TW201006927A - Method for sustained expression of an exogenous gene - Google Patents

Description

201006927 ' 九、發明說明： ' 【發明所屬之技術領域】 本發明是有關一種長期表現外源基因之方法’特別是一 種藉由重組桿狀病毒以長期表現外源基因之方法。 【先前技術】 目前的基因載體(gene delivery vector)可分為兩大類：非 病毒（non-viral vector )及病毒（viral vector )載體。在非病 ® 毒載體中，目前以化學或物理方法，如利用高分子或微脂粒 v ( liposome )等包覆外來基因進行轉染（transfection )或電 穿透（electroporation)的方式，將基因送入細胞内。然而這 些方法並不適用於所有的細胞株，尤其是初代細胞（primary cell);且利用這些方式不僅需要純化大量的外源基因，且會 嚴重傷害細胞膜，影響細胞生理活性，更重要的是，轉染效 率通常較低。 在病毒載體方面，以病毒為外源基因載體之優點為其具 φ 有相當高的感染率以傳送外源基因，並具有專一性及較強的 基因表現能力。目前已知可利用反轉錄病毒與 lentivirus)、腺病毒(adenovirus)或腺相關病毒(adeno-associated virus)作 為基因載體(gene delivery vector)進行基因改質。

、儘管上述載體的應用已經獲得不同程度的成功，但目前常用的 載體仍存在有各自的缺點。例如，質體雖然被認為較為安全，但是傳 遞基因效率較病毒載體差。反轉錄病毒會將病毒基因嵌入宿主細胞染 色體中，有可能造成宿主細胞基因突變或引發其他病變，2〇〇2年法國 ^ 團隊即發現利用反轉錄病毒為基因載體，雖然已經治癒了 9名X linked_SCID的病人’但也在兩名'病人身上造成白血病的症狀，因而 5 201006927 引發利用反轉錄病毒為基因載體的安全疑慮。再者，反轉錄病毒的製 備較麻煩，因此難以製備高效價的病毒。近年來雖然許多研究團隊改 用其他反獅病毒如贿病雜ntivirus)，但紐病毒也會將病毒基 因隨機獻細胞⑽基_域，因此軸未有致病的報導 全上的疑慮。 、在腺病毒方面，雖然膝病毒不會將病毒基因嵌入宿主細胞中， 但部有誘發紅產生免疫反應之困擾，並且在1999年細腺病毒的 基因治療實驗也㈣發-為人的死亡；近年耗發展出無腸載體 (gutless veetoi·) ’可喊少免疫反應之發生，細在放大無腸载體的過 程’需要有輔助病毒(helper vims)共感染才能完成，因而增加了純化 病毒顆粒之難I腺铺病毒雜有安全與基因表猶間長等優點， 但腺相關病毒所能攜帶的基因大小限於3 5_4 kb，無法傳遞較大的基 因，而且腺相關病毒载體的製備相當麻煩，生產程序也不易放大。更 重要的是’最近腺相關病毒也被發現在高病销量τ，會將病毒基因 嵌入宿主細胞染色體中，引發新生小鼠的肝細胞腫瘤。 如上所述，現在普遍使用的基因治療載體都存有安全性或大量 應用上的困難，因此雖然基因練具有相當大的潛力，但目前尚沒有 理想的病毒載體，因而限制了基因治療應用上的發展。 另方面’和·狀病毒/昆蟲細胞表現系統ceii Expression System)已廣泛地被應用於基因重組蛋白質生產上。過去認 為桿狀病毒只會感染昆蟲細胞，因此被認為具有相當高的安全性。然 而在 1995 年’才干狀病 f AcMNPV ca/拆洲如 Multiple

Nucleopolyhedmvims，AcMNPV)已被證明可以將基因送入肝癌細胞 HepG2，並且相當有效地在細胞内以哺乳動物啟動子，如sv_4〇或 CMV_EE (eytomegabvirus immediate-early)，驅動報導基因的表現。此 後便陸續有文獻指出桿狀病毒可以轉導其他多種哺乳動物細胞株， 如：BHK、CHO、CV-1、HeLa、293、Cos7以及神經細胞、人類纖 6 201006927 維母細胞和顧細胞等。此外，在最近也發現桿狀病毒可轉導骨趙間 • 葉幹細胞，且其轉導效率高達87 %。 主相較於其他病毒載體，桿狀病毒具有以下幾項特點：⑴桿狀病 母在轉導哺乳動物細胞後*會複製和產生細胞毒性，且dna會隨著 時間降解而不會嵌人宿主染色體巾；（2)桿狀病毒的天然宿主是昆蟲 細胞’故在人體中並沒有已存在的抗體會攻擊桿狀病毒；⑶桿狀病 毒本身DNA (〜130 kb)遠較其他做為基因載體之病毒大，因此可以攜 帶較大練多之外來基因(至少可達％ kb)進入細胞内；⑷桿狀病 毒了用簡便之操作方式感染天然宿主（昆蟲細胞)來放大病毒量；（5) ί干狀病毒為昆蟲病毒，不會感染人類，因此可在一般生物安全等級1 , 的實驗至進行操作。前二項特性使桿狀病毒可作為有效且安全的基因 載體，後兩項則使桿狀病毒可安全、容易地大量製備。這些特性均有 ’ 助於發展桿狀病毒於哺乳動物細胞中作為基因治療載體。 因此，桿狀病毒已被開發為候選的外源基因載體。雖然 桿狀病毒可做外源基因載體，但因哺乳動物細胞非其天然宿 主細胞，使得桿狀病毒的DNA在哺乳動物細胞内的穩定性 不佳，且由於不具備複製能力，桿狀病毒的DNA和轉殖基 φ 因會隨著細胞的增生而逐漸被稀釋（dilution )和分解，因此 轉殖基因的表現量會隨著細胞培養時間增加而遞減。因此在 使用桿狀病毒作為外源基因載體的情形之中，其表現期較為 短暫（<7 days )是目前在應用上所面臨的首要問題。 一般而言，欲使轉殖基因進入細胞後能持續表現及複製 基因的方法有兩類：一是將外源基因插入細胞染色體中，使 基因可隨著細胞染色體一同複製，以建構穩定表現（staWe expression)之細胞株，如同上述，此方法容易造成干擾細胞 的正常基因作用的現象。 7 201006927 持續表現及複製轉殖基因的另一方法則是形成可複製 塑的游離質體(episomal plasmid)以攜帶轉殖基因，其中游離 質體需具備能在哺乳動物細胞中表現的複製起始點（〇Ι^#η 0f replication)以使游離質體能夠自行複製，因而能持續穩定表 現轉殖基因。游離質體因為不會插入細胞之染色體，因此可 避免上述干擾細胞的正常基因作用的問題。 综上所述，如何藉由使用桿狀病毒作為基因傳遞載體， 使其形成可複製型的游離質體，以使哺乳動物細胞長期表現 外源基因便是目前極需努力的目標。 【發明内容】 針對上述問題，本發明目的之一是提供一種長期表現外源 =之方法，其储由碱環狀__萌決目前槪絲DNA 隨其所轉導的哺乳動物細胞之增生而被稀釋及分解以致短暫表現的 問題’並且可避免細胞生理代謝失常的問題。 為了達到上述目的，本發明—實施例揭示—種長期表現 外源_之方法’包含：提供_第_重組桿狀病毒，立中第 -重組桿狀病毒包括-重組酶基因；提供—第二重組桿狀病 毒’其中第二重組桿狀病毒包括二重組酶辨識序列、位於重 組酶辨識序列之間的-外源基因區，其中外源基因區包含一 核抗原（Nuclear antlgen)基因及一複製起始（〇ri細〇f 序列，核抗原基因表現—核抗原以與複製起始序 列結合；以及將第-重組桿狀病毒及第二重組桿狀病毒丘轉 導(C〇-tranSdUCe)到一哺乳動物細胞之中，其中重_基因表 現一重組酶，重組酶辨識重組酶辨識序列以進行特定點重組 ㈣e-Specif1C recombination) ’以形成—包含外源基因區之環 狀游離質體。 8 201006927 以下藉由具體實施例配合所附的圖式詳加說明，當更容 • 易瞭解本發明之目的、技術内容、特點及其所達成之功效。 【實施方式】 請參照圖1、圖2a及圖2b，圖1為一流程圖顯示本發明一 較佳實施例；圖2a及圖2b顯示依據本發明一較佳實施例之 第一重組桿狀病毒1及第二重組桿狀病毒2。 開始於步驟S11，提供一第一重組桿狀病毒1，其中第 ® 一重組桿狀病毒1包括一重組酶基因11及一位於重組酶基因 11之上游的第一啟動子12。 在步驟S12，提供一第二重組桿狀病毒2，其中第二重 ' 組桿狀病毒2包括二重組酶辨識序列21、及一位於重組酶辨 識序列21之間的一外源基因區23。外源基因區23包括一核 抗原（Nuclear antigen)基因 241、一複製起始（Origin of replication)序列242及一第二啟動子243。核抗原基因241 表現一核抗原以與複製起始序列242結合。 ^ 在本發明一較佳實施例中，其中重組酶為翻轉酶重組酵 素（Flipase recombination enzyme, FLP)，而其所對應之重組酶 辨識序列為翻轉酶重組酵素辨識目標（Flipase Recognition Target，Frt)。其中 FLP/Frt 可進行特定點重組（site-specific recombination)，而特定點重組過程需要能辨識這些特定序列 的特定點重組酶(site-specific recombinase) FLP來進行催化 反應，FLP可協助具Frt序列之間的重組。Frt特定點重組發 生機率非常高，且此特定點重組截至目前為止，幾種模式動 物（如線蟲、果繩、老鼠）及人類基因組之中尚未發現這些 序列，因此在哺乳動物細胞申，FLP可進行專一性的重組。 9 201006927 在另一實施例中，其中重組酶為CRE重組酶(Cyclization - Recombination Recombinase);而其所對應的重組酶辨識序列 為 X-over P1 基因座（locus of X-over Pl，loxp)。 另一方面，游離質體必須包含複製起始點以協助轉殖基 因藉由持續複製以穩定存在於細胞中。在本發明一較佳實施 例中’其中複製起始序列242為EB病毒(Epstein-Barr virus) 複製起始（EBV replication origin，OriP)，而其對應的核抗原 為 EB 病毒核抗原-i(EBV nuclear antigen 1, EBNA-1)。 OriP/EBNA-1系統為取自EB病毒的複製起始點及其核抗 ® 原。0riP在細胞進行分裂時，主要藉由EBNA-1與OriP結 . 合相互作用後，隨著每次細胞分裂進行一次複製，並且有效 率地將游離質體均勻分配至子代細胞（daughter cells )，以維 * 持等量的游離質體穩定存在於細胞之中。 在本發明之另一實施例之中，其中複製起始序列242為 猿猴病毒40複製起始序列，而其對應之核抗原為猿猴病毒 40 大 T 抗原（SV40 large τ antigen)。 在本發明一較佳實施例中，外源基因區23更包括一轉 φ 殖基因251及一位於轉殖基因251上游之第三啟動子252。 上述之啟動子之功用為增強基因表現，因此可以為選擇 性存在’其方向為與欲增強表現之基因同向；其可為持續表 現型、或是誘導型。舉例而言’第一啟動子12、第二啟動子 243及第_啟動子252可為細胞巨大病毒（Cytomegalovirus, CMV)最早期啟動子或是猿猴病毒4〇(simjan virUs 40, SV40) 啟動子。 接下來為步驟S13 ’將第一重組桿狀病毒1及第二重組 才干狀病毒2共轉導到一哺乳動物細胞之中。在哺乳動物細胞 • 之中’重組酶基因11表現一重組酶，重組酶辨識重組酶辨識 201006927 序列21以進行特定點重組(site-specific recombination)，以形 成—包含外源基因區23之環狀游離質體。 請參照圖2b，轉殖基因251可為一報導基因，例如增強 t、、表色螢光蛋白（enhanced green fluorescence protein, EGFP);或可為一具功能性的目標基因。 轉殖基因251亦可為一抗生素抵抗性基因（antibi〇tics resistant gene)’舉例而言，可為新黴素(Neomycin)抵抗性基 因’用以在加入抗生素的篩選壓力情況之下，增加新形成之 ❺ 環狀游離質體在哺乳動物細胞中的穩定性。因此，本發明更 可加入抗生素來提供一篩選壓力以增加細胞内外源基因區 - 23之穩定性。 • 請參照圖2c，本發明建構另一第二重組桿狀病毒2,以分析環 形游離質體之形成及表現比例，其與第二重組桿狀病毒的差異在於第 —起動子252的放置位置，需經過特定點重組，第三起動子m2才會 與轉殖基因251同方向。在此實施例中，轉殖基因251為一報導基因， 例如增強型綠色螢光蛋白（danced聊611prQte< EGFP)。在環形游離質體未形成之前，第三起動子252因為未與EGFp ® 同方向，因此無法增強EGFP之表現。而在環形質體形成之後，第三 ，動子252與EGFP為同方向，因此可增強EGFp之表現。本發明可 藉以檢測哺乳動物細胞之發光比例以決定具有外源基因區之哺乳動 物細胞比例。 由以上敘述可知，本發明可使哺乳動物細胞表現具複製起始 序列之環形游離質體以表現轉殖基因，而其基因載體為桿狀病毒: 因此可達到高安全性及高效率之基因傳遞。 k 以下通過具體實施例配合附圖詳加說明，可更容易瞭解 本發明的目的、技術内容、特點及所達成的功效，並據以實 ' 施，但不能以此限定本發明的保護範圍。 11 201006927 凊參照圖3 ’其為一流程示意圖顯示依據本發明一較佳實施例。 ' 其中，第一重組桿狀病毒1為Bac-FLP，其包含FLP重組酶基因以作 為重組酶基因11、Pcmv-ie(CMV-IE啟動子)以作為第一啟動子12 ;第 二重組桿狀病毒2為BacCON-CE’其包含Frt以作為重組酶辨識序列 21 ’而第二重組桿狀病毒2的外源基因區23包括：ΕΒΝΑ_ι基因以 作為核抗原基因241、OriP以作為複製起始序列242、Pcmvi 以作為第二啟動子243。此外轉殖基因251包括一報導基因 EGFP及一抗生素抵抗性基因（Ne〇、Ne〇mycin郎以抓㈣。 EGFP的啟動子為pcMV]E，而Neor的啟動子則為pSV4夂sV4〇

〇 啟動子）。因為EGFP及Neor為真核動物之基因，因此EGFP 及在其後包括多聚腺苷酸尾(p〇ly a tail，PA)以做為基因 • 表現之修飾。 • 將Bac-FLP和BacCON-CE以共轉導方式送入HEK293細胞 後’ Bac-FLP藉由PCMVLIE驅動FLP基因表現FLP重組酶，辨識 BacCON-CE基因體中的Frt序列’將轉殖基因從桿狀病毒的基因體中 分離’其本身的Frt序列會再次進行接合(ligation)形成一環狀游離質 體（pFC-OEE) ’此時，環狀游離質體隨著每次細胞分裂進行一次複 製’並且有效率地將游離質體均勻分配至子代細胞（daughtercells)， ® 並維持等量的外源DNA數量，並穩定地存在細胞中進行長期表現。 如圖4所示’經由一般桿狀病毒載體Bac-CE (利用CMV啟動 子驅動EGFP基因）所轉導的胞表現GFP，其表現期則僅有20天； 而經Bac-FLP和BacCON-CE共轉導後之細胞可長期表現GFP螢光蛋 白。表現期在轉導後35天，GFP+細胞仍能維持在22.5 ± 3.9 %以上， 因此與一般桿狀病毒BacCE之載體有顯著差異。。 此外’為使細胞能更有效的長期表現外源基因，可於細胞培養 環境加入抗生素以穩定具轉殖基因之細胞。在加入抗生素之實驗組 中，經Bac-FLP和BacCON-CE共轉導後之細胞可長期表現GFP螢光 12 201006927 蛋白，表現期可達60天以上，GFP+細胞仍能維持在36 2 士 4 2 %以 上。由上可知，本發明可使細胞長期表現轉殖基因。 此外，可進一步進行聚合酶連鎖反應 PCR)以確認外源基因區之存在，其中因為pFC_〇EE質體上含有一經 重組後新形成的Frt連接序列，因此可藉此序列在兩側各設計一組引

子(Frt-F: 5’-CGTGTACGGTGGGAGGTCTAT-3,和 Frt-R: 5，-GCCCT TGCTCACCATGGT-3’）。由上述可知，經FLp重組酶進行重組作用 後，可從桿狀病毒基因體中切除外源基因區，並自行組裝成環形游離 質體，由此邊明本發明形成環形游離質體之可行性。 如前所述，本發明可在哺乳動物細胞中長期表現外源基因，其 與桿狀病毒之表現時效性不同，因此更進一步利用q_pcr以確認外 源基因是以病毒DNA形式存在或是以游離質體形式進行表現。為了 解病毒DNA於細胞内的存在情形，將實驗組（Bac_FLp + BacCON-CE)和賴組（BaeCE)於轉#後在分別在不同時間點收集 細胞，分離細胞内全部DNA ’並以q_PCR分析比較實驗組與對照組 細胞内病毒DNA (即64基因）和游離質體隨時間變化情形。 如圖5顯示，對照組之重組桿狀病毒DNA在細胞中的含量不穩 定，大約於轉導後第18天則所剩無幾，病毒DNA殘存量約為轉導後 第1天的0.1%以下，而在實驗紐_中，雖然大部分的病毒DNA於轉導 後7天内快速被降解(約至Π %)，但是降解速率較對照組緩慢，在未 加入抗生素之實驗組中，於轉導後第22天後，細胞内病毒DNA的含 量則僅剩約0.1 % ;而在加入抗生素之實驗組，於轉導後第3〇天後， 細胞内病毒DNA的含量則僅剩〗％。此外，雖然娜分的新生成的 游離質體於轉導後快速被降解(約至20 %)，但是未加入抗生素實驗組 中，在轉導後20天到50天之間細胞内游離質體的含量仍可維持〇 25 %，而在加入抗生素之之實敝，在轉導後2〇天到6〇天之間細胞内 游離質體的含量航地轉2.5 %，上聽果顯示，轉殖基因能夠長 13 201006927 』表現歸功於獅質體敎存在，如於喊培養環境加人抗生素能更 增加細胞中轉殖基因之穩定性。 、目刚相的轉染方法使用於她胞株或職幹細胞時 ，往往傳 、土因之效率不佳。此實驗藉轉導不聊型的細胞，戦本發明之 傳遞游離質體的效率，以提供除f知的轉染方法之外的另—種傳遞方 式。如同先前實驗的病毒轉導程序，於轉導後2天以流式細胞儀分析 GFP+、.’田胞比例及螢光強度。由圖6顯示，在細^細胞中游離質體傳 遞效率最佳可達82.3 ± 2.9 %，平均螢絲度達1937 ± 145。HepG2 和Huh-7傳遞效率分別為36 2 ± 2 4 %和41 8 土 3 〇 %，而融_7的轉 染效率約八有8.8 %(未顯示)。初代細麟用兔子的膝關節取得之軟骨 細胞（chondrocyte)進行測試，傳遞效率可達58 5 土 2 2 %，而其轉 木效率約只有6.2 0/〇(未顯示間葉幹細胞採用從人類臍帶血所分離出 來之間葉幹細胞(mesenchymaI stem cell)，其傳遞效率可達％ 5 ± 4 4 %，而其轉染效率約只有3 Q%(未顯示）。 綜合上述，本發明之長期表現外源基因之方法可有效轉導各類 型細胞’並且可以改善桿狀病毒表現的時效性，表現期至少可達6〇 天以上。應用本發明作絲因傳遞的方法，其優點在於：利用桿狀病 毒共轉導姐動物細胞’藉由桿狀病毒的高轉導效率，能有效提升基 因傳遞效率。本發明並且不需使用一般質體轉染過程常用的轉染試 劑’例如：微絲(其售價非常昂貴）’因此可減少操作成本；並且桿 狀病毒容易進行放大得到高效價的病毒，因此可節省操作時間及成 本。 以上所述之實施例僅是為說明本發明之技術思想及特 點’其目的在使熟習此項技藝之人士能夠瞭解本發明之内容 並據以實施i當不能以之限定本發明之專利範圍，即大凡依 本發明所揭*之精神所作之均㈣減修飾，仍應涵蓋在本 發明之專利範圍内。 201006927 【圖式簡單說明】 圖1為顯示本發明一較佳實施例之流程圖。 圖2a至圖2c顯示本發明一較佳實施例之重組桿狀病毒。 圖3顯示本發明一較佳實施例之流程示意圖。 圖4至圖6顯示本發明一較佳實施例之實驗結果。

【主要元件符號說明】 S11 〜S13 長期表現外源基因之步驟 1 第一重組桿狀病毒 11 重組酶基因 12 第一啟動子 2 第·一重組桿狀病毒 21 重組酶辨識序列 23 外源基因區 241 核抗原基因 242 複製起始序列 243 第二啟動子 251 轉殖基因 252 第三啟動子 15

Claims (1)

1. 201006927 十、申請專利範圍： ' 1. 一種長期表現外源基因之方法，包含： 提供一第一重組桿狀病毒，其中該第一重組桿狀病毒包含 一重組酶基因； 提供一第二重組桿狀病毒，其中該第二重組桿狀病毒包含 二重組酶辨識序列、位於該等重組酶辨識序列之間的一外源基 因區，其中該外源基因區包含一核抗原（Nuclear antigen)基因及 一複製起始（Origin of replication)序列，該核抗原基因表現一核 φ 抗原以與該複製起始序列結合；以及 將該第一重組桿狀病毒及該第二重組桿狀病毒共轉導到 一哺乳動物細胞之中，其中該重組酶基因表現一重組酶，該重 . 組酶辨識該等重組酶辨識序列以進行特定點重組（site-specific recombination)，以形成一包含該外源基因區之環狀游離質體。 2. 如請求項1之長期表現外源基因之方法，其中該第一重組桿 狀病毒更包含一第一啟動子，其位於該重組酶基因之上游。 3. 如請求項1之長期表現外源基因之方法，其中該外源基因區 ©更包含一第二啟動子，其中在該環狀游離質體之中，該第二 啟動子與該核抗原基因為同向，且第二啟動子位於該核抗原 基因之上游。 4.如請求項1之長期表現外源基因之方法，其中該外源基因區 更包含一轉殖基因。 5.如請求項4之長期表現外源基因之方法，其中該轉殖基因為 一報導基因或一具功能性的目標基因。 16 201006927 6. 如請求項$ 增強别 之長期表現外源基因之方法，其中該報導基因為 EGFP) 愛光蛋白（enhanced green fluorescence protein, 7. 如請求項6 <長期表現外源基因之方法，更包含： 檢須彳該n金- 之喵查丨红ΓllL動物細胞之發光比例以決定具有該外源基因區 之“L動物細跑比例。 8. 如請求項4 ❹

   一抗生 之長期表現外源基因之方法，其中該轉殖基因為 抗性基因（antibiotics resistant gene) 〇 9. 如請求項8 <長期表現外源基因之方法，更包含： 加 定性。 &生素提供一篩選壓力以增加該外源基因區之穩 10· 如清求Jg A之長期表現外源基因之方法，其中該外源基因 1丄 Μ第三啟動子，其中該第三啟動子與該轉殖基因為 同向，且兮黹— ^二啟動子位於該轉殖基因之上游。 11· 言青 t ' ° ^1之長期表現外源基因之方法，其中該重組酶為 翻轉酶重細@ A . 畔素(Flipase recombination enzyme, FLP)。 12.如5青求項11之長期表現外源基因之方法，其中該重組酶辨 識序列為翻轉酶重組酵素辨識目標（Flipase Recogniti〇n Target，Frt) 〇 13. 如請求項1之長期表現外源基因之方法，其中該重組酶為 CRE 重組酶（Cyclization Recombination Recombinase)。 14. 如請求項13之長期表現外源基因之方法，其中該重組酶 辨識序列為 X-〇ver P1 基因座（locus of X-over P1, loxp) 〇 17 201006927 15. 如請求項1之長期表現外源基因之方法，其中該複製起始 • 序列為 EB 病毒(EpStein-Barr virus)複製起始（EBV replication origin, 〇Ηρ)。 16. 如請求項15之長期表現外源基因之方法，其中該核抗原 為 EB 病毒核抗原-1(EBV nuclear antigen 1，EBNA-1) » 17. 如請求項1之長期表現外源基因之方法，其中該複製起始 序列為猿猴病毒4〇複製起始序列。 18. =清求項17之長期表現外源基因之方法，其中該核抗原 ❹ 為板猴病’ 40大T抗原（SV40 large T antigen)。