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TW201009079A - Recombinant parainflulenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from metapneumovirus - Google Patents

Recombinant parainflulenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from metapneumovirus Download PDF

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TW201009079A
TW201009079A TW098137418A TW98137418A TW201009079A TW 201009079 A TW201009079 A TW 201009079A TW 098137418 A TW098137418 A TW 098137418A TW 98137418 A TW98137418 A TW 98137418A TW 201009079 A TW201009079 A TW 201009079A
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virus
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rsv
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piv3
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TW098137418A
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Aurelia Haller
Roderick Tang
Ronaldus Adrianus Maria Fouchier
Bernadetta Gerarda Van Den Hoogen
Albertus Dominicus Marcellinus Erasmus Osterhaus
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Medimmune Vaccines Inc
Vironovative Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27766025&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TW201009079(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Medimmune Vaccines Inc, Vironovative Bv filed Critical Medimmune Vaccines Inc
Publication of TW201009079A publication Critical patent/TW201009079A/zh
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Description

201009079 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於重组的副流感病毒（pIV) cDNA或RNA，其 可用來在適當的宿主細胞系統中表現異源基因產物，並/ 或解救表現、包裝及/或提交異源基因產物的負股RNA重 組病毒。特定而言’本發明包括疫苗製品，其包括表現異 源基因產物的嵌合型ρΙν，其中該異源基因產物最好是抗 原肽或多肽。在一個具體實施例中，本發明之ριν載體表 現一、二或三個異源基因產物，其可由相同或不同的病毒 編碼。在較佳的具體實施例中，該異源序列編碼異源基因 產物，其為得自其他PIV物種，或得自其他負股^^八病毒 的抗原多肽，包括但不限於流感病毒、呼吸道融合細胞病 毋（RSV)、哺乳動物間質肺病毒和禽肺病毒。本發明之疫 苗製品包括多價疫苗，包括二價和三價的疫苗製品。可以 一個表現每個異源抗原序列的PIV載體，或二或多個分別 編碼不同的異源抗原序列的PIV載體之形式，投予本發明 之多價疫苗。可單獨或與其他疫苗、預防劑或治療劑一起 投予本發明之疫苗製品。 【先前技術】 副流感病毒的感染，在嬰幼兒和兒童導致嚴重的呼吸道 疾病（Tao等人，1999，Vaccine 17:1100-08)。傳染性副流感 病毒的感染，佔全世界所有因為呼吸道感染而住院之小兒 科患者的大約20%。同上。對於治療pIV相關之疾病，沒 有可利用的有效抗病毒治療，亦尚未核准預防ριν感染的 144243.doc 201009079 疫苗。 PIV是副黏液病毒科（paramyxoviridae)之呼吸道病毒 (respirovirus)(PIV 1 ' PIV3)或路伯拉病毒（rubulavirus) (PIV2、I>IV4)屬的成員。PIV由兩個結構功能域（module)構 成：（1)内部的核糖核蛋白核心或殼包核酸，含有病毒的基 因組和（2)外部粗略為球狀的脂蛋白被膜。其基因組由單股 的反義RNA所組成，長度約為15,456個核苷酸，編碼至少8 個多肽。這些蛋白質包括殼包核酸的結構蛋白質（視屬而 為NP、NC或N)、磷蛋白（P)、基質蛋白質（M)、融合糖蛋 白（F)、血球凝集素-神經胺糖酸苷酶糖蛋白（HN)、大聚合 酶蛋白質（L)以及未知功能的C和D蛋白質。同上。 副流感殼包核酸蛋白質（NP、NC或N)，在每個蛋白質單 元内，含有兩個功能部位。這些功能部位包括：胺基-終 端的功能部位，其幾乎包括分子的三分之二，並直接與 RNA產生交互作用，以及羧基-終端功能部位，其位在裝 配好之殼包核酸的表面上。認為在這兩個功能部位的接合 處存有絞鏈，藉此給與該蛋白質一些彈性（參見Fields等人 (編輯），1991，FUNDAMENTAL VIROLOGY，第 2版，Raven Press, New York,將其全文以引用的方式併入本文中）。基 質蛋白質（M)顯然涉及病毒的裝配，且其與病毒膜和殼包 核酸蛋白質兩者產生交互作用。磷蛋白（P)經歷磷酸化作 用，並已經涉及轉錄調節作用、甲基化作用、磷酸化作用 和聚腺甞酸化作用。融合糖蛋白（F) —開始以無活性前驅 物的形式產生’在轉譯時將其切開，產生兩個二硫連接的 144243.doc 201009079 多肽。有活性的F蛋白質與病毒膜產生交互作用，在那裏 它藉著促進病毒被膜與宿主細胞漿膜的融合，而使副流感 病毒粒子更容易貫穿進入宿主細胞内。同上。糖蛋白，血 球凝集素-神經胺糖酸苷酶（HN)從被膜中伸出，並給與病 毒血球凝集素和神經胺糖酸苷酶活性。HN具有強忌水性 的胺基終端，其功能為將HN蛋白質固定在脂雙層内。同 上。最後，大聚合酶蛋白質（L)在轉錄和複製作用兩者中， 扮演重要的角色。同上。 牛流感病毒是在1959年，首先從顯示運輸熱症狀的小牛 中分離出。從那時起，已經從正常的牛、流產胎兒和顯露 呼吸疾病症狀的牛中分離出該病毒（Breker-Klassen等人， 1996，Can. J_ Vet. Res. 60:228-236。亦參見Shibuta, 1977, Microbiol. Immunol. 23(7), 617-628)。人類和牛PIV3共享中 和抗原決定位，但顯示出不同的抗原特性。在人類和牛病 毒品系之間，在HN蛋白質中存有顯著的差異。事實上， 牛品系對hPIV感染誘導一些中和抗體，而人類品系似乎對 人類PIV3誘導更大範圍的中和抗體（Van Wyke Coelingh等 人，1990, J. Virol. 64:3833-3843)。 所有負股RNA，包括PIV的複製，均由於缺少複製RNA 所需之細胞結構，而變得很複雜。此外，必須在發生轉譯 之前，將負股的基因組轉錄成正股（mRNA)副本。因此， 在進入細胞内時，單獨的基因組RNA不能合成所需的 RNA-依賴性RNA聚合酶。L、P和N蛋白質必須與基因組 RNA—起進入宿主細胞。 144243.doc 201009079 假設大多數或全部的病毒蛋白質，轉錄PIV mRNA亦進 行基因組的複製。尚未清楚地確認調節蛋白質之相同補體 另一種用途（即轉錄或複製作用）的機制，但該過程顯然涉 及增強一或多種殼包核酸蛋白質的自由形式。在病毒貫穿 之後，就藉由L蛋白質，使用在殼包核酸中的反義RNA作 為模板，開始轉錄作用。調節病毒的RNA合成，使得它在 轉錄期間，產生單順反子的mRNAs。 在轉錄之後，在被負股RNA病毒感染時，病毒基因組的 複製是第二個必要事件。像其他的負股RNA病毒一樣，在 PIV中，由病毒特有的蛋白質調解病毒基因組複製。複製 RNA合成的第一個產物是PIV基因組RNA的互補副本 (cRNA)(即正-極性）。這些正-股副本（反-基因組），在其終 端的結構上，是與正-股mRNA轉錄本不同的。不像mRNA 轉錄本，反-基因組cRNAs在5'端未被加帽或甲基化，且它 們在3'端沒有被截短也沒有被聚腺苷酸化。cRNAs與其負 股模板是同終端的，並以互補的形式含有所有的遺傳資 訊。cRNAs係擔任合成PIV負股病毒基因组（vRNAs)的模 板。 藉著殼包核酸將bPIV負股基因組（vRNAs)和反基因組 (cRNAs)殼體化；只有未殼體化的RNA物種是病毒的 mRNAs。bPIV RNA的複製和轉錄發生在宿主細胞的細胞 質中。病毒組份的裝配似乎發生在宿主細胞漿膜，在那裏 藉著出芽釋放成熟的病毒。 2.1.禽肺病毒 144243.doc 201009079 在1970年代末期，首先在南美描述了由禽肺病毒（APV) 引起的呼吸道疾病（Buys等人，1980, Turkey 28:36-46)，在 那裏它成為毁滅火雞工廠的原因。該疾病在火雞中的症 狀，包括竇炎和鼻炎。將該疾病稱為火雞鼻氣管炎 (TRT) 〇亦已經強烈地暗示，APV的歐洲分離株為雞的頭 腫徵候群（SHS)的原因（O’Brien，1985，Vet. Rec. 117:619-620)。最初，該疾病出現在已感染新城雞瘟病毒（NDV)的 肉雞群中，並以為是與新城雞瘟（ND)有關的二級問題。在 SHS發生後，在被感染的雞中檢測到對抗歐洲APV的抗體 (Cook等人，1988, Avian Pathol. 17:403-410)，因此暗示 APV 為致病原。 禽肺病毒是單股、非-片斷的RNA病毒，屬於副黏液病 毒科的肺病毒亞科（Pneumovirinae)，間質肺病毒屬 (Cavanagh和 Barrett，1988，Virus Res. 11:241-256; Ling等人， 1992, J. Gen. Virol. 73:1709-1715; Yu等人，1992，J· Gen. Virol. 73:1355-1363)。將副黏液病毒科分成兩個亞-科：副 黏液病毒亞科和肺病毒亞科。副黏液病毒亞科包括：副黏 液病毒屬、路伯拉病毒屬和摩比利病毒（Morbillivirus)屬。 最近，按基因順序和序列同種性，將肺病毒亞科分成兩 屬，即肺病毒和間質肺病毒（Naylor等人，1998，J. Gen. Virol., 79: 1393-1398; Pringle, 1998, Arch. Virol. 143:1449-1159)。肺病毒屬包括人類呼吸道融合細胞病毒（HRSV)、 牛呼吸道融合細胞病毒（BRSV)、羊呼吸道融合細胞病毒和 老鼠肺病毒。間質肺病毒包括歐洲禽肺病毒（A和B亞群）， 144243.doc 201009079 其與肺病毒屬的典型物種HRSV有別（Naylor等人，1998, J. Gen. Virol., 79: 1393-1398; Pringle, 1998, Arch. Virol. 143:1449-1159)。APV的美國分離株代表在間質肺病毒屬中 的第三個亞群（C亞群），因為已經發現它在抗原性上和遺 傳上，與歐洲分離株不同（Seal，1998, Virus Res. 58:45-52; Senne 等人，1998，在 Proc.第 47 次 WPDC，California，第 67-68頁中）。 負染色APV的電子顯微鏡檢查，顯示多晶的，有時球狀 的病毒粒子，直徑範圍從80至200毫微米，具有長度範圍 從 1000 至 2000毫微米的長絲（Collins 和Gough, 1988，J. Gen. Virol. 69:909-916)。被膜則由鑲有長度從13至15毫微米之 釘子的膜構成。殼包核酸是螺旋狀的，直徑為14毫微米， 高度為7毫微米。殼包核酸的直徑比來自副黏液病毒和摩 比利病毒之病毒的殼包核酸之直徑更小，後者的直徑通常 為18毫微米。 禽肺病毒感染，在美國是正在發生的疾病，不管在家禽 中，它的全世界發生已持續數年。在1996年5月，在科羅 拉多州出現火雞的高度傳染性呼吸道疾病，接著在Ames, Iowa 的國家獸醫服務實驗室（National Veterinary Services Laboratory (NVSL))中分離出 APV (Senne 等人，1997，Proc. 第134次Ann. Mtg.，AVMA，第190頁）。在此之前，已經認 為美國和加拿大是沒有禽肺病毒的（Pearson等人，1993，在 Newly Emerging and Re-emerging Avian Diseases: Applied Research and Practical Applications for Diagnosis and 144243.doc 201009079 C〇ntr〇1，第 78-83 頁中；Hecker和 Myers, 1993, Vet. Rec. 132:172)。在1997年早期，在明尼蘇達州，以血清學之方 式在火雞中檢測到APV。在那時，進行第—次證明診斷， 而APV感染亦已經散播至許多農場。與該呼吸道疾病有關 的臨床症狀’包括：多泡沫的眼睛、鼻分泌物和f腫服。 藉由二次感染使其惡化，而被感染鳥類的發病率已高達 100%。死亡率範圍從U9G%’ *最高較在6至12週齡的 禽肺病毒是藉著接觸傳播。鼻分泌物、被感染鳥類的移 動、被污染的水、被污染的環境、被污染的飼料卡車和裝 倒出的活動’都有助於病毒的散播。認為恢復的火雞 疋帶原者。因為顯示病毒感染產卵火雞的輸卵管上皮，並 因為已經在小鳥中檢測到APV’亦猜測印是傳播的方式。 2.2.人類間質肺病毒 大h的人類呼吸道疾病是由病毒亞科副黏液病毒亞科 和肺病毒亞科㈣起的’對於職保護、對抗各種導致呼 吸道感染之病毒的有效疫苗將仍有需求。 不應將在本文中引述或討論的參考文獻解釋為承認這類 參考文獻為本發明的先前技術。 【發明内容】 本發明係、關於重組的副流感病毒cDna和麵，可將 加以設計，以便表現異源的或非·天然的基因產物特 :言’表現抗原多肽和肽。在—個具體實施例中，本發 關於設計重組的牛或人類副流感病#，其表現異源 144243.doc 201009079 原’或異源抗原之免疫原及/或抗原片段。在特定的具體 實施例中，該異源基因產物是得自其他PIV物種或其他負 股RNA病毒的抗原多肽。在本發明的另一個具體實施例 中’異源基因產物是非-天然的ΡΙν基因產物，包括由突變 之PIV核苷酸序列編碼的那些。特定而言，本發明係關於 重組的堪薩斯（Kansas)-品系的牛副流感第3型病毒，將其 設計成表現編碼相同物的異源序列，以及cDNA和rna分 子。本發明亦關於重組的PIV，其含有修改，結果產生嵌 合型病毒，具有更適合用來作為疫苗調配物的表現型，以 及3有異源基因或異源基因之片段的重組ριν，包括其他 PIV物種、其他病毒、病原、細胞基因、腫瘤抗原等等的 基因。 本發明首次提供調配成疫苗的嵌合型PIV，它能夠賦與 對抗各種財錢的保護。在特定的具體實_巾，本發 =提供能夠賦與對抗啤吸魏合細胞病毒感染之保護的疫
田本發明首次提供了能夠賦與在哺乳動物宿主中，對抗 間質肺病毒感染之保護的疫苗。 二:：！明，重組的病毒係衍生自牛副流感病毒或人類 ““、母’其由内源或天然的基因組序 的基因組序列编樨招褚士找 ^非-天，、、、 發明，非_天然序列是因為一 # i重排、插入、刪除等 序列而: 的基因組序列不同的序列，對基因組 1Γ’可能或可能沒有導致表現型上的改變。 根據本發明’本發明之嵌合 口土两毋疋重組的bpiv或 144243.doc 201009079 hPIV，其更包括一或多個異源的核苷酸序列。根據本發 明，該嵌合型病毒可由其中已經將異源核苷酸序列加至基 因組内的核站酸序列’或其中已經利用異源核甞酸序列置 換的核甞酸序列編碼。 本發明亦關於設計重組的副流感病毒和病毒載體，其編 碼異源序列的組合，該異源序列所編碼之基因產物，包括 但不限於得自不同品系之PIV、流感病毒、呼吸道融合細 胞病毒、哺乳動物間質肺病毒（例如人類間質肺病毒）、禽 肺病毒、其他病毒、病原的基因、細胞基因、腫瘤抗原或 其組合。此外’本發明係關於設計重組的副流感病毒，其 含有與衍生自呼吸道融合細胞病秦之核苷酸序列組合的衍 生自間質肺病毒之核嘗酸序列，並進一步與衍生自人類副 流感病毒之核苷酸序列組合。本發明亦包括重組的副流感 載體和病毒’ 6¾计使其編碼得自副流感病毒之不同物種和 品系的基因，包括人類卩1乂3的？和11>1基因。 在一個具體實施例中，設計本發明之PIV載體，以便表 現一或多個異源序列，其中該異源序列所編碼之基因產 物，最好是抗原之基因產物。在較佳的具體實施例中本 發明之PIV載體表現一、二或三個異源序列，其編碼抗原 多肽和肽。在某些具體實施例中，該異源序列係衍生自相 同的病毒或不同的病毒。在較佳的具體實施例中，該異源 序列編碼異源基因產物，其為得自其他ριν物種，像是人 類PIV、PIV之突變品系，或得自其他負股RNA病毒，包括 但不限於流感病毒、呼吸道融合細胞病毒（RSV)、哺乳動 144243.doc 12 201009079 物間質肺病毒（例如人類間質肺病毒（hMPV))和禽肺病毒的 抗原多肤。在一個具體實施例中，該異源序列編碼異源基 因產物的免疫原及/或抗原片段。在較佳的具體實施例 中’該重組的PIV為牛PIV第3型或減毒的人類PIV第3型。 在一個具體實施例中，刪除編碼融合（F)蛋白質、血球凝 集素（HN)糖蛋白或ριν基因組之其他非-必要基因的序列， 並藉著異源抗原序列取代之。在另-個錢實施例中，除 了異源核苷酸序列之外，還有含有突變或修改的PIV基因 組’結果產生具有更適合在疫苗調配物中使用之表現型的 敌口里病毒’例如減毒的表現型或具有增強抗原性的表現 —在特定的具體實施例中，待插入Piv基因組内的異源核 苷酸序列，係衍生自編碼1?蛋白質、G蛋白質或取蛋白質 的核芬酸序列。在某些具體實施例中，待插入之核芬酸序 列編碼歲合型F蛋白質、嵌合型G蛋白質或嵌合型_蛋白 φ ^在特定的具體實施例中’ F蛋白f包括間質肺病毒之F 白質的外功能部位（eet〇d〇main)、副流感病毒之F蛋 的穿透膜功能部位和副流感病毒 AK h 皮曰買的魯米那功能 〇 。在某些具體實施例中，待插入
蛋白質，其中刪除該F蛋白質 核錢序列編碼F 表現可溶的⑼白質。#之穿透媒功能部位，而得以 在其他特定的具體實施例中，本 組的歲人“直— 赞月k供包括PIV基因 的嵌口型病毒，该PIV基因組包括衍 異源核苷酸庠刻* — 門質肺病毋的 酸序列在料的具體實施例t，該PIV病毒是 144243.doc 201009079 堪薩斯-品系的牛副流感第3型病毒。在其他的具體實施例 中’該PIV病毒是具有減毒之表現型的人類副流感病毒。 在其他的具體實施例中，本發明提供嵌合型牛副流感病毒 第3型/人類副流感病毒，設計使其在牛副流感主鏈中，含 有人類副流感病毒F和HN基因。該故合型病毒可進一步包 括衍生自間質肺病毒的異源核:y：酸序列，及/或進一步包 括衍生自呼吸道融合細胞病毒的異源核甞酸序列。 在某些具體實施例中’本發明之病毒包括衍生自間質肺 病毒之至少兩個不同基因的異源核苷酸序列。在特定的具 ⑩ 體實施例中’該異源序列係衍生自間質肺病毒，例如禽肺 病毒和人類間質肺病毒。更特定而言，該異源序列係衍生 自禽肺病毒’包括禽肺病毒A型、禽肺病毒b型和禽肺病 毒C型。 本發明亦提供包括表現一或多個異源抗原序列之嵌合型 PIV的疫苗製品和免疫原組合物。在特定的具體實施例 中，本發明提供多價疫苗，包括二價和三價的疫苗。本發 明之多價疫苗可以一個表現每個異源抗原序列的ριν載❹ 體’或以二或多個分別編碼不同異源抗原序列的PIV載體 之形式投予。在一個具體實施例中，本發明之疫苗製品包 括肷口型PIV ’表現一、二或三個異源多肽，其中該異源 多肽可由衍生自相同病毒的一個品系、相同病毒的不同品 系，或不同病毒的序列編碼。該異源抗原序列最好是衍生 自負股RNA病毒’包括但不限於流感病毒、副流感病毒、 呼吸道融合細胞病毒（Rsv)、哺乳動物間質肺病毒（例如人 144243.doc -14- 201009079 類間質肺病毒（hMPV))和禽肺病毒（Apv)。該異源抗原序 列包括，但不限於編碼人類副流感病毒f或蛋白質、 RSV之F蛋白質、流感病毒A、^c型的蛋白質以及人 類MPV和禽肺病毒之F蛋白質的序列。更佳的是，本發明 之疫苗製品包括ί咸毒的欲合型病#，其為可存活並有傳染 I·生的在較佳的具體實施例中，重組的ΡΙV為牛ΡΙV第3型 或人類PIV的減毒品系。 纟一個具體實施例中’疫苗製品包括本發明之嵌合型病 毒，其中已經取代或刪除PIV基因組之F、HN或一些其他 非必要的基因。在較佳的具體實施例中，藉著設計在想要 之宿主中，具有減毒表現型的PIV品系，來製備本發明之 疫备製im在其他較佳的具體實施例中，藉著設計pIV的 減毒系，來製備本發明之疫苗製品。 在另一個具體實施例中，將異源核荅酸序列加至完整的 PIV基因組中。在某些具體實施例中，設計基因組，以 籲便在位置1、2、3、4、5或6處，插入該異源序列，而得以 病毒基因組的第1、2、3、4、5或6個基因，來表現該異源 序列。在特定的具體實施例申，在病毒基因組的位置〗、2 或3處插入異源序列。在某些具體實施例中，將在被插入 之異源基因的密碼序列末端，與下游基因之密碼序列的起 點之間的基因間區域，變更為想要的長度，結果提高了該 異源序列的表現，或促進該嵌合型病毒的生長。或者，將 基因間區域變更為想要的長度，有可能改變該異源序列的 表現，或重組的或嵌合型病毒，例如減毒之表現型的生 144243.doc 15 201009079 長。在一些具體實施例中’設計插入的位置和位在該異源 核甞酸序列側面之基因間區域的長度兩者，以便選擇具有 想要程度之異源序列表現，和想要之病毒生長特徵的重組 或嵌合型病毒。 在某些具體實施例中，本發明提供包括本發明之重組或 嵌合型病毒，以及在醫藥上可接受之賦形劑的疫苗調配 物。在特定的具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物， 來調節諸如人類、靈長類、馬、牛、綿羊、豬、山羊、 狗、貓、嚅齒動物之類的個體，或禽類個體的免疫反應。 在更特定的具體實施例中，使用疫苗來調節人類嬰幼兒或 兒童的免疫反應。在其他的具體實施例中，本發明係關於 獸醫用途的疫苗調配物。可單獨或與其他疫苗，或其他的 預防或治療劑，一起投予本發明之疫苗調配物。 3 · 1.慣例和縮寫 cDNA CPE L Μ F ΗΝ 互補DNA 致細胞病變作用 大蛋白質 基質蛋白質（被膜的線内） 融合糖蛋白 血球凝集素-神經胺糖酸:y：酶糖蛋白 N、NP或NC核蛋白（與RNA有關，並為聚合酶活性所 必需的） P 磷蛋白 MOI 傳染的多重性 144243.doc -16- 201009079
神經胺糖酸苷酶（被膜糖蛋白） 副流感病毒 牛δ1]流感病毒 牛副流感病毒第3型 人類副流感病毒 人類副流感病毒第3型 重組的bPIV，具有hPIV序列 b/h PIV
b/hPIV3或 重組的bPIV第3型，具有hPIV第3型的序列 bPIV3/hPIV3 nt 核甞酸 RNP 核糖核蛋白
rRNP 重組的RNP
vRNA 基因組病毒RNA
cRNA 反基因組的病毒RNA
ΝΑ PIV bPIV bPIV3 hPIV hPIV3 bPIV/hPIV 或 hMPV 人類間質肺病毒 APV 禽肺病毒 位置 當設計任何病毒而使用位置時，意指欲轉 錄之病毒基因組的基因位置。例如，若基因 位在位置1，則它便是欲轉錄之病毒基因 組的第一個基因，若基因位在位置2，則 它便是欲轉錄之病毒基因組的第二個基 因。 bPIV3、b/h 基因組的核苷酸位置104，或者是欲轉錄 144243.doc •17· 201009079 PIV3及其衍生 物的位置1 bPIV3、b/h PIV3及其衍 生物的位置2 bPIV3 > b/h PIV3及其衍 生物的位置3 bPIV3 ' b/h PIV3及其衍 生物的位置4 bPIV3、b/h PIV3及其衍 生物的位置5 bPIV3 ' b/h PIV3及其衍 生物的位置6 【實施方式】 本發明係關 之病毒基因組的第一個基因位置。 基因組的核甞酸位置1774，或者是在天然副 流感病毒的第一和第二個開放編閱架構之 間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組的 第二個基因位置。 基因組的核苷酸位置3724，或者是在天然 副流感病毒的第二和第三個開放編閱架構 之間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組 的第三個基因位置。 基因組的核苷酸位置5042，或者是在天然 副流感病毒的第三和第四個開放編閱架構 之間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組 的第四個基因位置。 基因組的核甞酸位置6790，或者是在天然 副流感病毒的第四和第五個開放編閱架構 之間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組 的第五個基因位置。 基因組的核苷酸位置863 1，或者是在天然 副流感病毒的第五和第六個開放編閱架構 之間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組 的第六個基因位置。 於重組的副流感cDNA和RNA構築體，包括 144243.doc -18- 201009079 但不限於重組的牛和人類PIVcDNA和RNA構築體，其可用 來表現異源或非-天然的序列。 根據本發明’重組的騎是射自由内源或天絲因組 序列或非-天然基因組序列編碼之牛副流感病毒或人類 副流感病毒的病毒。根據本發明，非_天然的序列是因為 p或多個突變，包括但不限於點突變、重排、插入、刪除 4 4而與天然或内源之基因组序列不同的序列，對基因 ^ 組序列而言，可能或可能沒有導致表現型上的改變。 根據本發明，本發明之嵌合型病毒是重組的bPIV或 hPIV，其進一步包括一或多個異源核苷酸序列。根據本發 明，該嵌合型病毒可由其中已經在基因組中加入異源核甞 酸序列的核甞酸序列，或其中已經利用異源核甞酸序列代 替之核芬酸序列來編碼。可使用這些重組的和喪合型病 毒，以及表現產物，作為適合投予人類或動物的疫苗。例 如，可在疫苗調配物中使用本發明之嵌合型病毒，賦與對 馨 抗肺病毒、呼吸道融合細胞病毒、副流感病毒或流感病毒 感染的保護。 在一個具體實施例中’本發明係關於PIV cDna和RNA構 築趙’其衍生自人類或牛ριν變種，並將其設計成表現 一、二或三個異源序列，最好是編碼外來抗原和得自各種 病原、細胞基因 '腫瘤抗原和病毒之其他產物的異源基 因。特定而言’該異源序列衍生自負股RNA病毒，包括但 不限於流感病毒、呼吸道融合細胞病毒（RSV)、哺乳動物 間質肺病毒（例如人類間質肺病毒變種Al、A2 ' B1和 144243.doc -19· 201009079 B2)，以及禽肺病毒亞組A、B、C和D。在本發明其他的具 體實施例中’该異源序列是非-天然的PIV序列，包括突變 的PIV序列。在一些具體實施例中，該異源序列係衍生自 相同，或衍生自不同的病毒。 在特疋的具體實施例中’本發明之病毒是重組的Piv， 包括衍生自人類間質肺病毒或禽肺病毒的異源核苷酸序 列。待插入PIV基因組内的異源序列，包括但不限於編碼 人類間質肺病毒Al、A2、B1或B2之F、G和HN基因的序 列，編碼禽肺病毒A、B或C型之F、G和HN基因的序列，© 以及其免疫原及/或抗原片段。
在某些具體實施例中，將異源核菩酸序列加至病毒基g 組内。在另外的具體實施例中，以異源核甞酸序列交換户 源的核嘗酸序列。可將異源核驻酸序列加至或插入ριν| 因組的各種位置，例如在位置i、2、3、4、5或6處。在举 佳的具體實施例中，在位L處加入或插入異源核誓酸力 列。在另一個較佳的具體實施例中，在位置2處加入或襄 入異源核苷酸序列。在另一個較佳的具體實施例中，在七 置3處加人或插人異源料酸序列。在病毒之較低編號会 位置處插入或加入異源核甞酸序列，與在較高編號的位3 處插入相比較，產生較強的異源料酸序列表現m 為跨越病毒基因組存在的轉錄梯度n亦必須考量男 毒複製的效率。例如，在本發明之b/h_合型病, 中’在位置1處插入異源基因，在活體外延遲了複製動y 學，而在活體内亦達到較低的程度（參見第8節，實例3禾 144243.doc -20· 201009079 圖5 ’以及第26節’實例21)。因此，若需^異源核誓酸序 列的強表J見，則在較低編號的位置處插入異源核芬酸序 歹J疋本發明較佳的具體實施例。若需要異源序列的強表 現，最好是將異源序列插入b/h piV3基因組的位置2處（參 見下文第4.1.2_節和第8節，實例3)。 在一些其他的具體實施例中，設計重組或嵌合型ριν基 因組，而得以改變在異源基因之密碼序列末端，和下游基 ❿目之密碼序列起點之間的基因間區域。在另外—些其他的 具體實施例中’本發明之病毒包括重組或嵌合型潰基因 組，設計使其得以在選自由位置1、2、3、4、5和6所組成 之群的位置處插入異源核菩酉复序列，並改變在該異源核菩 酸序列與接下來的下游基因之間的基因間區域。可使用適 當的測定，判定最佳的插入方式（即插入那一個位置，以 2基因間區域的長度），達到適當程度的基因表現，和病 毋生長特徵。關於細節，參見下文第4· 1.2.節。 • 在某些具體實施例中，本發明之嵌合型病毒含有兩個不 同的異源核:y：酸序列。可在PIV基因組的各種位置，插入 不同的異源核苷酸序列。在較佳的具體實施例中，在位置 1處插入一個異源核甞酸序列，並在位置2或3處，加入或 插入另一個異源核苷酸序列。在本發明其他的具體實施例 中，將額外的異源核誃酸序列插入PIV基因組之較高編號 的位置處。根據本發明，異源序列的位置意指從病毒基因 組中轉譯序列的順序，例如在位置1處的異源序列，是欲 從基因組中轉錄的第一個基因序列。 144243.doc -21 · 201009079 在本發明的某些具體實施例中，欲插入本發明病毒之基 因組内的異源核菩酸序列’係衍生自負股讓病毒，包括 但不限於流感病毒、副流感病毒、呼吸道融合細胞病毒、 #^^&@胃#病毒和禽肺病毒。在本發明的特定具體實 施例中，該異源核替酸序列係衍生自人類間質肺病毒。在 另個特疋的具體實施例中，該異源核贫酸序列係衍生自 禽肺病毒。更特定而言’本發明之異源核芬酸序列，編碼 人類或禽間質肺病毒的F、〇或SH基因，或其一部分。在 特定的具體實施例中，該異源核答酸序列可以是序列識別❿ 號至序歹J識別5號、序列識別j 4號和序列識別j 5號（參見 表16)中的任一個。在某些特定的具體實施例中，該核苷 酸序列編碼序列識別6號至序列識別13號、序列識別16號 =序列識別17號（參見表16)中任一個的蛋白質。在某些特 疋的具體實施例中，該核菩酸序列編碼序列識別至⑽ 號中任一個的蛋白質。 在本發明特定的具體實施例中，本發明之異源核芬酸序 列係衍生自A型禽肺㈣。在本發明其㈣定的具體實施© 例中，本發明之異源核#酸序列係衍生自Β型&肺病毒。 在本發明其他特定的具體實施例中’本發明之異源核芬酸 序列係衍生自C型禽肺病毒。系統發生分析顯示，a型和B 型彼此的相關纟，比它們對c型的更密切（㈤，2咖， Ammal Health Res. Rev, i⑴:67_72)。在歐洲發現a型和 b 型，而C型則首先在美國發現。 在本發明另一個具體實施例中，該異源核芬酸序列編碼 144243.doc -22- 201009079 嵌合型多肤，其中外功能部位含有衍生自與從其中衍生載 體主鏈之PIV品系不同的病毒之抗原序列，以及衍生自PIV 序列的穿透膜和魯米那功能部位。所得的欲合型病毒，將 給與所選出之負股RNA病毒抗原性，並將具有減毒的表現 型。 在本發明特定的具體實施例中，該異源Π酸序列編碼 嵌合型F蛋白質。特定而言，該嵌合型f蛋白質的外功能部 籲纟是間質肺病毒的外功能部位’像是人類間質肺病毒或禽 肺病毒，而穿透膜功能部位和魯米那功能部位是副流感病 毒的穿透膜和魯米那功能部位，像是人類或牛副流感病 毒。未與任何理論結合，嵌合型？蛋白質的插入，可進一 步在預定的宿主中將病毒減毒，但保留藉其外功能部位減 毒之F蛋白質的抗原性。 可在疫苗調配物中，使用本發明之嵌合型病毒，賦盥對 抗各種感染的保護，包括但不限於肺病毒感染、呼吸道融 ❹纟細胞病毒感染、副流感病毒感染、流感病毒感染或其組 合。本發明提供包括嵌合型PIV的疫苗製品，其表現一或 多個異源抗原序列，包括二價和三價的疫苗。可以一個表 現每個異源抗原序列的PIV載體，或二或多個分別編碼不 同的異源抗原序列的PIV載體之形式，投予本發明之二價 和三價疫苗。該異源抗原序列最好是衍生自負股祖病 毒’包括但不限於流感病毒、副流感病毒、呼吸道融合細 胞病毒（RSV)、哺乳動物間質肺病毒（例 毒)和禽肺病毒。因此，可設計本發明之嵌== 144243.doc -23- 201009079 子，創造例如抗-人類流感疫苗、抗-人類副流感疫苗、抗_ 人類RSV疫苗和抗-人類間質肺病毒疫苗。本發明之疫苗製 品最好包括減毒的嵌合型病毒，其為可存活並有傳染力 的。可單獨或與其他疫苗，或其他預防劑或治療劑一起投 予本發明之疫苗製品。 本發明亦關於病毒載體和嵌合型病毒，在調配對抗大範 圍病毒及/或抗原，包括腫瘤抗原之疫苗上的用途。可使 用本發明之病毒載體和嵌合型病毒，藉著刺激體液免疫反 應、細胞免疫反應，或藉著刺激對抗原之耐受性，來調節 _ 個體的免疫反應。當在本文中使用時，個體意指人類、靈 長類、馬、牛、綿羊、豬、山羊、狗、描、嚷齒動物和禽 類的成員。在遞送腫瘤抗原時，可使用本發明來治療罹患 順從調解排斥之免疫反應的疾病，像是非-固體腫瘤，或 小尺寸之固體腫瘤的個體。亦企圖藉著在本文中描述的病 毒載體和嵌合型病毒，來遞送腫瘤抗原，這將可用於移除 大固體腫瘤之後的後續治療。亦可使用本發明來治療懷疑 患有癌症的個體。 @ 為了解釋之目的，並非企圖加以限制，僅將本發明分成 下列的階段：（a)建構重組的cDNA* RNA模板；（b)使用重 組的cDNA和RAN模板表現異源基因產物並（c)在重組的病 毒顆粒中，解救該異源基因。
4.1 ·建構重組的cDNA和RNA 本發月包括由衍生自副流感病毒，包括牛副流感病毒和 嘴乳動物副流感病毒之基因組的病毒載體編碼的重組或嵌 144243.doc •24· 201009079 =型病母。根據本發明，重組病毒是衍生自牛副流感病毒 或哺礼動物副流感病毒的病毒，其係由内源或天然的基因 組序列或非·天然的基因組序列編碼。根據本發明，非·天 然的序列是因為-或多個突變，包括但不限於點突變、重 排、插入、刪除等等，而與天然或内源之基因組序列不同 的序列，對基因组序列而言，可能或可能沒有導致表現型 的改變。本發明之重組病毒包括由衍生自副流感病毒， 鲁 &括牛和哺乳動物副流感病毒之基因組的病毒載體編碼的 那些病毒，可能或可能沒有包括對該病毒基因組而言’為 非·天然的核酸。根據本發明，衍生自副流感病毒之基因 、-且的病毒載體，含有編碼至少一部分副流感病毒的一個 ORF之核酸序列。 根據本發明，本發明之病毒載體係衍生自哺乳動物副流 感病毒的基因組，特別是人類副流感病毒（hpiv)〇在本發 明=定的具體實施例中，該病毒載體係衍生自人類副流感 〇 病毒第3型的基因組。根據本發明，這些病毒載體可以或 可以不包含對該病毒基因組而t，為非_天然之核酸。 根據本發明，本發明之病毒載體係衍生自牛副流感病毒 (bPIV)之基因組。在本發明特定的具體實施例中，該病毒 載體係何生自牛副流感病毒第3型的基因組。根據本發 :’廷些病毒載體可以或可以不包含對該病毒基因組而 言’為非-天然之核酸。 根據本發明，嵌合型病毒為重組或其進一步 包括異源核菩酸序列。根據本發明，該嵌合型病毒可由其 144243.doc -25. 201009079 中已經將異源核苷酸序列加至基因組中的核苷酸序列，或 其中已經利用異源核苷酸序列代替的内源或天然核苷酸序 列編碼。根據本發明，該嵌合型病毒係由本發明之病毒載 體編碼，其進一步包括異源核甞酸序列。根據本發明，該 嵌合型病毒係由可以或可以不含對該病毒基因組而言，為 非-天然之核酸的病毒載體編碼。根據本發明，該嵌合型 病毒係由其中已經加入、插入或取代天然或非-天然序列 之異源核甞酸序列的病毒載體編碼。 嵌合型病毒對於產製可保護對抗二或多種病毒的重組疫 苗，具有特殊的用途（Tao等人，J. Virol. 72，2955-2961; Durbin等人，2000，J. Virol. 74, 6821-6831; Skiadopoulos等 人，1998, J. Virol· 72, 1762-1768 (1998); Teng等人，2000，殳 Virol. 74，9317-9321)。例如，可想像hPIV或bPIV病毒載體 表現一或多個其他負股RNA病毒，例如MPV的蛋白質或 RSV載體表現一或多個MPV的蛋白質，將可保護接種這類 疫苗的個體對抗兩種病毒感染。可對其他的副黏液病毒， 想像類似的方法。為了以活毒疫苗接種疫苗之目的，減毒 和複製缺陷的病毒可能是有用的，如同已經針對其他病毒 所討論的（參見PCT WO 02/057302，在第6和23頁，以引用 的方式併入本文中）。 根據本發明，欲併入編碼本發明之重組或嵌合型病毒之 病毒載體内的異源或非-天然序列，包括獲自或衍生自不 同的間質肺病毒品系、禽病毒品系，以及其他負股RNA病 毒，包括但不限於RSV、PIV、流感病毒，及其他病毒， 144243.doc -26- 201009079 包括摩比利病毒的序列。 ::::的某些具體實施例中，本發明之嵌合型或重組 令丁生自病毒基因組的病毒載體編碼， 經 :異源或非-天然之相，取代-或多個序列、基因間區 域、終端序列或-部分或整個⑽卜在本發明的某些呈體 實施例中，本發明之嵌人 柯月之嵌。型病|係的生自病毒基因組的 病毒載體編碼，盆φ p么·^收 lj A.. WT已經將-或多個|源序列加至該載體 内。
本發明特定的具體實施例是嵌合型病毒，包括由衍生自 副流感病毒基因組之核菩酸序列編碼的主冑。在較佳的具 體實施例中，該PIV基因組係衍生自牛Μ，像是^㈣ 堪薩斯品系或衍生自人類p…在較佳的具體實施例中， 該PIV基因組係衍生自bPIV3的堪薩斯品系，其中已經利用 異源序列取代牛副流感病毒核菩酸序列，或其中已經將異 源序列加至完整的bpIV基因組中。本發明更進一步的特2 具體實施例為嵌合型病毒，包括由衍生自人類副流感病毒 第3型基因組之核甞酸序列編碼的主鏈，其中已經利用異 源序列取代人類副流感病毒核:y：酸序列，或其中已經將異 源序列加至完整的hPIV基因組中。本發明額外特定的具體 實施例為嵌合型病毒，包括由衍生自牛副流感病毒基因組 之核苷酸序列編碼的主鏈’像是bPlV3的堪薩斯品系，其 中（a)已經利用人類副流感病毒之f基因和HN基因取代牛副 流感病毒F基因和HN基因（bPIV/hPIV)，且其中（b)已經將異 源序列加至完整的bPIV基因組中。 -27- 144243.doc 201009079 本發明亦包括嵌合型病毒，其包括由衍生自bPIV、hPIV 或bPIV/hPIV基因組之核甞酸序列編碼的主鏈，除了異源 序列之外尚含有突變或修改，結果使該嵌合型病毒具有更 合適在疫苗調配時使用的表現型，例如減毒的表現型或增 強的抗原性。根據本發明該特定的具體實施例，在牛PIV3 主鏈前後的異源序列，可以是對bPIV3而言為異源的任何 序列。 本發明其他特定的具體實施例是嵌合型病毒，包括由衍 生自人類PIV1、2或3之核苷酸序列編碼的主鏈，其中已經 利用異源序列取代hPIV核甞酸序列，或其中已經將異源序 列加至完整的hPIV基因組中，其限制條件為所得的嵌合型 病毒，不是其中血球凝集素·神經胺糖酸苷酶和融合糖蛋 白已經被hPIVl的那些取代的嵌合型hPIV3。本發明亦包括 嵌合型病毒，其包括由衍生自hPIV基因組之核苷酸序列編 碼的主鏈，除了異源序列之外尚含有突變或修改，結果使 該嵌合型病毒具有更合適在疫苗調配時使用的表現型，例 如減毒的表現型或增強的抗原性。 可使用此項技藝中已知的技術，建構位在病毒聚合酶結 合位置/啟動基因之互補物，例如本發明之3'-PIV病毒終端 的互補物，或3'-和5'-PIV病毒兩端之互補物側面的異源基 因密碼序列。所得的RNA模板可能具有負-極性，並可含 有適當的終端序列，使病毒RNA-合成裝置能夠認出該模 板。或者，亦可使用正-極性的RNA模板，其含有適當的 終端序列，使病毒RNA-合成裝置能夠認出該模板。可選 144243.doc •28- 201009079 殖含有這些雜種序列的重組DNA分子，並藉著DNA_指揮 之RNA聚合酶，像是噬菌體T7聚合酶、T3聚合酶、sp6聚 合酶或真核生物聚合酶，像是聚合酶〗及其類似物轉錄， 以便在活體外或在活體内產製具有適當之病毒序列，並給 予病毒聚合酶認知和活性的重組RNA模板。 在一個具體實施例中，本發明之ριν載體表現一、二或 三個編碼抗原多肽和肽的異源序列。在一些具體實施例 ❹ 中，該異源序列係衍生自相同病毒或衍生自不同病毒。在 某些具體實施例中，將一個以上相同異源核苷酸序列的副 本，插入牛副流感病毒、人類副流感病毒或bPIV/hPIV嵌 合型載體的基因組中。在較佳的具體實施例中，將兩個相 同異源核苷酸序列的副本，插入本發明之病毒的基因組 中在一些具體實施例中，該異源核：y：酸序列係衍生自間 質肺病毒，像是人類間質肺病毒或禽肺病毒。在特定的具 體實施例中，衍生自間質肺病毒之異源核苷酸序列是間質 φ 肺病毋的F基因。在其他特定的具體實施例中，衍生自間 質肺病毒之異源核苷酸序列是間質肺病毒的G基因。在一 了其他的具體實施例中，該異源核苷酸序列係衍生自呼吸 道融合細胞病毒。在特定的具體實施例中，衍生自呼吸道 融合細胞病毒之異源核苷酸序列是呼吸道融合細胞病毒的 ^ 其他特定的具體實施例中，衍生自呼吸道融合 細胞病毒之g 異源核善酸序列是呼吸道融合細胞病毒的G基 因。當4番入 —或多個異源核苷酸序列時，可操縱每個被插 入之副本^^ 播入位置和基因間區域之長度，並藉著根據下 H4243.doc -29- 201009079 文第4.1.2.節的不同測定來判定之。 在某些具體實施例中，可藉著逆向遺傳學，在其中利用 嵌合型cDNA或RNA構築體轉移感染的宿主細胞中，達成 嵌合型病毒或表現產物的解救。藉著以DNA-指揮之RNA 聚合酶轉錄適當的DNA序列，來製備本發明之RNA模板。 可在活體外或在活體内，藉著使用DNA-指揮之RNA聚合 酶，像是噬菌體T7聚合酶、T3聚合酶、SP6聚合酶或真核 生物聚合酶，像是聚合酶I，轉錄適當的DNA序列，來製 備本發明之RNA模板。在某些具體實施例中，可在活體外 或在活體内，藉著使用以質體為基礎的表現系統，像是在 Hoffmann等人，2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6108-6113中描述的，或單一方向的RNA聚合酶I-聚合酶II轉錄 系統，像是在 Hoffmann 和 Webster, 2000, J. Gen. Virol. 81:2843-2847中描述的，轉錄適當的DNA序列，來製備本 發明之RNA模板。所得的帶負極性之RNA模板，將含有適 當的終端序列，其將使病毒RNA-合成裝置能夠認出該模 板。或者，亦可使用正-極性的RNA模板，其含有適當的 終端序列，使病毒RNA-合成裝置能夠認出該模板。可藉 著具有被DNA-依賴性RNA聚合酶認出之啟動基因的質體 的轉移感染，完成從正極性之RNA模板中的表現。例如， 在T7啟動基因控制之下，編碼正RNA模板的質體DNA，可 與疫苗病毒或禽痘T7系統一起使用。 可建構二順反子的mRNAs，容許從内部開始病毒序列的 轉譯，並容許從正常的終端開始位置，表現外來蛋白質之 144243.doc -30- 201009079 密碼序列，反之亦然。或者，可從内部的轉錄單位表現外 來蛋白質，其中該轉錄單位具有開始位置和聚腺嘗酸化作 用位置。在另—個具體實施例中，將外來基因插入附基 因内，使得所得的表現蛋白質是融合蛋白質。 在某些具體實施例中，本發明係關於包括本發明之病毒 的三價疫苗。在特定的具體實施例中，可供三價疫苗使用 的病毒是谈合型牛副流感第3型/人類副流感第㈣病毒， 參#含有衍生自間質肺病毒’像是人類間質肺病毒或禽肺病 毒的第-個異源核菩酸序列，以及衍生自啤吸道融合細胞 病毒的第m料㈣列。在代表性的具體實施例 中’這類三價疫苗將是對下列專一的：⑷人類副流感病毒 之F基因和HN基因的基因產物；⑻由衍生自間質肺病毒之 異源核芬酸序列編碼的蛋白質以及⑷由衍生自啤吸道融合 細胞病毒之異源核苷酸序列編碼的蛋白質。在特定的具體 實施例中，第一個異源核誓酸序列是呼吸道融合細胞病毒 ❷ Γ基因，並將其插入位置1中，而第二個異源核铝酸序列 :人T間質肺病毒的❻因’並將其插入位置3中。本發明 更多的組合’並在表1中舉例說明-些。可使用禽 =毒之基因的其他組合。此外，亦可使用編碼後合 蛋白質的核嘗酸序列（參見前文）。在一些較差的具體 列中’可將異源核誓酸序列插入病毒基因組之 唬的位置中。 144243.doc 31 201009079 表1.在三價疫苗使用之病毒中，異源核苷酸序列的代表 性配置 組合 位置1 位置2 位置1 1 hMPV之F-基因 RSV之F-基因 - 2 RSV之F-基因 hMPV之F-基因 - 3 - hMPV之F-基因 RSV之F-基因 4 - RSV之F-基因 hMPV之F-基因 5 hMPV之F-基因 - RSV之F-基因 6 RSV之F-基因 - hMPV之F-基因 7 hMPV之G-基因 RSV之G-基因 - 8 RSV之G-基因 hMPV之G-基因 - 9 - hMPV之G-基因 RSV之G-基因 10 RSV之G-基因 hMPV之G-基因 11 hMPV之G-基因 - RSV之G-基因 12 RSV之G-基因 - hMPV之G-基因 13 hMPV之F-基因 RSV之G-基因 - 14 RSV之G-基因 hMPV之F-基因 - 15 - hMPV之F-基因 RSV之G-基因 16 - RSV之G-基因 hMPV之F-基因 17 hMPV之F-基因 - RSV之G-基因 18 RSV之G-基因 hMPV之F-基因 19 hMPV之G-基因 RSV之F-基因 20 RSV之F-基因 hMPV之G-基因 - 21 - hMPV之G-基因 RSV之F-基因 22 - RSV之F-基因 hMPV之G-基因 23 hMPV之G-基因 - RSV之F-基因 24 RSV之F-基因 - hMPV之G-基因 144243.doc -32- 201009079 在一些其他的具體實施例中，可改變在異源序列和下游 基因之密碼序列起點之間的基因間區域。例如，在表1中 列舉的每個基因，可具有想要長度的基因間區域。在代表 性的具體實施例中，三價疫苗包括b/h PIV3載體，其具有 插入位置1處之呼吸道融合細胞病毒的F基因，改變了'的 177個核菩酸之基因間區域（最初是乃個核苷酸至下游n 基因起始密碼子AUG)，以及插入位置3處之人類間質肺病 毒的F基因，具有其天然的基因間區域。本發明包括多更 多的組合，因為可根據下文的4丄2節，操縱每個異源核甞 酸序列的插入。 在更廣泛的具體實施例中，可設計本發明之表現產物和 嵌合型病毒粒子，創造對抗各種病原，包括病毒抗原、腫 瘤抗原和涉及自體免疫病症之自體抗原的疫苗。一種達成 該目的的方式，涉及修改現存的ριν基因，使其在它個別 的外部功能雜+，含有外來序歹。在#源序列為抗原決 φ 定位或病原的抗原之處，可使用這些嵌合型病毒誘導保護 性免疫反應，對抗從其中衍生出這些決定位的病原。 一種建構這些雜種分子的方法，是將異源核甞酸序列插 入PIV基因組，例如hPIv、bPIV或bpiv/hpiV之DNA補體 内，而得以使該異源序列位在病毒聚合酶活性所需之病毒 序列，即病毒聚合酶結合位置/啟動基因的侧面，在後文 中稱為病毒聚合酶結合位置，以及聚腺甞酸化作用位置。 在較佳的具體實施例中，該異源密碼序列係位在包括5，和 3'終端之複製啟動基因、基因起點和基因結束序列，以及 144243.doc 201009079 在5·及/或3,終端中發現之包裝作骑的、由矣产， L蒗琥的病毒序列的側.面。在 另-種方法中，可將編碼病毒聚合酶結合位置的募核嘗 酸’例如病毒基因組斷片之3，_端或兩端的㈣，與該異源 密碼序列連接’建構雜種分子。纟標乾序列中放置外來基 因或外來基因的斷片，從前是藉著在標靶序列中出現之^ 當限制酵素位置來指揮。然而，最近在分子生物學上的進 步，已經大大地減少了該問題。可經由使用指定位置之突
變生成作用（例如，參見，例如由Kunkel，1985，p⑺e NaU
Acad· Sci. U_S_A. 82:488描述的技術）’迅速地將限制酵素 位置放在標靶序列中的任何地方。在下文中描述之在聚合 酶連鎖反應（PCR)技術上的改變，亦容許序列（即限制酵素 位置）的指定插入，並容許輕易地建構雜種分子。或者， 可使用PCR反應，製備重組的模板，而不需要選殖。例 如’可使用PCR反應，製備含有DNA-指揮之RNA聚合酶啟 動基因（例如噬菌體T3、T7或SP6)的雙股DNA分子，以及 含有異源基因和PIV聚合酶結合位置的雜種序列。然後可 從該重組DNA中，直接轉錄RNA模板。在另一個具體實施 例中，可藉著使用RNA連接酶，使指出異源基因之負極性
的RNAs與病毒聚合酶結合位置連接，來製備重組的rnA 模板。 此外，可在未轉譯區域中，在HN基因之3'端加入一或多 個核甞酸，與“六的規則，，附接，該“六的規則”在成功的病 毒解救中，可能是很重要的》“六的規則”適用於許多副黏 液病毒，且RNA基因組之核甞酸的數目，必須是6的因 144243.doc -34- 201009079 數’才是有功能的。可藉著此項技藝中已知的技術，像是 使用市售的突變生成套組，像QuikChange突變生成套組 (Stratagene)，元成核菩酸的加入。在加入適當數目的核甞 酸之後，可藉著以適當限制酵素消化，並以凝膠純化，分 離出正確的DNA片段’例如hpiV3 ρ和NH基因的〇ΝΑ片 &。可根據在後文之子章節中描述的本發明，使用病毒聚 合酶活性所需之序列和構築體。 4 · 1.1 ·欲插入之異源基因序列 本發明包括設計重組的牛或人類副流感病毒，表現一或 多個異源序列’其中該異源序列編碼基因產物或基因產物 的片段，其最好是抗原性及/或免疫原性的。當在本文中 使用‘抗原性的”一詞時’意指分子與抗體或子結合 的能力。“免疫原性的，，一詞意指分子在宿主中產生免疫反 應的能力。 在較佳的具體實施例中，欲插入之異源核苷酸序列係衍 生自負股RNA病毒，包括但不限於流感病毒、副流感病 毒、呼吸道融合細胞病毒、哺乳動物間質肺病毒（例如人 類間質肺病毒）和禽肺病毒。在較佳的具體實施例中，欲 插入之異源序列包括，但不限於編碼人類p〗V之ρ或HN基 因、RSV之F基因、流感病毒a、B或C型之HA基因、人類 MPV之F基因、禽肺病毒之F基因或其免疫原及/或抗原片段 的序列。 在一些具體實施例中，欲插入之異源核:y：酸序列係衍生 自人類間質肺病毒及/或禽肺病毒。在某些具體實施例 144243.doc •35· 201009079 中，欲插入之異源核苷酸序列係衍 和呼吸道融合細胞病毒及/或 句人類間質肺病毒 πΑ — 土 肺病毒和呼明、隹- 胞病毒。 ，及道融合細 在本發明某些較佳的具體實施例中，欲 酸序列係衍生自得自人類間質肺病=入之異源核苷 因。在某些具體實施例中，該F基因係衍:自^人毒的Μ 肺病毒和呼吸道融合細胞病毒c間質 融合細胞病毒。 和呼吸道 2本發明的某些具體實施例中，欲插人之異源 列為衍生自人類間質肺病毒及/或禽肺病毒的战因。在= ^具體實施例中，該G基因係衍生自⑷人類間質肺病毒和 呼吸道融合細胞病毒及/或⑻禽肺病毒和呼吸道融合細胞 病毒6 在某些具體實施例中，可將衍生自人類間質肺病毒、禽 肺病毒和呼吸道融合細胞病毒之不W基因及/或不同G基 ®的任何組合’插入本發明之病毒内’其限制條件為在所 有的具體實施例中’至少有—個衍生自人類間質肺病毒或 禽肺病毒的異源序列，出現在本發明之重組副流感病毒 中。 在某些具體實施例中，欲插入之核甞酸序列是編碼衍生 自人類間質肺病毒之F蛋白質的核甞酸序列。在某些其他 的具體實施例中，欲插入之核苷酸序列是編碼衍生自人類 間質肺病毒之G蛋白質的核甞酸序列。在另外的具體實施 例中’欲插入之核甞酸序列是編碼衍生自禽肺病毒之F蛋 144243.doc •36- 201009079 白質的核甞酸序列。在其他的具體實施例中，欲插入之核 菩酸序列是編碼衍生自禽肺病毒之G蛋白質的核甞酸序 列。其限制條件為在所有的具體實施例中，至少有一個異 源核·#酸序列疋衍生自間質肺病毒，欲插入之異源核答酸 序列係編碼呼吸道融合細胞病毒的F蛋白質或G蛋白質。 在某些具體實施例中，欲插入之核答酸序列係編碼後合 型F蛋白質或嵌合型G蛋白質。嵌合型F蛋白質包括一部分 鲁 得自不同病毒的F蛋白質，像是人類間質肺病毒、禽肺病 毒及/或呼吸道融合細胞病毒。嵌合型G蛋白質包括一部分 得自不同病毒的G蛋白質，像是人類間質肺病毒、禽肺病 毒及/或呼吸道融合細胞病毒。在特定的具體實施例中， 該F蛋白質包括間質肺病毒之F蛋白質的外功能部位，副流 感病毒之F蛋白質的穿透膜功能部位以及副流感病毒之F蛋 白質的魯米那功能部位。 在某些特定的具體實施例中，本發明之異源核苷酸序列 φ 是序列識別1號至序列識別5號、序列識別14號和序列識別 15號中的任一個（參見表16)。在某些特定的具體實施例 中，該核苷酸序列編碼序列識別6號至序列識別13號、序 列識別16號和序列識別17號中任一個的蛋白質（參見表 16)。在某些特定的具體實施例中，該核苷酸序列編碼序 列識別314至389號中任一個的蛋白質。 至於衍生自呼吸道融合細胞病毒的異源核苷酸序列，參 見，例如PCT/US98/20230,將其全文以引用的方式併入本 文中。 144243.doc 37- 201009079 在較佳的具體實施例中，可在本發明之嵌合型病毒内表 現的異源基因序列，包括但不限於編碼病毒之抗原決定位 和糖蛋白的那些，像是流感病毒之糖蛋白，特別是血球凝 集素H5、H7、呼吸道融合細胞病毒之抗原決定位、新城 雞痕病毒之抗原決定位、引起呼吸道疾病之仙臺病毒 (Sendai virus)和傳染性喉氣管炎病毒（ILV)。在最佳的具體 實施例中，該異源核苷酸序列係衍生自間質肺病毒，像是 人類間質肺病毒及/或禽肺病毒。在本發明另一個具體實 施例中，可設計成在本發明之嵌合型病毒内的異源基因序 列，包括但不限於編碼病毒抗原決定位和病毒糖蛋白，像 是B型肝炎病毒表面抗原、愛氏頓病毒之A或C型肝炎病毒 之表面糖蛋白、人類乳頭狀瘤病毒、猿病毒5或流行性腮 腺炎病毒、西尼羅河病毒（West Nile virus)、登革病毒 (Dengue virus)之糖蛋白、癌療病毒之糖蛋白、骨髓灰白質 炎病毒之VPI以及衍生自人類免疫缺陷病毒（HI V)，最好是 第1型或第2型之序列的那些。在另外的具體實施例中，可 設計成在本發明之嵌合型病毒内的異源基因序列，包括但 不限於編碼馬立克氏（Marek's)病病毒（MDV)之抗原決定 位、傳染性華氏囊炎病毒（IBDV)之抗原決定位、雞貧血病 毒、傳染性喉氣管炎病毒（ILV)、禽流感病毒（AIV)、狂犬 病、猫白血病病毒、犬痕熱病毒、水疽性口炎病毒和猪痘病 毒之抗原決定位的那些（參見Fields等人（編輯），1991, FUNDAMENTAL VIROLOGY,第 2 版，Raven Press, New York,將其全文以引用的方式併入本文中）。 144243.doc -38 - 201009079 本發明其他的異源序列，包括編碼為自體免疫疾病所特 有之抗原的那些。這些抗原通常將衍生自哺乳動物組織的 細胞表面、細胞質、核、粒線體及其類似物，包括糖尿 病、多發性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、風濕性關節炎、 惡性貧血、愛迪森氏（Addis〇nis)病、硬皮病、自體免疫萎 縮性胃炎、青少年糖尿病和盤狀紅斑性狼瘡所特有的抗 原。 為過敏原之抗原通常包括蛋白質或糖蛋白，包括衍生自 花粉、塵埃、黴、孢子、皮屑、昆蟲和食物的抗原。此 外，為腫瘤抗原所特有的抗原，通常將衍生自腫瘤組織之 細胞的表面、細胞質、核、胞器及其類似物。實例包括腫 瘤蛋白質所特有的抗原，包括由突變之致癌基因編碼的蛋 白質；與腫瘤有關之病毒蛋白質；以及糖蛋白。腫瘤包 括，但不限於從下列類型之癌症衍生的那些：唇、鼻咽、 咽和口腔、食道、胃、結腸、直腸、肝臟、膽囊、狹臟、 喉、肺臟和支氣管、皮膚之黑色素瘤、乳房、子宮頸、卵 巢、膀胱、腎臟、子宮、腦和神經系統的其他部分、甲狀 腺、别列腺、睪丸、霍奇金氏（Hodgkin，s)症、非-霍奇金氏 淋巴瘤、多發性骨髓瘤和白血病。 在本發明一個特定的具體實施例中，該異源序列係衍生 自人類免疫缺陷病毒（ΗΙΛΟ,最好是人類免疫缺陷病毒· 人類免疫缺陷病毒_2的基因組。在本發明其他的具體實施 例中，可將該異源密碼序列插入ριν基因密碼序列中，而 得以表現在PIV病毒蛋白質中，含有該異源肽序列 的嵌合 144243.doc •39. 201009079 型基因產物。在本發明的 、顯具體實施例中，該異源序列 亦可衍生自人類免疫缺陷病毒， 贵攻好疋人類免疫缺陷病 毒或人類免疫缺陷病毒·2的基因組。 在異源序列為HIV-衍生的荦例φ，、士相e , A， 〜果例干，這類序列可包括，但 不限於衍生自⑽基因（即編媽全部或部分gP⑽、gpl20及/ 或gp41之序列）、pGl基因（即編碼全部或部分逆轉錄酶、核 酸内切酶、蛋白酶及/或接合酶之序列）、㈣基因（即編碼 全部或部分P7、p6、p55、pl7m、p24/25之序列）、⑻、 rev、nef、vif、vpu、vpr及 / 或νρχ的序列。 在其他的具體實施例+，可設計成在嵌合型病毒内的異 源基因序列’包括編碼具有免疫強化活性之蛋白質的那 些。免疫強化蛋白質的實例，包括但不限於細胞激動素、 干擾素第1型、γ干擾素、菌落刺激因子和介白素、 -4、-5、-6、-12。 此外，其他可設計成在嵌合型病毒内之異源基因序列， 包括編碼衍生自細菌之抗原的那些，像是細菌表面糖蛋 白、衍生自真菌的抗原以及衍生自各種其他病原和寄生蟲 的抗原。衍生自細菌病原之異源基因序列的實例，包括但 不限於編碼衍生自下列屬之物種的抗原的那些··沙門氏桿 菌屬（Salmonella)、志贺桿菌屬（Shigella)、衣原體屬 (Chlamydia)、螺桿菌屬（Helicobacter)、耶爾森氏菌屬 (Yersinia)、博德氏菌屬（Bordatella)、假單孢菌屬 (Pseudomonas)、奈瑟菌屬（Neisseria)、弧菌屬（vibri〇)、嗜 血桿菌屬（Haemophilus)、黴漿菌屬（Mycoplasma)、鏈徽菌 144243.doc -40· 201009079 屬（Streptomyces)、密螺旋體屬（Treponema)、柯克斯體屬 (Coxiella)、艾利希體屬（Ehrlichia)、布氏桿菌屬 (Brucella)、鏈桿菌屬（Streptobacillus)、梭菌螺旋體屬 (Fusospirocheta)、螺菌屬（Spirillum)、月尿原體屬 (Ureaplasma)、螺旋體屬（Spirochaeta)、黴漿菌屬、放線菌 屬（Actinomycetes)、疏螺旋體屬（Borrelia)、類桿菌屬 (Bacteroides)、奇可莫拉菌屬（Trichomoras)、布藍漢氏菌屬 (Branhamella)、巴斯德菌屬（Pasteurella)、梭狀芽胞桿菌屬 (Clostridium)、棒狀桿菌屬（Corynebacterium)、李士 德菌屬 (Listeria)、桿菌屬（Bacillus)、 丹毒絲菌屬 (Erysipelothrix)、紅球菌屬（Rhodococcus)、埃希桿菌屬 (Escherichia)、克雷伯氏桿菌屬（Klebsiella)、假單抱菌 屬、腸桿菌屬（Enterobacter)、沙雷菌屬（Serratia)、葡萄球 菌屬（Staphylococcus)、鏈球菌屬（Streptococcus)、軍團菌 屬（Legionella)、分枝桿菌屬（Mycobacterium)、變形桿菌屬 (Proteus)、臀曲桿菌屬（Campylobacter)、腸球菌屬 (Enterococcus)、不動桿菌屬（Acinetobacter)、摩根菌屬 (Morganella)、莫拉菌屬（Moraxella)、擰檬酸細菌屬 (Citrobacter)、立克次體屬（Rickettsia)、羅查利馬氏體屬 (Rochlimeae)，以及細菌物種，像是綠膿桿菌（p. aeruginosa)、大腸桿菌、蔥頭假單胞菌（P. cepacia)、表皮 葡萄球菌（S. epidermis)、糞腸球菌（E. faecalis)、肺炎鍵球 菌（S. pneumonias)、金黃色葡萄球菌（S. aureus)、腦膜炎奈 瑟菌（N. meningitidis)、讓膿鏈球菌（S. pyogenes)、敗血性 144243.doc -41 · 201009079 巴斯德桿菌（Pasteurella multocida)、梅毒螺旋體 (Treponema pallidum)和奇異變形菌（P. mirabilis)。 衍生自病原性真菌之異源基因序列的實例，包括但不限 於編碼衍生自下列真菌之抗原的那些，像是：新型隱球菌 (Cryptococcus neoformans);皮炎芽生黴菌（Blastomyces dermatitidis);皮炎艾洛黴菌（Aiellomyces dermatitidis);莢 膜組織胞紫菌（Histoplasma capsulatum);粗球黴菌 (Coccidioides immitis);念珠菌屬（Candida)物種，包括白 色念珠菌（C. albicans)、熱帶念珠菌（C. tropicalis)、近平滑 念珠菌（C. parapsilosis)、吉利蒙念珠菌（C. guilliermondii) 和克魯斯念珠菌（C. krusei)，麴菌屬（Aspergillus)物種，包 括煙麴菌（A. fumigatus)、黃麴菌（A. flavus)及黑麴菌（A. niger)，根黴菌屬（Rhizopus)物種；根毛黴菌屬 (Rhizomucor)物種；克銀漢黴屬（Cunninghammella)物種； 囊托徽菌屬（Apophysomyces)物種，包括沙氏囊托黴菌（A. saksenaea)、毛黴菌（A. mucor)和棘子鬚黴菌（A. absidia); 申克氏抱子絲菌（Sporothrix schenckii)、巴西副球黴菌 (Paracoccidioides brasiliensis);波迪假黴樣真菌 (Pseudallescheria boydii)、光滑球擬酵母（Torulopsis glabrata);毛癣菌屬（Trichophyton)物種、小芽抱菌屬 (Microsporum)物種和皮癬菌屬（Dermatophyres)物種，以及 任何目前已知或稍後確認為病原性的其他酵母菌或真菌。 最後，衍生自寄生蟲之異源基因序列的實例，包括但不 限於編碼衍生自下列物種之抗原的那些：頂複動物門 144243.doc •42· 201009079
(Apicomplexa)的成員，像是例如焦蟲屬（Babesia)、弓漿蟲 屬（Toxoplasma)、遽原蟲屬（Plasmodium)、艾美球蟲屬 (Eimeria)、等抱球蟲屬（Isospora)、阿托索漿蟲屬 (Atoxoplasma)、囊等抱球蟲屬（Cystoisospora)、哈蒙蟲屬 (Hammondia)、貝諾蟲屬（Besniotia)、肉孢子蟲屬 (Sarcocystis)、福瑞克蟲屬（Frenkelia)、血變形蟲屬 (Haemoproteus)、白血球孢子蟲屬（Leucocytozoon)、賽利 爾梨漿蟲屬（Theileria)、普金蟲屬（Perkinsus)和抱子蟲屬 (Gregarina spp.);卡氏肺孢子蟲（Pneumocystis carinii);微 孢子門（Microspora)的成員，像是例如小抱子蟲屬 (Nosema)、腸微孢子蟲屬（Enterocytozoon)、腦炎微抱子蟲 屬（Encephalitozoon)、賽普塔塔蟲屬（Septata)、馬拉辛飢蟲 屬（Mrazekia)、鈍抱子蟲屬（Amblyospora)、阿美森蟲屬 (Ameson)、格留蟲屬（Glugea)、普抱子蟲屬（Pleistophora) 和微抱子屬（Microsporidium spp.);以及奇異孢子蟲門 (Ascetospora)的成員，像是例如單孢子蟲屬 (Haplosporidium spp.)，以及包括下列的物種：惡性癦原蟲 (Plasmodium falciparum)、間曰癌原蟲（P· vivax)、卵形癔原 蟲（P. ovale)、三曰癌原蟲（P. malaria);鼠.弓漿蟲 (Toxoplasma gondii);墨西哥利什曼原蟲（Leishmania mexicana)、熱帶利什曼原蟲（L. tropica)、碩大利什曼原蟲 (L. major)、埃塞俄比亞利什曼原蟲（L. aethiopica)、杜氏利 什曼原蟲（L. donovani)、克氏錐蟲（Trypanosoma cruzi)、布 氏錐蟲（T. brucei)、曼氏住血吸蟲（Schistosoma mansoni)、 144243.doc -43- 201009079 埃及住血·吸蟲（S· haematobium)、曰本住血吸蟲（S. japonium);旋毛蟲（Trichinella spiralis);班氏吳策絲蟲 (Wuchereria bancrofti);馬來布魯線蟲（Brugia malayli);溶 組織内阿米巴（Entamoeba histolytica);蟯蟲（Enterobius vermiculoarus);有鈞絛蟲（Taenia solium)、無钩絛蟲（T. saginata);陰道滴蟲（Trichomonas vaginatis)、人滴蟲（Τ. hominis)、口腔毛滴蟲（Τ· tenax);腸梨形蟲（Giardia lamblia);短小隱抱子蟲（Cryptosporidium parvum);卡氏肺 孢子蟲、牛焦蟲（Babesia bovis)、分歧焦蟲（B. divergens)、 田鼠焦蟲（B. microti)、貝氏等抱球蟲（Isospora belli)、人焦 蟲（L. hominis);脆弱雙核阿米巴（Dientamoeba fragilis); 人盤尾絲蟲（Onchocerca volvulus);人细蟲（Ascaris lumbricoides);美洲钩蟲（Necator americanis);十二指腸釣 蟲（Ancylostoma duodenale);糞類圓線蟲（Strongyloides stercoralis);菲律賓毛細線蟲（Capillaria philippinensis); 廣東血管圓線蟲（Angiostrongylus cantonensis);短小包膜 絛蟲（Hymenolepis nana);闊節裂頭絛蟲（Diphyllobothrium latum);細粒棘球絛蟲（Echinococcus granulosus)、多房型 棘球絛蟲（E. multilocularis);衛氏并殖吸蟲（Paragonimus westermani)、卡列并殖吸蟲（P. caliensis);中華後睪吸蟲 (Chlonorchis sinensis);猫後睪吸蟲（Opisthorchis felineas)、維氏腹囊雙 口吸蟲（G. viverini)、肝經（Fasciola hepatica)、療癬蟲（Sarcoptes scabiei)、人益（Pediculus humanus);陰齒（Phthirlus pubis)和人膚繩（Dermatobia 144243.doc • 44- 201009079 h〇minis)’以及任何目前已知或務後確認為病原性的其他 寄生蟲。 4.1.2.異源基因序列的插入 可藉著以外來基因完全置換病毒之㈣區，或藉著相同 物的部分置換，或藉著將異源核替酸序列加至病毒基因組 中，完成將外來基因彳列插入PIV之纟分斷基因組内的作 用。完全置換可能最好是經由使用PCR—指 成。簡言一引子一3,端，將 特的限制酵素位置，像是第ns級的限制酵素位置（即"轉移 者（shifter)酵素，它認得特定的序列，但切開在該序列上 游或下游的DNA);-片與PIV基因區互補的核嘗酸；以及 一片與外來基因產物之羧基_端密碼部分互補的核甞酸。 PCR-引子B ’從5’至3,端’將含有：獨特的限制酵素位置； 一片與PIV基因互補的核苷酸；以及一片與外來基因之夕 密碼部分互補的核苷酸。在使用這些引子與外來基因之選 ❹ 殖副本的PCR反應之後，可切除產物，並使用獨特的限制 位置選殖《以第IIS級的酵素消化，並利用經過純化之噬 菌體聚合酶轉錄，將產生含有ριν基因之正確未轉譯末 端，並帶有外來基因插入的RNA分子。在另一個具體實施 例中，可使用PCR-誘發的反應，來製備含有噬菌體啟動基 因序列和雜種基因序列的雙股DNA，而得以直接轉錄rna 模板，不需選殖。 可將異源核甞酸序列加入或插入本發明之病毒的各種位 置。在一個具體實施例中，將異源核苷酸序列加入或插入 144243.doc -45· 201009079 位置卜在另一個具體實施例中 或插入位置2。在另-個具髅實施例中==加入 列加入或插入位置在另 X酸序 苷酸岸石“ Λ U 〃體實施例中，將異源核 加人或插人位置4。在另—個具體實施例中將 異源核嘗酸序列加人或插人位置5。在另—個、 中”’將異源核錢序列加人或插人位置6。當在本文= 2立置”-詞時，意指在該異源核料序列在待轉錄之病 :笑因組上的位置，例如，位置1意指它是第-個待轉錄 的基口，而位置2意指它是第二個待轉錄之基I在病毒 之較低-編號位置處插入異源核甞酸序列，與在較 ： 位置f的插人相比較，料產生較強的異源核I酸序列表° 現，是因為跨越病毒基因組存在的轉錄梯度。然而，轉錄 梯度亦產生特定比例的病毒mRNAs。外來基因的插入將擾 亂這些比例，解致不同量之病毒蛋白質的合成，其可能 影響病毒的複製。因此，在選擇插入位置時，必須考量轉 錄梯度和複製動力學。例如，在b/h piV3載體的位置2處插 入異源核：y：酸序列，產生最佳的複製比例和異源基因的表 現程度。若想要異源核苷酸序列的強表現，在較低-編號 的位置處插入異源核甞酸序列，是本發明較佳的具體實施 例。在較佳的具體實施例中，在位置i、2或3處加入或插 入異源序列。 當將異源核甞酸序列插入本發明之病毒内時，可改變在 異源基因之密碼序列末端與下游基因之密碼序列起點之間 的基因間區域，而達到想要的效果。當在本文中使用，，基 144243.doc -46- 201009079 因間區域"一詞時’意指在一個基因之中止信號與下一個 下游開放編閱架構之密碼序列的起始密碼子（例如AUG)之 間的核#酸序列。基因間區域可包括基因的非密碼區， 即是在轉錄開始位置與基因之密碼序列的起點（AUG)之 間。該非·密碼區天然存在於bPIV3 mRNAs和其他病毒基因 中’在表2中以非-限制性實例說明之： 表2 : bPIV3 mRNAs之非-密碼區的長度
AUG. • CTT[基因起點] 45個核:y：酸 68個核苷酸 21個核甞酸 201個核：y：酸 62個核芬酸 12個核甞酸 10個核甞酸 86個核苷酸
N P Μ F ΗΝ L
b/h RSV FI b/h RSV F2 b/h RSV FI NP-P ______83個核甞酸 在各種具體實施例中’可彼此獨立地設計在異源核苷酸 序列與下游基因之間的基因間區域，使其長度為至少職 核苷酸、至少20個核苷酸、至少3〇個核甞酸、至少5〇個核 甞酸、至少75個核苷酸、至少1〇〇個核苷酸、至少125個核 嘗酸、至少15G個核：y：酸、至少175個核#酸或至少細個 核甞酸。在某些具體實施例中，可彼此獨立地設計在異源 核苷酸序列與下游基因之間的基因間區域，使其長度 多1〇個核料、最多20個核#酸、最多3G個料酸、最多 144243.doc •47- 201009079 50個核誓酸、最多75個核料、最多刚個核菩酸最多 125個核^:酸、最多15請核誓酸、最多175個核誓酸或最 多200個核铝酸。在各種具體實施例中，亦可彼此獨立地 設計在病毒基因組中想要基因的非_密碼區，使其長度為 至少10個核料、至少2(H目核H至少細料酸、至 少50個核答酸、至少75個核嘗酸、至少i⑼個核芬酸、至 少125個核^:酸、至少15()個核首酸、至少175個核誓酸或 至少200個核#酸。在某些具體實施例中，亦可彼此獨立 地設計在病毒基因組中想要基因的非_密碼區使其長度 為最多10個核料、最多2〇個核#酸、最多職核誓酸、 最多50個料酸、最多75個核料、最多⑽個核答酸、 最多⑵個m最多15_m最多175個核誓酸或 最多200個核答酸。 當插入異源核#酸序列時’可合併使用位置的影響和基 因間區域的操縱，以便達到想要的效果。例如，可在選自 由位置1、2、3、4、5和6處所組成之群的位置，加入或插 入異源核茹酸序列，並可改變在異源核苷酸序列與下一個 下游基因之間的基因間區域（參見表3)。在代表性的具體實 施例中，將hRSVF基因插入b/hPIV3載體的位置丨處，並將 在F基因和N基因（即F的下一個下游基因）之間的基因間區 域改為177個核站酸。本發明包括多更多的組合，並在表3 中舉例顯示其中的一些。 144243.doc •48- 201009079
表3.異源核苷酸序列之插入模式的實例 位置1 位置2 位置3 位置4 位置5 位置6 IGRa 10-20 10-20 10-20 10-20 10-20 10-20 IGR 21-40 21-40 21-40 21-40 21-40 21-40 IGR 41-60 41-60 41-60 41-60 41-60 41-60 IGR 61-80 61-80 61-80 61-80 61-80 61-80 IGR 81-100 81-100 81-100 81-100 81-100 81-100 IGR 101-120 101-120 101-120 101-120 101-120 101-120 IGR 121-140 121-140 121-140 121-140 121-140 121-140 IGR 141-160 141-160 141-160 141-160 141-160 141-160 IGR 161-180 161-180 161-180 161-180 161-180 161-180 IGR 181-200 181-200 181-200 181-200 181-200 181-200 IGR 201-220 201-220 201-220 201-220 201-220 201-220 IGR 221-240 221-240 221-240 221-240 221-240 221-240 IGR 241-260 241-260 241-260 241-260 241-260 241-260 IGR 261-280 261-280 261-280 261-280 261-280 261-280 IGR 281-300 281-300 281-300 281-300 281-300 281-300 a基因間區域，以核甞酸測量 依據插入異源核苷酸序列之目的（例如具有強的免疫原 性），可藉著各種指標來判定插入的位置和所插入之異源 核菩酸序列的基因間區域之長度，包括但不限於複製動力 學’以及藉著下列非-限制性的測定實例，測量到的蛋白 質或mRNA表現程度：溶菌斑測定、螢光·焦點測定、感染 中心測定、轉化測定、終點稀釋測定、電鍍效力、電子顯 144243.doc •49· 201009079 微鏡、血球凝集作用、病毒酵素活性的測量、病毒中和作 用、血球凝集抑制作用、補體固定、免疫染色、免疫沉澱 和免疫墨點、酵素連接之免疫吸附測定、核酸檢測（例如 南方墨點分析、北方墨點分析、西方墨點分析）、生長曲 線、報告者基因的使用（例如使用報告者基因，像是綠螢 光蛋白質（GFP)或增強的綠螢光蛋白質（eGFP)，整合到病 毒基因組，以與感興趣之異源基因相同的方式，觀察蛋白 質表現）或其組合。進行這些測定的程序，為此項技藝中 已熟知的（參見，例如Flint等人，PRINCIPLES OF VIROLOGY， MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, 2000，ASM Press第25-56頁，將全文以引用的方式併入本 文中），並在下文的實例章節中，提供非-限制性的實例。 例如，可藉著以本發明之病毒感染培養的細胞，並接著 藉著例如西方墨點分析或ELISA，使用對該異源序列之基 因產物專一的抗體，測量蛋白質的表現程度，或藉著北方 墨點分析，使用對該異源序列專一的探針，測量RNA的表 現程度，來判定表現程度。同樣地，可藉著感染動物模 式，並在該動物模式中，測量來自本發明之重組病毒的異 源序列的蛋白質表現程度，來判定該異源序列的表現程 度。可藉著從被感染的動物中獲得組織試樣，然後使該組 織試樣接受西方墨點分析或ELISA，使用對該異源序列之 基因產物專一的抗體，來測量蛋白質的含量。此外，若使 用動物模式，便可藉著任何熟諳此藝者已知的技術，包括 但不限於ELISA，來判定該動物對異源序列之基因產物所 144243.doc • 50- 201009079 產生之抗體的力價。 因為異源序列可以是與在病毒之基因組中的核誓酸序列 同種的，故應小心地採用確實對該異源序列或其基因產物 專一的探針和抗體。
在某些特定的具體實施例中，可藉著熟諳此藝者已知的 任何技術判疋來自嵌合型b/h PIV3 RSV或b/h PIV3 hMPV 或b/h PIV3 RSV F及hMPV F之RSV或hMPV的F-蛋白質表現 0 程度。可藉著以本發明之嵌合型病毒，感染培養的細胞， 並藉著例如西方墨點分析或ELISA，使用對hMpVi f-蛋白 質及/或G-蛋白質專一的抗體，測量蛋白質的表現程度， 或藉著例如北方墨點分析，使用對人類間質肺病毒之f•基 因及/或G-基因專一的探針’測量RNA的表現程度，來判 定F-蛋白質的表現程度。同樣地，可使用動物模式，藉著 感染動物，並在該動物模式中，測量匕蛋白質及/或〇-蛋白 質的含量，來判定該異源序列的表現程度。可藉著從被感 參 染的動物中獲得組織試樣，並使該組織試樣接受西方墨點 分析或ELISA，使用對該異源序列之厂蛋白質及/或（}蛋白 質專一的抗體，來測量蛋白質的含量。此外，若使用動物 模式，便可藉著任何熟諳此藝者已知的技術，包括但不限 於ELISA，來判定該動物對卜蛋白質及/或^蛋白質所產生 之抗體的力價。 可藉著熟諳此藝者已知的任何技術，判定本發明之重組 病毒的複製速率。 在某些具體實施例中，欲更容易地確認異源序列在病毒 144243.doc •51 - 201009079 基因組中的最# & 、 ，以及基因間區域的最佳長度，可使 =異源序列料報告者基因。—旦衫最佳的參數，便由 、:所選出之抗原的異源核誓酸序列代替該報告者基因。
务月之方法中，可使用任何熟諳此藝者已知 基因1於更多的細節’參見4·5節。 H 可藉著任何熟諳此藝者已知的標準技術，判定重組病毒 =複氣速率。可以病毒的生長速率表示複製速率，並可藉 者將病毒力價對感染後的時間作圖來判定之。可藉著任 何熟π此藝者已知的技術’測量病毒力價。在某些具體實 把例中冑3有病毒的懸浮液與易被該病毒感染的細胞一 起培養。可在本發明之方法中使用的細胞類型，包括但不 限於 ver〇 細胞、LLC_MK_2 細胞、Hep 2 細胞、LF 1〇43 (HEL)細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞或tMK細胞。在將病 毒與細胞一起培養之後，判定被感染細胞的數目。在某些 特定的具體實施例中，病毒包括報告者基因。因此，表現 報告者基因之細胞的數目，代表被感染細胞的數目。在特 疋的具體實施例中，病毒包括編碼eGFp的異源核誓酸序 列’並使用FACS判定表現eGFP之細胞的數目，即被該病 毒感染之細胞的數目。 在某些具體實施例中’本發明之重組病毒的複製速率， 最多是在相同條件下’從其中衍生該重組病毒之野外型病 毒的複製速率的20%。相同的條件意指相同的開始病毒力 價、相同的細胞品系、相同的培養溫度、生長培養基、細 胞數目以及其他可能影響複製速率的試驗條件。例如，在 144243.doc -52- 201009079 位置1處帶有RSV之F基因的b/h PIV3的複製速率，最多是 bPIV3之複製速率的20%。 在某些具體實施例中，本發明之重組病毒的複製速率， 最多是在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病 毒的複製速率的5%、最多10%、最多20%、最多30%、最 多40%、最多50%、最多75%、最多80%、最多90%。在某 些具體實施例中，本發明之重組病毒的複製速率，至少是 在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病毒的複 製速率的5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、 至少50%、至少75%、至少80%、至少90%。在某些具體實 施例中，本發明之重組病毒的複製速率，是在相同條件 下，從其中衍生該重組病毒之野外型病毒的複製速率的5% 到20%之間、10%到40%之間、25%到50%之間、40%到75% 之間、50%到80%之間或75%到90%之間。 在某些具體實施例中，在本發明之重組病毒中的異源序 列的表現程度，最多是在相同條件下，從其中衍生該重組 病毒之野外型病毒的F-蛋白質之表現程度的20%。相同的 條件意指相同的開始病毒力價、相同的細胞品系、相同的 培養溫度、生長培養基、細胞數目以及其他可能影響複製 速率的試驗條件。例如，在bPIV3之位置1處，MPV之F-蛋 白質的異源序列的表現程度，最多是bPIV3之牛F-蛋白質 的表現程度的20%。 在某些具體實施例中，在本發明之重組病毒中的異源序 列的表現程度，最多是在相同條件下，從其中衍生該重組 144243.doc 53· 201009079 病毒之野外型病毒的F-蛋白質之表現程度的5%、最多 10%、最多20%、最多30%、最多40%、最多50%、最多 75%、最多80%、最多90%。在某些具體實施例中，在本發 明之重組病毒中的異源序列的表現程度，至少是在相同條 件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病毒的F-蛋白質之 表現程度的5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少 40%、至少50%、至少75%、至少80%、至少90%。在某些 具體實施例中，在本發明之重組病毒中的異源序列的表現 程度，是在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型 病毒的F-蛋白質之表現程度的5%到20%之間、10°/。到40% 之間、25%到50%之間、40%到75%之間、50%到80%之間或 75%到90%之間。 4.1.3.將異源基因序列插入HN基因内 由單一基因HN，編碼負責PIV之血球凝集素和神經胺糖 酸苷酶活性的蛋白質。該HN蛋白質是病毒的主要表面糖 蛋白。對各種病毒而言，像是副流感病毒，已經顯示血球 凝集素和神經胺糖酸甞酶蛋白質含有許多抗原位置。結 果，該蛋白質在感染之後，是體液免疫反應的可能標靶。 因此，以一部分外來的蛋白質取代HN之抗原位置，可提 供對抗該外來肽之旺盛的體液反應。若將序列插入HN分 子内，並在HN的外表面上表現它，則它是免疫原性的。 例如，可用衍生自HIV之gpl60的肽來代替HN蛋白質的抗 原位置，結果產生對gpl60和HN蛋白質兩者的體液免疫反 應。以不同的方法，可將外來的肽序列插入抗原位置内， 144243.doc -54- 201009079 而不刪除任何病毒的序列。這類構㈣的表現產物’可用 ί抗外來抗原的疫苗中，且確實可規避補早討論的問 題’即是重組病毒在接種疫苗之宿主中繁殖。僅在抗原位 置發生取代的完整ΗΝ分子，^ m 刀于，仍可給予HN功能，並因此容 許建構可存活的病毒。因 口此’該病毒不需添加額外的協助 者功能便可生長。亦可以其他方式將該病毒減毒，以避免 任何意外逃脫的危險。
，可進行其他的雜種建構，在細胞表面表現蛋白質或得以 從、，田胞中釋放匕們。作為表面糖蛋白，具有運送至細 胞表面所需之胺基'終端的可切開信號序列，以及膜固定 所需之羧基'終端序列。為了在細胞表面上表現完整的外 來蛋白質可此需要使用這些hn信號，創造雜種蛋白 質。在該情況下，可以與額外之内部啟動基因分開的融合
蛋白質形式’來表現該融合蛋白質。或者，若只出現運送 信號，但缺乏膜較功能部&，則可將蛋白質分泌至細胞 外。 4· 1.4.二順反子之rna的建構 可建構一順反子的mRNA，容許從内部開始病毒序列的 轉課，並谷許從正常的終端開始位置，表現外來蛋白質之 密碼序列。或者，可建構二順反子的mRNA序列，其中從 正常終端的開放編閱架構，轉譯病毒序列，而從内部位置 開始外來序列^可使用某些内部的核糖體進入位置（ires) 序列。應選擇短得足以避免干擾副流感病毒之包裝限制的 IRES序列。因此，為這類二順反子方法所選出的ires，長 144243.doc -55- 201009079 度最好不超過500個核苷酸，而理想的長度是小於25〇個核 芬酸。在特定的具體實施例中，該IRES係衍生自細小核糖 核酸病毒，且不包括任何額外的細小核糖核酸病毒之序 列。較佳的IRES元件包括，但不限於哺乳動物Bip IRES* C型肝炎病毒ires。 或者’可從新的内部轉錄單位來表現外來蛋白質，其中 e亥轉錄單位具有開始位置和聚腺苷酸化作用位置。在另一 個具體實施例中，將外來基因插入ριν基因内，使得所得 的表現蛋白質為融合蛋白質。 4.2.使用重組的cDNA和RNA模板，表現異源基因產物 可使用按照上述製備的重組模板，以各種方式在適當的 宿主細胞中，表現異源基因產物，或創造表現該異源基因 產物的嵌合型病毒。在一個具體實施例中，可使用重組的 cDNA，轉移感染適當的宿主細胞，而所得的RNA可以高 程度指揮該異源基因產物的表現。提供高程度表現之宿主 細胞系統’包括供應病毒功能的連續細胞株，像是以PIV 重複感染的細胞株、設計補足PIV功能的細胞株等等。 在本發明另一個具體實施例中，可使用重組模板，轉移 感染表現病毒聚合酶蛋白質的細胞株，以便達成該異源基 因產物的表現。為了這個目的，可利用表現聚合酶蛋白 質’像是L蛋白質的轉化細胞株，作為適當的宿主細胞。 可以類似的方式設計宿主細胞，提供其他的病毒功能，或 額外的功能，像是HN、NP或N。 在其他的具體實施例中，協助者病毒可提供由細胞利用 144243.doc -56- 201009079 的RNA聚合酶蛋白質，以便達成該異源基因產物的表現。 在另一個具體實施例中，可利用編碼病毒蛋白質，像是N 或NP、P和L蛋白質的載體，轉移感染細胞。 可使用不同的技術，檢測異源基因產物的表現（參見， 例如 Flint 等人，PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, 2000, ASM Press第25-:56頁，將全文以引用的方式併入本文中）。在實 例的測定中，利用曱醇或丙酮，使以病毒感染的細胞變成 可通透的，並與對該異源基因產物升高的抗體一起培養。 然後加入認得第一個抗體的第二個抗體。該第二個抗體通 常與指示劑結合，而得以用肉眼看到或檢測出該異源基因 產物的表現。 4.3.解救重組的病毒顆粒 為了製備嵌合型病毒，可使用編碼PIV基因組及/或外來 蛋白質之經過修改的cDNAs、病毒RNAs或RNA，以+或-義 轉移感染提供複製和解救所需之病毒蛋白質和功能的細 胞。或者，可在藉著編碼PIV基因組及/或外來蛋白質之 DNA或RNA分子轉移感染之前、期間或之後，以協助者病 毒轉移感染細胞。可藉著幾個熟諳此藝者已知的技術，按 照在1992年11月24曰發證之美國專利第5，166,057號；在 1998年12月29日發證之美國專利第5,854,037號；在1996年 2月20曰發表之歐洲專利公開案EP 0702085A1 ;在美國專 利申請案第09/152,845號；在1997年4月3日發表之國際專 利公開案PCT WO97/12032 ;在1996年11月7日發表之 144243.doc •57- 201009079 W096/34625 ;在歐洲專利公開案EP-A780475 ;在1999年1 月21日發表之WO99/02657 ;在1998年11月26日發表之 WO98/53078 ;在 1998 年 1 月 22 日發表之 W098/02530 ;在 1999年4月1日發表之W099/15672 ;在1998年4月2日發表之 WO98/13501 ;在1997年2月20日發表之W097/06270以及在 1997年6月25日發表之EPO 780 47SA1中的描述，分別將其 全文以引用的方式併入本文中，在傳染性病毒顆粒内複製 並解救合成的重組質體PIV DNAs和RNAs。 在本發明的一個具體實施例中，可製備合成的重組病毒 RNAs，其含有由病毒聚合酶認出，以及產製成熟病毒粒 子所需之包裝信號所必要的負股病毒RNA之非密碼區。可 使用許多不同的方法，將逆向遺傳法應用在解救負股RNA 病毒上。首先，從重組的DNA模板中合成重組的RNAs， 並在活體外利用經過純化的病毒聚合酶複合物重建，形成 重組的核糖核蛋白（RNPs)，可用它來轉移感染細胞。在另 一種方法中’若在活體外或在活體内，在合成RNAs的轉 錄期間出現病毒的聚合酶蛋白質，則達成更有效的轉移感 染。利用該方法，可從cDNA質體轉錄合成的RNAs，其在 活體外與編碼聚合酶蛋白質之cDNA質體共同-轉錄，或在 活體内，在聚合酶蛋白質的存在下轉錄，即在暫時性或在 組成上表現聚合酶蛋白質的細胞中。 在本文描述的其他方法中，可在表現PIV病毒聚合酶蛋 白質的宿主細胞系統中（例如，在病毒/宿主細胞表現系統 中；設計成表現聚合酶蛋白質之經過轉化的細胞株等 144243.doc 58 - 201009079 等）重複有傳染性之嵌合型病毒的產製，而得以解救有 傳染性之嵌合型病毒。在該例子中，不需使㈣助者病 毒，因為藉著所表現之病毒聚合酶蛋白質，提供該功能。 根據本發明’可使用任何熟諸此藝者已知的技術，達成 嵌合型病毒的複製和解救。一種方法涉及在轉移感染宿主 細胞之前，在活體外供應複製所需的病毒蛋白質和功能。 在這類的具體實施例中，可以野外型病毒、協助者病毒、 經過純化之病毒蛋白質，或以重組表現之病毒蛋白質的形 式提供病毋蛋白質。可在編碼嵌合型病毒之合成cDNAs 或RNAs的轉錄之前、期間或之後，提供病毒蛋白質。可 使用整個混合物來轉移感染宿主細胞。在另一種方法中， 可在編碼嵌合型病毒之合成cDNAs或RNAs的轉錄之前或期 間 k供複製所需之病毒蛋白質和功能◎在這類的具體實 施例中，可以野外型病毒、協助者病毒、病毒萃取物、合 成之cDNAs或RNAs，其經由感染或轉移感染導入宿主細胞 内，來表現病毒蛋白質的形式，提供病毒蛋白質。該感染 /轉移感染’係在導入編碼嵌合型病毒之合成cDNAs或 RNAs之前，或與其同時發生。 在特別想要的方法中，設計細胞使其表現PIv病毒的所 有基因’結果可能產生有傳染性的嵌合型病毒，其含有想 要的基因型；因此排除了對選擇系統的需求。在理論上， 可利用外來序列代替編碼PIV之結構蛋白質的六個基因中 的任一個’或六個基因中任一個的一部分。然而，該等式 的必要部分為繁殖有缺陷之病毒的能力（因為漏掉或改變 144243.doc -59· 201009079 正常的病毒基因產物而變成有缺陷的）。可利用許多可能 的方法，規避該問題。在一種方法中，可使具有突變蛋白 質的病毒生長細胞株中，將該細胞株建構成，或使其在組 成上表現相同蛋白質之野外型版本。以此方式，使該細胞 株補足了病毒中的突變。可使用類似的技術，建構經過轉 化的細胞株，使其在組成上表現任何的PIV基因。可使用 這些能夠表現病毒蛋白質的細胞株，補足在重組病毒中的 缺陷，並藉此繁殖它。或者，可利用某些天然的宿主排列 系統，來繁殖重組的病毒。 在另一個具體實施例中，可以編碼嵌合型病毒之合成 cDNAs或RNAs的形式，作為遺傳材料，來供應複製所需之 病毒蛋白質和功能，使其與編碼嵌合型病毒的合成cDNA 或RNAs共同-轉錄。在特別想要的方法中，將表現嵌合型 病毒和病毒聚合酶，及/或其他病毒功能的質體，共同-轉 移感染到宿主細胞内。例如，可將編碼野外型或經過修改 的基因組或反基因組之PIV RNA的質體，與編碼PIV病毒 聚合酶蛋白質NP或N、P或L的質體，共同-轉移感染到宿 主細胞内。或者，可藉著使用編碼T7 RNA聚合酶之經過 修改的疫苗病毒安卡拉（Modified Vaccinia Virus Ankara)(MVA)或MVA與編碼聚合酶蛋白質（N、P和L)之質 體的組合，達成嵌合型b/h PIV3病毒的解救。例如，可將 MVA-T7或禽痘-T7感染到HeLa、Hep-2或Vero細胞内。在 以MVA感染之後，可將全長的反基因組b/h PIV3 cDNA與 編碼NP、P和L之表現質體，一起轉移感染到HeLa或Vero 144243.doc -60- 201009079 細胞内。接著可收獲細胞和細胞上清液，並接受單次的冷 凍-融解。然後可使用所得的細胞溶胞產物，在阿拉 伯呋喃糖基胞嘧啶（ara C)，一種疫苗病毒之複製抑制劑的 存在下，感染新鮮的HeLa或Vero細胞單層，產生病毒母 液。然後從這些培養盤中收獲上清液和細胞，冷凍-融解 一-人’並藉著病毒溶菌斑的免疫染色，使用piV3_專一的 抗血清，檢測bPIV3病毒顆粒的存在。
其他繁殖重組病毒的方法，可能涉及與野外型病毒共 同-培養。這可藉著簡單地取得重組的病毒，並以該病毒 和/、他野外型病毒（最好是疫苗品系）共同·感染細胞來進 行野外型病毋應該補足有缺陷的病毒基因產物，並容許 野外型和重組病毒兩者生長。或者，可使耗助者病毒， 供應重組病毒的繁殖。 在另一種方法中’可在以表現ριν病毒聚合酶蛋白質之 重組病毒共同·感染的細胞中，複製合成的模板。事實 上，可使用該方法’根據本發明來解救重組有傳染性的病 毒。為了這個目的，可在任何表現載體/宿主細胞系統， 包括但不限於病毒表現載體(例如疫苗病毒、腺病毒 '桿 狀病毒等等）’或表現聚合酶蛋白f的細胞株中，表現ριν 聚合酶蛋白質（參見’例如Krystal等人，Μ%，他化
Acad. Sci. USA 83:27〇9_2713)。再者，表現所有六個 ριν 蛋 白質之宿主細胞的感染’可能導致有傳染性之嵌合型病毒 顆粒的產生。請注意有可能建構不改變 病毒。這些經過改變的病毒將能夠生長 病毒存活力的重組 ’且不需協助者的 144243.doc •61 · 201009079 功能便可複製。 4.4.重組病毒的減毒 了進步以遺傳方式設計本發明的重組病毒，以便表現 出減毒的表現型。特別是在將其投予作為疫苗之病毒的個 體中本發明之重組病毒表現出減毒的表現型。可藉著任 何熟諳此藝者已知的方法，完成減毒作用。未與理論結 &例如，可藉著在特定之宿主中，使用自然不能完美複 製的病毒（例如在人類中使用牛piV3載體），或藉著相對於 病母的野外型品系，降低病毒基因組的複製、降低病毒感 染宿主細胞的能力，或降低病毒蛋白質裝配成有傳染性之 病毒顆粒的能力，而引起重組病毒的減毒表現型。可使用 迷你基因組（minigenome)測定（參見4 5」節），測試病毒某 些序列的存活力。 可藉著任何熟諳此藝者已知的方法（參見，例如4.5節）， 來測試本發明之重組病毒的減毒表現型。例如，可針對其 感染宿主的能力’或在細胞培養系統中複製的速率來測 試候選病毒m具體實施例中，可測試重組病秦在動 物模式中’誘發病理學之徵候的能力。病毒在動物模式系 統中’降㈣發病理學之徵候的能力，代表其減毒的表現 型。在特定的具體實施例中，在好模式中對鼻感染測試 候選的病毒，並藉著黏液的產生表示。 可將本發明之病毒減毒，而使得—或多個病毒的功能特 徵受損。在某些具體實施财，與從其中衍 的病毒之野外型品系相比較，來測 杨病毋 π j篁我毋作用。在其他的 144243.doc •62- 201009079 具體實施例中，藉著比較減毒病毒在不同宿主系統中的生 長，來判定減毒作用。因此，關於非_限制性的實例，與牛 PIV3在牛宿主中的生長相比較，若降低了牛PIV3在人類宿 主中的生長，便將在人類宿主中生長的牛打…稱為減毒 的。 在某些具體實施例中，本發明之減毒病毒能夠感染宿 主，能夠在宿主中複製，而得以產生有傳染性的病毒顆 眷粒。然而，與野外型品系相比較，減毒的品系生長至較低 的力價，或生長得更慢。可使用任何熟諳此藝者已知的技 術，判定減毒病毒的生長曲線，並將其與野外型病毒的生 長曲線相比較。關於代表性的方法，參見下文的實例章 節。在特定的具體實施例中，減毒的病毒在按照實例3、 4、5和10中描述的條件下，在Ver〇細胞中，生長至低於1〇5 Pfu/毫升、低於104 pfu/毫升、低於1〇3 pfu/毫升或低於1〇2 pfu/毫升的力價。 Φ 在某些具體實施例中，本發明之減毒病毒（例如嵌合型 PIV3)在人類細胞中，不能像野外型病毒（例如野外型piv3) 一樣好地複製。例如，減毒的b/h piV3/RSV F在人類 細胞中，不像野外型PIV3或RSV 一樣好地複製。然而，減 毒的病毒能夠在缺乏干擾素功能的細胞株，像是Ver〇細胞 中良好地複製。 在其他的具體實施例中，本發明之減毒病毒能夠感染宿 主、在宿主中複製，並使本發明之病毒的蛋白質插入細胞 質膜内，但減毒病毒不能使宿主產生新的有傳染性的病毒 144243.doc -63 · 201009079 顆粒。在某些具體實施例中，減毒病毒以與野外型喝乳動 物病毒相同的效力，感染宿主、在宿主中複製，並使病毒 蛋白質插入宿主的細胞質膜内。在其他的具體實施例中， 與野外型病毒相比較，減毒病毒降低了使待插入細胞質膜 内之病毒蛋白質進入宿主細胞内的能力。在某些具體實施 例中，與野外型病毒相比較，減毒病毒降低了在宿主中複 製的能々。可使用任何熟諳此藝者已知的技術，判定病毒 是否能夠感染哺乳動物細胞、在宿主内複製，並使病毒蛋 白質插入宿主的細胞質膜内。關於解釋性的方法，參見4.5 _ 節。 在某些具體實施例中，本發明之減毒病毒能夠感染宿 主。然而，與野外型哺乳動物Mpv相反，減毒的哺乳動物 MPV不能在宿主中複製。在特定的具體實施例中，減毒的 哺乳動物病毒可感染宿主，並可使宿主將病毒蛋白質插入 其細胞質膜内，但減毒病毒不能在宿主中複製。可使用任 何熟諳此藝者已知的方法，測試減毒的哺乳動物是否 感染宿主細胞’並使宿主將病毒蛋白質插入其細胞質膜m 内。 在某二具體實把例中，與野外型病毒感染相同宿主的能 力相比較’減毒的哺乳動物病毒降低了感染宿主的能力。 可使用任何熟諳此藝者已知的技術’判定病毒是否能夠感 染宿主。關於解釋性的方法，參見45節。 在某些具體實施例中，將突變（例如錯義突變）導入病毒 土因、卫内產生具有減毒表現型的病毒。可將突變（例 144243.doc • 64 · 201009079 如錯義突變）導人重組病毒眺基因、p_M、 F-基因、M2-基因、sHx因、G美田土 、 暴因G_基因或L-基因内。在 定的具體實施例中，錯義突變是感冷性的突變、 具體實施例中，錯義突變是感熱性的突變。在-個具體實 施例中，移除病毒之p蛋白質的主要填酸化作用位置 另一個具體實施例中，將突變或突變們導入病毒的 内’產生感溫性的品系。 在其他的具體實施例中，在重組病毒的基因組中導入刪 除。在更特定的具體實施例中，可將刪除導入重組病毒 N-基因、基因、M_基因、F·基因、M2基因、阳·基因、、 G-基因或L_基因内。在特定的具體實施例中，該删除是在 本發明之重組病毒的M2_基因中。在其他特定的具體實施 例中，該刪除是在本發明之重組病毒的sh基因中。 ❹ 在某些具體實施例中，藉著以不同物種之病毒的基因代 替野外i病毒的基因，達成病毒的減毒作用。在解釋性的 具體實施例中，可利用hpiV3的N_基因、基因、％美 因、F-基因、Μ2_基因、抓基因、。基因或l基因，分二 代替㈣3的N_基因、p_基因、Μ·基因、f基因μ〗·基 因、SH-基因、G_基因或L_基因。在其他解釋性的具體^ 施例中，可利用bPIV3的N_基因、Ρ·基因、M_基因、f—基 因、M2-基因、SH-基因、G·基因或L_基因，分別代= hPIV3的N-基因、p-基因、M_基因、F•基因、M2基因' SH-基因、G-基因或L-基因。 在本發明的某些具體實施例中’可修改本發明之重組病 144243.doc -65- 201009079 毒的前導及/或拖尾序列，獲得減毒的表現型。在某些較 特定的具體實施例中，相對於野外型病毒，減少前導及/ 或拖尾序列的長度至少丨個核苷酸、至少2個核甞酸、至少 3個核铝酸、至少4個核苷酸、至少5個核苷酸或至少^個核 嘗酸。在某些其他更特定的具體實施例中，使重組病毒之 前導及/或拖尾的序列發生突變。在特定的具體實施例 中，前導和拖尾序列是彼此100%互補的。在其他的具體實 施例中，前導和拖尾序列中有丨個核甞酸、2個核苷酸、3 個核苷酸、4個核：y：酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核甞 酸、8個核誓酸、9個核嘗酸或1〇個核站酸不是彼此互補 的’但剩下的核：y：酸是彼此互補的。在某些具體實施例 中，非-互補的核苷酸是彼此相同的。在某些其他的具體 實施例中’非·互補的核甞酸是彼此不同的。在其他的具 體實施例中，若在拖尾中的非_互補核甞酸是嘌呤，則在 月ίι導序歹j中相對應的核嘗酸亦是嗓吟。在其他的具體實施 例中，右在拖尾中的非-互補核甞酸是嘧啶，則在前導序 列中相對應的核菩酸亦是嘌呤。 、當使㈣減毒疫苗時，亦必須考慮它的安全性。該疫苗 '、、不引起疾病。在本發明中，可使用任何使疫苗安全之 此項技藝中已知的技術。除了減毒的技術之外，可使用其 他，術。一個非_限制性的實例是使用可溶性異源基因了 不能將其併人㈣粒子膜内。例如’可使用可溶性RSV F 基因的單一Sif ^ 、缺乏穿透膜和胞液功能部位的RSV基因 版本目為不能將其併入病毒粒子膜内故不預期改變該 144243.doc 201009079 病毒的向性。 可使用各種測定來測試疫苗的安全性。參見下文4 5 節。特別是使用蔗糖梯度和中和測定。 4.5.測量嵌合型病毒的病毒力價、抗原序列的表現、免 疫原性及其他特徵 可使用任何熟諳此藝者已知的技術’判定本發明之病毒 在細胞培養系統或在個體中的生長速率。在某些具體實施 ❹ 例中，在以該病毒感染細胞或個體之後的某些時間點，判 定病毒的力價。然後將病毒力價對時間作圖，判定該病毒 的生長特徵。在特定的具體實施例中，藉著從被感染的細 胞或被感染的個體中獲得試樣，製備該試樣之連續稀釋， 並以容許顯現出單一溶菌斑之病毒稀釋程度，感染易感受 該病毒感染的細胞單層，來判定病毒力價。然後可計算溶 菌班，並以每毫升試樣的溶菌斑形成單位來表示病毒力 價。可使用任何熟諳此藝者已知的技術，測試減毒活疫苗 ❹ 的女全性，包括但不限於中和測定和蔗糖梯度測定。 在本發明特疋的具體實施例中，#著在個體中測量對抗 該病毒之抗體的力價，來評估本發明之病毒在個體中的生 長速率。未與任何理論結合，在個體中的抗體力價，不僅 反映在該個體中的病毒力價，亦反映抗原性。若病毒的抗 原性是不變的’則可使用在個體中抗體力價的增加，來判 定病毒在該個體中的生長曲線。 可藉著任何熟諳此藝者已知的技術，來判定異源基因序 歹J在細胞培養系統或在個體中的表現。在某些具體實施例 144243.doc •67- 201009079 中’藉著定量轉錄本的含量，來測量異源基因的表現。可 藉著北方墨點分析’或藉著RT-PCR，分別使用對轉錄本專 一的探針或引子，來測量轉錄本的含量。可區別轉錄本和 病毒之基因組，因為病毒為反義之方位，而轉錄本則是有 意義的方位。在某些具趙實施例中，藉著定量異源基因之 蛋白質產物的量，來測量異源基因的表現。可藉著西方墨 點分析，使用對該蛋白質專一的抗體，來測量蛋白質的含 量。在特定的具體實施例中’將肽標籤附貼在異源基因 上。可使用對抗該肽標籤的抗體來檢測肽標籤《所檢測到 之肽標籤的含量，代表從異源基因中表現之蛋白質的含 量。或者，可藉著肽標籤來分離從異源基因中表現之蛋白 質❶經過純化之蛋白質的含量，與異源基因的表現程度有 關。這類肽標籤，以及分離與這類肽標籤融合之蛋白質的 方法為此項技藝中已熟知的。可使用此項技藝中已知的各 種肽標籤來修改異源基因，包括但不限於免疫球蛋白恆定 區、聚組胺酸序列（Petty，1996，金屬-螯合親和力層析法 (Metal-chelate affinity chromatography),在 Current Protocols in Molecular Biology,第 2 冊，編輯 Ausubel 等人，Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience 中），榖胱甘肽 S-轉移 酶（GST; Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4:220-229)、 大腸桿菌甘露糖結合蛋白質（Guan等人，1987, Gene 67:21-30)、各種纖維素結合功能部位（美國專利第5,496,934號； 5,202,247號；5,137,819號；Tomme等人，1994, Protein Eng. 7:117-123) ’ 以及 FLAG 抗原決定位（Short Protocols in 144243.doc -68 - 201009079
Molecular Biology, 1999，編輯 Ausubel 等人，John Wiley & Sons, Inc.,單元10.11)等等。其他的肽標籤可被專一的結 合夥伴認出，並因此有助於藉著對結合夥伴的親和力結合 作用分離，最好是將該結合夥伴固定及/或放在固體支撐 物上。如同熟諳此藝者所知曉的，可使用許多方法獲得上 文-提及之肽標籤的密碼區，包括但不限於DNA選殖、 DNA擴大和合成方法。一些肽標籤和用來檢測及分離它們 的試劑是可購得的。 可藉著任何熟諳此藝者已知的方法，獲得來自個體的試 樣。在某些具體實施例中，該試樣包括鼻抽吸物、咽喉抹 拭物、痰或支氣管-肺泡灌洗液。 4.5.1.迷你基因組構築體 可產製迷你基因組構築體，含有反義報告者基因。本發 明可使用任何熟諳此藝者已知的報告者基因（參見下文 4.5.6.節）。在特定的具體實施例中，報告者基因為CAT。 在某些具體實施例中，報告者基因可位在反-義bPIV3或 hPIV3前導序列的側面，與肝炎δ核酶（Hep-d Ribo)和T7聚 合酶終止（T-T7)信號連接，而bPIV3或hPIV3拖尾序列則在 T7 RNA聚合酶啟動基因之前。 在一個具體實施例中，以協助者噬菌體，例如MVA-T7 或禽痘-T7轉移感染的細胞，提供了 T7 RNA聚合酶的來 源。在另一個具體實施例中，以編碼T7 RNA聚合酶之質 體轉移感染細胞。 在一些具體實施例中，然後以編碼N、P、L基因之質體 144243.doc -69- 201009079 和編碼迷你基因組之質體（所有的質體均在T7啟動基因的 控制之下）’轉移感染表現Τ7 RNA聚合酶的細胞。在一些 其他的具體實施例中，以編碼N、p、L和Μ2-1基因之質體 和編碼迷你基因組之質體，轉移感染表現T7 RNA聚合酶的 細胞。 可藉著任何熟諳此藝者已知的方法，測定報告者基因之 表現程度及/或其活性，像是，但不限於在4.56節中描述 的方法。 4.5.2.測量感染速率的發生率 可藉著任何此項技藝中已熟知的方法，判定感染的發生 率’包括但不限於針對感染的存在，測試臨床試樣（例如 鼻抹拭物）’例如’可藉著免疫螢光測定（IFA)，分別使用 抗-hMPV-抗原抗體、抗-rsv—抗原抗體、抗_hpiv_抗原抗 體’及/或對異源核苷酸序列之基因產物專一的抗體，來 檢測 hMPV、RSV、hPIV或 bPIV/hPIV組份。 在某些具體實施例中，可直接處理含有完整細胞的試 樣’而沒有完整細胞的分離物應先在許可的細胞株（例如 HEp-2細胞）上培養。在解釋性的具體實施例中，應藉著在 室溫下，以例如300xg離心5分鐘，使培養的細胞上清液澄 清’接著在相同的條件下以PBS，pH 7.4(不含Ca++和Mg++) 沖洗。將細胞小球再懸浮於少量體積的pBS中，以供分 析。將含有完整細胞的原始臨床分離物與PBS混合，並在 室溫下以300xg離心5分鐘。利用無菌的吸移管尖端，從界 面中移除黏液，並在相同的條件下，以pBS沖洗細胞小球 144243.doc •70· 201009079 一次以上。然後將小球再懸浮於少量體積的PBS中，以供 分析。將細胞懸浮液各5-10微升，點在以丙酮沖洗過之j2_ 孔HTC超級矯正之（supercured)玻片上每個5毫米的孔中， 並容許風乾。在冰冷的（-20 °C )丙酮中固定玻片1〇分鐘。藉 著在每孔中加入PBS-1%BSA ’接著在室溫下培養丨〇分鐘， 阻斷該反應。以PBS-0.1%ti溫-20沖洗玻片三次，並風 乾。將各10微升之以阻斷緩衝溶液稀釋至25〇毫微克/毫升 的初級抗體試劑，點在每孔中，並在潮濕的37。(：環境下培 養該反應30分鐘。然後以PBS_〇.1%吐溫_2〇廣泛地沖洗玻 片，更換三次，並風乾。將10微升之以阻斷緩衝溶液稀釋 至250毫微克/毫升的適當二級共軛抗體試劑，點在每個個 別的孔中，並在潮濕的37t：環境下培養該反應額外的3〇分 鐘。然後以PBS-0.1 %吐溫-20沖洗玻片，並更換三次。將5 微升PBS-50%甘油-10 mM Tris pH 8 〇1 mM edta點在每個 反應孔中’並在玻片上覆上蓋玻片。接著藉勞光顯微鏡， β 以200Χ功率，使用Β-2Α濾光鏡（ΕΧ 45〇_49〇毫微米），分析 每個反應孔。對獲自未染色細胞，或僅以二級試劑染色之 細胞的自動營光背景，給陽性反應評分。藉著在被感染細 胞之細胞質中，由小包涵物點出的明亮榮光，來定出聊 陽性反應的特徵。 4.5.3.測量血清力價 可藉著任何此項技藝甲已熟知的方法，判定抗體的血清 力價，例如’但不限於，可藉著三明治eusa來定量抗體 或抗體片段在血清試樣中的含量。簡言之，eusa包括利 144243.doc •71· 201009079 用認得在血清中之抗體或抗體片段的抗體塗覆微量滴定 盤，並在4°C下過夜。然後在室溫下，以pBS吐溫_〇 5% BSA阻斷該培養盤大約30分鐘。使用以pBS_BSA_BSA稀釋 之經過純化的抗體或抗體片段，建構標準曲線，並以pBs· BSA-BSA稀釋試樣。以一式兩份，將試樣和標準物加至測 定培養盤的孔中，並在室溫下培養大約丨小時。接著以 PBS-吐溫沖洗掉未-結合的抗體，並在室溫下利用經過標 示的二級抗體（例如與辣根過氧化酶共軛的山羊-抗-人類 IgG)處理已結合的抗體大約1小時。藉著加入對該標示專_ 一的色原受質’並測量該受質的周轉率，例如藉著分光光 度计’來檢測已標示之抗體的結合作用。藉著比較試樣之 受質周轉率與標準曲線之受質周轉率’來判定抗體或抗體 片段在血清中的濃度。 4.5.4.攻毒研究 使用該測定來判定本發明之重組病毒和本發明之疫苗， 在動物模式系統’包括棉鼠、敘利亞黃金倉鼠和祕,。老 鼠中預防下呼吸道病毒感染的能力。可藉著靜脈内〇v) 路徑、藉著肌肉内（IM)路徑或藉著鼻内路徑（in)，投予該 重組病毒及/或疫苗。可藉著任何熟諳此藝者已熟知的技 術投予違重組病毒及/或疫苗。亦使用該測定，使抗體 之血清濃度與降低與該抗體結合之病毒的肺臟力價發生關 在第0天 内之路徑 藉著肌肉内注射、藉著靜脈内注射或藉著鼻 以重組病毒或感興趣之疫苗或BSA接種動物 144243.doc •72- 201009079 組，包括但不限於棉鼠（棉鼠（Sigmodon hispidis)，平均重 100克）和倉鼠（例如敘利亞黃金倉鼠）。在投予本發明的重 組病毒或疫苗之前、同時或之後，以野外型病毒感染動 物’其中該野外型病毒是針對其產製疫苗的病毒^在某些 具體實施例中，在投予本發明之重組病毒及/或疫苗之後 至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6 天、至少1週、至少2週、至少3週或至少4週，以野外型病 毒感染動物。在較佳的具體實施例中，在投予本發明之重 組病毒及/或疫苗之後21天，以野外型病毒感染動物。在 另一個較佳的具體實施例中，在投予本發明之重組病毒及 /或疫苗之後28天，以野外型病毒感染動物。 在感染之後，犧牲動物，並收獲他們鼻部的鼻甲骨組織 及/或肺組織，再藉著適當的測定，例如溶菌斑測定和 TCID5〇測定，來判定病毒力價。可使用牛血清白蛋白 (BSA) 10毫克/公斤作為陰性對照組。可使用三 ELISA，判定在攻毒時，在血清中的抗體濃度。 4.5.5.臨床試驗 可進一步在正常健康的人饉士 J入頰心、願者組別中，包括所有年 齡的組別中，就其安全性、而A认 主改、耐爻性、免疫原性、傳染性和 樂物動力學，评估已經在活μ、Βιι 6 ▲ 舌體外測疋和動物模式中測試過 的本發明之疫苗或其片段。右鲂 权在較佳的具體實施例中，健康 的人類志願者是大約6週大的 ,.^ ^ 八幻誓兒’或較大的兒童和成 人。以經鼻、肌肉内、餹邮如▲丄 „ 脈内之方式，或藉著肺臟遞送系 統，將早一劑量的本發明舌 货月之4組病毒及/或本發明之疫苗 144243.doc •73· 201009079 投予志願者。在6至60個月齡之血清陰性的兒童中，可能 需要多個劑量的本發明之病毒及/或疫苗。在生命中前6個 月’刺激局部和全身免疫力，並克服母體抗體的中和作 用’亦可能需要多個劑量的本發明之病毒及/或疫苗。在 較佳的具體實施例中，使用在2、4和6週齡時的最初劑量 攝生法’以及在生命第二年開始時的補強劑量。可單獨或 與在相當年齡時所建議之小兒科疫苗一起，投予本發明之 重組病毒及/或本發明之疫苗。 在較佳之具體實施例中，使用雙盲隨機的、安慰劑-對 _ 照之臨床試驗。在特定的具體實施例中，使用電腦產生的 隨機計畫。例如’將在研究中的每個個體登記為單一的單 位，並指派獨特的案號。為了登記之目的，將個別處理在 一個家族中的多個個體。在研究期間，將仍使患者/監護 人、個體和研究者不知道個體已被分配到那一個處理組。 不知處理組分配的實驗室人員來進行企清學和病毒學 、九然而，預期在接種疫苗之後，從鼻沖洗液中獲得 =苗病毒的分離，將可能使病毒學實驗室的人員確認疫❹ ^將血凊學和病毒學的人員分開，並將避免血清學組獲 得任何培養結果的知識。 县丄·？ 此 在接受本發明的重組病毒及/或本發明的疫苗之 先監視每個志願者至少i 2小時’並在臨床處接受投藥 將'視每個志願者至少15分鐘。然後在投藥後第i_ 士 1 ' 28、35 '芯、49和56天，以門診病患之方式監視 〜'願者。在較佳的具體實施例中在每次接種疫苗之後的 144243.doc •74· 201009079 第1個Η 月’以門診病患之方式監視志願者。在整個試驗期 間’將報告與所有疫苗有關的嚴重不利事件。將嚴重不利 的事件定義為1)導致死亡，2)立刻威脅生命的，3)導致永 二實際上的無能’ 4)導致患者住院’或延長現正住院之 %者的住卩70期間，5)導致先天異常，6)是癌症或7)是研究 疫苗藥量過多之結果的事件，在第一次接種疫苗的當天 (第〇天）開始報告與疫苗無關的嚴重不利事件，並持續至最 φ 後人接種疫苗之後30天。在最後一次接種疫苗之後的3〇 天報告期間之後5至8個月，將不再報告與疫苗無關的嚴重 不利事件。在先前的劑量之後’若兒童有與疫苗有關之嚴 重不利事件，將不再給予疫苗/安慰劑的投藥。並未將任 何不利事件視為是與疫苗有關的，但若擔心，將在決定進 行另_人投藥之前，由臨床研究監視者與醫療監視者先進 行討論。 以下列之間隔.（i)在投與本發明之重組病毒及/或本發 ❹ 之疫田的、”。樂之前，（2)在投與本發明之重組病毒及/或 本發明之疫苗的給藥期間；（3)在投與本發明之重組病毒及 /或本發明之疫苗的給藥之後5分鐘、1()分鐘、15分鐘、 分鐘、30分鐘、i小時、2小時、4小時、8小時、12小時、 J時和48小4以及（4)在投與本發明之重組病毒及/或本 發明之疫苗的給藥之後3天、7天、14天、21天、以天：Μ 天、42天、49天和56天，經由留置套管或直接靜脈穿刺 (例如，藉著使用Π)毫升紅蓋的真空採血管），收集錢試 樣。在特定的具體實施财，獲得總共5次抽金（各3巧毫 144243.doc •75- 201009079 升）’分別在投予疫苗或安慰劑的第一次、第三次和補強 給藥之前’以及在第三次給藥和補強給藥之後大約1個 月。谷許S式樣在室溫下凝固，並在離心之後收集血清。 就對抗本發明之病毒的品系-專一之血清血球凝集素抑 制作用（HAI)抗體含量，測試血清。亦測試其他免疫原性 的指示劑，像是IgG、IgA或中和抗體。可測量對一或多個 其他同時給予之疫苗的血清抗體反應。可藉著ELISA定量 在得自患者之試樣中’對抗本發明之重組病毒及/或本發 明之疫苗所產生的抗體含量。 藉著從在投予本發明之重組病毒及/或本發明之疫苗的 給藥之後，在每個收集間隔處的血清含量，減去給藥前的 血清含量（背景含量），修正在志願者丘清中之抗體含量的 濃度。對每個志願者，根據模式-獨立性方法（Gibaldi等 人’編輯，1982，Pharmacokinetics，第 2版，Marcel Dekker,
New York)，從經過修正的血清抗體或抗體片段濃度，計 算藥物動力學參數。 培養在每次投予疫苗/安慰劑之後大約2、3、4、5、6、 7或8天時獲得的鼻沖洗液，檢測本發明之疫苗病毒的排 毋。在較佳的具體實施例中，培養在每次投予疫苗/安慰 劑之後7天時獲得的鼻沖洗液。亦使用鼻咽抹拭物、咽喉 抹拭物或鼻沖洗液’判定在志願者中，在研究期間的任何 時間’在醫學上伴隨著發燒疾病（直腸溫度大於或等於 102°F)，及/或喉炎、支氣管炎或肺炎而至之其他病毒的存 在。將試樣放在乾冰上運送至指定的研究場所。使用分離 144243.doc -76- 201009079 和定量本發明之疫苗病毒的測定，以及使用M Ab來確認本 發明之疫苗病毒的免疫染色測定（在下文的實例章節中， 提供這類測定的實例）。可針對其他的病毒和免疫反應， 包括IgG、IgA和中和抗體，測試鼻沖洗液的樣本。 4.5.6·報告者基因 在某些具體實施例中’本發明之方法可使用在組織培養 或在動物模式中，測量報告者基因表現的測定。將報告者 基因的核嘗酸序列選殖到病毒内，像是bPIV、hPIV或b/h PIV3 ’其中⑴改變報告者基因的位置並（Η)變更位在報告 者基因側面之基因間區域的長度。測試不同的組合，判定 報告者基因表現的最佳速率以及包括該報告者基因之病毒 的最佳複製速率。 在某些具體實施例中，產生包含報告者基因的迷你基因 組構築體。在4.5.1節中描述了迷你基因組構築體的建構。 可藉著任何熟諳此藝者已知的技術，判定報告者基因產 0 物的豐富性。這類技術包括，但不限於北方墨點分析或西 方墨點分析，分別使用對該報告者基因專一的探針或抗 體。 在某些具體實施例中’可使用發出可在FACS中檢測到 之螢光信號的報告者基因。可使用FACS來檢測在其中表 現該報告者基因的細胞。 將使用實行本發明之特定觀點的技術，除非另行指定， 由熟請此藝者例行地實行傳統的分子生物學、微生物學和 重組DNA操縱及產製技術。參見，例如Sambr〇〇k，1989, 144243.doc •77· 201009079
Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2 版；DNA Cloning,第 I和 II冊（Glover編輯，1985);以及 Transcription and Translation (Hames & Higgins編輯，1984) 〇 報告者基因產物的生化活性，代表報告者基因的表現程 度。報告者基因活性的總量，亦依據本發明之重組病毒的 複製速率。因此，欲判定得自重組病毒之報告者基因的真 實表現程度，應將總表現程度除以在細胞培養或動物模式 中之重組病毒的力價。 本發明之方法可使用的報告者基因，包括但不限於在下 表4中列舉的基因： 表4:報告者基因及各個報告者基因產物的生化特性 報告者基因 蛋白質活性&測量 CAT (氣黴素乙醯轉移酶） 將放射性乙醯基運送至氣黴素或藉 著薄層層析法和放射自顯術檢測 GAL (b-半乳糖甞酶） 水解無色的半乳糖苷，產生有顏 色的產物 GUS (b-尿甘酸酶） 水解無色的尿甘酸，產生有顏色 的產物 LUC (蟲螢光素酶） 氧化蟲螢光素，放出光子 GFP (綠螢光蛋白質） 螢光蛋白質，無受質 SEAP (分泌性鹼性磷酸酶） 與適當受質或與產生發色團之受 質的發光反應 HRP (辣根過氧化酶） 在氧化氫的存在下，氧化3,3’,5,5’-四 甲基聯苯胺，形成有顏色的複合物 AP (鹼性磷酸酶） 與適當受質或與產生發色團之受 質的發光反應 144243.doc -78- 201009079 特別可藉著西方墨點分析或北方墨點分析’或任何用來 定量核苷酸序列之轉錄、其mRNA或其蛋白質之豐富性的 其他技術，測量報告者基因的豐富性（參見Short Protocols in Molecular Biology，Ausubel 等人（編輯）’ John Wiley & Sons，Inc.,第4版，1999)。在某些具體實施例中，以得自 重組病毒之報告者基因表現的讀出，來測量報告者基因的 活性。為了定量報告者基因產物的活性，可調查報告者基 因產物的生化特徵（參見表4)。測量報告者基因產物之生化 ® 活性的方法，為熟諳此藝者已熟知的。在下文中陳述本發 明之方法可使用之解釋性報告者基因的更詳細說明。 蟲螢光素酶 蟲螢光素酶是在氧和受質（蟲螢光素）存在下發光的酵 素，並已經在細胞培養、個別細胞、整個生物和基因轉質 之生物中，用於基因表現的真-時、低-光顯影（由Greer & Szalay，2002，Luminescence 17(1):43-74回顧）。 ©當在本文中使用時，關於本發明所使用之“蟲螢光素酶” 一詞，企圖包括所有的蟲螢光素酶，或衍生自具有蟲螢光 素酶活性之蟲螢光素酶的重組酵素。已經完全定出得自螢 火蟲之蟲螢光素酶基因的特徵，例如得自螢火蟲屬 (Photinus)和絲角螢屬（Luciola)之物種（參見’例如國際專 利公開案第WO 95/25798號的北美螢火蟲（Photinus pyralis)，歐洲專利申請案第EP 0 524 448號的十字絲角螢 (Luciola cruciata)和侧絲角螢（Luciola lateralis)，以及 Devine等人，1993，Biochim. Biophys. Acta 1173 (2):121-132 144243.doc -79- 201009079 的明格里卡絲角螢（Luciola mingrelica)。其他真核生物的 蟲螢光素酶基因包括，但不限於海三色堇（sea panzy)(海三 色堇（Renilla reniformis)，參見，例如 Lorenz 等人，1991， Proc Natl Acad Sci USA 88(10):4438-4442)，以及無翅螢火 蟲（無翅榮火蟲（Lampyris noctiluca) ’參見，例如Sula-Newby等人，1996，Biochem J. 313:761-767)。細菌的蟲螢光 素-蟲螢光素酶系統，包括但不限於陸生螢光光桿菌 (Photorhabdus luminescens)的細菌 lux 基因（參見，例如 Manukhov等人，2000，Genetika 36(3):322-30)，和海洋細菌 費氏弧菌（Vibrio fischeri)和哈氏弧菌（Vibrio harveyi)(分別 參見，例如 Miyamoto 等人，1988，J Biol Chem. 263(26):13393-9 和 Cohn 等人，1983，Proc Natl Acad Sci USA.，80(1):120-3)。本發明所包括之蟲螢光素酶，亦包含 在8911卜代11等人之美國專利第6,265,177號中描述的突變種 蟲螢光素酶，將其全文以引用的方式併入本文中。 綠螢光蛋白質 綠螢光蛋白質（“GFP”）是238個胺基酸的蛋白質，其中胺 基酸65至67涉及發色團的形成，不需額外的受質或輔因子 來發出螢光（參見，例如Prasher等人，1992, Gene 111 :229-233; Yang等人，1996，Nature Biotechnol. 14:1252-1256和 Cody等人，1993，Biochemistry 32:1212-1218)。 當在本文中使用時，關於本發明所使用之“綠螢光蛋白 質”或“GFP”一詞，企圖包括所有的GFPs (包括顯示出綠色 以外的顏色的各種形式之GFPs)，或衍生自具有GFP活性之 144243.doc -80 - 201009079 GFPs的重組酵素。從生物發光的水母（水母（Aequorea victoria))中，選殖GFP的天然基因（參見，例如Morin等人， 1972, J. Cell Physiol. 77:313-318)。野外型GFP 在 395 毫微米 處具有主要的激發高峰，並在470毫微米處具有次要的激 發高峰。在470毫微米處的吸光度高峰，容許使用標準的 螢光素異硫代氰酸酯（FITC)濾紙組來監視GFP含量。已經 發現GFP基因的突變種，可用來增強表現，並修改激發和 螢光。例如，以丙胺酸、甘胺酸、異亮胺酸或蘇胺酸取代 在位置65處之絲胺酸的突變種GFPs，結果使突變種GFPs在 激發最高點出現位移，並當在488毫微米處激發時，有比 野外型蛋白質更大的螢光（參見，例如Heim等人，1995, Nature 373:663-664;美國專利第 5,625,048號；Delagrave等 人，1995，Biotechnology 13 :15 1-154; Cormack 等人，1996, Gene 173 :33-3 8 和 Cramer 等人，1996, Nature Biotechnol. 14:315-319)。在488毫微米處激發GFP的能力，容許將GFP 用於標準螢光激活細胞分類（“FACS”）設備。在另一個具體 實施例中，從水母以外的生物中分離GFPs，像是但不限於 海三色堇，海三色菫。 EGFP是野外型GFP (3-5)的變紅變種，為了在哺乳動物 細胞中更明亮的螢光和更高的表現，而充分運用它。（最 大激發=488毫微米；最大發射=507毫微米）。EGFP編碼 GFPmutl，其含有Phe-64至Leu和Ser-65至Thr的雙-胺基駿 取代。EGFP基因之密碼序列含有超過190個無聲鹼基變 化，其與人類的密碼子-使用偏好一致。 144243.doc -81 - 201009079 β-半乳糖苷酶 Ρ-半乳糖-苷酶（“b-gal”）是催化b_半乳糖菩，包括乳糖，以 及半乳糖苷類似物鄰-硝苯基-b-D-p比喃半乳糖嘗（“〇NpG，，） 和氣酴紅-b-D-说味半乳糖苷（“CPRG，，）之水解作用的酵素 (參見’例如Nielsen等人，1983 PrOC Natl Acad Sci USA 80(17):5198-5202; Eustice等人，1991，Bi〇techniqUes 11:739一 742 以及 Henderson 等人，1986, Clin. Chem. 32:1637-1641)。 b-gal基因非常適合作為報告者基因，因為其蛋白質產物是 極穩定的’對於在細胞溶胞產物中之蛋白水解的降解作用 有抵抗力，並容易測定。當使用ONPG作為受質時，可利 用分光光度計或微盤讀取器來定量b-gai活性。 當在本文中使用時，關於本發明所使用之"p_半乳糖 茹酶"或"b-gal” 一詞，企圖包括所有的b_gals，包括丨扣冗基 因產物’或衍生自具有b-gal活性之b-gals的重組酵素。匕_ gal基因非常適合作為報告者基因，因為其蛋白質產物是極 穩定的，對於在細胞溶胞產物中之蛋白水解的降解作用有 抵抗力，並容易測定。在ONPG為受質的具體實施例中， 可利用分光光度計或微盤讀取器判定在42〇毫微米處轉變 之ONPG的量，來定量b-gal活性。在CPRG為受質的具體實 施例中，可利用分光光度計或微盤讀取器判定在57〇至595 毫微米處轉變之CPRG的量，來定量b-gal活性。 氣黴素乙醯轉移酶 氣黴素乙醯轉移酶（“CAT”）在哺乳動物細胞系統中，經 常用來作為報告者基因’因為哺乳動物細胞沒有可檢測之 144243.doc -82 - 201009079 含量的CAT活性。CAT的測定涉及將細胞萃取物與放射性 標示之氣黴素和適當輔因子一起培養，藉著例如薄層層析 法（“TLC”）從產物中分離起始物f，接著是閃爍計數（參 見’例如美國專利第5,72M41號，將其全文以引用的方式 併入本文中）。 當在本文中使用時，關於本發明所使用之“氣徽素乙酿 轉移酶”或“CAT”一詞’企圖包括所有的CATs，或衍生自 具有CAT活性之CAT的重組酵素。雖然最好是不需要細胞 加工、放射性同位素和層析分離的報告者系統，將更可接 受高輸貫量㈣選，但在報告者基因之較性極為重要的 情況下，以CAT作為報告者基因可能是較佳的。例如， CAT報告者蛋白質具有大約5〇小時的在活體内之半衰期， 當想要累積對動力學變化類型之結果時，這是有利的。 分泌性驗性填酸酶 分泌性鹼性磷酸酶（“SEAP”）酵素是鹼性磷酸酶的截短形 式，其中蛋白質之穿透膜功能部位的切開，容許將其從細 胞中分泌至周圍培養基内。 當在本文中使用時’關於本發明所使用之“分泌性鹼性 磷酸酶，，或“SEAP”一詞，企圖包括所有的SEAp，或衍生自 具有驗性鱗酸酶活性之SEAP的重組酵素。可藉著各種方 法檢測SEAP活性’包括但不限於測量螢光受質之催化作 用、免疫沉搬法、HPLC和放射檢測。發光法是較佳的， 因為它增加的敏感性勝過熱量檢測法。使用SEAp的優點 是不需要細胞溶解步驟’因為SEAP蛋白質被分泌到細胞 144243.doc -83- 201009079 外，其有助於採樣和測定程序的自動化。在Potts等人之美 國專利第6,280,940號中描述了以細胞為基礎，使用SEAP 的測定，可用在C型肝炎病毒蛋白酶抑制劑之以細胞為基 礎的評估中，將其全文以引用的方式併入本文中。 4.5.7.細胞培養系統、胚胎卵和動物模式 可使用此項技藝中已知的細胞培養系統，繁殖或測試本 發明之病毒的活性（參見，例如Flint等人，PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, 2000, ASM Press 第 25-29頁，將其全文以 引用的方式併入本文中）。這類細胞培養系統的實例，包 括但不限於從動物組織製備的原始細胞培養物（例如衍生 自猴腎、人類胚胎羊膜、腎臟和包皮以及雞或老鼠胚胎的 細胞培養物）；由單一類型之均一族群所組成的二倍體細 胞品系，在染色之前可分裂高達100次（例如衍生自人類胚 胎的細胞培養物，像是衍生自人類胚胎肺臟的WI-38品 系）；以及由單一細胞類型組成的連續細胞株，並可在培 養中無限期地繁殖（例如HEp-2細胞、Hela細胞、Vero細 胞、L和3T3細胞以及BHK-21細胞）。 亦可在雞胚中繁殖本發明之病毒。在受精後5至14天， 在殼上鑽孔，並將病毒注射到適合其複製的地方。 在本發明中可使用任何此項技藝中已知的動物模式，達 成各種目的，像是判定本發明之疫苗的效力和安全性。這 類動物模式的實例包括，但不限於棉鼠（棉鼠（Sigmodon hispidis))、倉鼠、老鼠、猴子和黑猩猩。在較佳的具體實 144243.doc -84- 201009079 施例中，使用敘利亞黃金倉鼠。 4.5.8.中和測定 可進行中和測定，提出 托出將異源表面糖蛋白併 内，是否可能產生改變痣主aw主a , 病蚕粒子 雙病f向性表現型之結果沾击面〜 性爭論。杏在太令&说 果的重要安全 丨爭…在本文中使用時’ “向性，，一詞意指病毒 細胞類型的親和力。通常葬 胁心… 著出現在特定細胞上的細胞受 體。’來&向性’其容許病毒侵人並僅限於該料細胞類
支。藉者使用異源表面糖蛋白㈣歳（非限制性 負股RNA病毒的F蛋白質 ^ }及I栝對抗该異源表面糖蛋白 之抗體的多株抗血清，來谁耔由*加— ^ 月來進订中和測定。測試不同稀釋度 的抗體’看是否可中和太恭ηΒ>山人， 疋”中和本發明之嵌合型病毒。異源表面糖 蛋白不應該以足以導致抗體結合和中和作用的量，出現在 病毒粒子表面上。 4.5.9.蔗糖梯度測定 可藉著使用生化敎，進—步調查異源蛋白質是否被併 入病毒粒子内的問題。可在2請％㈣糖梯度中，分級分 離被感染細胞的溶胞產物，收集各種溶離份，並藉著西方 墨點法，分析異源蛋白質和載體蛋白質的存在與分布。亦 可藉著溶菌斑敎，就高峰病毒力價，測七容離份和病毒 蛋白質。在下文第23節中提供了簾糖梯度測定的實例。當 異源蛋白質與病毒粒子結合時，它們將與病毒粒子一起移 動。 4.6.使用嵌合型病毒的疫苗調配物 本發明包括含有本發明之經過設計之負m病毒的疫 144243.doc •85· 201009079 苗調配物。可使用本發明之重組ριν料，作為表現外來 抗原決定㈣齡’該㈣线位料對㈣各種病原的 保蔓f±反應、纟特疋的具體實施例令，本發明包括在疫苗 調配物中使用已經修改的重組瞻病毒或減毒的贿 與對hPIV感染的保護。 —本發明之疫苗製品包括多價疫苗，包括二價和三價的疫 裝 可以個表現每個異源抗原序列的pIV載體，或 或多個刀別編碼不同的異源抗原序列之附載體的形 式，投予本發明之二價和三價疫苗。例如，可將表現一或 多個異源抗原序列的第—個嵌合型PIV，與表現__或多個 異源抗原序列的第二個嵌合型PIV_起投予，纟中在第二 個嵌σ型PIV中的異源抗原序列，與在第—個嵌合型MV中 的異源抗原序列不同。在第—和第：個嵌合型PIV中的異 源抗原序列，可^生自相同的病毒，但編碼不同的蛋白 質或衍生自不同的病毒。在較佳的具體實施例中，在第 -個嵌合型PIV中的異源抗原序列’係衍生自呼吸道融合 細胞病毒’而在第二個嵌合型PIV中的異源抗原序列，係 何生自人類間質肺病毒。在另__個較佳的具體實施例中， 在第-個嵌合型PIV中的異源抗原序列，係衍生自呼吸道 融合細胞病毒，而在第二個嵌合型PIV中的異源抗原序 列，係衍生自禽肺病毒。 在某些較佳的具體實施例中，使用本發明之疫苗調配 物，保護對抗由負股RNA病毒引起的感染，包括但不限於 流感病毒、副流感病毒、啤吸道融合細胞病#和哺乳動物 144243.doc -86· 201009079 間質肺病毒（例如人類 負間貝肺病毒）。更特定而言，使用本 發明之疫苗調配物，伴 保護對抗由人類間質肺病毒及/或禽 肺病毒引起的感染。右 在某些具體實施例中，使用本發明之 疫苗調配物，保護對浐 了仏由（a)人類間質肺病毒和呼吸道融合 、t病毒及/或（b)禽肺病毒和呼吸道融合細胞病毒引起的 感染。 在某一、體只施例中’使用本發明之疫苗調配物，保護 對抗由⑷人類間質肺病毒和人類副流感病毒及/或⑻禽肺 病毒和人類副流感病毒引起的感染。 在某些具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物，保護 對抗由⑷人賴質肺病毒、呼吸道融合細胞病毒和人類副 抓感病毒及/或（b)禽肺病毒、呼吸道融合細胞病毒和人類 副流感病毒引起的感染。 在某些具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物，保護 對抗由人類間質肺病毒、啤吸道融合細胞病毒和人類副流 感病毒引起的感染。在某些其他的具體實施例中，使用本 發明之疫苗調配物，保護對抗由禽肺病毒' 呼吸道融合細 胞病毒和人類副流感病毒引起的感染。 因為在不同病毒物種之F蛋白質中的高度同種性，關於 代表性的胺基酸序列比較，參見圖丨，故可使用本發明之 疫苗調配物，保護免於與從其中衍生編碼F蛋白質之異源 核苷酸序列的病毒不同的病毒。在特定的代表性具體實施 例中’該疫苗調配物含有包括衍生自禽肺病毒A型之異源 核誓酸序列的病毒’並使用該疫苗調配物，保護免於禽肺 144243.doc •87- 201009079 病毒A型和禽肺病毒B型的感染。在另一個特定的代表性 具體實施例中，該疫苗調配物含有包括衍生自禽肺病毒C 類之異源核：y：酸序列的病毒，並使用該疫苗調配物，保護 免於禽肺病毒C類和禽肺病毒D類的感染P。 本發明包括待投予人類和動物的疫苗調配物，其可用來 保護對抗PIV、流感、RSV、仙臺病毒、腮腺炎、喉氣管 炎病毒、猿病毒5、人類乳頭狀瘤病毒以及其他病毒和病 原。本發明更進一步包括待投予人類和動物的疫苗調配 物，其可用來保護對抗人類間質肺病毒感染和禽肺病毒感 染。 在一個具體實施例中，本發明包括可用來對抗家畜致病 原，包括狂犬病病毒、I苗白血病病毒（FLV)和犬痕熱病毒 的疫苗調配物。在另一個具體實施例中，本發明包括可用 來保護家畜對抗水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、牛瘟病 毒、豬痘病毒，並進一步保護野生動物對抗狂犬病病毒的 疫苗調配物。 在本文中描述之疫苗和醫藥組合物中，可使用藉著逆向 遺傳方法產製的減毒病毒。亦可使用逆向遺傳技術，為其 他對產生疫苗很重要的病毒基因，設計額外的突變。例 如，在5’非-密碼區中的突變，可影響mRNA轉譯，咸相信 在衣殼蛋白質中的突變會影響病毒的裝配，而感溫性和感 冷性的突變種，通常具有比親代病毒更低的病原性（參 見，例如 Flint 等人，PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, 144243.doc -88 - 201009079 2000, ASM Press第67。_683頁，將其全文以引用的方式併 入本文中）。可將有用病毒品系變種的抗原決定位，設計 在減毒病毒内。或者，可將完全外來的抗原決定位包括 何生自其他病毒或非-病毒病原的抗體，設計在減毒品系 内。例如，可將無關的病毒’像是mv (gpl6〇、卽12〇、' gp41)、寄生蟲抗原（例如癔疾）、細菌或真菌抗原，或腫瘤 抗原，設計在減毒品系内。或者，可將在活體外改變病毒 向性的抗原決定位，設計在本發明之嵌合型減毒病毒内。 幾乎可將任何的異源基因序列建構至本發明之喪合型病 毒内，以便在疫苗中使用。較佳的是，對任何各種的病原 誘導保護性免疫反應的抗原決定位，或與中和抗體結合， 可由嵌合型病毒表現，或為其一部分的抗原。例如，可建 構至本發明之拔合型病毒内的異源基因序列，包括但不限 於流感和副流感血球凝集素-神經胺糖酸苷酶，以及融合 糖蛋白，像是人類PIV3的HN*F基因。在另一個具體實^ 例中’可設計在嵌合型病毒内的異源基因序列，包括編碼 具有免疫強化活性之蛋白質的那些。免疫強化蛋白質的實 例包括，但不限於細胞激動素、干擾素第丨型、丫干擾素、 菌落刺激因子、介白素_】、_2、胃4、_5、_6、_ 12。 此外，可被建構至本發明之嵌合型病毒内，並在疫苗中 使用的異源基因序列’包括但不限於衍生自人類免疫缺陷 病毒（HIV)，最好是第i或第2型的序列。在較佳的具體實 施例中，免疫原性之HIV-衍生肽，可以是建構至嵌合型 PIV内之抗原的來源，然後用它來誘發脊椎動物的免疫反 144243.doc •89· 201009079 應。這類HIV-衍生之肽，可包括但不限於衍生自咖基因 (即編碼全部或部分gpl6〇、印12〇及/或卯Μ的序列）、基 因（即編碼全部或部分逆轉錄酶、核酸内切酶、蛋白酶及/ 或接合酶的序列）、gag基因（即編碼全部或部分、 P55、pl7/18、p24/25 的序列）' ⑻、_、—、咐、二、 vpr及/或VpX的序歹丨j 〇 其他的異源序列可衍生自B型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)，A或C型肝炎病毒表面抗原、愛氏頓病毒的糖蛋 白；人類乳頭狀瘤病毒的糖蛋白；呼吸道融合細胞病毒、❿ 副流感病毒、仙臺病毒、猿病毒5或腮腺炎病毒的糖蛋 白；流感病毒的糖蛋白；疱疹病毒的糖蛋白；骨髓灰白質 炎病毒的VP1 ;諸如細菌和寄生蟲之類非-病毒性病原的抗 原決定位，此外還有很多。在另一個具體實施例中，可表 現全部或部分的免疫球蛋白基因。例如，可將模仿這類抗 原決定位的抗-遺傳性型之免疫球蛋白的可變區建構至本 發明之嵌合型病毒内。 其他的異源序列可衍生自腫瘤抗原，並可使用所得的嵌 〇 合型病毒產生對抗該腫瘤細胞的免疫反應，導致腫瘤在活 體内退化。為了治療腫瘤，這些疫苗可與其他治療攝生法 併用，包括但不限於化學治療、輻射治療、手術、骨趙移 植等等。根據本發明’可設計重組病毒，表現與腫瘤有關 的抗原（TAAs)，包括但不限於由τ細胞認出的人類腫瘤抗 原（Robbins和 Kawakami, 1996，Curr· Opin. Immunol. 8:628- 636 ’將其全文以引用的方式併入本文中）、黑色素細胞系 144243.doc •90· 201009079 統的蛋白質，包括 gpl〇〇、MART1/MelanA、TRP] (gp75) '酪胺酸酶；腫瘤專一的廣泛共享之抗原，河八〇匕 1、MAGE-3、BA(3E、GAGE-1、N-乙醯葡萄糖胺基轉移 酶·V、p15 ;腫瘤專一的突變抗原，a-凱特寧U-catenin)、 MUM-1、CDK-4 ;乳房、#巢、子宮頸和騰臟癌的非黑色 素瘤抗原、HER-2/neu、人類乳頭狀瘤病毒_E6、_E7、 MUC-1。 ❹ 在另一個具體實施例中，異源核苷酸序列係衍生自間質 肺病毒，像是人類間質肺病毒及/或禽肺病毒。在另外的 具體實化例中’本發明之病毒含有兩個不同的異源核誓酸 序列，其中一個衍生自間質肺病毒，像是人類間質肺病毒 及/或禽肺病#，而另一個衍生自呼吸道融合細胞病毒。 異源核·#酸序列編媽個別病毒的F蛋白質或〇蛋白質。在特 定的具體實施例中，異源核甞酸序列編碼嵌合型F蛋白 質’其中該嵌合型F蛋白質含有間質肺病毒之f蛋白質的外 • 減部位以及副流感病毒以蛋白質的穿透膜功能部位和 魯米那功能部位。 可調配活的重組病毒疫苗或失活的重組病毒疫苗。活疫 苗可能是較佳的，因為在宿主中增殖，導致與在自然感染 時所發生之刺激類似種類和大小的延長刺激，並因此賦與 實質上長期-持續的免疫力。可使用涉及在細胞培養物或 在雞胚之尿囊中繁殖病毒的傳統方法，接著純化，完成這 類活重組病毒疫苗調配物的產製。另外，已經證實b爾在 人類中是非-病原性的，該病毒極適合用來作為活疫苗。 】44243.doc •91 · 201009079 關於這一點’為了疫苗而使用遺傳設計的PIV (載體），可 月b希望在這些品系中，有減毒特徵的存在。將適當的突變 (例如刪除）導入用來轉移感染的模板中，可提供具有減毒 特徵的新穎病毒。例如，可將與感溫性或冷適應性有關的 特定誤義突變，做成刪除突變。這些突變應該比與感冷或 感溫性突變種有關的點突變更穩定，且逆轉的頻率應該很 低。 或者，亦可建構具有"自殺"特徵的嵌合型病毒。這類病 毒在宿主内將僅完成一次，或數次複製。當用來作為疫苗 時’重組的病毒將完成有限回合的複製，並引起足夠程度 的免疫反應’但它將不會在人類宿主中進—步運轉，並引 起疾病。缺乏一或多個PIV基因，或持有突變PIV基因的重 組病毒，將不能經歷成功的連續複製。可在永久表現這類 基因（們）的細胞株中，產製有缺陷的病毒。缺乏必要基因 (們）的病毒將在這些細胞中複製’然而，當投予人類宿主 時，它們將不能完成一回合的複製。這類製品可轉錄和轉 譯一在該不成熟的回合中—足夠數目的基因，而誘導免疫反 應。或者，可投予較大量的品系，使這些製品得以作為失活 的（死的）病毒疫苗。關於失活的疫苗，最好是以病毒組份 之形式來表現異源基因產物’使基因產物得以與病毒粒子 結合。這類製品的優點是它們含有天然蛋白質，且未經歷 藉著福馬林或其他用來製造死毒疫苗之製劑處理的失活作 用。或者’可將由cDNA製造的突變PIV高度減毒，俅i世 可複製數回合。 ' 144243.doc -92- 201009079 在本發明該項觀點的其他具體實施例中，可使用傳統技 術來"殺死"嵌合型病毒，製備失活的疫苗調配物。失活的 疫苗疋"死的"，在意義上來說，已經破壞了它的傳染性。 確實，破壞病毒的傳染性，但不影響其免疫原性。為了製 備失活的疫苗，可使嵌合型病毒生長在細胞培養物中，或 在雞胚的尿囊中，藉著區域超離心作用純化，藉著甲醛或 a-丙醇酸内酯失活，並收集之。所得的疫苗通常以肌肉内 接種。 可使用各種技術來評估根據本發明之疫苗的效力和安 全。有效的疫苗是藉著引起適當天生的細胞和體液反應， 保護接種疫苗之個體免於病原引起的疾病，並具有最低副 作用的疫苗。疫苗不得引起疾病。可使用任何能夠測量病 毒之複製，以及接種疫苗之個體的免疫反應的技術，來評 估病毒。在下文的實例章節中提供非-限制性的實例。 4.6.1.本發明之疫苗或免疫原製品的劑量攝生法和投藥 本發明提供疫苗和免疫原製品，包括表現一或多個異源 或非-天然抗原序列的嵌合型PIV。本發明之疫苗或免疫源 製品’包括單一或多價的疫苗’包括二價和三價的疫苗。 本發明之疫苗或免疫原調配物，可用來提供對抗各種病毒 感染的保護。特定而言，本發明之疫苗或免疫原調配物提 供宿主對抗呼吸道感染的保護。 可單獨或與其他疫苗一起投予本發明之重組病毒及/或 疫苗或免疫原調配物。較佳的是，與其他提供對抗呼吸道 疾病之保護的疫苗或免疫原調配物，一起投予本發明之疫 144243.doc 201009079 苗或免疫原調配物，像是但不限於呼吸道融合細胞病毒疫 苗、流感疫苗、肺炎球菌疫苗、立克次體疫苗、葡萄球菌 疫苗、百日咳疫苗或對抗呼吸道癌症的疫苗。在較佳的具 體實施例中，本發明之病毒及/或疫苗可與在相符年齡建 議之小兒科疫苗同時投予。例如，在2、4或6個月齡時， 本發明之病毒及/或疫苗可與DtaP (IM)、Hib (IM)、骨髓灰 白質炎（IPV或OPV)和B型肝炎（IM)同時投予。在12或15個 月齡時，本發明之病毒及/或疫苗可與Hib (IM)、骨髓灰白 質炎（IPV或 OPV)、MMRII® (SubQ) ; Varivax® (SubQ)和 B型 肝炎（IM)同時投予。在各種出版物中回顧可與本發明之方 法一起使用的疫苗，例如The Jordan Report 2000，Division of Microbiology and Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, United States，將其全文以引用的方式併入本文 中。 可將本發明之疫苗或免疫原調配物本身投予個體，或以 醫藥或治療組合物之形式投予。包括佐劑和本發明之免疫 原抗原（例如病毒、嵌合型病毒、突變病毒）的醫藥組合 物’可藉著傳統的混合、溶解、粒化、製造糖衣錠、研 磨、乳化、包膠、陷入或冷凍乾燥加工的方法來製造。可 使用一或多種在生理學上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑 或輔助劑，以傳統的方式調配醫藥組合物，其有助於將本 發明之免疫原抗原加工成可在藥學上使用的製品。其中， 適當的調配物將視所選擇的投藥途徑而定。 144243.doc •94· 201009079
當本發明之疫苗或免疫原組合物包括佐劑或與一或多種 佐劑一起投予時，可使用的佐劑包括，但不限於無機鹽佐 劑或無機鹽凝膠佐劑、顆粒佐劑、微顆粒佐劑、黏液的佐 劑和免疫刺激性的佐劑。佐劑之實例包括，但不限於氫氧 化紹、破酸紹凝膠、福瑞德氏完全佐劑、福瑞德氏不完全 佐劑、角鯊烯或角鯊烷水包油佐劑調配物、生物可降解和 生物可相容的聚酯類、聚合的微脂粒'三萜系糖苷或皂角 菩（例如 QuilA和 QS-21 ’ 亦以商標 STIMULON、ISCOPREP 販售）、N-乙醯基_胞壁醯基1_蘇胺醯基_D_異穀胺醯胺（蘇 胺酿基-MDP，亦以商標TERMURTIDE販售）、LPS、單鱗 醯基脂質A (3D-MLA，亦以商標MPL販售）。 投予本發明之疫苗或免疫原組合物的個體較好是哺乳動 物，最好是人類，但亦可以是非-人類的動物，包括但不 限於靈長類、牛、馬、綿羊、豬、禽類（例如雞、火雞）、 山羊、貓、狗、倉鼠、老鼠和大鼠。 了使用許多方法，導入本發明之疫苗或免疫原組合物， 包括但不限於口服、皮内、肌肉内、腹腔内、靜脈内、皮 下、鼻内的路徑，並經由劃痕法（經由皮膚的上層劃痕， 例如使用分又的針頭）。 關於局σ卩投藥，可將本發明之疫苗或免疫原製品調配成 此項技藝中已熟知的溶液、凝膠、軟膏、乳霜、懸浮液等 等。 ~ 至於吸入投藥，可以從加壓包裝或霧化器提供之氣溶膠 噴霧的形式，便利地遞送根據本發明使用之製品，並使用 144243.doc •95- 201009079 適當的推進劑，例如二氣二氟甲⑨、三氣氟甲烷、二氣四 氟乙烧—氧化碳或其他適當的氣體。在加壓氣溶膠的案 例中，可藉著提供活Η，遞送計量過的含量，來判定劍量 單位。可調配在吸人器或吹藥器中使用的膠囊和藥筒，使 ，、3有化合物之散劑混合物，以及適當的散劑基底像是 乳糖或澱粉。 關於注射，可在含水溶液中，最好是在生理學上可相容 的緩衝溶液，像是漢克氏液、林格氏液或生㈣水缓衝溶 ，中’調配疫苗或免疫原製品。該溶液可含有調配劑，像 疋d浮穩疋及/或分散劑。或者，該蛋白質為散劑形 式’在使用之前，利用摘者&丄甘 用週田的媒劑，例如無菌無熱原的水 重建。 熟諳此藝者有能力判定投藥用的疫苗或免疫原調 配物& ................ 有效含量’特別是根據在本文中提供的詳細揭示内容 -開始可從在活體外的測定’估計有效劑量。例如，； 使用此項技藝令已熟知的技術，調配在動物模式令達到, 導免疫反應的劑量。熟諳此藝者可以在本文中描述的結為 為基礎，輕易地充分運用對所有動物物種的投藥。可個另 地調整劑量含量和間隔。例如，當用來作為免疫原組合* 時’適當的劑量是當按照上述投藥時，能夠誘發抗體反肩 的組合物量。當用來作為疫苗時，可在⑽週的期間 大約1至3個難’投予本發明之疫苗或免疫原調配物4 佳的是以大約2週至大約4個月的間隔，投予!或2個劑量: 之後定期給予補強的疫苗接種。交替的草案可能適合個, 144243.doc •96~ 201009079 的動物。適當的劑量是當按照上述投藥時，能夠使在被免 疫動物中的免疫反應升高，足以保護該動物免於感染至少 4至12個月的疫苗調配物量。一般而言，出現在劑量中之 抗原的量，範圍是從每公斤宿主大約i微微克到大約1〇〇毫 克’通常是從大約1 0微微克到大約1毫克，而較佳的是從 大約100微微克到大約1微克。適當的劑量範圍，將視注射 路徑和患者的尺寸而改變，但通常範圍是從大約〇丨毫升到 大約5毫升。 翁 在特定的具體實施例中，以至少1〇3 TCID5〇、至少1〇4 tcid50、至少105 tcid50、至少l〇6 tcid50之開始單一劑 量，投予本發明之病毒及/或疫苗。在另一個特定的具體 實施例中’以多個劑量投予本發明之病毒及/或疫苗。在 較佳的具體實施例中，使用在2、4和6個月齡時的最初給 藥攝生法’以及在生命第二年開始時的補強給藥。更佳的 疋，以多次給藥攝生法，給予至少1〇5 TCID5()或至少106 ❹ TCIDm的每個劑量。在臨床試驗中，可使用病毒的複製速 率作為調整疫苗劑量的指標。例如，可使用測試病毒複製 速率的測定（例如生長曲線，關於可利用的測定，參見4.5 節）’比較本發明之病毒及/或疫苗的複製速率與bPI V3的速 率，在先前的研究中已證實之（參見Clements等人，J. Clin. Microbiol. 29:1175_82(1991); Kamm等人，】祿以此 171.1107-14 (1995); Karron 等人，Ped. Inf. Dis. J. 5:650- 654(1996)。這些研究顯示牛pIV3疫苗通常是安全的，並為 健康的人類志願者所能完全忍受的，包括成人、6_6〇個月 144243.doc •97- 201009079 齡的兒童以及2-6個月齡的嬰兒。在這些研究中，個體接 受至少一個劑量從103 TCID5〇至106 TCID50的bPIV3疫苗。 12個兒童改而接受兩個劑量的1〇5 TCID5() PIV3疫苗代替一 個劑量，沒有不利的影響）。可與bPIV3相比擬的複製速 率，暗示在臨床試驗中可使用可相比擬的劑量。與bPIV3 相比較，較低的複製速率暗示可使用較高的劑量。 下列的實例係用來解釋，而非限制本發明。如下維持在 實例中使用的細胞和病毒：使RSV A2品系和載有牛副流感 第3型/人類副流感第3型之RSV病毒（bPIV3/hPIV3/RSV病 毒），在健大黴素的存在下生長在在Opti-MEM (Gibco/BRL) 中的Vero細胞中。使表現噬菌體T7 RNA聚合酶的經過修改 之疫苗病毒安卡拉（MVA-T7)或禽-痘-T7 (FP-T7)生長在雞 胚腎臟細胞（SPAFAS)中。將Vero、HeLa和Hep-2細胞維持 在補充有10%胎牛血清（FBS)、2mM L-穀胺醯胺、非-必要 胺基酸和抗生素的MEM (JRH Biosciences)中。
實例1 :建構並選殖嵌合型牛副流感3/人類副流感3 cDNA 為了以hPIV3的F和HN基因取代bPIV3的那些，將额外的 限制酵素位置導入傳染性的bPIV3 cDNA内，使用指定位 置之突變生成作用，在bPIV3 cDNA的核苷酸位置5041處， 導入獨特的Nhe I位置，並在核苷酸8529處，導入Sail位 置。以Nhel和Sail限制酵素處理經過修改的全長bPIV3 cDNA ’並藉著凝膠純化作用，分離包括除了 ρ和hn基因 之外所有病毒bPIV3序列的14 kb DNA片段。 欲獲得hPIV3 F和HN基因序列，以hPIV3品系（hPIV3/Tex/ 144243.doc -98- 201009079 12084/1983)感染10公分培養皿的匯合Vero細胞。在37°C下 培養3天之後，收獲細胞，並使用RNA STAT-LS 50 (Tel-Test Inc.)分離總 RNA。 藉著逆轉錄作用 ，使用 hPIV3 專一 的寡，在hPIV3基因組的位置4828處黏接，產生病毒 cDNA。藉著PCR (聚合酶連鎖反應），使用Taq聚合酶，擴 大hPIV3 F和HN基因。將PCR產物選殖到pT/A TOPO選殖載 體（Invitrogen)内，並從兩個純種系（11號和14號）中，定序 hPIV3 F*HN基因。序列分析顯示，關於純種系11號，F基 因是正確的，但HN基因含有反常的序列；關於純種系14 號，HN基因是正確的，但F基因含有反常的中止密碼子。 因此，藉著以下列方式混合11號的正確F基因與14號的正 確HN基因，建構包含具有功能之hPIV3 F和HN基因的質 體。以Nhe 1和EcoRl消化兩個hPIV3質體（11號和14號）。一 個1.6 kb之片段，藏有分離自純種系11號的正確F基因，以 及一個8.5 kb之片段，含有分離自純種系14號的正確HN基 因和質體序列。連接兩個片段，產生含有完整hPIV3 F和 HN基因的質體◊藉著DNA序列分析證實正確的序列。最 後，在非轉譯區域中之HN基因的3'末端處，加入一個核甞 酸，以便滿足“六的規則”。可藉著使用QuikChange突變生 成套組（Stratagene)完成單一核替酸的加入，並藉著DNA定 序證實之。然後藉著以Nhe 1和Sal 1消化，分離正確的 hPIV3F和HN基因DNA片段，並以凝膠純化3.5kb之DNA片 段。 藉著連接上述之藏有bPIV3序列的14.5 kb DNA片段與含 144243.doc •99- 201009079 有hPIV3 F和HN基因的3.5 kb DNA片段，建構全長的b/h PIV3嵌合型cDNA (參見圖3)。藉著延伸限制酵素作圖’證 實全長的嵌合型質體DNA。此外’可藉著對兩個含有 bPIV3和hPIV3序列，以及Nhe 1和Sal 1限制酵素位置分別 進行DNA定序，證實嵌合型構築體的M/F和HN/L基因接合 點。 實例2:建構並選殖載有呼吸道融合細胞病毒cDNAs 的嵌合型牛副流感3/人類副流感3 為了判定在b/h PIV3基因組之位置1或2中’插入RSV抗 原對病毒複製的影響，將呼吸道融合細胞（RSV)F和G基因 選殖到嵌合型牛副流感3/人類副流感3載體（b/h PIV3載體） 的不同位置内。參見圖4。
為了將外來基因插入牛/人類（b/h) PIV3 cDNA内，藉著 指定位置之突變生成作用，使用QuickChange套組 (Stratagene)，將AvrII限制酵素位置導入b/h PIV3 cDNA質 體（Haller等人，2000; 2001，這是與在實例5中相同的構築 體）内。使用下列的寡 5'GAA ATC CTA AGA CCC TAG GCA TGT TGA GTC3,及其互補物，將一個AvrII位置導入b/h PIV3基因組中的核苷酸（nt) 104處，使四個核苷酸改變。 使用該限制酵素位置，在病毒基因組的第一個（最靠近3’） 位置中插入RSV基因。使用下列的寡 5'CCACAACTCAATCAACCTAGGATTCAT GGAAGACAATG3,及其互補物，將另一個AvrII位置導入在 nt 1774處的N-P基因間區域中，使兩個核甞酸改變。使用 144243.doc -100- 201009079 該限制位置，在b/h PIV3之N和P基因之間的第二個位置中 插入RSV基因（圖4)。藉著逆向遺傳學，針對病毒恢復之官 能性’測試在nts 104和1774處藏有AvrII位置的全長b/h PIV3 cDNAs。 RSV G卡匣（N-P基因中止/開始）的建構：使用b/h PIV3 cDNA作為PCR模板，產生DNA片段，其含有bPIV3 N-P基因間 區域，以及RSV G基因的3’端序列。藉著PCR，使用下列的 募 ：
5'CCCAACACACCACGCCAGTAGTCACAAAGAGATGACCACTATCAC3' 和 5，CCCAAGCTTCCTAGGTGAATCTTTGGTTGATTGAGTTGTGG3' 產生該片段。然後使用該片段進行重疊PCR，將RSV G基 因加至bPIV3 N-P基因間區域。至於第二個PCR反應，使用 含有RS V G和F基因的質體作為DNA模板，並使用寡 5'CAGCG GATCCTAGGGGAGAAAAGTGTCGAAGAAAAATGTCC3，和 從上文之短PCR片段產生的寡作為引子。將所得的含有 RSV G基因（其與bPIV3 N-P基因間區域連接，並位在AvrII 限制酵素位置側面）之PCR片段，選殖到pGEM3内。定出 RSV G基因之序列，證實完整的開放編閱架構和預測之胺 基酸序列的存在。使用在僅藏有bPIV3基因組前5200個核 苷酸（1-5 bPIV3)，並以AvrII弄直之繼代純種系内的AvrII限 制酵素位置，將藏有RSV G基因的DNA片段插入第一或第 二個位置内。當在此處和其他實例中使用時，1-5 bPIV3意 指牛PIV3基因組的核苷酸1至5196 (或5200)。在該處有 144243.doc -101 - 201009079
BstB 1位置。 RSV F卡匣（N-P基因開始/中止）的建構：藉著PCR，使用 在RSV F基因之5'和3'端加入AvrII的寡，從全長的bPIV3/ RSV F+G cDNA質體中，分離RSV F基因片段，並導入在nt 1774處藏有AvrII位置，並以AvrII弄直之1-5 bPIV3質體 内。藉著PCR，使用1-5 bPIV3/RSV G2作為模板，分離 bPIV3 N-P 基因 間區域 。 使用募 5'GACGCGTCGACCACAAAGAGATGA CCACTATCACC3,和 在bPIV3 F基因中黏接的寡，產生含有bPIV3 N-P基因間區 域、AvrII位置和高達nt 5200之bPIV3序列的PCR片段。以 Sail和Nhel消化PCR片段，並加至以Sail和Nhel處理，並在 位置2中藏有RSV F基因的1-5 bPIV3質體中。欲將含有N-P 基因間區域的RSV F基因導入位置1内，使用AvrII切除1.8 kb RSV F卡匣，並連接到在nt 104處含有AvrII位置，並以 AvrII弄直的 1-5 bPIV3 内。 建構帶有短基因間區域之RSV F卡匣（N中止/N開始）：藉 著進行PCR反應，使用1-5 bPIV3/RSV F2作為模板，募 5'GCGCGTCGACCAAGTAAGAAAAACTTAGGATTAAAGAA CCCTAGGACTGTA3’以及在包括AvrII限制酵素位置之RSV F基因5’端上游黏接的寡，完成帶有短N-N基因間區域之 RSV F基因的產製。以AvrII消化含有RSV F基因和短N-N基 因間區域的PCR產物，並導入以AvrII弄直的1-5 bPIV3 nt 104 内。 在藉著限制酵素作圖，證實合宜的方位之後。以SphI和 144243.doc -102- 201009079
BssHII消化*在第一個位置藏有RSV基因的質體，並分離4 kb (1-5 bPIV3/RSV G1)或 4.8 kb (1-5 bPIV3/RSV FI) DNA片 段。在第二個選殖步驟中，以Sphl-BssHII 15.1 kb之DNA 片段，加入剩下的b/h PIV3基因組，產生全長的cDNAs。 利用SphI和Nhel切開在第二個位置藏有RSV基因的bPIV3繼 代純種系，並分離5·8 kb (bPIV3/RSV G2)和6.5 kb (bPIV3/RSV F2)的DNA片段。在第二個選殖步驟中，以尺 寸為14 kb之Nhel- SphI DNA片段，加入剩餘的b/h PIV3基 因組。在STBL-2細胞（Gibco/BRL)中繁殖全長的嵌合型b/h PIV3/RSV質體，其提供高產量的全長病毒cDNA質體。 實例3 :載有呼吸道融合細胞病毒F或G的牛副流感3/人類 副流感3，對於在活體外的mRNA產生和蛋白質表現，以及 病毒複製，展現出位置的影響 進行3個實驗，證實在實例2之構築體中的RSV F或G基 因的有效表現，並欲判定在PIV3基因組中之基因插入的位 置影響。 首先，為了證實由嵌合型病毒表現RSV蛋白質，進行嵌 合型病毒-感染之細胞溶胞產物的西方墨點分析，並以 RSV-專一抗血清來探測。參見圖5A。如下進行西方墨點分 析：以0.1或1.0之MOI，使用嵌合型病毒感染（70-80%)匯合 不足的Vero細胞。在感染後48小時，移出覆蓋的培養基， 並以1毫升PBS沖洗被感染單層1次。接著以400毫升含有 0.05%b-巯基乙醇（Sigma)的 Laemmli緩衝溶液（Bio-Rad)，溶 解細胞。在12% Tris-HCl準備好的凝膠（Bio-Rad)上，分離 144243.doc -103- 201009079 試樣各15毫升，並使用半-乾的運送細胞（Bio-Rad)將其運 送至尼龍膜。以含有0.5% (體積/體積）之吐溫-20 (Sigma)的 PBS [pH 7.6](PBST)沖洗尼龍膜，並在室溫下以含有5% (重量/體積）奶粉的PBST (PBST-M)阻斷20-30分鐘。在室溫 下，將該膜與在PBST-M中，以1:1000豨釋之RSV F單株抗 體（WHO 1269、1200、1153、1112、1243、1107)的混合 物，或在PBST-Μ中，以1:2000稀釋之RSV G 10181多株抗 體（Orbigen)—起培養1小時。在以PBST沖洗四次之後’在 室溫下將該膜與在PBST-Μ中，以1:2000稀釋之二次辣根過 氧化酶-共軛的山羊抗-老鼠抗體（Dako)一起培養1小時。以 PBST沖洗四次，並使用化學發光受質（Amersham Pharmacia)展開，使Biomax Light軟片（Kodak)曝光’看到 蛋白質譜帶。 與在Vero細胞中降低b/h/RSV fTN-N的複製效率（圖5C ’ 參見下文）一致，在感染後48小時檢測到的RSV 6含量’ 大約比出現在b/h PIV3/RSV F2或野外型RSV A2感染細胞 中的更低10倍（比較跑道2、3和4，圖5A)。50 kDa之譜帶代 表在以所有嵌合型病毒和野外型RSV感染之細胞中檢測到 的F,片段。然而，與野外型RSV相比較，在嵌合型病毒感 染細胞的溶胞產物中，有較多20 kDa F片段的堆積。當以 1.0的較高MOI，重複b/h PIV3/RSV fTN-N感染時（圖5A， 跑道1)，在感染後48小時’ b/h PIV3/RSV F1感染細胞中的 F,片段，堆積至野外型RSV的含量。在b/h PIV3/RSV F1或 b/h PIV3/RSV F2感染細胞中，50 kDa和20 kDa F丨片段的相 144243.doc 201009079 對含量為大約1:5。在以嵌合型病毒感染的細胞中未檢測 到 F〇，表示在b/h PIV3/RSV F1 和 b/h PIV3/RSV F2感染期 間，有效地加工F〇前驅物，如同亦在野外型RSV感染中觀 察到的® 在圖 5A 中顯示 RSV G在 b/h PIV3/RSV Gl、b/h PIV3/RSV G2和野外型RSV感染之細胞中的相對表現。檢測到兩個 RSV G的不成熟和糖基化形式，分別移動至大約50 kDa和 90 kDa。b/h PIV3/RSV G1感染的細胞，顯示出類似在野外 型RSV感染細胞中看到的RSV G表現程度（跑道1和3，圖 5A)。然而，在b/h PIV3/RSV G2感染的細胞中，RSV G的 堆積比在野外型RSV感染細胞中出現的更多大約2-3倍（跑 道2和3，圖5A)。這些資料集體地顯示嵌合型b/h PIV3/RSV，在位置1或2處，有效地表現RSV蛋白質。然 而，在位置2藏有RSV基因的病毒，表現較高程度的RSV蛋 白質。 接下來，北方墨點分析顯示與藉著西方墨點分析證實之 蛋白質表現結果相關的mRNA轉錄作用，參見圖5B。如下 進行北方墨點分析：使用Trizol LS (Life Technologies)，從 病毒感染的細胞中製備總細胞RNA。藉著一次酚-氣仿萃 取作用進一步純化RNA，並以乙醇使其沉澱。將RNA小球 再懸浮於焦碳酸二乙酯處理過的水中，並儲存在-80°C 下。在含有1%甲醛的1%瓊脂糖凝膠上分離等量的總 RNA，並使用 Turboblotter裝置（Schleicher & Schuell)，移至尼 龍膜（Amersham Pharmacia Biotech)上。使墨點與藉著在活 144243.doc •105· 201009079 體外之轉錄作用，使用DIG RNA標示套組（Roche Molecular Biochemicals)合成的毛地黃毒苷（DIG)-UTP-標示之核糖探 針雜交。在68°C下，在Express Hyb溶液（Clontech)中進行 雜交作用12小時。在68°C下，以2X SSC (IX SSC含有 0.015M NaCl與0.015 Μ檸檬酸鈉）-0.1%十二烷基硫酸鈉 (SDS)沖洗墨點兩次，接著以0.5X SSC-0.1% SDS沖洗一 次，最後再以0.1X SSC-0.1%SDS沖洗。藉著使用DIG-發光 檢測套組（Roche Molecular Biochemicals)，檢測來自雜交 探針的信號，並藉著使BioMax ML軟片（Kodak)曝光，而得 以看到。 b/h PIV3/RSV F1*N-N > b/h PIV3/RSV F2 ' b/h PIV3/RSV G1和b/h PIV3/RSV G2的北方墨點分析，顯示RSV F或RSV G之病毒mRNA含量，與觀察到的RSV蛋白質含量頗有關連 (圖5B)。對b/h PIV3/RSV F1*N-N觀察到最低含量的RSV F mRNAs，其亦展現出產生最低量的RSV F蛋白質。b/h PIV3/RSV G1產生少量的RSV G mRNAs，結果產生比在b/h PIV3/RSV G2中觀察到更低的RSV G蛋白質含量。 最後，不同病毒（在位置1或位置2處有RSV F或G基因）的 生長，亦與蛋白質表現和RNA轉錄的結果有關連。如下獲 得在圖5C中所示的生長曲線：使Vero細胞生長至90%匯 合，並以 0.01 或 0.1 之 MOI，以 b/h PIV3、b/h PIV3 RSV FI > b/h PIV3 RSV G1、b/h PIV3 RSV F2和 b/h PIV3 RSV G2感染。在37°C下培養被感染的單層。在感染後〇、24、 48、72、96和120小時，一起收獲細胞和培養基，並儲存 144243.doc 201009079 在-70°C下。藉著在Vero細胞中的TCID50或溶菌斑測定，判 定每個時間點收獲的病毒力價❶TCID5〇測定是在37°C下培 養6天之後，以肉眼檢查CPE，而溶菌斑測定則是在培養5 天之後，利用RSV多株抗血清進行免疫染色，來定量之。 在Vero細胞中，以〇.〇1之MOI，在第一個位置藏有RSV G 或F基因的嵌合型病毒（b/h PIV3 RSV G1和b/h PIV3 RSV F1*N-N)，比起在第二個位置含有RSV基因的病毒，以更慢 的速率複製，產生更低的高峰力價，並顯示出較大的遲滞 期。在感染後96小時，b/h PIV3/RSV fTN-N和b/h PIV3/RSV G1的高峰力價，分別為106 7和105 5TCID5〇/毫升 (圖5C)。相反的，在感染後72和96小時，b/h PIV3/RSV F2 和b/h PIV3/RSV G2的高峰力價，分別為108 G和107·4 TCID50/毫升（圖5C)。b/h PIV3對照組病毒，展現出 108 GTCID50/毫升的高峰力價（圖5C)。b/h PIV3/RSV F2產生 比 b/h PIV3/RSV FrN-N 更高 1.3 log10 的力價。b/h PIV3/RSV G2 複製比 b/h PIV3/RSV G1 更高 1.9 log10 的力 價。結果表示與在第二個位置藏有RSV基因的嵌合型病毒 相比較，在第一個位置藏有RSV基因的嵌合型病毒，延遲 開始在活體外複製。 欲判定到底能不能達到b/h PIV3/RSV fTN-N和b/h PIV3/RSV G1的較高力價，以0.1的較高MOI，重複生長曲 線。在 0.1 之MOI時，b/h PIV3/RSV Fl'N-N和 b/h PIV3/RSV G1的高峰力價增加0·5至1.3 log1()(資料未顯示）》在生長週 期中，較早降低了這些病毒的遲滯期，並達到高峰力價。 144243.doc 107· 201009079 實例4 :在牛副流感3/人類副流感3基因組中插入eGFP，對 病毒複製的位置影響 藉著實質上在PIV3的所有基因之間’導入eGFP基因’並 觀察對病毒複製和eGFP表現的影響（圖6)，系統性地評估 將基因插入牛/人類PIV3載體主鏈中的影響。這類型的測 定調查對副黏液病毒所觀察到之轉錄梯度的重要性’其產 生特定比例的病毒mRNAs。外來基因的插入將擾亂這些比 例，結果合成不同含量的病毒蛋白質，其可影響病毒的複 製。為了該測定選出eGFP基因，因為它不會被併入病毒粒 子的膜内，並因此應該不干擾病毒的加工，像是包裝、出 芽、侵入等等。將eGFP基因插入b/h PIV3基因組的四個位 置内，其中三個是eGFP表現和病毒複製所特有的。將 eGFP基因卡匣與bPIV3 N-P基因間區域連接。b/h GFP1在 b/h PIV3基因組最接近3’的位置中，藏有eGFP基因卡匣。 b/h PIV3/GFP2在b/h PIV3基因組的N和P基因之間，含有 eGFP基因卡匣。b/h PIV3/GFP3則是在P和Μ之間，b/h PIV3/GFP4是在b/h PIV3的Μ和F之間，含有eGFP基因（圖 6) °
eGFP基因卡匣的建構：eGFP基因的模板是市售的，例 如可從 BD Biosciences (pIRES2-EGFP)或 Clontech (pEGFP-N1)購買。參見 Hoffmann 等人，Virology 267:310-317 (2000)。藉著PCR分離eGFP基因，並藉著使用重疊PCR 法，使用下列的募：5'ATTCCTAGGATGGTGAGCAAGGGCG3,、 5'GGACGAGCTGTACAAGTAAAAAAATAGCACCTAATCAT 144243.doc • 108· 201009079 G3'和 5，CTA CCTAGGTGAATCTTTGGTTG3'，加入bPIV3 N-P基因間區域。將eGFP卡匣插入pCR2.1内，定序，並證實 堅守六的規則。然後以AvrII消化eGFP卡匣，凝膠純化， 並按照下述插入b/h PIV3的位置1、2、3和4内。 產生在位置1和2處藏有eGFP基因的全長cDNAs :將eGFP 基因卡匣插入含有從nts 1至5200之bPIV3序列，並在ntl04 (位 置1)或nt 1774 (位置2)處含有AvrII限制酵素位置的1-5 bPIV3質體内。在藉著限制酵素作用證實合宜的方位之 後，以SphI和BssHII消化在第一個位置藏有eGFP基因的質 體，並分離4 kb (1-5 eGFPl) DNA片段。接著，以Sphl-BssHII 15.1 kb之DNA片段，加入剩餘的b/h PIV3基因組， 產生全長的cDNAs。至於在第2個位置中包括eGFP之全長 cDNA的產製，以SphI和Nhel切開在第二個位置藏有eGFP 基因的bPIV3繼代純種系，並分離5.8kb(l-5eGFP2)DNA 片段。接下來，以尺寸為14 kb的Nhel-SphI DNA片段，加 入剩餘的b/h PIV3基因組。在STBL-2細胞（Gibco/BRL)中繁 殖全長的嵌合型b/h PIV3/eGFP質體，其提供高產量的全長 病毒cDNA質體。 產生在位置3和4處藏有eGFP基因的全長cDNAs:為了將 eGFP卡匣插入b/h PIV3基因組的位置3内，在含有bPIV3 nts 1-5200之繼代純種系的P-Μ基因間區域中，在nt 3730處 導入AvrII限制酵素位置，改變兩個核芬酸。在 QuickChange PCR反應中使用下列的募及其互補物： 5'GGACTAATCAATCCTA GGAAACAATGAGCATCACC3，， 144243.doc • 109- 201009079 導入AvrII位置。以AvrII消化eGFP卡E，並連接到以AvrII 弄直，在nt 3730處藏有AvrII位置的1-5 bPIV3繼代純種系 内。從含有GFP之繼代純種系中，分離從SphI至Nhel的5.5 kb DNA片段，並導入以SphI和Nhel消化的b/h PIV3 cDNA 内，產生全長的質體。為了將eGFP基因卡E加至b/h PIV3 基因組的位置4内，產製含有從nts 1-8500之b/h PIV3序列 的繼代純種系。以Nhel (nt 5042)弄直該純種系，並插入含 有可相容之AvrII末端的eGFP卡匣。然後以SphI和Xhol消化 藏有eGFP卡匣的繼代純種系，並分離7.1 kb之DNA片段。 以SphI和Xhol處理b/h PIV3質體，產生11 kb之片段。連接這 兩個DNA片段，產生b/h PIV3/GFP4。 以兩種方式評估b/h PIV3/GFP1、2和3所產生的eGFP 量。首先使用螢光顯微鏡，判定以0.1和0.01之MOI，利用 b/h PIV3/GFP1、2和3感染Vero細胞20小時時，所產生之綠 細胞的量（圖7A)。b/h PIV3/GFP3產生的綠細胞，明顯比 b/h PIV3/GFP1 或 2 更少。 其次，對被感染的細胞進行西方墨點分析，並以GFP MAb和PIV3 PAb探測墨點。最初的觀察證實b/h PIV3/GFP3 產生戲劇化少量的eGFP蛋白質（圖7B)。b/h PIV3 GFP1和 GFP2產生類似含量的eGFP蛋白質。西方墨點法控制相同 的裝載體積，以供使用PIV3抗體探測（圖7B)。有趣的是， 所有的三種病毒均顯示產生類似含量的PIV3蛋白質（HN蛋 白質是最突出的譜帶）。這些結果暗示與位置1和2相比 較，b/h PIV3/GFP3在位置3轉錄較少的GFP mRNAs。該資 144243.doc -110· 201009079 料證實了在副黏液病毒中，存有病毒mRNAs的轉錄梯度。 PIV3 HN蛋白質的產量，不受eGFP基因插入的影響（圖 7B)。 為了判定GFP基因插入是否對b/h PIV3/GFP1、2和3之病 毒複製的動力學有影響，在Vero細胞中進行多回合的生長 曲線（圖7C)。生長曲線顯示b/h PIV3/GFP1在感染後24和48 小時，具有比b/h PIV3/GFP2或GFP3延遲發生的病毒複 製。然而，所有三種病毒最後獲得的高峰力價是類似的。 b/h PIV3/GFP2和GFP3的複製動力學，幾乎是相同的（圖 7C)。有趣的是，改變了的病毒mRNAs比例，似乎未顯著 地影響病毒複製。 實例5 :建構並選殖載有呼吸道融合細胞病毒F與不同基因 間區域的嵌合型牛副流感3/人類副流感3 使用三種不同的構築艎，判定基因間區域（在每個mRNA 之間的核苷酸，例如在F基因和N基因之間的核苷酸）對蛋 白質表現和病毒複製的影響。參見圖8。第一個構築體是 在位置1中載有RSV F1#N-N的b/h PIV3，其具有較短的 bPIV N基因中止/N基因開始序列（RSV FrN-N，在圖4 中）；第二個構築體是在位置1中載有RSV F的b/h PIV3 (RSV F2，在圖4中）；而最後一個是在位置1中載有RSV的 b/h PIV3 (RSV F1，在圖4中）。根據在第6節，實例2中描述 的選殖策略，產製所有三種構築體。 在兩個卡匣之間最戲劇化的差異，是在b/h PIV3/RSV F1*N-N中，在N基因開始序列與N轉譯開始密碼子之間的 144243.doc -111- 201009079 距離，它僅有10個核甞酸長。相反的，在b/h PIV3/RSV F2 中，該距離為86個核苷酸長。另一個差異是在b/h PIV3/RSV fTN-N中使用N基因開始序列，而非在b/h PIV3/RSV F2中使用的P基因開始序列。為了判定在病毒轉 錄單元之轉錄基因起點和轉譯起點之間的距離，是否影響 病毒的複製，產製b/h PIV3/RSV F1構築體，其含有與b/h PIV3/RSV F2所使用的相同的RSV F基因卡匣。 實例6:在呼吸道融合細胞病毒基因下游之基因間區域的 長度及/或性質，對病毒複製的影響 在下列的實驗中，使用在實例5中的三種構築體，判定 基因間區域對病毒蛋白質表現和病毒複製的影響。參見圖 9 〇 首先，使用西方墨點分析，在以0.1之MOI感染Vero細胞 後 24 和 48小時，比較b/h PIV3/RSV FI、b/h PIV3/RSV fTN-N和b/h PIV3/RSV F2的RSV F蛋白質表現。如下進行 西方墨點分析：以0.1之MOI，使用嵌合型病毒感染（70-80%)匯合不足的Vero細胞。在感染後24和48小時，移出覆 蓋的培養基，並以1毫升PBS沖洗被感染的單層1次。接著 以400毫升含有0.05% b-疏基乙醇（Sigma)的Laemmli緩衝溶 液（Bio-Rad)，溶解細胞。在12°/。Tris-HCl準備好的凝膠 (Bio-Rad)上，分離試樣各15毫升，並使用半-乾的運送細 胞（Bio-Rad)將其運送至尼龍膜。以含有0.5% (體積/體積） 之吐溫-20(8丨经11^)的？88(?117.6)(?631')沖洗尼龍膜，並在 室溫下以含有5% (重量/體積）奶粉的PBST (PBST-M)阻斷 144243.doc -112- 201009079 20-30分鐘。在室溫下，將該膜與在PBST-Μ中，以PBST-M 稀釋 1:1000之RSV F單株抗體（WHO 1269、1200、1153、 1112、1243、1107)的混合物，一起培養1小時。在以PBST 沖洗四次之後，在室溫下將該膜與在PBST-Μ中，以1:2000 稀釋之二次辣根過氧化酶-共軛的山羊抗_老鼠抗體（Dak〇) 一起培養1小時。以PBST沖洗四次，並使用化學發光受質 (Amersham Pharmacia)展開，使Biomax Light軟片（Kodak)曝 光，看到蛋白質譜帶。 在感染後24和48小時，b/h PIV3/RSV F1表現的RSV卩丨蛋 白質含量，接近對b/h PIV3/RSV F2所觀察到的含量，但比 b/h PIV3/RSV F1#N-N的那些高很多。因此，在基因開始元 件與轉譯開始密碼子之間的間隔，對病毒複製可能是很重 要的。將N基因開始序列變更成P基因開始序列，然而，該 變更僅招致單一核苷酸的改變。這些因素中任一個，可能 負責解救RSVF蛋白質表現的表現型。 接下來，進行多回合的生長曲線，以便在以0.1之MOI感 染的 Vero細胞中，比較b/h PIV3/RSV FI、b/h PIV3/RSV FrN-N和b/h PIV3/RSV F2之病毒複製的動力學（參見圖 9B)，如下進行之：使Vero細胞生長至90%匯合，並以0.1 之 MOI，利用 b/h PIV3、b/h PIV3/RSV F1*N-N、b/h PIV3/RSV FI 和 b/h PIV3/RSV F2感染。在37°C 下培養被感 染的單層。在感染後0、24、48 ' 72和96小時時，一起收 獲細胞和培養基，並儲存在-70°C下。藉著在Vero細胞中的 溶菌斑測定，判定每個時間點收獲的病毒力價。溶菌斑測 144243.doc -113- 201009079 定是在培養5天之後，利用RSV多株抗血清進行免疫染 色，來定量之。 如同在圖9B中所示，與b/h PIV3/RSV F2相比較’延遲了 b/h PIV3/RSV F1*N-N的複製發生，且高峰力價較低。相反 的，PIV3/RSV F1展現出與對b/h PIV3/RSV F2所觀察到的 幾乎相同的生長曲線。 實例7 :選殖三價載有牛副流感3/人類副流感3的構築體 下列的實例係關於三價疫苗的產製’它藏有hPIV3之表 面糖蛋白（F和HN)、RSV F和hMPV F，以便使用單一的活 減毒病毒疫苗，保護兒童免於由RSV、hMPV*hpIV3引起 的疾病。此等三價病毒藉逆向遺傳回收。 如下進行兩個病毒基因組的建構（參見圖10)，其分別包 括帶有兩個額外之異源序列插入的嵌合型b/h PIV3主鏈， 其中一個異源核：y：酸序列係衍生自間質肺病毒F基因’而 另一個異源核嘗酸序列係衍生自呼吸道融合細胞病毒F基 因：以 SphI 和 Nhel 消化質體 b/h PIV3/RSV F2 或 b/h PIV3/hMPV F2，並分離6.5 kb之片段。以SphI和Nhel消化 b/h PIV3 RSV F1 或 b/h PIV3/hMPV F1 的全長 cDNA，並分離 14.8 kb之DNA片段，再將其與衍生自質體b/h PIV3/RSV F2 或b/hPIV3/hMPV F2的6.5 kb片段連接，產生全長的病毒 cDNAs。 已經在Vero細胞中擴大帶有上述構築體的病毒。可使用 按照在本文中之描述設計的病毒，作為三價疫苗，對抗副 流感病毒感染、間質肺病毒感染和呼吸道融合細胞病毒感 144243.doc -114· 201009079 染。 實例8 :選殖兩種呼吸道融合細胞病毒至牛副流感3/人類 副流感3載體 設計攜帶兩個RSV F基因之副本的嵌合型病毒’以便判 定由嵌合型病毒產生較多的RSV蛋白質，是否將導致改良 的免疫原性。可藉著在Vero細胞中的逆向遺傳、生物學選 殖和擴大，解救該病毒，產生具有lxl〇6pfu/毫升之力價的 病毒母液。可使用該病毒b/h PIV3/RSV F1F2，來評估病毒 ® 生長動力學、RSV F蛋白質的產製以及在倉鼠中的複製和 免疫原性。 以下列方式產製構築體（參見圖11):以SphI和Nhel消化 1-5 1^¥?2質體，並分離6.5 1^之片段。以8?111和1^^1消化 b/h PIV3 RSV F1 的全長cDNA，並分離 14.8 kb 之 DNA 片 段，再與衍生自1-5 bPIV3/RSV F2的6.5 kb DNA片段連 接，產生全長的病毒cDNAs。 實例9 :建構和選殖載有人類間質肺病毒F cDNA的牛副流 m 感3/人類副流感3
將人類間質肺病毒（hMPV)的F基因插入b/h PIV3基因組 的位置1和2中（圖12)。hMPV F基因卡匣藏也bPIV3 N-P基 因間區域。使用hMPV F基因質體（pRF5 15)，並修正在 hMPV F基因中的單一核甞酸突變（即將核苷酸3352從C修正 為T (野外型）），產生pRF515-M4。使用重疊PCR，將bPIV3 N-P基因間區域加至hMPV F基因的3’端。至於hMPV F，重 疊 PCR 寡為 5，GGCTTCATACCACATAATTAGAAAAATAGC 144243.doc -115- 201009079 ACCTAATCATGTTCTTACAATGGTCGACC3'。在該選殖步 驟期間，在5'端使用的寡（5'GCAGCCTAGGCCGCAATAA CAATGTCTT GGAAAGTGGTGATC3，）以及在 PCR 反應中 hMPV F 基因卡匣的 3·端（5’CTACCTAGGTGAATCTTTGGTTG3’）， 含有AvrII限制酵素位置。使用QuickChange突變生成套組 和下列的寡（5’CCTAGGCCGCAATAGACAATGTCTTGG3,， 5，CCAAGACATTGTCTATTGCGGCCTAGG3，），調整hMPVF 基因卡匣，使其符合六的規則。以與在上文第8節，實例4 中，關於b/h PIV3/eGFPl和eGFP2之描述相同的方式，產 製全長的b/h PIV3/hMPV F1 (位置1)和F2 (位置2) cDNA質 體。 實例10 :載有人類間質肺病毒F之牛副流感3/人類副流感3 的免疫沉澱和複製測定 欲證實在在位置2處載有人類間質肺病毒F (hMPV F2)之 b/h PIV3中表現F蛋白質，使用天竺鼠或人類抗血清，對 hMPV F蛋白質進行免疫沉澱（參見圖13A)。關於由b/h PIV3表現之hMPV F蛋白質的免疫沉澱作用，以0.1或0.05 之 MOI，利用 b/h PIV3 或 b/h PIV3/hMPV F2感染 Vero細胞。 在感染後24小時，以沒有半胱胺酸且無甲硫胺酸（ICN)的 DME沖洗細胞1次，並在相同的培養基中培養30分鐘。移 出培養基，並將0.5毫升缺乏半胱胺酸和曱硫胺酸，含有 100微居里[35S]-Pro-Mix (Amersham)的 DME加至細胞中。 在37°C下，在35S-同位素的存在下，培養被感染的細胞5小 時。移出培養基，並以含有蛋白酶抑制劑的0.3 M RIPA緩 144243.doc -116- 201009079 衝溶液，溶解被感染的細胞。將該細胞溶胞產物與hMPV 天竺鼠或人類多株抗血清一起培養，並與IgG-瓊脂糖 (Sigma)結合。在以0.5 M RIPA緩衝溶液沖洗三次之後，在 10%蛋白質凝膠上分級分離試樣。將凝膠脫水，並使X-光 軟片曝光。 藉著免疫沉澱作用，使用gp和人類抗-hMPV抗血清，顯 示由b/h PIV3/hMPV F2表現的hMPV F蛋白質（圖13A)。有 趣的是，在b/h PIV3/hMPV F2之溶胞產物中，觀察到移動 至大約80 kDa的特定譜帶。該尺寸符合F前驅物蛋白質 F0。亦在b/h PIV3和模仿對照組跑道中，觀察到不同尺寸 的非-特異譜帶（圖13)。這些資料暗示b/h PIV3/hMPV F2表 現hMPV F蛋白質。然而，可利用之hMPV抗體試劑是有限 的，且這些抗血清僅與hMPV F蛋白質之前驅物產生交互 作用。被切開的F1亦可能是不穩定的，並因此不易使用該 方法呈像。 進行生長曲線，判定b/h PIV3/hMPV F2之病毒複製的動 力學，並將其與在Vero細胞中，以0.1之MOI，對b/hPIV3 和b/h PIV3/RSV F2所觀察到的那些相比較（圖13B)。資料 顯示在感染後24小時，與b/h PIV3/RSV F2相比較，b/h PIV3/hMPV F2展現出延遲的複製發生。然而，在感染後48 小時和之後，不再觀察到複製上的差異。 亦進行生長曲線，判定b/h PIV3/hMPV F1之病毒複製的 動力學，並將其與在Vero細胞中，以0.01之MOI，對b/h PIV3/hMPV F2和b/h PIV3所觀察到的那些相比較（圖13C)。 144243.doc -117· 201009079 資料顯示，與b/h PIV3/hMPV F2或b/h PIV3相比較，b/h PIV/hMPV F1具有延遲的複製發生，並產生較低的高峰力 價。b/h hMPV F1的溶菌斑尺寸，亦比b/h hMPV F2更小。 亦評估嵌合型病毒b/h PIV3/hMPV F1和F2，在敘利亞黃 金倉鼠中感染和複製的能力（表5)。結果顯示b/h PIV3/hMPV F1和F2在倉鼠鼻曱骨和肺臟中，複製達在b/h PIV3中觀察到的程度。甚至在倉鼠的上和下呼吸道中， hMPV亦複製至5.3和3.6 logio TCID5〇/克組織的力價。這些 資料顯示b/h PIV3/hMPV F1和F2在倉鼠的呼吸道中，可有 效地感染和複製，藉此證實倉鼠代表適合用來判定hMPV 之免疫原性的小動物模式，並可使用該動物模式來評估 hMPV疫苗候選者。 表5 在位置1或2中表現hMPV F蛋白質的 b/h PIV3，在倉鼠中的複製 病毒a 在感染後4天的平均病毒力價 (log】0TCID50/克組織土S.E.)b 鼻曱骨 肺臟 b/h PIV3 4.8 ± 0.2 5.6 ± 0.6 b/h hMPV FI 5_3 ± 0.5 5.7 ± 0.4 b/h hMPV F2 5.7 ± 0.5 4.6 ± 0.3 hMPV 5.3 ± 0.1 3.6 ± 0.3 3以lxl06pfu的指定病毒 ，鼻内接種一 組六隻倉鼠 b標準偏差 144243.doc -118- 201009079 注解：對第10天的CPE讀取TCID5〇測定 實例11 :選殖可溶性呼吸道融合細胞病毒F基因構築體 亦產製含有可溶性RSV F基因之單一副本，RSV F基因 缺乏穿透膜和胞液功能部位之版本的構築體（圖14)。可使 用該構築體測試免疫原性。其優點將是該可溶性RSV F不 會被併入病毒粒子膜内的能力。因此，可將該病毒視為較 安全的病毒，因為不預期它的病毒向性會改變。可藉著逆 φ 向遺傳，解救b/h PIV3/sol RSV F的cDNA質體。 使用質體1-5/RSV F2 (前述）作為PCR的DNA模板。使用 募 RSV f.2 (5'GCTGTAACAGAATTGCAGTTGC3，）（其黏接 RSV b nt 5946)和募 5，CGTGGTCGACCATTGTAAGAACATGATT AGGTGCTATTTTTATTTAATTTGTGGTGGATTTACCGGC3' 移除RSV F的穿透膜和細胞質功能部位，刪除150個核甞 酸。以Hpal和Sail消化所得的PCR片段，並導入以Hpal和 Sail處理過的 1-5 RSV F2内，產生 1-5 bPIV3/sol RSV F。以 φ SphI和Nhel消化該質體，並將所得的片段導入以SphI和 Nhel消化過的b/hPIV3 cDNA内，產生全長的cDNA。
實例12 :在以載有人類間質肺病毒F之牛副流感3/人類副 流感3感染的細胞中，表現人類間質肺病毒F 連續10倍稀釋b/h 104 hMPV F病毒母液，並用來感染匯 合不足的Vero細胞。以含有健大黴素的optiMEM培養基覆 蓋被感染的細胞，並在35°C下培養5天。以100%甲酵固定 細胞，並以1:1000稀釋的抗-hMPVOOl天竺鼠血清，接著是 144243.doc •119· 201009079 1:1000稀釋的抗·天竺鼠HRP共輛抗體，進行免疫染色。藉 著比色展開，在AEC受質系統（DAKO corporation)的存在 下，使hMPV F的表現呈像。參見圖15A。 連續10倍稀釋b/h NP-P hMPV F病毒母液，並用來感染匯 合不足的Vero細胞。以補充有1 X L15/含有青黴素/鏈黴 素、L-穀胺醯胺和胎牛血清之MEM培養基的1%在 EMEM/L-15培養基（JRH Biosciences; Lenexa, KS)中之甲基 纖維素，覆蓋被感染的細胞。在35°C下培養被感染的細胞 5天，以100%曱醇固定細胞，並以1:1000稀釋的抗-hMPVOOl天竺鼠血清，接著是1:1000稀釋的抗-天竺鼠HRP 共軛抗體，進行免疫染色（參見圖15B)。抗hMPVOOl天竺 鼠血清，是對hMPVOOl蛋白質專一的，且不與b/h PIV3蛋 白質結合。 實例13 :在HELA細胞和VERO細胞中，解救嵌合型牛副流 感第3型/人類副流感第3型病毒 使用與bPIV3解救類似的程序，進行嵌合型b/hPIV3病毒 的解救。在HeLa細胞中，使用 LipofecTACE (Gibco/BRL) ’ 藉著逆向遺傳，進行b/h PIV3嵌合型病毒的解救。以4之 MOI，利用MVA感染80〇/〇匯合的HeLa細胞、Hep-2細胞或 Vero細胞。在感染1小時之後’將全長的反-基因組b/h PIV3 cDNA (4微克），連同NP (0.4微克）、P (0.4微克）和 L/pCITE (0.2微克）表現質體’一起轉移感染至被感染的 HeLa或Vero細胞内。在感染後40小時’收獲細胞和細胞上 清液（P0)，並使其接受一回合的冷凉·_融解°然後使用所得 144243.doc -120- 201009079 的細胞溶胞產物，在Ι-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶〇ra C) 一種疫苗病毒的複製抑制劑的存在下，感染新鮮的Vero細 胞單層，產生P1病毒母液。收獲得自這些培養盤的上清液 和細胞，冷凍融解一次，並使用PIV3-專一抗血清，藉著 病毒溶菌斑的免疫染色，測定bPIV3病毒顆粒的存在。P1 收獲物的細胞溶胞產物，導致Vero細胞單層的完全CPE， 且免疫染色表示出現廣泛的病毒感染。 實例14 :解救載有人類間質肺病毒F病毒的牛副流感第3型 /人類副流感第3型 如下獲得在位置l(b/h 104 hMPV F)或位置2 (b/h NP-P hMPV F)處表現hMPV F的b/h PIV3病毒。以0.1至0.3之傳染 多重性（m.o.i)，利用禽痘-T7感染在6孔培養皿中，80-90% 匯合度的HEp-2或Vero細胞。在以禽痘-T7感染之後，以 PBS沖洗細胞一次，並以下列用量的質體DNA轉移感染： 全長的 b/h 104 hMPV F 或 b/h NP-P hMPV F cDNA 2.0微克， pCite N 0.4微克，pCite P 0.4微克，pCite L 0.2微克（pCite 質體具有T7啟動基因，接著是衍生自腦心肌炎病毒 (EMCV)的IRES元件）。根據製造者的指示，在脂染胺 (Lipofectamine) 2000 (Invitrogen)的存在下，進行轉移感 染。在33°C下培養轉移感染反應5至12小時，接著以2毫升 含有健大黴素的新鮮OptiMEM，取代含有脂染胺2000的培 養基。在33°C下進一步培養經過轉移感染的細胞2天。以 SPG使細胞穩定，並藉著在-80°C下一回合的冷凍融解，使 細胞溶解。使用粗製的細胞溶胞產物感染新的Vero單層， 144243.doc -121 - 201009079 以便擴大解救的病毒。 實例15 :藉著逆向遺傳，解救載有呼吸道融合細胞病毒基 因的牛副流感第3型/人類副流感第3型 藉著逆向遺傳，在HeLa或HEp-2細胞中，使用前述的轉 移感染法（參見實例13)，回收有傳染性的病毒（Haller等人， 2000)。簡言之，分別以0.1至0.3或1-5的傳染多重性 (m.o.i)，利用FP-T7或MVA-T7，感染在6孔組織培養皿中， 80-90%匯合度的HEp-2或Vero細胞。在以FP-T7或MVA-T7 感染之後，以PBS沖洗細胞一次，並以下列用量的質體 DNA轉移感染（2.0微克全長的b/h PIV3 RSV F或G cDNA， 0.4微克 pCITE/N，0.4微克 pCITE/P，0.2微克 pCITE/L) ° 根 據製造者的指示，在脂染胺2000 (Invitrogen)的存在下，進 行轉移感染。在33°C下培養轉移感染反應5至12小時，接 著以2毫升含有健大黴素的新鮮OptiMEM，取代含有脂染 胺2000的培養基。在33°C下進一步培養經過轉移感染的細 胞2天。以SPG使細胞穩定，並利用在-80°C下一回合的冷 凍融解，使細胞溶解。使用粗製的細胞溶胞產物感染新的 Vero細胞單層，以便擴大解救的病毒。藉著在Vero細胞中 有限的稀釋，純化嵌合型病毒，並產製l〇6-l〇8PFU/毫升的 高力價病毒母液。藉著RT-PCR分離嵌合型病毒的RSV基 因，並證實其序列。藉著以RSV山羊多株抗血清 (Biogenesis)對被感染之Vero細胞單層進行免疫染色，證實 RSV蛋白質的表現。 實例16 :證實藉著RT-PCR解救之嵌合型牛副流感第3型/人 144243.doc -122- 201009079 類副流感第3型病毒 欲確定所解救之病毒在性質上是嵌合的，即該病毒在 bPIV3主鏈中含有hPIV3 F和HN基因序列，藉著RT-PCR進 一步分析病毒的RNA基因組。收獲利用三種獨立衍生之b/h PIV3的分離株之P1病毒母液感染的Vero細胞，並分離總 RNA。使用在bPIV3之位置4757處黏接的寡，擴大病毒 RNA。藉著PCR擴大得自5255至6255的病毒區域。所得的1 kb PCR片段應含有hPIV3序列。這可藉著以對hPIV3專一的 ® 酵素（Sac 1和Bgl II)消化來證實之，且它不切開bPIV3的互 補區（參見圖2)。如同預期的，Sac 1和Bgl II切開PCR片 段，成為較小的片段，證實該經過分離的序列是衍生自 hPIV3 (參見跑道3、5、7)。此外，藉著PCR擴大在聚合 酶L基因中，從nt 9075至nt 10469的區域。該區域應含有 bPIV3序列。再度使用對bPIV3專一的酵素（Pvull和 BamHl)，消化所得的1.4 kb PCR片段，它不切開hPIV3的 ^ 相等區域（圖3)。藉著Pvull和BamHl實在地消化1.4 kb片 段，證實該聚合酶基因的來源是bPIV3(參見圖3的跑道3、 4、6、7、9和10)。總而言之，RT-PCR分析顯示該解救的 b/h PIV3病毒在性質上是嵌合型的。它在bPIV3遺傳主鏈中 含有hPIV3 F和HN基因。 實例17 :載有呼吸道融合細胞病毒基因之牛副流感第3型/ 人類副流感第3型的遺傳穩定性 為了判定b/h PIV3/RSV嵌合型病毒在遺傳上是穩定的， 並保持導入的RSV基因卡匣，在Vero細胞中，連續盲目地 144243.doc -123- 201009079 繼代被感染細胞之溶胞產物1 〇次。以〇· 1之MOI，利用b/h PIV3/RSV感染在T25燒瓶中，匯合不足的Vero細胞，並在 33°C下培養4天，或直到看見CPE為止。在培養期間結束 時，收獲被感染的細胞和培養基，冷凍並融解兩次，並使 用所得的細胞溶胞產物感染新的T25燒瓶中的Vero細胞。 重複該循環10次。針對RSV蛋白質的表現和病毒力價，藉 著溶菌斑測定，分析得自P1至P10的所有細胞溶胞產物， 並以RSV多株抗血清進行免疫染色。在第10次繼代時，藉 著RT-PCR分離出RSV基因卡匣，並藉著DNA序列分析證實 RSV基因序列（以便確認可能的核甞酸改變）。所有的分離 株均保持RSV基因卡匣，並分析10次繼代的RSV蛋白質表現 (資料未顯示）。 實例18 :在蔗糖梯度上，載有呼吸道融合細胞病毒基因之 牛副流感第3型/人類副流感第3型的病毒粒子分級分離 藉著使用生化測定，進一步調查是否將RSV蛋白質導入 b/h PIV3病毒粒子内的問題。以0· 1之MOI，利用每種嵌合 型b/h PIV3/RSV病毒接種Vero細胞。當看見最大CPE時， 冷凍、融解被感染的單層，並以2000 rpm旋轉10分鐘。通 過20%蔗糖墊，以100,000 X g旋轉澄清的上清液90分鐘。 然後將小球再懸浮於PBS中，並在20-66%蔗糖梯度的上 方，輕輕地分出層次。以100,000 X g旋轉梯度20小時，達 成平衡。從梯度的上方開始，收獲1 8個2毫升等份的溶離 份。每個溶離份中各移出0.4毫升，進行病毒力價判定。將 每個溶離份再懸浮於2倍體積的20% PBS中，並藉著以 144243.doc -124- 201009079 100,000 x g旋轉1小時離心，然後將小球再懸浮於0.05毫升 Laemmli緩衝溶液（Biorad)中，並藉著西方墨點法，使用 RSV F MAb (NuMax L1FR-S28R)、RSV(Biogenesis)和 bPIV3 (VMRD)多株抗血清，分析RSV和PIV3蛋白質。純化在桿 狀病毒中表現的C-終端截短之RSV F蛋白質至均質’亦在 嚴糖梯度上分析之。 亦藉著溶菌斑測定，分析溶離份的高峰病毒力價° 一開 始進行自由RSV F之對照組梯度（在桿狀病毒中產製’並為 C-終端截短的）、RSV A2和b/h PIV3。大部分的自由RSV F 出現在梯度上方的溶離份3、4、5和6中（圖16A) °在溶離 份10、11和12中觀察到最大濃度的RSV病毒粒子（圖16B)。 利用RSV多株抗血清，並以RSV F MAb探測RSV溶離份。 含有最大量RS V病毒粒子的溶離份，亦顯示最強的RSV F 信號，暗示RSV F蛋白質共同-移動，並與RSV病毒粒子結 合（圖16B)。這些溶離份亦展現出最高的病毒力價（圖 16B)。b/h PIV3病毒粒子可能是更多形的’並因此含有b/h PIV3病毒粒子之高峰溶離份的散布是更廣泛的。b/h PIV3 病毒粒子出現在溶離份9、10、11、12和13中（圖16C)。藏 有最大量病毒粒子的溶離份，藉著溶菌班測定再度展現出 最高的病毒力價（圖16C)。利用PIV3多株抗血清和RSV F MAb兩者，分析b/h PIV3/RSV F2的蔗糖梯度溶離份（圖 16D)。含有大多數病毒粒子的溶離份，是溶離份11、12、 13和14，如同藉著西方墨點法，使用PiV3抗血清所示。同 樣的，這些亦是展現出最高含量2RSV F蛋白質的溶離 144243.doc -125- 201009079 份。然而，亦有些自由RSV F出現在溶離份5和6中。溶離 份11、12、13和14展現出高峰病毒力價（圖16D)。類似的， 含有b/h PIV3/RSV G2之大多數病毒粒子的溶離份（溶離份 9、10、11和12)，亦顯示最強的RSV G蛋白質信號（圖 16E)。這些再度是具有最高病毒力價的溶離份（圖16E)。這 些資料集體地暗示大部分的RSV F和G蛋白質共同-移動， 並與b/h PIV3病毒粒子結合。然而，有些自由的RSV蛋白 質亦出現在梯度上方的溶離份中。 實例19 :不能以RSV抗血清，中和載有呼吸道融合細胞病 毒（RSV)之嵌合型牛副流感第3型/人類副流感第3型 為了尋求是否將RSV表面糖蛋白併入b/h PIV3病毒粒子 内，結果改變病毒向性表現型之重要安全問題性的解答， 進行中和測定（表6和7)。RSV F MAbs (WHO 1200 MAb)在 1:2000的稀釋度下，中和50%的野外型RSV A2(表6)。相反 地，即使是1:25之稀釋度，亦不能中和任何嵌合型b/h PIV3/RSV。同樣地，1:400稀釋度的多株RSV抗血清 (Biogenesis)中和了 50%RSV A2，但即使是 1:15.6之稀釋 度，亦不能中和b/h PIV3 RSV (表6)。 144243.doc -126- 201009079 ❹
表6 不能藉著RSV抗體中和b/h PIV3 RSV嵌合型病毒 在中和測定中 50%中和抗體稀釋度之倒數 使用的病毒 RSV F MAb RSV Ab RSV 2000 400.0 b/h PIV3 <25 <15.6 b/h RSV F1*N-N <25 <15.6 b/h RSV F2 <25 <15.6 b/h RSV G1 ND <15.6 b/h RSV G2 ND <15.6 hPIV3 F MAb C191/9，在1:500的稀釋度下，中和50%的 b/h PIV3 以及 b/h PIV3/RSV(表 7) ° hPIV3 HN MAb 68/2在 1:16,000的稀釋度下， 中和了 b/h PIV3， 並在1:32,000的稀 釋度下，中和了 b/h PIV3/RSV (表7)。 表7 藉著hPIV3 Mabs中和b/h PIV3 RSV嵌合型病毒 在中和測定中 50%中和抗體稀釋度之倒數 使用的病毒 hPIV3 F MAb hPIV3 HN MAb RSV 62.5 <500 b/h PIV3 500 16000 b/h RSV F1*N-N 500 32000 b/h RSV F2 500 32000 b/h RSV G1 NDd 32000 b/h RSV G2 ND 32000 £1未判定。 實例20 :當在活體内投藥時，嵌合型牛PIV證實了減毒表 144243.doc -127- 201009079 現型’並誘發強的保護性反應 以5 X 10 pfu之野外型bpiV3、重組的bpiV3、別乂3、人 類/牛PIV3和安慰劑感染5週齡的敘利亞黃金倉鼠。將五組 不同的動物分開關在微生物隔離籠中。在感染後4天，犧 牲動物。將動物的鼻甲骨和肺臟均質化，並冷凍在_8〇。〇 下。藉著在37C下，在MDBK細胞中的TCID50測定，判定 出現在組織中的病毒。藉著紅血球吸附作用，利用天竺鼠 紅血球細胞’證實病毒感染。表8顯示不同piV3品系在倉 鼠肺臟和鼻甲骨中的複製力價。注意到重組的bpiV3和b/h PIV3嵌合型病毒在倉鼠肺臟中是減毒了的： 表8 PIV3病毒在敘利亞黃金倉鼠中，在鼻 _曱骨和肺臟中的複製 bPIV3、卜bPIV3、r-bPIV3(l)、hPIV3 和牛/人類 PIV3(1)在 倉鼠之上和下呼吸道中的複製 在感染後4天時的平均病毒力價 (log1G TCID5G/克組織=S.E.)b 病毒& 鼻甲骨 肺臟 bPIV3 5.3 ± 0.3 5.3 ± 0.2 r-bPIV3 5.0 ± 0.3 3.5 ± 0.2 r-bPIV3(l) 5.5 ± 0.2 5.4 ± 0.2 hPIV3 4.9 ± 0.2 5.4 ± 0.2 牛/人類PIV3(1) 4.9 ± 0.2 4.5 ± 0.2 aH5xl〇5PFU之指定病毒，鼻内接種一組四隻倉鼠。 b標準偏差。 此外，在感染之前和在感染後21天，從倉鼠中收集血液 144243.doc •128- 201009079 試樣，以血球凝集抑制測定來分析之。以受體破壞酵素 (RDE、DENKA Seiken Co.)處理血清試樣，並藉著在冰上 與天竺鼠紅血球細胞一起培養1小時，移除非-特異性的凝 集素。將野外型bPIV3和hPIV3加至2-倍連續稀釋的倉鼠血 清試樣中。最後，加入天竺鼠紅血球細胞（0.5%)，並容許 在室溫下發生血球凝集作用。表9顯示在以不同PIV3品系 感染之倉鼠中產生的抗體反應。注意到b/h PIV3嵌合型病 毒對hPIV3，產生像野外型hPIV3 —樣強的抗體反應，遠超 過由重組體或野外型bPIV3所產生的反應： 表9 使用得自以不同PIV3病毒感染之倉鼠的 血清的血球凝集抑制測定 接種倉鼠所用的病毒 倉鼠jk清力價 野外型 bPIV3 HPIV3 重組的bPIV3 1:16 1:16 野外型bPIV3 1:16 1:8 野外型hPIV3 1:4 1:128 b/h PIV3嵌合型病毒 1:8 1:128 安慰劑 <1:4 <1:4 這些結果證實本發明之b/h PIV3嵌合型病毒的性質，其 使這些重組體更適合用於疫苗調配物。當在活體内投藥 時，b/h PIV3嵌合型病毒不僅證實減毒的表現型，亦產生 像野外型hPIV3 —樣強的抗體反應。因此，因為本發明之 嵌合型病毒具有具減毒表現型，並誘發像野外型hPIV—樣 強之免疫反應的獨特組合，故這些嵌合型病毒具有在人類 中成功地用來抑制及/或保護對抗PIV感染所必需的特徵。 144243.doc -129- 201009079 實例21 :載有呼吸道融合細胞病毒G或F蛋白質之牛副流感 3/人類副流感3，在倉鼠之上和下呼吸道中的複製 利用 100毫升體積之 lxl〇6pfu或 lxl〇4pfu的 b/h PIV3、b/h PIV3/RSV、RSV A2或安慰劑培養基，鼻内感染5週齡的敘 利亞黃金倉鼠（每組6隻動物）。將不同組的動物分開關在微 生物隔離籠t。在感染後4天，收獲動物的鼻甲骨和肺 臟’均質化並儲存在-70°C下。在Vero細胞中，藉著TCID50 測定，判定出現在組織中之病毒的力價。關於攻毒測定， 在第28天時以lxlO6 pfu/毫升的hPIV3或rSV A2鼻内接種動 物。在攻毒後4天，分離動物的鼻曱骨和肺臟，並藉著溶 菌斑測定，在Vero細胞上測定攻毒病毒的複製，以免疫染 色來定量。表10顯示在倉鼠中’不同品系在肺臟和鼻甲骨 中的複製力價。 表10 表現RSV G或F蛋白質之牛/人類PIV3 ’在倉鼠 之上和下呼吸道中的複製 在感染後4天時的平均病毒力價 (log1()TCID5。/克組織=s.E.)b 病毒a 鼻甲骨 肺臟 b/h PIV3 4.8 ± 0.4 4.4 ± 0.3 RSV A2 ^4 ± 0.5 3.3 + 0.5 b/h RSV G1 4.2 ± 0.7 2.9 ± 〇·7 b/h RSV FI 3.9 ± 0.4 2.7 ± 0.2 b/h RSV FI N-P 4.6 ± 0.4 3.5 ± 0.2 b/h RSV G2 4.2 + 0.9 4.3 + 0.2 b/h RSV F2 ^ 4.6 ± 0.6 4.4 + 0.5 aa5xl06PFU之指定病毒，鼻内接種一組四隻倉鼠。 144243.doc •130· 201009079 b標準偏差 敘利亞黃金倉鼠代表適用於評估重組之bPIV3和hPIV3遺 傳設計病毒的複製和免疫原性的小動物模式。預期導入 RSV抗原將不會改變嵌合型b/h PIV3在倉鼠中複製的能 力。該結果顯示所有的嵌合型病毒，均以類似b/h PIV3在 倉鼠鼻甲骨中的程度複製（表10)。相反的，在第1個位置藏 有RSV基因的嵌合型病毒，與b/h PIV3相比較，在倉鼠肺 臟中展現出1-1.5 l〇gl0降低的力價（表10)。在第2個位置藏 有RSV基因的嵌合型病毒，以類似在倉鼠的下呼吸道中， 對b/h PIV3觀察到的力價複製。 實例22 :當以人類副流感病毒3和呼吸道融合細胞病毒A2 攻毒時，以載有呼吸道融合細胞病毒G或F蛋白質之牛副流 感3/人類副流感3免疫的倉鼠得到保護 在免疫之後28天，以1x106PFU的RSV A2或hPIV3攻毒倉 鼠，評估由b/h PIV3/RSV引起的免疫原性。接受b/h PIV3/ RSV的動物，受到完全免於RSV和hPIV3的保護（表11)。只 有投予安慰劑培養基的動物，在下和上呼吸道展現出高力 價的攻毒病毒。該測定亦顯示以RSV免疫的動物，未得到 免於hPIV3攻毒的保護。同樣地，接種hPIV3疫苗的動物， 顯示出高力價的RSV攻毒病毒（表11)。 144243.doc -131 - 201009079 表11 當以 hPIV3和 RSVA2攻毒時，b/hPIV3/RSV _ 免疫之倉鼠t至]保護 攻毒病毒· hPIV3 RSV Α2 在攻毒後4天的平均病 毒力價（l〇gi〇TCID50/克 組織士S.E.)bc 在攻毒後4天的平均病 毒力價（log10 pfu5〇/克組 織土 S.E.)b 免疫病毒a 鼻曱骨 肺臟 鼻曱骨 肺臟 b/h PIV3 <1.2 ± 0.0 <1.0 ± 0.1 ND ND b/h RSV G1 <1.2 ± 0.1 <1·1 ± 0.1 <1.0 + 0.3 <0.7 + 0.1 b/h RSV FI <1.2 ± 0.2 <1.0 ± 0,0 <1.1 + 0.5 <0.6 ± 〇·〇 b/h RSV FI NP-P <1.0 ± 0.0 <1.0 ± 0.0 <0.8 + 0.1 <0.5 + 0.0 b/h RSV G2 <1.2 ± 0.2 <1.1 ± 0.2 <0.8 + 0.1 <0.8 + 0.3 b/h RSV F2 <1.2 ± 0.1 <1.0 ± 0.1 <1.3 + 〇.6 <1.6 土 1.0 RSV A2 4.5 土 0.6 4.8 ± 0.6 <〇·6 ± 0.2 <0.6 + 0.1 安慰劑 4.4 ± 0.1 4.1 ± 0.1 3.6 + 0.8 3.1 + 0.7 a在第0天，用來免疫每組6隻倉鼠的病毒。 b在第28天，以106 pfu的hPIV3或RSV A2攻毒倉鼠。在攻毒 後4天，收獲動物的肺臟和鼻甲骨。 e標準偏差。 實例23 :以載有啤吸道融合細胞病毒之牛副流感3/人類副 流感3接種倉鼠，誘導企清HAI和中和抗體 在攻毒之前，在第28天從免疫動物中獲得血清試樣。使 144243.doc • 132· 201009079 用50%溶菌斑降低測定，對倉鼠血清分析RSV中和抗體的 存在，並藉著進行血球凝集素抑制（HAI)測定（表8)，分析 PIV3 HAI血清抗體的存在。如下進行50%溶菌斑降低測定 (中和測定）：連續2-倍稀釋倉鼠血清，並與100 PFU的RSV A2—起培養1小時。然後將病毒-血清混合物移至Vero細胞 單層，並以曱基纖維素覆蓋。在35°C下培養5天之後，使 用RSV多株抗血清將單層免疫染色，以便定量。藉著在V 型底的96-孔培養盤中，在25°C下，將第28天之倉鼠血清 的連續2-倍稀釋與hPIV3—起培養30分鐘，進行血球凝集-抑制（HAI)測定。接著在每孔中加入天竺鼠紅血球，連續 培養額外的90分鐘，並記錄在每孔中血球凝集作用的出現 或缺乏。 結果顯示表現RSV F蛋白質的病毒，展現出幾乎像在獲 自以野外型RSV接種之動物的血清中觀察到的那些一樣高 的RSV中和抗體力價（表12)。相反的，表現RSV G蛋白質 的病毒則顯示出低很多的RSV中和抗體（表12)。所有的嵌 合型b/h PIV3/RSV倉鼠血清，所顯示出之HAI血清抗體的 含量，接近對b/h PIV3觀察到的含量（表12)。結果顯示嵌 合型b/h PIV3可在倉鼠中有效地感染和複製，並誘發保護 性免疫反應。 144243.doc -133- 201009079 表12 以b/h PIV3/RSV接種倉鼠，誘發血清HAI和中和抗體 病毒a 對RSV反應的中和抗體^ (平均值倒數log2± SE) 對hPI V3反應的HAI抗體e (平均值倒數log2 土 SE) RSV 7.9 ± 1_00 ND b/hRSVFl*N-N 7.8 ± 0.85 6.6 ± 0.5 b/h RSV FI 5.5 ± 0.53 5.5 ± 0.5 b/h RSV G1 3.4 ± 0.50 6.6 ± 0.7 b/h RSV F2 6.9 ± 0.65 6.7 ± 0.8 b/h RSV G2 3.4 ± 0.50 5.2 ± 0.4 b/h PIV3 ND 7.2 ± 0.5 a用來免疫倉鼠的病毒。 b藉著50%溶菌斑降低測定判定的中和抗體力價。 e倉鼠前-血清的中和抗體力價<1.0，且HAI抗體力價<4.0。 實例24 :以低劑量之載有呼吸道融合細胞病毒的牛副流感 3/人類副流感3接種倉鼠，保護倉鼠免於呼吸道融合細胞 病毒A2的攻毒，並誘導血清HAI和中和抗體 為了確認最佳的疫苗候選者，使用低劑量的不同構築體 (參見實例2)來免疫倉鼠。在表13中概述攻毒的結果。 144243.doc -134- 201009079 表13 b/h PIV3/RSV-低劑量免疫的倉鼠，受到 免於RSV A2攻毒的係謨 複製 以RSVA2攻毒 在接種疫苗後4天的平均 病毒力價(logio TCID50/克 組織土 S.E.)bc ------------------. 在接種疫苗後4天的平均 病毒力價(log10 pfu50/克組 織土S.E.)b 免疫的疫苗a 鼻甲骨 肺臟 鼻曱骨 肺臟 b/h PIVE 4.9 ± 0.5 4.8 ± 1.0 ND ND b/h RSV G1 3.0 ± 0.8 3_1 ± 0.5 <0.9 土 0.5 一 ~~ ,— <0.7 ± 0.4 b/h RSV F1*N-N 3_4 ± 0.1 3.5 ± 0.1 <1.4 ± 0.7 <0.5 ± 0.0 b/h RSV G2 4.1 ± 0.6 3.8 ± 0.4 <0.8 ± 0.0 <0.5 ± 0.1 b/h RSV F2 5.2 ± 0.6 3.9 ± 0.4 <0_7 ± 0.1 <0.5 ± 0.1 RSV A2 2.8 ± 0.3 2.7 ± 0.6 <0.8 ± 0.1 <0.5 ± 0.0 安慰劑 NDd ND 3.0 ± 0.8 3.2 ± 0.9 a在第0天，以104 PFU/毫升之低劑量，用來免疫一組6隻動 物的病毒。 b在第28天，以106 pfu之RSV A2攻毒倉鼠。在攻毒後4天， 收獲動物的肺臟和鼻曱骨。 e標準偏差。 <5未判定。
接下來，藉著50°/。溶菌斑降低測定（中和測定），判定中 和抗體力價。使用Vero細胞，對b/h PIV3、b/h PIV3/RSV 144243.doc -135· 201009079 嵌合型病毒或RSV，進行中和測定。在室溫下，在0.5毫升 OptiMEM中，將連續2-倍稀釋的RSV多株抗血清 (Biogenesis; Poole, England)、獲自 Medlmmune 的 RSV F MAb (WHO 1200 MAb)或 hPIV3 F (C191/9)和 HN (68/2) MAbs，與大約 100 PFU之 b/h PIV3、b/h PIV3/RSV嵌合型病 毒或RSV—起培養60分鐘。在培養之後，將病毒-血清混合 物移至Vero細胞單層，在35°C下培養1小時，以在EMEM/L-15培養基（JRH Biosciences; Lenexa, KS)中的1 %曱基纖維素 覆蓋，並在35°C下培養。在接種之後6天，將被感染的細 胞單層免疫染色。以抑制50%病毒溶菌斑之最高血清稀釋 度的倒數來表示中和力價。亦對在感染後28天，獲自以 b/h PIV3、b/h PIV3/RSV嵌合型病毒或RSV A2免疫之倉鼠 的血清，進行中和測定。以連續2-倍稀釋倉鼠血清，並與 100 PFU之RSV A2—起培養1小時。然後將病毒-血清混合 物移至Vero細胞單層，並以甲基纖維素覆蓋。在35°C下培 養5天之後，使用RSV多株抗血清，將該單層免疫染色， 以便定量。倉鼠前-血清之中和抗體力價<1.0，而HAI抗體 力價<4.0。藉著在25°C下，在V型底的96-孔培養盤中，將 連續2-倍稀釋的第28天倉鼠血清與hPIV3—起培養，進行 血球凝集-抑制（HAI)測定。接著，在每孔中加入天竺鼠紅 血球細胞，繼續培養額外的90分鐘，並記錄在每孔中血球 凝集作用的出現或缺乏。表14概述該結果： 144243.doc •136· 201009079 表14 以較低劑量之b/hPIV3/RSV接種倉鼠，誘 j6l清HAI和中和抗體 病毒a 對RSV的中和抗體反應1^ 對hPIV3的ΗΑΙ抗體反應e (平均值倒數log2+SE) (平均值倒數log2±SE) RSV 6·5 ± 〇·7 ND b/h RSVF1*N-N 2.5 ± 0.7 5.7 ± 0.6 b/h RSV G1 2.0 ± 〇.〇 6.0 ± 0.0 b/h RSV F2 3.8 ± 1.5 6.7 ± 0.6 b/h RSV G2 3.8 ± 1.3 5.5 ± 0.6 b/h PIV3 ND 6.5 ± 0.7 a#104pfu/毫升之低劑量，用來免疫倉鼠的病毒。 b藉著50%溶菌斑降低測定，判定中和抗艎力價。 c倉鼠前-血清之中和抗體力價<1.0，而HAI抗體力價<4.0。 當將接種劑量降低至每隻動物1 X 104 PFU時，加劇了在 第一個位置具有RSV基因之嵌合型病毒的受限複製表現 型。b/h PIV3/RSV F1和G1在倉鼠之上呼吸道中複製的力 價，與1?/11?1¥3的那些相比較，降低1.0-2.0 1(^1()(表13)。 相反的，在位置2帶有RSV基因的b/h PIV3/RSV，在上呼吸 道中複製，達到在b/h PIV3中觀察到的程度。在第一個位 置藏有RSV基因的b/h PIV3/RSV，在倉鼠肺臟中的複製亦 較受限制（表13)。相反的，b/h PIV3/RSV F2在鼻甲骨和肺 臟中的複製，仍分別達1〇5·2和1〇3·9的高力價（表13)。在第 144243.doc •137- 201009079 28天，以1 x 106 pfu的RSV A2攻毒接種疫苗的倉鼠（表 13)。不管在倉鼠的呼吸道中觀察到低程度的複製，動物 仍在下和上呼吸道兩處，得到免於RSV攻毒的保護（表 13)。保護的程度，像在以野外型RSV接種之動物中觀察到 的一樣好。只有接受安慰劑培養基的動物，在鼻甲骨和肺 臟顯示出高病毒力價（表13)。在第28天，從免疫倉鼠中收 集血清，並分析RSV中和抗體和PIV3 HAI血清抗體的存在 (表14)。與在野外型RSV血清中觀察到的力價相比較。在 獲自以b/h PIV3/RSV免疫之倉鼠的血清中，在RS V中和抗 體力價方面，觀察到大約50%的下降（表14)。但獲自接受 在位置2中藏有RSV基因之b/h PIV3的動物的血清，仍展現 出比得自在位置1中帶有RSV基因之PIV3/RSV的血清，更高 的RSV中和抗體。與b/h PIV3血清相比較，PIV3 HAI之血 清抗體力價亦稍微降低（表14)。 實例25 :當以人類副流感病毒3或人類間質肺病毒NL/〇i)1 .. 繊畐1J流 攻毒時，以載有人類間質肺病毒F之牛副流感3/人 感3免疫的倉鼠得到保護
ViTvlPV 或 分別以b/h PIV3、b/h hMPV FI、b/h hMPV F2 ' n 。將5.組 安慰劑免疫五組敘利亞黃金倉鼠（每組有六隻倉鼠）° 不同的動物分開關在微生物隔離籠中。在免疫後28 & ,U便 1 X 106PFU 之 hPIV3 或 hMPV (NL/001 品系）攻毒食鼠’ 評估由b/h PIV3/hMPV F引起的免疫原性。在攻善後4夭 犧牲動物。將動物的鼻甲骨和肺臟均質化，I### 測定 80°C下。藉著在37°C下，在MDBK細胞中的TClPw •138- 144243.doc 201009079 判定出現在組織中的病毒。藉著紅血球吸附作用，利用天 竺鼠紅血球細胞，證實病毒感染。表15顯示PIV3品系和 MPV品系在倉鼠肺臟和鼻曱骨中的複製力價。 表15 當以hPIV3或hMPV/NL/001攻毒時，以 b/h PIV3/hMPV F-免疫的倉鼠得到保護 攻毒病毒： hPIV3 hMPV 在攻毒後4天的平均病 毒力價（log1C)TCID50/克 組織士S.E)b 在攻毒後4天的平均病 毒力價（l〇g1()TCID50/克 組織土S.E)b 免疫病毒a 鼻甲骨 肺臟 鼻甲骨 肺臟 b/h PIV3 <1·3 ± 0.2 <1.1 ± 0.1 ND b/h hMPV FI <1.3 ± 0.1 <1.1 ± 0.1 3.5 ± 0.8 <0.5 ± 0.2 b/h hMPV F2 <1.2 ± 0.1 <1.2 ± 0.1 <0.9 ± 0.4 <0.5 ± 0.1 hMPV ND <0.8 ± 0.3 <0.4 ± 〇.〇 安慰劑 4_3 ± 0.3 4.5 ± 0.5 6.0 ± 〇.3 4.5 ± 1.3 a在第0天用來免疫每組6隻倉鼠的病毒。 b在第28天，以106pfu之hPIV3或hMPV攻毒倉鼠。在攻毒後 4天，收獲動物的肺臟和鼻曱骨。 ND=未判定。 結果顯示接受b/h PIV3/hMPV F2(F在位置2)的動物，完 全得到免於hMPV和hPIV3的保護（表15)。然而，b/h PIV3/hMPV FI (F在位置1)僅在上呼吸道（例如鼻甲骨）中， 144243.doc -139- 201009079 降低感染hMPV力價2·5 logs ,雖然其在下呼吸道（例如肺 臟）中，提供完全免於hMPV和hPIV3兩者感染的保護（表 15)。投與安慰劑之動物在下呼吸道及上呼吸道顯示有高 攻毒病毒之力價（表15)。 本發明之範圍，不受特別說明之具體實施例的限制，其 企圖作為本發明之個別觀點的單一解释，且任何在功能上 相等的構築體、病毒或酵素，亦在本發明的範圍内。實際 上，除了在本文中出示和描述的那些之外，熟諳此藝者應 可從前述的說明和附錄的圖式中，了解本發明的各種修 改。企圖將這類修改包括在附錄之申請專利範圍的範圍 内0 在本文中提及的各種出版物’將其揭示内容全部以引用 的方式併入本文中。 【圖式簡單說明】 圖1·人類間質肺病毒的F蛋白質，與得自不同禽肺病毒 的不同F蛋白質之胺基酸序列的逐對排列。藉著胺基酸的 單一-字母·符號，確認在兩個序列之間相同的胺基酸。以 "符號指出在兩個胺基酸序列之間的保留胺基酸交換， 而間隔表示非-保留性胺基酸交換。A)人類間質肺病毒F蛋 白質與分離自Mallard鴨之禽肺病毒之F蛋白質（在外功能部 位中有85.6%同一性）的排列。B)人類間質肺病蛋白質 與分離自火雞之禽肺病毒之F蛋白質（B亞組；在外功能部 位中有75%同一性）的排列。 圖2.擴大得自衍生自b/h PIV3嵌合型病毒之三種不同分 144243.doc -140- 201009079 離株的核甞酸5255至核：y：酸6255的PCR片段。利用對人類 PIV3之F基因專一的酵素，消化所得的1 kb DNA片段。這 些酵素不能切開牛PIV3的相對應片段。1%瓊脂糖凝膠顯示 未消化的片段（跑道2、5和6)以及經Sacl或Bglll消化的片段 (分別為跑道4、6和跑道9、10和11)。在跑道10中的試樣是 未經消化的’然而，當以Bglll重複消化時，切開該試樣 (資料未顯示）。跑道1和8顯示DNA尺寸標記。 圖3.擴大得自衍生自b/h PIV3嵌合型病毒之三種不同分 離株的核苷酸9075至核苷酸10469的PCR片段。利用對牛 PIV3之L基因專一的酵素，消化所得的1.4 kb DNA片段。 這些酵素不能切開人類PIV3的相對應片段。1%瓊脂糖凝 膠顯示未消化的1 ·4 kb片段（跑道2、5和8)。在跑道3、4、 6、7、9和10中，顯示藉著以BamHl和PvuII消化所產生之 較小的DNA片段。跑道1顯示DNA尺寸標記。 圖4.顯示解救載有RSV之bPIV3/hPIV3的構築體的表現。 六個構築體，包括bPIV3/hPIV3載體，並證實b/h PIV3載有 RSV F或G cDNA。刪除牛PIV3 F基因和HN基因’並分別以 人類PIV3 F和HN基因代替。將RSV F或G基因選殖到位置1 或位置2内。所有的RSV基因連接到bPIV3 N-P基因間區 域，除了RSV F1*(N-N)之外，其在較短的bPIV3 N基因終 止/N基因開始序列之後。 圖5.載有RSV F或G基因的b/h PIV3，展示出位置影 響。（A)是嵌合型病毒-感染細胞之溶胞產物的西方墨點分 析，以顯示得自嵌合型牛/人類PIV3之RSV F及G白質之表 144243.doc -141- 201009079 現。使用抗RSV F蛋白質的單株抗體（MAbs)，刪除F蛋白 質，並使用抗RSV G蛋白質的多株抗體（PAbs)，刪除G蛋白 質。50 kDa譜帶代表在利用所有嵌合型病毒，和野外型 RSV感染之細胞中檢測到的F!片段。與野外型RSV相比 較，在嵌合型病毒感染細胞之溶胞產物中，有較多20 kDa F片段的堆積。以0.1之MOI進行實驗，除了在跑道1中，以 1.0的較高MOI，重複載有RSV fTN-N之b/h PIV3的感染。 檢測到RSV G蛋白質的兩種不成熟和糖基化形式，移動至 大約50 kDa和90 kDa。（B)為顯示得自嵌合型牛/人類PIV3 之RSV F及G mRNAs之表現的北方墨點分析，其顯示與在 圖5 A中證實之蛋白質表現結果有關的mRNA轉錄。在含有 1%甲醛的1%瓊脂糖凝膠上，分離出等量的總RNA，並移 至尼龍膜上。使墨點與毛地黃毒甞（DIG)-UTP-標示之核糖 探針（riboprobe)雜交，該探針係使用DIG RNA標示套組， 藉著在活體外的轉錄作用而合成的。（C)為嵌合型病毒， 包括載有RSV F或G蛋白質之b/h PIV3，在Vero細胞中的生 長曲線（ΜΟΙ=0·01)。使Vero細胞生長至90%匯合，並以 0.01之MOI感染。在37°C下培養被感染的單層。藉著 TCID5Q測定判定每個時間點收獲的病毒力價，其係藉著在 37°C下培養6天之後，以肉眼檢查CPE來進行。 圖6.顯示在PIV3基因組中eGFP插入對病毒複製的位置影 響。b/h PIV3載有增強綠螢光蛋白質（eGFP)之構築體。隨 後，在PIV3的所有基因（在本文中僅顯示位置1、2、3和4) 之間，將eGFP基因導入b/h PIV3載體内。將eGFP基因連接 144243.doc -142- 201009079 到bPIV3 N-Ρ基因間區域。b/h GFP1構築體，在3'最接近b/h PIV3基因組的位置藏有eGFP基因卡匣。b/h GFP2構築體， 在N和P基因之間含有eGFP基因卡匣。b/h GFP3構築體，在 P和Μ基因之間含有eGFP基因卡匣，而b/h GFP4構築體， 則在Μ和b/h PIV3的F之間含有eGFP基因卡匣。 圖7.在b/h PIV3基因組中增強綠螢光蛋白質（eGFP)插入 的位置影響。（A)顯示b/h PIV3-GFP 1，2 ’ 3的GFP表現； 並顯示當利用載有eGFPl、2和3的b/h PIV3，以MOI 0.1和 MOI 0.01感染Vero細胞20小時時，所產生之綠細胞的量。 藉著使用螢光顯微鏡，以肉眼檢查綠細胞。（B)為被感染 細胞之溶胞產物的西方墨點分析，以顯示在b/h PIV3中， 在位置1，2和3中’ eGFP的表現（MOI為0· 1，在Vero細胞中 感染後24小時）。利用GFP MAb和PIV3 PAb探測該墨點。亦 使用PIV3抗體，顯示墨點有相同體積的負荷。（C)為載有 GFP構築體（在位置1、2和3處）之b/h PIV3，在Vero細胞中 的生長曲線（MOI=0.1)。 圖 8.顯示在 b/h PIV3 RSV F1* 和 b/h PIV3 RSV F2基因間 區域之間的差異。利用不同的基因間區域，載有RSV F基 因的b/h PIV3構築體。三個構築體118¥[1*>1-：^、1^¥?2]^-P和RSV FI N-P，分別與在圖 4中之RSV F*(N-N)、RSV F2 和RSV F1相同。在RSV FpN-N中’在N基因開始序列和N 基因轉譯開始密碼子之間的距離，僅為10個核苷酸（nts) 長。相反的，在RSV F2構築體中的該距離為86個核甞酸 長。RSV FI* N-N亦使用N基因開始序列，而非在RSV F2構 144243.doc -143- 201009079 築體中使用的p基因開始序列。 圖9 _在被插入之RSV基因下游，基因間區域的長度和性 質’對病毒複製有影響。（A)為在嵌合型病毒中，RSV F蛋 白質表現的西方墨點分析。利用抗RSV F蛋白質之單株抗 體，來探測墨點。由RSV F1構築體表現，並在感染後24和 48小時測量到的F1蛋白質含量’接近對RSV F2構築艎所觀 察到的，但比RSV F1*N-N構築體的那些高很多。（B)為b/h RSV FI N-P的生長曲線；且為比較以乂 FI、RSV F1*N-N 和RSV F2構築體，以o.i之MOI，在vero細胞中之病毒複製 動力學的多周期生長曲線。藉著溶菌斑測定來判定每個時 間點收獲的病毒力價，其係藉著在培養5天之後，以定量作 用之RSV多株抗血清進行免疫染色來進行。 圖10.載有RSV F和hMPV F的三價b/h PIV3構築體。在 本文中顯示兩個病毒基因組，分別包括嵌合型b/h PIV3載 體和衍生自間質肺病毒F基因的第一個異源序列以及衍生 自呼吸道融合細胞病毒F基因的第二個異源序列。已經在 Vero細胞中，擴大帶有任一構築體的病毒。可使用按照描 述設計的病毒’作為三價疫苗，對抗副流感病毒感染、間 質肺病毒感染和呼吸道融合細胞病毒感染。 圖11.顯示選殖兩個rSVf至b/hPIV3載體内。藏有兩個 RSV F基因的構築體。可使用該構築體判定病毒生長動力 學、RSV F蛋白質產製以及在倉鼠中的複製和免疫原性。 圖12.載有hMPV F構築體的嵌合型b/h PIV3。將人類間 質肺病毒（hMPV)之F基因插入b/h PIV3基因組的位置1或位 置2中。hMPV F基因卡匣藏有bPIV3 N-P基因間區域。 144243.doc 144· 201009079 圖13.載有hMPV F基因（在位置2)之b/h PIV3的免疫沉澱 法和複製測定。（A)顯示使用天竺鼠或人類抗-hMPV抗血清 之hMPV F蛋白質的免疫沉澱法。在載有hMPV F2之b/h PIV3的溶胞產物中，觀察到移動至大約80 kDa的特異譜 帶。該尺寸相當於F前驅物蛋白質F〇。亦在b/h PIV3和假對 照組跑道中，觀察到不同尺寸的非-特異譜帶。（B)顯示生 長曲線，其可用來判定b/h PIV3/hMPV F2的病毒複製動力 學，並將其與在Vero細胞中，以0.1之MOI，對於b/h PIV3 β 和b/h PIV3/RSV F2所觀察到的那些相比較。（C)為生長曲 線，其可用來判定b/h PIV3/hMPV F1的病毒複製動力學， 並將其與在Vero細胞中，以0.01之MOI，對於b/h PIV3/hMPV F2和b/h PIV3所觀察到的那些相比較。 圖14.載有可溶性RSV F基因構築體的嵌合型b/h PIV3。 該構築體包括可溶性RSV F基因的單一副本，缺乏穿透膜 和胞液功能部位之RSV F基因的版本。該構築體之優點是 可溶性RSV F不能被併入病毒粒子基因組内》
9 圖 15.經免疫染色的b/h PIV3/hMPV F1 和 b/h PIV3/hMPV F2。（A)稀釋b/h PIV3/hMPV F1病毒，並用來感染匯合不足 的（subconfluent) Vero細胞。以含有健大黴素之optiMEM培 養基覆蓋被感染的細胞，並在35°C下培養5天。固定細 胞，並以天竺鼠抗-hMPV血清進行免疫染色。在AEC受質 系統的存在下，藉著特異的顏色展開，以肉眼檢查hMPV F 的表現。（B)稀釋b/h PIV3/hMPV F2病毒，並用來感染Vero細 胞。以在EMEM/L-15培養基中的1%曱基纖維素（JRH Biosciences; Lenexa, KS)覆蓋被感染的細胞。培養細胞， 144243.doc -145- 201009079 固定，然後以抗-hMPV天竺鼠血清進行免疫染色。抗-hMPV天竺鼠血清是對hMPV 001蛋白質專一的。 圖16.在蔗糖梯度上，載有RSV基因之b/h PIV3的病毒 粒子分級分離。這些連續實驗調查RSV蛋白質是否被併入 b/h PIV3病毒粒子中。（A)顯示自由RSV F(在桿狀病毒中產 製，並截短C-終端）在20-66%蔗糖梯度的對照組梯度。大 多數的自由RSV F出現在溶離份3、4、5和6。（B)顯示RSV 簾糖梯度（以25,000 rpm旋轉1 5小時），及顯示在溶離份 10、11和12中觀察到的RSV病毒粒子之最大濃度。利用 RSV多株抗血清以及RSV F MAb，探測RSV溶離份。含有 最大量之RSV病毒粒子的溶離份，亦對RSV F顯示出最強 的信號，暗示RSV F蛋白質一起移動，並與RSV病毒粒子 有關。在（B)中最後的圖，亦顯示溶離份10、11和12，藉著 溶菌斑測定，展示最高的病毒力價^ (C)顯示b/h PIV3蔗糖 梯度（以25,000 rpm旋轉15小時）。b/h PIV3病毒粒子可以是 較具多型性的，並因此含有b/h PIV3病毒粒子之高峰溶離 份的散布是較廣泛的。（D)顯示b/h PIV3/RSV F2蔗糖梯度 (以25,000 rpm旋轉15小時）。利用PIV多株抗血清和RSV F MAb兩者，分析b/h PIV3/RSV F2的蔗糖梯度溶離份。含有 最多病毒粒子的溶離份，是溶離份11、12、13和14，如同 使用PIV3抗血清之西方法所示。同樣地，這些亦是展示最 高量RSV F蛋白質的溶離份。在溶離份5和6中，亦出現一 些自由的RSV F。溶離份11、12、13和14展示高峰病毒力 價。（E)顯示b/h PIV3/RSV G2蔗糖梯度（以25,000 rpm旋轉 15小時）。含有最多b/h PIV3/RSV G2病毒粒子的溶離份 144243.doc •146· 201009079 (9、10、11和12)，亦對RSV G蛋白質顯示出最強的信號。 再者，這些也是具有最高病毒力價的溶離份。
144243.doc -147- 201009079 序列表
<110> Medlmmuae Vacciaes, Inc, ViroNovative BV <120>重组之副流感病毒表現系統及包含衍生自間質肺病毒之異揉 抗原之疫苗 <130> 7682-061 <140> 092103642 <141> 2003-02-21 <150> 60/358,934 <151> 2002-02-21
<160> 93 <170> FastSlQ for Windows Version 4.0
<210> 1 <2Π> 2507 <212> DNA 間質肺病毒 <220〉 <221> CDS <222>(1)...(2507) <223>人類間質肺病毒分離株00-1基質蛋白質(M)和融合蛋白質(F)基因 <40〇> 1 Φ atggagtoct acctegtaga cacctatcaa'g^attcctt acacagtagc tsttcaagtt gatctaatj^ aaaasgacct gttaa:tg«i agcctJacea tatggttccc tttgEtteag 120 gccaaaca: caccagci®t gctgctcgst cagctaaaaacatgacaat aaccacttlg 1¾) tatgctgcat cacaazatgg tccaaisKic aaagtiaatg c^cagccca aggtgcagca 24〇 ai^tctgtac ttcccaaaaa atctgaagtc aatgcpctg tagc%tcga tgaatatagc 3(X) aaactggaat tteacaa^t cacagtctgt gaagtaaaaa cagtnactt ^mccatg 360 aaaxatacg ggatggtaic aasatttgtg agctcggcca aatcagtfeg caaaaaaaa 420 catgatctaa tcgcactaQ; gatctagaaa 够acacacc tgttacaata 4¾)
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<210>2 <211> 1596 <212> DNA <213>肺-病毒 <220>
<221>CDS <222> (1)...(1596) · <223>禽肺病毒融合蛋白質基因，部分的cds <400>2 atgtcttgga aagtggtact gctattggta ttgctagcta ccccaacggg ggggctagaa 60 gaa^gttatc tagaggagtc atgcagtact gttactagag gatacctgag cgttttgagg 120 acaggatggt atacaaatgt gttcacactt £SS£ttgga£ atgtgaaaaa tctcacatgt 180 accgacgggc ccagcttaat aagaacagaa cttgaactga caaaaaatgc acttgaggaa 240 ctcaagacag tatcagcaga tcaat^gca aagsaagcta ssataatgtc accaagaaaa 300 gcc〇S£tttg ttctgggtgc calagcatta ggtgtggcaa ctgctgctgc tgtgacggct 360 ggtgtagcga tagccaagac aattaggcta gaaggagaag tggctgcaat caaaggtgcg 420 ctcaggaaaa caaatgaggc tgtatctaca ttaggaaatg gcgtgagggt acttgcaaca 480 gctgtgaatg atctcaagga ctttataast aaaaaattga cacctgcaat aaacaggaac 540 aagtgtgaca tctcagacct taagatggca gtga£ctttg.gacaatacaa'tcggaggttc 600 ctcaatgtgg taagaca£tt ttctgacaat gcs^gtatta cgcctgcaat atctcta£at660 ttaatgactg acgctgagct tgtaagagct gtaagcaaca ^cxcacatc ttcaggacas 720 atcaatctga ^cttgagaa tcgggcaatg gtcagaagga aaggattcgg gattttgatt 780 ggagtttatg gtagctctgt ggtctatata g^cagcttc ctattdcgg tgtgatagat 840 acaccgtgtt ggagggtgaa ggc^ctcca ttatgttcag ggaaagacgg gaatta^ca 900 ^tctcttgc gz.gaggdxxdi aggttggtat tgtcaaaatg c^gatccac agtttattat 960 ccaaatgagg aggactgtga agtaagaagt gatcatgtgc tttgtgacac agcagct^g 1020 ataaatgtag caaaggagtc agaag'ag^c aacaggaata tdcaacaac aaagtaccct 1080 tgcaaggtaa gtacagggcg tcacccaata agcatggtgg ccttatcacc actgggtgct 1140 -2- 144243-序列表.doc 201009079 ttsgtagcct gttatgacgi tatgagttgt tccattggaa gcaacaaggttggaalaato 12(K3 agacctttgg ggaaagggtg tteato：2tc agcaatcaag atgctgacac tgttacaatt L260 gacaacacag tgtaccaatt gagcaaagtt ©aggagaac aacacacast taaagggaag 3320 ccagtatoia gcaattitga ccctatagag ttcccigaag aicagttcaacgiagcccig 1380 gaicaggigt ttgaaagtgt tgagaagagt csgaatctga agaxagsc aaacaagata 1440 .t^gatagca ugaaaaggg gaatgcagga tttgteatag tgatagtcct cattgtcctg 1500 ctcatgcigg cagcagttgg tgtgggcgtc Rcutgtss ttaagaagag aaaagcigct 15W coiaaaitcc caatggaaat gaatggtgtg aacaac 15% <210>3 - <211> 1666 <212>DNA <213>肺病毒 <220>
<22I>CDS <222> (14),..(1627) .. φ <223>备肺病4分余株lb融合蛋白質mRNA，完整的cds
gggacaagtg iuiaatgtctt ggaaagtggt act^tattg gt^ctag ctaaxcaac β) £££ggggcta gaagaaagtt atctagagga gtcatgcagc actgttacta gaggatacct 120 gagtgttttg aggacaggat gglatacaaa tgfettcaca cag^gttg gagatgtgga 180 a^ictcsca Igtaccgacg ggccca^ctt aa^tagaaca gaacttgaac igacaaaaaa 240 t^acttgag gaactcaa^a caglaicagc a^teaartg gcaaagpag ctaggataat 300 gtcaccas^a aaagcccggt ttgttctggg tgccitts^a tta^gtgtgg (^actg^gc 360 igctgtgdcg gci£St£tag cgatagccaa gacaattagg ctagaaggag aagtggctgc 420 aatcaagggt gcgctcagga aaacaaatga ggOgtaict ^acmggaa arggcgtgag 480 ggtacugca acagctgtga atgatctcaa ^actrtata ag^aaaaat tgscacctgc 5^) aataaacags aacaagtgts £K：atctcaga ccttaaga^gcagtgagct ttggacaaia 600 itccicaatg tggtaagsca gttttctgac aa^c^gta tacgoctgc 660 aatatcicta gatttaatga ctgxgaga gcctgtaaga gctgta^ca aca^cccac 720 atctfcagga cagatcaatc tgatgcttp gaatcgfgca atggtcagaa ggaaaggatt 780 tgggattctg attggagot aigg^gctc tgiggccai atagtgcag: ttcrtaim 840 cgi^tgata gatacaccgt gttggaaggt gaaggctgct ccauatgtt cagggaaaga 900 cgggaamt g^^tctct tgcgagagga ccaaggttgg tattgjcaaa atgctgg^ 960 cacagutat tatccaaatg aggaggs^tg tgaagtaaga agtgatcatg tgttagt£a 1020 cscagca^t gggataaatg tagc 抽 agga tgcaacBggai aiaictcaac 1(B0 ^acaaagtac cctt^aagg taagt^gg gcgtcacxxs atogcat^ tggccttatc 1140 ^oactgggt ^tccggtag atgttatga cggmigagt tguccattg gaagcaacaa 1200 ggttggaata atcag^cctt tggggmgg gtgttcatac atcagcaatc 1260 cactgttaca attgacaaca cagtgtacca attgascaaa£lt^aggagaacaacacac 1320 aaitaaaggg aagccagtat ctagc^utt tg^cctata gagtccctg aagatcagit 13B0 caacgtagcc ctggatcagg tgmgaaag tgttgagaag agtcagaatc tgatagacca 1440 gtcaaacaag atattggata gcattgaaaa §^§gaatgca ggatttgtca tagtgatagt 1500 cctcat^tc'ctgctcatgc tggca^cagt tggts^sfii gtcttctttg tggtta^aa 15fi) Eagaaaagct sctcxcaaattcccaaigga aatgaatggt gtgaacaaca aaggatttai 1620 cccttaattt tagttattaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1666
<210>4 <211> 1636 <212>DNA <2U>鼻氣管炎病毒 144243-序列表.doc 201009079 <220> <221>CDS <m> 03)...(1629) <223>火難鼻氣管炎融合蛋舡#之基因 次苹元），完曼的ecjs <400>4 ____________: ggg^aagta ggatggatgt aagaatctgt tccttaiatc taatcctagt 60 agcigcatac aagaaacata caatgaagaa tcctgcagta ctgtaaclag aggttataag 120 agtitgttaa g£acaggglE gtatacgaat gtamaacc tcgaaatagg gaatgitgag 180 a^atcactt gc2atgatgg acccagccta attpcactg agnagiact cacaaagaat 240 gctttgaggg agctcaaaac agtgtcagct gatouigtgg cta^gaaag cagaclaicc 300 tcacccagga gaogtagatt ^tic^ggt gcaat^cac tlggtgitgc g^agctgct 360 gccgtaacag ctggtgtagc acttgcaaag acaattagat lagagggaga ggtgaaggca 420 2tmgaatg ccctxrggaa gcagtstcca C3itagaa iggigtgagg 480 gt^taicaa ctgca£tcaa tgacctcaaa gaatnam gtaaaaaatt sactcd^ct 540 attaaccaga acaaatgcaa taUigcagat ataasgatgg caatiagca iggcraaaat 600 aacagaaggt tccisaatgt gg^aggcaa ttciotgata gtgcaggtat c^tcagci 660 gtgtctcttg atltaalgac agatgatg^ ct^iagag caattaacag aalsccaact 720 tcatcaggac agattagttt gatgttgaac aat<5tgcca Iggttagaag gaaggggm 780 Igtatattga ttg£tgttla tgsiggaacg gtcgtttaa tggmact gcccatattc 840 ggcgtgattg agacaccttg Ugga^gtg gtggcagcac cactctgtag gaaagagaaa ^30 ggcaaua培戊tstatact 脚雜 aagat c 卿g纪gguctgtac 碰“gctgj^tct %0 acagcttatt atcctaataa agatgat^ gaggtaaggg atgattatgt attt^^ac IG20 acagcagctg gcattastgt ggccctagaa gttgaacagt gcaactataa catatcgact iC®0 tcuaatacc cat£caaagt cagcacaggt 8gacaccct£ icagtatggt a^ctta^c 1140 cccctagggg gtctagtgtc agilatgag agtgtaagU gctccatagg tagcaata^ 12CX) gtagggataa taaaacagct aggcaaagfg tgcacccaca ttecc^caa c§aa^tg^: 1260 acgataacca ttgalaacac tg^taccaa ttgagcaagg ttgtaggcga acagaggao； 1320 ataaaaggas ctccagttgt gaaca^ttt aacccaatat tattccctga ggatcagttc 1380 aatgtt£cac Ug^raagt attt娜agt _ata$atctcaggactt aa_taag ]440 tctaacgact tgcia^gc agatga^tg agcaaggctg gaaagctat agcaamgta g^ctagtca ttctaggaat ctottttta cttgcagtga iataltactg ttccagagtc 1560 cggaagacca aaccaaagca tgattacccg gcc^^acag gtcatagcag catggcttat 1620 gtcagttaag ttattt 1636 <210>5 <211> 1860 <212>DNA <213>肺病毒 <220> <221>CDS <222> (1)...(110) 禽肺病毒基質蛋白質(M)基因，部分的cds <220> <221>CDS <222> (216)..,(1829) <2?3>.禽肺病毒融合糖蛋白（ρ)基因，完整的Cds * 144243-序列表.doc 201009079 <400>5
gagttcaggt satagl^gag ttaggggcat acgttcaagc agaaagcata agcagaatct60 gcaggaactg gagccsccag ggtacgagat atgtcctgaagtcaagataa acacagagag 12D tacacttacc aaatcacagt aaeaatttcg ttttraaccc tctcatagtt attacctagc 180 Ugatattat ttagaaaaaa ttgggacaag tgaaaatgtc ttggaaagtg gractgctat 240 tggtatt^t agctacxcca acgggggggc tagaagaaag ttatctagag gagfcatgca 300 gtactgttac tagaggatac ctga^tgttt tgaggacagg at£giataca aatgtgt^a 360 c^ttgaggt tggzgztgtg gaaaatctca catgtaccga cgggcccagc ttaataagaa 4¾) cagaacttga actgacaaaa aatgcactlg agpactcaa gacagtatca gcagatcaat 480 tggcaaagga agctaggata atgtcaccaa gaaaagcccg gtttgttctg ggtgccatag 540 cattaggtgt ggcaactgct gctgctgtga cggc^gtgt agcgatsga; suapcaatm 6(W ggctagaagg agaagtggct gcaaccaajgg gtgc^^g gaaaacaaat gaggctgtai: 660 ctacattagg ^aatggcgtg agggtacttg ca&^gctgt gaatgatctc aaggacttla 720 taaglaaaaa attg^acct gcaataaaca ggaacaagtg tgacatctca gaccttaaga 780 tggcagt^g ctttggacsa tacaatcgga ggricctcaa tgtggtaaga cagtttfctg 840 acaatgc^gg tattacgcct gcaatatctc tagatttaat pcE£acgct gagcttgtaa 900 fagctgtaag caacatgccc acatcttcag gacagalcaa tctgatgctt gagaatcggg 9S) caatggtcag aaggaaagga tttgggaut tgattggagt tta^gtagc tcigtggM 1020 ^atagtgca gcttcmtutcgg5iga tagatacacc gtgttggaag gigaaggctg 1娜 ctecattatg ttcagggaaa gacgggaatt atgcatgtct cttgcgagag gaccaaggtt 1140 ggtattgtca aaa^ctgga tccacagttt attatccaaa ^aggaggac tgtgaagtaa 1200 gaagtgatca tgtgtttigt gacacagcag ctgggacaaa tgtagcaaag gagteagaag 1260 agtgcaacag gaa^tctca acascaaagt accxttgcaa ggtaagtaca gggcgteacc 1320 caataagcar ggtggcctta tcacractgg gtgctttg£t agcctgttat gacggta^a 13¾) gtlgttccat tggaagcaac aaggttgiaa taatcagacc tttggggaaa ggglgttcat 1440 acatcagcaa tcaagatgct gac^tgUa caattgacaacacagtgtac csattgagca 1500 aagttgaagg agaacaacac acaattaaag ggaagcc^t atctagcaat u^^ccta 1560 tagagitccc tgaagatcag ttcaacatag ccctggalca ggtgtttgaa agtgttgaga 1620 agagtcagaa tctgatagac cagtcaaaca i^atattgga tagcattgaa aaggggaatg 1680 caggatttgt caragtgata gtcctcattg tcctgctcat gctggcagca gttggtgtgg 1740 gtgtcttctt tgtggttaag aagagaaaag ctgctcccaa attcccaalg gaaatgaatg 1¾¾} gtgtgaacaa caaaggaitt atcccttaat tttagtt^ a^aaattjgg g^zgtgm 1M) <210>6 <211> 574 <212>蛋白質 <2〗3>副黏液病毒 <400>6
Met du Leu Leu lie His Arg Leu Ser Ala De Phe Leu Thr Leu Ala 15 10 15 lie Asa Ala I-eu Tyr Leu Thr Ser Ser Gin Asn lie Glu Glu Hie 20 25 30
Tyr On Sar 1¾ Cys Ser Ala Val &r Aig Gly Tyr 1¼ Ser Ala Leu 35 40 45
Arg llr Gly Txp Tyr Ilr Ser Vd De Thr Ue Glu Leu Ser Asn De 50 55 60
Lys Glu Tlir Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu De Lys 65 70 75 80
Gh Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Va! Thr Glu Leu Gin Leu Leu 85 90 95 * Met Gin Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro 100 105 110 144243-序列表 _doc 201009079
Gin Tyr Met Asn Tyr Thr De Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser 115 120 125
De Ser Lys Lys Arg Lys Arg Ars Phe Leu Gly Phc Leu Leu Gly Vsl 130 135 140
Gly Ser Ala lie Ala Ser Gly De Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160
Glu Giy Glu Val Asn Lys lie Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 .
Ala Val Val Ser Lm Ser Asn Gly Val So1 Val Leu Thr Sor Lys Val 180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr He Asn Asn G3n L^u Leu Pro He Val Asn 195 200 205
Gin Gin Ser Cys Axs Ite Ser Asn De Glu Thr Val He Glu Phe Gin 210 215 220
Gk Lys Asm Scr Arg Leu I^u Glu He Asn Arg Glu Hie Ser Val Asn. 225 230 235 240
Ala (Jly Val Tnr 1¾ Pro Leu Scr Ihr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255
Leu Leu Ser Leu lie Asn Asp Met Pro He TTir Asn Asp Gin Lys Lys 260 265 270
Leu Met Ser Ser Asn Val Gin De Val Aig Gb Gin Ser TVr Ser Dc 275 280 285
Mei Ser lie De Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val GLi Leu Pro 290 295 300
He Tyr Qy Val De Asp Thr fto Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn lie Lys Glu Qy Ser Asn He Cys Leu Thr Arg 325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr C^s Αφ Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350
Pro Gin Ala Asp Thr Cys Lys Val Gin Ser Asn Ars Val Phe Cys Asp 355 360 365
Thr Asn Ser Leu Thr Leu Pio Ser Glu Val Ser Leu Cys Thr 370 375 380
Asp He Hhe Asn Scr Lys Tyr Asp Cys Lys De Met Ώιτ Scr Lys Thr 385 390 395 400
Asp lie Ser Ser Ser Val He Tk Sar Leu Gly Ala Be Val Ser Cys 405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Scr Asn Lys Asn Arg Gly De Dc 420 425 430
Lys Thr Hie Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Tbr Leu Tyr IVr Val Asn Lys Leu Glu Gly 450 455 鄉
Lys Asn Leu Tyr Val Lys Gly Glu ito He Dc Asn Tyr Tyr Asp Pro 465 , 470 475 480
Leu Vai Hie Pro Ser Asp Glu Hie Asp Ala Ser De Ser Gin Val 485 490 495
Glu Lys De Asn Gin Scr Leu Ala Η» lie Arg Aif Ser Asp Glu Leu 500 505 510
Leu His Asn Val Asn Thr Gly Lys Ser Ώτ Thr to De Met He Thr 515 520 525 1¾ Ik De D? Val He lie Val Val Leu Leu Ser Leu He A!a He -6- 144243-序列表.doc 201009079 530 535 540
Gly Leu im Leu Tyr Cys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Val Thr Ixa Ser 545 550 555 560
Lys A^) Gin Leu Ser Gly He Asn Asn He Ala Phe Ser Lys 565 570 <210>7 <2U> 574 <212>蛋白質 副黏液病毒 <400>? Μα Glu Leu Leu fle l>u Lys Ala Asn Ala De Thr Thr De Leu Thr 15 10 15
Ala Vai Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gin Asn He Thr Glu Glu Phe 20 25 30
Tyr Gin Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Lea Ser Ala Leu 35 40 45
Ar£ Thr (31y Trp Tyr Thr Ser Val fle Thr He Qu Leu Ser Asa De 50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Lew De Lys 65 70 75 SO
Gin Glu Leu Asp -Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gin Leu Leu 85 - 90 95
Met Glii Ser Thr fto Rro Thr Asn Asa Arg Ala Arg Ars Glu Leu Pro 100 105 110
Arg Ehe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lj« Ώιτ Asn Val Hit 115 ' 120 125
Leu Sk Lys Lys Arg Lys Aig Arg Phe Lets G!y Pile Leu Leu Gly Val 130 135 140
Gly Ser Ala De Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160
Ghi Gly Glu Vai Asn L5rs Be Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175
Ala Val Vzl Se;r Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 18S 190 ：Uu Asp Leu Lys Asn Tyr lie 均 Lys Gin Leu ku Pro He Val Aai 195 200 205
Lys Gin Ssr Cys Ser He Ser Asa De Glu Thr Va{ De Glu Phe Gin 210 215 220
Gin Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu lie Thr Arg Glu Fhe Ser. Val Asn 225 230 235 240
Ala Sly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asb Ser Glu · - 245 250 255
Leu Leu Ser Lea He Asn Αφ Met Pro De Thr Asn Asp Gin Lys Lys 260 265 270
Lea Met Ser Asn Asn Vsl Gin He Val Arg Gin Gin Sa Tyr Ser He 275 280 285
Met Ser lie He Lys Gla Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gin Leu Pro 290 295 300
Il£U Tyr Gly Val He Asp Tk Pro Cys Tip Lys to His Thr Ser Pro 305 310 315 320
Leu Ci's Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Aai lie Cys Leu Thr Arg 144243-序列表.doc 201009079 325 330 335
Thr Asp Arg Gly Tip Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350
Pro Gin Ala Glu Thr Cys Lys Val Gin Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu lie Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380
Asp lie Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys lie Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400
Asp Val Ser Ser Ser Val lie Thr Ser Leu Gly Ala He Val Set Cys 405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Tbi Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly lie He 420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp 435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gin Glu Gly 450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Dc De Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Hie Asp Ala Ser De Ser Gin Val Asn 485 490 495
Glu Lys lie Asn Gin Ser Leu Ala Phe De Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510
Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn He Met He Thr 515 520 525
Thr He Be De Val He De Val De Leu Leu Scr Leu lie Ala Val 530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560
Lys Asp Gin Leu Ser Gly Ik Asn Asn De Ala Phe $er Asn 565 570 <210>8 <211> 121 <212>蛋白質 <2I3>間質肺病毒 <400>8
Leu Leu lie Thr Pro Gin His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 . 10 15
Ser Cys Ser Thr lie Thr Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly 20 25 30
Tip Tyr Thr Asn-Val Phe Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu 35 40 45
Thr Cys Ala Asp Gly Pro Ser Leu De Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr 50 55 60
Lys Ser Ala Leu Arg Glu Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gin Leu Ala 65 70 75 80
Arg Glu Glu Gin Be Glu Asn Pro Arg Gin Ser Arg Phe Val Leu Gly 85 90 95
Ala lie Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val 100 105 110
Ala De Ala Lys Thr He Arg Leu Glu 144243-序列表.doc 201009079 115 120 <210>9 · <211> 539 <212>蛋白質 心3〉間質肺:病辜 <400>9
Met Ser Trp Lys Val Val De lie Phe Ser Leu Leu De Thr Pro Gin 15 10 15
His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr lie Thr 20 25 30
Glu Gly Tyr Lea Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45
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Ser Leu lie Ly$ Thr G】u Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80
Leu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gin Leu Ala Arg Glu Glu Gin He Glu 85 90 95
Asn Pro Arg Gin Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala De Ala Leu Gly Val 100 105 110
Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala De Ala Lys Thr lie 115 120 125
Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala lie Lys Asn Ala Leu Lys Lys Thr 130 135 140
Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160
Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 165 170 175 lie Asn Lys Asn Lys Cys Asp He Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190
Phe Ser Gin Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gin Phe Ser 195 200 205
Asp Asn Ala Gly He Thr Pro Ala Ee Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220
Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly G!n 225 230 235 240
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Gly Phe Leu He Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val De Tyr Met Val Gin 260 265 270
Leu Pro lie Phe Gly Val De Asp Thr Pro Cys Trp He Val Lys Ak 275 280 285
Ala Pro Ser Cys Ser Gly Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300
Glu Asp Gin Gly Tip Tyr Cys Gin Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320
Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335
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Asn lie Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His -9- 144243-序列表.doc 201009079 355 360 365
Pro lie Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly AJa Leu Val Ala Qys 370 375 380
Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser De Gly Ser Asn Axg Val Gly He lie 385 390 395 400
Lys Gin Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr De Thr Asn G!q Asp Ala Asp 405 410 415
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Glu Gin His Val lie Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phc Asp Pro 435 440 445
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Leu Ser Sa Ala Glu Lys Gly Asn Tta Gly Hie De He Val Tit lie 485 490 495
Leu lie Ala Val Leu Gly Ser Tk Met Be Leu Vai Ser Val Hsc He 500 505 510
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Met Ser Tip Lys Val Val Leu Leu Leu Val Leu Leu Ala Thr Pro Tlu: 15 10 15
Gly Gly Lea Glu Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys S«r Ihr ValTlir 20 25 30
Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Tip Tyr Ito Asn Vd Phe 35 40 45
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Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ak De Ala Lys Thr He 115 120 125
Arg Leu Glu Gly Glu Val Ala Ala De Lys Giy Ala Lax Arg Lys Hit 130 135 140
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Ala Val Asn Asp Leu Lys Asp Phe lie Ser Lys Lys Leu Thr Bro Ala 1« 170 175
Ils Asn Arg Asn Lys Cys Asp lie Scr Asp Leu Lys Met Ala Val Scr -10- 144243-序列表.doc 201009079 180 185 190
Phe Gly Gin Tyr Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg C5In Pbe Ser 195 200 205
Asp Asn Ala Gly He Thr Rro AJa lie Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220
Ala Glu Leu Val Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ser Gly Gin 225 230 235 240 lie Asn Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Axg Lys Giy Phe 245 250 255
Gly lie Leu lie Gly Val Tyr Qy Ser Ser Val Val Tyr He Val Gin 260 265 27Q
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Ala Pro Leu Cys Ser Gly Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Leu Leu Axi 观 295 300
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Pro Asa Glu Glu A^p Cys Glu Val Arg Set Asp His Vai Ehe Cys Asp 325 330 335
Thr Ala Ala Gly He Asn Val Ala Lys Glu Ser Glu Glu Cys Asa Arg 340 345 350
Asn lie Ser Tlir Ήιτ Lys Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365
Pro He Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375、 380
Tyt Asp Gly Met Ses* Cys Ser Be Gly Ser Asn Lys Val Gly De Ee 385 390 395 400
Arg Pro Leu Gly Lys Gly Cys Ser Tyr fle S«· Asn Ota Asp Ala Asp 405 410 415
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Glu Gin His Thr He Lys Gly Lys Pro Val Scr Scr Asti Asp Pk> 435 440 445
De Glu Phe Pro Glu Asp Gin Phe Asn Vai Ala Leu Asp Gin Val Phe 450 455 460 G!u Ser Val Glu Lys Ser Gin Asn Leu lie Asp Gbi &r Asn Lys Be 465 470 475 480
Leu Asp Ser Be Glu Lys Gly Asa Ala Gly Phe Val He Val Be Val 485 490 495
Leu He Val Leu Leu Met Leu Ala Ala Val Gly Val Gly Val Phe i%e 500 505 510
Val Val Lys Lys Arg Lys Ala Ala Pro Lys Rie ho Met Glu Met Asn 515 520 525
Gly Val Asn Asn · 530 <210> 11 <211> 537 <212>蛋白質 禽钸病毒 <4C0> Π
Met Ser Trp Lys Val Val Leu Leu Leu Val Leu Leu Ala Thr Pro Thr -11 - 144243·序列表.doc 201009079 1 5 10 15
Gly Gly Leu Glu Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Val Thr 20 25 30
Arg Gly Tyr Leu Ser Val Leu Axg TTir Gly Trp TVr Thr Asn Val Pte 35 40 45
Thr Leu Glu Val Gly Asp Vai Glu Asn Leu Thr Cys Tk Asp Gly Pro 50 55 60
Ser I^eu He Arg Thr Glu Leu Glu Lea Thr Lys Asn Ala Leu Glu Glu 65 70 75 80
Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gin Leu Ala Lys Qu Ala Arg He Met 85 90 95
Ser Pro Arg Lys Ala An Phe Vai Lea Giy Ala He Ala Leu Gly Vai 100 105 110
Ala Thr Ala Ala AJa Val Thr Ala Gly Val Ala Be Ala Lys Thr lie 115 120 125
Arg Leu Glu Gly Glu Val Ala Ala De Lys Gly Ala Leu Ail Lys Thr 130 135 140
Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val An Val Leu Ala Ίΐτ 145 150 155 160
Ala Val Asn Asp Leu L>.s Asp Hie Be &r Lys Lys Leu Thr Pro Ala 165 170 175 lie Asn Arg Asn Cys Asp He Ser Asp Leu Lys Met AJa Val Ser 180 185 190
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Asp Asa Ak Gly lie Thr Pro Ala Dc Ser Leu Leu Met Tnr Asp 210 225 220
Ala Glu Leu Val An Ala Val Ser Asn Met Pro TTir Ser Ser Gly Gm 225 230 235 240
De Asn I^u Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Hie 245 250 255
Gly De Leu He Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Val Tyr He Val Gin 260 265 270
Lea Pro He Pbe Gly Val De Asp Thr Rno Cys Trp Lys Val Lys Ala 275 280 285
Ala Pro Leu C>(s Ser Giy Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Lai Leu Arg 290 255 300
Glu Asp Gin Gly Trp Tyr Cys Gb Asn Ala Gly Set Tsr Val Tyr Tyr 305 310 315 320
Pro Asn Glu Glu Asp Cys Glu Val Arg Set Asp Hts Val His Cys Asp 325 330 335
Thr Ala Ala Gly He Asi Val Ala Lys Ghi Ser Giu Glu Cys Asn Arg 340 345 350
Asn He Ser Thr Tlur Lys Tyr PraCys Lys Val Ser Tbr Gly Arg His 355 360 365
Pro He Set Met Val Ala Leo Ser Pro 3Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys 370 375 380
Tyr Asp Gly Met Ser Cys Ser He Gly S«r Asn Lys Val Gly 31e Dc 385 390 395 400
Arg Pro Leu Gly Lys Gly Cys Ser Tyr He Ser Asa Gin Asp Ala Asp 405 410 415
Thr Val Thr He Asp Asn Thr Val Tyr Gin Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430
Glu Gin His Thr De Lys Gly Lys Pro Val Scr Ser Asn !%e Asp Pro -12- 144243-序列表.doc 201009079 435 440 445
De GIu Phe Ρϊό Glu Asp Gin Rie Asn Val Ala Leu Asp Gin Val Phe 450 455 460
Gk Ser Val GIu Lys Ser Gin Asn Leu De Asp Gin Ser Asn Lys De 465 470 475 480
Leu Asp Ser He Glu Lys Gly Asn Ala Gly Rje Val lie Val De Val 485 490 495
Leu He Val Leu Leu Met Ixu Ala Aia Vai Gly Val Gly Val Phe I%e 500 505 510
Val Val Lys Lys Arg Lys A]a Ala Pro Lys fht Pro Met Glu Met Asn 525 520 525
Gly Val Asn Asn Lys Gly Hie De Pro 530 535
<2I0> 12 <211>538 <212>蛋白質 <213>火雞鼻氣實果_毒. <4〇0>12
Met Asp Val Arg De Cys Leu Leu Leu Phe Leu He Ser Asn Pro Ser 15 10 15
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Ala Ihr Ala Ala Ala Vai Thr Ala Qy Val Ala Leu Ala Lys Thr De 115 - 120 125
Axg Leu Glu Gly Giu Val Lys Ala De Lys Asn Ala 3Lea Aji Asn Thr 130 135 140
Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160
Ala Val Asn Asp Leu Lys Glu Phe He Ser Lys Lys Leu Thr Pro Ala 165 170 175 lie Asn Gin Asn Lys Cys Asa He Ala Asp He Lys Met Ak De Ser 180 185 190
Phe Gly Gin Asn Asn Arg Arg Phe Lea Asn Val Val Axg Gin Phe Ser 195 200 205
Asp S^r Ala Gly He Thr Ser Ala Val Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220
Asp Glu Leu Val Arg Ala lie Asn Aig MetRro Tlir Sw Ser Gly Gin 225 - 230 235 240 · lie Ser Leu Met Leu Asn Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Hie 245 2» 255
Gly De Leu De Gly Val Tyr Asp Gly Thr Val Val Tyr Met Val Gin -13· 144243-序列表.doc 201009079 260 265 270
Leu Pro lie Phe Gly Val lie GIu Tbr Pro Cys Trp Arg Val Val Ala 275 280 285
Ala Pro Leu Cys Arg Lys Qu Lys Gly Asn TVr Ala Cys He Leut Arg 290 295 300
Glu Asp Gin Gly Trp Tyt Cys Tlir Asn Ala Gly Ser Thr Ala Tyr Tyr 305 310 315 320
Pro Asn Lys Asp Asp Cys Glu Val Arg Asp Asp Tyr Val Hie Cys Asp 325 330 335
Thr Ala Ala Gly He Asn Val Ato Leu GIu Val Gla Gla Cys Asn Tyr 340 345 350
Asn lie Ser Thr Ser Lys Tyr Pro Cys Lys Va[ Ser Tlir Gly An His 355 360 365
Pro Val Set Met Yai Ala Leu Thr Pro Leu Gly Gly I^u Val Ser Cys 370 375 ' 380
Tyr Glu Ser Val Ser Cys Ser lie Gly Ser Asn Lys Val Gly lie lie 385 390 395 400
Lys Gin Lea Gly Lys Gly Cys Thr His De Ρϊο Asn Asn Glu Ala Asp 405 410 415·
Thr He Thr Be Asp Asn Thr Val Tyr Gh Leu Ser Lys Val Val Giy 420 425 430
Glu Gla Arg Thr De Lys Gly Ala Pro Val Val Asn Asn Rie Asn Pro 435 440 445 lie Leu Phe Pro Glu Asp Gin Phe Asn Val Ala Leu Asp Gin VaJ Phe 450 455 · 460 (flu Ser lie Asp Aig Ser Gin Asp Leu lie Asp Lys Ser Asn Asp leu 465 470 475 480
Leu Gly Ala Asp Ala Lys Ser Lys Ala Gly He Ala Ile Ala He Val 485 490 495
Val Leu Val He Leu Gly Be Phe Phe Leu Leu Ala Val He Tyr Tyr 500 505 510
Cys Ser Arg Val Arg Lys Thr Pio Lys His Asp Tyr ?tq Ala Thr 515 520 525 Ώγ Gly His Scr Ser Met Ala Tyr Val Ser 530 535 <210> 13 <211> 537 <212>蛋白質 <13>禽肺病毒 <400>13
Met Ser Tip Lys Val Val Leu Lea Leu Val Leu Leu Ala Thr Pro Thr 15 10 15
Gly Gly Leu Glu Qu Ser Tyr U« Glu Glu Ser Cys S»Tk Val Thr QO 25 30
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Ser Leu He Arg Thr Glu. Leu Glu Leu Thr Lys Asn Aia Leu Glu Glu 65 70 75 80
Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gin Leu Ala Lys Glu Ala Arg He Met -14-
144243-序列表.doc 201009079 85 如 95
Ser Pro Axg Lys Ala Arg Phe Val Leu G!y Ala He Ala Leu Gly Val iOO 105 110
Ala Thr AJa Ala Ala Val Tht Ala Gly Val Ala lie Ala Lys Thr He 115 120 125
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Ala Val Asn Asp Leu Lys Asp Phe Dc Ser Lys Lys Leu Ήϊγ Pro AJa 165 170 175
De Asn Arg Asn Lys Cys Asp Be Scr Asp Leu Lys Met Ala Va! So: 180 185 190
Phe Gly Gin Tyr Asn Arg Leu Asn Val Val Arg Gin Phe &r 195 200 205
Asp Asn Ala Gly Dc 1¾ Pro Ala lie Ser Leu Asp Leu Met Hr Asp 210 215 220^
Ala Gk Leu Val Arg Ala Val Scr Asn Met Pro Thr Scr Ser Gly Gin 225 230 235 240
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Gly De Leu Dc Gly VaJ Tyr Gly Ser Scr Val Val Ί^τ Ee Val On 260 265 270
Leu Pro Be Pht Gly Vallk Asp Thr Pro Cys Tip Va〗Lys Ak 275 280 285
Ala fto Leu Cys Ser Gly Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Lea Leu Arg 290 295 300
Glu Asp Gin Gly Tip Tyr Cys Gin Asn Ala Gly Ser Ώτ Val Tyr Tyr 305 310 315 320 fto Asn Gfiu Gta Asp Cys Giu Val Arg Ser Asp His Vai Phe Cys Αφ 325 330 335
Thr Ala Ala Gly De Asn Val Ala Lvs Glu Ser Glu Ghi Cys Asn Arg 340 345 350
Asn Dc Scr Thr Thr Lys Tyr Pn> Cys Lys Val Ser Thr Gy Aig His 355 360 365
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Tyr Asp Gly Met Ser Cys Ser De Gly Ser Asn Lys Val Gly De De 385 390 395 400
Arg Pro Leu Gly Lys Gly Cys SerTVr De Ser Asn Gin Asp Ala Asp 405 410 415
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Glu Ser Val Glu Lys Sei* Gin Asn Leu Ik Asp Gin S汉 Asn L：^ He 465 47D 475 480
Leu Asp Ser He Glu Lys Gly Asn Ala Glv Hie Val He Val De Val 485 490 495
Leu He Val Lea Lea Met Leu Ala Ala Vsd Gly Val Gly VaS Phe i%e 500 505 510
Val Val Lys Lys Arg Lys Ala Ala Pro Lys Phe Pro Met Glu Met Asn -15- 144243·序列表.doc 201009079 515 520 525
Gly Val Asa Asn Lys Gly Phe lie Pro 530 535
<210> 14 <211>1193 <212>DNA <213>鼻氣管炎病毒 <220> <22I>CDS <222> (16).,.(1191) <223>火難鼻氣管炎病毒（品系CVL 14/1) 蝻接蛋白質（G)mRNA*完整的cds <400> 14 gggacaagta tctciatggg gtccaaacta taiatggctc agggcaccajg： tscatatcsa 60 actgca^gg ggttctg^ct ggacatcggfi aggaggiaca tauggctat agtcctatca 120 gctcicgggc tgacctgcac agtcaaatt gcactc^tg ttagcgicat ggtigaacag 180 ^ag^ttag agRagtgcgg aaactacaat g^iggagata £agaR?stg gtcas^xacc 240 caggagcagc caactacigc accaagtgcg actccagcag gaaatraigf afgattacaa 300 ac^gcicgaa caagaaagtc tgaaagc^t ttgcatgtgc aaatttctta tggtgmxg 360 tatagccgca £tgaiactgt actgggtggt mgau^a rgggcttatt ggtictttgc 420 saatcaggac caatttgtca gcgagaiaat caagttgacc caaca^cci c^ccattgc 480 a^gtagatc mcaagtgt ggactgctgc aagglg^ca agattagcac taacagcagc 540 dcczcactg ^ccccagaa gaccaacccg gcatggccta gccaagacaa cacagactcc 600 gatccaa^c cccaaggcat aaccacca^ acagccactc tgctctcaac aagtclggsc 560 ctcatgctca catcgaagac tgggeocac aaalcagggc cccccraasc cttscc££gg 720 agcaac^ca acggaaasac aaccacagac cgagaaccag gscccacaaa ccaaccaaat 780 tc&accacca atgggca&ca casmacac accca^gaa tgacaccccc iccaagtc^: 840 gacaacacaa ^a^catcct ccagc^caca ampcatt cagt^atac 900
aagcccacac actctccg&c ca^gaatca gatcaattxc iccccacaac tcaaa&cagc 960 atcaactgtg aacam®a cccccaasgc aa^aaaaaa tctgctacag agtaggttct ](Ϊ20 tacaactixa atactacaaa gcaatgcaga attgaigtgc ctttg^tic c^ttatagc 10K) acaglgtgca tgaaaacata ctataccg 挞 ccatlcaaa gttggaggcg tatctggcgt 1140 tgcugigig atgacgsagt tgg^g£U gagtggtgtt gcactagm aa 1193 <210> 15 <211>i260 <212> DNA
<2i3>鼻氣管炎病毒 <221> CDS <222> (16)...(1260) . <223>火難鼻氣管炎病毒（品系6574) 附接蛋白質(G>，完整的cds <400>15 gfgacaagta tccagatggg gtcagagctc tacatcatag agggggtgag ctcatctgaa 60 atagtccuai sgcaagtcct c^aaggagc caasaaatac tgct^gact ggtgtta^a 120 gccttaggct tgacgctcac tagcactatt gttatatcta togiattag tgtagaacag gtcmiidc gacagtgtgt g^icacttai tgsg"2£2aa atggalc^t acatccagga 240 •16· 144243·序列表.doc 201009079 cagtcaacag aaaatacuc aacaagaggt a^actacaa caaaagaccc tag^igatta 3CX) cag^gactg ^gcaggaaa gtltgagagc tgtgggtatg tgcaagt^t tgatgglgat 360 atgcatgate gca^Mtgc tg^^ggt gg^att gttt^gctt attggctctt420 tgtgaaicag gacca^ttg tcagggagat ^t^gictg aagacggaaa cttctgccsa 4%) tgcactmt cttcccatgg ggtgagttgc igcmaaac ccmagcaa ggcaaccact 540 gcccagagga actccaaacc agctascagc aaatcaactc ctccggtaca ttcagacagg SX) gccagcaaag aacataatcc ctcccaaggg g^caacrcc gcagggggcc asccagagc 660 aagacaacm ttgcta^ac cccttcaaca gaggaca^tg ccaaaccaac gauagcaaa 720 cctaaactca aatcaggcc ctc^aaaga ggtccaiccg scagc^caaa agcagcctcc 780 ^c^coxa ^caca^ac ca^^caga ggouxagca ag^gaccga cc^ag3c<x 840 cgcaccggac cxaciox^a aaggcccaga caa^ccaca gcacagcaac tcrjgco^xc 9CX) acaajccccaa tcc^aaggg a:gg£cccca acccccaa^: caac^tcaga cctca^£ic 960 asKxxaaggg aaggcagcac sz&xcmt gcaataaga aaaaccraac cacacaaagt 1020 mcxt§pg aagcacacr grc^atcca gaigagccac aaaggautg ctaccaggia 1(^0 ggaacttaca aicctagtca atcg££aacc tecaacaiag ag£ttccaaa atgttccaci 1140 tatgggcacg cttgtatggc tacattatat gacaccccat tcaactgctg gcgcaggacc 1200 aggaga^ca tctgtgattc cggaggggag ctgattgagt gg^ctgtac tagtcaataa 1260
<2I0>16 <21I>391 <212>蛋白質 a》火雞鼻氣管炎病毒 <400>16 -
Met Gly Ser Lys Leu Tyr Met A3a GLn Gly Hir Ser Ala Tyr Gin Hr I 5 10 15
Ala Val Gly ?he Trp Leu Asp He Gly Ais Tyr Dc Leu Ak He 20 25 30
Val Leu Ser Ala fte Giy Leu Thr Cys Thr Val Thr He Ala Lea Thr 35 40 . 45
Val Ser Val De Val Glu On Ser Val Lea Glu Gh Cys Arg Asn Tyr 50 55 60
Asn Gly Gly Asp Aig Asp Τφ Tip Ser TTir Thr Gin Glu Gin Pro Thr 65 70 75 80
Thr Ala Pro Ser Ala Thr Pro Ala Gly Asn Tyr Gly Gly Lest Gin Tbr 85 90 95
Ala Thr Arg Lys Sfer Glu Ser Cys Leu His Val Gla Ik; Ser Tyr 100 105 110
Gly Asp Met Tyr Sw Arg S« Asp Thr Val Leu Gly Gly Pte A^> Cys 115 120 125
Met Gly Leu Lea Val Leu Cys Lys Set Gly Pro Bo Cys Gto Arg Asp 130 135 140
Asn Gin Val Asp Pro Tar Ala Leti Cys His Cys Ai^ Val Asp Leu Ser 145 150 155 160
Ser Val Asp Cys Cys Lys Val Mn Lys De Ser Thr Asn Ser Ser Thr 165 170 175
Thr Ser Glu Pro Gin Lys Thr Asn Pro Ala Ttp Pw §er Gin Asp Asn ISO 185 190
Thr Asp Ser Asp Ro Asn Pro Gin Gly lie Thr Thr Ser Thr Ala Thr 195 200 205
Uu Leu Ser Thr Ser Leu Gly Un Met Leu Thr Ser Lys Thr Gly Tin 210 215 220
His Lys Ser Gly fto Pro Gin Ala Leu Rro Gly &r Asn Thr Asn Gly -17- 144243-序列表.doc 201009079 225 230 235 240
Lys Thr Thr Thr Asp Axg Glu Pro Gly Pro Thr Asn G3n fto Asi Ser 245 250 255
Thr Thr Asn Gly Gin His Asn Lys His Thi Gin Arg Met Thr Pro Pro 260 265 270
Pro Ser His Asp Asn Thr Arg Thr lie Leu Gin His TTirThr Pro Trp 275 280 285
Glu Lys Thr Phe S(2r Thr Tyr Lys Pro Thr His Ser Pro Thr Asn Glu 290 295 300
Ssr Asp Gin Ser Leu Pro Thr Thr Gla Asn Ser fle Asn Cys Glu His 305 310 315 ' 320
Phe Asp Pro Gin Gly Lys Glu Lys He Cys Tyr Arg Val Giy Ser Tyr 325 330 335
Asn Ser Asn He Thr Lys Gin Cys Arg lie Asp Val fto Leu Cys Ser 340 345 350
Thr Tyr Ser Thr Val Cys Met Lys Thr Tyr Tyr Thr Glu Pro Hie Asn 355 360 365
Cys Tip Arg Arg De Trp Arg Cys 3Leu Cys Asp Asp Gly Val Gly Leu 370 375 380
Val C3u Tip Cys Cys Thr Ser 385 390 <2i0> 17 <21l>414 · <212>蛋白質 鼻氣管炎病毒 <4〇0> 17
Met Gly Ser Glu Leu Tyr De He Gla Gly Val Sar Ser Ser Glu De 15 10 15
Val Leu Lys Gin Val Leu Arg Arg Ser Gin Lys De Leu Leu Gly Leu 20 25 30
Val Leu Ser Ala Leu Gly Leu Ώτ Leu Thr Ser Thr De Val lie Ser 35 40 45
De Cys lie Ser Val Glu Gin Val Lys Leu Arg Gin Cys Val Asp Tar 50 55 '60
Tyr Trp Ala Glu Asn Giy Ser Leu His Pro Gly Gin Ser Thr Glu Asn 65 70 75 80
Oar Ser Ihr Arg Gly Lys Thr Thr Hr Lys Asp Pro Arg Arg Leu Gin 85 90 95
Ala Tar Gly Ala Gly Lys Phe Gk Ser Cys Gly Tyr Val ©n Val Val 100 105 110
Asp Gly Asp Met His Asp Arg Scr Tyr Ala Vai Lsu Gly Gly Val Αφ 115 120 125
Cys L«i Gly Leu Leu Ala Leu Cys Gto Ser Gly fto De Cys Gin Gly 130 135 140
Asp Thr Trp Ser Glu Αφ Gly Asn Phe Cys Arg (¾¾ Thr 1¼ Ser Ser 145 150 155 160
His Gly Val Ser Cys Cys Lys Lys Pro Lys Ser.Lys Ala Thr Thr Ala 165 170 175
Gin Arg Asn Ser Lys Rro Ala Asn Ser Lys Ser Thr Pro Rro His 180 185 190
Ser Asp Arg Ala Ser Lys Glu His Asn fto Ser Gin Gly Glu Gin Pro -18-
144243-序列表.doc 201009079 195 200 205
Arg Axg Gly Pro Thr Ser Ser Lys 1½ Thr Dc Ala Ser Thr Pro Ser • 210 215 220
Thr GIu Asp Thr Ala Lys Pro Thr Be Ser Lys Pro Lys Leu Thr De 225 230 235 240
Arg Pro Scr Gin Arg Gly fto Ser Gly Ser Tlir Lys Ala Ala So* Ser 245 250 25S
Thr Pro Ser His Lys Thr Asn Thr Arg Gly Thr Ser Lys Thr Hsr Asp 260 265 270
Gin Arg Pro Arg Thr Gly Fto Thr Pro Glu Arg Pro Arg Gin Thr His 275 280 285
Ser Thr Ala 1¾ Pro Pro Pro Tlr Thr Pro lie His Lys Giy Arg Ala 290 295 300
Pro Ihr Pro Lys Pro Thr Thr Asp Leu Lys "Val Asa Rra Arg C3u Gly 305 310 315 320
Ser Γατ Ser Pro Thr Ala De Gin Lys Asn Pro Thr Thr Gh Ser Asn 325 330 335
Leu Val Asp Cys Thr Leu Ser Asp Pro Asp Gla Pro Gin Arg De Cys 340 345 350
Tyr Gin Val Gly ThrTyr Asn Rxi Ser Gta Ser Giy Thr Cys Asn De 355 360 365
Glu Val Pro Lys Cys Ser Thr Tyr Gly His Ala Cys Met Ala Thr Leu 370 375 380
Tyr Asp Thr Pro Phe Asn Cys Tip Arg Arg ihr Aig Aig Cys He Cys 385 390 - 395 400
Asp Scr Gly Gly Glu Leu De Glu Trp Cys Cys Ito Ser Gin 405 410 <2I0> 18 <211>539 <212>蛋白質 <^3>人類間質肺病毒 <40C>18
Met Ser Trp Lys Val Val He He Phe Ser Leu Leu He Thr Pro On 15 10 15
His Gly Leu Lys Gla Scr Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser T!ir Be Thr 20 25 30
Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Tbr Gly Tip Tyr Thr Asn Val Hie 35 40 45
Tta Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Hir Cys Ala Asp Oy Pro 50 55 60
Ser Leu lie Lys Thr Qu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu 65 70 75 80
Ixu Arg Thr Val Ser Ala Asp Gin Leu Ala Aig Glu Glu Gin De Gta 85 90 95 ·
Asn Pro Arg Gin Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala He Ala Leu Gly Val 100 105 110
Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val A!a lie Ala Lys Thr lie 115 120 125
Ari Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ils Lys Asn Ala Leu Lys Lys 1¾ 130 135 140
Asn Gla Ala Val Ser Tlbr Leu Oy Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr -19- 144243-序列表.doc 201009079 145 . 150 155 160
Aia Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn I^u Ilir Arg Ala 165 170 175
Be Asn Lys Asn Lys Cys Asp flc Ala Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190
Phe Ser Gin Phe Asn Ai? Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gin Phe Ser 195 200 205
Asp Asn Ak Gly De Tnr Pro Aia De Ser 3Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220
Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gin 225 230 235 240
De Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255
Gly lie Leu Oe Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val ie Tyr Met Val Gin 260 265 270
Leu Pro Be Phe Gly Val He Asp Thr Pro Cys Tip De Val Lys Ala 275 280 285
Ala Fto Ser Cys Ser Gly Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300
Glu Asp Gin Gly Trp Tyr Cys On Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320
Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp 325 330 335
Thr Ala Ala Gly He Asn Val Ala Glu Gin Ser Lys Glu Cys Asn He 340 345 350
Asn Be Ser Thr TTir Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Tbr Gly A^i His 355 360 365
Pro He Ser Met Val Ala Lsu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Vd Ala Cys 370 375 380
Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser fle Gly Ser Asn Arg Val Gly De lie 385 390 395 400
Lys Gin Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr He Thr Asn Gin Asp Ala Asp 405 410 415
Thr Val Thr He Asp Asn Thr Val Tk Gin Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430
Glu Gin His Val De Lys Qy Arg Pro Val Ser Ser Ser Ene Asp Pro 435 440 445
Val Lys Hie Pro Glu Asp Gin Phe Asn Val Ala Leu Asp Gin Val Phe 450 455 460
Glu Ser De Glu Asn Ser Gin Ala Lai Vai Asp Gin Scr Asn Arg De 465 470 475 480
Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe De He Val He Be 485 490 495
Leu De Ala Val Leu Gly Ssr Tor Met He Leu Val Scr'Val Rie Be 500 505 510 lie lie Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Lea Ser '515 520 525
Gly Val Tlir Asn Asn Giy Phe De Pro His Asn 530 535 <210> 19 <211> 539 <212>蛋白質 20·
144243-序列表.doc 201009079 <213>人類間質肺病毒 <400> 19
Met Ser Tip Lys Val Val lie lie Phe Ser Leu Leu He TTir Pro Gin 1 5 10 15
His Gly Leu Lys Giu SerTyr Leu Gla Glu Set Cys Ser Tfcr He Thr 20 25 30
Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asu Val Phe 35 40 45
Thr Leu Glu Val Gy Asp Val Glu Asn Lea Thr Cys Ser Asp Gly Pro 50 55 60
Ser Leu ite Lys Thr Glu Leu Asp Leu Ίΐτ Lys Ser Ala Leu Aii G】u 65 70 75 80
Isa Lys Thr Val Ser Ala Asp Gin Leu Ala Arg Glu Glu GLa lie Glu 85 90 95
Asn Pro Ail Gin Scr Arg Phe Val Leu Gly Ala He Ala Lea Gly Val 100 105 110
Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala lie Ala Lys Thr He 115 120 125
Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala He Lys Asn Ala Leu LysTlir Thr 130 135 140
Asn Glu Ala Val Ser Tur Leu Gly Asn Gly Val Ars Val Leu Ala Thr US 150 155 160
Ala Val Axg Glu Leu Lys Asp i%e Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala 16S * 170 175 lie Asn Lys Asn Lys Cys Asp He Asp Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190
Hie Ser Gin Phe Asn Arg Arg Pte Im Asn Val Val Arg Gin Phe Ser 195 200 2)5
Asp Asn Ala Gly Ue Thr Pro A!a lie Ser Leu Asp Leu Met Tlir Asp 210 215 220
Ala Glu Leu Ala Aig Ala Val &r Asn Met Pro Thr Scr Ala Gly GLi 225 230 235 240
De Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Vai Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255
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Lys Gin Leo Asi Lys Gly Ser Tyr He Thr Asa Gin Asp Ala Asp •21 - 144243-序列表.doc 201009079 405 410 415
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144243·序列表.doc 201009079 225 230 235 240
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<210> 22 <211> 1620 <212> DHA <213>人類間質肺病毒 <400>22
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<212>DNA <213>人類間質肺病毒 <400>23 atgtcagga aagtggtgat catttmca ctgctaam cacctcaaca cggtcttaaa 60 gagagctacc tagaagaaic atgcagc^t sdaactgagg ^itatcttag igttctgagg 1¾) acaggttggt ataccaacgt tmacatta gaggtgggtg atgts^aaaa ccttacatgt 180 tctgatggac ctagcctaat aaaa^agaa ttagatctga ccaaaagtgc actaagagag 240 •25· 144243-序列表.doc 201009079
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His Thr Scr Scr Ser Pro Met G!u Ser Ser Arg GIu Thr Pro Thr Val 65 70 75 80
Pro Hit Asp Aki Ser Asp TTir Asn Ser Se»· Pro Gh His Pro Thr Gin 85 90 95
Gin Sar Thr Glu Gly Scr Thr Leu Tj?r Phc A!a Ala Ser Ala Ser Ser \W 105 110 fto Glu Ήιτ Glu Pro Thr Ser Tbr Pro Asp Thr Thr Asn Arg Pro Pro 115 120 125
Phe Val Asp Thr His Thr Thr Pro Pro Ser AJa Ser Arg Thr Lys Thr i30 135 140
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Leu Arg Thr Ser Sar Thr Acs Lys Arg fto Ser Thr Ala Sa: Val Gin 180 185 190
Pro Asp He Ser Ala "Hir Tnr His Lys Asn Glu Glu Ala Ser Pro Ala 195 200 205
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Glu Ala Asn Thr So* Thr Thr Tyr Asn Gin Thr Ser 225 230 235 <210>27 <211>2I9 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <4〇〇>27
Met Glu Val Lys Val Glu Asn He Ajrg Ala He Asp Met Lea Lys Ala 15 10 15 細 Val Lys Asn Arg Val Ala Arg S»· Lys Cys Fae Lys Asn Ala Ser 20 25 30
Leu Dc Leu Be Gly Ik Thr Thr Leu Sa- Ik Ala Leu Asn lie Tyr 35 40 45
Leu ne Be Asn Tyr Thr He Gin Lys Thr TTir Ssr Glu Ser Glu His 50 55 60
His Thr Ser Ser Pro Pro ThT Glu Pro Ass Lys Glu AJa Ser Thr He 65 70 75 SO
Ser Thr Asp Asn Pro Asp lie Asn Pro Scr Scr Gin His Pro Thr Gin 85 90 95
Gin Ser Thr Glu Asn Pro Thr Lsu Asn Pro AJa Ala Ser Ala Ser Bro 100 105 U0
Sa* Glu Thr Glu Pro Ala Ser Thr Pro Asp Thr Tnr Asn Arg Leu Ser 115 120 Ί25
Ssr Val Asp Arg Scr Thr Ala Gin Pro Scr Glu Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140
Lys Pro Thr Val His Ttir He Asn Asn Pro Aai Thr Ala Ser Sar Thr 145 150 155 160
Gin Ser to Pro Arg Thr Thr Thr Lys Ala De Ars Arg AlaThrThr 165 170 175
Phc Ars Met Scr Ser Thr Gly Lys Arg Pro Thr Thr Thr Lea Val· Gin -28- 144243-序列表.doc 201009079 180 !85 190
Ser Asp Ser Ser Thr Thr Thr Gin Asn His Glu Glu Tar Gly Ser Ala 195 200 205
Asn Pro Gin Ala Ser Ala Ser Thr Met Gin Asn 210 215 <2I0>28 <2il>224 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400>28
Met Glu Val Arg Val Gla Asn lie Ai? Ala He Asp Met Phe Lys Ala 15 10 15
Lys lie Lys Asn Arg He Aig Ser Ser Arg Cys Tyr Arg Asn Ala Thr 20 25 30
Leu He Leu He Gly Leu Thr Ala Leu Ser Met Ala Leu Asn lie Phe 35 40 45
Leu He De Asp His Ala Thr Lai Arg Asn Met Be Lys Thr Glu Asn 50 55 60
Cys Ala Asn Met fto Ser Ala Glu Pro Ser Lys Lys Thr Pro Met Tlir 65 70 75 80
Ser Tnr Ala Gly Pio Asn Thr Lys Pro Asn Pro Gin Gin Ala Thr Gin 85 - 90 95
Trp Thr Ήϊγ Glu Asn Ser Thr Ser Pro Val Ala Thr Pro Glu Gly His 100 105 110
Pro Tyr Thr Gly Thr Thr Gb Thr Ser Asp Thr Thr Ala Pro Gin Gin 115 120 125
Thr Thr Asp Lys His Thr Ala Pro Leu Lys Ser Tnr Asn Glu Gin Be 130 135 140
Thr Gin Thr Thr Ώγ Glu Lys Lys Thr lie Arg Ala Thr Thr Gin Lys 145 150 155 160
Arg Gla Lys Gly Lys Glu Asn Thr Asn Gin Ίΐτ Hir Ser Ώτ Ala Ala 165 170 175
Thr Gin Thr Ήιτ Asn Hi Thr Asn Gin lie Arg Asn Ala S<a: Glu Tfer 180 185 190
He Thr Thr Ser Asp Arg Pro Arg Thr Asp Thr Thr Thr Gin Ser Ser 195 200 205
Glu Gb Thr Thr Arg Ala Thr Asp Pro Ser Ser Pro Pro His His Ala 210 215 220 <210>29 * <211>236 <212>蛋白質 、 <213>人類間質肺病毒 <400〉29
Met Gla Val Arg Val Glu Asn lie Arg Ala De Asp Met Phe Lys Ala 1 5 10 15
Lys Met Lys Asn Arg lie Arg Ser Ser Lys Cys Tyr Arg Asn Ala Thr 20 25 30
Leu He Leu Ue Gly Leu Thr Ala Leu Ser Met Ala Leu Asn lie Phe -29- 144243-序列表.doc 201009079 35 40 45
Leu He De Asp Tyr Ala Met Leu Lys Aan Mst Thr Lys Val Giu His 50 55 60
Cys Val Aai Met Pro Rro Val Giu fto Ser Lys Lys Thr Pro Met Thr 65 70 75 80
Ser Ala Val Asp Leu Asn Thr Lys Pto Asn Pro Gin Gin Ala Thr Gin 85 90 95
Leu Ala Aia Ola Asp Ser Thr δσ Ixu Ala Ala TTir Ser Glu Asp His 100 105 ilO
Leu His Thr Gly Thr Br Pro Thr Pro Asp Ala Thr Val Ser Gin Gin 115 120 125
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Glu Thr Thr Thr Arg Thr Tnr Ser Thr Aia Ala Thr Gin Thr Leu Asn 165 170 175
Tbx Ήιτ Asn Gin Thr Sac Tyr Val Arg Glu Ala Thr Tte Thr Ser Ala 180 185 】90
Arg Ser Arg Asn Ser Ala Thr Tbr Gin Ser Ser Asp Gin Thr Thr Gin 195 200 205
Ala Ala Asp Pro Ser Ser Gin Pro His His Thr Gin Lys Ser Thr 1% 210 215 220
Thr Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Ser Ser Pro Ser Ser 225 230 · 235
<210>30 <211>708 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <4Q0>30 gasstgaaes i^easaacat icsaacaata gatats^ca aa^gcaag^t aaaa&atcgt 60 g^scacgca g^aaigctt taaaaacgcc icttt^Kx: icata^aai mcwcmg 12D agtac^ccc icaatatcm (ctsalcaia aaoaiaaaa tgcaaaaaaa caca^igaa 1^) tc^a^atc acacca^tc atcacccatg gaaKxagca gagaa^Kx aacggtcox 240 aca^acaact cagacs^caa ctcaa^cca cagcaicxaa ctcaac^tc cacagaaggc 300 tccacactct ctcascaagc Ic^ccagag^ capaccaac atcaac^uxa 360 gatacaacaa accscccgcc ct£cg^ac ^acacacaa caccacta% cscaagcaga 420 acaaagac&a gtc^go&^t ccacacma aaca^mm ggsu^agcu: cagaac^c^t 480 octccaccac 辦caac咖 cgc^g^cca ccd^iccg cacaagcagc 540 acaagaaaga gacc^ccac agcatcagic caaco^aca icag^caac gacccacsaa 600 aac$aag^ig caag^cagc gagcco^aa ^a^tgcaa gcacaacaag aataca^g 660 aaaagcgtgg a^^ca^ac alcaacaaca ^caaccaaa ctagttaa 708 <21Q>31 <211>660
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Tyr Leu Lys Gly Val He Ser Phe Ser Glu Thr Asn Aia lie Gly Ser 20 25 30
Cys Leu Lai Lys Arg Pro Tyr Leu Lys Asn Asp Asn Thr Als Lys Val 35 40 45
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Asn Ser Lys Met Lys He Ser Asp Tyr Lys lie Val Glu Rro Val Asn 65 70 75 80
Met Gin His Glu lie Met Lys Asn Val His Ser Cys Glu Leu Thr Leu 85 90 95
Leu Lys Gin Hie Leu Thr Aig Sex Lys Asn lie Ser ITir Leu Lys Leu LOO 105 110
Aai Met lie Cys Asp Trp Leu Gin Lea Lys Sa Thr Ser Asp Asp % 315 120 125
Ser He Lea Ser Phe De Asp Val Glu Phe He Pro Ser Trp Val Ser 130 135 240
Asn Trp Fne Ser Asn Trp Tyr Asn Leu Asn Lys Leu He Lea Glu Phe 145 150 155 160
Arg Lys Glu Glu Val lie Arg Thr Gly Ser lie leu Cys Axg Ser Ixu 165 170 175
Gly Lys Leu Val Rie Val Val Ser Ser Tyr Gly Cys Be Val Lys Ser 130 · 185 190
Asn Lys Ser Lys Arg Val Ser Phe Phe Thr Tjt Asn Gin Leu Leu Thr 195 200 205
Tip Lys Asp Val Met Ixu Ser Arg Phe Asn Aia Asn JPhe Cys De Tip 210 215 220
Val Ser Asn Ser Leu Asn Glu Asn Gin Glu Gly Lea Gly Leu Arg Seht 225 230 235 240
Asn Lea Gin Gly De Leu Thr Asn Lys Leu Tjt <31u Thr Val Asp Tyr 245 250 255
Met Ixu Scr Leu Cys Cys Asn C3u Gly Phe Ssr Leu VaJ Lys Glu Phe 260 265 270
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Phe Ser Thr Aig Phe Ais Asn Thr Leu Leu Asti Gly Leu Thr Asp Gta 290 295 300
Leu Thr Lys Leu Lys Asn Lys Asn Arg Leu Arg Val His Gly Thr Val 305 310 315 320 L&i Glu Asa Asn Asp Tyr Pro Mei Tyr Gla Val Val Leu Lys Lsu Leu 325 330 335
Gly Asp Thr Leu Arg Cys He Lys Lea Lea He A® Lys Asn Leu Glu 340 345 350
Asn Ala Ala Glu Leu Tyr Tyr He Phe An He 1¼ CHy His Pro Met 355 360 365 ·
Val Asp Glu Arg Aj® Ala Met Asp Ala Val Lys Leu Asn Asn Giu fle 370 375 380
Thr Lys He Leu Arg Tip Glti Ser Leu Thor Glu Leu Arg Giy Ala Pte 385 390 395 400
He Leu Arg De lie Lys Gly Ehc Val Asp Asn Asn Lys .^rg Trp Pio 405 410 415
Lys lie Asa Leu Lys Val Leu Ser Lys Arg Trp Thr Met Tyr Bie -32- 144243-序列表.doc 201009079 420 425 430
Lys Ala Lys Ser Tyr Pro Ser Gin Leu GIu Leu Ser Glu Gta Asp Hie 435 440 445
Leu Glu Leu Ala Ala lie Gta Phe Glu Gin Glu Phe Ser Val Pro Glu 450 455 460
Lys Thr Asa Leu Glu Met Vsl Leu Asn Asp Lys Ala De Ser Pro Pro 465 470 475 480
Lys Arg Leu lie Ttp Set Val Tyr Pro Lys Asi Tyr Ixu Pro Gki Lys 485 490 495 lie Lys Asn Arg *ryr Uu Glu Glu Thr Phe Asn Ala Sa Asp Ssr Leu 500 505 510
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Gly Aif Met Phe Ala Met Gta Pro Gly Lys Gin Arg Gin lie Gto He 565 570 575
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Gin Ala Pbe Arg Tyr Glu Thr Thr Ala He Cys Ala Asp Val Ala Asp 645 650 655
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Arg Tyr His MeA Gly Gly lie Glu Gly Tip Cys Gin [>ys Leu Tip Tlir 705 710 715 720
Ma： G!u Ala Ee Ser Leu Leu Asp Val Val Ser Val Lys Thr Arg C^s 725 730 735
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Lys Pro Val Lys Leu Ser Glu Gly Leu Asp Giu Val Lys Ala Asp Tjt 755 760 765
Ser Leu Ala Val Lys Met Leu Lys Glu De Arg Asp Ala Tyr Aig Asn 770 775 780 lie Gly His Lys Leu Lys Glu Gly Glu On Tyr lie Ser Arg Asp Leu 785 790 795 800 '
Gin Phe He Ser Lys Vai Be Gin Ser Gla Gly Val Met His Pro Thr 805 810 815
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Asp i^p Oe Lys Thr Ser Ala Glu Ser He Gly Ser Leu Cys Gin Giu 835 840 845
Leu Gla Phe Arg Gly Glu Ser De lie Val Ser Leu De Leo Arg Asn -33- 144243-序列表.doc 201009079 850 855 860
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Ala Gly Lys Gin Leu Phe Lys Gin Leu Asa Lys Thr Leu rJThr Ser Val 885 B90 E95
Gin Arg Phe Hie Glu lie Lys Lys Glu Asn Glu Val Val A^p Leu Tip 900 905 910
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His Lys Ala Glu Lys Val Asn Met He Ser Gly Thr Lys Ser De 1060 1065 1070
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Leu Ser Val Val Val Asp Ser lie Giu De Pro Thr Lys Ser Asn Gly 1105 1110 1115 1120
Arg Leu lie Cys Cys Gin Be Scr Arg Hu· Leu Arg Glu Thr Scr Trp 1125 1130 1135
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Glu Lys Rk Ser Thr Asp Arg Thr Thr Arg Gly Glrs Aig Giy Pro Lys 1170 . 1175 1180
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Tyr Asa Ate Gin lie Ixa Scr Lys Gin Gin Arg Giu Gin Lsi Glu Ala 1205 1210 12!5
He Gly Lys Met Arg Tcp Val Tyr Lys Gly Ώιτ Pto Gly Leu Arg Arg 1220 1225 1230
Leu Leai Asn Lys lie Cys Leu Gly Ser Leu Gly Πε Ser Tyr Lys Cys 1235 1240' 1245
Val Lys Pro Leu 3-eu Pro Arg Phe Met Ser Val Asn Fbe Leu His Arg 1250 1255 1260
Leu Ser Vai Ser Ser Arg Pro Met C3a Phs Pro Ala Ser Val Pro Ala 1265 1270 1275 1280
Tyr Arg Tbr Thr Asn Tyr His Phe Asp Thr Ser Ρϊο He Asa Gin Ala -34- 144243-序列表.doc 201009079 1285 1290 1295
Leu Ser Glu Aa^ Phe Gly Asn Glia Asp lie Asn Leu Va] Phs Gin Asn 1300 1305 1310
Ah Ik Ser Cys Gly lie Ser Ik Met Ser Val Val Glu Gin Leu 1¾ 1315 1320 1325
Gly Arg Ser Pro Lys Gin Lai Val Leu Be Pro Gin Leu Glu Glu lie 1330 1335 1340
Asp lie Met Pro Pro Pro Val Phe Gin Gly Lys Phe Asn Tyr Lys Leu 1345 1350 1355 1360
Yal Αφ Lys He Thr Ser Asp Gin ffis De Phe &i: Pro Asp Lys He 1365 1370 1375
Asp Met Leu Thr Leu Gly Lys Met Leu Met Pro Hu* lie Lys Gly Gin 1380 1385 1390
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Lys Asn He Lys Asp Glu Asp He Val Asp Glu Ser De Asp Lys Leu 1475 1480 1485
Leu Arg He Asp Asn Thr Fne Tip Arg Met Phe Ser Lys Val Met 1¾ 1490 1495 1500
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Ser Leu Val Gly Tyr lie Gly Plic Lys Asn Trp ?ht lie Glu Gin Leu 1525 1530 1535 .Arg Ser Ala Glu Leu His Glu Val Pro TVp He Val Asn Ala Glu Gly 1540 1545 1550
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Gly Lys Leu Kfef Lys Asp Lea Asn Pro Lys Val Leu Tyr Hie De Gly 1^5 1690 1695
Glu Gly Ala Gly Asn Trp Met Ala Aii 1½ Ala Cys Glu Tyr fto Asp 1700 1705 1710
He Lys Pbe Va! Tyr Aig Ser Leu Lys Asp Asp Lea Asp His His Tyr -35- 144243-序列表.doc 201009079 1715 1720 1725
Pro Leu Glu Tyr Gin Arg Val lie Gly GIu Leu Ser Arg lie De Asp 1730 1735 1740 .
Ser Gly Glu Gly Lea Ser Met GIu Thr Thr Asp Ala Thr Gin Lys Thr 1745 ' 1750 1755 1760
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Leu Cys Asp Ala Glu Phe Lys Asp Arg Asp Asp Phe Pte Lys Met Val 1780 1785 1790 lie Leu Trp Arg Lys His Val ILcu Scr Cys Ail He Cys Thr Tlir Tyr 1795 1800 1805
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Leu Glu Phe Arg Gly Glu Ser Be He Val Ser Leu lie Leu Arg Asn 850 855 860
Phe Trp Leu Tyr Asn Leu Tyr Met His Glu Ser Lys Gin His Pro Leu 865 870 875 880
Ala Gly Lys Gin Leu Phe Lys Gin Leu Asn Lys Thr Leu Thr Ser Val 885 . 890 895
Gin Arg Phe Phe Glu He Lys Lys Glu Asn Glu Val Val Asp Leu Trp 900 905 910
Met Asn lie Pro Met Gin Phe Gly Gly Gly Asp Pro Val Val Phe Tyr 915 920 925 •38· 144243·序列表.doc 201009079
Arg Ser PheTyr Arg ,Ajg Thr Pro Asp Phe LeuThr Glu Ala He Ser 930 935 940
His Val Asp He Leu Leu Lys Us Ala Asn Ik Lys Asn Gh Thr 945 950 955 960
Lys Val Ser Phe Phe Lys Ala Leu Leu Ser Ih Gm Lys Asn Glu Arg 965 970 975
Ala Thr Leu Thr Tbr Leu Met Arg Asp Pto Gin Ala VaJ Gly Ser Glu 980 985 990
Axg Gin Ala Lys Val Thx Ser Asp He Asn Arg Thr Ala Val Thr Ser 995 1000 1005
He Leu Ser Leu Ser Rro Asn Gin Lea Phe Ser Asp Ser A!a Ik ffis 1010 1015 1020
Tyr Ser Ας^ Asn Ghi Gin Glu Val Gly Ec De Ala Glu Asn lie Thr 1025 1030 1035 1040
Pto Val Tyr Pro His Giy Leu Arg Val L^u Tyr Glu Ser Leu Pro 1045 1050 1055
His Lys Ala Glu Lys Val Vsl Asn Met De Ser Gly Thr Lys So: Ik 1060 1065 1070
Tlir Asn Lea Leu Gin Arg Thr Ser Ala He Asn Qy Glu Asp lie Asp 1075 1080 1085
Arg Ala Yat Ser Met Miet Leu Glu Asn Leu Gly Leu Leu Ser Arg lb 1090 1095 1100
Leu Ser Val Val Val Asp Ser lie Glu Be Pro lie Lys Ser Asn Gly 1105 1110 illS U20
Arg Leu He Cys (¾¾ Qln lie Sa: Arg Thr Leu 咕 Ghi Thr Ser Trp 1125 1130 1135
Asn Asn Met Glu De Val Gly Val Tta Ser Pro Ser He Thr Thr Cys 1140 1145 11M
Met A$p Val De Tyr Ala Thr Ser Ser His Leu Lys Gly lie lie i!c 1155 1160 1165 01¾ Lys Phe Ser ITar Asp Arg Thr Thr Arg Gly Gin Arg Gly fto Lys Π70 1175 1180
Ser Pm Trp Val Gly Ser Ser Thr Gin Glu Lys Lys Leu Vai fto Val 1185 1190 1195 1200
Tyr Asn Ajb Gin Leu Ser Lys Gin Gin Arg Glu CHn Leu G!u Ala 1205 1210 1215
He Gly Lys Met Arg Trp Vd Tyr Lys Gly Thr Pro Gly-Lcu Arg： Arg 1220 1225 1230 ·
Leu Leu Mn L对 De Cys Leu Gly Ser Leu Gly lie Ser Tyi Lys Cys 1235 1240 1245
Val Lys Pro Leu Leu Pro Arg Phe Mei Scr Val Asn Fhc I^u His Arg 1250 1255 1260
Leu Ssr Val Ser Ser Arg Pro Met Glu His Pro Ala So: Val Pro Ala 1265 1270 1275 1280
Tyr Arg Tk Thr Tyr His Phe Asp Thr Ser Pro lie Asn (3n Ala 1285 1290 1295
Leu Ser Glu Arg Phe Qy Asn Glu Asp Be Asn Leu Val Hie Gin λ^ι 1300 1305 1310 • Ala ilc Ser Cys Gly lie Ser He Met Ser Val Val Gin Ok Leu Thr 1315 1320 1325
Gly Arg Ser Pro Lys GJn Lea Val Leu Be Pro Gin Lea Glu Glu De 1330 1335 1340
Asp He Met Pro Ro Pto Val Hie Gta Gly Lys A$n Tyr Lys Leu 1345 1350 L35S 1360 -39- 144243-序列表.doc 201009079
Val Asp Lys lie Thr Ser Asp Gin His Be Phe Ser Pro Asp Lys He 1365 1370 1375
Asp Met Leu Thr Uju Gly Lys Met Leu Met Pro Thr lie Lys Gly Gin 1380 1385 1390
Lys Thr Asp Gin Phe Leu Asn Lys Arg Glu Asn Tyr Phe His Giy Asn 1395 1400 1405
Asa Leu He Glu Ser Leu Scr Ala Ala Lsa A!a Cys His Tip Cys Gly 1410 1415 1420
De Leu Thr Glu Gin Cys Iks Glu Asn lie Phe Lys Lys Asp Tip 1425 1430 1435 1440
Gly Asp Gly Phe Dc Ser Asp His Ala Rie Met Asp Phe Lys Dc Phe 1445 1450 1455
Leu Cys Val Phe Lys Thr Lys Leu Leu Cys So: Tip Gly Ser Gin Gly 1460 1465 1470
Lys Asn De Lys Asp Glu Asp lie Val Asp Glu Ser He Asp Lys Leu 1475 1480 1485
Leu Arg He Asp Asn Thr Pte IVp Arg Phe Sk· Lys Val Met Hie 1490 1495 1500
Glu Pro Lys Val Lys Lys Aig He Met Leu Tyr Asp Val Lys Phe Leu 1505 1510 1515 1520
Sea- Leu Vai Gly Tyr He Gly Phe Lys Asn Tip Phe He Glu Gin Leu 1525 1530 1S35
Aig Ser Ala Glu Leu His Glu De Pro Trp Be Val Asn Ala Glu Gly 1540 1545 1550
Asp Leu Val Glu lie Lys Scr He Lys Dc Tyr Leu Gin Leu lie Glu 1555 〖560 1565
Gin Ser Leu Ric Lem Arg He Tnr Val Lea Tyr Ίϊτ Asp Met Ala 1570 1575 1580
His Ala Leu Thr Arg Leu Ik Arg Lys Lys Leu Met Cys Asp Asn Ala 1585 1590 1595 1600
Leu Leu. Thr Pro lie Ser Ser Rro Met Val A^n Leu Thr Gin Val De 1605 1610 1615
Asp Pro Thr Thr Gin Leu Asp Tvr Phe Pro Lys He Thr Phe Glu Arg 1620 1625 1630
Leu Lys Asn Tyr Asp Thr Ser Ser Asn Tyr Ala Lys Gly Lys Leu Thr 1635 1640 1645
Arg Asn Tyr Met He Leu Leu Pro Trp Gin His Val Asn Arg Tyr Asn 1650 1655 1660
Phe Val Rie Ser Ser Thr Gly Cys Lys Val Ser Leu Lys Thr Cys lie 1665 1670 1675 1680
Gly Lys Leu Met Lys Asp Leu Asn Pro Lys Val Leu Tyr Pte Be Gly 1685 1690 1695
Glu Gly Ala Gly Asa Tip Met Ala Arg'Thr Ala Cys Glu Tyr Pro Asp 1700 1705 1710
De Lys Phe Val Tyr Arg Ser Leu Lys Asp Asp Leu Asp His His Tyr Π15 1720 1725
Pro Leu Glu Tyr Gin Arg Val lie Gly Glu Leu Ser Ατι Π& Be Asp 1730 1735 1740
Ser Gly Glu Gly Lea Ser Met Glu Thr Thr Asp Ala Thr Gin Lys Thr 1745 1750 1755 1760
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Leu Cys Asp Ala Glu Phe Lys Asp Arg Asp Asp Phe Phe Lys Met Val 1780 178S 1790 -40- 144243-序列表.doc 201009079 I】e Leu Trp Arg Lys His Val Leu Ser Cys Arg He Cys Thr Thr Tyr 1795 1800 1805
Gly Thr Asp Leu Tyr Leu Phe Ala Lys Tyr His Ala Lys Asp Cys Asn 1810 1815 1820
Val Lys Leu Pro Phe Phe Val Arg Ser Val Ala Thr Phe lie Met Gin 1825 1830 1835 1840
Gly Ser Lys Leu Ser Gly Ser Glu Cys Tyr He Leu Leu Thr Leu Gly 1845 1850 1855
His His Asn Ser Leu Pro Cys His Gly Glu lie Gin Asn Ser Lys Met 1860 1865 1870
Lys lie Ala Val Cys Asn Asp Phe Tyr Ala Ala Lys Lys Leu Asp Asn 1875 1880 1885
Lys Ser lie Glu Ala Asn Cys Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Arg lie 1890 1895 1900
Pro He Asn Lys Lys Glu Leu Asp Arg Gin Arg Arg Leu Leu Thr Leu 1905 1910 1915 1920
Gin Ser Asn His Ser Ser Val Ala Thr Val Gly Gly Ser Lys lie De 1925 1930 1935
Glu Ser Lys Tip Leu Thr Asn Lys Ala Ser Thr I】e lie Asp Trp Leu 1940 1945 1950
Glu His I3e Leu Asn Ser Rro Lys Gly Glu Leu Asn Tyr Asp Phe Phe 1955 1960 1965
Glu Ala Leu Glu Asn Thr Tyr Pro Asn Met ΰβ Lys Leu lie Asp Asn 1970 1975 1980
Leu Gly Asn Ala Glu lie Lys Lys Leu lie Lys Val Thr Gly Tyr Met 1985 1990 1995 2000
Leu Val Ser Lys Lys 2005 <210> 36 <211> 2005 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400>36
Met Asp Pro Phe Cys Glu Ser Thr Val Asn Val Tyr Leu Pro Asp Ser 15 10 15
Tyr Leu Lys Gly Val He Ser Phe Ser Glu Thr Asn Ala lie Gly Ser 20 25 30
Cys Leu Leu Lys Arg Pro Tyr Leu Lys Asn Asp Asn Thr Ala Lys Val 35 40 45
Ala Val Glu Asn Pro Val Val G]u His -Val Ar£ Leu Arg Asn Ala Val 50 55 60
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Met Gin His Glu lie Met Lys Asn De His Ser Cys Glu Leu Thr Leu 85 90 95
Leu Lys Gin Phe Leu Thr Arg Ser Lys Asn lie Ser Ser Leu Lys Leu 100 105 110
Asn Met lie Cys Asp Tip Leu Gin Leu Lys Ser Thr Ser Asp Asn Thr 115 120 125
Ser lie Leu Asn Phe lie Asp Val Glu Phe lie Pro Val Trp Val Ser 130 135 140 -41 - 144243-序列表.doc 201009079
Asn Trp Phe Set Asn Trp Tyr Asn Leu Asn Lys Leu lie Leu GIu Hie *145 150 155 160
Arg Arg Glu Glu Val lie Arg Thr Gly S^: He Leu Cys Axg Scr Leu 165 170 175
Gly Lys Leu Val Phe Ife Val Ser Ser Tyr Gly Cys Vai Val Lys Ser 180 185 190
Asn Lys Ser Lys Va{ Ser Phe Hie Thr Tyr Asn Gin Leu Leu Thr 195 200 205
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Asn Leu Gin Gly Met Leu Thr Asn Lys Leu Tyr Glu Thr Vai Asp Tyr 245 250 255
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Leu fe Val Leu Lys Ala Lys Asn Arg Scr Arg Vai Leu Gly Tar Be 305 310 315 320
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Asn Ala Ala Giu Leu Tyr Tyr lie Phe Arg lie Fne (31y His Rro Met 355 360 365
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Lys Ala Lys Scr Tyr Pro Ser Gin Leu Glu Leu Ser Val Gin Asp Phe 435 440 445
Leu (M Leu Ala Ala Val Gin Phe Glu Gh Glu Phe Ser Val Pro Οΐυ 450 455 460
Lys Thr Asn Lea Glu Met Val Leu Asn Asp Lys Ala Dc Scr Pro fto 465 470 475 4S0
Lys Lys Leu He Tip Sar Val Tyr Pro Lys Asa Tyr Lm Pro Glu Thr 485 - 490 495 lie Lys Asn Gin Tyr Leu Glu Glu Ala Phe Asn Ala Ser A$p Scr Gin 500 505 510
Arg Thr Aig Ai£ Yal Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Asp Cys Lys Phe Asp 515 520 525
Gin Lys Glu Leu Lys Arg Tyr Val Be Lys Gin Glu Tyr Leu Asn Asp 530 535 540
Lys Asp His He Vai Ser L^u Thr Gly Lys Glu Arg Glu Leu Scr Val 545 550 555 560
Gly Arg Mei Phe AM Met Gin Pro Gly Lys Gin Arg Gin lie Gin lie 565 " 570 575 -42- 144243-序列表.doc 201009079
Leu Ala GIu hys Lmi Leu Ala Asp Asn De Val Pro Phe Phe Pro Glu 580 585 590
Thr Leu Thr Lys Tyr Gly Asp Leu Asp Leu Gin Arg Ite Met Glu lie 595 600 605
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Asn Tyr lie Ala Arg Ala Ser He Val Thr Asp Leu &r Lys Phe Asn 625 630 635 640
Gin Ala Phe Arg Tyr Glu Thr Tnr Ala lie Cys Ala Asp Val Ala Asp 645 650 . 655 OIu Leu His Gly Thr Gin Ser Leu Fhe Cys Trp Leu His Leu He Val 660 665 670
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Lys Giy Glu Tyr Asp lie Asp Lys lie Gin Glu Gin Ser Gly Im Tyr 690 695 700
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Leu Glu Phe Arg Gly Glu Ser De Leu Val Ser Leu De Leu PiXg Asr 850 855 860
Phe Trp Leu Tyr Asn Leu Tyr Met Tyr Glu Ser Lys Gin His Pro Leu 865 870 875 S80
Ala Gly Lys Gin leu Bie Lys Gin Leu Asn Lys Thr Leu Thr Ser Yai 885 890 895
Gin Arg Phe Phe Glu Leu Lys Lys Glu Asa Asp Val Val Asp Leu Trp 900 905 910
Met Asn De Pro Mfct Gin Hie Gly Gly Gly Asp Pro Val Val Rie Tyr 915 920 -925
Arg Ser Phe Tyr Arg Arg Tlir Pio Asp Phe Leu Thr Glu Ala lie Ser 930 935 940
His Val Asp Leu Leu Leu Lys Val Ser Asii Asn He Lys Asp Glu Tiir 945 950 955 m
Lys lie Arg Phe Phe Lys Ak Leu Leu Ser Qe Glu Lys Asn Glu Axg 965 970 975
Ala Thr Leu Thr Thr Leu Met Arg Asp Pro Gin Ala Val Gly Ser Glu 980 985 990
Aig Gin Ala Lys Val Tht Ser Αφ Ite Asn Arg Tlir Ala Val Thr Ser 995 1000 1005 -43- 144243-序列表.doc 201009079 lie Leu Ser Leu Ser fto Asn Gin Leu Phe Cys Asp Ser Ak He His 1010 1015 1020
Tyr Ser Arg Asn Glu Glu Glu Val Gly lie De Ala Asp Asn Us Thr 1025 1030 1035 1040 fto Val Tyr Pro Hi$ Gly Leu Arg Val Leu Tyr Glu Ser Leu Rro Phc 1045 1050 1055
His Lys Ala Glu Ly$ Val Val Asn Met lie Ser Gly Thr Lys Ser He 1060 1065 1070 Τΐτ Asn Leu Leu Gin Thr Ser Ala De Asn Gly Glu Asp lie Asp 1075 1080 1085
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Arg Leu lie Cys Cys Gin He Ser Lys Thr Leu Arg Glu Lys Scr Trp 1125 1130 1135
Asn Asn Met Glu lie Val Gly Val Thr Ser Pro Ser He Val Ihr Cys 1140 1145 1150
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Leu Lea Asn Lys lie Cys lie Gly Ser Leu Gly He Ser Tyr Lys Cys 1235 1240 1245
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His Ala Leu Thr Arg Lee lie Arg Lys Lys Leu Met Cys Asp Asn Ala 1585 1590 1595 1600
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Gly Lys Leu De Lys Asp L^u Asn Pro Lys Val I^eu Tyr Phe lie Gly 1685 1690 L69S
Glu Gly Ala Gly Asn Tip Met Ala Arg Thr Ma Cys Giu Tyr Pro Asp 1700 1705 mo
He Lys Fbc Val Tyr An Ser Leu Lys Asp Asp Leu Asp His His Tyr 1715 1720 1725
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Ser Gly Glu Giy Leu Scr Met Giu Thr Thr Asp Ala Hit Gin Lys Thi 1745 1750 1755 1760
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Leu Cys Asp Ala Glu Pte Lys Asn An Asp Asp Ric Phe Lys Met Val 1780 1785 1790 lie Leu Tip 細 Lys FOs Yal Leu Ser Cys Arg He Cys Thr Ala Tyr 1795 1800 1805
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Ais lie AJa Val Cys Asn Asp Phe Tyr Ala Ser Lys Lys Leu Asp Asn !875 1880 1B85
Lys Ser He GIu Ala Asn Lys Ser Leu Leu Ser Giy Leu Arg De 1890 1895 1900
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Leu Gly Asa Ala Glu lie Lys Lys Leu 11c Lys Val Thr Gly Tyr Met 1985 1930 1995 2000
Leu Val Ser Lys Lys 2005 <ώ10>37 <211>2005 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400>37
Mtt Asp Pro Phe Cys Glu Ser Thr Val Asn Val Tyr Leu Pro Asp Ser 15 10 15
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Gin Ala Phe Arg Tyr Gla Thr Thr Ala He Cys Ala Asp Val Ala Asp 645 650 655 -47- 144243-序列表.doc 201009079
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Gly Ser Lys Leu Ser Gly Ser Glu Cys Tyr He Leu Leu Thr Leu Gly 1845 1850 1855
His His Asn Asn Leu Pro Cys His Gly Glu He Gin Asn Ser Lys Met 1860 1865 1870 .
Arg lie Ala Val Cys Asn Asp Phe His Ala Ser Lys Lys Lai Asp Asn 1875 1880 1885
Lys Ser Πε Glu Ala Asn Cys Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Arg De 1890 1895 · 1900
Pro Be Asn Lys Lys Glu Leu Asn Ars Gin Lys Lys Leu Leu Ilir Leu 1905 1910 1915 1920
Gin Ser Asn His Ser Ser lie Ala Thr Val Gly Gly Ser Lys lie He 1925 1930 1935
Glu Scr Lys Trp Leu Lys Asn Lys Ala Ser Thr He He Asp Trp Lea 1940 1945 1950 -50-
144243-序列表.doc 201009079
Glu His Qe Lea Asm Ser Pro Lys Gly Glu Leu As» Tyr Asp Pbe Η» 1955 1960 1965
Glu AM Leu Glu Asn Thr Tyr fto Asn Met De Lys Leu lie Asp Asn 1970 1975 1980
Leu Gly Asn Ala Glu He Lys Lys Lett Be Lys Vai ft〇 GJy Tyr Met 1985 1990 1995 2000
Leu Val Ser Lys Lys 2005
<210>38 <211> 6018 <212>DNA <313>人類間質肺病毒 <400>38
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<210>41 <211> 6018 <212>DNA <213>人類間質肺病毒 <400>41 atggatccat mgtgaatc csctgtcaat gmatctic c^tcata KiUraaagga 60 gmtatcit tcagtgasac caaigcaatt ggctca^cc trttgasaag accctatcta 120 aaaaaagata ^actgctaa iigttsctgta gaaaaccctg tigttgaaca tgfcsggctt 180 agaaatgc^g tcatgacxaa aatgaagala tcagattata aagtggtlga accaattaat 240 atgcagc^g aaataatgaa aaatataca: agttgtgagc ic$cmxi aaaacaattc 3(X5 rtaacaagaa geaaaaacat tagdctcta aaattaagta tgat^stga ttggttacgg 360 ttaaaatcca cctcagataa cacatcaatt coaatttta lagatgt^a gtttatacct 420 gtitgggtga gcaattggtt t^tasu^gg tataatctca ataaaltaat citagagttt 480 agaagagagg aaguataag aactggtica a^ttatgta gatcactagg caagttagtt 540 ttcattgtat catcttatgg gtgtgtagia aaaagcaaca aaagtaaaag agt2agttu ®)0 ttcacatata accaactttt aacatesaaa gatgtgatgi taagtaggtt caatgcaa^: 660 trt^tatat gggtaagtaa caacctgaac ^aaatcaag aaggaciagg amaga^t 77D aatctgcaag gtatgttaac czzmzm tatgaaaai ttgatta^t gctaag^ta 780 购gtaatg aagggtictc acc^®aaa gagttscga^g gctitsimt g^tsaaatt 840 cttaaaatta 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a^ttgtgta tgcaactagt 34¾) ictcattiaa aaggaataat tattgaaaaa ttcagt^tg acaagacxac aagaggtcag 3540 aggggaccaa aaaicccctg ggtag^tca agcactcaag agaaaaaatt agttcctgtt 3600 ^taatagac aaattc^ttc aaaaca^aa aaggagcaac tggaa^aat aggaaaaatg 3660 ^EEtgggtgt ataaaggaac tccagggcta aga^attgc tcaataagat ttgcaiatga 3720 agttta^ta ttagctataa atg^taaaa cctctattac gagtgtaaac 3780 ttcttacata ggttatctgt tagtagc^a cccatgg^i tcccagcitc tgtlccagct 3840 ^taggacaa caaattacca ctti^acact agtc^iatca acca^catt m^agg 390C ttcgggaacg aagacattaa lcta§tgtlc caaaat^aa ^ap;tscgg aattagta^ 3960 atgastgttg tagaacagtt aac^taga agcccaaaac aattagtctt aaicccccaa 4020 ttagsagaga tagatattat gccicctcct gtattlcaag gaaaadcaa ttataaacta 4080 gttgataaaa ta^xtctga tcaacacalc ucagtcclg acaaaataga catattaaca 4140 ct^ggaaga tgcuatgcc tactataaaa ggtmaaaa ctgatc&gtt cttaaataag 42(X) agagaaaact aaalaattta attgaatctr tatctgcagc acttgcatgc 4260 cactggtgtg gaatattaac agaacagtgcgtaga^aca ataictuag gaaagactgg 4320 ggtgatgggt tcata^a tcatgccnc 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aaggatgatc tteatcatca ttacccatta gggiaatagg tgatttaaai MM agggtaatag atggiggtga aggactatca atggzgsccz cagatgcaac icaaaag^t 5280 catigggact taatacacag ^iiaagiaaa gatgcitEat tgaiaacaci gtgigaigca 5340 pattcaaaa acagagatga tttctttaaa ategtaaite tttgsa^aa acatgtatta 5400 tcatgiagaa tctgt^agc ttatggaaca gatdttact taatgcaaa gtatcatgcg 54® acggactgca atataaaatt accaiitttt gtaaggtctg tagctacttt taaa^caa 5520 ggaagcaaat tgtcag£a£c a£aatgttac atactttt£a cattaggtca maataat 5580 ctgccs^cc atggagaaat acaaaaStec aaaatgagaa ts^cagtgtg taatgaittc 5640 catgcctcaa aaaaactaga caacaaatca attgaagcta actgtaaatc tcltdatca 5700 ggattaagaa taccaataaa caaa2asgag ttaaatagac amgaaact gttaacacta S760 caaagcaatc attcttccat agmcagtt ggcggcatfa agattau^aalccaaatgg 582Q ttaaagaaca aagcaagtac ^Ltaattgat tggtlagagc alatct^aa ttccccaaaa 58¾) ggtgaattaa actatgattt ctttg^gcz ttagagaaca cataccccaa tai^atcaas 5940 cttatagata acctgggaaa tgcagagata aaaaaactaa tcaaagitcc tgggtatatg 6WX) cttglgagta s^aagtaa S)18 O <210>42 <211>18? <212>蛋白質 <^3>人類間質肺病毒 <400>42 ；
Met Ser Arg Lys Ala Pro Cys Lys Tyr Glu Val Arg Gly Lys Cys Asn 15 10 15
Arg Oly Ser Glu Cys Lys Phe Asn His Asn Tyr Tip Ser Tip Pro Asp 20 25 30
Arg Tyr Leu Leu lie Arg Ser Asn Tyr Leu Leu Asn Gin Leu.Lea Arg 35 40 45
Asn Thr Asp Arg Ala Asp Gly Leu Sez fie lie Ser Gly Ala Gly Arg $0 55 60
Glu Asp Arg Thr Gin Asp Phe Val Leu Gly Ser Thr Asn Val Val GJn 65 70 75 80 ❹
Gly Tyr lie Asp Asp Asn Gin Ser De Thr Lys Ala Ala Ala Cys Tyr 85 90 95
Ser Leu His Asn He He Lys Gin Leu Gin Glu Val Glu Val Arg Gk 100 105 110
Ala Arg Asp Asn Lys Leu Ser Asp Ser Lys His Val Ala Leu His Asn 115 120 125
Leu Val Leu Scr Tyr Met Glu Met Scr Lys Thr Pro Ala Ser Leu lie 130 135 140
Asn Asn Leu Lys Arg Leu Pro Arg Gla Lys Leu Lys Lys Leu Ala Lys 145 150 . 155 160
Leu He lie Asp I^u Ser Ala Gly Ala Glu Asn Asp Ser Ser Tyr Ala 165 170 175
Leu Gin As? Ser Glu Scr Thr Asn Gin Val Gin 180 185 <210>43 <211> 187 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 -59- 144243-序列表.doc 201009079 <400>43
Met &r Arg Lys Ala Pro Cys Lys Tyr Glu Val Arg Gly Cys Asn 15 10 15
Arg Gly Ser Glu Cys Lys Phe Asn His Asn Tyr Tip Ser Tip Pro Asp 20 25 30
Arg Tyr Leu Leu lie Arg Ser Asa Tyr Leu Leu Asn Gin Leu Leu Arg 35 40 45
Aai Thr Asp An Ala Asp Gly Leu Ser He Πο Ser Gly Ala Gly Arg 50 55 60
Glu Asp Arg Thr Gin Asp Fne Val Leu Gly Ser Thr Asn Val Val Gin 65 70 75 80
Gly Tyr Ik Asp Asp Asn Gin Ser He Tar Lys Ala Ala Ala Cys Tyr 85 90 95
Ser Leu His Asn He lie Lys Gin Lea Gin Glu Val Glu Val Acg Gin loo 105 no
Ala Arg Asp Ser Lys Leu Ser Asp Ser Lys His Val Ala Leu His Asn 115 120 125
Lea Dc Leu Ser Tyr Met Glu Met Ser Lys Thr Pro Ala Ser Leu lie no 135 140
Asn Asn Leu Lys Arg Leu fto Arg Glu Lys Leu Lys Lys U« Ala Lys 145 150 155 160
Leu lie De Asp L«a Ser Ala Gly Ala Asp Asn Asp Ser Ser Tyr Ala 165 170 175
Leu Gin Asp Ser Glu §er Thr Asn Gin Val Gin 180 185 <210>44 <211> 187 <2】2>蛋白質 人類間質肺病毒 <400>44
Met Ser Arg Lys AJa Pro Cys Lys Tyr Glu Val Acg Gly Lys Cys Asn 15 10 15
Arg Gly Ser Asp Cys Lys Phe Asn His Asn Tyr Trp Ser Tip Pro Asp 20 25 30
Arg Tyr Lea Leu Leu Arg Ser Asn Tyr Leu Leu Asn Gin Leu Leu Arg 35 40 45
Aiax Thi A^5 Lys Ala Asp Gly Lea Scr He Be Ser Gly Ala Gly Αιϊ 50 55 60
Glu ΑφΑγε Thr (Sn Asp I%e Val Leu Gly Ser Thr Asa Val Val Gin 65 70 75 80
Gly Tyr He Asp Asp Asn Gin <Hy Ee Thr Lys Ala Ala Ala Cys Tyr 85 90 95
Scr Leu His Asn lie lie Lys Gin Lea Gin Glo Thr Olu Val Arg Gin 30Q 105 110
Ala Arg Asp Asn Lys Leu Ser Asp Set Lys His Val Ala Lwi His Asn 115 120 125
Leu lie Leu Ser Tyr Met Ghi Met &ar Lys Thr Pro Ala Ser Leu lie 130 135 140
Asn Asn Leu Lys Lys Lea Rro Arg Glu Lys Leu Lys Lys Leu Ala Arg -60- 144243-序列表.doc 201009079 145 150 155 160
Leu lie le Asp L«i Ser Ala Gly Thr Asp Asn Asp Ser Sea* Tyr Ala 165 170 175
Lea Gin Asp Set GIu Ser Hr Asn Gin Val Gin 180 185 <2I0> 45 <211> 187 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <40045
Met Ser Arg Lys Ala Pro Cys Lys T>t GIu Val Arg Gly Lys Cys Asn 1 5 10 15
Arg Gly Sei GIu 0¾¾ Lys Phe Asn His Asn Tyr Trp Ser Tip fto Asp 20 25 30
Arg Tyr Leu Leu Leu Arg Ser Asa Tyr Lai Leu Asn Gin Leu Lea Aig 35 40 45
Asn Thr Asp Lys Ala Asp Gly Lea Ser Ik He Sa Gly Ala Qy Arg 50 55 60 GIu Asp Arg Thr Gin Asp Hie Val Leu Gly Ser Thr Asn Val Val Glti 65 70 75 80
Gly Tyr lie Asp Asn Asn Gin Gly lie Thr Lys Ala Ala Ala Cys Tyr 85 90 95
Ser Leu Ha Asn lie lie Lys Gin Leu Gla Gfo He GIu Val Arg Gta 100 〖05 110
Ala Ati Asp Asn Lys Leu Ser Asp Ser Lys His Val Ala Leu His Asn 115 120 125 ·
Leii He Leu Ser Tyr Met Gla Met Ser Lys Thr Pro Ala Ser Leu He 130 135 140
Aai Asa Leu Lys Lys Leu Pro Arg GIu Lys Leu Lys Lys Leu Ala Lys 145 150 255 160
Leu lie He Asp Lai Ser Ala Gly Thr Asp Asn A^p Ser Ser Tyr Ala 155 170 175
Lsu Gin Asp Ser GIu &rTTn: Asn Gin Vd Gin 180 185
<210>46 <21 卜 564 <212>WA <213>人類間質肺病毒 <400>46 atgtcicgca aggctcogtg caaaiatgaa gtgcggggca aalgcaatag aggaagtgag 60 购agttta accacaatta ctggag 技gg cc^atagat acnattaat aagatcaaac 1¾] t2d;ttattaa atca^tttt aaggaacact §ata§agct£ atseettate a^taatatca 180 ggageaggea gagaagatag gacac^gat tttgta^ag gttecsKxaa tgtggticaa 240 ggmaatig atgataacca aagcataaca aaagctgoag octgttac^ iciacataat WQ at^tcaaac aactacaaga ^ttg^gtt aggegggeta gagat^acaa actatctgac 360 a£caaacatg tageaedra caacttag^: ctatcttala Iggagatgag caa^ectcct 420 gcatcutaa tcaac^itct caagagactg cc^agagasa aactgama attage^s^ 480 ctcataattg acttatcagc aggtgctgaa aatgactctt catatgcott gmgacagt 540 •61 - 144243-序列表.doc 201009079 gaaagcacta atcaagtgca gtga 564 <210>47 <211>564
<212>DNA <2i3>人類間質肺病毒 <4〇〇>47 aigictcgca aggctcxatg caaatatgaa gigcgiggca aatgc&acag aggaagtgag 60 tgtaagttta accacaatta ctggagtt^gg ccagatagat acttattaat aagatcaaac 120 tatcmti^a atcagcittt aaggaacact gatagagctg atggxtaic aataatatca 180 ggcgcaggca gagaagacag aacgcaagat mgtccrag gttccacxaa tgtggticaa 240 ggttataitg atgataacca aag<ataaca aaagctgcag cctgctacag ictac^cm 300 alaatcaagc aactacaaga agr^aagtt aggcaggcta gagatagcaa actmgac 360 agcaagcafe tggcactcxa taacttsaic ttatctta^ tggagatgag c^aactccc 420 gcatctttaa tcaacaau：t ta^^actg cceagasaaa aact^aaaa attascaaag 480 ctgataattg acttatcagc a£gcgctgac aatgaotctt catatgccct gcaaiacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca g^a 564
<210>48 <211> 564 <212>DNA <213>人類間質肺病毒 <400>48 · atg^gta .aggctccatg caaatatgaa gt热:ggggca aatgcaacag agggag 贼汉） tgcaaattca atcacaatta ctggagttgg cctgatagat atttatigtt aasatcaaat 120 tatctcttaa atcagctttt aagaaacaca gataaggctg ^ggtttgtc ^taatatca 180 ggagcaggta gagaagatag aactcaagac tttgttcttg gttct^taa tgtggttcaa 240 gggtacatcg atgacaacca aggaataacc aaggctgcag cttgctatag tctacaca^ 300 at^tcaagc aactacaaga aacagaagta agacaggcta gagaca£K：aa gctUc^at 360 ascaaa^atg tggcgctcca caacttga^ ttatcctata tggagatgag caaaac^cct 420 gcatcicu^ ccaacaaccr ^agaaacta ccaagggaaa aactgaagaa atiagcaaga 430 rmataattg atttatcagc aggaactgac aatgactctt catatgcctt gcaag^agt 540 gaaagcacta arcaagt落 a gm 564 <210>49 <211>564
<212>DNA <213>人類間質肺病毒 <400>49 aigictcgca aag<^ccatg cmtatgaa gtacggggca zgtgca^czg ggg^igtgag 60 tgcaaatica accacaaiia ctggagccgg ccEga^ggt atttgttgtc aagatcaaat 120 tatctcttga atcagctm aagaa^act gataaggctg atggutgtc zzi^zwcz 180 g^gcaggta gagaagat^ g2K：!caagac utgttcug gtictactaa tgtggttcaa 240 g^iacat% ataacaatca aggaa^aca aai£ct^:ag ctrgctatag td^ataac 3ΰ) ataataaaac aactacaaga aatagaagta 3gacaggcta gagamtaa gcutccgac 360 agcaaacatg tggcacttca caacttgata ttatcctata tggagateas ca^iactcct 420 gcatccctga ttiiataacct e^aaaota cca^ageaa aaagaagaa attagcgaaa 480 itzamug atttatcagc aggaactgat aatgactctt catatgcctt gcaajgac^t 540 gaaagcacta atcaagtgca gtaa 564 <210>50 62- 144243-序列表.doc 201009079 <21i>71 <m>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <m> so
Met Hir Leu His Met Pro Cys Lys Thr Vai Lys Ala Leu lie Lys Cys 1 5 io is
Sex Glu His Gly Pro Vai Hie Dc Thr Be Glu Val Asp Asp Met lie 20 25 30 Τφ Thr His Lys Asp l^u Lys Glu Ala Leu Set Asp Gly lie Val Lys 35 40 45
Ser His Thr Asn De Tyr Asn Cys Tyr Leu Glu Asn lie Glu lie 50 55 60
Tyr Val Lys Ala Tyr Leu Ser 65 70
<210>51 <211> 7] <212>蛋白質 <2»>人類間質肺病毒 <400>51
Met Thr Leu His Met Pro Cys Lys Thr "Val Lys Ala Lea lie Lys Cys 1 5 、1G 15
Ser Glu His Gly Pro Val Phe Qe Ήιτ fle Giu Val Asp Glu Met & 20 25 30
Trp Thr Gin Lys Glu Lea Lys Glu Ala I^a Ser Asp Gly lie Val Lys 35 40 45
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Tyr Val Lys Ala Tyr Leu Scr 65 70 <210> 52 <211>7L <2!2>蛋白質 <213>人類間質肺病毒‘ <40Q>52
Thr Leu His Met Pro Cys Lys Ώτ Vai Lys Ala Lea lie Lys Cys 15 10 15
Ser Lys His Gly Pro Lys Phe He Thr He Glu Ala Asp Asq Met Ik 20 25 30 frp Tnt His Glu Leu Lys Giu Thr Leu Ser Asp C3y De Val Lys 35 40 45 '
Ser His Thr Asn lie Tyr Ser Cys Tyr Lea Glu Asn lie Glu He Ife 50 55 60
Tyr Val Lys Thr Tyr Lei] Ser 65 ?0 <2!0> 53 63- 144243-序列表.doc 201009079 <2Π>71 <212>蛋白質 "^^人類間質肺病毒 <400>53
Met Thr Ixu His Met fto Cys Lys Thr Val Lys Ala Leu He Lys Cys 15 10 15
Ser Lys His Giy Piro Lys Hje De Thr De Glu Ala Asp Asp Met De 20 25 30
Trp Thr His Lys Glu Leu Lys Glu Thr Leu Ser Asp Gly He Val Lys 35 40 45
Scr His Thr Asn ilc Tyr Ssr Cys Tyr Leu Glu Asn lie Glu lie lie 50 55 60
Tyr Val Lys Ala Tyr Leu Ser 65 70 <210>54 <211>216
<2!2>DNA <2出人類間質肺病毒 <400> 54 atgactctfe atateccttg caagacagtg aaagcactaa tcaagi^ag tg2gcatg£t 60 ccagtttlca ttactataga ggtt^itgac atsatatgga ctcacaagga ctiaaaagaa 120 gcittatcig atgggatagt gaagtctcat actaacattt ^aattgtta ntagaaaac 180 2Lta£aaatta tatatgtcaa ggcttactta agttag 216
<210>55 <211> 216 <212>DHA <2!3>人類間質肺病毒 <400>55 atgactcttc atatgccctg caagacagig aaagcactaa tcaagtgcag tgagcatggt 60 cctgttttca itactataga ggttgaigaa afgatatgga ctcaaaaaga attaaaagaa 120 gctttgtccs stgggatagt ga^tctcac accaacattt acaattgtta tttagaaaac 180 atsgaaatta tatatglcaa ggctta:tta agttag 216 <210>56 <211>216
<212>DNA <213>人類間質肺病毒 <4{Χ)>56 etgactctto atatgccttg caagacagtg aaagcacaa tcaastgcag taaacat〇gc 60 cccaa^ltca tiaccataga ggc^galgat atgata^ga ctcscziagu attaaa^aa 220 2cactgtctg atgggatagt aaaatcacac accaatatttatagttgtta cttagaaaat 1¾} atagaaataa tatatgttaa ^cctact^i agtlag 216
<210>57 <211> 216 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 144243-序列表.doc -64- 201009079 <400>57 atgactcilc atatgccttg mgacagtg aaagcactaa tcaagtgcag taagcatggt fi) caaaatica ttaccataga ggcagatgat atgafatgga cacacsaaga attaaaggag 120 acactgiccg atgggatagt aaaatcacac accaatattt acagtigaa tttag^aat 180 at^aaatei tatatgttaa agct^icita agttag 216 <210>58 <211>727
<212>DNA <2以人類間質肺病毒 <400>58 '
atgictcgca aggctccgtg caaatatgaa gtgcggggca aatgcaatag aggaagtgag 60 tgcaaattia accacaatia ciggagttgg ccagatagat icaattaat aagatcaaat 120 tatttatiaa atcaactm aaggaacact gai2gagctg stggctlatc aataatatca 180 ggagcaggca gagaagatag gacacaagat tttgtcctag gttccaccaa tgtggtttaa 240 ggtiatattg atgateacca aagcataaca aaagctgcag cctgtiacag tctacataat 300 amtcaaac aactacaaga agttgaagtt agg^ggcta gagalaacaa asatetgac 3fi) agcaaacatg tagc^ttca caacSagtc ctatcttata tggagatgag caaaactcct 420 gcatctttaa tcaacaatct caagagac® ccgagagaga aactgaaaaa attagcaaag 480 ctcataatig acttatcagc aggtgctgaa aatgactett ca^tgcctt gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtgagcatgg tccagttttc attsctatag aggttgatga 600 catgatatgg actcacaagg acttaaaaga agctttaKi gatgggatag tgaagtctca 660 tacta^att tacaaitgtt ^ttag^aa catagaaatt atatatgtca aggcttsctt 720 aagtag 727 <210> 59 <211>727
<212>DNA <213>人類間質肺病毒 <4〇0>59 atg^gca aggctccatg caaatatgaa gtgcgg£gca aatgcaacaE aggaag^ag 60 tgtaagttta accacaatta c^gagttgg ccagstagat acttattaat aagatcaaac 120 tatctattaa atcagctttt aaggaacact gatagagctg a^gcctatc aataataica 180 ggcgcaggca gagaagacag aacgcaagat tttgttctag gttccaccaa tgtggitcaa 240 ggttatattg atgataacca aagcata^a aaagctgcag cctfctacag tc^cacaac 300 ataato^gc aactacaaga agttgaagtt aggcaggcta gasatagcaa actatctgac 3«) agcaagcatg tggcactcca taaotaatc tcaccttaca tggagalgag caaaacta:c 420 gcatetttaa ix^aatct taaaapctg <xgagagaaa aactgaaaaa attagcaaag 480 ctgamttg Eu^tatcagc aggcgctg^: aatgacmu catatgcca gcaags^agt 540 gaaagcacta atc^gtgca gtga^cafeg tcctgttttc atiactatag a^ttgatga ^X) .aatgata^g actcaaaaag aattaaaaga agctttgtcc gatgggatag tgaagtctca 6S) caccaacau tacaat^tt atttagaaaa catags^cc acata^tca aggcuacct 720 aaguag 727 <210>«) <211>727
<212>DNA <213>人類間質肺病毒 <4CK)>60 atgtctcgta aggctccatg caaatatgaa §tgcggggca aatgca紀想 agg辟gtgai 60 -65- 144243·序列表.doc 201009079 tgcaaattca ateacaatta ctggagttgs cctgatagal atttangtt aagatcaaat 120 tatctcttaa atcagctttt aaga^caca gataaggctg atggtttgic aataaiatca 180 ggagcaggta gagaagatag aactcaagac Utgttcttg gttctactaa tgtggucaa 240 gggtacaug atsacaacca aggaa^acc aaggagcag cttgctatag tctac^N^ac 300 ataatcaagc aactacasga aacagaagta ag^^g^ta gagacaacaa gcmct 抑1360 agcaaacafe tggcsctcca caacttgata ttatcctata tggagatgag caaaactcct 420 gcatctctaa tcaacaacct aaagaaacta cca^ggaaa aactgaagaa attagcaaga 480 tmcaattg atttaka®: aggaac^ac aatgactctt catatgcctt gcaagacagt 540 gaaagou:ta atcaagtgca gtaaacatgg tcccaaattc attaccatag aggca^tga 600 tatgaiatgg actcacaaag aatt^aaga aacactgrt ga®ggatag taaaatcaca 660 caccaatatt tatagttgtt acdagaa^ iatagaaai^ atalatgtta aaacttactt 720 aagttag 727 <210>61 <2U>727
<212>DNA <213>人類間質肺病毒 <400>61 atgtclc^ca aa^tcxatg caastatgaa gLacggggca agtgcaacag gggaagtgag 60 tgcaaactca accacaarta ctggagctg£ cctgataggt atMtgtt aagatcaaat ΥΚϊ tatctcttaa atcagcm aag^acadt gataaggctg atgsirgtc aateatatca ISO ggagcaggta gagaagatag gactcasgac tttgttcttg gttctacto ^tggttcaa 240 g£gcacattg ataacaatca aggaataaca aaggctgcag cttgctatag tctacataac 3CX) ataataa^u: agctacaaga .aatagaagta agacaeecta gagataataa gcmctgac 360 agcmcatg rggcacttca caacttgata ttatcctata igg^atgag caaaactcct 420 gcatccctp t^ataacct aaaga^cta ccaagagaaa a^tgaas^ attagcga&a 4S0 ttaataaicg ataatcagc aggaactgat aatgactctt catatgcctt gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtaagcat^ tcccaaattc attaccatag aggcagatga 6CK) talgatai^g socacaaag ^Uaaagga gacactgtci gatg£gatas taaaatcaca 660 caccaatatt tacagttgtt atttagaaaa catagaaata ataiai^tta aegcttactt 720 aagtmg 727 <210>62 <21I>254 <212>蛋白質 ^&人類間質肺病毒 <400>62
Met Gla Ser Tyr Leu Vai Asp Thr Tyr Gin Gly Πβ Pro Tyr Thr Ala 1 5 10 15
Ala Val Gta Val Asp Leu De Glu Lys Asp Leu Leu Pro Ala Ser Leu 20 25 30
Thr Be Trp Phs Pro Leu Pke Gta Ala Asn Thr Pro Pro Ala Val Leu 35 40 45
Leu Asp Gta Leu Lys Thr Leu Ihr fle Thr Leu Tyr Ala Ala Ser 50 55 60 ,
Gin Asn Gly Pro Ik Leu Lys Val Asn Ala Ser Ala Gin Gly Ah Ak 65 70 75 80
Met Ser Val Leu Pro Lys Lys Pfce Glu Val Asn Alalhr Val Alal^u 85 90 95
Asp Gla Tyr Ser Lys Leu Glu Hie Asp Lys Leu Thr Val Cys Giu Val 100 105 110
Lys ΊΊΐΓ Val Tyr Leu Thr Thr Mel Lys Fro Tyr Gly Met Val Ser Lys -66· 144243-序列表.doc 201009079 115 120 125
Phe Val Ser Ser Ala Lys Ser Val Gly Lys Lys Thr His Mp Leu He 130 135 140
Ala Leu Cys Asp Phe Met Asp Leu G2a Lys Asa Tlir Pro Val Thr De 145 150 155 160
Pro Ala Phe De Lys Ser Val Ser He Lys Glu Ser Glu Ser Ala Thr 165 l?0 175
Val Glu Ala Ala Be Ser Sar Glu Ala As? Gta Ala Leu Thr Gin Ala 180 185 190
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Pro Lys Giy He Phe Lys Lys Leu Gy Ala Qy Thr Gin Val He Val 210 215 220 G!u Leix Gly Ak 了沒 Val Gin Ala Glu Ser Be Ser Lys De Cys Lys 225 230 235 240
Thr Trp Ser His Gin Gly Thr Arg Tyr Val Leu Ser Arg 245 250
<2I0>63 <211> 254 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400> 63 . ·
Met Glu Ser Tyr Leu Val Asp Thr Tyr Gin Gly lie Pro Tyr TTir Ala 1 5 , 10 · 15
Ala Val Gin Val Asp Leu Val Glu Lys Asp Leu Leu Pro Ala Ser Leu 20 25 30
Thr He Trp Hie Pro Leu Phe Gin Ala Asn Thr Pro Pro Ala Val Leu 35 40 45
Leu Asp Gin Leu Lys Thr Leu Thr De Thr Hr 3Leu Tyr Ala Ala Ser 50 55 60
Gin Ser Giy Pro lie Leu Lys Val Asn Ala Ser Ala Gin Gly Aia Ala 65 70 · 75 80
Met Ser Val Leu Pro Lys Lys Phe Glu Val Asn Ala Thr Val Ala Leu 85 90 95
Asp Glu Tyr Ser Lys Leu Glu iTie Asp Lys Leu Thr Val Cys Glu Val 100 105 110
Lys Thr Val Tyr Leu TTir Thr Met Lys Ργό Tyr Gly Met Val Ser Lys 115 120 125
Phe Val Ser Ser Ala Lys Ser Val Gly Lys Lys Thr His Asp Lea He 130 135 140
Ala Leu Cys Asp Phe Met Asp Leu Glu Lys Asn Thr &〇 Val Thr lie 145 150 155 160
Pro Ala Phe He Lys Ser Val Ser lie Lys Glu Ser Glu Ser Ala Thr 165 170 175
Val Glu Ala Ala lie Ser Sear Glu Ala Asp Gin Ala Leu Thr Gin Ala 180 185 190
Lys De Ala Pro Tjor Ala Gly Ixu De Met fle Met Thr Met Asn Asn 195 200 205
Pro Lys Gly He Phe Lys Lys Leu Gly Ala Gly Tnr Gin Val De Val 210 215 220
Glu Leu Gly Ala Tyr Val Gin Ala Glu Ser lie Ser Lys lie Cys Lys -67- 144243-序列表.doc 201009079 225 230 235 240
Thr Trp Ser His Gk Gly Thr Arg Tyr Val Lsu Lys Ser Ser 245 250 <2I0>64 <211> 254 <212>蛋白質 ^&人類間質肺病毒 <40ft>64
Met Glu Ser Tyr Leu Val Thr Tyr Gin Gly Ite Pro Tyr Thr Ala I 5 10 15
Ala Val Gin Val As〇 Leu Val Qlu Lys Asp Leu Leu Rx> Ala Ser Leu 20 25 30
Thr lie Tip Ric Pro Leu Phe Gin Ala Asn Thr Pro Pro Ala Val Leu 35 _ 40 45
Leu Asp Gin Leu Lys Thr Leu Thr He Thr Thr Leu Tyr Ala Aia Ser 50 55 60 <31n A^e Gly Pro De Leu Lys Val Asn Ala Sor Ala Gin Gly Ala Ala 65 70 75 80
Met Scr Val Leu ?to Lys Lys Pbc Glu Val Asn Ala Thr Vd Ala Leu 85 90 95
Asp Glu Tyr Ser Lys Leu Asp Phe Asp Lys Leu Thr Vd Cys Asp Yal 100 、 105 110
Lys Thr Val Tyr Leu Thr Thr Met Lys Pro Tyr Gly Met Val Scr Lys 115 120 125
Phe Val Ser Ser Ala Lys Ser Val Gly Lys Lys TSir His Asp Lea De 130 135 140
Ala Leu Cys Asp Phe Met Asp Leu Glu Lys Asn He Rro VaJ Thr lie 145 150 155 160
Pro Ala Plie Ifc Lys Ser Vai Set lie Lys Glu Ser Gh So: Ala Thr 165 170 175
Val Glu Ala Ala He Sex Ser Glu Ala Asp Gin Ala Leu Thr Gin Ala 180 185 190
Lys He Ala Pro Tyr Ala Gly Leu He Met lie Met Thr Mel Asn Asn 195 200 205 Ρω Lys Gly lie Fhc Lys Lys Leu Gly Ala Gly Tar Gin Val lie Val 210 215 220
Glu 3Leu Gly Ala Tyr Val Qn Ala Glu Ser lie Ser An De Cys Lys 225 230 235 240
Ser Trp Scr His Gla Gly Thr Arg Tyr Val Leu Lys Ser Arg 245 250 <210> 65 <211> 254 ' <212>蛋白質 <^3>人類間質肺病毒 <4〇〇>65
Met Glu Ser Tyr Leu Val Asp Thr Tyr Gin Gly lie Pro Tyr Ίϊτ Ala 15 10 15
Ala Val Gin Val A^p Leu Val Glu Lys Asp Leu Leu Pro Ala Ser Lea •68-
144243-序列表.doc 201009079 20 25 30
Thr Ήο 7tp Phe Pro Lm Hie Gin Ala Asa Thr fto fto Ala Val Leu 35 40 45
Leu Asp Gin I^u Tk to Thr Qe Thr Thr Leu Tyr Ala Ala $cr 50 55 60
Gin Asn Gly fto lie Leu Lys Val Asn Ala Ser Ak Gta Glv AJa Ak 65 70 75 80
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Asp Gh Tyr Ser Lys Leu Asp Phe Asp Lys Leu 1¾ Val Cys Asp Val 100 105 110
Lys Thr Val Tyr Thr Thr Met Lys Rro Tyr Gly Met Val Ser Lys 115 120 125
Phe Val Ser Set Ala Lys Ser Val Gly Lys Lys Thr His Asp Leu Ite 130 135 140
Ala Leu Cys Asp Phe Nfct Asp Leu Giu l^s Asn lie Pro Val Thr fls 145 150 155 160
Pro Ala Phe lie Lys Ser Val Ser De Lys Gbx Scr Glu Ser Ala Thr 165 170 175
Val Glu Ala Ala He Ser Ser Giu Ala Asp Gla Ala Leu Thr Gin Ala 180 185 190
Lys De Ala Pro Tyr Ala Gly lm lie Met lie Mel Πττ Met Asn Asn 】95 200 205
Pro Lys Gly Ik Phe Lys Lys Leu Gly Ala Gly Thr Gin Val lie Val 210 215 . 220
Glu Leu Gly Ala Tyr Val Gin Ala Giu Scr De So: Ars Π6 Cys Lys 225 230 235 240
Ser Trp Ser His Gin Gly Tbt Arg Tyr Val Leu Lys Ser Aj^ 245 250 <210> 66 <21I>765
<212>DNA <213>人類間質肺病毒 <40Q>66
atggsgtcci xccagtaga c^ccatcaa ggeadeett acacagcagc tgucaagit 60 g^ctaatag aaaaggxct gtoctsca agcclaacaa tatggUccc tttguts^ 120 ^caacacac c$jcx$gcBgt getgetegat cagctaa&aa aaccacu:tg ISO mgc^czt cacaaaa^g u^aatac^c catcagccca aggtgcagca 240 atgtcigtac ttecaaaaa atttgaagee aat^gactg tage^tega tgaaiatagc 3(X) aaac^gaat ttgacaaact cacagtc^t gaagtaaaaa cagtttadi aac^ccatg 3K) aasccai^rg g^tggiatc aaaatttgtg agc^cagcca aatcagttgg maaaasca 42D catga^aa tcgcactatg tgatutatg gatet^aaa a^aacacacc tgtt^Kaata 480 c^gcattca tcaaatcagt ttcaatcaaa gagagigagt cagctac^t tgaagcigct 540 ataageagtg aagcagacca agctctaaca cagga:aaaa ttgcaccita tgeg^atta 600 attafgatca tp^taigaa caatcccaaa g§catattca aaaascttgs agcigg^ct 660 ceagtcaiag tagaactsgg ageataegu: caggctgaaa gcamagcaa aatatgcaag 720 acagga^cc atcaagggac aa^aia^tc ttgaagtcca gat&a
<210>67 <2U>765 <212> DNA 69· 144243-序列表.doc 201009079 <213>人類間質肺病毒 <400>67 aigg^tcct atciggtaga cacttaicaa ggcatcccu acacagcagc tgucaa£tt 60 gaictagcag aaaag^icct grtiwxtgca agcctaacaa taiggUccc atgtitcag 120 gccaatacac cgccagcagt tctgcttgat cagctaaa^i ctctgacut aaclxlctg 180 tatgctgcat cacaaagtgg tccaaiacta aaagtgaa^ catcagccca gggtgcagca 240 atgtctgtac ttcccaaaaa gttlgaagtc aa^cgactg tagcacttga cgaatatagc 300 aaanagaat ctgacaaacc tacagtctgc gaagtaaaaa cagmctt aacaso:atg 360 aaaccata^ sgamtatc aaagttcgtg agcic££cca aaticagtt£g ommacz 420 catgatctaa tcgcaUatg tgatutatg gatcia^aa agas:acacc agitacaaia480 ccagcattta tcaaatcagt rtctatcaag gagagtgaat cagccactgt igaagctgca 54〇 ataagcagtg aagc^cca agctciaaca ca^ccaaaa itgcacctta tgcgg^actg 600 atcatpcta ^accatgaa caatcccaaa sgcatattca agaagcttgg sgctgggacc 660 caagnatag tagaactagg agcaiatgtc caggctg^a gciaiaagtaa aata^caag 720 acttg^gcc atcaaggaac aagatatgig ctgaagtcca gttaa 765 <210>68 <21I>765
<212>DNA <213>人類間質肺病毒 <40Q>68
aiggag^ct aiciagtaga cacuatcaa ggcattccat aiacagctgc tgttcaagtt 60 gacctgglag aaaaagaut ^tgccagca agtttg^aa tat^tuco rttaiacag 120 ^xaacacac caK：agcagt tc^cctgai cagctaaaaa ccttg^^t aacaaclctg 180 ^tgc^cai: cacagaatgg tccaatactc aaggtaaatg catctgccca aggtgctgcc 240 atg^tgtac Ucccaaaaa attcgaggta aatgcaactg tagcacttga tgaatacagt 300 a^tcttgatx ctgacaagct gacggtct^: gatgttaaaa cagmattt gacaactstg 360 aa^cgtacg ggatggtgtc aaaatttgtg agt^ag^ aatcagttgg caaaaagaca 420 catp&ctaa ttgcactats tgacttcatg gacctagaga aaaataiaix tgtsacaata 480 ccagcattca tasa^cagt ttcaatcaaa gagagtgaat cagccactgt tgaa^tgca 540 aia^cagcg aagocgacca agccttgaca caagccaaga tti^gcxc^ tgcagsecta 600 attatgacca igaccat^i caaiccaa^ ggtataaca agaaactagg ggctggaaca 6^} caagtgalag tagagctggg ggcatatgtt caggctgaga gcatcagtag gatctgcaag 720 agctggagtc ^caa^aac aagatac£ta ctaaaatcca ^itaa 765 <210>69 <2il> 765 <212>DNA <213>人類間質肺病毒 <400>69 atggagtcct atctagtgga cacuatcaa g£cattcca acacagcigc tEttcaaett 60 gatctggtag ^aaagactt actaccagca agatgacaa talggittcx tctattccaa 120 gccascacac caccagcggt tttgctcgat cagctaaaaa cctigactat aacaactctg 180 tatgctgcat cacagaatgg tccaaroc^ m^BBm catcagctca sggtgc^ct 240 a^ictgtac ttoxasaaa atmgaagta 雄壤〇^3〇这 rggcadxga t辟atac^c 300 aaacttgaci agacaagtt a^ggtugq gatgttaaaa cagtaaot ^caaccatg 360 aagccatatg ggatggtgte aaaatttgtg agik^Lgcca aatcagi^g caaaaagaca 420 catgatctaa ttgcjctgtg tgacttcatg gacctagaga aaaarataicc tgtgacaata 4¾) ccagcattca tmstcagt ttcaatcm gagagtgagt cagccactgt tgaagctgca 540 ataagcagtg assccgacca agcauaaca caagccaa^ tlscacccta t^aggacta &X) atcaigaLca tgaccacgsut caatccaaaa sgtaiac^a aiaaacutgg agctgeaaca 660 -70-
144243-序列表.doc 201009079 caagtgatag tegagctagg ggiatatgtt «^cc^®a gcatcagcag gatctgcsag 720 agctggagtc sccaaggaac aagaiatgta ctaaaatcca gaiaa 765 <210>70 <211>394 <2】2>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400>70
Met Ser Leu Gin Gly He ifis Leu Ser Asp Leu Scr Tyr Lys His Ala IS 10 15
He Leu Gla Set Gin Tyr Thr Πε Lys Arg Asp Val Gly Thr Thr 20 25 30
Thr Ala Val Ήιτ Pro Ser Ser I^u Gb Gb Glu lie Thr Leu Lea C>^ 35 40 45
Gly Glu He 3Leu Tyr Ala His Ala Asp Tyr Lys Tyr Ala Ala Glu 50 55 仞
lie Gly De Gin Tyr lie Ser Thr Ala leu Gly Ser Glu Aig Val Gin 65 70 75 80
Gla De Leu Arg Asn Scr Gly Scr Gla Val Gin Val Val Leu Hr Aii 85 SO 95
Thr Tyr Ser Lea Gly Lys De Lys Asn Asn Lys Gly Glu Asp Leu Gin 100 ' 105 no
Met Leu Asp He His Gly Val Glu Lys Ser Ttp Val Glu Glu He Asp 115 120 125
Lys Glu Ala Arg Lys Thr Met Ala Thr Lea Leu Lys Glu Ser Sar Gly 130 135 140
Asn lie Pro Gin Asn Gin Arg Pro Ser Ala E^o Asp Thr Pro He He 145 150 155 160
Leu Leu Cys Val Gly Ala Lea De Phc Thr Lys L«i Ala Ser Thr lie 165 170 175
Glu Val Gly Leu Gla Thr Thr Val Arg Aig Ak Asn Arg Vai Leu Scr 180 185 190
Asp AJa Leu Ljs Arg Tyr Pro Aii Met il« Pro Lys lls Ala Aig 195 200 205
Ser Phe Tyr Asp Leu Phe Glu GLn Lys Val Tyr His Axg Ser Leu Phe 210 215 220
De Gla Tyr Gly Lys Ala Leu Gly Ser Ser Ser Thr Gly Ser Lys A3a 225 230 235 240
Glu Ser Leu Phe Val Asn Πε fte Met Gin Ala IVr Gly Ala Gly (Bn 245 250 255
Thr Met Leu Ax§ Trp Giy Val De Ala Arg Ser Ser Asn Asn De Met 260 265 270
Leu Gly His Val Ser VaL Gin Ala Qu Leu Lys Gb Val Thr Glu Vai 275 280 2S5
Tyr Asp Leu Val Arg Glu Mm Gly Pro Gin Ser Gly Leu Leu His L«i 290 295 300
Aig Gin Ser Pro Lys Ala Gly Leu Lai Ser Leu Ak 々n Cys Pro Asn 305 310 315 320
Phe Ala Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ser Gly Leu Gly He lie Gly 325 330 335
Met Tyr Arg Gly Arg Vd Pro Asn Thr Glu Leu Phc Scr Ala Ala Glu 340 345 350
Ser Tyr AJa Lys Ser Leu Lys Glu Ser Asn Lys He Asn Phe Scr Scr -71 - 144243-序列表.doc 201009079 355 360 365
Leu Qly I<eu Ήιτ Asp G3u Qlu Lys Glu Ala Ala Glu His Phe Leu Asn 370 375 380
Va) Ser Asp Asp S& Ola Asn Asp Tyr Ola 385 390 <210>71 <211>394 <2i2>蛋白質 <2丨3>人類間質肺病毒 <400>71
Met Sw Leu Gin Gly lie His Lm Sar Asp Leu Ser Tyr Lys His Ala 15 10 15 lie Lea Lys Glu Ser Gb» Tyr Thr I3c Lys Arg Asp Val Gly TTir Thr 20 25 30
Thr Ala Val Thr Pro Ser Ser Leu Gin Gin Glu IteThr Lsu Leu Cys 35 40 45
Gly Glu He ixu Tyr Ala Lys His A]a Asp Tyr Lys Tyr Ala Aia Glu 50 55 60
He Gly lie Gin Tyr lie Ser Thr Ala Leu Gly Ser Glu Arg Val Gin 65 70 75 80
Gte lie Leu Arg Asn Ser Gly Ser Glu Val Gin Val Val Lea Thr Arg 85 , 90 95
Thr Tyr Ser ieu Gly Lys Val Lys Asn Asn Lys Gly Glu Asp Leu Gin 100 105 110
Met Leu Asp Be His Gly Vai Glu Lys Ser Trp Val Glu G3h He Asp 115 120 125
Lys Glu Ala Arg Lys Thr li&t Ala Th· Leu Lea Lys Gin Ser Ser Gly 130 135 140
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Leu Lea Cys Val Gly Ala Leu lie Phe Thr Lys Leu Ala So： Thr De 165 170 175
Glu Val Gly Leu Glu Thr Thr Yal Ars Arg Ak Asn Arg Val Leu Ser 180 185 190
Mp Ak Leu Lys Arg Tyr Pro Aig Met Asp De Pro Lys lie Ala Axs 195 m 205
Ser Phe Tyr Asp Leu Phe Glu Gin Lys 'Van'yr Tyr Axg Ssr Leu Ftic 210 215 220 lie Gla Tyr Gly Lys Ala Leu Gly Sesr Ser Ser Thr Qy Sa· Lys AJa 225 230 235 240
Glu Ser Leu Phe Val Asn De Phe Mst Gin Ala Tyr Gly Ala Gly Gin 245 250 255
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Leu Gly His Vat Ser Val Gin Ala Clu Leu Lys Gin Vai Thr Gla Val 275 280
Tyr Asp Leu Vai Arg Gh Met Gly Pro G3u Ser Gly Leu Lai His Lsu 290 295 300
Arg Gin Scr Pro Lys Ala Gly Leu Lea Scr Leu Ala Asn Cys Pro Asn 305 310 315 320
Phe Ala Ser Val Val Leu G 丨y Asn Ala Gly Leu Gly lie lie Gly -72- 144243-序列表.doc 201009079 325 330 335
Met Tyr Arg Gly Arg Val Pro Asn Thr G!a l^u Phe Ser Ala Ala Olu 340 345 3M
Ser Tyr Ala Lys Sei Leu Lys Glu Ser Asn Lys lie Asn Phe Ser Ser 355 3® 365
Leu Gly Leu Thr Asp Glu Glu Lys Glu Ala Ala Glu His Phe Lsu Asn 370 375 380
Val Ser Asp Asp Ser Gin Asn Asp Tyr Glu 385 390 <210>72 從 1；> 394 <212>蛋白質 <^3>人類間質肺病毒
<400>72
Met Sh Leu G!q Gly De His Leu Ser Asp Leu Ser Tyr Lys His Ala 1 5 10 15
He Leu Lys Glw Scr Gin Tyr Ter lie Lys Arg Asp Val Giy Thr 1¾ 20 25 30
Thr Ala Val Thr Pro Sw Sex I«a Gin Gin Glu De Thr Leu Leu Cys 35 40 45
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Met Leu Asp lie His Gly Val Glu Lys Ser Trp He Glu Glu De Asp 115 120 125
Lys Glu Ala Acg Lys TTtr Met Val The Leu Leu Lys Glu Scr Scr Gly 130 135 140
Asn lie Pro Gin Asn Gin Arg Pro Ser Ak Pro Asp Thrfto De De 145 150 155 160
Leu Leu Cys Val Gly Ala Leu De Phe Thr Lys Leu Ala Ser 1¾- lie 165 Π0 175
Glu Val Gly Leu Glu Thr Hr Val Arg Arg Ak Asm Arg Val Lrn Ser 180 185 190
Asp Ala Leu Lys Arg Tyr Pra Ai? He Asp He Rd Lys He Ak Arg 195 200 . 205
Ser Phe Tyr Glu Leu Phe (?lu Gin Lys Val Tyr Tyr Ais Ser Leu FiK 210 215 220
Be Glu Tyr Gly Ala Leu Gly Ser Ser Ser Thr Gly Ser Lys Ala 225 230 235 240
Glu Ser Leu Phe Val Asn lie Phe Met Gh Ala Tyr Gly Ala Gly Gin 245 250 255
Thr Leu Leu Arg Trp Gly Val lie Ala Arg Ser Ser Asn Asn He Met 200 265 270
Leu Qy His Val Ser Val Gin Ser Glu Leu Lys Gin Val Thr Glu Val 275 280 285 -73- 144243-序列表.doc 201009079
Tyr Asp Leu Val Arg G!u Met Gly Pro Glu Scr Gly Leu Leu His 290 295 300
Arg Gin Scr Pro Lys Ala Qy Leu Leu Ser Leu Ala Asn Cys Pro Asn 305 310 315 320
Phe Ala Ser Vai Val Leai Gly Asn Ala Sea* Gly Leu Gly lie Dc Gly 325 330 335
Me£ Tyr Arg Gly Arg Val Pro Asn Thr Glu Leu Hie Ser Ala Ala Ghi 340 345 350
Ser Tyr Ala Arg Ser Lea Lys Glu Ser Asn Lys lie Asn Phe Ser Ser 355 360 365
Leu Giy Leu Thr Asp Glu Glu Lys Glu Ala Ala Qu His Pte Leu Asn 370 375 380
Met Scr Gly A^p Asn Gin Asa Asp Tyr Gla 385 390 <210>73 <211>394 <212>蛋白質 ^^人類間質肺病毒 <400>73
Met Ser Leu Gin Gly lie His Leu Ser Asp Leu Ser TVr Lys His Ala 1 5 10 15
De Leu Lys Glu Ser Gin Tyr Hir lie Lys Arg Asp Val Gly TT»r Thr 20 25 30
Thr Ala Val Tnr Ero Scr Siar Lea Gh Gin Glu Qe Thr Leu Leu Cys 35 40 45
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De Gly He Gin Tyr lie Cys Thr Ala Leu Gly Ser Glu Arg Val Gla 65 70 75 80
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Met Uu Asp lie His Gly Val Gla lys Ser Tip Val Ghi Glu He Asp 115 120 125
Lys Glu Ala Arg Lys Thr Met Val Thr Leu Leu Lys Glu Ser Ser Gly 130 135 140
Asn lie Pro Gin Asii G]n Aig Pro Ser Ak Pro Asp Thr Pro De He 145 】50 155 160
Lea Leii Cys Val Gly AJa Leu Be Hie Thr Lys Leu Ala Ser Thr He 165 170 . 175
Glu Val Gly Leu Glu Ha: Thr Val Arg An Ala Asn Arg Val Leu Ser 180 185 190
Asp Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Arg Vai A^p He Pro Lys lie Ala Arg 195 200 205
Ser Phc Tyr Glu Leu Phc Glu Gto Lys Val Tyr Tyr Ars Ser Leu Phe 210 215 220
He Gla Tyr Gly Lys Ala Leu Gly Ser Ser Ser Thr Gly Ser Lys Ala 225 230 235 240
Glu Ser Leu File Val Asn De Phe Met Gin Ala Tyr Gly Ala Gly Gin 245 250 255 -74-
144243-序列表.doc 201009079
Iht Met Leu Arg Tip Giy Val He Ala Axg Ser Ser Asn Asn De Met 260 265 270
Leu C3!y His Val Ser Val Gin ASa Glu Leu Lys Gin Val Thr Gto Val 275 280 285
Tyr Asp Leu Val Arg Glu Met Gly Pro Glu S^: Gly Im Lea His Leu 290 295 300
Arg Gin Ser Vto Lys Ala Gly 3jeu Leu Ser Leu Aia Aai Cys Rpo Asn 305 310 315 320
Rie Ala Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ser Gly Leu Gly fie lie Gly 325 330 335
Met Tyr Arg Gly Arg Val R:o Asn Thr Glu Leu |%e Ser Ala Ala Glu 340 345 350
Ser Tyr Ala An： Ser Leu Lys Glu Ser Lys lie Asn Phe Ser Ser 355 3m 365
Lea Gly I^ti Thr Asp Glu Glu Lys Glu Ak Ala Glu His Phc Leu Asn 370 375 380 _ Met Ser Asp Asp Asn Gin Am Asp Tyr Glu ❹ 385 390
<2I0>74 <211> 1185 <2I2>DNA <213>人類間質肺病毒 <400> 74 atgtetette aagggattca cctgagtgat ttatcamca agcatgptax zmmg$g 60 tctcagtaca caataaaa^g agatgtgggt acaacaactg cagtgacacc cicatcattg 120 caacaagaaa taacactgit gtjg^gagaa attcigtatg ctaaacatgc rg^tacm 180 tatgctgcag acaatatatt agcacagca lagsatoaga gapgtgcag 240
cs^attctga £gaactca^ cagtgaaglc caagtggtct taaccagaac gtactctets 300 gg^iaaatta aaa^raataa aggagaa^at ttacagatgt tagacataca cggggtaga^ 360 ^gagctggg tagaagagat agacaa^aa gcaaggsaaa caatggcasc ettgettaag 420 gaatcatcag gtaatatccc acaaaau:ag ^gcccteag caccagacac acccataatc tiaitatgtg laggtgcctt aataticact aaactagcat caaccataga agtgggam 540 gagaccacag teaga^gge taaccgtgtactaagtga^ cacU:aagag ataccciaga 600 magai^c cagatccuc tatgaettat ttgaacaaaa astsiateac 660 agaagtngt icaitgagi^ ggea^gea oaggeteat catct^gg cagcaaagca 720 gaaagiciat rtgttaatat attcatgcaa gct^tgggg ccggc^c aatgetaagg 780 tggggggtca ttgccaggtc ataaigttag gacatgtatc cgtccaagct 840 g^tUaaac agjgu：aca^ agteiatgae ttggtgci^ aa^gggccc tgaaictgga 900 cactacatt taaggcaa^ cccaaaagct ggactgtiat cactagaaa ctgtcccaac 960 ttxgcaagig ttgnctcgg saaigcxtca ggettaggea taatcjggiat gtatcgaggg 1(K0 agagtaccaa acaQagaatt artttca^a ^tgaaagtt atgccaaaag trtgaa^aa 1G80 agcaataaaa laaautctc Ucallagga cUacaga^ aagag22aga ^c^cagaa 1140 camcrt^i acgtgagtga cgacag^sa ^igaitatg asms 1185
<210>75 <211> 1185 <212>DNA <213>人類間質肺病毒 <40075 agtotctu： aagggattca at^igtgac ctatcaaca ageatgetat sttaaaagag 60 -75 - 144243-序列表.doc 201009079 tctcagtata caataaagag agat^iagsc acaacaaccg cagigacacc ctc&to&ttg 120 caacaagaaa taacactait etgtggagaa attctaialg ciaagcatgc tgatmc&aa 180 latgctgcag aaataegaal acaatatatt agcacagctc ^ggatcaga gagagtacag 240 cagattctaa gaaactcagg tagtgaagtc c^gtssttt taaccagaac gtaciccttg 3(X) gggaaagtta aaaacaacaa aggaga^gat ttacagatgl tagacataca cggagtagag 36Q aaaagc^g tggaagagat agacaaagaa gcaagaaaaa caatggca^ utgctmaa 4% gaatcatcag gcaatattcc acaaaa^ aggccttca^ cacc^acac acccataatc 480 ttattatgtg taggtgcctt aatatttacc aaactagcat caactataga agtgggatta 540 gagaccacag tca^aagagc taaccgtgta ctaagt^ttg cactcaaaag ataccctagg 600 atggacatac caaaaatcgc tagatctttc tai^acttat usaamaa a^tgtauac 660 agaagmgt tcattgagta tggcaaagca ttaggctcat cctctacagg cagcaaagca 720 gaaaftttac tcgttaatat aitcatg^a gotiacgg^： ctg^raaac aa^ctgagg 780 tggggagtca ttgccaggrc atctaacaat ataatgttag gacaigtacc tgitc^igct 840 gagttaaaac aagtcaca^a agtctatgao ctggtgcg&g Bmgggccc tgaatctggg 90Q ctcclacaU iaa^gcsiaag cccaaaagct sgactgitat c&ctagccaa ttgtcccaac 960 tUgctagts ttsttclcsg caatgcctca ggcdaggca taataggiat giatcgcggg 1020 agastgccaa acacagaact attttcagca gcaga^igct a^ccaagag tttgaaas&a 1080 agcaataaaa ttaactntc Ucattagga ctcac^atg &a£&aaaaga sgcigcagaa 1140 cacttcct^t atgtgagtga cgacagtcaa aai^aMg agfaa 1185
<210>76 <211> 1185 <212>DNA <213>人類間質肺病毒 <4〇C>76 atgtdctic aagggattca cctaagtgai datcatala aacatsctai attaaas^ Θ0 tctcaataca caataaaaag agaigtaggc accacaactg cagigac&cc ttcatcaua 120 caacaagaaa taacacmi gtgtggggaa a^tttaca ctaaacacac igaoacaaa 180 tatgctgctg agataggaai ecaatautt tgc^asc^ u^plc^a ^g^tacaa 240 cagattuga s^ctca$g ta£tgaastt cagg^gttc laaccaaaac 300
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<211> 1185 <212>DNA <213>人類間質肺病毒 <400>77 stgtctcttc aagggattca ccraagtgat ctgtcatata aacatgciat attaaaagag 60 -76- 144243·序列表.doc 201009079
tctc^t^a caataaaaag a^igtaggc acc^mctg cagtgacacc ttcatcattg 120 cagcsagaga ^acacdit gtstggagag Mtctltaca ctaaacaiac tgattacsaa 180 tatgctgcag agatagggat acaatatatt tgcacagctc taggatcaga a^agtacaa 240 cagattttaa gaaattcagg tagtga^tt caggtgg^: taaccaagac atacccuta 300 ggga^ggta ^aatastaa aggggaagag ttgcaaa^t tagatataca tggagtggaa 360 aagagtlggg tagaagaaal agacaaaga£ gcaagaaa^ caatggtgac tttgctaaag 420 g^tcatcajg gcaacatcxc acaaaaccag aggccttcag caccagacic acxaataatt480 ttangtgtg laggtgciu aatattcact aaactagcat c^caataga agttggacta 540 gagactacag ttagaagggc taacagagtg ttaagtgatg cgctcaaaag at^cctagg fi)0 gtagatatac caaagattgc tagatctut tat^actat ttgsgc^gaa ag^t^tac 6ft) aggagtctat tcatfeagta tgggaaagct ixaggcicat cltcaacagg aagcaaagca 720 gaasgttrgt tigtaaatat atttatgcaa gcttatggag ocggtcagac ^tgcta^g 780 tggggtgtca ttgc^gatc stctoca^: ataatgctag ggcatgtatc tgtgcaagct 840 gaattgaaac aagttaca^i ggtttafeat ttggtaagag gaatgggtcc tgaataggg 9CX) cttttac^lc t^igacaaag iccaaaggca g^cigttat cgrtggctaa ttgccccaat 9¾) tttgctagtg ttgucttgg taatgcttcaggtctaggta taatcggz^t g^cagggga 1020 agagtgcraa acacagagct atttfc^ca gcagaaagtt ai^cagaag cttaaaagaa 10K) agcaacaaaa tc^cttctc ctcattaggg cicacagacg aajg：aaaa^a asctgcagaa 1140 cacr^ttaa acstgagiga tgacaatcaa gatpttatg agtaa 1185 <210>?8 <211>294 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 ： <40D>78
Met Ser Phe Pro Glu Gly Lys Asq Be Leu JHie Met Giy Asn Glu Ala 1 5 10 IS AJa Lys Leu Ala G3u Ala Pte Gin Lys Ser Leu Arg Lys Pro Gly His 20 25 30
Lys Ail Ser Gin Ser lie lie Gly Glu Lys Val Asn Thr Val Ser Glu 35 4Q 45
Thr Lai Glu Lea Pro Thr Be Ser Aig Pro Ala Lys Pro Thr lie Pro 50 55 60
Ser Gla FVo Lys Leu Ala Trp Thr Lys Gly Gly Ala Thr Lys Thr 65 70 75 80
Glu Be Lys Gin Ala lie Lys Val Met Asp ?ro lie Glu On Giu (Hu 85 90 95
Ser Ife Glu Lys Lys Val Lea Pro Scr Scr Asp Gly Lys Thr Pro Ala 100 105 UO
Glu Lys Lys Lea Lys Pro Ser 1¾ Asa Thr Lys Lys Lys Val Ser Phe 115 120 125
Thr Asa Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Lys Leu Gta Lys Asp Ala Leu 130 135 140 ·
Asp Leu Leu Ser Asp Asn Giu Glu Gto Asp Ala Glu Ser Scjt He Lea 145 150 155 160
Thr PSk Glu Glu Arg Asp Thr Ser Ser Lu Ser He G]u Ala Leu 165 170 175
Glu Ser lie Glu Glu Lys Leu Sor Met Dc Leu Gly Leu I^u Arg Thr 180 185 190
Leu Asn lie Ala Thr Ala Gly Pro Thr Ala Ala Asp Gly Ue Arg 195 200 205
Asp Ala Met He Gly Val Arg Glu Glu Leu lie Ala Asp lie He Lys 210 215 220 -77- 144243-序列表.doc 201009079
Glu Ala Lys Gly Lys Ala Ala Glu Met Met Glu Glu Glu Met Ser Gin 225 230 235 240
Aii Ser Lys lie Gly Asn Gly Ser Vai Lys Leu Thr Glu Lys Ala Lys 245 250 255
Giu L«i Asn Lys lie Val Gla Asp Glu Ser Thr Ser Gly Gto Ser Glu 260 265 270
Glu Glu Glu Glu Pro Lys Asp TTir Gin Asp Asn Ser Gin Glu Asp Asp 275 280 285 lie Tyr Gin Lea He Met 290 <210>79 <21I>294 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400>79
Met Scr Phc Pm Glu Gly Lys Asp Be Leu Phc Met Gly Asn Glu Ala I 5 10 15
Ala Lys Leu Ala Glu Ala JFhe Gin Lys Ser Lea Arg Lys fto Asa His 20 25 30
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144243-序列表.doc 201009079
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<210> 82 <211> 88S <212> DMA <213>人類間質肺病毒 <400>82 atgtcaUcc ctgaagga^ agatattctt ttcatgggta acgaagcagc aaaauagca K) gaagctttcr agaaatcatt aagaaaacca gglcaiaaaa gatctcaatc tatta^igga 120 gaaaaagtga at^tgma: agaaacang gaattaccra ctatcag&g acctgcaaaa 180 ccaaccatac <^tcagaacc aaaguagca (eEacagata aaggcggggc a^caaaact 240 gaaataaagc aagaiatcaa agtca^gat xcatlgaas aagaagagtc tsuxgagaag 3(X) i^gtgctac cciccagiga tgo^mcc cctgcagaaa agaa^tgaa accatcaact 3&) -80-
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Met lie Thr Leu Asp Val He Lys Ser Asp Gly Ser Sa Lys Thr Cys 1 5 10 15
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Asp Leu Cys Arg Asn Lys Pro Lys Pro Ala Val Gly Val Tyr His He 145 150 155 160
Val Glu Cys His Cys He Tyr Thr Val Lys Trp Lys Cys Tyr His Tyr 165 Π0 175
Pro Thr Asp Glu Thr Gin Ser 180 -82- 144243-序列表.doc 201009079 <210> 87 <211> 179 <5】2>蛋白質 從^人類間質肺病毒 ‘ <400>87
Met lie Thr Leu Asp Val He Lys Set Asp Gly Ser Scr Lys Tlir Cys 1 5 10 15
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Ala Leu Lys L&u De Leu Ala Leu Leu Thr Phc Phc Thr De Ώιγ Dc 35 40 4S
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Lys Tnr Glu &r Lys Glu Asp Ser Ρϊο Ser Asn Thr Thr Va! 65 70 75 80
Thr Thr Lys Thi Thr Leu Asp Hfe Asp He Thr Gin Tyr Phe Lys Arg Q 85 90 95
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Lys He Scr Arg Asn Gin Cys Thr Asa De Thr Thr Lys Hie Leu 115 120 325
Cys Phe Lys Rx> Glu Asp Ser Lys He Asn Ser Cys Asp Ar^ Lea Thr 130 135 140
Asp Leu Cys Arg Asn Lys Ser Lys Set AJa Ala Glu Ala Tyr His Thr 245 150 155 160
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Pro He Asp <22Q>88 <2L1> 177 <212>蛋白質 φ <^3>人類間質膪病毒 <400>88
Met Lys Thr Leu Asp Val De Lys Sir Asp Gly Sar So: Glu Hir Cys 15 10 15
Asa Gin Leu Lys Lys lie lie Lys Lys His Ser Gly Lys Val Leu He 20 25 30
Ala Lea Lys Leu lie Leu Ala Leu Leu Thr Hse Phe Thi Ala Thr lie 35 40 45
Thr Vai Asa Tyi De Lys Val Gla Asn Asn Lai Gta Ala Cys Gin Pro 50 55 60
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Thr De Arg Pro Thr Pro Asp Pro Thr Val Val His His Leu Lys Aig 85 90 95
Leu De Gin Arg His Thr Asn Sw Val Tfar Lys Asp Scr Asp Thr Cys H30 105 110
Trp Arg lie His Lys Asn Gin Arg Ώγ Asn lie De Tyr Lys Pbe 115 120 125 -83- U4243-序列表.doc 201009079
Lett Cys Sear Gly Hie Thr Asn Ser Lys Gly Thr Asp Cys Gla Glu Ro 130 135 140
Tin AJa Leu Cys Asp Lys Lys Leu Lys Thr lie Val Glu Lys ifis Arg 145 】50 155 160
Lys Ala Glu Cys His Cys Leu His Thr Thr Glu Trp Gly Cys Lem His 165 170 175
Pro <210>89 <211>177 <2必蛋白質 類間質肺病毒 <400>89
Met Lys Thr Leu Asp Val Be Lys Ser Asp Gly Ser Ser Gtu Thr Cys 15 10 15 ·
Asn Gb Leu Lys Lys De lie Lys Lys His Ser Gly Lys Leu Leu De 20 25 30
Ala Leu Lys Lea lie Lea Ala Uu Len Thr Phe Phc Tfc Val Thr ISc 35 40 45
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Lys Ala Glu Cys His Cys Leu ffis Thr Thr Glu Trp Trp Cys Tyr Tyr 165 170 】75
Leu <210>90 <2H>552
<212>DNA <213>人類間質肺病毒 <400>90 aigataacat tasatsicat ta^^tgat gggtcttcaa aaacatgtac tcsux:tcaaa 60 aaaataatta a^accactc tggtaaa^tg cuattgtac ttaa^taat attagOUa 120 ccaacaittc tcacagiaac aatcaccaic aattatataa aagtggaaaa caau^tgcaa ISO atatgccagt caaaaactga atcagac^a aagssctcat caccaaaULO cacatcagtc 2Φ acaaccaasa ctacictaaa tcatgatatc acacsgtatt tiaaaagttt gatimagg 300 tatac&a£ct ctgcaalaaa c^tgacnca igct££aaaa taaaca^aa tcaatgcaca 3θΰ •84· 144243·序列表.doc 201009079 aaiataacaacataca^.tt ttMgtttt aaatctga2g acacaaaaac caacaattgt420 gataaactga cagatttatg cagaaacaaa ccaaaaccag cagttggagt giatcacata 480 gtag^itgcc attgtatata cacagttaaa t^aagtgct atcattaccc aaccgatgaa 540 acccaatcct aa 552 <2l〇> 91 <211>54〇
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<212>DNA <213>人類間質肺病毒 <400>93 ‘ atgaaaacat tagatgfcat aaaaagtgac ggatcctcag aaacaigtaa tcaaccc^a 60 aaaataataa aaaaacactc aggtaaattg cttattgcat taaaactgat att^cctta 120 tlgacsutt tcacastaac aattactgtt aagt^aaaa caamgcag 180 gcatgtcaat taaaaaatga ^cagacaaa ^tg^cacaa agctaaatac ^cal^aaca 240 acaaic^ac ccaa^ctga tctaaatgt^ gtacagtaci tgaaaaggct gattcagaaa 300 cacaccaact t^tcataaa agac^iagat acctgrtgga gaatacacac gaaicaatsc 360 acaaatataa aaatatalaa gUctts^t tts^ggttta tgsaucaac aastacagac 420 tgtgaagaac t^cagtttt aiglgacaaa aagtcaaaaa ccatgxaga aaaaca^gg 430 aaagcagagt gtcactgtct acat^aacc gagt^tggt gttattatct ttaa 534 -85 - 144243-序列表.doc

Claims (1)

  1. 201009079 七、申請專利範圍： 1. 一種嵌合型重組第3型牛副流感病毒（bPIV3)/第3型人類 副流感病毒（hPIV3)，其中該病毒包括： (i) 編碼bPIV3之N、P、Μ及L基因的核苷酸序列； (ii) 編碼hPIV3之F及ΗΝ基因的核苷酸序列，該核苷酸 序列係插入病毒基因組以取代編碼bPIV3之F及HN 基因的核苷酸序列；及 (iii) 異源核苷酸序列，其中該異源核苷酸序列包括編 碼呼吸道融合細胞病毒（RSV)多肽之核苷酸序列。 2. —種嵌合型重組第3型牛副流感病毒（bPIV3)/第3型人類 副流感病毒（hPIV3)，其中該病毒包括： (i) 編碼bPIV3之N、P、Μ及L基因的核苷酸序列； (ii) 編碼hPIV3之F及ΗΝ基因的核苷酸序列，該核苷酸 序列係插入bPIV3基因組之核苷酸位置5041及8529 間，以取代編碼bPIV3之F及HN基因的核苷酸序 列；及 (iii) 異源核苷酸序列，其中該異源核苷酸序列包括編 碼呼吸道融合細胞病毒（RSV)多肽之核苷酸序列。 3. 如請求項1或2之病毒，其中該RSV多肽係為RSV F蛋白 質、RSV G蛋白質或RSV F蛋白質之可溶性外部功能部 位。 4. 如請求項3之病毒，該異源序列係插入位置1或2或兩者。 5. 如請求項4之病毒，其中該異源核苷酸序列進一步包括 bPIV N基因終止/N基因起始區域，其中該N基因起始序 144243.doc 201009079 列與°亥N轉譯起始密碼子間之距離為1 〇個核苷酸。 6·如叫求項5之病毒，其中該RSV多肽之編碼序列之終點與 該Ν基因起始序列間之距離為65個核苷酸。 7·如凊求項4之病毒，其中該異源核苷酸序列進一步包括 bPIV Ν-p基因起始人終止區域，其中該ρ基因起始序列與 該N轉譯起始密碼子間之距離為83個核苷酸。 8. 如明求項7之病毒’其中該RSV多肽之編碼序列之終點與 §玄P基因起始序列間之距離為94個核苷酸。 9. 如請求項4之病毒，其中該異源核苷酸序列進一步包括 bPIV N-P基因起始/終止區域，其中該p基因起始序列與 該P轉譯起始密碼子間之距離為86個核苷酸。 10. 如凊求項7之病毒’其中該RSv多肽之編碼序列之終點與 該P基因起始序列間之距離為94個核苷酸。 11 · 一種嵌合型重組第3型牛副流感病毒（bPIV3)/第3型人類 副流感病毒（hPIV3)，其中該病毒包括： ⑴編碼bPIV3之Ν、P、Μ及L基因的核苷酸序列； (Π)編碼hPIV3之F及ΗΝ基因的核苷酸序列，該核苷酸 序列係插入病毒基因組以取代編碼bPIV3之F及HN 基因的核苷酸序列；及 (iii)異源核苷酸序列，其中該異源核苷酸序列包括編 碼增強的綠螢光蛋白質（eGFP)多肽之核苷酸序列。 12. 如請求項11之病毒，該異源序列係插入位置1或2或3或 4 〇 13. 如請求項12之病毒，其中該異源核苷酸序列進一步包括 144243.doc 201009079 bPIV N-Ρ基因起始/終止區域。 ⑷如請求項丨之病毒’其中該bPIV係為堪薩斯如邮)_品 系的牛副流感第3型病毒。 15. 如”月求項！、2&nj_14中任一項之病毒，其中該病毒之 基因組包括突變或基因修改。 16. 如請求項卜2及"至14中任一項之病毒，其中該病毒係 減毒的表現型或具有增強抗原性的表現型。 φ I7. 一種重組DNA或RNA分子，其編碼如請求項丨至16中任一 項之病毒的基因組。 18. —種疫苗調配物，其包括如請求項丨至16中任一項之重 組病毒及醫藥上可接受之賦形劑。 19. 如研求項18之疫苗調配物，其中該修改或突變係衍生自 天然發生的突變。 2〇·種免疫原調配物，其包括如請求項1至16中任一項之 重組病毒及醫藥上可接受之賦形劑。 Q 21 ·如凊求項20之免疫原調配物，其中該修改或突變係衍生 自天然發生的突變。 22· —種如請求項18或19之疫苗調配物或請求項2〇或21之免 疫原調配物的用途’其係用以製備用於在哺乳動物中治 療或預防呼吸道感染之醫藥品。 23. 根據申請專利範圍第22項之用途，其中該呼吸道感染是 RSV感染。 24. 根據申請專利範圍第22項之用途，其中該呼吸道感染是 RSV、hPIV感染或其組合。 144243.doc 201009079 25. 根據申請專利範圍第22項之用途，其中該哺乳動物是人 類。 26. 根據申請專利範圍第25項之用途，其中該人類個體小於5 歲。 27. 根據申請專利範圍第25項之用途，其中該人類個體小於2 歲。 28. 根據申請專利範圍第25項之用途，其中該人類個體罹患 呼吸道感染之外的疾病或病況。 29. 根據申請專利範圍第28項之用途，其中該疾病或病況是 胰囊性纖維變性、白血病、非·霍奇金氏淋巴瘤、氣喘以 及骨髓移植和腎臟移植。 30. 根據中請專利範圍第25項之用途，其中該個體是免疫減 弱的個體。 31. 根據申請專利範圍第25項之用途，其中該個體是老年 人。 144243.doc
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