TW200914608A - Demannosylated recombinant factor VIII for the treatment of patients with haemophilia A - Google Patents

Description

200914608 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域] 本發明係有關，於實質地益&、虎 I貝地無免疫原性或較低 被修飾的因子VI11。本發明f@ h 7 Γ生的 丰七月更有關於包括編碼被修飾的因 子VIII之DNA的核酸構築物，以及 伯主、、、田胞或生物體表 現與生產被修飾的因子VI Π的古、么士々 1U的方法。本發明亦有關於對個 體給予被修飾的因子νπι以治療出血疾病的方法。 f \ 【先前技術】 人類因子Vm:c(FVIII)為χ染色體關聯的出血疾病 a型血友病的凝結因子缺陷，受影響雄性的出血性發病率 與死亡率的主要來源。傳統上，血友病患被以全血輸送治 療。近來，治療被以衍生自人類血襞的因子νπι濃縮物製 劑進行。然而，源自血渡產物的使用將血友病患暴露於病 毒傳染疾病的可能風險下，例如肝炎與AIDs。用於降低此 風險的昂貴純化方案會增加治療成本。隨著成本增加以及 源自血漿的因子VIII的不易取得，患者依需要基礎被間斷 式/口療’而非預防性治療。重組地生產的因子!在純度 與安全性，以及所增加的可利用率相較於源自血毅的因子 VIII具有貫質的優點，因此更多的研究心力被導向重組地 生產的因子VIII的發展。由於因子VIII易變的本質，尤 其是其活性，不論是血漿或重組的’必須給予大量而重複 劑量的蛋白質以達到治療的效果。然而，病患暴露於因子 VIII蛋白質的劑量與抑制其活性之抗體的發展相關。依此 6023-9587-PF;Kai 5 200914608 已知的免疫原性’發展當作治療藥劑的因子VI11之新重組 升> 式的目的之一 ’就是降低或減少這類免疫反應之產品的 發展。因子V111在血液凝結作用的内部過程的作用為藉由 因子I Xa加速因子X的活化，在|丐離子存在下發生在帶負 電的罐脂（phospholipids)表面的反應。

因子V111分子被分為6個結構性的功能區塊：三重複 的A功能區塊（Al，A2，A3)、碳水化合物豐富且可分散的 中央功能區塊（B功能區塊），以及二重複的◦功能區塊（C1， C2)(參照第5圖）。因子VIII以重鏈（功能區塊A1_A2_B) 與輕鍵（功能區塊A3-C1-C2)異二聚體的形式被分泌至血 水其經由A1與A 3功能區塊之間的非共價鍵之二價金屬 離子連結。在血漿中，因子VIIII藉由與溫韋伯氏因子（v〇n Willebrand factor)結合而被穩定。更特別地，因子νηι 輕鏈係經由非共價交互作用與溫韋伯氏因子胺基端的初級 結合位置結合。在凝血酶（thr⑽bin)的蛋白水解活性下， 因子VIII被活化$ 2個重鏈片段（M，5QkDa片段，以及 A2’ 43kDa 片段），與輕鏈（A3 —C1—C2, 73kDa 鏈）。因子 νηι 的活性形式（mna)因此具有透過二價金屬離子鍵結與凝 血酶切割的A3-C卜C2輕鏈結合的A1次單位，以及經由離 子作用與A1功能區塊結合的游離A2次單位。此Fvma異 二聚體不穩定’在生理條件下經由A2次單位的分離迅速地 失去活性。因子vm分子具有25個保守序列 usn]xx-Thr/Ser)，允許N端的糖化作用，其中2〇個顯 示被聽化（1 )。 6023-9587-PF;Kai 6 200914608 因子V111蛋白質可功能性地被定義為在A型血友病影 響之患者的血漿能彌補凝集缺陷的因子。為了 A型血友病 的治療’因子V111從人類或豬的血漿中被純化，而近來以 重組DNA技術生產。例如，美國專利第4, 965, 1 99號揭露 在哺乳動物宿主細胞的醫療級因子V Π I重組製造的方 法。在中國倉鼠卵巢細胞（CH0)與幼倉鼠腎細胞（BHKC)表現 的人類因子V111亦已被報導，而且近來b功能區塊被刪除 的因子VI Π的效果在臨床實驗上也被示範（美國專利第 4, 868, 1 12號，引用文獻2)。 商業上可購得之治療用的因子V111產品包括，源自血 漿的因子VI11 (pdFVI 11)，以及重組因子vj丨丨（rFVI π )產 品’例如全長 rFVI II (Kogenate® Bayer，Advate® Baxter，

Helixate® CSL-Behring)，以及B功能區塊被刪除的 rFVIII(Refacto® Wyeth)。 然而，儘管醫療級因子VI11的可利用性，具有增加效 果的因子V111類似物之需求仍高。甚至，以有療效的因子 VIII(PdFVIII或rFVIII)治療A型血友病患，π至30%的 案例產生抗因子V111抗原（抑制劑）的出現，會中和治療所 給予的因子VI11的前凝集活性（3, 4)。抑制劑的發生被認 為反映對於外源性因子VI11蛋白質的重複給予的異體免 疫反應。有些血友病患對於外源性重組因子VI丨丨極端敏 感，因而發展限制其治療效果的抗因子V111抗體。因此， 因子VI11抑制劑的發展同時代表主要的醫療障礙以及關 鍵的社會考量’因為會產生因子VIII抑制劑的患者變成對 6023-9587-PF;Kai 7 200914608 •於傳統替代療法有抗性。因子VIII抑制劑發生不只造成治 療成本提高3倍⑸，也顯著地影響患者生活品f ’增加發 病率與死亡率。關於這一點，高度期望提供具有降低的或 對人體不會造成免疫反應的因子VI丨卜此外，高度期望提 供在人體内具有增加的循環時間的因子yi丨丨，對於慢性與 再發性的疾病有益’例如A型血友病。 因子VIII引起的專—性免疫反應的第一步被顯示為 經由抗原表現細胞（APC)的因子VI丨丨内噬作用。樹突細胞 (DC)被暗不為引導原生τ細胞與對應抗原_專一免疫反應 的啟動之最主要的APC(6, 7)。經由DC的抗原内噬作用通 常藉由巨胞飲作用或受體調節的内噬作用 (receptor-mediated endocytosis)進行。確實，DC 表面 呈現大量内噬作用的受體，大部分與二價離子，主要為鈣 的存在有關。許多内噬作用受體，依據其暴露的碳水化合 物區域（carbohydrate recognition domains, CRDs)的效 用，對抗原表現的糖類殘基專一（8)，並被稱為c型凝集素 受體（C type lectin receptors, CLRs)。在抗原的甘露醣 殘基可能因此被DC表面的一系列甘露醣敏感的cLRs所辨 識’包括甘露醣受體（mannose receptor(MR, CD206))、樹 突細胞專一性 ICAM3 凝集素（dendritic cell specific ICAM3 grabbing non-integrin(DC-SIGN， CD209))、多醣 受體（dectin)、以及DEC-205(CD205)。聚碳水化合物甘露 聚醣被顯示為這些甘露醣敏感CLRs的配體（1 igand)，尤其 是MR與DC-SIGN(9-11)。在DCs的DC-SIGN分子固定T細 6023-9587~PF;Kai 8 200914608 胞的I CAM-3。此專一性交互作用似乎在DCs與T細胞之間 的免疫學突觸扮演起始的主要角色。淋巴球的活化可能因 而以抗DC-SIGN的阻卻抗體而被抑制。 許多治療被.顯示降低後續的因.'子V111免疫反應.。例 如，使用類似因子V111合成激素的去氨加.壓素 (desmopressin)、凝血促進劑（例如凝血酶原複合體濃縮物 或活化的凝血酶原複合體濃縮物）、重組因子V11 a或灌注 因子V111的治療，以產生耐受性。 r.. ' ^ 最近的方法，抗獨特性（anti-idiotypic)抗體的使 用’該抗體會與其他抗體的變異區域交互作用，被發展用 來中和抑制劑抗體（1 2)。因此，直接對應抗因子v 111匸1 功此區塊的I gG4kappa單株人類抗體被分離，可阻卻因子 VIU的共同因子活性，及其與溫韋伯氏因子（v〇n Willebrand factor，VWF)的連結（13)。類似地，對應抗因 子VIII C2功能區塊的人類單株抗體B〇2CU(IgG4kappa) I 被分離（Μ)，其抑制因子VIII對於VWF與鱗脂的連結。這 個抗體因而完全地抑制原生與活化因子v丨丨丨的促凝血活 性。另一個單株抗體的例子為Β〇ΠΒ2，直接對應於因子 ΠΙΙ A2功能區塊，可阻卻因子yin 99%的活性。然而， 因子VI11誘導的免疫反應係為多重反應，使用直接對應於 抗因子VI Π抗體的抗獨特性抗體會僅部分地中和因子 VIII免疫反應。 申請人近來已示範在因子VIII之甘露醣結尾的醣化 作用調節經由未成热人類樹突細胞之因子VI〗〗的内化。這 6〇23-9587-PF;Kai 9 200914608 ,些結果顯示位於因子VI11甘露醣化的醣類與DCs甘露醣受 體之間相互作用的阻卻，降低因子VI〗丨的内化以及進一步 表現於因子viπ專一性的τ細胞。因子VIn免疫原性的 降低因此可以藉由降低其與甘露餹敏感受體的交互作用而 被達成。 申請人更驚訝地發現當被表現於DCs時，被修飾的因 子V111的活化T細胞能力實質地被降低或被廢除，導致有 機會對患者提供無免疫原性或較低免疫原性的治療用因子 VIII’其中一或多個選自天冬醯胺酸239與天冬醯胺酸 211 8的胺基酸被取代或刪除。 【發明内容】 本發明提供一種因子VI11蛋白質，包括被修飾的因子 Y111聚胜肽’其特徵在於該被修飾的因子V丨丨I聚胜肽與 具内噬作用細胞相互作用或被吞入的能力，相較於未被修 飾的因子V111聚胜肽係被降低或廢除。 於一特定實施例中，本發明提供一種被修飾的因子 V111聚胜肽，其與具内噬作用細胞之表面受體相互作用的 成力被降低或廢除，尤其是一種當表面受體為甘露醣敏感 叉體時，其能力被降低或廢除之被修飾的因子V〗丨丨聚胜 肽，更尤其是當表面受體係選自甘露醣受體（MR，CD206)、 樹突細胞專一性ICAM3凝集素（DC-SIGN，CD209)、多醣受 體（dectin)、以及DEC-205(CD205)所組成之群組。於一特 疋貫施例，具内噬作用細胞係為抗原表現細胞（ApCs),以 6023-9587-PF;Kai 10 200914608 .及，特別地，樹突細胞（Dendritic Cells)、巨噬細胞、内 皮細胞（endothelial ceiis)、或B淋巴球細胞。 於另一特定實施例，本發明提供一種被修飾的因子 VIII聚胜肽，其對人類的免疫原性實質地被降低或廢除。 於另一型態’本發明之被修飾的因子Vn I聚胜肤係實 貝地被去醣基化，更特別地，本發明之被修飾的因子v 111 聚胜肽係為實質地以末端甘露醣殘基去醣基化因子ν丨t J 聚胜肽封端的聚糖結構。 ρ;· 更特別地’本發明之被修飾的因子VI Π聚胜肽包括具 有保守序列Asn-Xxx-Thr/Ser之醣化作用保守區域至少一 個胺基酸的取代或刪除，其中，χχχ代表任何胺基酸。更 特別地’本發明之被修飾的因子V111聚胜肽包括選自SEQ ID Ν0 : 2提到的全長人類因子V Π I聚胜肽序列之天冬醯 胺酸2 3 9、天冬醯胺酸2118、絲胺酸2 41以及穌胺酸21 2 0 所組成的群組之至少一個胺基酸的取代或刪除。於一特定 實施例，天冬醯胺酸2 3 9係被選自丙胺酸、甘胺酸、絲胺 v 酸、麩胺酸、穌胺酸、天冬胺酸或麩胺酸所組成之群組的 胺基酸所取代。於另一特定實施例，天冬醯胺酸2118係被 選自丙胺酸、絲胺酸、麩胺酸、穌胺酸、天冬胺酸或麩胺 酸所組成之群組的胺基酸所取代。於另一實施例，天冬醯 胺酸239係被丙胺酸所取代’及/或天冬醯胺酸2118係被 丙胺酸所取代。於進一步的實施例’天冬醯胺酸2 3 9係被 麩胺酸所取代，及/或天冬醯胺酸2118係被麩胺酸所取 代。於另一實施例，天冬醯胺酸239係被丙胺酸所取代’ 6023-9587-PF;Kai 11 200914608 且天冬醯胺酸2118係被麩胺酸所取代。於另一實施例，天 冬醯胺酸239係被麩胺酸所取代’且天冬醯胺酸211 8係被 丙胺酸所取代。於另一特定實施例，本發明之被修飾的因 子VIII聚-胜肽包括以下至少一種：（i)SEQ ID N0: 6提出 的胺基酸序列；及/或（i i ) SEQ ID NO : 8提出的胺基酸序 列。於更特定實施例’本發明之被修飾的因子V111聚胜肽 包括以下至少一種（i)SEQ ID NO: 12提出的胺基酸序列； 及/或（ii)SEQ IDN0: 14·^出的胺基酸序列。於另一特定 實施例，本發明之被修飾的因子V111聚胜肽包括（丨）seq ID NO: 6之胺基酸序列；及（ii)SEQ ID NO: 14之胺基酸序列。 於更特定的實施例’本發明之被修飾的因子V Π I聚胜肽包 括：（i)SEQ ID N0: 12 之胺基酸序列；及（ii)sEQ id N0: 8之胺基酸序列。 於另一型態’本發明之被修飾的因子V π I聚胜肽係為 促凝血活性的因子VIII蛋白質。 於另一型態，本發明之被修飾的因子V〗丨丨聚胜肽更包 括SEQ ID NO : 1 0之B功能區塊之全部或部分的刪除。於 另一較佳貫施例，本發明之被修飾的因子V111聚胜肽僅部 分地刪除B功能區塊，以及，更佳地，本發明之被修飾的 因子V111聚胜肽仍具有B功能區塊至少前2 2 6個胺基酸 (參照 SEQ ID N0: 1〇)。 本發明之目的係提供一種編碼包括本發明之被修飾的 因子VIII聚胜肽之分離的核酸分子或被修飾之被分離的 核酸分子序列。於一特定實施例，編碼因子v丨丨丨蛋白質的 6023-9587-PF;Kai 12 200914608 核酸序列包括下列至少之一：（i)SEQ ID NO: 5之核酸序 列’及/或（ii)SEQ ID NO: 7之梭酸序列。於更特定的實 施例’編碼因子VIII蛋白質的核酸序列包括能在高度嚴苛 條件之下與以下至少一種雜交之分離的核酸分子（丨） ID N0: 5之核酸序列；及/或（ii)SEQ Ιί} N0: 7之核酸序 列。 於另一特定實施例，編碼因子VII〗蛋白質的核酸序列 包括以下至少一種（i)SEQ ID N0: 11之核酸序列；及/或 (1 OSEQ ID N0: 13之核酸序列。於更特定實施例，編碼 因子VIII蛋白質的核酸序列包括能在高度嚴苛條件之下 與下列至少一種雜交之分離的核酸分子：（丨）SEQ ID N⑺1丨 之核酸序列；及/或（ii)SEQ ID N〇: 13之核酸序列。 於另一特定實施例，編碼因子VIII蛋白質的核酸序列 包括以下至少一種（i)SEQ IDN〇: 5之核酸序列，及（ii)sEQ ID NO: 13之核酸序列。於更特定的實施例，編碼因子Η" 蛋白質的核酸序列包括能在高度嚴苛條件之下與下列至少 一種雜父之被分離的核酸分子（i)SEQ ID N〇: 5之核酸序 列’及（i i) SEQ ID NO: 1 3之核酸序列。 於另一特定實施例，編碼因子VIII蛋白質的核酸序列 包括以下至少一種（i)SEQ ID N〇: u之核酸序列，及 (u)SEQ ID NO: 7之核酸序列。於更特定的實施例，編碼 因子VIII蛋白質的核酸序列包括能在高度嚴苛條件之下 與下列至少一種雜交之被分離的核酸分子（丨）SEQ丨D⑽： 11之核酸序列，及（ii)SEQ ID N〇: 7之核酸序列。 6023-9587-PF;Kai 13 200914608 本發明更提供一種表現載體，包括本發明之被分離的 核酸或編碼本發明之被修飾的因子νπι聚胜肽之被分離 的核酸分子。 本發明之另—目的係提供一種具有表現載體之宿主鈿 胞，該載體包括本發明之被分離的核酸分子，以表現本發 明之因子νιπ蛋白質或被修飾的因子VIII聚胜肽。 本發明更提供—種非人類基因轉殖生物，以表現本發 口子V111蛋白質，特別是選自微生物、動物或植物的 生物，更特別是哺乳動物。 本發明之另一目的係提供一種組合物，包括本發明所 揭露之因+ VI11蛋自質，以及特別是醫藥組合物或冷凍乾 烯組合物，更包括—種藥學上可接受之載體。 本喬明之另一目的係提供一種方法，以製造依據本發 明，因子VI u蛋白質，且包括步驟培養生長被以本發明之 核酸分子’或被以編碼本發明之因子VIII蛋

子所轉型或轉染的宿主細胞，以及由宿主細胞及/二 分離核酸分子表現所產生的因子仙蛋白質。養基 V11 ί作為治療 缺陷之疾病，更 本發明亦提供一種依據本發明之因子 出血疾病的用途，尤其是特徵為因子VIII 特定為A型血友病或後天血友病。 价一将定實施例，本 卜、队終f找％〈囚子ν ΤΤ τ 蛋白質用於製造用於治療A型血 品的用途，後友病之醫藥 、 療病患的A型血友病或後天血古、广 的方法，包括對於有需要的击认 嘀 w、，.D予喊血有效劑量之依據 6023-9587-PF；Kai 14 200914608 本發明之因子VIII蛋白質 【實施方式】 此處所使用之“因子Vni蛋白質（FVIII protein)” 係指胺基酸分子，包括至少一個因子νπ !聚胜肽，但不限 於此聚胜肽。因此，本發明之因子VIII聚胜肽表示至少約 5〇%，較佳為 60%、70%、75%、8〇%、85%、9〇%、95%、96%、 97%、98%、99%或1〇〇%的本發明之因子νιπ蛋白質的胺基 酸含量°當因子VI11蛋白f的因子VI! i聚胜肽比率不是 100%’因子VIII蛋白質可能具有任何其他胺基酸序列，如 此因子VIII蛋白質可被認為是嵌合蛋白質（chimehc proteirO。包含於因子νίίΙ蛋白質之額外的胺基酸序列可 能與因子VI11聚胜肽之間為共價鍵結或非共價鍵結，並可 能對應或源自於任何天㈣合成的聚胜肽。這些額外的聚 胜肽可作用為酵素或活性蛋白質，細胞運輸、轉位、輸送、 分泌的訊號序列，或可扮演其他酵素及/或反應蛋白質之辨 識序列的角色。 ' 此處所使用之“因子VIII聚胜肽（FVIII polypeptide)係指具有凝血活性與相較於SEQ ID N〇: 2 之全長人類因子VIII之類似凝血酶活性特點的聚胜肽，並 與SEQ IDN0:2所表示之聚胜肽序列的卜74〇與1 689_2332 區域具有至少約 60%、70%、75%、W、85%、、95%、 96%、97%、98%、99%或1〇〇%相同度。尤其，已知道不同的 突變與保守的胺基酸變化是可被忍受的，某些非保守胺基 6023-9587-PF；Kai 15 200914608

酸的變化；fp; PI -^ 同，只要變異的因子VIII仍具有凝血活性。片 /、’、二醣基化作用也是被允許的，實際上因子VIII聚胜 狀的任何改變都是被允許的，只要該聚胜肽維持其特定的 活性。_ 此處所使用之“因子VIII聚胜肽（FVIII polypeptide)亦指具有凝血活性與相較於SEQ ID NO : 2 王長人類因子v 111之類似凝血酶活性特點的聚胜肽，並 與SEQ ID N0: 2所表示之聚胜肽具有至少約6〇%、7〇%、75%、 、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 1〇〇%相同度。 尤其’已知道不同的突變與保守的胺基酸變化是可被忍受 的’某些非保守胺基酸的變化亦同，只要變異的因子v 111 仍具有凝血活性。片段與某些醣基化作用也是被允許的， 車乂 it地’貫際上因子V111聚胜肽的任何改變都是被允許 的’只要該聚胜肽維持其特定的活性。 此處所使用之“被修飾的因子VIII聚胜肽（modified r , FViI1 polyPePtide)” ，可能在全長或是 BDD-FVIII 非關

L 鍵區域具有任何胺基酸數目或是原生胺基酸的變化，包括 在聚胜肽分子的任何區域的取代及/或插入及/或刪除，只 要該聚胜肽變異物包括與SEQ ID NO : 2所表示之聚胜肽序 列的1-740及/或1 689-2332區域具有至少約60%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同度 之序列’且該變異的出現不會妨礙變異株因子VIII的活 性0 此處所使用之“被修飾的因子V111聚胜肽（mod i f i ed 6023-9587-PF;Kai 16 200914608 FVIII polypeptide)”包含具有與指定的參考序列6〇%、 70% 、 75% 、 80% 、 85% 、 90% 、 95% 、 96% 、 97% 、 98% 、 99%或 1 0 0%同源性之胺基酸序列，亦即與SEQ ID N0 : 2之人翻入 、犬Η王 長因子VIII。 此處所使用之名詞“被修飾的”係指相較於對照聚胜 肽（例如全長因子V111序列），胺基酸序列具有某些不同的 分子。胺基酸變化可為在原生或全長胺基酸序列的取代、 插入、删除或這些變化任何想要的組合。取代可以是單一 的，當在分子中只有一個胺基酸要被取代，或是可以為多 重的’當同一分子中二或多個胺基酸被取代。 為了改善或改變本發明之因子VI丨丨聚胜肽的特性，可 以使用胺基酸工程。熟悉技藝人士已知的重組DNA技術可 被用於創造新的突變聚胜肽，包括單一或多重的胺基酸取 代、刪除、添加或融合蛋白質。這些被修飾的聚胜肽顯示， 例如增加/減少的活性或增加/減少的穩定性。此外，他們 可以被純化而提高產量，並相較於天然的聚胜肽顯示較佳 的溶解度，至少在某些純化或儲存條件下。 此處所使用之名詞“聚胜肽，，包括全長蛋白質分子及 其片段，自己或與其他片段在凝血試驗能產生因子v⑴凝 血活性。需瞭解本發明之新穎蛋白f產物之合成的聚胜狀 亦在本發明之範圍内，且可依據標準的合成方法製造。亦 需瞭解，此處所使用之胺基酸編號系統中，胺基酸殘基1 係為原生、成熟因子νιπ蛋白質的第一個殘基。更需：解 的是’名肖“功能區塊(domain)”係指熟知技藝人士已知 6023-9587-PF;Kai 17 200914608 之因子VIII的適當區域。 用於本申請案的胺基酸符號包括下列： 不論胺基酸的單一或三字母縮寫被用於本申請案，並 可能父互使用，具有以下意義：A或Ala=丙胺酸；R或Arg= 精胺酸；N或ASn =天冬醯胺酸；D或Asp =天冬胺酸；c.或 Cys =雙胱胺酸’· Q或6111 =麩胺酸；E或Glu =麵胺酸，· g或 Gly =甘胺酸；Η或His =組胺酸；；[或ne =異白胺酸；L或

Leu-白胺I，K或Lys =離胺酸；Μ或Met=甲基胺酸；F或

Phe=苯丙胺酸；p或Pr〇 =脯胺酸；s或以厂絲胺酸；τ或

Thi-穌胺酸’· W或Trp=色胺酸；γ或Tyr =酪胺酸；以及v 或V a 1 =顯胺酸。 此外，此處所使用之“被修飾的因子VIII聚胜肽的修 倚作用限於精確敘述所指定之數目或位置，只要達到 的功能與結果相同即可1端或“、或人類全長因子νπΙ 的其他部分之少數脸其y亚_ 数基敲位置可以被插入、加添或刪除， 只要能維持功能活性，命|如、盛1 i f丄 例如綾血酶切割或凝血作用。蛋白 質或片段或其街生勒J t h k 1 物方包括在本發明範圍内，其存在相同 或相似的生物學活性， / 以及在轉譯期間或之後被不同修飾 的衍生物’例如醣基化作 土儿TF用、蛋白質水解作用、接合至抗 體分子或其他細胞配體等等。 其維持可 因子V111 此處所使用之“片，，及此* 月丰又係指部分的聚胜肽 利用的功能特性。例如 ,,v 例如’如本發明内文使用的 聚胜肽片段具有凝血的功能。 如此處所使用的，呈古 /、有因子V111凝血活性之蛋白質係 6023-9587-PF;Kai 18 200914608 < .為μ 、以以>0或^ w w在動物模式能引起因子 X活化的蛋白質。不作為限制的例子，此定義包括全長重 組人類.因子V π I以及B功能區塊被刪除的因子v π {。此 處所使用之名詞“凝血活性（procoagulant —active)„與 “活性.（active)”因子VIII ,可以被交換使用，以指在凝 血忒驗中顯示凝血活性之一或多個聚胜肽或蛋白質。此處 可使用之名詞因子包括FVI j丨，且熟悉技藝人士將由内文 瞭解所使用的名詞（前—凝血酶活化的因子 \

Vin(pre-thr〇mbin activated FVIII)或凝血酶活化的因 子 VIIKthrombin activated FVIII，FVIIIa))。 此處所使用之以末端甘露糖殘基去醣基化因子viii 聚胜肽封鳊的聚糖結構（glycan_structure with mannose residue deglycosy1ated FVIII polypeptide)”係指因子vin聚胜肽或被修飾的因子 VI11聚胜肽’其缺少—或多個以甘露醣殘基封端聚糖結構。 j 此處所使用之“末端甘露醣殘基封端的聚糖結構 (glycan-structure(s) terminated with mannose reSldue(S))”係指以遠離聚胜肽骨架之一或多個甘露醣 殘基封端的聚糖結才冓，此類甘露醣殘基稱為末端I露酶殘 基。本發明之“末端甘露醣殘基封端的聚糖結構，，包括具 有退離聚胜肽骨架之-或多個甘露醣殘基之單-與多重觸 角狀的聚糖結構，更特別地，“末端甘露聽殘基封端的聚 糖結構包括寡甘露醣類型的聚糖結構（第丨丨圖）。 此處所使用之末端甘露醣殘基（terminal-mannose 6023-9587-PF;Kai 19 200914608 一e)”係指遠離聚胜肽骨架之甘露酶殘 基化作用位置的聚糖結構的觸角（第丨1圖）土八封端醣 此處所使用之名詞“能在'高度嚴苛條件 … 在高度嚴苛條件下黏合互補於標的dna之:父係指 “能在低度嚴苛條件下雜交，，係指在低度嚴苛:::::二 互補於標的職之臟股。黏合過程可能相關"产： 苛條件”，例如，高溫及/或低鹽含 0又嚴 不利於錯誤配對鹼 土對之風鍵接觸。“低度嚴苛條件，’卩能牽涉比高产嚴吁 條件較低的溫度，及/或較高的鹽濃度。此條件允=二股 DNA黏合’如果實質上在接近的二股並無接近的完全互補， 例如編碼相同蛋白質但因遺傳密碼退化而序列不同之情 形。促進DNA雜交之適當的嚴苛條件，例如，約45。〇的^ SSC’接著以5〇t 2XSSC清洗’係為熟悉技藝人士所已知， 或可見於 Current Protocols in M〇lecuiar Bi〇1〇gy，J〇hn Wiley & Sons，N.Y. ( 1 989)’ 6· 3卜6· 3. 6。例如，清洗步 驟之鹽濃度可以選自約5(TC 2XSSC的低度嚴苛條件至約 50 C 0. 2X SSC的咼度嚴苛條件。此外，清洗步驟的溫度 可以自低度嚴苛條件的室溫，約22°C，增加至高度嚴苛條 件’約75C。其他嚴苛參數被敘述於Maniatis, T.，etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring N,Y., (1982), at PP_ 387-389 ;亦可參照 Sambrook J. et al. , Mol ecu 1 ar

Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Volume 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, 6023-9587-PF;Kai 20 200914608 N.Y· at ρρ· 8.46-8.47 (1989)。 此處所使用之“載體（carrier)”包括藥學上可接受 之載體、賦形劑或安定劑’對給藥或濃縮接觸的細胞或哺 乳動物沒有毒性。其他藥學上可接受的载體為液狀汕緩衝 /合液。藥學上可揍受之載體的例子包括但不限於緩衝液， 例如磷酸、檸檬酸、與其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞 血酸；低分子量聚胜肽（少於約丨〇殘基）；蛋白質，例如血 清球蛋白、明膠、免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙 *烯吡咯烷酮（PobvinylPyuolidone);胺基酸，例如甘胺 酸、麩胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、雙糖 與其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露醣或葡聚糖；螯合 劑，例如EDTA ;糖醇（sugar alcohols)，例如甘露醇或山 梨糖醇；鹽形成的反離子（salt —f0rming c〇unteri〇ns)， 例如鈉，及/或非離子性介面活性劑，例如tween(r)、聚 乙二醇（PEG)、及 PLURONICS(R)。 此處所使用之“有效劑量，，係為足夠影響有益的或預 期的臨床或生化結果的劑量。有效劑量可被給藥一或多 -人。依據本發明之目的’抑制劑化合物的有效劑量係為足 夠緩和、改善、穩定、反轉、減慢或遲延疾病進程的劑量。 於本發明之一較佳實施例，“有效劑量”被定義為能夠產 生血液凝結的化合物劑量。 此處所使用之“宿主細胞（h 〇 s t c e 11) ”包括單獨細 胞或細胞培養，可以或已經被作為本發明之載體的接受 者。宿主細胞包括單一宿主細胞的後代，以及該後代可能 6〇23-9587-PF;Kai 21 200914608 不必與原來的親代細胞完全相同（型態上或全部ma組成 上），因為自然、意外或故意的突變及/或改變。宿主細胞 包括被.包含編碼血管生成因子之.命仿过减， 卞之象核苷酸的載體於體内或 間接體内所轉染或感染的細胞。 此處所使用的“純化的，，或“分離的”係指生物分 子’被尤其天然環境移除，被分離或分開，且沒有其他自 然地與其相關的成分。 此處所使用的“治療”係、得到有益的或預期的臨床結 果的方式。依據本發明之目的，有益的或預期臨床結果包 括但不限於，症狀的緩和、疾病程度的減少、疾病的穩定 狀態(亦即’沒有惡化）、遲延或減慢疾病的近程、改善或 減輕疾病狀態、以及減緩（不論是局部或全部不& θ可 察覺或不可察覺的。“治療”亦可指延長存活，相 接受治療之所預期的存活。“治療”係同時指醫療治療以 及預防或防止的處置。那些需要治療者包括那些已經患病 以及那些需要預防疾病者。“緩和（Palliating)，，疾病係 指疾病狀態的程度及/或不預期的臨床表現被減輕，及/或 病程的時間表被減慢或減輕，相較於未治療的情形。一 此處所使用的“載體(vector)”、‘‘聚核苦 體”、“構築物”與“聚核苷酸構築物，，，在此係可交換 使用的。本發明之聚核苷酸載體可以為數種形式任何— 種’包括但不限於，驗、臟、包裹於反轉錄病毒外膜的 RNA、包裹於腺病毒外膜的DNA、包裝於其他病毒或似病主 形式的DNA(例如，單純皰疹病毒（herpes。仰1以）'與腺 6023-9587-PF/Kai 22 200914608 相關病毒（AAV)、包裹於微脂體的DNA、與聚離胺酸複合的 DNA、與合成的聚陽離子分子複合.、與聚乙二醇之類的化合 物複合，以免疫學地『偽裝』該分子，及/或增加半衰期， 或與非病毒性蛋白質接合。較佳地，該聚核苦酸係為Dna。 選擇用於本發明之載體轉染

包括同時編碼因子VI11衍生物，以及例如，二氫葉酸還原 酶（DHFR)蛋白質之DNA序列，需依據使用之DHFR蛋白質類 型而選擇宿主。若使用野生型的DHFr蛋白質，較佳為選擇 缺乏DHFR之宿主細胞，因而在缺少次黃嘌呤、甘胺酸與^ 腺嘧啶之選擇性培養基，允許诎邝編碼序列作為成功轉染 的標記。另一方面，如果對甲氨喋呤Μτχ) 結合親和性低的DHFR蛋白質被使用為調節序列，不需要使 用DHFR抗性細胞。突變的DHFR對Μτχ有抗性，因此具有 MTX的培養基可被作為篩選方式，因為被提供的宿主細胞 本身為MTX敏感的。可選擇地，野生型DHFR基因可以被使 用為宿主細胞的放大標記，其在提供DHFR時並無缺陷，而 在第二個藥物篩選標記，例如抗潮黴素（hygr〇町ch resistance)被使用時。前面提到的範例描述抗Μτχ之⑶〇 細胞（CH0-DBX11 cells)作為宿主細胞的使用，载體上使用 CMV與SV40啟動子作為調節序列，以分別啟動因子叩 衍生物與DHFR。其他可選擇的標記包括對於例如新徽素、 潮徽素與甲氨喋呤等藥物有抗性的基因。 T、C與G，亦 ’例如甲基化 此處所使用之“MA”不僅包括鹼基A、 包括任何其類似物或這些鹼基被修飾的形式 6023-9587-PF;Kai 23 200914608 的核苦酸、核苦酸之間的修飾作用，例如不帶電連結“ 代醋（thi〇ates)，以及，糖類似物的使用，及㈣及/ = 變骨架結構，例如聚酿胺。 於.另-型態’本發明提供一種被分離的核酸分子，包 括在嚴苛雜交條件下與本發明前述核酸分子部分雜交的聚 核苦酸。雜交的聚核苦酸可作為如先前討論的探針與引 子。與編碼因子v⑴聚胜肽序列之雜交的聚核苦酸部分， 可以如前所述被精準地經由5，與3,驗基位置或核普酸驗 基之尺寸而特定，或以相同方式精準地排除。相似地，與 因子VIII聚胜肽雜交的聚核苷酸的部分，亦可以被作為探 針或引子。本發明之較佳的雜六取> —h '' 的雜父聚核苷酸，係為那些以雜 交試驗習知的方法標記與使用（例如南方氏盘北… 幻，顯示最大訊號強度，而不管其他同量存在之異源序二 者。 如此處所使用，被修飾的核酸序列包括那些由核普酸 取代、刪除或添加所產生者。取代、刪除或添加可能盘一 或多個核苦酸有關。胺基酸序列的改變可能產生保守或非 保守的胺基酸取代、刪除或添加。這些之中最佳為沈默的 取代、添加與刪除，其不影響本發明之聚胜肽或其部分的 特性與活性。在此觀點，較佳亦為保守性的取代。 本發明允許表現載體之序列的使用，以及轉染宿主細 =广包括原核或真核細胞。本發明亦容許由表現 載體所表現之聚胜狀的純化。表現载體可能具有不銅的分 子標記以利純化。後續得到的表現構築物可以被轉型至任 6023-9587-PF;Kai 24 200914608 何選擇的宿主細胞。源自宿主έ • 、，、田胞之細胞裂解物被習知技 藝所建立之方法純化。 於一特定實施例，包括紘级m， J ^括編碼因子VIII蛋白質或被修飾 的因子VII .1.聚胜狀之序列的仿絲 斤夕J的核酸，經由基因療法的方式， 被施用以治療 ' 抑制或預防痂、忘 與万疾病或與本發明聚胜肽異常表 現及/或活性有關的異常。基因疼 、 u原去係指對個體施用表現的 或可表現的核酸。在水發明夕山由 本發明之此貫施例中，核酸產生其編 碼之蛋白質’調節治療的效果。 本領域任何可用的基因療法 欲在方去可以依據本發明而被 使用。於一較佳型態，核酸序 〜」Sb編碼因子V111聚胜 肽，在其中核酸序列為在適當宿 傾王辰現聚胜肽之表現載體 的"一部份。特別是，這類核酿皮Χϊ Θ _i» 、 疋 < 頰核馱序列具有連結於聚胜肽編碼 區域之可操作的啟動子，該啟叙 忒啟動子可以被誘導或構成，以 及，選擇性地組織專一性。右x 、 人哥旺在另—個特定實施例中，核酸

分子被使用，在其中聚胜肤e T t P r水胜肽編碼序列與其他想要的序列位 於促進基因組想要位置同湃會ό )'、重！的兩側區域，因此提供為 編碼抗體之核酸的染色體内表現。核酸至患者的遞送可為 直接的，此時病患係直接暴露於核酸或載有核酸的載體， 或間接的，此時細胞先在體外被轉型，冑後被轉殖進入患 者。這兩種方式，分別已知真种 . J匕夭為體内（M 或間接體内（以 r/FO)基因療法。 於一特定實施例，核酸序列可直接給予至體内，以表 現生產編碼產物。這可由任何多種已知的方法達成，例如， 構築為適當的核酸表現載體的一部份，並施用使其成為細 6023-9587-pf；Kai 200914608 胞内的，例如，使用有缺陷的或減毒性的反轉錄病毒或其 他病毒載體，或藉由裸露DNA的直接注射，或以脂肪或細 胞表面受體或轉染藥劑披覆，包裹於微脂體、微粒體或微 膠囊，或藉由與已知會進入細胞核的胜肽連結施用，萨由 與受體調節之内噬作用標的配體連結施用（可被用於指向 表現特定受體的細胞類型），以及類似方法。 此外，核酸可被導入細胞内，並藉由同源重組嵌入宿 主細胞DNA 見。於一特$實施例，具有編碼聚胜狀之核 酸序列病毒載體被使用。用於基因療法之編碼聚胜肽的核 酸序列被選殖進入一或多個載體，其有助於遞送基因至病 患。反轉錄病毒載體、腺病毒載體以及腺相關病毒載體係 為可以被用之病毒載體的例子。反轉錄病毒載體具有正確 包裝病毒基因組並嵌入宿主細胞DNA所需的成分。 基因療法的其他方式牽涉到移轉基因至組織培養的細 胞’經由電穿孔、脂質體、磷酸鈣調節的轉染或病毒感染 等方法。通常，移轉的方法包括移轉可選擇的標記至細胞。 細胞隨後被置於！帛選’以分離那些攝人並表現移轉基因的 細胞。那些細胞接著被遞送至病患。在此實施例中，核酸 在施用產生的重組細胞體内前先被導入細胞。這樣的導入 可用任何本領域已知的方法進行，包括但不限於，轉染、 :牙孔I ’主射、以具有核酸序列之病毒或噬菌體載體感 染、細胞融合、染色體調節的基因移轉、微細胞調節的基 因私轉、原生質體融合（spher〇plast —ion)以及類似方 法。本領域數種用於導入外來基因至細胞的已知技術可依 6023-9587-PF;Kai 200914608 據本么明而被使用，提供接受細胞必要的發育上與生理上 功此而不會中斷。技術能提供核酸穩定移轉至細胞，因此 核駄在細胞為可表現的，較佳為該細胞後代可遺傳與可表 現的。 核酸基於基因治療目的可導人的細胞，包含任何期望 的、可用的細胞類型，並包括但不限於，上皮細胞、内皮 細胞、角質細胞、纖維母細胞、肌肉細胞、肝細胞、血液 細胞’例如T淋巴球、b淋巴球、單核球、巨噬細胞、嗜 中性白血球、嗜伊紅血球、巨核細胞、粒細胞，不同的幹 細胞或原始細胞，尤其是造血幹細胞或原始細胞，例如取 自月知、臍▼血、外周血液、胚胎肝臟以及類似物。 於一實施例，本發明有關於治療血液凝結疾病。因此， 本發明的治療化合物可施用於有傾向或已患病之人類病 患，藉由提供刺激血液凝集的化合物。特別是，該疾病為 、友病更特別疋，A型血友病。治療化合物的配方通常 ^為本領域所已知的，可方便地參考Remington，s ‘ Pharmaceut1Cal Sciences, 17th ed. , Mack Publishing

Co.， Easton， Pa. ， USA 。 給藥方案（Dosage regime)可以被調整，以提供最適當 的治療反應。例如，多次分開的劑量可以被每天給藥，或 是劑量可視治療情形的危急程度，依指示比例降低。活性 化合物可以方便的方式給藥，例如口服的、靜脈内的（水溶 性）、肌肉内的、皮下的、鼻腔内的、真皮内的、或栓劑路 徑或植入（例如使用慢性釋放分子，經由腹腔内路徑，或使 6023-9587-PF;Kai 27 200914608

用細胞例如單核球或樹突細胞在體外過敏，並移轉扩 接受者）。依據給藥路徑的不同，因子VI 龙白貝或被修 飾的因子vm聚胜肽可以被需要披覆材料，以保護其免除 酵素、酸或其他會去活化該成分的天然環境的作用。

適合注射的醫藥學形式，包括無菌水溶液(水溶性)或 分散液，以及用於臨時準備無菌可注射之溶液或分散液的 無囷粉末。這些情形，該形式必須為無菌，且必須為容易 注射出去的溶液程度。必須在製造與保存的條件下^ =須f對抗微生物例如細菌與真菌下保存。載體；為溶 政液，具有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二 醇、液態聚乙二醇’以及類似物） 植物油。合適的流動性可以被維持之::广以及 之類披覆層的使用，藉由分散所二二精由如輸旨 —丄人 7而顆粒尺寸的維持，以及 猎由；丨面活性劑的使用。微 菌與抗真菌劑達成，例如，氯丁 = 預以由犧 (咖η〇υ、山梨酸 以及類似物。許多情形，較佳為：：“he〇mersal)， 咖⑴，例如糖類或氯化鈉。可=括人等張錄相C 作用（㈣。峨““州⑻可”::物的被延長吸收 物藥劑而達成，例如，單/用延緩吸收的組合 nionostearate)與明膠。 脂酸鋁（aluminium 在用於無菌可注射溶液製 佳的製備方法為真空乾燥以及 過濾的溶液，產生其活性成分 切之無菌粉末的情形下，較 冷墩乾燥方法，由先前無菌 '及任何想要的添加成分的 6023-9587-PF;Kai 28 200914608 粉末。 當胜狀被以上述方法適當的保護後，活性化合物可以 被口服給藥，例如，與惰性稀釋劑或與可吸收可食用的載 體給藥，或可以被包裹於硬或軟殼明膠膠囊，或可以被壓 縮為叙为]或可以被直接加入飲食的食物中。為了 口服治 療給藥，活性化合物可以被加入賦形劑，並使用於可消化 形式的錠劑、口含錠劑、喉片、膠囊、酏劑（elixirs)、懸 浮劑、糖漿、糯米紙（wafers)、以及類似物。

錠背丨藥丸、膠囊與類似物亦可能具有下列：黏著劑： 例士兴#膠（gum tragaeanth)、阿拉伯膠（aeaeia)、玉米 澱粉或明膠；賦形劑，例如磷酸二妈（dicalciUE Phosphate);分散劑（disintegming邮⑷，例如玉米 殿粉、馬鈴薯殿粉、海藻酸（aiginic㈣）以及類似物； 潤滑劑（lubricant)，例如硬脂酸鎂；以及甜味劑，例如可 以糧糖、乳糖或糖精’或調味劑，例如薄荷、冬青油 或櫻桃香味。當劑量單位形式為膠囊，除了前述類型材料， 其可能具有液狀載體…的其他材料可能作為披覆層或 劑量單位的其他物理形式的修飾。❹，制、藥丸或膠 囊可能被蟲勝（shellac)、糖類、或二者同時披覆。糖浆或 醜劑可能具有活性化合物、作為甜味劑㈣糖、作為防腐 劑的甲基與丙基苯甲_、色素與香味例如櫻桃或橘子香 二用於製備任何劑量單位型式的任何材料需要為 子早、，4且所使料含量實質地無毒性。此外’活性化 合物可以被加入持續釋放製劑與配方。 6023-9587-PF;Kai 200914608 # 此處所使用之“藥學上可 包括任何以及全部溶劑、分散媒介冑體及/或稀釋劑，， 層、等張劑與遲緩 二、::、抗菌與抗真菌劑披覆 物質之這類媒介盘筚 用於樂學上活性 ”梁劑的使用係為本 了相容於活性成^^ / 只埤人士所熟知。除 成刀之任何傳統媒介或 的使用要慎重。補m 、 於治療組合物 w死性活性成分亦可以 配方為非腸w、蓄 皮加入組合物中。 …A 物之劑型的優點為給華容… 劑篁的-致性。此處所“易以及 、連續的單位，適於£ 位形式係指物理上不 通於對攸治療哺乳動物 位具有一經過舛笪,ν太a w里’母個早 、斤异以產生預期的治療效 性物質，並與所雲i < 頂疋含里的活 位形式的說明直接地右Μ#,、 本备明之劑量單 直接地有關於（a)活性物質的特性 達成之特定療效，以及（b) 及所欲 及（b)已知的歿合之限制， 療具有疾病情形之活體的活用、〜 的。 貝八個體的健康是受損 典型的活性成分被配製為方 — 又”有效的以有效劑量鈐 樂，與適當的藥學上可接# ° 卡于上了接又的載體一起為劑量單位形式。 組合物被稱為“醫藥學上或生理上可接受，，， 給藥能被接受的動物忍受，則適於對該動物給藥。 劑被稱為以“有療效劑量，，給藥，如果該給藥劑量係為生 理上顯著的。藥脅彳為生5里上顯著的，如果其存在導致接受 的病患可彳貞測的生理改變。 於一特定實施例，哺乳動物細胞培養為表現外源 以生產本發明揭露之功能性人類因子VI丨丨演生物之方 6〇23-9587-PF;Kai 30 200914608 法。尤其是，通常用於生產重組蛋白質的哺乳動物細胞， 例士中國倉既卵巢細胞株（CH0)、幼倉鼠腎細胞株（βηκ)、 cos細胞株、HKB1〗細胞株（腎與B細胞的混合物；右 CRL 1 2568)、COS-1 (ATCC CRL 1 650)、以及狗腎細胞株（肋CK) 是有用的。用於這些細胞的表現載體通常包括（如有需要） 複製起點、欲表現之基因前方的啟動子、任何必要的粒線 體結合位置、RNA剪接位置、多腺苷酸化位置、以及轉錄 終端子序列。 為了用於哺乳動物，表現載體上的調節功能可能由病 毒物質而被提供。例如，通常使用的啟動子係衍生自延長 因子-1(EF-1)、猴病毒40(SV4〇)(15)、巨細胞病毒 (CMV)(16)、以及腺病毒2主要的晚期啟動子（17^此外， 也可能而且通常是需要的，利用通常與預期基因序列有關 之啟動子或調節序列’提供這類與宿主細胞系統相容之調 節序列。 細胞的啟動子包括小鼠κ基因啟動子（1 8)、小鼠^啟 動子（19)、以及小鼠金屬硫蛋白啟動子（2〇)。表現载體 亦可能具有一組RNA剪接位置，位於啟動子下游與因子 nil序列插入位置上游。較佳的RNA剪接位置可由腺病毒 及/或免疫球蛋白基因而獲得。表現載體亦可在cD·因子 viii序列具有一組RNA剪接位置。表現載體也可具有多腺 普酸化訊號’位於插入位置的下游"寺別較佳的多腺苷酸 化訊號包括源自SV40之早期或晚期多腺苦酸化訊號 (Kaufman and Sharp，ibid·)、源自腺病毒 5 Eib 區域之 6023-9587-PF;Kai 31 200914608 多腺普酸化訊號、或人類生長激素基因終端子(⑴。表現 載體也可能包括無編石馬的病毒先導序列，例如腺病毒2三 聯先導序列，位於啟動子與鹽剪.接位置之間；以:增: 子序列，例如SV40增強子。 依據本發明之製造的被修飾的因子可經由抗因子仙 抗體管柱之親合管柱層析純化。額外的純化可經由傳統的 化學純化方式被達成，例如高效液相層析（HpL〇。其他純 化的方法，包括檸檬酸鋇沈澱法（barium citrate precipitation)係為f知的，且可應用於新穎之被修飾的 因子VUI的純化。實質地純化的被修飾的因子Μη可能 被用於藥學上的用《。一旦被純化’部分或如預期的同一 性，被修飾的因子VI11可接著被藥學上地使用。 如此處所使用的，Ι2ι“_τ2161胜肽（1…4 —T2m 係為SEQ ID NO : 9之合成的胜肽。此胜肽並未甘露醣化， 1.. 匕甘路聚糖對抗原表現細胞，例如樹突細胞之受體調節 的内噬作用沒有效果。 如此處所使用的，D9E9細胞係為Marc Jacqueinin所 開發的人類因子VI11專一性CD4+ T細胞選殖株（Ref Jaequemin Bl〇〇d 2003)。當與抗原表現細胞共同培養時， 乂二細胞會產生干擾素-7 (IFN-gamma)，這些抗原表現細 胞已先吞入因子VIII或因子VIII衍生之胜肽I2144-τ2】61。 匕處所使用的’ LE2E9細胞係為Marc Jacquemi η所 開發的人類因子νι π專一性Β細胞選殖株（Ref peerlinck B1〇〇d 1 9 9 9 )。這些細胞生產人類因子VI11專一性IgG4， 6023-9587-PF;Kai 32 200914608 能辨識因子V111的Cl功能區塊。 如此，處所使用的’ B02C11細胞係為Marc JacQueinin 所開發的人類因子VI11專一性B細胞選殖株（Ref Jacquem in Blood 1998)。這些細胞生產人類因子VIII專 一性IgG4，能辨識因子VI11的C2功能區塊。 如此處所使用的，CTLD4-7Fc分子係指嵌合構築物包 括老鼠巨噬細胞甘露醣受體（CD206)的功能區塊4至7。 CTLD4-7Fc 分子由 Luisa Martinez-Pomares 所製造 f \ (Linehan 2001 Eur J Immunol)。 如此處所使用的，樹突細胞為專門的抗原表現細胞， 其特徵在於不同的專一性表面標記（CDla、CDllc、HLA-DR、 CD8 0、CD8 6、CD83、CD40、…等），以及功能（抗原的内噬 作用、對T淋巴細胞表現抗原）。 如此處所使用的，抗-CD206 PAM-1抗體係為專一性地 直接對應人類巨噬細胞甘露醣受體（CD206)的抗體。由ρ· f Allavena 所製造（Laboratory of Cellular Immunology, Institute» Mario Negri, Milan, Italy)0 下列序列對應於SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，亦即， 對應於包括1 9個胺基酸之訊號胜肽之原生的全長人類因 子V111胺基酸序列：

MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFP

PRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVY

DTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPG

GSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCRE 6023-9587-PF;Kai 33 200914608

GSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKM HTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNH RQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPE EPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKT WVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRF.MAY TDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGIT DVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTR YYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDE NRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCL HEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMS MENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLL SKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPK IQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSL SEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSST SNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTE SGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGP " ALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQN ILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKK EGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVS LGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDN LHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLS TRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLG NQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRI IVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIP 6023-9587—PF;Kai 34 200914608

QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQES

SHFLQGA'KKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLP

KPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLV.EGSLLQGTEG

AIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWK SQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGR-

TERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYD

EDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFK

KVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASR

PYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFD

CKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFT

IFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPG

LVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPG

VFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGH

IRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMII

HGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVD

SSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGME

SKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQ

VDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVK

VFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDL

Y 下列序列對應於SEQ ID NO: 2的胺基酸序列，亦即， 對應於不包括1 9個胺基酸訊號胜肽之全長人類因子V111 的胺基酸序列：

ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTL 6023-9587-PF;Kai 35 200914608

FVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHA VGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASD PLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFA VFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHR KSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLL MDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDL TDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVL APDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILG 〇 PLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKD FPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGP LLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAG VQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLS VFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNR GMTALLKYSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPS TRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTP HGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMYFT PESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDN TSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLES GLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKT NKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRM LMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKML FLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKV VVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEK KETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQD 6023-9587-PF;Kai 36 200914608

' FRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPN TSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPS TLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIR PIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTL EMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHI YQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVA TESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILS LNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREI

、 TRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFI AAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRG ELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGA EPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSG LIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCR APCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSN ENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVEC LIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKL r

i ARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQ FIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIR LHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMF ATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKS LLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPP LLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY 下列序列對應於SEQ ID NO: 3的核酸序列，亦即，對 應於編碼人類BDD-因子V111的核酸序列： 6023-9587-PF;Kai 37 200914608

' GCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATAT GCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAAGATTTCCTCCTAGAG TGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTG TTTGTAGAATTCACGGTTCACCTTTTGAACATCGCTAAGCCAAGGCCACC CTGGATGGGTCTGGTAGGTCCTACCATCCAGGCTGAGGTTTATGATACAG TGGTCATTACACTTAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCT GTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGCTGAATATGATGATCA GACCAGTCAAAGGGAGAAAGAAGATGATAAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCC : ATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGAC

CCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGGTAAAAGA CTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCCCTACTAGTATGTAGAGAAGGGAGTC TGGCCAAGGAAAAGACACAGACCTTGCACAAATTTATACTACTTTTTGCT GTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGAT GCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGCACACAG TCAATGGTTATGTAAACAGGTCTCTGCCAGGTCTGATTGGATGCCACAGG AAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCA f、

I CTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCCAGG CGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTG ATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTTGTCATATCTCTTCCCACCAACA TGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACAGCTGTCCAGAGGAACCCC AACTACGAATGAAAAATAATGAAGAAGCGGAAGACTATGATGATGATCTT ACTGATTCTGAAATGGATGTGGTCAGGTTTGATGATGACAACTCTCCTTC CTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTAC ATTACATTGCTGCTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTC 6023-9587-PF;Kai 38 200914608

' GCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTCAATATTTGAACAATGGCCCTCA GCGGATTGGTAGGAAGTACAAAAAAGTGCGATTTATGGCATACACAGATG AAACCTTTAAGACTCGTGAAGCTATTCAGCATGAATCAGGAATCTTGGGA CCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACACACTGTTGATTATATTTAAGAA TCAAGCAAGCAGACCATATAACATCTACCCTCACGGAATCACTGATGTCC GTCCTTTGTATTCAAGGAGATTACCAAAAGGTGTAAAACATTTGAAGGAT TTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCAAATATAAATGGACAGTGACTGT AGAAGATGGGCCAACTAAATCAGATCCTCGGTGCCTGACCCGCTATTACT

' CTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGGCCCT CTCCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGAGGAAACCAGATAAT GTCAGACAAGAGGAATGTCATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAGAACCGAA GCTGGTACCTCACAGAGAATATACAACGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGA GTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAGCCTCCAACATCATGCACAGCAT CAATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTGCATGAGG TGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTTCCTTTCT GTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGACAC ϋ

ACTCACCCTATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAA

ACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGTGCCACAACTCAGACTTTCGGAACAGA

GGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTGACAAGAACACTGGTGA

TTATTACGAGGACAGTTATGAAGATATTTCAGCATACTTGCTGAGTAAAA

ACAATGCCATTGAACCAAGAGAAATAACTCGTACTACTCTTCAGTCAGAT

CAAGAGGAAATTGACTATGATGATACCATATCAGTTGAAATGAAGAAGGA

AGATTTTGACATTTATGATGAGGATGAAAATCAGAGCCCCCGCAGCTTTC

AAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTCTGGGAT 6023-9587-PF;Kai 39 200914608

• TATGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGG

" CAGTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATGGCT CCTTTACTCAGCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATGAACATTTGGGACTC CTGGGGCCATATATAAGAGCAGAAGTTGAAGATAATATCATGGTAAGTTT CAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCTTATTTCTT ATGAGGAAGATCAGAGGCAAGGAGCAGAACCTAGAAAAAACTTTGTCAAG CCTAATGAAACCAAAACTTACTTTTGGAAAGTGCAACATCATATGGCACC CACTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTG ACCTGGAAAAAGATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGC CACACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAGACAAGTGACAGTACAGGA ATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGACCAAAAGCTGGTACTTCA CTGAAAATATGGAAAGAAACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCAGATGGAA GATCCCACTTTTAAAGAGAATTATCGCTTCCATGCAATCAATGGCTACAT AATGGATACACTACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGAT GGTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTATTCATTTC AGTGGACATGTGTTCACTGTACGAAAAAAAGAGGAGTATAAAATGGCACT

[.

GTACAATCTCTATCCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTTACCATCCA

AAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCT

GGGATGAGCACACTTTTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCT

GGGAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGATTACAGCTTCAGGAC

AATATGGACAGTGGGCCCCAAAGCTGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCA

ATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAAGGTGGATCT

GTTGGCACCAATGATTATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGCCCGTCAGA

AGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCATGTATAGTCTTGAT 6023-9587-PF;Kai 40 200914608

' GGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAAATTCCACTGGAACCTTAATGGT CTTCTTTGGCAATGTGGATTCATCTGGGATAAAACACAATATTTTTAACC CTCCAATTATTGCTCGATACATCCGTTTGCACCCAACTCATTATAGCATT CGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTAAATAGTTGCAG CATGCCATTGGGAATGGAGAGTAAAGCAATATCAGATGCACAGATTACTG CTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTTCAAAAGCT CGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGACCTCAGGTGAATAA TCCAAAAGAGTGGCTGCAAGTGGACTTCCAGAAGACAATGAAAGTCACAG (] GAGTAACTACTCAGGGAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAG GAGTTCCTCATCTCCAGCAGTCAAGATGGCCATCAGTGGACTCTCTTTTT TCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCCTTCACAC CTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATT CACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTTCTGGG CTGCGAGGCACAGGACCTCTACTGA 下列序列對應於SEQ ID NO : 4的胺基酸序列，亦即對 應於人類BDD-因子V111的胺基酸序列： C j

ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTL

FVEFTVHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHA

VGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASD

PLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFA

VFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHR

KSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLL

MDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDL

TDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVL 6023-9587-PF;Kai 41 200914608

• APDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILG — PLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKD FPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGP LLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAG VQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLS· VFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNR GMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPREITRTTLQSD QEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWD YGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGL LGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVK PNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVC HTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQME DPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHF SGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHA GMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGS INAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLD { i

GKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSI

RSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKA

RLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVK

EFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRI

HPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY 下列序列對應於SEQ ID NO: 5的核酸序列，亦即，對 應於編碼包括突變Asn239Ala之人類因子VI11重鏈的核酸 序列： 6023-9587-PF;Kai 42 200914608

' GCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATAT • GCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAAGATTTCCTCCTAGAG TGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTG： TTTGTAGAATTCACGGTTCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACC CTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAGGCTGAGGTTTATGATACAG TGGTCATTACACTTAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCT GTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGCTGAATATGATGATCA GACCAGTCAAAGGGAGAAAGAAGATGATAAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCC ATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGAC CCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGGTAAAAGA CTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCCCTACTAGTATGTAGAGAAGGGAGTC TGGCCAAGGAAAAGACACAGACCTTGCACAAATTTATACTACTTTTTGCT GTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGAT GCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGCACACAG TCAATGGTTATGTAGCCAGGTCTCTGCCAGGTCTGATTGGATGCCACAGG AAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCA ^ ./

' CTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCCAGG CGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTG ATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTTGTCATATCTCTTCCCACCAACA TGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACAGCTGTCCAGAGGAACCCC AACTACGAATGAAAAATAATGAAGAAGCGGAAGACTATGATGATGATCTT ACTGATTCTGAAATGGATGTGGTCAGGTTTGATGATGACAACTCTCCTTC CTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTAC ATTACATTGCTGCTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTC 6023—9587-PF;Kai 43 200914608

' GCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTCAATATTTGAACAATGGCCCTCA ' GCGGATTGGTAGGAAGTACAAAAAAGTCCGATTTATGGCATACACAGATG AAACCTTTAAGACTCGTGAAGCTATTCAGCATGAATCAGGAATCTTGGGA CCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACACACTGTTGATTATATTTAAGAA TCAAGCAAGCAGACCATATAACATCTACCCTCACGGAATCACTGATGTCC GTCCTTTGTATTCAAGGAGATTACCAAAAGGTGTAAAACATTTGAAGGAT TTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCAAATATAAATGGACAGTGACTGT AGAAGATGGGCCAACTAAATCAGATCCTCGGTGCCTGACCCGCTATTACT 〇 CTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGGCCCT CTCCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGAGGAAACCAGATAAT GTCAGACAAGAGGAATGTCATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAGAACCGAA GCTGGTACCTCACAGAGAATATACAACGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGA GTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAGCCTCCAACATCATGCACAGCAT CAATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTGCATGAGG TGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTTCCTTTCT GTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGACAC c)

ACTCACCCTATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAA

ACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGTGCCACAACTCAGACTTTCGGAACAGA

GGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTGACAAGAACACTGGTGA

TTATTACGAGGACAGTTATGAAGATATTTCAGCATACTTGCTGAGTAAAA

ACAATGCCATTGAACCAAGA 下列序列對應於SEQ ID NO : 6的胺基酸序列，亦即， 對應於包括突變Asn239Ala之人類因子VIII重鏈的胺基酸 序列： 6023-9587-PF;Kai 44 200914608

• ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTL ' FVEFTVHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHA VGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASD PLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFA VFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVARSLPGLIGCHR KSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLL MDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDL TDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVL 1 APDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILG PLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKD FPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGP LLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAG VQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLS VFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNR GMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR 下列序列對應於SEQ ID NO : 7的核酸序列，亦即，對 應於編碼包括突變Asn2118Ala之人類因子VI11輕鏈的核 酸序列：

AGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCT

CTGGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTC

AGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACT

GATGGCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATGAACATTT

GGGACTCCTGGGGCCATATATAAGAGCAGAAGTTGAAGATAATATCATGG

TAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCTT 6023-9587-PF;Kai 45 200914608 - atttcttatgaggaagatcagaggcaaggagcagaacctagaaaaaactt

TGTCAAGGCTAATGAAACCAAAACTTACTTTTGGAAAGTGCAACATCATA TGGCACCCACTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCT GATGTTGACCTGGAAAAAGATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCT GGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAGACAAGTGACAG TACAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGACCAAAAGCTGG TACTTCACTGAAAATATGGAAAGAAACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCA GATGGAAGATCCCACTTTTAAAGAGAATTATCGCTTCCATGCAATCAATG 1 GCTACATAATGGATACACTACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGG ATTCGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTAT TCATTTCAGTGGACATGTGTTCACTGTACGAAAAAAAGAGGAGTATAAAA TGGCACTGTACAATCTCTATCCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTTA CCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCT ACATGCTGGGATGAGCACACTTTTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGA CTCCCCTGGGAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGATTACAGCT

TCAGGACAATATGGACAGTGGGCCCCAAAGCTGGCCAGACTTCATTATTC

J

CGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAAGG

TGGATCTGTTGGCACCAATGATTATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGCC

CGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCATGTATAG

TCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAGCCTCCACTGGAACCT

TAATGGTCTTCTTTGGCAATGTGGATTCATCTGGGATAAAACACAATATT

TTTAACCCTCCAATTATTGCTCGATACATCCGTTTGCACCCAACTCATTA

TAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTAAATA

GTTGCAGCATGCCATTGGGAATGGAGAGTAAAGCAATATCAGATGCACAG 6023-9587-PF;Kai 46 200914608 *

' ATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTTC ' AAAAGCTCGACTTCACCTCGAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGACCTCAGG TGAATAATCCAAAAGAGTGGCTGCAAGTGGACTTCCAGAAGACAATGAAA GTCACAGGAGTAACTACTCAGGGAGTAAAATCTCTGCTTACC.AGCATGTA TGTGAAGGAGTTCCTGATCTCCAGCAGTCAAGATGGCCATCAGTGGACTC TCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCC TTCACACCTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCT TCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGG TTCTGGGCTGCGAGGCACAGGACCTCTACTGA 下列序列對應於SEQ ID NO : 8的胺基酸序列，亦即， 對應於包括突變Asn2118A la之人類因子VIII輕鏈的胺基 酸序列：

SFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFT

DGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSL

ISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFS

DVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSW ί ;

YFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQR

IRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEML

PSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITA

SGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGA

RQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGASTGTLMVFFGNVDSSGIKHNI

FNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQ

ITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMK

VTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDS 6023-9587-PF;Kai 4 7 200914608 ' FTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY • 下列序列對應於SEQ ID NO: 9的胺基酸序列，亦即，

對應於I2144-T2161聚胜肽的胺基酸序列： IIARYIRLHPTHYSIRST

下列序列對應於SEQ ID Ν0: 10的胺基酸序列，亦即， 對應於全長人類因子V111之B功能區塊的胺基酸序列： SFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDL LMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQ LHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIP SDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSE ENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNAL FKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFK KVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQ NPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEG QNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQ EKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSY

['-：

DGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEK

YACTTRISPNTSQQNFVTQRSKR 下列序列對應於SEQ ID NO : 11的核酸序列，亦即， 對應於編碼包括突變Asn239G In之人類因子VIII重鏈的核 酸序列：

GCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATAT

GCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAAGATTTCCTCCTAGAG

TGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTG 6023-9587-PF;Kai 48 200914608

' TTTGTAGAATTCACGGTTCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACC

' CTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAGGCTGAGGTTTATGATACAG TGGTCATTACACTTAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCT GTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGCTGAATATGATGATCA GACCAGTCAAAGGGAGAAAGAAGATGATAAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCC ATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGAC CCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGGTAAAAGA CTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCCCTACTAGTATGTAGAGAAGGGAGTC TGGCCAAGGAAAAGACACAGACCTTGCACAAATTTATACTACTTTTTGCT GTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGAT GCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGCACACAG TCAATGGTTATGTACAGAGGTCTCTGCCAGGTCTGATTGGATGCCACAGG AAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCA CTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCCAGG CGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTG ATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTTGTCATATCTCTTCCCACCAACA TGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACAGCTGTCCAGAGGAACCCC AACTACGAATGAAAAATAATGAAGAAGCGGAAGACTATGATGATGATCTT ACTGATTCTGAAATGGATGTGGTCAGGTTTGATGATGACAACTCTCCTTC CTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTAC ATTACATTGCTGCTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTC GCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTCAATATTTGAACAATGGCCCTCA GCGGATTGGTAGGAAGTACAAAAAAGTCCGATTTATGGCATACACAGATG AAACCTTTAAGACTCGTGAAGCTATTCAGCATGAATCAGGAATCTTGGGA 6023-9587-PF;Kai 49 200914608 *

• CCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACACACTGTTGATTATATTTAAGAA

• TCAAGCAAGCAGACCATATAACATCTACCCTCACGGAATCACTGATGTCC GTCCTTTGTATTCAAGGAGATTACCAAAAGGTGTAAAACATTTGAAGGAT TTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCAAATATAAATGGACAGTGACTGT AGAAGATGGGCCAACTAAATCAGATCCTCGGTGCCTGACCCGCTATTACT CTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGGCCCT CTCCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGAGGAAACCAGATAAT GTCAGACAAGAGGAATGTCATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAGAACCGAA GCTGGTACCTCACAGAGAATATACAACGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGA GTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAGCCTCCAACATCATGCACAGCAT CAATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTGCATGAGG TGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTTCCTTTCT GTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGACAC ACTCACCCTATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAA ACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGTGCCACAACTCAGACTTTCGGAACAGA GGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTGACAAGAACACTGGTGA :；

TTATTACGAGGACAGTTATGAAGATATTTCAGCATACTTGCTGAGTAAAA

ACAATGCCATTGAACCAAGA 下列序列對應於SEQ ID NO : 1 2的胺基酸序列，亦即， 對應於編碼包括突變Asn2 3 9G In之人類因子VIII重鏈的胺 基酸序列：

ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTL

FVEFTVHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHA

VGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASD 6023-9587-PF;Kai 50 200914608

" PLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFA

' VFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVQRSLPGLIGCHR KSVYWHYIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLL MDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDL TDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVL APDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILG PLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKD FPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGP LLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAG VQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLS VFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNR GMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR 下列序列對應於SEQ ID NO: 1 3的核酸序列，亦即， 對應於編碼包括突變Asn211 8G In之人類因子VIII輕鏈的 核酸序列：

AGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCT

CTGGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTC

AGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACT

GATGGCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATGAACATTT

GGGACTCCTGGGGCCATATATAAGAGCAGAAGTTGAAGATAATATCATGG

TAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCTT

ATTTCTTATGAGGAAGATCAGAGGCAAGGAGCAGAACCTAGAAAAAACTT

TGTCAAGCCTAATGAAACCAAAACTTACTTTTGGAAAGTGCAACATCATA

TGGCACCCACTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCT 6023-9587-PF;Kai 51 200914608

* GATGTTGACCTGGAAAAAGATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCT

GGTCTGCCACACTAACACACTGAACGCTGCTCATGGGAGACAAGTGACAG TACAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGACCAAAAGCTGG TACTTCAGTGAAAATATGGAAAGAAACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCA GATGGAAGATCCCACTTTTAAAGAGAATTATCGCTTCCATGCAATCAATG GCTACATAATGGATACACTACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGG ATTCGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTAT TCATTTCAGTGGACATGTGTTCACTGTACGAAAAAAAGAGGAGTATAAAA TGGCACTGTACAATCTCTATCCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTTA CCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCT ACATGCTGGGATGAGCACACTTTTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGA CTCCCCTGGGAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGATTACAGCT TCAGGACAATATGGACAGTGGGCCCCAAAGCTGGCCAGACTTCATTATTC CGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAAGG TGGATCTGTTGGCACCAATGATTATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGCC CGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCATGTATAG k ’ TCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGACAGTCCACTGGAACCT TAATGGTCTTCTTTGGCAATGTGGATTCATCTGGGATAAAACACAATATT TTTAACCCTCCAATTATTGCTCGATACATCCGTTTGCACCCAACTCATTA TAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTAAATA GTTGCAGCATGCCATTGGGAATGGAGAGTAAAGCAATATCAGATGCACAG ATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTTC AAAAGCTCGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGACCTCAGG TGAATAATCCAAAAGAGTGGCTGCAAGTGGACTTCCAGAAGACAATGAAA 6023-9587-PF/Kai 52 200914608 t

' GTCACAGGAGTAACTACTCAGGGAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATGTA * TGTGAAGGAGTTCCTCATCTCCAGCAGTCAAGATGGCCATCAGTGGACTC TCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCC TTCACAGCTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCT TCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGG TTCTGGGCTGCGAGGCACAGGACCTCTACTGA 下列序列對應於SEQ ID NO : 14的胺基酸序列，亦即， 對應於包括突變Asn2118Gln之人類因子VIII輕鏈的胺基 酸序列：

SFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFT

DGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSL

ISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFS

DVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSW

YFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQR

IRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEML

PSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITA f

ν' SGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGA RQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGQSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNI FNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQ ITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMK VTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDS FTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY 本發明並不限於此處所述特定之實施例的範圍。實際 上，對本發明所述内容之額外不同的修飾，由先前所述以 6023-9587-PF;Kai 53 200914608 氤 •及相關圖式而言，對於熟悉技藝人士是明顯的。這類的修 •飾將落入所附申請專利範圍的範圍内。以下實施例係用於 示範本發明，而非加以限制。. 實施例 實施例1 :衍生自單核球的人類樹突細胞 周邊血液單核球細胞從健康成年捐贈者之加入抗凝血 劑的白血球衣（heparinized buffy coats)分離，附著於塑 膠細胞培養皿，以含有1 〇 %人類A血清、麵胺酸、抗生素 r·... 之RPMI 1 640培養液培養60分鐘。以培養液輕輕沖洗3次 移除未附著的細胞。附著的單核球被培養於丨v〇 1 5培 養液（Cambrex Bio Sciences, Paris, France)，並添加 人類AB血清、抗生素’ 5〇〇iu/mL之重組人類介白素 4(rhIL-4)、R&D 糸統（R&D Systems, Lille, France)以及 1 000 IU/mL之重組人類顆粒球巨嗟細胞集落刺激因子 (rhGM-CSF)、與 I_unoTools(Friesoythe，Germany)進行 培養。培養液的一半’包括所有的添加物，每2天更換一 、 次。培養5天後’對應於樹突細胞豐富的部分之未附著與 附著不緊密的細胞被收取’清洗，並用於後續的實驗。 實施例2 :人類重組全長因子VI11、具有螢光蛋白之b功 能區塊删除之人類重組因子V111的接合 重組人類全長因子 VIII(l〇〇〇 IU, Kogenate， Bayer)、重組人類B功能區塊删除之因子VI11 (BDD-FVI11， 1000 IU，Refacto®, Wyeth)，被溶解於水 _，以含有 5mM CaClz之重碳酸鹽缓衝液（pH9_ 2) ’於4°C下進行透析，接 6023-9587-PF;Kai 54 200914608 . 著以 5- 螢 光異硫氰酸鹽 （fluorescein ' 5-isothiocyanate ； isomer I， Sigma-A1 drich, Saint Quentin Fallavier，France)，於 4°C 接合 7 至 8 小時。 被標記的因子VIII再次以RPMI 1 640培養液被透析，以除 去未接合的FITC。、因子..VIII-FITC以Bradford試驗定.量， 利用胎牛血清球蛋白作為標準。 實施例3 :與因子V111内噬作用有關之受體的性質 貫驗步驟 在添加40" g/ml之FVIII-FITC培養2小時之前，樹 突細胞先於37°C，以5毫莫耳濃度EDTA、甘露聚糖（lmg/mI) 或半乳糖（lmg/ml)處理30分鐘。以於rc的内噬作用當作 控制組（未顯示）。 結果 第1A圖：在刪的例子，FVIn—FITC的内嗟作用祐 抑制達92±16·5%(Ρ<0·01)。此資料顯示二價離子相關受體 在樹突細胞因子V⑴内嗟作用所扮演的角色。聚碳水化合 物甘露聚糖’甘露賴感攝取之模式競爭配體，降低 =:C的攝取達6°卿卿，而半乳糖敏感攝取 之模式规肀配體，不具顯著效果。 第1Β圖：利用FITC標記的葡萄聚糖 · 聚糖對於甘露醣敏感CLRs的專一 ：：：甘路 感之⑽s的典型配體，…鳴檐為甘露醣敏 咖… 6’以及榮黃(⑹加 ，Y)/、内化作用單獨由受體依賴型巨 行。在甘露聚糖存在下，葡 t飫作用進 匍萄聚糖的内化作用被阻卻達 6023-9587-PF；Kai 55 200914608 ·. 89±9·3%，而LY未被影響。 結論 、σ果頌不甘露醣敏感受體調節樹突細胞對因子VI11 内噬作用的顯著部分。 實施例4:樹突細胞對因子VIII之甘露醣敏感攝取產生因 子VIII何生胜肽至因子ν丨丨〗專一性⑶τ細胞的表現 實驗步驟 第2A圖：由MHC-II相符的捐贈者產生的樹突細胞以 、 坨養液單獨培養（1〇〇〇〇細胞/培養井），或加入甘露聚糖（】 毫克/¾升）或抗-CD206 IgG(1〇微克/毫升），接著與FVIII 專一性T細胞株D9E9(5〇〇〇細胞/培養井）培養，在不同劑 量（5.56、2.78或L39微克/毫升）的全長因子 乂111(1(〇狀脱忱@)與20單位/毫升rML —2存在下，於3rc 培養20小時。τ細胞的活化以培養上清液釋放的干擾素一 T評估。 I) 第2B圖：由MHC-II相符的捐贈者產生的樹突細胞以 甘路聚糖（1毫克/毫升）或抗-CD206 IgG(l〇微克/毫升）預 先培養，接著添加因子VI Π(5. 56微克/毫升）或胜肽 I -T (2微克/毫升）以及D9E9。每個處理中，干擾素一 7的產生被指出與每個單獨實驗的最大值相關（*: Ρ<0· 0001 使用 Mann-Whitney 試驗法評估）。 第1C圖：人類因子V111專一性HLA相符的B細胞株 LE2E9、B02C11或DCs被單獨培養’或是加入甘露聚糖培 養（1毫克/毫升）’接著與全長因子VIII(K〇genate®)及 6023-9587~PF;Kai 56 200914608 ， D9E9培養。 * 結果 上述資料驗證甘露聚糖對於D9E9活化作用的抑制效 果’起因於阻止樹突細胞對因子vi u之甘露醋敏感性内嗟 作用。 貝％例5 ·被暴露於B功能區塊外之甘露醋殘基對於樹突 細胞因子V I I I内〇菜/f七田道：# rp , 鬥巫作用v致T細胞之活化扮演顯著角色 實驗步驟 第3Α圖：在添加全長因子vm_FITC(K〇genate(E))(4〇 微克/毫升、143奈莫耳濃度（nM)、全圓形（fuU circles))、或 BDD—FVIII—FITC(24. 31 微克/毫升、i43nM、 空圓形（empty circles))、或葡萄聚糖—FITC(5〇微克/毫 升）之前，以甘露聚糖（1、5、10、1〇〇與1〇〇〇微克/毫升） 預先培養樹突細胞被。以細胞流量計分析抗原的攝取。計 算每個條件對應不含甘露聚糖的條件來分計抑制作用的比 例。 第3B圖：原生或EndoFl處理的BDD-FVI11 (3. 7微克） 以7. 5% SDS-PAGE分離’並轉移至；s肖酸纖維素膜 (nitrocellulose membrane)。移轉的蛋白質以 pr〇1：〇g〇ld® 顯示’或與10微克/毫升CTLD4-7-Fc後續培養，利用驗性 磷酸接合的抗人類IgG。輕鏈（LCh)與重鏈（HCh)被確定， 經由以輕鏈與重鏈專一的抗-因子VI Π單株I 抗體的墨 點（未顯示）。 第3C圖：BDD-FVIII的EndoFl處理降低τ細胞活化 6023-9587-PF;Kai 57 200914608 * \ 作用。結果係為3次獨立實驗的代表。 ， 結果 上述資科確認位於B功能區塊之外的甘露醣封端聚糖 對於因子V111攝取的關連。 第3B圖：以EndoFl處理之寡甘露醣的移除被指出， 經由BDD-FVIII移動的資料位移，以及被CTLD4—7_Fc的辨 識的缺乏。 第3C圖：與EndoFl處理之BDD-FVIII培養的樹突細 ' 胞活化D9E9較低程度，相較於與原生bdd_fviu培養者 (Ρ<0·0001 ’於DC的情形）。應注意的是，BDD-FVIII的去 甘露醣作用不足以降低T細胞活化，當使用甘露聚糖飽和 DC的甘露醣受體。EndoFl處理的BDD-FVI11所殘留活化 D9E9的能力，可能對於因子vΠ I維持之乙醯葡萄糖胺 (N-acety卜glucosamine)殘基的存在有貢獻，其對甘露醣 敏感受體表現輕微的親合性。 , 實施例6:被修飾之因子¥111輕鏈人5112118八18的1'細胞 ί ^ u 活化作用 貫驗步驟 由 Dr E Saenko(University of Maryland, Baltimore, MD, USA)提供之純化的源自血漿之因子VI11 (wtLCh)，以 Endo-Fl處理或無。wtLCh、wtLCh於甘露聚糠（1毫克/毫升） 存在下、以及Endo-Fl-處理的wtLCh被加入樹突細胞（第4A 圖）、或B02C11(第4B圖），並與D9E9細胞共同培養20小時。 D9E9的活化作用經由ELISA量測培養上清液中的干擾素-r 6023-9587-PF;Kai 58 200914608 _ ··而被評估。第4C圖與第4D圖顯示因為 • LCh-FVinUSn2118Ala-LCh-FVI ⑴的定.點突變，臟9 減少 活化作用。B02C11B細胞株與衍生自單核球的樹突細胞被與 D9E9培養，分別在野生型LCh(第扎圖）或突變的 Asn2118Ala-LCh-FVI IK第4D圖）存在的條件下。Ala殘基對 Asn2118的取代移除了 N-甘露醣基化的位置。⑽“的活化作 用在2 0小時後，以量測培養上清液中的干擾素_ γ而被評 估。 r.+ ' ? 結果 第4A與4B圖：首先，驗證了 wtLCh以甘露醣敏感之形式 進入讨生自单核球的樹突細胞，並活化F V11 I專一性D 9 e 9 丁 細胞株。樹突細胞對D9E9的活化作用，相較於未處理的 wtLCh(第4A圖）在wtLCh與甘露聚糖培養的情形、與 Endo-Π-處理的wtLCh的情形顯著地降低。相反地，經由因 子VIII專一性B細胞受體吞噬因子VIII的B02C11 B細胞對 D9E9的活化作用，以wtLCh與甘露聚糖培養、或以Endo_F卜 處理的情形並未改變（第4 B圖）。這些資料聯想到對完整因 子VIII的觀察（第3圖），並顯示因子VIII輕鏈進入源自單核 球之樹突細胞主要係依靠甘露醣化的聚糖。 第4C與4D圖：以ELISA確認適當的Asn2118Ala LCh折 疊’利用對因子V111之C2功能區塊的構形抗原決定位專一 之單株人類IgG(亦即，由B02C11 B細胞株所產生的IgG)。 被wtLCh活化的D9E9均經由B02C11與DCs的表現（第4C圖）。 相反地’當 D9E9 被 Asn2118Ala-LCh-FVIII 經由 B02C11 的表 6023-9587-PF;Kai 59 200914608 現而被活化，DC作為抗原表現細胞時並未被活化（第4D圖> 貫施例7 :重組因子v III變異株的選殖與生產 步驟1_不同重組因子Π.Π變異株的選殖 編碼 BDD-FVIII 的 cDNA(來自 ATCC， clone PSP64-FVIII)、重組全長因子 vln(K〇genate，Bayer)、 或任何被修飾的因子ν π I被當作本實施例的“因子 VIII” 。因子VIII被次選殖至次選殖載體（vector pCR®-Blunt ΙΙ-Τ0Ρ0®)，利用 Zero Blunt® Τ0Ρ0® PCR 技 術。定點突變利用適當的引子進行，以產生4個不同的因 子VIII變異株cdna : -野生型序列 -單一重鏈變異株：密碼AAC(Asn239)—密碼 GCC(Ala239) -單一輕鏈變異株：密碼AAT(Asn2118)—密碼 GCT(Ala2118) -雙重變異株：Asn239Asn2118 -> Ala239Ala2118 插入物以合適的限制酶分解’純化並與用於在真核細胞株 表現蛋白質的 pCDNA3.1( + )載體（invitrogen，Carlsbad， CA， USA)、或用於體内高壓注射的pLiVE載體（Mirus， Madison, WI，USA)黏合於端點。 步驟2 ·哺乳動物細胞株的暫時性轉染 不同的pCDNA3.1( + )-FVIII變異株被轉染至不同的真 核細胞株：中國倉鼠卵巢細胞株（CH0)、幼倉鼠腎細胞株 (BHK)、以及HKB11細胞株（腎與B細胞的混合物；ATCC # 6023-9587-PF;Kai 60 200914608 CRL-12568)，利用 Nucleofector® 技術（Amaxa ' Biosystems)。典型地，Nucleofector®技術允許細胞70至 100%的穩定轉染。HKB11細胞特別被發展用於生產重組因. 子 V111。 FVI11於上清液被偵測到，利用三明治ELISA、表面電 漿共振（surface p 1 asmon resonance, SPR, Biacore®)、 以及西方墨點法。FV111的濃度被與商業可購得之重組因

子 VIII 標準（rFVIII，Kogenate®, Bayer, orBDDBrFVIII "..

Ref act o® Wyeth)相比較。暫時性轉染指出全部的因子νπ I 變異株均以細胞製造。 步驟3.不同因子 VIII構築物的體内轉染（//7 transfection of the different FVIII constructs) 選殖至pL ΠΕ載體之不同的因子V111構築物被注射至 因子 VIII 缺乏的小鼠（FVIII-deficient mice)。100 微克 的每一種質體在5秒内被腹腔注射2毫升。此方法，稱為 f 尚壓注射（hydrodynamic in jection)” ，過去已成功被 應用在溫韋伯氏因子（VWF )缺乏的小鼠表現大量的溫韋伯 氏因子（25)。這些實驗中，VWF的表現被維持達3週以上， 優於野生型小鼠血漿中的含量。在此，因子V111表現的動 力學在3週後以EL ISA、SPR與西方墨點法進行。 步驟4_哺乳動物細胞株的穩定性轉染與小規模生產 穩定性轉染如步驟 2所述方式進行。使用 Nucl e〇f ect〇r®技術轉染標的細胞株之後，細胞以序列稀釋 篩選。生產因子V111的細胞將被增長，而品系被冷凍保存 6023-9587-PF;Kai 61 200914608 ' 於-80°C。蛋白質的小規模生產於DMEMl : 1-F12接著標準方 _ 法進行。簡言之’於收集培養上清液前，細胞生長3至4 天至半滿狀態（subcon fluency)。培養上清液將被測試因子 VIII變異株的存在，經由ELISA、表面電漿共振（Biacore®) 以及西方墨點法’利用老鼠與人類單株抗-因子VI丨I I gG。 因子VIII的含量被定量，使用商業可購得之rF VIII作為 標準（Kogenate，Bayer，or Refacto Wyeth)，以評估每天 每個細胞的因子V111產量。 步驟5.增加分泌/生產rFVI 11變異株產量的建議溶液 哺乳動物細胞生產的rF V111含量被不同因素限制：1) 因子VI11的A1功能區塊與内質網（ER)保護蛋白 (chaperones)的相互作用，例如免疫球蛋白結合蛋白質 (lmmunoglobul in-binding protein，BiP)，抑制因子 vi j j 的分泌；2)因子VIII分子上的甘露醣基化糖類與 LMAN1(ERGIC53)的結合需要適當的由ER傳送至高基氏 體，因此所有N-連結的醣基化作用的移除應該要被避免， 不僅是預防與LMAN1結合並傳送因子VI丨卜相反地，因子 VI Π生產/分泌的產量可以經由分子的生物工程而增加： 1 )B功能區塊的切割部分的增加、表現6個N_醣基化作用 位置、相較於野生型功能區塊刪除的rFVIU，藉由多個折 疊增加rFVIII的生產；2)Phe309突變為⑹殘基降低與 BiP結合，並增加因子VIII的分泌。依此觀點，以定點突 變刪除N-醣基化作用的位置可能導致減少因子νηι的生 產。實際上，野生型B功能區塊刪除的因子vin CD·具 6023-9587-PF;Kai 62 200914608 有3個醣基化作用的位置。定點突變之後，僅有一個位置 被』望維持· A3功能區塊的Asn 1 81 0，其可能不足以供分 子適合的分泌。 若因子VIII的低產量以突變的rFVIn變異株而得 到，可能導入編碼因子VIII的B功能區塊前226個胺基酸 之cDNA序列構築物。這個序列具有6個N_醣基化作用的

位置。為此目的，mRNA已從人類肝臟萃取物被萃取，而人 類 cDNA 業已被製備（由 Dr Cavard 提供，c〇chin，

Paris)。編碼B功能區塊DNA利用合適的引子而被增加， 亚被插入4個因子v III構築物的重鏈與輕鏈之間。具有B 力月b區塊的構築物接著被選殖至pC])NA3與載體。細 胞被轉染’而表現以前述方法研究。 實施例8 :經修飾之因子VI丨丨的中規模生產 由實施例7而來的因子vm(野生型 /239,21 18,239，118_)，於補充血清的基礎培養液 中，利用滾動培養航被生產。足量的不同因+ νιπ於滚動 培養瓶被生產，接著以親合管柱純化。完成下述實驗所需 的評估含量，每個變異株約2毫克（1〇〇〇〇單位（υι))。純 化過程的產率接近約25%，因此需要每個因子νηι變異株 生產8毫克（40000單位）。 每個選殖株之因子VIII的生產依據每個選殖株的生 產力。高水準生產者（>5UI/1Q6細胞/天），單—批次的滾動 培養瓶生產就完成。低度的生產者（<5UI/1〇e細胞/天），生 產茜利用重複批次的滾動培養瓶進行。 6023-9587-PF;Kai 63 200914608 . 實施例9 :被修飾因子VI11結構/功能的完整性 ' 步驟1.重組因子VIII變異株的體内轉染 來自實施例7或8的不同因子v πI構築物被選殖至 pLIVE載體，並經由高壓注射表現於因子νΠΙ-缺乏的老 鼠。老鼠血清的因子V111含量利用三明治EL ISA與功能性 凝結試驗（functional coagulation assays)。老鼠凝血作 用的权正以斷尾與流血時間的測量以及流血量的測量調 查。 步驟2 ·體外的促凝血活性 4個重組因子V111變異株（實施例7)的促凝血活性於 體内與體外被調查。稀釋液中的因子VIII被與去除因子 \ I Π的人類血漿培養，其活性以功能性凝結試驗 (FibrinTimer CA540，Dade-Behring)量測。此外，因子 VIII的活性以顯色試驗（chrom〇genic assay)評估，其中 因子VIII被活化的因子IX、因子χ、或磷脂混合。活化的 : 因子X的產生隨後以活化的因子X的顯色合成受質來量 測。分析不同因子V111構築物的專一活性。較佳利用刪除 B功能區塊之因子VIII(Refact〇®，Wyeth)。由因子產 生之結果被表現為標準除以測試樣品tl,2(半數最大反應， half maximal response)值之比例值。 步驟3.因子VIII與單株抗體、溫韋伯氏因子與磷脂的交 互作用 不同因子V π I變異株與單株抗體、溫韋伯氏因子與磷 脂的交互作用被調查。 6023-9587-PF；Kai 64 200914608 步驟4 ·轉錄後修飾作用分析的方法 a)因子V111的去鹽化、濃縮與活化 因子V111樣品的濃縮與去鹽化被需要以去除鹽類、單 醣與可能影響進一步分析的小分子。 去鹽化於 AKTA Purifier 系統（AKTA Purifier system, Amersham-Biosciences)被進行，裝備逆相（reversephase RP)Uptisphere 10WC4- 25QS 管柱（lnterchim)，以 5% MeCN + TFA 0. 1%平衡。洗提使用 5 至 9〇%梯度 MeCN + TFA 〇. 1% 於5CV内進行。去鹽的產物被收集，並以Speed —真空 乾燥機乾燥。 純化的因子VIII樣品亦可經由凝血酶處理活化。產生 的因子鏈可隨後使用通常MecN+TFA梯度之 RP-HPLC(UPtisPhere UP5WOD$25QK)而分離。 b)因子VIII的酵素去醣基化作用 i)PNGase F去醣基化作用

顺㈣17係為對N—聚糖結構專一的酵素。去鹽化盘草 無之後’因子ΠΠ被重新懸浮於酵素緩衝液，加入或未力 入還原劑，並於室溫培養15分鐘。酵素接著被力 毫單位（mIU)/200微克），而去 云醣基化作用於37°C培養1 小時而進行。 ii)Endo-H去醣基化作用 混合類型的N-聚糖結構專— 因子ΠΙΙ被重新懸浮於酵素 ’於95C被加熱5分鐘。在

EndoH係為對寡甘露醣與 的酵素。去鹽化與乾燥之後， 緩衝液，加入或未加入還原劑 6023-9587-PF;Kai 65 200914608 宅單位/微克p r 〇 t)。 冰上冷卻之後，酵素被添加（E/S: 去醣基化作用於3rc進行2小時 iii)SDS-PAGE 分析 因子VUI的去醣基化作用可以部分地以PNGAse F或 ΜΗ的酵素切基化作用前後得到之產物# SDS-PAGE 分析為特徵。SDS-PAGE “（InvitrQgen，Ufe

Technologies)進仃。樣品在無還原的與還原的條件下被載 (〇· 5 ” 1 U 克）4 至 12%膠體（N〇vex)。在以 2〇〇v 移動 5〇 /刀鐘後白質被銀染。接著為膠體的數位掃瞄與積分 (Quantity One software，Biorad) ’ 不同蛋白質帶之明顯 分子量係與蛋白質標準比較而定。 iv)凝集素墨點試驗 包括因子ΠΙΙ之醣基化（複合體類型、高度甘露醣類 型）的胜肽與聚胜肽的專一性檢測，利用凝集素墨點分 析（Fukuda et Kobata， Glycobiology a pratical Appr〇ach) 進行。10微克的因子VIII如前述以SDS-PAGE分離，並移 轉至硝酸纖維素或尼龍膜，依據製造商的說明（N〇vex)。簡 言之，當墨點的膜被BSA阻卻，於PBST(PBS，Tween 20 0. 05%) /月洗’並於4 C與過氧化物酶（peroxydase, Ey labs)標記 之合適的凝集素（亦即，GNA、Con A、DGA、LcH、ΜΝΑ-Μ、 VFA、PEA、PMA、ΑΜΑ、…）培養2小時。於某些PBST清洗 之後’過氧化物酶以色度法或化學螢光法呈現，而形成的 墨點影像以掃描器或CCD相機擷取。影像分析與定量以

Quantity One software(Biorad)進行。 66 6023-9587-PF；Kai 200914608 •步驟5.因子VI11初級結構分析的方法 ' a)因子VIII製圖 因子VI11製圖有助於初級結構分析。蛋白質序列係為 獨特的’因此以特定酵素（胰蛋白酶（ trypsin)或内切蛋白 酶Asp-N(endop:rotease Asp-N))所消化後產生的胜肽為所 注意之蛋白質的特徵。去鹽化與乾燥之後，因子V111被變 性（8M 尿素）’被還原（DTT 20 moles/mole of SH)，以及 被烷基化（iodoacetamide 40 moles/mole of SH)。因子 VI11隨後以胰蛋白酶消化（E/s: 1/25m/m)，其在Arg(R) 與Lys(K)殘基之後切割蛋白質。Asp_N(E/s: i/1〇〇m/m)亦 被使用’其在Asp(D)殘基之前切割蛋白質。蛋白質消化之 後，所產生的胜肽被直接地注入LC-MS/MS系統分析，或是 以逆相HPLC管柱層析分離，使用增加的乙腈 (acetonitrile)梯度的Cl 8 300A管柱。餾分最後被收集， 並以 Speed-Vac 乾燥，以用於 Edman Sequencing 與 MALDI-T0F MS的其他分析。 j b)Edman 定序 因子VI11的Edman定序以3步驟程序在微定序 機（microsequencer， Procise 491 HT， Applied Biosystems)進行：配對-切割與轉換（c〇upHng- cleavage and conversion)。胺基酸以逆相管柱層析分離。N_端殘基 的分析與鑑定被達成’經由使用Sequence Pr〇(AppHed Biosystems)之標準胺基酸並與因子νπι理論上的序列比 對，因而提供例如胺基酸取代作用的構形。 6023-9587-PF;Kai 67 200914608 C )質譜儀 基質輔助雷射脫附游離法（MALDI T0F(/T0F)) 基質輔助雷射脫附游離/飛行時間質譜技術 (MALDI-TOF MS)係為一種技術，能使分子質量的量測具有 很高的精準度。MALDI-TOF MS為一種離子化的方法，能分 析胜肽、蛋白質與聚糖。 受注意的胜肽、蛋白質與聚糖（因子VI11、其片段或 聚糖）與吸收雷射光波長的基質混合。最常使用的基質為用 於胜肤的 a-泉基_4-經基肉桂酸（a_ cyano — 4 一 hydroxycinnamic acid， HCCA)，用於蛋白質的芥子酸 (SA) ’以及用於寡糖的2, 5-二經苯曱酸（2, 5- di hydroxy benzoic acid, DHB)。每個胜肽的鑑定以透過質 譜儀量測其質量而進行，並將其與理論上的蛋白質序列推 論之理論上的質量比較。胜肽定序可以使用MS/MS實驗進 行（串聯質譜（T0F/T0F)，以提供的胜肽在這些條件下得到 的片段離子為基礎。相似的策略被用於寡糖的鑑定/特性描 述。可利用儀器（Bruker Autoflex 2 instrument)。 液相色譜-電噴霧離子化質譜聯用技術 與MALDI相&，電喷霧離子化（electrospray =加咖:則不需要基質的使用。在阳，樣品溶液 立 彳在间電壓下。強力電場被加於試 + 務冋％穿過質譜分析儀路秤 的電場與壓力梯度。 工 以ESIMS的分析可以被 仃在4化作用下被管柱層 6023-9587-PF;Kai 68 200914608 . 析分離之後’亦可得到胜肽製圖。在因子VI11的情形，胜 肽的分離可以在乙腈梯度的Uptisphere UP5WOD25QK管柱 (Interchim)進行。 以質譜儀的偵測被進行，經由Qq_T〇F混合質譜儀 (Qq-TOF hybrid mass spectrometer,四極飛行時間 (quadripole- time of flight), Qstar-xl, Applied Biosystems)，其能收集MS與MS/MS資料。因此，胺基酸 序列的涵蓋範圍可以被達成。 ' d)HPCE-LIF寡糖製圖 連接於天冬醯胺酸或“N—連結結構，，之不同寡糖結構 的特性描述與定量以HPCE-LIF進行。糖類經PNGase F處 理而由因子VI11釋放，並以冰冷酒精之蛋白質沈澱法分 離。樣品以外切糖苷酶（exoglyc〇sidases，如唾液酸酶 (sial idase)、半乳糖苷酶（gaiact〇sidase)、甘露醣苷酶 (mannosidases)、乙醯己糖胺酶（hexnacase))處理，以確 涊每個分離的結構被定量與定性。全部所使用的糖苷酶係 ‘ 購自Prozyme。在此階段，進行第2次的酒精沈澱。所得 到的聚糖以螢光標記（fluroph〇re，APTS)，並依據其質量 與電荷而被分離。2個標準（葡萄糖同質聚合物（gluc〇se homopolymers)、募糖）使結構能鑑定。

Beckman Coulter N-CH0 披覆的毛細管（Beckman

Coulter N-CHO coated capillary)(直徑 50 公分 x 50 微 米ID)被裝置於毛細管電泳（Prote〇meLab pA8〇〇, Beckman Coulter)。實驗條件為·•分離緩衝液《膠體緩衝液 6023-9587-PF;Kai 69 200914608 .-N-Beckraan cou 11 er» (separat i on buffer <<gei -buf fer —N-Beckman coulter»)，於 25KV、20t 移動 20 分 鐘’而雷射檢測使用入ex 488nm與λ em 520奈米。 e)NP-HPLC寡糖製圖 連接於天冬醯胺酸的不同寡糖結構，稱為N —連結結構 的鑑定與定量經由正相高效液相層析（Np - HpLC)被進行。 N-聚糖使用特定酵素（PNGase F)而被釋放，並以酒精沈澱 分離。所得到的聚糖以2-氨基苯甲醢胺（2-AB)螢光標記。 標§己的聚糖以利用醯胺-8〇(Amide-80)管柱（Tosohaas)的 NP-HPLC進行，其連接於《Gold»系統（Beckman)。 在樣品注射之前’管柱以80%乙腈緩衝液平衡。寡糖 以增加梯度的50毫莫耳濃度、PH4. 45曱酸銨沖提。偵測 利用；I ex 330奈米與；I⑽420奈米的螢光進行。 實施例10:在因子VIII缺陷之小鼠的Asn2118Ala LCh免 疫原性 實驗步驟 純化的源自血漿之人類因子VI π輕鏈（wtLCh)係由Dr E SaenkoCUniversity of Maryland, Baltimore, MD, USA) 提供。突變之因子VIII的LCh(Asn2118Ala LCh)被產生與 製造。wtLCh與突變的LCh以每週四次的間隔，被腹腔注 射（0. 2微克蛋白質於200微升PBS)至因子VIII缺陷小老 鼠（Prof Kazazian 提供，Pennsylvania University, USA )。四次注射後一週，小鼠被犧牲出血，而抗-因子v 111 I gG的含量使用因子VI11專一之EL ISA調查。 6023-9587-PF;Kai 70 200914608 • ELISA :小鼠血清由1被稀釋至99，並於披覆人類因 * 子 VI11 (Recombinate, Baxter)的試盤培養。試盤利用 PBS-1% BSA阻塞。結合的IgG利用結合過氧化物酶的多株 抗-老鼠IgG(anti-murine IgG)、以及過氧化物酶受質（〇pD) 顯現。結合的強度利用光度計.測量，以光譜儀（Tecan Genyos)於492奈米波長’因而定義抗-因子vin IgG的含 量。 結果 純化的源自血漿之人類因子VIII輕鏈（wtLCh)的腹腔 注射至因子V111缺陷之小鼠’產生可偵測的抗因子y 111 IgG濃度。值得注意的是，由本實驗6隻被誘導的小鼠觀 察，小鼠對wtLCh的免疫反應為多向的（heterogeneous)。 相反地，以突變的Asn2118Ala LCh處理小鼠不會產生主要 含量的抗因子VIII IgG。 結論 ： 這些資料顯示，相較於wtLCh，Asn2118Ala LCh引起 專一免疫反應的能力明顯的降低。 參考文獻： 1. Lenting P, et al. 1 998. Blood 92( 1 1 ):3983-96 2. Lusher JM et al. 2003 Hoemophilia 9: 38-49 3. Ehrenforth S， et al. 1992. Lancet 339:594. 4. De Biasi R, et al. 1994. Throm Haemost 7(5):544 5. Gringeri A, et al. 2003. Blood 102:2358 6. Banchereau J, et al. 1998. Nature 392:245 6023-9587-PF/Kai 71 200914608 < ' 7. Trombetta ES, et al. 2005. Annu Rev Immunol 23: - 975 8.Geijtenbeek TB, et al. 2004. Annu Rev Immunol 22:33 9.Sallusto F, et al. 1995. J Exp Med 182:389 10. Geijtenbeek TB, et al. 2000. Cell 100:575 11. Keler T, et al. 2004. Expert Opin Biol Ther 4: 1953 12. Saint-Remy JM et al. 1 999 Vox Sang ; 77 (suppl 1): 21-24 13. Jacquemin et al. 20 00 Blood 95: 156-1 63 14. Jacquemin et al. 1998 Blood Jul 15; 92 (2): 496-506 15.Subramani et al. 1981 Mol. Cell. Biol. 1:854-864 16. Boshart et al. 1985 Cell 41:521-530 \ 17. Kaufman and Sharp, 1982 Mol. Cell. Biol. 2: 1304-1319 18. Bergman et al. 1 983 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7041-7045 19. Loh et al. 1983 Cell 33:85-93 20. Palraiter et al. 1983 Science 222:809-814 21. DeNoto et al. 1981 Nuc. Acids Res. 9:371 9-3730 22. Pittman et al. 1994. Blood 84(12):4214-4225 6023-9587-PF;Kai 72 200914608 23.Kaufman RJ 1989. Nature 342(6246)： 207-208 ' 24.Toole et al. 1984. Nature 312(5992)： 342-347 25.Lenting et al_ 2007. Blood. 109(5):2267-2268 【圖式簡單說明】 第1圖：因子VIII的甘露醣敏感進入樹突細胞 (Mannose-sensitive entry of FVIII into Dendritic Cells (DCs))。 (A)在添加因子VI 11(40微克/毫升）培養2小時之前， 樹突細胞先於37°C，以5毫莫耳濃度EDTA、甘露聚糖（1 4:克/ ¾升）或半乳糖（1毫克/毫升）被培養3〇分鐘。報導 值指出相關抗原攝取被定義為[(37 cMFlinh - 4mmediun)/ (MF I medium ~ M F I m e d i u π ) ] X 1 0 0 ’ 其中 “ M F I i n h ” 為抑制劑 存在下所偵測到的MFI。結果係來自12個捐贈者，統計顯 著性依據原始資料以非成對Student檢定被計算。 f.、（ B)甘露聚糖在樹突細胞的内嗔作用的抑制作用。樹突 、J. 細胞以甘露聚糖（1毫克/毫升）預先培養，接著為葡萄聚糖 -FITC(50微克/毫升）或螢黃（200微克/毫升）培養2小時。 第2圖：樹突細胞對因子νΠΙ之甘露醣敏感攝取產生 因子VIII衍生胜肽至因子νΐ 11專一性CD4+ τ細胞的表現 (Mannose-sensitive uptake of FVIII by DCs results in the presentation of FVII I-derived peptides to FVI11-specific CD4+ T cells) (A)產生自DRBm501/DRB5*01健康捐贈者之樹突細 6023-9587-PF;Kai 73 200914608 胞被以培養液單獨培養（ 1 0000細胞/培養井），或加入甘露 聚糖（1 .毫克/毫升）或抗_CD2〇6 IgG(1〇微克/毫升），接著 與FVIII專一性τ細胞株D9E9 ( 5000細胞/培養井）培養， 在不同劑量（5. 56、2. 78或1. 39微克/毫升）的因子νιπ 與20單位/毫升rhIL-2存在下，於37°C培養20小時。丁 細胞的活化以培養上清液釋放的干擾素_ r評估。結果為來 自3至8個獨立貫驗的1個代表性實驗。干擾素_ ^產量隨 不同D9E9批次而變化，而不同來源的捐贈者樹突細胞被用 於分離的試驗。 (B)由MHC-11相符的捐贈者產生的樹突細胞以甘露聚 糖（1毫克/毫升）或抗—CD206 IgG(10微克/毫升）預先培 養’接著添加因子ΠΙΙ(5·56微克/毫升）或SEQ ID NO: 9 的胜肽I2144-T2161(2微克/毫升）以及D9E9。每個處理中，干 擾素-r的產生被指出與每個單獨實驗的最大值相關（*: P<0. 000 1使用Mann-Whitney試驗法評估）。結果來自3個 獨立的實驗。 ϋ CC)人類因子VI11專一性HLA相符的Β細胞株LE2E9、 B02C11或DCs’於因子νπΐ(10微克/毫升）與D9E9存在下 培養。 第3圖：被暴露於β功能區塊外之甘露醣殘基對於樹 突細胞因子V111内嗟作用導致Τ細胞之活化扮演顯著角色 (Α)以甘露聚糖（1、5、1〇、1〇〇與1〇〇〇微克/毫升）預 先培養樹突細胞被，接著添加因子VI 11(40微克/毫升、143 奈莫耳濃度、全圓形）、與BDD-FVIIIC24. 31微克/毫升、 6023-9587-PF/Kai 74 200914608 » ,l43nM、空圓形）、或葡萄聚糖-FITC(50微克/毫升）。抗原 ’的攝取被以細胞流量計分析。.抑制作用的比例被計算每個 條件對應不含甘露聚糖的條件。2個獨立實驗的代表。 (B) 原生或EndoFl處理的bdd-FVIII(3.7微克）被以 7. 5% SDS-PAGE分離，被轉移至硝酸纖維素膜。被移轉的 蛋白質以Protogold®顯示，或與1〇微克/毫升CTLD4_7_Fc 後續培養，利用鹼性磷酸接合的抗人類IgG。輕鏈（LCh)與 重鏈（HCh)被確定，經由以輕鏈與重鏈專一的抗—因子n j! 單株IgG抗體的墨點（未顯示）。 (C) BDD-FVIII的EndoFl處理降低τ細胞活化作用。 結果係為3次獨立實驗的代表。干擾素_ r的產量隨著不同 批次的D9E9而不同，且與不同實驗所使用之不同來源的人 類樹突細胞而不同。為了統計上比較3組實驗，干擾素— 7的生產以每個獨立實驗所得到的最大值平均化。τ細胞 活化作用的平均程度的差異在“培養液，，與“ End〇F卜處 :理”之間具有顯著差異，經由AN〇VA與Fi sher，s psLD檢 定評估（P<0.000 1，資料未顯示）。 第4圖：由野生型或突變因子VIII輕鏈的因子VI Η 專一性Τ細胞株的活化作用 、（〇與3)野生型因子VIII輕鏈的樹突細胞甘露醣敏 感進入導致Τ細胞的活化作用的確認。純化的源自血装之 因子νιπ輕鏈（野生型LCh)被以End0_F1處理。原生的野 生型LCh、野生型輕鏈於甘露聚糖（1毫克/毫升）存在下、 以及End〇-F卜處理的野生型輕鏈被加入樹突細胞（a組 6〇23-9587-PF;Kai Ί5 200914608 .或因子VI11專一之B02C11 (B組）’並與D9E9細胞共同培 • 養20小時。D9E9的活化作用經由ELISA量測培養上清液 中的干擾素-9"而被評估。 (C)與（D)因為因子VIII輕鏈的定點突變，D9E9的活 化作用的減少。B02C11B細胞株與衍生自單核球的樹突細 胞被與D9E9培養，分別在野生型LCh(C組）或突變的 Asn2118Ala LCh(D組）存在的條件下。Ala殘基對Asn2118 的取代移除了 N-甘露醣基化的位置。D9E9的活化作用在 ' 20小時後，以量測培養上清液中的干擾素_τ而被評估。 第5圖：全長因子VIII結構的示意圖 全長異二聚體的人類因子VIII (SEq id Ν0: 2)具有 2 332個胺基酸，包含一個“重鏈”，對應於殘基i至丨 且具有功能區塊A卜al-A2-a2-B, —個“輕鏈，，，對應於 殘基1 649至2332且具有功能區塊a3_A3_cl_C2(胺基酸殘 基的數目參照SEQ ID N0: 2的胺基酸序列）。因子vπ I分 子具有25個保守序列（Asn_Xxx_Thr/Ser)，允許N—連結的 醣基化作用，其中20被顯示為被醣基化的位置（1 )。 第6圖·原生全長人類因子VIII的胺基酸序列（如SEQ Π> NO ： 1) 底線的胺基酸序列對應於訊號胜肽，其具有原生的 王長人類因子VIII的前19個胺基酸。典型的全長異二聚 體的人類因子VI11 (SEQ ID N0: 2)之胺基酸編號由位置20 # Θ 酸開始。粗體表現的胺基酸殘基對應於保守的醣基 用位置’其車父佳地於本發明之實施例中被修飾。 6〇23-9587-PF.Kai 200914608 . 能區塊對應於SEQ IDNO: 1之位置76〇至位置1667 的胺基酸序列範圍，並揭露於第6圖。 原生&鍵於貫施例6當作控制組，其係指“純化的源 自血漿之因子νιΠ輕鏈，，，對應於SEQ ID NO: 1之位置 1668至位置2351的胺基酸序列範圍，並揭露於第6圖。 原生人類因子Viii的重鏈對應於seq id NO: 1之位 置1 9至位置759的胺基酸序列範圍，並揭露於第6圖。 第 7 圖：BDD(B Domain Deleted) -人類因子 yin. 因子V111的β功能區塊被顯示對促凝血活性是非必要 的。第7圖同時揭露胺基酸序列與核酸序列，對應於由seq ID NO·’ 2之全長人類因子VI丨丨刪除B功能區塊而獲得之B 功能區塊刪除的人類因子VIII。胺基酸序列與核酸序列被 放在一起，因此每個胺基酸（上方）面對對應之核酸密碼（下 方）。對應於BDD-人類因子VIII之胺基酸序列與核酸序列 係互相獨立地被編號（編號被揭露於序列右侧）。揭露於第 7圖之BDD-人類因子νιπ的胺基酸序列對應於SEQ 4的序列。揭露於第7圖之BDD_人類因子VI丨〗的核酸序列 對應於SEQ ID N0: 3的序列。粗體表現的胺基酸殘基（或 對應的核酸殘基）對應於保守的醣基化作用位置，其較佳地 於本發明之實施例中被修飾。符號“ *，，被置於停止密碼上 方。 第8圖：Asn在位置239取代Ala之修飾的人類因子 V111重鏈（參照SEQ ID N0: 2的全長人類因子VIII序列） 第8圖同時揭露胺基酸序列與核酸序列，對應於本發 6023-9587-PF;Kai ΊΊ 200914608 明之一特定實施例中被修飾的人類因子V111重鏈。胺基酸 ’ 序列與核酸序列被放在一起’因此每個胺基酸（上方）面對 對應之核酸密碼（下方）。對應於被修飾的人類因子V111重 鏈之胺基酸序列與梭酸序列係互相獨立地被編號（編號被 揭露於序列右側）。揭露於第8圖之被修飾的人類因子VIII 重鏈的胺基酸序列對應於SEQ ID NO : 6的序列。揭露於第 8圖之被修飾的人類因子π 11重鏈的核酸序列對應於SEQ ID NO : 5的序列。粗體表現之胺基酸殘基（丙胺酸）或對應 之核酸密碼對應於聽基化作用位置（Asn 239 )，其在本發明 之實施例中被修飾。 第9圖：Asn在位置2118取代Ala之修飾的人類因子 V111輕鏈（參知、s E Q ID N 0 : 2的全長人類因子v η j序列） 第9圖同時揭露胺基酸序列與核酸序列，對應於本發 明之一特定實施例中被修飾的人類因子νιη輕鏈。胺基酸 序列與核酸序列被放在一起，因此每個胺基酸（上方）面對 對應之核酸密碼（下方）。對應於被修飾的人類因子νιπ輕 鏈之胺基酸序列與核酸序列係互相獨立地被編號（編號被 揭露於序列右側）。揭露於第8圖之被修飾的人類因子Η。 輕鏈的胺基酸序列對應於SEQ ID Ν〇: 8的序列。揭露於第 8圖之被修飾的人類因子VIII輕鏈的核酸序列對應於 ID NO: 7的序列。粗體表現之胺基酸殘基（丙胺酸）或對應 之核酸密碼對應於醣基化作用位置（Asn 2218)，其在本發 明之實施例中被修飾。 第10圖：抗-因子VIII IgG在小鼠經由野生型或突變 6023-9587-PF;Kai Ί8 200914608 因子V111輕鏈的生產 ’ 純化的源自血漿之人類因子V111輕鏈（wtLCh)與突變 的因子V.111 .LCh(Asn2118Ala LCh)以每週四次的間隔，被 腹腔注射（0.2微克蛋白質於.2 0 0微升PBS )至因子V11J缺 陷小老鼠。四次注射後一週’小鼠被犧牲出血，而抗—因子 VIII IgG的含量使用因子VIII專一之ELISA調查。小鼠 血清由 1 被稀釋至 99 ，並於彼覆人類因子 VIII (Recombinate，Baxter)的試盤培養。結合的IgG利用 結合過氧化物酶的多株抗-老鼠IgG(anti-murine IgG)、 以及其受質（〇PD)顯現。結合的強度以光譜儀（Tecan Genyos)於492奈米波長測量。 第11圖：三種以甘露醣殘基封端之聚糖結構的示意 圖。 主要元件符號說明 益 〇 6023-9587-PF;Kai 79 200914608

27690- Seq list Definitif 080418 . SEQUENCE LISTING "<310> LFB biotechnologies

Insti tut National de la Sante et de la Recherche' Medicale (INSERM)

<120> Demannosylaled recombinant Factor VII] for the t reatment of patients with hemophilia A <130> 11465/39 ' <140> EP 07290495.6 <]41> 2007-04-20 ' :.. . r <160> 14 <170> Patent In version 3.3 <210> 1 <211> 2351

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Met Gin He Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15

Cys Phe Ser AJa Thr Arg Arg 丁yr 丁yr Leu Gly A]a Va] G】u Leu Ser 20 25 30

Trp Asp Tvr Met Gin Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 35 40 45

Phe Pro Pro Are Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Va] 50 55 60

Tyr Lvs Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn lie 65 70 75 80

Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr lie Gin 85 90 95

Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val lie Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 100 105 110

His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 115 120 125

Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gin Thr Ser Gin Arg Glu Lys Glu Asp 130 135 140

Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gin Val Leu ]45 150 155 160

Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser 165 170 175

Tyr Leu Ser His Va] Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu lie 180 185 190

Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr 195 200 205 第]頁 200914608

27690- Seq Jist Definitif 08041S

Gin Tin Leu His Lys Phe He Leu Leu Phe Ala Va] Phe Asp Glu Gly 210 215 220

Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gin Asp Arg Asp 225 230 235 240

Ala Ala Ser Ala Arg Ala 丁rp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly 丁yr 245 250 255

Va] Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu He Gly Cys His Arg Lys Ser Val 260 265 270

Tyr Trp His Val lie Gly Met Gly Thr Thr Pro G]u Val His Ser lie 275 280 285

Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gin Ala Ser 290 295 3⑻

Leu Glu lie Ser Pro He Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Leu Leu Met 305 310 315 320

Asp Leu Gly Gin Phe Leu Leu Phe Cys His lie Ser Ser His Gin His 325 330 335

Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro 340 345 350

Gin Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp 355 360 365

Leu Thr Asp Ssr Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser 370 375 380

Pro Ser Phe lie Gin He Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 385 390 395 400

Trp Va] His Tyr He Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 405 410 415

Leu Va] Leu A3a Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gin Tyr Leu Asn 420 425 430

Asn Gly Pro Gin Arg lie Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met 435 440 445

Ala Tyr Thr Asp G]u Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala ]le Gin His Glu 450 455 460

Ser Gly lie Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480

Leu I]e Jle Phe Lys Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Asn lie 丁yr Pro 485 490 495

His Gly lie Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys 第2頁 200914608 27690- Seq ]3st Definitif 080438 500 505 510

Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro lie Leu Pro Giy Glu lie Phe 515 520 525

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val G3u Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg 545 550 555 560

Asp Leu Ala Ser Gly Leu lie Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu 565 570 575

Ser Val Asp Gin Arg Gly Asn Gin I]e Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 580 585 590

lie Leu Phe Ser Val Phe Asp G]u Asn Arg Ser Trp 丁yr Leu Thr Glu 595 600 605

Asn lie Gin Arg Phe Leu Pro A.sn Pro Ala Gly Val Gin Leu Glu Asp 610 615 620

Pro Glu Phe Gin Ala Ser Asn lie Met His Ser lie Asn Gly Tyr Val 625 630 635 640

Phe Asp Ser Leu Girt Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala 丁yr Trp 645 650 655

Tyr lie Leu Ser lie Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe 660 665 670

Sei. Gly Tyi· Thr Phe Lys Hi s Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 680 685

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700

Gly Leu Trp lie Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly 705 710 715 720

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp 725 730 735

Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp lie Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys 740 745 750

Asn Asn Ala He Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gin Asn Ser Arg His Pro 755 760 765

Ser Thr Arg Gin Lys Gin Phe Asn Ala Thr Thr He Pro Glu Asn Asp 770 775 780 lie Glu Lys Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys 785 790 795 800 第3頁 200914608 27690- Seq list Defnmif 080418 lie Gin Asn Va] Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gin Ser 805 810 815

Pro Thr Pro His Giy Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gin Glu Ala Lys Tyr B20 825 830

Glu Thr Phe Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala lie Asp Ser Asn Asn 835 840 845

Ser Leu Ser Glu Met Thr His Phe- Arg Pro Gin Leu His His Ser Gly 850 855 860

Asp Met Val Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gin Leu Arg Leu Asn Glu 865 870 875 880

Lys Leu Gly Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys 885 890 895

Val Ser Ser Thr Ser Asn Asn Leu He Ser Thr 11 e Pro Ser Asp Asn 900 905 910

Leu Ala Ala Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met 915 920 925

Pro Val His Tyr Asp Ser Gin Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys 930 935 940

Ser Ser Pro Leu Thr Glu Ssr Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu 945 950 955 960

Asn Asn Asp Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gin Glu 965 970 975

Ser Ser Trp Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe 980 985 990

Lys Gly Lys Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala 995 1000 1005

Leu Phe Lys Val Ser lie Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser 1010 1015 1020

Asn Asn Ser Ala Thr Asn Arg Lys Thr His lie Asp Gly Pro Ser 1025 1030 1035

Leu Leu lie Glu Asn Ser Pro Ser Va] Trp Gin Asn lie Leu GIu 1040 1045 1050

Ser Asp Thr Glu Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu I]e His Asp Arg 1055 1060 1065

Met Leu Met Asp Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met 1070 1075 1080

Ser Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gin Gin 1085 1090 1095 第4頁 200914608 27690- Seq list Definitif 080418

Lys Lys Glu Gly Pro He Pro Pro Asp Ala Gin Asn Pro Asp Met 1100 1105 1110

Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala krg Trp I]e 1115 1120 1125

Gin Arg Thr His G']y Lys Asn Ser Leu Asn Ser Giy Gin Gly Pro 3130 1135 1140

Ser Pro Lys Gin Leu Va] Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu 1145 1150 1155

Gly G3n Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys Va3 Val Va] Gly Lys ]160 1165 Π70

Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Va] Phe Pro 1175 1180 1185

Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His GJu 1190 1195 1200

Asn Asn Thr His Asn Gin Glu Lys Lys lie Gin Glu Glu lie Glu 1205 1210 1215

Lys Lvs GJu Thr Leu lie Gin Glu Asn Val Val Leu Pro Gin I3e 1220 1225 1230

His Thr Val Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu 1235 1240 1245

Leu Ser Thr hrg Gin Asn Val Glu Gly Ssr Tyr Asp Gly Ala 丁yr 1250 1255 1260

Ala Pro Val Leu Gin Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn 1265 1270 1275

Arg Thr Lys Lys His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu 1280 1285 1290 G)u Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Gin Thr Lys Gtn ]le Val Glu 1295 1300 1305

Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg lie Ser Pro Asn Thr Ser Gin Gin 1310 1315 1320

Asn Phe Val Thr Gin Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gin Phe Arg 1325 1330 1335

Leu Pro Leu Glu Glu Thr Glu Leu G]u Lys Arg lie He Val Asp 1340 1345 1350

Asp Thr Ser Thr Gin Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro 1355 1360 1365

Ser Thr Leu Thr Gin 11e Asp Tyr Asn Glu Lys G1u Lys Gly Ala 1370 1375 1380 ^ 第5頁 200914608 27690- Seq list Defimlif 080418 • ]le Thr Gin Ser Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser 1385 1390 1395 lie Pro Gin Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro I)e Ala Lys Val Ser 1400 1405 1410

Ser Phe Pro Ser 1]e Arg Pro lie Tyr Leu Thr Arg Va] Leu Phe 1415 1420 1425

Gin Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys 1430 1435 1440

Asp Ser Gly Val Gin Glu Ser Ser His Phe Leu Gin G]y Ala Lys 1445 ]450 1455

Lys Asn Asn Leu Ser Leu Ala lie Leu Thr Leu Glu Met 丁hr Gly 1460 1465 1470 / \

Asp Gin Arg Glu Va] Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser 1475 1480 1485

Val Thr Tyr Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp 1490 1495 15⑻

Leu Pro Lys Thr Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Va] His 1505 1510 1515

He Tyr Gin Lys Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser 1520 1525 1530

Pro Gly His Leu Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gin Gly Thr 1535 1540 1545

Glu Gly Ala lie Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val 1550 1555 1560

Pro Phe Leu Arg Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser 1565 1570 1575

Lys Leu Leu Asp Pro Leu Ala 丁rp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gin 1580 1585 1590

He Pro Lys Glu Glu Trp Lys Ser Gin Glu Lys Ser Pro Glu Lys 1595 1600 1605

Thr A]a Phe Lys Lys Lys Asp Thr 11e Leu Ser Leu Asn Ala Cys 1610 1615 1620 GJu Ser Asn His Ala J]e A)a AJa JJe Asn Glu Gly Gin Asn Lys 1625 3630 1635

Pro Glu lie Glu Val Thr Trp Ala Lys Gin Gly Arg Thr Glu Arg 1640 1645 3650

Leu Cys Ser Gin Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gin Arg Glu 第6頁 200914608 27690- Seq list Definilif 080418 1655 1660 1665 lie Thr Arg Thr Thr Leu Gin Ser Asp Gin Glu Glu lie Asp Tyr 1670 ]675 1680

Asp Asp Thr lie Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp lie 1685 ]690 3695

Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser Pro Arg Ser Phe Gin Lys Lys 1700 1705 1710

Thr Arg His Tyr Phe lie Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr 1715 1720 1725

Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gin Ser ]730 1735 1740

Gly Ser Val Pro Gin Phe Lys Lys Va3 Val Phe Gin Glu Phe Thr 1745 1750 ]755

Asp Gly Ser Phe Thr Gin Pro Leu Tyr Arg G3y G]u Leu Asn Glu 1760 1765 1770

His Leu Gly Leu Leu Pro Tyr Arg A】3 G)u Va] G]u Asp 1775 1780 1785

Asn lie Met Val Thr Phe Arg Asn Gin Ala Ser Are Pro Tyr Ser 1790 1795 1800

Phe Tyr Ser Ser Leu lie Ser Tyr Glu Glu Asp Ghi Ar£ Gin Gly 1805 1810 1815

Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Va] Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr 1820 1825 1830

Tyr Phe Trp Lys Val Gin His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu 1835 1840 1845

Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu 1850 1855 1860

Lys Asp Val His Ser Gly Leu lie Gly Pro Leu Leu Val Cys His 1865 ]870 1875

Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gin Vai Thr Val Gin 1880 1885 1890

Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr lie Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp 1895 1900 3905

Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn 1910 1915 1920 I]e G]n Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn 丁yr Arg Phe His 1925 1930 1935 第7頁 200914608 27690- Seq list Defmitif 080438 .Ala lie Asn Gly Tyr lie Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Mel 1940 1945 1950

Ala Gin Asp Gin Arg lie Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser 1955 )960 1965

Asn Glu Asn He His Ser lie His Phe Ser Gly His Val Phe Thr 1970 1975 1980

Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr 1985 1990 1995

Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly 2000 2005 2010 lie Trp Arg Val Glu Cys Leu lie Gly Glu His Leu His Ala Gly 2015 2020 2025

Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gin Thr Pro 2030 2035 2040

Leu Gly Met Ala Ser Gly His 1le Arg Asp Phe Gin lie Thr Ala 2045 2050 2055

Ser Gly Gin Tyr Gly Gin Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His 2060 2065 2070

Tyr Ser Gly Ser lie Asn Ala Trp Ser Thr Lvs Glu Pro Phe Ssr 2075 2080 2085

Trp Iie Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met 11e 11e His Gly lie 2090 2095 2100

Lys Thr Gin Gly Ala Arg Gin Lys Phe Ser Ser Leu Tyr He Ser 2105 2110 2115

Gin Phe He He Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gin Thr 2120 2125 2130

Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn 2135 2]40 2145

Val Asp Ser Ser G]y He Lys His Asn He Phe Asn Pro Pro lie 2150 2155 2360 lie Ala Arg Tyr lie Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser lie Arg 2165 2170 2375

Ser Thr Leu Arg Met G]u Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys 2180 2185 2190

Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala lie Ser Asp Ala Gin 2195 2200 2205 ]】e Thr Ala Ser Ser 丁yr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser 2210 2215 2220 第8頁 200914608 27690- Seq list Definiiif 080438

Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gin Gly Arg Ser Asn Ala Trp 2225 2230 2235

Arg Pro Gin Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gin Val Asp Phe 2240 2245 2250

Gin Lys Thr Mel Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gin Gly Val Lys 2255 2260 2265

Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu ile Ser Ser 2270 2275 2280

Ser Gin Asp Gly His Gin Trp Thr Leu Phe Phe Gin Asn Gly Lys 2285 2290 2295

Val Lys Val Phe Gin Gly Asn Gin Asp Ser Phe Thr Pro Val Val 2300 2305 2310

Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His 2315 2320 2325

Pro G]n Se】· 丁jp Va] His G]n ]]e Ala Leu Arg Met Glu Val Leu 2330 2335 2340

Gly Cys Glu Gb Asp Leu Tyr 2345 2350 <210> 2 <211> 2332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Ala Thr Arg Arg 丁yr Tyr Leu Gly Ala Va] Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 3 5 10 15

Met Gin Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro

20 25 30

Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Va] Val Tyr Lys Lys 35 40 45

Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60

Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gin Ala Glu Val 65 70 75 80

Tyr Asp Thr Val Val lie Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val 85 90 95

Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110

Glu 丁yr Asp Asp G!n Thr Ser Gin Arg Glu Lys G!u Asp Asp Lys Va] 115 120 125 第9頁 200914608 27690- Seq list Definitif 080418

Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gin Val Leu Lys Glu Asn 130 135 ]40

Gly Pro Mel Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser 145 150 155 160

His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu He Gly Ala Leu 165 170 175

Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu A】a Lys G3u Lys Thr G]n Thr Leu 180 185 190

His Lys Phe 11e Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu G]y Lys Ser Trp 395 200 205

His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gin Asp Arg Asp Ala Ala Ser 210 215 220 f

Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg 225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Leu I3e Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His 245 250 255

Val He Gly Met G]v Thr Thr Pro Glu Val His Ser lie Phe Leu Glu 260 265 270

Glv His Thr Phe Leu Va] Arg Asn His Arg Gin Ala Ser Leu Glu lie 275 280 285

Ser Pro He Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly 290 295 300

Gin Phe Leu Leu Phe Cys His He Ser Ser His Gin His Asp Gly Met 305 310 315 320

Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gin Leu Arg I y 325 330 335

Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp 340 345 350

Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe 355 360 365 lie Gin lie Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val Hii 370 375 380

Tyr lie Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu 385 390 395 400

Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gin Tyr Leu Asn Asn Gly Pro 405 410 415

Gin Arg lie G3y Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr 420 425 430 第10頁 200914608 27690- Seq list Definitii 080418

Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala lie Gin His Glu Ser G]y lie 435 440 445

Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu lie lie 450 455 460

Phe Lys Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Asn lie Tyr Pro His Gly lie 465 470 475 480

Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495

Hi s Leu Lys Asp Phe Pro I le Leu Pro Gly Glu 11 e Pile Lys 丁yr Lys 500 505 510

Trp Thr Val Thr Val Glu Asp G]y Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525 f \

Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 530 535 540

Ser Gly Leu He Gly Pro Leu Leu lie Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp 545 550 555 560

Gin Are Gly Asn Gin lie Met Ser Asd Lvs Arg Asn Val lie Leu Pile 505 570 575

Ser Va] Phe Asp Glu Asn Arg Ser 丁rn Tyr Leu Thr G1u Asn lie Gin 580 585 590

Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Va] Gin Leu Glu Asp Pro Glu Phe 595 600 605

Gin Ala Sei· Asn lie Met His Ser lie Asn Gly Tyr Va] Phe Asp Ser 610 615 620

Leu Gin Leu Ser Val Cys Leu His G1 u Val Ala Tyr Trp Tyr He Leu 625 630 635 640

Ser lie Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr 645 650 655

Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670

Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 675 680 685

He Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700

Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 705 710 715 720

Asp Ser Tyr Glu Asp lie Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 第11頁 200914608 27690- Seq list Defmjtif 080418 725 730 735 lie Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gin Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg 740 745 750

Gin Lys Gin Phe Asn Ala Thr Thr lie Pro Glu Asn Asp lie Glu Lys 755 760 765

Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lvs ])e Gin Asn 770 775 780

Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gin Ser Pro Thr Pro 785 790 795 800

His G3y Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gin Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe 805 8]〇 815

Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala lie Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser 820 825 830

Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gin Leu His His Ser Gly Asp Met Va] 835 840 845

Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gin Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly 850 855 860

Thr 丁hi. Ala Ala Thr Giu Lsu Lys Lys Leu Asp Phe Lvs Val Ser Ssr 865 870 S75 880

Thr Ser Asn Asn Leu lie Ser Thr Iie Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala 885 890 895

Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His 900 905 910 丁yr Asp Ser Gin Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro 915 920 925

Leu 丁h】.Glu Ser Giy G3y Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp 930 935 940

Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gin Glu Ser Ser Trp 945 950 955 960

Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys 965 970 975

Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys 980 985 990

Val Ser lie Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala 995 1000 1005

Thr Asn Arg Lys Thr His lie Asp Gly Pro Ser Leu Leu lie Glu ]〇]〇 1015 ]〇20 第12頁 200914608 27690^ Seq list Defimiif 080418 -Asn Ser Pro Ser Val Trp Gin Asn lie Leu Glu Ser Asp Thr Giu , ]〇25 J030 1035

Phe Lys Lys Va3 Thr Pro Leu lie His Asp Arg Met Leu Met Asp 1040 1045 1050

Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr 1055 1060 3065

Thr Ser Ser Lys Asn Mei Glu Mel Val Gin Gin Lys Lys Glu Gly 3070 1075 1080

Pro lie Pro Pro Asp Ala Gin A_sn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys 1085 1090 1095

Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp lie Gin Arg Thr His 1100 1105 1110 ' Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gin Gly Pro Ser Pro Lys Gin ' 1115 1120 1125

Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gin Asn Phe 1130 ]135 1140

Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr ]145 1150 1155

Lys Asp Va 1 G]y Lsu Lys G]u Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn 1160 1165 1170

Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu Asn Asn Thr His 1175 1180 1185

Asn Gin Glu Lys Lys lie Gin Glu Glu lie Glu Lys Lys Glu Thr 1190 1195 1200

Leu lie Gin Glu Asn Va3 Val Leu Pro Gin lie His Thr Val Thr 1205 1210 1215

Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr Arg 1220 1225 1230

Gin Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu 3235 1240 1245

Gin Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys 1250 1255 1260

His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu G3u Asn Leu Glu 1265 1270 1275

Gly Leu Gly Asn Gin Thr Lys Gin lie Val Glu Lys Tyr Ala Cys 3280 3285 1290

Thr Thr Arg He Ser Pro Asn Thr Ser Gin Gin Asn Phe Va] Thr 1295 1300 1305 第]3頁 200914608 27690- Seq iist Defmitif 080418 ,Gin Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lvs Gin Phe Arg Leu Pro Leu Glu 1310 1315 1320

Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg lie lie Val Asp Asp Thr Ser Thr 1325 1330 1335

Gin Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr 1340 1345 1350

Gin He Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala He Thr Gin Ser 1355 1360 1365

Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser lie Pro Gin Ala 1370 1375 1380

Asn Arg Ser Pro Leu Pro Jle Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser 1385 1390 1395 f ' ' lie Arg Pro Jle Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gin Asp Asn Ser 1400 1405 1410

Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val 1415 1420 1425

Gin Glu Ser Ser His Phe Leu Gin Gly Ala Lys Lys Asn Asn Leu 3430 1435 1440

Ser Leu Ala lie Lsu Thr Leu Glu Mel Thr Gly Asd Gin Arg Glu ]445 1450 1455

Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys ]460 1465 1470

Lys Va] Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr 1475 1480 1485 i Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His lie Tyr Gin Lys 1490 1495 15⑻

Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu 1505 1510 1515

Asp Leu Va] Glu Gly Ser Leu Leu Gin Gly Thr Glu Gly Ala lie 1520 1525 1530

Lys Trp Asn Glu A3a Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg 1535 1540 3545

Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp 1550 1555 1560

Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gin I]e Pro Lys Glu 1565 1570 1575

Glu Trp Lys Ser Gin Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys 1580 1585 3590 第M頁 200914608 27690- Seq list Definitif 080418

Lys Lys Asp Thr I le Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His ]595 3600 1605

Ala Jle Ala Ala J3e Asn Glu Gly Gin Asn Lys Pro G)u lie Glu 1610 1615 1620

Val Thr 丁rp Ala Lys Gin Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser Gin 1625 1630 1635

Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gin Arg Glu lie Thr Arg Thr 1640 1645 1650 丁hr Leu Gin Ser Asp Gin Giu Glu 11e Asp Tyr Asp Asp Thr I]e 1655 1660 ]665

Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Jle Tyr Asp Glu Asp 1670 1675 1680

Glu Asn Gin Ser Pro Arg Ser Phe Gin Lys Lys Thr Arg His Tyr 1685 1690 1695

Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser 1700 1705 1710

Ser Pro Hi s Val Leu Arg Asn Arg Ala Gin Ser Glv Ser Val Pro 1715 1720 1725

Gin Phe Lys Lys Vai Val Phe Glu Glu Phe Thr Asp Glv Ser Phe 1730 J735 1740

Thr Gin Pro Leu Tyr Arg Gly G1u Leu Asn Glu His Leu Gly Leu 1745 1750 1755

Leu Gly Pro Tyr He Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn lie Met Val 1760 1765 1770 \ 1 Thr Phe Arg Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser 1775 1780 3785

Leu He Ser Tyr Glu Glu Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu Pro Arg 1790 3795 1800

Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Th】. Lys Thr 丁yr Phe Trp Lys 1805 1810 1815

Val Gin His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys 1820 1825 1830

Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val Hi s 1835 1840 1845

Ser Gly Leu He Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu 1850 1855 1860

Asn Pro Ala His Gly Arg Gin Val Thr Val Gin Glu Phe Ala Leu 第]5頁 200914608 27690- Seq list Definitif 080418 1865 1870 1875

Phe Phe Thr He Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu 1880 1885 1890

Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn lie Gin Met Giu 1895 1900 1905

Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala lie Asn Gly 1910 1915 1920

Tyr I]e Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Va3 Met Ala Gin Asp Gin 1925 1930 1935

Arg lie Arg Trp 丁yr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn ]]e 1940 1945 1950

His Ser lie His Phe Ser Gly Hi s Val Phe Thr Val Arg Lys Lys f ' 1955 1960 1965

Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe 1970 1975 1980

Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly He Trp Arg Val 1985 1990 1995

Glu Cys Lsu lie Glv Giu His Lsu His Ala Gly Met Ser Thr Leu 2000 2005 2010

Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lvs Cys Gin Thr Pro Leu Gly Μεί Ala 2015 2020 2025

Ser Gly His lie Arg Asp Phe Gin lie Thr Ala Ser Gly Gin Tyr 2030 2035 2040

Gly Gin Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser 2045 2050 2055

lie Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp lie Lys Val 2060 2065 2070

Asp Leu Leu Ala Pro Met lie lie His Gly lie Lys Thr Gin Gly 2075 2080 2085

Ala Arg Gin Lys Phe Ser Ser Leu Tyr lie Ser Gin Phe lie lie 2090 2095 2100

Met Tyi. Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gin Thr Tyr Arg Gly Asn 2105 2110 2115

Ser Thr G]y Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser 2120 2125 2130

Gly lie Lys His Asn lie Phe Asn Pro Pro lie lie Ala Arg Tyr 2135 2140 2145 第]6頁 200914608 27690- Seq list Definitif 080418 lie Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser lie Arg Ser Thr Leu Arg 2150 2155 2160

Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu 2]65 ' 2170 2175

Gly Met Glu Ser Lys Ala ]le Ser Asp Ala Gin lie Thr Ala Ser 2180 2185 2190

Ser Tvr Phe Ήίγ Asn Me[ Pile Ala 丁hr 丁rp Ser Pro Ser Ly.s Aia 2195 2200 2205

Arg Leu His Leu Gin Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gin Val 2210 2215 2220

Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gin Val Asp Phe Gin Lys Thr Met 2225 2230 2235 、Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gin Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr 2240 2245 2250

Ser Met Tyr V'al Lys Glu Phe Leu lie Ser Ser Ser Gin Asp Gly 2255 2260 2265

His Gin Trp Thr Leu Phe Phe Gin Asn Gly Lys Val Lys Val Phe 2270 2275 2280

Gin Giy Asn Glu Asp Ser Phe Thr Pro Vai Val Asn Ser Leu Asp 2285 2290 2295

Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tvr Leu Arg lie His Pro Gin Ser Trp 2300 2305 2310

Val His Gin He Ala Leu Arg Met Glu Vai Leu Gly Cys Glu Ala 2315 2320 2325

Gin Asp Leu Tyr 2330 <210> 3 <211> 4275 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gccaccagaa gatactacct gggtgcagtg gaactgtcat gggactatat gcaaagigat 60 ctcggtgagc tgcctgtgga cgcaagattt cctcctagag tgccaaaatc ttttccattc 120 aacacctcag tcgtgtacaa aaagactctg 11 tgtagaat tcacggttea cct 11 tcaac 180 ategetaage caaggccacc ctggatgggt ctgctaggtc ctaccatcca ggctgaggtt 240 tatgatacag tggtcai tac acltaagaac atggcitccc atcctgtcag tet teatget 300 gttggtgtat cctactggaa agettetgag ggagctgaat atgatgatca gaccagtcaa 360 agggagaaag aagatgataa agtcttccct ggtggaagcc atacatatgt ctggcaggtc 420 ctgaaagaga aiggiccaai ggccicigac ccactgtgcc t tacctactc aiatctttct 480 catgtggacc tggtaaaaga cttgaattea ggcctcattg gagccctact agtatgtaga 540 第Π頁 200914608 27690- Seq list Definilif 080418 gaagggagtc tggccaagga aaagacacag accttgcaca aatitaiact actttttgci gtatugatg aagggaaaag ttggcactca gaaacaaaga actcctIgat gcaggatagg galgctgcat ctgctcgggc ctggcctaaa atgcacacag tcaatggtta tgtaaacagg

tctctgccag ogcaccactc catcgccagg atggaccttg gaagcttatg gaagaagcgg galgatgaca acttgggtac gcccccgatg aggaagtaca gctat tcagc ci〇ttgatta actgatgtcc tttccaattc ccaactaaat agagatctag caaagaggaa gagaaccgaa gtgcagcttg gtttttgata agcattggag aaaatggtct tcgatggaaa ggcatgaccg gacagttatg gaaataactc tcagi tgaaa cgcagcittc tatgggatga cagt tcaaga cgtggagaac gataatatca ct tat tlet t cctaatgaaa gtctgattgg ctgaagtgca egteettgoa gacagt ttet tcaaagtaga aagactatga actctcct tc attacattgc acagaagtta aaaaagtccg atgaatcagg tatttaagaa gteett tgta tgccaggaga cagatcctcg ct tcaggact accagataal gctggtacct aggatccaga gtttgcagtt cacagactga atgaagacac acccaggtct ccttactgaa aagatat t tc gtactactct tgaagaagga aaaagaaaac gtagctcccc aagttgtttt taaatgaaca tggtaact 11 aigaggaaga ccaaaact ta atgccacagg ctcaatai tc aatctcgcca actgttttgt cagclglcca tgatgatet t ctttatccaa tgctgaagag taaaagtcaa atttatggca aatcttggga tcaagcaagc ttcaaggaga aatattcaaa gigcdgacc catlggccct gtcagacaa^ cacagagaat gttccaagcc gtcagtttgt cttcctttct actcacccta atggattctg ggtttctagt ageataettg teagteagat agattttgac acgacactat acatgttcta ccaggaatt t tttgggactc cagaaatcag tcagaggcaa cttttggaaa aaatcagtct ctcgaaggtc ataaett tee catatctctt gaggaacccc actgattctg at tcgctcag gaggactggg tatttgaaca tacacagatg cctttacttt agaccatata ttaccaaaag tataaatgga egetat tact ctcctcatct aggaatgtea atacaacgct tccaacatca ttgeatgagg gtettettet ttcccattct gggtgccaca tgtgacaaga ctgagtaaaa caagaggaaa atttatgatg tttattgctg agaaacaggg actgatggct ctggggccai gcctctcgtc ggagcagaac glgcaacatc attggcatgt acacat t tet t tactgctca cccaccaaca aaciacgaal aaatggatgt ttgccaagaa actatgctcc atggccctca aaacct t taa atggggaagt acatctaccc gtgtaaaaca cagtgactgt ctagtttcgt gctacaaaga tcctgttttc t tctccccaa tgcacagcat tggcatactg ctggatatac caggagaaac actcagactt acactggtga acaatgccat ttgactalga aggatgaaaa cagtggagag ctcagagtgg cctttactca atataagage cctattcctt ctagaaaaaa atatggcacc gattggaatg tgtgaggaac aacactct tg tgatggcatg gaaaaataal ggtcaggttt gcatcctaaa ct tagtcctc gcgsatlggt gactcgtgaa tggagacaca teaeggaate tttgaaggat agaagatggg taatatggag atctgtagat tgtat t tgat tccagctgga caatggctat glacattcta cttcaaacac tgtet tcatg tcggaacaga t tat taegag tgaaccaaga tgataccata tcagagcccc gctctgggat cagtgiccct gccct tatac agaagttgaa etattetage ctttgtcaag cactaaagat 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 ]440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2] 60 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 第18頁 200914608 27690- Seq list Definitif 080418 gagt ugact «caaagcctg ggcttatttc tctsatgttg acclggaaaa agatgtgcac 2820 tcaggcctga t tggaccccl tctggtctgc cacactaaca cac tgaaccc Lgctcatggg 2880 agacaagtga cagtacagga alt tgctctg 1111 tcacca tet ttgatga gaccaaaagc 2940 tggtact tea ctgaaaatat ggaaagaaac tgcagggctc cctgcaatat ccagatggaa 3000 gatcccacti t taaagagaa i ta teget tc catgcaatca atgge tacat aatggataca 3060 ctacctggct tagtaatgge tcaggaicaa aggattegat ggtatctgct cagcatgggc 3120 agcaatgaaa acatccat tc lattcatltc agtggacatg tgi tcactgt acgaaaaaaa 3]80 gaggagtata aaatggcact gtacaatctc tatccaggtg 1111 tgagac agtggaaatg 3240 t tacca tcca aagctggaat ttggcgggtg gaatgcct ta ttggcgagca tctacatgct 3300 gggatgagea cactttttct ggtgtacagc aataagtgtc agactcccct gggaatggct 3360 tctggacaca ttagagattt tcagattaca gcttcaggac aatatggaca gt<>ggcccca 3420 aagctggcca gacttcatta ttccggatca atcaatgcct ggagcaccaa ggagcccttt 3480 tet tggatca aggtggatct gt tggcacca atgat tat tc acggcatcaa gacccagggt 3540 gcccgtcaga agt tctccag cctctacatc tctcagttta tcatcatgta tagtet tgat 3600 gggaagaagt ggeagaetta tcgaggaaat tccactggaa ccttaatggt cttctttggc 3660 aatgtggatt catctgggat aaaacacaai atttttaacc ctccaat tat tgctcgatac 3720 atccgt t t〇c acccaactca ttatageatt cgcagcactc t tcgcatgga gttgatgggc 3780 tgtgat t taa atagt tgcag catgccattg ggaatggaga gtaaagcaat atcagatgca 3840 cagattactg cticatccta ctttaccaat atgtitgcca cctggictcc ΐ tcaaaagct 3900 cgacttcacc tccaagggag gagtaatgee tggagacctc aggtgaataa tccaaaagag 3960 tggctgcaag tggacttcc2 gaagacaatg aaagtcacag gagtaactac tcagggagta 4020 aaatctctgc ttaccagcat gtatgtgaag gagt tcctca tctccagcag tcaagatggc 4080 catcagtgga ctctcttttt teagaatgge aaagtaaagg tttttcaggg aaatcaagac 4140 tcct tcacac ctgtggtgaa ctctctagac ccaccgttac tgactcgcta ccttcgaatt 4200 cacccccaga gttgggtgca ccagat tgee ctgaggatgg aggttctggg ctgegaggea 4260 caggacctct actga 4275 <210> 4 <211> 1424 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu 1 5 10 Leu Sei· Trp Asp Tyr 15

Met Gin Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Fhe Pro Pro 20 25 30

Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Va] Tyr Lys Lys 35 40 45

Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn lie Ala Lys Pro 50 55 60 第19頁 200914608 27690- Seq i ist DefinUif 080418

Ai'^ Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr lie GMn Ala Glu Val 65 70 75 80

Tyr Asp Thr Val Val lie Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val .85 90 95

Ser Leu His Aia Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala loo 105 no

Glu Tyr Asp Asp Gin Thr Ser Gin Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val 115 120 125

Phe Pro Gly Gly Ser His Thr 丁yr Va] Trp Gin Val Leu Lys G]u Asn 130 135 140

Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser 145 150 155 160

His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ije Gly Ala Leu 165 170 175

Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gin Thr Leu 180 185 190

His Lys Pne lie Leu Leu Phe Ala Val Phe Asd Glu Gly Lys Ser Trp 195 200 205

His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gin Ast? Arg Asp Ala Ala Ser 210 215 220

Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg 225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Leu He Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His 245 250 255

Val lie Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Va] His Ser He Phe Leu Glu 260 265 270

Gly His Thr Phe Leu Va3 Arg Asn His Arg Gin Ala Ser Leu Glu lie 275 280 285

Ser Pro lie Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly 290 295 300

Gin Phe Leu Leu Phe Cys His lie vSer Ser His Gin His Asp Gly Met 305 310 315 320

Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro G'ln Leu Arg 325 330 335

Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp 340 345 350

Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe 355 360 365 第20頁 200914608 27690- Seq list Definitif 080418 lie Gin lie Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His 370 375 380

Tyr lie Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu 385 390 395 400 A]a Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gin Tyr Leu Asn Asn Gly Pro 405 410 415

Gin Arg J】e G]y Arg Lys 丁y!· Lys Lys Va] Arg Phe Met A]a Tyr 丁hr 420 425 430

Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg GJu Ala lie G]n His Glu Ser Gly He 435 440 445

Leu Gly Pro Leu Leu Tyr GJy Glu Val G3y Asp Thr Leu Leu lie lie 450 455 460

Phe Lys Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly lie 465 470 475 480

Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495

His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro G1v Glu 11e Phe Lys Tyr Lvs 500 505 510

Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Glv Pro Thr Lvs Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525

Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 530 535 540

Ser Gly Leu lie G)y Pro Leu Leu He Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp 545 550 555 560

Gin Arg Gly Asn Gin He Met Ser Asp Lys Arg Asn Val lie Leu Phe 565 570 575

Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn lie Gin 580 585 590

Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gin Leu Glu Asp Pro Glu Phe 595 600 605

Gin Ala Ser Asn lie Met His Ser lie Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser 630 6J5 620

Leu Gin Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr lie Leu 625 630 635 640

Ser He Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr 645 650 655

Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 第21頁 200914608 27690- Seq list Defmitif 080418 660 665 670

Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asri Pro Gly Leu Trp 675 680 685

He Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700

Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 705 730 715 720

Asp Ser Tyr Glu Asp 11 e Ser Ala 丁y】.Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 725 730 735

Jle Glu Pro Arg Glu He Thr Arg Thr Thr Leu Gin Ser Asp Gin Glu 740 745 750

Glu lie Asp Tyr Asp Asp Thr He Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp 755 760 765

Phe Asp lie 丁yr Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser Pro Arg Ser Phe Gin 770 775 780

Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe lie Ala Ala Val G】u Arg Leu Trp Asp 785 790 795 800

Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn krg A]a Gin Ser 805 810 815

Gly Ser Val Pro Gin Phe Lys Lys Val Val Phe Glu Glu Phe Thr Asp 820 825 830

Gly Ser Phe Thr Gin Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu 835 840 845

Gly Leu Leu Gly Pro Tyr He Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn lie Met 850 855 860

Val Thr Phe Arg Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser 865 870 875 880

Leu lie Ser Tyr Glu Glu Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu Pro Arg Lys 885 890 895

Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gin 900 905 910

Mis His Met Ala Pro Thr Lys Asp G]u Phe Asp Cys Lys Ala 丁rp Ala 915 920 925

Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu lie 930 935 940

Gjy Pro Leu Leu Val Cys His 丁1π Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly 945 950 955 960 第22頁 200914608 27690- Seq list Definitif 080418 Arg Gin Val Thr Val G]n Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr lie Phe Asp 965 970 975

Glu Thr Lvs Ser 丁rp Tyr Phe Thr Glu Asn ivlei Glu Arg Asn Cys Arg 980 985 990

Ala Pro Cys Asn lie Gin Mel Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr 995 1000 1005

Arg Phe His Ala He Asn Gly Tyr lie Met Asp Thr Leu Pro Gly 1010 1015 1020

Leu Val Met Ala Gin Asp Gin Arg ]le Arg Trp Tyr Leu Leu Ser 1025 1030 1035

Met Gly Ser Asn Glu Asn He His Ser lie His Phe Ser Gly His 1040 1045 1050 〆 Val Phe Thr Val Arg Lys Lys G]u Glu 丁yr Lys Met Ala Leu Tyr 1 1055 1060 1065

Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser 1070 1075 1080

Lys Ala Gly He Trp Arg Val Glu Cys Leu lie Glv Glu His Leu ]〇85 3090 1095

His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tv!· Ser Asn Lys Cys 1100 1105 1110

Gin Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His lie Arg Asp Phe Gin 1115 1120 1125

He Thr Ala Ser Gly G3n Tyr Gly Gin Trp Ala Pro Lys Leu Ala 1130 1135 1140

Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser I ]e Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu 1145 1150 1155

Pro Phe Ser 丁i.p I]e Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met He lie 1160 1165 1170

His Gly I]e Lys Thr Gin Gly Ala Arg Gin Lys Phe Ser Ser Leu 1175 1180 1185

Tyr lie Ser Gin Phe He lie Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys 1390 1195 1200

Trp G3n Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe 1205 12]〇 1215

Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly lie Lys His Asn lie Phe Asn 1220 1225 1230

Pro Pro Ile J1e A1a Arg 丁yr lie Arg Leu His Pro Thr His Tyr 1235 1240 1245 第23頁 200914608 27690- Seq list Definitif 080418

Ser lie Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu 1250 1255 1260

Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala lie Ser 1265 1270 1275

Asp A]a Gin lie Thr Ala Ser Sei. 丁yr Phe Thr Asn Met Phe Ala 1280 1285 1290

Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu G3n Gly Arg Ser 1295 1300 1305

Asn Ala Trp Arg Pro Gin Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gin 1310 1315 1320

Val Asp Phe Gin Lys Thr Met Lys Va] Thr Gly Va) Thr Thr Gin 1325 1330 1335 f 夂 Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu 1340 1345 1350 lie Ser Ser Ser Gin Asp Gly Hi s Gin Trp Thr Leu Phe Phe Gin 1355 1360 1365

Asn G]v Lys Va] Lys Val Phe Gin Gly Asn Gin Asp Ser Phe 丁hr 1370 1375 1380

Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu 1385 1390 1395 krg lie His Pro Gin Ser Trp Val His Gin lie Ala Leu Arg Met 1400 1405 1410

Giu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gin Asp Leu 丁yr 1415 3420 r <210> 5 <211> 2220 <212> DNA <2]3> Homo sapiens <400> 5 gccaccagaa gatactacct gggtgcagtg gaactgtcat gggactatat gcaaagtgat 60 ctcggtgagc tgcctgtgga cgcaagattt cctcctagag tgccaaaatc ttttccattc 120 aacacctcag tcgtgtacaa aaagactctg tttgtagaat tcacggttea ccttttcaac 180 ategetaage caaggccacc ctggatgggt ctgctaggtc ctaccatcca ggctgaggtt 240 tatgatacag iggtcat tac act taagaac atgget tccc atcctgtcag tet teatget 300 gt tggtgtat cctactggaa aget tetgag ggagctgaat atgatgaica gaccagtcaa 360 agggagaaag aagatgataa aglet tccct ggtggaagcc atacatatgt ctggcaggtc 420 ctgaaagaga atggtccaat ggcctctgac ccactgtgcc ttacctactc atatetttet 480 catgtggacc tggtaaaaga ct tgaat tea ggcctcat tg gagccctact agtatgtaga 540 gaagggagtc tggccaagga aaagacacag accttgcaca aatttalact actttttgct 600 第24頁 200914608 27690- Seq lisl Definitif 080418 gtat t tgatg aagsgaaaag ,itggcactca gaaacaaaga actccttgat gcaggaiagg 660 gatgcigcat ctgctcgggc ciggcctaaa atgcacacag tcaatggt ta tgtagccagg m tctctgcca〇 gtctgattgg atgccacagg aaatcagtct at tggcatgt gattggaatg 780 Sgcaccactc cigaagtgca clcaatat tc ctcgaag«tc acacattict tgtga〇gaac 840 calcgccagg cgtcct tgga aatctcgcca alaactltcc ΐ tactgctca aacactcttg 900 atggacctt<i gacagt t tct acigt tt tgt catatctctt cccaccaaca tgatg〇catg 960 gaagcttaig tcaaa^taga cagctgicca gaggaacccc aactacgaat gaaaaataat 1020 gaagaagcgg aagactaiga tgatgatctt actgattctg aaatggatgt ggtcaggttt 1080 gatgatgaca actctcct tc ct t tatccaa at tcgctcag t tgccaagaa gcatcctaaa 1140 acttgggtac attacattgc tgctgaagag gaggactggg actatgctcc ct tagtcctc 1200 gcccccgatg acagaagt ta taaaagtcaa tatttgaaca atggccctca gcggattggt 1260 aggaagtaca aaaaagtccg atttatggca tacacagatg aaacctt taa gactcgtgaa ]320 gctat tcagc atgaatcagg aatct tggga cctttacttt atggggaagt tggagacaca 1380 ctgttgatta tatttaagaa tcaagcaagc agaccatata acatctaccc tcacggaatc 1440 actgatgtcc gicctitgta ttcaaggaga ttaccaaaag gtgtaaaaca tttgaaggat 1500 tticcaattc tgccaggaga aatat tcaaa tataaatgga cagtgactgi agaagatggg 1560 ccaactaaat cagatcctcg gtgcctgacc cgctat tact ctagt ttcgt taatatggag 1620 agagatctag ct tcaggact cat tggccct ctcctcatct gctacaaaga atctgtagat 3680 caaagaggaa accagataat gtcagacaag aggaatgica tcctgtttlC tsiatttgai 1740 gagaaccgaa gctggtacci cacagagaat atacaacgct t tctccccaa tccagctgga 1800 gtgcagct tg aggatccaga gt iccaagcc iccaacatca tgcacagcat caatggctat 1860 gtitttgata gtttgcagti gtcagtttgt tigcatgagg tggcatactg gtacattcta 1920 agcattggag cacagactga ct tcct t tct gtct tct tct ctggatatac cttcaaacac 1980 aaaatggtct atgaagacac actcacccta t tcccat tct caggagaaac tgtcttcatg 2040 tcgatggaaa acccaggtct atggat tctg gggtgccaca actcagactt tcggaacaga 2100 ggcatgaccg ccttactgaa ggtttctagt tgtgacaaga acactggtga ttattacgag 2360 gacagttatg aagatat t tc agcatacttg ctgagtaaaa acaatgccat tgaaccaaga 2220

<210> 6 <211> 740 <212> PKT <213> Homo sapiens <400> 6

Ala Tin Arg Arg Tyr Tyr Leu G]y A】a Val G】u Leu Ser Trp Asp Tyr 15 10 15

Met Gin Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30

Arg VaJ Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45

Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn He Ala Lys Pro 第25頁 200914608 27690- Seq list Definitif 0804J8 50 55 60

Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr lie Gin Ala Glu Va] 65 70 Ί5 80

Tyr Asp Thr Val Val lie Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Va] 85 90 95

Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 - 105. ]]〇 丁yr Asp Asp 丁hr Ser G]n Arg Glu Lys G】u Asp Asp Lys Va] 115 120 125

Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gin Val Leu Lys Glu Asn 130 135 340

Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser 145 150 155 160

His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu lie Gly Ala Leu 165 370 ]75

Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gin Thr Leu 180 185 190

Kis Lys Phe lie Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Glv Lys Ser Trp 195 200 205

His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gin Asp Arg Asd Ala Ala Ser 210 215 220

Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Ala Arg 225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Leu lie Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His 245 250 255

Val lie Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser He Phe Leu Glu 260 265 270

Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gin Ala Ser Leu Glu lie 275 280 285

Ser Pro He Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Leu Leu Mel Asp Leu Gly 290 295 300

Gin Phe Leu Leu Phe Cys His lie Ser Ser His Gin His Asp Gly Met 305 330 315 320

Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gin Leu Arg 325 330 335

Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp 340 345 350 第26頁 200914608 27690- Seq list Defmitif 0804]8 Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe 355 360 365 lie Gin lie Arg Ser Val Ala Lvs Lvs His Pro Lvs Thr Trp Va] His 370 375 380

Tyr lie Ala Ala G]u Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu 385 390 395 400

Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gin Tyr Leu Asn Asn Gly Pro 405 410 415

Gin Arg Jle Gly Arg Lys Tyi· Lys Lys Val Arg Phe Met Aia Ty】· Th】· 420 425 430

Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala lie Gin His Glu Ser Gly lie 435 440 445

Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu I】e lie 450 455 460

Phe Lvs Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Asn He Tyr Pro His Gly He 465 470 475 480

Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495

His Leu Lvs Asp Phe Pro I le Leu Pro Gly Glu He Phe Lys Tyr Lys 500 505 510

Trp Thr Va] Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525

Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 530 535 540

Ser Gly Leu lie Gly Pro Leu Leu lie Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp 545 550 555 560

Gin Arg Gly Asn Gin He Met Ser Asp Lys Arg Asn Val lie Leu Phe 565 570 575

Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn lie Gin 580 585 590

Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gin Leu Glu Asp Pro Glu Phe 595 600 605

Gin Ala Ser Asn lie Met His Ser I]e Asn Gly Tyr Va] Phe Asp Ser 610 615 620

Leu Gin Leu Ser Yal Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 丁yi· lie Leu 625 630 635 640

Ser lie Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr 645 650 655 第27頁 200914608 27690- Seq list Definitif 080418

Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670

Pl]e Ser Gly Glu 丁hr Va) Phe Met Se]· Mei G]u Asn Pro Gly Leu 丁rp 675 680 685 lie Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700

Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 705 710 715 720

Asp Ser Tyr Glu Asp lie Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 725 730 735 I le Glu Pro Arg 740 <210> 7 <211> 1932 <212> DNA <213〉 Homo sapiens <400〉 Ί agctttcaaa agaaaacacg acactatttt attgctgcag tggagaggct ctgggattat 60 gggatgagta gctccccaca tgttctaaga aacagggcic agagtggcag tgtccctca£ 120 ttcaagaaag ttgttttcca ggaatttact gatggctcct itactcagcc cttataccgt 180 ggagaactaa atgaacattt gggacicctg gggccatata taagagcaga agttgaagat 240 aatatcatgs taactttcag aaatcaggcc tctcglccct attccttcta ttctagcctt 300 atttcttatg aggaagatca gaggcaagga gcagaaccta gaaaaaactt tgtcaagcct 360 aatgaaacca aaacitactt ttggaaagtg caacatcata tggcacccac taaagaiga〇 420 titgactgca aagcctgggc ttatttctct gatgttgacc tggaaaaaga tgtgcactca 480 ggcctgattg gaccccttct ggtctgccac actaacacac tgaaccctgc tcatgggaga 540 caagtgacag tacaggaatt tgctctgttt ίtcaccatct ttgatgagac caaaagctgg 600 tacttcactg aaaatatgga aagaaactgc agggctccct gcaatatcca gaiggaagat 660 cccactttta aagagaatta tcgcttccai gcaatcaatg gctacataat ggatacacta 720 cctggcttag taatggctca ggatcaaagg attcgatggt atctgctcag catgggcagc 780 aatgaaaaca tccattctat tcatttcagt ggacatglgt tcactgtacg aaaaaaagag 840 gagtaiaaaa tggcactgta caatctctat ccaggtgttt ttga£acagt ggaaatgtta 900 ccatccaaag ctggaatttg gcgggtggaa tgccttattg gcgagcatct acatgctggg 960 atgagcacac tttttctggt gtacagcaat aagtgtcaga ctcccctggg aatggcttct 1020 ggacacatta gagat11tea gattacagcl tcaggacaat atggacagtg ggccccaaag 1080 ctggccagac ttcattattc cggatcaatc aatgcctgga gcaccaagga gcccttttct 1140 tggatcaagg tggatctgtt ggcaccaatg attatteaeg gcatcaagac ccagggtgcc 1200 cgtcagaagt tclccagcct ctacatctct cagt t tatca tcatgtatag tcttgatggg 1260 aagaagtggc agacttateg aggagcctcc actggaacct taatggtctt ctttggcaat 1320 第28頁 200914608 27690- Seq list Definitif 080418 gtggat teat ctgggataaa acacaatai t 11 taaccctc caai taltgc tcgatacatc 1380 cgt ΐ tgcacc caactcatta lageattege agcactct tc gcatggagtl gatgggctgt 1440 gait taaata gi tgeageat gccat tggga atggagagta aagcaatatc agatgcacag ]500 a t tactgct t catcctact i taccaatatg 11 tgccacct ggtctcct tc aaaagctcga 1560 ct tcacctcc aagggag〇ag taatgcct〇g agacctcagg tgaataatcc aaaagagtgg 1620 ctgcaagtgg acttccagaa gacaatgaaa gtcacaggag taactactca gggagtaaaa 1680 tetetgetta ccagcatgta tgtgaaggag ttcctcatct ccagcagtca agatggccat 1740 cagtggactc tcttttltca gaatggcaaa gtaaaggt11 t tcagggaaa icaagactcc 1800 ttcacacctg tggtgaactc tctagaccca ccgttactga ctcgctacct tcgaattcac I860 ccccagagtt gggtgcacca gattgccctg aggatggagg ttctggsctg cgaggcacag 1920 gacctctact ga 1932 <210> 8 <211> 643 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Ser Phe Gin Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe lie Ala Ala Val Glu Arg 1 5 10 15

Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg 20 25 30

Ala Gin Ser Gly Ser Val Pro Gin Phe Lys Val Val Phe Gin Glu 35 40 45

Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gin Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn 50 55 60

Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr He Arg Ala Glu Val Glu Asp 65 70 75 80

Asn lie Met Val Thr Phe Arg Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe 85 90 95

Tyr Ser Ser Leu He Ser Tyr Glu Glu Asp Gin At〇 Gin Gly Ala Glu 100 105 Π0

Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp 315 120 ]25

Lys VaJ Gin His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys 130 135 140

Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Va] Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser H5 150 155 160

Gly Leu lie Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro 165 170 175

Ala His Gly Arg Gin Val Thr Val Gin Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr 第29頁 200914608 27690- Seq list Defininf 080418 180 ]85 190 lie Phe Asp Glu Th】· Lys Ser 丁i.p Tyr Phe Thr G】u Asn Met Glu Arg J95 200 205

Asn Cys Ar« Ala Pro Cys Asn lie Gin Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys 230 215 220

Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala lie Asn Gly Tyr lie Mel Asp Thr Leu 225 230 235 240

Pro Gly Leu Val Met Ala Gin Asp G]n Arg lie Ar〇 Trp Tyr Leu Leu 245 250 255

Ser Mel Gly Ser Asn Glu Asn Jle His Ser lie His Phe Ser Gly His 260 265 270

Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn 275 280 285

Leu 丁yr Pro Gly Va] Phe Glu Thr Val Glu Mei Leu Pro Ser Lys Ala 290 295 300

Glv lie Trp Arg Val Glu Cvs Leu ]le Gly Glu His Leu His Ala Gly 305 310 315 320

Met Ser Thr Leu Phe Leu Vai Tvr Ssr Asn Lys Cys Gin Thr Pro Leu 325 330 335

Gly Met Ala Ser Gly His lie Arg Asp Phe Gin lie Thr Ala Ser Gly 340 345 350

Gin Tyr Gly Gin 丁rp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser G]y 355 360 365

Ser lie Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp .lie Lys Val 370 375 380

Asp Leu Leu Ala Pro Mel I]e lie His Gly lie Lys Thr Gin Gly Ala 385 390 395 400

Arg Gin Lys Phe Ser Ser Leu Tyr I】e Ser Gin Phe lie He Met Tyr 405 410 415

Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp G]n Thr Tyr Arg Gly Ala Ser Thr Gly 420 425 430

Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Va] Asp Ser Ser Gly lie Lys His 435 440 445

Asn lie Phe Asn Pro Pro lie lie Ala Arg Tyr lie Arg Leu His Pro 450 455 460

Thr His Tyr Ser lie Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys 465 470 475 480 第30頁 200914608 27690- Seq list Definitif 080418 Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys A]a lie 485 490 495

Ser Asp Ala Gin He Thr Ala Ser Ser Tvr Phe Thr Asn Met Phe Ala 500 505 5)0

Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gin Gly Arg Ser Asn 515 520 525

Ala Trp Arg Pro G]n Va] Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gin Val Asp 530 535 540

Phe Gin Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gin Gly Va] Lys 545 550 555 560

Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu lie Ser Ser Ser 565 570 575

Gin Asp Gly His Gin Trp Thr Leu Phe Phe Gin Asn Gly Lys Val Lys 580 585 590

Val Phe Gin Gly Asn Gin Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu 595 600 605

Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Ar〇 lie His Pro Gin Ser Trp 6]0 615 620

Val His Gin lie Ala Leu Arg Met Giu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gin 625 630 635 640

Asp Leu Tyr <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 lie lie Ala Arg Tyr lie Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 13 e Arg 15 10 15

Ser Thr <210> 10 <211> 573

<212〉 PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Ser Phe Ser Gin Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg Gin Lys Gin Phe 15 10 15

Asn Ala Thr Thr lie Pro Glu Asn Asp lie Glu Lys Thr Asp Pro Trp 20 25 30

Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys lie Gin Asn Val Ser Ser Ser 第3]頁 200914608 27690- Seq list Definitif 080418 35 40 45

Asp Leu Leu Met Leu Leu Ar^ Gin Ser Pro Thr Pro His Gly Leu Ser 50 55 60

Leu Ser Asp Leu Gin Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe Ser Asp Asp Pro 65 70 75 80

Ser Pro Gly Ala Jle Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser Glu Met Thr His 85 90 95

Phe Arg Pro Gin Leu His His Ser Gly Asp Met Val Phe Thr Pro Glu 100 105 110

Ser G]y Leu Gin Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly Thr Thr Ala Ala 115 ]20 125

Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Va] Ser Ser Thr Ser Asn Asn (- 130 135 ]40 \

Leu lie Ser Thr He Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala Gly Thr Asp Asn 145 150 155 160

Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His Tyr Asp Ser Gin 165 170 375

Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lvs Ser Ser Pro Leu Thr Glu Ser 180 185 190

Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asd Ser Lys Leu Leu 195 200 205

Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gin Glu Ser Ser Trp Gly Lys Asn Val 210 215 220

Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys Arg Ala His Gly 225 230 235 240

Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys Va] Ser lie Ser 245 250 255

Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala Thr Asn Arg Lys 260 265 270

Thr His He Asp Gly Pro Ser Leu Leu lie Glu Asn Ser Pro Ser Val 275 280 285

Trp Gin Asn lie Leu Glu Ser Asp Thr Glu Phe Lys Lys Val Thr Pro 290 295 300

Leu lie His Asp Arg Met Leu Met Asp Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg 305 310 315 320

Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met 325 330 335 第32頁 200914608 27690- Seq ]isi Defimtif 080418 Val Gin Gin Lys Lys Glu G3y Pro lie Pro Pro Asp Ala Gin Asn Pro 340 345 350

Asp Met Ser Phe Phe Lvs Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp 355 360 365 lie Gin Arg Thr His Glv Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gin Gly Pro 370 375 380

Ser Pro Lys Gin Leu Va] Ser Leu G)y Pro Glu Lys Ser Va] Glu Gly 385 390 395 400

Gin Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu 405 410 415

Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro Ser Ser Arg 420 425 430

Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu Asn Asn Thr His 435 440 445

Asn Gin Glu Lys Lys lie Gin Glu Glu lie Glu Lvs Lys Glu Thr Leu 450 455 460 lie Gin Glu Asn Val Val Leu Pro Gin He His Thr Va3 Thr G]y Thr 465 470 475 480

Lys Asn Phe Met Lvs Asn Lsu Phe Leu Leu Ser Thr Arg Gin Asn Va] 485 490 495

Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu Gin Asp Phe Arg 500 505 510

Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys His Thr Ala His Phe 515 520 525

Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Gin Thr 530 535 540

Lys Gin lie Val Glu Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg lie Ser Pro Asn 545 550 555 560

Thr Ser Gin Gin Asn Phe Va] Thr Gin Arg Ser Lys Arg 565 570 <210> 11 <211> 2220 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gccaccagaa gatactacct gggtgcagtg gaactgtcat gggactatat gcaaagtgat 60 ctcggtgagc tgcctgtgga cgcaagatt i cctcctagag tgccaaaatc tittccattc 120 aacacctcag tcgtglacaa aaagactctg 11 tgtagaat tcacggttca ccttttcaac 180 atcgctaagc caaggccacc ciggatgggt ctgctaggtc ctaccatcca ggctgaggtt 240 talgatacag tggtcat tac acttaagaac atggct tccc atcctgtcag let tcatgct 300 第33頁 200914608 27690- Seq list Definilif 080418 gttggtgtat cctactggaa agcttctgag ggagctgaat atgatgatca gaccaglcaa 360 agggagaaag aagatgataa aglet tccc! ggtggaagcc atacataigt ctggcaggtc 420 ctgaaagaga atggtccaat ggcctctgac ccactgtgcc t tacctactc alatet tlet 480 catgtggacc tggtaaaaga ettgaattea ggcclcattg gagccctaci agtatgtaga 540 gaagsgagtc tggccaagga aaagacacag accttgcaca aatttatact act111tget 600 gtai t tgatg aagggaaaag t tggcactca gaaacaaaga actcct tgat gcaggatagg 660 galgctgcat ctgctcgggc ctggcctaaa atgcacacag tcaatggtta tgtacagagg 720 tctctgccag gicigait〇£ aigccacagg aaatcagtct attggcaigl galtggaatg 780 ggcaccactc ctgaagtgca ctcaatatic ctcgaaggtc acacatttct tgtgaggaac 840 catcgccagg cgtccttgga aatctcgcca ataactttcc ttactgctca aacactcttg 900 atggaccttg gacagtttct actgtttigt ealatetett cccaccaaca tgatggcatg 960 gaagcttatg tcaaagtaga cagctgtcca gaggaacccc aactacgaat gaaaaataat 1020 gaagaagegg aagactatga tgatgatett actgattctg aaatggatgt ggtcaggttt ]080 gatgatgaca actctccttc ctttatccaa attcgctcag ttgccaagaa gcatcctaaa 1140 acttgggtac attacattgc tgctgaagag gaggactggg actatgctcc cttagtcctc 1200 gcccccgatg acagaagt ta taaaagtcaa tat ttgaaca atggccctca geggat tggt 1260 aggaagtaca aaaaagtccg atttatggca tacacagatg aaacctttaa gactcgtgaa 1320 getai teage atgaatcagg aatcttggga cctttacttt atggggaagt tggagacaca 1380 ct^ttgatta tatttaagaa tcaagcaagc agaccatata acatctaccc teaeggaate 1440 actgatgtcc gtccttista ttcaaggaga ttaccaaaag gtgtaaaac2 11tgaaggat 1500 tttccaattc tgccaggaga aatattcaaa tataaatgga cagtgactgi agaagatggg 1560 ccaactaaat cagatcctcg gtgcctgacc cgctattact ctagtttcgt taatatggag 1620 agagatetag cttcaggact cattggccct ctcctcatct gctacaaaga atctgtagat 1680 caaagaggaa accagataat gtcagacaag aggaatgtea tcctgttttc tgtatttgat 1740 gagaaccgaa gctggtacct cacagagaat atacaacgct ttctccccaa tccagctgga 1800 〇lgcagcttg aggatccaga gttccaagcc tccaacatca tgcacagcal caatggctat 1860 gtttttgata gtttgcagtt gtcagtttgt ttgeatgagg tggcaiactg gtacattcta 1920 ageattggag cacagactga cttcctttct gtettettet ctggatatac cttcaaacac 1980 aaaatggtct atgaagacac actcacccta ttcccattct caggagaaac tgtettcatg 2040 tcgatggaaa acccaggtct atggattctg gggtgccaca actcagactt tcggaacaga 2100 ggcatgaccg ccttactgaa ggtttctagt tgtgacaaga acactggtga ttattaegag 2360 gacagttatg aagatatttc ageataettg ctgagtaaaa acaatgccat tgaaccaaga 2220 <210> 12 <211> 740 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Giy Aia Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 第34頁 200914608 27690- Seq list Defimtif 080418

Met Gin Ser Asp Leu G]y Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30

Arg Va] Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Va] Val Tyr Lys Lys 35 40 45

Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn lie Ala Lys Pro 50 55 60

Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr He Gin Ala Glu Va] 65 70 75 80

Tyr Asp Thr Val Val ]】e Th】· Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val 85 90 95

Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110 \

Glu Tyr Asp Asp Gin Thr Ser Gin Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val 115 120 125

Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gin Val Leu Lys Glu Asn 130 135 140

Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cvs Leu Thr Tyr Ser Tyr Lsu Ser 145 150 155 160

His Val Asp Lsu Val Lys Asp Leu Asn Ser Glv Lsu lie G]y Ala Leu 165 170 175

Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gin Thr Leu 180 185 190

His Lys Phe lie Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp 195 200 205

His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gin Asp Arg Asp Ala Ala Ser 210 215 220

Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn G]y Tyr Val Gin Arg 225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Leu lie Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His 245 250 255

Val He Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Va] His Ser lie Phe Leu Glu 260 265 270

Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gin Ala Ser Leu Glu lie 275 280 285

Ser Pro lie Thr Phe Leu Thr Ala Gin Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly 290 295 300 G3n Phe Leu Leu Phe Cys His lie Ser Ser His Gin His Asp Gly Met 第35頁 200914608 27690- Sec] lisl Defimtif 080418 305 3]0 315 320

Glu Ala Tyr Val Lys Va! Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gin Leu Arg 325 330 335

Met Lys Asn Asri Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp 340 345 350

Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe 355 360 365 lie Gin lie Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His 370 375 380

Tyr lie Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu 385 390 395 400 / Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gin Tyr Leu Asn Asn Gly Pro f 405 410 415

Gin Arg lie Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr 420 425 430

Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala 11e Gin Hi s Glu Ser Gly lie 435 440 445

Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Cr]u Val Gl}' Asp Thr Leu Leu J)e i 1 e 450 455 460

Phe Lys Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Asn 11e Tyr Pro His Gly lie 465 470 475 480

Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495

His Leu Lys Asp Phe Pro lie Leu Pro Gly Glu lie Phe Lys Tyr Lys 500 505 510 k

Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525

Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu A3a 530 535 540

Ser Gly Leu lie Gly Pro Leu Leu lie Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp 545 550 555 560

Gin Arg Gly Asn Gin lie Met Ser Asp Lys Arg Asn Val lie Leu Phe 565 570 575

Ser Va] Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tv】· Leu Thi· Glu Asn lie Gin 580 585 590

Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gin Leu Glu Asp Pro Glu Phe 595 600 605 第36頁 200914608 27690- Seq list Definilif 080418 Gin Ala Ser Asn lie Mel His Ser He Asn Glv Tyr Val Phe Asp Ser 610 615 620

Leu Gin Leu Ser Val Cvs Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr lie Leu 625 630 635 640

Ser lie Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Glv Tyr 645 650 655

Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670

Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 675 680 685

He Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700

Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 705 710 715 720

Asp Ser Tvr Glu Asp lie Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 725 730 735

He Glu Pro Arg 740 <210> 13 <211> ]932 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 agctttcaaa agaaaacacg acactatttt attgctgcag tggagaggct ctgggattat 60 gggatgagta gctccccaca tgttctaaga aacagggctc agagtggcag tgtccctcag 120 ttcaagaaag ttgttttcca ggaatttact gatggctcct ttactcagcc cttataccgt 180 ggagaaciaa atgaacaitt gggactcctg gggccatata taagagcaga agttgaagat 240 aatatcatgg taactttcag aaatcaggcc tctcgtccct attccttcta ttctagcctt 300 atttcttatg aggaagatca gaggcaagga gcagaaccta gaaaaaactt tgtcaagcct 360 aatgaaacca aaacttactt ttggaaagtg caacatcata tggcacccac taaagatgag 420 tttgactgca aagcctgggc ttatttctct gatgttgacc tggaaaaaga tgtgcactca 480 ggcctgattg gaccccttci ggtctgccac actaacacac tgaaccctgc tcatgggaga 540 caagtgacag tacaggaatt tgctctgttt ttcaccatct ttgatgagac caaaagctgg 600 tacttcact〇 aaaatatgga aagaaactgc agggctccct gcaatatcca gatggaagat 660 cccactttta aagagaatta tegettccat gcaatcaatg gctacataat ggatacacta 720 cctggcttag taatggctca ggatcaaagg attcgatggt atctgctcag catgggcagc 780 aatgaaaaca tccattctat tcatttcagt ggacatgtgt tcactgtacg aaaaaaagag 840 gagtataaaa tggcactgta caatctctat ccaggtgttt ttgagacagt ggaaatgtta 900 ccatccaaag ctg〇aatttg gcggglggaa tgccltattg gegageatet acatgctggg 960 atgagcacac tttttctggt gtacagcaat aagtgtcaga ctcccctggg aatggcttct 1020 第37頁 200914608 27690- Seq list Definitif 080418 ggacacat ta gagat 11lea gattacagct tcaggacaat atg〇acagtg ggccccaaag 1080 ctggccagac tteat tat tc cggatcaatc aatgcctgga gcaccaagga gcccttttct 1140 tggatcaagg tggatctglt ggcaccaatg attattcacg gcatcaagac ccagggtgcc 1200 cgtcagaagt ictccaijcct ctacatctct cagt t tatca tcatgtatag tcttgatggg 1260 aagaagtggc agact tateg aggacagtcc actggaacct taatggtctt ct t t〇gcaat 1320 gtggat teal ctgggataaa acacaatatt ttlaaccctc caattattgc tcgatacatc 1380 cgt t tgcacc caactcat ta tageat tege agcactct tc gcatggagtt gatgggctgi 1440 gatt taaata gt tgeageat gccattggga atggagagta aagcaatatc agatgcacag 1500 attactgctt caicctact i taccaatatg 11 tgccacct ggtctcct tc aaaagctcga 1560 cttcacctcc aagggaggag taatgcctgg agacctcagg tgaataatcc aaaagagtgg 1620 ctgcaagtgg acticcagaa gacaatgaaa glcacaggag taactactca gggagtaaaa 1680 tetetget ta ccagcatgta tgtgaaggag t tcctcaict ccagcagtca agatggccai 1740 cagtggactc tcttttttca gaatggcaaa gtaaaggttt t tcagggaaa tcaagactcc 1800 t tcacacctg tggtgaactc tctagaccca ccgt tactga ctcgctacct tegaat tcac 1860 ccccagagt i gggtgcacca gatigccctg aggatggagg ttctgggctg cgaggcacag 1920 gacctctact ga 1932 <210> 14 <211> 643 <212> PR丁 <213> Homo sapi ens <400> 14

Ser Phe Gin Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe lie Ala Ala Va] Glu Arg 15 10 15

Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg 20 25 30

Ala Glr Ser Gly Ser Val Pro Gin Phe Lys Lys Va) Val Phe Gin Glu 35 40 45

Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gin Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn 50 55 60

Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr lie Arg Ala Glu Val Glu Asp 65 70 75 80

Asn He Met Val Thr Phe Arg Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe 85 90 95

Tyr Ser Ser Leu He Ser Tyr Glu Glu Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu 100 105 110

Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp 1]5 120 125

Lys Val Gin His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys 130 135 140 第38頁 200914608 27690- Seq list Definitif 080418 /Ua Trp A】a Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser ]45 150 155 160

Gly Leu lie G)y Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro 165 170 175

Ala His Gly Arg Gin Val Thr Val Gin Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr 180 185 m

He Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Mei Glu Arg 195 200 205

Asn Cys Arg Aia Pro Cys Asn lie Gin Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys 210 215 220 G】u Asii 丁y】· Arg Phe His Ala lie Asn G]y Tyr Met Asp Thr Leu 225 230 235 240

Pro Gly Leu Val Met Ala Gin Asp Gin Arg lie Arg Trp Tyr Leu Leu 245 250 255

Ssr Met Gly Ser Asn Glu Asn lie His Ser He His Phe Ser Gly His 260 265 270

Va] Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu 丁yi. Lys Met Ala hen Tyr Asn 275 280 285

Lsu Tyr Pro Gly Va] Phe Glu Thr Va] Glu Met Lsu Pro Ser Lys Ala 290 295 300

Gly lie Trp Arg Val Glu Cys Leu lie Gly Glu His Leu His Ala Gly 305 310 315 320

Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gin Thr Pro Leu 325 330 335

Gly Met Ala Ser Gly His lie Arg Asp Phe Gin lie Thr Ala Ser Gly 340 345 350

Gin Tyr Gly Gin Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His 丁yr Ser Gly 355 360 365

Ser I]e Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp lie Lys Val 370 375 380

Asp Leu Leu Ala Pro Mel lie lie His Gly I3e Lys Thr Gin Gly Ala 385 390 395 400

Arg Gin Lys Phe Ser Ser Leu Tyr lie Ser Gin Phe ]le I]e Met 丁yr 405 430 415

Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gin Thr Tyr Arg Gly Gin Ser Thr Gly 420 425 430

Thr Leu Met Va] Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly lie Lys His 第39頁 200914608 27690- Seq list Deiinitif 080418 435 440 445

Asn I]e Phe Asn Pro Ρ】·〇 He ]]e Ala Arg 丁yr I】e Arg Leu His Pro 450 455 460

Thr His 丁yr Ser lie Arg Ser Thi. Leu Arg Mei G)u Leu Me! Gly Cys 465 470 475 480

Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Mel Glu Ser Lys Ala lie 485 490 495

Ser Asp Ala Gin lie Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala 500 505 510

Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gin Gly Arg Ser Asn 515 520 525 A3 a Trp Arg Pro Gin Val Asn Asn Pro Lys Giu Trp Leu G3n Val Asp 530 535 540

Phe Gin Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Th]' Gin Gly Va] Lys 545 550 555 560

Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu lie Ser Ser Ser 565 570 575

Gin Asd GIv His Glu Trp Thr Leu Phe Phe G3ij Asn u]y Lvs Val Lys 580 585 590

Val Phe Gin Gly Asd Gin A.sp Ser Phe Th: Pro Val Val Asn Ser Leu 595 600 605

Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg lie His Pro Gin Ser Trp 610 615 620

Val His Gin lie Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gin 625 630 635 640

Asp Leu 丁yr 第40頁

Claims (1)

1. 200914608 十、申請專利範圍： 1. 一種因子VIII蛋白質，包括一被修飾的因子VIII 聚胜肽，其特徵在於：相較於未被修飾的因子VI〗丨聚胜 肽，該被修飾的因子VI11聚胜肽與具内噬作用細胞相互作 用或被吞入的能力被降低或廢除。 2. —種因子VIII蛋白質，包括一被修飾的因子VIII 聚胜肽，其特徵在於：該被修飾的因子V111聚胜肽與具内 噬作用細胞之表面受體相互作用的能力被降低或廢除。 3. —種因子VIII蛋白質，包括一被修飾的因子VI ^ 聚胜肽，其特徵在於：該被修飾的因子V π I聚胜肽對人類 的免疫原性實質地被降低或廢除。 4_如申請專利範圍第2項所述之因子νπ I蛋白質，其 中該表面受體為甘露醣敏感型受體。 5 ·如申請專利範圍第4項所述之因子v π I蛋白質，其 中該表面受體係擇自於下列所組成之族群：甘露醣受體（仙 CD206)、樹突細胞專一性ICAM3凝集素（dc_Sign CD209))、多醣受體（dectin)、以及 dec_2〇5(CD2〇5)。 6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之因子 VIII蛋白質’其中該被修飾的因子νπΐ聚胜肽的修傅作 用實質上產生一去醣基化因子VIII聚胜肽。 7. 如申請專利範圍第6項所述之因子vi 11蛋白質，其 中該實質上去醣基化因子νιη係為一實質上以末端甘露 醜殘基去酶基化因子VI11聚胜肽封端的聚糖結構。 8·如申請專利範圍第7項所述之因子VI11蛋白質，其 6023-9587-PF;Kai 1 200914608 中^ X末Jr而甘露酿殘基封端的聚糖結構係為一寡甘露醣類 型的聚糖結構。 9·如申請專利範圍第2項所述之因子VI11蛋白質，其 中忒具内化作用之細胞係為抗原表現細胞。 1〇·如申請專利範圍第9項所述之因子VI11蛋白質， /、中該抗原表現細胞係為樹突細胞、巨噬細胞、内皮細胞、 或B淋巴球細胞。 11 ·如申請專利範圍第1至10項任一項所述之因子 v I π蛋白質，其中該因子v 11丨蛋白質係為一促凝血活性 的因子V111蛋白質。 12·如申請專利範圍第1至11項任一項所述之因子 ▲ 11蛋白負’其中該被修飾的因子v 111聚胜肽之修飾作 用包括具有保守序列Asn-Xxx-Thr/Ser之醣化作用保守區 域至少—個胺基酸的取代或刪除，其中，Xxx代表任何的 胺基酸。 13.如申請專利範圍第1至12項任一項所述之因子 viiI蛋白質’其中該被修飾的因子νιπ聚胜肽的修飾作 用包括擇自於下列所組成之族群之至少一個胺基酸的取代 或刪除：SEQ ID Ν0: 2之全長人類因子ν III聚胜肽序列 之天冬醯胺酸239、天冬醯胺酸2118、絲胺酸241以及穌 胺酸2120。 14·如申請專利範圍第13項所述之因子vi 11蛋白質， 其中該修飾作用至少包括以擇自丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸、 麩胺酸、穌胺酸、天冬胺酸或麩胺酸所組成之群組的胺基 2 6023-9587-PF;Kai 200914608 酸取代天冬醯胺酸2 3 9。 15.如申請專利範圍第13項所述之因子vi Π蛋白質， 其中該修飾作用至少包括以擇自丙胺酸、絲胺酸、麵胺酸、 穌胺酸、天冬胺酸或麵胺酸所組成之群組的胺基酸取代.天 冬醯胺酸2118 〇 1 6 ·如申請專利範圍第14項所述之因子V111蛋白質， 其中s玄修倚作用至少包括以丙胺酸取代天冬醯胺酸2 3 9。

   17.如申請專利範圍第14項所述之因子VIII蛋白質， 其中該修飾作用至少包括以麩胺酸取代天冬醯胺酸2 3 9。 1 8.如申請專利範圍第15項所述之因子V111蛋白質， 其中該修飾作用至少包括以丙胺酸取代天冬醯胺酸2118。 1 9 ·如申凊專利範圍第15項所述之因子V111蛋白質， 其中該修飾作用至少包括以麩胺酸取代天冬醯胺酸211 8。 2〇·如申睛專利範圍第13項所述之因子VIII蛋白質， 其中該修飾作用包括同時以丙胺酸取代天冬醯胺酸239及 天冬醯胺酸211 8。 •士申明專利範圍第13項所述之因子νπΐ蛋白質， 其中該修飾作用& ^ 匕括同時以麵胺酸取代天冬醢胺酸239以 及天冬醯胺酸2118。 申β專利範圍第13項所述之因子VIII蛋白質， 其中該修飾作用七、 匕括同時以丙胺酸取代天冬醯胺酸239, 以及以麩胺酸取代 代天冬醯胺酸2118。 2 3.如申譜直名丨 Ί無圍第13項所述之因子yin蛋白質， 其中該修飾作用白虹 、 匕枯同時以麩胺酸取代天冬醯胺酸239, 6023-9587~PF；Kai 3 200914608 以及以丙胺酸取代天冬醯胺酸2118。 2 4.如申請專利.範圍第.1至2 3項任一項所述之因子 νιΠ蛋白質，其中該被修飾的因子VIII蛋白質聚胜肽的 修飾作用更包括SEQ ID NO : 1 〇之Β功能區塊全部或部分 的刪除® 2 5 ·如申請專利範圍第1至24項任一項所述之因子 VHI蛋白質，其中該被修飾的因子VIII聚胜肽包括下列 至少一種： (i) SEQ ID N0: 6之胺基酸序列，及/或 (ii) SEQ ID N0: 8之胺基酸序列。 26. —種編碼如申請專利範圍第1至25項之因子VI11 蛋白質之分離的核酸分子或被修飾之分離的核酸分子’其 中編碼該被修飾的因子V111聚胜肽之該核酸序列或該被 修飾的核酸序列包括下列至少一種： (i )SEQ IDN0: 5之核酸序列；及/或 (i i) SEQ ID N0 : 7之核酸序列。 2 7. —種能在高嚴苛條件之下與申請專利範圍第2 Θ項 之分離核酸分子雜交之分離核酸分子，或其互補的核酸分 子。 28. —種表現載體，包括如申請專利範圍第26至27項 任一項之分離的核酸分子。 29. —種宿主細胞，包括轉染如申請專利範圍第28項 之表現載體，或表現如申請專利範圍第i至19項之任/項 的因子V111蛋白質。 6〇23-9587-PF;Kai 4 200914608 ^ 3〇·—種非人類基因轉殖生物’其表現如申請專利範圍 第1至25項之任一項的因子VIU蛋白質。 31·如申請專利範圍帛3〇項所述之非人類基因轉造生 物，其中該生物係擇自於微生物、動物或植物。 32.如申請專利範圍第31項所述之非人類基因轉殖生 物，其中該動物係為一哺乳動物。 33·-種組成物’包括如申請專利範圍第丄至項任 一項之因子VIII蛋白質。

   从如申請專利範圍第33項所述之組合物， & — Ά Λ_ ...... 於其為一醫藥组成物或一冷来乾燥組合物 :5如申請專利範圍$⑽至34項任一項所述之組 物’人匕括一藥學上可接受之載體。 νιπ:二種製造申請專利範圍第1至25項任-項之因 蛋白貝的方法，包括步驟： * 養轉51或轉木如申請專利範圍第26或27項之 ，或編碼如申請專利範圍第25項之任一項之 子則蛋白質的核酸分子之宿主細胞；以及 b )由宿主細胞及/或班 因子νίπ蛋白質。。養基刀離該核酸分子所產生， 一項所述之因 陷之疾病的用 37.一種如中請專利範園第1至25項任 子VIII蛋白質用於治療特徵為因子” Η缺 途。 、 3 8.如申請專利範圍第 έ亥因子V U I缺陷之疾病係 37項所述之用途，其特徵在於 為Α型血友病或後天血友病。 6023-9587-PF;Kai 5 200914608 39.—種如申請專利範圍第 VIII蛋白質用於製造治 項 品的用途。 i血友病或後天 任一項之因子 血友病之醫藥 4U. 至25項任一項的因子viH蛋白質 6023-9587-PF;Kai 6