TW200810834A - Method of manufacture of a plate of releasable elements and its assembly into a cassette - Google Patents

Description

200810834 , 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本申4案主張2006年4月28曰所提申之美國臨時申 請案第60/746008號之權益，該申請案被併入本案參考。 本發明係關於一種具有微型襯板（micr〇_pallets)的具微 型圖案板片，其能促進可定址性（addressaMe)生化分析， 且更特別地，係關於一種製造具有可釋放元件之板片及將 該板片組裝於匣體中之方法。 • 【先前技術】 習知的系統允許生物材料以陣列方式定位於一些表面 上。可以藉由將材料以機械方式放入特定位置—「點放式 (spotting)」、建造許多凹穴以收集材料—「微型井式 (micr〇-wells)」、處理在特定區域中之表面，以及上述這 些方法之組合等方式而達成材料的放置。這些技術中大部 分對於活體細胞並未處理得很好。一旦定位好之後，樣本 幾乎就無法被移出以進行進一步分析或處理。 書 貼附性細胞一般是藉由將他們放置在一表面上，然後 使用顯微鏡觀察找尋他們。細胞的位置是任意散亂的，致 使要尋找這些細胞是一件相當耗時的過程。為了加快速 度，有時候使用一些運用機械視覺的機器人系統，以便在 顯微鏡影像的視野範圍内找到這些細胞。在一些情形中， 可藉由以下的方法將一子集（subset)的細胞隔離開來：將_ 犧牲丨生基礎層放置於此板片上；在此基礎層上培育細胞； 使用高能量雷射在感興趣的細胞周圍切割出一圓形且穿過 5 200810834 此犧牲層；可以藉由將此犧牲層剝開’或者藉由 量雷射脈衝將切割下來的材 ^ b 。叩的材枓攸板片弹射出去，而將細胞

If出去，而將這些細胞隔離開來。 〜 =於非貼附性細胞，可以使用允許細胞快速流過㈣ =備m細胞儀而進行快速分析q以藉由使液滴移 到收集容器内之下游靜電㈣，而將感興趣的細胞進行 分類。假如諸如蛋白質與DNA等生物基質被貼附於小液 珠上的話’此方法對這些生物細胞也有效。但是，對於較 大的樣本（諸如多細胞有機體），則本方法就無法有效運作， 而且，難以進行多工操作。 因此，最好能夠提供一種可被用來執行生物與化學分 析之具有可釋放元件（稱之為「微型襯板」）的板片，及製 造此板片之方法。 【發明内容】 本發明所述之系統與方法係提供一板片，其被製造成 能使諸如單細胞、多細胞、微生物、蛋白質、dna、生物 分子與其他生物基質等樣本可以被定位於此板片上的特定 位置或部位上，用以在這些樣本上執行可定址性分析。而 且，較佳地，這些部位的一些或全部均由一個微型襯板形 式的可移除材料所建造而成，致使感興趣的樣本之一子集 可以輕易地與此板片隔離開來，以便進一步的處理或分 析。此板片可以包含一些結構或化學處理，以便增強或提 升樣本的貼附性及/或功能，而且還能促進或協助樣本的分 析。此板片亦包含一些結構，能有助於在板片與外部儀器 6 200810834 維持樣本 之間的結合，或者有助於一些附加操作，例如 的適當化學條件。 可以更加清楚了解本發明之其 從以下的詳細說明中 他目的與優點。 、 【實施方式】

以下所揭示的每項額外特點與料均可以被單獨運 用’或者可以與其他特點及教導組合使用，以便提供—種 此促進可疋址性生化分析之具有微型襯板的改良式具微型 圖案之板片’以及用於細胞分類與選取之諸改良式方法。 以下’將參考附圖詳細說明本發明的一些代表性範例，這 ，範料獨地或組合地運用上述許多額外優點與教導。此 羊、田況明僅用以更加詳細地教導熟知此項技術匕 ^ ^ η 六月b 夠…發明的較佳形態，並非用以褐限本發明之範圍。 口此，以下評細說明中所揭示之優點與步驟的組合並不能 必需係以最廣泛的觀念實施本發明，而是僅用以特別地描 述本發明之代表性範例而已。 愛再者，代表性範例及申請專利範圍附屬項中的不同特 點γ以藉由並非特定及明確列舉之多種方式組合起來，以 更提ί、本發明的其他額外有用實施例。此外，要注意的是， 在=W細說明及/或中請專利範圍中所揭示之所有特點係 打异分開描述且彼此獨立無關，以達到具有原創性揭示之 的以及用於限制與實施例及/或申請專利範圍内的特點 組成無關之主張標的之目的。也要注意較，所有成組實 體的數值範圍或讀數均揭示出每一個可能的中間值或中間 7 200810834 貝體’以便達到具有原創性揭示之目的，以及用於限制所 主張標的之目的。

在一較佳實施例中，提出一種系統，其設有一具微型 圖案（micro-patterned)之板片，此板片包含一組具有供樣本 貼附的可移除區域或部位之可定址陣列。光學編碼器、電 極與類似物均能使具微型圖案板片輕易連接到外部儀器 上，而產生出高速可定址性細胞陣列。機器可以使此板片 移動而在顯微鏡下被定位至任何可定址的部位上。可以使 用高放大率的物鏡進行成像，因為只有單一部位被形成影 像（這一點與許多細胞的大視野相反）。對於細胞來說，此 細胞位i之索引能夠產生比現有分析方式更為快速的分析 結果。 本系統也可以與貼附至表面上的單細胞、多細胞、分 子、化合物、有機體、及生物與化學基質等樣本，以及盥 並未貼附的樣本-起使用。凹穴或其他捕集裝置可被用來 定位非貼附性樣本。 此f微型圖案之板片系統有利地解決了樣本的正向選 擇i可移除崎的可^址料心允許使帛者快速 且選擇性地從此板片移除一此 。樣本，以進行其他的處理。 使用可私除襯板免除掉切割樣太 A,立曰 像本周圍之必要性，大幅增加 速度與產ϊ，同時減少選擇樣本 ^ ^ ^ U μ π 才的後雜性。由於襯板被 配置在板片上，因此，能夠 々々的禮夕、Φ、玄此 尺間早的方式以相比於流 式細胞儀之速率，執行高速的分析與樣本選擇。 在一較佳實施例中，如圖1 尸打不’ 一板片10係被製 8 200810834 作成使得諸如單細胞、多細胞、微生物、蛋白質、dna、 生物分子與其他生物基質等樣本14_被定位於板片ι〇 上的特定位置或部位13上’以便在這些樣本14上執行可 定址性.分析。較佳地，這些部位13 部分或全部係襯 -種可移除材料以襯板12开》式所建造而成，致使，感興 趣的樣本14之一子集（subset)可以輕易地與板片ι〇分開並 隔離開來’以利進一步的處理或分析。此板片可以包含一 些結構或化學處理’以便增強或提升樣本14的貼附性及/ 或功能，而且還能促進或辅助樣本的分析。此板片1〇亦 包含-些結構，能有助於板片1〇與外部儀器之間的結合。 此板片10亦包含一些額外的結構，能有助於一些附加操 作，例如：維持樣本的適當化學條件。 抑參考圖，具微型圖案之板片1G包括—些樣本14(諸 如早細胞或多細胞)，這些樣本被貼附至特定可定址性部位 :3上•：即，在部位13貼附於板片1〇的小型薄襯板η。 只％例中所不，當樣本14被迅速移動至偵測器Μ底 時：-顯微鏡或其他傾測器16被用於使樣本14 像。母個㈣13均可以被成像，或者被光線或以 =量⑼如：磁能、電能、機械能、熱能)探測，= 疋出该部位1 3所猪隹接丄 4、 位η的樣太 之特性，或者修改在該部 的:本14。而且’含有感興趣的樣本14之這些部位 只:為襯板12)可以從此板片10上被移除， 板片1〇隔_來’而進行其他分析或處I - 概板12係被製備於板片10的表面上，且較佳地，是 9 200810834 從一個具有不同於板片ίο主體材料之特性的第二材料所 製成。襯板12可以藉由許多種不同的機構，從帶有樣本14 的支撐板片10上移除，致使，這些樣本14可與板片 隔離開來或移除。可以藉由局部修改表面化學成分或者以 物理方式改變此表面，而製備出這些部位13或襯板Η。 這些部位13或襯板12係打算小到足以在每個部位13上 捕集很少或單細胞、微生物、生物分子、其他生物或化學 基質（在此稱之為樣本14)。襯板12亦包含一些結構，能 夠在襯板12從板片1〇移除之後有助於其移動或放置。 可以藉由任何適當的方式移除一襯板12。範例的方法 包括：以機械方式推擠或從板片1〇舉起襯板12;使用局 部的熱或光線，以改變襯板12的黏接特性；使用聲立或 機械震動將襯板12從板片10取出；使用高能量雷射：衝 將襯板12從板片10取出；改變襯板12的電氣或 性等方式。 參考圖2，其顯示一個使用來自雷射18的雷射脈衝17 ::除襯板之範例。如圖所示，藉由從板# 10釋放出含 有樣本14的襯板12，可以6 士、4装丄 Ί以兀成樣本14的正向選擇。如上 也可以運用其他的襯板釋放方法’包括制機械能、 =、熱能、光學能、磁能等。所釋放出來的襯板12可 以朝下游流動以便收隼，式參 、— /、 可以猎由其他適當手段（例 如私注或以移液管吸取）被收集。 較佳地，部位13或襯板12_起形成純接近，致使， 板片…在-分析儀器下被移動，以快速執行許多部 10 200810834 位13的分析。例如，假如這些部位13被定位成相隔〇」_ 的話’則可以50mm/sec的速度移動此板片ι〇，以便在每 秒鐘分析500個樣本。可以任何一種方法，將樣本μ裝 附至這些部位13 i。例如’可允許活體細胞在一培養基 t浮動，直到他們貼附至這些部位為止。剩餘的細胞可以 被沖洗掉，而留下可以被迅速成像的細胞之一可定址陣 歹J也可以使用諸如點放、絲印、模板印刷、微影技術、 光學操控、或機械貼附等習知方法，將這些樣本貼附於部 位上。 4位13或襯板12彳以形成矩形或其他規則圖案（例 如：六角形、圓形、直線等），或者可以被隨意地定向。具 有圖案的部位或襯板可以被定位於一較大結構内，例如在 多井式板片的底部内。此具有圖案的板片可允許其他結構 被定位於其中，以促進其他功能，例如：使用可允許不同 樣本被引進板片的不同區域内之暫時分割器，或者使用能 促進緩衝劑㈣㈣流過這些部位（如圖6所示）之流體結構 (例如：通道）。 茶考圖3,其顯示一個具微型圖案板片20,其中樣本 岣有機體）被貼附於特定可定址部& 23 i。在此實施例 中在板片20上的3D結構圖案25有助於在特定部位收 集樣本24’在這些部位巾，樣本可讀直接㈣於板片Μ 上’或者在每個部位23上被貼附於小襯板22上。 ，可以修改此表面的形狀’以増強在部位的捕集（且不得 增強在非部位處之捕集)，或者能夠有助於分析。例如，這 200810834 些部位（參考圖4中元件符號32)可以被形成於柱狀物的頂 ^ 如此’能提供的優點在於··非部位處（non-sites)是在 顯微鏡成像系統的焦距（參考圖4的元件符號35)之外，因 而降低影像中的背景。其他的範例包括能夠將樣本捕集於 其中的凹穴、或者為板片上的不透明區域。 其他特點可以被添加於板片上，以促進連接於一外部 儀杰上。例如，光學編碼器、電極、或磁性裝置可以被包 括於板片上以促進其放置。也可以使用感測器，以測試成 長么卞件。也可以將基準標記包括在内，以用於光學對齊。 圖4顯示出一些值得注意的增進。如圖4所示，一具 U型圖案板片3〇包括在特定可定址部位上貼附於襯板32 或柱狀物之樣本（細胞）34。在本實施例中，使用一顯微鏡 物鏡36，當樣本快速地移動至物鏡36下的適當位置時， 可乂使這些在焦距内的樣本3 4產生影像。其他的特點包 括有圖案的電極37、有圖案的不透明區域38，以及可用 於溶解（lySe)特定的細胞之外加電場39。 也可以修改這些部位的化學特性，以增強在這些部位 的捕集（且不得增強在非部位處之捕集），或者促進分析。 例如，可以修改表面化學成分，以便使一些區域變成疏水 ^而其他區域變成親水性，以提升在疏水性部位的細胞黏 著。也可以使用表面化學成分，以便使板片的非部位處^ 為不透明，而部位區域變成透明，以提供用以增強光學成 像的局部孔隙。 予 可以在現有的工業標準托盤與匣體内產生出這些部位 200810834 的陣列。例如，所有的部位 部内，以便對工業標準裝備提二二於夕井式板片的底 如，參考D。定址的檢測分析（例 料的陣列也可以被製造於卡匿的訂 做糸統内（例如：參考圖6)。 所7^可以將—具微型圖案板片40放置在多井 式板片41的單一共47 +产α 你夕开 Μ 4Π 4早井47之底部’以允許習知卫具能夠與板 片4〇、一起使用。具微型圖案板片利包括多數個襯板42,

^成具有樣纟44的多數個部位43。緩衝劑溶液填滿此 單一井。 如圖0所不，具微型圖案板片5〇被顯示成包括貼附至 一流體蓋55的臨時或永久性分割器51，以允許不同種類 或來歷的樣本54能夠被放置在板片5〇上的不同位置。如 此能允許在單一板片上完成多工分析。此分割結構51也 可以促進緩衝劑流動於樣本區域上，以便抽取所釋放出來 的襯板52。 荼考圖7Α與7Β，其等顯示使用貼附性細胞篩選與培 養所用之襯板板片之過程中的步驟。此範例顯示出所揭示 的系統是如何從大量細胞中篩選出稀有細胞或感興趣的細 胞。例如，貼附性細胞可以從一個病人的切片檢查中取得， 且此系統可被用來搜尋並收集顯示出不尋常或惡性反應的 細胞。或者，也可以DNA載體（vector)來處理貼附性細胞， 以期轉染（transfect)細胞，且本系統係用以找出並隔離出受 到適當轉染的細胞。 根據範例的方法，在步驟1，根據一適當的協定而預 13 200810834 先處理一些細胞60。然後，在步驟2中，這些細胞6〇被 散佈於此板片70上，且允許被貼附至板片70或襯板72 的多數個部位73上。如圖所示，此一步驟可以在一多井 式板片62或單井式板片上執行。在步驟3中，這些細胞 貼附於板片70或襯板72上以作為樣本74。由於此板片受 到處理而具有圖案，所以，細胞最好能夠被貼附至特定部 位。在步驟4中，然後，較佳地此板片被清洗，且最好執 行另外的檢測分析以便將感興趣的細胞標上標籤。在步驟 5中，藉由一偵測器76篩選此板片，以取得關於細胞族群 的統計資訊’且識別出感興趣的細胞。在步驟6中，較佳 地，例如可藉由來自一雷射78的高能量雷射脈衝77，而 將含有感興趣的細胞（樣本74)之襯板72a從板片中取出（釋 放）。然後，在步驟7中，從緩衝劑溶液中收集自由浮動的 襯板72a。在步驟8中，從被釋放的細胞74中長出新的細 胞培養物。 現在參考圖8八與8B，其等顯示使用一襯板板片進行 DNA篩選的過程中之步驟。此範例顯示出本系統是如何被 用來從大量DNA中篩選出稀有的DNA股。例如，可以從 DNA板片篩遥出未知的疾病引發媒介，以選定出减興 趣的DNA股。然後，感興趣的_股可以被隔離開來了 且執行PCR將他㈣大而進行其他分析。此過程的步驟如 下：步驟1，將募核苷酸散佈於一板片8〇的特定部位μ 上，寡核苷酸係作為麵股之標的。這些寡核I酸亦被 製備成作為對照物（c〇ntr〇1)之用。步驟2，從樣本取出 200810834 DNA85，根據一適當的協定而改變其本性並且預先處理。 步驟3，DNA85被散佈於此板片80上，且允許在特定的 部位83上混合至其匹配標的。步驟4，板片被徹底清洗， 以移除掉自由的DNA。而且，執行分析，以便將感興趣的 DNA標上標籤。然後，步驟5，藉由偵測器86篩選此板 片，以便對樣本進行統計分析，且辨識出感芦趣的DNA。 步驟6，藉由來自一雷射88的高能量雷射脈衝87，而從 板片80取出（釋放）含有感興趣的Dna84之襯板82a。步驟 7 ’從緩衝劑溶液收集自由浮動的襯板。步驟8，DNA84 從襯板改變本性，且使用PCR反應以放大此樣本。 蒼考圖9’其顯示一個用於自動分析的整體襯板板片 E體90。本範例顯示出本系統是如何被整合到其他系統 内以產生一自動卡匣系統。如圖9所示，此整體的襯板 板片匣體90包括一微型襯板板片99，其具有多數個襯板 92 ’分別以三個陣列的方式形成於板片99上，且包括一 流體蓋91，其底面上形成有小通道％。流體蓋91與微型 概板板片99相吻合，以便使緩衝劑流動於襯板％上。 ί考圖10 A至1 〇M，其等顯示一個使用被顯微機器加 工過的整體襯板板片匣體1〇〇之過程。匣體1〇〇包括一襯 板板片109，其較佳地包括一組預先設定好用於細胞培育 的可釋放襯板102之陣列，這些襯板係可釋放地定位於玻 璃或類似物所形成的板片1〇9之頂面上。較佳地，襯板ι〇2 經處理過後而提升在襯板1()2中心處的細胞成長。較佳地， 襯板102被標上索引（例如：條碼），致使在使用昆體⑽ 15 200810834 * 之别便知道其位置。 曰+在圖10B與loc中，蓋1〇1被關閉於板片1〇9上，而 ♦、員路出進入孔107。在圖10D中，細胞被散佈於板片1〇9 上，且被允許能夠貼附於板片的特定部位i 〇2上或襯板上。 然後’如圖10E所示，藉由偵測器1〇6篩選板片ι〇9，以 用於樣本的統計分析，且辨識出感興趣的細胞。如圖^ 所示藉由來自一雷射108的高能量雷射脈衝，從板片1 〇9 取出（釋放）含有感興趣的細胞之一襯板102a。如圖l〇G所 隹示，從緩衝劑溶液朝向板片109的尾端收集自由浮動的襯 板l〇2a。在圖10H中，藉由來自一雷射1〇8的高能量雷射 脈衝從板片1 09取出（釋放）含有感興趣的額外細胞之第 一襯板102b。如圖1〇1所示，從緩衝劑溶液朝向板片ι〇9 的尾端收集自由浮動的襯板l〇2b。如圖i〇j與1〇κ所示， 使用一抽取器11〇透過進入孔107而抽取襯板1〇2&與 102b。如圖i〇l與ι〇Μ所示，從被釋放出來的細胞中長成 新的細胞培養物。 如圖11所示，顯示含有玻璃或類似材料形成的基板或 板片179之一匣體170以及一蓋171。此板片169可以包 括定位於板片179上的微型襯板172之陣列，例如：設置 有500000個（50x50微米）襯板部位。匣體17〇可以與一顯 微鏡裝設備150 —起使用，以便進行成像、螢光分析、分 類等等。可以使用電腦160上所提供的分析軟體進行高含 量篩選與細胞選取。可以使用一襯板抽取器，以便從g體 170抽出一選定的襯板。 16 200810834 =板陣Μ統有利地能使停駐襯板上的細 向1握他材料針對不同的特性進行分析，接著是細胞的正 : @同日守維持貼附於襯板上。微型襯板陣列系統的 襯板釋放與收集诉> . ,,_ ^ y ” σ壬，έ使細胞受到比以流式細胞儀檢查 技術進行分類時更小 _ 9 的k亂’這疋因為在分析與分類期間 細胞仍然維持貼附之緣 、、 。口此’可提供增進的細胞健康 狀況與存活力。而且，f 在襯板上成長的細胞將展現出其整

的胞，面史白質，及維持其原有形態與信號特性。因 σ ‘彳于更廣泛的一組細胞屬性，以用作為選擇的標準。 很重要地，這此-r、# i ~ 句可以随柃間進行分析，以便使選擇 能夠根據-特殊特性的暫時改變而定。 、提出些用於製造具有可釋放之微型襯板的板 、良方法而且，亦提出一些用於製造含有可釋放微 型襯板的板片之匣體的方法。 使光予u影技術及光敏感性聚合物製造含有聚合物 襯板的板片之方去，包含以下步驟：從玻璃、塑膠或其他 適當材料製成一板片；你田% * * 使用軚準清潔程序清潔此板片。選 擇性地，此板片可以塗上一 涛層的黏者促進劑，例如：碎 氧炫'已知能改變表面黏著特性的類似化學藥品。 可藉由任何手段，例如包括旋鍍、浸泡、塗鑛、喷塗 寻方式，將-光敏感性聚合物塗覆於此板片上。此聚合物 包含-光敏感性化學成分，當暴露於光線時將改變此聚合 物的化學特性。假如右兩φ A > 而要的活’此聚合物塗層被允許沉 澱下來且加以乾燥’有—些光敏感性聚合物也可以在潮濕 17 200810834 的狀態下使用。可以透過包含變粗糙、拋光、產生浮凸花 紋、形成草皮坑洞（diV(>ting)等方式，而使乾燥的聚合物之 表面產生一些物理變化。 事先製備出一罩體，其具有代表想要的可釋放元件之 適當不透明與透明圖案。此罩體被放置於一光線光束的路 徑上，此光束被用以曝光此聚合物的特定區域而已。使用 此罩體而曝《& ?长合物，能使其改變化學結構。在曝光步 驟元成之後，使用適當的溶劑沖洗掉一部分的聚合物，而 在板片上留下以光學方式產生圖案之聚合物。 可以使用許多材料的其中一種多次重複上述製程，以 產生出有興趣的襯板形狀，包括3D結構。對於熟知此項 技術者來說，可構思出對此方法作一些變化，以製造出具 有不同形狀與紋理的襯板。 可以施加額外的處理，以便使此板片在預期的應用方 式中k知更為有用。可以使用水溶液、溶劑或氣相處理等 方式’ ^加疏水性或親水性塗層。而且，也可以施加電漿 處理、輻射處理、物理處理、熱處理、光子處理等，以根 據需要而修改此表面。 具有圖案的聚合物襯板之板片，可以被切割而產生新 的$狀’或者產生含有襯板的許多較小板片。 圖12顯示一種藉由微影技術而製造微型襯板的方法之 辜包4 ϊ 已歹1 °在一板片124的表面上製備出一光敏感性聚合物 122(步驟〇，引導光線126透過一罩體128(步驟2)，以便 在特定區域曝光此聚合物。使此聚合物產生顯影，而留下 200810834 已經凝固的微型襯板120(步驟3)。 藉由光學微影技術與蝕刻而製造具有襯板的板片之方 法，包含以下步驟：從玻璃、塑膠或其他適當材料製成一 板片；使用標準清潔程序清潔此板片。選擇性地，此板片 3以塗上-薄層的黏著促進劑，例如：石夕氧烧或已知能改 變表面黏著特性的類似化學藥品。 由玻璃、塑膠、金屬、陶瓷等多數材料中任一種製成 之-薄材料層，其厚度-般從〇,〇lmm至"·imm的範圍之 間，係形成於此板片的表面上。形成此薄材料層的一種方 為使用黏著劑將一薄材料疊壓至此玻璃上。假如此層壓 2片是玻璃的話’則此玻璃可以是許多種標準玻璃的任何 一種三包括：錢鹽、石英、硼錢鹽、鹼石灰等。此外， 層壓薄片可以是uv敏感性種類的玻璃，例如⑧， 此種玻璃在暴露於UV光線之後會改變其飯刻抵抗性。 方Φ可以藉由洗鑄、旋鑛、喷塗、浸泡、塗_、 模製等方式應用此薄材料。假如它首先可以液體形式被運 話’例如：溶解於溶劑中的聚合物，或者欲藉由反應 又又結合的聚合物（例如：環氧樹脂、聚氨酯卜 彳φ可以藉由首先熔化此材料，然後藉由諸如 :!模製等方式將其形成於板片的表面上，而將此薄材料 層施加於該板片上。 j s可以藉由聚合作用或電鍍等方式使薄材料 “長於板片的表面上’而將薄材料層施加於薄材料層。 另方面，可以糈由諸如物理、化學蒸H㈣ 19 200810834 而將此薄材 沉殿等方式將薄材料層沉積於板片的表面上 料層施加於該板片上。 在產生之後’薄材料層可以被進—步處理，而以化學 方式或物理方式改變此表面。處理时式可以包含應用化 學成分、蝕刻、拋光、變粗糙等方式。 使用諸如旋鍍、噴塗等標準方法，將一光阻層塗鍍於 此層壓薄片上，以形成一伴讀矣而 成保濩表面。使用標準光學微影技 術，使此光阻產生圖幸，以} 異雨

口系以打開暴路出此層壓薄片的光阻 中之空間。假如需要的話’金屬可以被塗鍍於光阻底下或 上方’以形成一個比光阻具有更大保護性的「堅硬罩體」。 可藉由顯微製造技術領域中熟知的任何標準方法，使金屬 產生圖案。這些具有圖案的材料被稱之為保護層。 ^使用具有圖案的光阻或金屬來蝕刻此層壓薄片，以保 護襯板區域。可以使用蝕刻材料上所熟知的化學成分來執 行此蝕刻，例如：用於玻璃的氫氟酸、用於矽的氫氧化鉀、 用於銅的氯化亞鐵等。 方面可以使用乾式餘刻技術（諸如：運用電漿的 反應性離子蝕刻化學作用），而蝕刻掉此材料。 方面，可以使用物理腐餘技術（諸如：微 而蝕刻掉此材料。 、 一旦已經從此薄材料層蝕刻掉襯板之後，則使用溶劑 或適當的化學作用而剝掉此保護層。 σ 、夕人重複上述製程，以產生出有興趣的襯板形狀， 包括3D結構。對於熟知此項技術者來說，可構思出對此 20 200810834 ，以製造出具有不同形狀與紋理的襯板。

據需要而修改此表面。 方法作一些變化，以製造 可 式中變 方式， 處理、 具有圖案的襯板之板片，可以被切割而產生新的形狀， 或者產生含有襯板的許多較小板片。 參考圖13,其|員示一種藉由圖案腐钱或姓刻而製造微 型襯板的方法。諸如光敏感性光阻的第一材料132被製備 於具有弟二材料134的表面上， 此弟一材料是例如一種打 异成為微型襯板材料的聚合物。將第二材料丨34製備於一 板片136上。引導光線138透過一罩體13〇，以便在特定 區域曝光此光阻132。使此光阻132產生顯影，而留下已 經凝固的小型保護區域131。使用化學或物理手段133選 擇性地移除此微型襯板材料。清洗此光阻，留下微型概板 蝕刻與腐蝕兩 1 3 5。也可以使用一模板來執行上述步驟， 種方式皆可被使用。 藉由使用模板而製造出具有襯板的板片之方法，包含 以下步驟：如先前所述，從玻璃、塑膠或其他適當材料製 成一板片；如先前所述，在板片的表面上形成一薄材料層； 如先前所述，此薄材料層可進一步加以修改。 模板被從第二板片或薄膜處形成具有多數個開口，這 些開口對應於薄材料層上當形成襯板時打算要移除的^ 21 200810834 . 域。將此模板放置在此薄材料層上，以保護此薄材料層免 於受到後續製程的影響。 可應用物理的腐蝕技術，以便從模板中的開口底下移 除材料，。這些腐蝕技術包括：微型喷砂、水喷射、雷射蝕 刻等。在移除掉不想要的材料之後，可以運用第二模板， 以繼續移除不想要的材料之製程。在完成之後，所產生的 獨立材料則是由許多襯板所組成。 如上所述，可以將額外的處理應用至此板片。此外， • 板片可以被切割成新的形狀或更小的板片。 另一種使用模板的方案，就是使用模板而將保護材料 放置在薄材料層的特定位置上。然後，此保護材料可以保 護此材料層免受蝕刻、剝落、或物理腐蝕的影響。當完成 時，保護性材料會從襯板的表面剝下。 可以多次重複上述製程，以產生出有興趣的襯板形狀， 包括3D結構。對於熟知此項技術者來說，可構思出對此 φ 方法作一些變化，以製造出具有不同形狀與紋理的襯板。 藉由使用雷射而製造出具有襯板的板片之方法，包含 以下步驟：如先前所述，從玻璃、塑膠或其他適當材料製 成一板片；如先前所述，在板片的表面上形成一薄材料層； 如先前所述'，此薄材料層可進一步加以修改。 使用一雷射，以便將位於不想要位置的材料蝕刻掉， 以製造出襯板。雷射光束可以在材料上移動，以直接剥落 此材料。另一方面，雷射光束可以被引導通過一罩體或模 板，以製造出襯板。可以多次使用雷射，以便在概板上產 22 200810834 * 生出想要的形狀、圖案與紋理。 可以夕吹重複上述製程，以產生出有興趣的襯板形狀， 包括3D結構。對於熟知此項技術者來說，可構思出對此 方法作一些變化，以製造出具有不同形狀與紋理的襯板。 如上所述，可以應用其他的處理方式。此外，板片可 以被切割成新的形狀或更小的板片。 圖14顯示藉由雷射切割所製造的微型襯板之範例。如 _ 圖所示，打异作為微型概板材料的一材料〗被製備於一 板片144的表面上。來自一雷射的高強度光線146被導引 於此聚合物上。光線可以通過一罩體或模板148，或者， 此雷射可以被移動或調變，而在此表面上產生有效的光線 圖案。由於雷射的緣故，此聚合物被剝落或移除，而留下 微型襯板140。假如想要製造微型襯板的話，此方法也可 與其他方法（諸如光線輔助姓刻）組合。可以多次重覆此製 程，以製造出想要的形狀。 _ 藉由利用材料加工而製造出具有襯板的板片之方法， 包含以下步驟：如先前所述，從玻璃、塑璆或其他適當材 料製成一板片；如先前所述，在板片的表面上形成一薄材 料層；如先前所述，此薄材料層可進一步加以修改。 使用諸如端銑刀或精密錯等加工工具，以便將選定的 材料從此薄材料層上加工掉，所產生的結構是襯板。 如上所述，可以應用其他的處理方式。此外，板片可 以被切割成新的形狀或更小的板片。 可以多次重複上述製程，以產生出有興趣的襯板形狀， 23 200810834 - 匕括3D結構。對於熟知此項技術者來說，可構思出對此 方法作一些變化，以製造出具有不同形狀與紋理的襯板。 圖1 5顯不藉由加工所製造的微型襯板之範例。如圖所 不’打异作為微型襯板材料的一材料152被製備於一板片 154的表面上。諸如鑽石鋸的切割工具156與微型襯板材 料152產生接觸，使用此切割工具156在微型襯板材料 内切出開口 ’因而產生獨立的微型襯板1 58。 _ 藉由利用模製聚合物而製造出具有襯板的板片之方 去包έ以下步驟··如上所述，從玻璃、塑膠或其他適當 材料製成一板片。藉由許多種技術（包括··澆鑄、旋鍍、浸 泡、塗漆、噴塗、層壓等）之任何一種，在板片的表面上產 生一聚合物材料。如上所述，此聚合物層可進一步加以修 改。此聚合物被加熱至其迴焊溫度，而且，將一含有脫模 S案的模具緊罪著此柔軟的聚合物產生壓花。此聚合物經 冷部之後’移除此壓花的模具。在聚合物中所產生的結構 _ 形成了襯板的起初版本。使用一蝕刻劑或溶劑，以移除掉 襯板之間的殘餘物。然後，聚合物襯板可以被退火或再度 壓花而使它們固定於板片。 另 方面’此壓化程序可以使用一種反應硬化型熱固 性聚合物。在此情形中，當聚合物硬化時，使用此壓花板 片以模製此聚合物。在板片的硬化與移除之後，此方法繼 續以熱塑性材料進行下去。 可以多次重複上述製程，以產生出有興趣的襯板形狀， 包括3D結構。對於熟知此項技術者來說，可構思出對此 24 200810834 方法作一些變化，以集 u 製&出八有不同形狀與紋理的襯板。 茶号圖16，顯示一藉由 例。呈有預弈糟由杈板所製造的微型襯板之範 例具有預先切割出的開口 162 A ^ ^ m 心杈板與一板片164產 生接觸。使用一橡膠滾軸、 故^ 案片成其他工具強迫此材料166 通過权板。移除掉過多的姑 μ 夕的材枓，而留下模板與内含的材料 16 8。然後，移除扯禮 此核板，而留下具有圖案的材料160。假 如需要的話，呈右闰安、卜丨 a '、、材料可以藉由熱、壓力、壓花等 方式161進一弗卢饰 二女· 寻

处里，而產生出具有想要形狀與材 之微型襯板163。 / ® 17’顯示一藉由轉印過程所製造的微型襯板之 範例。具有預先製造好的幾何形狀之壓印们”，❹由 化學部分(m〇ie_而製備於其表面上。此化學部分174 被^疋而緊罪著—板片176’此化學部分174被轉印至此 板片所轉印過去的化學部分被用作為觸媒或先驅物， 以進仃後續的材料成長170。可藉由熱、壓花等方式處理 新的材料’以產生微型襯板173。 猎由修改襯板以產生想要的表面特性而製造出具有襯 ,的板片之方法，包含以下步驟：如上所述，從破螭、塑 膠或其他適當材料製備出一板片；如上所述，將一材料產 生於此板片的表面上。在加工到襯板内之前，可處理薄材 料層的表面，以便使其預備進行後續的塗鍍步驟。此處理 可包括將化學物質黏接到此表面上；（透過使用電暈、電聚、 UV光離子、化學蝕刻或氧化、或輻射等方式）而使此表 面的化學性質產生活性；在表面上的材料之化學成長；在 25 200810834 表面上的材料之化學或物理 凡初里，儿贏（例如：蒸鍍、無電極電鍍 寺），表面感應型移植聚合作 ♦ 口作用，或者在表面上的化學成分 物里吸附作用。此處理可打算作為概板的最終表面處 理’或者可以作為後續其他處理的底層（ρΗ膽）。藉由選擇 一種適當的表面修改方法，所姦 厅產生的表面修改過之概板可 以全成疋親水性、疏水性、生& j 玍物相谷性、具有化學抵抗性、 非黏性、可潤濕的，或其等之組合。 在處理到襯板内之後，佶用

<说便用此底層，可以進一步處理 概板的頂表面。許多表面處理僅 嘀#认广昆& 心王m而以一適當的底層進行即 可，致使，化學處理過程僅會影響頂層而已。 另方面，可以藉由應用熟知的化學成分去改變材料 襯板的表面㈣’而修改襯板的頂面，但是不會改變板片 材料的表面特性。 另一方面，可以將一底層應用至襯板的頂表面，而不 需要在形成襯板之前預先處理材料。可利用光線（―般為uv 光）或引導的輻射來執行此步驟，以便使襯板表面上的化學 成分產生活化。可以選擇板片的表面，致使，它不會對光 線或輕射產生反應。在此情形中，所導致的化學處理僅能 應用於襯板頂面上的活化表面。實際的化學作用可以根據 表面上所放置的材料而定加以顯著改變。 ^另一方面，上述的表面修改方法可以在襯板被加工之 後才應用。在此情形中，表面處理可應用至襯板的頂表面 與側壁上。 另一方面，在加工到襯板内之後，可以應用熟知的化 26 200810834 學：分去改變板片材料的表面特性，而修改板片材料的表 面特性’但是卻不要&變襯板材料的表面。 輕射或光線可以通過-模板或罩體，以便使板片上的 襯板之處理物質產生圖案，或者將表面處理物質僅放置在 板片的特定襯板上。 另一方面，可以使用含有感興趣的化學成分之平坦板 片且將其擠壓而緊罪著襯板的頂面，以便將化學成分轉 移至襯板的表面，藉此，修改襯板的頂面。 另一方面，可以藉由將襯板頂部變得粗糙，以促進黏 接至一個用於表面的材料，藉此，修改襯板的頂面。 另一方面，可以使用能夠將化學成分正確分佈於板片 的想要位置上之機器或工具，以便僅處理板片上的特定襯 板，藉此，處理這些襯板。 可以多次重覆上述製程，以產生具有表面處理的想要 圖案。 圖1 8顯示一種處理微型襯板表面而產生出訂做化學特 性之範例。如上所述，可以處理微型襯板，以便具有微型 襯板原有主要材料以外的新表面。在此範例中，環氧樹脂 為主的微型襯板被浸泡在一聚乙二醇溶劑内，將其吸附至 聚合物的表面内。接著，經聚乙二醇所處理過的微型襯板 顯示出沒有吸附標示為Alexa 647之蛋白質。如圖18所示， 尚未處理的微型襯板180顯示出明顯吸附標示螢光標籤 Alexa 647之蛋白質。也可以使用不同的方法將化學成分或 材料放置於微型襯板的表面上。 27 200810834 μ 4 囷19，^供一種使微型槪板表面變成生物相容之 靶例藉由將某些聚合物放置在此表面上，微型襯板被製 成I支持諸如細胞等生物實體的成長。可以各種不同的 =:成表面修改，包括使用多層的處理。此範例顯示在 已經塗有聚離胺酸的微型襯板192上之細胞成長與繁 殖:特寫的影像顯示出細胞194延伸出偽足（pseud〇p〇ds)， 表示一個具有良好貼附性的健康細胞。 _ 一圖顯示出變成生物活性的微型襯板表面之一範例。 藉由將4寸疋聚合物放置在此表面上，微型襯板可以被進一 =處理，以固持住諸如抗體、DNA與其他生物分子等的材 料202。此影像亦顯示由於螢光所導致的材料2〇2發光。 此種塗層對於黏接型的分析來說更為有用。假如使用光線 來輔助移植過程的話，則可以藉由光線與一罩體的移植而 使塗層194變得高度局部具有圖案。 圖21提出一種光學相容的微型襯板之範例❶藉由調整 φ 微型襯板内的感光起始劑之數量，或者在製造之後執行一 光漂白步驟（延長曝光於強烈光線），可以使微型襯板在成 像情形212與螢光應用情形214中均變得很有用。可以執 行材料的選擇’以便使微型襯板能夠最佳地用於光學量 測。 用以將具有襯板的一板片與一匣體或多井式板片整合 在一起之製造方法，包含以下步驟：使用一匣體，以固持 住具有襯板的板片。可以使用包括射出成形、吹塑、屢印、 加工、組裝與類似方法之任何方法，製造出此匣體。在一 28 200810834 貫施例中，此匣體被製造成能夠固持住流體，而不使其外 漏。此E體被設計成能多句包含—個供襯板板片裝附^區 域。可以藉由許多種習知的方法，諸如使用黏接劑，而將 襯板板片黏接至此匣體上。 或壓力，而將具有襯板的 。另一方面，也可以藉由 另一方面，可以藉由摩擦力 板片固持於匣體内的適當位置上 磁鐵而將具有襯板的板片固持於適當位置。

圖22顯示-個整合有£體的微型襯板板片之制，以 促進操縱、儲存流體以及維持無菌。如圖所示，單一匣體 224包括内側具有圖案的微型襯板陣歹^ 222。具有微型概 板222的一板片被裝附至—匣體224的底部，此匣體被設 計成能夠存放微型襯板且提供—個在培育㈣讓緩衝劑安 置的容室。選擇性地’它可以包含儲存器以、流體線路， 以及甚至如加熱器等主動零件。此匣體可以含有一蓋子 228，以保持内含的緩衝劑且減少細胞緩衝劑的蒸發。 另一方面，具有襯板的板片可以被裝附至一多井式匣 體’諸如在生物科技工業中所常用的£體一樣。在此實施 例中，襯板板片被製造成使其小到足以被放置在多井式g 體上單-井的空間内。可以任何上述方式，將襯板板片裝 附至此區域内。可以將多個襯板板片裝附至多井内。也可 以在多井式板片的井中開啟多個孔，以便容納此襯板板 片。 另一方面，可以使用具有襯板的單一大型板片，以裝 附至多井式板片的整個底面上。 29 200810834 圖23顯不一個整合有用於自動化系統的多井式匣體之 祕型襯板板片陣列之範例。如圖所示，具有24個井的陣 列微型概板1£體232包括一些在井内侧具有圖案的微型襯 板陣列234。較佳地，微型襯板陣列234形成8mm X 8mm 尺寸的格子’如此’將較佳地固持住64〇〇個50/z m(+100 βηι間距）的襯板，或者4〇〇個3〇〇从耐+4〇(^瓜間距）的 概板。板片的底部是由玻璃製成，且大約為U 2mm X 76mm。板片的尺寸大約是·· 14mm直徑的井，具有以㈤㈤ 的間距’外侧的尺寸為127 76mm X 85 47mm X 16mm。這 些尺寸僅為一般性，而非限制性。 身為實驗的一部分，高密度具微型圖案板片24〇包括 微型襯板241的一陣列，其係由如圖24八所示在玻璃表面 244上所製造的Su_8材料所組成。su_8光阻是一種環氧 樹脂為主的材料，當暴露於接近uv光時會變成交聯。在 產個半導體工業來說，使用su_8光阻是相當普遍的，因 為它能夠被用來製造出具有高縱橫比與接近垂直壁的微型 …構。SU-8的其中一項優點在於對大部分的可見光波長來 祝，它都是可透光的。使用上述的微型製造方法，可以形 成具有不同高度、形狀與表面積之襯板陣列。有利地，可 以在諸如顯微鏡載玻片的習知生物表面上製造出大量的襯 板。例如，具有50/zm側邊與2〇ym間隔之2〇〇〇〇個正方 形概板可存在於1cm2上。因此，在實際尺寸的區域中，單 一陣列可能就具有好幾十萬的襯板。 為了使襯板陣列能夠適用於諸如細胞單性生殖等方 30 200810834 法，較佳地，假如需要的話，可以釋放位於大量鄰近襯板 中間的個別襯板。典型地，當組合使用SU-8與玻璃時， 孟屬層被放置在S U- 8與玻璃表面之間以增強黏著性。 ’又有此插入的金屬層，則SU-8會軟弱地黏著於底下的玻 璃。省略掉金屬層會傾向產生出可能因適當量值的機械力 量便分離的襯板陣列。 為了釋放一微型襯板242，如圖24B所示，使用一雷 射的聚焦光束246(較佳地，通過一顯微鏡物鏡247)，以產 生一個侷限於微米尺寸的機械力量。Nd: YAG雷射（532nm) 的單一脈衝（5ns持續時間）被聚焦於玻璃與su_8襯板之間 的界面上。當一雷射光束被聚焦於一夠小的直徑時，產生 一局部化的電漿，接著會產生一朝外傳播的震動波以及一 個％脹的氣穴泡248。在一水溶液中，高達5%的雷射能量 被傳送至此氣穴泡内，而產生幾一數十微米或更大的直徑 之氣泡。為了決定是否雷射引起的電漿所產生之震動波與 氣八/包能夠釋放一襯板，所以，將低能量（2巧〆乃的單一 脈衝聚焦於襯板底下的SU_8玻璃界面。圖24Α中標示有 星號的襯板242被釋放，而不會如圖24C與24〇所示地擾 亂鄰近的襯板。在這些情形下，釋放1〇〇%(n>1〇〇)之標的 襯板，而分離〇〇/。的相鄰襯板。震動波、氣穴泡、或兩者 均會產生在雷射光束的焦點中心且被限制於單一襯板之局 P杜；械力i。可以藉由移動顯微鏡鏡臺而使襯板相繼地放 置於聚焦光束的路徑（例如，參考圖24A與24C)，而釋放 在一陣列中的多個襯板。對於這些小襯板（5() Am側邊）來 31 200810834 . 說，機械能量經常足以分離此襯板，且從其陣列部位推動 此襯板（且通常從顯微鏡的視野）（例如，參閱圖24c與 24D)。當襯板被釋放時，經常在與玻璃表面接觸之襯板表 面上’會存在有小型缺陷，意謂著電漿是形成於此表面附 近且位於SU-8與玻璃表面之間的界面上。 使用聚焦的雷射脈衝，也可以釋放較小與較大的襯板。 具有30 /z m側邊的襯板在較低能量（<2 # j)以} 〇〇%效率與 〇%的串擾（釋放相鄰襯板）進行釋放。較大的襯板（>1〇〇“m) 參 則需要較大的能量以產生100%的釋放速率。例如，具有250 // m寬度的正方形襯板需要6 # J的能量。即使在這些較高 的能量時，並未釋放任何相鄰的襯板。也可以使用多個雷 射脈衝，以便在低於單一脈衝（未顯示資料）的能量時釋放 襯板。也可以藉由此運用雷射的方法，相繼地釋放其他形 狀（橢圓與六角形）與尺寸（20-250 # m)的襯板。 在先前的研究中，811_8被發現能夠與生物相容。然而， ^ 細胞並未妥善貼附於天然SU-8的表面上。培養有纖連蛋 (、ronectin)與膠原蛋白的su_8厚板（slab)確實能夠支持 RBL 3T3與HeLa細胞的貼附與生長（未顯示資料）。襯板 陣歹〗被培養出纖連蛋白或膠原蛋白，接著就是在此陣列上 培養出3T3、RBL，或HeLa細胞。雖然大部分的細胞並不 會貼附至襯板的頂表面，但是，如圖25A與25B所示，有 -些襯板確實在其頂表面上具有細胞。為了決定出釋放具 ^活體細胞之可行性，所以，如圖25C所示，使用雷射^ κ…、光束釋放其表面上具有細胞的襯板。在釋放之前，使 32 200810834 這二、、、版> 載有存活力指示劑（〇reg〇n Green雙乙酸）。在襯 板頂表面上的大部分細胞都能保留住Oregon Green，暗示 出、、、田胞膜疋a整無損的，且這些細胞仍然活著（參考圖 25D)。相反地’貼附於襯板側邊的細胞通常並未保留住指 示劑，暗示他們通常被釋放步驟所殺死。 為了減少細胞進入襯板侧壁的可能性，在SU-8襯板 之間產生空氣的虛擬壁。如2006年1〇月9日所申請之美 國專利申請案第1 1/539,695號中所述，該專利申請案在此 _ 併入作為參考，其中提到，如圖26A所示，放置在SU_8 結構262之間的玻璃表面上之疏水性塗層265可被用來捕 集空氣264。在微型結構262之間所捕集的空氣264可以 穩定持績許多個星期，且能夠將細胞與分子從SU-8結構262 之間的區域排除出去。 為了決定是否由被捕集的空氣環繞之SU-8襯板可以 被聚焦雷射所釋放，所以，將微型襯板26〇的陣列塗上十 七氟-1，1，2,2-四氫癸基三氯石夕燒（（|1叩{&<16〇&:〇11〇1'〇-1，1，2,2- 響 tetrahydrodecyl)trichlorosilane)。在具有虛擬壁的陣列上之 微型襯板262被單一脈衝所釋放。對於高度小於5〇 # m且 襯板間的間隔大於3 0 # m之襯板來說，水溶液填滿了襯板 所空出的間隙，如圖26C與26D中星號所示。藉由移動顯 微鏡鏡臺，可以相繼地釋放微型襯板，同時如圖26E所示， 相鄰的微型襯板仍然貼附於玻璃表面。可釋放超過丨〇〇個 襯板，而不會使標的襯板附近的襯板產生分離。當高度大 於75 /z m(50 /z m側邊，襯板之間的間隔為30 # m)的襯板 33 200810834 • 被分開時，捕集空氣取代水溶液被填入被釋放的襯板之部 位，如圖26E所示。在這樣的情形下，儘管襯板從陣列被 移除，虛擬壁仍然很穩定。 為了比較釋放由空氣環繞的襯板以及由水溶液缓衝劑 環繞的襯板兩者所需之能量，所以，係針對具有與不具有 虛擬壁的陣列’相對雷射脈衝能量而測量襯板釋放的機 率，如圖26B所示。襯板釋放的機率對上雷射能量的曲線， 係符合一高斯誤差函數，以決定出微型襯板釋放的臨界能 ⑩ 量（EP)。具有與不具有虛擬壁的微型襯板之Ep分別為1.9 與1.5。因此，釋放由空氣環繞或由水溶液緩衝劑環繞的 被型襯板所需之能量是類似的。在這些實驗中（n> 1 〇〇)，並 未觀察到相鄰襯板的釋放。 為了進一步顯示運用雷射而釋放虛擬壁所圍繞的細胞/ 襯板，所以，在具有虛擬壁的微型襯板陣列上培養RBL與 HeLa細胞。具有30至40 # m側邊的正方形襯板可提供適 當的表面積供每個襯板上的i至2個RBL與HeLa細胞， 馨 這疋因為這些細胞的尺寸約為25"m(參考圖να)之緣故。 由於具有較大的表面積（參考圖27Β)，所以，較大的襯板（5〇 至75 μ m)可以維持較多的細胞，這些細胞均被侷限於襯板 表面。具有單一細胞的襯板被一聚焦脈衝雷射（2//J)所釋 放（參考圖27C與D)。su_8具有比水略大的密度，所以， 被釋放的襯板會沉澱回到陣列上。在釋放之後，襯板通常 會維持在視野範圍内。當襯板沉澱至其側邊上時，可以看 得見貼附於襯板頂表面上之細胞輪廓（參考圖27C至27F)。 34 200810834 至於沒有細胞的陣列，在被釋放的襯板之部位處的捕集空 氣之結局，係根據陣列尺寸、襯板大小，以及襯板間的間 隔而定。當襯板具有有限高度時，在分離的襯板部位上之 虛擬壁會被水溶液緩衝劑所取代（參考圖27C與27D)。相 較之下，當襯板具有適當高度時，則空氣的虛擬壁很穩定（參 考圖27E與27F)。在運用雷射進行釋放之後，分離的襯板 被收集起來’且經檢查以決定是否細胞仍然留在此襯板 上。對於RBL細胞來說，收集到的襯板之94%均具有細胞 (n=17)。對於HeLa細胞來說，收集到的襯板之93%均含有 貼附的細胞（n=42)。在玻璃與襯板兩者間的界面上，聚焦 雷射脈衝所產生的機械力並不足以將大部分的HeLa或RBL 細胞從SU-8分離開來。此外，藉由穿透光線顯微鏡檢查 法，發現被釋放的細胞具有正常的形態，意謂著這些細胞 還是活的。 為了進一步建立起被釋放細胞的存活力，所以，在釋 放之前，培育在襯板陣列上的HeLa細胞被載有一存活力 指示劑（飼黃綠素紅橙AM(calcein redorange AM))。然後， 釋放在襯板上的單一細胞，且立刻檢查此染料的保留程 度。發現超過90%的HeLa細胞（=21)保留有此染料，表示 其細胞膜是完整無損的，且這些細胞仍是活的。這些資料 顯示出可以使用雷射的聚焦光束，而根據需要來移除具有 細胞的每個襯板。更重要的是，在釋放貼附有細胞的襯板 之後，這些細胞仍然是活的。 如圖28所示，為了有效轉移並繁殖從一襯板陣列28〇 35 200810834 所收集的細胞’所以，將一簡單多井式板片282設計成能 夠與槪板陣列2 8 0相配合。此板片2 8 2具有2 0 0個正方形 或圓形的井284’其尺寸大約為1 參考圖28A或28B)， 且籍由使用雙塑模製程將PDMS洗鑄於SU-8模具内而製 成。這些井284大約深度為150 μ m，且被厚度為25〇 #瓜 的壁所分開。每個井以數字標上標籤以利辨識。此多井式 板片282為圓开^ ’其外徑為17mm，係配合含有襯板陣列 的容室之外徑（參考圖28C與28D)。在使用之前，此多井 式板片282被塗上無菌的纖連蛋白（在Pbs中25 // g/mL)， 且在室溫下達六個小時。被吸附至PDMS的纖連蛋白形成 一個適用於細胞貼附的表面。在襯板釋放之前，收集板片 282在無菌條件下被放置在襯板陣列280的頂面上且在一 組織培養罩（hood)中，而且，使用一無菌墊圈286將此板 片282密封至襯板陣列28〇，以防止流體外漏。在襯板選 擇與釋放期間，陣列與多井式板片仍保持密封，以維持此 單兀内部的無菌程度。在襯板釋放之後，收集板片與襯板 陣列之單元被很小心地倒轉過來，致使襯板與水溶液會因 重力的緣故而沉殿至多井式板片内（參考圖28D與28E)。 然後’此單元在無菌條件下被拆開，且使具有收集襯板的 多井式板片被放置在一習知的無菌培養器中。典型地，可 釋放出比收集板片内的微型井數量更少的襯板（n<4〇)。因 此’每個微型井一般具有1或〇個襯板。在微型井上的編 碼能允許隨時間持續密切注意在收集板片内的細胞。 多井式板片能有效地收集被釋放的襯板，且作為一個 36 200810834 * 枝的培育器皿，以利無性生殖族群的生長。然而，當多 個襯板被同時釋放與收集時，多井中的概板無法符合陣列 上的起初位置，所以，通常很難透過釋放步驟從陣列上的 位置追蹤出-細胞，以及在收集板片上的一微型井内追縱 出最終位置。當針對特定特性而篩選並選擇細胞時，將陣 列上的一細胞肖其無性生殖後代相^己彳能對纟來的應用 f月形來》兒相田重要。為了在整個篩選、釋放與收集過程中 追蹤一襯板，所以，將一個四個數字的號碼299(參考圖 釀^ 29D)刻在每個襯板的表面上。在陣列中的每個襯板均獲 侍一個獨特的號碼。藉由將號碼297(寬度為⑷放入製 2襯板292所用的光罩296之透明區域295内，而產生數 字碼（參考圖29A)。在UV曝光而使塗鍍在一板片294上 的SU-8產生父聯的期間，這些號碼僅會阻擋在頂表 面上之uv光線。由於這些號碼的尺寸很小，所以，uv光 線會擴散至薄線周圍。結果，在這些號碼底下僅會存在未 硬化SU-8的一淺層（2_5/zm深）。在顯影期間，此未硬化 SU 8 g ’谷解，而在襯板292的表面内留下凹痕299(圖29B /、29D)此方法的優點在於它並不會改變製造過程。可以 藉由改M UV曝光時間而控制缺口的深度。藉自聚焦於此 層細胞底下，在細胞於襯板上成長之後，讀取在襯板上的 號碼（圓29C)。此編碼系統的其中之一缺點在於襯板必須 具有用於四個數字的足夠尺寸。為了能夠輕易讀取，所以， 母個數字的高度為35_4〇/zm且寬度為15_2〇"m，致使對 於這些實驗來說，需要一般寬度為g75#m的襯板。具有 37 200810834 • 此尺寸或更大尺寸之襯板預計能夠具有很廣範圍的應用， 特別在當選擇、釋放與收集細胞的小群體之情形。 雖然本發明能容許不同的修改與變化形式，且其特定 範例已經顯示於圖式内並詳細敘述於說明書中，然而，要 知迢的是，本發明並非侷限於上述特定形式或方法而已， 相反地，本發明打算涵蓋落在申請專利範圍的精神與範圍 内之所有修改、等效置換與變化。 【圖式簡單說明】 _ 圖1A疋具有微型襯板陣列的一具微型圖案板片。 圖1B是一具微型圖案板片的侧視圖，該板片具有在 特定的可定址部位上被貼附於襯板之樣本（細胞）。 圖‘2是另一實施例的具微型圖案板片之侧視圖，且顯 不藉由從板片釋放含有樣本的襯板而正向選擇一樣本。 圖3是另一實施例的具微型圖案板片之側視圖，其中， 樣本（有機體）係被貼附至特定的可定址部位上。 _ 圖4是另一實施例的具微型圖案板片之側視圖，其中， 樣本（細胞）被貼附至特定的可定址部位上。 圖5是另一實施例的具微型圖案板片之侧視圖，其中， 該板片係被放置在多井式板片的單一井之底部上，以允許 與此板片一起使用習知工具。 圖6是一板片的侧視圖，顯示使用臨時或永久分割器， 以允許不同種類或來歷的樣本被放置於板片上的不同位置 或不同通道内。 圖7 A與7B顯示使用襯板板片進行貼附性細胞之篩選 38 200810834 - 與培養過程中之步驟。 圖 8 A血r d θ 一 》'、員示使用襯板板片進行DNA篩選過程中 之步驟。 Θ 是個用於自動化分析的整體襯板板片匣體之立 體圖。 圖1〇Α至1〇Μ顯示使用一整體襯板板片匣體進行 筛選與培養過程中之步驟。 7 ° 員示利用含有微型襯板陣列的微型襯板匣體之古 響容量筛選與細胞選擇系統之示意圖。 " 圖12疋藉由微影技術而製造微型襯板的方法之示意 圖。 一圖13疋藉由圖案腐蝕或蝕刻而製造微型襯板的方法之 不思圖。 圖14是藉由雷射切割而製造微型襯板的方法之示竟 圖。 、 _ 圖15是藉由微型加工而製造微型襯板的方法之示意 圖。 、 圖1 6是藉由模板印刷而製造微型襯板的方法之示意 圖。 圖17是藉由轉印處理而製造微型襯板的方法之示意 圖。 ' 圖18是用以處理微型襯板表面以產生出訂作的化學特 14之方法的示意圖。 圖19是用以處理微型襯板而使微型襯板表面變成生物 39 200810834 相容（bi〇compatible)之方法的示意圖。 圖20是用以處理微型襯板而使微型襯板表面變成生物 活性（bioactive)之方法的示意圖。 圖2 1是用以處理微型襯板而使微型襯板表面變成選擇 性相容之方法的示意圖。 圖22是一個與匣體整合在一起的微型襯板板片之示意 圖。 圖23是一個與多井式匣體整合在一起的微型襯板板片 陣列之示意圖。 圖24 A、C與D是在釋放微型襯板期間具有可釋放微 型襯板的高密度具微型圖案板片之影像。 圖24B是釋放微型襯板的過程之示意圖。 圖2 5 A至2 5 D是在一襯板上培育的細胞以及釋放此襯 板之影像。 圖26A是具有捕集空氣的微型襯板之示意圖。 圖26B是釋放襯板所需的臨界能量在具有或不具有襯 板周圍的捕集空氣之虛擬壁之間的比較圖形。 圖26C至26E是在微型襯板之間具有捕集空氣的微型 襯板陣列以及釋放此微型襯板之影像。 圖27 A至27F是在微型襯板之間具有捕集空氣的微型 襯板陣列以及釋放此微型襯板之影像。 圖28A至28B是多井式收集板片的影像。 圖28C至28E是連接至微型襯板陣列板片的多井式收 集板片以及釋放與收集襯板之示意圖。 200810834 圖29A是用以在微型襯板表面内形成識別號碼之方法 的不意圖。 圖29E至29D是在各微型襯板上具有識別號碼的微型 襯板陣列之影像。

【主要元件符號說明】 10 板片 12 襯板 13 部位 14 樣本 16 偵測器 17 雷射脈衝 18 雷射 20 板片 22 概板 23 部位 24 樣本 25 圖案 30 板片 32 部位 34 樣本 35 焦距 36 顯微鏡物鏡 37 電極 38 不透明區域 41 200810834

39 電場 40 具微型圖案板片 41 板片 42 襯板 43 部位 44 樣本 47 井 50 具微型圖案板片 51 分割器 52 襯板 54 樣本 55 流體蓋 60 細胞 62 板片 70 板片 72 襯板 72 a 襯板 73 部位 74 樣本 76 偵測器 77 雷射脈衝 78 雷射 80 板片 82a 襯板 42 200810834

83 84 85 86 87 88 90 91 95 99 100 101 102 102a 102b 106 107 108 109 110 120 122 124 部位

DNA

DNA 偵測器 雷射脈衝 雷射 匣體 流體蓋 概板 通道 微型概板板片 匣體 蓋 部位 第一槪板 第二襯板 偵測器 進入孔 雷射 板片 抽取器 微型概板 光敏感性聚合物 板片 43 200810834

126 光線 128 罩體 130 罩體 131 保護區域 132 第一材料 133 化學或物理手 134 第二材料 135 微型概板 136 板片 138 光線 140 微型概板 142 材料 144 板片 146 高強度光線 148 模板 150 顯微鏡裝設備 152 材料 154 板片 156 切割工具 158 微型概板 160 電腦 161 方式 162 開口 163 微型槪板 44 200810834

164 板片 166 材料 168 材料 169 板片 170 匣體 171 蓋 172 微型概板 173 微型概板 174 化學部分 176 板片 178 板片 179 板片 180 微^型概板 192 微型觀板 194 細胞 202 材料 212 成像情形 214 螢光應用情形 222 微型襯板陣列 224 匣體 226 儲存器 228 蓋子 232 匣體 234 微型襯板陣列 45 200810834

240 具微型圖案板片 241 微型襯板 242 微型襯板 244 玻璃表面 246 聚焦光東 247 顯微鏡物鏡 248 氣穴泡 260 微型襯板 262 SU-8結構 264 空氣 265 疏水性塗層 280 襯板陣列 282 多井式板片 284 井 286 無菌墊圈 292 概板 294 板片 295 透明區域 296 光罩 297 號碼 299 號碼 46

Claims (1)

1. 200810834 十、申請專利範圍： 1. 一種產生具有可釋放襯板的板片之製造方法，其包 含以下步驟： 將一板片塗上一能夠可釋放式地貼附於該板片上之材 料；以及 選擇性地移除此材料的一些部分，導致產生一些可釋 放式地貼附於邊板片的表面上之剛性概板。

   2·如申請專利範圍第i項之方法，其中，該材料包含 一或更多光敏感性聚合物。 3.如申請專利範圍第2項之方法，其中，該選擇性移 除之步驟包括使該一或更多光敏感性聚合物曝露於光線。 4·如申請專利範圍f 3項之方法’其中’該曝光步驟 包括使該光線通過一罩體。 5.如申請專利範圍帛i項之方法，其另外包含使該材 料塗有一保護層之步驟，且其中’該選擇性移除之步驟包 括：使該保護層產生圖t ’且透過該保護層蝕刻或腐蝕該 材料’以形成-些可釋放式&貼附於該板片Μ面上之剛 性概板。 6.如申請專利範圍第1 核板來保遵部分材料免受腐 該選擇性移除之步驟包括腐 而導致產生一些可释放式地 襯板。 項之方法，其另外包含使用一 鍅步驟影響之步驟，且其中， 蝕未叉該模板所保護的材料， 貼附至該板片的表面上之剛性 7·如申請專利範圍第 5項之方法，其中， 一模板被用 47 200810834 ’以便在該第一材料上提 方法，其中，該選擇性移 生一些可釋放式地貼附於 以將第二材料放置於第一材料上 供一臨時保護層。 8·如申請專利範圍第1項之 除材料之步驟包括使用雷射而產 板片上之剛性襯板。 9·如申請專利範圍第8項之方法 在’其中，來自雷射的 光線係通過一罩體或模板。 10·如申請專利範圍第8項之方

   κ万去，其中，來自雷射的 雷射能量經調整以在該材料上執耔 局邻蝕刻，而產生3D 該選擇性移 ，該機械工 11 ·如申請專利範圍第1項之方 /Sr ’其中， 除材料之步驟包括使用一機械工具。 12·如申請專利範圍第11項之方 具係連接至一電腦。 ’、中 13·如申請專利範圍第i項之 用模具重新形纟材料之步冑。 -另夕卜包含-個使 I4·如申請專利範圍第13項之 含有模製材料的板片以移除殘餘物之步驟m卜包含清潔 15·如申請專利範圍第14項之方 料被重新加熱且重新模製，以產生出預，其中’該模製材 16.如申請專利範圍第丨項之方法，发、形狀。 片上的剛性襯板表面之步驟。 "另外包含修改板 如申請專利範圍第16項之方 驟包括施加-或更多化學成分至襯板上。’其中，該修改步 48 200810834 ，其中，該等化學 ’其另外包含首先 促進或抵抗表面修 18·如申請專利範圍第17項之方法 成分為液態或蒸氣形式。 19·如申請專利範圍第17項之方法 應用一底層（primer)至襯板的表面上，以 改0 2〇·如申請專利範圍第16項之方法，且H A人 古其另外包含首先 把加先線或輻射之步驟，以促進或抵抗表面塗層之形成。 21·如申請專利範圍第2〇項之方法， 乂 κ y、 々决’其中，該光線或 輻射係通過一罩體或模板。 22·如申請專利範圍帛16項之方法，其另外包含首先 改變襯板表面㈣度之步驟，以促進或抵抗表面塗層之形 成。 23.如中請專利範圍帛17項之方法，其中，使用一可 固持該等化學成分的笛-4 的弟一板片，而使化學成分接觸該等襯 板。 在高壓條 24·如申請專利範圍第17項之方法，其中 件下使得該等化學成分接觸該等襯板。 在低壓條 25·如申請專利範圍第17項之方法，其中 化學成分接觸該等概板。 使用一機 ” 26·如申請專利範圍帛17項之方法，其中 的刀配系統’而使化學成分接觸該等概板。 透過一模 27·如申請專利範圍第17項之方法，直中 板，而使化學成分接觸料襯板。 ’ 種產生一匣體之方法，該匣體含有一個具多數襯 49 200810834 • 板的板片，該方法包含以下步驟： 使用第一製程以形成一匣體，且使用第二製程以形成 具有多數概板的^一板片。 29.如申請專利範圍第28項之方法，其中，該匣體適 用於固持具有多數襯板的該板片。 30_如申請專利範圍第28項之方法，其另外包含將具 有多數襯板的板片黏接至該匣體之步驟。 31.如申請專利範圍第28項之方法，其另外包含藉由 _ 摩擦力或壓力將具有多數襯板的板片裝附至匣體之步驟。 32·如申請專利範圍第28項之方法，其另外包含使用 磁鐵將具有多數襯板的板片裝附至匣體之步驟。 33·如申請專利範圍第28項之方法，其中，該匿體包 含多個井。 3 4.如申請專利範圍第33項之方法，其中，具有多數 襯板的一板片係裝附至多個井的一或更多井内。 35·如申請專利範圍第33項之方法，其中，具有多數 概板的一或更夕为開板片係放置於多井式匿體中的一或更 多井内。 36.如申請專利範圍第35項之方法，其中，具有多數 概板的一或更夕板片之一個分開的板片係放置於該匡體 内，以便可透過該多井式匣體内的井中之二個或更多開口 而取得。 50