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TW200930405A - Low density lipoprotein receptor-mediated siRNA delivery - Google Patents

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Publication number
TW200930405A
TW200930405A TW097144141A TW97144141A TW200930405A TW 200930405 A TW200930405 A TW 200930405A TW 097144141 A TW097144141 A TW 097144141A TW 97144141 A TW97144141 A TW 97144141A TW 200930405 A TW200930405 A TW 200930405A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
interfering rna
ligand
peptide
conjugate
ldlr
Prior art date
Application number
TW097144141A
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English (en)
Inventor
Jon E Chatterton
Original Assignee
Alcon Res Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alcon Res Ltd filed Critical Alcon Res Ltd
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200930405 六、發明說明： L· W JsSi, Ji 發明領域 5 ❹ 10 15 ❿ 本發明係關於經由干擾RNA分子-配位子綴合物將干 擾RNA分子輸送至一細胞之方法。該綴合物包括可與一種 低密度脂蛋白受體(LDLR)或LDLR家族成員結合之一種配 位子。本發明亦關於用於治療眼疾之方法，其係藉由對有 需求之一病患投予本發明之一種干擾RNA分子-配位子綴 合物。 發明背景 RNA干擾作用（RNAi)係藉由雙股RNA(dsRNA)使得基 因表現沈默化之一作用。RNAi係由存在於細胞中之小型（亦 即少於30個核苷酸)雙股RNA (“dsRNA”)分子所誘發(Fire等 人於1998年期刊第391期第806-811頁乙文）。該等 稱作“短型干擾RNA”或“siRNA”之短型dsRNA分子，造成與 該siRNA具有序列同源性之信使RNA(“mRNAs”）之破壞 (Elbashir等人於2001年期刊”Dev”第15期第188-200 頁乙文）。據信該siRNA的一股被納入一個稱作rnA誘導型 沉默複合體（RISC)之核糖核蛋白複合體中。Rise使用該 siRNA股以識別出與所納入的siRNA股至少部份互補之 mRNA分子，然後將該等標的mRNA剪切或抑制其等的轉譯 作用。非常類似於一種多次轉換型酵素，該siRNA顯然被回 收再利用，一個siRNA分子可引發約1〇〇〇個mRNA分子的剪 20 200930405 切作用。因此，mRNA之經siRNA媒介的降解作用， 比目前用於抑制一標的基因表現之技術更加有效。 RNAi提供-種用於治療及/或預防疾病之非常令人鼓 舞的方法。相較於各種傳統的治療方法，RNAi的一些主要 5優點包括：RNAi以高度專一性標定涉及疾病過程的一個非 常特疋基因之能力，藉此減少或消弭目標效應；RNAi是導 向高度專一的RNA降解作用之一種正常的細胞作用；及不 同於多種抗體式療法，RNAi不會引發宿主免疫反應。 正進行測試/研發數種干擾RNA輸送方法，以供活體内 〇 10使用。例如，siRNA可在鹽水溶液中以“裸型，，方式輸送；與 聚陽離子、陽離子脂質/脂質轉染試劑或陽離子肽複合；作 為已確定的分子綴合物（如經膽固醇修飾的siRNA、 TAT-DRBD/siRNA複合體）之組份；作為脂質體之組份；及 ' 作為奈米粒子之組份。該等方法所展現的成功程度不一。 15因此’需要用於在活體内輸送siRNA分子之新穎與改良的方 法’以達到與增進RNAi的治療潛力。 【發明内容】 ® 發明概要 本發明提供干擾RNA分子-配位子綴合物，其中該配位 20 子可與一種低密度脂蛋白受體(LDLR)或LDLR家族成員結 合。本發明亦提供使用該綴合物之方法，供在試管中或活 體内輸送一干擾RNA分子至一細胞中。就一方面而言，本 發明之一種干擾RNA分子-配位子綴合物，可用於輸送一干 擾RNA分子至一病患的眼睛。 4 200930405 本發明進一步提供用於治療或預防一病患眼疾之方 法八包括對該病患投予一種干擾rnA分子-配位子綴合 物其中5亥配位子可與一種低密度脂蛋白受體(LDLR)或 LDLR家族成員結合，及其中該干擾rna分子可減弱與該眼 疾相關聯的—基因之表現。就特定方面而言，該眼疾是眼 睛血e新生、乾眼、眼睛發炎性病況、高眼壓或青光眼； 或與其等相關聯。就其他方面而言，該綴合物之投藥係藉 〇 丨㈣’崎、結釘注射、玻魏岐射、近f:膜的前方 1或後方注射、眼部局部施用、靜脈注射、口服投藥、肌内 射腹膜内注射、經皮施用、鼻内施用或經黏膜施用。 ' j自本發_—些較佳實_之下収詳細的說明及申 • 11專利範圍，將更清楚本發明的特定較佳實施例。 【貧施方式】 發明之詳細說明 在此所顯示的特定情況，係舉例及僅為了說明討論本 ❹ 發明的較佳實施例之目的，及其呈現係為了提供據信為本 發明的不同實施例之原則與概念部份之最有用與立即可明 瞭的說明。就此而έ，並未試圖在對於本發明的基本瞭解 20所需者之外，更詳細地顯示本發明的結構細節丨連同圖式 及/或實例之說明，應使得該等嫻熟技藝者明瞭如何在實際 上實施本發明的數種形式。 下列定義與註釋係意欲支配後述任—詞句結構，除非 在下列實例中經清楚與明確地修飾，或者當該涵意之使用 使得任—詞句結構無意義或實質上無意義。若一詞的建構 200930405 使其無意義或實質上無思義時，則該定義應取自偉伯斯特 字典(Webster’s Dictionary)第3版或嫻熟技藝者所知的一辭 典，諸如牛津生物化學與分子生物學辭典（由Anth〇ny Smith 編輯，英國牛津的牛津大學出版社於2004出版）。 5 如用於此之所有百分比皆為重量百分比，除非另外說 明之。 如用於此及除非另外標明之”a”與”an”等詞，係指，，一 個”至少一個”或”一或多個"。除非内文中另外需要，在 此所用的單數名詞應包括複數，而複數名詞應包括單數。 1〇 在特定實施例中，本發明提供可將干擾RNA輸送至一 病患眼細胞中之干擾RNA-配位子綴合物。在—個特定實施 例中，該綴合物可與眼細胞表面上的一種低密度脂蛋白受 體(LDLR)或LDLR家族成員結合。 如用於此之“受體”一詞係意欲涵蓋整個受體或其配位 15子結合部份。受體的該等部份特別包括足以供配位子的專 一性結合作用發生之該等區域。 綴合物的配位子可為能在眼細胞上與一個LDL受體家 族成員進行專一性結合作用之任一分子。分子實例包括但 不限於蛋白質或適配子（aptamer)。如用於此之“蛋白質，，一 20 詞包括狀、多肽、共通分子、融合蛋白、經純化之天然存 在的蛋白質、人工合成的蛋白質、抗體及類似物、衍生物 或其組合物。 如用於此之”適配子（aptamer)”一詞，係指可與一特定 標的分子結合之核酸(典型地DNA、RNA或募核苷酸）。當 200930405 5 ❹ 10 15 ❹ 20 在標的分子之混合物中添加核酸時，自試管中的篩選作用 或其他類型的適配子篩選方法（如以流式細胞光度術進行 之珠式篩選作用或高密度適配子陣列）所得到的適配子，係 技藝中所熟知者。適配子的長度典型地介於1〇與3〇〇個核苷 酸之間。RNA與DNA適配子可自試管中的篩選實驗諸如 SELEX(指數富集性配位子系統進化作用）產生。有關適配子 的用途及用於製造/篩選適配子之實例，係述於例如Chu等 人於2006年期刊，Wwc/. 乂以办/?以.”第34期第e73頁乙文、第 20060014172號美國專利公開案、第5,840,867號美國專利、 第6,001，648號美國專利、第6225,058號美國專利、第 6,207,388號美國專利及第20020001810號美國專利公開 案’所有的揭露内容在此完整地併入本案以為參考資料。 低密度脂蛋白受體（LDLR)家族成員之非限制性實例 包括LDLR、極低密度脂蛋白（VLDL)受體、ApoE受體、LDL 受體相關蛋白質第1型（LRP-1)、LRP-1 b及LRP-2/megalin(見 Strickland 等人於 2002 年期刊 ”77?£7νΐ^ £Wocrz>io/. ά Λ/e—·”第13期第66-74頁乙文）。例如在Strickland等人於 2002年期刊 ”77^£7νΖλ9 ά Meiaft.” 第 13 期第 66-74頁乙文中，其揭露内容在此併入本案以為參考資料， 提供與受體家族成員結合之數種配位子。在一些情況下， 一種LDLR或LDLR家族成員之一配位子，可與LDLR家族的 多個成員結合。因此，如用於此之“LDLR配位子’’一詞係指 可與LDLR及/或LDLR受體家族的一或多個成員結合之一 配位子。 7 200930405 一種特佳的配位子家族包括具有載脂蛋白B (apoB， Spencer與Verma於2007年期刊”/Voc. Wi/. νΐαί/. ί/似” 第104期第7594-7599頁乙文）或載脂蛋白Ε (apoE，Lalazar 等人於1988年期刊V. 5幻/. CTiem·，，第263期第3542-3545頁 5 乙文）的LDLR結合領域之肽’其等為名義LDL受體配位 子。已經確認出apoE的三種主要的同型體，包括ap〇E2、 apoE3及apoE4 ’及多種apoE變異體已被提出（如見，de Knij ff 等人於1994年期刊”第4期第178-194頁乙文）。 apoB的LDLR結合領域為：
1〇 SSVIDALQYKLEGTTRLTRKRGLKLATALSLSNKFVE GS ;序列辨識編號：1。 apoE的LDLR結合領域為： EELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQK;序列辨識編 號·· 2。
15 干擾RNA分子可直接或經由一間隔區而與apoB或apoE LDLR結合領域共價鍵接，間隔區諸如具有1、2、3或4個甘 胺酸之一種甘胺酸間隔區。甘胺酸間隔區較佳具有2或3個 甘胺酸。 可與LDLR或LDLR家族成員專一性結合之配位子的其 20 他實例，包括可與LDLR或LDLR家族成員結合之抗體或抗 體片段。該等抗體或抗體片段可與LDLR或LDLR家族成員 結合，及為名義受體配位子。當抗體與細胞表面上的LDLR 或LDLR家族成員結合之際，發生該抗體與所連接的干擾 RNA傳送進入細胞内之作用。可藉由用於將抗體接合至干 200930405 擾RNA之任一可接受的方式，而連接該干擾^^八，藉此干 擾RNA可以藥學活性形式傳送通過細胞膜。在一個較佳實 施例中’具LDLR專一性的—抗體或抗體片段與干擾RNA形 成一綴合物。 5 ❹ 10 15 參 在其他實施例中’與LDLR或LDLR家族成員結合之一 抗體或抗體片段’與一種亦與LDLR反應的第二配位子接合 在一起，而形成一種融合蛋白。該第二配位子可為一種第 一抗體，或者較佳為一種名義配位子諸如ap〇B或apoE或其 LDLR結合片段。反之’融合蛋白的該二配位子可為二種名 義配位子或其LDLR結合片段。相較於僅具有·~~個配位子之 綴合物，該等融合蛋白具有與眼細胞相互作用的能力加倍 之優點。 適用於本發明中之抗體，可與一眼細胞上的LDL受體 或LDLR家族成員反應。抗體一詞係意欲涵蓋多株與單株抗 體。抗體一詞亦意欲涵蓋可與LDL受體或LDLR家族成員反 應之一種以上的抗體之混合物（如可與LDLR反應之不同類 型單株抗體之雞尾酒），其中各者皆與一干擾RNA接合形成 一綴合物。抗體一詞進一步意欲涵蓋完整抗體、其具生物 功能的片段、完全人化抗體及包括來自一種以上的物種之 部份、雙功能抗體等之嵌合抗體。可使用之具生物功能的 抗體片段，係可讓抗體片段與LDLR或LDLR家族成員的結 合作用發生之該等片段。與LDLR結合及被細胞内化之一抗 體實例為IgG-C7(Beisiegel等人於1981年期刊V· βζ·ο· CT^m”第 256期第 11923-11931 頁乙文）。 20 200930405 可使用化學共扼綴合技術，將干擾⑽八與一配位子鍵 接。除了共價鍵結之外，可使用諸如該等與雙功能抗體所 形成之非共價鍵、離子鍵、氫鍵、疏水性相互作用等而形 成綴合物。 5 在特疋實施例中，本發明的干擾RNA-配位子綴合物可 進步包括與配位子共價鍵接的_種核酸結合蛋白，諸如 精蛋白。例如，該綴合物的配位子可包括一種叩〇8肽_精蛋 白融a蛋白、一種叩〇£肽_精蛋白融合蛋白或一種具^^^尺 專-性的抗體-精蛋白融合蛋白。抗體_精蛋白融合蛋白曾用 1〇於輸送SiRNA至經HIV感染或經外套膜轉染的細胞(Song等 人於2005年期刊所oiec/mo/，，第23期第709-717頁乙 文）。干擾RNA分子可經由與核酸結合蛋白的相互作用，而 與配位子鍵接。 在其他實施例中，本發明的干位子綴合物之 15配位子，係與一種聚陽離子諸如聚離胺酸共價鍵接。例如， 該綴合物可包括與聚離胺酸或另一種聚陽離子融合之一種 apoB或apoE肽’或者與聚離胺酸或另一種聚陽離子諸如聚 精胺酸或聚乙烯亞胺(PEI)融合之一種具LDLR專一性的抗 體。用於製備與使用運鐵蛋白·聚離胺酸_DNA綴合物輸送 20核酸至多種培養的哺乳動物細胞及長有腫瘤的小鼠之方法 已被提出（如Qian等人於2002年期刊’’PAarmaco/ 第54 期第561-587頁乙文中所綜合評論)。干擾RNA分子可經由與 聚陽離子的相互作用，而與配位子鍵接。 在特定實施例中，干擾RNA分子經由一種完全由精胺 200930405 5 ❹ 10 15 ❷ 20 酸組成的肽(在此稱作一種“精胺酸肽”），而與配位子鍵接。 該精胺酸肽較佳具有7、8、9、10或11個精胺酸。精胺酸肽 可經由一個具有丨至4個甘胺酸的甘胺酸間隔區，與一配位 子諸如一種ap〇E或ap〇B肽的LDLR結合領域之C-或N-端鍵 接。該甘胺酸間隔區較佳具有2或3個甘胺酸。 在一實施例中，精胺酸肽係一種9x精胺酸肽。如用於 此之“9x精胺酸肽，，一詞係指具有9個精胺酸殘基之一肽 (RRRRRRRRR ;序列辨識編號：3)。在一實施例中，該9χ 精胺酸肽包括D-異構物或由其組成。帶負電荷的干擾rnA 刀子可與帶正電荷的9χ精胺酸肽結合，如Kumar等人所述， 其最近證明精胺酸肽可用於將干擾RNA分子鍵接至一種 狂犬病病毒醣蛋白（RVG)標把肽的C-端，以輸送通過血腦障 壁（Kumar等人於2〇〇7年6月17日於期刊”A^wre，，，付梓中）。 在特定實施例中，在一種TAT_HA2肽、一種配位子_HA2肽 或一種逆-反轉型ver>so)TAT_HA2肽（亦即反轉序列 由D-胺基酸構成）的存在下，將一種干擾RNA_配位子綴合 物投藥至一病患或一細胞中，其顯示可增進自核内體釋出 肽/蛋白質綴合物之作用（Wadia等人於2004年期刊” MecT第10期第31〇頁乙文）。“HA2肽”一詞係指一種包括流 行性感冒病毒血球凝集素蛋白質的N_端2〇個胺基酸之肽。 原有的HA2肽為： GLFGAIAGFIENGWEGMIDG ;序列辨識編號：4。 原有的HA2肽較佳包括l-異構物。 逆-反轉型HA2肽為： 11 200930405 GDtltMtGE^GNtEYFtGAtltAfGFVG ;序列辨識編 號：5。 D -異構物係由位於單一字母代號右側的上標短劍符號 Λ所標示；因此’ D1·代表D-天冬胺酸而U代表D-白胺酸。 5 ΗΑ2之存在有助於干擾RNA輸送系統自核内體釋出至 細胞溶質中之作用，藉此干擾RNA分子可減弱一細胞中之 一標的mRNA的表現。在其他的一些實施例中，在ldlr配 位子與9x精胺酸之間插入一個HA2肽，其中HA2肽係經由 一個甘胺酸間隔區而與配位子及9x精胺酸鍵接。例如，一 © 10 種配位子HA2缀合物可包括下列肽： 配位子-GGGDWGEtwtGNtEtfFtGAtfAtGFVGG GWWWRUt ;序列辨識編號：6。 在特定實施例中，該LDLR配位子-9x精胺酸肽係在與 干擾RNA分子共軛綴合之前，以一種單一肽的形式製成。 15 在其他實施例中，在配位子與肽可彼此連接之條件下，藉 由將LDLR配位子與9x精胺酸肽混合而製出LDLR配位子 -9x精胺酸肽。用於鍵接二種肽之方法係技藝中所熟知者。 〇 在又一其他實施例中，該9x精胺酸肽可與干擾rnA分子預 先混合，然後再與LDLR配位子鍵接’以利於在該肽的知 20精胺酸端與干擾RNA結合。因此，干擾rna分子的鍵接作 用’可在LDLR配位子與9x精胺酸鍵接之前或之後完成。 在特定實施例中’本發明提供在一病患眼中減弱一標 的mRNA表現作用之一種方法，其包括（a)提供一種干擾 RNA_配位子綴合物，其中該綴合物與一種低密度脂蛋白受 12 200930405 體(LDLR)結合；及⑻將該綴合物投藥至病患眼中，其中該 干擾RNA分子可減弱眼中之標的mRNA的表現作用。 在特定實施例中，本發明提供預防或治療一病患眼疾 之一種方法’該方法包括對該病患投予一種干擾RNA-配位 5子綴合物，其中該綴合物與一種LDLR結合及將干擾RNA輸 送至病患的眼細胞中。 如用於此之“病患”一詞係指患有一眼疾或具有罹患一 眼疾風險之一人類或其他哺乳動物。與該等病症相關聯的 眼睛結構可包括例如眼、視網膜、脈絡膜、水晶體、角膜、 10小樑組織、虹膜、視神經、視神經頭、鞏膜、眼前段或眼 後段、或睫狀體。在特定實施例中，一病患罹患與小樑組 織(TM)細胞、睫狀體上皮細胞或眼睛的另一類型細胞相關 聯之一眼疾。 如用於此之“眼疾，，一詞包括與眼睛血管新生作用、乾 15眼、發炎性病況、高眼壓相關聯之病況，及與眼壓升高（IOP) 相關聯的眼疾諸如青光眼。 如用於此之“眼部血管新生，’一詞包括眼部前血管新生 病況與眼部血管新生病況，及例如包括眼部血管新生、眼 新血官生成、視網膜水腫、糖尿病性視網膜病、與視網 2〇膜缺血相_的續發症、目隨段新血管生成(PSNV)及新生 血e性月光眼。用於本發明方法中之干擾RNA適用於治療 例如患有眼部灰管新生、眼部新血管生成、視網膜水腫、 糖尿病性視網膜病、與視網膜缺血相關聯的續發症、眼後 •k新Jk g生成(PSNV)及新生血管性青光眼之病患，或具有 13 200930405 罹患該等病況的風險之病患。‘‘眼部新血管生成，，一詞包括 老年κ斑病變、白内障、急性缺血性視神經病變(ai〇n)、 視網膜震傷、視網膜剝離、視網膜撕裂或穿孔、醫源性視 網膜病及其他缺血性視網膜病或視神經病變、近視眼、視 5網膜色素病變及/或類似病症。 如用於此之“發炎性病況，，一詞包括諸如眼睛發炎與過 敏性結膜炎之病況。 本發明的方法適用於使用RNA干擾作用，以減弱特定 基因在病患眼中之表現。 10 RNA干擾作用（RNAi)係藉由雙股RNA(dsRNA)使得基 因表現沈默化之一作用。在不希望受限於理論之際，RNAi 從藉由一種身為RNaselll類型酵素之切割酵素(Dicer)，將較 長的dsRNA剪切成為小型干擾RNA(siRNA)開始。SiRNA 係長度通常約為19至28個核苷酸或20至25個核苷酸或21至 15 22個核苷酸之dsRNA，及通常含有具2個核苷酸的3,突出
端，及5'磷酸鹽端與3'羥基端。siRNA的一股被納入一種稱 作RNA誘導型沉默複合體(RISC)之核糖核蛋白複合體。 RISC使用該siRNA股以識別出與所納入的siRNA股至少部 份互補之mRNA分子，然後將該等標的mRNA剪切或抑制其 20 等的轉譯作用。因此，被納入RISC中的siRNA股被稱作引 導股或反訊息股。從siRNA中除去被稱作過客(passenger) 股或訊息股之另一siRNA股，及該另一siRNA股與該標的 m RN A至少部份同源。該等嫻熟技藝者將原則上瞭解s i RN A 的任一股均可被納入RISC及作用為一引導股。然而，siRNA 200930405 之設計（如在所欲的引導股5’端之siRNA雙鏈的安定性較低) 有利於將所欲的引導股納入RISC中。 5 Ο 10 15 ❹ 20 在反訊息股被納入RISC之情況下，siRNA的反訊息股 係siRNA的活性引導劑，因此容許siRNA識別出與該反訊息 siRNA股至少部份互補之標的mRNA，以進行剪切作用或轉 譯抑制作用。對於其序列與引導股至少部份互補的mRNA 之經RISC媒介的剪切作用，導致mRNA及該mRNA所編碼 的對應蛋白質之穩定狀態水平的降低。任擇地，RISC亦可 經由轉譯抑制作用降低對應蛋白質的表現，而毋需進行標 的mRNA之剪切作用。 干擾RNA似乎以催化方式作用於標的mRNA之剪切作 用，亦即干擾RNA的量即使不足化學計算量，亦可達成標 的mRNA之抑制作用。相較於反訊息療法，在該等剪切條 件下’僅需要顯著較少的干擾RNA即能提供一治療效應。 在特定實施例中，本發明提供輸送干擾RNA之方法， 以抑制一標的mRNA的表現作用，及因此降低在罹患眼疾 病患中之標的mRNA水平。 如用於此之有關一基因或一 mRNA之“減弱表現作用” 一詞’係指投予或運送一量的干擾RNA(如一種siRNA)，以 經由mRNA剪切作用或經由直接抑制轉譯作用，而降低一 標的mRNA轉譯成為蛋白質之作用。如用於此之“抑制，’、“沈 默化”及“減弱，，等詞，係指一標的爪尺^^或對應蛋白質的表 現作用之可測量的降低程度，相較於該標的mRNA或對應 蛋白質在本發明的干擾RNA不存在下之表現作用而言。標 15 200930405 的mRNA或對應蛋白質的表現作用之降低一般稱作，，抑制作 用”，及射目對純予或料-辦標定制·να(如— 種非標定對照組siRNA)後所呈現的水平而報導之。此述實 施例所預期的表現作用抑制量係包括與介於5〇%與1〇〇%之 5間。然而，就本發明的目的而言，達成該抑制水平並非必 要。 抑制作用之評估一般藉由使用定量式聚合酶鏈反應 (qPCR)擴增作而測量mRNA水平，或藉由西方墨點法或酵 素結合免疫吸附分析(ELISA)而測量蛋白質水平。蛋白質水 〇 10平之分析可同時提供關於mRNA剪切作用以及轉譯抑制作 用之sf估。用於測量抑制作用之其他技術包括^^^溶液雜 父作用、核酸酶保護作用、北方雜交作用、以微陣列監控 基因表現、抗體結合作用、放射免疫分析及螢光活化細胞 分析。 15 可藉由觀察人類或其他哺乳動物的眼疾癥狀之改善， 而推斷本發明的一種干擾RNA分子減弱一標的基因表現之 作用。 在一實施例中，輸送一種單一干擾RNA，以降低標的 mRNA水平。在其他實施例中，投予二或多種標定 20 之干擾RNA，以降低標的mRNA水平。干擾RNAs可在相同 的干擾RNA分子-配位子綴合物中或在不同的綴合物中輸 送。 如用於此之“干擾RNA”與“干擾RNA分子’，等詞，係指 可與RISC相互作用及參與RISC媒介的基因表現作用改變 16 200930405 5 10 15 20 之所有RNA或RNA型分子。可與RISC相互作用之其他干擾 RNA分子實例，包括短髮夾型RNA(shRNAs)、單股 siRNAs、微RNA(miRNAs)及切割酵素(Dicer)-受質27員型雙 鏈。可與RISC相互作用之“RNA類型”分子之實例，包括含 有一或多種經化學修飾的核苷酸、一或多種非核苷酸、— 或多種去氧核糖核苷酸及/或一或多種非填酸二酯鍵接之 siRNA、單股siRNA、微RNA及shRNA分子。因此，SiRNA、 單股siRNA、shRNAs、miRNA及切割酵素(Dicer)-受質27員 型雙鏈係屬於“干擾RNA”或“干擾RNA分子，，之子集。 如用於此之“siRNA” 一詞係指一種雙股干擾RNA，除非 另外說明之。典型地，用於本發明方法中之siRNA係一種包 括二個核苷酸股之雙股核酸分子，各股具有約19至約28個 核苷酸（亦即約 19、20、21、22、23、24、25、26、27或28 個核苷酸）。典型地，用於本發明方法中之干擾RNA具有約 19至49個核苷酸之長度。用於雙股干擾11]^八之“具有19至49 個核苷酸之長度”一詞，係指反訊息與訊息股獨立地具有約 19至約49個核苷酸之長度，包括其中訊息與反訊息股係藉 由一連接子分子連接之干擾rNA分子。 已發現單股干擾RNA可達成mRNA沈默化作用，雖然 效率低於雙股RNA。因此，本發明的實施例亦提供一種單 股干擾RNA’以供投藥之用。與上述的雙股干擾RNA相同， 單股干擾RNA具有約19至49個核苷酸之長度。單股干擾 RNA具有一個5’磷酸鹽，或在原位或活體内在5，位置被磷酸 化。所用之”5’麟酸化，，一詞係指例如聚核苷酸或寡核苷酸， 17 200930405 其具有經由醋鍵結而與聚核苦酸或募核皆酸5，端之糖(如核 糖、去氧核糖或其類似物）的C5羥基連接之—磷酸鹽基。 單股干擾RNA可藉由化學方式合成，或藉由試管中的 轉錄作用或自此述有關雙股干擾RNA的載體或表現組合體 5之内源性表現作用而合成。可經由一激酶而附加5,磷酸鹽 基，或者5'磷酸鹽可為一RNA經核酸酶剪切之結果。髮夾 型干擾RNA是-種單分子(如一種單一的寡核皆酸鏈)，其同 時包括具莖環或髮夾型結構之干擾RNA(如-種shRNA)的 ail息與反訊息股。例如，shRNA可自DNA載體表現，其中 ® 10編碼一訊息干擾RNA股之DNA募核苷酸，係藉由一個短間 隔區而與編碼反向互補的反訊息干擾RNA股之DNA寡核苷 酸鍵接。視所選擇的表現載體之需要，可附加3，端胸腺嘧啶 及核苷酸所形成的限制酶位點。所產生的RNA轉錄本自我 - 折疊形成一個莖環結構。 15 藉由附加、刪除、取代或修飾一或多種核苷酸，可使 得干擾RNA不同於天然存在的RNA。可在干擾RNA的5， 端、3'端或内部連接非核苷酸物質。該修飾作用之設計一般 〇 係為了增加干擾RNA的核酸酶抗性、增進細胞攝取作用、 增進細胞標定作用、協助追蹤干擾rNA、進一步增進安定 20性或降低活化干擾素途徑之可能性。例如，干擾RNA可在 突出端的終端包括一個嘌呤核苷酸。例如，藉由一個吡咯 炫連接子之方式，將膽固醇共轆綴合在一種siRNA分子的訊 息版3端之作用，亦提供siRNA之安定性。 其他的修飾作用例如包括一種3,端的生物素分子、一種 18 200930405 已知具有W胞穿透性質之肽―種奈米粒子、一種擬肽物、 種螢光染料鸯光染料或一種樹枝狀聚合物。 «酸可在料的驗基部份 5 ❹ 10 15 ❹ 、其等的糖部份或該分子 的璃aUf”被修飾，及於本發明的實施例中發揮功用。 修飾作用例如包括燒基、院氧基、胺基、去氮基、鹵代基、 經基硫代基或其組合之取代作用。可以安定性更高的類 似物取代核’諸如以去氧核糖核普酸取代核糖核酸， 或進盯糖修部作用，諸如以2,胺基、2,氧·甲基、2,甲氧基乙 基或一個2’-氧、4,_碳亞曱基橋接取代2,羥基。核苷酸的嘌 呤或'«類似物之實例包括—種黃封、一種次黃嗓吟、 一種氮雜°票吟、一種甲基硫代腺嘌呤、一種7-脫氮-腺嘌呤 核苦及經氧與氮修飾的核苷酸。可藉由以氮或硫(硫代磷酸 鹽）取代碟酸鹽基的一或多個氧，而修飾核苷酸的磷酸鹽 基。修飾作用適用於例如增進功能、增進安定性或滲透性 或者引導定位作用或標定作用。 在特定實施例中，本發明的一種干擾分子包括至少一 種上述修飾作用。 如用於此之“標的序列，，與“標的mRNA”等詞，係指用於 本發明方法中之干擾RNA可辨識之mRNA或mRNA序列部 份’藉此如在此所述者，該干擾RNA可使該基因表現沈默 化。下列文獻提供用於篩選siRNA標的序列之技術，例如 Tuschl，T.等人於2004年5月6日修訂之”siRNA使用者指 南’可自洛克非勒大學(Rockefeller University)網站取得； 女畢昂（Ambion)網站之技術通報（Technical Bulletin) 20 200930405 #506 ’安畢昂（Ambion)股份有限公司之”siRNA設計指南”； 及其他網路上的設計工具例如英傑（Invitr〇gen)公司、達瑪 坎（Dharmacon)公司、整合 DNA 科技（Integrated DNA Technologies)公司、基因錄本（Genscript)公司或普利構 5 (ProHg〇)公司網站。最初的搜尋參數可包括G/C含量介於 35%與55%之間及siRNA長度介於19與27個核苷酸之間。標 的序列可位於mRNA的編碼區域或位於5,或3,的未轉譯區 域。標的序列可用於衍生諸如此述之該等干擾^^八分子。 使用諸如上述可取得之設計工具，篩選位於一標的 10 mRNA序列内之干擾RNA標的序列（如siRNA標的序列）。然 後藉由對於表現該標的mRNA之細胞的轉染作用，接著如 此述地評估抑制作用，而在試管中測試對應一標的序列之 干擾RNA。如在此所述者，可使用動物模式，在活體内進 一步評估該干擾RNA。 15 可如下在試管中評估干擾RNA在例如希拉(HeLa)細胞 中抑制内源性標的基因表現水平之能力。在轉染作用24小 時前，將希拉(HeLa)細胞植入標準生長基質（如添加1〇%胎 牛血清之DMEM)。例如使用Dharmafect第1型（美國科羅拉 多州拉法葉(Lafayette)之達瑪坎(Dharmacon)公司），進行轉 2〇染作用，依據廠商說明書，干擾RNA的漢度係介於〇.1 nM 至100 nM。分別使用SiCONTROLTM非標定siRNA #1與 siCONTROL™環親和素B siRNA(達瑪坎(Dharmac〇n)公司） 作為負與正對照組。藉由使用較佳與標的位址重疊之例如 TAQMAN®基因表現分析（美國加州福斯特市(p〇ster⑶丫） 200930405 5 ❺ 10 15 ❹ 20 之應用生物系統(Applied Biosystems)公司）之qPCR 24小時 後轉染作用，分析標的mRNA水平與環親和素(cycl〇philin) B mRNA(PPIB’NM_000942)水平。當轉染作用效率為100% 時，正對照組siRNA實質上完全抑制環親和素B mRNA。因 此，參照經環親和素B siRNA轉染的細胞中之環親和素B mRNA水平，以轉染作用效率校正標的111111^八抑制作用。在 轉染作用後約72小時’可藉由例如西方墨點法分析標的蛋 白質水平（實際時間將依蛋白質轉換率而定）。用於自培養細 胞中分離RNA及/或蛋白質之標準技術’係該等嫻熟技藝者 所熟知。為減少非專一性脱靶效應之機率，干擾!^^八係以 產生所欲標的基因表現的抑制水平之最低可能濃度使用。 可使用人類角膜上皮細胞或人類的其他眼細胞株，以評估 干擾RNA抑制一内源性標的基因水平之能力。 已知可用於測試干擾RNA分子活性之數種動物模式。 例如可在雷射誘發鼠脈絡膜新血管生成作用（CNV)之模式 中’測試siRNA分子，如述於Reich等人於2〇〇3年期刊” FWo”“第9期第210-216頁乙文；Shen等人於2006年期 刊77^叩/‘第13期第225_234頁乙文；或Bora等人於 2006年期刊”乂 第 177期第 1872-1878頁乙文。 在特定實施例中，干擾RNA分子-配位子綴合物包括一 種干擾RNA分子，其標定與一眼疾相關聯的一基因。本發 明的干擾RNA所設計標定之mRNA標的基因實例，包括與 影響視網膜的病症相關聯之基因、與青光眼相關聯之基因 及與眼睛發炎相關聯之基因。 21 200930405 標定與視網膜病症相關聯的基因之mRNA實例包括 内皮酪胺酸激酶(TEK);補體因子B(CFB);缺氧誘導因子 第1型之α次單元（HIF1A) ; HtrA絲胺酸肽酶第1型 (HTRA1);血小板源生長因子受體β (PDGFRB);化學趨素、 5 CXC要素受體第4型(CXCR4);類胰島素生長因子第〖型受體 (IGF1R);血管生成素第2型（ANGPT2) ; ν-fosFBJ鼠科骨肉 瘤病毒致癌基因同源物(FOS);組織蛋白酶L1轉錄變異體第 1型（CTSL1);組織蛋白酶L1轉錄變異體第2型（CTSL2);細 胞内黏著分子第1型（ICAM1);類胰島素生長因子第I型 ⑩ 10 (IGF1);整合子a5(lTGA5);整合子βΙ(ΠΌΒΙ);核因子K-B 之次單元第1型（NFKB1);核因子κ-Β之次單元第2型 (NFKB2);化學趨素、CXC要素配位子第12型（CXCL12); 腫瘤壞死因子-a-轉換酵素(TACE);腫瘤壞死因子受體第1 型（TNFR1);血管内皮生長因子(VEGF);血管内皮生長因 15子受體第1型(VEGFR1);及激酶插入領域受體(KDR)。 與青光眼相關聯之標的基因實例包括碳酸酐酶第II型 (CA2);碳酸酐酶第IVs(CA4);碳酸酐酶第χπ型（CA12) ; ® βΐ腎上腺性受體(ADBR1) ; β2腎上腺性受體(ADBR2);乙 醯膽鹼酯酶(ACHE) ; Na+/K+-腺苷三磷酸酶；溶質載劑家 20族第12型（鈉/钟/氣化物輸送子）第1成員（SLC12A1);溶質載 劑家族第12型（納/鉀/氣化物輸送子）第2成員（SLC12A2);結 締組織生長因子(CTGF);血清澂粉樣蛋白A(SAA);分泌型 捲曲相關蛋白第1型（sFRPl) ; gremlin(GREMl);賴胺醯氧 化S#(LOX) ; c-Maf ; rho相關性含捲曲螺旋蛋白質激酶第1 22 200930405 型（ROCK1) ; rho相關性含捲曲螺旋蛋白質激酶第2型 (ROCK2);纖維蛋白溶酶原抑制劑第丨型^八^丨）；内皮分 化、神經鞘脂質G-蛋白質偶合受體第3型（Edg3 R);肌纖蛋 白（MYOC) ; NADPH氧化酶第4型(n〇X4);蛋白質激酶Cs 5 Ο 10 15 ❿ 20 (PKC5)，水通道蛋白第i型（AQP1);水通道蛋白第4型 (AQP4);補體級聯系統之成員；腺苷三磷酸酶、H+輸送性、 溶酶體VI次單元A (ATP6V1A);縫隙連接蛋白質α] (GJA1);曱醯基肽受體第丨型^卩幻）；類甲醯基肽受體第i 型（FPRL1);介白素第iSQLw ;核因子κΒ次單元第1型 (NFKB1);核因子Κ_Β次單元第2型（NFKB2);早衰素 (presenilin)第1型（PSEN1);腫瘤壞死因子α_轉換酵素 (TACE) ’轉型生長因子p2(TGFB2);瞬時受體電位陽離子 通道亞家族V第1成員（TRpvi);氣化物通道第3型 (CLCN3)，縫隙連接蛋白質a5 (GjA5);腫瘤壞死因子受醴 第1型（TNFR1);及類幾丁質酶3第2型(CHI3L2)。 與眼睛發炎相關聯imRNA標的基因實例包括腫瘤 壞死因子受體超級家族第1A成員（TNFRSF1A);具cAMP專 一性的磷酸二酯酶4D(PDE4D);組織胺受體Hl(HRHl);脾 臟酪胺酸激酶(SYK);介白素lp(ILlB);核因子κ-Β次單元 第1型(NFKB1);核因子K_B次單元第2型（NFKB2);及腫瘤 壞死因子α-轉換酵素(TACE)。 該等標的基因例如述於具有下列公開案編號之美國專 利申請案：第20060166919號、第20060172961號、第 20060172963號、第 2〇_172965號、第 20_223773號、第 23 200930405 20070149473號及第20070155690，其揭露内容在此完整地 併入本案以為參考資料。 在其他實施例中，輸送干擾RNA分子之方法包括對病 患投予一種奈米粒子·配位子綴合物，其中該干擾RNA分子 5 係包封於奈米粒子中，及該奈米粒子係鍵接至一個可與 LDL受體(LDLR)結合之配位子，該綴合物可將干擾RNa分 子輸送至病患的眼細胞中。本發明的其他實施例提供一種 預防或治療一眼疾之方法，該方法包括使用一種奈米粒子_ 配位子綴合物’將一種干擾RNA分子輸送至病患眼中。用 10 於製備奈米粒子之方法及其等在輸送藥學劑方面的用途已 述於第6,632,671鲜美國專利，其揭露内容在此完整地併入 本案以為參考資料。用於製備奈米粒子_配位子綴合物之方 法及其等在輸送藥學劑方面的用途已述於第6,372,250號美 國專利，其揭露内容在此完整地併入本案以為參考資料。 15 本發明之干擾RNA-配位子綴合物與奈米粒子-配位子 缀合物可藉由下列方式投藥：眼内注射、眼睛局部施用、 靜脈注射、口服投藥、肌内注射、腹膜内注射、經皮施用 或經黏膜施用。綴合物的投藥劑型（如膠囊，錠劑，溶液， 乳化液)與濃度，至少部份依投藥途徑而定。 20 在特定實施例中’治療一眼疾之方法係涉及與TM細 胞、睫狀體上皮細胞或眼睛的另一類型細胞相關聯之一眼 疾。 在特定實施例中，本發明提供一種用於預防或治療一 病患眼疾之眼用藥學組成物，其包括位於眼科可接受的載 24 200930405 劑中之一治療有效量的本發明之一種干擾RNA-配位子綴 合物或奈米粒子-配位子綴合物。 藥學組成物係該等配方，其包括至多99重量％之本發 明的干擾RNA或其鹽類，及與一種包括以下所述諸如水， 5 緩衝液，鹽水，甘胺酸，透明質酸，甘露醇等之生理上可 接受的載劑基質混合。 本發明之干擾RNA-配位子綴合物及奈米粒子-配位子 綴合物係以溶液、懸浮液或乳化液形式投藥。下列的藥學 組成物配方實例可用於本發明方法中。 干擾RNA 以重量％為單位之量 至多 99 ; 0.1-99 ; 0.1-50 ; 0.5-10.0 羥基丙基甲基纖維素 0.5 氣化鈉 0.8 氣化苯甲烴銨 0.01 EDTA 0.01 氫氧化鈉/氫氯酸 調整至pH 7.4 經純化的水（無RNase) 調整至100毫升 Ο 10 以重量％為單位之量 干擾RNA 至多 99; 0.1-99; 0.1-50 ;0·5-10·0 經磷酸鹽緩衝的鹽水 1.0 氣化苯曱烴銨 0.01 聚山梨酸酯80 0.5 經純化的水（無RNase) 調整至100% 25 200930405 以重量％為單位之量 干擾RNA 至多 99;0·1-99;0.1-50;0·5-10.0 麟酸二氫納 0.05 磷酸二鈉（無水） 0.15 氣化鈉 0.75 乙二胺四乙基二鈉 0.05 氫化蓖麻油聚氧乙烯 0.1 (Cremophor EL) 氯化苯曱烴銨 0.01 氫氯酸及/或氫氧化納 pH 7.3-7.4 經純化的水（無RNase) 調整至100% 以重量％為單位之量 干擾RNA 至多 99 ; 0.1-99 ; 0.1-50 ; 0.5-10.0 經磷酸鹽緩衝的鹽水 1.0 翻·基丙基-β-環糊精 4.0 經純化的水（無RNase) 調整至100% 如用於此之“治療有效量”一詞係指所測得之干擾RNA 或一種含有干擾RNA的藥學組成物之量，其可在一哺乳動 物中產生一治療反應。即可由一般熟悉技藝者使用此述之 5 方法，確定該治療有效量。 一般而言，用於本發明的組成物中之一治療有效量的 干擾RNA，在標的細胞表面所產生之細胞外濃度係自100 pM至1 μΜ，或自1 nM至100 nM，或自5 nM至約50 nM，或 約25 nM。達到該局部濃度所需之劑量將依數種因素而異， 10 包括輸送方法、輸送位址、介於輸送位址與標的細胞或組 26 200930405 5 Ο 10 15 ⑩ 20 織之間的細胞層數、輸送作用屬於局部或全身性等。輸送 位址的濃度可能顯著高於標的細胞或組織表面的濃度。依 據-嫻熟的臨床醫師之例行判斷，可—天⑴次，或以較 長的輸送時程諸如每日、每週、二週一次、每月或更久， 將局部組成物輸送至標的器官諸如眼的表面。配方的酸鹼 值約為pH 4.0至約pH 9.0 ’或約為pH 4.5至約pH 7.4。 一配方之治療有效量可能依數種因素而定，諸如個體 的年齡、種族及性別；眼疾的嚴重程度；標的基因轉錄本/ 蛋白質轉換率；干擾RNA的效力及干擾RNA的安定性。在 一實施例中，干擾RNA係局部輸送至一標的器官，及以一 治療劑量送達該含有標的111111^八的組織諸如小樑組織、視 網膜或視神經頭，藉此改善與標的基因相關聯的疾病過程。 以朝向對抗標的mRNAs之干擾RNA治療病患之方 式，因為可藉由增加作用期間而容許較不頻繁的給藥作 用，及藉由增加標的專一性而藉此降低副作用，故預期比 小型分子療法有利。 如用於此之“眼科可接受的載劑，，係指該等載劑，其至 多對眼睛引起微量刺激作用及依所需提供保存作用，及以 一均一劑量輸送本發明的一或多種干擾RNA。適用於本發 明實施例的干擾RNA投藥作用之一種可接受的載劑，包括 陽離子脂質式轉染試劑TransIT®-TKO (美國威斯康辛州邁 迪遜（Madison)之邁洛斯（Minis)公司）、LIPOFECTIN®、 Lipofectamine、OLIGOFECTAMINEtm (美國加州卡爾斯巴 德（Carlsbad)之英傑（Invitrogen)公司）或 DHARMAFECT™ 27 200930405 (美國科羅拉多州拉法葉（Lafayette)之達瑪坎(Dharmacon)公 司）；聚陽離子諸如聚乙烯亞胺；陽離子肽諸如Tat、聚精胺 酸或穿透素(Penetratin)(Antp肽）；奈米粒子；或脂質體。脂 質體係自標準囊形成脂質與一種固醇諸如膽固醇形成，及 5 可包括一種標定分子諸如對於細胞表面抗原具有結合親 和性之一種單株抗體。此外，該脂質體可為聚乙二醇化脂 質體。 ， 干擾RN A -配位子綴合物與奈米粒子-配位子綴合物 可於溶液、懸浮液或生物可降解性或非生物可降解性輸送 〇 1〇 裝置中輸送。 干擾RNA-配位子綴合物與奈米粒子-配位子綴合物可 經由例如氣霧劑、頰錠，皮膚、皮内、吸入、肌内、鼻内、 . 眼内、肺内、靜脈内、腹膜内、鼻、眼、口、耳、非經腸、 - 貼片、皮下、舌下、局部或經皮投藥作用輸送。 15 在特定實施例中，以干擾RNA分子治療眼疾之作用， 係藉由將一種干擾RNA-配位子綴合物或奈米粒子·配位子 綴合物直接投藥至眼睛而完成。鑑於下列數個原因，而以 ◎ 眼睛的局部投藥作用較為有利，包括：劑量可小於全身性 輸送作用所用之劑量，該分子將眼睛以外的組織中之基因 20 標的沈默化之機率較低。 數項研究已顯示成功與有效地在活體内將干擾rna分 子輸送至眼睛。例如Kim等人證實標定VEgf途徑基因之 siRNA的結膜下注射與全身性輸送作用，抑制一小鼠眼中的 血管新生作用（Kim等人於2004年期刊”叙 28 200930405 165期第2177-2185頁乙文）。此外，研究顯示輸送至玻璃體 腔的siRNA可擴散至全眼，及在注射5天之後還可偵測到 (Campochiaro於2006年期刊”77ier叩第 13期第 559- 562頁乙文）。 5 ❹ 10 15 20 干擾RNA-配位子綴合物與奈米粒子_配位子綴合物可 直接輸送至眼睛，例如藉由眼組織的注射作用，諸如眼周 圍、結膜、眼球囊下、眼房内、玻璃體内、眼内、近鞏膜 的前方或後方、視網膜下、結膜下、眼球後或淚小管内注 射作用；藉由使用導管或其他施用裝置而直接施用至眼 睛，諸如一種視網膜丸劑、眼内嵌入物、栓劑或一植入物 包括一種孔性、非孔性或膠質材質；藉由局部的眼用滴液 或油膏，或者藉由位於陷凹（cul_de_sac)或植入鞏膜附近(透 鞏膜）或鞏膜中（鞏膜内）或位於眼内之一種緩慢釋出裝置。 眼房内’主射作用可經由角膜進入前房，以容許該藥劑到達 小樑組織。淚小管内注射作用可進入施萊姆式（ScWemm) 官所排流之靜脈集流通道或進入施萊姆式（Schlemm)管中。 就眼部輸送作用而言，干擾]^^八_配位子綴合物與奈米 粒子-配位子綴合物可與可接受的防腐劑 '共_、表面活 性劑、增黏劑、滲透增進劑、緩衝液、氣化納或水混合， 以形成一種含水的無菌眼用懸浮液或溶液。可藉由將干擾 RNA-配位子綴合物或奈米粒子·配位子綴合物溶於一種生 理上可接受之等渗壓的含水緩衝液中，而製職溶液配 方。此外’該溶液可包括_種可接受的表面活性劑，以協 助溶解干·ΝΑ。可在本發明的組成物巾添加增黏劑，諸 29 200930405 如羥基甲基纖維素、羥基乙基纖維素、甲基纖維素、聚乙 烯基吡咯烷酮等，以增進該化合物的留存作用。 為製備一種無菌的眼用油膏配方，該干擾RNA-配位子 綴合物或奈米粒子-配位子綴合物與一種位於一適宜載劑 5諸如礦物油、液態羊毛脂或白礦脂中之防腐劑混合。依據 技藝中所知之方法，可藉由將干擾RNA-配位子綴合物或奈 米粒子-配位子綴合物懸浮於一種製備自例如 CARBOPOL®-940 (美國北卡羅萊納州夏洛特(charlotte)之 BF古利奇（BF Goodrich)公司）等的組合物之親水性基質 10 中，而製備無菌的眼用凝膠配方。例如，VISC0AT®(美國 德州福特沃斯（Fort Worth)之愛爾康實驗室（Alcon Laboratories)股份有限公司）可用於眼内注射。當干擾rnA 在眼中的滲透性較低的情況，本發明的其他組成物可含有 滲透增進劑，諸如鯨蠟硬脂醇醚與TWEEN® 80(聚氧乙烯脫 15 水山梨糖醇月桂酸酯，美國密蘇里州聖路易（St. Louis)之西 克瑪艾爾迪希(Sigma Aldrich)公司）。 在特定實施例中，本發明亦提供一套組，其包括用於 在一細胞中減弱此述之一 mRNA表現作用之試劑。該套組 含有一種干擾RNA分子_配位子綴合物及/或製造該干擾 20 RNA分子-配位子綴合物所需之組份（如一種干擾RNA分子 以及配位子與鍵接所需的物質）。該套組亦可含有正與負對 照組siRNAs或shRNA表現載體(如一種非標定對照組siRNA 或一種標定不相關的mRNA之siRNA)。該套組亦可含有用 於評估預期的標的基因抑制作用之試劑（如用於偵測標的 200930405 mRNA之定量式PCR的引子與探針及/或用於西方墨點法之
抗對應蛋白質的抗體）。任擇地，該套組可包括一種siRNA 序列或一種shRNA序列，及藉由試管中轉錄作用產生該 siRNA或建構shRNA表現載體所需之說明與物質。 5 進一步提供一種套組形式的藥學組合物，其以包裝組 合形式包括一個在其閉合外殼中可容納一容器構件之裝載 構件，及一個包含一種干擾RNA組成物與一種配位子之第 ^ 一容器構件。若為所欲者，該套組可進一步包括一或多種 不同的習知藥學套組組件，諸如裝有一或多種藥學上可接 10受的載劑之容器、附加容器等，其等為嫻熟技藝者即可明 ， 瞭的。顯示所投藥的組份量、投藥準則及/或混合組份準則 . 之置入或標示形式的印製說明書，亦可包括在套組中。 在此所引述的參考文獻，在其等提供例示性程序或其 他細節以補充此述說明之方面，特地併入本案以為參考資 15 料。 〇 依據本揭露内容，該等嫻熟技藝者將瞭解可對在此所 揭露的實施例進行顯而易見的修飾作用，而不偏離本發明 的精神與範圍。依據本揭露内容，毋需過度的實驗工作， =可進行與實施在此簡露的所有實施例。本發明的完整 2〇範圍係說明於揭露内容及其等效實施例中。說明書之闡 釋，不應不合理地縮小本發明應得之完整的保護範圍。 應瞭解前述揭露内容著重於本發明的-些特定實施 例，而其所有的修飾或任擇的等效部份，係屬於如所附申 睛專利範圍所說明之本發明的精神與範圍之内。 31 200930405 【圖式簡單說明3 (無） 【主要元件符號說明】 (無）
32

Claims (1)

  1. 200930405 七、申請專利範圍： 1· 一種干擾RNA分子-配位子綴合物於製造一試劑以供輸 送—干擾RNA分子至一病患眼中之用途，其中該配位子 可與低密度脂蛋白受體(LDLR)家族中的一受體結合。 5 2·如申請專利範圍第1項之用途，其中該配位子包括載脂 蛋白B (ap〇B)的LDLR結合領域。 3. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該配位子包括載脂 蛋白E (apoE)的LDLR結合領域。 4. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該配位子包括一 10 LDLR專一性抗體或其一片段。 . 5.如申請專利範圍第丨項之用途，其中該干擾RNa分子係 經由一核酸結合蛋白而與配位子鍵接。 6.如申請專利範圍第1項之用途，其中該干擾RNA分子係 經由一聚陽離子而與配位子鍵接。 15 7.如申請專利範圍第6項之用途，其中該聚陽離子為聚離 胺酸。 8.如申請專利範圍第1項之用途，其中該干擾RNA分子係 經由一7x精胺酸肽、8x精胺酸肽、9x精胺酸肽、1〇χ精胺 酸肽或llx精胺酸肽而與配位子鍵接。 20 9·如申請專利範圍第8項之用途，其中該干擾RNA分子係 經由一 9x精胺酸肽而與配位子鍵接。 10. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該綴合物包括一 HA2 肽。 11. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該綴合物係在一 33 200930405 HA2肽存在下，投藥至該病患。 12.如申請專利範圍第1項之用途，其中該干擾RNA分子係 與配位子共價鍵接。 13·如申請專利範圍第1項之用途，其中該綴合物之投藥係 5 藉由眼内注射、眼部局部施用、結膜下注射、玻璃體内 注射、近鞏膜的前方或後方注射、靜脈注射、口服投藥、 肌内注射、腹膜内注射、經皮施用、鼻内施用或經黏膜 施用。 14. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該干擾RNA分子係 © 10 — siRNA、miRNA 或 shRNA。 15. —種干擾RNA分子-配位子綴合物於製造一藥物以供 治療或預防一病患眼疾之用途，其中該配位子可與低密 度脂蛋白受體(LDLR)家族中的一成員結合，及其中該 干擾RNA分子可減弱與該眼疾相關聯的一基因之表 15 現。 16. 如申請專利範圍第15項之用途，其中該配位子包括載 脂蛋白B (apoB)的LDLR結合領域。 17·如申請專利範圍第15項之用途，其中該配位子包括載 脂蛋白E (apoE)的LDLR結合領域。 20 丨8·如申請專利範圍第15項之用途，其中該配位子包括一 LDLR專一性抗體或其一片段。 19. 如申請專利範圍第15項之用途，其中該干擾rna分子 係經由一核酸結合蛋白或一聚陽離子而與配位子鍵接。 20. 如申請專利範圍第15項之用途’其中該干擾rna分子 34 200930405 係經由一7χ精胺酸肽、8χ精胺酸肽、9x精胺酸肽、10x 精胺酸肽或llx精胺酸肽而與配位子鍵接。 21.如申請專利範圍第20項之用途，其中該干擾RNA分子 係經由一 9x精胺酸肽而與配位子鍵接。 5 22.如申請專利範圍第15項之用途，其中該綴合物之投藥 係藉由眼内注射、眼部局部施用、結膜下注射、玻璃體 内注射、近鞏膜的前方或後方注射、靜脈注射、口服投 藥、肌内注射、腹膜内注射、經皮施用、鼻内施用或經 黏膜施用。 10 23.如申請專利範圍第15項之用途，其中該綴合物包括一 HA2 肽。 24. 如申請專利範圍第15項之用途，其中該綴合物係在一 HA2肽存在下，投藥至該病患。 25. 如申請專利範圍第15項之用途，其中該眼疾係與眼睛 15 血管新生、乾眼、眼睛發炎性病況、高眼壓或青光眼相 關聯。。 26. 如申請專利範圍第15項之用途，其中該干擾RNA分子 係一 siRNA、miRNA 或 shRNA。 35 200930405 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（）圖。（無) (二) 本代表圖之元件符號簡單說明：
    五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無）
    2
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