TW200813229A - Method for the regeneration of lipase - Google Patents

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200813229 ... ' ...... ' ' . ，【發明所屬之技術領域】 本發明係有關特定之固定化月旨肪酶或脂肪酶粉末组成 物^酯化能或交酿化能等之脂肪酶活性的回復方法以及使 用該回復之固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物進行醋化反 應或油脂交酯化反應之方法者。 〇 【先前技術】 脂肪酶廣泛使用在脂肪酸等之各種羧酸與一元醇或多 罾元醇等醇類之酯化反應、複數致酸醋間 其中’父酯化反應係應用於動植物類油脂之重組，以及各 種脂肪酸之酯、糖酯、或類固醇之製造方法的重要技術。 此等反應的觸媒可使用油脂分解酵素之脂肪酶，於室溫至 約70 c左右的溫和條件下進行交酯化反應，和以往的化學 反應相比，不僅可抑制副反應及降低能源成本，而且由於 作為觸媒之脂肪酶為天然物因此安全性也高。此外，依據 馨該受質特異性或位置特異性而能以優良的效率生產目的 物仁疋’一般而δ，將脂肪酶粉末直接使用於交酯化反 應日守1热法充分地表現活性，原本水溶性的脂肪酶要均勻 地分散於油性原料中相當困難，其回收也相當困難。因此， 以往通常係將脂肪酶固定於某些載體，例如陰離子交換樹 Μ專利文獻1)、紛吸附樹脂(專利文獻2)、疏水性載體（專 利文獻3)、陽離子交換樹脂(專利文獻4)、鉗合樹脂（專利 文獻5)等，然後再使用於酯化反應或交酯化反應。 然而’將脂肪酶固定化於載體時，脂肪酶的活性會降 319245 200813229 …低，因此開發了使甩脂肪酶粉末的各種技術。 •户产具體而言，有人提案在非活性有機溶劑的存在下或不 下，於進行交^化反應時將分散脂肪酶粉末粒子的 確保其粒徑在i至Ί⑽㈣之範圍，而將脂肪酶 ^ Ψ it# ^ sl ,b ^ ^ ^ ^ ^ 。此外’ Φ有人提綠料含有杨f及麟性維他命 的酵素溶液乾燥所得之酵素粉末(專利文獻7)。 復 言 μ另一方面，由於酵素之脂肪酶係高價產品，因此反應 :束後進彳了时而顧㈣，直到肋酶活性降至相當低 ^才廢棄。’然而，如果能夠使活性降低的脂肪酶之活性回 "厣肪酶的使用效率將顯著地提升，從工業上的角度而 相當期望開發出使脂肪酶活性回復之有效方法。 專利文獻2 專利文獻3 專利文獻4 專利文獻5 專利文獻6 專利文獻7 專利文獻1 ··日本國特開昭60-98984號公報 【發明内容】 卜本發明之目的在於提供一種能使活性降低之脂肪酶垣 復其活性的方法。 ^此外，本發明之目的在於提供一種使用具有回復脂忠 酶活性的固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物之酯化二:資 曰本國特開昭61-202688號公報 曰本國特開平2-138986號公報 曰本國特開平3-61485號公報 曰本國特開平1_262795號公報 曰本國特許2668187號公報 曰本國特開2000-106873號公報 319245 6 200813229 交酯化方法。 疋之固定化脂肪酶或談固定化脂私寸 而士以卜 _如年物、與助濾劑 成的如肪酶粉末組成物’於其脂肪酶活性降低者以二萨 甘油酯洗淨，便能回復至初斯的脂肪酶活性。-—:文 亦即，本發明係提供一種脂肪酶活性的回復方法，1 载體Q疋化之來自嗜熱真菌屬的脂肪酶之平均粒徑為 以上而未滿300私m之粉碎物、及助遽劑的脂^酶截 ^組成物在使用於酯化反應咸交酯化反應後，以三酸甘油 酯（triacylglycerol)予以洗淨。 此外，本發明係提供一種酯化反應或交酯化反應，其 _ :含有被載體固定化之來自嗜熱真菌屬的脂肪酶:戈 被载體固定化之來自嗜熱真菌屬的脂肪酶之平均粒徑為1 以上而未滿3〇Mm之粉碎物、及助遽劑的脂肪酶粉 修末組成物在使驗酯化反應或交酯縫應後，從反應系統 中予以分離，並以三酸甘油酯洗淨使脂肪酶的活性回復， 然後再使用該固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物進行=化 反應或交酯化反應。 【實施方式】 本發明使用之脂肪酶係為來自嗜熱真菌屬者，係固定 化至載體之脂肪酶，該载體以二氧化矽為佳。在本發明可 將此直接使用，或將該脂肪酶粉碎至丨㈣以上而未滿遍 P後使用。在此’於：氧切韻固定化之該脂肪酶的 319245 7 200813229 ,平均粒徑宜為300/^至10〇〇/^左右。如此固定化之.腊: ，肪酶例如Lip〇zyme TL撕可由N〇v〇zyme A/s公司取得: t # ^ ^^mmm^n^ ^ ^^ ^ M m a 300/zm ^ # 1 ^ 2〇α^ m , £ ± ^ ^ ^ ^ # ^ 2 〇〇 ^ m ^ 20 ^ 100,m 〇 牛如礼妹、努切摩擦式粉碎機、刀片式粉碎機、微粒化機 (mycolloider > masscolloider) ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ (power mill) mill) ^ % ^ ^ ^ ^ ^ (|§ 磨機、球磨機)、輕式磨碎機以及氣流式磨碎機、均質機、 超音波破碎機等八^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ 、 、一當本發明使用之脂肪酶為上述粉碎物時，較好是和助 濾劑組合使甩為佳。作為助遽劑可例舉如石夕舞石（celite)等 之無機助濾劑及纖維素等有機助濾劑，尤以有機高分子助 濾劑為佳’其中以纖維素為佳，適合者可例舉如曰本製紙 _ CHEMICALS(株)之商品名為Ke FL()CK之商⑤。助遽劑 以粉狀為佳，平均粒徑為10至90/i m為佳。 上述脂肪酶粉碎物與助濾劑的質量比以1/10至1〇/1 為佳，尤以1/7至2/1為佳。 本發明使用之上述固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物 雖可直接使用於交酯化反應或酯化反應，但藉由使其與長 鏈知肪馱二酸甘油酯扣iglycedde)和中鏈脂肪酸三酸甘油 醋接觸’接著進行採取，則可進行精製，同時能使脂肪酶 319245 8 200813229 〃 作為在此使用之長鏈腊祐酸三酸甘油醋與中鏈脂肪酸 .三酸甘油醋較好係使甩記載於後述之固定化脂肪酶或脂肪 酶粉末組成物之洗淨項目中者為佳。 將長鏈脂肪酸三酸甘油酯與中鏈脂肪酸三酸甘油酯以 質量比95 : 5至50 : 50的比例使用為佳，使相對於脂』酶 之王貝虽2倍至1〇〇倍質量之三酸甘油酯接觸為佳。 使用上述固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物進行酯化 籲反應時，較好是在該固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物的 存在下進行油脂的酯化反應，接著再將固定化脂肪酶或脂 肪酶粉末組成物回收再利用為佳。 尤其是上述脂肪酶粉末組成物，由於其脂肪酶活性提 升，且使酯化反應或交酯化反應之易使用性（操作性）提 升，而且可循環使用於此等反應，因此可適用於工業規模 之油脂的交酯化等之油脂的改質。 ^然而，若將如此之脂肪酶粉末組成物或固定化脂肪酶 •經數次回收再利用於酯化反應或交酯化反應時時，會隨著 使用次數而降低所謂酯化能或交酯化能之脂肪酶活性。 本發明係將如此之脂肪酶粉末組成物或固定化脂肪酶 ^特定條件洗淨，使絲酶活性回復，而且，上^ ;末組成物係可長時間持續提升其脂肪酶活性與易使用性 (操作性）之產品。 .'' ' ' . t 本發明對象的固定化脂肪酶或賴酶活性降低之 酶粉末組成物，雖可將相對於初期活性稍微降低者作 '、、、對象’但《工業上的角度來看’以初期活性（⑽％)降低 319245 9 200813229 ... 卜至70至50%者作為對象為佳。 '物而Γ : „以洗淨固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成 物t使用的三酸甘油醋以在室溫下為液狀者龍 油S曰與中鏈脂肪酸三酸甘油酯的混合物為佳。:甘 & t在此使用之長鏈脂肪酸三酸甘油酯，係以構成月t 肪酉夂之碳數為14至24的二辦廿^ ^ ^ ^曰 大豆油、葵花油、紅花油 植物油a。 」所構成之群集中選出之 肪酸之用之中鏈一脂肪酸三酸甘油醋，係以構成脂 於甘、由= 2的三酸甘油s旨為佳。如此之㈣酸三 ==可：公知方法可製造t ^商扣可例舉如日清_iG gn)up之商品名為侧之 口口0 所旦旨㈣三酸甘油酉旨與中鏈脂肪酸三酸甘油酉旨之 1二=5至5〇:5。的比例為佳，^ 甘油酯接觸為佳。 化之用於洗淨之三酸甘油'，以作為進行 M 理係使㈣化脂肪酶或脂肪酶粉末㈣物中的 曰…、述二酸甘油酯充分接觸的方式進行為佳。呈體 :之㊁！在三酸甘油醋中將使用於酿化反應或交醋：反 ^後之固疋化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物進行攪拌並使其 319245 10 200813229 刀放接著從二酸甘油酯中分離的方式進行。 一一 接觸，具體而言’係於i 0至4 51攪拌為佳，尤以h

2^ 10 ^ J 12小時至48小時的方式進行為佳。另外，依據斯望亦可 進行48小時以上… ^ 1了 a、，.：、進行.擾掉的.¾摔.機.雖.無.特別限定，但以使_用葉.片 擾摔器、電磁攪拌器、攪拌震盪器為佳。 、匕方式’使固疋化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物中的 摩甘油酯中分離出固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物，然 後再度使用於酯化或交酯化反應。 (發明的效果） 根據本發明，關於將脂肪酶使用於各種反應而造成脂 肪酶活性降低者’直到目前為止都是廢棄不用，但藉由本 發明的=法，由於能使脂肪酶活性回復，而能延長脂肪酶 籲的使用壽命，且能降低使用脂肪酶製造之製品的成本，因 此本發明從工業上的角度來看有很大的優點。 以下’藉由實施例詳細地說明本發明。 實施例1 (1)使用HOSOKAWA MICRON(株）公司製造之針盤式磨粉 機以 17600rPm 將 Novozyme A/s 公司生產之 Lip〇zyme TL-IM(平均粒徑800 /z m)lKg磨碎。使用堀場公司製造之 粒度分布計LA-500測定磨碎後之脂肪酶粒徑，測得平均 粒#為13.8 // m。於该粉末中加入kg作為助濾劑之纖維 319245 11 200813229 素粉（日本I纸CHEMICALS :平均粒徑30 // m)，作為脂 肪酶粉末組成物。 (2) 於上述所得之脂肪酶組成物5g中添加脫色菜籽油90g 及ODO[日清Oillio group(株）公司製造：中鏈脂肪酸三酸 甘油酯]10g，在室溫下攪拌24小時後，過濾回收脂肪酶組 成物。將此脂肪酶組成物的交酯化活性以下述方法測定 之。結果發現，以磨碎前之Lipozyme TL-IM的活性定為 • '· . '. . . . · . · . - . · 100時，測得之相對活性為714。 •(脂肪酶活性的測定方法） 在三油酸甘油醋和三辛酸甘油酯之1 : 1 (w)比例的混 合油中，添加脂肪酶組成物後於60°C進行反應。定時採樣 10# 1，以己烷1·5ηι1稀釋後，將濾除月旨肪酶組成物之溶液 作為氣相層析（GC)之分析樣品。以GC(管柱：DB-lht)分析 並依下式求得反應率。GC條件為管柱溫度：初期150°C、 升溫：15°C/分鐘、最終370°C。 φ 反應率（％)={C34area/(C24area+C34area)}xl00 算式中，C24表示三辛酸甘油酯、C34表示三辛酸甘 油酯的1個脂肪酸被油酸置換者，area為該等的區域面 積。根據各時間之反應率，藉由解析軟體（origin ver.6.1) 求得反應速率常數k。 脂肪酶活性係以將Lipozyme TL-I1V[之活性定為1 〇〇 時的相對活性來表示。 (3) 於脫色菜籽油（曰清Oillio group(股）公司製造）85g及 ODO(曰清Oillio group(股）公司製造）15g中添加上述（2)所 12 319245 200813229 . - . ' ； · ，得之脂肪酶組成物1質量％，於60°c攪拌19小時進行交 ―酯化反應。定時求得交酯化率並確認反應的進行:。又，交 酯化反應係使用氣相層折法分析甘油g旨的組成，將測定樣 品中之交酯化反應物中的比例算出。 將反應後的脂肪酶組成物過濾回收，使用該回收之脂 肪酶組成物重複進行交酯化反應。進行數次的重複反應， 以相對比確認反應率之變化，結果如第丨圖所示。 由第1圖的結果發現，當合計反應時間到達82小時 日守’知肪I#組成物之脂肪酶活性會降低至約。 ' (4)在上述（3)中，將相對活性降低至約6〇%的脂肪酶組成物 過濾回收’於該回收之脂肪酶組成物中添加脫色菜籽油（日 清Oillio group(股）公司製）18g及〇D〇(曰清〇i出〇 group(股）公司製）2g’於室溫使用電磁授拌器攪拌Μ小 時。過濾回收脂肪酶組成物，再和上述（3)一樣重複進行交 酉旨化反應。以相對比但確認反.應率變化之绪果，如第2 •所示。 ^ f 2 ® ^ ^ ^ # ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ,, I组成物，可使脂肪酶活性回復至當初的」_，並可將 脂肪酶回收重複使用許多次。 實施例2 ㈣於實施例丨之⑴所得之朗酶組成 添加脫 菜籽油90g及0D0(曰清〇im ⑽ g T 贶已 6(rr庐杜士愈、证占 g 〇uP(股）公司製）l〇g，方 60 C攪拌2小日守後，過濾回收脂 έθ ^ ^ ^ ^/μ ^ ^ 崃、、且成物。將該脂肪酉 組成物之父1日化活性依實施例〗相 伯U之方法測定，結果注 319245 13 200813229 得其相對活性為557。 “ — / (2-2)在大豆油100g及大豆極高度氫化油(橫關油脂工業 (股）公司製）25g中添加上述（2-1)所得之脂肪酶組成物1.2 .... . · - · 質量％，於70\：反應120小時後，過濾回收脂肪酶組成物。 將回收之脂肪酶的一部分依實施例1 一樣地測定脂肪酶活 性（2-2a)。將上述回收的脂肪酶組成物分散於丙酮中，然 - * 後過濾，將遽餅再次回收，並分散於脫色菜籽油: 〇DO(日 清Oillio group(股）公司製）=9 : l(w)的混合油50g中，藉由 ⑩在室溫過濾的方式而進行洗淨/置換，而回收脂肪酶組成 物。將該脂肪酶組成物之交酯化活性依實施例1相同的方 法測定（2-2b)，所得之活性以相對值表示，結果如表1所 示。 表1 脂肪酶製劑之單位質量的相對交酯化活性 磨碎前（TL-IM) 100 (2-1) 557 (2-2a) 11 〇2b) 200 實施例3 在脫色菜軒油（曰清Oillio group(股）公司製）85g及 ODO(曰清 Oillio group(股）公司製）15g 中添加 Lipozyme TL-IM(固定化脂肪酶：Novozyme A/S公司製)5質量％，於 60°C擾拌19小時進行交酯化反應。定時求得交酯化率並確 認反應的進行。又，交酯化反應率係使用氣相層析法分析 14 319245 200813229 一甘油s旨的組成，藉由測定試料中之交醋化反應物的組成比 例算出。 將反應後之上述脂肪酶組成物過濾回收，使用該回收 之脂肪酶組成物重複進行交酯化反應。進行數次的重複反 應，並以相對比值確認反應率之變化，結果如第3圖(3丄T) 所示0 將相對活性降低至約60%的脂肪酶組成物過濾回收， 於u亥回收之固定化月旨肪酶組成物中添加脫色菜籽油（日清 Oillio group(股）公司製)18g 公司製）2g，於室溫攪拌24小時。過濾回收固定化脂肪酶 組成物，再重複上述操作（^^進行交酯化反應。以相對比 值確認反應率之變化。結果如第3圖（3-2)所示。 【圖式簡單說明】 第1圖示使用脂肪酶粉末組成物進行交酯化反應時間 隨時間造成之交酯化活性的降低[實施例1(3)]。 _ 第2圖示將交酯化活性降低的脂肪酶粉末組成物藉由 本發明方法洗淨後達成之交酯化活性的回復。 第3圖示將交酯化活性降低之固定化脂肪酶藉由本發 明方法洗淨後達成之交酯化活性的回復。 319245 15

Claims (1)

1. 末組成物在使甩於酯化及應或交酯化反應後，以三‘ς 油酯(triacylglycerol)予以洗淨。 如申請專利範圍第1項之方法，其中，該三酸甘油酯係 在室溫為液狀者。 ^ ” 如申請專利範圍第i項之方法，其中，該三酸甘油酉旨係 含有中鏈脂肪酸三酸甘油酯者。 ^申請專利範圍第i至3項中任一項之方法，其中，該 二酸甘油酯係用作交酯化之原料油。 _ 知肪酶或脂肪酶粉末組成物在三酸甘油酯中進行攪拌 亚使其分散，然後再從三酸甘油酯中分離者。 .如申凊專利範圍第j至5項中任一項之方法，其中，該 载體係二氧化矽。 7.如申請專利範圍第1至6項中任一項之方法，立中，該 粉碎物的平均粒徑係u 200,m。…Λ 如申明專利範圍第1至4項中任一項之方法，其中，該 洗淨處理係藉由將酯化反應或交酯化反應後之固定化

   至8項中任一項之方法，其中，該 .如申請專利範圍第 助濾劑係纖維素。 如申凊專利範圍第 319245 16 200813229 γ助濾劑係平与粒徑為1〇至9〇諸之粉末…—— • 10.—種酯化反應或交酯化反應，其特徵·入右縣 定化之來自嗜熱真菌屬的肪酶^恭j 7 -固 A,乃曰肪輿或被载體固定化之來 自嗜熱真菌屬 300# m之粉拜物、及助濾劑的脂肪酶粉末組成物在使 用於酯化反應或交酯化反應後’從反應系統中予以分 離’並以二酸甘油酯洗淨使脂肪酶的活性回復後，再使 用遠固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組成物進行酯化反應 或交酯化反應。

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