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TW200813216A - Improved process for the culturing of cells - Google Patents

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TW200813216A
TW200813216A TW096125227A TW96125227A TW200813216A TW 200813216 A TW200813216 A TW 200813216A TW 096125227 A TW096125227 A TW 096125227A TW 96125227 A TW96125227 A TW 96125227A TW 200813216 A TW200813216 A TW 200813216A
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cells
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culture medium
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TW096125227A
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Gerben Meile Zijlstra
Robert Patrick Hof
Jacob Schilder
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Dsm Ip Assets Bv
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Publication date
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Description

200813216 九、發明說明： 【發明所屬^^技術領織;j 發明領域
本發明係關於一種於一反應器内於一細胞培養基之懸 5 浮液中培養細胞之方法。 t先前技術I 發明背景 此種方法例如由WO04/099396為已知。此處說明如何 將一批次式進給方法中之生長條件最佳化，來改良細胞培 10 養醪之細胞密度及期望之生物材料之產量。 此外， WO 05/095578揭示一種經由連續灌注培養包含細胞 培養基細胞之一細胞培養锻來培養細胞之方法，其中細胞 培養基添加至細胞培養醪，細胞培養醪循環通過一過濾模 15組，該過濾模組包含中空纖維，結果導致液體流出流具有 比該細胞培養醪更低的細胞密度，以及於該過濾模組内部 之液流為父替正切流，其中該等細胞可製造一生物物質。 於WO05/095578之實例中顯示製造〇·9克/升/日產物，相當 於流出流中之產物濃度約為〇·3克/升。 20 含有該生物物質之液體體積愈大，則該生物物質純化 變成愈煩瑣。所得生物物質之濃度不如WO04/099396及 WO05/G95578所揭示之方法之生物物質之濃度高。因此此 種生物物食之下游處理變煩瑣，原因在於生物物質於進一 步純化步驟之前必須經濃縮，或須純化大量較低度濃縮之 5 200813216 生物物質。此外，於較低生物密度培養細胞，結果導致較 低體積生產力，因此需要較大型及/或較多個培養容器，如 此對一給定製造層面而言需要更高的資本設備投資。 因此，本發明之目的係提供一種其中產物係以較高濃 5 度由細胞培養獲得之方法。 本發明之又一目的係允許長時間培養細胞及製造生物 材料之方法。 【發明内容3 發明概要 10 此等目的可經由一種於一反應器於一細胞培養基之懸 浮液培養細胞之方法，其中該等細胞製造一生物物質，其 中至少一種細胞培養基成分係進給至該細胞培養醪；以及 其中包含該生物物質及細胞培養基之細胞培養醪循環通過 一分離系統；以及其中該分離系統將該生物物質與具有分 15 子量比該生物物質更低之該等物質分離；以及其中該生物 物質係保留於反應器或反向進給回該反應器内。 舉例言之，本發明係關於一種於一反應器於一細胞培 養基培養細胞之方法，其中該等細胞製造一生物物質；其 中養分及/或細胞培養基進給至該反應器；以及其中包含該 20 等細胞及細胞培養基之細胞培養醪循環通過具有孔徑或具 有分子量截留為5kD至500kD之一過濾器。 發現經由使用將該生物物質與具有比該生物物質更低 分子量之物質分離之一分離系統，生物物質以較高濃度積 聚於該細胞培養醪中。 6 200813216 如此本發明與先前技術說明之細胞培養之差異在於， 本發明方法允弁期望之生物材料連同細胞質塊之積聚。 於本發明之一較佳實施例中，部分較低分子量物質係 由該細胞培養中連續移除。 5 本發明方法之一額外優點為，比較例如批次法或批次 式進給法實例可達成較高活細胞濃度 。此外，比較例如批 次法或批次式進給法，製造時間亦即細胞製造生物物質的 時間可延長。此外，比較批次法或批次式進給法，可使用 較小型反應器。使用較小型反應器之優點在於可減少設備 10 及工廠相關的投資成本。 此外’可於較短時間獲得較高濃度之生物物質。 發現可於反應器内部獲得較高濃度之生物物質，而細 胞存活率不會銳減，如此不會限制其製造時間。熟諳技藝 人士預期出現產物抑制，亦即藉生物物質本身抑制生物物 15質的製造，或藉細胞所製造的其它巨分子(例如宿主細胞蛋 白質、酶、或細胞殘骸）而抑制生物物質的製造。此外，發 現期望之生物材料的積聚不會有損分離系統的功能。 本發明方法比較根據W〇 〇5/〇95578&w〇 04/099396 之方法’就細胞密度、細胞培養醪中之產物濃度及延長培 20養週期等方面而言提供顯著優點。結果，本方法獲得期望 生物材料之改良製造。 可用於製造生物物質之細胞原則上全部皆為熟諸技藝 人士已知之細胞，該等細胞具有製造生物產物的能力。該 等細胞可為真核細胞例如絲狀真菌，例如黑麴菌 7 200813216 (Aspergillus niger)、稻麴菌（Aspergillus oryzae)、雷思木霉 (Trichoderma reesei)、產黃青霉(Penicillium chrysogenum); 酵母類例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克魯 維酵母(Kluyveromyces lactis)、Phaffia rhodozyma ;得自比 5 奇菌（Pichia)屬之酵母例如巴士多比奇菌（Pichia pastoris); 或為原核細胞例如大腸桿菌（Escherichia coli)、芽孢桿菌屬 (Bacillus sp·)例如第一芽孢桿菌（B. licheniformis)、枯草芽 孢桿菌（B· subtilis)、溶解澱粉芽孢桿菌（B_ amyloliquefaciens)、嗜鹼芽孢桿菌（B. alkalophilus)、鏈絲菌 10 屬（Streptomyces sp.)、麵胺酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)、假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.)。真核細胞 之實例例如也說明於Chu，L·，Robinson，D. K.，（2001) Curr. Opinion Biotechn·，vol· 12, ρ· 180-187。較佳用於本發明方 法之細胞為動物細胞，特別為哺乳動物細胞。哺乳動物細 15 胞之實例包括CHO(中國倉鼠卵巢)細胞、融合瘤、ΒΗΚ(嬰 倉鼠腎）細胞、骨髓瘤細胞、人類細胞例如ΗΕΚ-293細胞、 人類淋巴母細胞、Ε1-永生化HER細胞、小鼠細胞例如NS0 細胞。更佳使用E1-永生化HER細胞，最佳為pER C6細胞。 一次人胚胎網膜（HER)細胞可分離自胎兒（Byr(j p，
20 Brown KW，Gallimore ΡΗ· 1982。藉經轉殖之腺病毒 12 DNA 之人胚胎網狀母細胞之惡性轉形，自然298:69-71 ; Byrd PJ， Grand RJA，Gallimore ΡΗ· 1988。藉腺病毒£1 區及E1A+ras 之組合進行一次人胚胎網膜細胞之差異轉形，致癌基因 2:477-484)。一次細胞於培養數個繼代培養之後將死亡。用 8 200813216 於本發明之目的之El-永生化HER細胞係經由表現其中編 碼腺病毒E1A蛋白質及E1B蛋白質之DNA，獲得永生化細胞 而從一次HER細胞衍生而得。此種永生化細胞可培養超過 100繼代培養。獲得E1-永生化HER細胞之方法例如係說明 5 於美國專利5,994,128 ; Byrd P，Brown KW，Gallimore PH. 1982。藉經轉殖之腺病毒12 DNA之人胚胎網狀母細胞之惡 性轉形’自然298:69-71 ; Byrd PJ，Grand RJA，Gallimore PH. 1988。藉腺病毒El區及El A+ras之組合進行一次人胚胎網膜 細胞之差異轉形，致癌基因2:477-484 :及Gallimore，P.H.， 10 Grand，R.J.A.及Byrd P.J.(1986)，以猴病毒40、腺病毒及ras 致癌基因之人胚胎網狀母細胞之轉形，抗癌研究，6， 499-508頁。例如永生化HER細胞包括PER.C1、PER.C3、 PER.C4、PER.C5、PER.C6、PER.C8及PER.C9細胞係經由 於人填酸甘油酸醋激酶（「PGK」）啟動基因的控制之下，使 15 用含有腺病毒血清型5(Ad5) E1A-編碼序列及E1B-編碼序 列（Ad5核苷酸459-3510)之一質體轉感染所產生（參考美國 專利5,994，128)。 於一較佳實施例中，於本發明方法中之細胞為E1 -永生 化HER細胞，更佳為PER.C6細胞（參考美國專利 20 5,994，128)。PER.C6細胞例如為以ECACC No· 96022940寄 存之細胞(例如參考美國專利5,994,128、EP 0833934 B1)。 於本發明方法中，細胞可以任一種形式於懸浮液培 養，例如細胞可呈永生化細胞、單一細胞、或細胞簇或其 組合。較佳細胞係呈單一細胞及/或呈不超過100細胞更佳 9 200813216 不超過20細胞之細胞簇培養。細胞可為例如致動於微載體 上，微載體例如可購自GE健康照護公司（GE Healthcare)(賽 妥戴斯(Cytodex))。 此處定義之反應器為一種包含細胞培養之系統，而該 5 細胞培養又包含細胞及細胞培養基。較佳提供無菌屏障諸 如空氣濾清器來防止其它細胞的污染期望的細胞；較佳係 經由提供正確的培養條件，諸如混合、溫度、pH、氧濃度 等來為細胞維持有利的環境。 反應器例如可具有更為持久的本質，例如反應器可為 10不鏽鋼製成或玻璃製成或反應器可具有拋棄式本質，例如 反應器可為塑膠瓶或塑膠袋。適合用於本發明之反應器之 實例包括但非限於攪拌槽反應器、空氣升高反應器、及拋 棄式袋’可糟搖動、振動或授動來混合。較佳使用抛棄式（生 物)反應器，原因在於該等反應器為有利，反應器所需投資 15成本相對較低，反應器有較大操作彈性、較短週轉時間， 且反應器容易組配來適合本發明方法。拋棄式（生物）反應器 於市面上可購自海可隆(Hyclone)、沙妥立思(—Ο、艾 普立康（Applikon)、或偉夫(Wave)。 於本發明之主幹内部定義之「分離系統」一詞為可基 20於分子量來分離之系統。於本發明方法中使用之分離系統 為可由具有比該生物物質更低分子量之物質分離該生物物 質之系統。換言之，分子量截留係選定為分子量截留 (MWCO)係比生物物質之分子量更小，更佳更小至少因數 2 ’最佳更小至少因數3。典型地，當然係依據於本發明方 200813216 法所製造之生物物質之分子量決定，分離系統之MWCO較 佳至少為5kDa，更佳至少為10kDa，最佳至少為3〇kDa，且 較佳至多為500kDa，更佳至多為300kDa，最佳至多為 lOOkDa。例如對於具有分子量15〇kDa之IgG而言，以至多 5 50kDa之MWCO之分離系統為佳。 分離系統之實例包括但非限於過濾器、離心機及水性 二相萃取系統。 「過濾器」一詞用於此處係表示包括可基於尺寸或基 於分子量分離粒子之全部裝置。原則上，於本發明方法中， 10可選用任一種過濾器，只要孔徑或MWCO係選擇讓生物物 質與具有比該生物物質更低分子量之物質分離即可，典型 具有孔徑或MWCO為5kDa至500kDa。適合用於本發明之過 濾器實例包括膜過濾器、陶瓷過濾器及金屬過濾器。可使 用任一種形狀之過濾器；過濾器例如為螺旋捲繞或為營 15 狀，或過濾器可以片狀形式使用。較佳於本發明方法中， 所使用之過濾器為膜過濾器，較佳為中空纖維過濾器。Γ中 空纖維」一詞表示管狀膜。管子内徑至少為毫米，更佳 至少為0_5毫米，最佳至少為0.75毫米且較佳管子内徑至多 為10毫米，更佳至多為6毫米及最佳至多為i毫米。包含中 20 空纖維之過遽裔模組於市面上例如可得自奇異公1 (General Electric)(GE，前名阿默山公司（Amersham))。 藉由包含生物物質、細胞及細胞培養基之細胞培養醪 於一分離系統上循環，生物物質及細胞保留於反應器内， 因此液體流出流具有比細胞培養醪更低濃度之生物物質及 11 200813216 更低細胞密度。通常於本發明方法中，液體流出流不含或 殆不含任何生物物質之細胞。通常，液體流出流主要只含 具有分子量低於生物物質之分子量之成分。因此大致上全 部細胞及大致上全部生物物質通常係保留於反應器内。 5 較佳過濾器之孔徑或MWCO經選擇讓過濾器之孔徑或
MWCO比較產物之直徑或產物之分子量更小，更佳小至少 因數2，最佳小至少因數3，來確保產物之高保留性。典型 地，當然係依據產物之尺寸及分子量而定，換言之，依據 本發明方法所製造之生物物質之尺寸或分子量而定，過濾 10為之孔徑或MWCO較佳至少為5kDa，更佳至少為10kDa， 及最佳至少為30kDa，及/或過濾器/過濾膜之孔徑或MWCO 較佳至多為500kDa，更佳至多為3〇〇kDa，及最佳至多為 lOOkDa ° 分子置截留（MWCO)—詞表示高於該mwCO分子量之 至少90%粒子係由分離系統所保留。 細胞培養駿於~分離系統循環，例如過遽器裝置循 %，讓細胞k養醪通過分離系統，例如過㈣、，結果導致 液U Μ及物可維持於反應器内或反向進給回反應 器之流。其内容物維持於反應⑽或反向進給回反應器内 之Ufh、3有具有分子量至少等於或高於該生物物 貝之刀子I成刀gj此該液流將包含比液體流出流更大 量之生物物質。 15 20 殊限制’於本發明方法期間何時細胞 培養開始循環通過分離备^ 承統。細胞培養醪的循環例如可始 12 200813216 於該方法的起點’或可始於細胞之活細胞數目達到某個程 度時。 〃 細胞培養義環於過慮器上可為就過渡器表面之實質 垂直流，也稱作為死端流；或循環可為實質上平行於= 5器表面之流，也稱作為正切流，例如單向正切流(τ呢或2 叉流。交叉流之較佳實例為交替正切流(ATF)，原因在於使 用AT F，發現即使於極高細胞密度也不會(快速）出現過滤器 阻塞。-般瞭解於深部過滤時，最終小孔隙過渡器需要藉 過转前置過滤器來保護避免阻塞。本實務係基於—般瞭解 10有較小孔隙或有較小MWC0之過渡器較容易阻塞，因而限 制生產時間。若使用ATF，則無需使用前置過渡器。 T流可藉由移動培養醪導引，藉由移動域器或藉由 二者導引。過渡器例如可藉旋轉移動(旋轉過滤⑸或藉振動 移動(振動過攄器）。另外，若液流之經由移動細胞培養酵導 15引，過渡器為靜態，細胞培養酵例如可藉幫浦或藉加壓移動。 「 交替正切流」一詞表示於過濾器表面之相同方向（亦 即2切過渡器表面）只有一道液流，該液流來回移動，以及 =實質垂直於該過濾器表面方向之另一道液流。交替正切 /爪可根據熟諸技藝人士已知之方法(例如述於us 6,544,424) 20來達成。 =、、、田胞培養過程中，至少一種細胞培養基成分，例如 &種或夕種養分及/或細胞培養基可進給至細胞。於根據本 八/之方法中，較佳藉由養分進料之進給反應器來補充部 或車又乜補充全部至少一種被耗盡的養分。例如完全細胞 13 200813216 培養基可進給至反應器，完全細胞培養基較佳係呈分開進 料，因此無需分開準備。細胞培養基例如可以較為濃縮形 式進給至細胞；其優點為體積較小因此較容易處理。此外， 一種或多種養分可進給至反應器。例如碳水化合物例如葡 5 萄糖或果糖；胺基酸諸如麩胺或胜肽類也較佳進給至反應。 於本發明之較佳實施例中，細胞培養條件經選擇，讓 細胞生長速率及/或細胞之比生產力未受限制，更佳細胞培 養基之至少一種成分之濃度維持大致上恆定。限制細胞培 養條件之實例為養分限制及抑制性代謝產物(諸如氨_、二 10 15 20 氧化碳及乳酸鹽）的形成。舉例言之，細胞培養條件諸如進 料可選擇讓細胞生長速率不受限制，例如經由供給足量養 分來補償養分的耗盡；及/或避免製造出抑制性代謝產物諸 如乳酸鹽或氨。舉例言之，可選擇通氣條件，讓二氧化碳 的形成不會限制細胞生長速率。於非限制性條件下生長的 細胞由優良製造規範(GMP)觀點看來高度較佳，原因：於 1)可獲得恒定細胞培養環境，於多種情況下，可獲得穩定 良好之產品品質·’以及2)可獲得高細胞存活率，於某些情 況下，可獲得大於98%之細胞存活率。高細胞存活率^ 低細胞相關污染物諸如宿主細胞蛋白㈣釋放，而有助於 產物的純化。此外，細胞於不受限制之細胞生長速式 不受限制之比生產力生長’具有商業優勢，如此生長细胙 可於甚至更短時間内製造更大量生物㈣，原因在^^ 方法將可更早期達到更高細胞密度。 、Μ 細胞之「比生產力」騎單位時間每個細胞所製造之 14 200813216 給定生物物質數量，通常係以皮克細胞·^表示。 至少一種細胞培養基成分例如養分及/或細胞培養基 添加至細胞培養之添加速率（流人速率注速率）影變細 胞的存活率及細胞密度。於本發明方法中細胞培養基成 5分諸如養分及/或城鱗基可㈣如連賴、半連續流例 如階梯式流或交錯流進給。較佳，細胞培養基成分例如養 分及/或細胞培養基係以連續流添加。 細胞培養基成分諸如完全細胞培養基及/或養分原則 上可於方法過程中之任何時間進給至反應器。較佳，進料 Π)係始於酶基質諸如麵胺基葡萄糖達到過低濃度，因而導致 細胞生長停止之前；或進料係始於抑制性代謝產物諸如乳 酸鹽或氨達到高濃度結果細胞生長停止之前。由此點開 始，細胞培養基成分諸如養分及/或完全細胞培養基較佳係 以符合酶基質的需求之速率進給至反應器。 ， 15 於本發明之一個實施例中，細胞培養基係以根據式⑴ 之進給速率添加： 進給速率= SFRx(總細胞培養醪體積）χ(存活細胞密度）（1) 其中進給速率係以每日之升數表示，其中SFR為比進 20給速率，亦即細胞培養基進給至細胞培養醪之速率，以每 單位時間每個存活細胞之培養基添加量表示；以及其中存 活細胞密度為每單位體積之存活細胞數目。存活細胞數目 可由熟諳技藝人士例如透過崔朋藍（trypan blue)排除方法 測定。比進給速率較佳係選用〇 〇1至〇 3奈升/細胞/日，更佳 15 200813216 為〇·〇1至0.2奈升/細胞/曰。 碉正進π迷率時考慮額外參數 至培養膠之葡萄糖數量及/或氧攝取速率。舉== 5 Γ二:培養基及/或養分之進給速率較佳係選用葡萄 辰度維持於3至20毫莫耳/升，更佳維持於…5毫莫耳/ :本發明之特定實施财，細胞培麵（包括細胞、生 .物質及細胞培養基）至少由反應器移開—次：添加液體例 如細胞培養基或養錢料至反應絲補償細胞培養酵的移 ^細胞培養醪的移除可能導致較長方法時間，於高細胞 社、度組合高細胞存活率，導致較高生產力。細胞培養酵可 連續移除或階段式移除。 升。較佳葡萄糖濃度至少為3毫莫耳/升，更佳至少5毫莫耳 /升且較佳至多2〇毫莫耳/升更佳至多ls毫莫耳/升 於本發明之較佳實施例中，一旦達到期望之細胞密 度例如細胞岔度至少為ΙΟχΙΟ5存活細胞/毫升，較佳至少 2〇xl06存活細胞/毫升，更佳至少3〇χ1〇6存活細胞/毫升例如 至多2〇〇xl〇5存活細胞/毫升之細胞密度時，細胞培養醪（包 括細胞、生物物質及細胞培養基）由反應器移出 ;以及例如 細胞培養基或養分進料等液體添加至反應器來補償所移除 20之細胞培養醪。較佳細胞培養醪之移除速率允許細胞密度 維持於期望之細胞密度之範圍。本發明之此一實施例比較 習知批次法或批次式進給法高度優異，原因在於組合本發 明方法之優點於可夠長時間維持高存活率，因此可實現甚 至更鬲之總體積生產力。「體積生產力」一詞表示每單位時 16 200813216 間每單位反應器體積所生產之生物物質數量，通常係以克· 升―1·日―1表示。比較習知灌注方法，本發明之實施例也高度 較佳，原因在於其組合本發明方法之優點與細胞培養醪移 除流含有高濃度生物物質。於細胞培養醪移除流中之高濃 5 度生物物質可由其中收穫生物物質因而於商業上獲得高度 感興趣。於其中細胞培養被移除之習知灌注方法中，細胞 培養移除流不含足量生物物質來讓收穫生物物質有商業價 值，細胞培養的移除流通常被視為廢棄物。因此，於本發 明之實施例中，理論上全部製造的生物物質皆可以直捷、 10 經濟可行且簡單之方式收穫。 於本發明之特佳實施例中，細胞培養條件係選用細胞 生長速率及/或細胞之比生產力未受限制，且更佳細胞培養 條件係選擇也讓細胞培養基之至少一種成分諸如葡萄糖或 麵胺成分之濃度維持恆定，以及一旦達到期望之細胞密度 15時細胞培養醪至少由反應器移除一次，且液體例如細胞培 養基添加至反應器來補償該細胞培養_的移除。 較佳流出流速率係選用實質等於至少一種細胞培養基 成分例如養分及/或細胞培養基之添加速率減任選的細胞 培養醪移除速率。 20 製造生物物質的細胞例如為可表現該生物物質之編碼 基因之細胞。可表現該生物物質之編碼基因之細胞例如可 經由使用一質體轉感染該等細胞而製備，該質體含有該生 物物質之編碼基因及適當選擇標記之編碼基因，例如新徽 素(neomycine)抗藥性編碼基因（Neo編記基因）。然後穩定轉 17 200813216 感染細胞可藉選擇壓力來選出。例如以Neo標記基因為例， 經由將轉感染的細胞於G418(珍那瑞辛（genericin))存在下 培養，即刻篩選具有高度該生物物質表現程度之細胞之選 擇壓力下選出。製備表現一種蛋白質之E1-永生化HER細胞 5純株之方法及培養此種細胞來製造該種蛋白質之方法為熟 諳技藝人士眾所周知，例如可參考US 6,855,544。 可由細胞所製造之生物物質，例如可經由表現一（重組) 編碼基因所製造之生物物質因而為（重組)蛋白質，特別為受 體峰融3蛋白質、血液蛋白質例如得自血液凝固串級 之蛋白貝 '夕功能蛋白質例如紅血球生成素、病毒蛋白質 或、、田菌蛋白貝例如用於疫苗;免疫球蛋白例如抗體如IgG或 IgM等，較佳為細胞製造之蛋自質更佳為細胞製造之抗體。 、田胞製^之生物物質諸如蛋白質或疫苗可用於藥學 製劑作為活性成分。於本發明之内文中，「產物」一詞盘「生 15物物質」一詞互換使用。 —於本發明之架構内，藥學製劑_詞表示任—種可用作 為藥物特则於人體作為藥物之製劑。此種藥物例如可用 於痛或用於預防目的，例如疫苗及/或用於治療目的例如 20 乏之或蛋白質或殺死非期望的細胞之抗體。藥學 製d可進步含有藥學上可接受之載劑或賦形劑，其實例 為熟諳技藝人士眾所周知。 主 6、、田皰系可用於製造生物物質，諸如e卜排空腺 病毒(例如參考美國專利6,994，128 ;版⑽等人，腫腺 病毒載體之繁殖；PER伽胞之使用於：Curiel D. Douglas 18 200813216 JT編輯，基因治療用之腺病毒載體，聖地牙哥：艾索維亞 (Elsevier)，129-167頁、其它病毒(例如參考WO 01/38362)、 或重組蛋白質例如參考美國專利6,855,544 ; Yallop等人， 2005，PER.C6細胞用於製造生物藥學蛋白質，新穎生藥： 5 設計、發展及優化，第4輯，779-807，J0rg Knablein(編者)）。 可用於藥學製劑（括出商品名）作為活性成分之蛋白質 實例包括鐵尼太普拉斯(Tenecteplase) (TN Kase)、（重組)抗 嗜血因子(瑞法妥(ReFacto))、類淋巴母細胞干擾素α-ηΐ (偉 費隆（Wellferon))、（重組）凝血因子（諾佛席分 10 (NovoSeven))、伊坦尼賽普（Etanercept)(英布爾（Enbrel))、 萃司土馬（Trastuzumab)(赫賽普丁（Herceptin))、英富西馬 (Infliximab)(瑞米凱(Remicade))、帕里席祖馬（Palivizumab) (賽納吉（Synagis))、巴席里西馬（Basiliximab)(西慕列 (Simulect))、達可立祖馬（Daclizumab)(西那帕（Zenapaz))、 15瑞土西馬（Rituximab)(瑞土山（Rituxan))、（重組）第IX凝血因 子（貝 >圼費（Benefix))及干擾素β-la(阿佛；®(Avonex))。 可用作為藥學製劑之活性成分之疫苗實例包括經分離 之蛋白質抗原，其實例包括但非限於活、口服、四價輪狀 病毒疫苗（瑞塔席爾（RotaShield))、狂犬病疫苗（藍阿佛 20 (RanAvert))、流行性感冒疫苗及鈍化A型肝炎疫苗（法可塔 (VAQTA)) 〇 培養基之pH、溫度、溶氧濃度及滲透度原則上並無特 殊限制，且係依據所選用的細胞類型決定。較佳，pH、溫 度、溶氧濃度及滲透度經選擇因而對細胞的生長及細胞生 19 200813216 產力為最佳。熟諳技藝人士瞭解如何找到培養之最佳pH、 溫度、溶氧濃度及滲透度(例如參考WO 2004/099396)。較 佳用於本發明方法，當使用Ei_永生化HER細胞時，pH係選 用6.6至7.6及/或溫度係選用3〇°c至39°C及/或滲透度係選用 5 260至40〇毫滲透度/千克(mOsm/kg)。為了維持最佳方法條 件，期望自動化控制方法條件。為了獲得最佳方法條件， 例如細胞生長停止來獲得較高生產力，於培養期間可施加 培養條件的變定。例如可藉溫度變動（例如由37°C至32°C)、 pH變動或滲透壓變動來建立。 10 本發明方法原則上可於任一型適合用於細胞培養之細 胞培養基進行。細胞培養基及細胞培養條件之選用指南為 眾所周知，例如提供於Freshney，R· I.動物細胞培養(基本技 術手冊）第4版2000年Wiley-Liss之第8章及第9章；以及提供 於Doyle，A·，Griffiths，J. B·，Newell，D. G·細胞與組、織培 15 養：實驗室程序1993年，約翰威利父子公司。 舉例言之，細胞培養基例如包含碳水化合物源、鹽類 及/或胺基酸及/或維生素及/或脂質及/或清潔劑及/或緩衝 劑及/或生長因子及/或激素及/或細胞激素及/或微量元素來 作為細胞培養基成分。碳水化合物來源實例包括葡萄糖、 2〇 果糖、半乳糖及丙酮酸鹽。鹽類之實例包括鎮鹽例如 MgCl2*6H20、MgS〇4 及 MgS〇4.7H2〇 ;鐵鹽例如 FeS〇4’7H2〇，钟鹽例如 KH2PO4、KC1 ;納鹽例如 、
NaaHPO4;及鈣鹽例如CaClr2H2〇。胺基酸之實例包括全部 已知之蛋白質產生性胺基酸諸如組胺酸、麵胺、蘇胺酸、 20 200813216 絲胺酸、蛋胺酸。維生素之實例包括抗壞血酸、生物素、 膽鹼.C1、肌糖醇、D-泛酸、核糖黃素、脂質之實例包括脂 肪酸例如亞麻酸及油酸；清潔劑之實例包括呑恩(Tween) 80 及普隆尼克（Pluronic) F68。緩衝劑之實例包括HEPES及 5 Na2C03。生長因子/激素/細胞激素之實例包括IGF (胰島素 狀生長因子）、氫皮質酮(hydrocortisone)及（重組)胰島素。 微量元素之實例為熟諳技藝人士所已知且包括辞、鎂及 石西。細胞培養基例如也包含其它細胞培養基成分例如大豆 蛋白睐或乙醇胺。 10 用於根據本發明之生物物質之製造，特別若該生物物 質欲用作為藥學製劑之活性成分，以不含血清之培養基優 於含有血清來源之培養基。其理由在於血清來源之培養基 可月匕污染有病毒’存在有普利子感染(pri〇nic infecti〇ns)的 風險，可能造成下游生藥產品製造上的重大障礙(換言之， 15 由細胞培養中進一步純化該生物物質的重大障礙）。因此本
發明方法較佳係於不含來自於動物來源包括人類來源之血 清之細胞培養基進行。因得自哺乳動物來源之化合物也具 有感染風險，故較佳細胞培養基為不含哺乳動物來源（亦即 細胞培養基不含得自哺乳動物來源之血清或成分）。更佳， 20細胞培養基為不含動物來源（亦即細胞培養基不含來自動 物來源包括人類來源之血清或成分）。可用於培養pERC6 細胞之不含血清之培養基之實例包括市售培養基例如EX
Cell VPR0培養基(SAFC)、HyQ® CDM4Retino(海可隆）、IS ProVec CD(艾文科學公司（irvine scientific))、293-SFM II(因 21 200813216 維左金公司（invitrogen))。 於較佳實施例中，於本發明方法製造之生物物質係由 液流中收穫，該液流之内容物係維持於反應器或較佳反向 進給回反應為'’或收獲自由反應裔中移除之細胞培養_ ; 5或收獲自一^者。於本發明方法所製造之生物物質可使用與 生物物質相關之方法而進一步有所謂之下游處理之細胞培 養醪中收穫，該等使用之方法為熟諳技藝人士眾所周知。 下游處理通常包含以各種組合及各種順序之數個純化步 雜。於下游處理之純化步驊之實例為分離步驟(例如藉親和 1〇層析術及/或離子交換層析術及/或藉水性二相系統萃取及/ 或例如藉硫酸銨沉澱）、濃縮生物物質之步驟(例如藉超濾或 滲濾濃縮）、交換緩衝液之步驟及/或去除病毒或鈍化病毒之 少鱗(例如經由病毒過渡、pH變換或溶劑清潔劑處理）。 於一個態樣中，本發明係關於一種細胞培養，包含哺 15乳動物細胞較佳為E1-永生化HER細胞，更佳為1>£扎〇:6細 胞，具有活細胞密度至少為50xl06細胞/毫升，較佳至少為 6〇xl〇6細胞/毫升，特別至少為9〇χΐ〇6細胞/毫升，及具有生 物物質濃度至少為5克/升，更佳至少為1〇克/升，特別至少 為11克/升。原則上，生物物質濃度係如生物物質之溶解度 2〇所允許儘可能為高濃度。活細胞濃度典型為不超過200χ106 細胞/¾升，且較佳係於8〇_15〇χ1〇6細胞/毫升之範圍。 /舌細胞密度例如可使用崔朋藍排除法例如使用市面上 得自以伊諾法提公司（innovates)(西戴司（Cedex)細胞計數器） 之細胞計數器。 22 200813216 細胞培養表示包含細胞培養基、細胞及生物物質之液 體，該液體係細胞於反應器内於細胞培養基培養程序之結 果，其中該細胞製造該生物物質。 現在將藉下列實例說明本發明，但非限制性。 5圖式簡單說明 第1圖顯示方法A(批次）、B(抵次式進給)及C1(本發明 方法)之活細胞密度Y(106毫升])相對於處理時間X⑻之作圖。 第2圖顯示方法Α(批次）、β(抵次式進給)及叫本發明 方法)之反應器Ζ中之TgG濃度（比較方法八之邮濃度之百分 10 比)相對於處理時間x(日）之作圖。 第3圖顯示方法A(批次）、B(抵次式進給)及以本發明 方法)之活細胞密度Y⑽毫升])相對於處理時财(日）之作圖。 第4圖顯示方法A(批次）、B(批次式進給)AC2(本發明 方法)之反應、器Z中之IgG濃度（比較方法八之收濃度之百分 15 比)相對於處理時間x(曰）之作圖。 第5圖顯不方法A(批次）、B(批次式進給)及C3(本發明 方法)之活細胞後度Y(10毫升】)相對於處理時間乂⑻之作圖。 第6圖顯不方法A、及C3之反應器2中之IgG濃度（比較 方法A3之IgG濃度之百分比)相對於處理時間χ⑻之作圖。 2〇 帛7關示方法Α之累進產率Q(比較每個反應 器體積，於方法A之產率之百分比）相對於處理時間χ(日） 之作圖。 第8圖顯示C4(本發明方法）之細胞數目γ(1〇6毫升’相 對於處理時間Χ(日）之作圖。 23 200813216 第9圖顯示方法c 4 (本發明方法）之一實施例於反應器z 之IgG濃度（比較所達到之最大igG濃度之百分比）相對於處 理時間X(日）之作圖。 I：實施方式3 5 較佳實施例之詳細說明 實例 列1 :批次法、批次式進給法及根攄本發明方法間之 於本實例中，根據本發明之方法之效能與批次法及批 次式進給法作比較。 10 第1圖顯示方法A(批次）、B(批次式進給)及Cl(本發明 方法)之活細胞密度Y(l〇6毫升，相對於處理時間X(日）之作圖。 第2圖顯示方法A(批次）、B(批次式進給)及Cl(本發明 方法）之反應器Z中之IgG濃度（比較方法A之IgG濃度之百分 比)相對於處理時間X(曰）之作圖。 15 全部發酵皆係使用沙妥立思（Sartorius)生物史塔
(Biostat) B控制器將溫度控制於36.5°C，pH於7·2至6.8及DO 於50%空氣飽和度及於200rpm進行。全部實驗係使用相同 之可製造IgG之PER.C6細胞系（參考W0 2004/099396)。 批次法A 2〇 批次法係於沙妥立思B5容器中於4升工作量進行。細 胞以3xl〇5細胞/毫升接種於補充6mM L_麵胺之VPR0培養 基(SAFC)及隨後培養17曰。
批次式進給法B 批次法係於沙妥立思B5容器中於4升工作量進行。細 24 200813216 胞以3χ105細胞/毫升接種於補充6mM L-麩胺之VPRO培養 基(SAFC)。於培養期間，添加葡萄糖及麩胺，來分別維持 派度咼於15mM及lmM。由第5日開始添加胺基酸及胜肽來 補充所耗用之胺基酸。 5 本發明方法C1 本發明方法係於2升艾普立康容器内進行。得自奇異 公司（GE)之100 kDa分子量截留（MWCO)中空纖維膜以ATF 流動模式操作’使用ATF-2系統（精製技術公司（Refine Techn〇l〇gy))用來保留細胞及IgG產物。培養始於3xl〇5細胞 1〇 /毫升於補充6mM L·麩胺之VPR〇培養基(SAFC)。補充6mM L-麵胺之VPRO培養基(SAFC)係使用比流速(SFR)為0.05及 0.2奈升/細胞/日灌注通過懸浮液細胞培養_。所得最高產 物濃度為1.4克/升。 本發明方法比較所述培養模式可於較短時間内獲得 15較高活細胞密度及較高產物濃度，由如下第1圖及第2圖可知。 艾沬 ,、_-括次式據本發明方法間之出_ 於本實例中，根據本發明方法再度與批次法及批次式 進給法比較；於方法C2中，二氧化碳壓力經控制，及使用 50 kDa分離系統。 2〇 第3圖顯不方法A(批次）、B(批次式進給)及C2(本發明 方法)之活細胞密度Y(106t升-1)相對於處理時間χ(日）之作圖。 第4圖顯示方法Α(批次）、Β(批次式進給)及C2(本發明 方法）之反應器Z中之IgG濃度（比較方法a之IgG濃度之百分 比)相對於處理時間χ(曰）之作圖。 25 200813216 全部發酵皆係使用沙妥立思生物史塔B控制器將溫度 控制於36.5°C，pH於7.2至6.8及DO於50%空氣飽和度及於 200rpm進行。全部實驗係使用相同之可製造IgG之pER C6 細胞系（參考WO 2004/099396)。
5 批次法A 批次法係於沙妥立思B5容器中於4升工作量進行。細 胞以3xl05細胞/毫升接種於補充6111?^ 麩胺之vpR〇培養 基(SAFC)及隨後培養π曰。
批次式進給法R 10 批次法係於沙妥立思B5容器中於4升工作量進行。細 胞以3xl05細胞/毫升接種於補充6111]^ L-麩胺之VPRO培養 基(SAFC)。於培養期間，添加葡萄糖及麵胺，來分別維持 濃度高於15mM及ImM。由第5日開始添加胺基酸及胜肽來 補充所耗用之胺基酸。 15 本發明方法C2 本發明方法係於2升艾普立康容器内進行。5〇kDa分子 量截留（MWCO)中空纖維膜(ge)於ATF流動模式使用ATF-2 系統(精製技術公司）操作，用來保留細胞及IgG產物。培養 始於3xl〇5細胞/毫升於補充6niM L-麩胺之VPRO培養基 20 (SAFC)。補充6mM L-麩胺之VPRO培養基(SAFC)係使用比 流速(S F R)為0 · 0 5及〇 · 2奈升/細胞/日灌注通過懸浮液細胞培 養醪。二氧化碳濃度控制低於15%。 結果 如由第3圖及第4圖可知，根據本發明方法於相等時間 26 200813216 或較少時間（100%批次時間；81%批次式進給時間）獲得顯 著提咼之活細胞密度及較高產物濃度(2415%X批次產率； 690%x批次式進給產率）。 本發明方法之總生產率增高（以克·升-1·曰·ι表示）為批 5次生產力（以克·升十日-1表示）之23.9倍，及為批次式進給生 產力（以克·升-1·曰-1表示）的8·5倍。於本發明方法〇2中，製 造11·1克產物/升。17日期間未出現保留裝置的阻塞，即使 使用極高細胞密度也未發生。
於本實例中，根據本發明方法伴以細胞培養醪移除效 能再度與批次法及批次式進給法作比較；於方法C3中，細 胞培養醪已經被移除。 第5圖顯示方法Α(批次）、Β(批次式進給)及C3(本發明 方法)之活細胞密度γ( 1 〇6毫升-1)相對於處理時間χ(日）之作圖。 第6圖顯示方法A、及C3之反應器Ζ中之IgG濃度（比較 方法A3之IgG濃度之百分比)相對於處理時間义（日）之作圖。 第7圖顯示方法A、B及C3之累進產率q(比較每個反應 器體積，於方法A之產率之百分比）相對於處理時間义（曰） 之作圖。 全部發酵皆係使用沙妥立思生物史塔B控制器將溫度 控制於36.5 C ’ pH於7.2至6.8及DO於50%空氣飽和度及於 20〇rpm進行。全部實驗係使用相同之可製造IgG之pER.c6 細胞系（參考WO 2004/099396)。
批次法A 27 200813216 批次法係於沙妥立思B5容器中於4升工作量進行。細 胞以3x10細胞/毫升接種於補充6111]^ L_麩胺之vpR〇培養 基(SAFC)及隨後培養π曰。
批次式進給法R 5 批次法係於沙妥立思B5容器中於4升工作量進行。細 胞以3xl05細胞/¾升接種於補充6mM L_麩胺之vpR〇培養 基(SAFC)。於培養期間，添加葡萄糖及麩胺，來分別維持 濃度高於15mM及ImM。由第5日開始添加胺基酸及胜肽來 補充所耗用之胺基酸。 10 木發明方法C3 本發明方法係於2升艾普立康容器内進行。1〇〇 kDa分 子量截留（MWCO)中空纖維膜（GE)於ATF流動模式使用 ATF-2系統（精製技術公司）操作，用來保留細胞及IgG產 物。培養始於3xl05細胞/毫升於補充6mM l-麵胺之VPRO 15培養基(SAFC)。補充6mM L_麵胺之VPRO培養基(SAFC)係 使用比流速(SFR)為〇·〇5及〇·2奈升/細胞/日灌注通過懸浮液 細胞培養醪。每日於高於細胞密度l〇xl〇6細胞/毫升-1時以 10%工作里移除細胞培養if，而當活細胞密度超過 細胞/毫升-1及以上時以每日之30%工作量移除。 20 結果 如由第5圖可知，使用本發明方法可快速達成較高活細 胞密度。第5圖也顯示使用本發明方法，細胞存活率可較長 時間維持’方法C3可維持知作超過接近4〇日時間，即使高 細胞密度，保留裝置仍然未發生阻塞。 28 200813216 第6圖顯示本發明方法之產物濃度遠比批次法之產物 濃度更高。含有產物之產物流比較批次法A之終濃度可以約 200%至250%之倍數收穫自方法C3。 第7圖顯示大部分產物係藉本發明方法形成，本發明方 5法可比較批次法A或批次式進給法B維持更長時間。於第17 曰，方法C3之累進產率為批次法(A3)累進產率之81倍，而 為批次式進給法(B)之累進產率之2·丨倍。此外，於第17曰， 批次法結束。於第21日，方法C3之累進產率為批次式進給 法之累進產率之3.〇倍。於第21日批次式進給法結束。於第 1〇 39日後’方法C3之總累進產率為批次法A之累進產率之25 倍而為批次式進給法B之累進產率之6倍。 由本實驗獲得結論，於根據本發明方法中期望之生物 材料之總產率可具有於細胞密度超過某個高濃度時排放細 胞培養醪來進一步改良。 15 實例4 : CHO細胞之接養及寧洁 於本實例中’根據本發明之方法係使用可製造IgG之 CHO細胞系進行’包括溫度下降來降低細胞生長。 第8圖顯不C4(本發明方法）之細胞數目γ(1〇6毫升_ι)相 對於處理時間Χ(日）之作圖。 2〇 帛9圖顯不方法C4 (本發明方法)之-實施例於反應器 z之IgG濃度（比較所達到之最大IgG濃度之百分比）相對於 處理時間X(日）之作圖。 發酵係使用沙妥立思生物史塔B控制器控制溫度於 6.5 C PH於7· 1至6.9及DO於40%空氣飽和度及於lOOrpm 29 200813216 進行。於第5日溫度降至32°c。 本發明方法C4 本發明方法係於2升艾普立康容器内進行。細胞及產物 保留裝置為於ATF流動模式附有ATF_2系統(精製技術公司） 5之5驗分子量戴留（MWC〇)中空纖維膜(奇異公司）。培養 係始於5X106細胞/毫升於MTCM-49培養基（海可隆公 司）i口養基使用SPR為〇.1至〇 4奈升細胞.!日灌注通過懸 浮液細胞培養醪。二氧化碳壓力控制低於15%。 結果 1〇 資料顯示當使用可製造蛋白質之CHQ細胞系時，本發 明方法也有效。所達成之細胞密度及產物濃度比批次培養 高。資料也顯示於根據本發明之方法中，可停止細胞培養 (例如藉溫度下降），而產物積聚於培養祕仍然持續。 實例5 ··使用骨懸應胞系進行本發明方法 15 根據本發明方法也可應用於骨髓瘤細胞系。為了達成 此項目的’使用沙妥立思生物史塔B控制器將溫度控制於 36.5 C，pH控制於7.2至6.8及DO控制於40%空氣飽和度及於 lOOrpm進行發酵。細胞培養始於以3χ1〇5細胞/毫升接種骨 髓瘤細胞於5升沙妥立思容器内之SFM4]v[ab培養基（海可隆 20公司）。細胞及產物保留裝置為附有ATF-4系統(精製技術公 司）於ATF流動模式操作之3〇kDa分子量截留（Mwc〇)中空 纖維膜（奇異公司）。SFM4Mab培養基（海可隆公司）係使用 SPR為0.1至0.4奈升·細胞十曰-1灌注通過懸浮液細胞培養 曝。二氧化碳壓力控制低於15〇/0。 30 200813216 膏例6 :使用MDCK細胞系淮杆也^明方法 根據本發明方法也可應用於轉形MDCK細胞系。為了 達成此項目的，使用沙妥立思生物史塔B控制器將溫度控制 於36.5°C ’pH控制於7.2至6.8及DO控制於4〇%空氣飽和度及 5於lOOrpm進行發酵。細胞培養始於以3xl〇5細胞/毫升接種 轉形MDCK細胞於5升沙妥立思容器内之vp_SFM培養基 (因維左金公司）。細胞及產物保留裝置為附有ATF_4系統(精 製技術公司）於ATF流動模式操作之3〇kDa分子量截留 (MWCO)中空纖維膜（奇異公司）。Vp_SFM培養基（因維左金 ίο公司）係使用SPR為0.丨至0·4奈升·細胞-1·日-1灌注通過懸浮 液細胞培養酵。一^氧化$反壓力控制低於15 %。 【圖式簡單說明】 第1圖顯不方法A(批次）、B(批次式進給)及〇1(本發明 方法)之活細胞擂度γ(ιο笔升q相對於處理時間χ(日）之作圖。 15 第2圖顯不方法Α(批次）、Β(批次式進給)及Cl(本發明 方法）之反應！§z中之IgG濃度（比較方法A之IgG濃度之百分 比）相對於處理時間X(曰）之作圖。 第3圖顯不方法A(批次）、B(批次式進給)及C2(本發明 方法)之活細胞密度Y(10宅升])相對於處理時間X⑻之作圖。 20 第4圖顯示方法Α(批次）、Β(批次式進給)及C2(本發明 方法)之反應ι§ζ中之igG濃度（比較方法mgG濃度之百分 比)相對於處理時間x(日）之作圖。 第5圖顯不方法A(批次）、叫批二欠式進給^C3(本發明 方法)之活細胞密度γ(106毫升])相對於處理時間χ(日）之作圖。 31 200813216 第6圖顯示方法A、及C3之反應器Z中之IgG濃度（比較 方法A3之IgG濃度之百分比)相對於處理時間χ(日）之作圖。 弟7圖顯示方法A、Β及C3之累進產率q(比較每個反應 為體積，於方法A之產率之百分比）相對於處理時間χ(日） 5 之作圖。 弟8圖顯示C4(本發明方法）之細胞數目γ(ι〇6毫升-1)相 對於處理時間Χ(日）之作圖。 弟9圖顯示方法C4(本發明方法）之一實施例於反應器Ζ 之1gG濃度（比較所達到之最大TgG濃度之百分比）相對於處 °理時間X(日）之作圖。 【主要元件符號說明】 (無） 32

Claims (1)

  1. 200813216 十、申請專利範圍： 1. 一種於一反應器於一細胞培養基之懸浮液培養細胞之 方法， 其中該等細胞製造一生物物質，其中至少一種細胞 5 培養基成分係進給至該細胞培養醪；以及 其中包含該生物物質及細胞培養基之細胞培養醪 循環通過一分離系統；以及 其中該分離系統將該生物物質與具有分子量比該 生物物質更低之該等物質分離；以及 10 其中該生物物質係保留於反應器或反向進給回該 反應器内。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中部分較低分子量物 質係由細胞培養中連續移除。 3. 如申請專利範圍第1-2項中任一項之方法，其中該等細 15 胞為哺乳動物細胞，較佳為E1-永生化HER細胞，更佳 為PER.C6細胞。 4. 如申請專利範圍第1_3項中任一項之方法，其中該生物 物質為重組蛋白質，較佳為抗體。 5. 如申請專利範圍第1_4項中任一項之方法，其中該分離 20 系統為過濾器，較佳為膜過濾器，更佳為中空纖維過濾器。 6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該細胞培養係以交 叉流較佳為交替正切流循環通過該過濾器。 7. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之方法，其中細胞培 養醪係由反應器至少移出一次；以及液體較佳為細胞培 33 200813216 養基係添加至該反應器來補償該細胞培養醪的移除。 8.如申請專利範圍第1-7項中任一項之方法，其中細胞培 養條件經選擇讓細胞生長速率及細胞之比生產力不受 限制。 5 9.如申請專利範圍第8項之方法，其中該細胞培養條件經 選擇讓該細胞培養基之多個成分中之至少一者之濃度 維持恒定。 10. 如申請專利範圍第1-9項中任一項之方法，其中至少被 耗盡之養分係經由進給此專養分至该反應裔來部分補 10 充或較佳為全部補充。 11. 如申請專利範圍第M0項中任一項之方法，其中該生物 物質視需要可由該等細胞及/或由細胞培養醪中收穫。 12. —種包含哺乳動物細胞之細胞培養，具有活細胞密度至 少為50xl06細胞/毫升及生物物質濃度至少為5克/升。 15 13.如申請專利範圍第12項之細胞培養，其中該生物物質濃 度至少為10克/升，較佳至少為11克/升。 14.如申請專利範圍第12-13項中任一項之細胞培養，其中 該哺乳動物細胞為E1-永生化HER細胞，較佳為PER.C6 細胞。 34
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1930281A (zh) * 2004-03-05 2007-03-14 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于通过连续灌注和交互切向流来培养细胞的方法
US8585594B2 (en) * 2006-05-24 2013-11-19 Phoenix Biomedical, Inc. Methods of assessing inner surfaces of body lumens or organs
KR20120009530A (ko) 2006-07-14 2012-01-31 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 개선된 세포 배양 방법
US9109193B2 (en) * 2007-07-30 2015-08-18 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Continuous perfusion bioreactor system
US8623650B2 (en) * 2007-10-19 2014-01-07 Viacyte, Inc. Methods and compositions for feeder-free pluripotent stem cell media containing human serum
US9238792B2 (en) * 2009-09-15 2016-01-19 E I Du Pont De Nemours And Company Compartmentalized simultaneous saccharification and fermentation of biomass
WO2011045378A1 (en) 2009-10-15 2011-04-21 Crucell Holland B.V. Method for the purification of adenovirus particles
MX2012004221A (es) 2009-10-15 2012-06-08 Crucell Holland Bv Proceso para purificacion de adenovirus de cultivos de alta densidad celular.
WO2012030512A1 (en) 2010-09-03 2012-03-08 Percivia Llc. Flow-through protein purification process
CN103154233A (zh) * 2010-10-05 2013-06-12 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 生产蛋白质的方法
SG192611A1 (en) 2011-02-10 2013-09-30 Crucell Holland Bv Pneumatic alternating pressure membrane cell separation system
RU2580020C2 (ru) * 2011-04-29 2016-04-10 Биокон Рисерч Лимитед Способ снижения гетерогенности антител и способ получения соответствующих антител
WO2012156356A1 (en) 2011-05-13 2012-11-22 Octapharma Ag A method of increasing the productivity of eucaryotic cells in the production of recombinant fviii
WO2013006479A2 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Amgen Inc. Mammalian cell culture
TWI637057B (zh) 2012-11-09 2018-10-01 拜爾沙納有限公司 具交替生物反應器用途之不連續進料批次製程
US9975095B2 (en) 2012-11-29 2018-05-22 Emd Millipore Corporation Container having magnetic impeller assembly with hood
AU2014228275B2 (en) * 2013-03-15 2019-03-14 Genzyme Corporation High-density cell banking methods
US10316282B2 (en) 2013-03-19 2019-06-11 Cmc Biologics A/S Method for producing a product (e.g. polypeptide) in a continuous cell culture fermentation process
BR112016005545B1 (pt) * 2013-09-16 2021-06-01 Genzyme Corporation Método de processamento de uma cultura de células de mamífero
BR112016006063A2 (pt) * 2013-09-30 2017-08-01 Crucell Holland Bv método para clarificação de uma colheita de cultura celular em bruto
PT3152317T (pt) 2014-06-04 2019-04-18 Amgen Inc Métodos de colheita de culturas de células de mamíferos
PL3158055T3 (pl) * 2014-06-13 2020-03-31 Csl Limited Ulepszone wytwarzanie rekombinowanego czynnika von Willebranda w bioreaktorze
KR102364111B1 (ko) 2014-07-24 2022-02-17 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 세포 배양물로부터 폴리오바이러스의 정제 방법
JP6530171B2 (ja) * 2014-09-09 2019-06-12 旭化成メディカル株式会社 培養産生物の回収方法
EP3423158B1 (en) 2016-02-24 2023-11-15 The Rockefeller University Embryonic cell-based therapeutic candidate screening systems, models for huntington's disease and uses thereof
WO2017180724A1 (en) * 2016-04-12 2017-10-19 Artemis Biosystems, Inc. Perfusion filtration systems
WO2018159847A1 (ja) 2017-03-03 2018-09-07 富士フイルム株式会社 細胞培養装置及び細胞培養方法
IL273549B2 (en) 2017-10-06 2023-10-01 Lonza Ag Automated control of cell culture using Raman spectroscopy
AU2018350898B9 (en) 2017-10-16 2024-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Perfusion bioreactor and related methods of use
EP3700505A4 (en) 2017-10-26 2021-01-06 Repligen Corporation MICRO-ALTERNATIVE TANGENTIAL FLOW INFUSION FILTER, PROCESSING CONTAINER, AND METHODS OF USE THEREOF
KR102833281B1 (ko) * 2017-12-11 2025-07-11 암젠 인크 이중특이적 항체 생성물의 연속 제조 공정
CN111902197B (zh) * 2018-03-08 2022-10-28 瑞普利金公司 切向流深度过滤系统和使用其进行过滤的方法
JP6869423B2 (ja) * 2018-03-19 2021-05-12 富士フイルム株式会社 生産物の製造方法
KR102819571B1 (ko) 2018-05-25 2025-06-12 리플리겐 코포레이션 접선 유동 여과 시스템 및 방법
CN109157690A (zh) * 2018-06-15 2019-01-08 翁炳焕 猴-人细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备
JP7707062B2 (ja) * 2018-11-02 2025-07-14 ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド 連続的採取を行い細胞流出を行わない強化灌流による細胞培養法
EP3647405A1 (en) * 2018-11-02 2020-05-06 Microfluidx Cell culture device and method of using the same
WO2020238918A1 (en) 2019-05-28 2020-12-03 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. A raman spectroscopy integrated perfusion cell culture system for monitoring and auto-controlling perfusion cell culture
EP4055136A1 (en) 2019-11-07 2022-09-14 Merck Patent GmbH Methods and systems for performing perfusion cell culture
EP4107247A2 (en) 2020-03-10 2022-12-28 Cellares Corporation Systems, devices, and methods for cell processing
US12252678B2 (en) 2021-12-01 2025-03-18 Microfluidx Ltd Systems and methods for bioprocessing
WO2024228717A2 (en) 2022-09-07 2024-11-07 Quantitative Biosciences, Inc. Fentanyl-specific single variable-domain antibodies and use in a continuous agglutination assay
WO2024072444A1 (en) * 2022-09-26 2024-04-04 Upside Foods, Inc. Harvesting cell-based meat
US11898127B1 (en) 2022-09-26 2024-02-13 Upside Foods, Inc. Harvesting cell-based meat
CN120897988A (zh) 2023-03-21 2025-11-04 赛阿瑞斯公司 用于在细胞处理系统内的电穿孔的系统、设备和方法
WO2024226439A1 (en) 2023-04-24 2024-10-31 Quantitative Biosciences, Inc. Engineered biosensor strains of e. coli for continuous aerobic detection of analytes
US12399193B2 (en) 2023-05-05 2025-08-26 Cellares Corporation Systems, devices, and methods for combined cell processes
WO2025041064A2 (en) 2023-08-21 2025-02-27 Cellares Corporation Systems, devices, and methods for automatic cell sorting
US12497587B2 (en) 2023-08-21 2025-12-16 Cellares Corporation Bioreactors and methods of their use in automatic cell processing systems
WO2025041046A1 (en) 2023-08-21 2025-02-27 Cellares Corporation Systems, devices, and methods for fluid control in a cell processing system
WO2025128343A1 (en) 2023-12-11 2025-06-19 Just-Evotec Biologics, Inc. Protein expression using trans-splicing and split selectable markers
US12492368B2 (en) 2024-03-11 2025-12-09 Cellares Corporation Monitoring air pressure within a cell processing system
USD1109621S1 (en) 2024-04-15 2026-01-20 Cellares Corporation Analytical platform for biological material testing

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4477342A (en) 1982-08-31 1984-10-16 Becton, Dickinson And Company Apparatus and method for controlling ultrafiltration during hemodialysis
US4885166A (en) * 1985-06-11 1989-12-05 Ciba-Geigy Corporation Hybrid interferons
US5286646A (en) * 1985-11-25 1994-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Method for mammalian cell culture
IL82746A (en) * 1986-06-06 1994-10-07 Genentech Inc Process for producing biologically active tissue-type plasminogen activator
JPH0642905B2 (ja) 1986-06-13 1994-06-08 東レ株式会社 血液透析膜
GB8617646D0 (en) 1986-07-18 1986-08-28 Manchester Inst Science Tech Recovery of biological material
US6022742A (en) * 1986-11-26 2000-02-08 Kopf; Henry B. Culture device and method
US4806484A (en) 1987-08-07 1989-02-21 Igb Products, Ltd. Perfusion airlift bioreactor
JPH0797982B2 (ja) 1987-09-24 1995-10-25 東洋紡績株式会社 細胞培養装置
US4921792A (en) 1987-11-27 1990-05-01 Miles Inc. Continuous cell dispersion, cultivation and substance recovery process
JPH01243985A (ja) 1988-03-25 1989-09-28 P C C Technol:Kk 植物器官の培養法及びその培養槽
US5595909A (en) * 1988-05-23 1997-01-21 Regents Of The University Of Minnesota Filter device
JPH02119772A (ja) * 1988-10-29 1990-05-07 Shimadzu Corp 細胞培養装置
JP2625990B2 (ja) * 1988-11-19 1997-07-02 株式会社島津製作所 細胞培養装置
US5019512A (en) * 1989-03-17 1991-05-28 Baxter International Inc. Spin filter for removing substantially cell-free culture medium from suspension cell culture system
JP2690144B2 (ja) * 1989-04-24 1997-12-10 哲哉 峠 膜型細胞培養装置
JPH0793874B2 (ja) * 1989-04-27 1995-10-11 日本碍子株式会社 バイオリアクタ
US5256294A (en) 1990-09-17 1993-10-26 Genentech, Inc. Tangential flow filtration process and apparatus
JP2948675B2 (ja) * 1991-03-20 1999-09-13 日本碍子株式会社 発酵液中の有価物を回収するクロスフロー濾過方法
JPH0531332A (ja) * 1991-07-30 1993-02-09 Toto Ltd 微生物の膜分離方法
GB9118664D0 (en) 1991-08-30 1991-10-16 Celltech Ltd Cell culture
JPH07123972A (ja) * 1993-11-01 1995-05-16 Fumio Yamauchi 膜型バイオリアクター
JPH07298871A (ja) * 1994-05-06 1995-11-14 Fumio Yamauchi 膜型バイオリアクター
US6204000B1 (en) 1995-04-28 2001-03-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Diagnostic methods and gene therapy using reagents derived from the human metastasis suppressor gene KAI1
ATE278794T1 (de) 1995-06-15 2004-10-15 Crucell Holland Bv Verpackungssysteme für humane, menschliche adenoviren, zur verwendung in die gentherapie
US5994728A (en) * 1995-11-15 1999-11-30 Matsushita Electronics Corporation Field effect transistor and method for producing the same
JPH1015357A (ja) * 1996-07-01 1998-01-20 Nitto Denko Corp 排水の処理方法
JPH1033671A (ja) * 1996-07-24 1998-02-10 Jms Co Ltd 中空糸型人工肝臓とその灌流及び培養システム
JP3346996B2 (ja) 1996-09-18 2002-11-18 金剛株式会社 免震自立棚
JPH10108673A (ja) * 1996-10-04 1998-04-28 Asahi Medical Co Ltd 中空糸型培養器を用いた動物細胞の培養方法
JPH10108666A (ja) * 1996-10-04 1998-04-28 Asahi Medical Co Ltd 中空糸型培養器
US6001585A (en) 1997-11-14 1999-12-14 Cellex Biosciences, Inc. Micro hollow fiber bioreactor
US8026096B1 (en) 1998-10-08 2011-09-27 Protein Sciences Corporation In vivo active erythropoietin produced in insect cells
DE60041322D1 (de) 1999-01-26 2009-02-26 Schering Plough Ltd Vermehrung des bovinen coronavirus in cho (chinese hamster ovary) zellen
SI1161548T2 (sl) 1999-04-15 2010-02-26 Crucell Holland Bv Priprava rekombinantnega proteina v humani celici z uporabo sekvenc, ki kodirajo adenovirusni E1 protein
US6855544B1 (en) 1999-04-15 2005-02-15 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell
JP2001149099A (ja) 1999-11-26 2001-06-05 Olympus Optical Co Ltd 染色体異常解析のための有核細胞の標本作製方法
EP1103610A1 (en) 1999-11-26 2001-05-30 Introgene B.V. Production of vaccines from immortalised mammalian cell lines
US6544424B1 (en) 1999-12-03 2003-04-08 Refined Technology Company Fluid filtration system
US6168941B1 (en) * 2000-04-07 2001-01-02 Genvec, Inc. Method of producing adenoviral vector stocks
JP4138209B2 (ja) 2000-06-29 2008-08-27 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 プラバスタチン含有組成物
JP2002113896A (ja) 2000-10-05 2002-04-16 Seiko Epson Corp 画像形成装置
EP1363857A2 (en) * 2001-02-23 2003-11-26 V.A.I. Ltd. Methods and apparatus for biological treatment of waste waters
JP3547715B2 (ja) * 2001-03-06 2004-07-28 榮 新垣 ベクター精製用装置及び方法
US6716354B2 (en) 2001-03-08 2004-04-06 Cdg Technology, Inc. Methods of treating water using combinations of chlorine dioxide, chlorine and ammonia
WO2002086133A1 (fr) * 2001-04-17 2002-10-31 Seiren Kabushiki Kaisha Additifs de milieu et milieux de culture de cellules animales
DE10120838A1 (de) 2001-04-27 2002-10-31 Basf Ag Stoffmischung zur UV-Stabilisierung von Kunststoffen und Herstellung davon
DE10120835C2 (de) 2001-04-27 2003-04-10 Sifin Inst Fuer Immunpraeparat Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern
DE60238863D1 (de) 2001-08-31 2011-02-17 Bayer Schering Pharma Ag Vorrichtung und verfahren zur fermentation in hohen zelldichten
ES2249616T3 (es) 2001-09-05 2006-04-01 Yamasa Corporation Citidina-fosfocolina para el tratamiento de la neuropatia diabetica.
US20030054544A1 (en) * 2001-09-14 2003-03-20 Medcell Biologics, Inc. Oxygen enriched bioreactor and method of culturing cells
GB0123098D0 (en) * 2001-09-26 2001-11-14 Lonza Biologics Plc Use of aminoglycoside resistance gene
WO2003041749A1 (de) 2001-11-15 2003-05-22 Aesculap Ag & Co. Kg Sterilbehälter
JP2003219873A (ja) 2002-01-24 2003-08-05 Japan Science & Technology Corp サケ科キングサーモン由来の不死化細胞
US20030186335A1 (en) 2002-03-28 2003-10-02 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Monoclonal antibodies, hybridomas, cell isolation method, isolated cells and immunological diagnostic method
US6902909B2 (en) 2002-07-09 2005-06-07 Synthecon, Inc. Methods for efficient production of mammalian recombinant proteins
DE10237082B4 (de) * 2002-08-09 2014-12-31 Sartorius Stedim Biotech Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur biotechnologischen Herstellung von Wertstoffen
ES2290705T3 (es) * 2003-05-01 2008-02-16 Dsm Ip Assets B.V. Proceso para la produccion de sustancias biologicas por cultivo por perfusion de celulas animales suspendidas.
JP4865539B2 (ja) * 2003-05-09 2012-02-01 クルセル ホランド ベー ヴェー Ｅ１不死化細胞の培養物及び該培養物を培養して該培養物から得られる産物の収量を増加させる方法
EP1660629A4 (en) * 2003-07-17 2015-04-08 Global Cell Solutions Llc SYSTEM AND METHOD FOR AUTOMATIC CELL CULTURE
JP2005041984A (ja) 2003-07-22 2005-02-17 Shin Kobe Electric Mach Co Ltd 水架橋ポリオレフィン製シートの製造法
CN1930281A (zh) 2004-03-05 2007-03-14 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于通过连续灌注和交互切向流来培养细胞的方法
CA2560716A1 (en) * 2004-03-29 2005-10-13 Pall Corporation Pleated, crossflow fluid treatment elements, methods for making them, and methods for treating cellular solutions
CN101061215A (zh) * 2005-01-05 2007-10-24 中外制药株式会社 细胞的培养方法及其应用
CN100354408C (zh) * 2005-10-09 2007-12-12 南京工业大学 一种高密度细胞培养方法及其生物反应装置
CA2640870A1 (en) * 2005-12-17 2007-06-21 Airinspace B.V. Air purification devices
JP5031332B2 (ja) 2006-03-31 2012-09-19 旭化成ホームズ株式会社 線切断具
KR20120009530A (ko) 2006-07-14 2012-01-31 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 개선된 세포 배양 방법
EP2014760A1 (en) 2007-06-13 2009-01-14 CMC Biopharmaceuticals A/S A method for producing a biopolymer (e.g. polypeptide) in a continuous fermentation process
JP2008308560A (ja) 2007-06-13 2008-12-25 Tohcello Co Ltd 表面防汚性複合フィルムの製造方法
JP5426937B2 (ja) * 2009-06-19 2014-02-26 興和株式会社 光学的反応測定装置および光学的反応測定方法

Also Published As

Publication number Publication date
US8685731B2 (en) 2014-04-01
FI2343362T4 (fi) 2024-07-04
AU2007272054B2 (en) 2011-09-08
JP5448010B2 (ja) 2014-03-19
IL196322A0 (en) 2009-09-22
ES2650042T3 (es) 2018-01-16
US9469865B2 (en) 2016-10-18
MX2009000522A (es) 2009-01-27
DK2634243T3 (en) 2017-12-11
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TW201341527A (zh) 2013-10-16
ES2579957T3 (es) 2016-08-17
IL234890A (en) 2016-05-31
SI2041259T1 (sl) 2016-04-29
EP2343362A1 (en) 2011-07-13
SI2343362T1 (sl) 2016-09-30
US20140154745A1 (en) 2014-06-05
US8440458B2 (en) 2013-05-14
US9670520B2 (en) 2017-06-06
SI2634250T1 (sl) 2017-06-30
DK2634242T3 (en) 2017-05-22
JP5092129B2 (ja) 2012-12-05
EP2634243B2 (en) 2024-07-24
EP2634243B1 (en) 2017-09-06
AU2007272054A1 (en) 2008-01-17
EP2634242B1 (en) 2017-04-05
CA2657040C (en) 2013-10-01
AR062072A1 (es) 2008-10-15
JP2014217395A (ja) 2014-11-20
EP2634243A1 (en) 2013-09-04
EP2343362B2 (en) 2024-04-03
JP2012165764A (ja) 2012-09-06
TWI627274B (zh) 2018-06-21
US20120149063A1 (en) 2012-06-14
KR101143796B1 (ko) 2012-05-21
US8222001B2 (en) 2012-07-17
EP2041259B1 (en) 2015-10-14
SI2634242T1 (sl) 2017-07-31
WO2008006494A1 (en) 2008-01-17
PL2041259T3 (pl) 2016-04-29
PL2634243T3 (pl) 2018-02-28
EP2634242A1 (en) 2013-09-04
CA2657040A1 (en) 2008-01-17
EP2041259B2 (en) 2024-10-09
KR20090031899A (ko) 2009-03-30
SI2634243T1 (en) 2018-01-31
HUE028365T2 (en) 2016-12-28
HUE034299T2 (en) 2018-02-28
ES2625062T3 (es) 2017-07-18
CL2007002060A1 (es) 2008-04-18
PL2634250T3 (pl) 2017-09-29
CN104263700A (zh) 2015-01-07
DK2343362T3 (en) 2016-07-18
JP2011067222A (ja) 2011-04-07
CN102876628A (zh) 2013-01-16
BRPI0714347A2 (pt) 2013-05-07
US20100075413A1 (en) 2010-03-25
PT2343362T (pt) 2016-07-13
KR101685246B1 (ko) 2016-12-09
HUE028593T2 (en) 2016-12-28
EA200900188A1 (ru) 2009-06-30
PT2634250T (pt) 2017-07-13
DK2634243T4 (da) 2024-09-23
PL2343362T5 (pl) 2024-12-02
US20130095527A1 (en) 2013-04-18
PT2634242T (pt) 2017-07-12
EP2041259A1 (en) 2009-04-01
PL2634242T3 (pl) 2017-09-29
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