TW200831900A - Cancer screen method - Google Patents

Description

200831900 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種癌症歸檢的方法，特別是指一種以甲基化DNA作為 生物標記的癌症篩檢的方法。 【先前技術】 子宮頸癌是全球及台灣女性主要的死因之一，根據2〇〇2年世界衛生組 肩(TOO)的麟，子謂癌為全球女性雜死因的第三位，僅:欠於乳癌； 定期接受子謂簡檢是驗子宮_的最财法，習用子魏癌筛檢的 方式主要有兩種，一疋最韦見的子宮頸抹片檢查(pap sme虹），另一則為人類 乳突病毒檢驗(HPVtesting);子宮頸抹片檢查是取出子宮頸部之分泌物，以 顯微鏡觀察其巾脫落之上皮細胞巾‘，是否錢錢產生，以早期偵測子宮 頸疡，而HPV彳欢驗則疋以反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcHpti〇n polymemse chain reaction，RT_PCR>^查樣本中是否存在有人類乳突病毒 (human papill〇ma virus，HPV)病毒基因的表現。 然而，由於子宮頸抹片檢查(Pap smear)需要靠醫師取樣、檢驗師/病理 邊帀判4抹片，除了容易產生兩偽陰性率(High faise negative rate)而延遲癌 前病變的診斷與治療之外，再者，所需的人力成本太高，這對許多發展中 的國豕來《兒，有推廣上的困難；另一方面，人類乳突病毒檢驗(Hp^铋贫匕幻 雖八有南敏感度’但卻容易造成高偽陽性率(High faise p0Sitive rate)，不僅 讓病患白白擔心，也會浪費許多醫療資源在偽陽性患者的追蹤檢查上；因 此，如何提高子宮頸癌檢驗方法的準確性及方便性，是推廣子宮頸癌檢驗 的重要課題之一。 在子宮頸癌的病原學上.，感染致癌的人類乳突病毒(HPV)是最顯著的危 200831900 險因子；zurHausen於2002年的報告顯示，“高危險，，人類乳突病毒(HPV) 產生的E6/E7致癌蛋白(〇nc〇pr〇tein)會與腫瘤抑制基因；?53/^凡8作用，造成 細胞週期調節異常；事實上，人類乳突病毒(HPV)的DNA可在所有的子宮 頸癌病例中被偵測到。然而，感染人類乳突病毒(HPV)雖為產生子宮頸癌必 要的條件，但卻不足以導致子宮頸癌的發生；大約有60%低度鱗狀細胞上 皮内病變(low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL)會復原(regress)， • 30%則會持續(Persist)，5-10%會發展為高度鱗狀細胞上皮内病變(high-grade

f squamous intraepithelial lesions，HSIL)，只有少於 1%會變成子宮頸癌。HPV 的持續感染以及病毒量(viral load)可能是發展成為高度鱗狀細胞上皮内病 變(HSIL)及癌症的決定因子；然而，子宮頸癌發生的分子機制仍有待確認。 其他的因子，如：環境及基因的改變，可能也在子宮頸角質細胞的惡 化上扮演重要的角色；且不論是否由HPV所啟動，基因的改變造成基因組 的不穩定已長久被認為是子宮頸癌發生的重要機制，由細胞發生學上的研 究顯示，在子宮頸癌細胞内存在有非隨機染色體的改變(non-rand〇m chmmosomal changes);另外，數個分子遺傳學的研究則鑑識出一些時常發 生去異質化(loss of heterozygosity，LOH)的位置，這些位置可能跟子宮頸癌 發生時的腫瘤抑制基因(tumor suppressor genes，TSGs)有關聯。 基因的缺失(genomic deletions)被認為是腫瘤形成的重要因素，長久以 來’我們都習慣了基因組中的編碼是仰賴ATCG四個鹼基排列的觀念， Knudson早在1975年即提出雙重受創理論(two-hit theory)，指出一些同源腫 瘤抑制基因伴隨的突變或缺失可能造成或易造成癌症的發生；然而，其他 影響表現型(phenotype)的訊息可能存於被修飾過的鹼基5-曱基胞嘧啶 (5-methylcytosine)中，5-曱基胞嘧啶被發現存在於哺乳類動物細胞内的迴文 6 200831900 序列5’-CpG-3’中，在哺乳類動物細胞内除了一些被稱為“CpG島，，（CpG islands，CGIs)的區域之外，大多數的CpG雙核苷酸對都被甲基化，CpG島 是指在大約1000個鹼基對(1Kb)的區域内含有大量的GC-以及CpG-，通常 位於基因的附近，且在廣泛表現的基因之啟動子附近被發現。胞嘧啶的甲 基化發生在DNA合成後，自一曱基捐贈者s-腺核苷曱硫胺酸 (iS^adenosylmethionine，SAM)將一甲基經酵素轉移到胞哺η定第5個碳的位置 - 上，该酵素反應係由DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMTs)執 f % 行’ DNMT1是哺乳類動物主要的甲基轉移酶，係負責將半甲基化位置複製 後修復(post-replicative restoration)為全甲基化，被稱為維持甲基化 (maintenance methylation);反之，DNMT3A 及 DNMT3B 則被認為主要負責 甲基化新的位置’進行一種稱為重|斤甲基化(％⑽V0inethylation)的步驟。

CpG雙核苦酸對甲基化的遺失(i〇ss methylation)，意即一般的低度甲 基化’疋癌細胞内的第一個超遺傳異常(epigenetic abnormaiity);然而，在過 去幾年内的研究卻顯示，特定位置(例如：一些腫瘤抑制基因)的高度甲基化 (site-specifichypermethylation)與其功能的喪失有關，這可能會在癌症生成時 提供選擇優勢(selective advantages);在啟動子區域上CpG島的高度甲基 化’可以藉由組蛋白修佩histone modification)伴隨接續而來的基因默化現 象(gene silencing) ’來引起染色質改造(chromatin remodeling);除了染色體 缺失及基因突變之外，經由啟動子的高度甲基化所造成腫瘤抑制基因的超 遺傳默化現象(epigenetic silencing)也常見於人類癌症中。 最近的流行病學研究顯示，血清葉酸鹽(serum folate)的濃度(一種甲基 的主要來源)與HPV的感染和清除有關聯；在甲基週期(methyicycle)的代謝 作用中，酵素的基因多型性(genetiC P〇lym〇rphisms)也曾被報導與子宮頸上 7 200831900 皮内病變的發展有關；如同超基因演化的觀念一般，DNA甲基化與子宮頸 癌間關聯的研究也同樣盛行，子宮頸癌的DNA甲基化研究日與遽增，顯八 使用甲基化作為子宮頸癌篩檢的可能性；由於遺傳與環境交互作用的特 性，腫瘤抑制基因甲基化程度因不同的基因及不同的族群而異，不同的疾 病也會有不同的曱基化表現^methylatorphenotypes);然而，子魏 •基化表現型以及其與HPV基因型的關聯仍未知，而子宮頭癌中有何特定的 ’ 基因會被甲基化，以及需要多少基因方可達到臨床應用的需求，這些問題 (、 仍是未來需要被確認的議題。 由此可見，上述制子宮頸_檢方法仍有諸多缺失，實非_良善之 設計者，而亟待加以改良。 ° 本案發明人鑑於上述制子宮_篩檢方法所衍生的各項缺點，乃返 思加以改良創新，並經多年苦心孤詣潛心研錄，終於成功研發完成本件 癌症篩檢的方法。 【發明内容】 本發明之目的即在於提供一種子宮頸癌筛檢的方法，以作為第一線-宮頸癌的篩檢(cancer screen)。 本發明之次-目的録於提供_種子宮賴篩檢的枝，％方法除 可作為第-線子宮職㈣檢之外，亦可作„二線子宮嘱簡檢% 助人類乳突病毒檢驗(HPVtesting)，以達到更準確之子宮顯癌筛檢效果。 本發明之另-目的録於提供—翻症診斷的方法，財法除可⑹ 在子宮頸癌的檢測上，亦可顧於其他麵如：㈣癌、肝_檢= 輔助異常檢體之診斷。 可達成上述發明目的之-種癌症筛檢的方法，係檢測受測檢體細心 200831900 目標基因曱基化的狀態，以作為癌症有無的篩檢指標，該方法包含下列步 驟： 步驟1 提供一受測檢體； 步驟2檢測該受測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因的CpG序 列曱基化狀態’該目標基因係由S〇Xl、PAX1、LMX1A、 NKXW、WT1以及ONECUT1所組成；以及 步驟3根據該目標基因甲基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有癌症 或癌前病變病變。 其中a亥受測檢體為子呂頸抹片、腹水、血液、尿液、糞便、瘦、口腔 黏膜細胞、胃液、膽汁、子.宮頸上皮細胞等。 其中該目標基因的CpG序列甲基化狀態檢測方法為甲基化特異性聚合 酶連鎖反應(methylation-spedfic PCR，MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖 反應(quantitative methylation-spedfic PCR，QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulflte sequencing，BS)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectr〇meter)、變 性高效液相色譜（denaturing high-perfo麵nce liquid Chmmat()graphy， DHPLC) 〇 其中該目標基因SOX1係具有如SEQn3No: i所示之核苷酸序列。 其中該目標基因PAX1係具有如SEqIDNo:2所示之核苷酸序列。 其中該目標基因LMX1A係具有如SEq ID No: 3所示之核苷酸序列。 其中該目標基因NKX6-1係具有如SEQIDNo:4所示之核苷酸序列。 其中該目標基因WT1係具有如SEq IDNo: 5所示之核苦酸序列。 其中該目標基因ONECUT1係具有如SEq ID No: 6所示之核普酸序列。 本I月進供-種子呂頸癌篩檢的方法，係檢測受测檢體細胞中 9 200831900 目標基因甲基化的狀態，以作為子宮頸癌有無的篩檢指標，該方法包含下 列步驟： 步驟1提供一受測檢體； 步驟2檢測該受測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因的CpG序 列甲基化狀態，該目標基因係由SOX卜PAX1、LMX1A、 NKX64、WT1以及ONECUT1所組成；以及 步驟3根據目標基因甲基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有子宮頸 癌及癌前病變。 其中該受測檢體為子宮頸抹片、血液、尿液、子宮頸上皮細胞等。 其中該受測檢體為異常之子宮頸抹片。 其中該受測檢體為人類乳突病毒檢驗(HPV testing)呈陽性(positive)之 子宮頸細胞檢體。 其中該目標基因的CpG序列甲基化狀態檢測方法為甲基化特異性聚合 酶連鎖反應(methylation-specific PCR，MSP)、定量曱基化特異性聚合酶連鎖 反應(quantitative methylation-specific PCR，QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing，BS)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)、變 性高效液相色譜（denaturing high-performance liquid chromatography， DHPLC) ° 其中該目標基因SOX1係具有如SEQ ID No: 1所示之核苦酸序列。 其中ό亥目&基因PAX1係具有如SEQ ID No: 2所示之核皆酸序列。 其中該目標基因LMX1A係具有如SEQ ID No·· 3所示之核普酸序列。 其中該目標基因NKX6-1係具有如SEqh)No:4所示之核苷酸序列。 其中該目標基因WT1係具有如SEqIDNo:5所示之核苦酸序列。 200831900 其中該目標基因〇NECUT1係具有如SEQ N〇: 6所示之核皆酸序列。 本發明進—步提供—種祕癌_檢的方法，係檢測受測檢體細胞中目 標基因甲基化的狀態’以作树巢癌有無的篩檢指標，該方法包含下列步 驟： 步驟1提供一受測檢體； 步驟2檢測该夂測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因的序 列甲基化狀態，該目標基因係由S〇xi、ρΑχ卜LMX1A所組 成；以及 步驟3根據目標基因甲基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有卵巢癌 及癌前病變。 其中該受測檢體為腹水、金液、尿液等。 其中該目標基因的CpG序列甲基化狀態檢測方法為甲基化特異性聚合 酶連鎖反應(methylation-speciflc PCR，MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖 反應(quantitative methylation_specific PCR，QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing，BS)、微陣列(microarrayS)、質譜儀分析(mass叩沈加⑽㈣、變 性咼效液相色譜（denaturing high-performance liquid chromatography， DHPLC)、焦填酸定序(pyrosequencing)。 其中該目標基因SOX1係具有如SEQIDNo·· 1所示之核脊酸序列。 其中該目標基因PAX1係具有如SEQ ID No: 2所示之核芽酸序列。 其中該目標基因LMX1A係具有如SEQ ID No: 3所示之核苦酸序列。 本發明進一步提供一種肝癌篩檢的方法，係檢測受測檢體細胞中目標 基因甲基化的狀態，以作為肝癌有無的篩檢指標，該方法包含下列步驟： 步驟1提供一受測檢體； 11 200831900 步驊2檢測該受測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因的CpG序 列甲基化狀態，該目標基因係由SOX1、NKX6-1所組成；以 及 步驟3根據目標基因甲基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有肝癌及 癌前病變。 其中該受測檢體為腹水、血液、尿液、糞便、胃液、膽汁等。 其中該目標基因的CpG序列甲基化狀態檢測方法為甲基化特異性聚合 酶連鎖反應(methylation-specific PCR，MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖 反應(quantitative methylation-specific PCR，QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing, BS)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)、變 性南效液相色谱（denaturing high-performance liquid chromatography， DHPLC)、焦填酸定序(pyrosequencing)。 其中該目標基因SOX1係具有如SEQ ID No: 1所示之核發酸序列。 其中該目標基因NKX6-1係具有如SEQIDNo:4所示之核苷酸序列。 【實施方式】 實施例一材料與方法 一、試驗材料 試驗材料包含一系列完整的子宮頸病變樣本，包括正常樣本(n = 45)、 低度鱗狀細胞上皮内病變(LSIL，n = 45) '高度鱗狀細胞上皮内病變(HSIL，n 58)、鱗狀細胞癌(SqUam〇us cell carcinoma，SCC，η = 109);試驗材料另包含 系列完整的卵巢腫瘤樣本，包括卵巢良性腫瘤樣本(n = 36)、卵巢邊緣性 腫瘤樣本(η = 6)、卵巢惡性腫瘤樣本(η = 122);所有的子宮頸樣本及卵巢樣 12 200831900 本均取自台北三軍總醫院的婦科腫瘤組織庫，各樣本的基因組DNA以 Qiagene DNA套組抽取，並以pic〇Green螢光吸收法定量DNA，且以凝膠 電泳檢測DNA的品質。 另外，肝細胞樣本則包含正常肝細胞樣本(n= 13)、慢性肝炎(n= 15)、 肝硬化(cirrhosis，η = 40)、肝癌(hepatoceiiular carcinoma，HCC，η = 54);所有 的肝細胞樣本均取自台北三軍總醫院一般外科腫瘤組織庫，各肝細胞樣本 的基因組DNA也疋以Qiagene DNA套組抽取，並以PicoGreen螢光吸收法 定量DNA，且以凝膠電泳檢測DNA的品質。 一、使用CpG島微陣列(CpGisland mieroarrays)進行差異甲基化雜合反應 (Differential Methylation Hybridization, DMH) 取30個子宮頸癌組織樣本的〇]^八混合在一起，另外取1〇個正常子宮 頸抹片樣本的DNA混合在一起，樣本的DNA以限制酶酶切後，黏接 (ligated)到連接子（linkers)上，隨後以對甲基化敏感之限制酶 (methylation-sensitive restriction enzymes)你all 以及伤iUI 進行酶切，再將 該DNA作為PCR的模版(template)進行20個循環(cycles)的擴增，並以螢光 染劑標記，正常子宮頸抹片樣本的DNA以螢光染劑Cy3標記，子宮頸癌組 織樣本的DNA則以螢光染劑Cy5標記；將標記好的樣本DNA作為探針， 與含有 8,640 CpG 島標籤(CpG island tags)的 CpG 島微陣列(CpG island microarrays)進行雜交反應，以 CGI資料庫（網址： http://dertab.med.utoronto.ca/CpGIslands/)來辨識被挑選到的 CpG 島。微陣列 數據以GenePix 6.0軟體的圓形特徵模式(circuiar-features m〇(je)分析，標記 重複挑選的選殖株(done)，以及過濾去除掉不被接受的特徵；Cy5對Cy3 的比率(ratio)大於2.0的基因位(loci)為在混合的子宮頸癌組織樣本中具有高 13 200831900 度甲基化的基因，因此接受比率大於2.0的棊因位。 三、亞硫酸鹽修飾作用(Bisulfite modification)、甲基化特異性聚合酶連鎖 反應（methylation-specific PCR，MSP)以及亞硫酸鹽定序（bisulfite sequencing, BS)

使用Chemicon公司出產之DNA修飾套組(DNA modification kit， • Chemicon，Temecula，CA)進行亞硫酸鹽修飾作用··取1 樣本的基因組DNA ， （Senomic DNA)，以亞硫酸鈉對基因組DNA進行化學修飾，在單鏈DNA中， 所有非甲基化的胞喊淀都會發生脫氨基作用而轉變成尿喊咬，而曱基化的 胞嘧啶則不被修飾，仍保持5-甲基胞嘧啶的狀態；最後，將反應後的樣本 DNA溶於70μ1 55°C的ΤΕ緩衝液(TE buffer)中，以進行甲基化特異性PCR (MSP) 〇 * < 另取人類周圍血(peripheral blood)的正常DNA進行亞硫酸鹽修飾作 用，以作為具有非甲基化啟動子序列的對照組；並將人類的正常DNA以 SssI 甲基轉移酶(methyltransferase，New Engl—出〇1執㈣响，ma)處 理，以得到具有甲基化對偶基因的陽性對照組。 ^ 取lpg經過亞硫酸鹽修飾作用後的樣本基因組DNA，以及對照組和陽 性對照組DNA ’以MSP引子進行甲基化特異性pcr擴增，該MSP引子分 為兩種，一種為可專一辨認非甲基化基因序列的]^;§1>引子(u)，另一種為可 專-辨認甲基化基因序列的MSP引子(M)，各.目標基因的MSp引子序列如 表一所不；甲基化特異性PCR反應物的總體積為25μ1，包含1μ1已修飾過 的模版DNA、每-引子各15 pm〇卜〇 2麵视dNTps以及j她G〇w㈣ DNA polymerase (AppHe(j Bi〇systems，F〇ster CA);將混合好的反應物置 於95°C下5分鐘，接著以95t解離(denature)3〇,、適當引子黏合(annealing) 14 200831900 溫度黏合30秒、72°C合成30秒為循環，解離、黏合、合成步驟共重複35 個循環，之後再置於72°C反應5分鐘。擴增後的產物以含有溴化乙錠 (ethidiumbromide,EtBr)的2.5%瓊脂膠體進行電泳分析，並置於紫外光下照 射觀察。 表一甲基化特異性PCR (MSP)所使用之MSP引子的序列 基因名稱 引子種類 引子序列 r~" 1ΤΓ'1 ' 一，··1 --------------- - - ---- - --

Μ SOX1 ——u

Μ LMX1A — U M ONECUT1 ~-

正股(F·) 反股(R) 正股(F) 反股(R》 正股(F·) 反股(R·) 正股(F) 反股(R·) 正股(F·) 反股CRD 5r CGTTTTTTTTTTTTCGTTATTGGC 3f 5r CCTACGCTCGATCCTCAACG 5/ TGTTTTTTTTTTTTTGTTATTGGTG 3r 5f CCTACACTCAATCCTCAACAAC 3r 5， TTTAGAAGCGGGCGGGAC 3r 5, CCGAATCCAAACACGCG 5, GAGTTTAGAAGTGGGTGGGATG 3r 5，CAACCAAATCCAAACACACAAAAC 3f 5r TTGTAGCGGCGGTTTTAGGTC 3f GCCAAACCCTTAACGTCCCG 3f (SEQ ID No: 7) (SEQ ID No: 8) (SEQ ID No: 9) (SEQ ID No: 10) (SEQ ID No: 11) (SEQ ID No: 12) (SEQ ID No: 13) (SEQ ID No: 14) (SEQ ID No: 15) (SEQ ID No: 16)

U 正股(F’） 5A GATTGTAGTGGTGGTTTTAGGTTG 3， 反股(R》5，CACCAAACCCTTAACATCCCAATAC 3r ϋ PAX1

正股(F’） 5r TATTTTGGGTTTGGGGTCGC 3r 反股QRQ 5，CCCGAAAACCGAAAACCG u 正股(F’） 5r GTTTATTTTGGGTTTGGGGTTGTG 3, 反股5r CACCCAAAAACCAAAAACCAC 3f NKX6.1 u 正股(F’） 5f CGTGGTCGTGGGATGTTAGC 3， 反股(R’） 5，ACAAACAACGAAAAATACGCG 3' 正股(F) 5f GTGTGGTTGTGGGATGTTAGTG 3r 反股(R’) 5f CAACAAACAACAAAAAATACACAAC 31 WT1 正股(F丨）5f TGTTGAGTGAATGGAGCGGTC 反股(R1) 5，CGAAAAACCCCCGAATATAAACG 3r

U 正股(F’） 5f GTTGTTGAGTGAATGGAGTGGTTG 3， 反股(R》5，AATTACAAAAAACCCCCAAATATAAACAC 3 丨 (SEQIDNo: 17) (SEQ ID No: 18) (SEQ ID No: 19) (SEQ ID No: 20) (SEQ ID No:21) (SEQ ID No: 22) (SEQ ID No: 23) (SEQ ID No: 24) (SEQ ID No: 25) (SEQ ID No: 26) (SEQ ID No: 27) (SEQ ID No: 28) (SEQ ID No: 29) (SEQ ID No: 30) 引子種類M代表可專一辨認甲基化基因序列的MSP引子。 引子種類U代表可專一辨認非甲基化基因序列的MSP引子 15 200831900 所有的樣本均進行至少兩次獨立的亞硫酸鹽修飾作用及甲基化特異性 PCR，在使用可專一辨認甲基化基因序列的MSP引子(Μ)所進行的PCR反 應中，若同一樣本無法合成出PCR產物兩次以上，則視為該樣本不具甲基 化；將使用可專一辨認甲基化基因序列的MSP引子(M)所擴增之PCR產物 選殖到pCR4-T0P0載體(lnvitr〇gen，Carlsbad，CA)中，選取至少5個獨立的 選殖株(clones)進行亞硫酸鹽定序(BS)，亞硫酸鹽定序(BS)所使用的引子如 表二所示’使用377自動定序儀(Applied Biosystems，Foster City，CA)進行亞

硫酸鹽定序。 Ο 表二亞硫酸鹽定序(BS)所使用之引子的序列 基因名稱 引子種類 引子序列 ''' .............................·Γ_,ι.—__.丨丨…丨，丨， — S0X1 正股(F’）5' 反股(R’）5'

LMX1A 正股(Ff) 5' 反股(R) 5' 0NECUT1 正股(P) 5, 反股(R〇 5' ΡΑΧ1 ΝΚΧ6.1 WT1 BS1 正股(Ff) 5, 反股(R〇 BS2 正股(F1) S' 反股(R》5' BS1 正股(P) 5, 反股(R，）5' BS2 正股(F1) 5, 反股(R) 5' 正股(F) 5, 反股5' GTTGTTTTYGGGTTTTTTTTTGGTTG 3， (SEQ ID No： 31) ATTTCTCCTAATACACAAACCACTTACC (SEQ ID No: 32) TAGTTATTGGGAGAGAGTTYGTTTATTAG 3r (SEQ ID No： 33) CTACCCCAAATCRAAAAAAAACAC 3,_(SEQ ID No： 34) GAGTTTATTTAAGTAAGGGAGG 3r (SEQ ID No： 35) CAACTTAAACCATAACTCTATTACTATTAC 3f (SEQ ID No： 36) GTGTTTTGGGAGGGGGTAGTAG 3f (SEQ ID No： 37) CCCTCCCRAACCCTACCTATC 3,_(SEQ ID No： 38) GATAGAAGGAGGGGGTAGAGTT 3f (SEQ ID No： 39) TACTACCCCCTCCCAAAACAC 3f_(SEQ ID No： 40) GGTATTTTTGGTTTAGTTGGTAGTT 3r (SEQ ID No： 41) AATACCCTCCATTACCCCCACC 3f_(SEQ ID No: 42) GGTGGGGGTAATGGAGGGTATT 3r (SEQ ID No： 43) CCTAAATTATAAATACCCAAAAAC 3f (SEQ ID No： 44) —-~ ........ .... 1 ----------- _ - 一 GTGTTGGGTTGAAGAGGAGGGTGT 3r (SEQ ID No： 45) ATCCTACAACAAAAAAAAATCCAAAATC 3/ (SEQ ID No： 46) 四、經由5’_雜氮-2’-脫氧胞苷(5’_aza_2’-deoxycytidine)處理，使甲基化基因 在子宮頸癌細胞株内再表現 16 200831900 首先在HeLa子宮頸癌細胞株中，以甲基化特異性pcR (Msp)測試可能 具有高度甲基化的基因之甲基化狀態，並選出具有甲基化的基因。再將故^ 子宮頸癌細胞株以10 μΜ的DNA甲基轉移酶抑制劑 5’-aZa-2’-de〇XyCytidine (Sigma Chemical Co·)處理 4 天，使細胞株中原本因甲 基化而不表現的基因可重新表現，並以RT_PCR分析基因的表現；使用 - Qmgen RNeasy kit (Qiagen，Valencia，CA)抽取總 rna (total RNA)，並加入 - DNase 1以去除掉DNA的污染；每一樣本取1 pg total RNA以Superscript II 反轉錄酶（reverse transcriptase)及6鹼基隨機引物（random hexamer)(Invitrogen)進行 cDNA 合成；合成的 cDNA 以 PCR master mix reagents kit (Applied Biosystems)進行PCR擴增，並置於溫度循環反應器 (thermal cycler，GeneAmp 2400 PE，Applied Biosystems)中反應，擴增後的 cDNA再以RT-PCR分析基因的表現，各目標基因所使用的RT-PCR引子如 表三所示。 表三RT-PCR所使用之MSP引子的序列 基因名稱 引子種類 引子序列 S0X1 正股(F·) 5, AGACCTAGATGCCAACAATTGG 37 (SEQ ID No: 47) 反股(R’） 5, GCACCACTACGACTTAGTCCG 3f (SEQ ID No: 48) LMX1A 正股(F》 5f GCTGGTTCTGCTGCTGTGTCT 3f (SEQ ID No: 49) 反股(R：) 5, ACGTTTGGGGCGCTTATGGTC 3r (SEQ ID No: 50) 0NECUT1 正股(F·) 5, CAAACCCTGGAGCAAACTCAA 3r (SEQ ID No; 51) 反股(R〇 5r TGTGTTGCCTCTATCCTTCCC 3; (SEQ ID No: 52) PAX1 正股(F’） 5f CCTACGCTGCCCTACAACCACATC 3f (SEQ ID No: 53) 反股(RD 5, TCACGCCGGCCCAGTCTTCCATCT 3f (SEQ ID No: 54) NKX6.1 正股(F*) 反股(R〇 5, CACACGAGACCCACTTTTTCC 3f CCCAACGAATAGGCCAAACG 3, (SEQ ID No: 55) (SEQ ID No: 56) WT1 正股(F·) 5, GCTGTCCCACTTACAGATGCA 3f (SEQ ID No: 57) 反股(R) TCAAAGCGCCAGCTGGAGTTT 3; (SEQ ID No: 58) 17 200831900 五、人類乳突病毒(HPV)的偵測 以LI consensus PCR及反向線點雜交技術(reverse line blot)偵測鱗狀細 胞癌(SCC)中是否有人類乳突病毒(HPV)DNA的出現，若有超過該雜交技術 分析範圍的結果，則以DNA定序確認新型人類乳突病毒(novel HPV type) 之序列。 六、統計分析 以統計軟體SAS version 9.1進行數據分析，基因的甲基化與各臨床參 數(包括HPV狀態)之間的關係，係使用f測試(X2 test)及費雪氏準確檢定 (Fisher’s exact test)計算’並以羅吉斯迴歸模型(logistic regression model)計算 並調整年齡與HPV感染的勝算比(Odds ratios，ORs)以及95%信賴區間 (confidence intervals, CI)，統計的顯著水準(the alpha level of statistical significance)訂為；7 = 〇·〇5 ;並計算使用HPV及甲基化標記(markers)以診斷 子宮頸病變的靈敏度(sensitivity)及專一性(specificity)。 實施例二子宮頸癌甲基化指標基因之篩選 藉由CpG島微陣歹彳(CpG island microarrays)進行差異甲基化雜合反應 (DMH)，以篩選出在子宮頸鱗狀細胞癌(sec)内具有高度曱基化之基因； CpG島微陣列(CpG island microarrays)結果顯示，子宮頸癌組織樣本與正常 子宮頸抹片樣本之間，共有216個點具有差異性甲基化，去除掉序列重複 者之後’付到26個基因啟勢子區域CpG島(promoter CGIs)。 針對這些基因啟動子進行定序及分析，並挑選出6個基因，這些基因 包含·· S0X1(SEQ Π) No: 1)、PAX1(SEQ ID No: 2)、LMX1 A(SEQ ID No: 3)、 NKX6-1(SEQ ID No: 4)、WT1(SEQ ID No: 5)以及 0NECUT1(SEQ ID No: 200831900 6)，其詳細資料如表四所示；由表四可知，這六個基因都是在發育過程中重 要的轉錄因子(transcription factors)，SOX 卜 PAX1、LMX1A、NKX64、 wti分別對大腦、神經版(roofpiate)、四肢、胰島以及泌尿生殖器的發育很 重要，0NECUT1對肝臟及▲臟基因的表現很重要，但目前卻很少有研究顯 示這些基因與癌症的關連。

UniGene --BE_^ 染色體定位 基因名稱 S0X1 _〇〇5986 13q34 PAX1 NM—006192 20pll.2 基因全名 已知之基因功能 Sex determining DNA binding region Y-box 1 Transcription factor activity Paired box gene DNA binding LMX1A NM_177398 Iq22-q23 LIM homeobox Transcription factor activity transcription Zinc ion binding --—_____factor 1 alpha NKX6 1 NM—006168 4q21.2-q22 NK6 Transcription factor activity transcription factor related

ONECUT1 _____locus 1_ NM 004498 15q21 · 1 -q21.2 One cut domain Transcription factor activity family member Transcriptional activator _ ___1_activity_ NM_024426 llpl3 Wilm?s tumor 1 Transcription factor activity

針對上述各基因轉錄起始點(+1)前後各約500 bp核苷酸進行CpG序列 分析，如圖一所示，各基因中具有CpC}序列者以Γ |」標示，並針對各基 因設計其MSP引子(如表一所示)及亞硫酸鹽定序(BS)引子(如表二所示），各 目標基因進行甲基化特異性PCR (MSP)以及亞硫酸鹽定序(BS)所合成的片 段位置也標示在圖一中。 19 200831900 接著對混合的子宮頸癌組織樣本(3〇個樣本混合)與混合的正常子宮頸 抹片樣本(ίο個樣本混合)進行甲基化特異性PCR (MSp)，以確認這6個基 因的甲基化現象在不同的組織樣本令是否具有差異，結果如圖二所示，這6 個基因纽合的子宮賴組織樣本巾均存在甲基化現象(如圖二第2棚所 示），而在混合的正常子宮頸抹片穌中則沒有甲基化現象(如圖二第i棚所 -示）；進-步以個別的子宮頸癌組織樣本進行測試，取4個子宮頸癌組織樣 - 本(丁1 丁2、丁3、丁4)及4個正常樣本(Nl、N2、N3、N4)進行甲基化特異性 (，PCR(MSP) ’分別以可專一辨認非甲基化基因序列的MSP引子(U)，以及可 專-辨認甲基化基因序列的MSP引子(M)進行甲基化特異性pCR (Msp)， 結果如圖三所示，此六個基因在個別的子宮頸癌組織樣本中均具有甲基化 現象(如圖三第卜3、5、7攔獅)，關樣的基因在正常樣本巾則偵測不 到甲基化現象的發生(如圖三第9、1卜13、15欄所示）；根據上述結果，將 此6個基因作為筛檢子宮頸癌之甲基化指標基因。 實施例X子宮頸癌細跑株内DNA甲基化與基因表現的相關性

為了確認子宮頸癌甲基化指標基因的表現是否透過DNA甲基化作用 來調節，以10μΜ的DNA甲基轉移酶抑制劑5，_aza_2，_de〇xycytidine(AZQ (Sigma Chemical Co‘)處理HeLa子宮頸癌細胞株4天，再以甲基化特異性 PCR(MSP)檢查上述6個基因啟動子去甲基化的情況；分別以可專一辨認非 甲基化基因序列的MSP引子⑼，以及可專-辨認甲基化基因序列的MSp 引子(Μ)進行甲基化特異性PCR (MSP)，結果如圖四A所示，未處理 5’-aZa-2’-de0XyCytidine (AZC)之 HeLa 子宮頸癌細胞株(AZC_)中，6 個目標 基因均具有甲基化現象(如圖四A第1攔所示)，且摘測不到未甲基化的基因 200831900 (圖A第2攔所示)，而在處理s^^^deoxycytidine (AZC) 4天之HeLa 子宮頸癌細胞株(AZC+)中，則可_到未甲基化的目標基因(如圖四A第4 攔所示）’顯示經過甲基轉移酶抑制劑5,條2，‘〇χ_— (AZC)處理後 的子宮頸癌細胞株中，上述6個目標基因均有部分已去除甲基化。 再以RT-PCR分析這6個基因在HeLa子宮頸癌細胞株中的表現，結果 如圖四B所不’經5’_aza_2’:de〇xycytidine (Azc)處理後的細麟中，均可 . 摘測到這6個目標基因的mRNA (如圖四b第6攔所示），而未經 Γ 5’-’2’-deoxyc_ine (AZC)處理的細胞株中，測不到任何一個目標基 因的mRNA (如_ B第5攔所示），由結果可知，這六個目標基因在子宮 頸癌細胞中，確實會經由DNA甲基化作用來調節其基因表現，當基因具有 甲基化現象時，基因的表現會受到抑制，去除甲基化作用之後，目標基因 又會開始表現。 另以亞硫酸鹽定序(BS)分析目標基因在HeLa子宮頸癌細胞株中是否存 在高度甲基化（hypermethylation)現象，結果如圖五所示，未經 )^鲁以㈣鄉—⑽⑽理的細胞株㈤五⑸中’目標基因高度甲基 化的樣本數比經過5,姻J’-deoxycytidine (AZC)處理的細胞株(圖五B)要來 .❹；同樣以亞硫酸鹽定序(BS)分析子宮頸鱗狀細胞癌(scc)及正常樣本， 結果則如圖六所示，在子宮頸鱗狀細胞癌(scc)(圖六A)樣本中，目標基因 高度甲基化的樣本數也明顯較正常樣本(圖六B)來的多。 實施例四臨床子宮頸樣本内目標基因的甲基化分析 請參閱表五，正常樣本、低度鱗狀細胞上皮内病變(lsil)、高度鱗狀細 胞上皮内病變(HSIL)以及鱗狀細胞癌(scc)樣本的平均年齡分別為5i〇 土 200831900 11 ·3、39.7 土 9·6、46·4 士 14.4 以及 53.3 士 1〇·9 歲(ρ<0·05);樣本中高危險 pjpv DNA呈現陽性的比率各為··正常樣本21.4%，低度鱗狀細胞上皮内病變 (LSIL)樣本47.7%，高度鱗狀細胞上皮内病變(HSIL)樣本59.3%，鱗狀細胞 癌(SCC)樣本88.9%。結果顯示，感染HPV的病患較易罹患不同嚴重程度的 子宮頸病變(LSIL、HSIL ' SCC樣本的勝算比各為3·1、5.2、29·9 ; 95%信 •賴區間各為 1.1-8.3、2.1-13.0、11.5-77.7)。 - 在不同嚴重程度的子宮頸病變樣本中，以甲基化特異性PCR (MSP)分 f 析目標基因的甲基化狀態，目標基因的甲基化狀態及人類乳突病毒(册乂) 的有無之分析結果如表五所示，SOX卜PAX卜LMX1A、NKX卜1、Α\ΓΓ1 以及ONECUT1這6個基因在鱗狀細胞癌(SCC)中均具有高頻率甲基化現 象，各基因在鱗狀細胞癌(see)樣本中甲基化的比例分別為·· 81.5%、94.4%、 89.9%、80.4%、77.8%以及20_4〇/。；而在正常子宮頸樣本中各基因甲基化的 比例則分別為：2.2%、〇%、6·7%、11.9%、ιι·1% 以及 〇% ② $〇 〇〇1); 因此，與正常子宮頸樣本比較，這6個基因在鱗狀細胞癌(scc)樣本中被甲 基化的情況明顯高出許多。 。 NKX6-1基因曱基化的頻率在LSIL樣本中為53·3%，在膽l樣本中 • 為55·1〇/。，在SCC樣本中則為_% ;統計結果顯示，具有基因 曱基化現象的病患罹患鱗狀細胞癌(SCC)的風險較高(勝算比為29 8,95%信 賴區間為1〇·4_85·2)。 ° ΡΑΧ1基gm化的辦在LSIL樣本巾為2 3%，在祖樣本中為 42.1%，在SCC樣本中則為94.4% ;統計結果顯示，具有ρΑχι基因甲基化 現象的病患’罹患高度鱗狀細胞上皮内病變卿L)及鱗狀細胞癌(scc)的風 22 200831900 險較高(hsil 0·1->999·9) 〇 以及SCC樣本的勝算比均為>999·9 ; 95%信賴區間為< X及ONECUT1三個基因在癌前病變(precancer〇us ,)的樣本中甲基化的頻率很低，但在册正樣本及scc樣本中甲基化 的頻率則大中田增加，分別為9 3%及&抓、祕及、7·概及跑％ ; 統木。果如’具有s〇Xl、⑽篇或⑽^⑶了丨基因甲基化現象的病患， .罹患々狀細胞癌(SCC)的風險較高(三者的勝算比分別為200.2'124.5、7.3 ; Γ 95%信賴區間分別為 25·8_999·9 ' 33.G-47(U、2飢9)。 WT1基因甲基化的頻率隨著病變嚴重程度增加而增加，在正常樣本中 WT1基因甲基化的頻率為n 1%，在[肌樣本巾為则％，在HSIL樣本 中為42.1%’在scc樣本中則為77:8%;統計結果顯示，具有醫基因甲 基化現象的病患’罹患高度鱗狀細胞上皮内病變卿l)及鱗狀細胞癌卿） 的風險权同(兩者的勝算比分別為6·7、27·9;跳信賴區間分別為a·、 9.8-78.9) 〇 DNA甲基化指標的診斷表現 分析DNA甲基化的靈敏度(_出_)以及專一性(specifid⑺，以決定 目k基因疋何作為高度子宮賴病變以及子宮顧_檢的生物指標，分 析、”。果如表八所示，以HPV測試來I帛檢樣本有無鱗狀細胞癌(SCC)的靈敏 度及專-性分別為83.1%以及私5% (其9州信舰間則分別為77 6·88 5以 及79.6-91.4);而分析S(m、ΡΑΧ卜LMX1A、船61以及wti這$個 基因的甲基化狀態以篩檢鱗狀細胞癌(SCC)的有無，各基因甲基化狀態對鱗 狀細胞癌(see)的靈敏度則為77.8%_94.4%，其專—性為881%_1〇〇% :當同 時合併卿職與個別甲基化指標基因來檢測疾病時（_bined pa· 23 200831900 testing，CPT)，意即只要聊測試或任一甲基化指標基因的測試結果為陽 性，則認定該測試樣本的子宮頸癌篩檢結果為陽性，其靈敏度介於 97.2〇/〇-98.2〇/〇^#^^^ 66·7〇/-79.5〇/〇 ； testing，CST) HPV測試與個別甲基化指標基因時，意即首先進行測 試，並對HPV測試呈陽性反應之樣本^^行各指標基_曱基化狀態摘測， ^ 其靈敏度介於69.4%~85,0%，而所有測試的專一性均為100%。 - #同時以高度鱗狀細胞上皮内病變卿L)以及鱗狀細胞癌(scc)診斷 標的時，以測試來篩檢樣本有無HSIL或SCC的靈敏度及專一性分別 為75.0%以及85·5% (其95%信賴區間則分別為7〇 2-79·8以及79 6 91 4); 而分析SOX卜PAX卜LMX1A、ΝΚΧ6-1以及WT1這5個基因的甲基化 狀態以筛檢樣本有無HSIL或SCC :各基因甲基化狀態對腦匕或似的 靈敏度則介於57·4%_76·2%，其專-性介於881%•獅％ ;當同時合併Hpv 測試與個別甲基化指標基因來檢測疾病時（cpT)，其靈敏度可增加到 85·8%-94·9〇/。’·而當循序合併（CST)册⑽試與個別甲基化指標基因時， 所有測试的專一性均為100。/。；當同時合併（CPT) Hpv測試與S〇xl、 P PAX卜LMX1A三個基因的甲基化狀態測試，以篩檢樣本有無鱗狀細胞癌 - (SCC)時’其靈敏度可達100%，而以相同方法篩檢樣本中有無HSIL或SCC 時，其靈敏度則為93.4%。 在以個別甲基化指標基因篩檢鱗狀細胞癌(scc)的結果中，以單獨檢測 PAX1基因曱基化狀態料檢樣本巾有無鱗狀細胞癌(scc)的錄度為最 高，其靈敏度可達94.4%(其95。/。信賴區間為90.0-98.8)，同樣的，以PAX1 基因甲基化狀態篩檢樣本中有無HSIL或SCC的靈敏度也可達到76.2% (其 95%彳g賴區間為69.7-82.7)，而兩個測試的專一性則均為。 24 200831900 HPV 9/42 (21.4%) 21/44 (47.7%) 3.3 (1.3-8.6) 3.1 (1.1-8.3) 32/54 (59.3%) 5.3 (2.1-13.3) 5.2 (2.1-13.0) 96/108 (88.9%) 29.3 (11.3-75.8) 29.9 (11.5-77.7) ^<0.0001 ONECUT1 0/45 (0%) 3/45 (6.7%) 4/54 (7.4%) 2.3 (0.5-10.8) 2.3 (0.5-10.8) 22/108 (20.4%) 7.4 (2.1-25.7) 7.3 (2.0-25.9) 尸=0.001 WT1 5/45 (11.1%) 9/45 (20.0%) 2.0 (0.6-6.5) 2.7 (0.8-9.3) 24/57 (42.1%) 5.8 (2.0-16.9) 6.7 (2.2-19.8) 84/108 (77.8%) 28.0 (10.0-78.8) 27.9 (9.8-78.9) /?<0.0001 NKX6-1 5/42 (11.9%) 24/45 (53.3%) 8.5 (2.8-25.5) 9.6 (3.1-30.4) „ 27/49 (55.1%) 9.1 (3.1-27.0) 9.6 (3.2-29.1) 86/107 (80.4%) 30.3 (10.6-86.5) 29.8 (10.4-85.2) p<omoi LMX1A 3/45 (6.7%) 6/45 (13.3%) 2.2 (0.5-9.2) 2.2 (0.5-9.7) 8/50 (16.0%) 2.7 (0.6-10.7) 2.7 (0.7-10.9) 98/109 (89.9%) 124.7 (33.1-469.9) 124.5 (33.0-470.1) 尸 <0.0001 PAX1 0/41 (〇%) 1/44 (2.3%) .24/57 (42.1%) >999.9 (<0.1 - >999.9) >999.9 (<0.1->999.9) 101/107 (94.4%) >999.9 (<0.1 - >999.9) >999.9 (<0.1- >999.9) 尸 <0.0001 SOX1 1/45 (2.2%) 2/45 (4.4%) 2.0 (0.2-23.4) 3.1 (0.3-36.7) 5/54 (9.3%) 4.5 (0.5 - 39.9) 5.1 (0.6-45.9) 88/108 (81.5%) 193.5 (25.2-1000) 200.2 (25.8-999.9) ^<0.0001 樣本 正常（η = 45) LSIL (η = 45) 勝算比 (95%信賴區間） 勝算比* (95%信賴區間） HSIL (η = 58) 勝算比 (95%信賴區間） 勝算比* (95%信賴區間） SCC (η= 109) 勝算比 (95%信賴區間） 勝算比* (95%信賴區間） 統計 ^雄^1-傘^涨嚼 AdH^t^ik* 200831900 高度鱗狀細胞上皮内病變(HSIL) /鱗狀細胞癌(SCC) 專一性 (95%信賴區間） (79.6-91.4) (93.0-100.0) (63.3-89.1) (100.0-100.0) (100.0-100.0) (66.8-92.2) (100.0-100.0) (85.1-100.0) (57.8-85.1) (100.0-100.0) (80.7-99.3) (55.8-84.2) (100.0-100.0) (78.3-97.9) (52.4-80.9) (100.0-100.0) 勝算比 85.5 97.6 76.2 100.0 100.0 79.5 100.0 92.9 71.4 100.0 90.0 70.0 100.0 88.1 66.7 100.0 靈敏度 (95%信賴區間） (70.2-79.8) (49.8-65.0) (80.4-91.2) (42.9-58.3) (69.7-82.7) (85.0-94.3) (58.0-72.5) (59.3-74.0) (84.5-94.1) (50.8-66.2) (65.4-79.5) (91.4-98.3) (51.3-66.7) (58.2-72.7) (85.8-94.8) (46.3-61.5) 勝算比 75.0 57.4 85.8 50.6 76.2 89.6 65.2 66.7 89.3 58.5 72.4 94.9 59.0 65.5 90.3 53.9 專一性 (95%信賴區間） (79.6-91.4) (93.0-100.0) (63.3-89.1) (100.0-100.0) (100.0-100.0) (66.8-92.2) (100.0-100.0) (85.1-100.0) (57.8-85.1) (100.0-100.0) (80.7-99.3) (55.8-84.2) (100.0-100.0) (78.3-97.9) (52.4-80.9) (100.0-100.0) 鱗狀細胞癌(see) 勝算比 85.5 97.6 76.2 100.0 100.0 79.5 100.0 92.9 71.4 100.0 90.0 70.0 100.0 88.1 66.7 100.0 靈敏度 (95%信賴區間） (77.6-88.5) (74.2-88.8) (95.6-100.0) (63.8-80.7) (90.0-98.8) (95.6-100.0) (78.3-91.8) (84.3-95.6) (95.7-100.0) (73.3-88.1) (72.9-87.9) (95.6-100.0) (62.4-79.6) (69.9-85.6) (94.1-100.0) (60.8-78.1) 勝算比 83.1 81.5 98.1 72.2 94.4 98.1 85.0 89.9 98.2 80.7 80.4 98.1 71.0 77.8 97.2 69.4 測試方式 單獨測試 單獨測試 CPT CST 單獨測試 CPT CST 單獨測試 CPT CST 單獨測試 CPT CST 單獨測試 CPT CST 生物標記 HPV SOX1 PAX1 LMX1A NKX6-1 WT1 VIXm+ Ρ·ε8-8Ί75) Γ69 (ε·卜 6 丨寸CK8) 寸·£6Ρ·ε8_00·κ) S9 (ooosooi) 0001 Idur—ίχνΐ IXOS+

As 200831900 實施例五卵巢腫瘤樣本内目標基因的甲基化分析

以甲基化特異性PCR (MSP)分析目標基因在卵巢腫瘤樣本中的甲基化 狀態，目縣基錄態分機果如表七_，分各卵巢腫^樣 本中SOX1、PAX1以及LMX1A這3個基因的甲基化狀態，結果顯示， SOX卜PAX1以及LMX1A這3個基因在所有_巢良性腫瘤及_巢邊緣 性腫瘤樣本内，均不具甲基化現象；而在㈣惡性腫瘤樣本中，這3個基 因甲基化的頻率則大幅增加，S0X1基因甲基化的頻率$ 55·7%，ρΑχι基 因甲基化的頻率為49.2%，LMX1A基因甲基化的頻率則為32舰。 (i 表七 腫瘤樣本中目標基因的甲基化狀態分析

SOX1 PAX1 1 *---—---- !P良色gj色(n=36) 0/36 (0,0%) 0/36 (0.0%)

實施例六肝細胞樣本内目標基因的甲基化分析 以甲基化特異性PCR (MSP)分析目標基因在肝細胞樣本中的甲基化狀 "目‘基因的甲基化狀_分析結果如表人所示，在正常肝細胞樣本中 SOX1基因甲基化的頻料7 7%，她之下，具有異常病變崎細胞樣本 中SOX1基因甲基化的頻率則大幅提高，在慢性肝炎樣本、肝硬化樣本以 及肝癌樣本中，S〇Xl基因甲基化的頻率分別為33.3%、27.5%、53.7%。另 外’在正常肝細胞樣本巾腦⑹基因甲基化的頻率_)也明顯比在肝癌 27 200831900 樣本中NKX6-1基因甲基化的頻率(57%)低。

本發明所提供之癌症診_方法，與前述習用技術相互比㈣，更具

1·本發明所提供之癌症篩_方法係讀财特絲因的甲基化程产作 為癌症有無的診斷指標，與制子宮頸抹片及人類乳突病毒檢驗(HPV =ng)方紐較，本發明之癌症輯方㈣賴性及專—性均較前述兩者 局0 2. 本發明所提供之癌症篩檢的方法除了可作為第—線子宮的筛檢之 外，亦可合併或輔助人類乳突病毒檢驗(HpVtesting)檢驗，作為第二線子宮 頸癌的篩檢，以達到更準確之子宮職篩檢效果。 3. 本發明所提供之癌症診_方法除可細在子宮_的檢耻，亦可應 用於其他癌症(如W肝癌)的檢測，以輔助異常檢體之診斷。， 上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例 並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實 28 200831900 施或變更’例如：受測者檢體中各目標基因甲基化程度的觸方式等變化 之等效f生貫施例，均應包含於本案之專利範圍中。 ”、不上所述’本案所提供之癌症診斷的方法確屬創新，並能較習用子宮 員癌方柳進上述多項功效，應已充分符合新穎性及進步性之法定發 月專利要件，級法提出申請，懇請f局核准本件發明專利巾請案，以 勵發明，至感德便。 【圖式簡單說明】 ( ®—為本發明癌症篩檢方法所使狀各目標基_〇^序列分析，各 f因中具有CPG序列者以「I」標示；各基因MSIM丨子合成片段位置以「_」 標示；各基因亞硫酸鹽定序(BS)引子合成片段位置以「㈠」標示； 圖二為針對本發明癌症篩檢方法所使用之各目標基因，在混合的子宮 頸癌組織樣本(3〇個樣本混合)與混合的正常子宮頸抹片樣柳個樣本混幻 中，進行甲基化特異性PCR (MSP)分析之結果；帛丨攔為混合的正常子宮 頸抹片樣本(10個樣本混合），第2欄為混合的子宮頸癌組織樣本⑼個樣本 」混合)，第3攔為陰性對照組(negative幅rol)，第4攔為陽性對照組㈣ control)，第5攔為空白對照組(水）； 圖三為針對本發明癌㈣檢方法所使狀各目標基因，在個別的子售 頸癌組織樣本與個別的正常子宮頸抹片樣本中，進行甲基化特異性pcf (MSP)分析之結果，T1、T2、T3、T4代表4個個別的子宮頸癌組織樣本， 奶、Ν2、Ν3、Ν4代表4個個別的正常樣本，標示υ之棚位表示以可專一 辨認非甲基化基因序列的MSP引子(U)進行甲基化特異性pCR (MSp)之結 果，標示Μ之攔位表示以可專-辨認甲基化基因序列的引子⑽進行 甲基化特異性PCR (MSP)之結果； 29 200831900 圖四A為針對本發明癌症篩檢方法所使用之各目標基因，在沒有處理 5’-aza-2’-deoxycytidine 之 HeLa 子宮頸癌細胞株中(AZC-，第 1、2 攔），以 及有處理5’-aza-2’-deoxycytidine之HeLa子宮頸癌細胞株中(AZC+，第3、 4欄），進行甲基化特異性PCR(MSP)分析之結果；標示^^之欄位表示以可 專一辨認非甲基化基因序列的MSP引子(U)進行甲基化特異性PCR (Msp) 之結果，標示Μ之攔位表示以可專一辨認甲基化基因序列的MSp引子(μ) 進行甲基化特異性PCR (MSP)之結果； 圖四B為針對本發明癌症篩檢方法所使用之各目標基因，在沒有處理 5’-aza-2’-deoxycytidine之HeLa子宮頸癌細胞株中(AZC-，第5欄），以及有 處理5’-aza-2’-deoxycytidine之HeLa子宮頸癌細胞株中(AZC+，第6攔）， 進行RT-PCR分析之結果； 圖五A為針對本發明癌症篩檢方法所使用之各目標基因，在沒有處理 5’-aza-2’-deoxycytidine之HeLa子宮頸癌細胞株中，進行亞硫酸鹽定序(Bs) 分析之結果； 圖五B為針對本發明癌症篩檢方法所使用之各目標基因，在有處理 5’-aza-2’-deoxycytidine之HeLa子宮頸癌細胞株中，進行亞硫酸鹽定序(bs) 分析之結果； 圖六A為針對本發明癌症篩檢方法所使用之各目標基因，在子宮頸鱗 狀細胞癌(SCC)中，進行亞硫酸鹽定序(BS)分析之結果；以及 圖六B為針對本發明癌症筛檢方法所使用之各目標基因，在正常樣本 中，進行亞硫酸鹽定序(BS)分析之結果。 【主要元件符號說明】 無 30

Claims (1)

1. 200831900 十、申請專利範圍： 種癌症篩檢的方法，係檢測受測檢體細胞中目標基因甲基化的狀態， 以作為癌症有無的篩檢指標，該方法包含下列步驟·· 步驟1提供一受測檢體； γ驟2私測该受測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因的序 列甲基化狀態，該目標基因係由S0X1、PAX1、LMX1A、 NKX64、WT1以及ONECUT1所組成；以及 步驟3根據該目標基因甲基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有癌症 或癌前病變病變。 2·如申請專利範圍第1項所述之癌症篩檢的方法，其中該受測檢體為子宮 頸抹片、腹水、血液、尿液、糞便、痰、口腔黏膜細胞、胃液、膽汁、 子宮頸上皮細胞等。 3·如申請專利範圍第1項所述之癌症篩檢的方法，其中該目標基因的CpG 序列甲基化狀態檢測方法為甲基化特異性聚合酶連鎖反應 (methylatiompedfic PCR，MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應 (quantitative methylation-specific PCR，QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing，BS)、微陣列(inicroarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)、 變性咼效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography， DHPLC)、焦填酸定序(pyrosequencing) 〇 4·如申請專利範圍第1項所述之癌症篩檢的方法，其中該目標基因s〇xi 係具有如SEQ ID No: 1所示之核皆酸序列。 5·如申請專利範圍第1項所述之癌症篩檢的方法，其中該目標基因MX1 係具有如SEQ ID No: 2所示之核皆酸序列。 31 200831900 6. 如申請專利範圍第！項所述之癌症篩檢的方法，其中該目標基因腫认 係具有如SEQ ID No: 3所示之核苷酸序列。 7. 如申請專利範圍第！項所述之癌症篩檢的方法，其中該目標基因祖^ 係具有如SEQ ID No: 4所示之核苷酸序列。 8·如申#專利範圍第1項所述之癌症|帛檢的方法，其中該目標基因贾^ 係具有如SEQ ID No: 5所示之核苷酸序列。 9.如申請專職圍帛1項所述之癌症_檢的方法，其中該目標基因 p 0NECUT1係具有如SEQIDN〇:6所示之核苷酸序列。 10·—種子宮頸癌篩檢的方法，係檢測受測檢體細胞中目標基因甲基化的狀 悲，以作為子呂頸癌有無的篩檢指標，該方法包含下列步驟： 步驟1提供一受測檢體； 步驟2檢測該受測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因的CpG序 列曱基化狀態’該目標基因係由SOXl、PAX1、LMX1A、 NKX6]、wti以及ονεοιγι所組成；以及 步驟3根據目標基因曱基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有子宮頸 ^ 癌及癌前病變。 11·如申請專利範圍第10項所述之子宮頸癌篩檢的方法，其中該受測撿體為 子宮頸抹片、血液、尿液、子宮頸上皮細胞等。 12·如申請專利範圍第1〇項所述之子宮頸癌篩檢的方法，其中該受測檢體為 異常之子宮頸抹片。 13.如申請專利範圍第1〇項所述之子宮頸癌篩檢的方法，其中該受測檢體為 人類乳犬病毒檢驗(HPV testing)呈陽性(positive)之子宮頸細胞檢體。 14·如申請專利範圍第1〇項所述之子宮頸癌篩檢的方法，其中該目標基因的 32 200831900 CpG序列甲基化狀態檢測方法為甲基化特異性聚合酶連鎖反應 (methylation-specific PCR，MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應 (quantitative methylation-specific PCR，QMSP) ' 亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing，BS)、微陣列(mictOarrays)、質譜儀分析(mass spectr〇meter)、 變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography， - DHPLC)、焦磷酸定序(pyrosequencing)。 • i5·如申請專利範圍第丨〇項所述之子宮頸癌篩檢的方法，其中該目標基因 ζ SOX1係具有如SEQIDNo: 1所示之核苷酸序列。 16·如申请專利範圍第1〇項所述之子宮頸癌篩檢的方法，其中該目標基因 PAX1係具有如SEQIDNo:2所示之核苷酸序列。 17.如申請專利範圍第1()項所述之于宮頸癌篩檢的方法，其中該目標基因 LMX1A係具有如SEQ ID No: 3所示之核苦酸序列。 18·如申請專利範圍第1G項所述之子宮頸癌篩檢的方法，其中該目標基因 NKX6-1係具有如SEQIDN〇:4所示之核苷酸序列。 ^ I9·如申請專利範圍帛1〇項所述之子宮頸癌篩檢的方法，其中該目標基因 WT1係具有如SEQ ID No: 5所示之核苷酸序列。 20·如申請專利範圍第1〇項所述之子宮頸癌筛檢的方法，其中該目標基因 ONECUT1係具有如SEQ IDN〇: 6所示之核芽酸序列。 21.-種印巢癌_檢的方法，係檢測受測檢體細胞中目標基因甲基化的狀 態，以作切巢癌有無_檢指標，該方法包含下列步驟： 步驟1提供一受測檢體； 步驟2檢測該受測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因的CpG序 歹丨甲基化狀態，該目標基因係由soxi、PAX1、LMX1A所組 33 200831900 成；以及 步驟3根據目標基因甲基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有印巢癌 及癌前病變。 22. 如申請專利範圍第2丨項所述之印巢癌筛檢的方法，其中該受測檢體為腹 水、血液、尿液等。 23. 如申請專利範圍第21項所述讀巢麵檢的方法，其中該目標基因的 CPG序列甲基化狀態檢測方法為f基化特異性聚合酶連鎖反應 (methylation-spedfic PCR，MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應 (quantitative methylati〇n-speciflc PCR，QMsp)、亞硫酸鹽定序 sequencing，BS)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectr〇meter)、 變性高效液相色譜(denaturing hjgh-perf_ance ehr_t()graphy> DHPLC)、焦麟酸定序(pyroseqUencing) 〇 24·如申請專利範圍第21項所述之卵巢癌篩檢的方法，其中該目標基因 SOX1係具有如SEQ IDNo: 1所示之核苷酸序列。 25.如申請專利範圍第21項所述之卵巢癌篩檢的方法，其中該目標基因 PAX1係具有如SEQIDNo:2所示之核苷酸序列。 26·如申清專利範圍第21項所述之卵巢癌篩檢的方法，其中該目標基因 LMX1A係具有如SEqIDNo:3所示之核苷酸序列。 27·—種肝癌篩檢的方法，係檢測受測檢體細胞中目標基因甲基化的狀態，· 以作為肝癌有無的篩檢指標，該方法包含下列步驟： 步驟1提供一受測檢體； 步驟2檢測該受測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因wCpG序 列甲基化狀態，該目標基因係由SOX卜NKX6-1所組成；以及 34 200831900 步驟3根據目標基因甲基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有肝癌及 癌前病變。 28.如申請專利範圍第27項所述之肝癌篩檢的方法，其中該受測檢體為腹 水、血液、尿液、糞便、胃液、膽汁等。 29·如申請專利範圍第27項所述之肝癌篩檢的方法，其中該目標基因的CpG ^ 序列甲基化狀態檢測方法為甲基化特異性聚合酶連鎖反應 (methylation-specific PCR，MSP)、定量曱基化特異性聚合酶連鎖反應 （quantitative methylation-specific PCR，QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing，BS)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)、 變性咼效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography， DHPLC) ' 焦·酸定序(pyrosequencing) 〇 30. 如申請專利範圍第27項所述之肝癌篩檢的方法，其中該目標基因s〇Xl 係具有如SEQ ID No: 1所示之核苷酸序列。 31. 如申請專利範圍第27項所述之肝癌篩檢的方法，其中該目標基因 NKX6-1係具有如SEqIDN〇:4所示之核苦酸序列。 〇 35 200831900 序列表 <110〉賴鴻政 <120〉一種癌症篩檢的方法. <160> 58 <210> 1 . <211> 2300 <212> DNA <213〉人屬智慧種（Homo sapiens) <400〉 1 f

   tctccacaag cactctcatc tcagggtgcc tcggggaggg cagaggagga atacttgggc 60 tcaaaagtcg tctttggacc actttcagat cagtctggtg gaaacggtag tgtgagcgct 120 atgctacttg agactgcgtt tgaaaatctc tttcacgttc ccaaatcaaa gccactttga 180 ggtttaagaa tgataaccac aggtgaatgc cttactcttt ccacgagcca ggcctttcct 240 ttgcatgacg cagaccggcg gctgagaccc gtcctgaggc cccgcctttc attcggttta 300 tgtggccccg cgcagttcac gcagttttct ccgttcttag gcaaccagct cgtgggaaat 360 tcactccaga aaagcgtgcg ccatatcatt attttgcgat tcaacaaact ttttcaactg 420 ttgttcagga actagattcc agatagatct tgttgtgttc ggccttccta gaaattcctt 480 ttccagagga agaagatccg ggttgggaag agtgcgtgac tatggccccg ggctcattga 540 aagactcctc cccacaaaag tttagggctg atactaaacg aagctatgga gccatgccca 600 cacaaatact ccccctttac ccgaattgtg gggcctggac tgtgaaggcc ttcgctgcaa 660 gagcgggcac tggcgaactt cagtgcacgc cgcggccgag aacggatgca gggcggggga 720 tggctgagcc gcctgatcct tgcagagaac ctgcaggggc cctcggaggg tatcccctgc 780 gtccaaggga gcgcccctcc ttttcagcac tcgggggaac tgagggcgac gtgccagccc 840 cgcactcaac tttccccttc cctgcaggca cagagttggc cggcgggggc agaggaggag 900 ctgggtctcc actgcgcccg tttaaacctg gccaggggct gcgtttcctc cccccacccc 960 acgacgatcc tttcttagtc ttcgcttttc aacccaatcg ttaatcattc ggaacgcgcg 1020 ggcggggagc ggcgaggagg gcgagctcgg ggttcgccgc cgccgccgcc gccgcgcgcg 1080 cgcgctcagg aagcggtgtg gctgtcaccc cctcccgggc ctcctccccc ctccttcctg 1140 ctttgctccc cctccttcct cccctcctcc ccgctccgcc gcccgcgccc agtgtatcta 1200 ctccctcccc acgtcactcg ccagcgcgcc atgcaaatca ccgccgccgc cggctcccat 1260 tggccgcggc gcgctcattt aatggcagcc cgggcccggc gtatggctgc tgggccccgc 1320 gcgccgccgg ccccgcgtgc gcctccgctc cgagcgcacg gccccgggca ggcagcgggc 1380 agcccatccc gggctcggcg gccccggctc tccggccctc tccgcgagcc cgcgctcctc 1440. ccgctgtccc cgggcccctc cctggctgca ccgtaatcgc cccctgcagg cccccctgcg 1500 cctccccccc cccgccactg gcgcctggct tcccccgggc acctgggacc agcacatgcc’1560 cagcgcacgc ggcgcgccgc cctgc.tagaa gttgcagcct ccgagttgga ggccgctgag 1620 gaccgagcgc aggaggaagg agacagcgcg cagcggcggc cggcgaggag acagcacacc 1680 ccgggccggg cccagcgcac cgctcccggc cccaaaagcg gagctgcaac ttggccacga 1740 ctgcacctgt ttgcaccgct ccgccgaggg cgcctgggct gcggtggcgg cgaagacggc 1800 200831900 gaccccgacc gtcggcctct ttggcaagtg gtttgtgcat caggagaaac tttccacctg 1860 cgagccgaac cggcgccgag tgcgtgtgtt tctgcctttt tttgttgtcg ttgcctccac 1920 ccctccccat tcttctctcc gctaggaccc ccccgccccc gtctcactcc gtctgaattc 1980 ctctccgtct ccctcccacc ccggccgtct atgctccagg ccctctcctc gcggtgccgg 2040 tgaacccgcc agccgccccg atgtacagca tgatgatgga gaccgacctg cactcgcccg 2100 gcggcgccca ggcccccacg aacctctcgg gccccgccgg ggcgggcggc ggcgggggcg 2160 gaggcggggg cggcggcggc ggcgggggcg ccaaggccaa ccaggaccgg gtcaaacggc 2220 ccatgaacgc cttcatggtg tggtcccgcg ggcagcggcg caagatggcc caggagaacc 2280 ccaagatgca caactcggag 2300 <210> 2 <211> 1200 <212> DNA f

   <213〉人屬智慧種（Homo sapiens) <400> 2 agaaagacga ggccaggcca cctgggatag agtggtgcga gattccaccg ccagggagaa 60 aggaacttgt ccttcagacc tagagctgga gctatgcatt tggcctcccg ccggtcgcgc 120 ttggggacag gagggcgccg gatctatgcg ccccttagca gcagatcggg atccttttgc 180 ctcctgcccc ttctgtcact gcttggagag ggatgagttc tggtggctgg gcctggctgt 240 aggagacagg atttggaccg tgcccctctc gcatcaccga aatcaccccc actattccaa 300 gagtggttgg ctattaaacg tgaagatttc ctgagagaag gattgaggac ctggccagga 360 atgggacaca agttccgcct tgtgtcttcc tgacaggagc cctgcaccgc gctggacgct 420 caccttgaca ctcccagcca gctggggtac tgatcccacc cttccccggc cgctgccccg 480 ggagtgggga ggt^gagaga gccacacccg aaacaccttt ccacgataaa cttttattct 540 ctatcttatt attaatggtg gcggaaataa aactaaaacc aaaacgaaaa cgagtactag 600 tactaacaca ctaatcaatt tgagatgact tccccctcat tcccaaagct agaggaggaa 660 gggggctgaa aggggctcag agcagtggaa ggtcccaggc ccagctgggg ttgggacgtg 720 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tagaggggtg ggttccgggg 780 gggtggtgga agagggccga ggggggagga tagaaggagg gggtagagtt tcagggcggg 840 gaggggggcg ctggggcgca gtgacgggaa ccaatgagct gccaactcgc gcgtctccgg 900 cgtgactgcc gagattgacg tggaggacac gtcaaattga ttcccgcacg ctgcagcctc 960 ccggtcagac gaatttctcc caatcggatg aagttcaccc tgggcctggg gtcgcgggcg 1020 tggagagtgt cctgggaggg ggcagcagcg gcggcggcag gccctggagc gggcggcagc 1080 gcgctccgct gccgcgcaca gcgcgtctcc agcccgcggc tgggccgccg cggctctcgg 1140 ctctcgggcg ccctccctct atgcctctca cgcggcggcg gcggcgccca agctctcccg 1200 <210〉 3 <211> 2350 <212> DNA <213〉人屬智慧種（Homo sapien’s) 2 200831900 <400> 3

   agccccccgc ccagcgcacc ccaccccctc tccgccgccg cgcacgcagc gccgcggccc 60 ctgtcagaag ctgcaggatc cgccccggcg aagcagggcc gactcgcacc caggaccctg 120 ggcctctgcc ttccctccta gccttggaga agcaactggc cctctcctcc cgctgaggag 180 cgacgcgggc tggtaggacg tcccgggaag gccggcagct cgcgaccacg tcccggccca 240 gcctgggcgc gccgaggagc agagccagcg gccggcgttc gctccggctc cctccccggc 300 gctccgaagc cgagggcggc tcctccggct gcagtctcgg gggcgacgcc ttcccgggca 360 gaagcttcca gcagcgctcc gcaacttctc tctgctccag tcactgggag agagctcgcc 420 taccaggtaa gtaaggctgc ccgtgcctag gctgtggctc gggcgggcgt gtttctgaaa 480 gttgacttga aatgcatcca agagtgagcc gggccagccg gggctcctcc ccgaggcgac 540 tcttttgctt ctgcagacat tcccggcact ggccgactgg cgggaggacc tccccgcgcg 600 ccccgcacac cggctcctgc gcgcacccca acagagcgca gcgccaggag tccagaagcg 660 ggcgggacgc cctccgggtc ccttacagtg ccccttctcg acctggggca ggtgagggcc 720 gcaacggggc ggctgggacg cgggattgca aaccccatcg tcccgcgtgc ctggacccgg 780 tcgctcgagg gagggtaccc actctttata tacccaatat accccagtag ctgcgttcct 840 gcagagacgt cccgagggcc caccttcgta taggttgggg cggagtcgga ttcgggatgg 900 aaaacctggg gcaagggatg taggtggggg tgaggggggq aggagaagga gaaacgcagt 960 tggggggcgg aggcctaagt acataacgtg ttgacttcaa gtgaaatcag atcagccaga 1020 gcagttcgct gtgactgatc tctcctccca ccctacattc tcttggctgg accctatcct 1080 cctggctgat tctggtcgcc ctggacactc cctcagttct ttcccaggag tgcggtggct 1140 gctggcgccg agtcccagcg ggcacggacg tcagacgcat cgtttcttct cctctacagg 1200 tcctcccggc ccggcccgaa catgctggac ggcctaaaga tggaggagaa cttccaaagc 1260 gcgatcgaca cctcggcctc cttctcctcg ctgctgggtg agtgttcagg ccgtgcgtcc 1320 tgggcgcact ctctttccgc ttggcgctga gctctggagc cccgctctct gggacctggt 1380 ccgcgatagg gaagctagcg cccctcttca tacactaaat tgagccccat cactatctgt 1440 ccgtcagtgc ttgtgggtcg tccctaccca aataaatcca acaagccgcc ccaggcctca 1500 cgcactgggc accgaattcc ccaaagccgc gaggggcggg cgagcttgtt cgtaggcgtc 1560 tgagtggcaa gtgattaaaa atacccaggg ctggattttt aatctcggag ctgatcgacg 1620 tctcataaat gccgccctct tctcgcggcc tagaggcaat agcatccgag acccgaggcc 1680 tggagcgccc aagttcgagg aggcttctct cccccaccaa ctccagcccc aatttcagcc 1740 atgggcaagg ccgagagaga cttttctggg ccagtaggca acgcagcgcg gggattagac 1800 cgcgcggctg ggccctaggc tccgcgttaa ttaactggag ctggatgtcg ggtcctgtgg 1860 gtcccccctc acaactcctt tgcagcgaca gaggaggagc agcgagtcaa ggaccccgga 1920 agagtgtcca cacacgggtc ttgcagagct gaagccagag attctggtta cggctccccc 1980 acccactctg cccttggagc ttttcaagtt tgggaagccc gtattttatt ttattttatt 2040 ttatttattt atttttagca ggagggagtt ttccttctgt cctttaaacc tcttgcctct 2100 ttcactcgga accgctagag cggcatgaat gtggaggatg agacagttct gctggagaaa 2160 ccaaatccag tgaggaatct ccccaccccc aacaccctag atgaaacgaa atcacgtgca 2220 ctgagcgccc ctctttgaac ccccctttcg ggaacttttg gacttgccca gcctcggaag 2280 agagcggaag ccagagcagg cagtacccgg gcgggcagcg ggtgcggatt tatgtataca 2340 gcgggcgtcg 2350 3 200831900 <210> 4 <211> 1250 <212> DNA <213〉人屬智慧種（Homo Sapiens) <400> 4 f.. o aaagagcgga ggagccgcgg agagggtcag tttggccaga ggacaggact tagaagaccg 60 aagcctggga agccgcgaag aaaatgccag agaggagagt caaaggctga gagtgagagg 120 gagagaggga gcgggggtgg ggcgggggtc gccgggcccg tttgcagaag tggactgacg 180 agcggcgccg aaacccagcc gtcagacttt tcacacttag tcttttgttt ttctgtgttt 240 ttcctccccc tttttctttt caatattgca actccagtgc cccgtgggcc agagggcaag 300 gcgggtggag gtgaggacct gggagccgcg gggatccgtg gcactgccct ttctggcgca· 360 gcagcccggg gcagcgtggg cggaggaagc ccgcacagag gctagatctc ccgcgggctg 420 gatgcgcttt ctccccgggc acagtgagcg tcgaatgcga atcagccgcg cgaccgaaag 480 agcagagcat cccagtaaga tcagaggagc gccacgggct gcacaaggcg tcctttgaac 540 ctccccaaag aaagcaagcc acccccaccc tccaacttca aagtggagat tcggcaacta 600 actttgctac aaactctccg gagccagcct gggttttgtt ttgcttattt cccgggggca 660 gaagatgaga agtagcgcac tttgaacagc taggaaaagt gaggaagaga gaatagccag 720 ggatcgaatc taggactcgc ggaacgaaag gactgcctag cccgccggga cgcctgcttt 780 tctcggcgag ctgccgcctc ccgcgtggag ggtttggaca tctctgctgc gcagctaggc 840 gagcaactcc cggcagcggc atttttggtt cagttggcag ctcgcctccg ggcgcgccga 900 gtgcctctcc gctcgcgccc tcggcgcttc cggctcctct gagccccgcg gggggcacca 960 gccagcgccc tcgctgcaag gctacggtct ccggcgtggc cgtgggatgt tagcggtggg 1020 ggcaatggag ggcacccggc agagcgcatt cctgctcagc agccctcccc tggccgccct 1080 gcacagcatg gccgagatga agaccccgct gtaccctgcc gcgtatcccc cgctgcctgc 1140 cggccccccc tcctcctcgt cctcgtcgtc gtcctcctcg tcgccctccc cgcctctggg 1200 cacccacaac ccaggcggcc tgaagccccc ggccacgggg gggctctcat 1250 <210〉 5 <211> 1700 <212> DNA <213> 人屬智慧種（Homo sapiens) <400> 5 tcactgagca accagaatgg tatcctcgac cagggccaca ggcagtgctc ggcggagtgg 60 ctccaggagt tacccgctcc ctgccgggct tcgtatccaa accctcccct tcacccctcc 120 tccccaaact gggcgccagg atgctccggc cggaatatac gcaggctttg ggcgtttgcc 180 caagggtttt cttccctcct aaactagccg ctgttttccc ggcttaaccg tagaagaatt 240 agatattcct cactggaaag ggaaactaag tgctgctgac tccaatttta ggtaggcggc 300 aaccgccttc cgcctggcgc aaacctcacc aagtaaacaa ctactagccg atcgaaatac 360 gcccggctta taactggtgc aactcccggc cacccaactg agggacgttc gctttcagtc 420 200831900

   ccgacctctg gaacccacaa agggccacct ctttccccag tgaccccaag atcatggcca 480 ctcccctacc cgacagttct agaagcaaga gccagactca agggtgcaaa gcaagggtat 540 acgcttcttt gaagcttgac tgagttcttt ctgcgctttc ctgaagttcc cgccctcttg 600 gagcctacct gcccctccct ccaaaccact cttttagatt aacaacccca tctctactcc 660 caccgcattc gaccctgccc ggactcactg cttacctgaa cggactctcc agtgagacga 720 ggctcccaca ctggcgaagg ccaagaaggg gaggtggggg gagggttgtg ccacaccggc 780 cagctgagag cgcgtgttgg gttgaagagg agggtgtctc cgagagggac gctccctcgg 840 acccgccctc accccagctg cgagggcgcc cccaaggagc agcgcgcgct gcctggccgg 900 gcttgggctg ctgagtgaat ggagcggccg agcctcctgg ctcctcctct tccccgcgcc 960 gccggcccct cttatttgag ctttgggaag ctgagggcag ccaggcagct ggggtaagga 1020 gttcaaggca gcgcccacac ccgggggctc tccgcaaccc gaccgcctgt ccgctccccc 1080 acttcccgcc ctccctccca cctactcatt cacccaccca cccacccaga gccgggacgg 1140 cagcccaggc gcccgggccc cgccgtctcc tcgccgcgat cctggacttc ctcttgctgc 1200 aggacccggc ttccacgtgt gtcccggagc cggcgtctca gcacacgctc cgctccgggc 1260 ctgggtgcct acagcagcca gagcagcagg gagtccggga cccgggcggc atctgggcca· 1320 agttaggcgc cgccgaggcc agcgctgaac gtctccaggg ccggaggagc cgcggggcgt 1380 ccgggtctga gccgcagcaa atgggctccg acgtgcggga cctgaacgcg ctgctgcccg 1440 ccgtcccctc cctgggtggc ggcggcggct gtgccctgcc tgtgagcggc gcggcgcagt 1500 gggcgccggt gctggacttt gcgcccccgg gcgcttcggc ttacgggtcg ttgggcggcc 1560 ccgcgccgcc accggctccg ccgccacccc cgccgccgcc gcctcactcc ttcatcaaac 1620 aggagccgag ctggggcggc gcggagccgc acgaggagca gtgcctgagc gccttcactg 1680 tccacttttc cggccagttc , 1700 <210〉 6 <211> 1850 <212> DNA <213> 人屬智慧種（Homo sapiens) <400> 6 gaaagaaagc cgcggcatgt ggcggccggg tgtacgtctc aaactggggg cctccgcaca 60 cgtccccacc aggcccaaag accaggttcg attccagatt ggagcgtgac tgtgggaagg 120 gcgaaattac tcccgaagct gaattgattt tcaaatctgg aggcgtctct cggggacgcc 180 gggaaaaggg cgtccctagg ggccaagcgg agacccgcgc gccggcgtcc accctgtctg 240 cgtcagtact tctggaaagc aaccgcctcc gggtgcttta gcaggagggc cttgggagta 300 accgcaggga cggcccgagc ctccacggcc ccaccagcac ccggaagtta acatgggtac 360 cctccagggc actccctccg ctctccctcg cccccctcca caggccgagt catcggcgaa 420 gcggacgcac agccttaatt atgagctgag cgggagaagg agccaggcgg cgggggacag 480 tgaggtatgg cccgaactgg gattcttggc actgattact cctctcccca gggcatggat 540 gagaaagggt gggcaagtat gtatctggga ggacgaaggg tgccgggtca acggccgcca 600 aacggaccca gccctttaag caatctgcac cccaccccac cccaaccccc atcccccaat 660 aggccgtgaa ttcaagggtg ggaaagcgca ctcccagcag ccccccggga aataaagctt 720 agtgggctag agccgaaggg gtgatgacac agtccccagc tccccgggca agctgcaccg 780 200831900 f ggaagcagca actggagaga gaggggcgat gtctccaagc acagcactcc agccgctaga 840 agcccgacac gagcgtcccc gggctgggag gacagagccc actcaagcaa gggaggcgag 900 cgagccaggc gcgagtctcc tgggattgca gcggcggccc caggtcgcgc tctgcgccaa 960 tctttcgcac gtgcccgcag ctccctggcc atccagcgcc gcagggaagg cgctgggccc 1020 cctccttcat ttgtaccggg acgccaaggg cctggcgcgc cgcgacctag ggggcggggg 1080 cgggcctcgc gcatgcgcgc tgcgcctggc gggcgtgagg gcgggccgct gcggcggcgg 1140 cggcggcggc taccgaaccg cggccacaga gtctgtaaca gtaacagagc catggctcaa 1200 gctggccagc ggggcgggca ggcagcagac gcggcaggcg cgcgggccgc ggcaggggag 1260 ccggagacct cagaatttta agaaagagag gggcgagagg tggccgaggc gggcgggctg 1320 gggcactgcg ctctcccaac ggcgcggatc ctctttggaa attaatatta aaaaaaaaaa 1380 agccgaggac gcagagggga aggtgggggg taagagggaa ggcgagacac acacacacac 1440 acacacgcac acgcacacac ggacacacac acacggagag agagagagag agagacagag 1500 ccccacagtg agaggaagga aggcaacagt cgccagcagc cgatgtgaag accggactcc 1560 gtgcgcccct cgccgcctct gcctggccac atcgatgttg tgtccgccgc ctgctcgccc 1620 ggatcacgat gaacgcgcag ctgaccatgg aagcgatcgg cgagctgcac ggggtgagcc 1680 atgagccggt gcccgcccct gccgacctgc tgggcggcag cccccacgcg cgcagctccg 1740 tggcgcaccg cggcagccac ctgccccccg cgcacccgcg ctccatgggc atggcgtccc· 1800 tgctggacgg cggcagcggc ggcggagatt accaccacca ccaccgggcc 1850 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 7 cgtttttttt ttttcgttat tggc 24 G <210〉 8 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 8 cctacgctcg atcctcaacg 20 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213〉人工序列 200831900 <400〉 9 tgtttttttt tttttgttat tggtg <210〉 10 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <400> 10 cctdcactca atcctcaaca ac <210〉 11 <211〉 18 <212> DNA <213>人工序列 <400〉 11 tttagaagcg ggcgggac <210〉 12 <211〉 17 <212> DNA <213〉人工序列 Ο <400〉 12 ccgaatccaa acacgcg <210〉 13 <211> 22 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 13 gagtttagaa gtgggtggga tg <210〉 14 <211〉 24 <212> DNA 200831900 <213〉人工序列 <400〉 14 caaccaaatc caaacacaca aaac <210> 15 <211〉 21 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 15 ttgtagcggc ggttttaggt c <210> 16 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 16 gccaaaccct taacgtcccg o <210〉 17 <211〉 24 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 17 gattgtagtg gtggttttag gttg <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 18 caccaaaccc ttaacatccc aatac <210> 19 200831900 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 19 tattttgggt ttggggtcgc <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 20 cccgaaaacc gaaaaccg <210> 21 <211〉 24 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 21 gtttattttg ggtttggggt tgtg

   <210〉 22 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 22 cacccaaaaa ccaaaaacca c <210〉 23 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 23 cgtggtcgtg ggatgttagc 200831900 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 24 acaaacaacg aaaaatacgc g 21 <210〉 25 <211〉 22 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 25 22 gtgtggttgt gggatgttag tg <210> 26 <211〉 25 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 26 caacaaacaa caaaaaatac acaac 25

   <210〉 27 <211〉 21 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 27 tgttgagtga atggagcggt c <210> 28 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 28 10 200831900 cgaaaaaccc ccgaatataa acg <210> 29 <211〉 24 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 29 gttgttgagt gaatggagtg gttg <210〉 30 <211〉 29 C <212〉 DNA <213〉人工序列 <400> 30 sattacaasd adcccccaea tataaacac <210〉 31 <211> 26 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 31

   gttgttttyg ggtttttttt tggttg <210> 32 <211〉 28 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 32 atttctccta atacacaaac cacttacc <210〉 33 <211> 29 <212> DNA <213〉人工序列 200831900 <400> 33 tagttattgg gagagagtty gtttattag <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 34 ctaccccaaa tcraaaaaaa acac <210〉 35 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <400> 35 gagtttattt aagtaaggga gg <210> 36 <211〉 30 <212> DNA <213〉人工序列

   <400> 36 caacttaaac cataactcta ttactattac <210> 37 <211〉 22 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 37 gtgttttggg agggggtagt ag <210> 38 <211> 21 200831900 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400> 38 ccctcccraa ccctacctat c <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 39 gatagaagga gggggtagag tt <210> 40 <211〉 21 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 40 tactaccccc tcccaaaaca c o <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 41 ggtatttttg gtttagttgg tagtt <210> 42 <211〉 22 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 42 aataccctcc attaccccca cc 200831900 <210〉 43 <211〉 22 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 43 ggtgggggta atggagggta tt <210〉 44 <211〉 24 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 44 cctaaattat aaatacccaa aaac <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 45 gtgttgggtt gaagaggagg gtgt

   <210〉 46 <211> 28 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 46 atcctacaac aaaaaaaaat ccaaaatc <210〉 47 <211> 22 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 47 agacctagat gccaacaatt gg 200831900 <210〉 48 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 48 gcaccactac gacttagtcc g

   <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 49 gctgcttctg ctgctgtgtc t <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 50 acgtttgggg cgcttatggt c 〇 <210〉 51 <211〉 21 <212> DNA <213>人工序列 <400> 51 caaaccctgg agcaaactca a <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 200831900 <400> 52 tgtgttgcct ctatccttcc c <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 53 cctacgctgc cctacaacca catc

   Ο <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 54 tcacgccggc ccagtcttcc atct <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 55 cacacgagac ccactttttc c <210〉 56 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 56 cccaacgaat aggccaaacg <210> 57 <211〉 21 <212> DNA 200831900 <213> 人工序列 <400> 57 gctgtcccac ttacagatgc a 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA 。 <213> 人工序列 <400> 58 * tcaaagcgcc agctggagtt t 21 Γ) o 17