TW200846365A

TW200846365A - CD44 antibodies

Info

Publication number: TW200846365A
Application number: TW096148114A
Authority: TW
Inventors: Haichun Huang; Mohan Srinivasan; Erika Meaddough; Lan Yang; Kristopher Toy; Xu Xu; Vahe Bedian; Advait V Badkar
Original assignee: Medarex Inc; Pfizer
Priority date: 2006-12-21
Filing date: 2007-12-14
Publication date: 2008-12-01
Also published as: EP2102238A2; CN101605812A; US20100092484A1; AU2007338844A1; WO2008079246A2; UY30776A1; CA2672916A1; RU2009128064A; PE20081478A1; KR20090094848A; BRPI0720477A2; MX2009006891A; EP2102238A4; WO2008079246A3; CL2007003807A1; AR064456A1; JP2010512790A

Description

200846365 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於結合至人類CD44之抗體及其抗原結合部分。本發明亦關於編碼該等抗體及抗原結合部分之核酸分子’製造CD44抗體及抗原結合部分之方法，包含此等抗體或其抗原結合部分之組合物及使用抗體、抗原結合部分及組合物或藥劑用於治療之方法。本申請案主張2006年12月21曰申請之美國臨時專利申請 φ 案第60/876109號之權利，其全文以引用之方式併入本文中。【先前技術】由（例如）物理損傷、感染或免疫反應引起之炎症、局部積液係由炎性細胞（諸如單核細胞及τ細胞）於胞外基質中

募集起始的。Naor，D·等人，（2003) Arthritis Res Ther， 5:105-115。此細胞募集通常導致細胞激素（諸如TNF_a、 IL-6及IL-Ιβ)於細胞外基質（Ibid)中進一步浸潤及增加。該細胞募集及浸潤連同各種其他細胞過程（諸如生長、黏著、分化、侵入及存活之調控）係藉由跨膜醣蛋白細胞黏著分子、黏著受體之總科介導。細胞黏著受體家族成員包括CD44、廣泛分布之跨膜醣蛋白。cm4在各種細胞行為（包括黏著、遷移、活化及存活）中起關鍵作用。p⑽汍 H.等人，（2003) Molecular Cell Biology，4:33-45 〇 CD44分子重量在80至9〇 kDa之範圍内且可藉由差異替代性拼接產生接近800個變異同功異型物。Cichy，）·等人， (2003) J_al of Cell Bi〇1〇gy，161:5, 839_843。目前已知 126413.doc 200846365 數十種同功異型物。CD44於許多細胞類型（包括白血球、纖維母細胞、上皮細胞、角質細胞及一些内皮細胞）上普遍表現，且缺少任何變異外顯子之標準CD44(CD44s)形式為最多表現之同功異型物。 CD44連同其原始配位子（玻尿酸（ha)，一種親水性，直鏈’胞外多醣）在炎症中起主要作用。Na〇r D.，（2003) 及以 77zer，5:105-115及 Amffo, A. (1990) Ce// 61， 1301-1313。舉例而言，在活體内研究中，誘發CD44介導 • 之HA結合活性之單株抗CD44抗體（IRAWB 14)導致經蛋白聚糖誘發關節炎之小鼠體内炎性症狀加重。pure, Ε·等尺 ’ TRENDS in Molecular Medicine, 7 .·2]3-22\。【發明内容】本發明提供特異性結合CD44且可用作CD44拮抗劑之經分離抗體或其抗原結合部分，及包含該抗體或其抗原結合部分之組合物或藥劑。本發明之另一態樣提供如本文所述之抗體或其抗原結合部分中之任何，其中該抗體或抗原結 • 合部分為人類抗體。在另一態樣中，該抗體或抗原結合部分為人類重組抗體。本發明提供特異性結合CD44之抗體，其包含：⑴重鏈及/或t鍵’或（L)其可變域，或（iii)其抗原結合部分，或 (iv)其互補判定區（CDR)。本發明另外提供CD44抗體或其抗原結合部分，其中抗體或其抗原結合部分具有如以下於幻至g)中所述之至少一種官能特性。 a)以如表面電漿共振所量測1000 nM或更小之KD結合至 126413.doc 200846365 CD44 ； b) 具有如表面電漿共振所量測小於或等於0.01 s_]之CD44 解離速率（kw); c) 以如FACS或ELISA結合檢定所量测小於500 nM，75 pg/ml之 EC5G結合至 CD44 ; d) 以如ELISA結合檢定所量測小於500 nM，75 pg/ml之 IC50抑制CD44與HA之間之相互作用； e) 以如FACS所量測小於約100 nM之IC5G降低CD44受體 φ 於炎性細胞（諸如CD3+ T細胞）中之活體内表面表現； f) 以小於50 nM之IC5G降低CD44受體於活體外之表面表現； g) 對CD44具有高於淋巴管内皮細胞玻尿酸受體1蛋白 (LYVE-1)至少100倍之選擇性。在另一實施例中，本發明提供包含編碼如本文所述之抗體或其抗原結合部分中之任何的核苷酸序列之經分離核酸分子。在一特定實施例中，本發明提供包含以本文所述之 φ 任何SEQ ID NO所列出之核苷酸序列之經分離核酸分子。本發明另外提供包含本文所述之任何核酸分子之載體，其中該載體視情況包含可操作連接至核酸分子之表現控制序列。另一實施例提供包含本文所述之載體中之任何或包含本文所述之核酸分子中之任何的宿主細胞。本發明亦提供產生本文所述之抗體或抗原結合部分中之任何或產生該等抗體或該等抗原結合部分中之任何之重鏈或輕鏈的經分離細胞株。 126413.doc 200846365 在另一實施例中，本發明提供產生CD44抗體或其抗原結合部分之方法，其包含在合適條件下培養本文所述之宿主細胞或細胞株中之任何，且回收該抗體或抗原結合部分。本發明亦提供包含本文所述之核酸中之任何的非人類轉殖基因動物或轉殖基因植物，其中非人類轉殖基因動物或轉殖基因植物表現該核酸。 ^ 本發明另外提供分離結合至CD44之抗體或其抗原結合部分之方法，其包含將抗體自如本文所述之非人類轉殖基因動物或轉殖基因植物分離之步驟。土本發明提供組合物，λ包含：⑴該抗CD44抗體之重鍵及/或輕鏈，其可變域，或其抗原結合部分，或其CRd，或編碼其之核酸分子；及（ii)醫藥學上可接受之載劑。本 ’X明之組合物可另外包含另一諸如治療劑或診斷劑之組份。 • 本發明亦提供包含經連接或於懸浮液中如本文所述之抗體或其抗原！吉合部A中之任何及視情況之醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物或藥劑。本發明之組合物可另外包含另一諸如治療劑或診斷劑之組份。本發明亦提供診斷及治療方法。。、本=明亦提供治療有此需要之哺乳動物之炎性細胞浸潤或募集的方法，其包含向該哺乳動物投與本文所述之抗體或八！几原結合部分中之任何，或醫藥組合物中之任何的步 126413.doc 200846365 本發明之另一態樣提供如本文所述之抗體或其抗原結合部分中之任何，其中該抗體或抗原結合部分為人類抗體。在另一悲樣中，該抗體或抗原結合部分為人類重組抗體。【實施方式】定義貝牙此說明書及申請專利範圍，將詞語"包含"或其變型理解為暗示涵蓋所述整數或整數群，但不排除任何其他整數或整數群。除非本文另有定義，否則與本發明相關使用之科學及技術術語應具有通常由普通熟習此項技術者所理解之含義。此外’除非上下文另有所需，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。一般而言，本文中關於細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白及核酸化學及雜交所使用之命名法為彼等常用於此項技術中之命名法。已知鹼性抗體結構單元包含四聚物。各四聚物係由兩對相同之多肽鏈組成，各對具有一 ’，輕”鏈（約25 kDa)及一，，重” 鏈（約50-70 kDa)。各鏈之胺基端部分包括一主要負責抗原識別之約100至120或更多胺基酸之可變區。各鏈之羧基端部分界定了一主要負責效應子功能之恆定區。將人類輕鏈刀類為κ及λ輕鏈。將重鏈分類為μ、δ、γ、α或ε，且將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鍵及重鏈中，由約12或更多胺基酸之"j”區來接合可變區及怪定區，其中重鏈亦包括約3或更多胺基酸之，，D”區。一般 126413.doc 200846365 參見 Fundamental Immunology 第 7章（Paul, W·編輯，第 2 版，Raven Press，Ν·Υ· (1989))。各重鏈/輕鏈對之可變區 (VH及VL)分別形成抗體結合位點。因此，完整IgG抗體（例如）具有兩個結合位點。除了在雙官能或雙特異性抗體中以外，兩個結合位點均相同。重鏈及輕鏈可變區展現藉由三個高變區接合之相對保守之構架區（FR)的相同一般結構，亦稱作互補判定區或 CDR。術語”可變"係指抗體間可變域之某些部分的序列廣泛不同且該等部分用於各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性的事實。然而，可變性並非於整個抗體可變域中均勻分配，而是集中於藉由更高度保守之FR分離之CDR中。各對之兩個鏈之CDR係藉由FR對準，以使其能結合至特異抗原決定基。自N-終端至C-終端，輕鏈及重鏈皆包含 FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4結構域。根據下列文獻之定義·· Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health， Bethesda，Md· (1987及 1991)) ; SChothia&LeskJ.Mol. Biol· 196:901-917 (1987); Chothia等人，Nature 342:878-883 (1989)，將胺基酸分配至各結構域。如本文所使用，藉由編號提及之抗體與獲自相同編號之融合瘤的單株抗體相同。舉例而言，單株抗體1 A9.A6.B9為與獲自融合瘤 1A9.A6.B9或其次純系者相同之抗體。本文所使用之Fd片段意謂：由VH及CH1域組成之抗體片段；由單臂抗體之VL 及Vh域組成的Fv片段；及由VH域組成之dAb片段（Ward等 126413. doc 11 200846365 人，Nature 341:544-546 (1989))。在一些實施例中，該抗體為單鏈抗體（scFv)，其中乂及 VH域經由使其成為單一蛋白鏈之合成連接子成對以形成單扣 /刀子。（Bird等人，（1988) Science 242:423-426及 Huston 等人，（1988) Proc. Natl. Acad· Sci. USA 85:5879-5883)。在一些實施例中，該等抗體為雙功能抗體，意即為二價抗體，其中¥1及％域表現於單一多肽鏈上，但使用過短以致使同一鏈上兩個結構域之間無法成對之連接子，藉此迫使該等結構域與另一鏈之互補域成對且產生兩個抗原結合位點。（參見例如，Holliger P·等人 ’（1993) Proc· Natl. Acad· Sci· USA 90:6444-6448及Poljak R· j·等人，（⑽4)此邮職 2:1121-1123)。在一實施例中，可將來自本發明抗體之一或多種CDR共價或非共價併入分子中以使其成為特異性結百至C D 4 4之免疫黏附素。在該等實施例中，該（該等）〔耵r 可以較大多肽鏈之一部分併入，可共價地連接至另一多肽鏈，或可非共價地併入。在具有一或多個結合位點之抗體實施例中，結合位點可彼此相同或可不同。本文所使用之術語”類似物”或”多肽類似物”係指包含具有與一些對照胺基酸序列之實質一致性且具有與對照胺基酸序列大體上相同之功能或活性之區段。通常多肽類似物包含一關於對照序列之保守胺基酸取代（或插入或缺失）。類似物可為至少20或25個胺基酸長，或可為至少5〇、6〇、 70、80、90、1〇〇、150或200個胺基酸長或更長，且可通 126413.doc -12· 200846365 苇與全長多肽一樣長。本發 ^^ ^ _ 乂月之一些實施例包括具有自生殖糸&C基酸序列之1、2、3、4 4 、 5 、 6 、 7 、 8 、 9 、 1〇、 11、12、13、14、15、16¾ 17倘俶儿個取代之多肽片段或多肽類似物。抗體或免疫球蛋白分子之片^或類似物可由普通孰篇此項技術者根據本說明書之教示而容易地製備。'

在一實施例中，對_4抗體或其抗原結合部分之胺基酸取代為彼等··⑴降低對蛋白水解之敏感性；⑺降低對乳化之敏感性；（3)改變形成蛋白複合物之結合親和力，或 (4)賦予或改質該等類似物之其他物理化學或功能特性，但仍保持對CD44之特異性結合之取代。類似物可包括對天然產生之肽序列之各種取代。舉例而言，可在天然產生之序列中（例如在形成分子間接觸之結構域外之多肽部分中）進行單或多胺基酸取代（較佳為保守胺基酸取代）。亦可在形成可改良多肽活性之分子間接觸之結構域中進行胺基酸取代。保守胺基酸取代應不大體上改變親本序列之結構特徵；例如取代胺基酸不應改變發生於親本序列中，組成免疫球蛋白結合域之反平行β摺疊，或不應分裂表徵親本序列之其他類似二級結構。一般而言，甘胺酸及脯胺酸不用於反平行β摺疊。經技術辨別之多肽二級與三級結構之實例係描述於 Proteins ， Structures and Molecular

Principles(Creighton 編 ’ W· Η· Freeman and Company， New York (1984)) ； Introduction to Protein Structure (C. Branden 及 J· Tooze 編，Garland Publishing，New York， Ν·Υ· (1991))及 Thornton 等人之 Nature 364:105 (1991))中0 126413.doc -13- 200846365 本文所使用之術語"抗體”與免疫球蛋白同義且將其理解為此項技術中通常已知之含義。詳言之，術語抗體不限於產生抗體之任何特定方法。舉例而言’術語抗體包括（尤其）重組抗體、單株抗體及多株抗體。本文中所用之術語抗體之"抗原結合部分，，（或僅”抗體部分"）係指保留與抗原（例如CD44)特異性結合之能力之抗體的-或多個片|史。已展示抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。涵蓋於術語抗體之，，抗原結合部分"中之結口片I又的貝例包括·（OPab片段，由VL、Vh、Cl及^域組成之單價片段；⑻F(abm，於鉸鏈區包含藉由雙硫橋連接之兩個Fab片段之二價片段；（丨⑴由Vh&Ch1域組成之Fd片段；(iv)由單臂抗體之&及％域組成之π片段； (v)dAb 片段（Ward等人，（1989) Nature 341:544-546)，其係由vH域組成；及（vi)經分離之互補判定區（cdr)。此外，儘管Fv片段之兩個結構域（Vl^Vh)由獨立基因編碼，但其可使用重組法由合成連接子接合，該連接子能夠使其形成 V L與V H區成對以形成單價分子之單一蛋白鏈（稱為單鏈 FV(SCFV))，（參見，例如 Bird等人，（1988) Science 242: 423-426 ;及 Huston 等人，（1988) Proc· Natl Aead % 79 5 883)。該等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之 ’’抗原結合部分”内。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如雙功旎抗體。雙功能抗體為二價、雙特異性抗體，其中Vh及 VL域係表現於單一多肽鏈上，但使用過短而使得無法在同鏈上兩個結構域之間成對之連接子，藉此迫使該等結構 126413.doc -14- 200846365 域與另一鏈之互補域成對且產生兩個抗原結合部位（參見例如 Holliger，P.等人（1993) Proc· Natl· Acad· Sci· USA 90:6444-6448 ; Poljak，R· J·等人（1994) Structure 2:1121- 1123) 〇此外’抗體或其抗原結合部分可為較大免疫黏附分子之 4为’其係藉由抗體或抗體部分與一或多個其他蛋白或肽共價或非共價締合而形成。該等免疫黏附分子之實例包括使用抗生蛋白鏈菌素核心區以製成四聚seFv分子 (Kvpmy嶋v 等尺、1995、Human Antib〇dies and 6:93-101)及使用半胱胺酸殘基、標誌肽及c_端聚組胺酸標圯物以製成二價及經結合生物素scFv分子等人 (1994) Mo/·蚰卿彻/· 31:1〇47_1〇58)。其他實例包括，其中將一或多種來自抗體之CDR共價或非共價地併入分子中以使得其成為特異性結合至所關注之抗原（諸如CD44)的免疫黏附素。在該等實施例中，該（該等）CDR可以較大多肽鏈之邛刀併入，可共價地連接至另一多肽鏈，或可非共價，併入可使用分別諸如全抗體之木瓜蛋白酶及胃蛋白酶消化之習知技術由全抗體製備諸如Fab及F(ab，）2片段之抗體卩刀此外，如本文所述，可使用標準重組DNA技術獲得抗體、抗體部分及免疫黏附分子。除非另外特別指出，否則術語”CD44，，係指人類cD44。 CD44為多結構胞外基質受體及調控細胞細胞及細胞-基質活1*生之經典跨膜醣蛋白家族成員。人類CD44之選殖及序列已經報導’例如Am)f。，A. (199()) Cell, 16•(寄存編號 126413.doc 200846365 NM—001001391)且係列於SEQ ID ΝΟ:1。術語CD44意欲包括重組人類CD44及重組嵌合形式CD44，其可藉由標準重組表現法製備或為可購得的（例如R&D Systems目錄號861-PC-100)。詳言之，CD44為以包含20個外顯子之單一 60 kb 基因編碼之80-90 kDa糖基化I型跨膜蛋白。20個外顯子（標準外顯子Is至10s)中之十個係於所有CD44陽性細胞中表現且編碼”標準CD44”。其餘10個外顯子（變異外顯子lv至 1 Ον)經受替代性拼接且編碼插入CD44之胞外區中之肽序列。”CD44之胞外域”包含藉由3個雙硫鍵穩定之Ν端球狀區，且係藉由直鏈結構自細胞膜分離且長度大約為247個殘基且係列於 SEQ ID ΝΟ:3。（Gadhoum Ζ·等人，（2004) Leukemia & Lymphoma 45(8):1501-1 5 10)。此三雙硫鍵梯包括位於CD44胞外域内之展現玻尿酸（HA，玻尿酸鹽，玻尿酸）結合域"HA結合域"之球狀區，且包括長度大約為100 個殘基之n連接分子"(CD44之胞外域殘基32-123且係列於 SEQ ID NO:5)。ΠΗΑ結合域”之其他特徵可為至少包含胺基酸殘基Lys38、Arg41、Tyr42、Arg78、Tyr79、AsnlOO、 AsnlOl、Argl50、Argl54 及 Argl62。（Teriete P.等人， (2004) Molecular Cell, 13, 483-496)。本文中所使用之術語n嵌合抗體n意謂包含來自兩種或兩種以上不同抗體（包括來自不同物種之抗體）之區域之抗體。舉例而言，嵌合抗體之CDR中之一或多種可源自人類 CD44抗體。在一實例中，可將來自人類抗體之CDR與來自非人類抗體（諸如小鼠或大鼠）之CDR組合。在另一實例 126413.doc -16- 200846365

中，所有CDR可源自人類CD44抗體。在另一實例中，可於散合抗體中組合來自一種以上人類CD44抗體之CDR。舉例而言，嵌合抗體可包含來自第一人類CD44抗體輕鏈之CDR1，來自第二人類CD44抗體輕鏈之CDR2，及來自第三人類CD44抗體輕鏈之CDR3，且來自重鏈之CDR可源自一或多種其他CD44抗體。此外，構架區可源自獲取一或多種CDR之CD44抗體中之一者或來自一或多種不同人類抗體。此外，術語，，嵌合抗體”意欲涵蓋上述組合中之任何’其中該等組合包括人類及非人類抗體。本文關於抗體所使用之術語，，競爭”意謂第一抗體（或其抗原結合部分）與第二抗體（或其抗原結合部分）競爭結合，其中，在第二抗體存在下，第一抗體與其同源抗原決定基之結合與在不存在第二抗體下，第地減低。替代情況可（但不一定）為第二抗體與其抗原決定基之結合在第一抗體存在下亦可偵測地減低。亦即，第一杬體可抑制第二抗體與其抗原決定基之結合，而彼第二抗體不抑制第一抗體與其各別抗原決定基之結合。然而，當各抗體可偵測地抑制其他抗體與其同源抗原決定基或配位體結合時，據稱該等抗體彼此”交又競爭，，與其各別抗原決 =基結合（以相同，較大或較小程度）。本發明涵蓋競爭及又又脱f抗體。無論該競爭或交又競爭之發生機制(例如絲、構形改變，或與常見抗原決定基或其部分結合）為何’熟習此項技術者基於本等之教示將瞭解涵蓋該，及/或父又競爭抗體且其可適用於本文中所揭示之 126413.doc 200846365 方法。本文中所使用之術語”保守胺基酸取代"為胺基酸殘基經具有類似化學特性（例如電荷或疏水性）之側鏈尺基之另一胺基酸殘基取代的胺基酸取代。一般而言，保守胺基酸取代大體上不改變蛋白之功能特性。在兩個或兩個以上胺基酸序列由於保守取代而彼此不同之情況下，可將序列類似性百分比向上調整以校正取代之保守性質。進行此調整之方式為熟習此項技術者眾所熟知。pearson，（1994) Methods Mol· Biol· 243:307_31。具有類似化學特性之側鏈之胺基酸群之實例包括：υ脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；2)脂族-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；3)含有醯胺之側鏈：天冬醯胺酸及麩醯胺酸；4) 芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；5)鹼性側鏈··離胺酸、精胺酸及組胺酸；6)酸性侧鏈：天冬胺酸及麵胺酸，及7)含硫之側鏈：半胱胺酸及甲硫胺酸。保守胺基酸 φ 取代基可為：（例如）纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酷胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸_纈胺酸、麵胺酸鹽-天冬胺酸鹽及天冬醯胺酸-麵醯胺酸。保守取代亦可為於Gonnet等人，（1992) Science 256: 1443-45中所揭示之PAM25〇對數概似矩陣中具有正值之任何改變。”中度保守η取代為於pAM25〇對數概似矩陣中具有非負值之任何改變。 π接觸”係指以使抗體可影響CD44生物活性之方式使本發明之抗體或其抗原結合部分與靶CD44或其抗原決定基聚 126413.doc -18· 200846365 至一處。該”接觸”可（例如）於試管、皮氏培養皿或其類似物中”活體外”完成。在試管中，接觸可僅涉及抗體或其抗原結合部分與CD44或其抗原決定基，或其可涉及全細胞。細胞亦可維持或生長於細胞培養盤中且在彼環境下與抗體或其抗原結合部分接觸。在此上下文中，在將抗體活體内用於更複雜活有機體成為可能之前，可測定特定抗體或其抗原結合部分影響CD44相關病症之能力（亦即抗體之 ic^)。對於有機體外之細胞而言，存在多種使cD44與抗體或其抗原結合部分接觸之方法且其為熟習此項技術者眾所熟知。本文所使用之術語|，ELISA"係指酶聯結免疫吸附劑檢定。此檢定為熟習此項技術者眾所熟知。此檢定之實例可見於 Vaughan，^,等人，（1996)Nat Bi〇tech 14:3〇9314, 以及本申請案實例5、6、7及11中。

術語”抗原決定基"包括能夠特異性結合至免疫球蛋白或 T細胞—受體或另外與分子相互作用之任何蛋白決定子。抗原決定基之決定子一般由諸如胺基酸或碳水化合物或糖側鏈之分子的化學活性表面分群組成，且__般具有特里性三維結構特徵以及特異性電荷特徵。抗原決定基可為”線性” 或’構型”。在線性抗原決定基中，蛋白與相互作用分子（諸 2體）之間之所有相互作用點沿蛋白之主要胺基酸序列現。在構形抗原決定基中，相互作用點穿過彼此分一：：上：胺基酸殘基而產生。而抗原上所需之抗原決 h㉞確定’則可（例如）使用本發明所述之技術來產生 126413.doc -19- 200846365 彼抗原決定基之抗體。在發現過程期間，抗體之產生及特被亦可閘明關於合乎需要之抗原決定基之資訊。由此資訊’接著可能競爭性地篩檢用於與相目抗原、決定基結合之杬體。達成其之方法為進行交叉競爭研究以發現彼此競爭性結合之抗體，亦即競爭與抗原結合之抗體。基於其交又矶爭將抗體"裝箱”之高產率法係描述於PCT公開案第w〇 03/48731號中。 ^ 本文所使用之術語’，表現控制序列，，意謂實現所接合之編碼序列之表現及加工所必需的聚核皆酸序列。表現控制序列包括：適當之轉錄起始、終止、啟動子及強化子序列；有效RNA加：Ms號，諸如拼接及多聚腺㈣化信號；穩定、胞貝mRNA之序列；增強轉譯效率之序列（意即— 致序列），增強蛋白穩定性之序列；及若需要，增強蛋白刀/必之序列。該等控制序列之性質視宿主有機體而不同；在原核生物中，5亥等控制序列一般包括啟動子、核糖體結 φ =位點及轉錄終止序列；在真核生物中，該等控制序列一般包括啟動子及轉錄終止序列。術語，，控制序列，，意欲包括 (至少）存在為表現及加工所必需之所有組份，且亦可包括存在有利於（例如）丽導序列及融合搭配物序列之額外纽份。、本文所使用之術語”生殖系”係指經由生殖細胞自母體傳至子代之抗體基因及基因區段之核苦酸序列。此生殖系序列不同於編碼在Β細胞成熟過程期間因重組及超突變作用而改變之成熟Β細胞中之抗體的核苦酸序列。可將本發明 126413.doc -20- 200846365 之生殖系抗體設計為g-l A9.A6.B9、g-2Dl.A3.D12及g-14G9.B8.B4。本文所使用之術語π人類抗體”意謂可變區及恆定區序列為人類序列之任何抗體。術語涵蓋具有源自人類基因（包括彼等已經改變之人類基因）之序列（例如）以減少可能之免疫原性、增加親和力、消除可引起非所要摺疊之半胱胺酸殘基等之抗體。術語涵蓋該等重組產生於非人類細胞中可賦予非典型人類細胞糖基化之抗體。此等抗體可以如下所述之各種方式製備。本文中所使用之術語，，人化抗體，，係指非人類起源之抗體’其中以見於對應人類抗體位置之殘基取代以非人類物種抗體序列為特徵之胺基酸殘基。認為此”人化”法降低所得抗體於人類體内之免疫原性。將瞭解，可使用於此項技術中眾所熟知之技術來使非人類起源之抗體人化。Winter 4人 ’（1993) Immunol. Today 14:43-46。受關注之抗體可藉由重組DNA技術來工程設計以藉由對應人類序列取代 CHI、CH2、CH3、鉸鏈域及/或構架域。pCT公開案第w〇 92/02190號及美國專利第5,530，101號、第5,585,〇89號、第 5,693,761 號、第 5,693,792 號、第 5,714,350 號及第 5,777,085號。本文所使用之術語”人化抗體"在其含義内另外包括嵌合人類抗體及CDR-接枝抗體。本發明之嵌合人類抗體包括非人類物種抗體之VH及VL及人類抗體之以及匕域。本發明之CDR經移植抗體係由分別以非人類動物抗體之VH及VL之彼等CDr取代人類抗體Vh&Vl2Cdr而產 126413.doc -21 - 200846365 生。本文所使用之術語，’經分離之聚核苷酸”意謂染色體、 cDNA或合成來源或其組合之聚核苷酸，關於其起源，，，分離之聚核苷酸” ··（1)不與天然發現”經分離聚核苷酸"之聚核苷酸之全部或部分相關聯，（2)可操作連接至天然不與其連接之聚核苷酸，或（3)天然不以較大序列之部分出現。

術語π經分離蛋白”、”經分離多肽，，或”經分離抗體”為就其起源或衍生來源而言滿足下列條件的蛋白、多肽或抗體·（ 1)不與以其原生狀態伴隨其之天然相關組份相關聯； (2)不含有來自相同物種之其他蛋白；（3)係以來自不同物種之細胞表現；或（4)並非天然產生。因此，（例如）化學合成或在與其天然起源之細胞不同之細胞系統中合成之多肽將自其天然相關組份中”分離”。亦可使用此項技術中眾所熟知之蛋白質純化技術藉由分離大體上供給不含天然相關組份之蛋白質。使用於此項技術中眾所熟知之蛋白純化技術，蛋白亦可藉由分離而表現大體上不含天然相關組份。經分離抗體之實例包括已使用CD44親和力、純化之抗體及已藉由活體外細胞株合成之CD44抗體。，，活體外，，係指在人造環境中（例如但不限於試管或培養基中）所進行之程序。活體内"係指在活有機體（諸如但不限於哺乳動物，例如猴、小氣、大鼠或兔）體内所進行之程序。 :〜係指特定抗體-抗原相互作用之結合親和力平衡韦數。據稱當KW mM，較佳地侧nM且最佳w福 126413.doc -22· 200846365 時，抗體與抗原特異性結合。kd結合親和力常數可藉由表面電漿共振（例如使用如實例5所論述之BIACORE™系統）來量測。術語”kQff”係指特定抗體-抗原相互作用之解離速率常數。kcff解離速率常數可藉由表面電漿共振（例如使用如實例5所論述之BIACORETM系統）來量測。

本文所使用之術語”天然產生之核苷酸"包括脫氧核糖核苷酸及核糖核苷酸。本文所使用之術語’’經修飾核苷酸”包括（例如）具有經修飾或取代之糖基之核苷酸。本文中所提及之術語’’寡核苷酸鍵π包括寡核苷酸鍵，諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、磷醯胺酸。LaPlanche等人， (1986) Nucl. Acids Res. 14:9081 ； Stec等人，(1984) J. Am. Chem. Soc. 106:6077 ； Stein等人，（1988) Nucl· Acids Res. 16:3209 ; Zon 等人，（1991) Anti-Cancer Drug Design 6:539 ; Zon 等人，Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach，第 87-108 頁（F. Eckstein 編，Oxford University Press, Oxford England (1991));美國專利第 5，151，510 號；Uhlmann and Peyman，(1990) Chemical Reviews 90:543。若需要，寡核苷酸可包括债測標記。 ”可操作連接’’之序列包括與所關注基因鄰接之表現控制序列及反置或隔一定距離起作用來控制所關注基因之表現控制序列。在核酸序列上下文中術語π序列一致性百分比’’意謂當為 126413.doc •23- 200846365 最大對應而對準時兩序列中之相同殘基。序列一致性比較之長度可超過至少約9個核普酸，通常為至少㈣個核‘ 酸，更通常為至少約24個核苷酸，通常為至少約28個核苷酸，更通常為至少約32個核菁酸，且較佳為至少約hi 個或更多之核_長度。此項技術中已知可用以量測核苷酸序列一致性之許多不同演算法。舉例而言，可使用 FASTA、Gap或Bestfit來比較聚核苷酸序列，該等方法為 Wisconsin Package 1〇.〇版本，c⑽p加心卿 (GCG)，Madison，Wisconsin中之程式。包括（例如）程式 FASTA2及FASTA3之FASTA提供查詢與搜尋序列之間最佳重璺區之對準及序列一致性百分比（Pears〇n，她咖办 EnzymoL, 183: 183:63-98； Pearson, (2000) Methods Mol. Biol. 132:185-219 ； Pearson, (1996) Methods Enzymol. 266:227-258 ； Pearson, (1998) J. Mol. Biol. 276:71-84) 〇 ^ 非另有所扣，否則使用特定程式或演算法之預設參數。舉例而口核®文序列之間的序列一致性百分比可使用 FASTA，使用其預設參數（字長為6及打分矩陣之因數）或使用Gap，使用如GCG 6·；!版本中所提供的預設參數來測定。除非另外指出，否則提及核苷酸序列涵蓋其互補序列。因此，應理解提及具有特定序列之核酸涵蓋其互補鏈及其互補序列。在胺基酸序列上下文中術語，，序列一致性百分比”意謂當為最大對應而對準時兩序列中之相同殘基。序列一致性比 126413.doc -24- 200846365 較長度可超過至少約5個胺基酸，通常至少約Μ個胺基酉欠更通系至少約30個胺基酸，通常至少約50個胺基酸，，通常至少約⑽個胺基酸且甚至更通常約15()、2〇〇或更夕胺基g文之長度。此項技術中已知可用以量測胺基酸序列致I*生之許多不同演异法。舉例而言，可使用、 Gap或Bestfit來比較胺基酸序列，該等方法為⑽如 Package 1〇·〇版本，Genetics c〇mputer 仏哪（gcg)， Madison，Wisconsin 中之程式。通吊使用序列分析軟體來量測多肽之序列一致性。使用賦予各種取代、缺失及其他修飾（包括保守胺基酸取代）之類似性的量度來使蛋白分析軟體與序列匹配。舉例而言 GCG含有諸如’’Gap”及”Bestfit”之程式，其可以如該等程式所指定之預設參數加以使用以測定緊密相關之多肽（諸如來自不同物種有機體之同源多肽）之間或野生型蛋白與其類似物之間的序列同源性或序列一致性。參見例如Gcg 6.1 版本（University of Wisconsin，WI)。亦可使用 FASTA 利用預設或推薦參數來比較多肽序列，參見GCG 6.1版本。 FASTA(例如FASTA2及FASTA3)提供查詢及搜尋序列之間最佳重疊區之對準及序列一致性百分比（Pearson，（1990) Methods Enzymol. 183:63-98 ； Pearson, (2000) Methods Mol. Biol. 132:185-219)。當比較本發明之序列與含有來自不同有機體之大量序列的資料庫時，另一較佳演算法為電腦程式BLAST，尤其為blastp或tblastn，其使用如該等程式所供應之預設參數。參見例如Altschul等人，（1990) J. 126413.doc -25- 200846365

Mol. Biol. 215:403_410 ; Altschul 等人，（1997) Nucleic

Acids Res· 25:3389-402。所比較之同源多肽序列之長度一般為至少約16個胺基酸殘基，通常為至少約2〇個殘基，更通常至少約24個殘基，通常至少約28個殘基且較佳大於約35個殘基。當搜尋含有來自大ϊ不同有機體之序列的資料庫時，較佳為比較胺基酸序列。本文中所提及之術語”聚核苷酸，，意謂長度為至少10個鹼基之聚合形式核苷酸（核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或經修飾形式之任一類型的核苷酸該術語包括單鏈及雙鏈形式。術浯多肽”涵蓋原生或人造蛋白、蛋白片段及蛋白序列之多肽類似物。多肽可為單體或聚合體。本文所使用之術語”多肽片段”係指具有胺基端及/或羧基知缺失仁其中其餘胺基酸序列與天然產生序列中之相應位置相同之多肽。在一些實施例中，片段為至少5、6、8 或ίο個胺基酸長。在其他實施例中，片段為至少14、至少 20至V 50或至少70 ' 80、90、1〇〇、15〇或2〇〇個胺基酸本文所使用之術語"重組宿主細胞"（或簡稱”宿主細胞意謂已引入重組表現载體之細胞。應瞭解"重組宿主細胞，，及箱主、、’田胞不僅思謂特定受檢細胞，且亦意謂該細胞之子代。由於在後代中因突變或環境影響可發生某些改變，口此事a上該子代可不同於親本細胞，但仍包括於本文中 126413.doc -26- 200846365 所使用之術语”宿主細胞’’之範轉内。备至少約60至75%之樣本展現單物種之多肽時，蛋白或多肽為’’大體上純"、”大體上均質"或"大體上純化”。多肽或蛋白質可為單體或多聚體。大體上純之多肽或蛋白通常可包含約50%、60%、70%、80%或99% w/w之蛋白樣本，更通常約95%，且較佳可超過99%純淨。蛋白純度或均質性可以於此項技術中眾所熟知之許多方式來表示，諸如蛋白樣本之聚丙烯醯胺凝膠電泳，隨後在以此項技術中眾所 ^ ^知之染料將凝膠染色後觀測單-多肽帶。如熟習此項技術者所瞭解，可藉由使用HPLC或於此項技術中眾所熟知之用於純化之其他方式來提供較高解析度。 § &及核酸或其片段時，術語"實質相似性”或”實質序列相似性”意謂當藉由適當核苷酸插入或缺失與另一核酸 (或其互補鏈）最佳對準時，核苷酸序列一致性如藉由諸如上文論述之FASTA、BLAST或Gap之任何眾所熟知序列一 φ 致性運算法所量測為至少約85%，較佳至少約90%且更佳至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%之核苷酸鹼基。應用於多肽之術語，，實質一致性”或”實質相似性”意謂當諸如藉由程式GAP或BESTFIT，使用程式所供應之預設空位權重最佳對準時，兩個胺基酸序列共有至少7〇%、75% 或80%之序列相似性，較佳至少9〇%或％%序列一致性且更佳至少97%、98%、99%或100%之序列一致性。在某此實施例中，不相同之殘基位置由於保守胺基酸取代而不 1264I3.doc -27- 200846365 同。本文所用之術語"表面電聚共振"係指一種使得藉由摘測蛋白濃度在生物傳感器基質中之變化而分析即時生物特異性相互作用之光學現象，例如使用BIac〇ReTM系統 (Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden&piscataway, N.J.)。關於其他描述，參見jonsson u.等人，（Μ%) a仙 Biol· Clin. 51:19-26 ; Jonsson U 望 / •寻人，（1991)

Biotechniques 11:620-627 ; Jonsson Β·等人，（1995) 了 Mol. Recognit· 8:125-131 ;及 Johnsson Β·等人，（1991) Anal· Biochem. 198:268-277 ° ’’治療有效量，，係指將在一定程度上緩解所治療病症之一或多種症狀之所投與治療劑的量。提及類風濕性關節炎之治療，治療有效量係指具有以下效應中之至少一者之量· P牛低關卽之結構彳貝害；抑制（亦即在一定程度上減緩，車* 佳停止）關節區之積液；且在一定程度上緩解（或較佳消除與類風濕性關節炎相關之一或多種症狀。 ’’治療’’係指減輕或減緩生物病症及/或其伴隨症狀之方法。關於各種自體免疫疾病（諸如類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化、肉芽腫性疾病及多發性硬化），此等術語簡單地意謂受自體免疫疾病影響之個體之預期壽命增加且疾病之一或多種症狀減輕。本文所使用之關於特定基因之術語"利用，，意謂抗體中特定區域之胺基酸序列根本上係在3細胞成熟期間衍生自彼基因。舉例而言，短語”利用人類Vh_3家族基因之重鏈可 126413.doc -28- 200846365 變區胺基酸序列"係指抗體Vh區在B細胞成熟期間衍生自 VH-3家族基因區段之情況。在人㈣細胞中，存在超過川個不同之官能重鏈可變區，藉由該等可變區來產生抗體。因此’使用特定重鏈可變基因表示就與抗原結合之組合特性及功能活性而言，較佳抗體_抗原相互作用結合基元。如將瞭解，基因利用分析僅提供有限的抗體結構概述。隨者人類B細胞隨機產生v_D_j重鏈轉錄或v_Jk輕鏈轉錄，發生許多次級過程，包括（但不限於）體細胞超突變、&添加及CDR3延長。參見例如Mendez等人Nature Genetics 15:146-156 (1997) 〇本文所使用之20種習知胺基酸及其縮寫遵循習知用法。參見 Immunology-A Synthesis (第 2版，E.S· Golub及 D.R. Gren編，Sinauer Associates，Sunderland，MA (1991))。本文所使用之術語，，載體”意謂能夠轉運已連接之另一核酸的核酸分子。在一些實施例中，該載體為質體，亦即其 φ 中可接合額外DNA區段之環狀雙鏈DNA段。在一實施例中，該載體為病毒载體，其中額外DNA區段可接合至該病毒基因組之内。在一實施例中，該等載體能夠在引入其之宿主細胞中自主複製（例如具有複製細菌起源之細菌載體及游離型哺乳動物載體）。在其他實施例中，該等載體（例如非游離型哺乳動物載體）可在將其引入宿主細胞時整合至宿主細胞之基因體内，且藉此與該宿主基因體一起加以複製此外，某些載體能夠指導與其可操作連接之基因之表現。該等載體在本文中稱為，，重組表現載體，或簡稱，，表 1264I3.doc •29、 200846365 現載體”) 或"經標記 c"係指將另一分子併

或毋素。標記多肽及醣蛋白之各種方法在此項技術中已知且可使用該等方法。用於多肽之標記之實例包括（但不限於）以下：放射性同位素或放射性核種、螢光標記（例如 FITC、若丹明、鑭系元素磷光體）、酶標記、化學發光標誌、生物素基、由第二報導體（例如白胺酸拉鏈對序列、本文所使用之術語"標記入抗體中。在一實施例中，二次抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標記物）辨識之預定多肽抗原決定基、磁性劑（諸如釓螯合劑）、毒素（諸如百日咳毒素）、紫杉酚、細胞遲緩素B、短桿菌素 D、溴化乙錠、吐根鹼（⑽…此）、絲裂黴素、依托泊普 (etoposide)、特諾波賽（tenoposide)、長春新鹼 (vincristine)、長春驗（vinblastine)、秋水仙驗 (colchicine)、阿黴素（doxorubicin)、道語黴素 (daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌 (mitoxantrone)、光神徽素（mithramycin)、放線菌素 d、1-去氫睾酮、糖皮質激素、普魯卡因（procaine)、丁卡因 (tetracaine)、利多卡因（lidocaine)、普萘洛爾（卩1>〇卩以11〇1〇1) 及嗓呤黴素（puromycin)及其類似物或同源物。在一些實施 126413.doc -30- 200846365 例中，標記係藉由各長度之間隔臂附著以減小潛在位阻。本發明之抗CD44抗體之重鏈c端離胺酸在由於抗體在哺乳動物細胞培養#中表現時之一或多健肽酶活性而重組產生抗體時裂解。（Lewis D. A·等人，』/·⑶所,66(5): 585-95 (1994) ； Harris R. J., J. of Chromatography A} 705： 129-134 (1995))。可於重組產生之抗體中發現自已知或新穎類型之活體内（轉譯後）修飾或由自發性（非酶促）蛋白降解（諸如甲&取酸氧化、二酮派嗪形成、天冬胺酸鹽異構化或天冬醯胺酸殘基脫醯胺或琥珀醯亞胺形成）產生之所預期結構之許多變型。人類抗CD44抗體及其特徵本發明k供結合至人類CD44之經分離人類抗體或其抗原結合部分。本發明之各種態樣係關於該等抗體及抗原結合部分，及其醫藥學上可接受之組合物，以及用於製造該等抗體及抗原結合部分之核酸，重組表現載體及宿主細胞。本發明亦涵蓋使用本發明抗體及抗原結合部分來活體外或活體内偵測人類CD44或抑制人類CD44活性之方法。根據本發明較佳實施例之人類抗CD44抗體使非人類或非人類所衍生之單株抗體（Mab)所固有之免疫原及過敏反應減至最低且從而增加所投與之抗體之功效及安全性。完全人類抗體之用途提供治療慢性及復發人類疾病之實質優點’該等疾病諸如類風濕性關節炎、幼年型類風濕性關節乂、動脈粥樣硬化、肉芽腫性疾病、多發性硬化症、哮 %、克羅恩氏病（Crohnls Disease)、僵直性脊椎炎、牛皮 126413.doc -31 - 200846365 癬性關節炎、斑狀乾癣及癌症，其可能需要重複投與抗體。已知來自若干物種（包括人類）之CD44胺基酸及核苦酸序列，SEQ ID NO: 1及2(參見例如寄存編號nm— 001001391)。人類CD44或其抗原部分可根據熟習此項技術者眾所熟知之方法來製備或可自商家購得（例如來自r&d Systems目錄號861-PC_ 100)。來自馬來猴之（：£)44胺基酸及核皆酸序列於此項技術中為未知的且揭示於本文中，Seq ® ID NO: 5、7(胺基酸）、8及 153(核酸）。在一些實施例中，人類抗CD44抗體係藉由使基因體包含人類免疫球蛋白基因之非人類轉殖基因動物（例如齧齒動物）免疫以使轉殖基因動物產生人類抗體而產生。在一些實施例中’抗CD44抗體及抗原結合部分包括（但不限於）結合至HA結合位點之抗體或抗原結合部分。在另一實施例中’本發明提供抗體或其抗原結合部分，鲁其中該抗體或抗原結合部分包含至少一種選自以下之 CDR :獨立選自SEQ ID NO: 17、53、89及125中任一者之 VH CDR1或因至少一種保守胺基酸取代而不同於seq ID NO: 17、53、89及125中之任一者之序列；獨立選自SEQ ID NO: 19、55、91及127中任一者之VH CDR2或因至少一種保守胺基酸取代而不同於SEQ ID NO: 19、55、91及127 中之任一者之序列；及獨立選自SEQ ID NO:21、57、93及 129中任一者之γΗ CDR3或因至少一種保守胺基酸取代而不同於SEQ ID NO: 21、57、93及129中之任一者之序列。 126413.doc -32- 200846365 舉例而言，上述VH CDRl、CDR2及CDR3序列可因1、2、 3、4或5個保守胺基酸取代而各自獨立地不同於各別所述之 SEQ ID NO 〇在另一實施例中，本發明提供抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部分包含至少一種選自以下之 CDR :獨立選自SEQ ID NO: 23、59、95及131中任一者之 Vl CDR1或因至少一種保守胺基酸取代而不同於SEQ ID NO: 23、59、95及131中之任一者之序列；獨立選自SEQ ® ID NO:25、61、97及133中任一者之VL CDR2或因至少一種保守胺基酸取代而不同於SEQ ID NO: 25、61、97及133 中之任一者之序列；及獨立選自SEQ ID NO: 27、63、99 及137中任一者之Vl CDR3或因至少一種保守胺基酸取代而不同於SEQ ID NO: 27、63、99及135中之任一者之序歹》]。舉例而言，上述Vl CDR1、CDR2及CDR3序列可因1、 2、3、4或5個保守胺基酸取代而各自獨立地不同於各別所述之 SEQ ID NO。在本發明之另一態樣中，抗體或抗原結合部分包含：列於 SEQ ID NO:17 之 VH CDR1，列於 SEQ ID NO:19 之 VH CDR2，列於 SEQ ID NO:21 之 VH CDR3，列於 SEQ ID NO:23 之 VL CDR1，列於SEQ ID NO:25 之 VL CDR2，及列於 SEQ ID NO:27之 VL CDR3。

在本發明之另一態樣中，抗體或抗原結合部分包含：列於 SEQ ID NO:53 之 VH CDR1，列於 SEQ ID NO:55 之 VH CDR2，列於 SEQ ID NO:57 之 VH CDR3，列於 SEQ ID 126413.doc -33- 200846365 NO:59之VL CDRl，列於SEQ ID NO:61 之VL CDR2，及列於 SEQ ID NO:63之 VL CDR3。在本發明之另一態樣中，抗體或抗原結合部分包含：列於 SEQ ID NO:89 之 VH CDR1，列於 SEQ ID NO:91 之 VH CDR2，列於 SEQ ID NO:93 之 VH CDR3，列於 SEQ ID NO:95 之 VL CDR1，列於SEQ ID NO:97 之 VL CDR2，及列於 SEQ ID NO:99之 VL CDR3。在本發明之另一態樣中，抗體或抗原結合部分包含：列 ⑩ 於 SEQ ID ΝΟ··125 之 VH CDR1，列於 SEQ ID NO:127 之 VH 。〇112，列於8£(5 1〇凡0:129之¥11€〇113，列於8£()1〇 NO:131 之 VL CDR1，列於 SEQ ID NO:133 之 VL CDR2，及列於8丑(^10>10:135之¥1^€0113。在另一實施例中，上述VH及VL CDR1、CDR2及CDR3序列亦可因至少一種保守胺基酸取代而各自獨立不同於上述特定SEQ ID NO。舉例而言，CDR1、CDR2及CDR3序列可 ^ 因1、2、3、4或5個保守胺基酸取代而各自獨立地不同於上述各別特定SEQ ID NO。本發明另外提供抗體或其抗原結合部分，其中如於抗體 1A9.A6.B9、2D1.A3.D12、14G9.B8.B4 及 10C8.2.3 中任一者中所見，該抗體或抗原結合部分包含VH及Vl CDR1、VH 及 VL CDR2及 VH及 VL CDR3。在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分包含為SEQ ID NO: 11、47、83及119中任何一者之VH域，或具有至少一個保守胺基酸取代而不同於SEQ ID NO: 11、47、83及119 126413.doc -34- 200846365 中之任一者之^域Q舉例而言，％域可因工、2、3、斗、 5、6、7、8、9或10個保守胺基酸取代而不同於seq ι〇耻H、47、83及119中之任何一者。在另—實施例中，此等保守胺基酸取代中之任何可出現在CDR1、CDR2&/或 CDR3區中。本發明之另一態樣為包含胺基酸序列與SEQ m N0: 11、47、83及119中之任何至少9〇〇/〇、較佳95%且更佳 96%、97%、98%、"％或⑽％相同之VH域之抗體或其抗響原結合部分。在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分包含為SEQ NO·· 15、51、87及123中任何一者之％域，或具有至少一個保守胺基酸取代作用而不同於SEq ID NO: 15、51、87 及123中之任何之\^域。舉例而言，&域可因1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10個保守胺基酸取代而不同於sEQ NO: 15、51、87及123中之任何一者。在另一實施例中， φ 此等保守胺基酸取代中之任何可出現在CDR1、CDR2及/或 CDR3區中。本發明之另一態樣為包含胺基酸序列與SEq ID NO: 15、5 1、87及123中之任何至少90%、較佳95%且更佳 96%、97%、98%、99%或100%相同之丸域之抗體或其抗原結合部分。在本發明之另一態樣中，抗體或其抗原結合部分係選自由下列各物組成之群：a)包含列於SEQ ID ΝΟ··11之VH域及列於SEQ ID NO: 1 5之VL域之抗體或其抗原結合部分；b)包 126413.doc -35· 200846365 含列於SEQ ID NO:47之VH域及列於SEQ ID ΝΟ··51之VL域之抗體或其抗原結合部分；c)包含列於SEQ ID NO:83之VH 域及列於SEQ ID NO:87之VL域之抗體或其抗原結合部分；及（1)包含列於8£(^1〇>10:119之¥11域及列於8£(5 1〇 ΝΟ··123之VL域之抗體或其抗原結合部分。在另一實施例中，對於群a)至d)中如上所述之抗體或其抗原結合部分中之任何而言，V Η及/或V L域可因至少一種保守胺基酸取代而不同於其中所述之特定SEQ ID NO。舉例而言，VH及/或Vl域可因1、2、3、4、5、6、7、8、9或 10個保守胺基酸取代而不同於所述SEQ ID NO。在另一實施例中，此等保守胺基酸取代中之任何可出現在CDR1、 CDR2及/或CDR3區中。

在另一態樣中，本發明為選自由下列各物組成之群之抗體或其抗原結合部分：a)包含胺基酸序列與SEQ ID NO:9 至少 90%，較佳 95%且更佳 96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之重鏈，及胺基酸序列與SEQ ID NO·· 13至少90%，較佳95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之輕鏈之抗體或其抗原結合部分；b)包含胺基酸序列與SEQ ID NO:45至少90%相同之重鏈及與SEQ ID NO:49至少95%，較佳 96%、97%、98%、99%或100%相同之輕鏈之抗體或其抗原結合部分；c)包含與SEQ ID ΝΟ··81至少95%，更佳 96%、97%、98%、99%或100%相同之重鏈及與SEQ ID NO:85 至少 95%，較佳 96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之輕鏈之抗體或其抗原結合部分；及d)包含與SEQ ID 126413.doc -36- 200846365 NO:‘117至少90%相同之重鏈及與SEQ ID NO:121較佳 95%，更佳96%、97%、98%、99%或100%相同之輕鏈之抗體或其抗原結合部分。在另一實施例中，本發明為選自由下列各物組成之群之抗體或其抗原結合部分：a)包含列於SEQ ID NO:9之重鏈及列於SEQ ID NO: 13之輕鏈之抗體或其抗原結合部分；b) 包含列於SEQ ID NO:45之重鏈及列於SEQ ID NO:49之輕鏈之抗體或其抗原結合部分；c)包含列於SEQ ID NO:81之重鏈及列於SEQ ID NO:85之輕鏈之抗體或其抗原結合部分；及d)包含列於SEQ ID NO:117之重鏈及列於SEQ ID NO:121之輕鏈之抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，將本發明抗CD44抗體之重鏈C端離胺酸裂解（Lewis D. Α·等人，dna/. Chemy 66(5): 585-95 (1994) ； Harris R. J.? J. of Chromotography, 705: 129-134 (1995) ) 〇在本發明之各種實施例中，抗CD44抗體或其抗原結合部分之重鏈及/或輕鏈可視情況包括信號序列。本發明另外提供CD44抗體或其抗原結合部分，其中如所述抗體或其抗原結合部分或其CDR具有以下於A)至0)中所述之若干官能特性中之至少一種。 A)舉例而言，在一實施例中，抗體或其抗原結合部分以如表面電漿共振所量測1000 riM或更小之KD結合至CD44。在另一實施例中，抗體或部分以如表面電漿共振所量測小於500 ιιΜ或較佳小於100 nM，小於50 nM，小於20 nM， 126413.doc -37- 200846365 小於1 〇 nM，小於5 nM，小於4 nM，小於3 nM，小於2 nM，小於1 nM，小於9G() pM，小於綱，小於· PM ’小於600 pM，小於5〇〇 pM或小於1〇〇 pM之KD結合至 CD44。通常’ Kd值不存在下限。然而，對於實踐目的而言’可假定下限為約1 pM。 B) 在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分具有如表面電桌共振所量測小於或等於〇〇1 w之CD44解離速率 (koff)。舉例而言，在某些實施例中，抗體或部分具有小於 0·005 s 1 ’ 小於0.004 S-1，小於〇·〇〇3 S-1，小於0 002 S-1，或 λΙΉ·001 s 1之CD44之k〇ff。通常，k。感不存在下限。然而，對於實踐目的而言，可假定下限為約lxl〇-7 S-1。 C) 在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分以如FACS 或ELISA、'、。己檢疋所1測小於500 nM，75 pg/ml之EC50結合至CD44。在另一實施例中，抗體或部分以如elisa所量測小於100 nM ’小於5〇 nM，小於20 nM，小於10 nM，小於1 nM ’小於500 pM或小於100 PM之EC5〇結合至CD44。較佳地’抗體或部分以小於1〇 ηΜ，1·5 pg/ml之EC5G結合至CD44。通常，ECw值不存在下限。然而，對於實踐目的而言，可假定下限為約1 pM。 D) 在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分以如elisa 結合檢定所量測小於5〇〇 nM，75 pg/ml之IC5G抑制CD44與 HA之間之相互作用。在另一實施例中，抗體或部分以如 ELISA結合檢定所量測小於1〇〇 nM，小於50 nM，小於20 ηΜ’小於10 ηΜ，小於5 ηΜ，小於4 ηΜ，小於3 ηΜ，小 126413.doc -38 - 200846365 於2 ιιΜ，小於1 nM，小於500 pM或小於100 ρΜ之ic5G結合至 CD44 〇 Ε)在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分降低活體内表面表現及單核細胞且如FACS所量測ICw小於約1〇〇 ηΜ。 F) 在另一實施例中’抗體或抗原結合部分以如卩八0§所量測小於50 ηΜ、小於20 ηΜ、小於1 〇 ηΜ、小於i ηΜ、小於500 ρΜ或小於1〇〇 ρΜ，小於約20 ηΜ，小於約1〇 nM或小於約5 nM之ICw降低CD44受體之活體外表面表現。較佳地，抗體或抗原結合部分以小於30 nM，4.5 pg/mi之ic50 降低CD44受體之表面表現。然而，對於實踐目的而言，可假定下限為約1 pM。 G) 在另一實施例中，抗CD44抗體或其抗原結合部分對 CD44具有比對淋巴管内皮細胞玻尿酸受體i蛋白（LYvn) 高至少100倍之選擇性。在一實施例中，本發明提供命名為1A9 A6 B9、 2D1.A3_D12、14G9.B8.B4w〇C823之人類抗⑶料單株抗體（mAb);及產生其之融合瘤細胞株。申請案之表丄及展示編碼全長重鏈及輕鏈之核酸、對應全長經推斷之胺基酸序列及重鏈及輕鏈可變區之核苷酸及經推斷胺基酸序列的序列識別碼（SEQ ID NO)。在實施例中，抗體為命名為1A9.A6.B9、2D1.A3.D12、 14G9.B8.BU 10〇8.2.3之IgG。本發明之抗體或其抗原結合部分或抗體域之特定胺基酸序列係描述於表9、1〇、 11&12及圖2中。 126413.doc -39- 200846365 在實施例修正中，相對於人類基因之生殖系胺基酸序列，CD44抗體之Vl包含一或多個胺基酸取代。在一些實施例中，相對於生殖系胺基酸序列，抗CD44抗體之VL包含1、2、3、4、5、ό、7、8、9或10個胺基酸取代。在一實施例中’來自生殖系之彼等取代中之一或多者在輕鏈之 CDR區中。在一實施例中，相對於生殖系之胺基酸取代在與抗體 1Α9.Α6.Β9、2D1.A3.D12、14G9.B8.B4 及 10C8.2.3 之Vl中任一或多者中相對於生殖系之取代之相同位置的一或多者處。舉例而言，與在抗體1Α9·Α6·Β9之VL中所發現之生殖系相比，本發明之抗CD-44抗體之VL可含有一或多個胺基酸取代。在一些實施例中，胺基酸改變係在對照抗體之一或多個相同位置，但包括與對照抗體不同之取代。在一實施例中，相對於生殖系之胺基酸改變係在與抗體 1A9.A6.B9、2D1.A3.D12、14G9.B8.B4 及 10C8.2.3 之 Vl 中之任何之一或多個相同位置處發生，但該等改變可表示相對於對照抗體中胺基酸之該（該等）位置處之保守胺基酸取代。舉例而έ，若此等抗體中之一者中之特定位置相對於生殖系改變且為麵胺酸鹽，則吾人可於彼位置處取代天冬胺酸鹽。類似地，若與生殖系相比之胺基酸取代為絲胺酸，則吾人可於彼位置處保守地以蘇胺酸取代絲胺酸。保守胺基酸取代已於前述中論述。在一些實施例中，人類抗CD44抗體之輕鏈包含抗體 1Α9·Α6·Β9 (SEQ ID N〇:15)、2D1.A3.D12 (SEQ ID Ν0: 51)、MG9.B8.B4 (SEQ ID n〇:87)或 1〇C8 2 3 (seq 126413.doc •40- 200846365 NO: 123)之VL胺基酸序列，或具有達至1、2、3、4、5、 6、7、8、9或10個保守胺基酸取代及/或總共3個非保守胺基酸取代之該胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈自 CDR1開始處至CDR3末端包含前述抗體中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈可包含分別獨立選自抗體 1A9.A6.B9、2D1.A3.D12、14G9.B8.B4 及 10C8.2.3 之輕鏈之輕鏈 CDR1、CDR2 及 CDR3 的 CDR1、CDR2 及 CDR3 區；或各自具有小於4或小於3個保守胺基酸取代及/或總共三個或少於三個之非保守胺基酸取代之CDR區。在一些實施例中，抗CD44抗體之輕鏈包含輕鏈CDR1、CDR2及 CDR3，其各自獨立選自單株抗體1Α9_Α6·Β9 (SEQ ID NO:13) ； 2D1.A3.D12 (SEQ ID NO:49) ^ 14G9.B8.B4 (SEQ ID NO:85)或 10C8.2.3 (SEQ ID NO: 121)之輕鏈 CDR1、 CDR2及CDR3區。在某些實施例中，抗CD44抗體之輕鏈包含具有選自 1Α9·Α6·Β9 (SEQ ID NO:15)、2D1.A3.D12 (SEQ ID ΝΟ·51)、14G9.B8.B4 (SEQ ID ΝΟ·87)或 10C8.2.3 (SEQ ID NO: 123)之抗體VL區之胺基酸序列的抗體輕鏈 CDR1、CDR2及CDR3區，或各自具有小於4或小於3個保守胺基酸取代及/或總共三個或小於三個非保守胺基酸取代之該等CDR區。本發明之抗CD44抗體可包含人類κ或人類λ輕鏈或源自其之胺基酸序列。在包含κ輕鏈之一些實施例中，輕鏈可變域（VL)經人類VkI、Vk2或Vk3家族基因部分編碼。在某 126413.doc -41 - 200846365 些實施例中，輕鏈利用人類或猴胺基酸序列或其組合。關於重鏈，在一實施例中可變域（Vh)經人類基因部分編碼。在一些實施例中，抗CD44抗體之^序列相對於生殖系胺基酸序列含有一或多個胺基酸取代、缺失或插入（添加）。在一些實施例中，重鏈可變域包含自生殖系胺基酸序列之 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、U、12、13、 14、15、16或17處突變。在一些實施例中，突變為與生殖系胺基酸序列相比之非保守取代、缺失或插入。在一些實加例中，犬變在重鏈之CDR區中。在一些實施例中，胺基酸改變係在抗體1A9 A6 B9、2D1A3 D12、14G9 b8別或 10C8.2.3之VH$任一或多者自生殖系突變之一或多處相同位置進行。在其他實施例中，胺基酸改變係在對照抗體之一或多個相同位置，但包括與對照抗體不同之突變。在一些實施例中，重鏈包含抗體1Α9·Α6·Β9 (SEQ ID ΝΟ:11) > 2D1.A3.D12 (SEQ ID NO:47) > 14G9.B8.B4 (SEQ ID NO:83)或 10C8.2.3 (SEQ ID NO:119)之 VH 胺基酸序列；該VH胺基酸序列具有達至！、2、3、4、6、8或l〇個保守胺基酸取代及/或總共達至3個非保守胺基酸取代。在一些實施例中，重鏈自CDR1開始處至CDR3末端包含前述抗體中任一者之胺基酸序列。在一實施例中，重鏈包含抗體1A9.A6 B9、 2D1.A3.D12、14G9.B8.B4 或 10C8.2.3 之重鏈 CDR1、CDR2 及CDR3區’或各自具有小於8、小於6、小於4或小於3個保守胺基酸取代及/或總共三個或小於三個非保守胺基酸 126413.doc -42- 200846365 取代之該等CDR區。在一些實施例中，重鏈CDR區獨立選自抗體 1A9.A6.B9、2D1.A3.D12、14G9.B8.B4 或 10C8.2.3 之CDR區。在另一實施例中，重鏈包含獨立選自兩種或兩種以上選自 1A9.A6.B9 (SEQ ID NO:ll)、2D1.A3.D12 (SEQ ID NO:47)、14G9.B8.B4 (SEQ ID NO:83)或 10C8.2.3 (SEQIDNO:119)之 VH 區之 CDR 區。在另一實施例中，抗體包含輕鏈及重鏈。在另一實施例中，輕鏈CDR及重鏈CDR來自相同抗體。可進行之一種類型之胺基酸取代為將抗體中可為化學反應性之一或多種半胱胺酸改變為另一殘基，諸如（但不限於）丙胺酸或絲胺酸。在一實施例中，存在非典型半胱胺酸取代。取代可在抗體可變域之CDR或構架區中或抗體之恒定域中進行。在一些實施例中，半胱胺酸系典型的。可進行另一類型之胺基酸取代來改變抗體中任何可能之蛋白水解位點。該等位點可出現在抗體可變域之cdr或構架區中或抗體之恆定域中。取代半胱胺酸殘基且移除蛋白水解位點可降低抗體產物中任何異質性之危險，且從而辦加其均質性。另一種類型之胺基酸取代係用以藉由改變殘基之一或兩者來消除形成可能之脫醯胺位點之天冬醯胺酸-甘胺酸對。在本發明之實施例中’抗CD44抗體之重及輕鏈況包括信號序列。 Θ 在一態樣中，本發明提供四個較佳的抑制性人類抗 CD44單株抗體及產生其之融合瘤細胞株。表1列出編碼重 126413.doc -43- 200846365 鏈及輕鏈全長及包含可變域之部分之核酸，及對應或所推斷之胺基酸序列的序列識別碼（SEQ ID NO:)。表1 人類抗CD44抗體單株抗體序列識別碼〔SEQ ID NO:) 包含可變域之部分全長輕輕蛋白 DNA 蛋白 DNA 蛋白 DNA 蛋白 DNA 1A9.A6.B9 11 12 15 1 9 10 13 14 2D1.A3.D12 47 48 51 52 45 46 49 50 14G9.B8.B4 83 84 87 88 81 8 85 86 10C8.2.3 119 120 123 124 117 118 121 122 在一些實施例中，本發明提供單株抗體1A9.A6.B9、 2D1.A3.D12、14G9.B8.B4 或 10C8.2.3 之重鏈及輕鏈變異體。如本發明實例3中更詳細論述，進行許多重鏈及輕鏈變異體突變以與生殖系CDR區中之彼等匹配。舉例而言，在本發明之一實施例中，g-lA9.A6.B9、g-2Dl.A3.D12、 §-14〇9.68.；64及8_10〇8.2.3分別為生殖系譯本1八9.八639、 2D1.A3.D12、14G9.B8.B4及 10C8.2.3。藉由比較生殖系與非生殖系抗體序列，經突變以達到生殖系譯本之特定胺基酸為熟習此項技術者顯而易見。舉例而言，本發明於抗體 2D1.A3.D12重鏈中提供一種胺基酸取代，其中使殘基28處之蘇胺酸變化為異白胺酸。第二點突變在抗體2D 1.A3.D 12 之輕鏈中，且在殘基38處以組胺酸取代麩醯胺酸。如將瞭解，基因利用分析僅提供有限的抗體結構概述。隨著人類B細胞隨機產生V-D-J重鏈轉錄或V-J κ輕鏈轉錄，發生許多次級過程，包括（但不限於）體細胞超突變、η•添加及CDR3延長。參見例如Mendez等人，（1997) Nature 126413.doc -44- 200846365

Genetics 15:146-156及美國公開專利申請案第2〇〇3_ 00 70185號。因此，為進一步檢驗本發明之抗體結構，所預測之抗體之胺基酸序列係自獲自純系之eDNA產生。此外，N端胺基酸序列係經由蛋白定序獲得。下表2說明生殖系基因區段利用及四個抗CD44融合瘤衍生之抗體之同型。表2 純系重鏈輕鏈 r^l jiiJ Vh D Jh VL Jk NS 1A9.A6.B9 3-33 D4-17 JH6b L6 JK4 IgG2 2D1.A3.D12 1-03 nd JH6b L19 JK1 IgGl 14G9.B8.B4 1-03 D3-10 JH5b All JK4 IgGl 10C8.2.3 3-21 D6-19 JH6b All JK4 IgG4 nd=未確定在一替代實施例中，本發明係關於特異性結合至人類 CD44 且具有選自由 i)vH D4-17 及 VlL6 ; 2)VH D3-10 及 VLA27;及3)VH D6-19及VLA27組成之群之γΗ及VL基因利用的抗體或其抗原結合部分。

另一實施例提供上述抗體或抗原結合部分中之任何，其為Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、單鏈ρν片段、單鏈vH 片段、單鏈VL片段、人化抗體、嵌合抗體或雙特異性抗體。在另一實施例中，提供包含如本文所述之抗體或其部分中之任何及至少一種額外分子實體的所衍生之抗體或抗原結合部分。舉例而言，至少一種額外分子實體可為另一抗體（例如雙特異性抗體或雙功能抗體）、偵測劑、標記、細 126413.doc -45- 200846365 胞毒性劑、藥劑及/或可介導抗體或抗原結合部分與另一種分子締合之蛋白或肽（諸如抗生蛋白鏈菌素核心區或聚組胺酸標記物）及/或連料融合（融合蛋白）至抗體或抗原 ❿aiP刀之載體蛋白（例如血液蛋白白蛋白或運鐵蛋白）。舉例而言，可衍生本發明之抗體或抗原結合部分之適用偵測劑包括螢光化合物’·尤其為螢光素、螢光素異硫氰酸酉旨:若丹明、％二甲基胺-1·萘石黃醯基氣化物、藻紅素、鑭糸碟光體。抗體亦可經適用於偵狀酶標記，該等酶諸如辣根過氧化物酶、β_半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶、葡萄糖氧化酶。在另—實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分亦可經生物素標記，或經由第二報導體辨識之預定多肽抗原決定基（例如白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標記物）標記。在本發明之另一實施例♦，抗體或其抗原結合部分中之任何亦可使用化學基團（諸如聚乙二醇（pEG)、甲基或乙基或碳水化合物基團）來衍生。在一些實施例中，將本文中所揭示之CD44抗體或抗原結合部分附著至固體支撐物或顆粒上。該等顆粒可適用於活體内或活體外診斷用途。抗CD44抗體之種類及子類 CD44抗體之種類（例如IgG、IgM、IgE、“八或IgD)及子 *員（例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)可藉由此項技術中已知之任何方法來確定。一般而言，抗體之種類或子類可使用特異於抗體特定種類及子類之抗體來確定。該等抗體可購 126413.doc -46- 200846365 得。可藉由ELISA或西方墨點（Western Blot)以及其他技術來判定種類及子類。或者，可藉由對抗體重鏈及/或輕鏈之所有恆定域或部分恆定域進行定序，將其胺基酸序列與免疫球蛋白之各種種類及子類的已知胺基酸序列作比較且確定該等抗體之種類及子類來確定種類及子類。本發明之 CD44抗體可為IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。舉例而言，CD44抗體可為IgG，亦即IgGl、IgG2、IgG3或IgG4子類。本發明之一個態樣提供將CD44抗體種類或子類轉化為另一種類或子類之方法。在一些實施例中，使用於此項技術中眾所熟知之方法，分離出不包括編碼匕或以之序列之編碼VL或VH的核酸分子。接著將核酸分子操作地連接至來自所需免疫球蛋白種類或亞類之編碼Cl4 Ch之核酸序列。其可如上述使用包含cL*cH鏈之載體或核酸分子來達成。舉例而§，原本為IgM之CD44抗體可為轉換為IgG之種類。此外，種類轉換可用以將一個IgG子類轉化為另一種，例如自IgGl轉化為IgG2。用於產生包含所需同型之本發明抗體之另一方法包含以下步驟：將編碼CD44抗體重鏈之核酸與編碼CD44抗體輕鏈之核酸分離，分離編碼Vh 區之序列，將VH序列接合至編碼所需同型重鏈恆定域之序列，於細胞中表現輕鏈基因及重鏈結構且收集具有所需同型之CD44抗體。物種及分子選擇性在本發明之另一態樣中，抗CD44抗體展示物種及分子 126413.doc -47- 200846365 選擇性兩者。在一些實施例中，抗CD44抗體結合至人類及靈長類動物CD44。較佳地，抗CD44結合至人類及馬來猴CD44。根據本發明之教示，吾人可使用於此項技術中眾所熟知之方法確定抗CD44抗體之物種選擇性。舉例而言，吾人可使用西方墨點、流式細胞儀、ELISA、免疫沈澱或RIA來確定物種選擇性。（參見例如實例5)。在另一實施例中，抗CD44抗體對CD44具有比淋巴管内皮細胞玻尿酸受體1蛋白（LYVE-1)高至少100倍之選擇性。 (參見實例11)。吾人可根據本說明書之教示，使用於此項技術中眾所熟知之方法確定抗CD44抗體對CD44之選擇性。舉例而言，吾人可使用西方墨點、流式細胞儀、 ELISA、免疫沈澱或RIA來確定選擇性。· 抗CD44抗體與CD44之結合親和力在一實施例中，抗CD44抗體以高親和力結合至哺乳動物CD44，較佳人類CD44 〇在一實施例中，抗CD44抗體於HA結合域内結合。在另一實施例中，抗CD44抗體以高親和力結合至由列於SEQ ID NO:3(胞外域IgG融合）或列於SEQ ID NO:154(猴胞外IgG融合）列出之胺基酸序列組成之多肽，且較佳以高親和力結合至由HA結合域胺基酸序列組成之多肽。在另一實施例中，抗CD44抗體以500 nM或更低之KD結合至CD44，或更佳結合至HA結合域。在其他實施例中，抗體以2χ10·8 Μ、2xl〇-9 Μ或5χ10·1() Μ或更低之KD結合至 CD44，或更佳結合至CD44之HA結合域。在更佳實施例 126413.doc -48 - 200846365 中，抗體以2·5χ1(Γ12 μ或更低之KD於HA結合域中結合至 CD44。在一些實施例中，抗體以與抗體1A9.A6 B9、 2D1.A3，D12、14G9.B8.B4或 10C8.2.3大體上相同 Kd結合至 CD44。在一些實施例中，抗CD44抗體具有低解離速率常數 (k〇ff)。在一些實施例中，抗CD44抗體以1 ·〇χ 1〇·3 η或更低之kQff ’或5·〇χ1(Γ4 s·1或更低之kQff結合至CD44，或更佳結合至CD44之HA結合域。在另一實施例中，k。^大體上與本文中所述之抗體（包括選自1A9.A6.B9、2D1.A3.D12、 14〇9.：68.；84及10€8.2.3之抗體）相同。在一些實施例中，抗體以與包含重鏈CDR區或輕鏈CDR區，來自選自 1Α9.Α6.Β9、2D1.A3.D12、14G9.B8.B4 及 10C8.2.3 之抗體之抗體大體上相同的koff結合至CD44。在一些實施例中，抗體以與包含具有列於SEQ ID NO: 9、45、81及117所見之VH區胺基酸序列之重鏈可變域，具有列於SEq id N〇: 13、49、85或121所見之VL區胺基酸序列之輕鏈可變域的抗體大體上相同之k〇ff結合至CD44，或更佳結合至CD44之 HA結合域。在另一實施例中，抗體以與包含具有列於SEq ID NO: 15、49、85或121所見之VL區胺基酸序列之輕鏈可變域CDR區，或具有列於SEQ ID NO: 9、45、81及117所見之VH區胺基酸序列之重鏈可變域cdr區的抗體大體上相同之koff結合至CD44，或更佳結合至CD44之ha結合域。可藉由於此項技術中已知之方法來測定抗CD44抗體與 CD44之結合親和力及解離速率。結合親和力可藉由 126413.doc -49- 200846365 ELISA、RIA、流式細胞儀（FACS) '表面電漿共振（諸如 BIACORETM)來量測。解離速率可藉由表面電漿共振來量測。較佳地，結合親和力及解離速率係藉由表面電漿共振來量測。更佳地，結合親和力及解離速率係使用 BIACORETM來量測。吾人可藉由使用於此項技術中已知之方法來確定抗體是否具有與抗CD44抗體大體上相同之 KD。實例5提供用於測定抗CD44單株抗體之親和力常數之方法。以抗CD44抗體所辨識之CD44抗原決定基之識別本發明提供結合至CD44且與下列抗體競爭或交叉競爭及/或與下列抗體結合至相同抗原決定基之人類抗CD44單株抗體：（a)選自 1A9.A6.B9、2D1.A3.D12、14G9.B8.B4及 1008.2.3之抗體；（1))包含具有列於8£(5 10 1^0:9、45、81 及117所見之可變域胺基酸序列之重鏈可變域之抗體；（C) 包含具有列於SEQ ID NO: 13、49、85或121所見之可變域胺基酸序列之輕鏈可變域之抗體；或（d)包含如（b)中所定義之重鏈可變域及如（c)中所定義之輕鏈可變域的抗體。若兩個抗體彼此相互競爭與CD44結合，則將其稱作交叉競爭。吾人可藉由使用於此項技術中已知之方法來確定抗體是否結合至相同抗原決定基或交叉競爭與抗CD44抗體結合。在一實施例中，吾人使得本發明之抗CD44抗體在飽和條件下結合至CD44且接著量測測試抗體與CD44結合之能力。若測試抗體能夠在與抗CD44抗體相同之時間結合 126413.doc -50- 200846365 至CD44，則測試抗體結合至與抗CD44抗體不同之抗原決定基。然而，若測試抗體不能夠同時結合至CD44，則測試抗體結合至相同抗原決定基、重疊抗原決定基或與藉由人類抗CD44抗體結合之抗原決定基緊密鄰近之抗原決定基。此實驗可使用ELISA、RIA ' BIACORE™或流式細胞儀（FACS)進行。為測試抗CD44抗體是否與另一抗CD44抗體交叉競爭，吾人可以兩種方向使用上述競爭法，亦即測定對照抗體是否阻斷測試抗體及測試抗體是否阻斷對照抗體。在一實施例中，該實驗係使用ELISA來進行。測定KD之方法係於以下進一步論述。藉由抗CD44抗體來抑制CD44活性在另一實施例中，本發明提供抑制CD44所介導之信號轉導之抗CD44抗體。在其他實施例中，本發明提供抑制淋巴細胞及單核細胞經由CD44共刺激信號轉導之抗CD44 抗體。在另一實施例中，本發明提供阻斷細胞激素產生之抗CD44抗體，且尤其為諸如TNF-α、IL-6及IL-Ιβ之細胞激素。在另一實施例中，本發明提供抑制HA與CD44受體結合之抗CD44抗體。在一實施例中，CD44受體為人類。在另一實施例中，抗CD44抗體為人類抗體。IC5〇可以藉由 ELISA、RIA之配位體結合檢定，或其他檢定及以細胞為主之檢定，諸如FACS檢定或表現CD44之細胞來量測。在一實施例中，抗體或其抗原結合部分以如ELISA檢定所量測不超過5 pg/ml，較佳不超過1 pg/ml，更佳不超過0.5 126413.doc -51 - 200846365 pg/ml，甚至更佳不超過0.20 pg/ml之IC50抑制HA與CD44 之間之配位體結合。實例4提供用於測定藉由結合至HA之 CD44單株抗體之抑制的方法。在另一實施例中，本發明提供防止CD44與HA結合之抗 CD44抗體。在一實施例中，抗CD44抗體抑制HA所誘發之：（i)白血球募集；（ii)細胞-基質相互作用及細胞（諸如白血球與内皮細胞）之間之直接相互作用；（iii)調控白血球細胞功能；（iv)HA之新陳代謝；及/或（v)CD44對基質之組 _ 裝、組織及重塑之作用。吾人可藉由測定由脂多醣（LPS) 及Η A所引發之自白血球之炎性細胞激素釋放來確定抗 CD44抗體是否可在HA存在下防止、抑制或降低CD44之活化。偵測CD44活化及/或HA與CD44結合之檢定係描述於實例4、5、6及7中。在一實施例中，吾人使用細胞激素檢定來測定CD44活化水平。在一些實施例中，使用HA競爭結合檢定所量測之IC5G不超過5 pg/ml，較佳不超過1 pg/ml，更佳不超過0.5 pg/ml，甚至更佳不超過0.20 ⑩ pg/ml。藉由抗CD44抗體來降低表面細胞表現在本發明之另一態樣中，抗體引起細胞表面CD44表現在以抗體培育後下調。在一實施例中，培育可為短時段 (例如4小時）或較長時段（例如24小時）。詳言之，本發明提供引起循環淋巴細胞及較佳地CD3+ T淋巴細胞之CD44表現下調之抗CD44抗體。可使用FACS來量測細胞表面CD44 表現之下調。在本發明之特定實施例中，如FACS所量測 126413, doc •52· 200846365 抗體可引起較佳地細胞表面CD44表現6%之減低，較佳 1〇%減低，或更佳20%下調，或甚至更佳細胞表面CD44表現至少50%減低。實例8例示一種類型之FACS檢定量測之兩種物種（人類及馬來猴）之白血球及T細胞上細胞表面 CD44表現下調。產生抗體之方法本务明之單株抗體可藉由各種技術來產生，包括習知單株抗體方法，例如Kohler 及 Milstein (1975) Nature 256. 495之標準體細胞雜交技術。儘管體細胞雜交程序較佳，但總體上可採用其他產生單株抗體之技術，例如B淋巴細胞之病毒或致癌轉化。用於製備融合瘤之較佳動物系統為鼠類系統。小鼠中之融a瘤產生為極良好確立之程序。使免疫化脾細胞分離以供融合之免疫方案及技術於此項技術中已知。融合搭配物 (例如鼠類骨髓瘤細胞）及融合程序亦為已知。本發明之嵌合抗體或人化抗體可基於如上所述製備之鼠類單株抗體的序列來製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之 DNA可使用標準分子生物學技術由受關注之鼠類融合瘤獲侍且可經工程化以含有非鼠類（例如人類）免疫球蛋白序列。舉例而言，為產生嵌合抗體，可使用於此項技術中已知之方法（美國專利第4,816,567號）將氟類可變區連接至人類恒定區。為產生人化抗體，可使用此項技術中已知的方法（美國專利第5,225,539號、第5,53G，101號、第5,585，_ 號、第5,693,762號及第6，18〇,37〇號）來將鼠類cdr區插入 126413.doc -53- 200846365 人類構架中。在較佳實施例中，本發明抗體為人類單株抗體。該等針對CD44之人類單株抗體可使用具有人類免疫系統而非小鼠系統之部分的轉殖基因或轉染色體小鼠來產生。此等轉殖基因及轉染色體小鼠包括本文中分別以HuMAb Mouse® 及KM Mouse®提及之小鼠且於本文中共同稱為"人類Ig小鼠，、

HuMAb Mouse®(Medarex，Inc.)含有編碼未經重排之人類重（μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因微基因座，以及使内因性μ及κ鏈基因座失活之乾突變（參見例如 Lonberg 等人（1994) Nature 368: 856-859)。因此，小鼠展現降低之小鼠IgM或κ之表現，且回應免疫，使所引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因經受種類轉換及體細胞突變以產生高親和力人類IgGK單株抗體（同上文之Lonberg，N.等人（1994);論述於 Lonberg，N· (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101 ; Lonberg, N.及 Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 及

Harding，F·及 Lonberg，Ν· (1995) Ann· Ν·Υ· Acad. Sci. 764:536-546)中。HuMAb Mouse®及該等小鼠所具有之染色體組修飾之製備及用途係進一步描述於Taylor，L.等人 (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295 ; Chen，J·等人 (1993) International Immunology 5: 647-656 ; Tuaillon等人 (1993) Proc. Natl· Acad. Sci· USA 90:3720-3724 ; Choi等人 (1993) Nature Genetics 4:117-123 ; Chen, J·等人（1993) 126413.doc -54- 200846365 EMBO J· 12: 821-830; Tuamon 等人（1994) J. Immunol· 152:2912-2920 ; Taylor，L.等人（1994) International Immunology 6: 579-591 ；及 Fishwild，D·等人（1996) Nature Biotechnology 14: 845-85 1中。另外參見美國專利第 5,545,806 號、第 5,569,825 號、第 5,625，126 號、第 5,633,425 號、第 5,789,650 號、第 5,877,397 號、第 5,661，016 號、第 5,814,318 號、第 5,874,299 號及第 5,770,429號、美國專利第5,545,807號、PCT公開案WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、 WO 98/24884及 WO 99/45962及 WO 01/14424。在另一實施例中，本發明之人類抗體可使用在轉殖基因及轉染色體上具有人類免疫球蛋白序列之小鼠，諸如具有人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠來培育。本文中稱作’’KM mice™”之該等小鼠係詳細描述於PCT公開案 WO 02/43478 中。另外，表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉殖基因動物系統在此項技術中為可用的且可用以培育本發明之抗 CD44抗體。舉例而言，可使用稱作XenomouseTM(Abgenix， Inc.)之替代轉殖基因系統；該等小鼠係描述於（例如）美國專利第 5,939,598 號、第 6,075,181 號、第 6，114,598 號、第 6，150,584號及第 6,162,963號中。此外，表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉染色體動物系統在此項技術中為可用的且可用以培育本發明之抗 CD44抗體。舉例而言，可使用稱作nTC小鼠π之具有人類 I26413.doc -55- 200846365 重鏈轉染色體及人類輕鏈轉染色體之小鼠；該等小鼠係描述於 Tomizuka 等人（2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727中。此外，具有人類重鏈轉染色體及輕鏈轉染色體之牛已於此項技術中經描述（Kuroiwa等人（2002) Nature Biotechnology 20:889-894)且可用以培育本發明之抗CD44抗體。本發明之人類單株抗體亦可使用人類免疫細胞已重新建構其中以使得可在免疫後產生人類抗體反應之SCID小鼠來製備。該等小鼠係描述於（例如）美國專利第5,476,996號及第 5,698,767號中。人類Ig小鼠之免疫抗體及抗體產生細胞株之產生以CD44抗原免疫動物之後，可自動物獲得抗體及/或抗體產生細胞。在一些實施例中，含有抗CD44抗體之血清係藉由將動物放血或犧牲而獲自該動物。血清可如自動物中獲得者來使用，可自血清獲得免疫球蛋白部分或可將抗 CD44抗體自血清純化。在一些實施例中，由分離自經免疫動物之細胞製備產生抗體之永生細胞株。免疫之後，將動物處死且藉由於此項技術中已知之任何方式使淋巴結及/或脾B細胞永生。使細胞永生之方法包括（但不限於）以致癌基因將其轉染，以致癌基因病毒將其感染且將其在選擇用於使細胞永生之條件下培養，使其經受致癌物或突變化合物、將其與永生細胞 (例如骨髓瘤細胞）融合且滅活腫瘤抑制基因。參見例如同 126413.doc -56- 200846365 上文之Harlow及Lane。若與骨髓瘤細胞融合使用，則該等骨髓瘤細胞較佳地不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性細胞株)。使用CD44 ’其部分或表現CD44之細胞來篩檢永生細胞。在一較佳實施例中，CD44部分包含：⑴⑶料之吉合位點；（ii)包含列於SEQ ID N〇:1&/^SEQ m ν〇··2列出之完全或截短之胺基酸序列；或（iii)其組合。在一實施例中，使用酶聯結免疫檢定（eusa)或放射免疫檢定法來進行初始篩檢。ELISA篩檢之一實例係提供於pCT公開案w〇 00/37504 中。選擇、選殖及進一步篩檢所需特徵之產生抗CD44抗體之細胞（例如融合瘤）’該等特徵包括健康生長、高抗體生產及下文進一步論述之合乎需要的抗體特徵。可使融合瘤在同源動物中、在缺乏免疫“之動物（裸小鼠）中於活體内膨脹或在細胞培養物中於活體外膨脹。對融合瘤進行選擇、選殖及使其膨脹之方法已為普通熟習此項技術者所眾所熟知。在一實施例中，經免疫動物為表現人類免疫球蛋白基因之非人類動物且將脾B細胞融合至來自與該非人類動物相同之物種的骨髓瘤細胞株。在一更佳實施例中，經免疫動物為Kirin TC Mouse™小鼠且骨髓瘤細胞株為非分泌型小鼠骨趙瘤。在甚至更佳之實施例中，骨髓瘤細胞株為 Sp2/0-Agl4(美國典型微生物菌種保藏中心（atcc)crl_ 1581)且小鼠融合瘤細胞株為^乃^以幻^^、 1376·3.1Α9.Α6·Β9 或 1376.2.14G9.B8_B4。參見例如實例 126413.doc -57- 200846365 因此，在一個實施例中，本發明提供用以製備可產生針對CD44之人類單株抗體或其抗原結合部分之細胞株的方法，其包含··⑷以CD44、CD44部分或表現CD44之細胞或組織使本文所述之非人類轉殖基因動物免疫；（b)使該轉殖基因動物對CD44具有免疫反應；（c)從該轉殖基因動物分離出產生抗體之細胞；（d)使產生抗體之細胞永生；（幻產生永生之產生抗體之細胞的個別單株群體；及⑴篩檢永生之產生抗體之細胞以識別針對CD44的抗體。在一個實施例中，步驟（f)包含篩檢永生之產生抗體之細胞以識別針對 CD44之HA結合位點’且視情況不於CD44之HA結合位點外結合的抗體。師仏永生之產生抗體之細胞以識別針對C D 4 4之Η A結合位點的抗體可藉由測試細胞所產生之抗體是否結合至包含 CD44之HA結合位點之胺基酸序列的肽來達成。在另一態樣中，本發明提供產生人類抗CD44抗體之融合瘤。在一個實施例中，藉由融合瘤產生之人類抗CD44 抗體為CD44拮抗劑。在另一實施例中，藉由融合瘤所產生之人類抗CD44抗體具有以下特徵⑴結合至CD44之HA結合位點；（ii)不於HA結合位點外結合；（丨丨”不與丨“了結合位點結合·，或（iv)其組合。Mikecz 等人，（1999) Arthritis Rheumatism 42: 659，668，Zheng (1995) J. Cell Biol· 130: 485-495，Peach等人，（1993) J. Cell Biol· 122: 257-264及美國專利第6，0 01，3 5 6號。在一個實施例中，融合瘤為如上 -58 - 126413.doc 200846365 所述之小鼠融合瘤。在其他實施例中，融合瘤係於其他哺乳動物體内產生。在本發明一個實施例中，產生抗體之細胞係於宿主細胞 (例如骨髓瘤細胞）中分離且表現。在另一實施例中，轉殖基因動物以CD44免疫，從經免疫之轉殖基因動物分離出原始細胞（例如脾細胞或外周血細胞）且識別產生特異於所需抗原之抗體之個別細胞。將來自各個別細胞之聚腺苷酸化mRNA分離且使用黏接至可變區序列之正向引子（例如辨識大多數或所有人類重鏈及輕鏈可變區基因之FR1區之兼併引子）及黏接至恆定或接合區序列之反義引子進行反轉錄聚合酶鏈反應（RTVPCR)。接著在任何合適宿主細胞（例如骨髓瘤細胞）中以與各別免疫球蛋白恆定區（諸如重鏈及K 或λ恆定域）之嵌合抗體選殖且表現重鏈及輕鏈可變域之 cDNA 參見 Babcook，J.S.專人（1996) Proc· Natl. Acad

Sen· USA 93: 7843·48。接著可如本文中所述識別且分離抗 CD44抗體。產生抗體之重組法本發明之抗體或抗原結合部分可藉由在宿主細胞中重組表現免疫球蛋白輕鏈及重鏈基因而製備。舉例而言，為重組表現抗體，以一或多個具有編碼該抗體之免疫球蛋白輕鏈及重鏈之DN Α片段的重組表現載體轉染宿主細胞以便使該等輕鏈及重鏈在宿主細胞中表現且較佳分泌至培養基 (於其中培養宿主細胞）中，可自培養基回收該等抗體。使用標準重組DNA方法以獲得抗體重鏈及輕鏈基因以將此等 126413.doc -59- 200846365 基因併入重組表現載體中且將載體引入宿主細胞中，諸如彼等於 Sambrook，Fritsch 及 Maniatis (編），Molecular Cloning; A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y·，（1989)，Ausubel，F. M.等人（編）Current Protocols in Molecular Biology， Greene Publishing Associates，（1989)及美國專利第4,816,397號中描述之方法。突變及修飾 • 為表現本發明之CD44抗體，可首先使用上述方法中之任何來獲得編碼VH& VL區之DNA片段。亦可使用熟習此項技術者已知之標準方法將各種修飾（例如突變、缺失及/ 或添加）引入DNA序列中。舉例而言，突變可使用標準方法進行，諸如PCR所介導之突變，其中將經突變之核苷酸併入PCR引子中，使得PCR產物含有所需突變或定點突〇可進行之一種類型之取代（例如）為將抗體中可為化學反應性之一或多種半胱胺酸改變為另一殘基，諸如（但不限於）丙胺酸或絲胺酸。舉例而言，可存在非典型半胱胺酸取代。取代可在可變域之CDR或構架區中或抗體之恆定域中進行。在一些實施例中，半胱胺酸為典型的。抗體亦可在（例如）重鏈及/或輕鏈之可變域中經修飾（例如）以改變抗體之結合特性。舉例而言，可於一或多個 CDR區中進行突變以增加或減低CD44抗體之KD，增加或減低k。^，或改變抗體之結合特異性。定點突變之技術在 126413.doc -60- 200846365 此項技術中為眾所熟知的。參見例如同上文之以111心00]^等人及Ausubel等人〇突變修餺亦可在構架區或恆定域中進行以增加CD44抗體之半衰期。參見例如PCT公開案第w〇 00/09560號。亦可於構架區或恆定域中進行突變以改變抗體之免疫原性，提供與另一分子共價或非共價結合之位點，或改變諸如互補固定、FcR結合及抗體相關細胞介導之細胞毒性（Adcc) 之特性。根據本發明，單一抗體可於可變域之Cdr或構架區之任一或多者中或於恆定域中具有突變。在稱作11生殖系化”之方法中，可使Vh&Vl序列中之某些胺基酸突變以匹配彼等於生殖系VH& vL序列中天然所見之胺基酸。詳言之，VH及VL序列中構架區之胺基酸序列可經突變以與生殖系序列匹配來降低投與抗體時免疫原性之危險。人類VH& VL基因之生殖系DNA序列於此項技術中已知（參見例如”Vbase”人類生殖系序列資料庫；亦參見

Kabat，E. A.等人（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，u.S. Department 〇f Health and Human Services，NIH 公開案第 91-3242 號； Tomlinson等人（1992) J· Mol· Biol· 227:776-798 ;及 Cox等人，（1994) Eur· J· Immunol· 24:827-836。可進行另一類型之胺基酸取代來移除抗體中可能之蛋白水解位點。該等位點可出現在可變域之CDR或構架區中或抗體之恆定域中。取代半胱胺酸殘基且移除蛋白水解位點可降低抗體產物中異質性之危險，且從而增加其均質性。 126413.doc -61 - 200846365 另一種類型之胺基酸取代係用以藉由改變殘基之一或兩者來消除形成可能之脫醯胺位點之天冬醯胺酸-甘胺酸對。在另一實例中，可使本發明CD44抗體重鏈之C端離胺酸裂解。在本發明之各種實施例中，CD44抗體之重鏈及輕鏈可視情況包括信號序列。一旦獲得編碼VH及VL區段之DNA片段，此等DNA片段即可進一步經由標準重組DNA技術操縱（例如）以使得可變區基因轉化成全長抗體鏈基因，轉化成Fab片段基因或轉化成scFv基因。在此等操縱中，可使編碼VL或VH之DNA片段可操作地連接至編碼另一蛋白之另一 DNA片段，諸如抗體恆定區或可撓性連接子。此上下文中所使用之術語”可操作地連接"意謂使兩個DN A片段接合以使得由兩個DN A 片段編碼之胺基酸序列保持同框。可藉由使編碼VH之DNA與編碼重鏈恆定區（CHI、CH2及 CH3)之另一 DNA分子可操作地連接而將編碼VH區之經分離DNA轉化成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列於此項技術中已知（參見例如Kabat，E. A.等人（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第十五版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公開案第91-3242號）且涵蓋此等區域之DNA片段可藉由標準 PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgGl、IgG2、IgG3、 IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳為IgGl或 IgG2恆定區。IgGl恆定區序列可為已知出現在不同個體中之各種等位基因或異型中之任何，諸如Gm(l)、Gm(2)、 126413.doc -62- 200846365

Gm(3)及Gm(17)。此等異型表示igGi恒定區中天然產生之胺基酸取代。就Fab片段重鏈基因而言，可將編碼％之 DNA可操作地連接至另一僅編碼重鏈chi恆定區之DNA分子。CH1重鏈恆定區可衍生自重鏈基因中之任何。可藉由將編碼VL之DNA可操作地連接至編碼輕鏈恆定區 CL之另一DNA分子，將編碼乂[區之經分_DNA轉化為全長輕鏈基因（以及Fab輕鏈基因）。人類輕鏈恒定區基因之序列於此項技術中已知（參見例如Kabat，Ε· A.等人（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest » 第十五版，U.S· Department of Health and Human Services，NIH公開案第91-3242號）且涵蓋此等區域之DNA片段可藉由標準 PCR擴增獲得。該輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。κ恆定區可為已知發生於不同個體中之各種等位基因中之任何，諸如Inv(l)、Ιην(2)及Ιην(3)。λ恆定區可衍生自三個λ基因中之任何。為產生scFv基因，將編碼VH及VL之DNA片段可操作地連接至編碼可撓性連接子（例如編碼胺基酸序列（Gly4 _Ser)〇之另一片段，使得VH及VL序列可表現為VL及VH區藉由可撓性連接子接合之鄰近單鏈蛋白（參見例如Bird等人， (1988) Science 242:423-426 ; Huston等人，(1988) Proc· Natl· Acad· Sci· USA 85:5879-5883 ; McCafferty等人， (1990) Nature 348:552-554)。若僅使用單一 VH 及 VL，則單鏈抗體可為單價，若使用兩個VH及Vl，則為二價，若使用兩個以上之VH及VL，則為多價。可產生特異性結合至 I26413.doc -63- 200846365 CD44及至另一分子之雙特異性抗體或多價抗體。在另一實施例中，可製成包含連接至另一多肽之全部或 4刀本發明之CD44抗體的融合抗體或免疫黏附素。在另一實施例中，僅將CD44抗體之可變域連接至多肽。在另一實施例中，以使¥11與1域可彼此相互作用以形成抗原結合位點之方式，將CD44抗體之Vh域連接至第一多肽，而將CD44抗體之Vl域連接至與第一多肽相締合之第二多肽。在另一較佳實施例中，藉由連接子將％域與％域分離’使得vH與vL域可彼此相互作用。接著將Vh_連接子％抗體連接至所關注之多肽。此外，可建立兩個（或兩個以上）單鏈抗體彼此連接之融合抗體。若吾人需要於單一多肽鏈上產生二價或多價抗體或若吾人需要產生雙特異性抗體，則此係適用的。在其他實施例中，可使用編碼核酸分子之CD44抗體來製備其他經修飾抗體。舉例而言，\體”（⑴等人，（1997)

Protein Eng· 10·· 949-57)、”微型抗體"（Martin等人，（1994) EMBO J. 13·· 5303-9)、π 雙功能抗體”（H〇lliger 等人， (1993) proc· Natl· Acad· Sci· USA 90·· 6444-6448)或 ’’Janusins"(Tra\mecker等人，（1991) EMBO J· 10:3655-3659 及 Traunecker 等人，（1992) Int. J. Cancer (Suppl·) 7:51_52) 可根據說明書之教示，使用標準分子生物技術製備。可藉由各種方法（包括融合瘤融合或Fab，片段連接）來製造雙特異性抗體或抗原結合片段。參見例如Songsivilai & Lachmann，（1990) Clin. Exp. Immunol. 79:3 15-321 -64- 126413.doc 200846365

Kostelny等人，（1992) J· Immunol· 148:1547-1553。此外，雙特異性抗體可以”雙功能抗體”或"Jamisins,"形成。在一些實施例中，將雙特異性抗體結合至CD44之不同抗原決定基。在一些實施例中，使用來自本文所提供之人類 CD44抗體之一或多個可變域或CDR區來製備本文所述之經修飾抗體。載體及宿主細胞為表現本發明之抗體或抗體部分，將如本文所述獲得之

編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA插入表現載體中以使得該等基因與轉錄及轉譯控制序列可操作地連接。在此上下文中，術語”操作性連接”意謂將抗體基因接合至載體内使得載體内之轉錄及轉譯控制序列起調節抗體基因之轉錄及轉#之預期作用。選擇表現載體及表現控制序列以與所用表現宿主細胞相容。表現載體包括（例如）質體、反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒（AAV)、植物病毒（諸如花椰菜嵌紋病毒（cauliflower mosaic virus)、煙草花葉病毒⑽咖〇選擇表現载體及表現控制序列以與所用表現宿主細胞相容。可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入獨立載體中。在-較佳實施例中，可將兩個基因插人相同表現載體中。經由標準方法將該等抗體基因(例如該抗體基因片段與載體上之互補限制位點的接合，或若不存在㈣位點則為平 mosaic virus))、黏f體、YAC、EBv所衍生之染色小體。將抗體基因接合至载體内以便使轉錄及轉譯㈣序列在該載體内1揮其$抗體基因之轉錄及轉譯的預期功能。 I26413.doc -65- 200846365 端接合）插入表現載體中。便利載體為一種編碼功能上完全之人類Ch或（^免疫球蛋白序列’具有經工程設計之適當限制酶位點以便任何vH或 vL序列可如上所述容易地插入及表現的載體。在該等載體中拼接通常發生在經插入之j區中的拼接供體位點與人類C域之前的拼接受體位點之間，且亦發生在存在於人類 CH外顯子内之拼接區域處。聚腺苷酸化及轉錄終止發生在編碼區下游之天然染色體位點處。重組表現载體亦可編碼便於自宿主細胞分泌抗體鏈之信號肽。可將該抗體鏈基因選殖至該載體中以便使該信號肽在框内連接至免疫球蛋白鏈之胺基端。該信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽（亦即來自非免疫球蛋白的信號肽）。除抗體鏈基因以外，本發明之重組表現載體具有控制該等抗體鏈基因在宿主細胞中表現之調節序列。熟習此項技術者應瞭解包括選擇調節序列在内之表現載體設計可視諸如以下因素而定：待轉化之宿主細胞之選擇、所需蛋白之表現水平及其類似因素。用於哺乳動物宿主細胞表現之較佳調節序列包括在哺乳動物細胞中引導高水平蛋白表現之病毒要素，諸如源自反轉錄病毒LTR、細胞巨大病毒 (CMV)(諸如CMV啟動子/強化子）、猿病毒4〇(sV4〇)(諸: SV40啟動子/強化子）、腺病毒（例如腺病毒主要晚期啟動子（AdMLP))、多瘤病毒及強效哺乳動物啟動子（諸如天然免疫球蛋白及肌動蛋白啟動子）之啟動子及/或強化子。關於病毒調控要素及其序列之其他描述，參見例如美國專利 126413.doc -66- 200846365 第5，168,062號、第4,51〇,245號及第4,968,615號。表現植物中抗體之方法，包括啟動子及載體，以及植物轉化之描述於此項技術中已知。參見例如美國專利第6,517,529號。於細菌細胞或真菌細胞（例如酵母細胞）中表現多肽之方法亦於此項技術中眾所熟知。除抗體鏈基因及调節序列以外，本發明之重組表現載體可具有額外序列，諸如調節該載體在宿主細胞中複製之序列（例如，複製源）及可選擇標誌基因。可選擇標誌基因便利於已引入該載體之宿主細胞的選擇（參見例如美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5，179,017號）。舉例而 a，通常可選擇標諸基因賦予已引入載體之宿主細胞對諸如G418、濕黴素（hygromyCin)或甲胺喋呤之藥物的抗性。較佳可選擇標誌基因包括二氫葉酸還原酶（DHFR)基因（供在dhfr-宿主細胞中之甲胺喋呤選擇/擴增使用）、新黴素 (neomycin)磷酸轉移酶基因（用於G4丨8選擇）及麵胺酸鹽合成酶基因。編碼CD44抗體之核酸分子及包含此等核酸分子之載體可用於合適哺乳動物、植物、細菌或酵母宿主細胞之轉染。轉化可藉由用於引入聚核苷酸至宿主細胞之任何已知方法。用於將異種聚核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法為此項技術中所眾所熟知，且包括葡聚糖介導之轉染、磷酸鈣沈澱、聚凝胺介導之轉染、原生質體融合、電穿孔、將聚核芽酸封裝於脂質體中及將DNA直接顯微注射至核中。此外，核酸分子可藉由病毒載體引入哺乳動物細胞中。轉 126413.doc -67 - 200846365 化、、、田胞之方法於此項技術中為眾所熟知。參見例如美國專利第4,399,216號、第4,912，_號、帛4,74M61號及第 4,959,455號。轉化植物細胞之方法在此項技術中眾所熟知，包括（例如）土壤桿菌介導之轉化、基因槍轉化、直接注射、電穿孔及病毒轉化。轉化細菌及酵母細胞之方法在此項技術中亦為眾所熟知。可用作表現宿主之哺乳動物細胞株在此項技術中眾所熟知且包括可自美國典型微生物菌種保藏中心（ATCC)獲得之許夕永生之細胞株。其包括（例如）中國倉鼠卵巢（CH〇)細胞、NSO細胞、SP2細胞、HEK-293T細胞、NIH-3T3 細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎（BHK)細胞、非洲綠猴腎細胞 (COS)、人類肝細胞之癌細胞（例如Hep G2)、A549細胞、及諸多其他細胞株。特別較佳之細胞株係經由測定具有高表現水平之細胞株來選擇。可使用之其他細胞株為昆蟲細胞株，諸如Sf9或Sf21細胞。當將編碼抗體基因之重組表現载體引入哺乳動物宿主細胞中時，抗體係藉由培養宿主細胞歷時足以使抗體在宿主細胞内表現或更佳為使抗體分泌至宿主細胞於其中生長之培養基内的一段時間而產生。可使用標準蛋白純化法自培養基回收抗體。植物宿主細胞包括（例如）花煙草（Nicotiana)、芥菜屬（Arabidopsis)、浮萍 (duckweed)、玉米、小麥、馬鈴薯等。細菌宿主細胞包括大腸桿菌及鏈黴素屬。酵母宿主細胞包括粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)及巴斯德畢赤氏酵母（Pichia pastoris)。 126413.doc -68· 200846365 此外，可使用許多已知技術來增強本發明抗體自產生細胞株之表現。舉例而言，麩醯胺酸合成酶（GS系統）及 DHFR基因表現系統為在某些條件下用於增強表現之常用方式。可使用習知技術（諸如有限稀釋選殖及微滴技術 (Microdrop technology))來識別高表現細胞純系。GS系統係論述於歐洲專利第EP 0 216 846號、第EP 0 256 055號、第 EP 0 323 997號及第 EP 0 338 841號中。藉由不同細胞株或在轉殖基因動物中表現之抗體將可能具有彼此不同之糖基化。然而，無論抗體之糖基化為何，藉由本文所提供之核酸分子編碼或包含本文所提供之胺基酸序列的所有抗體為本發明之部分。噬菌體展示文庫本發明提供一種用於產生抗CD44抗體或其抗原結合部分之方法，其包含下列步驟：合成人類抗體文庫於噬菌體上 '以CD44或其部分篩檢該文庫、分離結合之噬菌體且自噬菌體獲得抗體。舉例而言，製備用於噬菌體呈現技術之抗體文庫之一種方法包含以下步驟：以CD44或其抗原部分使包含人類免疫球蛋白基因座之非人類動物免疫以產生免疫反應，自經免疫之動物萃取產生抗體之細胞；自經萃取之細胞分離編碼本發明抗體之重鏈及輕鏈之 RNA反轉錄RNA以產生cDNA，使用引子來擴增cDNA，且將cDNA插入噬菌體展示載體中使得於噬菌體上表現抗體。本發明之重組抗CD44抗體可以該方式獲得。可藉由篩檢重組組合抗體文庫來分離本發明之重組抗 126413.doc -69- 200846365

CD44人類抗體。較佳地，文庫為使用由分離自B細胞之 mRNA製備之人類VL及VH cDNA產生的scFv嗔菌體展示文庫。用於製備及篩檢該等文庫之方法在此項技術中已知。用於產生噬菌體展示文庫套組可購得（例如Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，目錄號 27-9400-01 ; 及Stratagene SurfZAP™噬菌體展示套組，目錄號 240612)。亦存在可用於產生且篩檢抗體展示文庫之其他方法及試劑（參見例如美國專利第5,223,409號；PCT公開案 WO 92/18619 、 WO 91/17271 、 WO 92/20791 、 WO

92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047及 WO 92/09690 ; Fuchs 等人，（1991) Bio/Technology 9:1370-1372 ; Hay 等人，（1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 ; Huse 等人，（1989) Science 246:1275-1281 ; McCafferty 等人， (1990) Nature 348:552-554 ; Griffiths等人，（1993) EMBO

J. 12:725-734 ; Hawkins 等人，(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896 ； Clackson 等人，（1991) Nature 352:624- 628 ； Gram 等人，（1992) Proc· Natl. Acad· Sci. USA 89:3576-3580 ； Garrad 等人，（1991) Bio/Technology 9:1373-1377 ; Hoogenboom等人，（1991) Nuc. Acid Res· 19:4133-4137 ;及 Barbas 等人，（1991) Proc. Natl· Acad.

Sci. USA 88:7978-7982) 〇在一實施例中，為分離且產生具有所需特徵之人類抗 CD44抗體，本文所述之人類抗CD44抗體首先使用PCT公開案WO 93/06213中所描述之抗原決定基印記方法，用以 126413.doc -70- 200846365 選擇具有針對CD44之類似結合活性之人類重鏈及輕鏈序列。用於此方法之抗體文庫較佳為如PCT公開案WO 92/01047、McCafferty等人，Nature 348:552 554 (1990)及 Griffiths等人，EMBO J. 12:725·734 (1993)中所述製備且篩檢之scFv文庫。scFv抗體文庫較佳係使用人類CCR2作為抗原來篩檢。初始人類VL及VH域一經選擇，即進行’’混合及匹配”實驗，其中篩檢用於CD44結合之不同初始選擇之VL及VH區段對以選擇較佳VL/VH對組合。此外，為進一步改良抗體品質，可較佳在VH及/或VL之CDR3區内，以與活體内負責抗體在天然免疫反應期間之親和力成熟之體細胞突變方法類似之方法使較佳VL/VH對之VL及VH區段隨機突變。此活體外親和力成熟可藉由使用分別與VH CDR3或Vl CDR3互補之PCR引子而擴增VH及又!^域來完成，在某些位置以四個核苷酸鹼基之隨機混合物使該等引子”尖峰化’’以使所得 PCR產物編碼於VH及/或Vl CDR3區中引入隨機突變之VH 及VL區段。可再篩檢此等隨機突變之VH及VL區段以與 CD44結合。將本發明之抗CD44抗體自重組免疫球蛋白展示文庫篩檢及分離之後，可將編碼所選擇抗體之核酸可自展示組 (例如噬菌體基因體）中回收且藉由標準重組DNA技術次選殖至其他表現載體中。若需要，核酸可經進一步操縱以產生如下所述之本發明之其他抗體形式。為表現藉由篩檢組合文庫而分離之重組人類抗體，將編碼抗體之DNA如上所 126413.doc -71 - 200846365 述選瘦至重組表現載體中且引入哺乳動物宿主細胞中。去免疫抗體在本發明之另一態樣中，可使用描述於（例如）Pct公開案WO 98/52976及WO 00/34317中之技術使抗體或其抗原結合部分去免疫以降低其免疫原性。所衍生及標記之抗體本發明之抗CD44抗體或抗原結合部分可經衍生或連接至另一分子（例如另一肽或蛋白）。一般，抗體或其抗原結合部分經衍生使得CD44結合不受衍生或標記之不利影響。因此，本發明之抗體及抗原結合部分意欲包括完整及經修飾形式之本文所述之人類CD44抗體。舉例而言，可將本發明抗體或抗原結合部分功能性地連接（藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或其他）至一或多種其他分子實體，諸如另一抗體（例如雙特異性抗體或雙功能抗體卜偵測劑、標記、細胞毒性劑、藥劑、可介導抗體或抗原結合部分與另一分子締合之蛋白或肽（諸如抗生蛋白鏈菌素核心區或聚組胺酸標記物）及/或載體蛋白（例如血液蛋白、白蛋白或運鐵蛋白）。一種類型之經衍生抗體係藉由使兩種或兩種以上（相同崩型或不同類型）抗體交聯（例如以產生雙特異性抗體)而產生。合適交聯劑包括具有兩個由適當間隔基分離之不同反應性基團之異質雙官能性之彼等物質(例如間順丁稀二醯亞胺苯甲醯基·Ν·經基琥_亞胺醋）；或同f雙官能性之彼等物貝（例如辛二酸二琥珀醯亞胺基酯）。該等連接子可 I26413.doc •72· 200846365 購自 Pierce Chemical Company，Rockford，IL 〇所衍生之抗體之另一類型為經標記抗體。可衍生本發明抗體或抗原結合部分之適用偵測劑包括螢光化合物，包括 (例如）螢光素、螢光素異硫氰酸酯、若丹明、5_二甲基胺_ 1-萘磺酿基氯化物、紅藻素、鑭系磷光體。抗體亦可經適用於㈣之酶標記’該等酶諸如辣根過氧化物酶、卜半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶、葡萄糖氧化酶。當抗體偵測酶標記時，其藉由添加額外試劑偵測，酶使用該等4劑產生可㈣之反應產物。舉例而言，當存在試劑辣根過氧化物酶時，過氧化氫及對二胺基聯苯胺之添加致使可偵測之有色反應產才勿。抗體亦可以生物素標言己，且經由間接量測抗生物素蛋白或抗生蛋白鍵菌素結合而摘測、。抗體亦可以II由第二報導體辨識之預定多肽抗原決定基（例如白胺酸拉鏈對序列、第二抗體之結合位點、金屬結合 f抗原决定基標記物）標記。纟一些實施例中，標記係藉由各長度之間隔臂附著以減小潛在位阻。抗CD44抗體亦可以化學基團(諸如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或碳水化口物基）衍生。此等基團適用以改良抗體之生物特徵（例如）以增加血清半衰期。醫藥組合物及投藥本發明亦提供治療哺乳動物（包括人類）體内之異常細胞次潤之醫藥組合物，其包含治療異常細胞浸潤有效量之本文所述之CD44抗體或其抗原結合部分，及醫藥學上可接又H較佳組合物向具有各種發炎性及自體免疫疾病 126413.doc -73- 200846365 中之一或多者之患者提供治療優點，該等疾病諸如類風濕性關節炎、幼年型類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化、肉芽腫疾病、多發性硬化症、哮喘、克羅恩氏病、僵直性脊椎炎、牛皮癖性關節炎、斑狀乾癖及癌症。如（例如）PCT公開案W〇 2006/096488及其中所引用之參考所述，可將本發明抗體及抗原結合部分併入適用於向受檢者投與之醫藥組合物中。通常’醫藥組合物包含本發明抗體及抗原結合部分，及適用以維持蛋白穩定性、溶解度及生物活性之醫藥學上可接受之載劑。本文中所用之"二藥學上可接受之载劑"包括生理學上相容之任何及所有：劑、分散介質、包衣、抗菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似載劑。醫藥學上可接受之載劑之一些實例為生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、右旋糖、:二: 乙醇及其類似物’以及其組合。在許多情況下，較佳在組合物中包括等張劑，例如’糖：諸如甘露醇、山梨糖醇之多元醇；或氣化鈉。醫藥學上可接受之物質之額外實例為增強抗體存放期或有效性之濕潤劑或微量輔助物質，諸如濕潤或乳化劑、防腐劑、包括胺基酸之緩衝劑及養Μ (例如EDTA、DTPA、刪及其混合物）。在一實施例中: 醫藥組合物包括砂，較佳IgGlsiugG2，單株抗體及醫藥學：可接受之養合劑。抗體之代表性莫耳濃度在約0.嶋晃莫耳至約1.35毫莫耳之範圍内’且螯合劑之莫耳濃約0.003宅莫耳至約5G毫莫耳之範圍内且抗體與螯合劑之莫耳比在約0.00001至約2000之範圍内。 126413.doc -74- 200846365 本發明之組合物可為各種形式，例如液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液（例如可注射及可輸注溶液）、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、粉末、脂質體及栓劑。較佳形式視投藥及治療應用之預期模式而定。典型較佳組合物為

可注射或可輸注溶液形式，諸如與彼等用於人類被動免疫之組合物類似之組合物。較佳投藥模式為非經腸（例如靜脈内、皮下、腹臈内、肌肉内）。在較佳實施例中，抗體係藉由靜脈内輸注或注射來投與n較佳實施例中，抗體係藉由肌㈣或皮下注射來投與。用於注射之調配物可呈具有或不具有附加防腐劑之單位劑型，例如在安瓶或多劑量容器中。該等組合物可呈諸如油性或水性媒劑中之懸淨液、溶液或乳液之形式，且可含有諸如懸浮劑、釋定劑及/或分散劑之調配劑。或者，活性成份可為在使用前以合適媒劑（例如無菌無熱原質水）構造之粉末形式。 —治療組合物通常在製造及儲存條件下必須為無菌且穩疋。可將組合物調配為溶液、 " m 做孔，夜分散液、脂質體式適用於高藥物濃度之其他貝體戍體併入呈右h H構。將所需篁之CD44抗产後、見：所列之一種成份或其組合之合適溶劑中，而要進行過濾殺菌’藉此可製備無菌可注射产r —般分散液係藉由將活性化人 κ 〇哕1菌拔^入『化口物併入無菌媒劑中來製偫， …，，、囷媒诏含有鹼性分散介質及他所兩士、八又所夕』之成份的其而2。在將無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之产〆車乂佳製備法為產生活性成^ 溶液之任咅額… 〖生成伤加來自其先前無菌過遽 -額外所需成份之粉末的真空乾燥及冷來乾燥。 1264I3.doc -75- 200846365 ::之適當流動性可(例如)藉由使用諸如卵構脂之包衣來臾寺’猎由在分散液情況下維持所需顆粒尺寸及藉由使用界面活性劑來維持。可注射射、、且s物之延時吸收可藉由使 (例如）硬脂酸鹽及明膠吵心L遲及收之藥劑包括於組合物中而進行。

本發明之抗體或抗原結合部分可藉由此項技術中已知之 ^種方法投與，儘f對於許多治療應用μ，較佳投藥途 :/杈式為皮下、肌肉内或靜脈輸注。熟習此項技術者將瞭解，投藥途徑及/或投藥模式將視所需結果而變化。在某些實施例中’可製備具有將保護抗體避免快速釋放之载』之本發明抗體組合物，該載劑諸如控釋調配物，包括植入體、經皮貼片及微膠囊化傳遞系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物’諸如乙埽基乙酸乙稀醋、聚酸軒、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酉旨及聚乳酸。該等調配物之諸多製備法-般為熟習此項技術者已知。參見例如， Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems ? J· R. Robinson 編，Marcel Dekker，—，丫他， 1978 〇亦可將額外活性化合物併入組合物中。在某些實施例中，將本發明之抑制性CD44抗體與一或多種額外治療劑共調配及/或共投與。此等藥劑包括（但不限於）抑制cd44 之結合其他靶之抗體、抗腫瘤劑、抗血管生成劑、信號轉導抑制劑、抗增生劑、化學療劑或肽類似物。該等組合可需要較低劑量之抑制性CD44抗體以及共投與藥劑，從而 1264l3.doc -76- 200846365 避免與各種單一療法相關之可能毒性或併發症。

本發明化合物亦可部分或完全以共療法（預處理、後處理或共處理）使用，除其他抗炎藥或DMARDS以外，包括 (但不限於）環孢素（cyclosporine)、嗤來膦酸（zoledronic acid)、法利珠（efalizumab)、阿法賽特（alefacept)、依托度酸（etodolac)、氯諾昔康（lornoxieam)、OM-89、伐地考昔 (valdecoxib)、妥昔珠單抗（tocilizumab)、阿巴西普 (abatacept)、美償西康（meloxicam)、依那西普 (etanercept)、萘普酮（nambumetone)、利美索龍 (rimexolone)、153Sm-EDTMP、普囉索巴（prosorba)、水楊酸味嗤、奥普維金（oprelvekin)、玻尿酸、萘普生 (naproxen)、°比羅昔康（piroxicam)、雙醋瑞因（diacerein)、羅美昔布（lumericoxib)、羅非考昔他克莫司（rofecoxib tacrolimus)、醋氯芬酸（aceclofenac)、阿克他利（actarit)、替語昔康（tenoxicam)、梵帝雅（rosiglitazone)、地夫可特 (deflazacort)、阿達木單抗（adalimumab)、來氟米特 (leflunomide)、利塞膦酸鈉（risedronate sodium)、米索前列醇（misoprostol)及雙氯芬酸（diclofenac)、SK-1306X、英利昔單抗（infliximab)、阿那白滯素（anakinra)、賽利克西 (celecoxib)、雙氯芬酸（以。1€^11&。）、依託昔布（61:〇1^〇乂11)) 及聯苯乙酸（felbinac)、魯美康（reumacon)、戈利木單抗 (golimumab)、狄諾塞麥（denosumab)、奥法土姆單抗 (ofatumumab)、10rTl抗體、派羅比洛酚（pelubiprofen)、利克飛龍（licofelone)、泰羅莫司（temsirolimus)、伊庫立單抗 126413.doc •77- 200846365

(eculizumab)、艾拉莫德（iguratimod)、乙酸甲潑尼龍 (methylprednisolone acetate)、布洛芬（ibuprofen)、曲安奈德（triamcinolone acetonide)、萘丁美酮（nabumetone)、鳴丙嗓（oxaprozin)、氧可酮HC1、芬太尼（fentanyl)、舒林酸 (sulindac)、吼哆醇（pyridoxine)、乙醯胺苯紛 (acetaminophen)、阿命膦酸鹽（alendronate)、, σ朵美辛 (indomethacin)、葡糖胺（glucosamine)、奥洛他定 (olopatadine)、奥美拉嗤（omeprazol)、硫嗤嗓呤 (Azathioprine)、柳氮石黃胺吼。定（Sulfasalazine)、經氣喧琳 (Hydroxychloroquine)、環孢素（Ciclosporin)及潑尼松 (prednisone)。其他合適抗炎劑包括彼等以諸如以下之公司編碼序號命名之藥劑：480156S、AA861、AD1590、 AFP802、AFP860、AI77B、AP504、AU8001、BPPC、 BW540C、CHINOIN 127、CN100、EB382 、EL508 、 F1044 、 FK-506 、 GV3658 、 ITF182 、 KCNTEI6090 、 KME4、LA2851、MR714、MR897、MY309、ON03144、 PR823、PV102、PV108、R830、RS2131、SCR152、 SH440、SIR133、SPAS510、SQ27239、ST281、SY6001、 TA60、TAI-901(4-苯甲醯基-1-茚滿羧酸）、TVX2706、 U60257、UR2301 及 WY41770、CP-481715、ABN-912、 MLN-3897、HuMax-IL-15、RA-1、紫杉醇（paclitaxel)、 Org-37663、Org 39141、AED-9056、AMG-108、氟妥利單抗（fontolizumab)、旅蘇呢塞特（pegsunercept)、帕那薩珊 (pralnacasan)、阿 σ比莫德（apilimod)、GW-274150、AT- 126413.doc -78- 200846365

001、681323 (GSK) Κ-832、R-1503、奥來珠單抗 (ocrelizumab) 、 DE-096 、 CpnlO 、 THC+CBD(GW

Pharma)、856553 (GSK)、ReN-1869、免疫球蛋白、mm-093、阿米魯苯（amelubant)、SCIO-469、ABT-874、 LenkoVAX、LY-2127399、TRU-015、KC-706、阿莫仙平 (amoxapinet)及雙。密達莫（dipyridamole)、TAK-715、PG 760564、VX-702、潑尼龍（prednisolone)及雙喊達莫、 PMX-53、貝利單抗（belimumab)、普林貝瑞（prinaberel)、 CF-101、tgAAV-TNFR:Fc、R_788、潑尼龍（prednisolone) 及 SSRI、CP-690550及 PMI-00 卜在另一實施例中，額外治療劑包括生物劑。在另一實施例中，一或多種生物劑係選自腫瘤壞死因子a(TNFa)拮抗劑、介白素-la(IL-la)拮抗劑、CD28拮抗劑及CD20拮抗劑。在另一實施例中，一或多種生物劑係選自由以下各物組成之群：依那西普（enbreltm)、阿達木單抗 (HUMIRA™)、英利昔單抗（infliximab)(REMICADETM)、P可那白滯素（KINERETtm)、阿巴西普（ORENCIA™)、利妥昔單抗（RITUXANtm)及塞妥珠單抗（certolizumab pegol) (CIMZIAtm)。可與式（I)化合物及其鹽及溶劑合物組合用於類風濕性關節炎之其他醫藥活性劑之實例包括：免疫抑制劑，諸如旅胺托美丁（amtolmetin guacil)、卩米峻立賓（mizoribine)及利美索龍（rimexolone);抗TNFa劑，諸如依那西普、英利昔單抗、雙醋瑞因（diacerein);酪胺酸激酶抑制劑，諸如來 126413.doc •79- 200846365 氟米特；激肽釋放酶拮抗劑（kallikrein antagonist)，諸如舒布姆（subreum);介白素11促效素，諸如奥普維金；干擾素βΐ促效劑；玻尿酸促效劑，諸如NRD-lOl(Aventis);介白素1文體拮抗劑，諸如阿那白滯素；CD8拮抗劑，諸如鹽酸胺普立糖（amiprilose hydr〇ehl〇ride) ; β澱粉狀蛋白前驅蛋白拮抗劑’諸如魯美康；基質金屬蛋白酶抑制劑，諸如西皮麥泰（cipemastat)及其他疾病改質抗風濕藥 (ARD)諸如甲胺嗓呤、柳氮石黃π比咬（suiphasaiazine)、環孢素A、經基氫啥、金諾芬（謝瞻叫、金硫代葡萄糖 ( 〇glUC〇Se)、金硫蘋果酸鈉及青黴胺（penicillamine) 〇本I明之組合物可包括"治療有效量，，或"預防有效量，，之本發月抗體或抗原結合部分。，，治療有效量，，係指在必需劑量及時段下達成所需治療結果之有效量。抗體或抗原結合部分之治療有效量可視諸如疾病狀況、年齡、性別及個體體重及抗體或抗體部分在個體中引出所需反應之能力之因 =而變化。治療有效量亦為治療有益效應超過抗體或抗原 Ρ刀之任何毋性或有害效應的量。”預防有效量”係指在必需劑量及時段下達成所需預防結果有效之量。通常，由於預防劑量在疾病前或疾病較早階段用於受檢者，所以預防有效量可切治療有效量。給藥方案可經調節接防反摩、。爽" 最佳所需反應(例如治療或預防反應）舉例而t，‘、Λ成主組mΌ如療6況之緊迫性所指示，可投 u v々現寺間才又與若干分開之劑量或劑量可按比例降低或增加。脸处，里乂 ^里了知等非！腸組合物調配成易於投與且劑量 126413.doc 200846365 均一之單位劑型尤其有利◊本文所使用之單位劑型係指適合以整體劑量用於待治療之哺乳動物受檢者的實體離散單元；各單元含有經計算與所需醫藥載劑締合以產生所需治療效應之預定量活性化合物。本發明之單位劑型之規格受以下支配且直接視以下而定：（a)CD44抗體或其抗原結合部分之獨特特徵及待達成之特定治療或預防效應’及（b)將該抗體化合以治療個體敏感性之技術中所固有之限制。

本發明抗體或抗體部分之治療或預防有效量之例示性非限制性範圍為0.025至50 mg/kg，更佳地〇1至5〇 mg/kg，更仏地0.1 25、o.l至10或0.1至3 mg/kg。在一實施例中，本發明抗體或抗體部分係以呈無菌水溶液之調配物投與，該溶液具有約5.〇至約6 5範圍内之阳值，且包含約i 至約200 mg/mi之抗體；約！毫莫耳至約ι〇〇毫莫耳之（例如）組胺酸、乙酸鹽或琥珀酸鹽緩衝劑；約〇〇1 mg/ml至約1〇 mg/ml之聚山梨醇酯8〇 ;約1〇〇毫莫耳至約毫莫耳之海藻糖及約〇.〇1毫莫耳至約u毫莫耳之二水合edta二鈉。本發明之組合物視情況可包含醫藥學上可接受之抗氧化劑及/或螯合劑。合適之抗氧化劑包括（但不限於）甲硫胺酸、硫代硫酸鈉、觸酶及始。舉例而言，組合物可含有濃度在 1 mM至約1〇〇 mM範圍内，且尤其為約27 之甲硫胺酸。待注意劑量值可隨待緩解之病況類型及嚴重性而變化。待進一步瞭解，對於任何特$受檢者而t，特定給藥方案應根據個體需要及投與或監督組合物投與之人的專業判斷隨著時間而加以調整，且本文所列之劑量範圍僅為例 126413.doc -81 - 200846365 不性的，而不意欲限制所主張之組合物的範脅或實踐。本發明之另―態樣提供包含本發明CD44抗體或抗原结合部分或包含該等抗體或抗原結合部分之組合物的套組。除抗體或組合物以外’套組可包括診斷m療劑。套組亦可包括用於診斷或治療法之說明。在—較佳實施例令，套組包括抗體或包含其之組合物及可用於下述方法之診斷劑。在另-較佳實施例中，套組包括抗體或包含其之组合物及一或多種可用於下述方法之治療劑。口使用之診斷方法在另一態樣中，本發明提供活體内及活體外診斷法。抗 CD44抗體可用以活體外或活體内偵測生物學樣本中之 CD44。在一實施例中，本發明提供用於在有此需要之受檢者體内診斷表現CD44之細胞的存在或位置之方法，其包含以下步驟：將抗體注射至受檢者體内，藉由使結合抗體處侷限化來確定CD44於受檢者體内之表現，比較受檢者體内之表現與正常對照受檢者或標準中之表現，且診斷細胞之存在或定位。亦可將抗CD44抗體用作用於炎症及/ 或使免疫細胞（諸如單核細胞及T細胞）浸潤至組織中之標呑患0 可將抗CD44抗體用於習知免疫檢定，包括（但不限於）ELISA、RIA、流式細胞儀、組織免疫組織化學、西方墨點或免疫沈澱。可使用本發明之抗CD44抗體來偵測來自人類之CD44。在另一實施例中，可使用抗CD44抗體來偵測來自馬來猴或恆河猴之CD44。 126413.doc -82- 200846365 本發明提供用於偵測生物樣本中之CD44之方法，其包含使生物樣本與本發明之抗CD44抗體接觸，且偵測所結合之抗體。在一實施例中，以可偵测之標記直接標記抗 CD44抗體。在另一實施例中，抗CD44抗體（第一抗體）未經標記且第二抗體或可結合抗CD44抗體之其他分子為經標記的。如熟習此項技術者眾所熟知，選擇能夠特異性結合特定物種及種類之第一抗體的第二抗體。例如，若抗 CD44抗體為人類IgG，第二抗體可為抗人類IgG 〇可結合至抗體之其他分子包括（但不限於）蛋白A及蛋白G，該等兩者可（例如）購自 Pierce Chemical Company 〇在其他實施例中，CD44可利用以可偵測物質標記之 CD44標準及未經標記之抗CD44抗體，藉由競爭免疫檢定而於生物樣本中檢定。在此檢定中，將生物樣本、標記之 CD44標準及抗CD44抗體組合且測定結合至未標記之抗體之經標記CD44標準之量。生物樣本中CD44量與結合至抗 CD44抗體之經標記之CD44標準量成反比。吾人可將申請案中所揭示之免疫檢定用於許多目的。舉例而言，可使用抗CD44抗體來偵測經培養細胞中之 CD44。在一實施例中，使用抗CD44抗體來測定已經各種化合物處理之細胞表面上之CD44量。可使用此方法來識別調節CD44蛋白水平之化合物。根據此方法，以測試化合物處理一種細胞樣本歷時一段時間，而使另一樣本保持未經處理。若待量測總CD44表現，則使細胞溶解且使用上述免疫檢定中之一者來量測總CD44表現。比較經處理 126413.doc -83- 200846365 與未經處理細胞中總CD44表現來測定測試化合物之效應。用於量測總CD44表現之較佳免疫檢定為流式細胞儀或免疫組織化學。若待量測細胞表面CD44表現，則不使細胞溶解且使用上述免疫檢定中之一者來量測細胞表面 CD44水平。用於測定細胞表面CD44水平之較佳免疫檢定包括以下步驟··以可偵測標記（諸如生物素或1251)標記細胞表面蛋白，以抗CD44抗體使CD44免疫沈澱，且接著偵測 ⑩經標記之CD44。用於測定CD44定位（例如細胞表面水平）之另一較佳免疫檢定係藉由使用免疫組織化學。偵測CD44之細胞表面水平之較佳免疫檢定包括結合以適當螢光團（諸如螢光素或紅藻素）標記之抗CD44抗體，且使用流式細胞儀偵測初級抗體。在另一實施例中，抗CD44抗體為未經標記的且第二抗體或可結合抗CD44抗體之其他分子為經標記的。諸 ^ 如ELISA、RIA、流式細胞儀、西方墨點、免疫組織化學、整體膜蛋白之細胞表面標記及免疫沈澱之方法於此項技術中為幕所熟知（參見例如同上文之Harlow及Lane)。此外，為測試用於活化或抑制CD44之大量化合物，免疫檢定法可按比例增加以供高產率篩檢。本發明之抗CD44抗體亦可用以測定組織中或源自組織之細胞中CD44含量。在一些實施例中，組織為病變組織。在一些實施例中，組織為組織之活組織切片。在方法之一些實施例中，組織或其活組織切片係自患者切離。接 126413.doc -84- 200846365 著將組織或活組織切片用於免疫檢定以藉由上述方法來測定（例如）總CD44表現、細胞表面CD44水平或CD44之定位。δ亥荨方法可用以確定組織是否表現高水平CD44，其可說明該組織為用於以抗CD44抗體處理之輕。本發明之抗體亦可活體内使用以識別表現CD44之組織及器官。在一些實施例中，使用抗CD44抗體來識別表現 CD44之細胞。使用本發明之人類抗CD44抗體之一個優點為不像具有人化或嵌合抗體之非人類起源之抗體，其可在投藥後在不引出對抗體之實質免疫反應下於活體内安全地使用。該方法包含以下步驟：向需要該診斷測試之患者投與經可偵測標記之抗CD44抗體或包含其之組合物’且使患者經受^像分析以測定表現CD44之組織之定位。成像分析於醫藥技術中為眾所熟知’ I包括(但不限於)χ線分析、磁共振成像（MRI)或電腦斷層攝影（CT)。該抗體可以適用於活體内成像之任何藥劑標記，言亥等藥劑例如可用於X線分析之造影劑（諸如鋇），或可用於MRI或CT之磁造影劑（諸如釓螯合）。其他標記劑包括（但不限於）放射性同位諸如 9 9 ι-ρι 二。在另一實施例中，抗CD44抗體未經標記且將藉由投 -、第抗體或可偵测且可結合抗CD44抗體之其他分子成象在實知例中，自患者獲得活組織切片以測定所關注之組織是否表現CD44。在一實施例中，經可偵測標記之抗CD44包含螢光團。在另κ鈿例中，本發明之抗CD44抗體亦可用以測定 126413.doc -85- 200846365 細胞上CD44之表面細胞表現之降低。在較佳實施例中，細胞為淋巴細胞及單核細胞。使用之治療法在另一實施例中，本發明提供藉由向有此需要之患者投與CD44抗體來抑制CD44活性之方法。可治療性地使用本文所述之抗體或其抗原結合部分中之任何。在一實施例中’ CD44抗體為嵌合抗體或人化抗體。在一較佳實施例中，CD44為人類且患者為人類患者。或者，患者可為表現與CD44抗體交叉反應之CD44之哺乳動物（例如猴）。可向作為人類疾病動物模型之表現CD44之非人類哺乳動物投與抗體。該等動物模型可適用於評估本發明抗體之治療功效。在另一實施例中，可向表現不適當之高水平CD44之患者投與CD44抗體或其抗體部分。為最佳功效，可投與該抗體一次，但更佳地投與多次。該抗體可以每日三次至每六個月或更長時間一次投與。投藥時程可為（諸如）每曰三次、每曰兩次、每曰一次、每兩天一次、每三天一次、每週一次、每兩週一次、每月一次、每兩個月一次、每三個月一次及每六個月一次。該抗體亦可經由微型泵連續投與。該抗體可經由黏膜、頰、鼻内、可吸入、靜脈内、皮下、肌肉内、非經腸或腫瘤内途徑投與。可投與該抗體一次、至少兩次或歷時至少一段時間直至病況得以治療、減輕或治癒為止。一般投與該抗體歷時病況存在之久。咳疒體一般將作為如上文所述之醫藥組合物之一部分來投與。 126413.doc -86- 200846365 抗體劑量一般在0·1至100 Hig/kg，更佳0.5至50 mg/kg，更佺1至20 mg/kg，且甚至更佳is 1〇 mg/kg之範圍内。可藉由於此項技術中已知之任何方法來量測抗體之血清濃度。本發明亦提供治療哺乳動物（包括人類）體内之異常細胞 /文/閏之方法，其包含向該哺乳動物投與治療異常細胞浸潤有效之治療有效量之本文所述的CD44抗體或其抗原結合部分。基因療法 •可將編碼本發明抗體及抗體部分之核酸分子經由基因療法向有此而要之患者投與。療法可為活體内或離體的。在一較佳實施例中，向患者投與編碼重鏈及輕鏈之核酸分子在更佳實施例中，投與核酸分子以使其穩定併入b 二胞柒色體中，其係因為該等細胞特定用於產生抗體。在較仏貝施例中’將前驅體B細胞離體轉染或感染且再移植至有此兩要之患者中。在另一實施例中，使用已知感染 φ 所關/主之細胞類型之病毒活體内感染前驅體B細胞或其他細胞。用於基因療法之典型載體包括脂質體、質體及病毒載體例示〖生病t載體為反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毋。活體内或離體感染後，可藉由自所治療之患者獲取樣本且使用此項技術中已知或本文論述之任何免疫檢定法來監控抗體表現水平。在一較佳實施例中，基因療法包含以下步驟：投與編碼 CD44抗體之重鏈或其抗原結合部分之經分離核酸分子且 I現核酸分子。在另一實施例中，&因療法包含以下步 1264B.doc -87- 200846365 驟：投與編碼CD44抗體之輕鏈或其抗原結合部分之經分離核酸分子且表現核酸分子。在一更佳方法中，基因療法包含以下步驟：投與編碼本發明之CD44抗體之重鏈或其抗原結合部分之經分離核酸分子及編碼本發明之CD44抗體之輕鍵或其抗原結合部分之經分離核酸分子且表現核酸分子。基因療法亦可包含投與另一種治療劑（諸如相關於組合療法論述於本申請案中之藥劑中之任何）之步驟。為了可更好理解本發明，列出下列實例。此等實例僅為說明之目的且不應將其理解為以任何方式限制本發明範 _ 0 實例在以下實例及製備中，"BSA”意謂牛血清白蛋白； ’’EDTA”意謂乙二胺四乙酸；nDMSOn意謂二甲亞砜； ”MOPS”意謂3-(N-嗎啉基）丙烷磺酸；”MES”意謂2-(N-嗎啉基）乙烷磺酸；nPBS"意謂磷酸鹽緩衝生理食鹽水；"dPBS" 意謂杜貝科氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水（Dulbecco’s phosphate buffered saline) ; ΠΗΕΜΑ” 意謂 2-羥基-乙基甲基丙烯酸酯；”DMEM"意謂杜貝科氏改質伊科氏培養基 (Dulbecco’s modified eagle’s medium); ’’FBS”意謂胎牛血清；"NEAA”意謂非必需胺基酸；”HEPES”意謂N-2-羥基乙基哌嗪_N’_2-乙烷磺酸；及"DMFn意謂二甲基曱醯胺。實例1 產生抗CD44抗體之融合瘤之產生如下製備、選擇且檢定根據本發明之較佳抗體： 126413.doc -88- 200846365 免疫及融合瘤產生：使用經轉染以表現人類CD44之經純化重組人類CD44-Ig 融合蛋白（SEQ ID ΝΟ··1)，鼠類前 B 細胞 300-19(Reth，Μ. G.等人，TVa⑼re 312 29: 418-42，1984 ; Alt，F·等人，Ce// 27: 381-390，1981)及天然表現人類CD44之人類單核細胞性白血病細胞株THP-1(ATCC目錄號TIB-202)作為免疫原。使用人類Ig轉殖基因小鼠菌株HCo7及HCol2，以及人類 • 轉染色體/轉殖基因菌株KM(Mederex，Inc·)來製備人類 CD44之完全人類單株抗體。此等菌株均表現無法與自人類分離之抗體區分之完全人類抗體。在此等小鼠菌株中，如Chen等人（1993) EMBO J· 12:811·820所述同型性中斷内因性小鼠κ輕鏈基因，且如PCT公開案WO 01/09187實例1 所述同型性中斷内因性小鼠重鏈基因。此等小鼠菌株各自具有如 Fishwild 等人（1996) Nature Biotechnology 14:845-0 851中所述之人類κ輕鏈轉殖基因。HCo7菌株具有如美國專利第5,545,806號、第5,625,825號及第5,545,807號所述之HCo7人類重鏈轉殖基因。HCol2菌株具有如PCT公開案 WO 01/09187之實例2所述之HCol2人類重鏈轉殖基因。 KM 菌株具有如 Ishida 等人，（2002)，Cloning and Stem Cells，4: 91-1 02中所述之人類微染色體。為產生CD44之完全人類單株抗體，以THP-1細胞，經純化之重組CD44_Fc或表現人類CD44之300-19轉染子使 HCo7、HCol2及KM菌株之HuMab小鼠免疫。HuMab小鼠 126413.doc -89- 200846365 之一般免疫流程係描述於Lonber§，N.等人（1994) Natllre 368(6474): 856-859 ; Fishwild，D·等人（1996) Nature

Biotechnology 14·· 845-851 及 PCT公開案 WO 98/24884 中。首次輸注抗原時，小鼠為6_16週大。腹膜内（IP)、皮下（Sc) 或經由足底注射（fp)使用CD44-F(^^原之經純化重組製劑 (5-20 pg)，THP-1細胞或經轉染300_19細胞之製劑（1χ1〇7細胞）使HuMab小鼠免疫。以1-4週之時間間隔腹膜内及皮下使用佐劑中之抗原使轉殖基因小鼠免疫（總共達到8次免疫）。以藉由後眼窩放血獲取之血液來監控免疫反應。藉由FACS來篩檢血清（如下所述），且使用具有充分抗CD44人類免疫球蛋白效價之小鼠用於融合。在將小鼠處死且移除脾及/或淋巴結之前3 及2天，以抗原靜脈内刺激小鼠。通常，對於各抗原而言，進行10-20次融合。總共使81隻HCo7、HCol2及KMA 小鼠經免疫。對於各抗原而言，使數十隻小鼠免疫。選擇產生抗CD44抗體之HuMab小鼠：為選擇產生結合CD44之抗體之HuMab小鼠，藉由流式細胞儀（FACS)來篩檢來自經免疫小鼠之血清以與表現全長人類CD44之細胞株結合而非與不表現CD44之對照細胞株結合。簡而言之，使用以1:20稀釋之來自經免疫小鼠之血清來培育表現〇044之300-19細胞。洗滌細胞且以？1丁(：標記之抗人類IgG Ab偵測特異性抗體結合。於FACS流式細胞儀工具（Becton Dickinson, San Jose, CA)上進行流式細胞分析。使用產生最高抗CD44抗體效價之小鼠用於融合。 126413.doc •90- 200846365 融合係如下所述進行且藉由FACS來測試融合瘤上清液之抗CD44活性。產生CD44之人類單株抗體之融合瘤產生：使用標準或製造者所推薦之方案，使用聚乙二醇（PEG) 或電融合（E_ 融合，Cyto Pulse™ 技術，Cyto Pulse™ Sciences，Inc.，Glen Burnie，MD)將自 HuMab小鼠分離之小鼠脾細胞及/或淋巴結淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞株 SP2/0(ATCC，CRL-1581，Vendor，City，State)融合。簡而言之，分別使用 50% PEG(Sigma，St. Louis，MO)或 E融合，將來自經免疫小鼠之脾及/或淋巴結淋巴細胞之單一細胞懸浮液融合至三分之一與相等數量之間的Sp2/0非分泌性小鼠骨髓瘤細胞。將細胞以大約每孔lx 1〇5個脾細胞（PEG)或每孔2χ104個脾細胞（E融合）塗覆於平底微量滴定盤中，且於含有 10%胎牛血清、10% P388D1(ATCC，CRL-TIB-63)改良性培養基、DMEM 中 3-5% (IGEN) (Mediatech，Herndon， VA，目錄號CRL 10013，具有高葡萄糖、L-麩醯胺酸及丙酮酸納）、5 mM HEPES、0.055 mM 2-魏基乙醇、50 mg/ml 慶大黴素（gentamycin)及 1 xHAT(Sigma，目錄號 CRL -P-7185)之選擇性培養基中培育10-14天。1-2週後，將細胞於以HT置換HAT之培養基中培養。細胞塗覆後大約10-14 天，首先篩檢來自個別孔之上清液是否含有人類γ、κ抗體。接著隨後以FACS(上述）篩檢人類γ、κ計分為陽性之上清液之人類抗CD44單株IgG抗體。將分泌抗體之融合瘤轉移至24孔盤中，再次篩檢且若確認為人類抗CD44 IgG單株 126413.doc -91 - 200846365 抗體陽性，則將其藉由限制性稀釋次選殖至少兩次。接著活體外培養穩定次純系，以在組織培養基内產生少量抗體以供表徵。該等融合瘤給予以下編號：表3

抗體小鼠融合瘤細胞株命名菌株命名 1A9.A6.B9 1376.3.1A9.A6.B9 LN 15922 2D1.A3.D12 1376.3.2dl.A3.D12 LN Ϊ5920 14G9.B8.B4 1376.2.14G9.B8.B4 LN 15921 實例2 選殖人類及馬來猴CD44 cDNA以產生穩定細胞株及 CD44-Ig融合蛋白人類CD44 cDNA選殖：

使用以下弓I子自人類脾cDNA(Clontech Labs· Inc·， Mountain View，CA，目錄號 6393 12)選殖人類CD44 (SEQ ID ΝΟ:1) ·· 5’-atggacaagttttggtggcacgcagcctgg-3’（SEQ ID N 0:15 5)及 S’-ttacaccccaatcttcatgtccaca-V (SEQ ID NO:156)。使用以下引子再擴增PCR產物以添加Xhol及 Xbal 限制位點：S’-gactcgaggccaccatggacaagttttggtggd (SEQ ID: 1 5 7)及 5f-gatctagatcactattacaccccaatcttcatgtcc-3f (SEQ ID NO:158)。將此第二PCR產物接合至pMIG哺乳動物表現載體中且驗證兩條鏈之CD44序列。Hawley等人， (1994) Gene Thera. 1:136-138。馬來猴CD44 cDNA選殖：使用以下引子自馬來猴PBMC cDNA將馬來猴CD44基因 126413.doc -92- 200846365 PCR#if : 5'-atggacaagttttggtgg-3' (SEQ ID NO:159)^5'-gttacaccccaatcttcatgtcca-3’（SEQ ID NO:160)。將 PCR 產物接合至 PCR2.1 TOPO 載體中（Invitrogen，City，Carlsbad， CA，目錄號K45 1 0-20)。將十九個純系定序且藉由所有上述純系之一致序列來確定馬來猴CD44序列。展示兩個純系之核酸序列，5-2 (SEQ ID NO:153)及 5-8 (SEQ ID NO:8)。將經序列驗證之馬來猴CD44 (SEQ ID NO:8)次選殖至哺乳動物表現載體pMIG中。Hawley等人，（1994)。 300-19人類及馬來猴CD44 300-19過度表現細胞株：使用 FUGENE 6 轉染試劑（Hoffman-La Roche Inc.， Nutley，NJ，目錄號 1 1815091001)將 pMIG-人類 CD44 及 pMIG-馬來狼CD44皆轉染至293T/17細胞（ATCC第CRL-1 1263號）中，產生人類CD44及馬來猴CD44反轉錄病毒。隨後將兩種反轉錄病毒轉導至300-19細胞中以產生人類 CD44及馬來猴CD44表現細胞株中。人類CD44-IgGl融合蛋白之選殖：將人類CD44胞外域表現為人類IgGl融合蛋白（SEQ ID NO:3)。將編碼成熟CD44胞外域之cDNA自人類白血球 cDNA(Clontech Labs· Inc.)PCR 擴增（Klentaq PCR 套組， Clontech Labs Inc·，Mountain View，CA，目錄號639108)且且次選殖至哺乳動物表現載體，即含有CD5前導序列及人類IgGl標記物之PCDMamp中。設計以下PCR引子為所公開之CD44標準形式之序列（G.R· Screaton等人，（1992) PNAS 89:12160-12164) 126413.doc -93- 200846365 (CD44+C: AGTGAGACTAGTCAGATCGATTTGAATATAACCTGCCGCTTTG) (SEQ ID NO:161) > (CD44-D: ATCACTGAGATCTTCTGGAATTTGGGGTGTCCTTATAG) (SEQ IDNO:162)。於兩條鏈中將完全CD44IgGl cDNA定序且驗證。馬來猴CD44-IgGl蛋白選殖：使馬來猴CD44之胞外域表現為人類IgGl Fc融合蛋白 (SEQ ID NO:5)。將編碼成熟馬來猴CD44胞外域之cDNA自 pMIG_馬來猴CD44載體PCR擴增且次選殖至含有CD5前導序列、人類IgGl標記物以及Xhol及Hpal限制位點之内部哺乳動物表現載體pLNp中。設計PCR引子以與具有Xhol及 EcoRV限制位點之人類CD44胞外域對準。引子序列如下： S'-atcggcgatccagatcgatttgaatataacc-S1 (SEQ ID NO: 163)、 5’-ctgtgcctcgagccattctggaatttggggtgtcc-3’（SEQ ID NO:164)。在兩條鏈中序列驗證完全馬來猴CD44胞外IgGl cDNA。使用麵Taq聚合酶（Invitrogen，目錄號11304-011 )，隨後進行標準PCR方案之以上所有選殖之PCR條件：95°C下3分鐘；25x(5 5°C下3 0秒，78°C下1分鐘）；72°C下7分鐘。人類CD44及馬來猴CD44表現及純化之胞外域·· 根據製造者方案使用Freestyle 293表現系統 (Invitrogen，目錄號Κ9Ό00-01)來表現人類CD44IgGl (SEQ ID ΝΟ··3)及馬來猴 CD44 IgGl 融合蛋白（SEQ ID NO:5)。以蛋白A環脂糖珠粒（Pierce，Rockford，IL，目錄號 15918-014)來純化融合蛋白。收集培養基後，添加蛋白酶抑制劑錠劑（Hoffman La-Roche目錄號1 697 498，每50毫 126413.doc -94- 200846365 升培養基1鍵）、Tris緩衝劑（pH值為8.0，最終濃度10 mM) 及疊氮化鈉（最終濃度，0.02%)且將其經由0.22微米過濾器過濾。向每100 ml培養基中添加一毫升50%之蛋白A珠粒之漿料。使培養基/漿料混合物在4 °C下旋轉至少2小時。在1000 xg下旋轉10分鐘產生瓊脂糖離心塊。小心地移除上清液且將瓊脂糖離心塊再懸浮於2-3體積之洗滌緩衝劑中（0·1 M Tris HCL，pH值為 7.5，0·1 M NaCl)且應用於管柱。將管柱以20床體積之洗滌缓衝劑洗滌且以5床體積之溶離缓衝劑溶離（ImmunoPure IgG溶離緩衝劑，Pierce，目錄號21004)至含有1/2管柱體積之pH值為8之1 M Tris的管中。根據製造者方案使用Amicon濃縮器10,000 MW截斷 (Millipore，Billerica，ΜA)將緩衝劑交換為 PBS。實例3 根據本發明製備之抗C D 4 4抗體序列為分析根據本發明製造之抗體結構，吾人選殖編碼來自產生抗CD44單株抗體之融合瘤之重鏈及輕鏈片段之核酸。選殖及定序係如下完成：

使用 RNeasy Mini 套組（Qiagen，San Diego，CA)來提取 (silated)聚（A)+ mRNA，且使用募（dT)引發，以 Advantage RT-for-PCR 套組（BD Biosciences，Franklin Lakes, NJ)由 mRNA來合成cDNA。分別使用表4、5及6中所列出之兼併引子來擴增用於純系1A9.A6.B9、2D1.A3.D12及 14G9.B8.B4 之寡（dT)所引發之cDNA。擴增係使用High Fidelity 聚合酶（Roche)及 PTC-200 DNA Engine(MJ 126413.doc -95- 200846365

Research)以如下循環達成：在95 °C下21 ; 25χ(在95 °C下 20!丨，在52〇C下30”，在72〇C下2丨）；在72〇C下10’。使用標準方案將PCR擴增子選殖至pCR2.1 TOPO(Invitrogen, Carlsbad，CA目錄號K4500-01)中且轉染至TOP10化學感受態細胞（Invitrogen)中。使用 Grills 第 16 BDTv3.1/dGTP 化學 (Applied Biosystems Inc)及 3730x1 DNA 分析器（Applied Biosystems Inc.，Foster，CA)來序列驗證純系。藉由與”乂 BASE序列目錄”對準來分析所有序列（Tomlinson等人， (1992) J. Mol. Biol.，227，776-798 ; Hum，(1995) Mol. Genet” 3, 853-860 ; EMBO J·，14, 4628-4638)。表4: 1A9.A6.B9之兼併引子（5’至3’） VH3c 5UTR F ATTYRGTGATCAGSACTGAACASAG (SEQ ID NO: 165) G 3UTR_R TACGTGCCAAGCATCCTCGC (SEQ ID NO: 166) VK3 5UTR_F ATCAATGCCTGKGTCAGAGCYYTG (SEQ ID NO:167) K 3UTR R 1 AGGCTGGAACTGAGGAGCAGGTG (SEQ ID NO: 168) 表5 : 201.人3.012之兼併引子（5’至3’) VHla 5UTR F CCCTGAGAGCATCAYMYARMAACC (SEQ ID NO: 169) G 3UTR R TACGTGCCAAGCATCCTCGC (SEQ ID NO: 170) VKla 5UTR F GSARTCAGWCYCWYYCAGGACACAGC (SEQ ID NO: 171) K 3UTR_R AGGCTGGAACTGAGGAGCAGGTG (SEQ ID NO:172) 表6: 14G9.B8.B4之兼併引子（5’至3’) VHla—5UTR—F CCCTGAGAGCATCAYMYARMAACC (SEQ ID NO: 173) G 3UTR R TACGTGCCAAGCATCCTCGC (SEQ ID NO: 174) VK3 5UTR F ATCAATGCCTGKGTCAGAGCYYTG (SEQ ID NO: 175) K 3UTR—R AGGCTGGAACTGAGGAGCAGGTG (SEQ ID NO: 176) 基因利用：表7列出以所選之根據本發明之抗體融合瘤純系為根據的基因利用。 126413.doc -96- 200846365 表7 純系重鏈輕鏈同型 vH D Jh Vl Jk 1A9.A6.B9 3-33 D4-17 JH6b L6 JK4 IgG2 2D1.A3.D12 1-03 nd JH6b L19 JKi IgGi 14G9.B8.B4 1-03 D3-10 JH5b A27 JK4 IgGl 10C8.2.3 3-21 D6-19 JH6b All JK4 IgG4 nd=未確定序列及突變分析：如熟習此項技術者將瞭解，基因利用分析僅提供抗體結構之有限概述。隨著KM動物體内之B細胞隨機產生V-D-J 重鏈轉錄或V-J κ輕鏈轉錄，發生許多次級過程，包括（但不限於）體細胞超突變、缺失、N-添加及CD3延長。參見例如 Mendez等人，（1997) Nature Genetics 15:146-156及 PCT 公開案WO 98/24893。因此，為進一步檢驗抗體結構，吾人自獲自純系之cDNA產生所預測之抗體之胺基酸序列。圖2展示經分離之抗CD44單株抗體之重鏈及輕鏈可變域的所預測胺基酸序列與對應輕鏈及重鏈基因之生殖系胺基酸序列的對準。表9-12提供抗體1八9.八6.：69(表9)、2〇1.人3.〇12(表10)、 14G9.B8.B4(表11)及10C8.2_3(表12)之重鏈及κ輕鏈之核苷酸及所預測之胺基酸序列，其中各抗體之可變區係以大寫字母展示。吾人產生一種經突變抗體2D1.A3.D12。抗體 2D 1· A3 .D12中之重鏈經突變以改變位置28處之蘇胺酸殘基至異白胺酸。抗體2D 1.A3.D12在位置38處之輕鏈經突變以 126413.doc •97- 200846365 改變麩醯胺酸殘基至組胺酸。純系2D1.A3.D12之VH(I28T)及VK(H3 8Q)區中之突變係根據製造者說明使用來自StrataSen之QuickChanSe定點突變套組，以表8所列出之引子進行。藉由自動定序來確認突變，立將經突變之插入物次選殖至表現載體中。抗CD44 抗體2D1.A3.D12之突變係如下進行：表8 : 201.八3.012之突變引子（5|至3|) 2D1 VHJ28T AAGGCTTCTGGATACAcCTTCACTAGCTATGCT (SEQ ID NO: 177) 2D1 VH—I28T—R AGCATAGCTAGTGAAGgTGTATCCAGAAGCCTT (SEQ ID NO: 178) 2D1 VL—H38Q TTAGCCTGGTATCAGCAgAAACCAGGGAAAGCC (SEQ ID NO: 179) 2D1 VL—H38Q—R GGCTTTCCCTGGTTTcTGCTGATACCAGGCTAA (SEQ ID NO: 180)

表9 :抗體1八9.八6.；89之0"八及蛋白序列描述序列：來自融合瘤細胞之重鏈DNA序列（可變域為大寫字母） CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGG TCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTAT GGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTG GCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATTCTATGCAGACTCCGTG AAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGT GCGAGGAGAAGTGACTACAGGGGCTACTACGGTATGGACGTCTGGGGC CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgcctccaccaagggcccatcg gtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcg gccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtg tcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagct gtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtg ccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcac aagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgt gtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtc ttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacc cctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgag gtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaag acaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagc gtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaag tgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatc tccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgccc ccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctg 126413.doc -98- 200846365

gtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaat gggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactcc gacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcagg tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctg cacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO: 10) 來自融合瘤細胞之重鏈之衍生（藉由轉譯)蛋白序列(可變域為大寫字母） QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWV AVIWYDGSNKFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARRSDYRGYYGMDWGQGTTVTVSSastkgpsvfplapcsrstsesta algclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtv pssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsv f1fppkpkd11mi s rtpevt cwvdvshedpevqfnwyvdgvevhnak tkpreeqfnstf rwsvltwhqdwlngkeykckvsnkglpapiekti sktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesn gqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmheal hnhytqks1s1spgk (SEQ ID NO： 9) 來自融合瘤細胞之輕鏈DNA序列(可變域為大寫字母） 1A9.A6.B9的全長輕鏈序列-核甞酸 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTATCAACTAC TTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATC TATGATGCATCCAACAGGGCCTCTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGC AGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCT GAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTCGCAACTGGCCGCTC ACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACgaactgtggctgca ccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctgga actgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggcc aaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccag gagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagc agcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctac gcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc ttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO·· 14) 來自融合瘤細胞之輕鏈之衍生（藉由轉譯)蛋白序列(可變域為大寫字母） EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVINYLAWYQQKPGQAPRLLI YDASNRASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRRNWPL TFGGGTKVEIKrtvaapsvf ifppsdeqlksgtaswcllnnfyprea kvqwkvdna1qsgnsqe svt eqdskds tys1s s1111skadyekhkvy acevthqgls spvtks fnrgec (SEQ ID NO·· 13) 表10··抗體2D1·A3·D12之DNA及蛋白序列描述序列：來自融合瘤細胞之重鏈DNA序列(可變域為大寫字母） CAGGTCCAACTTGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCC TCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACATCTTCACTAGCTAT GCTATGCATTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGCTTGAGTGGATG GGGTGGATCAACGCTGCCATTGGTAGCACAAAATATTCACAGAAGTTC CAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCGAGCACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGT GCGAGAGACGGGTGGGAGGACTACTACTACCACGGTATGGACGTCTGG GGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgcctccaccaagggccca -99- 126413.doc 200846365

tcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcaca gcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacg gtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccg gctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgacc gtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaat cacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatct tgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctg gggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctc atgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagc cacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggag gtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacg taccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaat ggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagccccc atcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacag gtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtc agcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtg gagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcct cccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcacc gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtg atgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctg tctccgggtaaa (SEQ ID NO: 46) 來自融合瘤細胞之重鏈之衍生（藉由轉譯)蛋白序列變域為大寫字母） QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY1FTSYAMHWVRQAPGQRLEWM GWINAAIGSTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYC ARDGWEDYYYHGMDVWGQGTTVTVS S a s t kgp svfp1ap s s ks t sggt aalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswt vpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapell ggpsvf lfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevkfnwyvdgve vhnaktkpreeqynstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpap iektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiav ewesngqpennykttppvldsdgsf f lyskltvdksrwqqgnvf scsv mhea 1 hnhytqks 1 s 1 spgk (SEQ ID NO ： 45) 來自融合瘤細胞之輕鏈DNA序列（可變域為大寫字母） GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGA GACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGTAGCTGG TTAGCCTGGTATCAGCATAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATC TATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGC AGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT GAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAATAATTTCCCGTGG ACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACgaactgtggctgca ccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctgga actgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggcc aaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccag gagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagc agcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctac gcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc ttcaacaggggagagtgt (SEQ 工D N〇：50) 來自融合瘤細胞之輕鏈之衍生(藉由轉譯)蛋白序列(可 DIQjyTTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQHKPGKAPKLLI YAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANNFPW TFGQGTKVEIKrtvaapsvfifppsdeqlksgtaswcllnnfyprea 126413.doc -100- 200846365

Γ57ηΐΓ~：----- 又％芍犬冩字母）- ----- kvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvy acevthqglsspvtksfnrgec (SEQ 工D NO: 49) 表 11 ·· 抗體14G9.B8.B4之DNA及蛋白序列插述序列：來自融合瘤細胞之重鏈DNA序列（可變域為大寫字母） CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCC TCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTAT GCTATGCATTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGCTTGAGTGGATG GGATGGATCAACACTGGCAATGGTAACACAAAATATTCACAGAAGTTC CAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCGAGCACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGT GCGAGGTTTTACTCTGGTTCGGGGAGTCCCTGGGGCCAGGGAACCCTG GTCACCGTCTCCTCAgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctg gcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgc ctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactca ggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcc tcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagc ttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaac accaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcac acatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtc ttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacc cctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgag gtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaag acaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagc gtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaag tgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatc tccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgccc ccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctg gtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaat gggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactcc gacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcagg tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctg cacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO·· 82) 來目融合瘤細胞之重鏈之衍生（藉由轉譯)蛋白序列（可變域為大寫字母） 1--—---- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMHWVRQAPGQRLEWM GWINTGNGNTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYC ARFYSGSGSPWGQGTLVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgc 1vkdyfpepvtvswnsgalt sgvht fpavlqs sglys1s svvtvp s s s lgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsv f 1 f ppkpkdt lmi srtpevt cwvdvshedpevkf nwyvdgvevhnak tkpreeqynstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiekti skakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesn 126413.doc -101 - 200846365

gqpennykt tppvl ds dgs f f lyskl t vdksrwqqgnvf sc s vmheal hnhytqks 1 s 1 spgk (SEQ ID NO : 81) 來自融合瘤細胞之 14G9.B8.B4 輕鏈 DNA序列(可變域為大寫字母） GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGC TACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTC ATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAG CCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCG CTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACgaactgtggct gcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatct ggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagag gccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcc caggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctc agcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtc tacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaag agcttcaacaggggagagtgt (SEQ 工D N〇:86) 來自融合瘤細胞之重鏈之衍生（藉由轉譯)蛋白序列(可變域為大寫字母） EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLL IYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP LTFGGGTKVEIKrtvaapsvfifppsdeqlksgtaswcllnnfypre akvqwkvdn a1qsgns qe svt eqdskds tys1s s 1111skadyekhkv ya c evt hqg1s spvt ks fnrgec (SEQ 工D N〇：85) 表12 :抗體10C8.2.3之DNA及蛋白序列描述序列：來自融合瘤細胞之重鏈DNA序列(可變域為大寫字母） GAGGTGCAGCTGATGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGG TCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTAT AGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC TCATCCATTACTGTTAGAAGTAGTTACATATACTACGCAGACTCAGTG AAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGT GCGAGAGTCCTCGCTATAGCAGTGCCTGGTACCTCCTACTACTACTAC GGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgct tccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagc acctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttc cccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggc gtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctc agcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctac acctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaga gttgagtccaaatatggtcccccatgcccatcatgcccagcacctgag ttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggac actctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggac gtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggc gtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaac agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactgg 126413.doc -102- 200846365 來自融合瘤細胞之重鏈之衍生（藉由轉譯)蛋白序列（可變域為大寫字母） ctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccg tcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagag ccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaac caggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatc gccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc acgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcagg ctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgc tccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctc tccctgtctctgggtaaa (SEQ ID N〇：118) EVQLMESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSiynSiWVRQAPGKGLEWV SSITVRSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARVLAIAVPGTSYYYYGMDVWGQGTTVTVSSastkgpsvfplapcsrs tsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglysl sswtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpscpape f Iggpsvf lfppkpkdtlmisrtpevtcwvdvsqedpevqfnwyvdg vevhnaktkpreeqfnstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglp ssiektiskakgqprepqvytippsqeemtknqvsitcivkgfypsdi avewe sngqpennykt tppvl dsdgs f f ly sr 11 vdksrwqegnvf s c svmhea 1 hnhytqks 1 s 1 s 1 gk (SEQ ID N〇：117) 來自融合瘤細胞之重鏈DNA序列(可變域為大寫字母） GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGC TACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTC ATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAG CCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACGG CTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAcgaactgtggct gcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatct ggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagag gccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcc caggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctc agcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtc tacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaag agcttcaacaggggagagtgt (SEQ 工D N〇:122) 來自融合瘤細胞之重鏈之衍生（藉由轉譯）蛋白序列 (可變域為大寫字母） EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLL 工YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSR LTFGGGTKVEIKrtvaapsvf ifppsdeqlksgtaswcllnnfypre akvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkv yacevthqglsspvtksfnrgec (SEQ ID NO： 121) 如下將抗CD44抗體之可變域選殖至表現載體中：

使用表13、14及15中所列出之引子將可變域自pCR2.1選殖之cDNA擴增。擴增係使用Pfx翻聚合酶（Invitrogen)及 PTC-200 DNA Engine(MJ Research)以如下循環達成：94〇C 103- 126413.doc 200846365 下2分鐘；2〇x(94°C下30秒，55°C下45秒，68°C下1分鐘）；68 °C下分鐘。接著將可變域選殖至含有適當同型之恆定域之表現載體中。使用Grills第16 BDTv3.1/dGTP化學 (Applied Biosystems Inc)及 3730x1 DNA 分析器（Applied Biosystems Inc)來序列驗證此等純系。表13: 1Α9·Α6·Β9之可變域引子（51至3*) H3一11 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG (SEQ ID NO:181) G1/2-VH一R TGGAGGCTGAGGAGACGGTGAC (SEQ ID NO :182) K—L6 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAG (SEQ 工D N〇：183) JK4—R tatattccttaattaagttattctactcacGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCT (SEQ 工D N〇：184)

表14 : 201.八3.012之可變域引子（5*至3’) HI—03 CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTG (SEQ ID N〇：185) G1/2—VH 一R TGGAGGCTGAGGAGACGGTGAC (SEQ ID N〇：186). K_OI2 GACATCCAGATGACCCAGTCTCC (SEQ ID N〇：187) JK1—R tatattccttaattaagttattctactcacGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCT (SEQ ID NO:188) 表15: 14G9.B8.B4之可變域引子（5’至3’) HI 一 03 CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTG (SEQ ID N〇：189) G1/2_VH_R TGGAGGCTGAGGAGACGGTGAC (SEQ 工D NO :190) K一A27 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAG (SEQ ID NO :191) JK4—R tatattccttaattaagttattctactcacGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCT (SEQ 工D N〇：192) 實例4 玻尿酸（ΗΑ)與CD44結合之人類抗CD44抗體阻斷評估人類抗CD44抗體抑制如實例2所述之HA(Sigma，目錄號H5388)與人類CD44蛋白（SEQ ID NO:3)之間之相互作用的能力。

結合檢定係在96孔ELISA檢定盤（Immunolux HB -104- 126413.doc 200846365

Maxisorp 96孔盤，Nunc目錄號442404)中進行。在第一日，向培養盤上之檢定孔中添加以pH值為9.6之50 mM Nabicarb缓衝劑以2·5 mg/ml稀釋的100 μΐ雞冠HA，且在4 °C下培育隔夜。大約24小時後，使用具有0.05%吐溫 20(Sigma，目錄號P1379)之300 μΐ PBS將經HA塗覆之培養盤洗滌四次。接著藉由向各孔中添加200 μΐ PBS中之3% BSA，且在37°C下培育2小時來阻斷培養盤。接著將經阻斷之培養盤以具有0.05%吐溫20之PBS洗滌。在獨立的96 孔聚丙烯盤（Falco，目錄號351190)中，將各種濃度之抗 CD44 抗體 1A9.A6.B9、2D1.A3.D12、14G9.B8.B4 及 10C8.2.3於含1% BSA的PBS稀釋，與50 μΐ體積且最終濃度為0·6 pg/ml的人類CD44-Ig融合蛋白混合。將混合物在室溫下培育60分鐘且接著轉移至經HA塗覆之培養盤中且在室温下培育一小時。使用0.05%吐溫20，藉由PBS來洗滌培養盤。將於1% BSA中以1··5 00稀釋（以偵測結合至HA之 CD44-Ig)之抗人類 IgG-HRP(Amersham Biosciences, Pi scat away，NJ，State，目錄號NA9 33)添加至各孔中且在室溫下培育。接著將培養盤再次洗滌且添加50 μΐ TMB(TMB 微孔過氧化酶底物，KPL，52-00-02)且培育歷時約10分鐘。接著以50 μΗ亭止溶液使反應停止且於盤讀取器上量測 OD450值。圖3說明阻斷ΗΑ與CD44-Ig融合蛋白之間之相互作用之CD44抗體1A9.A6.B9的圖解。表16展示抗CD44抗體之IC50。 126413.doc -105· 200846365 表16 抗體純系 IC50 (pg/mL) 1A9.A6.B9 0·41 土0.03 (n=3) 2D1.A3.D12 0.33 士 0.01 (n=2) 14G9.B8.B4 0.43士 0.01 (11=3) 10C8.2T~ 0.64 (n=2) IM7 1·85士0.35 (n=9) ~5Τ5 " 0.32 (n=l) 實例5 抗CD44單株抗體之結合常數之測定

吾人進行另一種活體外檢定來表明本發明抗體與CD44 之結合親和力。

結合研究表明在平衡結合分析中經轉染細胞上抗CD44 Ab與CD44之結合具有〇·98 pg/mL(6.8 nM，參見圖4 A-C，特別為圖4C)之結合常數。300-19細胞經以編碼人類CD44 蛋白之反轉錄病毒載體轉導，並以PBS洗滌兩次。接著將 300-19細胞以每毫升1x1 〇6個細胞之細胞密度再懸浮於 FACS緩衝劑[PBS，（Sigma，目錄號D-8537 ; 0.02%疊氮化合物（Sigma，目錄號S-2000) ; 5 pg/ml細胞遲緩素 B(Sigma ’ 目錄號 C-6762)及 2% 胎牛血清（Gibco，City， State，目錄號 16140-071)]中。將400 μΐ 表現 CD44 之 300-19 細胞（2x 1 05/400 μΐ)轉移至 Nunc-Immuno 管（VWR，目錄號 443990)中，添加各種濃度之 5 μΐ 抗 hu IgG FITC(Jackson，目錄號109-095-098)及1A9.A6.B9且在室溫下在持續震盪下將管在震盪盤（Thermolyne，rotomix type 48200)上培育3小時。3小時後，將細胞以FAC S緩衝劑洗滌兩次。將細胞再懸浮於 250 μΐ 1%聚甲酸（Electron Microscopy Science，Ft· 126413.doc -106- 200846365

Washington，PA，目錄號 15710)中。使用 Becton Dickinson FACSCalibur 讀取管，且使用 CellQuest Pro(Becton Dickinson)分析資料。（參見圖4C)。亦將抗CD44抗體結合至表現於外周CD3+ T細胞上之人類CD44及馬來猴CD44蛋白。（參見圖4Α及4Β)。詳言之，自正常人類志願者收集人類外周血於具有肝素之採血管 (Becton Dickinson，目錄號 366480)中。向 Nunc-Immuno 管 (VWR目錄號443990)中添加100 μΐ所收集之人類血。將抗 CD44 Ab添加至各管中以達成0.2 pg/ml至20 pg/ml之最終濃度。其後向各管中添加10 μΐ抗CD3-PerCP(BD Pharmingen，目錄號 347344)及 10 μΐ 抗 CD14_APC(BD Pharmingen，目錄號555399)。在冰上培育30分鐘，隨後以 1200 rpm離心10分鐘，且移除上清液。添加1〇〇 μΐ FACS洗滌緩衝劑（PBS-Sigma D853 7 ; 0.02%疊氮化合物，Sigma目錄號S2002及2%胎牛血清，Gibco目錄號16140-071)以及添加每孔50微升之以1:100倍稀釋之經第二FITC標記之山羊抗人類IgG Fc特異性抗體（Jackson目錄號109-095-098)。在黑暗中在4°C下培育25分鐘。培育25分鐘後，添加2 ml FACS溶胞溶液（BD Pharmingen，以1:10於水中稀釋），將其渦旋且在室溫下再次培育10分鐘。培育10分鐘後，在 1200 rpm下離心10分鐘且移除上清液，以FACS洗滌緩衝劑洗滌細胞，隨後進行離心且移除上清液。接著將細胞以 250 ml 1% 聚甲醛（Electron Microscope Science，Ft Washington，PA 目錄號 15710)固定且使用 Becton Dickson -107- 126413.doc 200846365 FACS Calibur讀取，且使用 CellQuest Pro(Becton Dickinson) 分析。 ELISA結合研究： ELISA結合研究表明1Α9·Α6·Β9與塗覆於96孔盤上之人類及馬來猴CD44-Ig融合蛋白結合（參見圖5)。為開始檢定，將PBS中1 pg/ml之50 μΐ CD44-Ig融合蛋白添加至96孔檢定盤（Immuno Maxisorp plate，Nunc·目錄號 442404)中且在4°C下培育隔夜。次日，將培養盤以PBS，0.05%吐溫20 洗滌四次。接著將培養盤在37°C下藉由每孔200 μΐ之PBS 中3% BSA阻斷2小時且再次洗滌。使用PBS及1% BSA將抗 CD44抗體1Α9.Α6.Α9以各種濃度稀釋且添加至培養盤中且在室溫下培育一小時。洗滌培養盤，且向各孔中添加50 μΐ 於PBS中1% BSA中以1:2000稀釋之抗人類κ輕鏈HRP抗體 (Amersham Bioscience，目錄號NA 933)，且將其在室溫下再培育1小時。將培養盤再次洗滌且添加50 pg/ml TMB微孔過氧化酶底物（目錄號KPL S2-00-02)且培育歷時約5至10 分鐘。以停止溶液使ELISA反應停止且藉由盤讀取器量測 OD450 值。 BIAcore結合研究：使用表面電漿共振來量測表面以人類CD44-FC融合蛋白 (12 μδ/ηι1，10 mM乙酸鹽，pH值為4·0)塗覆之CM5感應晶片上之分子相互作用。藉由直接法篩檢5、3、2、1、0.5 及0.25 pg/ml濃度之抗CD44 Ab。使用人類IgGl及IgG2標準來檢查非特異性及背景結合。使用曲線之締合及解離相 126413.doc -108 - 200846365 初始部分來計算親和力及速率常數且報導於表17中。表17 抗CD44抗體之Biacore結合資料抗CD44抗體親和力 KDxl(T9(M) 解離速率koffXlO·41/s 1A9A6.A9 0.6 5.76 2D1.A3.D12 2.01 6.53 14G9.B8.B4 4.88 1 52.9 實例6 抗CD44單株抗體阻斷自人類外周血單核細胞（PBMC)產生炎性細胞激素亦評定抗CD44抗體阻斷藉由HA(Sigma，目錄號H53 8 8) 刺激之自經純化人類PBMC釋放IL-Ιβ之能力（參見圖6)。自正常人類志願者收集人類外周血於具有肝素之採血管 (Becton Dickinson，目錄號366480)中。根據製造者說明使用 Sigma Accuspin 管（Sigma，目錄號A7054)來分離 PBMC。將經純化之細胞以RPMI 1640(Gibco，目錄號11875-093)洗滌兩次且以5xl06再懸浮於RPMI中且以每孔100 μΐ PBMC 添加至95孔檢定盤（Costar，目錄號3596)中。接著於RPMI 中，在各種濃度之抗CD44抗體1A9.A6.B9、2D1.A3.D12、 14G9.B8.B4 及 10C8.2.3 存在下，以 HA(Sigma，目錄號 H1751)刺激人類PBMC。詳言之，將100 μΐ HA儲備溶液 (RPMI中10 pg/ml)與PBMC及各種濃度之20 μΐ抗CD44抗體 1Α9. Α6.Β9、2D1.A3.D12、14G9.B8.B4 及 10C8.2.3 混合。將檢定培養盤在增濕氣氛中在37°C下培育24小時（Narco 6300 C02恆溫箱）。接著，以1200 rpm將培養盤離心1〇分 126413.doc -109- 200846365 鐘。接著將上清液自各孔移除且根據製造者方案以IL-1 β ELISA 量測（IL-Ιβ Quantikine ELISA 套組，R&D 目錄號 DLB50) 〇 (參見表 18) 〇表18 藉由ΗΑ刺激之使用人類經純化PBMC之抗CD44單株Ab 的IL-Ιβ釋放檢定。抗體純系 IC50(pg/mL) 1Α9Λ6.Α9 0·83 土 0·61 (n=6) 2D1.A3.D12 0,23士0.23 (η二 1) 14G9.B8.B4 0.35±0.02 (η-3) 10C8.2.3 0.40 (η=1) IM7 1.62士0·93 (η=4) 515 1.46 (η=1) 實例7 抗CD44單株抗體阻斷自人類外周T細胞產生細胞激素抗CD44單株抗體阻斷由抗CD3及抗CD28抗體刺激之自人類外周T細胞產生IL-2及IFN-γ。自正常人類志願者收集人類外周血於具有肝素之採血管（Becton Dickinson，目錄號366480)中。接著在Falcon聚丙烯管（Falcon目錄號2059) 中將血液與於PBS中稀釋之等體積抗CD3(UCTH1，R&D，目錄號MAB100)及抗CD28抗體（R&D，目錄號AF-342-PB) 混合。抗CD3及抗CD28抗體之最終濃度分別為約1 pg/ml 及10 ng/ml。在96孔聚苯乙烯盤（Costar，目錄號3596)中，將10 μΐ各種濃度之抗CD44抗體1A9.A6.B9、2D1.A3.D12及 14G9.B8.B4添加至各孔中，且接著與200 μΐ與抗CD3及抗 CD28抗體預混合之人類全血混合，且在37°C下培育24小時。將血清移除且由IFN-γ及IL-2 ELISA檢定測試（R&D， 126413.doc -110- 200846365 目錄號分別為DIF50及D2〇5〇)。（參見下表19)。表19 抗CD44 Abp且斷由抗CD3及抗CD28抗體活化之自人類外周血釋放IL-2及IFN-γ 抗CD-44抗體 1C 50 (μβ/ιηΐ) IL-2 IFN-γ 1Α9.Α6Λ9 0.58 土 0.21 (η=6) 2·46士 1.46 (η=7) 14G9 B8.34 無活性（η=10) 無活性（η=10) 2D1 WT/H38Q 0.46士0.06 (η=5) 2.45士2·2 (η=2) 實例8 CD44表面表現之降低進行流式細胞儀（FACS)分析以偵測CD44表面表現藉由抗CD44抗體之降低。吾人在活體外條件下以人類全血培育各抗CD44抗體歷時大約12小時，且偵測人類外周白血球上降低之CD44表面表現水平（參見圖7)。將10 μΐ各種濃度之抗 CD44 抗體 1Α9.Α6.Β9、2D1.A3.D12、14G9.B8.B4 及 10C8.2.3抗體添加至96孔平底聚苯乙烯檢定培養盤 (Costar，目錄號3596)中。自正常人類志願者收集人類外周血於具有肝素之採企管（Becton Dickinson，目錄號 366480)中。接著將每孔100 μΐ之人類血與抗CD44 Ab混合且在增濕氣氛中在37°C下培育24小時（Narco 6300 C02恆溫箱）。接著向孔中添加20 μΐ CD44偵測抗體、0-44-26_ PE(BD PharMingen，Franklin Lakes，NJ，目錄號 555479)、 10 μΐ 抗 CD3-perCP抗體（BD PharMingen，目錄號347344)及 10 μΐ 抗 CD14-APC 抗體（BD PharMingen，目錄號 555399)且在黑暗中保持在冰上歷_ 30至40分鐘。接著自培養盤中移 126413.doc -111 - 200846365 除 100 μΐ血且轉移至mmc-immuno管（VWR，West Chester ’ PA，目錄號443990)中且添加以1:10水稀釋之2 ml FACS溶胞溶液（BD Pharmingen目錄號349202)，將其渦旋’且在室溫下保留歷時10分鐘。10分鐘後，將血液以1200 rpm離心歷時10分鐘且將細胞以FACS洗滌缓衝劑（PBS ; 0.02%疊氮化合物，Sigma，目錄號S2002及2%胎牛血清（Gibco，目錄號16140-071)洗滌。將血液以1200 rpm再次離心1〇分鐘，且以FACS洗滌缓衝劑洗滌。接著將細胞以250 ml之1%聚 _ 甲搭（Electron Microscopy Science，目錄號 15710)固定且使用FACS calibur讀取管且使用Cellquest軟體分析資料。 (參見表20及21)。圖8展示對於（a)淋巴細胞，（b)單核細胞及（c)PMN而言，10 pg/ml濃度之1A9.A6.B9抗體之FACS結果。以灰色展示1 A9.A6.B9抗體結果且以黑色展示基線值表現。表20 抗CD44 Ab降低人類及馬來猴外周CD3+ T細胞上之 CD44表面表現人類外周CD3+T細胞外周CD3+ Τ細胞 IC50 fug/mL) ----IC50 (ug/mL) 1A9.A6.B9 2.8 士 1.3 -------Vr^o /___ 〇.82±〇.16 _㈣) __ ____ (n=3) 14G9.B8.B4 0.93 士 0.85 0.39 土 0· 18 (11=3) 2D1.A3.D12 >20 --------\AA ^ /____ >20 _(η=4)__ (n=4) 10C8.2.3 >20 (η=2) IM7 1.5±0.71 (n=2) 9.9 (n=l) 515 失去活性* ^----_L--- *在20 pg/ml下小於40%抑制 126413.doc -112- 200846365 表21 1A9.A6.B9降低人類及馬來猴外周血中白血球上之CD44 表現（參見圖8A-8C) 白血球 IC50(pg/ml) 人類馬來猴 T細胞 2.6±1.0(n=10) 1.1 土 0.5(n=5) 單核細胞 3,3士0.3 (n=3) N.R, B細胞 2.4 土 1.1 (n=4) NT. N.R. =無反應 Ν·Τ· =未測試實例9 抗CD44抗體1Α9.Α6.Β9引起馬來猴體内外周CD3+ Τ細胞上CD44表現之劑量相關減低之單一劑量活體内研究藉由向由 Charles River Primates, BRF(Bi〇 Research Facility，House Texas)供應之馬來猴以 1、i〇及 loo mg/kg(每劑量組2隻雄性動物及2隻雌性動物）投與單_靜脈内劑量之1Α9·Α6·Β9(25 mM乙酸鈉中10 mg/mi，14〇 NaCl，pH值為5.5之0.2 mg/ml聚山梨醇酯80)來檢驗由抗 CD44抗體引發之自淋巴細胞（參見圖9A)及單核細胞（參見圖9B)之CD44表面表現降低。在處理前且在給藥後2、 24、48、168、336及504小時藉由股靜脈穿刺自禁食之狼收集血樣（〜2 ml)兩次用於三色（CD3+、CD14+、CD44+)清式細胞分析。為藉由FACS檢定來偵測CD44表現，將100 μΐ外周灰與 20 μΐ CD14-FITC(純系 Μ5Ε2，BD-Pharm 目錄號 67509)、2〇 μΐ CD3-PerCP(BD-Pharm，目錄號 13043)與 1〇 μ1 CD44 126413.doc -113- 200846365 PE(IM7，BD-Pharm 目錄號 8900)之組合或 20 μΐ CD14-FITC(純系 Μ5Ε2，BD-Pharm 目錄號 67509)、20 μΐ CD3-PerCP(BD-Pharm，目錄號 13043)及 10 μΐ Rt IgG2b-PE(IM7, BD-Pharm目錄號60254)之組合中的任一者混合。以較低中等速度使用渦旋將抗體與血液混合歷時1秒。將具有抗體之血液在4°C下培育20至30分鐘，向各管中添加1.5 ml 1:10 FACS 溶胞溶液（B.D· Pharmingen，San Diego, CA)。將各管以低/中等速度之渦旋混合1 -3秒。在黑暗中將管在室溫下培育約12分鐘。為確保完全溶解，檢查各管之不透明度，且向表現混濁之管中添加額外500 μΐ FACS溶胞物。添加額外 2 ml BD 染色緩衝劑（BD PharMingen，San Diego， CA，目錄號55465C);對管加新蓋且藉由將管倒置而混合。接著將管置放於懸籃（swing bucket)中且在室溫下以 25〇xg離心6-7分鐘。將細胞離心塊以染色緩衝劑洗滌。將 100 μΐ細胞固定緩衝劑（cytofix buffer)(具有4% w/v聚曱酸之PBS)添加至細胞中。將樣本於黑暗中保持在4°C下直至其於FACSCalibur上獲得。向細胞中添加100 μΐ細胞固定緩衝劑（具有4% w/v聚曱醛之PBS)。將樣本於黑暗中在4°C下儲存於細胞固定緩衝劑中。在以FACSCalibur分析細胞之前，向所有管中添加100 μΐ PBS。於閘控淋巴細胞上收集總共20000個結果。實例10 抗原決定基分類研究使用則八⑶代…來進行競爭結合分析。 126413.doc -114- 200846365 BIAcore抗原決定基定位實驗：藉由以BIAcore™進行競爭檢定來進行CD44抗體 (1 A9.A6.B9、2D1 .A3.D12 及 14G9.B8.B4)之抗原決定基定位（參見關於抗體濃度之表22及表23之抗原決定基定位）。使用藉由表面電漿共振之生物感應器雙特異性相互作用分析工具（BIAcore 2000)來量測CM5感應晶片上之分子相互作用。量測感應晶片葡聚糖側分子相互作用所引起之兩種培養基、玻璃及羧甲基化葡聚糖之間之折射率改變且將其如製造者使用注意所詳述以任意反射率單位（RU)之改變報導。使感應晶片上之流槽之羧甲基化葡聚糖表面藉由由〇.2 Μ N-乙基-Ν’-(二甲基胺基丙基）碳化二醯亞胺介導之使用 0.05 Μ Ν-羥基琥珀醯亞胺衍生來活化歷時7分鐘。將阳值為3.5之10 mM乙酸鈉中30 pg/ml濃度之CD44-Ig以5 μΐ/min 之速率手動注射至流槽中且以所需量之RU共價地固定至流槽表面。使用pH值為8.5之1 Μ乙醇胺鹽酸鹽來進行未經反應之Ν-羥基琥珀醯亞胺酯之失活。固定後，藉由再生注射5次5 μΐ 50 mMNaOH清洗流槽中之任何未經反應或不良結合之材料，直至達成穩定基線值。流槽2量測大約62 RU，且流槽3量測大約153 ru。對於流槽1，即活化空白表面而έ ’在固定期間注射3 5 μΐ 1 〇 mM乙酸鹽缓衝劑替代抗原。流槽4含有約200 RU之固定CTLA4-Ig，即無關抗原對照物。使用電泳/稀釋緩衝劑（HBS-EP)來進行抗原決定基定位 1264I3.doc -115- 200846365 實驗。流率為5 μΐ/min，且工具溫度為20°C。各抗體對結合後，接著使用5 μΐ注射之50 mM NaOH使流槽表面再生至基線值。將電泳緩衝劑中經純化之抗體稀釋至30 pg/ml，且以25 μΐ之體積注射。將流槽表面以初級抗體飽和且隨後即刻進行第二抗體之注射。接著將第二抗體之結合評定為與經固定之CD44-Ig 表面”結合"、"不結合"或"部分結合”。進行結合評定後，使表面再生且在面板中再注射相同初級抗體，隨後注射第二抗體。持續此注射流程直至面板中所有抗體經評定與 CD44-Ig結合。選擇另一抗體作為初級抗體且將其他抗體評定為與CD44-Ig結合之第二抗體。詳言之，當抗CD44抗體14G9_B8.B4經測試為初級抗體時，將其與第二抗體共注射，因為14G9.B8.B4關於結合而言之解離速率較快。面板中所有抗體經測試為相對於所有抗體之初級注射後，製備將類似結合模式組合於一個抗原決定基内之簡化矩陣。接著根據簡化矩陣繪製拓撲圖。結合矩陣可根據展示不同抗原決定基之間之干擾的抗原（CD44-Ig)之拓撲表面圖來解譯。該圖僅展示功能關係且不一定與抗原表面之實際物理結構具有任何對應性。 BIAcore競爭結合分析展示以mAb 1A9.A6.B9及 14G9.B8.B4辨識之抗原決定基與由抗體515辨識之抗原決定基重疊。此外，BIAcoreTMW究展示mAb 1A9.A6.B9及 14G9.B8.B4不與抗體IM7重疊。 126413.doc -116- 200846365 表22 抗體最終濃度 IM7(BD Bioseience, Frankilin Lakes，NJ，目錄號553134) l.Omg/ml 515(BDBioscience，目錄號550990) l.Omg/ml 1A9.A6.B9 1.5mg/ml 14G9.B9.B4 l.Omg/ml 表23

CD44抗體之競爭抗原決定基圖 IM7 (BD) 1A9.A6.B9 515 (BD) 14G9.B8.B4 Rmax IM7 (BD) X 〇〇〇 233 1A9.A6.B9 〇 X X X 226 515 (BD) 〇 X X X 170 14G9.B8.B4 〇H X X X 144 x=所觀測之競爭〇=未觀測之競爭實例11

抗CD44抗體之敏感性吾人量測CD44抗體與淋巴管内皮玻尿酸受體1蛋白 (LYVE-1)(R&D，目錄號2089-Ly)之結合親和力且發現抗 CD44抗體對CD44具有比LYVE-1高100倍之敏感性（參見表 24)。將 96孔 ELISA培養盤（Immuno Maxisorp plate, Nunc 目錄號442404)以50 ng CD44-Ig融合蛋白或LYVE-1塗覆且在 4°C下培育隔夜。接著將培養盤藉由PBS，0.05%吐溫-20洗滌，且在室溫下以PBS中3% BSA阻斷2小時。將抗CD44抗 126413.doc -117- 200846365 體或抗LYVE-1抗體（R&D，目錄號AF 2089)以各種濃度於 PBS中1% BSA中稀釋，且添加至培養盤中。將ELISA培養盤在室溫下培育1.5小時。將培養盤洗滌且將於PBS中1% BSA中以1:2000稀釋之對於抗CD44抗體而言50 μΐ抗人類κ 輕鏈HRP抗體（Bethy卜目錄號Α80-115Ρ.6)及對於抗LYVE· 1抗體而言之抗山羊IgG-HRP(Cappel/ICN，目錄號55363) 添加至各孔中且再在室溫下培育一小時。將培養盤再次洗滌，且添加50 pg/ml之TMB且培育5至10分鐘。以停止溶液使ELIS A反應停止且藉由盤讀取器量測OD450值。表24抗CD44抗體之選擇性抗體 CD44-Ig(EC50 μ^/ηύ) LYVE-1(EC50 pg/ml) 1A9.A6.B9 0.011 在10 pg/ml下無交叉反應 2D1.A3.D12 0.024 在10pg/ml下無交叉反應 14G9.B8.B4 0.018 在lOgg/ml下無交叉反應 LYVE-1 Ab »10 0.1 實例12 MEM-85與1 Α9· A6.B9抗CD44抗體之結合競爭研究吾人進行FACS研究來測定本發明之人類抗CD44抗體是否結合至與可購得之抗CD44抗體MEM-85(Caltag Laboratories，Burlingame，CA，目錄號MHCD4404-4)相同或不同之CD44分子上之位點。吾人已使用於反轉錄病毒載體上經人類CD44分子轉導之CD3 +人類外周T細胞及300-19細胞來進行基於FACS之 CD44競爭結合檢定。自正常人類志願者收集人類外周血於具有肝素之採血管（Becton Dickinson，目錄號366480) I26413.doc -118- 200846365 中ο 人類外周Τ細胞FACS研究：自正常人類志願者收集人類外周血於具有肝素之採血管 (Becton Dickinson，目錄號366480)中。向 Nunc-Immuno管 (VWR目錄號443990)中添加100 μΐ所收集之人類血，其後向各管中添加10 μΐ抗CD44 Ab 1Α9.Α6.Β9以達成0.2 pg/ml 至20 pg/ml之最終濃度。將管在冰上培育5分鐘。培育5分鐘後，向各孔中添加20 μΐ CD44偵測Ab(MEM-85，目錄號 • MHCD4404-4)及抗 CD3-PerCP(BD Pharmingen，目錄號 347344)、1〇 μΐ 抗 CD14-APC(BD Pharmingen，目錄號 555399)及 1〇 ml 抗 CD4-APC(BD Pharmingen，目錄號 555349)且在黑暗中保持在冰上歷時3〇至40分鐘。添加2 ml FACS溶胞溶液（BD Pharmingen，目錄號349202，以 1:10 於水中稀釋）’將其渴說且在室溫下再次培育1 〇分鐘。以 FACS洗滌緩衝劑（PBS Sigma目錄號D8537，0.02%疊氮化 ^ 合物，Sigma目錄號S2002及2%胎牛血清，Gibco目錄號 16140-071)洗滌細胞，隨後進行離心且移除上清液。接著將細胞以 250 μΐ 1% 之聚甲酸（Electron Microscope Science，Ft Washington，PA 目錄號 15710)固定。使用 Becton Dickson FACS Calibur讀取管，且使用 CellQuest Pro(Becton Dickinson)分析資料。以人類CD44分子轉導之300-19細胞之FACS研究：向>11111〇11111111111〇管〇1^11目錄號443990)中以每毫升106個細胞添加100 ml之300-19細胞。接著將細胞與1〇 μΐ抗CD44 126413.doc -119- 200846365

Ab混合以達成0至10 pg/ml之最終濃度（參見圖10A)且在冰上培育5分鐘。培育後，向管中添加20 μΐ CD44偵測Ab MEM-85(Caltag Laboratories，Burlingame，CA，目錄號 MHCD4404-4)且將細胞在冰上培育30至40分鐘。以FACS 洗滌緩衝劑（PBS Sigma D8537，0.02%疊氮化合物，Sigma S2002及2%胎牛血清，Gibco目錄號16140-071)洗滌。以 12000 rpm離心歷時10分鐘且除去上清液。將細胞以250 ml 1% 之聚甲酸(Electron Microscope Science ， Ft Washington，PA 目錄號 15710)固定。使用 Becton Dickson FACS Calibur 讀取管’且使用 CellQuest Pro(Becton Dickinson)分析資料。 FACS競爭結合分析展示藉由mAb 1A9.A6.B9辨識之抗原決定基與由MEM-85抗體辨識之抗原決定基重疊，已將其映射至CD44分子之[1]>^域。6&』〇1^11，；1.等人，（1998) JBC，273:33 8-343(參見圖 10A-B)。實例13 根據下表25製備兩種凍乾（冷凍乾燥）之1A9.A6.B9調配物（HIS lyo & CIT Lyo)。調配物含有2〇11^/1111 1A9.A6.B9、組胺酸或檸檬酸鹽緩衝劑、聚山梨醇酯80、 EDTA及二水合海藻糖。如下表25所示，亦製備液體調配物（HIS液體）（1Α9·Α6·Β9)。液體調配物之組成為：1〇 mg/mL 1 Α9.Α6.Β9、20 mM組胺酸緩衝劑、0.2 mg/mL聚山梨醇自旨80、0.05 mg/mL EDTA、84 mg/mL二水合海藻糖及 0.1 mg/mL L-甲硫胺酸。 126413.doc -120- 200846365 表25 :用於1A9.A6.B9液體及lyo調配物之調配物組份調配物 1A9.A6.B9 (mg/ml) pH值組胺酸 (mM) 檸檬酸鹽(mM) PS80 (mg/mL) 海藻糖 (mg/mL) 蔗糖 (mg/mL) EDTA (mg/mL) 甲硫胺酸 (mg/mL) (HIS液體） 10 5.5 20 倫 0.2 84 - 0.05 0.1 (HIS lyo) 20 5.5 20 - 0.2 - 80 0.05 - (CIT lyo) 20 5.5 - 5 0.2 • 80 0.05 - 將以上所製備之各調配物保持在2-8 °C下，及加速穩定條件（25至40°C )下歷時52週（將含有擰檬酸鹽緩衝劑之凍乾調配物僅保持22週）。在4、8、13、22及52週分析樣本。在各時間點，肉眼分析樣本之微粒存在、顏色改變及透明度。亦進行pH量測。藉由SE-HPLC監控聚集體之存在。所測試之所有調配物保持肉眼透明、無色且不含顆粒且不展示任何顯著pH值改變。此外，表25之所有調配物均獲得優於97%之mAb單體回收（<3%聚集體形成），且以連續之2管柱（GS SW3 000XL及 GS SW2000XL)，使用 pH值為 7.0之 200 mM磷酸鹽緩衝劑之移動相，藉由SE-HPLC所量測在經受 2-8°C及25°C下儲存52週，以及在40°C下儲存22週（圖11a， b&c)後測試液體調配物，其係作為對照物。在40 min之進行時間下，將流率保持在0.7 mL/min。藉由毛細管等電聚焦成像（iCE)來分析各調配物以於50 週之冷凍儲存（2-8°C )後且在加速溫度條件（25°C下歷時52 週，以及40°C下歷時22週)下評估1A9.A6.B9電荷變異體形成（酸性、親本及鹼性物質）。在毛細管内進行此等帶電種類之分離，且使用UV偵測器及CCD攝影機來觀測且定量此等種類。將iCE檢定（酸性物質）之結果說明於圖12a， b&c中。該等結果說明所有調配物在2-8°C及25°C下儲存歷 126413.doc -121 - 200846365 時52週後具有類似酸性物質形成。在4(rc下，報導經凍乾調配物具有比對照物低之酸性物質形成。亦藉由SDS-PAGE分析各調配物以評估冷凍儲存（2_8 °C)52週後且在加速穩定條件（在25〇c下歷時52週，以及在 40°C下歷時22週）下評估mAb之較高及較低尺寸變異體形成。此方法提供隨時間較佳mAb純度（包括夾片形成及聚集體形成之含量）之量值。SDS_PAGE檢定之結果係說明於表 26、27 & 28 中。鲁亦分析各調配物以評估冷凍儲存（2-8°C )52週後且在加速穩定條件（在25 C下歷時52週或在40°C下歷時22週）下評估重鏈上曱硫胺酸_256位置處之甲硫胺酸氧化之形成。以 Lys-C消化單株抗體產物，且監控含有甲硫胺酸之肽片段及其各別之經氧化形式。表26、27 & 28展示甲硫胺酸氧化檢定之結果。亦分析各調配物以評估冷凍儲存（2_8°c )52週後，且在加籲速穩定條件（25 C下歷時52週以及在40°C下歷時22週）下之相關生物活性。生物活性檢定之結果係說明於表26、27 & 28中。表26 :在5°C下獲得之穩定性資料時間點 22週 52週調配物 HIS 液體 | HIS-lvo CIT-lyo HIS 液體 | HIS-lyo 1 CIT-lyo SDS-PAGE 純度％>50尺 0.8 0.5 0.7 0.6 0.6 未經分析純度％ 25 K-50 K 0 0 0 0 0 未經分析純度％<25 K 0 0 0 0 0 未經分析總純度％ 0.8 0.5 0.7 0.6 0.6 未經分析 126413.doc -122- 200846365 氧化 met-256 3.1 3.2 3·4 未經分析未經分析未經分析經還原CGE 純度％ 98.8 98.7 98.8 98.7 98.8 未經分析片段％ 1.2 1,3 1.2 1.3 1.2 未經分析生物檢定 95% 未經分析未經分析未經分析未經分析未經分析表27 :在25°C下獲得之穩定性資料時間點 22週 52週調配物 HIS液體 HIS-lyo cmyo HIS液體 HIS-lyo CIT-lyo SDS-PAGE 純度％>50 Κ 1.0 0.6 2.4 1.4 0.3 未經分析純度％ 25 Κ-50 Κ 0.9 0.1 0.2 0.6 0 未經分析純度％<25 Κ 0.1 0.0 0.1 0,0 0.0 未經分析總純度％ 2.0 0,7 2.7 2.0 0.3 未經分析氧化 met-256 未經分析未經分析未經分析未經分析未經分析未經分析生物檢定未經分析未經分析未經分析未經分析未經分析未經分析表28 :在40°C下獲得之穩定性資料時間點 22週調配物 HIS液體 HIS-lyo cmy〇 SDS-PAGE 純度％>501^ 2.0 0.6 1.1 純度％ 25 K-50 K 4.1 0.2 0 純度％<25 K 1.5 0 0 總純度％ 7.6 0.9 1.1 氧化 met-256 8.8 3.5 3.4 CGE(經還原）純度％ 91,2 98.9 98.9 片段％ 8.3 1.1 1.1 生物檢定 86 73 92

實例14 藉由Biacore™分析之人類及馬來猴CD44之1A9.A6.B9的結合親和力進行另一 BIAcore™分析以表明1A9.A6.B9抗體與人類及 126413.doc -123 - 200846365 馬來猴CD44之結合親和力。將人類CD44-Ig(55 RU，86 1111)及馬來猴€〇44-1§(99 111；，116 1111)以於？11值為3.5之10 mM乙酸鈉中10 pg/ml之濃度固定於CM-5晶片。使不同濃度之1Α9·Α6·Β9(半對數稀釋液中100 pg/ml至0.1 pg/ml)以每分鐘5微升之速率流過晶片。接著將晶片以50 mMNaOH 再生且以 HBS-EP(BIAeore 22-0512-44)洗滌。以 Biacore 2000進行分析。使用BIAEvaluation™軟體（n=2)分析資料。表29: 1A9.A6.B9之動力學分析 CD44 Ig Kd (xlO~")(l/s) Kd(pM) 人類 0.39 51 (n=3) 馬來猴 0.53 150 (n=3) 本說明書中所引用之所有參考文獻（包括（但不限於）所有論文、公開案、專利、專利申請案、陳述、本文、報導、原稿、小冊子、書、網際網路公告、雜誌文章、期刊、產品情況說明書及其類似物）之全文均係引用之方式併入本說明書中。本文中參考文獻之論述僅意欲概述其作者所作出之主張且不認可任何參考文獻構成先前技術且申請者保留質疑所引用參考文獻之精確性及適當性的權利。儘管已為清楚理解之目的以說明及實例之方式在一定程度上詳細描述前述發明，但普通熟習此項技術者將鑒於本發明之教示顯而易見，可在不偏離隨附之申請專利範圍之精神或範疇下，進行某些改變及修正。【圖式簡單說明】圖1為免疫球蛋白（IgG)之圖示。圖2A-2D展示經分離之抗CD44單株抗體之重鏈及輕鏈可 126413.doc -124- 200846365 變域的所預測胺基酸序列與對應輕鏈及重鏈基因之生殖系胺基酸序列的序列對準。純系與生殖系序列之間之相同殘基係以短劃線展示，缺失/插入係以散列符號展示，列出突變，且在CDR下劃線。圖3為說明阻斷HA與CD44_Ig融合蛋白結合之抗CD44 1A9.A6.B9抗體之圖。圖4A-4C為展示如流式細胞儀揀選（FACS)所檢定之抗 CD44抗體與細胞結合之圖。圖4A為說明如FACS所檢定抗CD44 1A9.A6.B9及 14G9.B8.B4抗體與人類全血T細胞結合之圖。圖4B為說明如FACS所檢定抗CD44 1A9.A6.B9及 14G9.B8.B4抗體與馬來猴（cynomolgus monkey)全血T細胞結合之圖。圖4C為說明如FACS所檢定之抗CD44抗體與以人類及馬來猴CD44所轉導之300-19細胞之結合的圖。圖5為說明如ELISA檢定所量測使用人類及馬來猴CD44-Ig融合蛋白之抗CD44 1A9.A6.B9抗體之結合研究的圖。圖6展示說明如使用ELISA所定量，阻斷由脂多醣（LPS) 及HA刺激之IL-Ιβ自人類全單核細胞釋放之抗CD44 1A9.A6.B9 及14G9.B8.B4抗體的圖。圖7為展示如FACS所量測，降低CD44受體於CD3 +外周T 細胞上之表面表現的抗CD44 1 Α9·Α6·Β9及14G9.B8.B4抗體的圖。圖8Α為展示藉由抗CD44抗體1Α9.Α6.Β9降低CD44受體 126413.doc -125- 200846365 於人類外周白血球（淋巴細胞）上之表面表現之圖。圖8B為展示藉由抗CD44抗體1A9.A6.B9降低CD44受體於人類外周白血球（單核細胞）上之表面表現之圖。圖8C為展示藉由抗CD44抗體1A9.A6.B9降低CD44受體於人類外周中性白血球（PMN)上之表面表現之圖。圖9A及9B展示說明如使用FACS所定量，向馬來猴投與之抗CD44 1A9.A6.B6抗體之單一劑量活體内研究的圖。圖10A為說明如使用FACS所定量，使用人類外周T細胞之與抗CD44抗體MEM 85直接競爭之抗CD44 1A9.A6.B9結合的圖。圖10B為說明如使用FACS所定量，使用以如實例1所述之人類CD44所轉染之300-19細胞，與抗CD44抗體MEM 85 直接競爭之抗CD44 1A9.A6.B9之結合的圖。圖 11為說明如 SE-HPLC所量測，在 5°C (11a)、25°C (lib) 及40 °C (11c)下所形成之本發明聚集體（高分子質量物質 (HMMS))之圖。圖12為展示如iCE所量測，在5°C (12a)、25°C (12b)及40 °C (12c)下所形成之總酸物質之圖。 126413.doc 126-

Claims

200846365 十、申請專利範圍： 1. 一種可特異性結合人類CD44之經分離人類抗體或其抗原結合部分，其包含重鏈可變（VH)域胺基酸序列，該重鏈可變（VH)域胺基酸序列包含選自由下列各種組合所組成之群之CDR1、CDR2及CDR3區： a) 列於 SEQ ID NO:17 之VH CDR1、1KSEQIDNO:19 之 VH CDR2及列於 SEQ ID N0.21 之 VH CDR3 ; b) 列於 SEQ ID NO:53之 VH CDR1、列於 SEQ ID NO:55 之 VH CDR2及列於 SEQ ID NO:57之 VH CDR3 ; c) 列於 SEQ ID NO:89之 VH CDR1、列於 SEQ ID NO:91 之 VH CDR2及列於 SEQ ID NO:93 之 VH CDR3 ;及 d) 列於 SEQ ID NO:125 之 VH CDR1、列於 SEQ ID NO·127之VHCDR2及列於SEQIDNO:129之VHCDR3。 2. 如請求項1之經分離人類抗體或抗原結合部分，其另外包含輕鏈可變（VL)域胺基酸序列，該輕鏈可變（VL)域胺基酸序列包含選自由下列各種組合所組成之群之 CDR1、CDR2及CDR3區： a) 列於SEQ ID NO:23之VL CDR1、列於SEQ ID NO:25 之 VL CDR2及列於 SEQ ID NO:27之 VL CDR3 ; b) 列於 SEQ ID NO:59之 VL CDR1、列於 SEQ ID NO:61 之 VL CDR2及列於 SEQ ID NO:63i VL CDR3 ; c) 列於SEQ ID NO:95之VL CDR1、列於SEQ ID NO:97 之乂1〇0112及列於8£(^10 1^0:99之¥1^€0113;及 d) 列於 SEQ ID NO:131 之 VL CDR1、列於 SEQ ID 126413.doc 200846365 1^0:133之¥1〇0112及列於8£()10,0:135之¥1^€0113。 3·如請求項2之經分離抗體或其抗原結合部分，其包含列於 SEQ ID ΝΟ:17 之 VH CDR1、列於 SEQ ID ΝΟ:19 之 VH CDR2、列於 SEQ ID NO:21 之 VH CDR3、列於 SEQ ID NO:23 之 VL CDR1、列於 SEQ ID NO:25 之 VL CDR2，及列於 SEQ ID NO:27之 VL CDR3。 4.如請求項2之經分離抗體或其抗原結合部分，其包含列於 SEQ ID NO:89之 VH CDR1、列於 SEQ ID NO:91 之 VH # CDR2、列於 SEQ ID ΝΟ··93 之 VH CDR3、列於 SEQ ID NO:95 之 VL CDR1、列於 SEQ ID ΝΟ··97之 VL CDR2，及列於 SEQ ID NO:99之 VL CDR3。 5 ·如請求項1之抗體或其抗原結合部分，其中該V h域胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 11、47、83及119組成之群，或具有保守胺基酸取代作用而不同於SEQ ID ΝΟ:11、47、83及 119 中之任一者。 6.如請求項1之抗體或其抗原結合部分，其包含與SEQ ID ® ΝΟ:11、47、83及119中之任——者之胺基酸序列至少95% 相同之VH域。 7·如請求項2之抗體或其抗原結合部分，其中該VL域胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 15、51、87及123組成之群，或具有保守胺基酸取代作用而不同於SEQ ID NO:15、51、87及 123 中之任一者。 8·如請求項2之抗體或其抗原結合部分，其包含與SEQ ID NO:15、51、87及123中之任一者之胺基酸序列至少95% 126413.doc 200846365 相同之VL域。 9.如請求項7之抗體或其抗原結合部分，其中該（VH)域胺基酸序列及該（VL)域胺基酸序列係選自由下列各種組合所組成之群· a) 列於 SEQ ID N0:11之 VH域及列於 SEQ ID NO:15iVL 域； b) 列於 SEQ ID NO:47之 VH域及列於 SEQ ID NO:51 之 VL 域； Φ c)列於SEQ ID NO··83之 VH域及列於SEQ ID NO:87之 VL 域；及 d)列於 SEQ ID NO: 119之 VH域及列於 SEQ ID NO:123之 VL域。 10·如請求項9之抗體或其抗原結合部分，其包含列於SEQ IDNO··ll之VH域及列於SEQIDNO:15之VL域。 11 ·如請求項9之抗體或其抗原結合部分，其包含列於S E Q IDNO:83之VH域及列於SEQIDNO:87之VL域。 • 12· —種可特異性與CD44結合之經分離人類抗體，其包含選自由下列各種組合所組成之群之重鏈胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列： a) 列於SEQ ID NO:9之重鏈及列於SEQ ID NO:13之輕鍵； b) 列於SEQ ID N0.45之重鏈及列於SEQ ID NO:49之輕鏈； c) 列於SEQ ID NO:81之重鏈及列於SEQ ID NO:85之輕 126413.doc 200846365 鏈；及 d)列於SEQ ID NO:117之重鏈及列於SEQ ID NO:121之輕鏈。 13. 如請求項12之經分離人類抗體或其抗原結合部分，其包含列於SEQIDNO·9之重鏈及列於SEQIDNO··13之輕鍵。 14. 如請求項12之經分離人類抗體或其抗原結合部分，其包含列於SEQ ID NO:9之重鏈及列於SEQ ID NO:13之輕 ⑩ 鏈。 15·如請求項9之抗體，其為lgG。 16·如請求項15之抗體，其中該igG為igG2。 17· —種醫藥組合物，其包含如請求項i之抗體或抗原結合部分及可選之醫藥學上可接受之載劑。 I8· 一種以抗CD44抗體或其抗原結合部分來治療、預防或緩解有此需要之受檢者之CD44介導病症之症狀的方法，其包含向該受檢者投與有效量之如請求項Ϊ之抗體或其抗原結合部分的步驟。 19·如請求項17之治療方法，其中該CD44介導病症為發炎性疾病或自體免疫疾病。 U項1 8之冶療方法，其中該疾病係選自由類風濕性關節人幼年型類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化、肉芽腫疾病、多發性硬化症、哮喘、克羅恩氏病(Cr〇hn，s dlsease)、僵直性脊椎炎、牛皮癬性關節炎、斑狀乾癖及癌症組成之群。 126413.doc 200846365 21. .種經分離核酸分子，其包含編碼如請求項〗之抗體之重鏈或其抗原結合部分及/或輕鏈或其抗原結合部分的核苷酸序列。 σ / 22. -種包含如請求項21之核酸分子的载體，其 23. 情況包含可操作性與該核酸分子連接的表現控制序列。種包含如請求項22之載體的宿主細胞。

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