TW200950808A - Anti-PirB antibodies - Google Patents

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200950808 六、發明說明： 、 【發明所屬之技術領域】 概言之本發明係關於神經發育及神經病症。本發明具體 而言係關於髓磷脂相關抑制系統之新穎調節劑之鑒定及如 此鑒定之該等調節劑之各種用途。 . 【先前技術】 魏磷脂及趙磷脂相關蛋白

V 已知成年哺乳動物CNS神經元之軸突在受傷後再生之能 Ο 力極其有限，而周圍神經系統（PNS)中之轴突可快速再 生。已知CNS神經元之再生能力有限部分歸因於CNS軸突 之内在特性，但亦係由於環境不允許所致。CNS髓磷脂雖 然不是神經突生長抑制性信號之唯一來源’且其含有多種 可有效阻斷軸突生長之抑制性分子，且因此其構成顯著再 生障壁。人們已確定該等髓磷脂相關蛋白（map)中之三 種：Nogo(亦稱作NogoA)係Reticulon蛋白質家族之成員其 具有兩個跨膜結構域；髓磷脂相關糖蛋白（MAG)係Ig超家 ® 族之跨膜蛋白；且OMgp係具有糖基化磷脂醯肌醇（GPI)錨 之富白胺酸重複（LRR)蛋白。Chen等人，Nature 403:434-- 39 (2000) ; GrandPre等人，Nature 417:439-444 (2000); • Prinjha等人，Nature 403:383-384 (2000) ; McKerracher等 人，Neuron 13:805-1 1 (1994) ; Wang 等人，Nature 417:941-4 (20020: Kottis等人，J. Neurochem 82:1566-9 (2002)。文獻中已闡述NogoA之一部分Nogo66作為具有66 個胺基酸之細胞外多肽存於Nogo之所有三種亞型中。 139862.doc 200950808 儘管結構中存在差異，但已顯示所有三種抑制性蛋白 (包括Nogo66)皆可結合相同GPI錨定受體（稱之為Nogo受 體）(NgR ;亦稱作Nogo受體-1或NgRl)，且已有人提出在 介導Nogo、MAG及OMgp之抑制作用時可能需要NgR。 Fournier等人，Nature 409:341-346 (2001)。亦已確定兩種 NgRl同系物（NgR2及NgR3)。於2005年3月3日公開之US 2005/0048520 Al(Strittmatter 等人）。鑒於NgR係 GPI錨定 細胞表面蛋白，其不可能係直接信號轉導體（Zheng等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:1205-1210 (2005))。其他 文獻已提出，神經營養因子受體p75NTR可用作NgR之共受 體且可在受體複合物中提供信號轉導部分（Wang等人， Nature 420:74-78 (2002) ; Wong 等人，Nat. Neurosci· 5:1302-1308 (2002))。

PirB及人類同源娌 I類主要組織相容性複合物（MHC)最初被鑒定為編碼對 免疫系統具有重要意義之分子家族之區段。最新證據表 明，I類MHC分子在發育中及成年CNS中具有其他功能。 Boulanger 及 Shatz，Nature Rev Neurosci. 5:521-53 1 (2004) ; US 2003/0170690 (Shatz及 Syken)，2003 年 9 月 11 曰公開。人們已發現在CNS神經元中表現多個I類MHC成 員及其結合配偶體。近年來之遺傳及分子研究集中於CNS I類MHC之生理學功能，且初期結果表明，I類MHC分子可 在活性依賴性突觸可塑性中發揮作用，在此過程期間已有 突觸連接之強度因應神經元活性而提高或降低，隨後神經 139862.doc 200950808 迴路發生長期結構改變。此外，I類MHC編碼區在遺傳上 亦與眾多種具有神經症狀之病症相關，且據認為I類MHC 分子之異常功能有助於破壞正常腦發育及可塑性。 在免疫環境中一種已知I類MHC受體係PirB，其係首先 由Kubagawa等人闡述之鼠類多肽，Proc. Nat. Acad· Sci. USA 94:5261-6 (1997)。小鼠PirB具有若干種人類同源 體，其係白細胞免疫球蛋白樣受體亞家族B (LILRB)之成 員，且亦稱作「免疫球蛋白樣轉錄物」（ILT)。人類同源 體表現與鼠類序列之顯著同源性，自最高至最低順序如 下：LILRB3/ILT5 、LILRB1/ILT2 、LILRB5/ILT3 、 LILRB2/ILT4，且其正如PirB —樣皆為抑制性受體。 LILRB3/ILT5 (NP_006855)及 LILRB 1/ILT2 (NP_006660)首 先由 Samaridis 及 Colonna 闡述於 Eur. J. Immunol. 27(3):660-665 (1997)中。LILRB5/ILT3 (NP—006831)已經 Borges 等人所確定，J. Immunol. 159(11):5192-5196 (1997)。LILRB2/ILT4(亦稱作 MIR10)係由 Colonna 等人所 確定，J. Exp. Med. 186:1809-18 (1997)。PirB及其人類同 源體表現很大程度之結構差異性。各種替代性剪接形式之 序列可自EMBL/GenBank獲得，包括（例如）以下登錄號之 人類 ILT4 cDNA ： ILT4-cll AF009634、ILT4-cll7 AF1 1566、ILT4-C126 AF1 1565。如上所述，PirB/LILRB 多 肽係I類MHC (MHCI)抑制性受體，且其在調節免疫細胞活 化中之作用為業内所熟知（Kubagawa等人，如前所述； Hayami等人，J. Biol. Chem. 272:7320 (1997) ; Takai等 139862.doc 200950808 人，Immunology 1 15:433 (2005) ; Takai等人，Immunol. Rev. 181:215 (2001); Nakamura等人Nat· Immunol. 5:623 (2004) ; Liang等人，Eur. J. Immunol. 32:2418 (2002))。

Syken等人所進行之近期研究(Science 313:1795-800 (2006))報導，在遍佈腦中之神經元亞組中皆表現pirB。在 缺少功能性PirB之突變小鼠中，皮質眼優勢柱（〇D)可塑性 在所有年齡皆得以顯著增強’此表明PirB具有在視皮質中 限制活性依賴性可塑性之功能。 【發明内容】 本發明至少部分基於以下發現：使用功能阻斷性抗PirB 抗體干擾PirB活性有助於救援由Nogo66及髓碟脂導致之神 經突生長抑制，且同時阻斷PirB及NgR活性可導致幾乎完 全解除髓磷脂抑制。 在一態樣中，本發明係關於經分離抗PirB/LILRB抗體’ 其實質上與選自由YW259.2、YW259.9及YW259.12組成之 群之抗體結合人類PirB (LILRB)上之相同表位。 在另一態樣中，本發明係關於經分離抗PirB/LILRB抗 體，其與選自由YW259.2、YW259.9及YW259.12組成之群 之抗體競爭結合人類PirB (LILRB)。 在另一態樣中，本發明係關於經分離抗pirB/LILRB抗 體，其包含一、二或三個來自選自由以下組成之群之重鏈 的超變區序列：YW259.2重鏈（SEQ ID NO: 4或11)、 YW259.9 重鏈（SEQ ID NO: 5 或 12)、及 YW259.12 重鏈（SEQ ID NO: 6或 13)。 139862.doc 200950808 在一實施例中，抗體包含YW259.2抗體重鏈（SEQ ID NO: 4或11)之所有超變區序列。 在另一實施例中，抗體包含YW259.9抗體重鏈（SEQ ID NO: 5或12)之所有超變區序列。 在另一實施例中，抗體包含YW259.12抗體重鏈（SEQ ID NO: 6或13)之所有超變區序列。 在另一實施例中，抗體包含輕鏈。 在另一實施例中，抗體包含一、二或三個來自SEQ ID NO: 7多肽序列之輕鏈的超變區序列。 在另一實施例中，抗體包含含有SEQ ID NO: 7或15多肽 序列之輕鏈之所有超變區序列。 在一具體實施例中，抗體包含重鏈及輕鏈二者，其中重 鏈包含一、二或三個來自選自由以下組成之群之重鏈之超 變區序列：YW259.2 重鏈（SEQ ID NO: 4)、YW259.9 重鏈 (SEQ ID NO: 5)及 YW259.12 重鏈（SEQ ID NO: 6)，及/或輕 鏈包含一、二或三:個來自SEQ ID NO: 7多肽序列之輕鏈之 超變區序列。 在另一實施例中，抗體係選自由以下抗體組成之群： YW259.2、YW259.9、及 YW259.12。 在另一態樣中，本發明係關於經分離抗PirB抗體，其中 抗體之全長IgG形式以5 nM或更強、或1 nM或更強之結合 親和性特異性結合人類PirB。 在一實施例中，抗體促進軸突再生，例如CNS神經元之 再生。 139862.doc 200950808 在另一實施例中，抗體至少部分地救援由N〇g〇66及髓磷 脂所導致之神經突生長抑制。 在所有態樣中’抗體較佳為單株抗體，其可為（例如）嵌 合抗體、人類化抗體、親和性成熟抗體、人類抗體、或雙 特異性抗體、抗體片段或免疫接合物。 在另一態樣中’本發明係關於編碼本文所述抗pirB抗體 之多核苷酸。 在其他態樣中’本發明係關於包含編碼本文所述抗體之 多核苷酸（包括一或多種抗體鏈之編碼序列）之載體及宿主 細胞。宿主細胞包括原核、真核及哺乳動物宿主。 在另一態樣中’本發明係關於製備抗PirB抗體之方法， 其包含（a)在適宜宿主細胞中表現包含編碼抗體之核酸之載 體’及（b)回收該抗體。 在另一態樣中，本發明係關於包含本文所述抗 PirB/LILRB抗體及醫藥上可接受賦形劑之組合物。視需 要’該組合物包含第二藥物，其中抗pirB/ULRB抗體係第 一樂物。例如’第二藥物可為NgR抑制劑，例如抗NgR抗 體。 在一不同態樣中’本發明係關於包含本文所述抗-抗 PirB/LILRB抗體之套組。 在另一態樣中，本發明係關於促進軸突再生之方法，其 包含向有需要之個體投與有效量之本文所述抗pirB/LILRB 抗體。較佳地，該個體為人類患者。 在各實施例中，本文所述治療方法可促進神經元之存活 139862.doc -8 - 200950808 及/或誘導神經元生長。 在另一態樣甲，太i > # 明係關於治療神經變性疾病之方 法，其包含向有需 ！任疾病之方

PirB/LILRB抗體。例如體投與有效量之本文所述抗 插神經系統造成之物理2經變性疾病之特徵可在於對中 關之腦損傷。 冑，且包括(但不限於)與中風相 ❹ Ο 群在一特定實施例中’神經變性疾病係選自由以下組成之 重广=神經痛、舌咽神經痛、貝爾麻痺（Ben,sPalsy)、 :症肌無力、肌營養不良、肌萎縮側索硬 性硬化（MS)、進行性肌萎 要縮進仃性延髓遺傳性肌萎縮、 因物理損傷（例如燒傷、創 幻傷）或諸如糖尿病、腎功能障礙 ㈣病狀態或因用於治療癌症及AIDS之化學治療的毒性 效應引發之外周神經損傷m、破裂性、或脫垂性椎 間盤症候群、頸椎病、神經叢病症、胸廓出Π破壞症候 群1圍神經病（例如由錯、胺苯鄉叩_)、蜱引起之 等）卜啉症、格林-巴厘症候群（Gullain-Barre ―)、阿兹海默氏症(Al—，s disease)、亨庭頓 氏症（Huntington’s Disease)、及帕金森病（parkin s disease) ° 本發明另外係關於抗獨特型抗體，其特異性結合本文所 述抗PirB抗體。 【實施方式】 A. 定義 在本文中術語「配對免疫球蛋白樣受體B」及「pirB」 139862.doc 200950808 可互換使用，其係指天然序列（SEQ ID NO: 1之841個胺基 酸之小鼠抑制蛋白（圖1)(NP_035225))及其在大鼠及其他非 人哺乳動物中之天然序列同系物，包括所有天然存在之變 體（例如替代性剪接及等位基因變體及亞型），以及其可溶 性形式。其他細節參見Kubagawa ί/α 94, 5261 (1997)。 在本文中術語「LILRB」、「ILT」及「MIR」可互換使 用，且其係指人類「白細胞免疫球蛋白樣受體亞家族Β」 之所有成員，包括所有天然存在之變體（例如替代性剪接 及等位基因變體及亞型），以及其可溶性形式。此LILR受 體之Β型亞家族内之各個成員係藉由縮寫後加數字來命 名，例如LILRB3/ILT5、LILRB1/ILT2、LILRB5/ILT3、及 ILIRB2/ILT4，其中除非另外說明，否貝，J在提及任一個別 成員時，亦包括所有天然存在之變體（例如替代性剪接及 等位基因變體及亞型），以及其可溶性形式。因此，例 如，「LILRB2」、「LIR2」及「MIR10」在本文中可互換 使用且係指SEQ ID ΝΟ:2 (圖1)(ΝΡ_005 865)之598個胺基酸 之多肽，及其天然存在之變體（例如替代性剪接及等位基 因變體及亞型），以及其可溶性形式。其他細節參見Martin % K ' Trends Immunol. 23, 81 (2002) 〇 本文所用術語「PirB/LILRB」共同意指相應小鼠及人類 蛋白質及在其他非人哺乳動物中之天然序列同系物，包括 所有天然存在之變體（例如替代性剪接及等位基因變體及 亞型），以及其可溶性形式。 139862.doc -10- 200950808 具有最廣泛含義且包括存 脂中之所有蛋白質，包括 所用術語「髓磷脂相關蛋白」 於抑制神經元再生之CNS髓磷 Nogo、MAG及 OMgp。

❹ 經分離」在用於描述本文所揭示各種蛋 自蛋白質之天然環境之組份^定並分離及/或时^ ，質。其天然環境之污染組份係通常會干擾蛋白質之診斷 或治療應用之物質’且可包括酶、激素及其他蛋白質或非 蛋白質溶質。在較佳實施例中，⑴可藉由使用旋杯式序列 分析儀將蛋白質純化至足以獲得至少15個殘基α末端或 内部胺基酸序狀喊，或（2)在非還輕或㈣性條件下 使用考馬斯藍（c〇_ssie blue)或較佳使用銀染藉由sds_ PAGE將蛋白質純化至同質性，或⑺藉由質譜或肽譜技術 將蛋白質純化至同質性。經分離蛋白質包括重組細胞内之 原T蛋白，此乃因所述蛋白質之天然環境中之至少一個組 n flb不存在。然而，通常經分離蛋白質可藉由至少一個 純化步驟來製備。 紐分離」核酸分子係如下核酸分子：其係自至少一種 π染核酸分、子鑒定並分離，且在所述核酸之天然來源中該 酸通常與6亥污染核酸分子相結合。經分離核酸分子之形 或所處環i兄與其在自然界中不同。因此，經分離核酸分 =與天然細胞中存在之核酸分子不同。然而，經分離核酸 子包括含於通常表現該核酸之細胞中的核酸分子，其中 (例如）該核酸分子位於與天然細胞不同之染色體位置。 本文所用術語r PirB/LILRB拮抗劑」係用於意指能阻 139S62.doc 200950808 斷、中和、抑制、消除、降低或干擾PirB/LILRB活性之試 劑。具體而言，PirB/LILRB拮抗劑干擾髓磷脂相關抑制 活性，由此促進神經突生長及/或促進神經元生長、修復 及/或再生。在一較佳實施例中，PirB/LILRB拮抗劑藉由 與 PirB/LILRB 結合來抑制 PirB/LILRB 與 Nogo66 及 / 或 MAG 及/或OMgp之結合。PirB/LILRB拮抗劑包括（例如）針對 PirB/LILRB之抗體及其抗原結合片段、能隔絕PirB/LILRB 與Nogo 66之間、或PirB/LILRB與MAG之間、或

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PirB/LILRB與 OMgp之間之結合的 PirB/LILRB、Nogo 66、 MAG或OMgp之截短或可溶性片段、及PirB/LILRB相關抑 制途徑之小分子抑制劑。PirB/LILRB拮抗劑亦包括能抑制 或降低PirB/LILRB mRNA之表現之短干擾RNA (siRNA)分 子。較佳PirB/LILRB拮抗劑係抗PirB/LILRB抗體。 本文所用術語「抗體」具有最廣泛含義且具體而言涵蓋 完整抗體、單株抗體、多株抗體、自至少兩種完整抗體形 成之多特異性抗體（例如雙特異性抗體）、及抗體片段（只要 其表現期望生物活性即可）。 本文所用術語「單株抗體」指自一群實質上同源之抗體 獲得的抗體，即構成該群之單個抗體除可以少量存在之可 能的天然存在突變外完全相同。單株抗體具有高特異性， 其針對單一抗原性位點。而且，與包括針對不同決定子 (表位）之不同抗體之多株抗體製劑相反，每一單株抗體皆 針對抗原上之單一決定子。除特異性外，單株抗體之優勢 在於其在合成時可不受其他抗體污染。修飾詞「單株」表 139862.doc -12- 200950808 不抗體之特徵如同自實質上同源之抗體群獲得一般，且不 應理解為需要藉助任一特殊方法來產生該抗體。舉例而 吕’欲根據本發明使用之單株抗體可藉由首先由K〇hler等 人，256:495(1975))闞述之雜交瘤方法製得或可藉 由重組DNA方法製得（例如’參見美國專利第4,816,567 號）°舉例而言’ 「單株抗體」亦可使用claeks〇n等人 (iVaiwre，352:624-628 (1991))及 Marks 等人（《/. Mo/.別〇/.， 222··581-5 97 (1991))闡述之技術自噬菌體抗體庫來分離。 抗體尤其包括「嵌合」抗體，其中重鏈及/或輕鏈之一 部分與源自特定物種或屬於特定抗體種類或亞類之抗體的 對應序列相同或同源，而鏈中其餘部分與源自另一物種或 屬於另一抗體種類或亞類之抗體（以及該等抗體之片段， 只要其表現期望生物活性即可）的對應序列相同或同源（美 國專利第 4,816,567號；及 Morrison等人，Proc. Natl. Aca.d. Sci. USA，81:6851-6855 (1984))。本文中之目標嵌合抗體 包括靈長類化抗體，其包含源自非人靈長類（例如舊大陸 猴（Old World Monkey)、猿等）之可變結構域抗原結合序列 及人類恆定區序列。 「抗體片段」包含完整抗體之一部分，較佳包含其抗原 結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab，、F(ab，）2 及Fv片段；雙特異性抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及 自抗體片段形成之多特異性抗體。 「完整」抗體係包含抗原結合可變區以及輕鏈恆定結構 域（Cl)及重鏈恆定結構域（CH1、Ch2及CH3)之抗體。悝定 139862.doc • 13· 200950808 結構域可為天然序列恆定結構域（例如人類天然序列恆定 結構域）或其胺基酸序列變體。較佳地，完整抗體具有一 或多種效應子功能。 非人類（例如齧齒動物）抗體之「人類化」形式係含有源 自非人類免疫球蛋白之最小序列之嵌合抗體。人類化抗體 大多數係人類免疫球蛋白（接受者抗體），其中來自接受者 超變區之殘基經來自非人類物種（例如小鼠、大鼠、兔或 非人靈長類）超變區（供體抗體）且具有期望特異性、親和性 及能力之殘基取代。在某些情況下，人類免疫球蛋白框架 區（FR)殘基經相應非人類殘基取代。此外，人類化抗體可 包含接受者抗體或供體抗體中不存在之殘基。實施該等改 變以進一步改良抗體性能。一般而言，人類化抗體可包含 實質上所有至少一個、且通常兩個可變結構域（Fab、 Fab'、F(ab')2、Fabc、Fv)，其中所有或實質上所有超變環 皆對應於非人類免疫球蛋白之彼等，且所有或實質上所有 FR皆為人類免疫球蛋白序列之彼等。人類化抗體亦可視需 要包含免疫球蛋白恆定區（Fc)(通常為人類免疫球蛋白恆定 區）之至少一部分。其他細節可參見jones等人，Nature 321:522-525 (1986) ; Riechmann等人，Nature 332:323-329 (1988);及 Presta，Curr· Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。 術語「超變區」在用於本文中時指抗體可變結構域中序 列具有超變性及/或可形成結構上經界定之環的區域。超 變區包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基 139862.doc 14· 200950808 (即輕鏈可變結構域中之殘基24-34、50-56及89-97及重鏈 可變結構域中之31-3 5、50-65及95-102 ; Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，％ 5版， Public Health Service > National Institutes of Health » Bethesda ’ MD.(1991))及/或彼等來自「超變環」之殘基 (例如輕鍵可變結構域中之殘基26-32、50-52及91-96及重 鏈可變結構域中之26-32、53-5 5及96-101;〇1〇如3及1^让 J. Μσ/·出〇/· 196:901-917 (1987))。在該兩種情況下，根據 Kabat等人（如前所述）對可變結構域殘基進行編號，如下文 所詳述。「框架區」或「FR」殘基係彼等除本文所定義超 變區殘基以外之可變結構域殘基。 「親本抗體」或「野生型」抗體係與本文所揭示抗體變 體相比所包含胺基酸序列缺少一或多個胺基酸序列變化之 抗體。因此，親本抗體一般具有至少一個超變區，其胺基 酸序列與本文所揭示抗體變體之對應超變區之胺基酸序列 有所不同。親本多肽可包含天然序列（及天然存在之）抗體 (包括天然存在之等位基因變體）、或天然存在之序列中存 在既有胺基酸序列改變（例如插入、缺失及/或其他變化）之 抗體。在整個揭示内容中，「野生型」、「WT」、 「wt」及「親本」或「親本的」抗體可互換使用。 本文所用「抗體變體」或「變體抗體」係指所具有胺基 酸序列與親本抗體之胺基酸序列不同之抗體，較佳地，抗 體變體包含具有自然界中不存在之胺基酸序列之重鏈可變 結構域或輕鏈可變結構域。.該等變體與親本抗體之序列一 139862.doc -15- 200950808 致性或相似性必然低於1 00%。在一較佳實施例中，抗體 變體之胺基酸序列與親本抗體重鏈或輕鏈可變結構域之胺 基酸序列之胺基酸序列一致性或相似性為約75%至小於 100°/。’更佳為約80%至小於100%，更佳為約85%至小於 100%，更佳為約90%至小於100%，且最佳為約95%至小於 100%。抗體變體一般係包含一或多個位於其一或多個超 變區中或與之相鄰之胺基酸變化者。 「胺基酸變化」係指預定胺基酸序列之胺基酸序列中之 變化。實例性變化包括插入、取代及缺失。「胺基酸取 代」係指用另一不同胺基酸殘基來替代預定胺基酸序列中 之現有胺基酸殘基。 「替代」胺基酸殘基係指在胺基酸序列中替代或取代另 一胺基酸殘基之胺基酸殘基0替代殘基可為天然存在或非 天然存在之胺基酸殘基。 「胺基酸插入」係指將一或多個胺基酸殘基引入預定胺 基酸序列中。胺基酸插入可包含「肽插入」，在此情況下 將包含兩個或更多個由肽鍵連接之胺基酸殘基之肽引入預 定胺基酸序列中。倘若胺基酸插入涉及肽插入，則可藉由 隨機誘變來生成所插入肽從而使得其具有自然界中不存在 之胺基酸序列。「與超變區相鄰」之胺基酸變化係指在超 變區之N-末端及/或C-末端引入或取代一或多個胺基酸殘 基，從而使得所插入或替代之胺基酸殘基中之至少一個與 所述超變區N-末端或C_末端胺基酸殘基形成肽鍵。 「天然存在之胺基酸殘基」係由遺傳密碼編碼者，其一 139862.doc -16- 200950808 般選自由以下組成之群：丙胺酸（Ala)、精胺酸（Arg)、天 冬酿胺（Asn)、天冬胺酸（ASp)、半胱胺酸（Cys)、麵胺酿胺 (Gin)、麩胺酸（Glu)、甘胺酸（Gly)、組胺酸（His)、異白胺 酸（lie)、白胺酸（Leu)、離胺酸（Lys)、甲硫胺酸（Met)、苯 丙胺酸（Phe)、脯胺酸（pro)、絲胺酸（ser)、蘇胺酸（Thr)、 色胺酸（Trp)、酪胺酸（Tyr)、及纈胺酸（Val)。 在本文中「非天然存在之胺基酸殘基」係除上文所列之 彼等天然存在胺基酸殘基以外之胺基酸殘基，其在多肽鏈 中此共價鍵結相鄰胺基酸殘基。非天然存在之胺基酸殘基 之實例包括正白胺酸、烏胺酸、正纈胺酸、高絲胺酸及其 他胺基酸殘基類似物，例如Ellman等人在Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)中所述之彼等。該等非天然存在之胺基 酸殘基可使用 Noren等人，Science 244:182 (1989)及Ellman 等人（如前所述）中之程序來生成。簡言之，該等程序涉及 以化學方式活化具有非天然存在之胺基酸殘基之抑制型 tRNA，之後在體外對RNA實施轉錄及轉譯。 在整個本揭示内容中，參照Kabat, E. A.等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda，Md. (1987)及（1991))之編號 系統。在該等綱要中，Kabat列舉了各亞類抗體之多種胺 基酸序列，且列舉了在該亞類中各殘基位置處最常見之胺 基酸。Kabat使用為所列序列中之每一胺基酸分配殘基編 號之方法，且此分配殘基編號之方法已成為業内標準。在 此說明中遵循Kabat編號方案。出於本發明目的，為將殘 139862.doc -17- 200950808 基編號分配至Kabat綱要中未包括之候選抗體胺基酸序 列，可遵循以下步驟。一般而言，對候選序列與Kabat中 之任一免疫球蛋白序列或任一共有序列進行比對。比對可 以人工方式實施’或藉由使用普遍接受之電腦程式之電腦 來貫施，此一程式之實例係Align 2程式。比對可藉由使用 大多數Fab序列共有之某些胺基酸殘基來輔助。舉例而 言’輕鏈及重鏈通常各自具有兩個具有相同殘基編號之半 胱胺酸；在VL結構域中該兩個半胱胺酸通常具有殘基編號 23及88，且在VH結構域中該兩個半胱胺酸殘基通常編號為 22及92。框架殘基一般（但並非總是）具有大致相同之殘基 編號’然而CDR之大小可變。舉例而言，倘若來自候選.序 列之CDR長於與其比對之Kabat序列之CDR，則通常向殘 基編號添加後綴以指示額外殘基之插入（例如，參見圖j B 中之殘基lOOabc)。對於（例如）與Kabat序列比對殘基34及 36但在該等殘基之間不存在可與殘基35比對之殘基之候選 序列而言，不將編號35分配至任一殘基即可。 本文所用具有「高親和性」之抗體係£〇(或解離常數）為 奈莫耳級（nM)或更佳之抗體。「奈莫耳級或更佳」之尺〇可 表示為Ζ nM ’其中X係小於約丨〇之數字。 「親和性成熟」抗體係在其一或多個CDR中存在一或多 處變化之抗體，該等變化會使抗體與抗原之親和性相對於 不具有該等變化之親本抗體有所改良。較佳親和性成熟抗 體可對靶抗原具有奈莫耳級或甚至皮莫耳級親和性。親和 性成熟抗體係藉由業内已知程序來製備。Marks等人， 139862.doc -18- 200950808 价σ/TVc/mo/og少 10:779-783(1992)闡述藉由 VH及 VL結構域 改組來達成親和性成熟。以下文獻闡述CDR及/或框架殘 基之隨機誘變：Barbas 等人， 91:3809-3813(1994) ； Schier 等人，Gene 169:147- 155(1995) ; Yelton 等人，《/· Immunol. 155:1994- 2004(1995) ; Jackson 等人，/. /wmw⑽/· 154(7):3310- 9(1995);及 Hawkins 等人，J. Mo/·价〇/. 226:889-896 (1992)。 抗體之「功能性抗原結合位點」係能結合靶抗原之位 點。抗原結合位點之抗原結合親和性未必與產生該抗原親 核位點之親本抗體一般強，但結合抗原之能力可使用已知 可用於評估抗體與抗原之結合之各種方法中的任一種來量 測。 具有指定抗體之「生物學特徵」之抗體係具有一或多種 抗體生物學特徵者，該等特徵可使該抗體與結合相同抗原 之其他抗體相區分。 為篩選可與目標抗體所結合之抗原表位結合之抗體，可 實施常規交叉阻斷分析，例如J Manual, Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow及 David Lane編輯（1988)中所述者。 術語「絲狀噬菌體」係指能在表面展示異源多肽之病毒 顆粒，且包括（但不限於）fl、fd、Pfl及M13。絲狀噬菌體 可含有諸如四環素等可選標記（例如「：fd-tet」）。各種絲狀 噬菌體展示系統為熟習此項技術者所熟知（例如，參見 139862.doc -19- 200950808

Zacher 等人，Gene 9: 127-140 (1980) ; Smith 等人，

Science 228: 1315-1317 (1985);及 Parmley及 Smith，Gene 73: 305-318 (1988))。 所用術語「淘選」係指在對載有諸如抗體等對靶具有高 親和性及特異性之化合物之噬菌體進行鑒定及分離時，實 施多輪篩選過程。 術語「短干擾RNA (siRNA)」係指干擾基因表現之小雙 鏈RNA。siRNA係RNA干擾之中間體，RNA干擾是雙鏈 RNA使同源基因沉默的過程。siRNA通常包括兩個長約1 5-25個核苷酸且形成二倍體之單鏈RNA，其可包括單鏈突出 端。藉由酶複合物（例如聚合酶）處理雙鏈RNA可使雙鏈 RNA裂解而產生siRNA。使用siRNA之反義鏈藉由RNA干 擾（RNAi)沉默複合物來引導mRNA裂解，由此促進mRNA 降解。為（例如）在哺乳動物細胞中使用siRNA使特定基因 沉默，對鹼基配對區加以選擇以避免與無關mRNA互補之 機會。業内已蓉定出RNAi沉默複合物，例如Fire等人， Nature 391:806-81 1 (1998)及 McManus 等人，Nat. Rev.

Genet. 3(10):737-47 (2002)。 本文所用術語「干擾RNA (RNAi)」係指可導致特定 mRNA催化降解之雙鏈RNA，且由此其可用於抑制/降低特 定基因之表現。 本文所用術語「多態」係指基因或其一部分（例如等位 基因變體）之多於一種形式。有至少兩種不同形式之基因 之部分稱作基因之「多態區」。基因多態區之特定遺傳序 139862.doc -20- 200950808 列為「等位基因」。多態區可為單—核苷酸，在不同等位 基因中不同，或可為幾個核苷酸長。 概言之’本文所用術語「病症」係指可受益於使用㈣ /ULRB2拮抗劑（例如抗PirB抗體）治療之任一病況，包括預 期可受益於轴突再生治療及/或神經系統中突觸可塑性改 良之任一病況。本文中欲治恭在、严> r奴/0縻病症之非限制性實例包括 (但不限於）可受益於促進神經突生長、促進神經元生長、 修復或再生之疾病及病況，包括神經病症，例如物理損傷 神經及神經變性疾病。該等病症特別包括中拖神經系統之 t理損傷（例如脊趙損傷及頭部創傷）；與中風相關之腦損 傷；及與神經變性相關之神經病症，例如三叉神經痛、舌 咽7痛、貝爾麻痒、重症肌無力、肌營養不良、肌萎縮 :,:rs)、進行性肌萎縮、進行性延趙遺傳性肌萎 r候二硬化（MS) ’犬出性、破裂性、或脫垂性椎間盤 =傷Γ病、神經叢病症、胸廓出口破壞症候群、因 物理㈣或諸如糖尿病等疾病狀態引發之外周神經損傷、 周圍神經病(例如由鉛、胺苯砜 m r~ — 巧5丨起者）、卟琳症、格 林-巴厘症候群、阿茲海默 病。 f正亨庭頓氏症、或帕金森 本文所用術语「治療」係指治療性、、Λ ·麻箱R叫 及預防⑺療。連續性治療或投藥係指 天一 在治療中無一日或多日之 人Μ且 間歇性方六、“ ^ Μ歇性治療或投藥、或以 本文所:投樂係指治療不連續’而是週期性。 術語「阻止神經變性」包括⑴在新近診斷為 139862.doc 200950808 患有神經變性疾 中抑制或阻止神 病或具有神經變 經變性之能力。 病或具有發生新神經變性疾病危險之患者 經變性之能力，及（2)在已患有神經變性疾 性疾病症狀之患者中抑制或阻止進一步神 哺1 2 「哺乳動物」係指任何歸類為哺乳動物之 二 包括人類、高等非人靈長類、齧齒動物、家畜 ^畜：例如牛 '馬、犬及貓。在本發明-較佳實施例 中，哺乳動物為人類。 與一或多種其他治療藥劑「組合」投與包括同時(一起) 投與及以任—順序連續投與。 社「有效量」係足以達成有益或期望治療性（包括預防性） 、。果之量。有效量可以一或多次投與來施用。 本文所用措辭「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」 可互換使用且所有該等表述皆包括其子代。因此，詞語 轉化體」及「轉化細胞」包括原代個體細胞及源自其之

培養物而不考慮轉移次數。亦應瞭解，所有子代所含DNA 可能因特意或無意突變而不精確相同。術語「子代」係指 原始轉化細胞或細胞系之後各世代之任一及所有後代。其 包括與原始轉化細胞中所篩選者具有相同功能或生物活性 之突變子代。倘若意欲使用獨特名稱，則可根據上下文而 明瞭。 關於本文所鑒定序列之「胺基酸序列一致性百分比 (%)」定義為：在比對各序列及（若需要）引入缺口以達成最 大序列一致性百分比後’候選序列中與參照序列中之胺基 139862.doc •22· 200950808 酸殘基一致之胺基酸殘基之百分比，且不將任何保守性取 代視作序列一致性之一部分。用於確定胺基酸序列—致性 百分比之目的之比對可以業内已知可確定量測比對之適宜 參數的各種方式來達成’包括指定在所比較全長序列上達 成最大比對所需鼻法。出於本文之目的，可使用序列比較 電腦知式ALIGN-2來獲得胺基酸一致性百分比數值，該程 • 式由Genentech公司設計且其原始碼已與用戶文檔一起歸 鲁 檔於美國版權局（us Copyright Office)(Washington, DC， 20559)中，註冊號為美國版權註冊第TXU51〇〇87號。 ALIGN-2程式係經由 Genentech公司（South San Francisco, C A)以公開方式獲得。所有序列比較參數皆係藉由ALiGN· 2程式來設定且不可變。 熟習此項技術者可容易地確定雜交反應之「嚴格性」， 且一般係基於探針長度、洗務溫度、及鹽濃度之經驗計 算。一般而言，較長探針需要較高溫度來達成適當退火， 〇 錢短探針需要較低溫度。當互補鏈所處環境之溫度低於 其解鏈溫度時，雜交一般取決於變性DNA再退火之能力。 料與可雜交序列之間期望—致性程度愈高，可使用之相 對溫度愈高。因此可斷定，較高相對溫度傾向於使反應條 . 2更嚴格。’而較低溫度所需反應條件嚴格性較低。關於雜 交反應嚴格性之其他細節及閣釋參見Ausubei等人，

Protocols in Molecular Biology, Wiley

Interscience Publishers, (1995)。， 本文所疋義4 π嚴格性條件」可藉由以下方式來確 139862.doc -23- 200950808 定：（1)洗務中採用低離子強度及高溫；在50。匸下採用 0.015 Μ氣化鈉/0.0015 μ擰檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉； (2)在雜交期間採用變性劑；在42。〇下採用5〇0/〇 (ν/ν)曱醯 胺及0.1%牛血清白蛋白/01%蔗聚糖（Ficoll)/〇 1〇/〇聚乙烯基 °比嘻咬酮/含有750 mM氣化鈉、75 mM檸檬酸鈉之50 mM 鱗酸鈉緩衝液（pH 6.5);或（3)在42°C下採用50%曱醯胺、5 X SSC((K75 M NaCl、0.075 Μ 檸檬酸鈉）、50 mM 磷酸鈉 (pH 6.8)、0.1%焦麟酸鈉、5xDenhardt，s溶液、經超音波處 理之鼓魚精子DNA (50 eg/ml)、〇tl% SDS、及10%硫酸葡 聚糖’且在42°C下於0.2xSSC(氣化鈉/檸檬酸鈉）中洗滌且 在55C下於5 0%甲酿胺中洗滌，之後在55。〇下於含有 EDTA之O.lxSSC中實施高嚴格性洗滌。

「中等嚴格性條件」可根據Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989所述來確定，且包括在37。〇下於包含以 下之溶液中培養過夜：20%曱醯胺、5xSSC (15〇 mM

NaCl、15 mM 枸橡酸鈉）、50 ιηΜ 磷酸鈉（pH 7.6)、5 X

Denhardt’s溶液、10%硫酸葡聚糖、及2〇 mg/ml變性剪切鮭 魚精子DNA，之後在lxSSC中於約37_5(rc下洗滌濾器。熟 習此項技術者可瞭解如何根據需要來調節溫度、離子強度 等以調適諸如探針長度及諸如此類等因素。 術語「控制序列」係指在特定宿主有機體内表現可操作 連接之編碼序列所需的DNA序列。舉例而言，適用於原核 生物之控制序列包括啟動子、（視需要）操縱子序列、及核 139862.doc -24· 200950808 已知真核細胞可制啟動子、聚腺苦酸化 Φ 當使核酸與另-核酸序列具有功能性關係時，該核酸係 「可操作連接的」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列 之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋自，㈣前序列或分泌 前導序列之DNA可操作連接至該多肽之亀上；啟動子或 增強子若可影響編碼序列之轉錄，則該啟動子或增強子可 操作連接至該編碼序列上；或若核糖體結合位點之定位有 助於轉譯，則該核糖體結合位點可操作連接至該編碼序列 上。一般而言，「可操作連接」意指所連接dna序列係鄰 接序列且在分泌前導序列情況下係處於閱讀相之鄰接序 列。然而’增強子無需鄰接。藉由在便利的限制位點處接 合可完成連接。若不存在該等位點，則可根據習知慣例使 用合成性寡核苷酸銜接子或連接體。

糖體結合位點 信號及增強子 在本文中將「小分子」定義為分子量低於約丨〇〇〇道爾 頓、較佳低於約500道爾頓。 B. 抗PirB/LILRB抗饉之產生 本發明抗PirB抗體可藉由業内已知方法來產生，包括重 組DNA技術。 (i)抗原製備 可使用視需要與其他分子接合之溶解性抗原或其片段來 作為生成抗體之免疫原。對於諸如受體等跨膜分子而言， 可使用其片段（例如受體之細胞外結構域）來作為免疫原。 或者，可使用表現跨膜分子之細胞作為免疫原。該等細胞 139862.doc -25- 200950808 可源自天然來源（例如癌細胞系）或可為已藉由重組技術轉 化而可表現跨膜分子之細胞。熟習此項技術者可瞭解其他 抗原及其可用於製備抗體之形式。 (ii)多株抗體 較佳藉由多次皮下（SC)或腹膜腔内（ip)注射相關抗原及佐 劑而在動物中產生多株抗體。有用的是，在欲免疫物種體 内使用雙功能試劑或衍生劑（例如’馬來酿亞胺基苯甲酿 基磺基琥珀醯亞胺酯（經由半胱胺酸殘基接合）、N_羥基琥

珀醯亞胺（經由離胺酸殘基）、戊二醛、琥珀酸酐、socl2 或RlN=C=NR，其中尺與Rl係不同燒基）使相關抗原與免疫 原性蛋白質（例如，鑰孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀 腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑）接合。

藉由以下方式針對抗原、免疫原性接合物或衍生物對】 物實施免疫：將（例如扉叫或5叫蛋白質或接合物（分) 用於兔子或小鼠)及3體積弗氏(—3)完全佐劑合併，」 在多個位點皮内注射該溶液。一個月後，藉由多位點皮_ =射用佔初始量1/5至咖之存於弗氏完全佐劑中之肽或^ =:物實施加強免疫…天後，插取動物之“ 進行抗體滴度分析。對動物實施加 =穩：狀態。較佳地’用接合至不同蛋白質及_ 疫。接同抗原之接合物對動物實施加幻 製備。同樣諸如M細胞培養物巾作為蛋白質融合物4 ㈣單株抗Γ聚集劑_於增強免疫反應。 139862.doc * 26 - 200950808 單株抗體可使用首先由Kohler等人在Nature, 256:495 (1975)中闡述之雜交瘤方法來製備，或可藉由重組DNA方 法（美國專利第4,816,567號）來製備。在雜交瘤方法中，根 據上文所述對小鼠或其他適宜宿主動物（例如倉鼠或短尾 猴）實施免疫以誘發可產生或能產生與免疫所用蛋白質特 異性結合之抗體的淋巴細胞。或者，可在體外對淋巴細胞 進行免疫。然後利用適宜融合劑（例如聚乙二醇）使淋巴細 胞與骨髓·瘤細胞融合’從而形成雜交瘤細胞（Goding， Monoclonal Antibodies: Principles and Practice，第 59 至 103 頁（Academic Press，1986))。 將由此製備之雜交瘤細胞接種於適宜培養基中並使之於 其中生長，該培養基較佳含有一或多種可抑制未融合親代 骨髓瘤細胞生長或存活之物質。舉例而言，若親代骨髓瘤 細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT或 HPRT)，貝I雜交瘤之培養基通常含有次黃嘌呤、胺基蝶呤 及胸苷（HAT培養基），該等物質可阻止HGPRT缺陷型細胞 生長。 較佳骨髓瘤細胞係彼等可有效融合、支持所選抗體產生 細胞穩定大量產生抗體、且對諸如HAT培養基等培養基敏 感之細胞。該等細胞中，較佳骨髓瘤細胞系係鼠類骨髓瘤 系，例如源自可自 Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego，Calif. USA獲得之MOPC-21 及MPC-11 小鼠腫瘤 之彼等，及可自 American Type Culture Collection, Rockville，Md. USA 獲得之 SP-2 或 X63-Ag8-653細胞。亦已 139862.doc -27- 200950808 闡述人類骨髓瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤細胞系可用於產 生人類單株抗體（Kozbor, J. Immunol.，133:3001 (1984); Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第 51-63 頁（Marcel Dekker 公司，New York，1987))。 在生長有雜交瘤細胞之培養基中分析針對抗原之單株抗 體之產生。較佳地，雜交瘤細胞產生之單株抗體之結合特 異性係藉由免疫沉澱或體外結合分析（例如放射免疫分析 (RIA)或酶聯免疫吸附分析（ELISA))來測定。 在確定可產生具有期望特異性、親和性及/或活性之抗 體的雜交瘤細胞後，可藉由有限稀釋程序對該等純系實施 亞選殖並藉由標準方法使其生長（Goding ， Mono clonal Anti bo dies ·' Principles and Practice，第 59 至 103頁（Academic Press，1986))。用於此目的之適宜培養基 包括（例如）D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，可使雜交 瘤細胞在動物體内作為腹水腫瘤生長。 可藉由習用免疫球蛋白純化程序以適當方式將亞純系分 泌之單株抗體與培養基、腹水、或血清分離，例如蛋白質 A-瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親 和層析法。 編碼單株抗體之DNA可使用習用程序容易地加以分離及 測序（例如藉由使用能特異性結合編碼單株抗體重鏈及輕 鏈之基因的募核苷酸探針來實施）。雜交瘤細胞可用作此 類DNA之較佳來源。分離後，可將DNA立即置於表現載體 139862.doc -28 - 200950808 中，隨後將其轉染至原本不產生免疫球蛋白之宿主細胞 (例如大腸桿菌（E. coli)細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢 (CHO)細胞、或骨髓瘤細胞）中以在重組宿主細胞中實現單 株抗體之合成。下文中更詳細地闡述抗體之重組產生。 在另一實施例中，可自使用McCafferty等人在Nature 3 48:552-5 54(1990)中闡述之技術生成之抗體噬菌體文庫分 離抗體或抗體片段。

Clackson 等人，Nature，352:624-628 (1991)及 Marks 等 人，J. Mol. Biol·，222:581-597 (1991)中分別闡述使用噬菌 體文庫來分離鼠類及人類抗體。隨後之出版物闡述了藉由 鏈改組（Marks等人，Bio/Technology 10:779-783 (1992))來 產生高親和性（nM級）人類抗體，以及作為構造極大噬菌體 文庫之策略之組合感染及體内重組（Waterhouse等人，Nuc.

Acids· Res·，21:2265-2266 (1993))。因此，該等技術係分 離單株抗體之傳統單株抗體雜交瘤技術之可行替代方案。 亦可藉由（例如）用人類重鏈及輕鏈恆定結構域之編碼序 列來取代同源鼠類序列（美國專利第4,8 16,567號；M〇rHs〇n 等人，/Vm. #如/. Scz·· ί/α , 81:6851(1984))或藉由 使非免疫球蛋白多肽之全部或部分編碼序列共價接合至免 疫球蛋白編碼序列上來對DNA進行修飾。 通常，該等非免疫球蛋白多肽可替代抗體之恆定結構域 或其可替代抗體中一個抗原結合位點之可變結構域，從而 產生嵌合雙價抗體，其包括__個對抗原具有特異性之抗原 結合位點及另-個對不同抗原具有特異性之抗原結合位 139862.doc •29· 200950808 (iv)人類化抗體及人類抗髏 人類化抗體中引入一或多個來自非人類來源之胺基酸殘 基。該等非人類胺基酸殘基經常稱為「輸入性」殘基，其 通常取自「輸入性」可變結構域。基本上可根據Winter及 合作者之方法藉由用齧齒動物CDR或CDR序列取代人類抗 體之對應序列來實施人類化（Jones等人，Nature， 321:522-525 (1986) ; Riechmann 等人，Nature，332:323-327(1988) ; Verhoeyen 等人，Science，239:1534-1536 (1988))。因此，該等「人類化」抗體係嵌合抗體（美國專 利第4,816,567號），其中實質上小於完整人類可變結構域 之部分已經非人類物種之相應序列取代。實際上，人類化 抗體通常為人類抗體，其中某些CDR殘基及可能某些FR殘 基經齧齒動物抗體中類似位點之殘基取代。 欲用於製備人類化抗體之人類可變結構域之選擇（輕鏈 及重鏈二者）對於降低抗原性具有極重要意義。根據所謂 「最佳擬合」方法，針對已知人類可變結構域序列之完整 文庫筛選齧齒動物抗體可變結構域之序列。然後接受與齧 齒動物序列最接近之人類序列作為人類化抗體之人類框架 區（FR)(Sims等人，《/. /mww„〇/· 151 : 2296 (1993) ; Chothia 等人，乂 Mo/.出〇/· 196 : 901 (1987))。另一方法使用源自 具有特定輕鏈或重鏈亞組之所有人類抗體之共有序列的特 定框架。相同框架可用於若干種不同人類化抗體中（Carter 等人，Proc. Natl· Acad. Sci· USA，89:4285 (1992)； 139862.doc •30- 200950808

Presta等人，immunol. 151: 2623 (1993))。 更重要的是，人類化抗體應保留對抗原之高親和性及其 他有利生物學特性。為達成此目#,根據較佳方法可藉由 使用親代與人類化序狀三_型分析親代序列及各種概 念性人類化產物之方法來製備人類化抗體。三維免疫球蛋 白模型通常可自市場購得且為熟f此項技術者所熟知。可 使用電腦程式，該等電腦程式可闡明並展示所選候選免疫 球蛋白序列之可能的三維構象結構。觀察該等展示内容使 得可分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能行使中之可能作 用，即分析可影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘 基。以此方式，可自接受者及輸入性序列中選擇FR殘基並 將其組合以達成期望抗體特徵，例如對靶抗原之高親和 性。一般而言，CDR殘基直接且最為實質性地參與影響抗 原結合。

或者，現在可產生轉基因動物（例如小鼠），其在免疫後 能在不產生内源免疫球蛋白之情況下產生人類抗體之所有 組成部分。舉例而言，文獻中已闡述嵌合及種系突變小鼠 中抗體重鏈接合區（JH)基因之純合缺失會導致完全抑制内 源抗體產生。將人類種系免疫球蛋白基因降列轉移至該等 種系突變小鼠中可在抗原攻擊後引起人類抗體之產生。例 如’參見 Jakobovits 等人，Proc· Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993) ; Jakobovits 等人，Nature 362:255-258 (1993) ; Bruggermann 等人，Year in Immunol. 7:33 (1993);及 Duchosal等人，Nature 355:258 (1992)。人類抗 139862.doc 31 200950808 體亦可源自喧菌體展示文庫（Hoogenboom等人，J. Mol

Biol. 227:381(1991) ; Marks等人 ’ J· MoL. Biol. 222:581-597 (1991) ; Vaughan 等人 ’ Nature Biotech 14:309 (1996))。下文中進一步闡述自抗體噬菌體展示文庫生成人 類抗體。 (v) 抗體片段 人們已經研發出多種用於製備抗體片段之技術。傳統 上，該等片段係經由對完整抗體實施蛋白水解消化而獲得 (參見（例如）M〇rim〇t〇 等人，journal 〇f Bi〇chemical and 〇

Biophysical Methods 24:107-1 17 (1992);及 Brennan 等人，

Science，229:81 (1985))。然而，該等片段如今可藉由重組 宿主細胞直接製備。例如，可自上述抗體噬菌體文庫中分 離抗體片段。或者，可自大腸桿菌直接回收Fab,_SH片 段’且以化學方式偶合以形成F(ab，）2片段（Carter等人，

Bio/Technology 10:163_167 (1992))。在下文實例中所述另 一實施例中，F(ab’）2係使用白胺酸拉鏈gCN4來促進F(ab，）2 分子組裝而得以形成。根據另一方法，可直接自重組宿主 © 細胞培養物中分離出F(ab，）2片段。熟習此項技術者應瞭解 製備抗體片段之其他方法。在其他實施例中，所選抗體係 · 單鏈 Fv 片段（scFv)。參見 w〇 93/16185。 (vi) 多特異性抗體 多特異性抗體具有針對至少兩種不同表位之結合特異 性’其中該等表位通常來自不同抗原。儘管該等分子通常 僅結合兩種不同表位（即雙特異性抗體，BsAb)，但在本文 139862.doc •32· 200950808 中使用時此表述亦涵蓋具有額外特異性之抗體，例如三特 異性抗體。BsAb之實例包括彼等一臂針對pirB/LILRB2且 另一臂針對Nogo或MAG或OMgp者。BsAB之其他實例包括 彼等一臂針對PirB/LILRB2且另一臂針對NgR者。 製備雙特異性抗體之方法為業内已知。全長雙特異性抗 體之傳統產生方法係基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之 共表現，其中該兩條鏈具有不同特異性（MiUstein等人， Nature，305:537-539 (1983))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈 之隨機配合，故該等雜交瘤（四源雜交瘤）可產生1〇種不同 抗體分子之潛在混合物，其中僅一種具有正確雙特異性結 構。正確分子至純化通常係藉由親和層析步驟來實施，該 方式較為繁瑣且產物產率較低。類似程序揭示於w〇 93/08829 A Traunecker # A > EMBO J.5 l〇： 3655-3659 (1991)中。根據一不同方法，可使具有期望結合特異性之 抗體可變結構域（抗體·抗原結合位點）與免疫球蛋白恆定結 構域序列融合。融合體較佳具有免疫球蛋白重鏈恆定結構 域’該結構域包含鉸鏈區、CH2區及CH3區中之至少一部 分。較佳使至少一個融合體中存在含有輕鏈結合所需位點 之第一重鏈恆定區（CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體 及（若需要）免疫球蛋白輕鏈之DNA插入分開的表現載體 中，並將其共轉染至適宜宿主有機體中。當用於構造之3 種多肽鏈之不等比率可提供最優產率時，此共轉染可為調 整實施例中3種多肽片段之相互比例提供較大靈活性。然 而，當以等比率表現至少2種多肽鏈可導致高產率時或當 139862.doc •33- 200950808 該等比率並無重要意義時，可將2種或所有3種多肽鍵之編 碼序列插入一個表現載體中。 在本方法-較佳實施例中，雙特異性抗體係由一臂中且 有第-結合特異性之雜合免疫球蛋白重鍵與另一臂中之雜 合免疫球蛋白重鏈.輕鏈對（提供第二結合特異性）構成。人 們發現此不對稱結構有助於分離期望雙特異性化合物與不 期望免疫球蛋白鏈組合，此乃因僅在一半雙特異性分子中 存在免疫球蛋白輕鏈使得易於分離。該方法揭示於獨 94/04690中。關於生成雙特異性抗體之其他細節可參見（例 如）Suresh 等人，Meth〇ds in Enzym〇】〇gy, i2i 2i〇 (1986)。 根據WO96/2701 1中所述之另一方法，可將抗體分子對 之間之介面設計為可使自重組細胞培養物回收之異源二聚 體之百分比最大化。較佳介面包含抗體恆定結構域之至少 一部分CH3結構域。在該方法中，用較大側鏈（例如酪胺酸 或色胺酸）替代來自第一抗體分子介面之一或多個小胺基 酸側鏈。藉由用較小胺基酸側鏈（例如丙胺酸或蘇胺酸）替 代較大胺基酸側鏈從而在第二抗體分子介面上形成大小與 大側鏈相同或類似之補償性「空穴」。此提供相對於其他 不期望終產物（例如同源二聚體）提高異源二聚體產率之機 制。 雙特異性抗體包括交聯或「異源接合」抗體。例如，異 源接合物中之一抗體可與抗生物素蛋白偶合，而另一抗體 可與生物素偶合。文獻中已提出該等抗體可（例如）使免疫 139862.doc • 34- 200950808 系統細胞靶向不期望細胞（美國專利第4,676,980號），且可 用於治療 HIV感染（WO 91/00360、WO 92/200373)。異源 接合抗體可使用任何簡便的交聯方法來製備。適宜交聯劑 為業内所熟知，且與多種交聯技術一起揭示於美國專利第 4,676,980號中。 自抗體片段生成雙特異性抗體之技術亦已闡述於文獻 中。例如，可使用化學鍵結來製備雙特異性抗體。 Brennan等人（Science, 229: 81 (1985))闡述以蛋白質水解方 式裂解完整抗體以生成F(ab')2片段之程序。在二硫醇錯合 劑亞砷酸鈉之存在下使該等片段還原以穩定相鄰二硫醇且 阻止形成分子間二硫鍵。然後將所形成Fab'片段轉化為硫 代硝基苯曱酸鹽（TNB)衍生物。然後藉由用巯基乙胺實施 還原來將一種Fab'-TNB衍生物再轉化為Fab'-硫醇，且將其 與等莫耳量之其他Fab’-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗 體。可使用所產生之雙特異性抗體作為選擇性固定酶之試 劑。

Fab'-SH片段亦可自大腸桿菌直接回收，且可以化學方 式偶合以形成雙特異性抗體。Shalaby等人，J. Exp· Med· ’ 175:217-225(1992)闡述完全人類化雙特異性抗體 F(ab·)2分子之產生。每一 Fab’片段皆可自大腸桿菌單獨分 泌且對其實施體外定向化學偶合以形成雙特異性抗體。 文獻中亦已闡述各種自重組細胞培養物直接製備並分離 雙特異性抗體片段之技術。例如，可使用白胺酸拉鏈產生 雙特異性抗體。Kostelny等人，j Immun〇1，148⑺：1547· 139862.doc * 35 - 200950808 1553 (1992)。藉由基因融合將來自F〇s及Jun蛋白之白胺酸 拉鏈肽連接至2個不同抗體之Fab，部分。在鉸鏈區還原抗體 同源二聚體以形成單體，且隨後將其再氧化以形成抗體異 源二聚體。此方法亦可用於產生抗體同源二聚體。

Hollinger 等人 ’ proc. Nati. Acad. Sci. USA，90:6444- 6448 (1993)闡述之「雙特異性抗體」技術提供製備雙特異 性抗體片段之替代機制。該等片段包含經由因過短而不能 在相同鏈上兩個結構域之間配對之連接體而連接至輕鏈可 變結構域（VL)之重鏈可變結構域（VH)。因此，迫使一片段 之VH及VL·結構域與另一片段之互補vl及VH結構域配 對’由此形成兩個抗原結合位點。亦已報導藉由使用單鏈 Fv(sFv)二聚體來製備雙特異性抗體片段之另一策略。參見

Gruber等人，J. Immunol，152:5368 (1994)。 本發明涵蓋二價以上之抗體。例如，可製備三特異性抗 體。Tuft等人，J. Immunol. 147: 60 (1991)。 (vii)效應子功能設計 可期望在效應子功能方面修飾本發明抗體以增強抗體之 效力。舉例而言，可在Fc區引入半胱胺酸殘基，藉此在該 區内形成鏈間二硫鍵。由此生成之同源二聚體抗體可具有 經改良之内在化能力及/或增強之補體介導細胞殺傷及抗 體依賴性細胞毒性（ADCC)。參見Caron等人，《/· Med. 2922(1992)。抗腫瘤活性增強之同源二聚體抗體亦可使用 異源雙功能交聯劑來製備，如Wolff等人，Cancer 139862.doc •36- 200950808

Research 53:2560-2565 (1993)中所述。或者，可設計具有 雙重Fc區之抗體，該抗體藉此可具有增強之補體裂解及 ADCC 能力。參見 Stevenson 等人’ Anti-Cancer Drug Dehgw 3:219-230 (1989)。 (viii)抗體-補救受體結合表位融合. 舉例而言，在本發明某些實施例中，可期望使用抗體片 段而非完整抗體以增強腔瘤渗透。在此情況下’可期望修 飾抗體片段以延長其清半衰期。例如，此可藉由將補救 艾體結合表位納入抗體片段中來達成（例如藉由抗體片段 中適宜區之突變來納入，或藉由將表位納入肽標籤中、之 後藉由（例如）DNA或肽合成使該標記融合抗體片段末端或 中部來納入）。 補救受體結合表位較佳構成一區段，其中將任何一或多 個來自Fc結構域中一個或兩個環之胺基酸殘基轉移至抗體 片段之類似位置處。4至更錢，轉移來自&結構域中一 個或兩個環之三個或更多個殘基。更佳地，該表位係取自 (例如IgG之）Fc區之CH2結構域且將其轉移至抗體之chi、 ⑽、或^"’或不止一個此類區段中。或者，該表位 取自Fc區之CH2結構域且將其轉移至抗體片段之區或 VL區或該兩個區中。 (ix)抗體之其他共價改變 抗體之共價改變包括於本發明範圍 % β乾固内。其可藉由化學合 成或藉由抗體之酶促或化學裂解（若適用）來製備。藉由使 抗體之乾定胺基酸殘基與能與所選側鏈或Ν”犯末端殘基 139862.doc •37· 200950808 反應之有機衍生劑反應而將其他類型之抗體共價改變引入 分子中。共價改變之實例闡述於美國專利第5,534,61 5號 中’該專利係以引用方式明確併入本文中。較佳類型之抗 體共價改變包含以以下文獻中所述之方式將抗體連接至各 種非蛋白質聚合物（例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯 烴）中之一種：美國專利第4 64〇 835號、第4 496 689號、 第4,301，144號、第4,67〇,417號、第 4,791,192 號或第 4,179,337 號。 (X)自合成抗體噬菌體文庫生成抗體 在一較佳實施例中，本發明提供使用獨特噬菌體展示方 法生成及選擇新穎抗體之方法。該方法涉及基於單一框架 模板來生成合成抗體噬菌體文庫、在可變結構域内設計充 分多樣性、展示具有多樣化可變結構域之多肽、選擇對靶 抗原具有高親和性之候選抗體、及分離所選抗體。 嗟菌體展示方法之細節可參見（例如）2〇〇3年丨2月丨丨曰公 開之W003/102157，其全部揭示内容係以引用方式明確併 入本文中。 在一態樣中’本發明中所用抗體文庫可藉由在抗體可變 結構域之至少一個CDR中使溶劑可及位置及/或高多樣性 位置發生突變來生成。可使用本文所提供方法使某些或所 有CDR發生突變。在某些實施例中，較佳藉由以下方法來 生成各種抗體文庫：使CDRH1、CDRH2及CDRH3中之位 置發生犬變以形成單一文庫，或使CDRL3及CDRH3中之位 置發生犬變以形成單一文庫’或使CDRL3及CDRH1、 139862.doc 200950808 CDRH2及CDRH3中之位置發生突變以形成單一文庫。 舉例而言，可生成在CDRH1、CDRH2及CDRH3之溶劑 可及位置及/或高多樣性位置中具有突變之抗體可變結構 域之文庫。可生成在CDRL1、CDRL2及CDRL3中具有突變 之另一文庫。該等文庫亦可彼此結合使用以生成具有期望 親和性之結合體。舉例而言，在針對與靶抗原之結合對重 鏈文庫實施一或多輪選擇後，可將輕鏈文庫重新置入重鏈 結合體群中以供另外實施數輪選擇來增強該等結合體之親 和性。 較佳地，在重鏈序列可變區之CDRH3區中藉由用變體胺 基酸取代原始胺基酸來創建文庫。所得文庫可含有複數個 抗體序列，其中序列多樣性主要存於重鏈序列之CDRH3區 中。 在一態樣中’在人類化抗體4D5序列、或人類化抗體 4D5序列之框架胺基酸序列之背景下創建文庫。較佳地， 藉由用以密碼子組編碼之胺基酸至少取代重鏈中之殘 基95-100a來創建文庫，其中DFA：密碼子組係用於編碼每一 該等位置之變體胺基酸組。可用於產生該等取代之寡核苷 酸組之實例包含序列（DFiC)7。在某些實施例中，文庫係藉 由用以DFK及WA：密碼子組二者編碼之胺基酸取代殘基95-1 00a來創建。可用於產生該等取代之募核苷酸組之實例包 含序列尺入（WiViO。在另一實施例中，文庫係藉由用以 DM及iViV/C密碼子組二者編碼之胺基酸至少取代殘基95-1 00a來創建。可用於產生該等取代之募核苷酸組之實例包 139862.doc -39- 200950808 含序列（DF幻5 (WiViQ。可用於產生該等取代之寡核苷酸組 之另一實例包含序列(^#尺)6。熟習此項技術者可根據本文 所述標準來確定適宜寡核苷酸序列之其他實例。 在另一實施例中，採用不同CDRH3設計來分離高親和性 結合體及分離針對不同表位之結合體。在此文庫中所生成 CDRH3之長度範圍為11至13個胺基酸，但亦可生成長度不 同於此範圍者。可藉由使用尺、DFi(及密碼子組來 擴大H3多樣性以及在N及/或C末端之限制程度更高之多樣 性。 亦可在CDRH1及CDRH2中產生多樣性。CDR-H1及H2多 樣性之設計遵循靶向所述模擬天然抗體庫之策略，與先前 設計相比該策略之改進集中於與天然多樣性更緊密匹配之 多樣性。 對於CDRH3中之多樣性而言，可以不同H3長度分別構 造多個文庫，然後將其組合以選擇針對靶抗原之結合體。 可將多個文庫匯合且使用先前文獻及下文中所述之固體支 撐選擇及溶液分選方法來對其實施分選。可採用多重分選 策略。舉例而言，一變化形式涉及根據與固體結合之靶來 分選，之後針對可能存於融合多肽上之標籤（例如抗gD標 籤）來分選，且隨後根據與固體結合之靶再次實施分選。 或者，可首先根據與固體表面結合之靶對文庫實施分選， 然後使用與低濃度靶抗原結合之溶液相來對經洗脫結合體 實施分選。採用不同分選方法之組合可僅使高表現序列之 選擇最小化，且提供對多種不同高親和性純系之選擇。 139862.doc -40- 200950808 可自文庫中分離針對把抗原之高親和性結合體。限制 H1/H2區中之多樣性可將簡並性降低約1〇4至1〇5倍，且容 許更大H3多樣性可提供親和性更強之結合體。採用 CDRH3中具有不同多樣性類型之文庫（例如採用DVK或 NVT)使得可分離可與靶抗原之不同表位結合之結合體。 在自上述匯合文庫分離之結合體中，已發現可藉由提供 輕鏈中之有限多樣性來進一步改良親和性。在此實施例 中，輕鏈多樣性係根據下文來產生：在CDRL1中：胺基酸 位置28係藉由RDT來編碼；胺基酸位置29係藉由RKT來編 碼；胺基酸位置30係藉由RVW來編碼；胺基酸位置31係藉 由ANW來編碼；胺基酸位置32係藉由THT來編碼；視需 要，胺基酸位置33係藉由CTG來編碼；在CDRL2中：胺基 酸位置50係藉由KBG來編碼；胺基酸位置53係藉由AVC來 編碼；且視需要，胺基酸位置55係藉由GMA來編碼；在 CDRJL3中：胺基酸位置91係藉由TMT或SRT或二者來編 碼；胺基酸位置92係藉由DMC來編碼；胺基酸位置93係藉 由RVT來編碼；胺基酸位置94係藉由NHT來編碼；且胺基 酸位置96係藉由TWT或YKG或二者來編碼。 在另一實施例中，生成在CDRH1、CDRH2及CDRH3區 中具有多樣性之文庫。在此實施例t，使用各種長度之H3 區及主要使用及AWA：或密碼子組來在CDRH3中產 生多樣性。可使用單獨寡核苷酸來形成文庫且將其匯合， 或可匯合寡核苷酸以形成文庫亞組。可針對與固體結合之 靶來分選此實施例之文庫。可使用ELISA分析針對特異性 139862.doc •41 _ 200950808 及親和性來筛選自多重分選分離之純系。對於特異性而 言，可針對期望靶抗原以及其他非靶抗原來篩選純系。然 後可在溶液結合競爭ELISA分析或點競爭分析中針對親和 性來篩選彼等靶抗原之結合體。可自上述使用密碼子 組製備之文庫分離高親和性結合體。可在細胞培養中以高 產率將該等結合體容易地製備為抗體或抗原結合片段。 在某些實施例中，可期望生成在CDRH3區之長度中具有 較大多樣性之文庫。舉例而言，可期望生成CDRH3區介於 約7至19個胺基酸之文庫。 自該等實施例之文庫分離之高親和性結合體係在細菌及 真核細胞培養中以高產率容易地產生。可將載體設計為易 於移除諸如gD標籤、病毒外殼蛋白組份序列等序列，及/ 或易於添加至恆定區序列中以便以高產率達成全長抗體或 抗原結合片段之產生。 可將在CDRH3中具有突變之文庫與含有其他CDR變體形 式（例如 CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1 及/或 CDRH2) 之文庫組合。因此，舉例而言，在一實施例中，將CDRH3 文庫與CDRL3文庫組合，該CDRL3文庫係使用預定密碼子 組在位置28、29、30、31、及/或32處具有變體胺基酸之 人類化4D5抗體序列背景下創建。在另一實施例中，可使 具有CDRH3突變之文庫與包含變體CDRH1及/或CDRH2重 鏈可變結構域之文庫組合。在一實施例中，CDRH1文庫係 用在位置28、30、31、32及33處具有變體胺基酸之人類化 抗體4D5序列來創建。CDRH2文庫可係使用預定密碼子組 139862.doc -42· 200950808 以在位置50、52、53、54、56及58處具有變體胺基酸之人 類化抗體4D5序列來創建。 (xi)抗體突變體 噬菌體庫生成之新穎抗體可進一步修飾以產生物理、化 學及/或生物學特性較親代抗體改良之抗體突變體。倘若 所用分析為生物活性分析，則在所選分析中抗體突變體之 生物活性較佳比親代抗體在該分析中之生物活性強至少約 10倍，較佳強至少約20倍，更佳強至少約50倍，有時強至 少約100倍或200倍。舉例而言，抗pirB/LILRB抗體突變體 與PirB/LILRB之結合親和性較佳比親代抗抗體之結合親和 性強至少約10倍，較佳強至少約20倍，更佳強至少約5〇 倍，有時強至少約100倍或200倍。 為生成抗體突變體，將一或多個胺基酸變化（例如取代） 引入親代抗體之一或多個超變區中。或者，或另外，可將 框架區殘基之一或多個變化（例如取代）引入親代抗體中， 其中該等變化導致抗體突變體與第二種哺乳動物之抗原的 結合親和性增強。欲修飾之框架區殘基之實例包括直接非 共價結合抗原者（Amit等人（1986)，心233: 747- 753)，干擾/景^響〇〇11 之構象者（chothia 等人（1987)，J. Mol. Β1〇1· 196:901-917);及 / 或參與 Vl_Vh 介面者（Ep 239 400B 1)。在某些實施例中，一或多個該等框架區殘基之修 飾可導致抗體肖第二種哺乳動物之抗原乂結合親和性增 強舉例而5，在本發明此實施例中可改變約丨至約5個框 架殘基。有時，即使無超變區殘基改變，此亦足以產生適 I39862.doc -43- 200950808 用於臨床前試驗之抗體突變體。然而，抗體突變體通常包 含其他超變區變化。 所改變之超變區殘基可隨機改變，尤其在親本抗體之起 始結合親和性使得該等隨機產生之抗體突變體可輕易篩選 時。 生成該等抗體突變體之一可用程序稱為 變」（Cunningham及 Wells (1989) 244:1081-1085) 〇 此處，用丙胺酸或聚丙胺酸殘基替代一或多個超變區殘基

以影響胺基酸與來自第二哺乳動物物種之抗原之交互竹 用。然後藉由在取代位點或針對取代位點引入另外或其付 突變來改良彼等對取代顯示功能敏感性之超變區殘基。始 儘管引入胺基酸序列變異之位點係預先確定，但突變本身 之I·生資無&預先確定。針對本文所述生物活性對以此方式 產生之ala-突變體實施篩選。 通常可以保守取代來把払 代术起始，例如下文所示以「較佳卑 代」為標題之彼等。苦兮莖^、入 右该等取代會引起生物活性（例如舞

合親和性）之改變，則可Μ ,Γ 則了引入更多實質性變化（下表中命；g ^^ 下文參照胺基酸種類所述者），卫 對產物加以薛選。 較佳取代：

139862.doc •44· 200950808

Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gin (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro ' ala ala His (H) asn、gin、lys、arg arg He (I) leu、val、met、ala、phe、正白胺酸 leu Leu (L) 正白胺酸、ile、val、met、ala、phe ile Lys (K) arg、gin、asn arg Met (M) leu、phe、ile leu Phe (F) leu、val、ile、ala、tyr leu Pro (P) ala ala Ser(S) thr thr Thr(T) ser ser Trp(W) tyr ' phe tyr Tyr (Y) trp、phe、thr、ser phe Val (V) ile、leu、met、phe、ala、正白胺酉曼 leu

抗體生物學特性之甚至更多實質性改變係藉由選擇維持 以下特徵之效應顯著不同之取代來達成：（a)取代區中多肽 主鏈之結構，例如呈薄片或螺旋狀構象，（b)靶位點處分子 之電荷或疏水性，或（c)侧鏈大小。可根據常見側鏈特性將 天然存在之殘基分為以下各類： (1) 疏水性胺基酸：正白胺酸、met、ala、val、leu、 ile ; (2) 中性親水胺基酸：cys、ser、thr、asn、gin ; (3) 酸性胺基酸：asp ' glu ; (4) 驗性胺基酸：his、lys、arg ; 139862.doc -45- 200950808 (5) 影響鏈取向之殘基：gly、pro;及 (6) 芳香族胺基酸：trp、tyr、phe。 非保守性取代使得需要將該等種類中一類之成員交換 另一種類。 在另-實施例中’使用嗟菌體展示使所選改變位點親和 性成熟（參見上文）。 編碼胺基酸序列突變體之核酸分子係藉由各種業内已知 方法來製備。該等方法包括（但不限於）對親代抗體之提前 製備突變體或非變體形式實施募核苷酸介導（或定點）誘 變、PCR誘變及盒式誘變。製備突變體之較佳方法係定點

誘變（例如，參見Kunkel (1985) 7Va"· Jed. 5W. USA 82:488) 〇 在某些實施例中，抗體突變體中可僅有單一超變區殘基 經取代。在其他實施例中，可取代親代抗體之兩個或更多 個超變區殘基’例如約2至約1 〇個超變區取代。 具有改良生物學特性之抗體突變體之胺基酸序列與親代 抗體重鏈或輕鏈可變結構域之胺基酸序列通常具有至少 75°/。之胺基酸序列一致性或相似性，更佳至少8〇%，更佳 至少85%，更佳至少90% ’且最佳至少95%。在本文中關 於此序列之一致性或相似性定義為：在比對序列並（若需 要）引入缺口以達成最大序列一致性百分比後，候選序列 中與親代抗體殘基相同（即相同殘基）或相似（即根據一般側 鏈特性來自相同類別之胺基酸，參見上文）之胺基酸殘基 之百分比。不應認為抗體序列中可變結構域以外之N—末 139862.doc -46· 200950808 端 c-末端或内部延長、缺失或插入可影塑庠丨 v詈序列—致性或 相似性。 在抗體突變體產生後，相對於親代抗體測定該分子之生 物活性。如上所述’此可涉及測定抗體之結合親和性之及/ 或其他生物活性。在本發明一較佳實施例中，製備一組广 體突變體且針對與抗原或其片段之結合親和性對其實施篩 選。視需要對選自此初始篩選之一或多種抗體突變體實2 一或多種其他生物活性分析，以證實結合親和性增強之抗 體突變體確實可用於（例如）臨床前研究中。 端視抗體之既定用途，經常可對如此選擇之抗體突變體 實施進一步改變。該等改變可涉及胺基酸序列之其他變 化、與異源多肽之融合及/或共價改變，例如下文所詳述 之彼等。關於胺基酸序列變化，實例性改變詳述於上文 中。舉例而言，一般亦可用絲胺酸取代任何不參與維持抗 體突變體正確構象之半胱胺酸殘基，以改良分子之氧化穩 疋性且阻止異常交聯。相反，可將半胱胺酸鍵結添加至抗 體中以提高其穩定性（在抗體係諸如Fv片段等抗體片段時 尤其如此）。另一類型之胺基酸突變體具有變化糖基化模 式。此可藉由刪除一或多個存於抗體中之碳水化合物部 分’及/或增加一或多個在抗體中不存在之糖基化位點來 達成。抗體之糖基化通常係N-連接或〇-連接。N-連接係指 碳水化合物部分與天冬醯胺殘基側鏈之連接。三肽序列天 冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺_x_蘇胺酸（其中χ係除脯胺酸 外之任何胺基酸）係碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈酶促 139862.doc •47- 200950808 連接之識別序列。因此，多肽中存在該等三肽序列中之任 一種均可產生潛在糖基化位點。0-連接糖基化係指一種糖 (N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖）與羥基胺基酸（最常見 為絲胺酸或蘇胺酸’但亦可使用5_羥基脯胺酸或5-羥基離 胺酸）之連接。可藉由改變胺基酸序列而使抗體中含有一 或多個上述三肽序列（對於N-連接糖基化位點）來將糖基化 · 位點容易地加入抗體中。亦可藉由向原始抗體序列中添加 一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基（或用一或多個絲胺酸或蘇 胺酸殘基實施取代）（對於〇_連接糖基化位點）來達成該改 ⑬ 變。 (xii)抗體之重组產生 對於抗體之重組產生，可分離編碼該抗體之核酸並將其 插入可複製載體中以供進一步選殖（DNA之擴增）或表現。 編碼單株抗體之DNA係使用習用程序容易地加以分離及測 序（例如藉由使用能特異性結合編碼該抗體重鏈及輕鏈之 基因之募核苷酸探針來實施）。可使用多種載體。載體組 伤-般包括(但不限於)以下中之一或多種：信號序列、複❹ 製起..沾 或多個標記基因、增強子元件、啟動子及轉錄 終止序列（例如，如美國專利第5,534,615號中所述，其係 . 以引用方式明確併入本文中）。 在本文中，選殖或表現載體中DNA之適宜宿主細胞係上 述原核、、,田胞、酵母細胞或高等真核細胞。用於此目的之適 且原核生物包括諸如革蘭氏⑼㈣陰性或革蘭氏陽性有機 菌例如腸桿菌科（Enterobacteriaceae)，例如埃 139862.doc -48· 200950808 希氏菌屬（心ί^^/π·β)(例如大腸桿菌）、腸桿菌屬 价r)、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬 (A7eWe//a)、變形桿菌屬（iv价⑽）、沙門氏菌屬 (心/腳《e//a)(例如鼠傷寒沙門氏菌（5W㈣⑽//β 所mWm/w))、沙雷菌屬（&"α/ι·β)(例如黏質沙雷氏菌 • β ⑽〇)、及志賀氏菌屬（从七dk)、以及桿 •菌屬（5^////)(例如枯草桿菌（5. 出⑷及地衣芽孢桿菌（反 …心則/orwzO(例如於1989年4月12日公開之DD 266 710中

參一 T 所揭示之地衣芽孢桿菌41Ρ))、假單胞菌屬 (/^Wi/〇m〇«似）（例如綠膿桿菌（P_ aerMgh⑽⑼、及鏈黴菌 屬（5>叩。一較佳大腸桿菌選殖宿主係大腸桿菌 294 (ATCC 3 1，446)，但諸如大腸桿菌b、大腸桿菌χΐ776 (ATCC 3 1,537)及大腸桿菌 W3110 (ATCC 27,325)等其他菌 株亦適宜。該等實例係例示性而非限制性。 除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母等真核微生物亦為 ❿ 抗體編碼載體之適宜選殖或表現宿主。釀酒酵母 cereWhae)、或常見麵包酵母（baker，s yeast)係最常用低等真核宿主微生物。然而，多種其他 • 屬、種、及菌株可以一般方式獲得且可用於本文中，例如 • 裂殖酵母菌（Sc/n'zosacc/zarom少ces ；?〇?«〜）；克魯維酵母屬 (Kluyveromyces)宿主，例如乳酸克魯維酵母（尺lactis)、 脆壁克魯維酵母（尺· /ragz7&) (ATCC 1 2,424)、保加利亞克 魯維酵母（尺.Zm/garz’cws) (ATCC 16,045)、威克海姆克魯維 酵母（K. wickwmi!·) (ATCC 24，178)、瓦爾特克魯維酵母 139862.doc -49- 200950808 (K. waltii)(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母（尼 drosophilarum) (ATCC 36,906)、而ί 熱克魯維酵母（尤. i/iermoio/eraw)、及馬科斯克魯維酵母（尺.marxiam/·?);子 囊菌酵母屬（3；arro>Wa) (EP 402,226);巴斯德畢赤酵母菌 (P/c/na (EP 183,070);念珠菌屬（Ca«i/zda);裏 氏木黴菌（TWcAoc/erwa rees^’a) (EP 244,234);粗糙鏈孢黴 菌（iVewrospora crawa);許旺酵母属（iSc/zwanm’owj/ces)，例 如西方許旺酵母occidentalis)；及絲狀真 菌，例如鏈孢黴屬（iVewrc^pora)、青黴屬（Pem'ci/nwm)、彎 頸黴屬、及曲黴菌屬宿主（例 如構巢麯黴（儿⑴Wa”·5)及黑麯黴（儿⑴‘ger))。 表現糖基化抗體之適宜宿主細胞得自多細胞有機體。無 脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出多種 杆狀病毒株及變體及來自諸如以下等宿主之對應許可性旯 蟲宿主細胞：草地黏蟲（处〇而介而)（毛蟲）、埃 及伊蚊（jWa ⑼幻少"）（蚊子）、白紋伊蚊（Jec/a 蚊子）、黑腹果题（乃广0*50/7^2"*3 (果 蠅）、及家蠶wori))。多種轉染用病毒株可自公開 途徑獲得，例如苜蓿銀紋夜蛾（Aut〇graPha calif〇rnica)NPV 之L-1變體及家蠶NPV之Bm-5株，且根據本發明該等病毒 可用作本文中之病毒，具體而言用於草地黏蟲細胞之轉 染。亦可使用棉花 '玉米、馬鈐薯、大豆、矮牽牛、番茄 及煙草之植物細胞培養物作為宿主。 然而，最令人關注者係脊椎動物細胞’且在培養（組織 139862.doc -50- 200950808 培養）中增殖脊椎動物細胞已成為常規程序。可用哺乳動 物宿主細胞系之實例係藉由SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)轉染之猴腎CV1細胞系；人類胚腎細胞系（經亞選殖 以在懸浮培養中生長之293或293細胞，Graham等人，J. Gen Virol. 36··59 (1977));幼倉鼠腎細胞（BHK，ATCC CCL 10);中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人， Proc_ Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980));小鼠睾丸支 持細胞（TM4，Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 猴腎細胞（CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞（乂£110-76，ATCC CRL-1587);人類宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2);犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34);水牛鼠肝細胞 (BRL 3A，ATCC CRL 1442);人類肺細胞（W138，ATCC CCL 75);人類肝細胞（Hep G2, HB 8065);小鼠乳房瘤 (MMT 060562, ATCC CCL5 1) ; TRI 細胞（Mather 等人， Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)) ; MRC 5細胞； FS4細胞；及人類肝瘤細胞系（Hep G2)。 用上述用於抗體產生之表現或選殖載體轉化宿主細胞， 且在習用營養培養基中加以培養，若適宜修改該等培養基 以誘導啟動子、選擇轉化體、或擴增編碼期望序列之基 因。 可在多種培養基中培養用於產生本發明抗體之宿主細 胞。市售培養基適用於培養宿主細胞，例如Ham's F10 (Sigma)、最小必需培養基（MEM)(Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、及達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基（Dulbecco's 139862.doc -51 - 200950808

Modified Eagle’s MediUm)((DMEM)，Sigma)。另外，可使 用以下文獻中所述任一培養基來作為宿主細胞培養基：

Ham等人，Meth. Enz. 58:44 (1979) ; Bames等人，八过 Biochem. 102:255 (1980);美國專利第 4 767 7〇4號第 4’657’866 號、第 4’927’762 號 '第 4,56〇 655 號、或第 5’122,469號；WO 90/03430、WO 87/00195 ;或美國專利 第Re. 30,985號。可根據需要向任一該等培養基中補加激 素及/或其他生長因子（例如胰島素、鐵傳遞蛋白、或表皮 生長因子）、鹽類（例如氣化鈉、鈣、鎂、及磷酸鹽）、緩衝❿ 液（例如HEPES)、核苷酸（例如腺苷及胸苷）、抗生素（例如 GENTAMYCIN™)、微量元素(定義為通常以微莫耳範圍之 最終濃度存在之無機化合物）、及葡萄糖或等效能源。亦 可以熟習此項技術者已知之適當濃度引入任何其他所需補 加物。諸如溫度、pH及諸如此類等培養條件係先前用於所 選表現用宿主細胞之條件’且對熟習此項技術者而言係顯 而易見的。 在使用重組技術時，抗體可在細胞内、壁膜間隙中產 © 生或可直接分必至培養基中。若4充體係在細胞内產生， J作為第步驟’藉由（例如）離心或超滤去除微粒碎屑（宿 主細胞或溶解細胞）。倘若抗體係分泌至培養基中，則通 常首先使用市售蛋白質濃縮過濾器（例如Amic〇n或 Millipore Pellicon超濾單元）濃縮來自該等表現系統之上清 液。在任-前述步驟中皆可加人蛋白酶抑制劑（例如pMsF) 以抑制蛋白質水解，且可加入抗生素以阻止外來污染物生 139862.doc -52- 200950808 長。 自細胞製備之抗體組合物可使用（例如）羥基磷灰石層 析、凝膠電泳、透析、及親和層析來純化，其中親和層析 係較佳純化技術。蛋白質A作為親和配體之適合性取決於 物種及存於抗體中之任一免疫球蛋白Fc結構域之同種型。 蛋白質A可用於純化基於人類γΐ、γ2、或γ4重鏈之抗體 (Lindmark等人 ’ J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。蛋白 質G被推薦用於所有小鼠同種型及人類^(Guss等人， EMBO J. 5: 1567-1575(1986))。親和配體所附著之基質最 經常為瓊脂糖，但亦可利用其他基質。力學穩定基質（例 如受控具孔玻璃或聚（本乙稀一乙稀基）苯）容許較竣脂糖更 快之流速及更短之處理時間。倘若抗體包含CH3結構域， 則可使用 Bakerbond ABXTM 樹脂（J T Baker，

Phillipsburg，N.J.)來實施純化。端視欲回收抗體，亦可採 用其他蛋白質純化技術，例如在離子交換管柱上實施分級 分離、乙醇沉澱、反相HPLC、於二氧化矽上實施層析、 於肝素SEPHAROSE™上實施層析、於陰離子或陽離子交 換樹脂（例如聚天冬胺酸管柱）上實施層析、層析聚焦、 SDS-PAGE、及硫酸銨沉澱。 C. 抗pirB/LILRB抗體之用途 據信本發明抗PirB/LILRB抗體可用作有助於神經細胞存 活或誘導其生長之試劑。因此其可用於治療神經系統變性 病症（「神經變性疾病」），包括（例如）對中柩神經系統造 成之物理知傷（脊髓及腦）；與中風相關之腦損傷；及與神 139862.doc -53- 200950808 經變性有關之神經病症，例如三又神經痛、舌咽神經痛、 貝爾麻痒、重症肌無力、肌營養不良、肌萎縮側索硬化 =)、多發性硬化⑽）、進行性肌萎縮、進行性延髓遺 傳性肌萎縮、因物理損傷（例如燒傷、創幻或諸如糖尿 病腎功此障礙等疾病狀態或因用於治療癌症及剔s之 化學治療的毒性效應引發之外周神經損傷、突出性破裂 性、或脫垂性椎間盤症候群、頸椎病、神經叢病症、胸廓 出口破壞症候群、周圍神經病（例如由錯、胺苯硬、蜱引 ，之彼等卜琳症、格林·巴厘症候群、阿茲海默氏症、 t庭頓氏症、或帕金森病。 -本文中之抗PirB/LILRB抗體亦可用作用於在體外培養神 經細胞之培養基之組份。 最後，在經放射性碘、酶、螢光團、自旋標記及諸如此 類標記時，包含本文抗PirB/LILRB抗體之製劑可在競爭性 結合分析中用作標準品。 藉由以下方式製備本文抗PirB/ULRB抗體之治療性調配 物以供儲存：混合具有期望純度之經鑒定化合物(例如抗 體）與可選生理上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑 (Remington’s Pharmaceuticai Seiences，如前所述），該等 調配物呈|乾餅或水性溶液形式。可接受之載劑、賦形劑 或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒，I包括緩衝 劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包 括抗壞血酸；低分子量（少於約1〇個殘基）多肽；蛋白質， 例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如 139862.doc •54- 200950808 聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸，麩胺醯胺，天冬 醯胺，精胺酸或離胺酸；單糖、二糖，及其他碳水化合 物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA ; 糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；鹽形成反荷離子，例如 鈉；及/或非離子型表面活性劑，例如Tween、Pluronics或 PEG。 欲用於體内投與之抗PirB/LILRB抗體必須無菌。此可在 凍乾及重構之前或之後藉由用無菌過濾膜過濾容易地完 成。 可將治療性組合物置於具有無菌入口孔之容器中，例如 具有可被皮下注射針頭刺穿之塞子的靜脈注射溶液袋或小 瓶。 本發明抗PirB/LILRB抗體可視需要與包括NGF、NT-3及 /或BDNF之神經營養因子組合或一起投與，且可與其他變 性神經病症之習用治療藥劑一起使用。此外，本發明抗 PirB/LILRB抗體較佳可與可阻斷Nogo-66、MAG及/或 OMgp與NgR之結合之NgR抑制劑（例如抗體、小分子或肽） 一起投與。 投與途徑與已知方法一致，例如藉由靜脈内、腹膜腔 内、大腦内、肌内、眼内、動脈内或病灶内途徑實施注射 或輸注、局部投與、或藉由持續釋放系統投與，如下所 述。 對於大腦内應用而言，可藉由輸注將化合物連續投與至 CNS之流體室中，但亦可接受快速濃注。較佳將化合物投 139862.doc -55- 200950808 與至腦室中或以其他方式引人CNS或腦脊液中。投與可使 用諸如幫浦等連續投與方式藉由留置導管來實施，或可藉 由植入持續釋放媒劑（例如大腦内植入）來投與。更具體而 吕，可經由長期植入插管來注射化合物或在滲透性微幫浦 輔助下長期輸注化合物。可使用皮下幫浦，其經由小輸液 管將蛋白質遞送至大腦室中。可經由皮膚對極複雜幫浦實 施重填，且可在無外科干預之情況下設定其遞送速率。涉 及皮下幫浦裝置或經由總體植入式藥物遞送系統實施連續 腦室内輸注之適宜投與方案及遞送系統之實例係彼等用於 將多巴胺（dopamine)、多巴胺激動劑及膽鹼能激動劑投與 阿兹海默氏症患者及帕金森病動物模型者，如Harbaugh， J· Neural Transm. Suppl.，24:271 (1987);及 DeYebenes等 人 ’ Mov· Disord. 2:143 (1987)中所述。 持續釋放製劑之適宜實例包括呈成形物件（例如膜或微 膠囊）形式之半滲透性聚合物基質。持續釋放基質包括聚 酯、水凝膠、多乳酸化合物（美國專利第3,773,919號、EP 58,481)、L-麩胺酸與γ-L-麩胺酸乙酯之共聚物（Sidman等 人’ 1983，Biopolymers 22:547)、聚（2-羥乙基-曱基丙烯酸 醋）（Langer等人，1981，J. Biomed. Mater. Res. 15:167 ; Langer，1982, Chem. Tech. 12:98)、乙稀乙酸乙烯醋 (Langer 等人，Id·)或聚-D-(-)-3-羥基丁酸（EP 133,988A)。 持續釋放組合物亦包括脂質體包埋之化合物，其可藉由本 身已為人所知之方法來製備。（Epstein等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 82:3688 (1985) ; Hwang 等人，Proc. Natl. 139862.doc •56- 200950808

Acad. Sci. USA 77:4030 (1980);美國專利第 4,485,045 號 及第4,544,545號；及£? 102,324八）。脂質體通常為脂質含 量大於約30 mol.%膽固醇之小（約200-800埃）單層型，所 選比例可經調整以達成最佳治療。 欲在治療中採用之活性化合物之有效量可取決於（例如） 治療目標、投與途徑、及患者之病況。因此，治療師應根 據需要對劑量實施滴定量測並改變投藥途徑以獲得最佳療 效。端視上述因素，典型每日劑量可在約1 gg/kg至100 pg/kg範圍内或更大。通常，臨床醫師可投與活性化合物 直至達到可修復、維持及（最佳）重建神經元功能之劑量。 該療法之進度可藉由習用分析容易地加以監測。 以下非限制實例進一步詳述本發明。 實例1 表現選殖LILRB2 為鑒定抑制性髓磷脂蛋白之新穎受體，採用表現選殖方 法。作為誘餌，生成使鹼性磷酸酶（AP)與以下定性髓磷脂 抑制劑（所用人類cDNA)之N-及/或C-末端融合之構造體： Nogo66、NogoA之兩個額夕卜抑制性結構域（NiR<8>D2及 NiG<6>20)(Oertle T, J Neurosci. 2003, 23(13): 5393- 406)、MAG、及OMgp。將該等構造體轉染至293細胞中以 產生含有誘餌蛋白之條件培養基（存於DMEM/2% FBS中）。 用於篩選之cDNA文庫包括存於由Origene製造之即用型表 達載體中之全長人類cDNA純系。對該等cDNA實施編輯、 列陣、及匯合。將約100個cDNA之匯合短暫轉染至COS7 139862.doc -57- 200950808 細胞中。 具體而言，在第1天，以85,000細胞/孔之密度將COS7細 胞平鋪於12孔板中。在第2天，使用脂基轉染劑FuGENE 6 (Roche)轉染1 mg匯合cDNA/孔。在第4天，實施篩選。簡 言之，自細胞去除培養基且用0.5 ml含有AP-融合誘餌蛋白 (20-50 nM)之293細胞-條件培養基來替代。在室溫下將細 胞培養90分鐘。然後用磷酸緩衝鹽水（PBS)將細胞洗滌3 次，用4%多聚甲醛固定7分鐘，用HEPES緩衝鹽水（HBS) 洗滌3次，且在65°C下加熱滅活90分鐘以破壞内源AP活 性。在 AP緩衝液（100 mM NaCl、5 mM MgCl2、100 mM Tris，pH 9.5)中將細胞洗務一次，且在生色基質（Western Blue, Promega)中培養，且在培養一小時後分析反應產物 之存在，並在過夜培養後再次實施此分析》藉由膜表面上 深藍色沉澱之存在來鑒定陽性細胞。將陽性匯合物進一步 細分以藉由隨後數輪篩選來鑒定各陽性純系。 藉由篩選鑒定出以下陽性命中物： MAG-AP誘餌獲得4個陽性命中物。一個先前被稱為 Nogo受體（Fournier 等人 ’ Nature 409，342-346 (2001))。該 等命中物中之二者係糖酵解加工酶’且據信不可能具有關 聯性。第四個稱為「來自純系643 (LOC57228)，mRNA之智 人假定蛋白」。cDNA之更細緻分析揭示與前述蛋白SMAG 同源之替代性ORF。 AP-Nogo66誘餌獲得2個陽性命中物。一個先前被稱為 N 〇 g 〇受體。另·個係「智人白細胞免疫球蛋白樣受體亞豕 139862.doc -58- 200950808 族B(具有TM及ITIM結構域），2號成員（LILRB2)，mRNA」 (SEQ ID NO: 2)。此基因亦具有多個替代性名稱，包括 MIG10、ILT4 及 LIR2(Kubagawa 等人，proc. Natl. Acad. Sei· USA 94:5261-6 (1997); Colonna等人，J. Exp. Med. 186:1809-18 (1997)) ° 實例2

PirB功能阻斷性抗體之製備及測試

PirB功能阻斷性抗體 針對PirB之抗體係藉由針對PirB細胞外結構域淘選合成 性噬菌體抗體文庫來生成（W. C. Liang等人，/ Mo/价〇/ 366，815 (2007))。然後在體外測試抗體純系（10㈣^川且 斷AP-Nogo66 (50 nM)與表現pirB之c〇S7細胞結合之能 力。各種YW259抗小鼠PirB(抗mPirB)抗體之重鏈及輕鏈序 列之核苷酸及胺基酸序列展示於圖6-16及17及18中。圖17 及18亦分別展示YW259.2、YW250.9及YW259.12之重鏈及 輕鏈内之超變區序列。 神經突生長分析 用髓磷脂（0.75 pg/ml)包覆預塗佈有聚-D_離胺酸 (Biocoat，BD)之 96 孔板過夜或用 AP-Nogo66 或 MAG-Fc(150-300 ng/點）包覆兩小時，且隨後用層黏連蛋白（1〇 pg/ml存於F-12中）處理2小時（CGN培養）或4小時（DRG培 養）。如前所述培養小鼠P7小腦神經元（B. Zheng等人， Proc 102，1205 (2005))且以約 2χ104細 胞/孔對其實施平鋪。如前所述培養小鼠PI〇 DRG神經元 139862.doc •59· 200950808 (Zheng等人，2005，如前所述）且以約5χ1〇3細胞/孔對其實 施平鋪。在37°C及5%C〇2下使培養物生長22小時，且隨後 用4%多聚曱醛/1〇〇/0蔗糖將其固定並用抗微管蛋白 (TuJl，Covance)實施染色。對於每個實驗而言，所有條件 皆係在六個重複孔中實施，其中量測最大神經突長度並測 定六個孔之間之平均值。將每個實驗實施至少三次，獲得 類似結果。使用司徒登氏t檢驗（Student，s r test)來測定 值。 生長冠萎縮分析 藉由自3週齡小鼠切出DRG來分離DRG外植體且將其切 為三等份。然後在八孔板之塗佈有PDl (1〇〇 pg/ml)及塗佈 有層黏連蛋白（10 pg/ml)之單獨孔中培養各DRG外植體。 在平鋪後72小時，將外植體與Ap-Nogo66 (100 nM)或髓磷 脂（3 pg/ml) —起培養30分鐘以刺激萎縮。用4%多聚曱醛 /10%蔗糖固定培養物，隨後藉由羅丹明-鬼筆環肽（分子探 針）染色來使生長冠顯像並記錄萎縮。藉由在至少3個重複 孔中取平均值來測定平均生長冠萎縮。 結果 為闡明PirB是否為Nogo66之功能性受體，吾人關注幼年 (P7)小腦顆粒神經元（CGN)，其在AP-Nogo66上生長時神 經突生長受到抑制（K.C. Wang等人，iVaiwre 420,74 (2002))。已顯示成年CGN可表現PirB(J. Syken等人， Science 3 13,1795 (2006))，且在藉由 RT-PCR、免疫組織化 學及原位雜交分析時吾人發現幼年CGN亦係如此（數據未 139862.doc -60· 200950808 顯示）。 首先，在體外測試PirB (PirB-His)之可溶性胞外結構域 干擾AP-Nogo66抑制之能力。如圖2A中所示’ AP_Nogo66 將P7 CGN之神經突生長抑制至未處理對照程度之約66%。 在此分析中包含PirB-His可逆轉AP-Nogo66抑制，其中神 • 經突生長基本恢復至對照程度。該等結果與所報道使用 . NgR之胞外結構域阻斷Nogo66之抑制之結果類似（B Zgeng 等人，/Voc. iVa". dcW. Scz.. t/M 102，1205 (2005) ; A. Ε· • Fournier 等人，J. Neurosci. 22，8876 (200) ; Z. L. He 等 人，38，177 (2003))，且表明 PirB可結合Nogo66之 功能性抑制結構域，但並未闡述CGN中之内源PirB是否可 介導由AP-Nogo66所致之抑制。 因此，生成能干擾PirB-Nogo66交互作用之針對PirB之 抗體（抗PirB)。使用針對PirB細胞外結構域之噬菌體展示 平臺（W.C. Liang等人，Mo/·价〇/. 366，815 (2007))根據 多個純系阻斷AP-Nogo66與PirB結合之能力來對其實施篩 9 選。對AP-Nogo66-PirB結合干擾最強之純系YW259.2(下文 中稱作aPBl)針對PirB之Kd為5 nM(參見圖13-16)。

aPBl對CGN之基線轴突生長無效。然而，在經培養CGN • 中aPBl顯著降低AP-Nogo66或髓磷脂所致之抑制（圖2B)， 救援神經突生長，對於AP-Nogo66自41%至59%，對於髓 磷脂自47%至62%。在使用MAG作為抑制性基質或使用不 同細胞類型（背根神經節（DRG)神經元）時觀察到類似結果 (圖5)。該等結果證明，PirB係介導神經突生長長期抑制之 139862.doc •61 · 200950808 功能性受體。 為證實此結果，藉由培養來自PirBTM小鼠之神經元來 測試遺傳移除細胞表面PirB是否亦可逆轉由AP-Nogo66或 髓磷脂所致之抑制，在該等神經元中已移除四個編碼跨膜 結構域及部分PirB細胞内結構域之外顯子（J. Syken等人， Sckwe 313,1795 (2006))。在對照基質、AP-Nogo66 或髓 磷脂上培養來自PirBTM小鼠或野生型（WT)同胞仔之 CGN。在對照基質（PDL/層黏連蛋白）上，PirBTM神經元之 特徵類似於WT神經元（圖2C)。然而，在AP-Nogo66或髓磷 脂上PirBTM神經元之神經突生長所受抑制顯著低於WT神 經元。在AP-Nogo66上，WT神經元之生長被抑制至對照程 度之50%，而PirBTM神經元僅被抑制至66%。與之類似， 在髓磷脂上，WT神經元被抑制至對照程度之52%，而 PirBTM神經元僅被抑制至70%。同樣，吾人觀察到類似部 分去抑制作用PirBTM DRG神經元之在髓磷脂及AP-Nogo66二者上（圖5)。該等發現表明，PirB實際上係AP-Nogo66及髓構脂介導之神經突生長抑制的功能性受體。然 而，PirB活性之損失不能完全救援生長。 由於先前已闡述NgR可作為髓磷脂抑制劑之受體，故 PirB與NgR可能一起發揮作用來介導對神經突生長之抑 制。為闡明此情形，藉由在抗PirB存在下培養來自NgR缺 陷型小鼠之神經元同時阻斷PirB及NgR二者在CGN中之功 能。如先前所報導（B. Cheng等人，PNAS 2005，如前所 述），NgR-/- CGN神經突生長被AP-Nogo66或髓磷脂抑制 139862.doc -62- 200950808 至與WT神經元中相同之程度（50%及49% ;圖3)。對 NgR+/-神經元實施aPBl抗體處理可部分逆轉由AP-Nogo66 或髓磷脂所致之抑制，如上文對WT神經元實施aPB 1處理 時所觀察到者一般。與之類似，對NgR-/-神經元實施aPB 1 處理可部分逆轉由AP-Nogo66所致之抑制，但所提供救援 程度不超過對NgR+/-神經元或WT神經元實施aPB 1處理時 所觀察到者。與之相反，對NgR-/-神經元實施aPBl處理可 將髓磷脂上之神經突生長幾乎恢復至對照程度。因此，由 存於CGN中之APNogo66所致之基質抑制似乎需要PirB而 非NgR，但僅係部分需要。此外，PirB及NgR二者可一起 促進由髓磷脂所致之基質抑制。 由於認為因應各種髓磷脂抑制劑之生長冠萎縮需要 NgR(J.E. Kim等人，44，439 (2004) ; O.Chivatakarn 等人，*/· iVewrosci. 27, 7117 (2007))，故此更為急性之反 應中可能亦涉及PirB。此實驗中使用來自3週齡小鼠背根 神經節（DRG)且已證實可表現PirB之感覺神經元。已發現 在此培養系統中生長冠具有較高萎縮基線程度（約30%)， 其可藉由與APNogo66或髓磷脂一起培養來進一步提高（圖 4)。此萎縮在NgR-/-神經元中大部分被消除。此外，用 aPB 1阻斷PirB功能亦足以逆轉由該等抑制劑所致之生長冠 萎縮。一起抑制PirB及NgR途徑二者（使用在來自NgR-/-小 鼠之神經元上之aPB 1處理）亦可完全逆轉生長冠萎縮，但 由於在此分析中單獨實施任一處理亦可導致完全救援，因 此此結果並不提供任何信息。 139862.doc -63 - 200950808 在另一實驗中’ C1QTNF5抑制小腦顆粒神經元（CGN)之 神蛵犬生長，且此抑制被PirB功能阻斷性抗體Yw259 2逆 轉。結果展示於圖19中。 忒等結果一起支持PirB具有作為由髓磷脂提取物、且更 具體而έ由髓磷脂相關抑制劑N〇g〇66& mag所致之神經 犬抑制所需受體之新穎作用。實際上，pirB似乎係比NgR 更重要之基質抑制介質，此乃因單獨移除pirB功能（以遺傳 方式或使用抗體）即可使髓磷脂提取物及髓磷脂抑制劑二 者上之生長部分去抑制，而單獨遺傳移除NgR不能在任一 該等基貝上去抑制。然而，NgR似乎在介導由髓磷脂提取 物（而非N〇g〇66)所致之抑制時發揮附屬作用’此乃因遺傳 移除NgR可增強在髓磷脂上（而非在N〇g〇66上）由抗^化抗 體引發之去抑制。吾人之發現可有助於闡釋以下事實：儘 管據報導在輸注NgR胞外結構域之齧齒動物中觀察到再生 或生長（S. Li等人，J· 24, 1051 1 (2004))，但令 人驚訝地NgR敲除小鼠中CST再生未增強（J.E Kim等人， 如别所述 ’ B. Zheng等人，Λ^/· 如· j〇2, 1205 (2005))。因此，可能需要移除pirB及NgR二者以在體 内達成顯著再生。此外，由於在Nogo66基質上遺傳移除 NgR不能進一步增強PirB移除之部分去抑制效應，因此 Nogo66可能存在其他結合受體。 儘管PirB似乎係比NgR更重要之基質抑制受體，但pirB 或NgR之早獨失活皆足以阻斷因添加趙碟脂抑制劑所致之 急性生長冠萎縮。此觀察結果表明，萎縮係要求更嚴格之 139862.doc •64- 200950808 過程，其需要PirB及NgR二者之活性同時或一起發揮作 用。在此背景中’令人關注者係最近已顯示pirB及NgR受 體在限制視皮質中突觸連接可塑性方面具有類似作用：在 缺少任一受體之小鼠中，在關鍵發育期間閉眼可過度強化 經由睁眼之連接（j. Syken等人，2006，如前所述；A.W. McGee等人，3〇9，2222 (2〇〇5)，如前所述）。兩種 受體在介導生長冠萎縮中產生效應之機制亦可能是其在眼 優勢柱可塑性中起共同作用之基礎。 成年軸突在受損後不能再生係在CNS發生創傷性損傷後 恢復功能之主要障礙。據推測，再生潛力由於突觸可塑性 能力隨年齡增長受限而下降’從而限制過度或過多突觸連 接之發育。此推測可自以下發現獲得支持：先前在發育及 成年期期間限制突觸可塑性中涉及之pirB(J. Syken等人， 2006，如前所述）亦係縫磷脂所致軸突抑制之介質；同時 發現：最初在軸突抑制中涉及之NgR同樣可調節突觸可塑 性（S. Li 等人，《/. 24，1051 1 (2004))。 吾人之發現亦可將潛在PirB配體之範圍擴展至 分子之範圍以外而包括神經元再生長抑制劑。反之，由於 已知髓磷脂抑制劑Nogo或MAG之遺傳缺失僅導致由髓磷 脂所致之抑制的適度降低-表明存在其他抑制劑—吾人之發 現提出以下可能性：通常由少突角質細胞少量表現之 MHCI分子可在受傷後發生上調並促進中樞髓磷脂中與 Nogo及MAG—致之生長抑制。

PirB信號因應髓磷脂抑制劑抑制軸突生長之機制尚未明 139862.doc -65- 200950808 瞭。然而’已顯示PirB可拮抗整合素受體之功能（S_

Pereira等人，J. 173:5757 (2004))，且可補充 SHP-1及SHP-2磷酸酶二者；該等事件中之一或二者皆可 減弱正常神經突生長。使用本文中之抗pirB抗體或藉由其 他方式阻斷PirB活性可為治療性干預提供重要的新目標以 刺激軸突再生。 , 本揭示内容通篇所引用之所有參考文獻皆係全文以引用 方式明確併入本文中。 儘管已參照可視為具體實施例之内容闡述了本發明，但 ® 應理解本發明並不限於該等實施例。相反，本發明意欲涵 蓋隨附申請專利範圍之精神與範疇内所包括之各種修改及 等效内容。 【圖式簡單說明】 圖1A及1B展示小鼠PirB序列（S]Eq ID NO: 1)及人類 LILRB2序列（SEQ ID NO: 2)。 圖2A及2B阻斷PirB可逆轉基於AP_N〇g〇66或髓磷脂之對 CGN生長之抑制。將經解離小鼠？7 CGN平鋪於pDL/層黏 © 連蛋白（對照）、AP-Nogo66、或趙填脂上以測試由該等受 質所致之抑制。（A)代表性顯微照片，（B)自一代表性實驗 . 量測平均神經突長度（±SE)之圖表。在存在或不存在針對 PirB之功能阻斷性抗體（aPB1 ; 5〇 μ§/ιη1)之情況下培養於 PDL/層黏連蛋白、Ap_N〇g〇66、或髓磷脂上生長之神經 兀。aPBl顯著降低由任一受質所致之抑制。fpui ;比 例尺，50 μηι) 139862.doc -66- 200950808 圖3A-3D阻斷PirB可逆轉基於AP-Nogo66或髓磷脂之對 CGN生長之抑制。將經解離小鼠P7 CGN平鋪於PDL/層黏 連蛋白（對照）、AP-Nogo66、或髓磷脂上以測試由該等受 質所致之抑制。代表性顯微照片展示於圖3A及3C中，且 自一代表性實驗量測平均神經突長度〇SE)之圖表展示於 圖3B及3D中。在存在或不存在針對PirB之功能阻斷性抗體 (aPBl ; 50 pg/ml)之情況下培養於PDL/層黏連蛋白、AP-Nogo66、或魏鱗脂上生長之神經元。aPB 1顯著降低由任 一受質所致之抑制。（*ρ<〇·〇1 ;比例尺，50 μηι) 圖4Α及4Β需要PirB及NgR二者來介導由髓磷脂抑制劑所 致之生長冠萎縮。單獨使用介質（對照）、髓磷脂（3 pg/ml)、或AP-Nogo66 (100 nM)將出生後DRG轴突之生長 冠處理30分鐘以刺激萎縮，且用羅丹明-鬼筆環肽 (Rhodamine-phalloidin)實施染色以使生長冠顯像。（A)代 表性顯微照片，（B)自蓄積性實驗量測生長冠萎縮百分比 (士SEM)之圖表。僅藉由抗PirB處理達成之NgR之遺傳損失 或PirB之抑制即足以阻止髓構脂或AP-Nogo66之生長冠萎 縮活性。兩條途徑之抑制亦可完全阻斷萎縮。（比例尺， 50 μηι) 圖5 A-5D阻斷PirB可使DRG神經元中及受質MAG上之神 經突生長部分去抑制。代表性顯微照片展示於圖5A及5C 中；顯示來自一代表性實驗之平均神經突長度（士SE)的圖 表展示於圖5B及5D中。（A)及（B)在存在或不存在抗PirB之 情形下將經解離Pl〇 DRG神經元平鋪於PDL/層黏連蛋白、 139862.doc -67- 200950808 AP-Nogo66、或髓磷脂上。aPBl可顯著降低由AP-Nogo66 及髓磷脂所致之抑制。（C)及（D)在存在或不存在aPBl之情 形下將經解離P7 CGN平鋪於PDL/層黏連蛋白或MAG-Fc 上。針對PirB之抗體降低MAG-Fc對神經突生長之抑制。 (* ρ<0·01 ;比例尺，200 μιη Α，Β ; 50 μπι C)。 圖 6抗 PirB抗體 YW259.2 重鏈（SEQ ID NO: 8)之 DNA序 列。 圖 7抗 PirB 抗體 YW259.9 重鏈（SEQ ID NO·· 9)之 DNA 序 列。 圖 8抗 PirB 抗體 YW259.12 重鏈（SEQ ID NO: 3)之 DNA 序 列。 圖9抗PirB抗體YW259.2重鏈（SEQ ID NO: 4)之蛋白質序 列。 圖10抗PirB抗體YW259.9重鏈（SEQ ID NO: 5)之蛋白質 序列。 圖11抗PirB抗體YW259.12重鏈（SEQ ID NO: 6)之蛋白質 序列。 圖12所有YW259抗體（SEQ ID NO: 7)之輕鏈之蛋白質序 列。 圖13抗PirB抗體YW259.2(IgG)抑制經His標記之小鼠 PirB之活性之能力。 圖14抗PirB抗體YW25 9.9 (IgG)抑制經His標記之小鼠 PirB之活性之能力。 圖15抗PirB抗體YW259.12 (IgG)抑制經His標記之小鼠 139862.doc -68- 200950808

PirB之活性之能力。 圖16包括YW259.2、YW25 9.9及YW259.12在内之一組抗 PirB抗體的相對AP-Nogo66結合。 圖 17A-17C 抗 PirB 抗體 YW259.2 (SEQ ID NO: 11)、 YW259.9 (SEQ ID NO: 12)及YW259.12 (SEQ ID NO 13)之 ' 重鏈序列之比對。對CDR HI、CDR H2及CDR H3序列以 . 及Kabat、Chothia之CDR H結構域及接觸CDR H結構域實 施加框。Hum III顯示為SEQ ID NO: 10。 ® 圖 18A-18C 抗 PirB 抗體 YW259.2 (SEQ ID NO: 15)、 YW259.9 (SEQ ID NO·· 15)及 YW259.12 (SEQ ID NO·· 15)之 輕鏈序列之比對。沿Kabat、Chothia及接觸CDR L結構域 之CDR L結構域為CDR LI、CDR L2及CDR L3序列加框。 HuKI顯示為 SEQ ID NO: 14。 圖19 C1QTNF5 (CTRP5;NP_05646)抑制背根神經節神 經元之神經突生長，且在藉由PirB功能阻斷性抗體 ^ YW259.2阻斷PirB時此抑制降低。 139862.doc -69- 200950808 【序列表】 <11〇>美商建南德克公司 <120>抗PirB抗體 <130> GNE-0324 <140〉098115945 <141> 2009-05-13 <150> US 61/052,949 US 12/208,883 US 12/316,130 <151> 200^05-13 2008*09-11 2008-12-09 <160> 15 <!?0> Patemla version 3,5

<2l〇> I <2Π> 841 <212> PRT <213>小鼠屬 <4〇〇> 1

Met Ser Cys Thr Phc Thr Ala Leu Leu Arg Leu Gly Leu Thr Leu Scr 1 5 10 15

Leu Trp lie Pro VaJ Leu Thr Gly Scr Leu Pro Lys Pro lie Lea Arg 20 25 30

Vai Gin Pro Asp Ser Val Val Ser Arg Trp Tlir Lys Val Thr Fhe Phe 35 40 45

Cys Glu Glu Thr l!c Gly Ala Asn GIu Tyr Arg Leu Tyr Ly& Asp Gly 50 55 60

Lys Leu Tyr Lys TTir Val Tbr Lys Asn Lys Gin Lys Pro Ala Asn Lys 65 70 75 80

Ala Glu Phe Ser Leu Scr Asn Val Asp Leu Arg Asn Ata Cly Gin Tyr 85 90 95

Arg Cys Ser Tyr Ser Thr Gin Tyr Lys Ser Scr Gly Tyr Ser Asp Pro 100 105 no

Uru Giu Leu Val Va丨 Thr Gly Asp Tyr Trp Thr Pm Ser Leu Leu 115 120 125

Gin Ala Ser Pro Val Vai Thr Ser Gly Gly Tyr Val Thr Leu Gin Cys 130 135 140 G\u Ser Trp His Asn A^p Ly$ Phe fie Leu Thr Val 〇]u Gly Pro 145 150 155 160

Gin Lys Leu Ser Trp Thr Gin Asp Ser Gin Tyr Asn Tyr Ser Thr Arg 165 170 175

Lys Tyr His Ala Leu Fhe Sef Vat Gly Pro Va] Thr Pro Asn Gin Arg m 185 190 139862.doc 200950808

Trp ik Cys Arg Cys Tyr Ser Tyr Asu Arg Asn Afg Pro Tyr Va丨 Trp 1¾ 200 205

Ser Pro Pro Ser Glu Ser Val Gtu LeH Leu Va〗Ser Gly Asn Leu Gin 210 215 220 ^ Pro mile Lys Ala Glu Pro Glv Pr〇 Vaille A)a Ser Lys Arg

Ala Sfct Thr tie Trp Cys Gin Gly k%n Leu Asp Ala Gin Val Tyr Phe 245 ISO 255

Leu Ηϊχ Asn Glu Gly Ser Gin Lys Thr G議n Ser Thr G]u Thr Leti Gin 260 265 270

Gin Pro 〇Iy Ash Lys Gly Lys Phe Phe lie Pro Ser Met Thr Arg Gin 275 280 285

His Ala Gly G\n Tyr Arg Cys Tyr C>fs Tyr Gly Scr Ala Gly Trp Ser 290 295 300 ΰίη Pro Scr Asp Thr Leu Gla Leu Vsl Val Ώιτ Gly He Tyr Glu His 30S 310 315 320

Tyr Lys Fro Arg leu Scr Vai Lea Pro Ser Pro Val Val Thr Ala 〇]y 325 330 3J5

Gly Ash Met Thr Uu His Cys Ala Ser Asp Phe His Tyr Asp Lys Phe 340 345 35D lie Leu Thr Ly$ G3u Asp Lys Lys Pile Qly Asn Scr As^i Thr GH 355 360 365

His lie Stt Str &r Arg Gin Tyr Arg Ala L·^ Phe He He Giy Pro 370 375 380

Thr Thr Pro Thr His Thr Gb Thr Pbe Arg Cys Tyr Gly T.yr Phe Lyt 385 390 395 400

Asn Ala Pro Gin Uu Trp Scr Val Pro Ser Asp Lem Gk Gin He Leu 405 410 41$

Jlc Ser Gfy Leu Ser Ly技 Lys Pro Ser Leu L«u Tlir His Girt H·" 420 425 430 lie lxu Mp Pro Cly itet Thr Leu Tbr Ixu Gin Cys Tyr Scr Asp lit 435 440 445

Asn Tyr Asp Arg Phe A】a Leu His Lys Va] Gty Gly Ala Asp lie Mei ^30 4SS HU Ser S$r Slit ϋ丨n Thr Asp Hr Gly Phe Ser \%丨 Ala Aim Phe 465 470 475 480

Thr Leu Gly Tyr Vjii Scr Scr Ser Thr G]y Gly Gin Tyr An Cy§ Tyr 4S5 490 495 、2· 139862.doc 200950808

Gly Ala His Asn Ser Ser Glu Trp Scr Ala Scr Ser G!a Pro Leu 500 505 510

Asp He Leu. I!a thr Gly Oln Leu Pro leu Thr Pro Ser Lea S«r Val 515 520 525

Lys Pro A.St> His Thr Va丨 His Sef Gty Glu Thr Va.】 Ser leu Leu Cys 53ύ 535 540

Trp S«r Met Asp Sfir Val Asp Thr Phe lie Uu Ser lys Glu Gly Ser 545 550 S55 560

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Eaggtgcaia atgccaagac a^agccgcgg gaggagcagt aca^cagcac £iaccgggtg 96€ glca£C£tcc tc^ccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagia caagtgcaag 1020 giciccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca ictccaaagc caaagggcag 10S0 ceccgagaac cacaggtgi^ c^cccigccc ccatcccgfg aagagaigac caagaaccag 1140 gtcagcclgs cctgcctg£t caaaggcitc iatcccagcg acatc£ccgi £.gagtgggag 1200 agcaatgggc agceggagaa caactscaag accacgeete eatgeigga e!eegacgge 1260 tccttatcc tctacagcaa gctciccgtg gBcs^iBgca ggrggcagca 1320 tUKruigct ccgtgatgca tg&agctctg cacsaccact acacgcagaa gagccicicc B80 cigtctccgg giaaaigagt gcgacggccc tagagicgii 141θ swsiiolG 0>l>2>3>»>va tsf tt 11 Λν u <2<2<2<2<4ΰι 0 v^· 15 GI o pr ln G va u u Glyio y G, V- G, Γ se Vi G va5 u u ln

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AtaArgGIyffiAspT>TTrp0lyl?C!yThr !i〇 -14- 139862.doc 200950808 <2i2> mr <213>人工序列 <22〇>

<223>人工序列描述：合成多肽 <400> II

Ctn Val Cli5 Lea Val Glu Ser Gty GSy G!y Leu Val 01 n Pro 01 y 01 y 1 5 10 15

Ser fjen A.rg Leu Scr Cys Ala Ala Gt^ Pte Thr Phe Ser ksn Set 20 25 30

Tyr lie Ser TrP Val Arg Gin Ata Pro Giy Ip 〇]y Leq GIu Trp Val 35 40 45

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Lys CJIy Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asu Thr Ala Tyr 65 70 75 SO ben Gin Asn Ser Leu Arg Ala Gtn Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cp 85 90 95

Ala Lys Ser Afa Trp Gin Phe Ala Tyr Trp Gly Gln< Gly Thr 100 105 110 <2IO> 32 <2ii> m <2I2> m <2I3>人工序列 <220> <223>人工序列描述：合成多肽 <4〇〇> 12 GIu Va] Gin Uu Val Gly Ser Gly G)y Gly leu Val Gin Fro Gly Giy ϊ 5 10 15

Ser Leu Arg Uu Ser Cy$ Ala Ala Ser Oly Ptss Thr Phe Ser Ser km 20 25 30

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Lys Arg Thr Ue Ser Wa A印 Thr Scr Lys Ma Leu 65 70 75 g〇

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Ar,Ser ^ Pha Asp ^ Tg Ciy Gly ^ <210> 13 <2Π> Π0 <2]2> PRT <2]3>人工序列 -15- 139862.doc 200950808 <220> Θ23>人工序列描述：合成多肽 <m> 13

Glu Vai GIs Leu Val 〇]» Ser G)y Gly G!y Leu Val 0in Pro Gly Gly 1 5 10 15

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Ala lys Ser Vai Trp Ala Btc Ala Tyr Trp Gly Cln Giy Thr 100 105 110 <210> 14 <211> 108 <212> PRT <2!3>智人 <4(K)> 14

Asp lie Gin Met Thr G!b Scr Pro Scr Ser Uu Ser Ala Scr Val Gly 1 5 10 IS

Asp Arg Val Hir He Utr Cys Arg Als Ser GJn Ser lie See Asn Tyi 20 25 30 L€u Ala trp Tyr Gin Gin Lys Pro Cly Lvs Ala Pro Lys Leu Leu fie 3S 40 ' 45

Tyr Ala ^Ja Ser Ser Leu Gius Ser Qly Val Pro Ssr Arf Phc Scr Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Pfec Thr Leu Thr lie Ser Sir Leu Girt Pro 65 70 7$ 80

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Tiir Phe Gly Gin Gly ITir Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <2ΐϋ> 1$ <21i> m <212> mt <213>人工序列 <320>

<223>人工序列描述：合成多肽 <400> IS •16- 139862.doc 200950808

Asp He Gin Met Tht Gin Ser Pro Ser Ser Lea Ser Ais Ser VaJ Oly } 5 10 15

Asp Arf Val Hr lie Thr Arg Ala Ser Qlti Asp Va! Ser Thr Ala 2ϋ 25 30

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Thr Phe Gly Gin Gly Iht Lys Va! 〇]u lie Lys Arg 剛 105 e -17- 139862.doc

Claims (1)

1. 200950808 七、申請專利範圍： 1 · 一種分離之抗PirB/LILRB抗體，其與選自由YW259.2、 YW259.9及YW259.12組成之群之抗體結合人類PirB (LILRB)上之相同表位（epitope)。 2. —種分離之抗PirB/LILRB抗體，其與選自由YW259.2、 YW259.9及YW25 9.12組成之群之抗體競爭結合人類PirB (LILRB)。 3. —種分離之抗PirB/LILRB抗體，其包含一、二或三個來 ® 自選自由以下組成之群之重鏈之超變區序列：YW259.2 重鏈（SEQ ID NO: 4 或 11)、YW259.9 重鏈（SEQ ID NO·· 5 或 12)、及 YW259.12重鏈（SEQ ID NO: 6或 13)。 4. 如請求項3之抗體，其中該抗體包含YW259.2抗體重鏈 (SEQ ID NO·· 4或11)之所有超變區序列。 5. 如請求項3之抗體，其中該抗體包含YW259.9抗體重鏈 (SEQ ID NO: 5或12)之所有超變區序列。 6. 如請求項3之抗體，其中該抗體包含YW259.12抗體重鏈 (SEQ ID NO: 6或13)之所有超變區序列。 7. 如請求項3至6中任一項之抗體，其另外包含輕鏈。 ' 8.如請求項7之抗體，其中該輕鏈包含一個、兩個或三個 . SEQ ID NO: 15多肽序列之超變序列。 9. 如請求項7之抗體，其中該輕鏈包含SEQ ID NO: 7或15多 肽序列之所有超變區序列。 10. 如請求項3之抗體’其選自由抗體YW259.2、YW 259.9、及YW259.12組成之群。 139862.doc 200950808 11. 一種分離之抗PirB/LILRB抗體，其中該抗體之八 形式以5 nM或更強之結合親和性特異性結合人類p B (LILRB)。 12. —種分離之抗PirB/LILRB抗體，其中該抗體之全長 形式以1 nM或更強之結合親和性特異性結合人類pirB (LILRB)。 13. 如請求項1至6及9至12中任一項之抗體，其可促進轴突 再生。 14. 如請求項1至6及9至12中任一項之抗體，其可促進cns神 〇 經元之再生。 15. 如請求項1至6及9至12中任一項之抗體，其至少部分救 援Nog〇66及髓碟脂所致之神經突生長抑制。 16. 如請求項丨至6及9至12中任一項之抗體，其中該抗體係 早株抗體。 17. 如請求項丨至6及9至12中任一項之抗體，其中該抗體係 選自由以下組成之群··嵌合抗體、人類化抗體、親和性 成熟抗體、人類抗體、及雙特異性抗體。 ❹ 18. 如請求項⑴及9至12中任一項之抗體其中該抗體係 抗體片段。 19. 如研求項1至6及9至12中任—項之抗體，其中該抗體係 免疫接合物。 20·種夕核苦酸，其編石馬如請求項卜12中任一項之抗體或 其重鍵或輕鍵。 21. -種載體’其包含如請求項2〇之多核苦酸。 139862.doc -2- 200950808 22. 如請求項21之载體’其中該載體係表現載體。 23. —種宿主細胞’其包含如請求項21之載體。 24. 如請求項23之宿主細胞，其中該宿主細胞係原核細胞。 25. 如請求項23之宿主細胞，其中該宿主細胞係真核細胞。 26. 如請求項25之宿主細胞，其中該宿主細胞係哺乳動物細 -胞。 . 27. —種製造抗PirB/ULRB抗體之方法，該方法包含（a)如請 ©求項22之載體在適宜宿主細胞中表現，及回收該抗 體。 28.如請求項27之方法，其中該宿主細胞係原核細胞。 29.如請求項27之方法，其中該宿主細胞係真核細胞。 3〇. 一種組合物’其包含如請求項1至12中任一項之抗 PirB/LILRB抗體及醫藥上可接受之賦形劑。 31.如清求項3〇之組合物’其中該組合物另外包含第二藥 物，其中該抗PirB/LILRB抗體係第一藥物。 Φ 32·如請求項31之組合物，其中該第二藥物係NgR抑制劑。 33·如明求項32之組合物，其中該NgR抑制劑係抗NgR抗 體。 34. —種套組，其包含抗如請求項M2中任一項之抗朽化/ ’ . lilrb抗體。 35·種如明求項卜12中任一項之抗PirB/LILR^^體之用 込其用於製造在有需要之個體中促進軸突再生之藥 物。 36.如請求項35之用途，其中該個體係人類患者。 139862.doc 200950808 37. 如請求項36之甩途，其中促進神經元之存活。 38. 如請求項36之用途，其中誘發神經元之生長。 39. —種如請求項丨_12中任一項之抗pirB/LILR^^體之用 途，其用於製造在有需要之個體中治療神經變性疾病之 藥物。 40. 如請求項39之用途，其中該神經變性疾病之特徵在於中 樞神經系統之物理損傷。 41. 如請求項40之用途，其中該神經變性疾病係與中風相關 之腦損傷。 42. 如請求項39之用途，其中該神經變性疾病係選自由以下 組成之群：三又神經痛、舌咽神經痛、貝爾（Bell，s)麻 痒、重症肌無力、肌營養不良、肌萎縮侧索硬化 (ALS)、多發性硬化（MS)、進行性肌萎縮、進行性延髓 遺傳性肌萎縮，因物理損傷（例如燒傷、創傷）或諸如糖 尿病、腎功能障礙等疾病狀態或因用於治療癌症及Ams 之化學治療的毒性效應引發之外周神經損傷，突出性、 破裂性、或脫垂性椎間盤症候群，頸椎病、神經叢病 症、胸廓出口破壞症候群、周圍神經病（例如由鉛、胺苯 颯（dapSone)、蜱（ticks)引起者）、卟啉症、格林_巴厘症 候群（Gullain-Barre syndrome)、阿茲海默氏症 (Alzheimer’s disease)、亨庭頓氏症（Huntingt〇n，s sease)、及帕金森病（parkinson，s disease)。 43. —種抗獨特型（idiotype)抗體，其特異性結合如請求項卜 12中任一項之抗PirB/LILRB抗體。 139862.doc