID NO : 1及/或SEQ ID NO : 2編碼之胺基酸 序列，或其變異物或任一者之片段。 本發明之脯胺酸-專一性酵素為具有最佳pH值約pH 4 至約pH 5，以及可立即失活者。因此，特別適用於食物或 3 201000634 飲料應用。 本發明之多胜肽與序列SEQ ID NO : 3具有至少約60% 之序列等同度。本發明之多胜肽具有長度至少約150個胺基 酸。一種具有脯胺酸-專一性蛋白酶活性之多胜肽，包含一 前述申請專利範圍任一項之多胜肽之功能性區塊。 本發明亦相關於一種聚核苷酸，其包含： (a) 如SEQ ID NO : 2之核苷酸序列及/或SEQ ID NO : 1 之編碼序列； (b) —種核苷酸序列，其可選擇性地與SEQ ID NO : 1 或SEQ ID NO : 2之反向互補聚核苷酸雜合； (c) 一種核苷酸序列，具有與核苷酸序列SEQ ID NO: 1 或SEQ ID NO : 2至少約50%之序列等同度； (d) —如（a)、（b)或（c)中所定義之核苷酸序列之片段，具 有至少約100個核苷酸； (e) —退化(degenerate)序列，其為如（a)、（b)、（c)或（d) 中定義之序列之基因編碼結果；或 (f) 一核苷酸序列，其為如（a)、（b)、（c)、（d)或（e)定義 之核苦酸序列之反向互補物。 本發明更提供： -一包含本發明聚核苷酸序列之載體； -一包含本發明多胜肽、聚核苷酸或載體之細胞； -一種製備具有脯胺酸-專一性蛋白酶活性之多胜肽之 方法，該方法包含培養本發明之細胞，於可使該多胜肽表 現之條件下，以及，選擇性地，回收該經表現之多胜肽； -一由此方法獲得之多胜肽； -一種組成物，包含：⑴本發明之多胜肽，以及選擇性 201000634 地，⑼—蛋白酶，其不同於⑴之多胜狀. --種製備蛋白質水解物之方 質受質與本發明之多 4料切-蛋白 -使用太㈣/ 發明之組成物接觸； 吏用本毛明之多胜肽或組成物 之用途； 表備蛋白質水解物 一種蛋白質切物，*上財法獲得； :種食物或飼料產品或飲料，其包含此水解物；

種製備食物或飼料產品或飲料之方法 =該食物、飼料產品或飲料時加入本發明二二 種由此方法獲得之食物或飼料產物或飲料； -使財發明之乡職餘搞，製備食物或飼料產品 或飲料之用途； 種食物或飼料產品或飲料，由此方法或用途獲得； 以及 本發明之多胜肽，用於治療或預防精神疾病或腹腔疾 病相關之病症。 圖式簡單說明 第1圖為用於選殖脯胺酸-專一性蛋白酶ZFX之策略。 第2圖為青黴菌CBS 455.95之染色體DNA片段序列，包 含編碼脯胺酸-專一性蛋白酶ZFX(SEQIDN0: 1)之基因。 該編碼序列（SEQ ID NO : 2)係標記出，並指出其蛋白質序 列(SEQ ID NO : 3)。 第3圖顯示該經單離脯胺酸-專一性蛋白酶ZFX之最佳 溫度。 5 201000634 序列表之簡要敘述 SEQ ID NO : 1為青黴菌CBS 455.95之染色體DNA片 I又之核苷酸序列，包含編碼脯胺酸_專一性蛋白酶ZFX之基因。 SEQ ID NO : 2為編碼脯胺酸_專一性蛋白酶ζρχ序列 之核苷酸。 SEQIDNO : 3為脯胺酸-專一性蛋白酶ZFX之胺基酸 序列。 SEQ ID NO , 4為直接pcR引子(ZFX-dir)，含有24個 核苷酸ZFX編碼序列，起始於ATG起始密碼子，之後接有 個核苷酸序列，包括一PacI限制酶切割位置。 SEQIDNO : 5為反向引子(ZFX_rev)，含有ZFX編碼序 列下游區域之反向股之互補核苷酸，該區域之後接有— 心cl限制酶切割位置。 C實施方式】 較佳實施例之詳細說明 本發明係相關於一種新穎之脯胺酸_專一性蛋白酶，其 係於真菌月Μ菌中辨識出。此相 田7人罵冴，因為在^¥〇〇2/45524文獻中顯示由,黑身磨(及 mgerj獲得之編碼脯胺酸_專一性蛋白酶2cDna片段，並不 會與單離自青礙菌之基因體DNA雜合(請見WO 02/45524中 之範例11與表6)。 於此所描述之新穎酵素具有最佳酸性pH值，實質上或 較佳在經由如加熱步驟（如標準巴斯得滅菌法）後會完全失 活。因此，該酵素適用於食物應用中，其一般為酸性環境， 並回度希望最终產物（食物）實質上並無殘留之酵素活性。 201000634 此外，本發明亦符合可大量生產脯胺酸-專一性蛋白酶 之要求。較佳為，此脯胺酸-專一性蛋白酶自宿主細胞中分 /必出。活性分泌為經濟活體製程中最重要的，由於其可使 酵素回收達幾乎完全純形式 ，而不需繁瑣之純化過程。此 ’舌丨生分泌之脯胺酸_專一性蛋白酶之過度表現，係使用食物 級真菌宿主如麴菌’可產生食物級酵素，以及相當經濟之 製程’因此為較佳方法。揭示之方法係用於大量產生脯胺 酸-專一性蛋白酶’使用食物級生產宿主黑麴菌。 由經濟觀點來看，目前仍相當需要一種增進之方法， 大里產生相當純形式之脯胺酸-專一性蛋白酶。吾人於此顯 不出’可使用重組DNA技術過度表現此脯胺酸-專一性蛋白 酶。一特佳之方式為藉由過度表現真菌衍生之脯胺酸-專一 性蛋白酶’最佳之方式為藉由過度表現青黴菌衍生之脯胺 酸-專一性蛋白酶。為了使後者之製造路徑可行，便必須知 道青徽菌衍生之脯胺酸-專一性蛋白酶之獨特序列資訊。較 佳獲得該編碼基因之完整核芽酸序列。 一旦可大量製造出相當純形式之該新穎酵素，具有增 進質地、外觀及/或免疫特性之食品（如麵包、麵團或麵條） 或蛋白質水解物便可製備出，為食品級且相當經濟之方 式。此酵素可應用為防腐劑。此外，此酵素可用於製備飲 料，尤其是預防或降低飲料呈現混濁。 於此’脯胺酸-專一性蛋白酶活性係定義為可切割蛋白 質及/或胜肽中涉及脯胺酸殘基胜肽鍵之蛋白酶活性。可普 遍視為用於本發明之蛋白質，包含大於約30個胺基酸。胜 7 201000634 肽亦可使用於本發明目的，包含約30個或更少之胺基酸。 因此’脯胺酸-專一性蛋白酶具有脯胺酸_專一性内蛋白 酶活性，及/或脯胺酸-專一性寡胜肽酶(EC 3 4 21 26)。較 仏，本叙明之脯胺酸-專一性蛋白酶，如脯胺酸-專一性内蛋 白酶，及/或脯胺酸-專一性寡胜肽酶，其可於含有脯胺酸_ 殘基之蛋白質及/或胜肽處進行水解反應。 在本發明中，脯胺酸-專—性蛋白酶較佳為會於脯胺酸 殘基羧基端水解該胜肽鍵。然而，會於脯胺酸殘基胺基端 切割之脯胺基-專一性蛋白酶，係描述於Nature，15 January 1998, Vol.391，p.301-304。 在本文中，術語脯胺基_專一性内蛋白酶、脯胺酸-專一 性内蛋白H、脯胺酸-專-性内胜肽酶、脯胺酸·專一性募胜 肽酶、脯胺基_專-性s胜狀酶、脯胺基募胜肽酶、具有膽 胺基-專一性活性或類似表現之蛋白質/胜肽，皆可互相交換 使用。 本發明係長:供一種聚核苷酸，編碼一脯胺酸-專一性蛋 白酶，於此稱之為ZFX” ’具有如SEQ ID NO : 3之胺基酸 序列或其k異序列（如其功能性等效物seq id NO : 3)，或 其片段之序列。該胺基醆序列亦列於第2圖中。 編碼Z F X脯胺酸-專一性蛋白酶之基因序列係經由定序 青Μ菌基因體而得。本發明係提供包含編碼ZFX脯胺酸_專 一性蛋白酶之聚核苷酸序列，以及其編碼序列。因此，本 發明係相關於一種單離出之聚核苷酸，包含如ID NO: 1或2之核苷酸序列，及其變異物，如其功能性等效物。該 201000634 核苷酸序列亦示於第2圖中。 特別的是’本發明係相關於一種單離出之聚核苷酸， 其可選擇性地與包含SEQ ID NO : 1編碼序列或SEQ id NO : 2編碼序列之反向互補聚核苷酸雜合，在嚴苛條件， 較佳為高度嚴苛條件下。 較佳為，本發明之聚核苷酸（以及其編碼之多胜肽），可 仔自及/或付自一真菌’尤其是子囊菌綱加)之真 菌’如來自盤菌亞綱（尸、散囊菌綱 、散囊菌目（五㈣，尤其是髮菌 (TWc/zoc⑽aceae)家族，如來自青黴菌屬，較佳來自產黃青 更特別的，本發明係相關於一種聚核苷酸，包含或實 質上由編碼SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2之核苷酸序列組成。 本發明亦相關於一種單離出之聚核苷酸，包含或實質 上由編碼SEQ ID NO : 3多胜肽之至少一功能區塊或其變異 物之序列，如其功能等效物或其片段組成。 使用於此，術語“基因”與“重組基因，，係指一核酸分 子，其可單離自染色體DNA，其包含一開放閱讀框’編碼 一蛋白質如本發明之青黴菌脯胺酸_專一性蛋白酶。 一基因可包括編碼序列、非編/5馬序列、内含子及/或调 節序列。此外，術語“基因，，可代表一單離出之核酸分子’ 如此處定義者。 本發明之核酸分子，如具有編碼SEQ ID NO : 1之核苷 酸序列’或SEQ ID NO : 2之序列，或其功能等效物，可使 9 201000634 用標準分子生物技術純化出，其序列資訊提供於此。例如， 使用SEQ ID NO : 1或2核酸序列之全部或部分作為雜合探 針，本發明之核酸分子可使用標準雜合與選殖技術單離出 (如描述於 Sambrook, J·，Fritsh，E. F·，and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989，一 書中者）。 此外，包含SEQ ID NO : 1或2之全部或部分之核酸分 子可使用聚合酶連鎖反應(PCR)單離出，使用合成之寡核苷 酸引子，依據SEQ ID NO : 1或2所含之資訊設計。 本發明之核酸，可使用cDNA、mRNA或基因體DNA作 為模版，以及適當之寡核苷酸引子，依據標準PCR倍增技 術進行倍增反應。如此倍增之核酸可選殖至適當之載體 上，並以DNA序列分析鑑定。於此係描述SEQ ID NO : 1片 段之單離與選殖。該片段係以PCR倍增，使用如SEQ ID NOs : 4與5之募核苷酸引子。 此外，對應於或可雜合至本發明核苷酸之寡核苷酸， 可依據標準合成技術製備’如使用自動化DNA合成儀。 在一較佳實施例中，本發明分離出之核酸分子包含核 苷酸序列，其編碼SEQ ID NO : 1之序列，或如seq ID NO : 2 之序列。SEQ ID NO : 2之序列係對應於青黴菌脯胺酸_專一 性蛋白酶cDNA之編碼區塊。此cDNA包含編碼青黴菌脯胺 酸-專一性蛋白酶多胜肽之序列，如SEQ ID NO : 3。 在另一較佳實施例中’本發明之單離核酸分子包含一 10 201000634 核酸分子，其為SEQ ID NO : 1或2核苷酸序列之反向互補 物，或此核苷酸之變異物，如功能等效物。 互補於另一核苷酸序列之核酸分子為足以與其他核苷 酸序列互補，使其可與其他核苷酸序列雜合而形成穩定二 合物者。 本發明之一觀點為一經單離之核酸分子，其編碼本發 明之多胜肽或其變異物，如其功能等效物，如一生物活性 片段或區塊，以及足以使用作為雜合探針之核酸分子，其 可辨識出編碼本發明多胜肽之核酸分子，以及是用作為 PCR引子之此核酸分子片段，用於倍增或突變核酸分子。 生物片段或區塊之一範例為一片段或區塊，其可至少 自（合成）受質上切割出一可偵測基團，該（合成）受質包含一 “耦合至偵測物上之脯胺酸”，於該（合成）受質之羧基端，其 中該偵測物係耦合至脯胺酸之羧基端，藉由可以蛋白酶切 割之化學鍵結。實驗部分提供了適當之(合成）受質範例。偵 測物之一範例為顯色或螢光基團。 本發明之聚核苷酸可“經單離”。在本發明中，一“經單 離之聚核苷酸”或“經單離之核酸”為一DNA或RNA，其並非 緊鄰於該二編碼序列，但在其所衍生之生物體天然發生之 基因體中，其為緊鄰著（一在5’端，一在3’端）。因此，在一 實施例中，經單離之核酸包括5’非編碼（如驅動子）序列之部 分或全部，其緊鄰於編碼序列。因此，該術語包括如重組 DNA，其可加至載體、自動重複質體或病毒，或是原核或 真核生物之基因體DNA上，或以獨立分子存在（如由PCR或 11 201000634 經内限制核酸酶處理之cDNA或基因體DNA片段），獨立於 其他序列。其亦包括重組DNA，其為編碼額外多胜肽之雜 合基因之一部份，其實質上不含細胞材料、病毒材料或培 養基（當使用重組DNA技術製造時），或化學前驅物，或其 他化學物（當經化學合成時）。此外，“經單離之核酸片段” 為一核酸片段，其非天然發生之片段，且在自然狀態下不 會被發現。 使用於此，術語“聚核苷酸，，或“核酸分子”係包括DNA 分子（如cDNA或基因體DNA)，以及RNA分子（如mRNA)， 以及使用核苷酸類似物產生之DNA或RNA類似物。亦即， 本發明之聚核苷酸可包含一 DNA及/或RNA。因此，本發明 之聚核苷酸可為可為DNA序列或RNA序列。該核酸分子可 為單股或雙股，但較佳為雙股DNA。該核酸分子可經合成， 使用合成或經修飾之核苷酸’包括胜肽核酸、寡核苷酸類 似物或衍生物（如肌苷、曱基碟酸酯’或硫代鱗酸酯核酸， 以及加入吖啶或聚離胺酸鏈，於該分子之3’，及/或5,端）。 此核苷醆與寡核苷酸可用於’如製備具有改變鹼基對能力 或增進對核酸酶抵抗能力之核酸。用於本發明目的，應瞭 解到於此描述之聚-核苷酸可以任何技術上已知之方法修飾。 本發明之另一實施例係提供一種經單離之核酸分子， 其為ZFX核酸分子之反義股，如ZFX核酸分子之編碼股。本 發明範疇亦包括於此描述之核酸分子之互補股。 提供於此之序列資訊不應狹窄限制為必要條件。於此 揭示之專一性序列可立即用於單離出完整基因，自絲狀真 12 201000634 菌中，尤其是青徵g，其之後可輕易地進行序列分析，因 而辨識出序列錯誤。 除非另有指出，所有核«序列皆由自動化DNA定序 儀定序DNA分子而得，而所有由該屬分子所編碼之多胜 肽之所有胺基酸相，係以上述決定之DNA序列轉譯而 仔。因此，如熟習以此自動化方式定序DNa序列之領域者 所知，任—以此測定之核《都會包含某些錯誤。自動化 測定之核芽酸序列-般至少有約9Q%之等同度，更佳為至 少約95%至至少約99.9%之等同度’等同於該定序DNA分子 之實際核苷酸序列。 1該實際序列可更準確地以其他方法決定，包括此領域 習知之人工DNA定序法。亦為技術上已知，該測^核皆酸 序列與實際序m目比較，不論是單-絲插人或刪除，都 會導致核《序狀_餘移，使得㈣敎核苦酸序 列編碼之胺基酸序列預測與實際上完全不同，自此标入或 刪除位置開始。 、熟習此技術領域者可辨識出此錯誤辨識之鹼基，並知 道如何修正此錯誤。 本發明之核酸可僅包含核酸序列SEQ ID N〇 : i之一部 或片·^又如可使用作為楝針或引子之片段，或編碼ZFX 蛋白質一部份之片段。 由選殖ZFX基因與CDNA而決定之核苷酸序列，可用於 t備探針或引子’其設計為辨識及/或選殖其他ZFX家族成 員，以及其他物種之ZFX之類似物。 13 201000634 該探針/引子一般包含實質上純之寡核苷酸，其〜护 含核普酸之-區塊，其可雜合至核賊序列seqid^包 或2(或其功能性等效物，或其反向互補物）之至少約1 . 1 15,較佳約18至20,更佳約22至25，更佳約3〇 35、、12至 45、50、55、60、65或75個，或更多連續核芽酸上， 高度嚴苛條件下。 ’如終 f入核甘酸序列為基礎之探針可用於偵測轉 基因體ZFX序列，其編石馬，如其他生物體之相同⑽^ 蛋白。在較佳實施例中，該探針更包含—標記基團聯 其上，如ό亥仏δ己基團可為一放射性同位素、一螢光化八； -酵素，或-酵素輔酶。此探針亦可使用作為診、 組之一部分，用於辨識出表現有取蛋白質之細胞。〜冬 術語“相似度” '“序列等同性，，及類似用語於此可 交換使用。用於本發明目的，於此係定義目 序列或二核酸序列間之等同度，序列係經對齊，用於：峻 對齊目的(如’可引人空格於第—胺基酸或核酸之序=佳 以與第二胺級或酸序列成最佳料）。此比料於待匕’ 序列之全長上進行。此夕卜，該比對亦可於較短長度上進= 如在約20、約50、約_固或更多之核酸/驗基或胺基酸上丁。， 對應胺基酸或核苦酸位置上之胺基酸殘基或核苦酸之 後進行比對。當第-序列上之—位置被與第二㈣對應位 置上之相㈣基酸殘基或核純佔據時，該位置上之分子 便視為相等。序關之相等度—般_二序關之等同度 百分比表示，為二序m目等位置數目/總位置數目之函數（即 14 201000634 %等同度=相等位置數目/總位置數目（即重疊位置)χ 100)。該 二序列可於全長上進行比較。 熟習此技術領域者應瞭解到，目前有數種電腦程式可 用以決定二序列間之類似度。例如，二序列間冬比較與等 同度百分比之決定可使用數學運算完成。 二胺基酸或核苷酸間之等同度百分比可使用如，Ε. Meyers與W. Miller演算法(CABIOS, 4:11-17 (1989)，其已加 入ALIGN程式中（2.0版），（得自ALIGN Query，使用 Genestream 伺服器 IGH Montpellier France 之序列資料 http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi)，使用 PAM120重 量殘基表，空格長度罰分為12，以及空格罰分為4。 本發明之核酸與蛋白質序列可使用作為“詢問序列’’， 以進行公用資料庫搜尋，如，辨識出其他家族成員或相關 序列。此搜尋可使用BLASTN、BLASTP與BLASTX程式(2.0 版），Altschul，et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10，進行。 核苷酸資料庫中之BLAST核苷酸搜尋可使用BLASTN程式 進行，以獲得本發明ZFX核酸分子之核苷酸序列類似物。 與蛋白質資料庫中經轉譯核苷酸序列之BLAST搜尋，可以 BLASTX程式進行，以獲得本發明ZFX基因轉譯之胺基酸序 列類似物。此外，用於與蛋白質資料庫比較，可使用BLASP 程式，具有矩陣Blosum 62，預期閾值=10，字元長度=3， 空格存在成本（cost)為11，以及空格延長成本為1。使用 BLAST程式時，可使用各程式之預設參數（如BLASTX、 BLASTP與BLASTN)。請見National Center for Biotechnology 15 201000634

Information之網頁http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，列有戶斤有公 用資料庫中類似物搜尋之相關資訊。 該BLASTP與BLAST N演算法可用於計算序列等同度 或比對序列（如辨識等效物或對應序列，如使用其預設設定）。 用於進行BLAST分析之軟體為公開可得，於National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。此演算法涉及首先辨識高分 序列配對（HSPs) ’藉由辨識出詢問序列中之長度w之短字 元’其媒合或滿足某些正值閾值積分T，當與資料庫序列相 同長度之字元比對時。T為鄰近字元積分閾值。這些起始鄰 近字元得分處（hit)可作為搜尋含有它們的HSP之起始種 子。該字元得分處可於每一序列之二方向延長，直到累積 比對積分增加為止。每一方向字元得分之延長中止於：累 積比對積分脫離X值，自其最大到達值；累積積分到達〇嘎 更低，歸因於一或更多負分殘基比對積分；或到達任—序 列之末端。BLAST演算法參數W、丁與\係決定比對之敏感 度與速度。用於DNA-DNA比較之BLASTN程式係使用預設 值字元長度（W)ll，期望值（E)10，以及二股之比較。用= 蛋白質-蛋白質比較之BLASTP係使用預設值字元長度 (W)3，BLOSUM62積分矩陣，空格存在罰分丨丨，空格延: 罰分1，以及期望值（E)10。 該BLAST演算法會進行二序列間類似度之統計分析。 由BLAST演算法提供之類似度測量為最小總和機率 _))，其提供機率指標，其中二核芽酸或胺基酸序列之媒 201000634 合會隨機發生。例如，一序列被認為類似於另一序列，若 第一序列與苐二序列比較之最小總和機率小於約1，較佳小 於約0.1 ’更佳小於約0.01，最佳小於約〇 〇〇1。 此外’一胜肽模體(motif)可用於辨識編碼含有此胜肽 模體之蛋白質之基因。除了一胜肽模體外，亦可使用二或 更多胜肽模體之組合物’以辨識出編碼含有該胜肽模體之 蛋白質之基因。當辨識出一或多個對應專一性脯胺酸_專一 性蛋白酶之胜肽模體後，便可辨識出編碼脯胺酸-專一性蛋 白酶之基因，使用這些胜肽模體之一者或多者之組合物。 脯胺酸-專一性蛋白酶可作為一範例，說明此基因如何被辨 識出’但所描述之方法為一般通用。一胜肽模體可用於搜 尋DNA資料庫中之經轉譯DNA，或自蛋白質序列資料庫中 搜尋一蛋白質序列，使用程式如Patscan (http://www-unix.mcs.anl.gov/compbio/PatScan/HTML/)。該 胺基酸序列必須以特定形式輸入，其描述於網頁上。另一 可進行之方法為使用該模體序列搜尋DNA資料庫中之經轉 澤DNA，或自蛋白質序列資料庫中搜尋一蛋白質序列，使 用程式如http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/。用於此程式，該 模體需以Prosite形式輸入於該搜尋區塊中，且資料庫係用 於搜尋蛋白質序列或經轉譯DNA序列中該模體之存在。此 方法可用於辨識編碼可使用之脯胺酸-專一性蛋白酶之真 菌基因。使用一或多種此述方法辨識出之基因可轉譯為一 蛋白質序列，使用此技術領域者已知之程式，並檢視其胺 基端訊號序列之存在。用於偵測訊號序列，可使用程式如 17 201000634

SignalP(httP://www.cbS.dtu‘dk/Services/訊號P/)。搜尋含有一 致序列與預測訊號序列之蛋白質序列，可提供工業生產此 酵素之許多優點。 另一可使用胜肽模體辨識脯胺酸_專一性蛋白酶基因 之方法，係設計寡核苷酸彳丨子，將該模體之胺基酸序列逆 轉譯為核苷酸序列，使用該生物體較偏愛之密碼子，其用 於辨識脯胺酸-專一性蛋白酶基因，並使用此募核苷酸於一 基因庫中進行雜合，或於經反轉錄mRNA匯合物之pcR引子 上。使用胜肽序列模體，可單離出編碼脯胺酸_專一性蛋白 酶之基因，當該基因序列為未知。設計退化寡核苷酸引子 之方法已描述於文獻中，其可用於此目的（Sambr〇〇k et吐 (1989) Molecular cloning： a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press)。此外，由生物體中單離出基因， 使用退化寡核苷酸作為探針或引子’已經描述。 編碼δ亥胜肽模體之春核苷酸係用於單離出編碼脯胺酸 -專性蛋白酶特性之基因。此群寡核皆酸之退化會由於引 入肌苷（inosine)⑴鹼基於未知核苷酸位置上而降低。此外， 胞t定(C)與胸腺㈣(T)驗基位置可㈣㈣⑼取代，而 在腺口票呤(A)與鳥糞口票呤(G)位置可僅引入脈，崎低退化 率，對於寡核賴引子僅有小量影響。此外，用於筛選生 物體中編碼脯胺酸_專—性蛋白酶之基因之存在，已知其密 碼:偏好，轉核㈣之退化率可於設轉料酸時，採 用密碼子偏好而降低。熟習此技術領域者應瞭解如何達 成。此外’所有可能之寡核苦酸引子組合，不含退化，可 18 201000634 分別合成，並用於各篩選實驗中。 首先，一基因體cDNA或EST基因庫係由有興趣物種接 於通用載體上而建立。適用於建立基因庫之方法係描述於 文獻中（Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press) ° 其 次，上述之退化寡核苷酸係用於PCR反應中，具有一通用 之寡核苷酸，其會在載體中於重組DNA插入物邊緣驅動單 離自該基因庫之DNA。可使用之策略已描述於文獻中，用 於單離出希望之基因，當僅有單一退化寡核苷酸引子時(如 Minambres et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 272, 477-479; PCR technology (1989) Ed. H.A. Erlich pp. 99-104’ Stockton Press)。第三，該PCR倍增片段之後經標 記，並使用作為以一般方法篩選基因庫之探針。全長基因 之後可選殖至適用於過度表現脯胺酸_專_性蛋白酶之表 現載體上’於希望之生產宿主中。 在不同方法中，若該物種無基因庫可篩選編碼脯胺酸_ 專性蛋白酶之基因之存在時，部分基因可經由pCR倍 增，使用不同之退化引子，或使用3，_RACE法，使用單一 退化引子。就此而言，RNA係單離自有興趣之物種，並使 用於3 -RACE反應中，使用單一退化引子作為基因專一性 引子。未知cDNA之倍增部分係使用一退化寡核苷酸，以及 通用引子，使用先前描述之3，_RACE法(w〇99/38956)。 €知僅使用小片段胜肽資訊而單離全長基因之方法， 係為於基因庫複製之濾紙上，雜合經標記之退化寡核苷 19 201000634 酸。使用退化寡核苷酸篩選基因庫之方法，以及計算或決 定這些寡核苷酸最佳雜合條件之方法’已廣泛描述於文獻 中（Sambrook et al.(1989))。上述之寡核苷酸可使用於此方 法中’以自不同物種中早離出編碼捕胺酸_ __性蛋白酶之 基因。 在此方法之變化中’可先建立部分基因庫。就此而古， DNA係經片段化，之後含有編碼脯胺酸-專_性蛋白酶之其 因之DNA片段，係以雜合上述經標記寡核苷酸而偵測出。 這些片段係經單離出，並用於建立部分基因庫，富含編石馬 脯胺酸-專一性蛋白酶之基因。此基因庫之後以一般方法篩 選。就此方法而言’基因體DNA首先以限制酶消化，之後 以凝膠電泳分離，此時cDNA可直接被分離。 另一單離編碼脯胺酸-專一性蛋白酶之基因之方法為 使用抗體，其特異於一致序列之任一胜肽。抗體可為單株 或多株。製造專一於小胜肽之抗體之方法係廣泛描述於文 獻中（Harlow, E and Lane，D (1988) Antibodies; a laboratory manual, ISBN 0-87969-314 -2)。 表現用基因庫係建立自有興趣之物種，藉由選殖cDNA 或基因體DNA至適用於方便使用之宿主，如大腸桿菌或酵 母菌中表現插入物之載體上。表現載體可以或不以噬菌體 lambda為基礎。由表現基因庫製造之抗體之免疫偵測，以 及專-性選絲現抗原之純化之描述已公開。使用專―於 一致模體中任-胜肽之抗體’可單離出編碼包含該模體之 贿月女酸-專一性蛋白酶之基因，使用此方法。 20 201000634 實際上，有許多不同之方法可用於單離編碼脯胺酸-專 一性蛋白酶之基因，若使用本發明所提供之資訊。使用胜 肽模體序列資訊之優點，與習知技藝相較，為速度較快且 相對較為容易，由於可辨識出新的活性脯胺酸-專一性蛋白 酶之基因密碼。使用序列資訊可提供新穎之脯胺酸-專一性 蛋白酶，應用於食品工業上，而不需進行實驗測試所有可 能之直接應用實驗。 使用於此，術語“選擇性雜合”與類似術語係用於描述 在雜合與清洗條件下，該核苷酸序列至少約60%、至少約 70%、至少約80%，較佳至少約85%，更佳至少約90%，較 佳至少約95%，更佳至少約98%，或更佳至少約99%類似 物，維持互相雜合。亦即，此雜合序列可共享至少約50%、 至少約60%、至少約70%、至少約80%，更佳至少約85%， 尤佳至少約90%，更佳至少約95%，尤佳至少98%，更佳至 少約99%之序列等同度。 因此，可選擇性雜合至SEQ ID NO : 1及/或SEQ ID NO: 2序列反向互補物之核苷酸序列，係包含於本發明中， 一般具有至少50%或60%、至少70%、至少80%、至少90%、 至少95%、至少98%，或至少99%之序列等同度，等同於SEQ ID NO : 1及/或SEQ ID NO : 2之編碼序列，長度約60，較 佳至少100，更佳至少200個連續核苷酸，更佳為SEQ ID NO : 1及/或SEQ ID NO : 2之全長。

類似地，編碼活性脯胺酸-專一性蛋白酶，並可選擇性 雜合至編碼SEQ ID NO : 1及/或SEQ ID NO : 2序列之DNA 21 201000634 互補片段之核賊，亦包含於本發明中。上述等同度與最 小尺寸之任-組合，亦可用於定義本發明<聚_核苷酸，較 佳為更嚴格之組合（即，具更長長度與更高等同度）。因此， 舉例而言，在60個，較佳100個核苷酸長度上具有至少議 或90%等同度之聚核《，為本發明之_觀點，以及在· 個核苦酸上具有至少9〇%等同度之聚核麵，為本發明之 另一觀點。 此雜合條件之-較佳、非限制性範例為於約饥之狀 氣化鈉/擰檬酸鈉（SSC)溶液中雜合，之後以5(rc，lxSSC , 0.1% SDS之溶液清洗，較佳於55t，更佳於6〇τ，尤佳於 65°C清洗。 高度嚴苛條件包括’如於68。(：，5x sse/5x Denhai_dt,s 溶液/1.0% SDS中雜合，以室溫之〇 2XSSC/0.1% SDS清洗。 此外，亦可於42°C清洗。 此技術領域者應瞭解到，何種情況下應施加嚴苛或高 度嚴苛雜合條件。此條件之額外守則為技術上已知，可獲

付於如 Sambrook et al., 1989，Molecular Cloning, A

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.； and Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons，N.Y.)。 當然’僅雜合至聚A序列（如在3,有聚(A)之mRNAs)， 或T(或U)殘基延伸互補之聚核苷酸，並不包含於本發明用 於專一性雜合至本發明核酸之一部分之聚核苷酸中，由於 此聚核苷酸會雜合至任一含有聚（A)延伸或其互補物之核 22 201000634 酸分子上(如實際上任一雙股cDNA選殖物）。 在一般方法中，由其他生物體建立之cDNA庫，如絲狀 真菌，尤其是髮菌（Trichomaceae)微生物家族，如麴菌或青 黴菌屬，可經篩選。 例如，青黴菌株可篩選出同源性ZFX聚核皆酸，使用 Northern墨潰分析法。藉由偵測本發明聚核苷酸同源性轉錄 物，cDNA庫可由單離自適當菌株之RNA建立，利用此技術 領域者已知之標準技術。此外，可篩選總基因體DNA庫， 使用可雜合至本發明ZFX聚核苷酸之探針。 可單離出同源性基因序列，如，藉由進行PCR反應’ 使用二退化募核苷酸引子匯聚物，以此述核苷酸序列為基礎。 該反應之模版可為由mRNA反轉錄獲得之cDNA，該 mRNA製備自已知或預期可表現本發明聚核苷酸之菌株。 該PCR產物可經選殖並定序，以確認該經倍增之序列係代 表新ZFX核酸序列，或其功能性等效物。 之後該PCR片段可用於單離全長cDNA選殖物，藉由各 種已知方法。例如，該經倍增之片段可經標記，並用於|争 選噬菌體或黏質體cDNA庫。此外，該經標記片段可用於篩 選基因庫。 PCR技術亦可用於單離出來自其他生物體之全長 cDNA序列。例如，可依據標準程序自適當細胞或組織來源 單離出RNA。可於RNA上進行反轉錄反應，使用專一於倍 增片段最5’端之募核苷酸引子，用於驅動第一股之合成。 所得之RNA/DNA雜合物之後可“加尾端”(如加上胍）， 23 201000634 使用標準末端轉移酶反應，該雜合物可以RNase Η切割，之 後可啟動第二股合成（如使用聚-C引子）。因此，該經倍增之 cDNA序列上游可輕易地被單離出。可使用之選殖策略請見 如Sambrook ei α/.，如前所述；以及Ausubei α/.，如前所述。 本發明之另一觀點係包含一載體，包括選殖與表現載 體’其包含本發明之聚核苷酸，其編碼一 ZFX蛋白質或其 功能性等效物，以及於適當宿主中培養、轉型或轉染此載 體之方法’如於表現本發明多胜肽之條件下。使用於此’ 術語“栽體”係指一核酸分子，可傳送其上聯結之另一核酸 分子。 本發明之聚核苷酸可加至一重組複製載體上，如一選 殖或表現載體。該載體可於可相容之宿主細胞中複製核 酸。因此，在另一實施例中，本發明係提供一種製造本發 明聚核苷酸之方法，藉由引入本發明之聚核苷酸至複製載 體上，引入該載體至可相容之宿主細胞中，並培養該宿主 細胞，於可複製載體之條件下。該載體可自宿主細胞中回 收。適當之宿主細胞描述如下。 本發明表現E (expressi〇n cassette)或聚核苷酸播入之 載體’可為任-載體，其可方便地進行重組⑽八流程，載 體之選擇通常取決於待引入之宿主細胞。 本發明之載體可為一自動複製載體，即，存在作為染 色體外體之載體’其複製與染色體本體之複製無關，如〆 質體。此外，該載體可為當引入宿主細胞時，係插入宿主 細胞基因體中，並與其插人位置之染色體_同複製着。 24 201000634 其中一種載體為“質體”，其係指一環狀雙股DNA,與 其他DNA片段成圈狀’可被接f另—種形式之載體為病 毒載體，其中額外之DNA片段可接合至病毒基因體上。某 些載體可於其引入之宿主細胞中自動複製（如具有細菌複 製源之細菌載體以及附加型(epiS()mal)哺乳動物載體)。其他 載體（如非附加型哺乳動物載體）係整合至宿主細胞之基因 體中，當引人宿主細胞中時，因而會隨著宿主基因體一同 複製。此外’某些載體可引導其上操作性聯結之基因表現。 此載體於此係稱之為“表現載體，，。—般而言，重組應技 術中所使狀表現賴妙為質體料。麟“_”與“載 體於此可互相交換使用，由於質體為最常使用之載體。然 而’本發明亦包括其他形式之表現紐 如複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒與腺相關病毒），以及 >、有相等功能之噬菌體載體。 本發明之賴可於體外制，一於製造腦，或用 ;轉染或轉型宿主細胞。 .個、四個或五個 本發明之載體可包含二或多個，如 本發明之聚核苷酸，如用於過度表現。 本㈣之重絲現載體包含辑明之喊，於適當形 體^用於表㈣油胞中之核酸，此代表該重組表現載 考二卜或多個調節序列’㈣於表現之宿主細胞為基礎 夏’其上操作性地聯結有待表現之核酸序列。 ^重組表現載體中’ “操作性聯結，，係财興趣之核誓 ”結至調節序列上’以允許該核㈣序列表現之 25 201000634 方如體外或於宿主細胞中之轉錄/轉譯系統，當該載體引 佰主細胞中時），即’術語“操作性聯結，，係指一並列位置， 中所榀述之各成分具有一相互關係，使其可發揮預期功 效。調節序壯促進子、增強子或其他表現調節序列訊號， 係操作I生聯結，，至編碼序列丨，以可達到表現編碼序列之 方式排列，在與控制序列相容之情況下，或該序列排列為 可發揮其功用目的，如促進子位置上起始轉錄作用，並前 進至編碼該多胜肽之DNA序列。 因此，本發明係提供一種載體，其可為一表現載體， 舉例而言，其中該聚核苷酸序列係操作性地聯結至一調節 序列’可使該聚核苷酸序列於細胞中表現，如於絲狀真菌 細胞中。 術語“調節序列”係包括促進子、增強子與其他表現控 制元件（如多腺嘌呤化訊號）。此調節序列係描述於，如 Goeddel; Gene Expression Technology： Methods in

EnzywzoMgy 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)。 術語“調節序列”包括引導核苷酸序列於許多種類宿主 細胞中基本表現，以及引導核苷酸序列僅於某一宿主細胞 中表現之序列（如組織-專一性調節序列）。 因此，用於特定宿主細胞之載體或表現建構物可包含 下列元件，每一者係以5 ’ -端對3 端方式連續操作性聯乡士， 相對於編碼本發明多胜肽之序列之編碼股：（1)一促進子序 列，可引導編碼多胜肽之核苷酸序列於特定宿主細胞中之 轉錄作用；（2)選擇性地，一訊號序列，可引導該多胜肽自 26 201000634 該宿主細胞分泌至培養基中；（3)本發明之DNA序列係編碼 一成熟，且較佳為活性形式之多胜肽，具有脯胺酸-專一性 蛋白酶活性；以及較佳亦包含（4) 一轉錄終止區塊（終止 子），可終止編碼該多胜肽之核苷酸序列之轉錄下游。 本發明核苷酸序列之下游可為3’未轉譯區塊，含有一 或多個轉錄終止位置（如一終止子）。終止子之來源較不重 要。終止子可，如，編碼該多胜肽之原始DNA序列。然而， 較佳使用酵母菌終止子於酵母菌宿主細胞中，並使用絲狀 真菌終止子於絲狀真菌宿主細胞中。更佳為，該終止子為 宿主細胞内生性（其中該編碼多胜肽之核苷酸序列待表 現）。在轉錄區塊中，用於轉錄之核醣體結合位置可存在。 由建構物表現之成熟轉錄子之編碼部分，包括一轉譯起始 點AUG於開端，以及一終止密碼子，位於待轉譯多胜肽終 端之適當位置上。 本發明聚核苷酸之強化表現亦可藉由篩選異源性調節 區塊，如促進子、分泌引導子，及/或終止子區塊，其可增 加有興趣蛋白質在表現宿主中之表現量與，若希望的話， 分泌量，及/或用於誘發控制本發明多胜肽之表現。 因此本發明係提供一載體，其可為一表現載體，如其 中該聚核苷酸序列係與一調節序列操作性聯結，使得該聚 核苷酸序列可於細胞，如絲狀真菌細胞中表現。 此技術領域者應可瞭解到，表現載體之設計係取決於 數種因素，如待轉型宿主細胞之選擇、希望之蛋白質表現 量等。本發明表現載體可引入宿主細胞中，而產生由上述 27 201000634 核酸編碼之蛋白質或胜肽（如ZFX蛋白質、ZFX蛋白質片段 之突變形式、其變異物或功能等效物、融合蛋白質等 促進子/增強子與其他表現調節訊號可經選擇，以與宿 主細胞相容’其表現載體係經設計。例如可使用原核促進 子’尤其是適用於大腸桿菌者。於哺乳動物細胞中表現本 發明多胜肽時，可使用哺乳動物促進子。亦 一性促進子，如爾·專-性促進子。亦可制病毒= 子，如M〇l〇ney嚙齒類白血病病毒長端重複單元 ltr)、勞氏肉瘤病毒(RSV) LTR促進子、SV4〇促進子、人 類巨細胞病毒(CMV)IE促進子、泡疹單純病毒促進子或腺 病毋促進子。 適當之酵母菌促進子包括釀酒酵母菌 arGAL4與ADH促進子，以及裂質性(iS ㈣nmti 與adh促進子。哺乳動物促進子包括金屬硫蛋白促進子，其 可由重金屬如鎘誘發反應。病毒促進子如SV4〇較大τ抗原 促進子，或腺病毒促進子亦可使用。所有這些促進子皆為 技術上可立即獲得者。 可使用哺乳動物促進子，如万-肌動促進子。組織_專一 性促進子’尤其是内皮細胞或神經細胞專一性促進子（如 DDAHI與DDAHII促進子）為尤佳。病毒促進子亦可使用’ 如Moloney嚙齒類白血病病毒長端重複單元(MMLV LTR)、 勞氏肉瘤病毒(RSV) LTR促進子、SV40促進子、人類巨細 胞病毒(CMV) ΙΈ促進子、腺病毒、HSV促進子（如HSV IE 促進子），或HPV促進子，尤其是HPV上游調節區塊(URR)。 28 201000634 病毒促進子為技術上立即可獲得的。 本發明之重組表現載體係設計為於原核或真核細胞中 表現蛋白質。例如，ZFX蛋白質可於細菌細胞如大腸桿菌、 昆蟲細胞(使轉狀病毒表現制）、酵母I細胞、真菌細胞 或哺乳動物細胞中表現。適當之宿主細胞更詳細地討論於 Goeddel, Gene Expression Technology： Methods in 卿/哪 185, Academic Press，San Diego, CA (19卯）。此 外，該重組表現載體可於體外轉錄與轉譯，如使用丁7促進 子調節序列與T7聚合酶。 就大部分絲狀真菌與酵母菌而言，該載體或表現建構 物較佳係整合至宿主細胞之基因體中，以獲得適當之轉型 物。然而，就某些酵母菌與真菌而言，適當之附加型載體 亦可加入表現建構物中，當其為穩定且大量表現時，範例 包括衍生自2p、CEN與PKD1質體之載體，其分別衍生自釀 酒酵母菌與克夫爾酵母菌’或含有ΑΜΑ序列（如得自麴菌之 ΑΜΑ1)之載體。就表現建構物整合至宿主細胞基因體中之 範例而言’該建構物係於基因體隨機位置上加入，或於預 定標的位置上加入，使用同源重組法，其中該標的位置較 佳包含一高度表現基因。高度表現基因為一基因，其mRNA 可組成至少〇 01 %(w/w)之總細胞mRNa，如在誘發條件 下’或者’ 一基因，其基因產物可組成至少0.2%(w/w)之總 細胞内蛋白質，或在分泌型基因產物範例中，可達到至少 0.05g/l之分泌量。 因此’用於本發明之表現載體包括染色體型_、附加型 29 201000634 -，以及病毒衍生型載體，》 ^ ^,Λ 何生自細菌質體之載體、噬菌 :、游離基因；酵母菌染色體元素、病毒如桿狀病 =狀病毒、腺病毒、禽痘病毒、假性狂 犬病病毒與反轉錄病毒，以 M及何生自其組合物之載體，如 衍生自質體與噬菌體基因 京者’如黏質體與嗜菌質體 (phagemids) ° 該核苦酸插人物應操作性聯結至—適當之促進子上 除了編碼本發日❹胜肽基因之原始促進子外，亦可使用玉 他促進子以引導本發明多胜肽之表現。該促進子可 擇，以有效引導本發”胜肽之表現，於希望之表現㈣ 中。可用於本發明之促進子範例包括，體_論孔促^ 子、大腸桿菌lac、trp與tac促進子、SV4〇早期與後期促益 子，以及反轉錄LTRs促進子等等。其他適用之促進子為企丨 技術領域者已知。在特定實施例中，促進子較佳為可於^ 菌或酵母菌中，引導脯胺酸_專一性蛋白酶高表現量者。此 促進子為技術上已知。 有多種促進子可用於本發明宿主細胞中引導轉錄作 用。較佳該促進子序列係衍生自高度表現基因。較佳高度 表現基因之範例，其中該促進子較佳衍生自，及/或包含於 整合表現建構物中較佳預定標的位置，包括但不侷限於， 編碼醣解酵素，如磷酸丙醣異構酶(TPI)、甘油醛-磷酸脫氫 酶(GAPDH)、磷酸甘油酯激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK或 PKI)、醇類脫氫酶(ADH)之基因，以及編碼澱粉酶、葡萄醣 殿粉酶、蛋白酶、木聚醣酶、纖維二醣水解酶、β-半乳醣 30 201000634 酶、醇類（曱醇）氧化酶、延長因子與核醣體蛋白質之基因。 高度表現基因之特定範例包括如克夫爾酵母菌之LAC4基 因、分別來自漢氏酵母菌與嗜曱基酵母菌 (尸/c/iO之曱醇氧化酶基因（AOX與MOX)、來自黑麴菌（儿 r)與泡盛麴菌（儿flwamor!·)之葡萄醣澱粉酶（g/αΑ)基 因、米麴菌（A. or;yzae)TAKA-殿粉酶基因、小巢狀麴菌(儿 mWM/imdgpi/A基因，以及里氏木黴菌（7：ree如·)纖維二醣水 解酶基因。 強組成性及/或可誘發促進子為用於真菌表現宿主之 較佳範例’為得自真菌基因木糖醇酶A)、植酸酶、ATP-合成酶、次單元9(o^C)、磷酸丙醣異構酶(卬丨）、醇類脫氫酶 (Αί/ΑΑ)、α-澱粉酶(flm：y)、澱粉葡萄醣苷酶(AG_得自咖八基 因）乙胺酶(⑽^S)，以及葡萄醣醛-3-磷酸脫氫酶(即^ 促進子。 強酵母菌促進子之範例為得自醇類脫氣酶、乳膽酶、 3-磷酸甘油酯激酶與磷酸丙醣異構酶之基因。 強細菌促進子範例為α—澱粉酶與5p〇2促進子，以及得 自細胞外蛋白酶基因之促進子。 適用於植物細胞之促進子包括月因脂驗—Mine)合成酶 (―、章魚驗(，ine)合成酶㈣、甘露驗(mann〇p㈣ 合成扭(叫、核_小次單元㈣⑽岭組織蛋白、米 :動蛋白、菜豆素(PhaSe°lin)、花椰菜馬賽克病毒(CMV)35S 與19S，以及環狀病毒促進子。 所有上述之促進子皆為技術上可獲得。 31 201000634 該載體更可包括一序列，側接有可產生RNA之聚核苦 酸，其包含類似於真核基因體序列或病毒性基因體序列之 序列。此可藉由引入本發明之聚核苷酸至宿主細胞之基因 體中而達成。尤其是，包含表現卡匣之質體載體，其側接 真菌序列，可用於製備適用於傳送本發明聚核苷酸之載體 至真菌細胞中。使用這些真菌載體之轉型技術為此領域已知。 該載體可包含本發明聚核苷酸，定位於反義方向上， 用於製造反義RNA。此可用於降低多胜肽之表現量，若希 望的話。 載體DNA可引入原核或真核細胞中，經由一般轉型或 轉染技術。使用於此，術語“轉型”與“轉染，，係指各種此領 域中已知之技術，用於引入外來核酸（如DNA)至宿主細胞 中’包括磷酸鈣或氣化鈣共沈澱、DEAE-葡聚醣-媒介轉 染、轉導、感染、脂質體轉染法、陽離子脂質媒介轉染或 電破法。用於轉型或轉染宿主細胞之適當方法可見於 Sambrook, et <i\.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd,ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor

Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis et al.，MoZecM/ar (1986)，以及其他實 驗手冊。 就哺乳動物細胞之穩定轉染而言，已知基於所使用之 表現載體與轉染技術，僅有小部分之細胞可將外來DNA整 合至其基因體中。為了辨識與篩選這些整合物，編碼一可 篩選標記物（如抗生素抵抗物）之基因，一般會與有興趣基因 32 201000634 一同引入宿主細胞中。較佳之可篩選標記物包括，但不侷 限於’會對藥物產生抵抗性，或互補宿主細胞缺陷者。其 包括多功能標記基因，可用於轉型大部分之絲狀真菌與酵 母菌’如乙醯胺酶基因或cDNAsOmi/S、、/acA基因或 來自小巢狀麴菌(A. 、米麴菌(7L 或黑麴菌 (7L 之cDNAs) ’或可提供抗生素抵抗性如抗G418、潮 徽素、博來徽素(bleomycin)、卡那黴素(kanamycin)、氨甲 0票吟、腐草徽素(phleomycin orbenomyl)抵抗性(benA)。此 外，可使用特定篩選標記物如營養缺陷標記物，其需要對 應之突變宿主株：如URA3 (得自釀酒酵母菌（兄 或传自其他酵母菌之類似基因hAyrG或/>3；rA(得自小巢狀麴 菌(A mWMkn幻或黑麴菌（A. m’ger))、argfi (得自小巢狀麴菌 (A. mWimJ或黑麴菌（A· 或irpC。在一較佳實施例 中，該篩選標記物係自轉型宿主細胞中移除，在引入表現 建構物後，以獲得可製造多胜肽，不含篩選標記物基因之 宿主細胞。 其他標記物包括ATP合成酶、次單元9(c^c)、乳清酸核 苦-5’-磷酸脫羧基酶(pvrA)、細菌G418抵抗基因（此亦使用於 酵母菌中，但非真菌中）、胺苄黴素(ampicillin)抵抗基因（大 腸桿菌）、新黴素(neomycin)抵抗基因（芽胞桿菌），以及大腸 桿菌w/ίΜ基因，編碼泠-葡萄醣醛酸酶(GUS)。載體可用於 體外’如用於製造RNA，或用於轉染或轉型宿主細胞。 於原核生物中表現蛋白質通常係於大腸桿菌中進行， 其具有含組成性或誘發性促進子之載體，可引導融合戈非 33 201000634 融合蛋白質之表現。融八 之蛋白質上，如在係將數個胺基酸加至其編碼 貝之胺基端。此融合載 可提供三個目的:1)增力 載體-般 1 # 、、且蛋白質之表現；2)增加曹έ日疋 白I之溶解度；以及3)幫 重、、且蛋 親和性純化之配位體。 乍為 <节’在融合表現載體中，— 質分解性切割位置係引 蛋白 融&片段與重組蛋白質之拉八 處，以在純化該融合蛋白暂 、 ° 合片段。 、後，分離該重組蛋白質與融 如上所述，表現載體較佳包含一可筛選標記物。 記物包括二氫葉酸還原酶或軸素(_零in)抵抗基因，^ 於真核細胞培養，以及四環黴錄_ynne)或胺节 (amP1ClUln)抵抗性，祕培養大腸桿®與其他細菌。適告 宿主之代表性範例如大腸椁菌、鏈黴g、鼠傷寒沙門氏二 ⑽⑹⑽心以及某些桿菌種；冑菌細胞如麵菌 種’如黑麴菌(Λ則·㈣、米趨菌^，叫與 小巢狀麴菌(Α. ⑽小如酵母菌如克夫爾酵母菌，如乳 酸克夫爾酵母菌，及/或嗜甲基酵母菌，如曱醇酵母菌(尸· 糾伽也）；昆蟲細胞如果蠅0)⑽叩Μ⑷S2與夜蛾 Sf9 ;動物細胞如CH〇、c〇s與人黑色素細胞 瘤⑽oma);以及植物細胞。上述宿主細胞之適當 培養基與條件為技術上已知。 較佳用於細菌之載體為如揭示於w〇_a1_2〇〇4/〇74468 者，其在此併入本案以作為參考資料。其他適當之載體為 此技術領域者立即可知。 34 201000634 已知適用於本發明之細菌促進子包括揭示於 WO-A1-2004/074468之促進子，在此併入本案以作為參考 資料。

編碼本發明多胜肽之DNA轉錄作用，係由較高等真核 生物進行’可藉由插入一增強子序列至載體上而增進，增 強子為DNA順式作用（cis_acting)元素，通常為約1〇至3〇〇 bP ’其可於特定宿主細胞中增進促進子之轉錄活性。增強 子之範例包括SV40增強子，其位於複製源下游位置bpl〇〇 至270處，巨細胞病毒早期促進子增強子、多瘤病毒增強 子，位於複製源之晚期側，以及腺病毒增強子。 就經轉譯蛋白質分泌至内質網空腔、至周質空間或至 細胞外環境中而言，適當之分泌訊號可加人該表現之多胜 肽中。該訊號可為多胜肽内生性或可為異源性訊號。 該ZFX多胜肽可表現於修飾形式中，如一融合蛋白 質，且可包括分泌訊號與額外異源性功能區塊。因:匕，舉 例而言，-額外胺基賴塊，尤其是Μ胺級，可加二 多胜肽之Ν-端，以增進於宿主細胞巾之穩定性與抵抗性， 在純化或後續操作與儲存時。此外，Μ 狀片段可加至該多 胜肽上，以幫助純化。 /狂肽，具有如SEQ id NO : 3之胺基酸序列’以及於適當宿主

王細胞中表現SEQ ID NO: 1或2聚核苷酸而獲得之胺基酸庠列 又7夕丨J。此外，一包含上 述多胜肽功能等效物之胜肽或多胜肽， + 中。上述多胜肽皆包含於術語“本發明多胜肽，，中。月乾可 35 201000634 術語“胜肽，’與“寡胜肽”為同義詞（如同一般認知），且每 一術語可互相交換使用，當内文需要時，用以表示至少二 胺基酸耦合至一胜肽聯結鏈上。術語“多胜肽”使用於此係 指含有大於七個胺基酸殘基之鏈。所有募胜肽與多胜肽化 學式或序列，於此係由左寫至右，方向為胺基端至羧基端。 於此使用之胺基酸單一字母一般為技術上已知，並可見於 Sambrook, et al. {Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd,ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)。 “經單離”多胜肽或蛋白質係指一多胜肽或蛋白質，自 其原始環境中移出。舉例而言，於宿主細胞中表現重組製 造之多胜肽與蛋白質，係經單離出，用於本發明目的，為 原始或重組多胜肽，其實質上經適當技術純化，如單一步 驟純化法，揭示於Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988)。 本發明之ZFX脯胺酸-專一性蛋白酶可經回收，並自重 組細胞培養液中純化，使用技術上已知之方法。最佳為， 高效能液相層析(“HPLC”)係用於純化。 本發明多胜肽包括天然純化產物、化學合成產物，以 =由原核或真㈣域生之重組產物，包括如細菌、酵母 =較高等植物、昆蟲與哺乳動物細胞。取決於重組製造 流程所使狀宿主，本發明多胜肽可_化，或未經聽化。 ^外’本發明多胜肽亦可包括—起始修飾W胺基酸殘 土，在某些範例中為宿主媒介過程之結果。 本發明之-特徵為本發明多胜肽之生物活性片段。 36 201000634 本發明多胜肽之生物活性片段包括一多胜肽’其包含 一胺基酸序列，有效等同於或衍生自ZFX蛋白質之胺基酸 序列（如SEQ ID NO : 3之胺基酸序列），其包括較全長蛋白 質少之胺基酸，其具有對應全長蛋白質之至少一生物活 性。一般而言，生物活性片段包含一區塊或模體，具有至 少一ZFX蛋白質活性。本發明蛋白質之生物活性片段可為 一多胜肽，其為10、25、50、100個或更多之胺基酸長。此 外’其他生物活性部分，其中該蛋白質區塊被刪除，可由 重組技術製備，並評估本發明多胜肽原始形式之一或多種 生物活性。 本發明之另一特徵為一核酸片段，其編碼上述ZFX蛋 白質之生物活性片段。 本發明蛋白質或其功能性等效物，如生物活性部分， 可操作性聯結至一非-ZFX多胜肽（如異源性胺基酸序列）， 以形成融合蛋白質。“非_ZFX多胜肽，’係指一多胜肽，具有 一胺基酸序列’對應於實質上非同源於ZFX蛋白質之蛋白 質。此“非-ZFX多胜肽，，可衍生自相同或不同生物體。在ZFX 融合蛋白質中，該ZFX多胜肽係對應於ZFX蛋白質所有或生 物活性片段。在一較佳實施例中，ZFX融合蛋白質包含ZFX 蛋白質之至少二生物活性部分。在融合蛋白質中，術語“操 作性聯結係指該ZFX多胜肽與非_ζρχ多胜肽係於讀框内 (m-frame)互相融合。該非_ζρχ#胜肽可融合至ZFX多胜肽 之N-端或C-端。

舉例而言，在一實施例中，該融合蛋白質為GST-ZFX 37 201000634 融合蛋白質，其中該ZFX序列係融合至GST序列之C端。此 融合蛋白質可幫助重組ZFX之純化。在另一實施例中，該 融合蛋白質為ZFX蛋白質’含有異源性訊號序列於其N_ 端。在某些宿主細胞中（如哺乳動物與酵母菌宿主細胞）， ZFX之表現及/或分泌，可經由使用異源性訊號序列而增加。 在另一實施例中，該桿狀病毒封膜蛋白質之gp67分泌 序列’可使用作為一異源性訊號序列（Cwrre/ίί /Voioco/s /η Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992)。真核異源性訊號序列之其他範例包括蜂毒溶血肽以 及人類血小板驗性去碌酸酶之分泌序列（Stratagene; La Jolla，California)。在另一範例中，可使用之原核異源性訊 號序列包括分泌訊號(Sambrook ei α/·, χΐφΑΥζ)，以及蛋 白質 Α 分泌訊號（Pharmacia Biotech; Piscataway, New

Jersey) ° 訊號序列可用於幫助本發明蛋白質或多胜肽之分泌與 單離。訊號序列一般特徵為具有一疏水性胺基酸核心，其 一般切割自成熟蛋白質，當分泌時，可切割一或多次。此 訊號胜肽包含一加工位置，其可使訊號序列自成熟蛋白質 切割，當它們通過分泌路徑。該訊號序列會引導蛋白質之 分泌，如自表現載體所轉型之真核宿主中分泌出，且該訊 號序列依序或同時切割。之後該蛋白質可立即自細胞外介 質中純化出’使用已知方法。此外，該訊號序列可聯結至 有興趣之蛋白質上，使用一可幫助純化之序列，如GST區 塊。因此，例如’編碼多胜肽之序列可融合至一標記物序 38 201000634 列上，如編碼一胜肽之序列，其幫助該融合多胜肽之純化。 在本發明某些較佳實施例中，該標記物序列為六-組胺酸胜 肽’如pQE載體提供之標記物（Qiagen, Inc )，其中許多皆為 商業上可購得。如描述於d a/，術以.Ααίΐ %·. iASA敝821-824(1989) ’舉例而言，係提供六-組胺酸標記， 以便於純化該融合蛋白質。該HA標記物為另一可用於純化 之胜肽’其對應於一抗原表位，衍生自流感病毒血球凝集 素蛋白質’其已描述於Wilson ei fl/.，Ce//37:767(1984)，舉 例而言。 分泌酵素’如同SEQ ID NO : 3之胺基酸序列，通常會 包含一先驅(pre)-或訊號-序列，及/或前(pro)_序列。這些序 列通常會在分泌過程中或之後自蛋白質上移除。因此，該 成熟之分泌蛋白質通常不會再包含這些先驅_與前_序列。 SEQ ID NO : 3之加工版本，缺乏可能之先驅_或前_序列， 為本發明之一部份。SEQ ID NO : 3A胺基酸序列之可能加 工位置係位於羧基端之胺基酸2〇。在此範例中，本發明之 成熟酵素起始於胺基酸數目21。SEQ ID NO : 3胺基酸序列 之所有其他修飾，由於進一步加工而成，皆可允許，只要 其不會影響酵素活性即可。 較佳為’本發明之ZFX融合蛋白質係由標準重組〇να 技術而得。例如，編碼不同多胜肽序列之DNA片段係於讀 框内（m-frame)接合，依據一般技術，如使用平_端或階梯_ 端末端接合，限制酶切割係提供適當之末端、適當填滿結 合末端、經鹼性去磷酸酶處理以預防不希望之結合，以及 39 201000634 進行酵素性接合。在另一實施例中，該融合基因可以一般 技術合成，包括自動化DNA合成儀。此外，基因片段之PCR 倍增可使用錫引子（anchor primer)進行，其在二連續基因片 段間提供互補突出’之後可經接合與重複倍增，以產生嵌 合性基因序列（請見如 Cwrreni Proioco/s A/o/ecw/aA* fi/o/ogy，eds. Ausubel ei a/· John Wiley & Sons: 1992)。此 外，許多表現載體為商業上可購得，其已編碼一融合片段 (如GST夕胜狀）。ZFX-編碼核酸可融合至此表現載體上， 使付。玄融a片^又可於讀框内（in_frarne)聯結至該ζρχ蛋白 質上。 術語變異物”、“功能性變異物”以及“功能性等效物” 可於此互相乂換使用。ZFX聚核苷酸之變異物/功能性等效 4=經早離之核段’其編碼—具有此述青㈣肩捕 fee'專-性蛋自酶特殊功能之多胜肽。本發明咖多胜狀 之生等效物為—多胜狀，其具有至少__青黴菌辅胺酸_ 專-㈣㈣之功能。因此該功能性等效物亦包含生物活 性片段。 歹，3 2明之多胜肽包含—如SEQ ID NO : 3之胺基酸序 ]或實質上同源之序列，或具有脯胺酸專-性蛋白酶活 歹J片奴。一般而言，較佳為該SEQ ID NO : 3之天然 發生私基酸序列。 胜肽明之多胜肽亦包含—天然發生之seqidn〇:3多 欠異物或物種同源物。 文異物係為-多胜肽，其天然發生於如真菌、細菌、 40 201000634 酵母菌或植物細胞中，該變異物具有脯胺酸-專一性蛋白酶 活性，以及一實質上類似於SEQ ID NO: 3序列之蛋白質。 術語“變異物”係指一多胜肽，其具有類似之必要特徵或基 本生物功能，如同SEQ ID NO: 3之脯胺酸-專一性蛋白酶， 包括對偶基因變異物。較佳為，變異多胜肽具有至少相等 之脯胺酸-專一性蛋白酶活性，如同SEQ ID NO : 3多胜肽。 變異物包括對偶基因變異物，不論是得自SEQ ID NO : 3多 胜肽之相同細胞株，或是得自相同屬或種之不同菌株。 類似地，本發明蛋白質之同種類似物為具類似序列之 等效蛋白質，其為一脯胺酸-專一性蛋白酶，並在另一物種 中為天然發生。 變異物與物種類似物可以此述之流程單離出，並於適 當之細胞來源中進行此流程，如細菌、酵母菌、真菌或植 物細胞。亦可使用本發明之探針探測得自酵母菌、細菌、 真菌或植物細胞之DNA庫，以獲得表現變異物或SEQ ID NO : 3多胜肽物種類似物之殖株。可用於單離出已知基因 之變異物與物種類似物之方法，已廣泛描述於文獻中，且 為此技術領域者已知。這些基因可以一般技術操作，以產 生本發明多胜肽，其之後可以重組或合成技術製造。 功能性蛋白質或多胜肽等效物可僅包含一保守性取代 基於SEQ ID NO : 3之一或多個胺基酸上，或非必須胺基酸 之取代、插入或刪除。因此，非必須胺基酸為一殘基，其 於SEQ ID NO : 3中可改變而實質上不會影響生物活性。 亦即，SEQ ID NO : 3多胜肽序列與其變異物，以及物 41 201000634 種類似物’亦可經修飾，以提供本發明多胜肽。胺基酸取 代基可產生自丨、2或3JL1Q、戰_取代基。相同數目之 二入番入亦可產生。這些改變一般係於對於多胜肽功能 相田重要之區塊外產生，因而該經修飾之多胜肽便可維持 其脯胺酸-專—性蛋白酶活性。 ^ 4σ。保寸性取代”係指一取代物，其中該胺基酸殘基 係以具有類似側鏈之胺基酸殘基取代。這些家族為技術 y ρ ^ 矣口 、 並包括具有驗性側鏈之胺基酸(如離胺酸、精胺酸 "、且胺心）、酸性側鏈(如天門冬胺酸、麵胺酸）、不帶電極 11側鏈(如甘胺酸 '天門冬醯胺、麩醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、 酪胺馱、半胱胺酸）、非極性惻鏈（如丙胺酸、纈胺酸、亮胺 酉欠、異免胺酸、脯胺酸 '苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸）、 冷-分支側鏈(如蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸），以及芳香側 鍵(如赂胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）。 本發明多胜肽包括上述全長多胜肽之片段與其變異 物’包括SEQ ID NO : 3之序列片段。此片段一般會維持脯 胺酸-專一性蛋白酶活性。片段至少為50、1〇〇或200個胺基 酸長’或SEQ ID NO : 3序列中此數目之胺基酸。 本發明多胜肽可，若需要的話，以合成方法製造，雖 然其通常係由上述重組方法製造。合成與重組多胜肽可經 修飾’例如，藉由加入組胺酸殘基或T7標記物，以幫助辨 識或純化，或藉由加入訊號序列’以促進其自細胞分泌出。 因此，變異序列可包含衍生自青黴菌之序列，除了可 單離出SEQ ID NO:3多胜肽之殖株外。變異物可由其他青黴 42 201000634 菌株辨識出，藉由尋找脯胺酸_專_性蛋白酶活性，並如此 所述進行選殖與定序。變異物可包括刪除、修飾或加入單 一胺基酸或胺基酸群於蛋白質序列中，只要該胜肽可維持 SEQIDNO : 3脯胺酸_專_性蛋白酶之基本生物功能。 胺基酸取代基係由如卜2或3至1〇、20或30個取代基組 成。該經修飾多胜肽一般會維持脯胺酸_專一性蛋白酶之活 性。保守性胺基酸取代物可由技術上已知之方法製備。 較短或較長之多胜肽序列係落於本發明範疇中。例 如，具有至少50個胺基酸，或至多1〇〇、15〇、2〇〇、3〇〇、 400、500、600、700或800個胺基酸長度之胜肽，皆被認為 落於本發明範疇中，只要其呈現SEQH)N〇:3脯胺酸專一 性蛋白酶之基本生物功能。尤其是，但不侷限於，本發明 之此觀點包含當該蛋白質為完整蛋白質序列之一片段時。 就本發明而言，較佳該有興趣之蛋白質係活性分泌至 培養基中。分泌型蛋白質一般原始合成時為前_蛋白質，且 該前-序列（訊號序列）之後會在分泌過程中移除。該分泌過 程基本上在原核與真核生物中皆類似：活性分泌之前-蛋白 質穿過細胞膜，該訊號序列係由專一性訊號胜肽酶移除， 而成熟之蛋白質係（重新）-折疊。該訊號序列之一般結構可 被辨識出。用於分泌之訊號序列係位於前蛋白質之胺其 端，一般為15-35個胺基酸長。該胺基端較佳包含帶正電之 胺基酸’較{圭為非酸性胺基酸。—般認為此正電區塊會與 細胞膜上磷脂質之負電基團交互作用。此區塊之後接^二 疏水性、橫田胞膜之核心區塊。此區塊—般為1〇_2〇個胺 43 201000634 基酸長，並主要由疏水性胺純組成。帶電荷之胺其酸一 般不存在於此區塊中。該橫越薄膜區塊之後接著有二號胜 肽酶辨識位置。該辨識位置係由小胺基醆_χ—小胺基酸組 成。小胺基酸可為丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸或半耽胺酸。X 可為任一胺基酸。 功能性核酸等效物一般包含靜默突變物，或不會改變 其編碼之多胜肽生物功能突變物。因此，本發明係提供一 種核酸分子，其編碼ZFX蛋白質，含有改變之胺基酸殘基， 其並非特定生物活性所必須。此ZFX蛋白質不同於SEQ ID NO : 3之胺基酸序列，但仍維持至少一生物活性。在一實 施例中，該單離出之核酸分子包含一編碼該蛋白質之核苷 酸序列，其中該蛋白質包含一實質上類似之胺基酸序列， 具有至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%或更高之SEQ ID NO : 3胺基酸序列 類似度。 例如’如何製備顯型靜默之胺基酸取代基之方法係提 供於Bowie，J.U. ei a/·, Science 247:1306-1310 (1990)，以及 於此引述之參考文獻。如同作者所陳述，這些研究皆透露 出蛋白質對於胺基酸取代基具有令人驚訝的容忍度。該作 者更指出該變化似乎可出現於蛋白質的某些位置。 編碼類似於SEQ ID NO : 3蛋白質之ZFX蛋白質之經單 離核酸分子’可由引入一或多個核皆酸取代基、插入或刪 除於SEQ ID NO : 1或2核苷酸序列上而製備，以使一或多 個胺基酸取代基、刪除或插入可引入其編碼之蛋白質中。 44 201000634 此種突變可由標準技術引入’如定點突變，以及PCR-媒介 突變。 術語“功能等效物”亦包含青黴菌脯胺酸_專一性蛋白酶 蛋白質之同源基因。青黴菌ZFX蛋白質之同源基因為該蛋 白質可分離自其他菌株或物種’並具有類似或相等之生物 活性。此同源基因可立即辨識出，由於其包含一胺基酸序 列，其實質上類似於SEQIDNO : 3。 定義於此，術語“實質上類似”係指一第一胺基酸或核 苷酸序列，其含有一足夠或最小數目之相等或等效(如具有 類似側鏈)胺基酸或核苷酸’等同於第二胺基酸或核普酸序 列，使得該第一與第二胺基酸或核苷酸序列具有類似區 塊。例如，胺基酸或核苷酸序列，其含有一共同區塊約 60%、較佳65%、更佳70%、尤佳75%、80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%或99%等同度或更高，於此定義為 足夠等同。 此外，編碼其他ZFX家族成員之核酸，因而具有不同 於SEQIDNO : 1或2之核苷酸序列，亦落於本發明範_中。 此外’編碼來自不同物種之ZFX蛋白質之核酸，可具有不 同於SEQIDNO : 1或2之核苷酸序列，亦落於本發明範鳴中。 對應於本發明Z FX聚核苷酸變異物（如天然對偶基因變 異物）與類似物之核酸分子，可基於其對於ZFX核酸之類似 度分離出’使用於此揭示之cDNAs或其適當之片段，作為 雜合探針，依據標準雜合技術，較佳於高度嚴苛雜合條 件下。 45 201000634 除了 ZFX序列天然發生之對偶基因變異物外’熟習此 技術領域者應認知到該變化可藉由引入突變於SEQ ID NO : 1或SEQ ID NO : 2核苦酸序列而達成，因而導致ZFX 蛋白質胺基酸序列之變化’但實質上不會改變ZFX蛋白質 之功能。 在本發明之另一觀點中’係提供增進之ZFX蛋白質。 增進之ZFX蛋白質為其中至少一生物功能增進之蛋白質。 此蛋白質可隨機引入突變於所有或部分ZFX編碼序列中’ 如藉由飽和突變，所得之突變物可重組表現，並篩選其生 物活性。例如，技術上已提供標準試驗，用於測量脯胺酸-專一性蛋白酶之酵素活性，因而可輕易篩選出增進活性之 蛋白質。 在一較佳實施例中，該ZFX蛋白質具有如SEQ ID NO : 3 之胺基酸序列。在另一實施例中’該ZFX多胜肽係實質上 類似於SEQ ID NO : 3胺基酸序列，一般而言，可維持SEQ ID NO : 3多胜肽之至少一生物活性，但胺基酸序列不同，由 於產生上述天然變異物或突變。 在另一較佳實施例中’該ZFX蛋白質具有一胺基酸序 列’由單離之核酸分子片段編碼，可雜合至SEQ ID NO : 1 或2之核酸，較佳於高度嚴苛雜合條件下。 因此’該ZFX蛋白質較佳為一蛋白質，其包含一胺基 酸序列，具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高類似度（及共享 序列等同度）’等同於SEQ ID NO: 3胺基酸序列。一般而言， 46 201000634 此蛋白質會維持SEQ ID NO : 3多胜肽至少一功能活性，如 與脯胺酸-專一性蛋白酶活性相關者。 本电明蛋白貝之功此相關物亦可藉由如筛選本發明蛋 白質突變物組合庫，如戴斷突變，之脯胺酸_專—性蛋白酶 活性而辨識出。在一實施例中，變異物之多變庫係由核酸 層級之組合突變產生。突變物之多變庫可由，如，將合成 募核苷酸混合物經酵素接合至基因序列上，而產生一組可 表現之潛力蛋白質序列，其為個別之多胜肽，或一組較大 融合蛋白質（如用於噬菌體呈現實驗）。有多種方法可用於製 備本發明多胜肽之潛力變異物庫，來自退化寡核苷酸序 列。用於合成退化寡核苷酸之方法為技術上已知（請見如 Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike ei a/· (1983) Nucleic Acid Res. 11:477)。 此外’本發明多胜肽編碼序列之片段庫亦可用於產生 多胜肽之多變族群，用於篩選後續之變異物。例如，一編 碼序列片段庫可藉由使用核酸酶處理有興趣編碼序列之雙 股PCR片段而獲得，在每分子僅發生一次缺口之條件下， 使該雙股DNA失活，再使該DNA活化，以形成雙股DNA， 其包含來自不同缺口產物之同義/反義配對，使用S1核酸酶 自重新形成之雙合體中移除單股部分，並接合所得片段庫 至表現載體上。藉由此方法，一表現庫可衍生自編碼有興 趣蛋白質各種大小之片段之N-端與内部片段庫。 此領域中已有數種技術可篩選截斷物點突變產生之組 47 201000634 合庫中之基因產物’以及用於篩選基因產物之CDNA庫，其 具有經篩選之特性。最廣泛用於篩選大基因庫之技術，為 高效能分析法，一般包括將基因庫選殖至可複製表現載體 上，以所得載體庫轉型適當細胞，並表現該組合基因，在 偵測到希望活性之條件下，可幫助單離出編碼該偵測到產 物之基因載體。遞歸整體突變（Recursive ensemble mutagenesis ’ REM) ’ 一種可增強基因庫中功能性突變頻率 之技術’可用於與辨識本發明蛋白質變異物之篩選試驗結 合（Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331)。 此技術領域者應瞭解到，使用一般技術，可製備出核 普酸取代物’其不會影響本發明聚_核苷酸編碼之多胜肽序 列’反映出表現本發明多胜肽之特定宿主生物體之密碼子 使用情況。 SEQ ID NO : 1及/或ID no : 2之編碼序列可經核 苷酸取代修飾’如1、2或3至1〇、25、5〇、1〇〇個或更多取 代基。SEQ ID NO : 1及/*SEq ID no : 2之聚核苷酸可擇 一或額外地經一或多個插入及/或刪除修飾，及/或於二者或 擇之末鳊進行延長而修飾。該經修飾之聚核苷酸一般係 編碼多胜肽，其具有脯胺酸_專一性蛋白酶活性。可進行 退化取代，及/或產生保守性胺基酸取代之取代物’當該經 修飾序列進行轉譯時，如後續討論到多胜肽時。 由本發明提供之序列亦可使用作為起始材料，用於建 48 201000634 構“二代，，酵素。“二代”脯胺酸-專一性蛋白酶為經由突變技 術(如弋點突變或基因交換技術）改變之脯胺酸-專一性蛋白 • 酶，其具有不同於野生型脯胺酸-專一性蛋白酶，或由本發 - 明製備之重組脯胺酸-專一性蛋白酶之特性。例如，其最佳 溫度或PH值，特異性活性、受質親和性或熱穩定性可經改 麦’使其更適用於特定製程中。 本發明脯胺酸-專一性蛋白酶活性所必須之胺基酸，且 〔 因此較佳進行取代反應，可依據技術上已知流程辨識出， 如定點突變或丙胺酸-掃瞒突變。在後者技術中，突變應於 - ②分子之每—殘基上進行，所得之突變物遂測試其生物活 性(如脯胺酸-專-性蛋白酶活性），以辨識出對於該分子活 性相當重要之胺基酸殘基。酵素·受f作用位置亦可由晶體 結構分析決定，如使用核磁共振、結晶學或光子親和性標記。 ^基因父換技術係提供一種隨機之方式，引入突變於聚 «酸相巾。表職，具有最佳特性之單離物健新分 1 A "併’並再次父換’以增加基因分歧度。藉由重複 此流程數次，編碼大幅增進之蛋白質之，可經單離出。 車父佳該基因交換流程起始於一基因家族，其編碼具有類似 1 力叙蛋㈣。本發㈣供之聚核賊相《應適用於 土因父換，以增進分泌之脯胺酸_專—性蛋白酶之特性。 作、b之外典型犬變技術與篩選，如以NTG處理之突 變初v照射錢於增進蛋白質之躲。突變可直 單離之DNA上進行，或以有興趣DNA轉型 細胞。此外， 大艾亦可以數種技術上已知之方法引入單離之DNA。這些 49 201000634 方法範例為錯誤傾向（error-prone)PCR、質體DNA於修復缺 乏宿主細胞中之倍增等。 除了 SEQ ID NO : 1或2顯示之ZFX基因序列外，此技術 領域者應明顯可知，該DNA序列之多型態可存在於特定族 群中，其可導致ZFX蛋白質之胺基酸序列改變。此基因多 型態可存在於不同族群或同一族群之細胞中，由於天然對 偶基因變異造成，對偶基因變異亦包括功能等效物。 本發明聚核苷酸之片段亦可包含未編碼功能性多胜肽 之聚核苷酸。此聚核苷酸可作用為探針或PCR反應之引子。 本發明核酸，不論其是否編碼具功能或無功能多胜 肽’皆可使用作為雜合探針，或聚合酶連鎖反應（PCR)之引 子。本發明核酸分子，其未編碼一具有ZFX活性之多胜肽， 可用於包括：（1)單離出編碼ZFX蛋白質之基因，或其對偶 變異物’來自cDNA庫，如來自青黴菌之外之生物體；⑵ 原位雜合(如FISH)至細胞分裂中期染色體延伸，以提供ZFX 基因準確之染色體定位，如同Verma以a/·, Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press，New York (1988)所描述；（3)Northern墨潰分析，用於 偵測ZFX mRNA於特定組織及/或細胞中之表現，及4)可使 用作為診斷工具之探針或引子，以分析在特定生物樣本中 (如組織）’雜合至ZFX探針之核酸之存在。 本發明亦包含一獲得ZFX基因功能等效物之方法。此 方法係得自一標記探針，其包括一經單離之核酸，其編碼 SEQ ID NO: 3蛋白質序列之全部或部分，或其變異物；以 50 201000634 經標記探針篩選㈣Μ段庫，在可練針雜合至核酸片段 庫之條件下，因而形成核酸雙合體，並製備一全長基因序 列，得自任一標記二合體之核酸片段，以獲得與zfx基因 相關之基因。 在—實施例中，本發明之ZFX核酸為至少60%、65%、

70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%，或更高類似度，類似於SEQ ID NO : 1或SEQ ID NO : 2之核酸序列，或二者之一之互 補物。 在另一實施例中，本發明之特徵為一細胞，如經轉型 之宿主細胞或重組宿主細胞’其包含本發明之核酸。“經轉 型細胞”或“重組細胞”為一細胞’其中（或其前代細胞中）已 使用重組DNA技術引入本發明之核酸。原核與真核細胞皆 包括，如細菌、真菌、酵母菌與類似物’尤佳為來自絲狀 真菌之細胞，尤其是黑麴菌。 因此，本發明係提供一種宿主細胞，包含本發明之多 胜肽、聚核苷酸或載體。該聚核苷酸可為與宿主細胞基因 體異源性。術語“異源性”，通常係針對宿主細胞，係指該 聚核苷酸不會天然發生於宿主細胞之基因體中，或該多胜 肽炎不會自然地被該細胞製邊。 宿主細胞可挑選會調節插入序列之表現者，或修飾與 加工該基因產物，以專一性、希望之方式。此蛋白質產物 之修飾（如醣化)與加工（如切割）可幫助蛋白質功能最佳化。 有多種宿主細胞具有蛋白質與基因產物之特徵性與專 51 201000634 一性轉譯後加工與修飾機制。適當之細胞株或宿主系統為 分子生物及/或微生物技術領域者所熟悉的，可選用以確保 所表現之外來蛋白質之希望與正確之修飾與加工。最後， 可使用具有適當加工一級轉錄物、醣化與磷酸化基因產物 之細胞機器之真核宿主細胞。此宿主細胞為技術上已知。 若希望的話，上述細胞可用於製備本發明之多胜肽。 此方法一般包含培養一宿主細胞（如以上述表現載體轉型 或轉染），在可提供該多胜肽之編碼序列表現之條件下（藉由 載體），並選擇性地回收該表現之多胜肽。 本發明之聚核苷酸可加入重組複製載體中，如一表現 載體。該載體可用於在相容之宿主細胞中複製核酸。 因此，在另一實施例中，本發明係提供一種製造本發 明聚核苷酸之方法，藉由引入本發明之聚核苷酸至可複製 載體中，引入該載體至可相容宿主細胞中，並於可進行載 體複製之條件下，培養該宿主細胞。該載體可自宿主細胞 中回收。 適當之宿主細胞包括細菌如大腸桿菌、酵母菌、哺乳 動物細胞株，以及其他真核細胞株，如見蟲細胞如Sf9細胞 與（如絲狀）真菌細胞。 較佳為，該多胜肽係以分泌型蛋白質產生，其中表現 建構物中編碼多胜肽成熟形式之核苷酸序列，係操作性聯 結至一編碼訊號序列之核苷酸序列上。較佳該訊號序列為 編碼該多胜肽之原始（類似）核苷酸序列。此外，該訊號序列 為外來的（異源性），相對於編碼該多胜肽之核苷酸序列，其 52 201000634 中該訊號序列較佳為宿主細胞内生性，其中本發明之核苷 酸序列係經表現。酵母菌細胞之適當訊號序列範例為^生 自酵母菌宿主細胞a·因子基因之訊號序列^類似的，絲狀 真菌宿主細胞之適當訊號序列為，如衍生自絲狀真菌殿粉 葡萄醣酶(AG)基因之訊號序列，如黑麴菌咖八基因。此可 使用於與殿粉葡萄醣酶（亦稱之為（葡萄酶）殿粉酶）促進子 組合，以及與其他促進子組合。雜合訊號序㈣可使用於 本發明中。 較佳之異源性分泌引導序列為源自真菌殿粉葡萄醋酶 (AG)基因者(g/aA_ 18與24個胺基酸二版本，如得自麴菌）、& 因子基因（酵母菌如釀酒酵母菌與克夫爾酵母菌），或1澱粉 酶基因（桿菌）。 該載體可於上述適當宿主細胞中轉型或轉染，以表現 本發明多胜肽。此過程可包含培養經上述載體如表現載體 轉型之伯主細胞，在可使編碼該多胜狀之編瑪序列載體表 現之條件下，以及選擇性地，回收該經表現之多胜肽。 本發明包含一多胜肽，可由此方法獲得。 在一較佳實施例中，本發明之多胜肽係由真菌製造， 更佳由麴菌，最佳由黑麴菌製造。 因此，本發明係提供一種宿主細胞，經本發明之聚核 皆S欠或載體轉型或轉染，或包含其於内。較佳該聚核普酸 係於一載體中搭載，用於複製與表現該聚核苷酸。該細胞 係經選擇，以與該載體相容，並可為原核（如細菌）、真菌、 酵母菌或植物細胞。 53 201000634 適當之宿主細胞較佳為原核微生物體，如細菌，或更 仏為真核生物體如真菌，如酵母菌或絲狀真_，或植物細 胞。-般而言’酵母_較佳之錢細胞，由於其較容易 操作，、、〈' 而某些蛋白質無法由酵母菌分泌，或無法適當 加工(如於酵母n巾同度_化）。在這些範例巾，應選擇真菌 宿主生物體。 為伯主細胞可過度表現該多胜肽，基因改造過度表現 之技術為已知。因此該宿主細胞具有二或多個聚核皆酸編 碼版本（因此該載體亦具有二或多個版本）。 來自桿菌屬之細菌非常適用作為異源性宿主，由於其 可分泌蛋白質至培養基中。其他適用作為宿主之細菌為來 自鍵黴g與假單胞菌屬者。較佳用於表現編碼該多胜肽之 DNA序列之酵母菌宿主細胞為_酵母g、克夫爾酵母 菌/奠氏酵母菌（//嶋、嗜甲基酵母菌（ρ,ϋ)、耶氏 酵母菌（y<arrovWa)與裂殖酵母菌。 更佳為，酵母菌宿主細胞係選自於由釀酒酵母菌、克 夫爾乳k酵母囷（亦稱之為幻 var./aciu)、漢氏多形酵母菌（付謝蘭μ p吻腸卬心）、嗜甲 基酵母菌（Pic/π’α 叫、耶氏解脂酵母菌 ///7〇/}^ca) ’以及裂殖酵母菌組成之族群。 然而’最佳為（如絲狀）真菌宿主細胞。較佳之絲狀真菌 侣主細胞係選自於由麵菌屬、、錄 胞菌(7½切n’wm)、、青黴菌、頂胞黴菌、脈 胞菌、嗜熱子囊菌、蝕絲黴菌、孢子絲菌、子囊菌與籃狀 54 201000634 菌屬組成之族群。更佳為來自黃麴菌oryzae)、 醬油趨菌（A57?erg/Z/Mi 、小巢狀麴菌 mWw/imW種之絲狀真菌宿主細胞，或來自黑麴菌 族斧。這些包括，但不侷限於黑麴菌 (Vl57?erg///w5· 、泡盛麴菌awamon·)、塔賓 麴菌（ν\·ϊ/?ββί7/Μ5· 、棘胞麴菌（AwergH/iu flCM/eaiwi)、臭麵菌/odi'i/wi)、小巢狀麴菌 (Aspergillus nidulans)、Η 琴觀菌（Aspergillus japonicus)、景 麴菌oryzfle)，以及無花果麴菌（Aver矣///ws /VcMMmJ，並進一步由里氏木黴菌（7Wc/i〇i^rma 、禾穀 鐮胞菌（Fwsan’wm容ramhearMW)、產黃青黴菌（Pem’c沿i_wm 、阿拉巴馬頂胞黴菌 fl/Mflmenw)、粗糙脈胞菌(WeMr〇M〇rfl craua)、蝕絲黴菌 (Myceliophtora thernaophilurri)、嗜纖維孢子絲菌 (Sporoptrichum cellulophilum) 、 Disporotrichum ，以及嗜熱子囊菌（77n_eZaWa ien^irid。 本發明較佳之表現宿主為真菌類，如麵菌（Aspergillus) 種（尤其是揭示於EP-A-184,438與EP-A-284,603者），以及 Trichoderma種；細菌如桿菌種（尤其是揭示於ep_a_134〇48 與EP-A-253,455者）’尤其是枯草桿菌仙如/⑻、地 衣芽胞桿菌/Zc/ien^brm⑷、澱粉液化芽胞桿菌 flm：y/o如j、假單胞菌種；以及酵母菌如克 夫爾酵母囷種（尤其是描述於EP-A-096,430如克夫爾乳酸酵 母菌，以及EP-A-301，670者），以及釀酒酵母菌種，如釀酒 55 201000634 酵母菌。 本發明係包含製造本發明多胜肽之方法，藉由重組表 現編碼該多胜肽之DNA序列。就此目的而言，本發明之DNA 序列可用於基因倍增及/或表現訊號之交替，如促進子、分 泌訊號序列，以於適當同源性或異源性宿主細胞中經濟地 製造該多胜肽。同源性宿主細胞為一相同物種之宿主細 胞，其為該相同物種之變異物，由於其DNA序列係衍生自 該物種。術語“異源性”通常係與宿主細胞一起使用，係指 該聚核苷酸不會天然地發生於宿主細胞之基因體，或該多 胜肽並不會由該細胞天然地製造。 因此，本發明係提供一種增進之方法，以製造新辨識 出之分泌型脯胺酸-專一性蛋白酶，以大量且相對純之形 式，經由青黴菌過度表現該編碼酵素，使用重組DNA技術。 較佳方法為於食品等級之微生物體中過度表現此分泌型脯 胺酸-專一性蛋白酶，該微生物體包括麴菌、木黴菌、鏈黴 菌、桿菌與酵母菌，如釀酒酵母菌與克夫爾酵母菌。更佳 之方法為過度表現該分泌型青黴菌衍生脯胺酸-專一性蛋 白酶，於食品等級之真菌如麴菌中。最佳為過 度表現該分泌型脯胺酸-專一性蛋白酶，於食品等級之真菌 中，其中該脯胺酸-專一性蛋白酶-編碼基因所使用之密碼子 已經最佳化，就所使用之食品等級表現宿主而言。一般而 言，為了確保後者之最佳化路徑，希望使用獨特之分泌型 脯胺酸-專一性蛋白酶序列資訊。較佳為，該完整之脯胺酸 -專一性蛋白酶編碼基因之核苷酸序列需可獲得。一旦編碼 56 201000634 該脯胺酸-專-性蛋白酶之基因於較佳宿主中轉型時，薛選 出之殖株便可崎發酵，以及自該發酵射單離出該 型脯胺酸-專一性蛋白酶蛋白質。 本杂明之宿主細胞包括植物細胞’因而本發明可延伸 至基因轉殖生物體，如植物及其部分，其含有-或多種本 發明之細胞。該細胞可為異祕表現本發明之多胜狀，或 異源性地含有本㈣之—❹種聚核純。因此，該基因 轉殖（或基因性修飾）植物已將編碼本發明-或多種多胜肽 之序列插人(如穩定性)其基因體中。該植物細胞之轉型可使 用已知技術，例如使用來自根癌農桿菌（a—她咖

_咖—之仏如質體。因此該質體(或載體)可包含感染 該植物需要之序列，並可使用Ti〜或Ri質體之衍生物。 此外’植物部分如葉、根或枝幹之直接感染可達成。 在此技術中，待感染之植物可先受傷，如以刹刀劃開植物， =以針刺植物，或以砂紙摩擦植物。該傷口之後種入農桿 菌。植物或植物部分之後可於適當培養基上成長，並使: 發展為成熟漏。經轉型細胞可再生絲因修飾之植物了 藉由使用已知技術’如篩選轉型莖，使用抗生素並繼代培養 該莖，於含有適當營養素、植物激素與類㈣之培養基上。 因此’本發明包括經修飾之細胞，其可表現脯胺酸-專 -蛋白酶或其變異物。此細胞包括短暫，或較佳穩定之較 高等真核細胞株’如似動物細胞或昆蟲細胞，較低等真 核細胞’如酵母菌以及(如絲狀)真菌細胞，或原核細胞如細 菌細胞。 57 201000634 本發明亦相關於製造母代細胞之突變細胞之方法，其 包含破壞或刪除内生性核酸序列，其編碼多胜肽或其控制 序列。導致該突變細胞製造較少之多胜肽，與母代細胞相較。 降低脯胺酸-專一性蛋白酶活性之殖株建構，可方便地 以修飾或使脯胺酸-專一性蛋白酶於該細胞中之表現所必 須之核酸序列失活。該經修飾或失活之核酸序列可為，如， 編碼脯胺酸-專一性蛋白酶活性所必須之多胜肽或其部分 之核酸序列，或該核酸序列可具有一表現該多胜肽所需之 調節功能，還自該核酸序列之編碼序列。此調節或控制序 列之一範例為促進子序列或其功能部分，即，足以影響該 多胜肽表現之部分。其他可能修飾之控制序列包括，但不 侷限於，引導序列、聚-腺嘌呤序列、前-胜肽序列、訊號序 列，以及終端序列。 核酸序列之修飾或失活可藉由將細胞進行突變，並篩 選其中該脯胺酸-專一性蛋白酶製造能力降低或消除之細 胞而達成。該突變，其為專一性或隨機，可藉由如使用適 當之物理或化學突變試劑、使用適當之寡-核苷酸，或藉由 將DNA序列進行PCR突變而進行。此外，該突變可使用這 些突變試劑之任一組合而進行。 適用於本發明目的之物理或化學突變試劑範例包括紫 外光（UV)照射、羥基胺、N-甲基-Ν’-硝基-N-亞硝基胍 (NTG)、0-甲基羥基胺、亞硝酸、曱基石黃酸乙酯（EMS)、亞 硫酸鹽、曱酸，以及核苷酸類似物。 當使用此類試劑時，該突變一般係以將待突變細胞靜 58 201000634 置於所選擇之突變試劑存在環境下，在適當條件下，並篩 選具有降低或無脯胺酸-專一性蛋白酶活性表現之細胞。 本發明多胜肽之製造之修飾或失活可藉由引入、取代 或移除一或多個核苷酸於該編碼該多胜肽或轉錄或轉譯所 需之調節元素之核酸序列中。例如，核苷酸可插入或移除， 以引入停止密碼子、移除起始密碼子，或改變開放閱讀框。 此修飾或失活可由定點突變或PCR突變完成，依據技術上 已知之方法。 雖然原則上該修飾可於體内進行，如直接於表現待修 飾之核酸序列之細胞中，較佳該修飾係於體外進行，如下 範例所述。 一種藉由選擇宿主細胞而使脯胺酸-專一性蛋白酶失 活或產量減少之方法，係以基因取代或基因干擾為基礎。 例如，在基因干擾法中，對應於内生性基因或有興趣之基 因片段之核酸序列，係於體外突變，以製造缺陷性核酸序 列，之後將其轉型於宿主細胞中，以製造一缺陷基因。藉 由同源性重組，該缺陷核酸序列取代内生性基因或基因片 段。較佳為，該缺陷基因或基因片段亦編碼一標記物，其 可用於篩選轉型物，其中該基因係編碼經修飾或破壞之多 胜肽。 此外，編碼本發明多胜肽之核酸序列之修飾或失活， 可藉由建立反義技術而達成，使用互補於多胜肽編碼序列 之核苷酸序列。更特別的是，細胞產生之多胜肽可被減少 或消除，藉由引入互補於編碼該多胜肽之核酸序列之核苷 59 201000634 酸序列。該反義聚-核苷酸一般係於細胞中轉譯，並可雜合 至編碼脯胺酸-專一性蛋白酶之mRNA上。在可使互補反義 苷酸序列雜合至mRNA之條件下，細胞所製造之脯胺酸-專 一性蛋白酶量會被減少或消除。 較佳為該經本發明方法修飾之細胞為微生物來源，如 適用於製造希望之蛋白質產物之真菌株，不論是與該細胞 為同源性或異源性。 本發明更相關於一種母代細胞之突變細胞，其包含破 壞或刪除編碼該多胜肽或控制序列之内生性核酸序列，導 致突變細胞製造較少之多胜肽，與母代細胞相較。 如此製造出之突變細胞缺乏多胜肽，特別適用於作為 宿主細胞，表現同源性及/或異源性多胜肽。因此，本發明 更相關於一種製造同源性或異源性多胜肽之方法，包含(a) 培養該突變細胞，在可製造該多胜肽之條件下；以及(b)回 收該多胜肽。在本文中，術語“異源性多胜肽”於此係定義 為一多胜肽，其並非宿主細胞之原始形式、一種原始蛋白 質，其中進行修飾以改變該原始序列，或一種原始蛋白質， 其表現係大量改變，為以重組DNA技術操作之結果。 在另一觀點中，本發明係提供一種製造蛋白質產物之 方法，其不含脯胺酸-專一性蛋白酶活性，藉由將製造本發 明脯胺酸-專一性蛋白酶多胜肽，以及有興趣之蛋白質產物 之細胞進行發酵。該方法包含加入一有效量之試劑，可抑 制脯胺酸-專一性蛋白酶活性，至發酵槽中，不論是在發酵 完全之同時或之後，自發酵槽回收有興趣之產物，並選擇 60 201000634 性地將回收產物進一步純化。此外，在培養後，所得典養 液可進行pH或溫度處理’以大幅降低脯胺酸-專—性蛋白酶 之活性，並可自培養槽中回收產物。pH或溫度之結合處理， 可於自培養槽回收之蛋白質製備物上進行。 上述方法用於製造實質上不含有興趣脯胺酸專—性 蛋白酶-產物，以製造真核性多胜肽，尤其是在製造真菌蛋 白質如酵素時。該缺乏脯胺酸-專一性蛋白酶之細胞亦可用 於表現有興趣之異源性蛋白質，用於食品工業或有興趣之 藥物。 依據本發明，本發明多胜肽之製造可藉由培養微生物 表現伯主而達成，其已經本發明一或多個聚核苷酸轉型， 於方便之營養發酵介質中。 本發明之重組宿主細胞可使用技術上已知之方法培 養。就每一促進子與宿主細胞之組合，培養條件為可表現 編瑪δ亥多胜肽之DNA序列。達到希望之細胞密度或多胜肽 浪度後，該培養係停止，並以已知流程回收該多胜肽。 該發酵介質可包含—已知之培養液，其包含—碳源(如 葡萄膽、麥芽骑、黑糖蜜等）、氮源（如硫酸銨、硝酸銨、氣 化銨等）、有機氮源(如酵母菌萃取物、麥芽萃取物、消化蛋 白等）’以及無機營養源（如硫酸鹽、鎂、鉀、鋅、鐵等）。 選擇性地，亦可包括誘發劑（如纖維素、果膠、麥芽醣、麥 芽糊精或木糖醇半乳糖醛酸聚醣(xylogalacturonan))。 適當培養基之選擇可以所選擇表現宿主為基礎，及/或 表現建構物所需之條件為基礎。此培養基為技術上已知。 61 201000634 該介質可，若希望的話，含有額外之成分，可幫助經轉型 宿主進行表現作用，而抑制其他潛在微生物體之污染。 該發酵可進行0.5-30天。可為批次式、連續式或進料批 次製程，適於溫度範圍如約0至45°C，及/或於pH如約2至約 10。較佳之發酵條件為溫度範圍為約20至約37°C，及/或於 pH約3至約9。適當之條件通常經過選擇，以所選擇之表現 宿主與待表現之蛋白質為基礎。 發酵後，若有需要的話，該細胞可自發酵槽中移出， 使用離心或過濾法。發酵停止後，或細胞移出後，本發明 之多胜肽之後可經回收，若希望的話，可使用一般方法進 行純化與單離。 本發明具有脯胺酸-專一性蛋白酶活性之多胜肽，可為 經單離形式。如此定義，該經單離之多胜肽可為内生性（典 型）製造或重組多胜肽，其實質上不含其他非-脯胺酸-專一 性蛋白酶多胜肽，一般為至少約20%純，較佳至少40%純， 更佳至少約60%純，尤佳至少約80%純，特佳至少約90% 純，最佳至少約95%純、約98%純或約99%純，以SDS-PAGE 測定。 該多胜肽可經過濾分離出，之後濃縮（如以超細過濾 法），或以技術上已知之任一方法，自粗產物溶液中獲得純 蛋白質。所得之製備物可進行喷霧乾燥或維持於液體製劑 中。應瞭解到，該多胜肽可與載體或稀釋劑混合，其不會 干擾多胜肽之使用目的，因此此形式之多胜肽仍可視為一 單離物。一般係將該多胜肽包含於製劑中，其中本發明之 62 201000634 多胜肽佔大於20%，如大於30%、40%、50%、80%、90%、 95%或99%之蛋白質重量，於製劑中。 本發明多胜肽可以某種形式提供，使其置於天然細胞 兄外。因此’其可為貫質上經單離或純化，如上所述， 或於天然不會發生之細胞中，如其他真菌細胞、動物細胞、 植物細胞或細菌細胞。 較佳為，本發明之多胜肽可由微生物體中獲得，其具 有編碼具有脯胺酸-專一性蛋白酶活性之酵素之基因。更佳 為’本發明之多胜肽係自該微生物體分泌。更佳為該微生 物體為真菌，最佳為絲狀真菌。因此，較佳之提供者生物 體為青黴菌屬，如產黃青黴菌屬。 本發明係提供一種經單離之多胜肽，具有胺基酸序 列’其具有與SEQ ID NO: 3多胜肽之胺基酸序列（即該多胜 肽）等同度至少約60%，如至少約70%、如至少約80%，較佳 至少約85%，更佳至少約90%，尤佳至少約95%，特佳至少 約98% ’最佳至少約99%等同度，其具有脯胺酸-專一性蛋 白酶活性。 較佳為，本發明經單離或純化之多胜肽較佳具有至少 10個脯胺酸專一性蛋白酶活性單元，每克蛋白質材料。這 些單元可使用合成胜肽Z-Gly-Pro-pNA測量，於37。(：與pH 5 條件下，如同方法一節所述。 一般而言，本發明多胜肽亦具有如同SEQ ID NO : 3多 胜肽之類似或增進特性，就溫度及/或熱穩定度而言。因 此，該多胜肽可具有最桂溫度約60°C或更低，約5(TC或更 63 201000634 低，約40°C或更低，約37°C或更低，或更低溫度。 可藉由加熱本發明多胜肽至約60°C，約10分鐘至約30 分鐘，如自約15至約25分鐘，如約20分鐘，而使其失活。 此種失活可使用巴司得滅菌法而達成。於本文中，失活係 指無或實質上未彳貞測到殘餘之酵素活性，在加熱失活法中。 因此，上述使用之方法，其中使用本發明多胜肽，可 包括一使多胜肽失活之步驟。此一步驟為上述之加熱活化 步驟。此步驟之結果為無或實質上未偵測到該多胜肽之殘 餘酵素活性。 本發明多胜肽可經化學性修飾，如轉譯後修飾。例如， 其可為經醣化（一或多次），或包含經修飾之胺基酸殘基。亦 可藉由加入組胺酸殘基而修飾，以幫助其純化，或藉由加 入訊號序列，以促進自細胞之分泌。該多胜肽可具有胺基 端或羧基端延伸，如胺基端甲硫胺基酸殘基、較小之聯結 胜肽，至多約20-25個殘基，或小片段延伸，其可幫助純化， 如聚-組胺酸追蹤物、抗原表位或結合區塊。 本發明之多胜肽可經追蹤標記物標記。該追蹤標記物 可為任一適當之標記物，使該多胜肽可被偵測出。適當之 標記物包括放射線同位素，如1251、35S、酵素、抗體、聚核 皆酸與聯結物，如一生物素。 該多胜肽可經修飾，以包含非天然發生之胺基酸於 内，或增加該多胜肽之穩定性。當該蛋白質或胜肽以合成 方法製造，此胺基酸可於製造時引入。該蛋白質或胜肽亦 可經修飾，在合成或重組製造後。 64 201000634 本發明之多胜肽亦可使用D-胺基酸製造。在此情況 下，該胺基酸可於反向序列中聯結，以C端至N端方向。此 為此領域之一般技術，用於製造此類蛋白質或胜肽。 有數種側鏈修飾為技術上已知，且可於本發明蛋白質 或胜肽側鏈上進行。此修飾包括如，使用藤類進行還原炫 基化反應’之後以NaBH4還原，以甲基乙酿胺酿進行酿胺 化，或以醋酸酐進行醯化而修飾胺基酸。 本發明多胜肽可使用於任一方法或應用中，其中脯胺 酸-專一性蛋白酶酵素活性為必須的。 因此，本發明係提供一種組成物，其包含本發明之多 胜肽。此組成物可用於本發明方法或用途中。 輔助酵素活性，如額外的蛋白酶活性，為本發明方法 或用途中所必須的。因此，本發明係提供一種組成物，包 含：⑴本發明之多胜肽，以及；（ii)一多胜肽，可提供與⑴ 之多胜肽不同之活性，如與⑴之多胜肽不同之蛋白酶。 例如，可使用一額外、不同之脯胺酸-專一性蛋白酶。 此類酵素之範例係廣泛發現於動物與植物中，並已報導於 微生物中.例如，脯胺酸-專一性蛋白酶已於麴菌 〇 522 428)、黃桿菌㈣·函)(Ep 〇 85)以及產氧單胞桿菌Bi〇chem.ll3, 790 796)、汽單胞菌推擬桿菌咖以謂·㈣中 辨識出。 。此外’可使用其他蛋白酶。較佳為，此其他蛋白酶具 有最佳之此酵素之範例係揭示於觸心撤，以 65 201000634 及本文。 因此，本發明係提供一種製備蛋白質水解物之方法， 該方法包含將一蛋白質受質與本發明多胜肽或組成物接 觸。因此，本發明亦提供使用本發明多胜肽或組成物製備 蛋白質水解物之用途。本發明亦相關於一種蛋白質水解 物，可由此方法或用途獲得。 此方法可用於創造出無苦味水解物，自蛋白質材料 中，使用獨特之胺基酸組成物。此獨特胺基酸組成物可提 供某些食品應用相當大的幫助。範例為酪蛋白或麥麩或玉 米蛋白質單離物，具有高含量之疏水性胺基酸殘基。使用 本發明方法，可產生無苦味水解物，用於嬰兒與臨床營養 品、治療飲食，以及消費者飲食或運動營養品。 本發明之一實施例係提供一種酵素混合物，其包含一 經單離、純化之脯胺酸-專一性蛋白酶（即本發明之多胜 肽），具有高產率蛋白質水解物，其實質上具有低苦味與低 過敏性，而不會伴隨大量自由胺基酸之產生。此酵素混合 物適用於製備各種蛋白質分液之水解物。尤其是，一蛋白 質受質，如乳蛋白質，可與經單離、純化之脯胺酸-專一性 蛋白酶與溶栓酶(subtilisin)接觸，製備一蛋白質水解物，富 含具有羧基端脯胺酸之胜肽片段。術語“富含”係指酵素切 割之至少8%胜肽片段具有羧基端脯胺酸殘基。 由水解蛋白質獲得之蛋白質可包含一胜肽，其中該帶 有羧基端脯胺酸之胜肽之莫耳分率（％)，至少為用於製造水 解物之蛋白質受質中脯胺酸之莫耳分率（％)之二倍。 66 201000634 水解物中胜肽之平均長度一般為3至9個胺基酸。 使用本發明多胜肽製備之較佳水解物係：包含胜肽之 乳清水解物，其中帶有羧基端脯胺酸之胜肽之莫耳分率為 至少8%，較佳至少15%，更佳姆寫；路蛋自水^物， 其包含帶有羧基端脯胺酸之胜肽之莫耳分率為至少， 較佳30至7G%之職；収大豆水解物，Μ”有叛基 端脯胺酸之胜肽之料分率為至少观，較⑽至观。 已知之方法分析 就上述水解物而言，胜肽或胜肽片段係指分子量為· 至2000逭耳吞者。這些胜肽可使用技術上 (例如使用LC/MC)。 一般而言’就製造本發明蛋白質水解物而令，錄白 質受質實質上係經水解，較佳至少鄕。較佳至少腦之蛋 白質文質賴為具有分子量為働至2_料吞之胜狀。更 佳為20至90%，更㈣至嶋之蛋白質受質轉換為此胜狀。 本㉝明之另—實施例中，—蛋白質受質可與一酵素 2物胁置’該混合物包含一經單離、純化之舖胺酸_ "1·生蛋白酶、—絲胺酸蛋白酶，或金屬蛋白酶，以及一 缓基胜肽酶，以製造富含具有絲端脯胺酸之胜肽片段之 蛋白質水解物。 本毛月之酵素混合物特別適用於製造蛋白質水解物， 用於香味與營—狀運較料躲汁基底飲料 ，為所得 水解胜肽混合物’具有非常少之苦味以及絕佳之溶解 ς在此敝料普級性之條件下。本發明酵素混合物之 、徵為其含有至少一蛋白酶，例如一絲胺酸蛋白酶或金屬 67 201000634 内蛋白酶’與脯胺酸_專—性蛋白酶結合， 物。更特別的是，本發明係相關於一 供初級水解 胺酸-專-性蛋白酶（即本發明之多胜肽），1化之脯 或金屬蛋白酶酵素之混合物，可製造—蛋白:、胺酸蛋白酶 含胜肽片段，其中至少8%，較佳、至少15%，質切物’包 之該胜肽段具有麟賴㈣。 h30至70% 經本發明酵素混合物水解之受質包括 酸赂、凝乳絡、酸乳清或乳赂乳清錢。相A、脫脂乳、 麴菌衍生之脯胺酸專-性蛋白酶不僅於人驚言牙地， 端切割’亦於經基脯胺酸殘基之絲端切割55^基之魏基 他膠原蛋白基底之動物蛋白質，如明膠，=，使得產生其 骨頭之碎肉，皆可為該酵素之有興趣受質。:含骨頭或魚 質，如麥麵、磨碎大麥，以及得自大豆、米^外，蔬菜受 質部分，為適當之受質。本發明製造之乳蛋或玉米之蛋白 用或不使用其他過濾、或純化步綠，於各種特物可使 如用於嬰兒營養品之低職水解物、腸道錢=物:’ 以及蛋白質濃縮物，用於各種健康食品中。因此U明 蛋白質水解物可詩製造具有低抗原性之食品，如嬰㈣ 方奶粉。此外’本發明讀讀射躲祕食物中之苦 味，由至少-蛋白質水解物增味，甚至當該蛋白質水解物 大量存在時。例如，食物可包含5%至1〇%(〜力之蛋白質水 解物，其苦味仍降低，使用本發明之酵素製劑。 因此，本發明係提供-種食物或飼料產品或飲料，其 包含於此所述之蛋白質水解物。 68 201000634 本發明之多胜肽係提供一經單離、純化之脯胺酸-專— 性蛋白酶，具有最佳之酸性pH ,或於一組成物中，包含— 或多種其他酵素，用於製備蛋白質水解物，用於各種食物 應用。 此一經單離、純化之脯胺酸-專一性蛋白酶較佳具有至 少10單元之脯胺酸專一性蛋白酶活性每克蛋白質材料。這些 單元可使用合成胜肽Z-Gly-Pro-pNA測量，於37°C與pH 5， 脯胺酸-專一性蛋白酶之最佳pH值低於pH 6，如黑麴菌脯胺 酸專一性内蛋白酶或其他者，該單元應於pH=7測量，如同 材料與方法一節所述。 此經單離、純化之酵素，單獨或與以酵素混合物使用， 可克服多種習知酵素混合物已知之缺點。最重要的，本發 明之多胜肽為—關鍵物質’於製造結合低過敏潛力、高產 渡與低苦味之水解物時。此外，所產生經單離、純化之脯 月女fee-專一性蛋白酶水解物或包含脯胺酸-專一性蛋白酶之 酵素混合物，為酸性穩定，並含有非常低量之自由胺基酸， 使知加熱步驟時產生最少怪味，如於喷霧乾燥或產物滅菌 時本發明之水解物包含低於微莫耳之自由胺基酸每克 乾燥粉末，較佳低於300微莫耳之自由胺基酸每克乾燥粉 末，更佳低於15〇微莫耳之自由胺基酸每克乾燥粉末，尤佳 低於5〇试莫耳之自*胺基酸每克乾燥粉末。 本發明之酵素混合物特徵為其包含另一内蛋白酶，如 絲胺酸蛋白酶或金屬内蛋白酶，與經單離、純化之脯胺酸-專一性蛋白酶，共同作用以提供初級蛋白質水解物。 69 201000634 絲胺酸蛋白酶代表一已知族群之鹼性内蛋白酶，以及 某些重要代表如溶栓酶（E.C. 3.4.21.62)與胰凝乳蛋白酶 (chymotrypsin)(E.C. 3.4.21.1) ’較佳於疏水性胺基酸之缓基 端切割胜肽鏈，如Tyr、Τϊρ、Phe與Leu。本發明之酵素混 合物可包含胰凝乳蛋白酶及/或溶栓酶。溶栓酶係由芽胞桿 菌製造，具有廣泛受質專一性’以及廣泛之鹼性pH最佳化。 該酵素係於50°C至60°C間最佳活化。該酵素可便宜獲得， 為一般可購得產物，並可用於製造如各種乳品水解物。得 自動物胰臟酶之胰凝乳蛋白酶，具有某些較窄之受質專一 性，於微高之鹼性pH值下，與溶栓酶相較，可適度地於低 於50°C下活化。 金屬内蛋白酶係廣泛分布於細菌、真菌與較高等生物 體中。他們可分離為中性與酸性金屬蛋白酶。此二亞族群 中，僅有該中性蛋白酶具有希望之切割傾向，即於疏水性 胺基酸殘基，如Phe與Leu之羧基端切割。已知中性金屬蛋 白酶種類代表為桿菌蛋白酶(^(^11〇¥丨11)(£.0：.3.4.24.28)與 嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)(E.C. 3.4.24.27)，以及其任一者 或二者’可存在於本發明之酵素混合物中。該二酵素得自 芽胞桿菌種，並在中性或微驗性條件下具有最大活性。較 不為人知之金屬内蛋白酶已由麴菌種獲得。在這些案例 中，其中該脯胺酸專一性蛋白酶並非用於使苦味降低，但 可幫助富含脯胺酸蛋白質序列之水解，與酸性金屬蛋白酶 族群組合，如(^1^1'〇1}^1^(£匚 3.4.24.39)較佳。 除了製備此水解物外，脯胺酸-專一性蛋白酶之苦味降 70 201000634 低作用亦可考慮。舉例而言，加人内胜肽酶於蛋白質食物 產品中，其涉及發酵步驟，如於乳赂或優格中，以抑制涉 及老化之苦味。此外，亦可用於需要以蛋白酶處理之蛋白 質食品產物’如製造經酵素修敎乳路或調味工業製造蛋 白質水解物’力认本發日狀酵素可幫助抑制苦味。 因此本《月係提供—種製備食物或飼料產物或飲料 之方法’該方法包含加人本發明多胜肽或組成物，在製備 錢品產物、飼料產物錢_。本發财提供使用本發 明多胜肽或組成物之㈣，以製備食物或飼料產品或飲 料。本發明亦提供—種食物或侧產品或飲料，可由上述 方法獲得。 申請專利範圍中所述之多胜肽與組成物可應用於食物 或飲料中’並非用於侷限至某—狀況，其中希望可抑制苦味。 例如，本發明之多胜肽可與食物蛋白質接觸，以降低 其過敏性。數種食物蛋白質含有高度過敏部分，如含有富 含脯胺酸胜肽序列之醇溶榖蛋白（prolamines)之麥麵。這些 蛋白質可置於新酵素中，以減輕其抗原性。 因此，本發明係提供一種製備食物或飼料產品或飲料 之方法’該方法包含加入本發明之多胜肽或組成物在製 備食物或飼料產品或飲料時，且其中所得之食物或飼料產 品實質上並不包含腹腔相關抗原表位（celiac related epitopes) ° 此外’本發明係提供使用本發明之多胜肽於精神疾病 或腹腔疾病相關疾病之預防性治療。 71 201000634 富含脯胺酸之飲食蛋白質，如牛乳之酪蛋白，或榖類 麩質，已知會抵抗人體腸胃道之蛋白質降解作用。因此富 含脯胺酸之胜肽會累積，並會導致副作用，於特定個體族 群中。某些這類作用已描述，該富含脯胺酸之胜肽可作為 鴉片鹼，其結合至周邊組織與中樞神經系統之受器上。舉 例而言，孤獨症與精神分裂症病患之症狀，已知與富含脯 胺酸之飲食蛋白質相關聯。其他作用則為無法忍受富含脯 胺酸之胜肽之結果。例如，富含專一性脯胺酸之序列為腹 腔疾病中觀察到的麩質毒性之主因。腹腔疾病（Celiac disease)為一種廣泛之小腸自體免疫疾病，其治療方式僅有 終身食用無麩質飲食。腹腔疾病有時亦會伴隨精神與神經 性症狀，此可能為富含脯胺酸胜肽之代謝紊亂之深遠後果。 使用脯胺酸-專一性蛋白酶以移除食物中有毒之富含 脯胺酸之胜肽，在攝食或口服供應矯正酵素前，以彌補不 適當之小腸消化過程，係詳細描述於WO 2005/027953，在 此併入本案以作為參考資料。 因此，本發明之多胜肽可用於水解富含脯胺酸之胜 肽，如於pH低於5.5時，其與精神疾病相關，包括孤獨症、 精神分裂症、ADHD、躁鬱症，以及憂鬱症，與腹腔疾病 相關疾病如自體免疫疾病，尤其是第1型糖尿病、痕療皮膚 炎、自體免疫曱狀腺炎、膠原蛋白疾病、自體免疫禿頭症， 以及自體免疫肝炎與IBS。因此，本發明係提供一種本發明 多胜肽之用途，用於治療或預防精神疾病或腹腔疾病相關 病症。 72 201000634 較佳為，編碼本發明多胜肽之酵素係用於製造食物， 如啤酒或麵包，其實質上不含腹腔相關抗原表位，較佳為 麩質抗原表位，更佳為小麥或大麥抗原表位。 本發明多胜肽可加入各種希望之麵糰中，由於觀察到 此可延遲產品，如麵包之腐壞。 本發明之脯胺酸-專一性蛋白酶可使用於富含脯胺酸 之胜肽之製備方法中。此富含脯胺酸之胜肽希望可加入各 種食物或營養食品中，由於其可能有降低食慾、纖維蛋白 溶解與抗血栓，以及抗高血壓作用，可保護胃黏膜，以及 預防風濕性關節炎。 另一應用為添加本發明之多胜肽於動物飼料中，可增 加蛋白質利用率。例如，本發明多胜肽之添加可用於增進 飼料蛋白質中難以消化之富含脯胺酸序列之消化性，並增 進可便宜獲得之蔬菜蛋白質，含有高量之多酚，之轉換率。 此外，本發明係提供一種使用本發明多胜肽，製備飲 料如啤酒，之用途。大麥蛋白質，例如，係富含脯胺酸序 列，以及其非麥芽形式之穀類蛋白質，極難降解為自由胺 基酸，但此為製備適當之發酵麥芽汁所需。因此，於研磨 過程添加本發明多胜肽，可刺激經研磨但非麥芽之大麥釋 放胺基酸，而可獲得較豐富之麥芽汁。以類似方法，可增 加得自含有高含量之其他低價與地區可獲得榖物，如高 粱，之研磨物之啤酒發酵物。 本發明亦提供一種預防或降低飲料混濁度之方法。此 方法包含加入本發明之多胜肽至飲料中，或在製備飲料時 73 201000634 加入本發明多胜肽，以預防或降低飲料混濁。於此，術語‘‘飲 料”包括製備階段中之任一飲料。因此，飲料不僅為可立即 攝食之飲料，亦包含用於製備飲料之組成物。例如，用於 製備啤酒之麥芽汁，亦包含於術語“飲料，，中。此外，在製 備飲料時加入本發明多胜肽組成物，其並非或並不完全是 液體’係落於本發明方法之麟巾。於開始釀造啤酒之磨 碎麥芽中加入本發明多胜肽為此組成物之一範例。使用脯 胺酸-專-性蛋白酶降低或預防啤細描述於 WO 02/46381 與wo 2007/101888。 於此’術語胜肽與蛋白質係互相交換使用。在本文中， 術語“混濁，，、“霧狀”與‘‘濁度’，可互相交換使用。飲料中之混 濁程度，可使収濁狀量。在混_巾，_量特定角 度散射之光量，相對於人射光方向1濁度測量相當適用 於測量由於蛋白質-㈣交互作用形成之霧狀體。混濁度測 量可於加人本發明多胜肽之飲料中進彳f，其詳細描述於购 2007/101888。當脯紐_專—性蛋白酶使用於降低或預防混 濁時’混濁度測量最佳係使用25度散射角進行。 多酚係定義為一化合物，具有一化學結構，其中含有 至少二芳香環’經至少一羥基取代，或具有一化學結構， 其含有至少一芳香環，經至少二羥基取代。多酚之範例為 單寧酸與黃酮’其包括如兒茶素、黃酮醇與花青素。 本發明方法較佳可應用於啤酒、紅酒與果汁中。較佳 係應用於除了啤酒與紅酒外之酒精飲料。 術語“啤酒”使用於此係包含至少一製備自非麥芽穀類 74 201000634 之研磨物、製備自麥芽穀類之研磨物，以及製備自非麥芽 毅類研磨物與麥芽縠類研磨物之混合物，之啤酒。術注‘‘啤 酒”亦包含以佐劑製備之啤酒，以及各種酒精含量之啤酒。 果汁可為由紅莓、草莓、蘋果、梨子、蕃茄、柑橘類、 咸米專製備之汁液。 依本發明方法加至飲料中之本發明多胜肽量可於廣範 圍間變化。在本發明之-較佳實施例中，其所添加之飲料 中，具有至少150毫單位之脯胺酸-專—性蛋白酶活性，其 中该活性係以Z-Gly-Pro-pNA作為受質，測量每克蛋白質之 活性。更佳為，至少5〇〇毫單位之脯胺酸_專一性蛋白酶係 加至飲料中，最佳為，加入至少1單位之脯胺酸-專一性蛋 白酶。 加入本發明多胜肽之最大量無法被精確定義出。該最 大量係依據希望之混濁度降低或預防之最大量、飲料之組 成飫料之pH值，以及蛋白酶具有最大活性時之pH值而定。 本發明多胜肽可於飲料製備不同階段中加入。在啤酒 製備過程巾’本發❹胜肽㈣可加至研磨物巾。本發明 多胜肽可加至發酵啤酒中，在混濁物形成前。然而，本發 明多胜肽亦可在混濁物形成後加入發酵啤酒中。本發明多 胜肽較佳可於啤酒製程中之研磨或熟化步驟加入。 在酒類製備過程中，本發明多胜肽較佳可加入發酵酒 中。該多胜肽較佳可於酒精發酵或蘋果乳酸發酵後加入， 於製造酒類之過程中。 在製備果汁之製程中，本發明多胜肽較佳可於浸軟或 75 201000634 去果膠步驟中加入。 由於混濁物通常於酸性飲料中發生，如啤酒、紅酒與 果汁，本發明具有脯胺基專一性活性之多胜肽較佳係於pH 值低於7時使用。更佳為，於pH低於7時具有最大活性之脯 胺基-專一性蛋白酶，係使用於本發明方法中。 如同典型之酵素活性，該脯胺基-專一性蛋白酶係為pH 值依賴性。在本發明之一較佳實施例中，蛋白酶係加至飲 料中，其於該飲料添加之pH下具有最大脯胺基專一性蛋白 酶活性。較佳之飲料為含蛋白質飲料。在另一較佳實施例 中，該飲料含蛋白質與多酚。較佳之飲料為具有pH低於7 之飲料。 脯胺酸-專一性蛋白酶可包含至少約5單位每克蛋白質 之酵素，較佳約10單位/g，更佳約25單位/g，尤佳約50單位/g。 依據本發明之一實施例，使用本發明之多胜肽可使飲 料如啤酒穩定化所需時間減少（與未使用脯胺酸-專一性蛋 白酶之製程相較）。例如，穩定化期間可縮短為小於約7天。 較佳小於6、5、4或3天。更佳為，縮短為小於2或1天。 最佳為，該穩定相可縮短為製造期間，該穩定化期間 可縮短為與啤酒自熟化相冷卻至希望溫度，如啤酒過濾及/ 或包裝時之溫度，之冷卻時間相等。此期間一般稱之為冷 卻期間。較佳將穩定期間縮短為冷卻啤酒至希望溫度之期 間，因為如此該穩定相便僅與可獲得之冷卻容量有關。 來自熟化相之啤酒傳統上係冷卻至溫度約-2°C至約〇°C。 然而，使用本發明脯胺酸-專一性蛋白酶，不僅可允許穩定 76 201000634 相縮短，同時可於較一般使用溫度更高之溫度下進行。傳 統上，穩定步驟係於較高溫度下進行，但此製程較花時間， 如需6週或更多。因此，在本發明之另一實施例中，該穩定 期間，一般為如上述之較短穩定期間，係於啤酒中進行， 較佳冷卻至約2°C，更佳冷卻至約3°C、4°C、5°C或6°C，或 更佳冷卻至約7°C或約8°C，最佳至包裝時希望之溫度，如 瓶裝或桶裝填充時。 包裝時希望之溫度可依據製程而不同，但較佳係於溫 度至多，較佳約7°C，以獲得希望之啤酒中二氧化碳溶 解量。僅需考慮將啤酒冷卻至包裝所需溫度之製程，僅需 相當少之能量，與已知製程相較。 在本發明之一較佳實施例中，該穩定相可降低為啤酒 冷卻之期間，自熟化步驟終點之溫度冷卻至包裝所需之溫 度，因而可省略傳統冷卻穩定時間。 因此，依據本發明，啤酒可冷卻至至多約2°C，更佳至 多約3°C、4°C、5°C或6°C，更佳至至多約7°C或8°C，最佳 至希望之包裝溫度。之後該啤酒可直接包裝，即，在此實 施例中，該啤酒並沒有在其冷卻溫度下閒置一段時間。 在本發明中，其他處理步驟亦可進行，以達成額外之 澄清化，及/或穩定化，若需要的話。事實上，若使用較短 之穩定相期間，其對應於啤酒冷卻至包裝溫度所需時間， 希望可以PVPP及/或矽膠處理啤酒。此可幫助確保延長儲存 期穩定性。 所有於此說明書中提及之文獻與專利，在此併入本案 77 201000634 以作為參考資料，每一單獨文獻或專利申請案皆具獨特 性’並個別在此併入本案以作為參考資料。 下列範例係用於詳細說明本發明： 範例 材料&方法 主色胜肽·所有合成之胜肽皆由pepScan prest〇 (Aimere, The Netherlands)提供。 光s普法係用於測定脯胺基-專一性蛋白酶活性：受質溶 液為2mM之N-羧基苯醯氧基_甘胺酸_脯胺酸_p硝基苯胺 (Z-Gly-Pro-pNA; m.w. 426.43; Bachem)溶液，溶於〇.1 Μ擰 檬酸/ 0.2 Μ填酸二鈉緩衝液中，pH 5·〇，含有40%二"惡烧。 在lmL ’ pH 5.0之緩衝液中係加入25〇μ!受質溶液，之後加 入ΙΟΟμΙ酵素溶液(較大或較小量之酵素溶液，應由缓衝溶液 補足）。反應混合物係靜置於37°C ’並釋放出ρΝΑ，藉由測 量41 Onm吸收度之增加而得知。 活性定義：1單位之脯胺酸專一性蛋白酶係定義為自 Z-Gly-Pro-pNA ’於所描述之反應條件下，於丨分鐘内釋放 出Ιμηιοί ρΝΑ之酵素活性。用於計算濃度，莫耳吸光係數(E) 為 8,800Μ-1。 SDS-PAGE :所有用於SDS-PAGE之材料與染料係購自 Invitrogen(Carlsbad，CA，US)。樣本係使用 SDS緩衝液製 備’依據使用手冊，並於12% Bis-Tris凝膠中分離，使用 MES-SDS緩衝系統，依據使用手冊。染色係使用simply Blue Safe Stain 染色（Collodial Coomassie G250)。 78 201000634 範例1 脯胺酸-專一性蛋白酶基因之ZFX選殖與表現 產黃青黴菌殖株CBS 455.95係於30°C培養3天，於PDB 中（Potato dextrose broth, Difco)，染色體DNA係分離自菌 絲，使用 Q-Biogene 套組（貨號 6540-600 ; Omniiabo International BV, Breda, the Netherlands)，依據使用手冊。 此染色體DNA係用於倍增脯胺酸-專一性蛋白酶之編碼序 列，使用PCR。 為了自青黴菌CBS 455.95之染色體DNA中，特異性倍 增該脯胺酸-專一性蛋白酶基因ZFX，遂設計二PCR引子。 引子序列部分得自一序列，其發現於青黴菌CBS 455.95之 基因體DNA中’如同SEQIDN0 : 1所示。吾人發現此序列 與黑麴菌之脯胺酸-專一性蛋白酶基因序列具有<5〇%之序 列等同度。於此我們首次描述分泌型青黴菌脯胺酸_專一性 蛋白酶之有效表現與鑑定。完整脯胺酸_專一性蛋白酶之蛋 白質序列，包括潛在之先驅-與前-序列，係描述於SEQ ID NO : 3。

ZFX-dir 5 -CACTTAATTAACTCATAGGCATCATGCATTTCTCAACTGTGGTTAAG(SEQ ID NO:4) ZFX-rev ^-TTAGGCGCGCCTCGCAAGCTGATACGAAAGGG(SEQ ID N0:5) 第一個正向PCR引子（ZFX-dir)包含24個核苷酸ZJW編 碼序列，起始於ATG起始密碼子，之後接著23個核苷酸序 列，包含有Pflcl限制酶位置(SEq ID N〇 : 4)。第二個反向 引子(ZFX-rev)含有ZFX編碼序列下游區塊之反向互補股核 苷酸，之後接有一hcl限制酶位置(SEq ID NO : 5)。使用 79 201000634 這些引子，我們可倍增1.9kb大小之片段，具有來自青黴菌 CBS 455.95之染色體DNA作為模板。因此獲得之i.9kb大小 片段係經單離，經pacl與AW切割與純化。包含ZFX編碼序 列之PacI/AscI片段，係與表現載體阳肝四^上之PacI/A5cI /7/〇；A片段交換(WO 99/32617)。所得質體為ZFX表現載體， 稱之為pGBFINZFX(請見第1圖），其中該ZFX基因係功能性 耦合至黑麴菌之glaA促進子。表現載體pGBFINZFX係藉由 切割而直線化，其移除所有表現載體上大腸桿菌衍生 序列。經切割之DNA係使用酚：氣仿：異戊醇萃取物（24 : 23 : 1)純化，並以乙醇沈澱。這些載體係用於使黑麴菌 CBS513.88轉型。黑麴菌轉型流程係廣泛描述於w〇 98/46772。亦描述如何於篩選洋菜培養基盤上，其含有乙 醯胺作為氮源，篩選轉型物，以篩選出標的多複製整合物。 較佳為，含有表現卡匣多複製版本之黑麴菌轉型物，係用 於篩選下一代之樣本材料。就pGBFINZFX表現載體而今， 30個黑麴菌轉型物係經純化；首先將個別轉型物塗佈於篩 選培養盤上，之後將單一選殖物塗佈於PDA(馬鈴薯葡萄醣 洋菜基：PDB+1.5%洋菜）盤上。各轉型物之孢子係於 培養1週後收集。孢子係冷凍儲存，並用於植入液體培養基中。 該黑麴菌轉型物殖株係用於產生樣本材料，藉由於搖 晃錐形瓶中培養該殖株之培養物而達成。可用於培養黑麴 菌殖株，並自培養液菌絲中分離出之方法係描述於 98M6772。培養基為CSM_MES(15〇g麥芽醣、6〇g 8〇^〇时 (Difco)^ 15g(NH4)2S04, ig NaH2P04H2〇'lg MgS04 7H2〇 . 201000634 lg L-精胺酸、80mg Tween-80、20g MES ρΗ6·2每升培養 液）。於發酵4-8天時，自二重複培養物中抽出5ml樣本，於 Hereaus labofuge RF，5000rpm離心1〇分鐘，懸浮液儲存於 -20°C，至進一步分析。 至此已相當清楚’含有pGBFINZFX載體之轉型物具有 令人驚訝的蛋白質有效分泌，其目視分子量約65kDa，當以 SDS-PAGE分析時。由於其等同於由ZFX蛋白質序列所預測 的’我們假設在移除訊號序列後，幾乎無醣化發生，當青 黴菌脯胺酸-專一性蛋白酶ZFX自黑麴菌分泌時。 篩選出之殖株可用於單離與純化較大量之青黴菌脯胺 酸-專一性蛋白酶，於發酵與下游製程放大時。此酵素之後 可用於其他分析中，並用於各種工業應用中。 範例2 基因ZFX編碼之酵素為脯胺酸_專一性蛋白酶

經選擇之黑麴菌（A. nigerj轉型物之發酵物係經回收， 經液體過渡，之後經0.22微米Millipore過濾器除菌後。澄清 之液體之後使用Pellicon高度過濾單元(Millipore, Bedford, MA，USA)濃縮。為了純化由基因ZFX編碼之酵素活性，濃 縮之液體之後係進行陰離子交換層析，使用Q_sepharoseFF XK(GE Healthcare Bio-Sciences, Diegem, Belgium)。最後， 經濃縮之液體係於20 mM檸檬酸鈉，pH 6.4中平衡，並加至 已經相同緩衝液平衡之管柱中。係以20倍管柱體積沖提， 使用線性梯度’自0至lmol/1 NaCl於施加緩衝液中。沖提分 液係進行SDS-PAGE分離並染色（請見材料&方法一節）。這 81 201000634 些分液顯示出一蛋白質帶，對應於分子量約65kDa，係經收 集、透析並再次進行相同層析與收集流程。所得之製備物 僅含有單一蛋白質帶，由SDS-PAGE與染色判定。 為了確認經純化蛋白質之蛋白質分解活性，遂與合成 之呈色胜肽Z-Ala-Ala-X-pNA(Z :苄基氧基羰基b ; Pna :對 -硝基苯胺；X :所有20個胺基酸殘基之任一者）一同靜置。 各受質首先係溶於DMSO中，之後稀釋至希望之濃度，約 為3毫莫耳/於〇.lmol/l醋酸鈉，pH 4.0，或O.lmol/1 tris-HCl 緩衝液，pH 7.0中。加入酵素後，該活性試驗遂於微滴定盤 上進行（MTP)，使用 TecanGeniosMTP讀取儀，以Magellan 軟體（Tecan，Salzburg, Vienna)進行。 依據所獲得之結果，僅有胜肽Z-Ala-Ala-Pro-pNA可有 效被切割，顯示於黑麴菌（A. 中過度表現之青黴菌衍 生ZFX酵素，的確是脯胺酸-專一性蛋白酶。其他酵素之鑑 定係使用胜肽Z-Ala-Ala-Pro-pNA，溶於Na-檸檬酸鹽 -MES、MES-NaOH與Tris-HCl緩衝液中，於37。(：靜置60分 鐘後’顯示出於約pH 4.5使用時’可呈現最佳之蛋白質分解 活性。 範例3 脯胺酸專一性蛋白酶ZFX具有最佳溫度約37。〇 為了測試青黴菌脯胺酸-專一性蛋白酶之最佳溫度， 過度表現之ZFX酵素’經範例2中之層析法純化，再次與胜 肽Z-Ala-Ala-Pro-pNA靜置。含有440微升之〇.im〇i/i擰檬酸 鈉，pH 5.0 ' 50微升之呈色胜肽，濃度為15毫莫耳/丨，以及 82 201000634 ίο微升之純化酵素溶液之反應混合物，係於不同溫度下靜 置70分鐘。之後該反應係以加入〇.5mi 2% (w/w)Tris溶液而 中止’測量405nm之光學密度’以定量在這些條件下之累積 酵素活性。所得之結果（請見第3圖）’清楚顯示於蛋白質水 解活性之最佳溫度約為37°C。 範例4 酵素ZFX在巴斯得滅菌法下完全失活 黑麴菌（A. n/ger)之脯胺酸-專一性蛋白酶之工業應用 之一為其用於預防啤酒中冷混濁物形成。在此應用中，酵 素會在啤酒滅菌時失活。就ZFX酵素之相對低最佳溫度而 言，我們試驗了酵素ZFX是否會在典型啤酒滅菌條件下存活。 並非使用啤酒，而是使用“重製，’啤酒於本試驗中。使 用此之理由為吾人觀察到由於Pr〇-pNA胜肽鍵成功切割所 造成之顏色變化，會受到啤酒之顏色干擾。因此，ZFX酵 素係以工業相關劑望谷於50宅莫耳/1醋酸納，pH 4·5之緩衝 液中’其含有5%乙醇。將此溶液置於一般啤酒滅菌處理， 於60 °C進行20分鐘，液體冷卻至37 °C。之後加入 Z-Ala-Ala-Pro-pNA胜肽，濃度3毫莫耳八，债測任何殘留之 脯胺酸-專一性蛋白質分解活性。即使在延長之靜置時間 後，OD 405並無增加，說明了青黴菌-衍生ZFX酵素係完全 失活，當施加巴斯得滅菌處理時。 【圖式簡單說明】 第1圖為用於選殖脯胺酸-專一性蛋白酶ZFX之策略。 第2圖為青黴菌CBS 455.95之染色體DNA片段序列，包 83 201000634 含編碼脯胺酸-專一性蛋白酶ZFX(SEQ ID NO : 1)之基因。 該編碼序列（SEQ ID NO : 2)係標記出，並指出其蛋白質序 列（SEQ ID NO : 3)。 第3圖顯示該經單離脯胺酸-專一性蛋白酶ZFX之最佳 溫度。 【主要元件符號說明】 (無） 84 序列表 <110> DSM IP ASSCTS B.V. <120>脯胺酸-專一性蛋白酶 <130> 26633-WO-PCI <160> 5 <]?0> Pateniln version 3.2

<210> 1 <211> 2180 <2]2> DNA <25 3>產黃青黴素 <40()> 1 cacaaacgca accatattgt icr.atcaia Ugtlcicgg ggtacati ta uaccccgat 60 ittgcatut cccagttgti acctaicict gtaatgcaia tataitccai aagagaccca 120 gcagtgagat aatccaaatc tgttctatat ccgtgtatcc taggcrgggg gutgagaga 180 ctgccaaggc actctcagta tgcatttctc aactgtggu aaggggatig caaccctgac 240

tgcgctgtcc ggtacagctg caggaatigt cacatcgcag itcaagcggg atctgaagct 30CJ ttccgctgag ctggggattc atccagatac ccigctcggt caaaagacca cggtgcatga 360 cgttaccaac tcccagcttg atgagaccat tgaggcagag tatgtttcgg tatgtgtcta 420 tgcttcccaa tgccgaagat ggtgataaat gctgacaatΐ tatagalccc aattgaccac 480 agcaactct ΐ cggttggcca ctatcggaac cgctat tggg tatccgaaga gcattacaag 540 gaggacggac cgatcttcgt gt i tgatgtg ggcgaatcaa ccgcggagcc tgcggggcaa 6D0 acctatctaa gcaattcgag cacgttcttt uccagttgg Uaaagagtt cggtggaatt 660 ggtatcgtit gggagcaccg gt ΐ tgtgtcc cctccccagt gaaagcccgg gctcaactaa 720 ccaaaaccag gtactatggg gattctcttc cctacaacgt cagcctggat atggagcctg 780 aacatctcca gtatctcaac aataagcagg ctctggcaga cataccatac tttgcggccc 840 aattcactcg ccaagattac agcgatgtgg acctgactcc agctggaaca ccatgggtca 900 tggtcggagg ctcgtacgct ggcatgcgcg cggcgtttac ccgtcaatcg tatcccgata 960 ctatttacgc tgctttcgct tcglccgccc ccgtcgaagc acgaatcgac atgagtgtct ]〇20 attttgacca ggtgtatgac ggcatggtta catatggaca ct tgaactgc accagggaca 1080 tcaaggccgc actggagtat atcgacgagc aactctccaa gagcgaatcg gccgcagcgg 1140 ccatcaagcg ggaattcttc ggtgaaggcg ccgaaaagaa cagcaacgga gat ttcaccg 1200 ccgcactcgt gacgatttac aactttttcc agtcttacgg iatgggaggt ggtgtgggca 1260 gcctggagic aticlgcgaa cacatggaga ccgacccgaa gactagcgca gcggcacccl 1320 ctgaaggatt cgctccgacc cgggggaaga agtatgicgc ggagcgatat gcgtcatggc 1380 cggttttcac acaggtagtc aatatgaata tgaagaccaa ctgcaaaaag cttgaaacca 1440 gcgaaccgci cgagtgcgat ctgggaccac catccgccaa tccagacacc atcagcigga 1500 catggcagta cigcactgaa tggggaiaci tccaaaccaa taacitcgga gctcactcgt 1560

Uctgtcaaa alaccagacc ctcgaatat^ cacaggaala ttgcaacaga ncttcccgg 1620 aggctgi tgc gaagggtcig nccccaaac acccgc'agac cgaggcgacc aatgcggaga 1680 ccggcggaig gtctattcgt ccgtccaacg ttiactggag cggcggccag tttgatccgt 1740 201000634 ggcggacttt gictcccctc gcggagacac ggttaggccc acagggtgtg actctgacga 1800 cagagatccc caastgcaat gtggagacgg aggaaaatac galcttcggc tacatcatgc 1860 agaaggcgga gcactgctu gatuccaca cggcctttgt acctggggcg att tctcggg 1920 gatattttca aacggcaltg aaagagtggc ttggalgt11 caaagccaag actcgttaaa 1980 cctlgacaaa tgttcaacgt tcaacggata tcgtgacica mtgaci tt ggat i ttctc 2040 cttttgacac tattcccctt icgtatcagc ttgcgatcci ccccgtctu ictcacgtgg 2100

I agctctaccg aggccgtgga catatagcai tctgtgaat t aaaattccat clcacatat t 2160 taaltgctcg ttttctttca 2180 <210> 2 <211> 1674 <212> DNA <2〗3>產黃青黴素 <220> <221> CDS <222> (1)..(]671) <400> 2 atg cat tic tea act gtg gt t aag ggg at t gca acc ctg act geg ctg 48

Met His Phe Ser Thr Val Val Lvs Gly I]e Ala Thr Leu Thr Ala Leu 1 5 10 15 tcc ggt aca gel gca gga att gtc aca teg cag ttc aag egg gat ctg 96

Ser G)y Thr Ala Ala G]y He Val Thr Ser Gin Phe Lys Arg Asp Leu 20 25 30 aag ct t tcc get gag ctg ggg at t cat cca gat acc ctg etc ggt caa 144

Lys Leu Ser Ala Glu Leu Gly lie His Pro Asp Thr Leu Leu Gly Gin 35 40 45 aag acc aeg gtg cat gac gtt acc aac tcc cag ett gat gag acc att 192

Lys Thr Thr Val His Asp Val Thr Asn Ser Gin Leu Asp δΐιι Thr lie 50 55 60 gag gca gag tat gtt teg ate cca att gac cac age aac tci teg gu 240

Glu Ala Glu Tyr Val Ser He Pro He Asp His Ser Asn Ser Ser Val 65 70 75 80 ggc cac tat egg aac ege tat tgg gia tcc gaa gag cat tac aag gag 288

Gly His Tyr Arg Asn Arg Tyr Trp Val Ser Glu Glu His Tyr Lys Glu 85 90 95 gac gga ccg ate ttc gtg ttt gat gtg ggc gaa tea acc geg gag eel 336

Asp Gly Pro He Phe Val Phe Asp Val Gly Glu Ser Thr Ala Glu Pro 100 105 110 geg ggg caa acc tat eta age aat teg age aeg ttc tit tac cag ttg 384

Ala Gly Gin Thr Tyr Leu Ser Asn Ser Ser Thr Phe Phe Tyr Gin Leu 115 120 125 gtt aaa gag ttc ggt gga att ggt ate gtt tgg gag cac egg tac tat 432

Val Lvs Glu Phe Gly Gly He Gly He Val Trp Glu His Arg Tyr Tyr 130 135 140 ggg gat let ett ccc tac aac gtc age ctg gal atg gag ect gaa cat 480 8ly Asp Ser Leu Pro Tyr Asn Val Ser Leu Asp Met Glu Pro Glu His 145 150 155 160 etc cag tat etc aac aat aag cag get ctg gca gac ala cca tac itt 528

Leu Gin Tyr Leu Asn Asn Lys Gin Ala Leu Ala Asp lie Pro Tyr Phe 165 170 175 geg gee caa uc aci ege caa gat tac age gat gtg gac ctg act cca 576 A]a Ala Gin Phe 丁hr Arg Gin Asp 丁yr Ser Asp Val Asp Leu Thr Pro 2 180 185 190 get gga aca cca tgg gtc atg gtc gga ggc leg tac get ggc atg ege 624

Ala Glv Thr Pro Trp Val Met Val Gly Gly Ser Tyr Ala Gly Met Arg 195 200 205 geg geg 111 acc cgt caa teg tat ccc gat act att tac get get ttc ()Ί2

Ala Ala Phe Thr Arg Gin Ser Tyr Pro Asp Tlir lie Tyr Ala Ala Phe 210 215 220 gel teg lee gee ccc gtc gaa gca ega ate gac atg agt gtc tat ttt 720

Ala Ser Ser X]a Pro Val Glu Ala Arg lie Asp Met Ser Val Tyr Phe 225 230 235 * 240 gac cag gtg tat gac ggc aig gtt A.sp G]n Val Tyr Asp Gly Met Val 245 oto.— 2G t Γ o 3 y 5 t Ti 2 Sr eh c n 3S Γ3 A s u t ε c Γ eh Γ3 丁 6 7 agg gac ate aag gee gca ctg gag tat ate gac gag caa etc tee aag 816

Ar^ Asp ile Lys Ala Ala Leu Glu Tyr He Asp Glu Gin Leu Sev Lys 260 265 270 age gaa teg gee gca geg gee ate aag egg gaa uc ttc ggt gaa g〇c 864

Ser Glu Ser Ala Ala Ala Ala Jle Lys Arg Glu Phe Phe Gly Glu Gly 275 280 285

IP C3 SJ oto A a y5 Ob 1 oy SG 2 c n 2 s 2 A c Γ oto c as c n 3 s 3 A 0» s ay a L a u o 3'I SG 2 c 2 n s A eh 3 丁

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Tyr Asn Phe Phe Gin Ser Tyr Gly Met Gly Gly Gly Val Gly Ser Leu 305 310 315 320 gag tea ttc tgc gaa cac atg gag acc gac ccg aag act age gca geg 1008

Glu Ser Phe Cys Glu His Met Glu Thr Asp Pro Lys Thr Ser Ala Ala 325 330 335 gca ccc tct gaa gga ttc get ccg acc egg ggg aag aag tat gtc geg 1056

Ala Pro Ser Glu Gly Phe Ala Pro Thr Arg Gly Lys Lys Tyr Val Ala 340 345 350 gag ega tat geg tea tgg ccg gtt tie aca cag gta gtc aat atg aat 1]〇4

Glu Arg Tyr Ala Ser Trp Pro Val Phe Thr Gin Val Val Asn Met Asn 355 360 365 atg aag acc aac tgc aaa aag ctt gaa acc age gaa ccg etc gag tgc 1152

Met Lys Thr Asn Cys Lys Lys Leu Glu Thr Ser Glu Pro Leu Glu Cys 370 375 380 gat ctg gga cca cca tee gee aat cca gac acc ate age tgg aca tgg 1200

Asp Leu Pro Pro Ser Ala Asn Pro Asp Thr lie Ser Trp 丁hr Trp 385 390 395 400 cag tac tgc act gaa tgg gga tac ttc caa acc aat aac ttc gga get 1248 G]n 丁yr Cys 丁hr δΐιι Trp Sly Tyr Phe Gin Thr Asn Asn Phe Gly A]a 405 410 415

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Thr Leu Ser Pro Leu Ala Glu Thr Arg Leu Gly Pro Gin Gly Val Thr 485 490 495 1536 1584 1632 1674 cig deg aca gag ate ccc aag tgc aat gtg gag aeg gag gaa aat aeg

Leu Thr Thr Glu lie Pro Lys Cys Asn Val Glu Thr Glu Glu Asn Thr 500 505 510 ate tie ggc tac ate atg cag aag geg gag cac tgc t ΐ i gat ttc cac lie Phe G1 v Tyr lie Met Gin Lys Ala Glu His Cys Phe Asp Phe His 515 520 525 aeg gee tit gta cct ggg geg ait tet egg gga lat tt t caa aeg gca

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Lea Lvs (ilu Trp Leu Gly Cys Phe Lys A】a Lys Thr Arg 545 550 555

<210> 3 <211> 557 <212> PRT <2]3>產黃青黴素 <4 ⑻> 3

Mel His Phe Ser Thr Val Va] Lys Gly lie Ala 丁h】· Leu Thr Aia Leu 1 5 10 15

Ser Gly Thr Ala Ala Gly I]e Va! 丁hr Ser Gin Phe Lys Arg Asp Leu 20 25 30

Lys Leu Ser Ala Glu Leu Gly He His Pro Asp Thr Leu Leu Gly Gin 35 40 45

Lys Thr Thr Val His Asp Val Thr Asn Ser Gin Leu Asp Glu Thr lie 50 55 60

Glu Ala Glu Tyr Val Ser lie Pro lie Asp His Ser Asn Ser Ser Val 65 70 75 80

Gly His Tyr Arg Asn Arg Tyr Trp Val Ser Glu Glu His Tyr Lys Glu 85 90 95

Asp Gly Pro lie Phe Val Phe Asp Val Gly Glu Ser Thr Ala Glu Pro 100 105 110

Ala Gly Gin Thr Tyr Leu Ser Asn Ser Ser Thr Phe Phe Tyr Gin Leu 115 120 125'

Val Lys Glu Phe Gly G】y lie Gly I]e Vai Trp Glu His Arg Tyr Tyr ]30 135 140

Gly Asp Ser Leu Pro 丁yr Asn Va’i Ser Leu Asp Met Glu Pro Glu His 145 150 155 160

Leu Gin 丁yr [,eu Asn Asn Lys Gin Ala Leu Ala Asp ]]e Pro Tyr Phe 165 170 ]75

Ala Ala Gin Phe llir Arg Gin A<p Tvv Ser Asp Val Asp Leu Tlir Pro 180 185 190 4 201000634

Ala Gly Trtr Pro Trp Va) Mel Val Gly Gly Ser Tyr A3a Gly Met Arg 195 200 205

Ala Ala Phe Tlir Arg Gin Ser Tyr Pro Asp Thr lie Tvr Ala Ala Phe 210 215 220

Ala Ser Ser Ala Pro Val Glu A]a Αγη lie Asp Met Ser Val Tyr Phe 225 230 235 240

Isp Gin Val Tyr Asp Gly Met Val Thr Tyr G]y His Leu A5n Cys 丁hr 245 250 255

Arg Asp lie Lys Ala Ala Leu Glu Tyr He Asp Glu Gin Leu Ser Lys 260 265 270

Ser Glu Ser Ala Ala Ala Ala lie Lys Arg Glu Phe Phe Gly Glu Gly 275 280 285

Ala Glu Lys Asn Ser Asn Gly Asp Phe Thr Ala Ala Leu Val Tlir lie 290 295 300

Tyr Asn Phe Phe Gin Ser Tyr Gly Mel Glv Gly Gly Va] Gly Ser Leu 305 310 315 320

Glu Ser Phe Cys Glu His Met Glu Thr Asp Pro Lys Thr Ser Ala Ala 325 330 335

Ala Pro Sev Glu Gly Phe Ala Pro Thr Arg Gly Lys Lys Tyr Val Ala 340 345 350

Glu Arg 丁yr Ala Ser Trp Pro Val Phe Thr G】n Val Val Asn Met Asn 355 360 365

Met Lys Thr Asn Cys Lys Lys Leu Glu Thr Ser Glu Pro Leu Glu Cys 370 375 380

Asp Leu Gly Pro Pro Ser Ala Asn Pro Asp Thr 】1e Ser Trp Thr Trp 385 390 395 400

Gin Tyr Cys 丁hr Glu Trp Gly 丁yr Phe Gin Thr Asn Asn Phe Gly Ala 40$ 410 415

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Thr Leu Ser Pro Leu Ala G]u Thr Arg Leu Gly Pro Gin Gly Val Thr 4S5 490 495 5 201000634

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Thr Ala Phe Val Pro Gly Ala He Ser Arg Gly Tyr Phe Gin Thr A]a 530 535 540

Leu Lvs G】u 丁rp Leu G】y Cys Phe Lys A]a Lys Thr Arg 545 550 555 <210〉 4

<211> 47 <212> DNA <2!3>人造序列 <220> <223>募核苔酸引子 <4〇0> 4 cacttaatta acicataggc aicatgcalt tctcaactgt ggttaag 47

<210> 5 <211> 32 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>募核苷酸引子 <400> 5 itaggcgcgc clcgcaagct galacgaaa〇 gg 32 6

Claims (1)

1. 201000634 七、申請專利範圍： 1 · 一種具有脯胺酸-專一，f生蛋白酶活性之多胜肽，其包含 如SEQ ID NO : 3所示之胺基酸序列，或由核苦酸序列 SEQIDNO : 1及/或SEQIDNO : 2編碼之胺基酸序列， 或其變異物，或任一者之片段。 2. 如申請專利範圍第1項之多胜肽，其與seQ ID NO : 3所 示之序列具有至少約60%、65%、70% ' 75%、80%、85%、 90%、95%、98%或99%之序列等同度。 3. 如申請專利範圍第1或2項之多胜肽片段，其長度為至少 約150個胺基酸。 4. 一種具有脯胺酸-專一性蛋白酶活性之多胜肽，包含一 如前述申請專利範圍任一項之多胜肽之功能性區塊。 5. —種聚核苷酸，其包含： ⑻如SEQ ID NO : 1及/或SEQ ID NO:2所示之核 苷酸序列； (b) —種核苷酸序列，其選擇性地可與作為SEq m NO : 1及/或SEQ ID NO : 2之反義互補股的聚核脊酸 雜交； (c) 一種核苷酸序列，具有與核苷酸序列SEq NO : 1及/或SEQ ID NO : 2至少約50%之序列等同声 (d) —種如（a)、（b)或(c)中所定義之核苷酸序列之片 段，具有至少約1〇〇個核苷酸； (e) —同義（degenerate)序列，其為如（a)、（b)、 (C) (d)中定義之序列之基因編碼結果；或 201000634 (f)一核苷酸序列，其為如（a)、（b)、（c)、（d)或⑹定 義之核苷酸序列之反義互補股。 6. 如申請專利範圍第5項之聚核苷酸，其可於高嚴謹度條 件下，與作為SEQ ID NO : 1及/或SEQ ID NO ·· 2之反義 互補股的聚核苷酸雜交。 7. —種聚核苦酸，其編碼一如申請專利範圍第1至4項任一 項之多胜肽。 8. 如前述申請專利範圍任一項之聚核苷酸，其為一DNA序列。 9. 如申請專利範圍第1至4項任一項之多胜肽，或如申請專 利範圍第5或8項任一項之聚核苷酸，可由真菌獲得。 10. 如申請專利範圍第9項之多胜肽或聚核苷酸，可由產黃 青徽菌（尸c/irpogenwm)獲得。 11. 一種載體，含有如申請專利範圍第5至10項任一項之聚 核苷酸序列。 12. 如申請專利範圍第11項之載體，其中該載體為一表現載 體，例如其中該聚核苷酸序列係可操作地與一調節序列 連結，使得該聚核苷酸序列可於細胞内表現。 13. 如申請專利範圍第12項之載體，其中該細胞為絲狀真菌 細胞。 14. 一種細胞，包含如申請專利範圍第1至4、9或10項任一 項之多胜肽、如申請專利範圍第5至10項任一項之聚核 苷酸，或如申請專利範圍第11至13項任一項之載體。 15. —種製備具有脯胺酸-專一性蛋白酶活性之多胜肽之方 法，該方法包含於可使該多胜肽表現之條件下培養如申 201000634 請專利範圍第12至14項任-項之細胞，以及， 地’回收該經表現之多胜肽。 16. -種乡胜肽’係由如巾料利範圍如項之方法獲^ 17. -種组成物，包含：⑴如申請專利範圍第…、 〇16項任—項之多胜肽’以及選擇性地，⑼-蛋白酶1〇 其不同於⑴之多胜肽。 軛 18·-種製備蛋自f水解物之方法，該方法包含將 受質與如申請專利範圍第⑴+喊响任貝 多胜肽，或如中請專利範圍第17項之組成物接觸。、之 19· 一種如申請專利範圍第1至4、9、1〇或16項任—項之夕 胜肽，或如中請專利範圍第17項之組成物，用於二 蛋白質水解物之用途。 20. -種蛋白質水解物，由如申請專利範圍第18項之方法卿 2L-種食物或飼料產品或飲料，其包含如申請專利範 ^第 20項之蛋白質水解物。 2 2. -種製備食物或飼料產品或飲料之方法，該方法包含在 製備该食物產品、飼料產品或飲料時加人如中請專利範 圍第1至4、9、1〇或16項任一項之多胜肽，或如申請專利 範圍第17項之組成物。 2 3.如申請專利範圍第2 2項之方法，其中該方法係用於預防 或降低飲料之混濁度。 2 4.如申請專利範圍第2 2或2 3項之方法’其中該所得之食物 或飼料產品實質上並不包含腹腔相關抗原表位（celiac related epitopes) ° 3 201000634 25. 26. 27. 一種如申請專利範圍第1至4、9、10或16項任—項之多 胜肽’或”請專利範圍第17項之組成物，用於製備: 物或飼料產品或飲料之用途。 種良物或飼料產品或飲料，由如申請專利範圍第μ項 之方法獲得。 、 —種如中請專利範圍第㈤⑼祕項任—項之多胜狀 用於治療或預防精神疾病或腹腔疾病相關之病症之用