[go: up one dir, main page]

MX2009000522A - Proceso mejorado para el cultivo de celulas. - Google Patents

Proceso mejorado para el cultivo de celulas.

Info

Publication number
MX2009000522A
MX2009000522A MX2009000522A MX2009000522A MX2009000522A MX 2009000522 A MX2009000522 A MX 2009000522A MX 2009000522 A MX2009000522 A MX 2009000522A MX 2009000522 A MX2009000522 A MX 2009000522A MX 2009000522 A MX2009000522 A MX 2009000522A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
cells
cell culture
biological substance
reactor
cell
Prior art date
Application number
MX2009000522A
Other languages
English (en)
Inventor
Robert Patrick Hof
Gerben Meile Zijlstra
Jacob Schilder
Original Assignee
Dsm Ip Assets Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38441437&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MX2009000522(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Dsm Ip Assets Bv filed Critical Dsm Ip Assets Bv
Publication of MX2009000522A publication Critical patent/MX2009000522A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D69/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by their form, structure or properties; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D69/08—Hollow fibre membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/28—Constructional details, e.g. recesses, hinges disposable or single use
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/18—External loop; Means for reintroduction of fermented biomass or liquid percolate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/10—Separation or concentration of fermentation products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C12N2500/92—Medium free of human- or animal-derived components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/99—Serum-free medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

La invención se relaciona con un proceso para el cultivo de células, preferiblemente células HER inmortalizadas E1, más preferiblemente células PER.C6 en un reactor en suspensión en un medio de cultivo celular, en donde las células producen una sustancia biológica, preferiblemente un anticuerpo, en donde al menos un componente del medio de cultivo celular es alimentado al cultivo de células y en donde se recircula el cultivo de células que contiene a las células, a la sustancia biológica y al medio de cultivo celular sobre un sistema de separación y en donde el sistema de separación separa la sustancia biológica de las sustancias que tienen un peso molecular menor que la sustancia biológica y en donde la sustancia biológica es retenida en o retroalimentada dentro del reactor. Preferiblemente, parte de las sustancias de peso molecular menor es continuamente removida del cultivo de células.

Description

PROCESO MEJORADO PARA EL CULTIVO DE CÉLULAS La invención se relaciona con un proceso para el cultivo de células en un reactor en suspensión en un medio para cultivo de células . Tal proceso es conocido por ejemplo desde WO 04/099396. Aquí se describe como la densidad de las células del cultivo de células y el rendimiento del material biológico deseado, pueden ser mejorados optimizando las condiciones de desarrollo en un proceso semicontinuo .
Además, WO 05/095578 describe un proceso para el cultivo de células por medio de un cultivo continuo por perfusión de un cultivo de células que comprende un medio de cultivo de células y células, en donde se añade el medio de cultivo de células al cultivo de células, se circula el cultivo de células sobre un módulo filtrante que comprende fibras huecas en un flujo de salida de liquido que tiene una densidad de células menor que el cultivo de células, y el flujo dentro del módulo de filtración es un flujo tangencial alternante, en donde las células producen una sustancia biológica. En los ejemplos de WO 05/095578 se observa que se producen 0,9 g/L/dia de producto, correspondientes a una concentración de producto en el afluente de aproximadamente 0,3 g/L.
Entre más grande el volumen de liquido que contiene la sustancia biológica, más laboriosa se hace la purificación de la sustancia biológica. La concentración de la sustancia biológica obtenida no es tan alta en el proceso como la descrita en WO 04/099396 y WO 05/095578. Por lo tanto, el procesamiento corriente debajo de esta sustancia biológica es difícil, debido a que la sustancia biológica necesita ser concentrada antes de aplicar etapas adicionales de purificación o se requiere purificar grandes volúmenes de sustancia biológica menos concentrada. Además, el cultivo de células con densidades de células menores resulta en una menor productividad volumétrica y por lo tanto se requiere de más recipientes para cultivo y/o de mayor tamaño y por lo tanto de inversiones más altas en equipo para un nivel dado de producción.
Por lo tanto, el objetivo de la invención es proveer un proceso en donde se obtiene el producto a partir del cultivo de células en concentraciones más altas .
Un objetivo adicional de la presente invención es permitir el cultivo de las células y la producción del material biológico durante un periodo prolongado.
Estos objetivos se logran por medio de un proceso para el cultivo de células en un reactor en suspensión en un medio de cultivo de células, en donde las células producen una sustancia biológica, en donde al menos un componente del medio de cultivo de células es alimentado al cultivo de células y en donde se hace circular el cultivo de células que incluye la sustancia biológica y al cultivo de células sobre un sistema de separación y en donde el sistema de separación separa a la sustancia biológica de sustancias que tienen un menor peso molecular que la sustancia biológica y en donde la sustancia biológica es retenida en, o retroalimentada dentro del reactor. Por ejemplo, la invención se relaciona con un proceso para el cultivo de células en un reactor en un medio de cultivo de células, en donde las células producen una sustancia biológica, en donde los nutrientes y/o el medio de cultivo de células son alimentados al reactor y en donde se hace circular el cultivo de células que incluye a las células y al medio de cultivo de células sobre un filtro que tiene un tamaño de poro o un corte de peso molecular entre 5 y 500 kD. Se ha encontrado que por medio del uso de un sistema de separación que separa la sustancia biológica de las sustancias que tienen un peso molecular menor que la sustancia biológica, se puede acumular la sustancia biológica en el cultivo de células en concentraciones mayores . Por consiguiente, la presente invención se diferencia del cultivo de células descrito en el estado del arte en que permite la acumulación del material biológico deseado junto con la masa de células . En una modalidad preferida de la presente invención, parte de las sustancias de menor peso molecular son continuamente removidas del cultivo de células. Una ventaja adicional del proceso de la presente invención es que se puede alcanzar una concentración más alta de células viables, por ejemplo, en comparación con procesos por lotes o semicontinuos . Además, el tiempo de producción - el periodo durante el cual las células producen la sustancia biológica -se puede prolongar en comparación, por ejemplo, con los procesos por lotes o semicontinuos. También, comparado con un proceso por lotes o semicontinuo, es posible utilizar un reactor más pequeño. El uso de reactores más pequeños es conveniente ya que reduce las inversiones relacionadas con equipo e instalaciones . También, se pueden obtener concentraciones más altas de la sustancia biológica en periodos de tiempos más cortos . Se encontró que era posible obtener altas concentraciones de sustancia biológica dentro del reactor sin disminuir drásticamente la viabilidad de las células y por lo tanto sin limitar el tiempo de producción. La persona capacitada en el arte habría esperado que ocurriera la inhibición del producto, esto es, la inhibición de la producción de la sustancia biológica por la sustancia biológica en sí misma o la inhibición por otras macromoléculas producidas por la célula (tales como por ejemplo las proteínas de la célula huésped, enzimas o residuos celulares) . Además, se encontró que la acumulación del material biológico deseado no deteriora la función del sistema de separación. El proceso de la presente invención provee una ventaja considerable en términos de densidad de células, de concentración de producto en el cultivo de células y de un período extendido de cultivo en comparación con los procesos de acuerdo con WO 05/095578 y WO 04/099396. Como resultado, el actual proceso resulta en una producción mejorada del material biológico deseado. Las células que pueden ser utilizadas para producir la sustancia biológica son en principio todas las células conocidas por la persona capacitada en el arte, que tienen la habilidad para producir un producto biológico. Las células pueden ser eucariotas, por ejemplo, hongos filamentosos, por ejemplo Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Penicillium chrysogenum, levaduras, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Phaffia rhodozyma, levadura del género Pichia, por ejemplo Pichia pastoris o procariotas, por ejemplo Escherichia coli, Bacillus sp, por ejemplo B. licheniformis , B. subtilis, B. amyloliquefaciens , B. alkalophilus , Streptomyces sp . , Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas s . Ejemplos de células eucariotas están por ejemplo también descritas en Chu, L., Robinson, D. K. , (2001) Curr . Opinión Biotechn., vol . 12, p. 180 - 187. Preferiblemente, las células que son utilizadas en el proceso de la presente invención son células animales, en particular células de mamífero. Los ejemplos de células de mamífero incluyen células de CHO (Ovario de Hámster Chino) , hibridomas, células de BHK (Riñon de Hámster Recién Nacido) , células de mieloma, células humanas, por e emplo células HEK-293, células linfoblastoides humanas, células HER inmortalizadas El, células de ratón, por ejemplo células NSO. Más preferiblemente, se utilizan células HER inmortalizadas El, lo más preferible, células PER.C6. Se pueden aislar células primarias de retina embrionaria humana (HER) a partir de fetos (Byrd P, Brown KW, Gallimore PH. 1982. Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12 DNA. Nature 298: 69 - 71, Byrd PJ, Grand RJA, Gallimore PH. 1988. Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus El regions and combinations of E1A + ras. Oncogene 2: 477 - 484) . Las células primarias morirán después de cultivarlas durante varias pasadas . Las células HER inmortalizadas El para el propósito de la presente invención se derivan de células primarias HER por expresión allí dentro del ADN que codifica proteínas adenovirales E1A y E1B, para obtener células inmortalizadas. Tales células inmortalizadas se pueden cultivar durante más de 100 pasadas. Los métodos para obtener células HER inmortalizadas han sido descritos por ejemplo en la patente estadounidense No. 5.994.128, en Byrd P., Brown K. W. , Gallimore P. H. 1982. Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12 DNA. Nature 298: 69 - 71, en Byrd P. J., Grand R. J. A., Gallimore P. H. 1988. Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus El regions and combinations of E1A + ras. Oncogene 2: 477 - 484, y en Gallimore, P. H., Grand, R. J. A. y Byrd, P. J. (1986) . Transformation of human embryo retinoblasts ith simian virus 40, adenovirus and ras oncogenes . AntiCancer Res. 6, p. 499 - 508. Por ejemplo, las células HER inmortalizadas, incluidas las células PER.C1, PER.C3, PER.C4, PER.C5, PER.C6, PER.C8 y PER.C9, fueron generadas por transfección de células HER primarias utilizando un plásmido que contenia las secuencias de codificación E1A y E1B de serotipo 5 (Ad5) de adenovirus (nucleótidos 459 - 3510 de Ad5) bajo el control del promotor de la fosfoglicerato quinasa humana ("PGK") (ver, la patente estadounidense No. 5.994.128) . En una modalidad preferida, las células en el proceso de la presente invención son células HER inmortalizadas El, más preferiblemente células PER.C6 (ver la patente estadounidense No. 5.994.128) . Las células PER.C6 están e emplificadas por células como las depositadas bajo ECACC No. 96022940 (ver, por ejemplo, la patente estadounidense No. 5.994.128, EP 0833934 Bl) . En el proceso de la invención, se pueden cultivar las células en suspensión en cualquier forma, por ejemplo como células inmortalizadas, como células individuales o en racimos de células o como una combinación de las mismas . Preferiblemente las células se cultivan como células individuales y/o como pequeños racimos de células de no más de 100 células, más preferiblemente de no más de 20 células. Las células pueden, por ejemplo, ser inmovilizadas sobre microportadores tal como los que se encuentran comercialmente disponibles por ejemplo con GE Healthcare (Cytodex) . Un reactor como el que se define aquí es un sistema que incluye al cultivo de células el cual a su vez incluye células y un medio de cultivo de células . Preferiblemente contiene barreras estériles, tal como filtros de aire, para evitar que otras células contaminen a las células deseadas y mantienen preferiblemente un ambiente favorable para las células proveyendo condiciones de cultivo adecuadas tales como mezcla, temperatura, pH, concentración de oxigeno, etc. El reactor puede ser por ejemplo de una naturaleza más permanente, por ejemplo, el reactor puede ser de acero inoxidable o de vidrio, o puede ser por ejemplo de naturaleza desechable, por ejemplo, el reactor puede ser un frasco plástico o bolsa. Los ejemplos de reactores adecuados para uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, recipientes agitados en forma de tanques, recipientes transportados por vía aérea y bolsas desechables que pueden ser mezcladas por medio de bamboleo, un movimiento de mezcla o agitación. Preferiblemente, se utilizan (bio) eactores desechables ya que son adecuados pues requieren de una inversión relativamente baja, tienen gran flexibilidad operacional, periodos de respuesta cortos y son fácilmente configurables para el proceso. Los (bio) reactores desechables se encuentran comercialmente disponibles por e emplo con Hyclone, Sartorius, Applikon o Wave . El término "sistema de separación" está definido dentro del esquema de la invención como un sistema capaz de efectuar separaciones con base en el peso molecular. El sistema de separación utilizado en el proceso de la invención es capaz de separar la sustancia biológica de las sustancias que tienen un peso molecular menor que el de la sustancia biológica. En otras palabras, se escoge el corte de peso molecular de tal manera que el corte de peso molecular (MWCO) sea más pequeño que, más preferiblemente al menos un factor de 2, lo más preferible al menos un factor de 3 más pequeño que el peso molecular que la sustancia biológica. Típicamente, pero desde luego dependiendo del peso molecular de la sustancia biológica producida en el proceso de la presente invención, el MWCO del sistema de separación es preferiblemente al menos de 5, más preferiblemente al menos de 10, lo más preferible al menos de 30 kDa y preferiblemente al menos de 500 kDa, más preferiblemente al menos de 300 kDa, lo más preferible al menos de 100 kDa. Por ejemplo para una IgG con un peso molecular de 150 kDa, un sistema de separación que tiene un MWCO de al menos 50 kDa es el más preferido. Los ejemplos de sistemas de separación incluyen, pero no se limitan a, filtros, centrífugas y sistemas acuosos de extracción en dos fases. El término "filtro" como se lo utiliza aquí, está destinado a incluir todos los dispositivos con la capacidad para separar partículas con base en el tamaño o en peso molecular. En principio, en el proceso de la presente invención, se puede utilizar cualquier filtro siempre y cuando el tamaño de poro o el M CO se escojan de tal menara que la sustancia biológica se separe de sustancias que tengan un peso molecular menor que el de la sustancia biológica, típicamente este será un tamaño de poro o un MWCO entre 5 y 500 kDa . Los ejemplos de filtros adecuados para uso en la presente invención filtros de membrana, filtros cerámicos y filtros metálicos. Se puede usar un filtro de cualquier forma; el filtro puede ser por ejemplo un devanado en espiral o tubular o se lo puede utilizar en la forma de una lámina. Pre eriblemente, en el proceso de la invención, el filtro utilizado en un filtro de membrana, preferiblemente un filtro de fibras huecas. Con el término "fibra hueca" se entiende una membrana tubular. El diámetro interno del tubo es de al menos 0,1 mm, más preferiblemente al menos de 0,5 mm, lo más preferible al menos de 0,75 mm y preferiblemente el diámetro interno del tubo es a lo sumo de 10 mm, más preferiblemente a lo sumo de 6 mm, lo más preferible a lo sumo de 1 mm. Los módulos filtrantes que incluyen fibras huecas se encuentran comercialmente disponibles por ejemplo con General Electric (GE, anteriormente Amersham) . Por medio de la circulación del cultivo de células que incluye a la sustancia biológica, a las células y al medio de cultivo de células sobre un sistema de separación, la sustancia biológica y las células son retenidas en el reactor y el liquido que sale tiene por lo tanto una menor concentración de sustancia biológica y una menor densidad de células que el cultivo de células. Usualmente, en el proceso de la invención, el liquido que sale no contiene, o difícilmente contiene alguna sustancia biológica y células. Usualmente, el líquido que sale contendrá esencialmente únicamente componentes que tienen un peso molecular menor que aquel de la sustancia biológica. Esencialmente todas las células y esencialmente toda la sustancia biológica son por consiguiente usualmente retenidos en el reactor. Preferiblemente, se escoge el tamaño de poro o MWCO del filtro de tal manera que el tamaño de los poros o el MWCO del filtro sea menor que, más preferiblemente al menos un factor de 2, lo más preferible al menos un factor de 3 menor que el diámetro o el peso molecular del producto, asegurando una alta retención de producto. Típicamente, pero desde luego dependiendo del tamaño o del peso molecular del producto, esto es la sustancia biológica producida en el proceso de la presente invención, el tamaño de poro o el M CO del filtro es preferiblemente al menos de 5, más preferiblemente al menos de 10, lo más preferible al menos de 30 kDa y/o el tamaño de poro o el MWCO del filtro/membrana es al menos preferiblemente de 500 kDa, más preferiblemente al menos de 300 kDa, lo más preferible al menos de 100 kDa . Por corte de peso molecular (MWCO) se entiende el peso molecular por encima del cual al menos 90% de las partículas es retenida por el sistema de separación . La circulación del cultivo de células sobre un sistema de separación, por ejemplo un filtro, significa que el cultivo de células es pasado a través de un sistema de separación, por ejemplo un filtro dando como resultado una salida de líquido y un flu o cuyo contenido se mantiene en, o es retroalimentado dentro del reactor. El flujo cuyo contenido es mantenido en, o retroalimentado dentro del reactor contendrá esencialmente usualmente únicamente componentes que tienen un peso molecular al menos igual a aquel de la sustancia biológica o superior y por lo tanto dicho flujo contendrá más sustancia biológica que el liquido saliente. En principio, no es critico cuando se inicie la circulación del cultivo de células sobre el sistema de separación durante el proceso de la invención. La circulación del cultivo de células se puede iniciar por ejemplo directamente desde el inicio del proceso o cuando la densidad de las células viables ha alcanzado un cierto nivel. La circulación del cultivo de células sobre un filtro puede ser un flujo sustancialmente perpendicular con respecto a la superficie del filtro, también conocido como un flujo de punto muerto o un flujo sustancialmente paralelo a la superficie del filtro, también conocido como un flujo tangencial, por ejemplo un flujo tangencial unidireccional (TFF) o flujo cruzado. Un ejemplo preferido de flujo cruzado es un flujo tangencial alternante (ATF) que como en el caso de ATF se encontró que no ocurría el la obstrucción del filtro (rápidamente) incluso con densidades muy altas de células. Es de conocimiento general que en filtración de profundidad, el filtro final de poro pequeño necesita ser protegido de la obstrucción por medio del uso de preflitros . Esta práctica se basa en el conocimiento general de que los filtros con poros más pequeños o con un MWCO más pequeño se obstruyen más fácilmente, limitando por lo tanto el tiempo de producción. Si se utiliza ATF, se hace innecesario el uso de un prefiltro. Se puede dirigir el flu o moviendo el cultivo de células, moviendo el filtro o ambos. Por ejemplo, el filtro se puede mover por rotación (filtro rotante) o por vibración (filtro de vibración) .
Alternativamente, si se dirige el flujo moviendo únicamente el cultivo de células, el filtro es estático y se puede mover por ejemplo el cultivo de células por medio de bombas o de presión. Por "flujo tangencial alternante" se entiende que existe un flujo en la misma dirección que (esto es, tangencial a) la (s) superficie (s ) del filtro, cuyo flujo va hacia atrás y hacia adelante, y que existe otro flujo en una dirección sustancialmente perpendicular a dicha superficie del filtro. Se puede lograr un flujo tangencial alternante de acuerdo con métodos conocidos por la persona capacitada en el arte (por ejemplo como se describe en la patente estadounidense No. 6.544.424) . Durante el cultivo de las células, al menos un componente del medio de cultivo de las células, por ejemplo uno o más nutrientes y/o el medio de cultivo de las células pueden ser alimentados a las células . En el proceso de acuerdo con la invención, es conveniente suplementar en parte o preferiblemente totalmente al menos uno de los nutrientes agotados con el objetivo de alimentar este nutriente o estos nutrientes al reactor. Por ejemplo, se puede alimentar un medio de cultivo celular completo al reactor, lo cual es una ventaja ya que no se necesita preparar un suministro separado en forma individual. Por ejemplo se puede alimentar también el medio de cultivo celular a las células en una forma más concentrada; esto es conveniente ya que son más fáciles de manejar volúmenes más pequeños. Se pueden alimentar también uno o más nutrientes al reactor. Por ejemplo carbohidratos, por ejemplo glucosa o fructosa; se pueden alimentar convenientemente aminoácidos, tales como glutamina y/o péptidos al reactor . En una modalidad preferida de la invención, se escogen las condiciones de cultivo celular de tal manera que la velocidad de crecimiento de las células y/o la productividad especifica de las células no este limitada y más preferiblemente de tal manera que la concentración de al menos uno de los componentes del medio de cultivo celular permanece esencialmente constante. Los ejemplos de condiciones limitantes del cultivo de células son las limitaciones de nutrientes y la formación de metabolitos inhibidores, tales como amoniaco, dióxido de carbono y lactato. Por ejemplo, se pueden escoger condiciones de cultivo de células tales como el suministro de tal manera que la velocidad de crecimiento de las células no se limite por ejemplo por medio del suministro de nutrientes suficientes para compensar el agotamiento y/o para evitar la producción de metabolitos inhibitorios tales como el lactato o el amoniaco. Por ejemplo, se pueden escoger condiciones de aireación de tal manera que la formación de dióxido de carbono no limite la velocidad de crecimiento de las células . El crecimiento de las células bajo condiciones no limitantes es muy ventajoso desde el punto de vista de las Buenas Prácticas de Manufactura (GMP) ya que 1) esto puede proporcionar un medio de cultivo celular que en muchos casos también produce una calidad constante y una buena calidad de producto y 2) esto puede conducir a una alta viabilidad celular, en algunos casos hasta una viabilidad celular del más del 98%. La alta viabilidad celular reduce la liberación de contaminantes relacionados con la célula, tales como proteínas de la célula huésped, lo cual facilita la purificación del producto. Además, el desarrollo de las células con una velocidad de crecimiento ilimitada y/o con una productividad especifica ilimitada tienen la ventaja comercial de que es posible producir más sustancia biológica incluso en un tiempo más corto ya que se alcanzarán densidades celulares más altas más temprano en el proceso . "Productividad especifica" de las células es la cantidad de una sustancia biológica dada producida por las células por unidad de tiempo y se expresa usualmente en pg . célula- ldia- 1. La velocidad de adición de al menos un componente del medio de cultivo celular, por ejemplo nutrientes y/o del medio de cultivo celular al cultivo celular (la velocidad de afluencia o la velocidad de perfusión) influye sobre la viabilidad y la densidad de las células . En el proceso de la invención, se puede (n) alimentar el (los) componente (s ) del medio de cultivo celular, tal como los nutrientes y/o el medio de cultivo celular por ejemplo en forma de un flujo continuo, de un flujo semicontinuo, por ejemplo de un flujo paso a paso o de un flujo escalonado. Preferiblemente, el (los) componente (s) del medio de cultivo celular, por ejemplo los nutrientes y/o el medio de cultivo celular se añaden en forma de un flujo continuo. El (los) componente (s ) del medio de cultivo celular, tales como el medio de cultivo celular completo y/o los nutrientes en principio se pueden alimentar al reactor en cualquier momento durante el proceso. Preferiblemente, el suministro se inicia antes que los sustratos, tales como la glutamina y la glucosa hayan alcanzado niveles tan bajos para provocar que se suspenda el crecimiento de las células o antes de que los metabolitos inhibitorios, por ejemplo lactato o amoniaco, alcancen niveles tan altos que se suspendería el crecimiento. Desde este punto en adelante, el (los) componente (s ) del medio de cultivo celular, tal como los nutrientes y/o el medio de cultivo de celular completo se alimenta preferiblemente al reactor a una velocidad tal que se satisfagan las demandas del sustrato. En una modalidad de la invención, el medio de cultivo celular se añade con una Velocidad de Alimentación de acuerdo con la fórmula (1) : Velocidad de Alimentación = SFR x (volumen total del cultivo de células) x (1) (densidad de las células viables) en donde la velocidad de alimentación se expresa en litros por dia, en donde la SFR es la Velocidad Especifica de Alimentación, esto es, la velocidad a la cual se alimenta el medio de cultivo celular al cultivo de células expresada como el volumen de medio añadido por célula viable por unidad de tiempo y en donde la densidad de las células viables es el número de células viables por unidad de volumen. El número de células viables la puede determinar la persona capacitada en el arte, por ejemplo a través del método de exclusión con azul tripán. La velocidad especifica de alimentación se escoge preferiblemente entre 0,01 y 0,3 nL/célula/día , más preferiblemente entre 0,01 y 0,2 nL/célula/día . Puede ser conveniente tomar en cuenta parámetros adicionales cuando se ajusta la velocidad de alimentación, por ejemplo la cantidad de glucosa que es alimentada al cultivo y/o la velocidad de absorción de oxígeno. Por ejemplo para PER.C6 la velocidad de alimentación del medio de cultivo celular y/o de los nutrientes se escoge preferiblemente de tal manera que la concentración de glucosa se mantenga entre 3 y 20 mmol/L, más preferiblemente entre 5 y 15 mmol/L. Preferiblemente, la concentración de glucosa es al menos de 3 mmol/L, más preferiblemente al menos de 5 mmol/L y preferiblemente al menos de 20 mmol/L, más preferiblemente a lo sumo 15 mmol/L. En una modalidad especial de la invención, se remueve el cultivo de células (que incluye a las células, a la sustancia biológica y al medio de cultivo celular) al menos una vez del reactor y se añade liquido, por ejemplo medio de cultivo celular o un suministro de nutriente al reactor para compensar la remoción del cultivo de células . La remoción del cultivo de células puede conducir a tiempos de proceso mayores con densidades celulares altas en combinación con viabilidades altas de las células en una productividad mayor. Se puede remover el cultivo de células en forma continua o por etapas . En una modalidad preferida de la invención, se remueve el cultivo de células (que incluye a las células, al medio de cultivo celular y a la sustancia biológica) del reactor tan pronto como se alcance la densidad deseada de células, por ejemplo una densidad de células de al menos 10 x 106 células viables//ml, preferiblemente de al menos 20 x 106 células viables/ml, más preferiblemente de al menos 30 x 106 células viables/ml, por ejemplo una densidad de células de al menos 200 x 106 células viables/ml, y el liquido, por ejemplo el medio de cultivo celular o el suministro de nutriente al reactor para compensar la remoción del cultivo de células. Preferiblemente, se remueve el cultivo de células a una velocidad tal que la densidad de las células permanece en el rango deseado de densidad celular. Esta modalidad de la invención es muy conveniente comparada con un proceso convencional por lotes o semicontinua ya que combina las ventajas del proceso déla invención con alta viabilidad que puede ser mantenida durante más tiempo, haciendo posible realizar incluso una productividad volumétrica total superior. Por "productividad volumétrica" se entiende la cantidad de sustancia biológica producida por unidad de volumen del reactor por unidad de tiempo y se expresa usualmente en g.L-l.día-1. Comparada con un proceso convencional de perfusión, esta modalidad de la invención es también muy conveniente ya que combina las ventajas del proceso de la invención con una corriente de remoción de cultivo de células que tiene una alta concentración de sustancia biológica. La alta concentración de sustancia biológica en la corriente de remoción del cultivo de células lo hace comercialmente interesante para recoger la sustancia biológica de allí. En un proceso convencional de perfusión en donde se remueve el cultivo de células, la corriente de remoción del cultivo de células no contiene suficiente sustancia biológica para hacerlo comercialmente válido para la recolección de la sustancia biológica y se considera usualmente a la corriente de remoción del cultivo de células como un desperdicio. Por lo tanto, en esta modalidad de la invención, en teoría toda la sustancia biológica producida puede ser recogida en una forma directa, económicamente viable y sencilla. En una modalidad particularmente preferida de la invención, se escogen las condiciones del cultivo de células de tal manera que la velocidad de crecimiento de las células y/o la productividad específica de las células no este limitada y más preferiblemente de tal manera que también la concentración de al menos uno de los componentes del medio de cultivo celular, tal como la glucosa o la glutamina permanezca constante y se remueva el cultivo de células al menos una vez del reactor tan pronto como se alcance la densidad deseada de las células y se añade el líquido, por ejemplo el medio de cultivo celular, al reactor para compensar la remoción del cultivo de células. Preferiblemente, se escoge la velocidad del desagüe del tal manera que sea sustancialmente igual a la velocidad de la adición de al menos un componente del medio de cultivo celular, por ejemplo los nutrientes y/o el medio de cultivo celular menos la velocidad de la remoción opcional del cultivo de células . Las células que producen una sustancia biológica son por ejemplo células capaces de expresar a un gen que codifica a la sustancia biológica. Las células capaces de expresar un gen que codifica a la sustancia biológica se pueden prepara por ejemplo por medio de transfección de las células con un plásmido que contiene al gen que codifica a la sustancia biológica y al gen que codifica a un marcador de selección adecuado, por ejemplo un gen que codifica la resistencia de la neomicina (gen marcador Neo) . Se pueden seleccionar entonces las células transfectadas en forma estable por presión selectiva, por ejemplo -en el caso de un gen marcador Neo - cultivando las células transfectadas en presencia de G418 (geneticina) y la selección inmediata de las células para aquellas que exhiben un nivel de expresión alto de la sustancia biológica. Los métodos para la preparación de clones de células HER inmortalizadas El que expresan una proteina, y los métodos para cultivar tales células para producir la proteina, son bien conocidos por la persona capacitada, y se pueden encontrar por ejemplo en la patente estadounidense No. 6.855.544. Las sustancias biológicas, que pueden ser producidas por las células, por ejemplo por expresión de un gen (recombinante) que las codifica son por ejemplo proteínas (recombinantes ) , en particular receptores, enzimas, proteínas de fusión, proteínas de la sangre tales como proteínas de la cascada de coagulación de la sangre, proteínas multifuncionales tales como por ejemplo eritropoyetina, proteínas de virus o bacterias por ejemplo para uso en vacunas; inmunoglobulinas tales como anticuerpos, por ejemplo IgG o IgM, y similares; preferiblemente, las células producen una proteína, más preferiblemente un anticuerpo. Preferiblemente, se pueden utilizar las sustancias biológicas tales como las proteínas o las vacunas producidas por las células como un ingrediente activo en una preparación farmacéutica. En el contexto de la presente invención, los términos "producto" y "sustancia biológica" son intercambiables . Dentro del marco de la presente invención, por preparación farmacéutica se entiende cualquier preparación, que puede ser utilizada como una medicina, en particular como una medicina en humanos. Tal medicina puede ser utilizada por ejemplo para diagnostico o para un propósito profiláctico tal como por ejemplo una vacuna y/o para propósitos terapéuticos, tal como por ejemplo una enzima o una proteina en la cual es deficiente un paciente, o un anticuerpo para matar células indeseadas. Una preparación farmacéutica puede contener además un vehículo o un excipiente farmacéuticamente aceptables, ejemplos de los cuales son bien conocidos por la persona capacitada en el arte. Se puede utilizar la línea celular PER.C6 para la producción de sustancias biológicas, tales como el adenovirus al cual se le ha suprimido El (ver por ejemplo, la patente estadounidense No. 6.994.128; Nichols y colaboradores, 2002, Propagation of adenoviral vectors : use of PER.C6 cells. En: Curiel D, Douglas J. T., editors . Adenoviral vectors for gene therapy. San Diego: Elsevier. Pg. 129 - 167) , otros virus (ver por ejemplo, WO 01/38362) , o proteínas recombinantes (ver por ejemplo, la patente estadounidense No. 6.855.544/ Yallop y colaboradores, 2005, PER.C6 cells for t e manufacture of biopharmaceutical proteins, Modern Biopharmaceuticals : Design, Development and Optimization, 4 Volúmenes, 779 - 807, Jorg Knáblein (Editor) ) .
Los ejemplos de proteínas que pueden ser utilizadas como ingrediente activo en preparaciones farmacéuticas (con el nombre la empresa entre paréntesis) incluyen a Tenecteplase (TN KaseTM) , factor antihemofilico (recombinante) (ReFactoTM) , Interferón linfoblastoide a-nl (Well eronTM) , factor de coagulación (recombinante) (NovoSevenTM) , Etanercept, (EnbrelTM) , Trastuzumab (HerceptinTM) , Infliximab (RemicadeTM) , Palivizumab (SynagisTM) , Basiliximab (SimulectTM) , Daclizumab (ZenapazTM), Rituximab (RituxanTM) , factor de coagulación IX (recombinante) (BenefixTM) e Interferón ß-la (AvonexTM) .
Los ejemplos de vacunas que pueden ser utilizadas como ingrediente activo en preparaciones farmacéuticas incluyen antígenos aislados de proteína, ejemplos de los cuales incluyen pero no se limitan a la vacuna tetravalente contra Rotavirus, oral, viva (RotaShieldTM) , a la vacuna contra la rabia (RanAvertTM) , vacunas contra la influenza y la vacuna inactivada contra la hepatitis A (VAQTATM) .
El pH, la temperatura, la concentración de oxigeno disuelto y la osmolaridad del medio de cultivo celular son en principio no críticos y dependen del tipo de célula escogida. Preferiblemente, el pH, la temperatura, la concentración de oxígeno disuelto y la osmolaridad se escogen de tal manera que sean óptimos para el crecimiento y la productividad de las células. La persona capacitada en el arte sabe como encontrar el pH, la temperatura, la concentración de oxígeno disuelto y la osmolaridad óptimos para el cultivo (ver, por ejemplo, WO 2004/099396) . Preferiblemente, cuando se utiliza para el proceso de la invención células HER inmortalizadas El, se escoge el pH entre 6,6 y 7,6 y/o se escoge la temperatura entre 30 y 39°C y/o se escoge la osmolaridad entre 260 y 400 mOsm/kg. Para mantener las condiciones óptimas para el proceso es deseable la automatización de las condiciones de control del proceso. Con el propósito de optimizar las condiciones del proceso, por ejemplo para obtener una detención en el crecimiento para incrementar la productividad celular, durante el cultivo se puede aplicar un cambio en las condiciones del cultivo. Esto se puede establecer por ejemplo por medio de un cambio en la temperatura (tal como de 37 a 32 °C) , un cambio en el pH o un cambio en la osmolaridad . El proceso de la presente invención se puede llevar a cabo en principio el cualquier tipo de medio de cultivo celular adecuado para el cultivo de células. Las pautas para escoger un medio de cultivo celular y las condiciones de cultivo de las células son bien conocidas y se encuentran por ejemplo en los capítulos 8 y 9 de Freshney, R. I. Culture of animal cells (a manual of basic techniques) , 4th edition 2000, Wiley-Liss y en Doyle, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G. Cell STissue culture: Laboratory Procedures 1993, John Wiley & Sons. Por ejemplo, el medio de cultivo celular puede por ejemplo incluir como un componente del medio de cultivo celular una fuente de carbohidratos, sales y/o aminoácidos y/o vitaminas y/o lípidos y/o detergentes y/o amortiguadores y/o factores de crecimiento y/o hormonas y/o citoquinas y/o elementos en trazas. Los ejemplos de fuentes de carbohidrato incluyen glucosa, fructosa, galactosa y piruvato. Los ejemplos de sales incluyen sales de magnesio, por ejemplo MgC12.6H20, MgS04 y MgS04.7H20, sales de hierro, por ejemplo FeS04.7H20, sales de potasio, por ejemplo KH2P04, KC1; sales de sodio, por ejemplo NaH2PQ4, Na2HP04 y sales de calcio, por ejemplo CaC12.2H20. Los ejemplos de aminoácidos incluyen a todos los aminoácidos proteinogénicos conocidos, por ejemplo histidina, glutamina, treonina, serina, metionina. Los ejemplos de vitaminas incluyen: ascorbato, biotina, colina. Cl, mioinositol, D-pantotenato, riboflavina. Los ejemplos de lipidos incluyen: ácidos grasos, por ejemplo ácido linoléico y ácido oleico. Los ejemplos de detergentes incluyen: T een® 80 y Pluronic® F68. Los ejemplos de amortiguadores incluyen HEPES y Na2C03. Los ejemplos de factores de crecimiento / hormonas / citoquinas incluyen IGF (factor de crecimiento como la insulina) , hidrocortisona e insulina (recombinante) . Los ejemplos de elementos en trazas son conocidos por la persona capacitada en el arte e incluyen Zn, Mg y Se. El medio de cultivo celular puede incluir por ejemplo también otros componentes del medio de cultivo celular, por ejemplo peptona de soja o etanol amina . Para la producción de sustancias biológicas de acuerdo con la invención, en particular si las sustancias biológicas se van a utilizar como un ingrediente activo en preparaciones farmacéuticas, se prefieren medios libres de suero para el medio que contiene una fuente de suero. La razón de esto es que el medio con la fuente de suero se puede contaminar con virus, presentándose el riesgo de infecciones priónicas, y se puede crear un obstáculo mayor en el procesamiento secuencia abajo del producto biofarmacéutico (esto es, la purificación adicional de la sustancia biológica a partir del cultivo de células) . Por lo tanto, el proceso de la invención se lleva a cabo preferiblemente en un medio de cultivo celular que no incluye suero de una fuente animal, incluida la humana. Ya que los compuestos de una fuente de mamífero también presentan un riesgo de infección, preferiblemente el medio de cultivo celular está libre de una fuente de mamífero (esto es, el medio de cultivo celular no incluye suero o componentes de una fuente de mamífero) . Más preferiblemente, el medio de cultivo celular está libre de una fuente animal (esto es, el medio de cultivo celular no incluye una fuente de suero o componentes de una fuente animal incluida una fuente humana) . Los ejemplos de medios libres de suero que se pueden utilizar para el cultivo de células PER.C6 incluyen medios comercialmente disponibles, tales como por e emplo medio EX CellTM VPRO (SAFC) , HyQ® CDM4RetinoTM (HyClone) , IS ProVec CD (Irvine scientific) , 293-SFM II (invitrogen) .
En modalidades preferidas, la sustancia biológica producida en el proceso de la presente invención es recogida del flujo cuyo contenido se mantiene en, o preferiblemente se retroalimenta dentro del reactor o del cultivo de células que es removido del reactor o de ambos. La(s) sustancia (s) biológica (s) producida (s) en el proceso de la presente invención puede (n) ser recogida (s) del cultivo celular en el asi llamado procesamiento corriente abajo, utilizando métodos que dependen de la sustancia biológica, cuyos métodos como tales son bien conocidos por la persona calificada. El procesamiento corriente abajo usualmente incluye varias etapas de purificación en diferentes combinaciones y en diferente orden. Los ejemplos de etapas de purificación en el procesamiento corriente abajo son etapas de separación (por ejemplo por medio de cromatografía de afinidad y/o cromatografía de intercambio iónico y/o extracción por medio de sistemas acuosos de dos fases y/o precipitación por ejemplo por medio de sulfato de amonio) , etapas para la concentración de la sustancia biológica (por ejemplo, por ultrafiltración o diafiltración) , etapas para amortiguadores de intercambio y/o etapas para remover o inactivar virus (por ejemplo, por filtración de virus, cambio del pH o tratamiento con detergente solvente) . En un aspecto, la invención se relaciona con un cultivo de células que incluye células de mamífero, preferiblemente células HER inmortalizadas El, más preferiblemente células PER.C6, que tienen una densidad de células viables de al menos 50 x 106 células/mL, preferiblemente al menos 60 x 106 células/mL, en particular al menos 90 x 106 células/mL y una concentración de sustancia biológica de al menos 5 g/L, más preferiblemente al menos 10 g/L, en particular al menos 11 g/L. En principio, la concentración de la sustancia biológica puede ser tan alta como la solubilidad de la sustancia biológica lo permita. La concentración de células viables típicamente no es mayor de 200 x 106 células/ml y preferiblemente está dentro del rango de 80 - 150 x 106 células/mL. La densidad de las células viables se puede determinar por ejemplo utilizando el método de exclusión de azul de triptano por ejemplo por medio del uso de un contador de células como el se consigue comercialmente por ejemplo con Innovatis (contador de células Cedex) . Por cultivo de células se entiende el líquido que incluye al medio de cultivo celular, a las células y a la sustancia biológica, cuyo liquido es el resultado de un proceso para el cultivo de células en un reactor en un medio de cultivo celular, en donde las células producen la sustancia biológica. Se aclarar la invención ahora por medio de los siguientes ejemplos sin limitarse sin embargo a los mismos .
Descripción de las figuras Fig. 1/9. muestra la densidad de las células viables Y (106 x mL-1) graficada versus el tiempo del proceso X (dias) para el proceso A (lote) , B (semicontinuo) y Cl (proceso de la invención) . Fig. 2/9 muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% comparado con la concentración de IgG en el proceso A) versus el tiempo del proceso X (dias) para el proceso A (lote) , B (semicontinuo) y Cl (proceso de la invención) . Fig. 3/9 muestra la densidad de las células viables Y (106 x mL-1) graficada versus el tiempo del proceso X (dias) para el proceso A (lote), B (semicontinuo) y C2 (proceso de la invención) . Fig. 4/9 muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% comparado con la concentración de IgG en el proceso A) versus el tiempo del proceso X (días) para el proceso A (lote) , B (semicontinuo) y C2 (proceso de la invención) . Fig. 5/9 muestra la densidad de las células viables Y (106 x mL-1) graficada versus el tiempo del proceso X (dias) para el proceso A (lote) , B (semicontinuo) y C3 (proceso de la invención) . Fig. 6/9 muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% comparado con la concentración de IgG en el proceso A3) versus el tiempo del proceso X (dias) para el proceso A y C3. Fig. 7/9 muestra el rendimiento acumulado Q (% comparado con el rendimiento en el proceso A, x el volumen del reactor en L) graficado versus el tiempo del proceso X (dias) para los procesos A, B y C3. Fig. 8/9 muestra el número de células Y (106 x mL-1) graficado versus el tiempo del proceso X (dias) para C4 (proceso de la invención) . Fig. 9/9 muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% comparado con la concentración máxima alcanzada de IgG) versus el tiempo del proceso X (dias) para el proceso C4 (una modalidad del proceso de la invención) .
E emplos Ejemplo 1: Comparación entre un proceso por lotes, un proceso semicontinuo y el proceso de acuerdo con la invención En este ejemplo se comparó el rendimiento del proceso de acuerdo con la invención con los procesos por lotes y el semicontinuo. La Figura 1/9 muestra la densidad de las células viables Y (106 x mL-1) graficada versus el tiempo del proceso X (días) para el proceso A (lote), B (semicontinuo) y Cl (proceso de la invención) . La Figura 2 muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% comparado con la concentración de IgG en el proceso A) versus el tiempo del proceso X (dias) para el proceso A (lote) , B (semicontinuo) y Cl (proceso de la invención) . Todas las fermentaciones fueron realizadas utilizando un controlador Biostat B de Sartorios para controlar la temperatura a 36,5°C, al pH entre 7,2 y 6,8 y la DO con una saturación de aire del 50% y a 200 rpm. Se utilizó la misma linea de células PER.C6 que produce IgG (ver WO 2004/099396) en todos los experimentos. Proceso A por lotes Se llevó a cabo el proceso por lotes en un volumen de trabajo de 4 L en un recipiente B5 de Sartorios. Se inocularon las células a razón de 3 x 105 células/mL en un medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM y posteriormente se cultivó durante 17 días. Proceso B semicontinuo Se llevó a cabo el proceso semicontinuo en un volumen de trabajo de 4 L en un recipiente B5 de Sartorios. Se inocularon las células a razón de 3 x 105 células/mL en un medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM. Durante el cultivo se añadieron glucosa y glutamina para mantener la concentración respectivamente por encima de 15 mM y 1 mM. Se añadieron aminoácidos y péptidos desde el dia 5 para reponer los aminoácidos consumidos . Proceso Cl de la invención El proceso de la invención se llevó a cabo en un recipiente Applikon de 2 L. Se utilizó una membrana de fibra hueca con un Corte de Peso Molecular de 100 kDa (M CO) obtenida con General Electric (GE) operada en un modo de flujo ATF con un sistema ATF-2 (Refine Technology) para retener las células y al producto IgG. Se inició el cultivo con 3 x 105 células/mL en un medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM. Se hizo perfusión del medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM a través del cultivo de células en suspensión utilizando una Velocidad Especifica de Flu o (SFR) entre 0,05 y 0,2 nL/célula/día . La concentración más alta de producto obtenida fue de 1,4 g/L.
El proceso de la invención resultó en mayores densidades de células viables y en mayores concentraciones de producto en comparación con los modos de cultivo mencionados en menos tiempo, como se puede observar en las Fig. 1 y Fig. 2 más abajo. Ejemplo 2: Comparación entre un proceso por lotes, un proceso semicontinuo y el proceso de acuerdo con la invención En este ejemplo se comparó nuevamente el proceso de acuerdo con la presente invención con procesos por lotes y semicontinuos ; en el proceso C2 , se controló la presión de C02 y se utilizó un sistema de separación de 50 kDa . La Fig. 3/9 muestra la densidad de las células viables Y (106 x mL-1) graficada versus el tiempo del proceso X (días) para el proceso A (lote), B (semicontinuo) y C2 (proceso de la invención) . La Fig. 4/9 muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% comparado con la concentración de IgG en el proceso A) versus el tiempo del proceso X (dias) para el proceso A (lote) , B (semicontinuo) y C2 (proceso de la invención) .
Todas las fermentaciones fueron realizadas utilizando un controlador Biostat B de Sartorios para controlar la temperatura a 36,5°C, al pH entre 7,2 y 6,8 y la DO con una saturación de aire del 50% y a 200 rpm. Se utilizó la misma linea de células PER.C6 que produce IgG (de aproximadamente 150 kDa) (ver WO 2004/099396) en todos los experimentos .
Proceso A por lotes Se llevó a cabo el proceso por lotes en un recipiente B5 de Sartorios. Se inocularon las células a razón de 3 x 105 células x ml-l en un medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM y posteriormente se cultivó durante 17 dias . Proceso B semicontinuo Se llevó a cabo el proceso semicontinuo en un volumen de trabajo de 4 L en un recipiente B5 de Sartorios. Se inocularon las células a razón de 3 x 105 células x mL-l en un medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM. Durante el cultivo se añadieron glucosa y glutamina para mantener la concentración respectivamente por encima de 15 mM y 1 mM. Se añadieron aminoácidos y péptidos desde el día 5 para reponer los aminoácidos consumidos . Proceso C2 de la invención El proceso de la invención se llevó a cabo en un recipiente Applikon de 2 L. Se utilizó una membrana de fibra hueca (GE) con un Corte de Peso Molecular de 50 kDa (MWCO) operada en un modo de flujo ATF con un sistema ATF-2 (Refine Technology) para retener las células y al producto IgG. Se inició el cultivo con 3 x 105 células /mL en un medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM. Se hizo perfusión del medio de cultivo VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM a través del cultivo de células en suspensión utilizando una SFR entre 0,05 y 0,2 nL x célula-1 x dia-1. Se controló la presión de C02 por debajo del 15% . Resultados Como se observa a partir de la Fig. 3/9 y a partir de la Fig. 4/9, el proceso de acuerdo con la invención resulta en densidades de células viables significativamente mayores y en mayores concentraciones de producto (rendimiento por lotes del 2415%; rendimiento en un proceso semicontinuo del 690%) en un tiempo igual o menor (tiempo en un proceso por lotes del 100%; tiempo en un proceso semicontinuo del 81%) . El incremento de la productividad total en g.L-l.dia-1 del proceso de la invención es de 23,9 veces para la productividad por lotes en g.L-l.dia-1 y de 8,5 veces para la productividad semicontinua en g.L-l.dia-1. En el proceso de la invención C2 , se produjeron 11,1 g de producto/L. No se presento obstrucción del dispositivo de retención durante 17 dias, incluso con una densidad de células muy alta. Ejemplo 3: Comparación entre un proceso por lotes, un proceso semicontinuo y el proceso de acuerdo con la invención En este ejemplo, se comparó el rendimiento del proceso de acuerdo con la presente invención con remoción del cultivo de células con los procesos por lotes y semicontinuo; en el proceso C3 se había removido el cultivo de células . La Fig. 5/9 muestra la densidad de las células viables Y (106 x mL-1) graficada versus el tiempo del proceso X (días) para el proceso A (lote) , B (semicontinuo) y C3 (proceso de la invención) . La Fig. 6/9 muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% comparado con la concentración de IgG en el proceso A3) versus el tiempo del proceso X (días) para el proceso A y C3. La Fig. 7/9 muestra el rendimiento acumulado Q (% comparado con el rendimiento en el proceso A, x el volumen del reactor en L) graficado versus el tiempo del proceso X (dias) para los procesos A, B y C3. Todas las fermentaciones fueron realizadas utilizando un controlador Biostat B de Sartorios para controlar la temperatura a 36,5°C, al pH entre 7,2 y 6,8 y la DO con una saturación de aire del 50% y a 200 rpm. Se utilizó la misma linea de células PER.C6 que produce IgG (de aproximadamente 150 kDa) (ver WO 2004/099396) en todos los experimentos . Proceso A por lotes Se llevó a cabo el proceso por lotes en un volumen de trabajo de 4 L en un recipiente B5 de Sartorios. Se inocularon las células a razón de 3 x 105 células/mL en un medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM y posteriormente se cultivó durante 17 dias . Proceso B semicontinuo Se llevó a cabo el proceso semicontinuo en un volumen de trabajo de 4 L en un recipiente B5 de Sartorios. Se inocularon las células a razón de 3 x 105 células/mi, en un medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM. Durante el cultivo se añadieron glucosa y glutamina para mantener la concentración respectivamente por encima de 15 mM y 1 mM. Se añadieron aminoácidos y péptidos desde el día 5 para reponer los aminoácidos consumidos .
Proceso C3 de la invención El proceso de la invención se llevó a cabo en un recipiente Applikon de 2 L. Se utilizó una membrana de fibra hueca (GE) con un Corte de Peso Molecular de 100 kDa (MWCO) operada en un modo de flujo ATF con un sistema ATF-2 (Refine Technology) para retener las células y al producto IgG. Se inició el cultivo con 3 x 105 células/mL en un medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM. Se hizo perfusión del medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM a través del cultivo de células en suspensión utilizando una SFR entre 0,05 y 0,2 nL/célula/dia . Se remueve el cultivo de células con 10% del volumen de trabajo por dia por encima de 10 x 106 células.mL-1 y con 30% del volumen de trabajo por día cuando la densidad de las células viables excede de 30 x 106 células .mL-1 en adelante. Resultados Como se observa a partir de la Fig. 5/9 con el proceso de la invención se alcanzan más rápidamente densidades superiores de células viables. Además, la Fig. 5/9 también muestra que la viabilidad de las células se puede mantener durante más tiempo mientras que con el proceso C3 se mantuvo en operación durante un período de cerca de 40 días, debido a que no se presentó obstrucción del dispositivo de retención incluso con una alta densidad de células.
La Fig. 6/9 muestra que las concentraciones de producto para el proceso de la presente invención son mucho mayores que la concentración de producto en el proceso por lotes. Se recogió el flujo de producto que contenia al producto a partir del proceso C3 con aproximadamente 200% a 250% veces la concentración final en el proceso A por lotes . La Fig. 7/9 muestra que la mayor parte del producto se forma por medio del proceso de la presente invención y que el proceso de la invención se puede mantener durante más tiempo que el proceso A por lotes o que el proceso B semicontinuo . El día 17, el rendimiento acumulado del proceso C3 es 8,1 veces el rendimiento acumulado del proceso por lotes (A3) y 2,1 veces el rendimiento acumulado del proceso semicontinuo (B) . También, el dia 17, terminó el proceso por lotes. El dia 21, el rendimiento acumulado del proceso C3 es 2,0 veces el rendimiento acumulado del proceso B semicontinuo. El dia 21, terminó el proceso semicontinuo. Después de 39 días, el rendimiento acumulado total del proceso C3 es 25 veces el rendimiento acumulado del proceso A por lotes y 6 veces el rendimiento del proceso B semicontinuo . Se puede concluir a partir de este experimento que el rendimiento total del material biológico deseado en el proceso de acuerdo con la presente invención puede ser mejorado adicionalmente por medio de la aplicación de una purga del cultivo de células cuando la densidad de las células excede de un cierto nivel alto . Ejemplo 4: cultivo de y producción con células CHO En este ejemplo, se llevó a cabo el proceso de acuerdo con la presente invención con una linea de células CHO que producen IgG e incluye una caída de la temperatura para disminuir el crecimiento celular. La Fig. 8/9 muestra el número de células Y (106 x ml-1) graficado versus el tiempo del proceso X (días) para C4 (proceso de la invención) . La Fig. 9/9 muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% comparado con la concentración máxima alcanzada de IgG) versus el tiempo del proceso X (días) para el proceso C4 (una modalidad del proceso de la invención) . Se llevó a cabo la fermentación utilizando un controlador Biostat B de Sartorios para controlar la temperatura a 36,5°C, al pH entre 7,1 y 6,9 y la DO con una saturación de aire del 40% y a 100 rpm. La temperatura cayó hasta 32 °C el dia 5. Proceso C4 de la invención El proceso de la invención se llevó a cabo en un recipiente Applikon de 2 L. El dispositivo de retención de producto y de células es una membrana de fibra hueca con un Corte de Peso Molecular de 50 kDa (MWCO) (General Electric) operada en un modo de flujo ATF con un sistema ATF-2 (Refine Technology) . Se inició el cultivo con 5 x 106 células.mL-1 en un medio de cultivo MTCM-49 (Hyclone) . Se hizo perfusión del medio a través del cultivo de células en suspensión utilizando un SFR entre 0,1 y 0,4 nL . célula-1. día-1. Se controló la presión de C02 por debajo del 15%.
Resultado Los datos muestran que el proceso de la invención también funciona cuando se utiliza una linea de células CHO que produce proteina. La densidad de células alcanzada y las concentraciones de producto se incrementan en comparación con el cultivo por lotes. Los datos también muestran que en el proceso de acuerdo con la presente invención se puede detener el crecimiento celular (por ejemplo, por medio de una caida de la temperatura) , mientras continúa la acumulación de producto en el sistema de cultivo. Ejemplo 5: Proceso de la invención realizado con una linea de células de mieloma El proceso de acuerdo con la presente invención se puede aplicar también a lineas de células de mieloma. Con este propósito se lleva a cabo la fermentación utilizando un controlador Biostat B de Sartorios para controlar la temperatura en 36,5°C, un pH entre 7,2 y 6,8 y la DO con una saturación de aire del 40% y a 100 rpm. El cultivo de células se inicia con la inoculación de las células de mieloma a razón de 3 x 105 células/mL en medio de cultivo SFM4Mab (Hyclone) en un recipiente Sartorios de 5 L. El dispositivo de retención de producto y de células es una membrana de fibra hueca con un Corte de Peso Molecular de 30 kDa (MWCO) (General Electric) operada en un modo de flujo ATF con un sistema ATF-2 (Refine Technology) . Se hizo perfusión del medio de cultivo SFM4Mab (Hyclone) a través del cultivo de células en suspensión utilizando un SFR entre 0,1 y 0,4 nL . célula- 1. dia- 1. Se controló la presión de C02 por debajo del 15%. Ejemplo 6: Proceso de la invención realizado con una linea de células MDCK El proceso de acuerdo con la presente invención se puede aplicar también a lineas de células MDCK transformadas en suspensión. Con este propósito se lleva a cabo la fermentación utilizando un controlador Biostat B de Sartorios para controlar la temperatura en 36,5°C, un pH entre 7,2 y 6,8 y la DO con una saturación de aire del 40% y a 100 rpm. El cultivo de células se inicia con la inoculación de las células MDCK transformadas a razón de 3 x 105 células/mL en medio de cultivo VP-SFM (Invitrogen) en un recipiente Sartorios de 5 L. El dispositivo de retención de producto y de células es una membrana de fibra hueca con un Corte de Peso Molecular de 30 kDa (MWCO) (General Electric) operada en un modo de flujo ATF con un sistema ATF-4 (Refine Technology) . Se hizo perfusión del medio de cultivo VP-SFM (Invitrogen) a través del cultivo de células en suspensión utilizando un SFR entre 0,1 y 0,4 nL . célula- 1. dia-1. Se controló la presión de C02 por debajo del 15%.

Claims (14)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes : REIVINDICACIONES
1. Proceso para el cultivo de células en un reactor en suspensión en un medio de cultivo celular, en donde las células producen una sustancia biológica, en donde se alimenta al menos un componente del medio de cultivo celular al cultivo de células y en donde el cultivo de células incluye a las células, a la sustancia biológica y se cultiva el medio de cultivo celular sobre un sistema de separación y en donde el sistema de separación separa la sustancia biológica de las sustancias gue tienen un peso molecular menor gue la sustancia biológica y en donde la sustancia biológica es retenida en o retroalimentada dentro del reactor.
2. Proceso de acuerdo a la reivindicación 1, en donde parte de las sustancias de menor peso molecular se remueve continuamente del cultivo de células.
3. Proceso de acuerdo a la reivindicación 1 - 2, en donde las células son células de mamífero, preferiblemente células HER inmortalizadas El, más preferiblemente células PER.C6.
4. Proceso de acuerdo a la reivindicación 1 - 3, en donde la sustancia biológica es una proteina recombinante , preferiblemente un anticuerpo.
5. Proceso de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en donde el sistema de separación es un filtro, preferiblemente un filtro de membrana, más preferiblemente un filtro de fibra hueca .
6. Proceso de acuerdo a la reivindicación 5, en donde se hace circular el cultivo de células sobre el filtro en un flujo cruzado, preferiblemente un flujo tangencial alternante.
7. Proceso de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, en donde se remueve el cultivo de células al menos una vez del reactor y del liquido, preferiblemente se añade medio de cultivo celular al reactor para compensar la remoción del cultivo de células .
8. Proceso de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7, en donde se escogen las condiciones del cultivo de células de tal manera que la velocidad de crecimiento de las células y/o la productividad especifica de las células no se vean limitadas .
9. Proceso de acuerdo a la reivindicación 8, en donde se escogen las condiciones del cultivo de células de tal manera que la concentración de al menos uno de los componentes del medio de cultivo celular permanece constante.
10. Proceso de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9, en donde al menos los nutrientes agotados son suplementados parcialmente o preferiblemente completamente por medio de la alimentación de estos nutrientes al reactor.
11. Proceso de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10, en donde se recoge opcionalmente la sustancia biológica de las células y/o del cultivo de las células .
12. Un cultivo de células que incluye células de mamífero que tienen una densidad de células viable de al menos 50 x 106 células/mL y una concentración de sustancia biológica e al menos 5 g/L.
13. Un cultivo de células de acuerdo a la reivindicación 12, en donde la concentración de la sustancia biológica es al menos de 10 g/L, preferiblemente al menos de 11 g/L.
14. Un cultivo de células de acuerdo a la reivindicación 12 - 13, en donde las células de mamífero son células HER inmortalizadas El, preferiblemente células PER.C6.
MX2009000522A 2006-07-14 2007-07-04 Proceso mejorado para el cultivo de celulas. MX2009000522A (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06014671 2006-07-14
EP07002571 2007-02-06
PCT/EP2007/005915 WO2008006494A1 (en) 2006-07-14 2007-07-04 Improved process for the culturing of cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2009000522A true MX2009000522A (es) 2009-01-27

Family

ID=38441437

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2009000522A MX2009000522A (es) 2006-07-14 2007-07-04 Proceso mejorado para el cultivo de celulas.
MX2013010858A MX340242B (es) 2006-07-14 2007-07-04 Proceso mejorado para el cultivo de celulas.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2013010858A MX340242B (es) 2006-07-14 2007-07-04 Proceso mejorado para el cultivo de celulas.

Country Status (22)

Country Link
US (7) US8119368B2 (es)
EP (5) EP2041259B2 (es)
JP (4) JP5092129B2 (es)
KR (3) KR20120009530A (es)
CN (2) CN104263700A (es)
AR (1) AR062072A1 (es)
AU (1) AU2007272054C1 (es)
BR (1) BRPI0714347A2 (es)
CA (1) CA2657040C (es)
CL (1) CL2007002060A1 (es)
DK (4) DK2634242T3 (es)
EA (2) EA016451B1 (es)
ES (5) ES2559308T3 (es)
FI (1) FI2343362T4 (es)
HU (5) HUE028593T2 (es)
IL (2) IL196322A0 (es)
MX (2) MX2009000522A (es)
PL (5) PL2634250T3 (es)
PT (5) PT2343362T (es)
SI (5) SI2634242T1 (es)
TW (3) TWI627274B (es)
WO (1) WO2008006494A1 (es)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1930281A (zh) * 2004-03-05 2007-03-14 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于通过连续灌注和交互切向流来培养细胞的方法
US8585594B2 (en) * 2006-05-24 2013-11-19 Phoenix Biomedical, Inc. Methods of assessing inner surfaces of body lumens or organs
KR20120009530A (ko) 2006-07-14 2012-01-31 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 개선된 세포 배양 방법
US9109193B2 (en) * 2007-07-30 2015-08-18 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Continuous perfusion bioreactor system
US8623650B2 (en) * 2007-10-19 2014-01-07 Viacyte, Inc. Methods and compositions for feeder-free pluripotent stem cell media containing human serum
US9238792B2 (en) * 2009-09-15 2016-01-19 E I Du Pont De Nemours And Company Compartmentalized simultaneous saccharification and fermentation of biomass
WO2011045378A1 (en) 2009-10-15 2011-04-21 Crucell Holland B.V. Method for the purification of adenovirus particles
MX2012004221A (es) 2009-10-15 2012-06-08 Crucell Holland Bv Proceso para purificacion de adenovirus de cultivos de alta densidad celular.
WO2012030512A1 (en) 2010-09-03 2012-03-08 Percivia Llc. Flow-through protein purification process
CN103154233A (zh) * 2010-10-05 2013-06-12 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 生产蛋白质的方法
SG192611A1 (en) 2011-02-10 2013-09-30 Crucell Holland Bv Pneumatic alternating pressure membrane cell separation system
RU2580020C2 (ru) * 2011-04-29 2016-04-10 Биокон Рисерч Лимитед Способ снижения гетерогенности антител и способ получения соответствующих антител
WO2012156356A1 (en) 2011-05-13 2012-11-22 Octapharma Ag A method of increasing the productivity of eucaryotic cells in the production of recombinant fviii
WO2013006479A2 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Amgen Inc. Mammalian cell culture
TWI637057B (zh) 2012-11-09 2018-10-01 拜爾沙納有限公司 具交替生物反應器用途之不連續進料批次製程
US9975095B2 (en) 2012-11-29 2018-05-22 Emd Millipore Corporation Container having magnetic impeller assembly with hood
AU2014228275B2 (en) * 2013-03-15 2019-03-14 Genzyme Corporation High-density cell banking methods
US10316282B2 (en) 2013-03-19 2019-06-11 Cmc Biologics A/S Method for producing a product (e.g. polypeptide) in a continuous cell culture fermentation process
BR112016005545B1 (pt) * 2013-09-16 2021-06-01 Genzyme Corporation Método de processamento de uma cultura de células de mamífero
BR112016006063A2 (pt) * 2013-09-30 2017-08-01 Crucell Holland Bv método para clarificação de uma colheita de cultura celular em bruto
PT3152317T (pt) 2014-06-04 2019-04-18 Amgen Inc Métodos de colheita de culturas de células de mamíferos
PL3158055T3 (pl) * 2014-06-13 2020-03-31 Csl Limited Ulepszone wytwarzanie rekombinowanego czynnika von Willebranda w bioreaktorze
KR102364111B1 (ko) 2014-07-24 2022-02-17 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 세포 배양물로부터 폴리오바이러스의 정제 방법
JP6530171B2 (ja) * 2014-09-09 2019-06-12 旭化成メディカル株式会社 培養産生物の回収方法
EP3423158B1 (en) 2016-02-24 2023-11-15 The Rockefeller University Embryonic cell-based therapeutic candidate screening systems, models for huntington's disease and uses thereof
WO2017180724A1 (en) * 2016-04-12 2017-10-19 Artemis Biosystems, Inc. Perfusion filtration systems
WO2018159847A1 (ja) 2017-03-03 2018-09-07 富士フイルム株式会社 細胞培養装置及び細胞培養方法
IL273549B2 (en) 2017-10-06 2023-10-01 Lonza Ag Automated control of cell culture using Raman spectroscopy
AU2018350898B9 (en) 2017-10-16 2024-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Perfusion bioreactor and related methods of use
EP3700505A4 (en) 2017-10-26 2021-01-06 Repligen Corporation MICRO-ALTERNATIVE TANGENTIAL FLOW INFUSION FILTER, PROCESSING CONTAINER, AND METHODS OF USE THEREOF
KR102833281B1 (ko) * 2017-12-11 2025-07-11 암젠 인크 이중특이적 항체 생성물의 연속 제조 공정
CN111902197B (zh) * 2018-03-08 2022-10-28 瑞普利金公司 切向流深度过滤系统和使用其进行过滤的方法
JP6869423B2 (ja) * 2018-03-19 2021-05-12 富士フイルム株式会社 生産物の製造方法
KR102819571B1 (ko) 2018-05-25 2025-06-12 리플리겐 코포레이션 접선 유동 여과 시스템 및 방법
CN109157690A (zh) * 2018-06-15 2019-01-08 翁炳焕 猴-人细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备
JP7707062B2 (ja) * 2018-11-02 2025-07-14 ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド 連続的採取を行い細胞流出を行わない強化灌流による細胞培養法
EP3647405A1 (en) * 2018-11-02 2020-05-06 Microfluidx Cell culture device and method of using the same
WO2020238918A1 (en) 2019-05-28 2020-12-03 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. A raman spectroscopy integrated perfusion cell culture system for monitoring and auto-controlling perfusion cell culture
EP4055136A1 (en) 2019-11-07 2022-09-14 Merck Patent GmbH Methods and systems for performing perfusion cell culture
EP4107247A2 (en) 2020-03-10 2022-12-28 Cellares Corporation Systems, devices, and methods for cell processing
US12252678B2 (en) 2021-12-01 2025-03-18 Microfluidx Ltd Systems and methods for bioprocessing
WO2024228717A2 (en) 2022-09-07 2024-11-07 Quantitative Biosciences, Inc. Fentanyl-specific single variable-domain antibodies and use in a continuous agglutination assay
WO2024072444A1 (en) * 2022-09-26 2024-04-04 Upside Foods, Inc. Harvesting cell-based meat
US11898127B1 (en) 2022-09-26 2024-02-13 Upside Foods, Inc. Harvesting cell-based meat
CN120897988A (zh) 2023-03-21 2025-11-04 赛阿瑞斯公司 用于在细胞处理系统内的电穿孔的系统、设备和方法
WO2024226439A1 (en) 2023-04-24 2024-10-31 Quantitative Biosciences, Inc. Engineered biosensor strains of e. coli for continuous aerobic detection of analytes
US12399193B2 (en) 2023-05-05 2025-08-26 Cellares Corporation Systems, devices, and methods for combined cell processes
WO2025041064A2 (en) 2023-08-21 2025-02-27 Cellares Corporation Systems, devices, and methods for automatic cell sorting
US12497587B2 (en) 2023-08-21 2025-12-16 Cellares Corporation Bioreactors and methods of their use in automatic cell processing systems
WO2025041046A1 (en) 2023-08-21 2025-02-27 Cellares Corporation Systems, devices, and methods for fluid control in a cell processing system
WO2025128343A1 (en) 2023-12-11 2025-06-19 Just-Evotec Biologics, Inc. Protein expression using trans-splicing and split selectable markers
US12492368B2 (en) 2024-03-11 2025-12-09 Cellares Corporation Monitoring air pressure within a cell processing system
USD1109621S1 (en) 2024-04-15 2026-01-20 Cellares Corporation Analytical platform for biological material testing

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4477342A (en) 1982-08-31 1984-10-16 Becton, Dickinson And Company Apparatus and method for controlling ultrafiltration during hemodialysis
US4885166A (en) * 1985-06-11 1989-12-05 Ciba-Geigy Corporation Hybrid interferons
US5286646A (en) * 1985-11-25 1994-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Method for mammalian cell culture
IL82746A (en) * 1986-06-06 1994-10-07 Genentech Inc Process for producing biologically active tissue-type plasminogen activator
JPH0642905B2 (ja) 1986-06-13 1994-06-08 東レ株式会社 血液透析膜
GB8617646D0 (en) 1986-07-18 1986-08-28 Manchester Inst Science Tech Recovery of biological material
US6022742A (en) * 1986-11-26 2000-02-08 Kopf; Henry B. Culture device and method
US4806484A (en) 1987-08-07 1989-02-21 Igb Products, Ltd. Perfusion airlift bioreactor
JPH0797982B2 (ja) 1987-09-24 1995-10-25 東洋紡績株式会社 細胞培養装置
US4921792A (en) 1987-11-27 1990-05-01 Miles Inc. Continuous cell dispersion, cultivation and substance recovery process
JPH01243985A (ja) 1988-03-25 1989-09-28 P C C Technol:Kk 植物器官の培養法及びその培養槽
US5595909A (en) * 1988-05-23 1997-01-21 Regents Of The University Of Minnesota Filter device
JPH02119772A (ja) * 1988-10-29 1990-05-07 Shimadzu Corp 細胞培養装置
JP2625990B2 (ja) * 1988-11-19 1997-07-02 株式会社島津製作所 細胞培養装置
US5019512A (en) * 1989-03-17 1991-05-28 Baxter International Inc. Spin filter for removing substantially cell-free culture medium from suspension cell culture system
JP2690144B2 (ja) * 1989-04-24 1997-12-10 哲哉 峠 膜型細胞培養装置
JPH0793874B2 (ja) * 1989-04-27 1995-10-11 日本碍子株式会社 バイオリアクタ
US5256294A (en) 1990-09-17 1993-10-26 Genentech, Inc. Tangential flow filtration process and apparatus
JP2948675B2 (ja) * 1991-03-20 1999-09-13 日本碍子株式会社 発酵液中の有価物を回収するクロスフロー濾過方法
JPH0531332A (ja) * 1991-07-30 1993-02-09 Toto Ltd 微生物の膜分離方法
GB9118664D0 (en) 1991-08-30 1991-10-16 Celltech Ltd Cell culture
JPH07123972A (ja) * 1993-11-01 1995-05-16 Fumio Yamauchi 膜型バイオリアクター
JPH07298871A (ja) * 1994-05-06 1995-11-14 Fumio Yamauchi 膜型バイオリアクター
US6204000B1 (en) 1995-04-28 2001-03-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Diagnostic methods and gene therapy using reagents derived from the human metastasis suppressor gene KAI1
ATE278794T1 (de) 1995-06-15 2004-10-15 Crucell Holland Bv Verpackungssysteme für humane, menschliche adenoviren, zur verwendung in die gentherapie
US5994728A (en) * 1995-11-15 1999-11-30 Matsushita Electronics Corporation Field effect transistor and method for producing the same
JPH1015357A (ja) * 1996-07-01 1998-01-20 Nitto Denko Corp 排水の処理方法
JPH1033671A (ja) * 1996-07-24 1998-02-10 Jms Co Ltd 中空糸型人工肝臓とその灌流及び培養システム
JP3346996B2 (ja) 1996-09-18 2002-11-18 金剛株式会社 免震自立棚
JPH10108673A (ja) * 1996-10-04 1998-04-28 Asahi Medical Co Ltd 中空糸型培養器を用いた動物細胞の培養方法
JPH10108666A (ja) * 1996-10-04 1998-04-28 Asahi Medical Co Ltd 中空糸型培養器
US6001585A (en) 1997-11-14 1999-12-14 Cellex Biosciences, Inc. Micro hollow fiber bioreactor
US8026096B1 (en) 1998-10-08 2011-09-27 Protein Sciences Corporation In vivo active erythropoietin produced in insect cells
DE60041322D1 (de) 1999-01-26 2009-02-26 Schering Plough Ltd Vermehrung des bovinen coronavirus in cho (chinese hamster ovary) zellen
SI1161548T2 (sl) 1999-04-15 2010-02-26 Crucell Holland Bv Priprava rekombinantnega proteina v humani celici z uporabo sekvenc, ki kodirajo adenovirusni E1 protein
US6855544B1 (en) 1999-04-15 2005-02-15 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell
JP2001149099A (ja) 1999-11-26 2001-06-05 Olympus Optical Co Ltd 染色体異常解析のための有核細胞の標本作製方法
EP1103610A1 (en) 1999-11-26 2001-05-30 Introgene B.V. Production of vaccines from immortalised mammalian cell lines
US6544424B1 (en) 1999-12-03 2003-04-08 Refined Technology Company Fluid filtration system
US6168941B1 (en) * 2000-04-07 2001-01-02 Genvec, Inc. Method of producing adenoviral vector stocks
JP4138209B2 (ja) 2000-06-29 2008-08-27 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 プラバスタチン含有組成物
JP2002113896A (ja) 2000-10-05 2002-04-16 Seiko Epson Corp 画像形成装置
EP1363857A2 (en) * 2001-02-23 2003-11-26 V.A.I. Ltd. Methods and apparatus for biological treatment of waste waters
JP3547715B2 (ja) * 2001-03-06 2004-07-28 榮 新垣 ベクター精製用装置及び方法
US6716354B2 (en) 2001-03-08 2004-04-06 Cdg Technology, Inc. Methods of treating water using combinations of chlorine dioxide, chlorine and ammonia
WO2002086133A1 (fr) * 2001-04-17 2002-10-31 Seiren Kabushiki Kaisha Additifs de milieu et milieux de culture de cellules animales
DE10120838A1 (de) 2001-04-27 2002-10-31 Basf Ag Stoffmischung zur UV-Stabilisierung von Kunststoffen und Herstellung davon
DE10120835C2 (de) 2001-04-27 2003-04-10 Sifin Inst Fuer Immunpraeparat Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern
DE60238863D1 (de) 2001-08-31 2011-02-17 Bayer Schering Pharma Ag Vorrichtung und verfahren zur fermentation in hohen zelldichten
ES2249616T3 (es) 2001-09-05 2006-04-01 Yamasa Corporation Citidina-fosfocolina para el tratamiento de la neuropatia diabetica.
US20030054544A1 (en) * 2001-09-14 2003-03-20 Medcell Biologics, Inc. Oxygen enriched bioreactor and method of culturing cells
GB0123098D0 (en) * 2001-09-26 2001-11-14 Lonza Biologics Plc Use of aminoglycoside resistance gene
WO2003041749A1 (de) 2001-11-15 2003-05-22 Aesculap Ag & Co. Kg Sterilbehälter
JP2003219873A (ja) 2002-01-24 2003-08-05 Japan Science & Technology Corp サケ科キングサーモン由来の不死化細胞
US20030186335A1 (en) 2002-03-28 2003-10-02 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Monoclonal antibodies, hybridomas, cell isolation method, isolated cells and immunological diagnostic method
US6902909B2 (en) 2002-07-09 2005-06-07 Synthecon, Inc. Methods for efficient production of mammalian recombinant proteins
DE10237082B4 (de) * 2002-08-09 2014-12-31 Sartorius Stedim Biotech Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur biotechnologischen Herstellung von Wertstoffen
ES2290705T3 (es) * 2003-05-01 2008-02-16 Dsm Ip Assets B.V. Proceso para la produccion de sustancias biologicas por cultivo por perfusion de celulas animales suspendidas.
JP4865539B2 (ja) * 2003-05-09 2012-02-01 クルセル ホランド ベー ヴェー Ｅ１不死化細胞の培養物及び該培養物を培養して該培養物から得られる産物の収量を増加させる方法
EP1660629A4 (en) * 2003-07-17 2015-04-08 Global Cell Solutions Llc SYSTEM AND METHOD FOR AUTOMATIC CELL CULTURE
JP2005041984A (ja) 2003-07-22 2005-02-17 Shin Kobe Electric Mach Co Ltd 水架橋ポリオレフィン製シートの製造法
CN1930281A (zh) 2004-03-05 2007-03-14 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于通过连续灌注和交互切向流来培养细胞的方法
CA2560716A1 (en) * 2004-03-29 2005-10-13 Pall Corporation Pleated, crossflow fluid treatment elements, methods for making them, and methods for treating cellular solutions
CN101061215A (zh) * 2005-01-05 2007-10-24 中外制药株式会社 细胞的培养方法及其应用
CN100354408C (zh) * 2005-10-09 2007-12-12 南京工业大学 一种高密度细胞培养方法及其生物反应装置
CA2640870A1 (en) * 2005-12-17 2007-06-21 Airinspace B.V. Air purification devices
JP5031332B2 (ja) 2006-03-31 2012-09-19 旭化成ホームズ株式会社 線切断具
KR20120009530A (ko) 2006-07-14 2012-01-31 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 개선된 세포 배양 방법
EP2014760A1 (en) 2007-06-13 2009-01-14 CMC Biopharmaceuticals A/S A method for producing a biopolymer (e.g. polypeptide) in a continuous fermentation process
JP2008308560A (ja) 2007-06-13 2008-12-25 Tohcello Co Ltd 表面防汚性複合フィルムの製造方法
JP5426937B2 (ja) * 2009-06-19 2014-02-26 興和株式会社 光学的反応測定装置および光学的反応測定方法

Also Published As

Publication number Publication date
US8685731B2 (en) 2014-04-01
FI2343362T4 (fi) 2024-07-04
AU2007272054B2 (en) 2011-09-08
JP5448010B2 (ja) 2014-03-19
IL196322A0 (en) 2009-09-22
ES2650042T3 (es) 2018-01-16
US9469865B2 (en) 2016-10-18
DK2634243T3 (en) 2017-12-11
ES2579957T5 (es) 2024-12-10
TW201341527A (zh) 2013-10-16
ES2579957T3 (es) 2016-08-17
IL234890A (en) 2016-05-31
SI2041259T1 (sl) 2016-04-29
EP2343362A1 (en) 2011-07-13
SI2343362T1 (sl) 2016-09-30
US20140154745A1 (en) 2014-06-05
US8440458B2 (en) 2013-05-14
US9670520B2 (en) 2017-06-06
SI2634250T1 (sl) 2017-06-30
TW200813216A (en) 2008-03-16
DK2634242T3 (en) 2017-05-22
JP5092129B2 (ja) 2012-12-05
EP2634243B2 (en) 2024-07-24
EP2634243B1 (en) 2017-09-06
AU2007272054A1 (en) 2008-01-17
EP2634242B1 (en) 2017-04-05
CA2657040C (en) 2013-10-01
AR062072A1 (es) 2008-10-15
JP2014217395A (ja) 2014-11-20
EP2634243A1 (en) 2013-09-04
EP2343362B2 (en) 2024-04-03
JP2012165764A (ja) 2012-09-06
TWI627274B (zh) 2018-06-21
US20120149063A1 (en) 2012-06-14
KR101143796B1 (ko) 2012-05-21
US8222001B2 (en) 2012-07-17
EP2041259B1 (en) 2015-10-14
SI2634242T1 (sl) 2017-07-31
WO2008006494A1 (en) 2008-01-17
PL2041259T3 (pl) 2016-04-29
PL2634243T3 (pl) 2018-02-28
EP2634242A1 (en) 2013-09-04
CA2657040A1 (en) 2008-01-17
EP2041259B2 (en) 2024-10-09
KR20090031899A (ko) 2009-03-30
SI2634243T1 (en) 2018-01-31
HUE028365T2 (en) 2016-12-28
HUE034299T2 (en) 2018-02-28
ES2625062T3 (es) 2017-07-18
CL2007002060A1 (es) 2008-04-18
PL2634250T3 (pl) 2017-09-29
CN104263700A (zh) 2015-01-07
DK2343362T3 (en) 2016-07-18
JP2011067222A (ja) 2011-04-07
CN102876628A (zh) 2013-01-16
BRPI0714347A2 (pt) 2013-05-07
US20100075413A1 (en) 2010-03-25
PT2343362T (pt) 2016-07-13
KR101685246B1 (ko) 2016-12-09
HUE028593T2 (en) 2016-12-28
EA200900188A1 (ru) 2009-06-30
PT2634250T (pt) 2017-07-13
DK2634243T4 (da) 2024-09-23
PL2343362T5 (pl) 2024-12-02
US20130095527A1 (en) 2013-04-18
PT2634242T (pt) 2017-07-12
EP2041259A1 (en) 2009-04-01
PL2634242T3 (pl) 2017-09-29
EP2343362B8 (en) 2016-05-18
ES2625066T3 (es) 2017-07-18
HUE035109T2 (en) 2018-05-02
HUE032608T2 (en) 2017-10-30
EA201101581A1 (ru) 2012-04-30
PT2634243T (pt) 2017-12-18
DK2343362T4 (da) 2024-07-08
ES2559308T3 (es) 2016-02-11
JP2009543565A (ja) 2009-12-10
TWI512102B (zh) 2015-12-11
KR20120009530A (ko) 2012-01-31
MX340242B (es) 2016-07-01
US8119368B2 (en) 2012-02-21
EP2343362B1 (en) 2016-03-30
EA016451B1 (ru) 2012-05-30
TW201604277A (zh) 2016-02-01
US20160265017A1 (en) 2016-09-15
DK2041259T3 (en) 2016-01-25
EP2634250A1 (en) 2013-09-04
EP2634250B1 (en) 2017-04-05
PL2343362T3 (pl) 2016-11-30
US20120064623A1 (en) 2012-03-15
US20120149107A1 (en) 2012-06-14
AU2007272054C1 (en) 2014-08-28
KR20130014640A (ko) 2013-02-07
PT2041259E (pt) 2016-02-15
TWI413689B (zh) 2013-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
MX2009000522A (es) Proceso mejorado para el cultivo de celulas.
CN101490239A (zh) 改进的细胞培养方法
AU2013204016B2 (en) Improved process for the culturing of cells
HK1189025B (en) Improved process for the culturing of cells
HK1189024A (en) Improved process for the culturing of cells
HK1189025A (en) Improved process for the culturing of cells

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration
HC Change of company name or juridical status

Owner name: DPX HOLDINGS B.V.

PD Change of proprietorship

Owner name: DPX HOLDINGS B.V.