TW201008596A - Stable protein formulations - Google Patents

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201008596 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明大致係關於包括CTLA4Ig分子之安定之調配物， 其包含用於經由包含（例如）諸如靜脈内（IV)及皮下（SC)之 途徑之各種途徑來投藥的凍乾及液體調配物。 【先前技術】 在過去20年_，重組DNA技術已使許多蛋白質療法商業 化。由於藉由大多數其他途徑之不良生物可用性、在臨床 φ 投藥期間更好之控制及更快之醫藥學發展，因而大多數傳 遞蛋白質藥物之習知途徑已為靜脈内（Iv)投藥。對需要頻 繁及長期投藥之產品而言，更要求皮下（sc)傳遞途徑作為 替代。當與預填充注射器及自動注射器裝置技術結合時， SC傳遞容許在家投藥及改善之投藥順應性。 由於可由SC途徑給與小體積（<15 mi)，因而使用大於i mg/kg或每劑量大於丨〇〇 mg2高劑量之治療常需要開發濃 度超過⑽mg/mi之調配物。對在更高濃度下具有聚集傾 _ 肖之蛋白質而s，獲得該等高濃度調配物為開發之挑戰。 甚至對IV傳遞途徑而言，當可投與大體積時，每毫升數十 毫克之蛋白質遭度可為高劑量療法所需的且其可對一些蛋 白質之安定性提出挑戰。 控制蛋白質可溶性之原則比小合成分子之彼等原則更複 因此克服蛋白質可溶性問題採取不同策略。操作 县办^白質之可溶性可藉由在共溶質存在下蛋白質之最大 4藉以溶液仍為明顯澄清的(亦即，不展示蛋白 144045.doc 201008596 質沈殿、結晶或凝膠）。蛋白質可溶性對離子強度、鹽形 態、PH值、溫度及某些賦形劑之依賴已由Arakawa等人於 Theory 〇f protein solubility, Methods of Enzymology, 114:49-77, 1985 中；ScheinKSo/Wmo； β "•⑽ 〇/ protein structure and solvent components, BioTechnology 8(4):308-317, 1990 中；Jenkins 於 77^ee 印 protein solubility problem, Protein Science 7(2):376-382, 1998中；及其他，藉由整體水表面張力及蛋白質與水及離 子之結合相對自身締合之改變而以機械學說明。蛋白質與 特定賦形劑或鹽之結合經由蛋白質構形之改變或遮蔽涉及 自身相互作用之某些胺基酸而影響可溶性。蛋白質亦藉由 某些鹽、胺基酸及糖而優先水合（且安定為更緊密之構 形），導致其變化之可溶性。 需要雙分子碰撞之聚集預期為蛋白質溶液中之主要降解 路徑。濃度與聚集形成之關係視聚集體之尺寸以及締合機 制而定。蛋白質聚集可產生共價締合（例如二硫化物_連接） 或非共價締合（可逆的或不可逆的）。藉由非共價締合之不 可逆聚集通常經由藉由改變蛋白質之原生構形之熱方法、 機械方法或化學方法而暴露之疏水性區域而發生。蛋白質 聚集可影響（例如）歸因於免疫原性之蛋白質活性、藥物動 力學及安全性。 最小化聚集之典型方法為限制蛋白質之遷移率以降低碰 撞數量。用適當賦形劑之冷凍乾燥可藉由降低蛋白質遷移 率及藉由限制構形可撓性來改善蛋白質抵抗聚集之安定 144045.doc 201008596 .2 =附加因移除水而最小化水解反應之利益。添加包含 ^'、€劑之適當賦形劑可防止在冷康乾燥處理期間以及 /、產°°之儲存期間形成聚集體。有效保護之關鍵參數 . ^東乾保護劑與蛋白質之莫耳比。通常’需要3㈣或更 • 之莫耳比以提供尤其用於室溫儲存之適合之安定性。然 而，該等比率亦可導致黏度之不良增加。 、’、 冷柬乾燥谷許設計具有適當安定性及張力之調配物。儘 s等張力性對SC投藥而言並非必需，但希望其最小化投藥 • i之疼痛。親液膠體之等張力性難以達到，因為蛋白質及 賦形劑皆在復水處理期間濃縮。若最終蛋白質濃度以大於 1〇〇 mg/ml為目標，則5〇〇:1之賦形劑蛋白質莫耳比將產生 高張性製劑。若欲獲得等張性調配物，則選擇賦形劑：蛋 白質之較低莫耳比將產生可能較不安定之調配物。 由於蛋白質構形之不安定性質及與其自身、與表面及與 特定/合質相互作用之傾向，確定可達到之最高蛋白質濃度 仍根據經驗實施。 •可自SC調配物受益之受治者之實例為患有需要頻繁及長 期投藥之病狀之彼等者，諸如患有免疫系統疾病、類風滿 性關節炎及與移植物移植相關之免疫病症之受治者。用於 治療類風濕性關節炎之市售蛋白質藥品包含HUMIRA®、 ENBREL®及 REMICADE®。 HUMIRA (Abbott)係作為用於皮下投藥之無菌、無防腐 劑溶液而供應於單用、1 ml預填充玻璃注射器中。 HUMIRA®之溶液為澄清且無色的，具有約5二之^^值。各 144045.doc 201008596 注射器傳遞0.8 ml(40 mg)之藥品。各0.8 ml之HUMIRA®含 有 40 mg阿達木單抗（adaiimumab)、4.93 mg氣化納、0·69 mg二水合磷酸二氫鈉、1.22 mg二水合磷酸氫二鈉、0.24 mg檸檬酸鈉、i.〇4 mg檸檬酸單水合物、9.6 mg甘露醇、 0.8 mg聚山梨醇酯8〇及注射用水，USP。氫氧化鈉按需要 添加以調節pH值。 ENBREL®(Amgen)係作為用於皮下注射之無菌、無防腐 劑溶液而供應於單用預填充1 ml注射器中。ENBREL®之溶 液為澄清且無色的並在pH 6.3±0.2下調配。各ENBREL®單 用預填充注射器含有0.98 ml之50 mg/ml依那西普 (etanercept)溶液，以及 1 〇 mg/ml 嚴糖、5.8 mg/ml 氣化 鈉、5.3 mg/ml L-精胺酸鹽酸鹽、2.6 mg/ml單水合磷酸二 氫鈉及0.9 mg/ml無水磷酸氫二鈉。當小瓶經復水且按推薦 來投與時’投與1個50 mg/ml預填充注射器之ENBREL®提 供相當於2個25 mg凍乾ENBREL®小瓶之劑量。ENBREL® 多用小瓶含有無菌、白色、無防腐劑、凍乾粉末。用1 ml 所供應之無菌注射用製菌水（Sterile Bacteriostatic Water for Injection)(BWFI)，USP(含有 0.9% 苄醇）之復水產生 pH 值為7.4±0.3之多用、澄清及無色溶液，其含有25 mg依那 西普、40 mg甘露醇、10 mg蔗糖及1.2 mg緩血酸胺 (tromethamine) 〇 REMICADE®(Centocor)係供應為用於靜脈内輸注之無 菌、白色、凍乾粉末。用10 ml之注射用無菌水，USP復水 後，所得pH值為約7.2。各單用小瓶含有1〇〇 mg英利昔單 144045.doc 201008596 • 抗（infliximab)、500 mg蔗糖、0·5 mg 聚山梨醇酯 80、2.2 mg單水合磷酸二氫鈉及6.1 mg二水合填酸氫二鈉。不存在 防腐劑。 用於治療與移植物移植相關之免疫病症之市售蛋白質藥 品包含 SIMULECT®及 ZENAPAX®。 藥品SIMULECT®(Novartis)為無菌冷凍乾燥物，其可以6 ml無色玻璃小瓶使用且可以10 mg及20 mg濃度使用。各10 mg小瓶含有待於2.5 ml之注射用無菌水，USP中復水之10 參 mg巴利昔單抗（basiliximab)、3.61 mg填酸二氫卸、0.50 mg填酸氫二納（無水）、0.80 mg氯化納、10 mg蔗糖、40 mg甘露醇及20 mg甘胺酸。各20 mg小瓶含有待於5 ml之注 射用無菌水，USP中復水之20 mg巴利昔單抗、7.21 mg磷 酸二氫钟、0.99 mg填酸氫二鈉（無水）、1.61 mg氣化鈉、 20 mg蔗糖、80 mg甘露醇及40 mg甘胺酸。不添加防腐 劑。 ZENAPAX®(Roche Laboratories)，25 mg/5 ml係供應為 • 用於進一步稀釋及靜脈内投藥之澄清、無菌、無色濃縮 物。每毫升之ZENAPAX®含有5 mg達利珠單抗（daclizumab) 及3.6 mg單水合磷酸二氫納、11 mg七水合填酸氫二納、 4.6 mg氣化鈉、0.2 mg聚山梨醇酯80，且可含有鹽酸或氫 氧化鈉以將pH值調節至6.9。不添加防腐劑。 CTLA4Ig分子藉由抑制CD28-B7相互作用來干擾T細胞 共刺激。因此，CTLA4Ig分子可提供用於諸如類風濕性關 節炎及與移植物移植相關之免疫病症之免疫系統疾病的治 144045.doc 201008596 療用途。 需要用於治療免疫系統病症之包括CTLA4Ig分子之安 定、有效方便調配物。 【發明内容】 本發明提供用於藉由向受治者投與CTLA4Ig分子來治療 免疫系統疾病之調配物，該等CTLA4Ig分子在B7陽性細 胞上與B7分子結合，進而抑制内因性B7分子在τ細胞上結 合 CTLA4及/或 CD28。 本發明之凍乾調配物包括CTLA4Ig分子且該蛋白質與凍 乾保護劑之重量比為至少丨：凍乾保護劑較佳為糖，更 佳為雙醣，最佳為蔗糖或麥芽糖。凍乾調配物亦可包括選 自由緩衝劑、界面活性劑、膨化劑及防腐劑組成之選項單 中之一種或多種組份。 在某些實施例中，適用於安定凍乾藥品之蔗糖或麥芽糖 之量係使蛋白質與蔗糖或麥芽糖之重量比為至少1:2者， 較佳係使蛋白質與蔗糖或麥芽糖之重量比為1:2至1:5者， 更佳係使蛋白質與麥芽糖或蔗糖之重量比為約1 :2者。 本發明之皮下（SC)用調配物包括於水性載劑中、與有安 定化作用之量之糖組合的蛋白質濃度為至少1〇〇 mg/ml2 CTLA4Ig分子’較佳與有安定化作用之量之糖組合的蛋白 質濃度為至少125 mg/ml之CTLA4Ig分子。糖之量較佳係使 蛋白質與糖之重量比為至少1:1.1者。安定劑之用量較佳不 大於會造成不良黏度或不適合經由SC注射器投藥之量。糖 較佳為雙醣，最佳為蔗糖。SC調配物亦可包括選自由緩衝 144045.doc 201008596 . 劑、界面活性劑及防腐麻成之選項單中之—種或多種組 份。 在某些實施例中，適用於安定化含CTLA4lg分子之阢藥 • 品之蔗糖之量係使蛋白質與蔗糖之重量比為至少i : 1者， . 較佳係使蛋白質與蔗糖之重量比為1:1 3至15者更佳係 使蛋白質與蔗糖之重量比為約1:14者。 本發明之液體調配物包括於水性載劑中、與有安定化作 用之量之糖組合的蛋白質濃度為至少20 mg/mliCTLA4Ig • 好’較佳與有安定化作用之量之糖組合的蛋白質濃度為 至J25 mg/ml之CTLA4Ig分子。較佳地，糖之量係使蛋白 質與糖之重量比為至少^者。糖較佳為雙醣，最佳為蔗 糖。液體調配物亦可包括選自由緩衝劑、界面活性劑及防 腐劑組成之選項單中之一種或多種組份。 在某些實施例中，適用於安定化液體藥品之蔗糖之量係 使蛋白質與蔗糖之重量比為至少1:1者，較佳係使蛋白質 與簾糖之重量比為1:2至1:10者，更佳係使蛋白質與廉糖之 •重量比為約1:2者。 在本發明之另一實施例中’提供一種製品，其含有藥品 且較佳提供其用途之說明。 本發明進一步提供藉由投與本發明之CTLA4Ig分子調配 物來治療免疫系統疾病及誘發耐受性之方法。 【實施方式】 如本文中所利用： 「安定之」調配物或藥品為其中在儲存後其中之 144045.doc 201008596 CTLA4Ig分子基本保持其物理及化學安定性及完整性之調 - 配物或藥品。CTLA4Ig分子調配物之安定性可在經選擇之 時間週期後，在經選擇之溫度下量測。舉例而言，在冷凍 乾燥及儲存後，聚集形成之增加為凍乾CTLA4Ig分子調配 物不安定之指示器。除聚集形成外，在整個存放期期間， 原始澄清度、顏色及氣味之保持為用以監測CTLA4Ig分子 . 溶液之安定性之指示器。HMW物質為多聚體（亦即，四聚 體、六聚體等），其具有比CTLA4Ig分子二聚體更高之分子 量。通常「安定之」藥品可為其中當調配物在2-8°C下儲 ⑩ 存1年時，如藉由高分子量物質之百分比（％ HMW)之增量 所量測，聚集增量小於約5%且較佳小於約3%之藥品。較 佳地，所製造之藥品包括小於約25%之HMW物質，較佳小 於約15%之HMW物質，更佳小於約10°/。之HMW物質，最佳 小於約5 °/。之HMW物質。 CTLA4Ig分子之單體、二聚體及HMW物質可藉由尺寸排 外層析法（SEC)來分離。SEC係基於分子尺寸來分離分 子。分離係藉由分子沿管柱長度方向遷移時之差異分子排 © 外法或包含法來達成。因此，解析度作為管柱長度之函數 增加。CTLA4Ig分子樣品可使用配備串聯之TSK Gel® G3000SWXL(300 mmx7_8 mm)及 TSK Gel® G3000SWXL(40 mm><6.0 mm)管柱（Tosoh Bioscience，Montgomery，PA)之 2695 Alliance HPLC(Waters，Milford，MA)來分離。在 10 mg/ml(20 μΐ等分試樣）下之樣品係在1.0 ml/min之流動速率 下，使用由 0.2 M KH2P〇4、0.9% NaCl ’ pH 6.8組成之移 144045.doc -10- 201008596 動相來分離。在280 nm之吸光度下，使用Water’s 2487雙 波長偵測器來監視樣品。使用該系統，HMW物質具有7.5 min±1.0 min之滯留時間。積分各峰之峰下面積。°/0 HMW 物質藉由將HMW峰面積除以總峰面積來計算。 「復水」調配物為已藉由將凍乾調配物溶於水性載劑中 以便CTLA4Ig分子溶於復水調配物中來製備之調配物。復 水調配物適於向需要其之患者靜脈内投藥（IV)。 「等張」調配物為具有基本與人類血液相同之滲透壓之

調配物。等張調配物通常具有約250至350 mOsmol/Kgi^O 之滲透壓。術語「高張性」係用以描述具有大於人類血液 之滲透壓之滲透壓的調配物。等張力性可使用（例如）蒸氣 壓型滲壓計或冰凍型滲壓計來量測。 術語「緩衝劑」係指一或多種組份，當將其添加至水溶 液中時，其能保護溶液以防添加酸或鹼時或用溶劑稀釋後 之pH變化。除磷酸鹽緩衝劑外，可使用甘胺酸鹽緩衝劑、 碳酸鹽緩衝劑、檸檬酸鹽緩衝劑及其類似物，在該狀況下 鈉離子、鉀離子或銨離子可用作平衡離子。 之物質。「醫藥學上可 方式下為無毒之無機酸 「酸」為在水溶液中產生氫離子 接受之酸」包含在調配其之濃度及 及有機酸。 「鹼」為在水溶液中產生氫氧根離子之物f。「醫藥與 上可接受之鹼」包含在調配其之濃度及方式下之： 機驗及有機鹼。 … 「束乾保護劑」為當與受關注之蛋白f組合時，防止或 144045.doc -11· 201008596 -、凍乾燥及後續儲存後蛋白質之化學及/或物理不 定性之分子。 ^防腐劑」為減少細菌作用且可視情況添加至本文中之 調配物中之藥劑。添加防腐劑可（例如）有助於多用（多劑量> 調配物之製造。可能的防腐劑之實例包含氣化十八基二甲 土苄基銨、氣化六羥季銨、氣化笨曱烴銨（氣化烷基苄基 甲基銨之現合物，其中烧基為長鍵化合物）及苄索氣 其他類型之防腐劑包含諸如盼之芳族醇、丁酵及节 醇、諸如對氧苯甲酸甲酯或對氧苯甲酸丙酯之對氧苯甲酸 烷基s曰、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3戊醇及間甲酚。 「界面活性劑」為含有疏水性部分（例如烷基鏈）及親水 性部分（例如羧基及羧酸酯基）之表面活性分子。界面活性 劑可添加至本發明之調配物中。適用於本發明之調配物之 界面活性劑包含（但不限於）聚山梨醇酯（例如聚山梨醇酯2〇 或80);泊洛沙姆（p〇i〇xamer)(例如泊洛沙姆188);脫水山 梨糖醇醋及衍生物；Triton ;月桂硫酸鈉；辛基糖苷鈉； 月桂基磺酸基碘絡酮、十四烷基磺酸基碘絡酮、亞油醯基 績酸基蛾絡酮或硬脂醯基確酸基填絡酮；月桂基肌胺酸、 十四烷基肌胺酸、亞油醯基肌胺酸或硬脂醯基肌胺酸；亞 油醯基甜菜鹼、十四烷基甜菜鹼或十六烷基甜菜鹼；月桂 酿胺丙基甜菜鹼、可可胺丙基甜菜鹼、亞油醯胺丙基甜菜 鹼、肉豆蔻醯胺丙基甜菜鹼、棕橺醯胺丙基甜菜鹼或異硬 脂醯胺丙基甜菜鹼（例如月桂醯胺丙基）；肉豆蔻醯胺丙基 二甲基胺、棕櫚醯胺丙基二曱基胺或異硬脂醯胺丙基二甲 144045.doc -12- 201008596 基胺；甲基椰油醯基牛磺酸鈉或曱基油基牛磺酸二鈉；及 MONAQUAT™ 系列（Mona Industries, Inc” Paterson, N.J.)、 聚乙二醇、聚丙二醇及乙二醇與丙二醇之共聚物（例如 Pluronics、PF68 等）° 「藥物」係指用於最終藥品之調配物中之起始物質。典 型CTLA4Ig藥物組成包括20 mg/ml至60 mg/ml之蛋白質濃 度，7至8之pH值及小於5%i%HMW物質。 「經調配之本體溶液」係指在填充容器前之最終調配 φ 物，諸如在填充用於冷凍乾燥之小瓶前之經調配溶液或在 填充用於SC注射之注射器前之經調配溶液。 「藥品」係指封裝於容器中之最終調配物，其可以（諸 如）凍乾藥品形式在使用前復水；以（諸如）液體藥品形式在 使用前進一步稀釋；或用作（諸如）sc溶液藥品。 術語「CTLA4-Ig」或「CTLA4-Ig分子」或「CTLA4Ig 分子」可交替地使用且係指包括至少1個具有CTLA4細胞 外域或其部分及免疫球蛋白恆定區或其部分之多肽之蛋白 ® 質分子。細胞外域及免疫球蛋白恆定區可為野生型，或突 變的，或經修飾的，及為包含人類或小鼠之哺乳動物的。 多肽可另外包括額外蛋白質域。CTLA4-Ig分子可亦係指多 肽之多聚體形式，諸如二聚體、四聚體及六聚體。 CTLA4-Ig分子亦能與CD80及/或CD86結合。 術語「B7-1」係指CD80 ;術語「B7-2」係指CD86 ;且 術語「B7」係指 B7-1 及B7-2(CD80 及 CD86)。術語「B7-1-Ig」或「B7-lIg」係指 CD80-Ig ;術語「B7-2-Ig」或「B7- 144045.doc -13- 201008596 2Ig」係指 CD86_Ig。 在一實施例中，「CTLA4Ig」4指具有以下殘基之胺基 酸序列之蛋白質分子：（i)SEQ ID NO:2之26-383、（ii)SEQ ID NO:2 之 26-382 ; (iii)SEQ ID NO:2 之 27-383 或（iv)SEQ ID NO:2 之 27-382 或視情況（v)SEQ ID NO:2 之 25-382 或 (vi)SEQ ID NO:2之25-383。在單體形式中，該等蛋白質可 在本文中稱為「SEQ ID NO:2單體」或「具有SEq m NO:2序列」之單體。該等SEQ ID NO:2單體可二聚以便二 聚體組合可包含（例如）：（i)及（i);⑴及（ii);⑴及（Ui);⑴ ❹ 及（iv) ; (i)及（v);⑴及（vi) ; (ii)及（ii) ; (ii)及（iii) ; (ii)及 (iv) ; (ii)及（v) ; (ii)及（Vi) ; (iii)及（iii) ; (iii)及（iv) ; (Hi) 及（v) ; (iii)及（vi) ; (iv)及（iv) ; (iv)及（v) ; (iv)及（vi) ; (v)

及（v) ·’（v)及（vi);及（Vi)及（vi)。該等不同二聚體組合亦可 彼此締合以形成四聚體CTLA4Ig分子。該等單體、二聚 體、四聚體及其他多聚體可在本文中稱為「SEQ ID NO:2 蛋白質」或「具有SEQ ID NO:2序列」之蛋白質。（如SEq ID ΝΟ·2所不之編碼CTLA4Ig之DNA係依據Budapest Treaty ❿ 規定，由美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection » ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209於1991年5月31曰寄存’且已給與其ATCC寄存 編號ATCC 68629 ;如SEQ ID NO:2所示之表現CTLA4Ig之 中國倉鼠印巢（Chinese Hamster Ovary，CHO)細胞株係以 ATCC識別號CRL-10762於1991年5月31日寄存）。如本文中 所利用，「Abatacept」係指SEQ ID NO:2蛋白質。 144045.doc • 14· 201008596 在一實施例中，（：11^4-[104£八29丫-1£(有時稱為 「LEA29Y」或「L104EA29Y」）為結構上相似於如SEQ ID NO: 1所示之CTAL4-Ig分子之經遺傳工程化的融合蛋白 質。L104EA29Y-Ig具有經修飾人類CTLA4之功能性細胞外 結合域及IgGl類之人類免疫球蛋白之？(：域》兩種胺基酸修 飾，亦即在為SEQ ID NO:2之位置130之位置104(L104E) 處，白胺酸變為麩胺酸，及在為SEQ ID NO:2之位置55之 位置29(A29Y)處，丙胺酸變為酪’胺酸，係在CTLA4域之B7 φ 結合區中進行以產生L104EA29Y。SEQ ID NOS:3及4分別 描述L104EA29YIg之核苷酸及胺基酸序列，該 L104EA29YIg包括信號肽；以位置+27處之甲硫胺酸開始 及以位置+150處之天冬胺酸結束，或以位置+26處之丙胺 酸開始及以位置+150處之天冬胺酸結束之CTLA4的突變細 胞外域；及Ig區。編碼L104EA29Y-Ig之DNA係依據 Budapest Treaty規定，由美國菌種保藏中心（ATCC)於2000 年6月20日寄存。已給與其ATCC寄存編號PTA-2104。 ❹ L104EA29Y-Ig另外描述於2006年8月22日頒予之美國專利 7,094,874中及WO 01/923337 A2中，其皆以引用之方式全 部併入本文中。

哺乳動物細胞中之Ll〇4EA29YIg之表現可造成N-末端變 異及C-末端變異之產生，以便所產生之蛋白質可具有以下 殘基之胺基酸序列··（i)SEQ ID NO:4 之 26-383、（ii)SEQ ID ΝΟ··4 之 26-382 ; (iii)SEQ ID NO:4 之 27-383 或（iv)SEQ ID N〇:4 之 27-382 或視情況（v)SEQ ID NO:4 之 25-382 或（vi)SEQ 144045.doc -15- 201008596 ID NO:4之25-3 83。在單體形式中，該等蛋白質可在本文 中稱為「SEQ ID NO:4單體」或「具有SEq ID ]^〇:4序 列」之單體。該等蛋白質可二聚以便二聚體組合可包含 (例如）：⑴及⑴；⑴及(U);⑴及(iii);⑴及(iv);⑴及 (V) ； (l)A(vi) ； (ii)^(ii) ; (ii)^(iii) ； (ii)^(iv) ； (ii)A (v)，（11)及（VI) ; (ill)及（iii) ; (Ui)及（iv) ; (Hi)及（v) ; (ni) 及（vi)，（lv)及（lv) ; (iv)及（v) ; (iv)及（vi) ; (v)及（v) ; (v)及 (Vi);及（Vi)及（Vi)。該等不同二聚體組合亦可彼此締合以 形成四聚體L104EA29YIg分子。該等單體、二聚體、四聚 體及其他多聚體可在本文中稱為「SEQ ID N〇:4蛋白質」 或「具有SEQ ID NO:4序列」之蛋白質。如本文中所利 用，「Belatacept」係指 SEQ ID NO:4蛋白質。 CTLA4-Ig單艟及多聚髏 CTLA4-Ig分可含有（例如）呈單體、二聚體、三聚體四 聚體、五聚體、六聚體或其他多聚形式之cTLA4_Ig蛋白 質。CTLA4-Ig分子可包括與具有至少一個cTLA4i細胞外 域及一免疫球蛋白恆定區融合之蛋白質。（例如）相對於 CTLA4細胞外域及免疫球蛋白恆定區序列，CTLA4 ig分子 可具有野生型或突變序列。可糖基化單獨或呈二聚體、四 聚體或其他多聚體形式之CTLA4-Ig單體。 在一些實施例中，本發明提供具有至少一定百分比之二 聚體或其他多聚艘分子之CTLA4-Ig分子群體。舉例而言， 本發明提供為大於90。/。、95%、96%、97%、98%、99%或 99.5%之CTLA4-Ig二聚體之CTLA4_Ig分子群體。在一實施 144045.doc -16- 201008596 例中，本發明提供包括約95%至約99.5%之CTLA4-Ig二聚 體及約0.5%至約5%之CTLA4-Ig四聚體之CTLA4-Ig分子群 體。在另一實施例中，CTLA4-Ig分子群體包括約98%之 CTLA4-Ig二聚體、約1.5%之CTLA4-Ig四聚體及約0.5%之 CTLA4-Ig單體。 在一實施例中，本發明提供CTLA4-Ig分子群體，其中該 群體大體上不含CTLA4-Ig單體分子。大體上不含CTLA4-Ig單體分子可係指具有小於1%、0.5%或0.1%之單體之 • CTLA4-Ig分子群體。 在一實施例中，本發明提供CTLA4-Ig分子群體，其中該 群體大體上不含比二聚體更大之CTLA4-Ig多聚體，諸如四 聚體、六聚體等。大艎上不含比二聚體更大之CTLA4-Ig多 聚體分子可係指具有小於6°/。、5%、4%、3%、2%、1%、 0.5%或0.1%之比二聚形式更大之CTLA4-Ig多聚體的 CTLA4-Ig分子群體。

在一實施例中，CTLA4-Ig單體分子可具有（例如）以下各 _ 序列之胺基酸序列：（i)SEQ ID NO:2之26-383、（ii)SEQ ID 1^0:2之26-382、（^)8£()1〇1^0:2之 27-383 或（卜）8£(5 1〇 NO:2 之 27-382 或視情況（v)SEQ ID NO:2 之 25-382 或（vi)SEQ ID NO:2之25-383。當在CHO細胞中表現包括SEQ ID ΝΟ:1 之核酸序列之表現卡匣時，所表現之優勢單體形式具有甲 硫胺酸之N-末端胺基酸殘基（SEQ ID NO:2之殘基27)’其 對應於野生型人類CTLA4之N-末端胺基酸殘基。然而，因 為SEQ ID ΝΟ:1亦包含製瘤素Μ信號序列（SEQ ID ΝΟ:1之 144045.doc -17- 201008596 核苷酸11-88)之編碼序列，所以自SEQ ID ΝΟ:1所表現之 蛋白質含有製瘤素Μ信號序列。該信號序列在蛋白質自細 胞質輸出或自細胞之分泌出之過程期間，自所表現之蛋白 質分裂。但分裂可造成Ν-末端變異，諸如與在胺基酸殘基 26與27之間的分裂（產生殘基27之Ν-末端）相對，在胺基酸 殘基25與26之間的分裂（產生殘基26之Ν-末端，亦即「Ala 變異」），或在胺基酸殘基24與25之間的分裂（產生殘基2之 N-末端，亦即「Met-Ala變異」）。舉例而言，Met-Ala變異 可以約1%存在於CTLA4-Ig分子之混合物中且Ala變異可以 _ 約8-10%存在於CTLA4-Ig分子之混合物中。另外，自SEQ ID ΝΟ:1所表現之蛋白質可由於不完全處理而具有C-末端 變異。優勢C-末端為SEQ ID NO:2之殘基382處之甘胺酸。 在CTLA4-Ig分子之混合物中，在C-末端處（SEQIDNO:2之 殘基383)具有離胺酸之單體可以（例如）約4-5%存在。 CTLA4-Ig單體分子可包括人類CTLA4之細胞外域。在一 實施例中，細胞外域可包括SEQ ID NO: 1之核苷酸89-463 之核苷酸序列，其編碼SEQ ID NO:2之胺基酸27-151。在 © 另一實施例中，細胞外域可包括人類CTLA4之突變序列。 在另一實施例中，細胞外域可包括變成SEQ ID NO: 1之核 苷酸89-463之核苷酸改變以便進行保守胺基酸改變。在另 一實施例中，細胞外域可包括至少75%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%或 99%與 SEQ ID ΝΟ:1之核苷 酸89-463—致之核苷酸序列。 CTLA4-Ig單體分子可包括人類免疫球蛋白恆定區。該恆 144045.doc •18· 201008596 定區可為恆定區之一部分；該恆定區可具有野生型或突變 序列。恆定區可來自人類IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgM、IgAl、IgA2、IgD或IgE。恆定區可來自免疫球蛋白 之輕鏈或重鏈。當恆定區係來自IgG、IgD或IgA分子時， 恆定區可包括以下恆定區之一或多者：CL、CH1、鉸鏈、 CH2或CH3。當恆定區係來自IgM或IgE時，恆定區可包括 以下恆定區之一或多者：CL、CHI、CH2、CH3或Ca4。在 一實施例中，恆定區可包括一或多個來自IgG、IgD、 • IgA、IgM或IgE之怪定區。 在一實施例中，CTLA4-Ig單體分子包括經修飾之人類 IgGl鉸鏈區（SEQ ID ΝΟ:1 之核苷酸464-508 ; SEQ ID NO:2 之胺基酸152-166) ’其中在SEQ ID NO:2之胺基酸殘基 156、162及165處之絲胺酸已自存在於野生型序列_之半 胱胺酸工程化。 在一實施例中，CTLA4-Ig單體分子包括經修飾之人類 IgGl CH2區及野生型CH3區（該經修飾之人類IgGl CH2域 籲具有SEQ ID ΝΟ:1之核苷酸509-838及SEQ ID NO:2之胺基 酸167-276;人類IgGl CH3域具有SEQ ID ΝΟ:1之核苷酸 839-1159 及 SEQ ID NO:2 之胺基酸 277_383)。 在一實施例中，CTLA4-Ig分子群體包括具有2006年8月 22日頒予之美國專利第7,094,874號之圖7、8或9的任一或 多者所示之序列及以公開案第US20030083246號及第 US20040022787號公開之美國專利申請案（其在此以引用之 方式全部併入）所示之序列的單體。 144045.doc -19· 201008596 在一實施例中，CTLA4-Ig四聚體分子包括2對CTLA4-Ig 多肽或2個CTLA4-Ig多肽之二聚體，其中各多肽具有以下 胺基酸序列之一 ：（i)SEQ ID NO:2 之 26-383、（ii)SEQ ID ]^0:2之 26-382、（以）8£(5 10>^0:2之27_383 或（卜）8£(5 10 NO:2 之 27-382 或視情況（v)SEQ ID NO:2 之 25-382 或（vi)SEQ ID NO:2之25-383。多肽對或二聚體之各成員彼此共價地 連接，且2對多肽彼此非共價地締合進而形成四聚體。該 等四聚體分子能與CD80或CD86結合。 在另一實施例中，該等四聚體分子可以比CTLA4-Ig二聚 體（其單體具有上述胺基酸序列之一）對CD80或CD86之結 合親和力大至少2倍之親和力與CD80或CD86結合。在另一 實施例中，該等四聚體分子可以比野生型CTLA4對CD80 或CD86之結合親和性或親和力大至少2倍之親和力與CD80 或CD86結合。該更大親和力可有助於治療免疫病症及如 下文所述其他疾病中之更高功效。另外，更大或改善之親 和力可產生藥物之更高效能之結果。舉例而言，包括 CTLA4-Ig四聚體之治療組合物將具有比相同量之具有 CTLA4-Ig單體之治療組合物更高之親和力及因此更高之效 能。在另一實施例中，與CTLA4-Ig二聚體（其單體具有上 述胺基酸序列之一）相比，該等四聚體分子可具有大至少2 倍之對T細胞增殖之抑制。在另一實施例中，與野生型 CTLA4分子相比，該等四聚體分子可具有大至少2倍之對T 細胞增殖之抑制。 T細胞增殖可使用此項技術中已知之標準檢定來量測。 144045.doc -20- 201008596 舉例而言，評估T細胞增殖之最常見方式之一為經由TCR 之抗原或促進抗體來刺激T細胞且量測（例如）經滴定胸苷 (3H-TdR)於增殖T細胞中之結合或藉由增殖T細胞而釋放至 培養物中之細胞激素之量。可進而量測T細胞活化或增殖 後，CTLA4-Ig分子之抑制效應。 CTLA4-Ig分子之親和力為分子與包含CD80、CD86或 CD80Ig或CD86Ig融合蛋白質之單配位體結合之強度。 CTLA4-Ig對配位體之親和力可藉由使用（例如）基於表面電 ❹ 漿技術之結合相互作用分析（BIA)來量測。除量測結合強 度外，其允許即時測定諸如締合及解離速率常數之結合動 力學。由經薄金屬膜塗佈之玻璃載片組成之感應晶片係用 相互作用物之一（亦即CTLA4-Ig或配位體之一）塗佈，表面 基質係共價地附著於該感應晶片。容許含有另一相互作用 物之溶液流經其表面。對表面之另一面引導連續光束且量 測其反射角。CTLA4-Ig與配位體結合時，光束之共振角改 變（因為其視靠近感應器之反應面之培養基的折射率而 ® 定，其亦直接與培養基中溶解物質之濃度相關）。隨後在 電腦輔助下將其分析。 在一實施例中，CTLA4-Ig結合實驗可藉由於BIAcore器 具（BIAcore AG, Uppsala, Sweden)上之表面電漿共振（SPR) 來執行。CTLA4-Ig可藉由第一胺基共價偶合至於BIAcore 感應晶片上之羧甲基化葡聚糖基質，進而將CTLA4-Ig固定 至該感應晶片。或者，抗恆定區抗體可用以經由Ig片段將 CTLA4-Ig間接固定至感應器。此後，向晶片中添加配位體 144045.doc -21- 201008596 以量測對配位體之CTLA4-Ig結合。親和力量測可（例如）如 van der Merwe, P.等人，J· Exp. Med. (1997) 185 (3):393-404中所述來執行。 亦可量測CTLA4-Ig分子之親和力。親和力可定義為在多 個位點處兩個分子或細胞彼此結合強度之總和。親和力相 異於親和性，親和性為分子上之一位點與其配位體結合之 強度。不受理論所約束，CTLA4-Ig分子之更高親和力可產 生藉由CTLA4-Ig分子對T細胞增殖及活化之抑制之增加效 能。親和力可（例如）藉由2類固相檢定來量測：a)競爭抑制 檢定及b)溶離檢定。在其兩者中，配位體係附著於固體支 撐物。在競爭抑制檢定中，隨後將固定濃度之CTLA4-Ig分 子連同不同濃度之游離配位體添加於溶液中，且測定抑制 固相結合5 0%之配位體之量。需要之配位體愈少，親和力 愈強。在溶離檢定中，將配位體添加於溶液中。獲得平衡 狀態後，以不同濃度添加離液劑或變性劑（例如異硫氰酸 鹽、尿素或二乙胺）以破壞CTLA4-Ig/配位體相互作用。其 後，用ELISA測定抵抗溶離之CTLA4-Ig之量。親和力愈 高，需要用以溶離特定量之CTLA4-Ig之離液劑愈多。 CTLA4-Ig分子之異質混合物之相對親和力可表示為親和力 指數（AI)，其等於需要用以溶離50%之所結合CTLA4-Ig分 子之溶離劑的濃度。資料之改進分析可藉由測定不同濃度 之溶離劑下所溶離之CTLA4-Ig百分比來進行。 產生本發明之CTLA4Ig分子之方法 可在原核細胞中表現CTLA4Ig分子。原核生物常藉由各 144045.doc •22- 201008596 種細菌菌株來表示。細菌可為革蘭氏陽性或革蘭氏陰性。 通常’諸如大腸桿菌（五.co/z·)之革蘭氏陰性細菌為較佳 的。亦可使用其他微生物菌株。 .上文所述之編碼CTLA4Ig分子之序列可插入經設計用於 在諸如大腸桿菌之原核細胞中表現外來序列之載體中。該 等載體可包含常用原核控制序列，其在本文中定義包含用 於轉錄啟始、視情況具有操縱基因以及核糖體結合位點序 列之啟動子，包含該等作為β_内醯胺（青黴素酶）及乳糖（lac) ❹ 啟動子系統（Chang等人’（1977) Nature 198:1〇56)、色胺酸 (trp)啟動子系統（Goeddel等人，（1980) Nucleic Acids Res. 8:4057)及λ衍生PL啟動子及N_基因核糖體結合位點 (Shimatake等人，（1981) Nature 292:128)之常用啟動子。 該等表現載體將亦包含複製起點及諸如給與對抗生素之 抗力之β-内醯胺或新黴素（neoniyCin)碟酸轉移酶基因的可 選擇標記’以便載體可在細菌中複製且載運質體之細胞可 在諸如女比西林（ampicillin)或康黴素（kanamycin)之抗生素 ® 存在下生長時受選擇。 表現質體可經由包含（但不限於）CaCl2_震動（c〇hen， (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110，及 Sambrook等 人（編）’「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」，第二 版 ’ Cold Spring Harbor Press，（1989))及電穿孔之各種標 準方法而引入原核細胞中。 根據本發明之實踐’真核細胞亦為適合之宿主細胞。真 核細胞之實例包含任何動物細胞（無論是否為初始的或永 144045.doc -23- 201008596 生化的）、酵母（例如釀酒酵母（Sacc/zaromyce·? cerevb/ae)、 啤酒釀酵母（iSc/zizosacc/iaro/^ces pow0e)及甲醇酵母 (Pz_c/n‘a 及植物細胞。骨髓瘤、COS及CHO細胞 為可用作宿主之動物細胞之實例。特定CHO細胞包含（但 不限於）DG44(Chasin等人，1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556 ； Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901- 10909)、CH0-K1(ATCC 第 CCL-61號）、CHO-K1 Tet-On 細 胞株（Clontech)、命名為 ECACC 85050302 之 CHO(CAMR， Salisbury, Wiltshire, UK)、CHO 純系 13(GEIMG，Genova， ⑮ IT)、CHO 純系 B(GEIMG，Genova，IT)、命名為 ECACC 93061607 之 CHO-Kl/SF(CAMR，Salisbury, Wiltshire，UK) 及命名為 ECACC 92052129之RR-CHOKl(CAMR，Salisbury, Wiltshire, UK)。說明性植物細胞包含煙草細胞（整個植 物、細胞培養物或愈傷組織）、玉米細胞、黃豆細胞及水 稻細胞。玉米種子、黃豆種子及水稻種子亦可接受。 編碼上文所述之CTLA4Ig分子之核酸序列亦可插入經設 計用於在真核細胞中表現外來序列之載體中。載艎之調節 ® 元素可根據特定真核宿主而變化。 適用於表現載體之常用真核控制序列包含與哺乳動物細 胞相容之啟動子及控制序列，諸如CMV啟動子（CDM8載體） 及禽類肉瘤病毒（ASV)(TtLN載體）。其他常用啟動子包含來 自猿病毒40(SV40)之早期及晚期啟動子（Fiers等人，（1973)

Nature 273:113)或諸如得自多瘤病毒、腺病毒2及牛乳突瘤 病毒之彼等啟動子之其他病毒啟動子。亦可使用諸如 144045.doc • 24- 201008596 hMTII(Karin等人，（1982) Nature 299:797-802)之誘導性啟 動子。 在真核細胞中表現CTLA4Ig分子之載體亦可載運稱為強 化子區之序列。該等載體在最佳化基因表現中為重要的且 發現於啟動子區之上游或下游。 用於真核宿主細胞之表現載髏之實例包含（但不限於）用 於哺乳動物宿主細胞之載體（例如，BPV-1、pHyg、 pRSV ' pSV2 ' pTK2(Maniatis) ； pIRES(Clontech) ； pRc/ CMV2、pRc/RSV、pSFVl(Life Technologies) ； pVPakc 載 體、pCMV載體、pSG5載體（Stratagene))、反轉錄病毒載 體（例如 pFB載體（Stratagene)、pCDNA-3(Invitrogen)或其經 修飾形式，腺病毒載體；腺相關病毒載體、桿狀病毒載 體、酵母載體（例如pESC載體（Stratagene))。 編碼CTLA4Ig分子之核酸序列可整合至真核宿主細胞之 基因組中且可複製成宿主基因組複製物。或者，載運 CTLA4Ig分子之載體可含有容許染色體外複製之複製起 點。 為在釀酒酵母中表現核酸序列，可使用來自内因性酵母 質體之複製起點，2μ環狀物。（Broach，（1983) Meth· Enz. 101:307)。或者，可使用來自酵母基因組之能促進自主複 製之序列（參見（例如），Stinchcomb等人，（1979) Nature 282:39) ; Tschemper 等人，（1980) Gene 10:157 ;及 Clarke 等人，（1983) Meth. Enz. 101:300)。 用於酵母載體之轉錄控制序列包含用於合成醣解酵素之 144045.doc -25- 201008596 啟動子（Hess等人，（1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; Holland等人，（1978) Biochemistry 17:4900)。此項技術中 已知之額外啟動子包含提供於CDM8載體中之CMV啟動子 (Toyama 及 Okayama, (1990) FEBS 268:217-221) ; 3-攝甘油 酸激酶之啟動子（Hitzeman等人，（1980) J. Biol. Chem. 255:2073)及其他醣解酵素之彼等者。 其他啟動子為誘導性的，因為其可藉由環境刺激或細胞 之生長介質來調節。該等誘導性啟動子包含來自以下各者 之基因之彼等啟動子：熱休克蛋白（heat shock protein)、 乙醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮分解代謝 相關之酶及負責利用麥芽糖及半乳糖之酶。 調節序列亦可置放於編碼序列之3'末端。該等序列可用 以安定信息RNA。該等終止子發現於若乾酵母衍生基因及 哺乳動物基因中之編碼序列後之3’未轉譯區中。 用於植物及植物細胞之說明性載體包含（但不限於）土壤 桿菌（Agrobacterium)Ti質體、花椰菜欲紋病毒（CaMV)及番 茄金色花葉病毒（TGMV)。 哺乳動物細胞可藉由包含（但不限於）在磷酸鈣存在下之 轉染、顯微注射、電穿孔之方法或經由用病毒載體之轉導 來轉型。 用於將外來DNA序列引入植物及酵母基因組中之方法包 含（1)機械方法，諸如將DNA顯微注射至單細胞或原生體 中，在DNA存在下用玻璃珠渦旋細胞，或將經DNA塗佈之 鎢球或金球射入細胞或原生體中；（2)藉由經由聚乙二醇處 144045.doc -26- 201008596 理或經受高電壓電脈衝（電穿孔）使細胞膜對巨分子可滲透 而引入DNA ;或（3)使用融合至細胞膜之脂質體（含有 cDNA)。 美國專利申請案美國公開案第20050019859號及美國專 利申請案美國公開第20050084933號教示藉由動物或哺乳 動物細胞培養產生本發明之蛋白質，尤其為重組糖蛋白產 物之方法，且其以引用之方式併入本文。 細胞培養方法之蛋白質產生階段後，使用熟習此項技術 φ 者暸解之技術自細胞培養基回收CTLA4Ig分子。詳言之， CTL A4Ig分子係作為戶斤分泌之多肽而自培養基回收。 最初將培養基離心以移除細胞碎片及微粒。隨後用以下 此項技術中良好建立之非限制性純化程序，將所要蛋白質 自污染物DNA、可溶性蛋白質及多肽純化：SDS-PAGE ; 硫酸銨沉澱；乙醇沉澱；免疫親和性溶離或離子交換柱溶 離；逆相HPLC ;矽膠層析或諸如QAE或DEAE之陰離子交 換樹脂層析；層析聚焦；使用（例如）Sephadex G-75™柱之 ❹ 凝膠過滤；及蛋白質A Sepharose™柱以移除諸如IgG之污 染物。添加諸如苯基甲基磺醯基氟（PMSF)之蛋白酶抑制劑 或蛋白酶抑制劑調和混合物（cocktail mix)亦可適用於抑制 在純化期間之蛋白水解降解。熟習此項技術者將認識到適 於例如糖蛋白之受關注蛋白質的純化方法可需要改變以說 明在重組細胞培養中表現後蛋白質之特徵改變。 選用於糖蛋白之碳水化合物群之純化技術及方法亦在本 發明之上下文中具有實用性。舉例而言，該等技術包含使 144045.doc -27- 201008596 用HPLC或陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂之離子交換 層析，其中視所選用之碳水化合物而定，收集更多鹼性或 更多酸性溶離份。使用該等技術亦可造成污染物之伴隨移 除。 純化方法可另外包括使病毒及/或反轉錄病毒失活及/或 移除病毒及/或反轉錄病毒之額外步驟，該等病毒及/或反 轉錄病毒可潛在地存在於哺乳動物細胞株之細胞培養基 中。大量病毒清除步驟為可用的，其包含（但不限於）用以 下各者來處理：諸如尿素或胍之離液劑、清潔劑、額外超 ❿ 濾/透濾步驟、諸如離子交換層析或尺寸排外層析法之習 知分離、pH極值、加熱、蛋白酶、有機溶劑或其任一組 合。 經純化之CTLA4Ig分子需要在儲存或進一步處理前之濃 度及緩衝劑交換。Pall Filtron TFF系統可用以濃縮及用藥 物所要之最終緩衝劑交換來自先前純化柱之溶離緩衝劑。 在一態樣中，已濃縮且經受透濾步驟之經純化之 CTLA4Ig分子可填充至2 L Biotainer®瓶、50 L生物處理袋 © 或任何其他適合之容器中。該等容器中之CTLA4Ig分子可 在冷凍前，在2°C至8°C下儲存約60天。在2°C至8°C下，經 純化之CTLA4Ig分子之延長儲存可使HMW物質之比例增 加。因此，為長期儲存，CTLA4Ig分子可在儲存前，在約 -70°C下冷凍且在約-40°C之溫度下儲存。冷凍溫度可自約 -50°C至約-90°C變化。冷凍時間可變化且主要視含有 CTLA4Ig分子之容器體積及加載於冷)東器中之容器數量而 144045.doc -28 * 201008596 定。舉例而言’在一實施例中，CTLA4Ig分子係在2 l Biotainer®瓶中。將少於4個2 L Bi〇tainer®瓶加載於冷凌器 中可需要約14至至少18小時之冷凍時間。加載至少4個瓶 可需要約18至至少24小時之冷凍時間。具有經冷;東之 CTLA4Ig分子之容器係在約_35〇C至約·55。。之溫度下儲 存。在約-35C至約-55C之溫度下之储存時間可變化且可 短至18小時。經冷凍之藥物可以用於藥品之調配物之控制 方式來解凍。 _ 共同申請中之2005年12月20日申請之美國專利申請案第 60/752,267號及2006年10月5日申請之第〇6/849,543號教示 藉由動物或哺乳動物細胞培養產生本發明之蛋白質，尤其 為重組糖蛋白產物之方法且以引用之方式併入本文。 本發明之凍乾調Β&物 本發明之凉·乾調配物包括CTLA4Ig分子且該蛋白質與東 乾保護劑之重量比呈至少1:2。凍乾保護劑較佳為糖，更 佳為雙聽’最佳為蔗糖或麥芽糖。束乾調配物亦可包括選 ® 自由緩衝劑、界面活性劑、膨化劑及防腐劑組成之選項單 中之一種或多種組份。 在調配物開發研究期間，評估各種賦形劑對CTLA4Ig分 子之溶液狀態安定性及冷凍乾燥固體狀態安定性之作用。 在缺少安定劑之情況下，冷凍乾燥CTLA4Ig分子之不安 定性明顯突出在調配物中包含凍乾保護劑之需要。初始篩 檢研究展示，藥品在諸如麥芽糖及蔗糖之糖及諸如精胺酸 及離胺酸之胺基酸存在下為安定的。諸如甘露醇之多元醇 144045.doc -29· 201008596 及諸如葡聚糖40之多醣對其安定性不利。較佳凍乾保護劑 為雙醣麥芽糖及蔗糖。 實例VI描述在50°C下儲存之冷凍乾燥Abatacept藥品在麥 芽糖存在下之安定性研究。使用安定性指示尺寸排外層析 法（SE-HPLC)檢定來監測高分子量（HMW)物質之增加。結 果證實呈冷凍乾燥固體狀態形式之CTLA4Ig分子之安定性 在麥芽糖存在下增強。 適用於安定凍乾藥品之蔗糖或麥芽糖之量係使蛋白質與 蔗糖或麥芽糖之重量比為至少1:2者，較佳係使蛋白質與 蔗糖或麥芽糖之重量比為1:2至1:5者，更佳係使蛋白質與 麥芽糖或蔗糖之重量比為約1:2者。 若必要，則在冷凍乾燥前藉由添加醫藥學上可接受之酸 及/或鹼來設定調配物之pH值。較佳醫藥學上可接受之酸 為鹽酸。較佳驗為氫氧化納。 在調配物開發期間，冷凍乾燥藥品之安定性係作為pH值 之函數來研究。實例VI描述作為pH值之函數之冷凍乾燥 Abatacept藥品的安定性研究。在冷柬乾燥前，將溶液pH 值調節在6至8之間。使樣品處於安定狀態且使用安定性指 示尺寸排外層析法（SE-HPLC)檢定，在各種時間點監測含 配成溶液之產物之小瓶中高分子量物質之增加。在2-8 °C 之推薦儲存條件下，未觀察到HMW物質形成速率之顯著 改變。另外，在早期開發期間所產生之溶液狀態安定性資 料展示最大安定性之pH值介於7與8之間。可接受之凍乾藥 品之pH值範圍為7至8，較佳目標pH值為7.5。 144045.doc -30- 201008596 在另一態樣中，可以至少約10 mM，較佳ι〇-2〇〇福之 量添加鹽或緩衝劑組份.鹽及/或緩衝劑為醫藥學上可接 受的且衫自各種已㈣（無機酸以_)與「錄」金 相胺。除碟酸鹽緩衝劑外，可使用甘胺酸鹽緩衝劑、碳 ㈣緩衝劑、榑檬㈣緩衝劑及其類似物，在該狀況下納 離子、鉀離子或銨離子可用作平衡離子。 「膨化劑」為增加凍乾混合物質量且有助於凍乾濾餅之 物理結構（例如有助於產生維持開放微孔結構之大體上均 Φ 勻之凍乾濾餅）之化合物。說明性膨化劑包含甘露醇、甘 胺酸、聚乙二醇及山梨糖醇。本發明之凍乾調配物可含有 該等膨化劑。 可視情況向本文中之調配物中添加防腐劑以減少細菌作 用。添加防腐劑可（例如）有助於多用（多劑量）調配物之製 造。 熟習此項技術者將視用於特定治療之所需劑量及投藥進 度而選擇待填充至小瓶中之藥品之量。舉例而言，每小瓶 春之CTLA4Ig濃度可在50至300毫克/小瓶，較佳1〇〇至250毫 克/小瓶之範圍變化。 凍乾Abatacept藥品之典型組成列於下文之表1中。 表1 凍乾abataeept(250毫克/小瓶）蕖品之粗成 組份 量(毫克/小瓶)a Abatacept 262.5 單水合麥-芽糖 525 單水合磷酸二氫鈉b 18.1 144045.doc •31- 201008596 組份 量(毫克/小瓶)a 氣化鈉b 15.3 鹽酸 調節至pH 7.5 氫氧化納 調節至pH 7.5 a包含小瓶、針、注射器損失之5%裝填過量 b該等組份存在於abatacept藥物溶液中 凍乾Belatacept藥品之典型組成列於下文之表2中。 表2 來乾Belatacept 100毫克/小瓶蘗品之组成 組份 量/小瓶(mg)a Belatacept 110a 蔗糖 220 單水合鱗酸二氫納 15.18 氣化納 2.55 1N氫氧化納 調節至pH 7.5 1N鹽酸 調節至pH 7.5 a各小瓶含有復水溶液之小瓶、針及注射器滯留之10%裝填 過量。 凍乾藥品係由水性載劑來配成溶液。本文中受關注之水 性載劑為醫藥學上可接受的（對向人類投藥而言安全且無 毒）且在冷凍乾燥後適用於製備液體調配物之水性載劑。 說明性稀釋劑包含注射用無菌水（SWFI)、注射用製菌水 (BWFI)、pH值緩衝劑（例如磷酸鹽緩衝生理食鹽水）、無菌 生理食鹽水溶液、林格氏溶液（Ringer's solution)或右旋糖 溶液。 較佳地，本發明之凍乾藥品係用注射用無菌水， USP(SWFI)或0.9%氣化鈉注射液，USP來配成溶液。在配 144045.doc -32- 201008596 成溶液（即復水）期間，凍乾粉末迅速溶解，提供澄清、無 色溶液。 通常本發明之凍乾藥品係用10 ml之注射用無菌水， USP(SWFI)或0.9%氣化鈉注射液，usp來配成濃度約 mg/ml之溶液。用〇 9%氣化鈉注射液，usp將配成之溶液 進一步稀釋至介於丨與^ mg/ml之間的藥品濃度。注射用 之經稀釋藥品為等張的且適於藉由靜脈内輸注而投藥。 在早期臨床開發期間，發現凍乾藥品之配成之溶液與常 ® 用於製備及投與非經腸產品之拋棄式矽化注射器不相容。 具體s之，當儲存於該等注射器中大於1〇15分鐘後，配 成之藥品溶液形成線狀、凝膠狀顆粒。其他研究證實該不 相容性係歸因於藥品與在該等注射器上用作潤滑劑之矽油 (二曱基矽氧烷）的相互作用。該等顆粒之形成不影響藥品 溶液在其使用時間内之效價。較佳使用不含聚矽氧之注射 器將藥品配成溶液並將配成之溶液自小瓶轉移至靜脈注射 袋。 •或者，可將界面活性劑（例如）以其足夠量添加至調配物 中以降低或防止配成之藥品溶液與石夕化注射器之相互作 用。 用於凍乾調配物之推薦儲存條件為2-8。(：，推薦存放期 為至少12個月。 製備凍乾調配物 束乾藥品製造方法包含將經調配之散裝溶液分批進行冷 /東乾燥、無菌過濾、填充至小瓶中，然後於冷涞乾燥室中 144045.doc -33- 201008596 冷束該等小瓶’接著冷;東乾燥、加塞子及封蓋。 實例III及IV分別描述;東乾Abatacept及Belatac啤藥品之 製造。 ^ 通常將經調配之纟體溶液設定在固定蛋白質濃度下以便 所要小瓶填充體積可保㈣定。在添加束乾保護劑㈣， 混合器速度控制在250士50 rpm以便最小化分批溶液中之發 泡且確保凍乾保護劑在10至2〇分鐘内完全溶解。經調配之 本體溶液可在冷凍乾燥前，在2_8。〇下或室溫及室光下儲 存至少3 2小時。 由於CTLA4Ig分子之熱敏感性，因此最後不對經調配之 本體溶液滅菌。經調配之本體溶液可使用兩個串聯之〇 Μ μηι MilliP〇re Millipak®滅菌級過濾器來滅菌，隨後填充至 用於冷凍乾燥之小瓶中。 選用於該產品之冷凍乾燥循環經優化以分別在乾燥之第 階丰又及第一 1¾段期間具有有效昇華及蒸發，而不損害產 品品質。 為在藥品之配成溶液期間輔助凍乾粉末之快速溶解且防 止過量泡沫之形成，在冷凍乾燥循環結束時，在500±100 微米室壓下塞堵凍乾小瓶。 熟習此項技術者將明白需要使容器裝填過量以便補償在 製備及注射期間小瓶、針、注射器滯留量。舉例而言各 小瓶之Abatacept藥品（250 mg/ml)含有5%過剩量之藥品以 補償復水（reconstitution)及抽取時之損失。 液tt皮下綱K物 144045.doc -34- 201008596 熟習此項技術者將認識到IV調配物對需要頻繁、長期治 療之患者之不便。患者必須頻繁地來到醫院以經由可持續 長達1小時之IV輸注來接受其藥物。因此，可在家自行投 與之SC調配物將對該患者極為有益。 對皮下投藥而言’需要具有高蛋白質濃度之劑型。由於 可由SC途徑給與小體積（<1 5 ml)，因而使用大於1 mg/kg(每劑量大於1〇〇 mg)之高劑量之治療需要開發濃度 超過100 mg/ml之調配物。為優化在高濃度下抵抗形成高 _ 分子量物質之長期安定性，進行調配物開發研究以評估各 種賦形劑對本發明之液體8(：調配物之溶液狀態安定性的作 用。 本發明之SC調配物包括於水性載劑中、與安定含量之糖 組合的蛋白質濃度為至少1〇〇 mg/ml2CTLA4lg*子較佳 與安疋含量之糖組合的蛋白質濃度為至少125 ^^/⑺丨之 CTLA4Ig分子。糖之量較佳係使蛋白質與糖之重量比為至 ’’ 者女疋劑較佳係以不大於可造成不良黏度或不適 合經由SC注射器投藥之量之量來使I糖較佳為雙聽，最 佳為嚴糖。SC調配物亦可包括選自由緩衝劑、界面活性劑 及防腐劑組成之選項單中之一種或多種組份。 在包含糖、多醣、胺基酸、界面活性劑、聚合物、環狀 葡聚糖f白質等之各種安定劑存在下評估sc調配物之安 定性分佈。在所有受評估之職形劑中，諸如嚴糖、甘露醇 及海漆糖之糖具有抵抗形成高分子量物質之良好安定作 用0 144045.doc -35- 201008596 實例V及VIII分別描述在蔗糖存在下，在各種溫度下儲 存各種時間週期之8€361&1&〇601；及人531&〇6口1；藥品之安定性 研究。使用安定性指示尺寸排外層析法（SE-HPLC)檢定來 監測高分子量物質之增加。結果證實於SC調配物中之 TLA4Ig分子之安定性在蔗糖存在下增強。在更高之蔗糖: 蛋白質重量比下，藉由蔗糖之安定作用更好。基於該等研 究，選擇以提供最佳安定性而不使SC溶液具有過度高滲壓 之比率的蔗糖作為安定劑。 適用於安定SC藥品之蔗糖之量係使蛋白質與蔗糖之重量 比為至少1:1者，較佳係使蛋白質與蔗糖之重量比為1:1.3 至1:5者，更佳係使蛋白質與蔗糖之重量比為約1:1.4者。 若必要，則藉由添加醫藥學上可接受之酸及/或鹼來設 定調配物之pH值。較佳醫藥學上可接受之酸為鹽酸。較佳 驗為氫氧化納。 在調配物開發期間，SC藥品之安定性係作為pH值之函 數來研究。實例V描述作為pH值之函數之SC Belatacept藥 品的安定性研究。將SC調配物之pH值調節在7至8.2之間， 使樣品處於安定狀態且使用安定性指示尺寸排外層析法 (SE-HPLC)檢定，在各種時間點監測藥品之高分子量物質 之增加。在2-8°C之推薦儲存條件下，3個月後未觀察到 HMW物質之形成速率之顯著改變。 除聚集外，脫醯胺作用為可在醱酵、收穫/細胞淨化、 純化、藥物/藥品儲存期間及在樣品分析期間發生之肽及 蛋白質的普通產物變異。脫醯胺作用為自形成可經歷水解 144045.doc -36- 201008596 之琥珀醯亞胺中間物之蛋白質失去nh3。琥珀醯亞胺中間 物造成母肽之17 u之質量減少。隨後之水解造成18 u之質 量增加。由於在含水條件下之不安定性，所以分離琥珀醯 亞胺中間物係困難的。在1 u之質量增加時，該脫醯胺作 用通常為可偵測的。天冬酿胺酸之脫醯胺作用產生天冬胺 酸或異天冬胺酸。影響脫醢胺速率之參數包含pH值、溫 度、溶劑介電常數、離子濃度、第一序列、局部多肽構形 及第三結構。與肽鏈中之Asn相鄰之胺基酸殘基影響脫醯 ❹ 胺速率。在蛋白質序列中之Asn後之Gly及Ser造成對脫酿 胺之更高敏感性。 初步實驗室規模安定性研究暗示使用pH 7.8之SC abatacept調配物’在24個月時，脫醯胺作用將超過肽圖譜 測試方法之參考水平。在2_8°c及25°C，60%濕度下，6個 月時之資料展示當與pH 7.8之SC abatacept樣品相比，pH 7_2下之脫醯胺速率較低且pH 8下之脫醯胺速率較高。實 例IX及XII描述實驗室規模pH值研究，研究經設計以評估 ❹ 在6.3至7.2之pH值範圍中之SC藥品調配物之脫醯胺作用。 SC藥品之可接受之pH值範圍為6至8，較佳6至7.8，更佳 6至 7.2。 在另一態樣中，可以至少1〇 mM，較佳10-200 mM之量 添加鹽或緩衝劑組份。鹽及/或緩衝劑為醫藥學上可接受 的且衍生自各種已知酸（無機酸及有機酸）與「成鹼」金屬 或胺。除碟酸鹽緩衝劑外，可使用甘胺酸鹽緩衝劑、碳酸 鹽緩衝劑、檸檬酸鹽緩衝劑及其類似物，在該狀況下納離 144045.doc -37- 201008596 子、鉀離子或銨離子可用作平衡離子。 實例VIII描述緩衝劑濃度對Abatacept SC藥品之作用。 在pH 7.5下，在100 mg/mL之abatacept藥品濃度下，與5 mM磷酸鹽緩衝劑相比，在10 mM磷酸鹽緩衝劑中之安定 性更好。此外，與5 mM緩衝劑相比，10 mM填酸鹽緩衝劑 所提供之緩衝能力愈高，調配物之pH值控制愈好。 本文中受關注之水性載劑為醫藥學上可接受的（對向人 類投藥而言安全且無毒）且適用於製備液體調配物之水性 載劑。說明性載劑包含注射用無菌水（SWFI)、注射用製菌 水（BWFI)、pH值緩衝劑（例如磷酸鹽生理食緩衝鹽水）、無 菌生理食鹽水溶液，林格氏溶液或右旋糖溶液。 可視情況向本文中之調配物中添加防腐劑以減少細菌作 用。添加防腐劑可（例如）有助於多用（多劑量）調配物之製 造。 如對凍乾藥品之討論，CTLA4Ig分子不與標準注射器中 所發現之聚矽氧相容，因為其與聚矽氧相互作用以形成可 見微粒，進而限制患者使用不含聚矽氧之注射器。SC調配 物可視情況包括界面活性劑以防止在聚矽氧存在下形成可 見微粒。 實例V及VIII描述諸如聚山梨醇酯80及泊洛沙姆188之界 面活性劑分別對belatacept及abatacept藥品之溶液安定性之 作用且發現界面活性劑對於SC調配物中之CTLA4Ig分子之 安定性不具有作用。評估不同含量之泊洛沙姆188且發現4 mg/ml至8 mg/ml，較佳8 mg/ml之濃度足以防止調配物中 144045.doc -38 - 201008596 之聚矽氧相關微粒形成。 belatacept SC藥品，125 mg/ml(100毫克/小瓶）藥品之典 型組成提供於下文之表3中。 表3

Belatacept SC藥品，125 mg/ml(100.毫克/小瓶）之组成 組份 量(毫克/小瓶)b Belatacept 140.0 蔗糖 190.4 泊洛沙姆188 8.96 單水合磷酸二氫鈉 0.371 無水填酸風二納 1.193 注射用水 足量至1.12 ml 含小瓶、針、注射器損失之40%裝填過量 abatacept SC藥品，125 mg/ml(125毫克/小瓶）之典型組 成提供於下文之表4中。 表4

Abatacept SC集品，125 mg/ml(125毫克/小瓶）之组成 組份 量(毫克/小瓶)e Abatacept 175 蔗糖 238 泊洛沙姆188 11.2 單水合磷酸二氫鈉 0.20 無水構酸氫二納 1.36 注射用水 足量至1.4 ml e包含小瓶、針、注射器損失之40%裝填過量 填充至注射器中之abatacept SC藥品，125 mg/ml之典楚 組成提供於下文之表5中。 144045.doc -39- 201008596 表5

Abatacept SC蕖品，125 mg/ml(125毫克/注射器）之组成 組份 量(毫克/注射器） Abatacept 125 蔗糖 170 泊洛沙姆188 8.0 單水合磷酸二氫鈉 0.143 無水填酸氫二鈉 0.971 注射用水 足量至1 ml SC調配物之推薦儲存條件為2-8°C，推薦存放期為至少 12個月。 使用梅特勒-托利多（Mettler-Toledo)密度計在周圍溫度 下測定abatacept SC藥品及匹配安慰劑之密度。使用三份5 mL樣品來執行量測。發現abatacept SC調配物之密度為1·1 g/cc且發現安慰劑產品之密度為1.065 g/cc。通常，SC CTLA4Ig調配物之密度為約1.0 g/cc至約1.2 g/cc，較佳約 1.0 g/cc至約 1.15 g/cc，更佳約 1.095 g/cc至約 1.105 g/cc。 使用博力飛（BrookHeld)流變儀在周圍溫度下測定 abatacept SC調配物之黏度。對量測使用9.3 cps之參考標 準。發現在125 mg/mL abatacept濃度下之SC藥品之黏度為 13 士 2 cps。通常，在125 mg/mL下之SC CTLA4Ig調配物之 黏度為約9至約20 cps，較佳約9至約1 5 cps，更佳12至約 15 cps ° 使用蒸氣壓方法來量測SC abatacept藥品及安慰劑調配 物之滲透壓度。資料展示在125 mg/mL之濃度下， abatacept SC調配物之滲透壓度為 770±25 mOsm/kgH2〇。 144045.doc -40- 201008596 通常，在125 mg/mL下之SC CTLA4Ig調配物之滲透壓度為 約250至約800 m0sm/kgH20，較佳約700至約800 mOsm/kgH2〇，更佳約 750至約 800 mOsm/kgH2〇。 製備SC調配物 開發用於SC調配物之製造方法通常包含與糖及界面活性 劑混配，接著無菌滅菌過濾及填充至小瓶或注射器中，視 情況先透濾（緩衝劑交換）及使用超濾單元濃縮藥物。 實例I及II分別描述SC Belatacept及Abatacept藥品之製 〇 造。 熟習此項技術者將明白需要使容器裝填過量以便補償在 製備及注射期間小瓶、針、注射器滯留量。舉例而言，將 40°/。過剩量之藥品併入SC液體調配物之各小瓶中以解決抽 取損失且保證含有100 mg belatacept藥品之0.8 ml溶液可自 小瓶抽取。 液髏調酤物 在特定情況下，諸如當患者在移植後，在醫院中經由IV • 途徑接受所有藥物時，IV調配物可為較佳投藥途徑。熟習 此項技術者將認識到分別對製造商及保健專家而言，凍乾 調配物之缺點及風險。對保健專家之與復水相關之風險及 缺點包含污染、發泡及產品損失以及製備IV調配物所需之 保健專家之時間。另外，製造商之設備成本及員工時間可 藉由移除製造方法之冷凍乾燥步驟而降低。所有該等原因 足以成為設計用於IV用途之液體調配物之動機。 欲開發之較佳液體調配物為模擬凍乾藥品所第一次配成 144045.doc -41 · 201008596 之蛋白質濃度為約25 mg/ml者之調配物。隨後，由保健專 家在使用時用〇·9%氣化鈉注射液，USP將所採購之液體調 配物進—步稀釋至1與1〇 mg/ml之間的所要藥品濃度。注 射用之經稀釋藥品為等張的且適於藉由靜脈内輸注之投 藥。 如上文所討論，液體調配物之長期安定性為蛋白質藥品 之問題。為確認溶液抵抗形成高分子量物質之長期安定 性，進行調配物開發研究以評估本發明之液體調配物之溶 液狀態安定性。 ❿ 本發明之液體調配物包括於水性載劑中與有安定化作 用之量之糖組合的蛋白質濃度為至少20 mg/ml之CTLA4Ig 分子，較佳與有安定化作用之量之糖組合的蛋白質濃度為 至）25 mg/ml之CTLA4Ig分子。較佳地，糖之量係使蛋白 質與糖之重量比為至少1:1者。糖較佳為雙醣最佳為蔗 糖。液體調配物亦可包括選自由緩衝劑、界面活性劑及防 腐劑組成之選項單中之一種或多種組份。 適用於安定液體藥品之蔗糖之量係使蛋白質與蔗糖之重 ❿ ®比為至少1:1者，較佳係使蛋白質與蔗糖之重量比為ι:2 至1:1〇者’更佳係使蛋白質與廉糖之重量比為約1:2者。 若必要，則藉由添加醫藥學上可接受之酸及/或鹼來設 定調配物之ΡΗ值。較佳醫藥學上可接受之酸為鹽酸。較佳 驗為風乳化納。 在調配物開發期Ρβ1，液體藥品之安定性係在75之目標 值下研究。實例VII描述在7.5之阳值下液體純加邮 144045.doc .42· 201008596 藥品之安定性研究。將液體調配物之pH值調節在75，使 樣品處於安定狀態且使用安定性指示尺寸排外層析法（se_ HPLC)檢疋，在各種時間點監測藥品之高分子量物質之增 加。在2_8 C之推薦儲存條件下，未觀察到UMW物質形成 速率之顯著改變。 除聚集外，脫醯胺作用及斷裂為可發生在醱酵、收穫/ 細胞淨化、純化、藥物/藥品儲存期間及在樣品分析期間 發生之肽及蛋白質的產物變異。初步實驗室規模安定性研

籲 究暗不使用在2-8°C下儲存之belatacept(20 mg/ml，pH 7.5)，在24個月時，脫醯胺作用將超過肽圖譜測試方法之 參考水平（升高大於5% T26a或T26b(%T30)最大值）且斷裂 超過SDS-PAGE測試方法之參考水平（降低小於96%主帶最 小值）。自液體調配物（參見上述sc資料）之資料展示本發 明之調配物中所發現之脫醯胺速率隨調配物？11值之降低而 降低。 _ 液體藥品之可接受之PH值範圍為6至8，較佳6至7.8，更 •佳6至7.2。 在另一態樣中，可以至少約10 mM，較佳1〇_2〇〇 mM之 量添加鹽或緩衝組份。鹽及/或緩衝劑為醫藥學上可接受 的且衍生自各種已知酸（無機酸及有機酸）與「成鹼」金屬 或胺。除磷酸鹽緩衝劑外，可使用甘胺酸鹽缓衝劑、碳酸 鹽緩衝劑、檸檬酸鹽緩衝劑及其類似物，在該狀況下鈉離 子、卸離子或銨離子可用作平衡離子。 本文中受關注之水性載劑為醫藥學上可接受的（對向人 144045.doc -43· 201008596 類投藥而言安全且無毒）且適用於製備液體調配物之水性 載劑。說明性載劑包含注射用無菌水（SWFI)、注射用製菌 水（BWFI)、pH值緩衝劑（例如磷酸鹽生理食緩衝鹽水）、無 菌生理食鹽水溶液，林格氏溶液或右旋糖溶液。 可視情況向本文中之調配物中添加防腐劑以減少細菌作 用。添加防腐劑可（例如）有助於多用（多劑量）調配物之製 造。 如對凍乾藥品之討論，CTLA4Ig分子不與標準注射器中 所發現之聚矽氧相容，因為其與聚矽氧相互作用以形成可 見微粒，進而限制保健專家使用不含聚矽氧之注射器。液 體調配物可視情況包括界面活性劑以防止在聚矽氧存在下 形成可見微粒。

Belatacept液體藥品，20 mg/ml(250毫克/小瓶）藥品之典 型組成提供於下文之表6中。 表6

Belatacept液禮蘗品，20 mg/ml(250毫克/小瓶）之组成 組份 量1(毫克/小瓶） Belatacept 260 蔗糖 520 單水合磷酸二氫鈉 18.1 氣化納 15.3 鹽酸 調節至pH 7.5 氫氧化納 調節至pH 7.5 注射用水 足量至13 ml 144045.doc -44- 1 包含小瓶、針、注射器損失之4%裝填過量 液體調配物之推薦儲存條件為2-8°C，推薦存放期至少 201008596 12個月。 製備液髏調配物 液體藥品製造方法通常包含與糖及視情況界面活性劑混 配’接著無菌過濾及填充至小瓶中，塞堵及封蓋。 通常將經調配之本體溶液設定在固定蛋白質濃度下以便 所要小瓶填充體積可保持怪定。在向藥物中添加糖期間， 混合器速度控制在250±50 rpm下以便最小化分批溶液中之 發泡且確保糖在1〇至20分鐘内完全溶解。經調配之本體溶 ❹ 液可在填充前’在2-8°C下或室溫及室光下儲存至少24小 時。 由於CTLA4Ig分子之熱敏感性，因此最後不對本體溶液 滅菌。本體溶液可使用兩個串聯之〇.22 μϊη ΜηΠρ()π

Millipak®滅菌級過濾器來滅菌，隨後填充至用於冷凍乾燥 之小瓶中。 熟習此項技術者將明白需要使容器裝填過量以便補償在 製備及注射期間小瓶、針、注射器滯留量。舉例而言， ^ Belatacept藥品，20 mg/ml(25〇毫克/小瓶）之各小瓶含有4% 過剩量之藥品以解決復水及抽取損失。 製品 在本發明之另一實施例甲，提供一種含有藥品之製品且 較佳提供其用途之說明。該製品包括一容器。適合容器包 含（例如）瓶、小瓶、注射器及試管。該容器可自諸如^ 璃、塑料或金屬之各種材料形成。 容器容納綠調配物或液體調配物。容器上之標藏或與 144045.doc -45- 201008596 容器相關之標籤可指示復水及/或使用之說明。舉例而 5 ’標籤可指示將25 mg/ml belatacept藥品稀釋至如上文 所述之蛋白質濃度。標籤可進一步指示8(：調配物適用於或 欲用於皮下投藥。容納調配物之容器可為多用小瓶，其容 許重複投與（例如2-6次投與）（例如）皮下調配物。或者，容 器可為含有（例如）皮下調配物之預填充注射器。 製品可進一步包括包含一（例如）用於凍乾調配物之適合 載劑之第二容器。 製品可進一步包含自商業及使用者立場為理想之其他材 料，其包含其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器及 帶有使用說明之包裝插頁。 不含聚矽氧之注射器較佳（諸如）在復水凍乾藥品及/或將 溶液自小瓶轉移至靜脈注射袋後用於不含界面活性劑之藥 品且可與樂品小瓶共同封裝。 使用方法 本發明進一步提供治療免疫系統疾病或誘發耐受性之方 法’其包括投與有效量之本發明之CTLA4Ig分子調配物。 在特定實施例中’該等免疫系統疾病係藉由CD28-陽性細 胞及/或CTLA4-陽性細胞與CD80/CD86-陽性細胞之相互作 用來介導。在另一實施例中，抑制T細胞相互作用。免疫 系統疾病包含（但不限於）自體免疫疾病、免疫增生性疾病 及移植物相關病症。該等方法包括向受治者投與本發明之 CTLA4Ig分子調配物以調節T細胞與CD80-陽性細胞及/或 CD86-陽性細胞之相互作用。移植物相關疾病之實例包含 144045.doc •46- 201008596 移植物抗宿主疾病（GVHD)(例如可由骨髓移植造成或造成 誘發耐受性）’與移植物移植排斥反應、慢性排斥反應及 包含實體g、皮膚、肤島、肌肉、肝細胞、神經元之組 織或細胞同種異體移植或異種移植相關之免疫病症，免疫 增生性疾病之實例包含（但不限於）牛皮癣；T細胞淋巴 瘤；T細胞急性淋巴母細胞白血病；睾丸血管中心性τ細胞 淋巴瘤；良性淋巴球性脈管炎；及自體免疫疾病，諸如狼 瘡（例如紅斑狼瘡、狼瘡腎炎）、橋本氏曱狀腺炎 β (Hashimoto’s thyroiditis)、原發性黏液水腫、葛瑞夫茲氏 病（Graves’ disease)、惡性貧血、自體免疫萎縮性胃炎、艾 迪森氏病（Addison’s disease)、糖尿病（例如胰島素依賴性 糖尿病、I型糖尿病）、肺出血腎炎症候群（good pasture’s syndrome)、重症肌無力、天疱瘡、克羅恩氏病（Cr〇hn’s disease)、交感神經眼炎、自體免疫葡萄膜炎、多發性硬 化症、自體免疫溶血性貧血、特發性血小板減少、原發性 膽汁性肝硬化症、慢性作用性肝炎、潰瘍性結腸炎、休格 林氏症候群（Sjogren’s syndrome)、風濕性疾病（例如類風濕 性關節炎）、多發性肌炎、硬皮病及混合結締組織疾病。 本發明進一步提供一種抑制受治者之實體器官及/或組 織移植排斥反應之方法，該受治者為移植組織之接受者。 通常’在組織移植中，移植物之排斥反應係經由T細胞將 其認作外來物’接著破壞移植物之免疫反應來起始。本發 明之CTLA4Ig分子調配物可藉由抑制τ淋巴細胞增殖及/或 細胞激素分泌而使組織破壞減少，且誘發抗原-特異性T細 144045.doc -47- 201008596 胞之不反應性，使得移植物被長期接受而無需全身性免疫 抑止。此外’本發明之CTLA4Ig分子調配物可與包含（但不 限於）以下各者之其他藥劑一起投與：皮質類固醇、環孢 素（cyclosporine)、雷帕擻素（rapamycin)、黴盼酸嗎琳乙酯 (mycophenolate mofetil)、硫》全嗓呤（azathioprine)、他克莫 司（tacrolismus)、巴利昔單抗及/或其他生物劑。 本發明亦提供抑制受治者之移植物抗宿主疾病之方法。 該方法包括向受治者單獨投與本發明之調配物，或將其連 同可與IL-2、IL-4或γ-干擾素反應之其他另外配位體一起 投與。舉例而言，本發明之CTLA4Ig分子SC調配物可向骨 髓移植接受者投與以抑制供體T細胞之同種異體反應性。 或者’可在移植之前使骨趙移植物中之供體T細胞耐受接 受者之離體同種異體抗原。 藉由本發明之CTLA4Ig分子調配物來抑制τ細胞反應亦 可適用於治療自體免疫病症。許多自體免疫病症由不適當 活化T細胞而造成，該等T細胞反應性抵抗自體抗原且促進 疾病病理學中所涉及之細胞激素及自體抗體之產生。在患 有或易得自體免疫病症之受治者中投與CTLA4Ig分子調配 物可防止活化自體反應性T細胞且可減少或消除疾病症 狀。該方法亦包括向受治者單獨投與本發明之調配物，或 將其連同可與IL-2、IL-4或γ-干擾素反應之其他另外配位 體一起投與。 本發明之調配物之最有效投藥模式及給藥方案視疾病之 嚴重性及進程、患者之健康及對治療之反應及治療醫師之 144045.doc -48- 201008596 判斷而定。根據本發明之實踐’治療受治者之有效量可介 於約0.1與約10 mg/kg受治者體重之間。又，有效量可為介 於約1與約10 mg/kg受治者體重之間的量。 本發明之CTL A4Ig分子調配物可以足以在受治者中阻斷 内因性B7(例如CD80及/或CD86)分子結合其各別配位體之 量及時間（例如時間長度及/或多次）來向受治者投與。阻斷 内因性B7/配位體結合進而抑制B7-陽性細胞（例如CD80-陽 性細胞及/或CD86-陽性細胞）與CD28-陽性細胞及/或 φ CTLA4-陽性細胞之間的相互作用。CTLA4Ig分子之劑量視 許多因素而定，其包含（但不限於）受感染之組織類型、所 治療疾病之類型、疾病之嚴重性.、受治者之健康及受治者 對用藥劑治療之反應。因此，藥劑之劑量可視受治者及投 藥模式而改變，美國專利申請案美國公開案第US 2003/ 0083246號及美國專利申請案美國公開案第US 2004/ 0,022787號教示具有SEQ ID NO:2所示之胺基酸序列之 CTXA4Ig用於治療諸如類風濕性關節炎之風濕性疾病的劑 ® 量及投藥進度。所有均以引用之方式併入本文。 有效量之CTLA4Ig分子可視情況以每小時/天/週/月/年單 次或多次而每天、每週、每月及/或每年向受治者投與。 舉例而言，在一實施例中，有效量之CTLA4Ig分子可開始 每兩週一次投與歷時1個月且隨後每月投與一次。 CTLA4Ig分子之有效量為約0.1至100 mg/kg受治者重量 之量。在另一實施例中，有效量為約0.1至20 mg/kg受治者 重量之量。在一特定實施例中，CTLA4Ig之有效量為約2 144045.doc •49- 201008596 mg/kg受治者重量之量。在另一特定實施例中，CTLA4Ig 之有效量為約10 mg/kg受治者重量之量。在另一特定實施 例中’ CTLA4Ig之有效量為對體重小於60 kg之受治者而言 500 mg，對體重在60-100 kg之間的受治者而言750 mg且對 體重大於100 kg之受治者而言1〇〇〇 mg。 2005年4月6日申請之美國專利申請案第60/668,774號及 2〇〇6年4月6日申請之美國專利申請案第11/399,666號教示 具有SEQ ID NO:4所示之胺基酸序列之LEA29YIg用於治療 與移植物移植相關之免疫病症的劑量及投藥進度。所有均 以引用之方式併入本文。 通常，本發明之CTLA4Ig分子調配物之劑量係以體重 計，且投藥方案可藉由目標血清最低分佈來指定。通常’ 在移植後之前3至6個月期間，介於約3 pg/mL與約30 pg/mL之間的本發明之LEA29YIg分子之目標最低血清濃度 將足以維持同種異體移植物之功能，該濃度較佳介於約5 pg/mL與約20 pg/mL之間。通常，在維持階段期間，本發 明之LEA29YIg分子之目標最低血清濃度係介於約〇·2 pg/mL與約3 pg/mL之間，較佳介於約0.25 pg/mL與約2.5 pg/mL之間。 本發明之LEA29YIg分子可以介於約0.1至約20.0 mg/kg 患者重量之間，通常介於約1.0至約15·0 mg/kg之間的量來 投與。舉例而言，L104EA29YIg可在早期階段期間，亦即 移植後之高風險期，以10 mg/kg患者重量來投與，且遞減 至5 mg/kg患者重量用於維持劑量。 144045.doc -50- 201008596 可經由30分鐘至—或多小時之靜脈内輸注來投與本發明 之CTLA4Ig分子。或者，單次至多次皮下注射可傳遞所需 劑量。通常’在治療之早期階段期間，利用3〇分鐘靜脈内 冑注作為技藥途徑’而患者住院及/或定期訪問保健專家 歧行監測。皮下注射為在維持階段期間所利用之典型投 藥模式，進而藉由減少因靜脈内輸注而對保健專家之訪問 來使患者返回其正常進度。 實例10描述凍乾IV CTLA4Ig調配物於健康受治者及患有 • 類風濕性關節炎（RA)之患者中之藥物動力學。abatacept於 RA患者及健康受治者中之藥物動力學似乎為相當的。在 RA患者中，在多次靜脈内輸注後，abatacept之藥物動力學 展不在2 mg/kg至1〇 mg/kg之劑量範圍RCmax&Auc之成比 例增加。在ίο mg/kg下，至第60天，血清濃度似乎以24 mcg/mL(約1至約66 mcg/mL)之平均最低濃度（範圍）達到穩 定狀態。在RA患者中以每月之時間間隔繼續重複1〇 mg/kg 之治療後’未發生abatacept之全身性積聚。 擊本發明將藉由參考以下實例而更完全地理解。然而，其 不應視作限制本發明之範疇。貫穿本揭示案之所有引用案 在此均以引用之方式明確地併入。

實例I

Belatacept SC，125 mg/ml(100毫克/小瓶）藥品係調配成 適於皮下投藥之無菌、非熱解性即用溶液。

Belatacept SC藥品，125 mg/ml(l〇〇毫克/小瓶）以 2.2 kg 規模（1500個小瓶）來製造。分批配方提供於下文之表7中。 144045.doc -51- 201008596 表7 代表性分批配方 組份 每批之量(g) Belatacept 藥物b 250.0 蔗糖 340.0 泊洛沙姆188 16.0 單水合磷酸二氫鈉 0.662 無水磷酸氫二鈉 2.13 注射用水 足量至2.2 kg 總分批•量(kg) 2.2 kg a 3總分批量2.2 kg(2-L)。溶液之密度為1.10 g/ml(在20-25°C 下）。 bBelatacept藥物：蛋白質濃度25 mg/ml、25 mM填酸納、 10 mM氣化鈉，pH 7.5，<5%之HMW物質

Belatacept SC藥品，125 mg/ml(100毫克/小瓶）藥品之製 造方法包含本體藥物自pH 7.5之25 mM碟酸納、10 mM氣 化鈉緩衝劑至pH 7.5之10 mM磷酸鈉緩衝劑之緩衝劑交 換，接著藉由移除緩衝劑將蛋白質自約25 mg/ml濃縮至約 15 0 mg/ml。緩衝劑交換係藉由對新pH 7 · 5之10 mM麟酸納 緩衝劑5次透濾本體藥物來完成，接著藉由移除緩衝劑將 蛋白質濃縮至約1 50 mg/ml。不錄鋼Pelicon迷你過滤器固 持器（Millipore)配備不銹鋼壓力計及於進料口、保留物口 及滲透物口上之膜閥。與Pellicon迷你模組一起使用之2個 過濾盒裝配有0.1 m2面積之具有30 kDa標稱分子量截斷極 限值之Biomax聚醚颯膜。過濾盒係根據製造商之推薦來安 裝。用於藥物之進料容器為具有磁攪拌桿之4公升玻璃容 144045.doc -52- 201008596 器。MasterFlex高效能聚矽氧管係用以將進料容器連接至 過濾器固持器及用於滲透管線。藉由安裝於進料管線中之 蠕動泵來提供進料流。隨後將蔗糖及泊洛沙姆188溶於濃 縮蛋白質溶液中且由pH 7·5之10 mM磷酸鈉緩衝劑來調節 最終分批重量。經由0.22微米無菌過濾器來過濾本體溶液 且將其填充至無菌及去熱5-cc I型燧石玻璃小瓶中，用20 mm橡膠塞來塞堵且用20 mm鋁質易拉密封件來密封。 Belatacept SC藥品，125 mg/ml(100毫克/小瓶）藥品之組成 φ 提供於下文之表8中。 表8

Belatacept SC藥品，125 mg/ml(100毫克/小瓶）之组成 組份 量(毫克/小瓶)d Belatacept 140.0 蔗糖 190.4 泊洛沙姆188 8.96 單水合填酸二氫鈉 0.371 無水磷酸氫二鈉 1.193 注射用水 足量至1.12 ml d包含小瓶、針、注射器損失之40%裝填過量

實例II

Abatacept SC，125 mg/ml(125毫克/小瓶）藥品係調配成 適於皮下投藥之無菌、非熱解性即用溶液。一批Abatacept SC藥品，125 mg/ml(125毫克/小瓶）藥品以5 L規模（3,500個 小瓶）來製造。分批配方描述於下文之表9中。 144045.doc -53- 201008596 表9 分批配方 組份 量(gm) Abatacept 藥物a 625 蔗糖 850 泊洛沙姆188 40 單水合填酸二氫鈉 0.715 無水磷酸氫二鈉 4.86 注射用水 足量至5.0 L 總分批量(L) 5.0 aAbatacept藥物：蛋白質濃度50 mg/ml、25 mM構酸納、50 mM氣化鈉，pH 7.5，<5%之HMW物質 如上文實例I中所述，Abatacept SC藥品，125 mg/ml( 125 毫克/小瓶）藥品之製造方法包含本體藥物自pH 7.5之25 mM構酸鈉、50 mM氯化納至pH 7.8之10 mM填酸納緩衝劑 之緩衝劑交換，接著藉由移除緩衝劑將蛋白質自約50 mg/ml濃縮至約1 50 mg/ml。隨後將嚴糖及泊洛沙姆1 88溶 於濃縮蛋白質溶液中且由pH 7.8之10 mM磷酸鈉緩衝劑來 調節最終分批重量。經由0.22微米無菌過濾器來過濾本體 溶液且將其填充至無菌及去熱5-cc I型燧石玻璃小瓶中， 用20 mm橡膠塞來塞堵且用20 mm鋁質易拉密封件來密 封。

Abatacept SC藥品，125 mg/ml(125毫克/小瓶）之組成提 供於下文之表10中。 144045.doc -54- 201008596 表ίο

Abatacept SC，125 mg/ml(125毫克/小航）築品之组成 組份 量(毫克/小瓶)e Abatacept 175 蔗糖 238 泊洛沙姆188 11.2 單水合構酸二氫鈉 0.20 無水填酸氫二納 1.36 注射用水 足量至1.4 ml e包含小瓶、針、注射器損失之40%裝填過量

實例III

Abatacept凍乾（250毫克/小瓶）藥品為適於靜脈内（IV)投 藥之無菌、非熱解性親液膠體。各單用小瓶含有250 mg之 abatacept，其係在使用時由注射用無菌水，USP配成溶液 且進一步由0.9%氯化鈉注射液，USP稀釋。 用於115公升分批量之分批配方描述於下文之表11中。 表11 分批配方 組份 量(kg) Abatacept 藥物a 4.6 單水合麥芽糖 9.2 鹽酸 調節至pH 7.5 氫氧化納 調節至pH 7.5 注射用水 足量至119.6b aabatacept藥物：蛋白質濃度50 mg/ml、25 mM填酸鈉、50 mM氣化鈉，pH 7_5，<5%之HMW物質 •^經調配之本體溶液密度=約1.04 g/ml 將所需量之abatacept藥物添加至配備混合器之乾淨及無 144045.doc -55- 201008596 菌不銹鋼混合谷器中。在250±50 rpm下混合藥物溶液同時 將溶液溫度維持在5-25°C之間。 將所需量之單水合麥芽糖粉末添加至該混配容器中。在 15 - 2 5 C下’將溶液混合最少1 〇分鐘。 若必要，則使用先前所製備之丨1^氫氧化鈉溶液或i ^^鹽 酸溶液將溶液pH值調節至7·3_7.7。使用注射用水，usp使 批量達到最終分批重量（最終足量）且將其混合最少8分鐘。 對經調配之本體溶液取樣以測定pH值。 用1個0.45-μιη過濾器將經調配之本體溶液預過濾。在經 〇·45-μιη過濾器過濾後’對經調配之本體溶液取樣以測定 生物負荷及細菌内毒素（BET)。 在填充前，用2個串聯之〇·22-μιη過濾器將預過濾之經調 配本體溶液無菌過濾。 填充經無菌過濾之經調配本體溶液且藉由全自動填充/ 塞堵機用20 nm-Daikyo灰色丁基塞部分地將其塞堵。將15_ cc I型燧石管玻璃小瓶洗滌且滅菌/去熱。 將經填充及部分塞堵之藥品小瓶凍乾。在凍乾abatacept 藥品期間所使用之冷凍乾燥循環的概述提供於下文之表12 中。 144045.doc •56- 201008596 表12 abatacept束乾藥品之冷來乾燥猫環 製程參數 處理中之控制 加載溫度 5 土 3°C 冷凍(變溫式存放） 2·5小時内，自5。。至-45。。 冷凍 在-45±3°C下保持4小時 第一乾燥(變溫式存放） 2小時内，自-45°C至-19°C 初級乾燥(真空） 100±20微米 初級乾燥 在-19±2°C下保持84小時 中間乾燥(變溫式存放） 2小時内，自-19°C至〇°C 中間乾燥 在0±3°C下保持8小時 第二乾燥(變溫式存放） 2.5小時内，自0°C至30°C 第二乾燥(真空） 100±20微米 第二乾燥 在30°C下保持12小時 塞堵 30±3〇C 塞堵(真空） 500±100 微米 卸載前之儲存 在20±3°C下保持至少4小時 凍乾循環結束時，使用經無菌過濾之氮將室壓升高至 500微米且在真空下執行小瓶塞堵。經塞堵之小瓶在凍乾 器内保留至少4小時。在經HEPA過濾之空氣下，藉由封蓋 機用20 mm鋁質、白色易拉密封件將經凍乾及塞堵之小瓶 密封。藉由外部小瓶洗滌器用去離子水沖洗經密封之小 瓶。在2至8°C下儲存經洗滌之藥品小瓶。 珠乾abatacept(250毫克/小瓶）藥品之組成列於下文之表 13中。 144045.doc •57- 201008596 表13 洗乾abatacept(250毫克/小瓶）鸚品之组成 組份 量(毫克/小瓶)f Abatacept 262.5 單水合麥芽糖 525 單水合鱗酸二氫鈉b 18.1 氣化鈉b 15.3 鹽酸 調節至7.5 氫氧化納 調節至7.5 含小瓶、針、注射器損失之5%裝填過量 5該等組份存在於abatacept藥物溶液中

實例IV

Belatacept束乾（1 00毫克/小瓶）藥品為適於靜脈内（IV)投 藥之無菌、非熱解性親液膠體。各單用小瓶含有100 mg之 belatacept，其係用4.2ml之注射用無菌水，USP來配成溶 液以產生25 mg/ml之濃度。其可在使用時進一步用5%右旋 糖注射液，USP或0.9%氣化鈉注射液，USP稀釋至低至1 mg/ml之濃度。 藥品製造之分批量可自20公升變化至120公升。用於分 批量為66公升（12,000個小瓶）之代表性分批配方提供於下 文之表14中。 表14 分批董為66公升（12,000個小瓶）之分批配方 組份 量(kg) Belatacept 藥物a 1.32 高純度，低内毒素蔗糖 2.64 單水合磷酸二氫鈉 0.18 144045.doc •58· 201008596 組份 量(kg) 氣化納 0.03 1N氫氧化鈉/或1N鹽酸 調節pH值至7.5 注射用水 足量至分批重量 aBelatacept藥物：蛋白質濃度25 mg/ml、25 mM磷酸納、 10 mM氣化鈉，pH 7.5，<5%之HMW物質

Belatacept凍乾藥品係如上文實例ΙΠ中所述來製造。 柬乾belatacept樂品’ 1 〇〇毫克/小瓶之組成列下文之表15 中。

表15 床乾BELATACEPT 100毫克/小瓶藥品之組成 組份 重/小瓶(毫克） Belatacept 110a 高純度，低内毒素嚴糖 220 單水合攝酸二氫鈉 15.18 氣化納 2.55 ' 1N氫氧化鈉 調節至pH 7.5 1N鹽酸 調節至pH 7.5 a各小瓶含有復水溶液之小瓶、針及注射器滯留之1〇%裝填 過量。

資例V 藉由使調配物在不同溫度下且歷時各種時間週期處於安 定狀態來進行Belatacept藥品之SC液體調配物之安定性研 究。 蔗输之作用 進行調配物開發研究以評估各種含量之蔗糖對belaucept 藥品之溶液安定性之作用。使樣品在_7(rc、8艺及25。〇/ 144045.doc -59· 201008596 60%濕度條件下處於女定狀態且在各種時間點監測。所評 估之蛋白質與Μ糖之比率為1:1、1:1 7及1:1 75。 belatacept之高分子量（HMW)物質之形成用以確定溶液中 之蛋白質安定性。結果展示於下文之表丨6中。 表16 各種含量之蔗输對100 mg/m丨之Belatacept藥品的作用 儲存條件 時間/月 %高分子量物質 對照a 1:1 1:1.75 1:1.7 初始 0 1 U1 1.07 1.05 1.06 -70°C 3 1.18 1.09 1.07 1.09 8°C 1 1.22 1.10 1.08 1.07 2 1.34 1.15 1.08 1.09 3 ΝΑ 1.24 1.15 1.17 6 1.78 1.39 1.23 1.24 9 2.02 1.53 1.34 1.34 12 2.06 1.49 1.26 1 24 25°C/60%相對濕度 0 1.11 1.07 1.05 1.06 1 2.73 1.83 1.48 1.56 2 3.98 2.41 1.84 1.87 3 4.88 3.02 ΝΑ 2.23 6 7.44 4.56 3.21 ΝΑ 於10 mM磷酸鈉緩衝劑中之Belatacept藥品，1〇〇 mg/mi， pH 7.5 研究結果展示蔗糖與蛋白質比率之增加改善蛋白質安定 性。選擇1··1_36(重量：重量）之蛋白質與蔗糖之比率用於開 發SC/合液，因為其提供最佳安定性而不使藥品具有過度高 渗壓。 界面活性銷之作用 評估諸如聚山梨醇酯80及泊洛沙姆J 88之市售產品中各 種界面活性劑對belatacept藥品之溶液安定性的作用。在 144045.doc 201008596 4、6及8 mg/ml之含量下評估泊洛沙姆188且在1及2 mg/ml 之最終調配物濃度下評估聚山梨醇酯80。使樣品在 -70°C、8°C及25°C/60%濕度條件下處於安定狀態且在各種 時間點監測。結果展示於下文之表17中。 表17 各種含量及類型之界面活性刻對Belatacept藥品（1〇〇 mg/ml)之作用 儲存條件 時間/月 %高分子量物質 對照a 泊洛沙姆188 mg/ml 聚山梨醇 酯80 mg/ml 4 6 δ 1 2 初始 0 1.11 1.06 1.07 1.07 1.08 1.08 -70。。 3 1.18 1.09 ΝΑ 1.09 1.11 1.15 8°C —1 1.22 1.10 1.08 1.09 1.10 1.12 2 1.34 1.09 1.10 1.11 1.12 1.12 3 ΝΑ 1.19 1.18 1.18 1.21 1.28 「6 1.78 1.27 1.23 1.25 1.29 1.30 9 2.02 1.34 1.33 1.34 1.42 1.40 12 2.06 1.28 1.25 1.27 1.38 1.36 25°C/60%相對濕度 0 1.11 1.06 1.07 1.07 1.08 1.08 1 2.73 1.52 1.52 1.52 1.55 1.55 \Y 3.98 1.91 1.89 1.89 1.99 1.97 3 4.88 2.31 2.29 2.24 2.56 2.50 6 7.44 3.39 4.05 ΝΑ 3.89 3.90 ❸ ❹ 蛋白質：喪糖（1:1.7)，1〇〇 mg/ml，pH 7·5 界面活性劑之作用之結果暗示，界面活性劑對belatacept 藥品溶液之安定性不具有顯著作用。在所評估之泊洛沙姆 188之含量中，發現8 mg/ml之濃度足以防止在調配物中形 成I梦氧相關微粒。 pH值之作用 144045.doc -61- 201008596 評估作為pH值之函數之Beiatacept sc(125 mg/m卜蛋白 質：簾糖1:1.36，8 mg/ml Pluronic F68)藥品的安定性。用 1N氫氧化納或1N鹽酸將溶液pH值調節在7至8.2之間。使 樣品在2-8。(：及25。(：/60%相對濕度條件下處於安定狀態且在 各種時間點監測。分析測試包#pH值及SE_HPLC以監測高 分子量（HMW)物質之增加。該等結果概述於下文之表18 中〇 表18 pH值對Belatacept SC藥品之作用* 條件 *間/月 %高分子量物質 pH 7.0 pH 7.4 pH 7.8 pH 8.2 初始 0 1.31 1.18 1.16 1.28 2-8〇C 1 1.34 1.23 1.25 1.44 2 1.42 1.29 1.31 1.56 3 1.48 1.35 1.36 1.59 25°C/60%相對濕度 1 2.09 2.62 2.13 2.52 2 7.04 5.68 5.89 6.40 3 卜 9·98 6.13 ΝΑ 7.81 *蛋白質.兔糖（1.1.36)，125 mg/ml，+8 mg/ml Pluronic F68 在2-8°C之推薦儲存條件下，未觀察到HMW物質之形成 ❹ 速率之顯著改變。另外’溶液狀態安定性資料展示最大安 定性之pH值介於7與8之間。基於此，選擇7_8ipH值範 圍’並選擇7.5之目標pH值用於該調配物。 滲透簾度 使用蒸氣壓方法在不同蛋白質濃度下及自調配物方法之 分離步驟量測於各種緩衝劑中之belatacept藥品溶液之滲透 壓度。該等結果概述於下文之表19中。 144045.doc •62· 201008596 表19 於各種緩衝劑中及在各種濃度下之Belatacept糗品溶液 之滲透壓度測定

Belatacept/緩衝劑/賦形劑 蛋白質濃度 (mg/ml) 磷酸鈉 氣化納 滲透壓度 (mOsm/kg) Belatacept API，原態 25 25 mM 10 mM 89 Belatacept，透遽步驟 25 10 mM — 40 Belatacept，透瀘7濃縮步驟 138 10 mM — 58 於水中之Belatacept 25 — — 17 於水中之Belatacept 100 — — 27 Belatacept:嚴糖(1:1) 100 10 mM — 424 Belatacept:嚴糖(1:1 · 7) 100 10 mM — 737 Belatacept:嚴糖(1:1.75) 100 10 mM - 769 Belatacept:嚴糖(1:2) 100 10 mM — 870 Belatacept:嚴糖(1:1 · 36) 125 10 mM — 770

攪動/震盪之作用 在100 mg/ml及125 mg/ml之濃度下測定擾動對belatacept SC藥品之溶液安定性之作用。在2-8°C下，在腕臂式震盪 器之速度3下震盪於5 cc管式小瓶中含有約1 ml之溶液等分 試樣。藉由將震盪器置放於2-8°C之冷室中來維持震盪器 之溫度。以適當時間間隔抽取樣品且檢定pH值及視覺外觀 且同時亦在攪動30天後評估樣品之生物活性。 當在2-8°C下擾動時，在100 mg/ml及125 mg/ml濃度下擾 動長達30天之樣品未展示HMW物質含量、SDS-PAGE分 佈、肽圖譜、B7結合檢定、pH值、外觀或蛋白質濃度之 改變。 多次冷凍/解凍之作用

在具有範圍為7.0至8.2之pH值的樣品中研究多次冷凍及 解凍對belatacept SC藥品調配物之安定性之作用。將在pH 144045.doc -63- 201008596 7.0、7.4、7.8及8.2之匕61&1&〇6卩18。藥品調配物（125 1!1§/1111) 之約10 μΐ等分試樣分配於30 ml Nalgene PETG容器中。藉 由在-7(TC下儲存小瓶，接著在周圍溫度下（251)解凍1〇分 鐘來執行多次冷凍及解凍。重複該循環歷時5天。在各冷 凍/解凍循環後，分析小瓶内含物之pH值、％ HMW物質及 外觀。 在5次冷凍/解凍循環期間，未在樣品中觀察到pH值、外 觀或％高分子量物質内含物之改變。 推薦儲存條件

Belatacept SC藥品，100毫克/小瓶（125 mg/ml)之推薦儲 存條件為2-8°C，推薦存放期為12個月。 注射器-能力研究 在2-8°C條件下，用belatacept SC藥品（125 mg/ml)執行注 射器-能力研究。評估具有1 ml及0.5 mL注射器之各種針 號。注射器填充時間及傳遞力係記錄於下文之表20中。 表20 ▲ 2-8°CT2BelataceptSC^S，125mg/mni.S)fe》 研究 注射器尺寸 針號 填充時間(秒） 傳遞 力 1 mL 27G 1/2" 25 中等 1 mL樁針(姨島素） 28G 1/2" 52 中等 1 mL樁針(胰島素） 29G 1/2" 50 中等 0.5 mL樁針(胰島素） 30G 42(對1 mL而言為94) 南 144045.doc -64- 201008596 基於展示於表20中之注射哭* _ 射18 _忐力研究結果。推薦21 口 徑X 1丨石吋無菌皮下注射針用 1叩目小瓶抽取該產品且2 7 口徑 χ1〆2吋針用於後績給藥。

資例VI 藉由使調配物在不同溫度下處於安定m歷時各種時 間週期來進行Abataeept藥品之魏調配物之安定性研究。 麥芽糖之作用 進行調配物開發研究以評估各種含量之麥芽糖對 ® abatacept藥品之安定性之作用。使樣品在5〇t下處於安定 狀態且在各種時間點監測。所評估之蛋白質與麥芽糖之比 率為1:1、1:2及1:5。abatacept之高分子量（HMW)*質之形 成用以確定固體狀態下之蛋白質安定性。結果展示於下文 之表21中。 表21 在50°C下麥芽糖對Abatacept鸚品之冷凍乾燥固韙狀想 安定性之作用 根據SE-HPLC之高分子量物質含量(面 積％) 時間(週） 無麥芽糖 藥物與麥芽糖之重量 比 1:1 1:2 l:5a 初始 0,9 0.7 0.6 2.0 2 5,4 3.7 2.0 ΝΑ 4 8.0 5.9 2.7 2.4 6 10.2 6.8 3.3 ΝΑ 8 11.7 7.5 3.9 2.9 144045.doc •65- 201008596 在'5〇毫克/小瓶之濃度之早期開發期間評估具有1:5藥物 與麥芽糖之重量比之藥品的安定性。用於該研究之藥物批 量不同於用於該表中之其他結果之彼者。其原因為在該等 樣品中之尚分子量物質之不同初始含量。 結果證實呈冷凍乾燥固體狀態形式之abatacept藥品之安 定性在麥芽糖存在下增強。另外，適用於安定abatacept之 麥芽糖之最小量測定為1:2蛋白質與麥芽糖之重量比。 pH值之作用 a平估作為pH值之函數之凍乾Abatacept藥品（25〇毫克/小 瓶，蛋白質：麥芽糖1:2)的安定性。用1N氫氧化鈉或以鹽 酸將溶液pH值調節在6至8之間。使樣品在2-8°C條件下處 於：ir疋狀態且在各種時間點監測。分析測試包含值及 SE-HPLC以監測高分子量（HMW)物質之增加。該等結果概 述於下文之表22中。 表22 pH值對高分子量（HMW)物質形成速率之作用 時間(月） 根據SE-HPLC在各種pH值下之HMW物質含 量(面積％) 6.0a 6.5a 7.0 7.5 8.0 初始 0.6 0.6 2.0 2.0 2.0 1 0,5 0.6 2,0 2.0 2.0 2 0.7 0.7 2.0 2,0 2.0 3 0,7 0.7 2.1 2.1 2.1 6 ΝΑ ΝΑ 1.8 1.7 1.8 12 0.8 0.8 1.9 1.8 1.9 a用於pH 6.0及6.5樣品之藥物批量不同於用於pH 7.0、7.5 及8.0樣品之彼者。其原因為在該等樣品中之高分子量物 144045.doc •66- 201008596 質之不同初始含量。 在2-8°C之推薦儲存條件下，未觀察到HMW物質形成速 率之顯著改變。另外，在早期開發期間所產生之溶液狀態 安定性資料展示最大安定性之pH值介於7與8之間。

實例VII 藉由使調配物在不同溫度下且歷時各種時間週期處於安 定狀態來進行belatacept(20 mg/ml)藥品之液體調配物之安 定性研究。 . 蔗帱之作用 進行調配物開發研究以評估各種含量之蔗糖對20 mg/ml 之belatacept液體藥品的溶液安定性之作用。使樣品在 8°C、25°C/60%濕度及30°C/60%濕度條件下處於安定狀態 且在各種時間點監測。所評估之蛋白質與蔗糖之比率為 1:1、1:2、1:5 及 1:10 蛋白質：嚴糖比率，belatacept 為 20 mg/mL。belatacept之高分子量（HMW)物質之形成用以確定 溶液中之蛋白質安定性。概述該等研究之結果且展示於下 ® t之表23中。 表23 各種含量之廉糖對液Ubelatacept蕹品，20 mg/ml的 作用 條件 時間/月 %高分子量物質 1:1 1:2 1:5 1:10 初始 0 0.37 0.37 0.39 0.37 8°C 1 0.39 0.39 0.38 0.36 2 0.40 0.41 0.38 0.37 3 0.43 0.39 0.36 0.36 144045.doc -67- 201008596 25°C/60%相對濕度 30°C/60%相對濕度 時間/月 1-- - _%高分子量物質 ~ hi_ "〇44~ 1:2 ~0Α2~ 1:5 "〇4〇~ 1:10 *037~ 〇 0.58 0.47 0.41 0.39 y ΤΓ —-— 0.54 0.45 0.42 0.39 0.52 0.45 0.44 0.51 1 0.61 0.62 0.66 0.50 2 — ， —^ 1.25 0.99 0.58 0.53 5 ~7---— 1.40 1.00 0.80 0.57 4 1.72 1.40 1.10 0.74 T — a "— 4.29 2.70 2.09 1.18 y "~7ΓΓ-- —* 5.59 4.15 2.33 υ·5 1 — 1.13 0.91 0.75 0.54 1 1.77 2.03 1.25 0 84 2 Τ"——— 3.01 2.90 1.78 1.10 ά 4.32 11.24 5.55 1.75 條件 研究結果展示薦糖與蛋白質與率之增加改善蛋白質安定 性。選擇1:2(重量：重量）之蛋白質與蔗糖之比率用於開發 液艎溶液’因為其提供最佳安定性而錢藥品具有過度高 滲壓。 安定性研究 製備三批液體beieatacept且使其在2_8<t及25t：/6〇%相對 滿度條件下處於安定狀態且在各種時間點監測。蛋白質與 蔗糖之重量比為1:2。belatacept之高分子量（HMW)物質之 形成用以確定液體調配物中之蛋白質安定性。安定性資料 概述於下文之表24中。 144045.doc 68· 201008596 表24 液llbelatacept藥品之安定性 條件 時間月 Belatacept 藥 物(25 mg/mL) 對照 蛋白質:蔬糖(1:2)，20 mg/mL，pH 7.5% HMW物 質 第1批 第2批 第3批 初始 0 0.40 0.37 0.43 0.91 5°C 1 0.44 0.39 0.45 0.90 2 0.47 0.41 0.46 0.90 3 0.47 0.39 0.62 0.91 4 0.54 0.42 NA 0.92 6 0.63 0.47 0.57 0.94 9 0.64 0.45 0.51 1.0 12 0.64 0.45 0.56 NA 25Γ/60%相對濕度 1 0.61 0.62 0.60 1.04 2 1.25 0.99 0.90 1.23 3 1.40 1.00 1.18 1.53 4 1.72 1.40 1.60 1.79 6 4.29 2.70 3.09 2.44 資料展示在2-8°C下12個月内，與無蔗糖之Belatacept藥 物中0.2%增加相比，液體調配物中之高分子量物質之增加 僅為〇. 1%。該等結果亦指示添加蔗糖確實有助於減少高分 ❹ 子量物質之形成。

實例VIII 藉由使調配物在不同溫度下且歷時各種時間週期處於安 定狀態來進行Abatacept藥品之SC調配物之安定性研究。 緩衝#1濃度之作用 評估作為緩衝劑漢度之函數之sc Abatacept藥品（100 mg/ml)的安定性。緩衝系統為5或1 〇 mM填酸鹽緩衝劑。 使樣品在2-8°C及30。(：/60%相對濕度條件下處於安定狀態且 144045.doc -69· 201008596 在各種時間點監測。分析測試包含pH值及SE-HPLC以監測 高分子量（HMW)物質之增加。該等結果概述於下文之表25 中 〇 表25 緩衝濃度對人匕3*汪〇〇?(築品（10〇11^/111丨，？117.5)之作用 儲存條件 時間/月 %高分子量物質 於10 mM磷酸鹽緩 衝劑中 於5 mM填酸鹽 緩衝劑中 初始 0 1.30 1.47 2-8 C 1 1.49 1.74 2 1.60 1.98 3 1.73 2.23 3〇 C/WJ%相对漭度 0 1.30 1.47 0.5 8.73 14.39 1 14.63 23.24 2 25.26 32.25 在1511 7.5下，在 100 mg/mL 之 abatacept 濃度下，與5 mM 填酸鹽緩衝劑相比，在10 mM磷酸鹽緩衝劑中之abatacept 之安定性更好》此外，與5 mM緩衝劑相比，1 〇 mM鱗酸鹽緩衝劑所提供之緩衝能力愈高’調配物之pH值 控制愈好。基於該等資料，選擇1〇 mM磷酸鹽緩衝劑用於 調配物開發。 糖之作用 進行調配物開發研究以評估各種糖對abatacept sc藥品 之'今液女定性之作用。使樣品在2°C、8。(：及30°C/60%濕度 條件下處於安定狀態且在各種時間點監測。所評估之糖為 蔗糖海藻糖及甘露醇。abatacept之高分子量（HMW)物質 之形成用以確定溶液中之蛋白質安定性。結果展示於下文 144045.doc 201008596 之表26中。 表26 各種辕對 1〇〇 mg/ml，pH 7.5之Abatacept SC藥品之 作用 儲存條件 時間/月 %高分子量物質 對照3 1:1 蔗糖 1:1 海藻糖 1:1 甘露醇b 初始 0 1.30 1.18 1.20 1.20 2-8〇C 1 1.49 1.37 1.38 1.25 2 1.60 1.40 1.41 1.26 3 1.73 1.45 1.48 1.60 6 2.10 1.54 N/A N/A 11.5 2.57 N/A N/A N/A 30°C/60%相對濕度 0 1.30 1.18 1.20 1.30 0.5 8.73 4.31 4.34 3.59 1 14.63 7.20 8.09 5.72 2 25.26 11.97 14.21 10.14 3於10 mM磷酸鈉緩衝劑申之Abatacept藥品，1〇〇 mg/nU， pH 7.5 bpH 7·8之甘露醇調配物 研究結果展示與無糖對照相比’所有3種糖蔗糖、海藻 糖及甘露酵向abatacept供應更好的安定性β在3〇°c之加速 條件下之研究結果展示與蔗糖及海藻糖相比，甘露醇向 abatacept供應更好的安定性。蔗糖稍好於海藻糖。在冷卻 下’藉由所有3種糖之安定性並非顯著不同。選擇蔗糖作 為糖之選擇，因為甘露醇調配物具有蔗糖調配物之2倍張 力。選擇蔗糖用於安定將容許添加同樣2倍蔗糖以在相同 比率下達到與甘露醇相同之張力，但達成抵抗聚集之更大 安定性。選擇1:1.36(重量：重量）之蛋白質：簾糖之比率用於 144045.doc -71- 201008596 開發sc藥品’因為其提供最佳安定性而不使藥品具有過度 高滲壓。 蔗耱之作用 進行調配物開發研究以言平估各種含量之嚴糖對 sc藥品之溶液安定性之作用。使樣品在及 3〇°C/60%濕度條件τ處於錢m在各種時間點監測。 所評估之蛋白質與Μ糖之比率為1:1及1:2。abataeept之高 分子量（HMW)物質之形成用以確定溶液中之蛋白質安定 性。結果展示於下文之表27中。 表27 各種含董之蔗蟾對100 mg/m丨，pH 7 kAbatacept sc 藥品的作用

30°C/65»/。相對濕度 1.18 1.17 2 14.63 4.31 2.41 25.26 7.20 3.69 11.97 6.59 a於1〇 mM磷酸鈉緩衝劑中之AbaUcept藥品，1〇〇 mg/mi pH 7.5 研究結果展示U與蛋白f與率之增加改善蛋白質安定 ]·生選擇1.1 ·36(重量.重量）之蛋白質：薦糖之比率用於開發 144045.doc •72· 201008596 RTU,今液，因為其提供最佳安定性而不使藥品具有過度高 滲壓。 界面活性#|之作用 評估諸如聚山梨醇酯8〇(Tween® 8〇)及泊洛沙姆 188(Plur〇nic® F68)之市售產品中各種界面活性劑對 abatacept SC藥品之溶液安定性的作用。在4及8 mg/ml之 3篁下ef估泊洛沙姆188且在1及2 mg/mi之最終調配物濃 度下評估聚山梨醇酯80〇使樣品在2_fC及25〇c/6〇%濕度條 φ 件下處於安定狀態且在各種時間點監測。結果展示於下文 之表28中。 表28 各種含量及類型之界面活性制對125 mg/ml之abatacept SC藥品的作用 %高分3 1量物質 儲存條件 時間/月 對照a 泊洛沙姆188 mg/ml 聚山梨醇酯80 mg/ml 4 8 1 2 初始 0 1.05 1.05 1.06 1.07 1.10 2-8〇C 1 0.98 0.99 0.99 1.01 1.02 2 1.02 1.03 1.04 1.05 1.07 3 1.06 1.07 1.08 Ϊ.08 1.09 6 1.23 1.27 1.28 1.25 1.32 9 1.30 1.35 1.36 1.34 1.36 25°C/60% 相對 濕度 0 1.05 1.05 1.06 1.03 1.04 1 1.92 1.94 1.92 1.97 2.02 2 2.69 2.71 2.68 2.75 2.80 3 3.74 3.92 3.67 3.84 3.84 5 5.12 5.16 5.03 5.05 5.03 a蛋白質：薦糖（1:1)，125 mg/ml ’ pH 7.8 界面活性劑之作用之結果暗示’界面活性劑對abatacept 144045.doc •73- 201008596 sc藥品之安定性不具有顯著負作用。在所評估之泊洛沙姆 188之含量中，發現8 mg/ml之濃度足以防止在調配物中形 成聚矽氧相關微粒。 滲透壓度 使用蒸氣壓方法在不同蛋白質濃度下及自調配物方法之 分離步驟量測於各種緩衝劑中之abatacept之滲透壓度。該 等結果概述於下文之表29中。 表29 於各種緩衝劑中及在各種浪度下之Abatacept SC溶液之 滲透麈度測定

Abatacept/緩衝劑/賦形劑 蛋白質濃度 (mg/ml) 磷酸鈉 氣化鈉 滲透壓度 (mOsm/kg) Abatacept 藥物 50 25 mM 50 mM 151 Abatacept，透濾步驟 50 10mM - 32 Abatacept，透濾7濃縮步驟 155 10mM — 49 10 mM pH 7.8之磷酸鹽缓衝 劑 — 10 一 35 於水中之Abatacept 100 10mM - 51 Abatacept:嚴糖(1:1) 100 10 mM - 567 Abatacept:蔬糖(1:1.75) 100 lOmM — 766 Abatacept:蔗糖(1:2) 100 10 mM - 913 Abatacept:蔬糖(1:1.36) 125 lOmM - 782 攪動/震盪之作用 在100 mg/ml及125 mg/ml之濃度下測定攪;動對abatacept SC藥品之溶液安定性之作用。在2-8°C下，在腕臂式震盪 器之速度3下震盪於5 cc管小瓶中含有約1 ml之溶液等分試 樣。藉由將震盪器置放於2-8°C之冷室中來維持震盪器之 溫度。以適當時間間隔抽取樣品且檢定pH值及視覺外觀且 同時亦在攪動30天後評估樣品之生物活性。 144045.doc -74· 201008596 當在2-8°C下攪動時，在100 mg/ml及125 mg/ml濃度下攪 動長達30天之樣品未展示HMW物質含量、SDS-PAGE分 佈、肽圖譜、B7結合檢定、pH值、外觀或蛋白質濃度之 改變。 推薦儲存條件 abatacept SC藥品，125毫克/注射器（125 mg/ml)之推薦 儲存條件為2-8°C，推薦存放期為至少12個月。

實例IX φ 脫醯胺作用及聚集為2種可觀察到之CTLA4Ig分子之降 解路徑。該實驗方案概括經設計用以評估在6.3-7.2之pH值 範圍中，尤其pH 6.3、6_6、6.9、7.2之SC藥品調配物的實 驗室規模pH值安定性研究。該研究之目的為識別最佳低 pH值調配物，就脫醯胺作用及形成高分子量物質而言，該 調配物將獲得CTLA4Ig SC調配物之最少18個月之存放 期。用於該研究之SC藥品調配物描述於下文表30中。 表30 β 在pH 6.9下之SC藥品調配物组成

成份 量mg/1.0 ml Abatacept 125 蔗糖 170 泊洛沙姆188 8 單水合磷酸二氫鈉 0.638 無水磷酸氫二鈉 0.475 注射用水 足量1.0 mL

Abatacept SC 藥品將在 pH 6.3、6.6、6.9、7.2下調配。 藥品如上文所述用蔗糖及泊洛沙姆188來調配且最後一批 144045.doc -75- 201008596 之漢度將用10 mM磷酸鹽緩衝劑（ΡΗ 6.9)來調節。pH值將 使用IN HC1分別滴定降至6.3及6.6。或者，pH值將使用1N NaOH滴定升至6 9、7 2及7 65。將藥品填充至1 mL長 PhyS1〇lisTM3射器中（1.0 ml填充體積）且使其在2-8°C、 15C、25°C(60%濕度）及35。〇下處於安定狀態。應藉由覆蓋 或插入棕色避光袋中而始終保護樣品避免光照。 將在0、2、4、0、12、18、24個月時及視情況9個月時 對在2-8C下儲存之藥品取樣。在1、2、4、6個月時及視 情況9個月時對在15°c下儲存之藥品取樣。在1、2、4及6 ❹ 個月時對在25°C及60%濕度下儲存之藥品取樣。在1、2及4 個月時對在3 5 °C下儲存之藥品取樣。將測試在2_8〇c下儲存 之樣品之外觀（僅初始樣品及最後樣品）、pH值（僅初始、 第4個月及最後樣品）、A280(僅初始、第4個月及最後樣 品）、尺寸排除HPLC、SDS-PAGE、胰蛋白酶消化肽圖譜 (TPM)、Biacore B7結合（僅初始、第4個月及最後樣品或按 需要取樣）及等電聚焦（IEF)(僅初始樣品及最後樣品）。將 測試在15°C及25°C及60%濕度下儲存之樣品之A280(僅初 〇 始、4個月時及最後樣品）、尺寸排除HPLC、SDS-PAGE及 胰蛋白酶消化肽圖譜（TPM)。將測試在35°C下儲存之樣品 之尺寸排除HPLC、SDA-PAGE及胰蛋白酶消化肽圖譜 (TPM)。 將使用非常規測試方法以在初始時間點、4個月時、12 個月時及研究結束時進一步鐘定樣品之安定性。若觀察到 趨勢或非預期結果，則亦可使用該等方法中之一些以測試 144045.doc •76· 201008596 特定樣品。非常規方法包含：使用多角度光散射之尺寸排 除層析法（SEC-MALS)、動力學結合（SPR)、質譜法、CD、 AUC、差示掃描熱量測定計（DSC)、FFF、FTIR、尺寸排 除HPLC(變性）及SDS-PAGE(銀染色）。

實例X 將PK子研究併入2B階段、多中心、隨機化、雙盲、安 慰劑對照研究中以評估向患有活性類風濕性關節炎同時接 受甲胺喋呤之受治者靜脈内投與之2種不同劑量的 _ abatacept之安全性及臨床功效。在該平行設計研究中，受 治者接受2種不同劑量（2及10 mg/kg)之abatacept或與MTX 組合之安慰劑。Abatacept係如共同申請中之2005年12月20 曰申請之美國專利申請案第60/752,267中號所述來製造， 該申請案教示藉由動物或哺乳動物細胞培養產生本發明之 蛋白質，尤其為重組糖蛋白產物之方法，且如本文中所 述，將其以於含有200 mg之abatacep之個別小瓶中的束乾 形式供應。在第1、15及30天且其後每30天歷時1年向受治 _ 者投與IV Abatacept。多劑量PK來自血清濃度相對時間之 資料，該資料在第60天與第90天之間的給藥時間間隔期間 自登記至位點-特異性PK子研究中之受治者得到。對PK子 研究中之受治者而言，在第60天給藥前收集血液樣品，且 對PK分佈而言，在第60天開始30分鐘時（對應於abatacept 輸注結束）、輸注開始後4小時及其後每週一次直至第90天 收集血液樣品。登記總共90位受治者參與PK子研究。然 而，在第60天至第90天之給藥時間間隔之間的完整PK分佈 144045.doc -77- 201008596 係自29位受治者（15位受治者以2 mg/kg給藥；14位受治者 以10 mg/kg給藥）獲得。 PK參數之概述呈現於表31中。研究之結果展示TAU=30 天時，〇„^及AUC(TAU)以與劑量成比例方式增加。對以 1:5之比率增加之標稱劑量而言，Cmax之幾何平均值以1:5.2 之比率增加，而AUC(TAU)之幾何平均值以1:5.0之比率增 加。另外，T-HALF、CLT及Vss值似乎不依賴劑量。在該 等RA受治者中，平均T-HALF、CLT及Vss值在13天左右分 別為約 0.2 mL/h/kg及約 0·07 L/kg。小 Vss指示 abatacept主 要受細胞外流體體積限制。基於在第一次輸注後2週及4 週，隨後在其後每月一次給藥之給藥模式，abatacept之穩 定狀態條件由第三個月劑量達到。又，由於該給藥模式， 血清濃度在治療之最初2個月期間大於穩定狀態最低濃 度。第60、90及180天之最低（Cmin)值之比較指示在每月給 藥後，abatacept似乎不積聚。接受2及10 mg/kg abatacept 之月IV劑量之所有受治者的平均Cmin穩定狀態值分別在4.4 至6.7 mcg/mL及22.0至28.7 mcg/mL之間的範圍變化。 144045.doc 78- 201008596 钕蹀W铽^xd f W ψ½丧枳β诳isr «婵ιε<

Abatacept之藥物動力學參數 平均值(SD) Vss (L/kg) 〇| o S 0.07 (0.03) CLT (mL/h/kg) O S 0.22 (0.09) T-HALF (天） ^ as Zi id 13.1 (5-3) 幾何平均值(％cv) AUC(TAU) ㈣ h/mL) 9573.5 (30)_ 47624.2 (31) j! 2 ^ 284.2 (23) 治療劑量 (mg/kg) in <N & il 年齡： (平均 值，範 圍） 54 (34-83) 受治者 數目 (男性/ 女性） 29 (18/11) 研究設計 隨機化、 雙盲、安 慰劑對 照、多劑 量研究。 30分鐘IV 輸注 研究目標 評估靜脈 内投與劑 量之 abatacept 之 功效、安 全性、多 劑量Pica 免疫原性 潛力 Q ^ C00157 C00196 C98283 研究實驗 方案(國家） IM101100 (USA)PK 子 研究階段II 144045.doc 79- 201008596 研究單一 10 mg/kg靜脈内輸注後在健康成年受治者中及 多次10 mg/kg靜脈内輸注後在RA患者中abatacept之藥物動 力學（參見表32)。 表32 10 mg/kg靜脈内輸注後，健康受治者及RA患者中之藥 物動力學參數（平均值，範園） PK參數 健康受治者(10 mg/kg 單一劑量後)n=13 RA患者(10 mg/kg多劑 量後a)n=14 峰濃度(Cmax)[mcg/mL] 292(175-427) 295(171-398) 最終半衰期(t1/2)[天] 16.7(12-23) 13.1(8-25) 全身性清除(CL)[mL/h/kg] 0.23(0.16-0.30) 0.22(0.13-047) 分佈體積(Vss)[L/kg] 0.09(0.06-0.13) 0.07(0.02-0.13) a多次靜脈内輸注係在第1、15、30天及其後每月一次投 與。

Abatacept於RA患者及健康受治者中之藥物動力學似乎 為相當的。在RA患者中，在多次靜脈内輸注後，abatacept 之藥物動力學展示在2 mg/kg至10 mg/kg之劑量範圍内 C max 及AUC之成比例增加。在10 mg/kg下，至第60天，血清濃 度似乎以24( 1 -66)mcg/mL之平均最低濃度（範圍）達到穩定 © 狀態。在RA患者中以每月之時間間隔繼續重複1 〇 mg/kg之 治療後，未發生abatacept之全身性積聚。 在RA患者中之群體藥物動力學分析揭示，存在隨體重 增加朝向abatacept之更高清除率之趨勢。年齡及性別（當 校正體重時）不影響清除率《共存之甲胺喋呤（MTX)、非類 固醇消炎藥（NSAID)、皮質類固醇及TNF阻斷劑不影響 abatacept清除率。 144045.doc •80- 201008596

Abatacept之血清檢定 藉由酶聯結免疫吸附劑分析法（ELISA)以總共25次分析 運作來分析abatacept血清樣品。所有分析結果符合在樣品 分析前所建立之接受準則，並指示ELISA方法對定量研究 樣品中之abatacept為精確及準碟的。也清中之abatacept之 標準曲線參數及平均QC資料的概述呈現於表33中。 abatacept之分析QC在運作之間及運作之中的變率分別為 4·5%及3.5% CV。所觀察到之分析QC樣品之平均濃度自標 稱值偏差小於±8.9%(表33)。 表33 人類血清中之Abatacept檢定之品質控制資料的概述 標稱濃度 低(3.000 ng/mL) + n2.500ng/m^) 高(24_000ng/mL) 所觀察到之平均濃度 2.866 13.608 24.526 %偏差 -4.5 8.9 2.2 運作之間精度(％ CV) 4.5 2.8 3.0 運作之中精度(％cv) 2.4 3.5 2.9 總變化0¼ CV) 5.1 4.5 4.2 η 75 75 75 運作次數 25 25 25

實例XI 該研究之目標為評估在健康受治者中，在50至150 mg之 範圍内之單一 SC劑量後belatacept之PK ;評估所注射溶液 之注射體積及濃度對皮下投與之belatacept之PK的作用； 評估belatacept之單一 SC劑量之安全性及对受性（包含注射 位點評估）；評估皮下投與之belatacept之免疫原性。 此為在健康受治者中之雙盲、隨機化、安慰劑對照、平 144〇45.d〇c -81 - 201008596 行組、單一劑量研究。總共42位受治者將隨機分成6個治 療組中之一者。在具有7位受治者之各組中，受治者將在 第1天以5:2之比率隨機接受belatacept或安慰劑之單一 SC注 射。受治者將需要達到重量〇〇 kg。6個治療組描述於表 34中。 表34治療纽

治療組 belatacept或安慰劑之劑量 注射體積 注射溶液濃度 1 50 mg 0.4 mL 125 mg/mL 2 75 mg 0.6 mL 125 mg/mL 3 100 mg 0.8 mL 125 mg/mL 4 150 mg 1.2 mL 125 mg/mL 5 50 mg 1.0 mL 50 mg/mL 6 75 mg 1.0 mL 75 mg/mL 受治者將經歷篩選評估以確定自第1天給藥起28天内之 合格性。將允許受治者在給藥前一天（第-1天）進入臨床設 施以用於包含MLR之基線評估。受治者將留在臨床設施中 直至在第5天完成治療後評估，且其後將返回臨床設施以 進行各研究訪問直至自研究排除。 在第1天，受治者將受隨機治療且將接受單一 SC劑量之 belatacept或安慰劑，且經歷詳細PK及免疫原性取樣。所 有受治者將在其大腿前側接受SC注射。在研究藥物投藥 後，調查員將評估注射位點之局部刺激及發炎徵象。 在整個研究中之選定時間執行身體檢查、生命徵象量測 及臨床實驗室評估。將收集在研究藥物投藥後至多56天之 血液樣品以進行PK分析及免疫原性評估。將在整個研究中 監測受治者之AE。在研究期間，自各受治者抽取約265 mL之血液。 144045.doc -82- 201008596 同時對所有劑量組進行給藥及追蹤。將無受治者接受比 單一劑量更大之劑量。可替換未完成研究之受治者（除因 AE而中斷之彼等者外）。 此為單一劑量研究。各受治者將經歷篩選期，其為在投 與研究藥物前最多28天。各受治者將保留在研究中直至投 與研究藥物後56天（±2天）之最後訪問。經歷試驗之最後一 位受治者之最後訪問將視為研究結束。 如本文中所述且如共同申請中之2006年10月5日申請之 Φ 美國專利申請案第60/849543號中所述來製造之Belatacept 100毫克/小瓶（125 mg/mL)，為提供於用於使用適合尺寸之 SC投藥用之習知注射器及針來抽取及投藥的玻璃小瓶中之 即用型液體產品，其中該專利教示藉由動物或哺乳動物細 胞培養產生本發明之蛋白質，尤其為重組糖蛋白產物之方 法。足夠過量之belatacept併入各小瓶中以解決抽取損失以 便可抽取含有1〇〇 mg之0.8 mL溶液用於8(：投藥。

Belatacept注射液，1〇〇毫克/小瓶〇25 mg/mL)不欲用於 # IV輸注。 由病史、身體檢查、12導程心電圖及臨床實驗室評估確 定之健康受治者將有資格參與研究。該研究將包含男性及 女性。在隨機化時，受治者必須為年齡至少18歲且重量 U00 kg。女性受治者必須為非哺乳者，未懷孕且必須在 研究期間在給藥前使用可接受之避孕方法至少丨個月且在 研究結束後使用可接受之避孕方法至多4週。具有生育可 能之婦女必須在研究藥物之給藥前24小時内進行陰性i清 144045.doc •83- 201008596 驗孕測試。將告知受治者對懷孕之潛在風險。男性受治者 必須在研究期間使用足夠之避孕方法且在研究結束後使用 足夠之避孕方法歷時至多4週以便將對其伴侣懷孕之風險 降至最低。參見第5部分之包含及排除準則之詳細清單。 登記前4週内服用之藥物必須記錄於CRF上。除非由調 查員所指定用於治療特定臨床事件之藥物，否則在研究期 間除口服避孕藥外，不投與伴隨藥物（處方藥、非處方藥 (over-the-counter)或中草藥）。任何伴隨療法必須記錄於 CRF 上。 belatacept SC注射後之PK將得自血清濃度相對時間之資 料。所評估之單一劑量PK參數包含：

Cmax 所觀察到之血清濃度最大值 Tmax 所觀察到之血清濃度最大值的時間 AUC(O-T) 自時間0至最後可定量濃度之時間之血清濃 度-時間曲線下面積 AUC(INF) 自時間0外推至無限時間之血清濃度-時間曲 線下面積 半衰期 血清半衰期 CLT/F 表觀總體清除率 VSS/F 穩定狀態下之表觀分佈體積 個別受治者PK參數值將由非間隔方法，藉由Innaphase Corp，Philadelphia, PA 之有效 PK 分析程式 ’ eToolbox Kinetica程式來得到。亦將報導經劑量正規化之AUC。 將隨時間收集血清樣品且使用2種ELIS A檢定來檢定 144045.doc -84- 201008596 belatacept之抗體力價之存在。一種檢定評估對整個分子之 反應且另一者僅評估對LEA29Y-T部分之反應。 接受研究藥物之所有受治者將包含於安全性及PD資料組 中。將在任何小組中接受安慰劑之受治者集合至單一安慰 劑治療組中用於除注射位點評估外之PD評估及安全性評 估。來自接受belatacept之受治者之所有可用資料將包含於 PK資料組中且將包含於概述統計及統計分析中。 基線視為第-1天。性別及種族之頻率分佈將由治療（注射 φ 體積及劑量）來製錶。年齡、體重及身高之概述統計將由 治療來製錶。 將列出所有記錄之AE且由較佳項目、系統器官類別及 治療來製表。將列出生命徵象及臨床實驗室測試結果且由 治療來概述。將列出任何顯著身體檢查發現及臨床實驗室 結果。注射位點評估（紅斑、發熱、腫脹、疼痛及搔癢）將 由治療及嚴重度來製錶。將跨越劑量組集合安慰劑受治者 且亦獨立地分析以評估注射位點。 ❿ 概述統計之PK參數將由治療來製錶。將呈現Cmax、 AUC(O-T)及AUC(INF)之幾何平均值及變化係數。將呈現 Tmax之中值、最小值及最大值。將提供其他PK參數之平均 值及標準差。為評估SC投藥後對劑量之依賴性，將提供 Cmax及AUC(INF)相對於劑量之散佈圖。將分析AUC(INF) 及Cmax交叉注射體積之散佈圖以評估此對belatacept之PK 之作用。又，將在可適用時提供對固定體積而言之Cmax及 AUC(INF)相對劑量之散佈圖，及在劑量内之Cmax及 144045.doc -85- 201008596 AUC(INF)相對體積之散佈圖。 概述統計將由治療及對抗belatacept及抗LEA29Y-T抗體 值及其自基線（第1天-〇小時）之改變的研究天數來製錶。為 探查免疫原性與暴露之間的可能聯繫，將提供抗belatacept 及抗LEA29Y-T抗體之改變相對belatacept濃度之圖。 PK及免疫原性血液取樣進度概括於表35中。 表35 築物動力學及免疫原性血液取樣進度

研究天數 時間（相對於給藥）小時:分 鐘 PK 免疫原性 1 00.00 (給藥前） X X1 01:00 X 02:00 X 06:00 X 12:00 X 2 24:00 X 36:00 X 3 48:00 X 60:00 X 4 72:00 X 84:00 X 5 96:00 X 6 120:00 X 7 144:00 X 8 168:00 X 14 X X 21 X 28 X X 35 X X 42 X X 56 X X 144045.doc -86· 1 第1天免疫原性（抗belatacept抗體）樣品必須在投與藥物前 抽取。可在±2天内抽取第28、35、42及56天之樣品。 上文之表35列出評估PK所依據之取樣進度。經由直接靜 脈穿刺或自生理食鹽水鎖（saline lock)將血液樣品（每樣品 201008596 約3 mL)收集於預標記、紅色及灰色頂部（SST)Vacutainer® 管中。若使用生理食鹽水鎖系統進行血液收集，則應經由 留置導管抽取約0.5 mL之血液且在獲得各PK樣品前丟棄。 一旦獲得pk試樣，將使血液在室溫下在Vacutainer®管中凝 結15-30分鐘。凝結後’必須在冷凍離心機（4。〇中在 1 500 X g下，將樣品離心丨5分鐘。當離心完成時，應由吸 管將來自各PK樣品時間點之至少〇 5 mL之血清移出且轉移 至預標記、螺旋蓋、聚丙烯、PK儲存及運輸管。必須使用 ® 乾淨吸管以等分用於各樣品時間點之血清。含有PK血清樣 品之聚丙烯管可在_2(TC或更冷之溫度下冷凍儲存最多1個 月且隨後在-7(TC下冷凍儲存。自樣品收集至冷凍血清所 允許之時間為12小時。將使用敏感、有效酶免疫檢定（EIA) 方法以量測血清中beiatacept之濃度。 表35列出評估免疫原性所依據之取樣進度。將在第i、 14、28、35、42及56天訪問時獲得血清樣品。第！天免疫 原性（抗beiatacept)樣品應在投與研究藥物前取出。將檢定 ® 樣品之抗beiatacept及抗LEA29Y-T抗體之存在。對各試樣 而言，經由直接靜脈穿刺或自生理食鹽水鎖（留置導管）將 血液（每樣品約3 mL)收集於預標記、紅色及灰色頂部 (SST)VacUtainer®管中。若使用生理食鹽水鎖系統進行血 液收集’則應經由留置導管抽取約0.5 mL之血液且在獲得 各免疫原性樣品前丟棄。一旦獲得試樣，將使血液在室溫 下在Vacmaine#管中凝結15-30分鐘。凝結後，必須在冷 凍離心機（4°C)中，在1500 X g下，將樣品離心15分鐘。當 144045.doc -87- 201008596 離心完成時’應由吸管將至少1 mL之血清移出且轉移至預 標記、螺旋蓋、聚丙晞、血清樣品儲存及運輸管。必須 在-20 C或更冷之溫度下冷床儲存含有血清樣品之聚丙浠 管。將使用2種敏感、有效酶聯結免疫吸附劑檢定（ELISA) 方法以量測血清中belatacept之抗體力價。一種檢定評估整 個分子之抗體力價且另一者僅評估LEA29Y-T部分之抗體 力價。 實例ΧΠ 脫醯胺作用、斷裂及聚集為可觀察到之LE A29YIg分子 之降解路徑。該實驗方案概括經設計用以評估在6.3-7.5之 pH值範圍中之belatacept SC藥品調配物的另一實驗室規模 pH值安定性研究。該研究之目的為識別最佳pH值調配 物，其將獲得belatacept SC調配物之最少18個月之存放 期。 對該研究而言，belatacept SC產品將在pH 6.3、6.6、 6.9、7.2及7_5下調配。約25 mg/mL之belatacept藥物將先 濃縮至约10〇11^/1111^，隨後透濾至？116.9之1〇111]\4磷酸鹽 緩衝劑中’接著第二次濃縮以獲得>160 mg/rnL之藥品中間 物（DPI)。該DPI將用蔗糖及泊洛沙姆！ 88來調配且最終分 批濃度將用10 mM磷酸鹽緩衝劑（PH 6.9)來調節。如研究 設計中所概括，將經調配之本體物再分成5個子批次。子 批次之pH值將使用IN HC1滴定降至6.3及6.6。另外2個子 批次之pH值將使用IN NaOH滴定升至6.9、7.2及7.5。將產 品批料填充至1 mL長Physiolis™中。應藉由覆蓋或插入棕 i44045.doc -88 - 201008596 色避光袋中而始終保護樣品避免光照。用於該研究之sc藥 品調配物描述於下文表36中。 表36 在PH 6.9下之SC蕖品調配物组成

成份 每l.OmL之量（mg) Belatacept 125 蔗糖 170 泊洛沙姆188 8 單水合鱗酸二氫納 0.638 無水碟酸氫二鈉 0.475 注射用水 足量1.0 mL β 在0、2、4、6、12、18、24個月時及視情況9個月時對 在2-8°C下儲存之藥品取樣。在1、2、4、6個月時及視情 況9個月時對在15°C下儲存之藥品取樣。在1、2、4及6個 月時對在25°C及60%濕度下儲存之藥品取樣。在1、2及4個 月時對在35°C下儲存之藥品取樣。將測試在2-8°C下儲存之 樣品之外觀（僅初始樣品及最後樣品）、pH值（僅初始、第4 個月及最後樣品）、A280(僅初始、第4個月及最後樣品）、 尺寸排外-HPLC、SDS-PAGE、胰蛋白酶消化肽圖譜 (TPM)、Biacore B7結合（僅初始、第4個月及最後樣品或按 需要取樣）及等電聚焦（IEF)(僅初始樣品及最後樣品）。將 測試在15 °C及25°C同時60%之濕度下儲存之樣品之A280(僅 初始、4個月時及最後樣品）、尺寸排外-HPLC、SDS-PAGE 及胰蛋白酶消化肽圖譜（TPM)。將測試在35°C下儲存之樣 品之尺寸排外-HPLC、SDA-PAGE及胰蛋白酶消化肽圖譜 (TPM)。 144045.doc -89- 201008596 將使用非常規測試方法以在初始時間點、4個月時、12 個月時及研究結束時進一步表徵安定性樣品。若觀察到趨 勢或非預期結果，則亦可使用該等方法中之一些以測試特 定樣品。非常規方法包含：使用多角度光散射之尺寸排外 層析法（SEC-MALS)、動力學結合（SPR)、質譜法、CD、 AUC、差示掃描熱量測定計（DSC)、FFF、FTIR、尺寸排 外-HPLC(變性）及SDS-PAGE(銀染色）。 【圖式簡單說明】 圖1表示CTLA4-Ig分子之表現卡匣之一部分的核苷酸序 列（SEQ ID NO: 1)。亦展示藉由核酸編碼之胺基酸序列 (SEQ ID NO:2)。可自該表現卡匣產生之CTLA4-Ig分子包 含具有以下殘基之胺基酸序列之分子：（i)SEQ ID NO:2之 26- 383 > (ii)SEQ ID NO:2 之 26-3 82、（iii)SEQ ID NO:2 之 27- 383 或（iv)SEQ ID NO:2 之 26-382 或視情況（v)SEQ ID NO:2 之 25-382 或（vi)SEQ ID NO:2 之 25-383。表現卡匣包括 以下區域：（a)製瘤素（Oncostatin)M信號序列（SEQ ID ΝΟ:1 之核苷酸11-88 ; SEQ ID NO:2之胺基酸1-26) ; (b)人類 CTLA4之細胞外域（SEQ ID ΝΟ:1之核苷酸89-463 ; SEQ ID 1^0:2之胺基酸27-151);〇)人類4〇1恆定區之經修飾部分 (SEQ ID ΝΟ:1 之核苷酸464-1159; SEQ ID NO:2之胺基酸 152-383)，其包含經修飾鉸鏈區（SEQ ID NO:l之核苷酸 464-508 ; SEQ ID NO:2之胺基酸152-166)，經修飾人類 IgGl CH2域（SEQ ID ΝΟ:1 之核苷酸 509-838 ; SEQ ID NO:2 之胺基酸167-276)及人類IgGl CH3域（SEQ ID NO:l之核苷 144045.doc -90- 201008596 酸 839-1159 ; SEQ ID NO:2 之胺基酸 277-383);及 圖 2 描述 CTLA4-L104EA29Y-Ig(亦稱為「L104EA29YIg」 及「LEA29Y」）之核苷酸（SEQ ID NO:3)及胺基酸（SEQ ID NO:4)序列，該CTLA4-L104EA29Y-Ig包括信號肽；以位置 + 1處之甲硫胺酸開始及以位置+ 124處之天冬胺酸結束’或 以位置-1處之丙胺酸開始及以位置+124處之天冬胺酸結束 之CTLA4的突變細胞外域；及Ig區域》SEQ ID NO:3及4分 別描述L104EA29YIg之核苷酸及胺基酸序列，該 L104EA29YIg包括信號肽；以位置+27處之甲硫胺酸開始 及以位置+150處之天冬胺酸結束，或以位置+26處之丙胺 酸開始及以位置+150處之天冬胺酸結束之CTLA4的突變細 胞外域；及Ig區域。L104EA29YIg可具有以下殘基之胺基 酸序列：（i)SEQ ID NO:4之26-383、（ii)SEQ ID NO:4之26_ 382 ; (iii)SEQ ID NO:4之 27-383 或（iv)SEQ ID NO:4之 27-382 或視情況（v)SEQ ID NO:4 之 25-382 或（vi)SEQ ID N〇:4 之25-383 。 144045.doc 91- 201008596

序列表 美商必治妥美雅史谷比公司 安定之蛋白質調配物 <130> 10739 ΤΗ <140> 095147647 <141> 2006-12-19 <150> 60/752,150 <1SL> 200$-12·20 <1GC1> 4 <17〇> Pfttentln version 3.3 <210> 1 <211> 1152 <212> ΟΚΆ <213> CTLA4Ig <400> 1 atgggtgc&c tgctcacaca gagg&cgct^ ctcagtctg^ tccttgcact ectgtttaca agcangggga gcatggcmat gcacgtggcc qagcctgctg tggtactggc c^gcagccga ggcaitcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tcceoaggca aagcc&cts« ggtccgggtg acagtgcctc ggca^gctga eagccaggtg aetgaag^ct gtgog9cMC ctaoacgacg g^gaetgi^t tgaacttoct agatgattac atctgcacgg gucctccag C9g«ia&tca& gcgaAcetaa ctatcaaagg actgagggcc atggac«ogg gactotacat otgcaag^tg g^gctcatgt acccaccgcc ataotacctg ggcatasgca acggaaccca g&tttatgta attgatacag «accgcgccc agattctgat caggagccca aatottctga caauctc«c acatccccac cgtccccagc acccgaacto ctgg^tggat cgtoagtott cctcttccoc ooaeaaccca ftggaeaccct catgatctcc cggaccectg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc aogaagaeco tgaggtoaag ctonactggt acgtgg&ogg cgcggftggtg cataatgcca ag&oaaagcc gcgsgaggag cagtacaaca gcacgtaccs gstggtcagc gtcctcaccg tcctgcacaa ggactggctg aatg^caa^g agtmcaagcg caaggcctcc aacaaagooc tcccagcccc catcgagM& accstctaca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgt&caccct gcccccatcc ogggatgagc tgaccaagaa ccaggtcacfc ctgacctgoc tggtcaaagg cttctacccc agcgaattcg ccgtggagtg ggagagcaat 999c&SwQgg aga&caacta caagaocacg ectcecgt^c t^gnctccga cggctccttc ttcctccaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtg^c agcaggggaa c^tc^tctca 144045.doc 60 120 180 240 200 360 420 480 540 ¢00 $€0 720 7B0 840 900 960 1020 1ΟΘ0 1140 201008596 1152 tgctcc^tga cgcat9»ggc fcctgcacaac caccacaegc agaagagoct ctccctg^ct cegggtaaat ga <2io> 2 <2ii> zn <212> PRT <213> CTIAilg <40Q> 2

Mat Gly Val L«u Leu Thr Gls Arg llir Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 15 10 is

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro 20 25 30

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Val eve Qlu 35 40 45

Tyr Ala Ser Pro Oly Lye Μλ Thr Glu Val Arg Val Thx Val Leu Ara 50 5S 60

Oln Ala Aip Ser Gin Val Thr Qlu Val Cye AIa Alft Thr TVr Met Met 65 70 75 e〇

Hit Qly Thr Ser 95

Gly Asn Glu Uet\x thr Pbe Leu Asp Asp £er 11« Cys 8S 90

Ser e.ly Asn Gitt Val Aen.Leu Thar lie (Jin Gly l*u Arg Α1» Met Asd 100 105 no

Thr G：y teu Tyr He Cye I.ye Val Olu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 120 X25

Tyv 01y Ile Qly Asn Qly Hir Qln He iyr Val He Asp Pro Qlu p« Cye pro Asp Ser Asp 〇ln Qlu Pro Lye ser Ser Asp Lye Thr Hie 150 155 ISO Set Pro Pro Set Pro Ala Pro Glu Leu Leu ciy <jly 6er Ser Val 170 175

Ph« Leu Ph· Pro Pro Lys Pro Lys A»p Thr i,eu Met He Ser Arg Thr 144045.doc 1· 201008596 180 185 190

Pro Glu Val Thr eye Val Val Val Αβρ Val s*r Hie Olu Asp Pro Glu 195 200 205

Val Lye Phe Asn Trp Tyr Val Asp Qly Val Glu Vai Kig Asn Ala Lye 210 215 220

Thr Lye Pro Arg Glu Glu Q\n Tyr Asn Sax Thr Tyr Arg Val Val Ser 225 230 235 240

Val Leu Thr val Leu Hie ein Aap Trp L«u Aen Gly Ly* Glu Tyr Lye 245 250 255

Cys Ly« Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lye Ihr Ue 260 265 270

Ser 2»ye Ala Lys Gly Oln Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 275 2Θ0 2β5

Pro Ser Arg Aap Glu Leu Thr Lye Asn Qla Val Ser I«u Thr Cys Leu 290 295 300

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Aep lie Ala Val Qlu Trp Glu Ser Asn 3〇S 310 31S 320 <5ly Gin Pro elu Αβη λβη Tyr Lye Thr Tiur Pro Pro-Val X«u Λβρ Ser 325 330 335

Aep Oly Ser Phe Phe teu Tyr Ser Lye Leu Thr Val Lve Sar Arg 340 345 350

Trp Oln Gin Oly Asn Val Phe Ser Qre Ser Val Met Hie Qlu Ala Leu 355 360 365

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Hie Asn His Tyr thr Gin Ly· S*r 3er Leu Pro Gly Ly丨 370 375 380 6- 144045.doc

Claims (1)

1. 201008596 七、申請專利範圍： 1. 一種適於皮下投藥之安定之調配物，其包括至少100 mg/ml之CTLA4Ig分子、能安定該調配物之糖且其濃度 可有效安定該調配物、以及醫藥學上可接受之水性載 I 劑。 2. 如請求項1之調配物，其中該糖係選自由蔗糖、乳糖、 麥芽糖、甘露醇及海藻糖及其混合物組成之群。 3. 如請求項1之調配物，其中該糖為雙醣。 • 4.如請求項3之調配物，其中該雙醣為蔗糖。 5.如請求項1之調配物，其進一步包括醫藥學上可接受之 緩衝劑。 6.如請求項1之調配物，其具有6至8之pH值範圍。 7.如請求項1之調配物，其中該CTLA4Ig分子具有SEQ ID NO:2所示之以位置27處之甲硫胺酸或位置26處之丙胺酸 開始及以位置383處之離胺酸或位置382處之甘胺酸結束 的胺基酸序列。 φ 8.如請求項1之調配物，其中該CTLA4Ig分子為 L104EA29YIg，其具有SEQ ID NO:4所示之以位置27處 之曱硫胺酸或位置28處之丙胺酸開始及以位置383處之 離胺酸或位置382處之甘胺酸結束的胺基酸序列。 9.如請求項7或8之調配物，其中該糖係選自由蔗糖、乳 糖、麥芽糖、甘露醇及海藻糖及其混合物組成之群。 10.如請求項7或8之調配物，其中該糖為雙醣。 11.如請求項7或8之調配物，其中該糖為蔗糖。 144045.doc 201008596 12·如請求項卜…之調配物，其中蛋白質:糖之比率為至 少 1:1_3 。 13_如請求項7或8之調配物，其進一步包括醫藥學上可接受 之緩衝劑。 又 如清求項7或8之調配物’其具有6至8之ΡΗ值範圍。 144045.doc