TW200812584A - Use of inhibitors of the Na+/H+ exchanger, subtype 5 (NHE5) for improving memory - Google Patents

Description

200812584 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 關Na+/H+交換器亞型5(醜 , 憶上之醫藥品_途。 〜及供改善記 【先前技術】 癡呆係指智能下降。咸了解，其特難記憶與思 下卜年長者癡呆或老年癡呆係指老年人因中樞神經系絲 10 #構與/或代謝異常所造絲進式、後天智力下降。約7% 65歲以上人口罹患不同嚴重型態之癡呆。癡呆之原因各° 異·阿兹海默氏症為最常見之型式，高達5G%，然後為血管 性癡呆，如··多發性梗塞癡呆，及這兩種型式之組合。較少 見之原因f tau突變、蛋白病毒疾病、聚麵麵胺擴增病 15 良，如·予丁頓氏舞蹈症(Huntington，s chorea)與脊髓小腦 共濟失調與巴金森氏症。亦已知有因感染（例如· HIV)、腦 創傷、腦瘤或中毒(例如：酒精)所造成與/或相關之續發性癡 呆。 s己憶珠刻之觀念係基於新記憶隨時間穩定之能力，而對 20 新訊息之干擾及腦部功能障礙較不敏感。可藉由常用之長期 強化之細胞模式(LTP)之助，來探討記憶訊息與鞏固之基本 狀態與機轉(Neuroscientist. 9: 463-474. 2003 ; Brain Res Brain Res Rev· 45: 30-37, 2004 ; Physiol Rev· 84: 87-136, 2004) 〇 200812584 月自中儲存及處理訊息之最重要區域為海馬回形成區。長 ^以來已知，海馬回中某些電刺激型態(tetanization)會造成 犬觸放力受化（Bhss 與 L〇mo，j phySi〇i· 232: 331-356, 1973) ’現在稱為”長期增強"或，，LTp，，，後來並已於多種不同 5 哺礼動物之腦中其他區域中證實，包括活體内與活體外。 LTP為目前認為學習與記憶之神經元機轉之重要成份之一。 亦已知微弱LTP與短期記憶相關，而強烈LTp則與長期記 憶相關（J Neurosci· 20: 7631-7639, 2000 ; Pr〇c Natl Acad Sci U S Α· 97: 8116-8121、2000)。 10 海馬回在插曲式、空間式與敘事式學習與記憶過程中扮 演重要角色，係空間取向及空間結構回憶上所必需，且在控 制自主性與發育功能上扮演重要角色(McEwen 1999之”壓力 與海馬回之可塑性（Stress and hippocampal plasticity)，， Annual Review of Neuroscience 22: 105-122)。人類之癡呆 15 病變中，通常出現學習與記憶過程受損現象，其中即涉及海 馬回。以其他動物進行之實驗亦展現類似結果。 因此，由空間記憶及LTP上出現缺陷之年老小鼠與年輕 小鼠比較’即可顯示改善LTP時，同時降低記憶缺陷(Bach 等人1999之”老年人之空間記憶缺陷與活體外海馬回長期強 2〇 化之後期缺陷具相關性且可利用加強cAMP訊號途徑之藥物 減輕（Age-related defects in spatial memory are correlated with defects in the late phase of hippocampal long-term potentiation in vitro and are attenuated by drugs that enhance the cAMP signaling pathway)” Proc Natl Acad Sci 200812584 U S Α· 27 ; 96:5280-5 ; Fujii & Sumikawa 2001 之’’急性與 慢性接觸尼古丁逆轉大鼠海馬回長期強化誘發過程中隨老化 下降程度(Acute and chronic nicotine exposure reverse age-related declines in the induction of long-term potentiation 5 in the rat hippocampus)’，Brain Res· 894:347-53, Clayton 等 人2002之’，海馬回NR2B缺陷可模擬Fischer 344大鼠長期 強化與空間學習之老化變化(A hippocampal NR2B deficit can mimic age-related changes in long-term potentiation and spatial learning in the Fischer 344 rat)，， J i〇 Neurosci.22:3628-37)。 於活體内及活體外之轉殖基因動物中，當投與β-類澱粉 蛋白肽時，該肽會負面影響LTP或干擾其恆定狀態(Ye & Qiao 1999之’’β-類殿粉蛋白狀片段31-35對長期強化大鼠海 馬回所產生壓抑作用與Ν-曱基天冬胺酸受體無關：以㈠ 15 石杉驗曱彌補（Suppressive action produced by beta-amyloid peptide fragment 31-35 on long-term potentiation in rat hippocampus N-methyl-D-aspartate receptor-independent: it’s offset by (_)huperzine A)”Neurosci Lett· 275:187-90， Rowan等人2003之’’早期阿兹海默氏症動物模式之突觸可塑 20 性(Synaptic plasticity in animal models of early Alzhemer’s disease)”Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci· 358: 821_8， Gureviciene等人2004 ：^nAPP + PS1轉殖基因小鼠之正常 誘發但加速降低 LTP(Normal induction but accelerated decay of LTP in APP + PS 1 transgenic mice)’’ Neurobiol 200812584

Disl5:lj8-95)。可利用彼等常用於人類阿兹海默氏症療法 之Μ補蘭(rolipram)與膽鹼酶抑制劑來修正LTp與記憶功能 之損傷(Gong等人2_之”阿茲海默氏症小鼠模式在樂補蘭 /口療後持續改善犬觸與認知功（persistent synaptic and cognitive functions in an Alzheimer mouse model after rolipram treatment)^ J Clin Invest. 114Ί624-34) 〇 因此’右使用可改善LTP之物質，應對與認知力損傷及 癡呆相關之病變亦有利。 10 【發明内容】 已驚人發現，細胞NHE5之抑制劑可加強LTp。因此該 抑制劑對癡呆病變，如：阿兹海默氏症與類似阿 症/ 15 之癡呆應具有改善記憶之功效。使用NHE5抑制劑優於= 用於此等病變活性成份，如：乙縣祕__劑，因為 刪5僅表現在神經元，因此僅針對腦部，所以全身 較輕或沒有（Am. J. Physiol. Cell. Physi〇1 281. C1157, 2001)。 · C1146- 因此NHE5抑制劑適用於治療神經變性病變 與癡呆病變，如：老年癡呆、阿縣默氏症、血管性=， 如’例如：多發梗塞性癡呆、阿兹海默氏症與私病辦 之組^、tau突變、蛋白病毒疾病、聚麵胺酿胺擴增病變交 口· 了丁頓氏麵症(Huntington，s ch〇rea)與脊趙小腦 失調與巴金森氏症，且改善記憶之顺防抑制劑亦翻= 20 200812584 療因感染（例如：HIV)、腦創傷、腦瘤或中毒（例如：酒精) 所造成與/或相關之續發性癡呆。 下列式I NHE5抑制劑特別適合治療神經變性病變、記 憶損傷與癡呆病變，及改善記憶。

H0N

其中之定義為：

Rl、R2、R3 與 R4 10 分別獨立為氫、F、a、Br、I、CN、N〇2 或 Rl 1- (CmH2m)-An-; m 零、1、2、3 或 4 ; η 零或1 ; Rll 氫、曱基或CpF2p+l ; 15 A 氧、NH、N(CH3)或 S(0)q ; p 1、2 或 3 ; q 零、1或2 ; R5氫、具有1、2、3、4、5或6個碳原子之烷基或具有 3、4、5或6個碳原子之環烷基； 200812584 R6氫、OH、F、CF3、具有1、2、3或4個碳原子之烷基 或具有3、4、5或6個碳原子之環烷基； R7 與 R8 5 10 15 20 分別獨立為氫、F、Cl、Br、CN、C〇2R12、NR13R14 或 R16-(CmmH2mm)_Enrr ; R12 氳、具有1、2、3或4個碳原子之烷基 或具有3、4、5或6個碳原子之環烷 基； R13 與 R14 分別獨立為氫、具有1、2、3或4個碳 原子之烷基或具有3、4、5或6個碳原 子之環烧基； 或 R13 與 R14 與其所鍵結之氮原子共同形成4-、5-、 6_或7-員環，其中一個CH2基團可被 NR15、S或氧置換； R15 氫、具有1、2、3或4個碳 原子之烷基或具有3、4、5 或6個碳原子之環烷基； mm 零、1、2、3 或 4 ; nn 零或1 ; R16 氳、曱基或 CppF2pp+l ; E 氧或 S(0)qq ; -10- 200812584 pp 1、2 或 3 ; qq 零、1或2 ; 與其醫藥上可接受之鹽類與三氟乙酸鹽。 一項具體實施例中，較佳為式I化合物，其中之定義 5 為：

Rl、R2、R3 與 R4 分別獨立為氫、F、Ο、Br、CN 或 Rll-(CmH2m)-An- m 零或1 ; 10 η 零或1 ; Rll 氫、甲基或CpF2p+1 ; A 氧、NCH3 或 S(0)q ; p 1 或 2 ; q 零、1或2 ; is R5 氬、甲基、乙基或環丙基； R6氫或甲基； R7 與 R8 分別獨立為氫、F、Cl、CN、C〇2R12、NR13R14 或 R16_(CmmH2mm)-Enrr ; 2〇 R12 氫、曱基或乙基； R13 與 R14 分別獨立為氫、具有1、2、3或4個碳 原子之烷基或具有3、4、5或6個碳原 子之環烷基； -11 - 200812584 或 5 與，所鍵結之氮原子共同形成5_、卜或 :貝環，其中—個％基團可被 NR15、S或氧置換； R15氫、具有卜2、3或4個碳 10 原子之烷基或具有3、4、5 或6個碳原子之環烷基； mm 零、1或2 ; nn 零或1 ; R16 氫、曱基或 CppF2pp+1 ; E 氧或 S(0)qq ; PP 1 或 2 ; 15 qq 零、1或2; 與其醫藥上可接受之鹽類與三氣乙酸鹽。 特別佳之式I化合物為其中之定義為： R1 與 R3 氫； 尺2與仏4 20 分別獨立為氫、F、Cl、NH2、NHCH3 或 N(CH3)2 ; R5氫、甲基、乙基或環丙基； R6氫或曱基； R7 與 R8 氫； -12- 200812584 與其醫藥上可接受之鹽類與三1乙酸鹽。 明確較佳化合物為N-二胺基亞曱基冬(6,8_二氯·2_曱 基-1，2,3,4-四氫異喹啉_4_基）苯磺醯胺與其醫藥上可接受之 鹽類與三氟乙酸鹽類。 一項具體貫施例中，較佳為式Z化合物，其中基團R1、 R2 R3 R4 分別獨立為氫、f、ci、Br、CN 或 Rll_ (ΟηΗ2ιη)-Α『，其中m與n分別獨立為零或1，rii為 氳、甲基或CpF2p+1，A為氧、NCH3*s(〇)q，其中口為 1或2與q為零、！或2 ;特別佳為式j化合物，其中以與 R3為鼠R2與R4分別獨立為氳、ρ、ci、NH2、NHCH3 或N(CH3)2，例如：α。一項具體實施例中，較佳為式工化 合物’其中R2與R4不為氫。 另一項具體實施例中，較佳為式〗化合物，其中R5為 氫、曱基、乙基或環丙基，例如：甲基。 另一項具體實施例中，較佳為式丨化合物，其中R6為 氫或曱基。 另一項具體實施例中，較佳為式〗化合物，其中基團 R7 與 R8 分別獨立為氫、f、Cl、CN、C〇2R12、NR13R14 或R16_(CmniH2mm)-Enn_ ’其中r12為氫、曱基或乙基、 R13與R14分別獨立為氳、具有！、2、3或*個碳原子之烧 基或具有3、4、5或6個碳原子之環烷基，R13與R14與其 所鍵結之氮原子共同形成5-、6-或7-員環，其中一個CH2 基團可被NR15、S或氧置換，其中R15為氫、具有t、2、 3或4個碳原子之烧基或具有3、4、5或6個碳原子之環烷 -13- 200812584 基，其中mm為零、！或2，nn為零或卜Rl6為氫、甲基 或CppF2pp+1 ’其中E為氧或s(〇)qq，其中卯為i或2與 qq為零、1或2 ;特別佳為式j化合物，其中R7盥似為 5 10 15 20 若式I化合物包含一個或多個不對稱令心時，其可分別 獨立為S與R組態。該等化合物可呈光學異構物、非對映異 構物、消旋物或其所有比例之混合物之型式。 本發明包括式I化合物之所有可能互變異構型。 本發明進-步包括式！化合物之衍生物，例如：溶劑合 物如.水合物與醇加合物、酿、前藥與式！化合物之其他 生里上可接又之彳生物、與式〗化合物之活性代謝物。本發 明同樣包括^1化合物之所有結晶修飾型。 你^基可為絲或分支。此料義於當其射取代基或 制1^基團之取代鱗’例如：氟絲或餘基。烧基實 基：基、正丙基、異丙基(=ι-甲基乙基)、正丁 丁其二！'甲基丙基）、第二丁基(=1_曱基丙基）、第三 _二曱基乙基）、正戊基、異戊基、第三戊基、新戊 較佳烧基為甲基、乙基、正丙基、異丙基與正丁 f、。烷基中-個或多個，例如：卜2、3、4、5、6、7、 箄翁/二U、12、13或14個氫原子可被氟原子置換。此 貫例為三氟曱基、2,2,2_三氟乙基、五氟乙基、七 1基。經取代之絲巾任液置均可經取代。 為直鏈it如例如:CmH2m、CmmH2mm或CrH2r可 ’、、、H H转驗當其具有取絲或作為其他基 -14- 200812584 團之取代基時，例如： 氣伸烧基，如，例如：CpF2p與

CppF2pp。伸烧基實例為亞曱基、伸乙基、卜甲基亞甲基、 伸丙基、1-甲基伸乙基、伸丁基、 、1-丙基亞甲基、1-乙基-1-

伸丙基、1，3-二曱基伸丙基、2,2_二曱基伸丙基、伸己基與 1-曱基伸戊基。伸烧基中一個或多個例如：^、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11或12個氫原子可被氟原子置換。 1〇 經取代之伸烷基中任何位置均可經取代。伸烷基中一個或多 個CH2基團可被氧、S、NH、队烷基或N-環烷基置換。 環烷基實例為環丙基、環丁基、環戊基或環己基。環烷 基中一個或多個例如：1、2、3、4、5、6、7、8、9、1〇、 11或12個氫原子可被氟原子置換。經取代之環烧基中任何 15 位置均可經取代。環烷基亦可呈分支型，如：烷基環烷基或 環烧基烧基，例如：甲基環己基或環己基甲基。 衍生自NR13R14之環實例（其中R13與R14與其所鍵 結之氮原子共同形成4-、5-、6-或7-員環，其中一個CH2 基團可被NR15、S或氧置換)為嗎琳、XJ比咯σ定、旅ϋ定、旅π井 20 與Ν-甲基旅畊。 若代號出現一次以上時，每次出現之代號定義分別獨 若式I化合物包含一個或多個酸性或鹼性基團或一個或 多個鹼性雜環時，本發明亦包括其相應之生理上或毒物學上 -15- 200812584 可接文之鹽類，尤指醫藥上適用之鹽類。因此，式〗化合物 之酸性基目可赚質子顧彡賴如^金屬_，較佳為鈉 或鉀鹽類，或形成銨购，例如：與氨或有機胺或胺基酸形 成之叙鹽類使用。由於式I化合物總是包含至少驗性基 團，因此其亦可製成其生理上可耐受之酸加成鹽類，例如： 與下列酸類形成之鹽類：無機酸類，如：鹽酸、硫酸或磷 酉欠戈有機S文類，如·乙酸、摔樣酸、酒石酸、乳酸、丙二 酉欠、曱石戸、酸、萄馬酸。此時合適之酸加成鹽類為所有醫藥上 可接受之酸類之鹽類，例如：_化物，特定言之鹽酸鹽、乳 酸鹽、硫酸鹽、擰檬酸鹽、酒石酸鹽、乙酸鹽、麟酸鹽、曱 基磺酸鹽、對曱苯磺酸鹽、己二酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸 鹽、麵胺酸鹽、甘油填酸鹽、馬來酸鹽與雙經萘酸鹽（此族 群亦相應於生理上可接受之陰離子）；且亦包括三氟乙酸鹽

類。 I 本文所說明之式I化合物可由式VIII化合物依據習此相 關技藝之人士已知之方法，進行氯磺酸化反應，然後依據習 此相關技藝之人士已知方法與胍反應製得（其說明於例如： Synthetic Communications，33(7)，1073 ; 2003) 〇

16- 200812584 與應後所得式χπ中間物不需要單離即可直接

式VIII起始化合物製法如下： 10 可例如：使用氫硼化鈉還原式VI化合物中之羰基，然 後依習此相·藝之人士已知製法，由所得式νπ醇進行 酸-或驗催化之環化反應（參見Tetrahedron

Lett· 1989，30, 5837，Org. prep. proced. Int 1995, 27, 513)，製備式 vma 四氫異噎琳’其中尺丨至]^如上述定義。 R7

VI

R7

、R5 Villa -17- 200812584 5 式I中R6不為氫之分支烷基化合物製法可依已知方 法，由相應之式IX二苯基乙酸酯中α位置經R6烷化製得。 式X化合物可依標準製程進行轉化，直到式XI相應醯胺類 於皮克-史本賽(Pictet-Spengler)-類似物反應中轉化成所需式 Vlllb 四氳異喹啉為止（參見 Tetrahedron 1987, 43, 439 ; Chem. Pharm. Bull. 1985, 33, 340)， 其中R1至R8如上述定義，LG相當於常用於烷化反應 之脫離基，如，例如：溴化物、氯化物、甲苯磺酸鹽或甲磺 酸鹽。 10

如上述使用之式VI化合物最好由式IV苯甲基胺，依習 -18- 200812584 此相關技藝之人士已知方法，由式V適當胺基取代之α-溴乙 醯苯化合物（其中R1至R8如上述定義）反應製備。

R7

R7

VI 式V α-溴乙醯苯化合物可依文獻中已知之方法，由相應 之乙醯苯前體進行溴化反應製備。 式IV苯甲胺前體若無法購得時，可採用習此相關技藝 ίο 之人士已知之標準製法，由式III相應苯曱基鹵化物，例 如：苯甲基氯或苯曱基溴，及由相應胺類R5-NH2合成， 其中R1至R5如上述定義，X為F、C卜Br或I，特定 言之C1或Br。

或者，式IV化合物亦可由式Ilia醛，依據習此相關技 -19- 200812584 藝之人士已知方法， R5如上述定義。 進行還原性胺化反應製得，其中R1至 5

θ式ΠΙ與IIIa、IX與R6-LG與R5_NH2化合物可自商品 講知或可㈣或類似文獻及習此相關技藝之人士已知之方法 製備。 10 若舄要守了採用常用之方法操作及純化產物與/或中 間物，如：萃取法、層析法或結晶法與常用之乾燥法。 15 本發明係有關以式I化合物與其醫藥上可接受之鹽類於 製造醫藥上之用途，供治療神經變性病變、記憶損傷與癡呆 病變，如：老年癡呆、阿茲海默氏症、血管性癡呆，如，例 如·多發梗塞性癡呆、阿茲海默氏症與腦血管性病變之組 合、tau突變、蛋白病毒疾病、聚麩胺醯胺擴增病變，如： 亨丁頓氏舞蹈症(Huntington’s chorea)與脊髓小腦共濟失調 與巴金森氏症，且改善記憶之NHE5抑制劑亦適用於治療因 感染（例如：HIV)、腦創傷、腦瘤或中毒(例如：酒精)所造 成與/或相關之續發性癡呆。 本發明亦有關包含有效量之式I化合物與/或其醫藥上可 接受之鹽之人類或獸醫用之醫藥，及單獨包含有效量之式工 -20- 20 200812584 化合物與/或其醫藥上可接受之鹽歧 他醫藥二可接受之活性成份或醫藥之人類或獸醫=夕種其 經口 =合物或其醫藥上可接受之鹽之 、、 非、、二％式、肌内、靜脈内、直腸内、畠& 特二於:二::：使:或與醫藥賦形劑組合使用， 其醫藥上可接受之_ 1活性成份與/或 至1克。 孤類 般3里為母早位劑量0.01毫克 藥調:物之::,丨之二=可依據其專業知識判斷適合所需醫 劑賦形劑與其他錄成份基質、鍵 劑、勻散劑i 打使用例如：抗氧化 劑或著色劑。 劑、氣味遮蔽劑、防腐劑、溶解 15 20 合，ΖΙΓί活性化合物係與適合此目的之添加物混 合適劑型，：:劑==釋劑’並依習知方式轉化成 或油性溶液：二=剎、兩段式膠囊、水性、醇性 碳酸鎂、細/ _實例為阿拉伯膠、氧化镁、 呈乾粒與渴=、乳糖、葡萄糖或殿粉，尤指玉米趟粉。可 動物油十美=魚=之油性載劑或溶劑為植物油或 供皮下 一 若需要時，=皮膚或靜脈内投藥時，所使用之活性化合物 或其他賦形劑，鏟：物貝’如…谷解劑、乳化劑 轉化成办液、懸洋液、或乳液。合適溶劑實 -21 - 200812584 ^為^技食鹽水溶液或_，例如：乙醇、 油，及糖浴液，如：葡萄糖或 ..+ ^ 溶劑之混合物。 ㈣H或如上述不同

==氣_或魏型式鄕之 I活性成份於醫藥上可接受之溶劑，如，特定〗D 或此等溶劑之混合物形成之溶、液、縣…、σ %或水 物若兩I日士 ^ ' 芯净液或乳液。該等調配 =而要亦可包含其他醫藥賦形劑，如：界面活性劑、 礼化t女定劑，與推進劑氣體。、 通常編.1錢，特定言之纟⑷㈣-度 f力ϋί性成份之投藥劑量與投藥頻率依所使用化合物之 定;亦可依所治療疾病之性質與嚴重性， /、所^哺摘物之性別、年齡、體重與健反應決定。 15 20 量至π: ’4重Γ75公斤，患者之式1化合物每日劑 13〇真吞/八☆毛a斤體重’較佳為ο.1毫克/公斤，至最 冋笔克/么斤，較佳為1毫克/公斤體重，若需要時，亦可 急狀態下提高劑量，例如：在高海拔下呼吸暫停‘ 尤，、*經靜脈内使用時，可能需要使用高達3GG毫克/公斤/ =例如：加護耗内之梗塞患者。該每日劑量可分成 ❹Μ，如·’至多4個小劑量投藥。 【實施方式】 實驗說明與實例 所使用之縮寫列表： AMP Α 从 可藉由α_胺基-3-羥基-5-甲基異噚唑_4_丙酸鹽 -22- 200812584 5 10 15 活化之受體偶合通道 CA 1 CA =阿蒙角（Ammon’s horn)，海馬回中之 CA區1 EA 乙酸乙酯 EPSP 激發突觸後電位 ES+ 電喷灑 HEP 正庚烧 Cone. NH3 飽和NH3水溶液 LTP 長期增強 LTP1 早期LTP(LTP期） MeOH 曱醇 mp 熔點 MS 質譜 NMDA 使用N-曱基天冬胺酸鹽活化之受體偶合通 道 RT 室溫 STP 短期增強(LTP期） THF 四氳呋喃 20 貫例1 · N-二胺基亞甲基-4-(6,8-二氣-2-曱基-1，2,3，4-四鼠 異喹啉-4-基)苯磺醯胺二鹽酸鹽 -23- 200812584

Cl

2HCI

於氬氣下，取0.36克胍懸浮於30毫升i水thf 六 加0.40克4_(6,8_二氯_2m，2，认四氯異啥琳冰臭= 磺醯氯(W02003048129)。於室溫下攪拌混合物= 澱，真空乾燥。得到〇·45克，mpl40°C(分解）。 Rf (EA/HEP/CH2Cl2/MeOH/conc. NH3- 10:5:5:5-1) = 〇 30 MS (ES+) : 412 後’蒸顧排除THF。添加1〇毫升水至殘質中，濾出沉殿了 以10毫升水洗滌，真空乾燥。取固體懸浮於1〇毫升， 添加10毫升飽和HC1之乙醚溶液。真空排除揮性成份1 殘質懸浮於10毫升EA中，於室溫下攪拌5小&。據^沉 10 藥理試驗： 15 NHE5試驗說明： 本試驗中，測定穩定表現不同鈉-質子交換器(NHE)亞型 之LAP1細胞經過酸化後之細胞内ρΗ(ρΗ〇回復程度。此回 復值係在無碳酸氫根條件下，使用有功能之NHE測定。因 此，使用對pH敏感之螢光染料BCECF(Molecular Probes， -24- 200812584

Eugene，OR，USA ;採用前體 BCECF-AM)測定 pHi。細胞 先與BCECF(5pM BCECF_AM)，於NH4CI緩衝液中培養 (NH4CI 缓衝液·· 115 mM 膽鹼 Cl、20 mM NH4CI、 5mMKCl、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2、20 mM Hepes、5 5 mM葡萄糖；使用1 Μ KOH調至ρΗ7·4)。使用無NH4CI 緩衝液（133.8 mM膽鹼氣化物、4.7mM KC1、1.25 mM CaCl2、1·25 mM MgCl2、0·97 mM K2HPO4、0.23 mM KH2PO4、5mM Hepes、5 mM 葡萄糖；使用 1 M KOH 調 至ρΗ7·4)洗滌於NH4CI緩衝液中培養之細胞，以誘發細胞 ίο 内酸化。經過洗滌後，在細胞内留下90微升無NH4CI緩衝 液。於分析儀器中（FLIPR，”螢光顯影板讀數機

(Fluorometric Imaging Plate Reader)，1，Molecular Devices， Sunnyvale，Ca·，USA)，添加 90 微升含 Na+-緩衝液（133.8 mM NaCl、4·7 mM KC1、1.25 mM CaCl2、1·25 mM 15 MgC12、0.97 mM Na2HP〇4、〇·23 mM NaH2P〇4、10 mM Hepes、5mM葡萄糖；使用1 M Na0H調至pH7 4)，開始 回^ PH。採用激發波長498nm與FupR發射光濾光片 i(帶狀間隙由510至570nm)測定BCECF。隨後追蹤nhe5 榮光變化2分鐘，以測定pH回復程度。計算試驗物質之 2〇 NHE_抑制潛力時，由細胞先於可完全回復pH或完全不回復 衝液中培養。用於完全_pH⑽%)時，細胞係與 二盔a _緩衝液(如上述)培養，若測定〇%值(如上述）時，則 ””、、Na+緩衝液培養。試驗物質係於含Na+_緩衝中 配。各試驗物質濃度下之細胞内pH回復程度係以 -25- 200812584 大回復程度之百分比表示。由pH回復程度百分比，即可利 用程式 XLFit (idbs, Surrey, UK)計算各 NHE 亞型之 1(：5〇。 NHE5 lC5〇 [μΜ] 實例1 0.37 5 試驗說明：海馬回切片之長期實驗(活體外） 實驗方法 CA1區中之LTP為最適合於活體外被特徵化之LTp。 此區域之分層與輸入之結構得以連續數小時於活體外測定場 電位。NHE試驗中，採用減弱的電刺激，其係針對θ_節律 ίο 且會誘發早期LTP，並在3小時内恢復初始值(J〇urnal 〇f

Neuroscience, 18(16), 6071(1998) ； Eur J Pharmacol. 502: 99-104, 2004)。最近已證實，增加連串卜衝擊次數所誘發 LTP之強度與持續性均提高（J Neurophysiol. 88:249-255 2002) ’亦即單一微弱刺激所誘發之ltp不飽和，未達LTp 15 飽合型之最高程度。此LTP之強度(Behnisch，Reymann et al·，Neurosci· Lett· 1998, 253(2): 91-94)與持續性（例如： Neuropeptides 26·· 421-427, 1994)可因物質影響而改善或負 面影響。在本試驗中出現之早期LTP同樣為不飽和。因此 可判斷會誘發早期LTP改善或惡化之物質。所探討之早期 20 LTP包括STP成份，已知其可持續約30分鐘(Nature 335: 820-824，1988) ’與LTP1成份，其通常在誘發LTP後先持 -26- 200812584 續 1-2 小時(Learn Mem. 3: 1-24，1996) 〇 電刺激處理前短時間（30-60分鐘）所記錄初始值可以探 討試驗物質對正常、未受刺激之突觸傳送作用之影響。由於 主要之激發性突觸為麩胺酸鹽激導性(J Clin Neurophysiol. 9: 252-263, 1992)，亦即單一突觸場EPSP主要由AMPA決定 且相當小部份由NMDA受體決定，因此可同時間接測定對 麵胺酸鹽激導性傳送作用之影響。 方法：對海馬回切片之長期影響（活體内） 10 15 20 動物型態： 年齡· 7-8週 品種：Wistar (Shoe Wist，Shoe) 性別：公鼠 養殖場：Harlan Winkelmann GmbH，人工照明（618 〇〇 h) 與每日周期 製法： 昏厥法·使用鐵棒打擊頸後部 殺死動物：切頭術 取腦：沿著頭顱矢狀縫，自背面往腹面切開頭顱 民自半球處切開腦部，自右半球開始，使用鈍端器 具拉出海馬回。 製作切片·取出之海馬回送至附有濕濾紙之冷卻盤上，利用 -27« 200812584 另一張濾紙吸除多餘之水份。取依此方式固定在冷卻盤上 此海馬回置於切刀上，平行旋轉，直縣馬回與切 角度為止。 5 切角度·為了維持海馬回之分層結構，必需以相對於切刀 呈約70度之角度切割海馬回。 切片：以400微米間隔切割海馬回。利用完全濕透之極軟毛 刷。（貂鼠毛）取下刀片上之切片，移至含有經通入 95/〇〇2/5%c〇2之冷卻營養液之玻璃瓶中。總製作時間不超 ίο 過5分鐘。 切片保存法： =泡切片：取切片置入控溫槽内（33°C)液面下1-3毫米處。 机速為2·5耄升/分鐘。先在預備槽中，在稍提高壓力下（约 15 iatm) ’利用顯微針頭通氣。由切片槽與預備槽連接，以維 持小循環。該小循環係由95%〇2/5%C〇2流出顯微針頭所 驅動。 切片调適··新鮮製備之海馬回切片先於33°C之切片槽中調 20 適至少1小時。 試驗刺激程度之測定·· 刺激程度：fEPSP :最高epsp之30% -28- 200812584 局部電位之測定 ㈣由烤漆過之不錄鋼及怪定電流、雙向刺激發生器 ,1作所組成之單極刺激電極局部刺激謝弗（Schaffer) Ί(電壓·· 1_5V，_個極性之脈衝寬度G1毫秒，總脈衝 10

1疋法·使用填充—般營養液之玻璃電極(含細纖維之卿 ^鹽玻璃，WMOhm，直徑：15毫米，尖端直徑：3_2〇微 ^^己錄來自輻射層之激發性後突觸電位(fEPSP)。使用DC 私i：擴大相對於位在切#槽邊緣之氯化銀參考電極測定 場電位。該場電位再經低通量之濾片（5kHz)顧。、 場電位測定法：測定鹏p之斜率(ffipsp斜率），以進行本 實驗之統計分析。利用神經生理學部門所發展之軟 15 (PWIN)進行實驗記錄、分析與控制。平均fEPSP斜率之^ ‘成及各時間點與作圖結構均利用Excel軟體進行，使用衫 放大器自動記錄數據。 營養培養基(林格氏液）： 物質 mM 數含量 NaCl 124 7.248 KC1 4.9 0.356 MgS04* 7H20 1.3 0.321 CaC12+無水 2.5 0.368 -29- 200812584 KH2P04 1.2 0.164 NaHC03 25.6 2.152 葡萄糖 10 1.802 滲透度mOsm 330 PH 7.4 取實例1溶於DMSO，以林格氏液稀釋至最終實驗濃度(終 濃度 0.01%DMSO)。 青驗大綱： 對照組實驗中’先記錄底線突觸傳送作用60—120分 鐘。隨後每間隔200毫秒施與兩個雙重脈衝，共四次，雙重 脈衝之間間隔10毫秒，各脈衝寬度〇·2毫秒(弱電刺激）。記 錄所得強化之EPSP至少60分鐘。 測試ΝΗΕ5抑制劑效應之實驗中，先再度記錄底線6〇_ 120分鐘。在刺激前先添加ΝΗΕ5抑制劑（1〇ρΜ)2()分鐘。 對照組則每間隔200毫秒施與兩個雙重脈衝，共四次，雙重 脈衝之間間隔1G毫秒’各脈衝寬度〇·2毫秒。刺激後，洗 除物質20分鐘，且記錄所得強化之Epsp至少6〇分鐘。

結果I 貫例1化合物於所使用之濃度中對突觸傳送作用沒有内 因性效應。 刺激80分鐘後，投與實例丨後之強化程度仍低於底線 137% ’崎肋條件下之強化程度職乎回復底線程度， -30- 200812584 達底線之113%。此顯示，即使10μΜ實例1化合物即可改 善維持弱LTP。

Claims (2)

1. 200812584 十、申請專利範圍： 1. 一種以式I化合物及其醫藥上可接受之鹽類於製造供治療 神經變性病變、記憶損傷與癡呆病變及供改善記憶上之醫 藥品的用途， HUN

   其中之定義為： Rl、R2、R3 與 R4 ίο 分；^獨立為氬、F、Cl、Br、I、CN、N〇2 或 R11- (CmH2m)-An-; m 零、1、2、3 或 4 ; η 零或1 ; Rll 氫、曱基或CpF2p+i ; 15 A 氧、NH，N(CH3)或 S(0)q ; p 1、2 或 3 ; q零、1或2 ; R5 氫、具有1、2、3、4、5或6個碳原子之烷基或具有 -32- 200812584 3、4、5或6個碳原子之環烷基； R6氫、OH、F、CF3、具有1、2、3或4個碳原子之烧 基或具有3、4、5或6個碳原子之環烧基· R7 與 R8 5 分別獨立為氳、F、Cl、Br、CN、C〇2R12、 NR13R14 或 R16-(CmmH2mm)-Enn-; R12 氫、具有1、2、3或4個碳原子之烷基 或具有3、4、5或6個碳原子之環烷 基； ίο R13 與 R14 分別獨立為氫、具有1、2、3或4個碳 原子之烷基或具有3、4、5或6個碳原 子之環烧基； 或 15 R13 與 R14 與其所鍵結之氮原子共同形成4-、5-、6-或員環，其中一個CH2基團可被 NR15、S或氧置換； R15 氮、具有1、2、3或4個碳 20 原子之烷基或具有3、4、5 或6個碳原子之環烷基； mm 零、1、2、3 或 4 ; nn 零或1 ; R16 氫、甲基或 CppF2pp+i ; - 33- 200812584 E 氧或 S(0)qq ; pp 1、2 或 3 ; qq 零、1或2 ; 2.根據申請專利範圍第1項之用途，其中使用式I化合物， 5 其中之定義為： Rl、R2、R3 與 R4 分別獨立為氫、F、Cl、Br、CN 或 Rll-(CmH2m)- An_ ·， m 零或1 ; 10 η 零或1 ; Rll 氫、曱基或CpF2p+l ; A 氧、NCH3 或 S(0)q ; 15 R5 氫、曱基、 p 1 或 2 ; q 零、1或2 ; 乙基或環丙基； R6氳或曱基； R7 與 R8 分別獨立為氫、F、C卜CN、C〇2R12、NR13R14或 R16-(CmmH2mm)"Enn-； 2〇 R12 氫、曱基或乙基； R13 與 R14 分別獨立為氫、具有1、2、3或4個碳 原子之烷基或具有3、4、5或6個碳原 子之環烷基； -34- 200812584 或 R13 與 R14 與其所鍵結之氮原子共同形成5-、6-或 7-員環，其中一個CH2基團可被 NR15、S或氧置換； R15 氫、具有1、2、3或4個碳 原子之烷基或具有3、4、5 或6個碳原子之環烷基； mm 零、1或2 ; 10 nn 零或1 ; R16 氫、甲基或CppF2pp+l ; E 氧或 S(0)qq; ρρ 1 或 2 ; qq 零、1或2 ; 15 與其醫藥上可接受之鹽類。 3.根據申請專利範圍第1或2項之用途，其中使用式I化合 物，其中之定義為： R1 與 R3 氫； 2〇 R2 與 R4 分別獨立為氳、F、Cl、NH2、NHCH3或 N(CH3)2 ; R5氫、曱基、乙基或環丙基； R6氳或甲基； -35- 5 10 15 20 200812584 氫； 與其醫藥上可接受之鹽類。 申請專利範圍第…項中一項或 :二;絲甲基邻，1 2 3-如 5 #土攄本顿胺賴其㈣切接受之鹽類。 用於製造治療癡呆病變之醫藥品。、^、 八、 ::::專利範圍第1 S 5項中-項或多項之用途，其係 :衣造治療老年癡呆之醫藥品。 ^據^ 1專利範圍第1至4項中—項或多項之用途，其係 i 1衣!^/〇療阿兹海默氏症、血管性癡呆、阿茲海默氏症 二腦血管性病變之組合、tau突變、蛋白病毒疾病、聚麩 胺酿胺擴增病變與巴金森氏症之醫藥品。 -36- 1 ·根據申請專利範圍第1至4項中-項或多項之用途，其係 用於製造治療阿茲海默氏症、多發梗塞性癡呆、阿茲海默 ^症與腦血管性病變之組合、tau突變、蛋白病毒疾病”、 =丁頓氏舞蹈症、髓小腦共濟失調與巴金森氏症之醫藥 σσ ° 2 ·根據申凊專利範圍第1至4中一項或多項之用途，其係用 於製造治療因感染、腦創傷、腦瘤或中毒所造成與/或相 關之續發性癡呆的醫藥品。 3 ·根據申睛專利範圍第1至4中一項或多項之用途，苴 於製造改善記憶之醫藥品。 ' 200812584 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（無）圖。 (二) 本代表圖之元件代表符號簡單說明： 無 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： 10

   200812584 、 N 發明專利說明書 (本說明書格式、順序及粗體字，請勿任意更動，※記號部分請勿填寫） ※申請案號： ※申請日期： 來1卩〇：分類： 一、 發明名稱：（中文/英文） NaVlt交換器亞型5(ΝΗΕ5)抑制劑於改善記憶之用途 I USE OF INHIBITORS OF THE NAW EXCHANGER, SUBTYPE 5 (NHE5) FOR IMPROVING MEMORY 二、 申請人：（共1人） 姓名或名稱：（中文/英文） 赛諾菲阿凡提斯公司 SANOFI-AVENTIS 4 代表人：（中文/英文） 桑瑞德/THOURET-LEMAITRE，ELISABETH 住居所或營業所地址：（中文/英文） 法國巴黎市法國大道174號
2. 174, AVENUE DE FRANCE, F-75013 PARIS, FRANCE 國籍：（中文/英文） 法國/FRANCE 三、 發明人：（共7人） 姓名：（中文/英文） I克利門/KLEEMANN，HEINZ-WERNER 2·連翰喬/LANQ HANS-JOCHEN 3·輪尼爾/HEINELT，UWE 4·侯密特/HOFMEISTER，ARMIN 5·卡呼格/GAUL，HOLGER 1 JA專利申請案\發明申請案\95\95491(9SADG)_發明申請書.doc