TW200817510A - Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals - Google Patents

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200817510 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 • 本發明係關於一種藉由促進正常B細胞發育及藉由維持 人類（化）抗體在具有人類（化）免疫球蛋白基因座之非人類 動物中的表現來改良人類（化）免疫球蛋白在非人類基因轉 殖動物中之表現的方法。特定言之，本發明係關於編碼人 類（化）Iga及/或Igp(B細胞受體之組成成份）之轉殖基因與編 碼一個或多個人類（化）免疫球蛋白基因座之轉殖基因的同 ^ 時表現。此方法容許人類（化）抗體在（例如）基因轉殖非人 類動物之血液、奶或或彡卩中以優勢表現。 【先前技術】 抗體係一類已成功地用於治療各種人類疾病及病況（例 如，癌症、變應性疾病）及預防移植排斥及宿主抗移植物 疾病的重要醫藥產品。 自非人類動物獲得的抗體製劑之主要問題係非人類免疫 球蛋白在人類患者中的固有免疫原性。為了降低非人類抗 " 體之免疫原性，人們已證實可藉由融合動物可變（V)區外 顯子與人類恆定（C)區外顯子來獲得嵌合抗體基因。此等 嵌合或人類化抗體對人類具有最小免疫原性且適用於人類 文试者之治療性治療。 已研發出並在臨床上使用若干人類化單株抗體。然而， 概言之，嵌合、人類化或人類單株抗體在治療諸如癌症及 病毒性病原體感染等毀壞性疾病方面的用途因該等疾病之 複雜性、多種致病因素及適應性而受到限制。針對獨特界 123851.doc 200817510 定靶之單株抗體通常在彼等靶變化、演化及突變時合失 Li而言’惡性^瘤可能會獲得對標準單株抗體^療 之抗性…種解決此問題之方法係使用能夠#向複數個正 在演化⑲之多株抗體。多株抗體能夠中和細菌性或病毒 性毒素並指導免疫反應以殺死及消除病原體。

因此’在臨床上急需用於大規模生產高效價、高親和性 人類化多株及單株抗體之適宜方法。而^，由於自抗體產 率角度考慮’較佳在諸如兔、雞、綿羊及牛等較大基因轉 殖動物中生產抗體，因此，亦極為需要創造表現大量轉殖 基因編碼產物之較大創始動物。 人源化單株抗體通常為其中某些€〇]^殘基且可能某些fr 殘基由來自非人類動物（例如，齧齒類動物）抗體中類似位 點之殘基取代的人類抗體。人源化基本按照Winter及同事 之方法（Jones# 乂，仏re，321:522(1986) ; Riechmann 事 乂，，332:323(1988) ; Verhoeyen#乂，π， 23 9:1534(198 8))藉由用非人類動物（例如，齧齒類動 物）CDR或CDR序列替代人類抗體之相應序列來實施。 在動物中製備人類化抗體時，所遇到的一個問題是宿主 抗體之内源性生成會超過基因轉殖抗體，此需要加以抑 制。有人曾闡述了抗體重鏈接合區（JH)基因在嵌合及種系 突變小鼠中的純合缺失會完全抑制内源性抗體生成。將人 類種系免疫球蛋白基因陣列轉移至該等種系突變小鼠中可 在受到抗原攻擊後產生人類抗體。參見，例如，

Jakobovits # Λ ^ Proc, Natl Acad Sci USA, 90: 2551 123851.doc 200817510 (1993) ； Jakobovits # χ , Nature, 362: 255 (1993)； Bruggemann#乂 ’ 1: 33 (1993);於2〇〇6 年6月20日授權的美國專利第7,〇64,244號；該等文獻之揭 示内容全部以引用方式併入本文中。 將人類免疫球蛋白基因導入小鼠之基因組中可達成各種 人類抗體譜在此等基因工程小鼠中的表現。表現人類-小 鼠嵌合抗體之小鼠的產生已闡述於piuschke^x之介心⑽/ ㈣215: 27_37 (1998)中。表現人類 免疫球蛋白多肽之小鼠的產生已闡述於Neuberger事乂， Nature 338: 350-2 (1989) ； Lonberg # χ , Jnt. Rev. /所廳⑽/· 13(1):65-93 (1995);及 BrUggemann 事人，Cwrr OpM·出 oiec/mo/，8(4): 455-8 (1997);於 1996年 8 月授權之 美國專利苐5,545,806號，於1996年8月授權之美國專利第 5,545,807號及於1996年10月授權之美國專利第W9,825號 中；該等文獻之揭示内容全部以引用方式併入本文中。表 現人類抗體之牛的產生已闡述於Kur〇iWa事乂， 扪okd 20(9): 889-894 (2002)中。表現人類（化）免疫球蛋 白轉殖基因座之非人類基因轉殖動物的生產及來自此等基 因轉殖動物之抗體的生產亦已具體闡述於PCT公開案第 WO 92/03918號、第WO 02/12437號及美國專利第 5,814,318號及第5,570,429號中，該等案件之揭示内容全部 以引用方式明確地併入本文中。所獲得人類化抗體對人類 具有最小免疫原性且適用於人類受試者之治療性治療。 儘管上文所引用基因工程方法可達成人類免疫球蛋白多 123851.doc 200817510 狀在基因工程小鼠中之表現，但人類免疫球蛋白表現水平 較正常水平為低。此可歸因於有效地表現免疫球蛋白所需 免疫球蛋白基因座之種族專一性調控因子。如在經轉染細 胞系中所示，存於人類免疫球蛋白基因中之調控因子在非 人類動物中不能夠正常地發揮功能。已經闡述若干存於免 疫球蛋白基因中之調控因子。特別重要的是重鏈恆定區之 增強子下游（3，）及輕鏈基因之内含子增強子。另外，其他 仍需確定之控制因子可能存於免疫球蛋白基因中。對小鼠 的研究已經證實：呈膜形式之免疫球蛋白分子的膜及胞質 尾區在人類-小鼠嵌合抗體於人類Cyl基因純合小鼠之血清 中的表現水平方面起重要作用。因此，對於異源免疫球蛋 白基因在動物中之表現而言，需要使用經常於動物類似位 置中I現的序列代替含有增強子因子及外顯子編碼跨膜 (Ml外顯子）及胞質尾區（m2外顯子）之序列。 此等基因工程動物中人類免疫球蛋白表現亦可受攜帶人 類或人類化免疫球蛋白基因座之非人類B細胞的b細胞發 月的影響。人們已經在小鼠中廣泛地研究B細胞受體 (BCR)對B細胞發育之影響。然而，人們尚不明確如何組 合人類或部分人類抗體以形成功能性BCR及此BCR是否會 有效地影響表現人類（化）。之非人類B細胞在基因轉殖動物 中的發育及存活（而此又可影響抗體產率）。 【發明内容】 在一個態樣中，本發明提供一種編碼BCR之嵌合ig(x亞 單位的轉殖基因構建體，其中該嵌合Iga亞單位包括非人 123851.doc 200817510 類Iga多肽序列之細胞内結構域序列及跨膜結構域序列； 以及與SEQ ID NO·: 1之人類Iga細胞外結構域具有至少 8 5 %序列一致性的多狀。 在第二態樣中，本發明提供一種編碼BCR之嵌合Igp亞 單位的轉殖基因構建體，其中該嵌合Igp亞單位包括非人 類Igp多肽序列之細胞内結構域序列及跨膜結構域序列； 以及與SEQ ID NO·: 7之人類Igp細胞外結構域具有至少 8 5 %序列一致性的多狀。 在本發明之某些實施例中’非人類Iga多狀序列之類別 包括但不限於牛序列（SEQ ID NO: 2);鼠序列（SEQ ID NO: 3);犬序列（SEQ ID NO: 4);靈長類序列（Seq ID NO: 5); 兔序列（SEQ ID NO: 6)或其他非人類序列。在本發明之另 一實施例中’非人類Igp多肽序列之類別包括但不限於犬 序列（SEQ ID NO: 8);大鼠序列（SEQ ID NO: 9);牛序列 (SEQ ID NO: 10);鼠序列（SEQ ID NO: 11);雞序列（SEQ ID NO: 12)或其他非人類序列。 在第三態樣中，該非人類基因轉殖動物包括（a)編碼如上 文所界定SEQ ID NO·: 1之全長人類Iga亞單位或嵌合Iga亞 單位的轉殖基因構建體，及/或（b)編碼如上文所界定SEQ ID NO·: 7之全長人類Igp亞單位或後合igp亞單位的轉殖基 因構建體，及（c)編碼人類（化）免疫球蛋白基因座之轉殖基 因構建體，其中該等所得之轉殖基因產物組合以形成人類 (化）B細胞受體複合體。 在此態樣之一個實施例中，非人類基因轉殖動物之任一 123851.doc 200817510 内源性ig生成之表現及/或内源性iga及/或内源性up亞單 位之表現實質上會降低。 在另一實施例中，該非人類基因轉殖動物係選自由兔、 小鼠、大鼠、豬、綿羊、山羊、鳥、馬、驢及牛組成之 群。在較佳實施例中，該非人類基因轉殖動物係兔。 在弟四悲樣中’本發明亦提供一種來自如上文所界定非 人類基因轉殖動物之分離人類（化）免疫球蛋白，其係抗體 或抗體片段。在此態樣之某一實施例中，該分離人類（化） 免疫球蛋白係多株或單株抗體或者亦可為抗體片段。該抗 體片段可來自多株或單株抗體。而且，該抗體或該抗體片 丰又可經標記、或與毒素融合以形成免疫毒素、或與治療劑 偶合、或與此項技術中明確界定及使用的任一異源胺基酸 序列融合。在某些實施例中，該抗體片段係Fc、FV、 Fab、Fab’或 F(ab，）2 片段。 在第五態樣中，本發明提供一種來自如上文所界定非人 類基因轉殖動物之分離B細胞，其中該B細胞表現天然人 類Iga亞單位或嵌合Iga亞單位及/或天然人類Igp亞單位或 嵌合IgP亞單位且亦表現人類（化）免疫球蛋白基因座。在某 些實施例中，對此B細胞實施永生化且在較佳實施例中， 其源自兔。 在第六態樣中，本發明提供一種包含如上文所述抗體或 抗體片段之抗體製劑。 在第七態樣中，本發明提供一種包含如上文所界定抗體 或抗體片段與醫藥上可接受成份之混合物的醫藥組合物。 123851.doc -10- 200817510 名酉藥組合物可包括一單株抗體或其片段，或一種或複數 種多株抗體或其片段。 在第八祕中’本發明提供一種用於在非人類動物中產 生亡類（Ύ抗體之方法，其包括：⑷將編碼天然人類Iga 亞早位或欲合Iga亞單位之轉殖基因構建體及/或編碼天然 頒Igp亞單位或嵌合Igp亞單位之轉殖基因構建體導入非 人^動物中並在其中表現之；及⑻將編碼人類（化）免疫球 土口座之轉殖基因構建體導入非人類動物中並在其中 (c)對4動物實施抗原刺激；及⑷自該動物分離 、：(化)抗體在此怨樣之某些實施例中，該抗體係多株 或單株抗體’或係多株或單株抗體之片段。而且，該抗體 或抗體片段可經標記、或可與毒素融合以形成免疫毒素、 或與治療劑偶合、或可與任—異源胺基酸序列融合。 —在第九態樣中，本發明提供一種用於在表現人類（化）抗 體之非人類動物中產生人類（化）抗體之方法，其包括：（幻 將編碼天然人類Iga亞單位或嵌合Iga亞單位之轉殖基因構 建體及/或編碼天然人類IgP亞單位或嵌合1§β亞單位之轉殖 基因構建體導入非人類動物之B細胞中並在其中表現之· 及（b)將編碼人類（化）免疫球蛋白基因座之轉殖基因構建體 導入非人類動物中並在其中表現之；其中該等所得之轉殖 基因產物組合以形成人類（化）B細胞受體複合體。在一 實施例中，該表現人類（化）抗體之非人類動物係一種可= 由基因轉化及/或體細胞超突變產生抗體多樣性之動物。 在較佳實施例中，該動物係兔。 123851.doc 11 200817510 【實施方式】 定義

除非另有說明，否則本文所用技術及科學術語均具有與 一般熟習本發明所屬技術者通常所瞭解意義相同的意義。 Singkton專 k，Dictionary of Microbiology cmd Molecular 万zo/og少（第 2版），J· Wiley & Sons (New York, NY 1994)及 March, Advanced Organic Chemistry Reactionsy Mechanisms —d （第 4版），John Wiley & Sons (New York，NY

1992)向一熟習此項技術者提供關於本申請案中所用許多 術語之一般指導。 一熟習此項技術者可知許多類似於或等效於彼等本文所 述者之方法及材料，該等均可可用於實踐本發明。實際 上，本發明決不會受限於所述方法及材料。出於本發明之 目的’下文對下列術語進行界定。 本文所界定”轉殖基因構建體或表現構建體，，係指DNA分 子，其含有至少一相關轉殖基因之編碼序列以及非人類基 因轉殖動物靶細胞内相關轉殖基因之時序、細胞專一性及 /或增加表現所需適當調控序列。 糸。此4細胞包括但不限 細胞"界定為能夠在其生命週期之某—階段經受免疫 求蛋白基口片奴重排及表現免疫球蛋白基因的細胞譜 於早期祖B細胞、晚期祖b細

胞、大的前8細胞、小的前B細胞、未成熟B細胞、成熟B 細胞、記憶B細胞、漿細胞等。 係指於B細胞上表 本文所界定，，B細胞受體（BCR)複合體 123851.doc -12- 200817510 現之多亞單位免疫識別受體，其包含下列亞單位：抗原 (Ag)受體、膜結合免疫球蛋白（mIg)、Iga亞單位及1§|3亞單 位。B細胞受體、其組成成份及其與五種免疫球蛋白之關 係已闡述於 Wienands # 乂 ，五9(2): 449-455 (1990)、Venkitaraman#乂，352: 777-781 (1991)、 Herren# 乂，/mm ㈣ 及〜· 26(1-3): 35-43 (2002)中。 此外，已選殖並測序若干與BCR有關之蛋白，但其功能仍 未知且其作為BCR之組成成份的作用仍受到質疑。與bcr 有關之蛋白已經闡述於Adachi#乂，五J 15(7): 1534- 1541 (1996)及 Schamel# 乂，PAMS 100(17): 9861-9866 (2003)中。 天然Iga或Igp亞單位”係指天然存在的Iga或Igp多肽序 列，其包括發現於既定類別動物或有關種族中之天然存在 的Iga或IgP亞單位等位基因。此等亦稱作”全長Iga或Igp序 列”。Flaswinkel等人已選殖人類Iga多肽序列 36 (4): 266_69 (1992);登記號 M74721) (圖1，SEQ ID NO: 1)。Mueller等人已選殖人類Igp多肽序 列（五⑽.丄价oc/2em. 22， 1621-25 (1992);登記號 M80461)(圖 2，SEQ ID NO: 7)。 術語π人類（化）π係指完全人類序列或含有一個或多個人 類序列之序列。因此，本文所用該術語包括人類及人類化 序列。 ”嵌合Iga"亞單位或蛋白或多肽係指來自動物（例如，大 鼠、小鼠、人類、兔、雞等）之Iga多肽序列，其中一個或 123851.doc •13- 200817510 多個Iga多肽結構域經來自另一動物或種族之不同Iga多肽 的一個或多個對應結構域替代，或經來自不同等位基因 Iga形式、或來自具有一個或多個胺基酸取代之序列變 體、或來自與既定Iga序列之對應結構域具有至少85%序列 一致性之Iga序列變體的一個或多個對應結構域代替。術 語’’後合Iga”及”人類（化）Iga，，在整個說明書中可互換使用。 來自某些非人類動物之Iga多肽序列（SEq m NOs: 2_6)亦 界定於圖1中。 ”嵌合Igpn亞單位或蛋白或多肽係指來自動物（例如，大 鼠、小鼠、人類、兔、雞等）之1§β多肽序列，其中一個或 多個IgP多肽結構域經來自另一動物或種族之不同多肽 的一個或多個對應結構域替代，或經來自不同等位基因 IgP形式、或來自具有一個或多個胺基酸取代之igp序列變 體、或來自與既定IgP序列之對應結構域具有至少85%序列 一致性之Igp序列變體的一個或多個對應結構域代替。術 語’’嵌合Igpn及π人類（化）Igp”在整個說明書中可互換使用。 來自某些非人類動物之Igp多肽序列（SEQ ID NOs: 8-12)亦 界定於圖2中。 ”細胞内多肽或結構域”或，，胞質尾區”係指存於細胞邊界 内之既定膜結合蛋白或亞單位的多肽序列部分。通常，蛋 白之細胞内結構域負責信號轉導。

Iga或IgP亞單位之，，細胞内結構域序列，，意指通常存於細 胞邊界内之Iga或Igp多肽或其片段的多肽序列。

Iga或Igp亞單位之”跨膜結構域序列，，意指跨越諸如質 123851.doc -14- 200817510 膜、細胞器膜或脂質雙層等生物膜之Iga或Ig(3多肽或其片 段的多肽序列。本文所界定，，跨膜結構域序列”包括天然存 在的跨膜多肽或可為非天然存在的共有序列或其片段。 π細胞外多肽或結構域”係指通常存於細胞邊界外之既定 膜結合蛋白或亞單位的多肽序列部分。” Iga4Igj3之細胞外 結構域π意指存於細胞邊界外2Ig(X4Igp多肽或其片段之多 肽序列。 本文所用術語’’人類（化）免疫球蛋白基因座”包括人類免 疫球蛋白或Ig基因座或其片段之天然存在序列、人類1§基 因座或其片段之天然存在序列的簡併形式、以及合成序 列’該合成序列編碼實質上與由人類Ig基因座序列或其片 段之天然存在序列編碼之多肽一致的多肽序列。在特定實 施例中’該人類Ig基因片段在人體中會賦予免疫球蛋白分 子以非免疫原性。此處，術語”人類（化）或人類化免疫球蛋 白（Ig)重鏈及/或輕鏈基因座，，或”人類或人類（化）免疫球蛋 白或Ig基因座，，可互換使用。 本文所用術語’’人類（化）B細胞受體（BCR)複合體”係指彼 等其中Iga亞單位係如上文所述天然人類Iga亞單位或具有 人類或人類化Iga序列之嵌合Iga亞單位；及/或（另外）其中 IgP亞單位係如上文所述天然人類Igp亞單位或具有人類或 人類化IgP序列之嵌合Igp亞單位；以及（另外）其中膜結合 免疫球蛋白（mlg)係如上文所述人類（化）免疫球蛋白之膜結 合免疫球蛋白的多亞單位BCR複合體。 本文所用術語，，人類抗體，，及，，人類免疫球蛋白”係指包含 123851.doc -15- 200817510 全人類序列之抗體及免疫球蛋白分子。 本文所用術語”人類化抗體”及”人類化免疫球蛋白，，意指 包含至少一部分人類免疫球蛋白多肽序列（或由人類免疫 求蛋白基因片^又編碼之多狀序列）之免疫球蛋白分子。本 發明之人類化免疫球蛋白分子可自經改造以產生人類化免 疫球蛋白分子之基因轉殖非人類動物分離。此等人類化免 疫球蛋白刀子與自動物製得或自源自動物之細胞製得之非 人類化免疫球蛋白分子相比對靈長類（尤其是人類）具有較 低免疫原性。人類化免疫球蛋白或抗體包括可藉由在基因 轉變動物中實施基因轉變及體細胞超突變來進一步多樣化 之免疫球蛋白（ig)及抗體。此等人類化Ig或抗體不為，，人類 的，此乃因其並非由人類自然生成（由於人類不會藉由基 因轉k來使其抗體譜多樣化)之故，而且人類化1§或抗體由 於在其結構中具有人類1§序列而對人類無免疫原性。 術語”實質上減少之”内源性Ig生成、及/或Iga及/或㈣亞 單位表現意指單獨的内源性1§或另外地内源性Iga及/或 表現之生成程度在基因轉殖動物中減少較佳至少約 49/〇或更“至少約50%_79%，或甚至更佳至少約8〇-89〇/。 或最佳約9(M〇〇%。 術語”單株抗體”用於指示藉由B細胞單一選殖合成的抗 體分子。 術語”多株抗體”用於指示藉由匕細胞群體合成的抗體分 子群體。 能夠經受基因重排及基因轉變之，，免疫球蛋白（Ig)基因座 123851.doc -16· 200817510 "在本文中亦稱作"功能性"Ig基因座且藉由功能性ig基因座 產生的具有多樣性之抗體在本文中亦稱作"功能性"抗體或 Π功能性’’抗體譜系。 本文所用術語，，非人類（基因轉殖）動物”包括但不限於哺 乳動物，例如，非人類靈長類、齧齒類動物（例如，小鼠 及大鼠）、非齧齒類哺乳動物（例如，兔、豬、綿羊、山 羊、牛、豬、馬及驢）；及鳥類，例如，雞、火雞、鴨、 鵝及諸如此類。本文所用術語”非靈長類動物”包括但不限 … 於非靈長類哺乳動物，包括但不限於上文所具體例示出的 哺乳動物。 具體說明 本發明至少在一定程度上係基於如下認識：可藉由在動 物之Β細胞中共表現人類或人類化iga及/或igp來大大地增 加人類或人類化免疫球蛋白（包括免疫球蛋白鏈）在非人類 基因轉殖動物中之生產。據信，將人類或人類化Iga&/或

IgP納入基因轉殖動物之B細胞中可重構並改良B細胞受體 I i 蛋白間之相互作用，進而增強抗原識別、攜帶此等轉殖基 因之B細胞的B細胞發育及存活。人類化免疫球蛋白在已 經攜帶人類或人類化Iga及/或Igp轉殖基因之基因轉殖動物 中的共表現可在很大程度上改良人類化免疫球蛋白生產。 另外，可能需要表現人類或人類化Iga及/或Igp轉殖基因及 針對（較佳）内源性Ig以及内源性Iga及/或Igp基因剔除背景 之人類化免疫球蛋白轉殖基因。 B細胞受體及其相關蛋白 123851.doc -17- 200817510 B細胞受體係由膜結合免疫球蛋白及信號轉導異源二聚 體（由兩個稱為Iga及Igp之二硫鍵連接糖蛋白構成）構成。 另外，已闡述BCR相關蛋白（BAP)。 BCR之表現對於B細胞發育、選擇及存活而言十分重 要。此等過程視經由Iga/Igp異源二聚體之BCR信號傳導而 定。此等分子之細胞質結構域攜帶一含有裝配成所謂基於 免疫受體酪胺酸之活化基元（ITAM)之若乾酪胺酸殘基的序 列基元，該等酿胺酸殘基在BCR觸發時受到填酸化。 基因打靶實驗已經證實：Iga/Igp異源二聚體之細胞質結 構域對於B細胞發育而言十分關鍵。在正發育的b細胞之 正選擇及負選擇中均涉及藉由Iga/Igp異源二聚體轉導信 號。 膜結合免疫球蛋白（mlg)分子係由兩個重鏈（形成同型二 I體）及兩個各自共價鍵結至一個重鏈之輕鏈構成。在n_ 端，重鏈攜帶VH結構域，視同種型而定，其後為4 (IgM， igE)、3 (IgG，IgA)或 2 (IgD) C·結構域。藉由 VH:VL配對 之超變區形成抗原結合位點。因此，每一 mIg分子具有兩 個抗原結合位點。 該mlgM分子與分泌形式之IgM的不同在於分泌IgM形成 具有10個潛在抗原結合位點之五聚體。該五聚合受分泌μδ 鍵之C端部分中序列的控制。由22個胺基酸構成之此部分 在膜結合μπι鏈中不存在，而此膜結合|^111鏈攜帶由Μ1&Μ2 外顯子編碼之48 C-端胺基酸。 該序列之μιη-專一性部分係整個IgM分子之最演化保守 123851.doc -18- 200817510 的部分。小鼠、兔與人類mlgM近乎相同且，且在吾人將 小氣與沙魚mlgM對比時仍發現該保守性係明顯的。當吾 人對mlgM之C-端序列與小鼠之其他mIg同種型的^端序列 進行對比時，亦發現胺基酸之保守性係明顯的。此發現證 實：保守跨膜胺基酸在Η鏈同型二聚體中彼此之間相互作 用或與Iga及Igp亞單位相互作用。

Iga及Igp二者具有22個胺基酸跨膜片段，其後為具有約 40-70個胺基酸之C-端胞質尾區，其含有若乾酪胺酸殘 基。在N-端，兩蛋白均攜帶前導肽，其後為含有半胱胺酸 殘基、色胺酸以及發現於Ig超家族蛋白中之若干其他保守 胺基酸的細胞外結構域。此表明Iga&Igj3亞單位二者之細 胞外部分形成Ig樣結構域。除了包含形成結構域内二硫鍵 之半胱胺酸外，該等Iga及Igp序列含有預測會在Iga與Igp 亞單位之間形成鏈内二硫鍵的額外半胱胺酸。 小鼠與人類Iga序列間之對比顯示：對Ig結構域與内鏈 鍵結之資訊重要的所有殘基均保留於兩種族之Iga間。然 而’該對比亦顯示：細胞外部分之序列保留僅達約56〇/〇， 而跨膜與胞質尾區分別顯示100%及87%之保留。後者反映 該分子C-端部分内之殘基的重要性。 mlgM分子與iga/igp異源二聚體之裝配為migM表面表現 所需。此需求可藉由μΓη鏈跨膜部分之突變來消除。舉例 而言’用Η-2Κ"分子之跨膜部分代替μιη鏈之跨膜區可達成 獨立於Iga/Igp之migM的表面表現。此等數據表明：μιη鏈 與Iga/Igp異源二聚體間之專一性相互作用需要μιη跨膜 123851.doc -19- 200817510 區。另外，B細胞具有可防止將跨膜蛋白複合體之單一或 不完全裝配組成轉運出ER的控制機制。 儘管BCR之跨膜部分可能是形成bcr複合體所需的最重 要結構’但亦有人提出Iga及Igp之細胞外Ig—結構域在 mlgM分子結合中起作用。舉例而言，在不表現小鼠Ig〇i之 小鼠細胞系J558I^m中，用iga轉殖基因轉染可恢復mIgM 之表面表現。令人感興趣的是，用小鼠Ig(X基因轉染會達 成較用人類Iga基因轉染大1〇倍的表現。此數據表明：iga 之細胞外結構域亦可與mIgM之細胞外部分相互作用。另 一方面，具有人類免疫球蛋白基因座之基因轉殖小鼠確實 可表現人類免疫球蛋白。人類（化）mlgM在基因轉殖非人類 動物中之B細胞發育、B細胞存活或表現是否會受人類Iga 及/或人類Igp在攜帶人類（化）mIgM基因之B細胞中之共表 現的影響仍不明了。 另外’已經選殖並測序若干與BCR有關之蛋白（BAP)， 但其功能仍未知。即使此等蛋白與BCR有關，其作為bcr 之組成的作用仍受到質疑。而且，BAP之遍在表現及強演 化保守表明：其一定會起重要作用，可能在一般細胞過程 中並提出若干推定的功能。舉例而言，此等蛋白可參與偶 合BCR與細胞骨架或控制小胞輸送。最後，有人提議其可 用作伴侣蛋白，有助於跨膜蛋白之折疊及裝配。 相關文獻 該B細胞受體、其組成及其與五種免疫球蛋白之關係已 闡述於 Wienands等人，五細〇 j 9(2): 449 455 (199〇)、 123851.doc -20- 200817510

Venkitaraman等人，352: 777-781 (1991)、Herren 事 人，26(1-3): 35-43 (2002)中。BCR相關 蛋白已闡述於Adachi等人，五M50 /15(7): 1534-1541 (1996)及 Schamel# 入，100(17): 9861-9866 (2003) 中。Β細胞受體對Β細胞發育及存活之影響已闡述於Reth， Annual Reviews of Immunology 10： 97-121 (1992) ^ Kraus^ 人，Cell 117(6)·· 787-800 (2004)、Sayegh 等人，

Immunological Reviews 175: 187-200 (2000)、Reichlin 事 A ’Journal of Experimental Medicine 193(1): 13-23 (2001)、Pike等人，172: 2210_2218 (2004)、Pelanda等人，Journal of Immunology 169: 865-872 (2002)中。BCR信號傳導之調控及其對B細胞發育及細 胞凋亡之影響已經闡述於Cronin等人，J· /mmw⑽/ogj; 161: 252-259 (1998)、Muller等人，PAMS 97 (15): 8451-8454 (2000) ^ Craggf A ^ Blood 100: 3068-3076 (2002)、Wang 等人，Immunology 171: 6381-6388 (2003) 、 Fuentes-Panand等人，J. /mmwno/ogjK 174: 1245-1252 (2005)中。上 述引用參考文獻之揭示内容均全部以引用方式併入本文 中0 因此，本發明係關於用於尤其在能夠產生各種人類（化） 抗體譜的基因轉殖動物中在B細胞中共表現人類（化）Iga及/ 或人類（化）IgP之方法，以改良在此等基因轉殖動物中B細 胞之存活。動物類別包括較大非人類動物，如兔、鳥、 雞、綿羊、山羊、牛、豬、馬及驢。當此等動物表現Ig轉 123851.doc -21 - 200817510 殖基因座時’由於其體形較大，因此其抗體產量亦應較 大。因此，本發明旨在產生經由增加B細胞發育及存活生 成大量人類（化）免疫球蛋白之大型創始動物。 因此，本發明係關於編碼全長人類1§〇1及Igp多肽之轉殖 基因構建體或者編碼欲合或人類化Iga&後合或人類化 多肽之嵌合轉殖基因構建體，如下文進一步所界定。 '編碼人類Iga及/或Igp多肽之轉殖基因或轉殖基因構建 體π分別意指天然、全長、人類1§01及/或Igp DNA序列以及 任何變體，密碼子優化之DNA序列，其編碼iga4Ig|3之功 能等效多肽，但具有基於密碼子簡並之不同DNA序列。此 概念進一步具體闡述於下文中。天然、全長、人類多 肽序列界定於SEQ ID NO: 1 (圖1)中。天然、全長、人類 IgP多肽序列界定於SEQ ID NO: 7 (圖1)中。 本文亦提及”編碼喪合或人類（化）Iga之核酸分子或轉殖 基因或轉殖基因構建體後合Iga”亞單位或蛋白或多肽 係指來自動物（例如，大鼠、小鼠、人類、兔、雞等）之Iga 多肽序列’其中一個或多個Iga多肽結構域經來自另一動 物或種族之不同Iga多肽的一個或多個對應結構域替代， 或經來自不同等位基因Iga形式、或來自具有一個或多個 胺基酸取代之Iga序列變體、或來自與既定Iga序列之對應 結構域具有至少85%序列一致性之iga序列變體的一個或多 個對應結構域代替。術語”嵌合Iga，，及”人類（化）Iga，，在整個 說明書中可互換使用。自其可獲得細胞内及/或跨膜結構 域序列之非人類Iga多肽序列包括但不限於（例如）牛序列 123851.doc -22- 200817510 (SEQ ID N〇: 2);鼠序列（SEQ ID NO: 3);犬序列（SEQ m NO·· 4);靈長類序列（(SEQ m N〇· 5);兔序列（剛① N0·· 6)或其他非人類序列。 本文亦提及n編碼嵌合或人類（化）Igp之核酸分子或轉殖 基因或轉殖基因構建體”。"嵌合Ig(3”亞單位或蛋白或多肽 係指來自動物（例如，大鼠、小鼠、人類、兔、雞等）之 '多肽序列，其中一個或多個Igp多肽結構域經來自另一動 物或種無之不同Igp多肽的一個或多個對應結構域替代， (或經來自不同等位基因Ig(3形式、或來自具有一個或多個 胺基酸取代之igp序列變體、或來自與既定Igp序列之對應 結構域具有至少85%序列一致性之Igp序列變體的一個或多 個對應結構域代替。術語，，散合1§{3”及，，人類（化）Igpn在整個 說明書中可互換使用。自其可獲得細胞内及/或跨膜結構 域序列之非人類Igp多肽序列包括但不限於（例如）犬序列

(SEQ ID NO: 8)，大鼠序列（SEQ ID NO: 9);牛序列（SEQ ID NO: 10);鼠序列（SEQ ID NO: 11);雞序列（SEQ ID (. NO: 12);或其他非人類序列。 因此，簡而言之，嵌合Iga或Igp轉殖基因係由下列構 • 成：1)分別編碼人類Iga或Igp之細胞外結構域的核苷酸序 列’及2)分別編碼宿主基因轉殖動物之iga或igp之跨膜及 細胞内結構域的核苷酸序列。 在另一態樣中，本發明亦係關於編碼人類（化）免疫球蛋 白或基因座之基因轉殖構建體，如在先前提出申請的美國 申請案，現在可獲知的美國公開案第2003-0017534號（在 123851.doc -23 - 200817510 2003年1月23日公開）及美國公開案第2006-0026696號（在 2006年2月2曰公開）中所述，該等案件之揭示内容全部以 引用方式併入本文中。其中所揭示基因轉殖動物、其產生 的B細胞或細胞系、及相關方法亦形成本發明之態樣。 在上述態樣之替代方法中，本發明亦係關於編碼人類 (化）免疫球蛋白或Ig鏈或基因座之基因轉殖構建體，如在 美國專利第5,545,806號（在1996年8月授權）、美國專利第 5,545,807號（在1996年8月授權）及美國專利第5,569,825號 (在1996年10月授權）、美國專利第7,〇64,244號（在2006年6 月20日授權）、或PCT公開案第WO 92/03918號、第WO 02/12437號及美國專利第5,814,318號及第5,570,429號中所 述；亦可參見 Jakobovits等人，Pn jcad. 5W t/又么 90: 255 1 (1993) ; Jakobovits 等人，362: 255 (1993) ; Bruggemann 等人，7: 33 (1993) ; Pluschke等人，〇//m卿㈣办 215: 27-37 (1998) ; Neuberger等人，338: 350-2 (1989) ; Lonberg 等人，/从 i?ev· /历卿⑽/· ^0):65-93 (1995);及 Bruggemann等人，Cwrr. 〇ρΖ>· 8(4): 455-8 (1997);及 Kuroiwa 20(9): 889-894 (2002)，該等 文獻之揭示内容全部以引用方式併入本文中。其中所揭示 基因轉殖動物、其產生的B細胞或細胞系、及相關方法亦 形成本發明之態樣。 可藉由各種技術（包括顯微注射原核、轉染、核轉移選 殖、精子介導之基因轉移、睾丸介導之基因轉移、及諸如 123851.doc -24- 200817510 此類）將轉殖基因或轉殖基因構建體納入動物之基因組 中0 在一個實施例中，人類Iga及/或Igp基因較佳藉助免疫專 一性啟動子（較佳為B細胞專一性啟動子）在基因轉殖動物 之B細胞中表現。此人類1§〇1或1§(3基因表現較佳只發生於b 細胞内’從而增加B細胞發育及延長非人類基因轉殖動物 存活。”B細胞專一性啟動子，，意指任一 b細胞專一性基因、 及/或其變體或經改造部分之啟動子/增強子序列，其通常 控制於B細胞中表現之基因的表現，其實例包括但不限於 下列之啟動子/增強子：CD19、CD20、CD21、CD22、 CD23、CD24、CD40、CD72、Blimp-1、CD79b (亦稱作 B29或Igp)、mbq (亦稱作Iga)、酪胺酸激酶碰、VpreB、 免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白κ輕鏈、免疫球蛋白λ_輕 鍵、免疫球蛋白j-鏈等。在較佳實施例中，該CD79a、 CD79b或κ輕鏈啟動子/增強子可促進人類Iga及/或ι§β基因 之B細胞專一性表現。 在又一實施例中，包含編碼人類Iga及/或Igp基因之核酸 分子的轉殖基因構建體與包含外源性免疫球蛋白或免疫球 蛋白（Ig)鏈轉殖基因基因座之轉殖基因構建體共表現。在 此實施例中，ig轉殖基因基因座及人類Iga&^tIg|3轉殖基 因二者可存於相同基因轉殖表現載體上或存於兩個不同基 口轉殖表現載體上。在後一種情形中，可同時或依序將兩 基因轉殖表現載體導入非人類基因轉殖動物中。 依照本發明，本文包含Iga或Igp之單獨人類全長或細胞 123851.doc •25- 200817510 外結構域的變體。此意指容許遺傳密碼簡並之核酸序列、 編碼包括胺基酸取代（可增加細胞外結構域功能性之功能 等效殘基）及/或突變之多肽序列的核酸序列。”細胞外結構 域之功能性’’包括但不限於形成能夠轉導信號之BCR。 就容許遺傳密碼簡並而言，本發明涵蓋與人類Iga及人 類IgP之細胞外多肽序列具有至少約70%，更通常約8〇%至 85%，較佳至少約90%且最佳約95%序列一致性的序列。 術語’’生物功能等效體”為此項技術所熟知且進一步具體 界定於本文中。因此，在胺基酸水平上具有介於約7〇%與 約80%之間；或更佳介於約81%與約90%之間；或甚至更 佳，介於約91%與約99%之間之一致性的序列被視為在功 能上等效於人類Iga及Igp，限制條件為可維持該等蛋白之 生物活性。 術語π功能等效密碼子”在本文中用於指編碼相同胺基酸 之密碼子（例如，精胺酸或絲胺酸之六個密碼子）且亦係指 編碼生物等效胺基酸之密碼子。 下文係基於改變蛋白之胺基酸以產生等效或甚至改良第 二代分子的論述。舉例而言，在蛋白結構中某些胺基酸可 由其他胺基酸取代，此並不會對各結構之相互結合能力造 成明顯損失，例如，抗體之抗原結合區或基質分子上之結 合位點。由於蛋白之相互結合能力及特性決定該蛋白之生 物功能活性，因此，可對蛋白序列及其基本〇1^八編碼序列 實施某些胺基酸取代，但產生具有類似性質之蛋白。因 此，本發明者預計··可對基因之DNA序列實施各種改變， 123851.doc -26- 200817510 而不會對其生物功用或活性造成明顯的損失，如下文所 述。 在實施此等改變時，亦可考慮胺基酸之親水性指數。親 水性胺基酸指數在賦予蛋白以相互作用性生物功能中的重 要性通$為此項技術所知（Kyte & Doolittle 1982)。為人 們所接受的疋胺基酸之相對親水性會影響所得蛋白之二級 結構，而此決定該蛋白與其他分子（例如，酵素、基質、 受體、DNA、抗體、抗原及諸如此類）間之相互作用。 此項技術亦瞭解：可根據親水性有效地對類似胺基酸實 施取代。以引用方式併入本文之美國專利第4,554，1〇1號聲 明蛋白之最大局部平均親水性（由其毗鄰胺基酸之親水性 控制）與該蛋白之生物學性質有關。如在美國專利第 4,554，101號中所述，下列親水性數值被指配給各胺基酸殘 基：精胺酸（+3.0);離胺酸（+3·〇);天冬胺酸（+3〇+-1); 楚胺酸（+3.0. + -.1)，絲胺酸（+〇·3);天冬醯胺（ + 〇·2);麵胺 醯胺（+0.2);甘胺酸（〇);蘇胺酸卜〇4);脯胺酸（h+o ; 丙胺酸（-0.5);組胺酸（-0.5);半胱胺酸甲硫胺酸 (-1.3);顯胺酸（-1.5);亮胺酸（_18);異亮胺酸（_18);酪 胺酸〇2.3);苯丙胺酸（-2.5);色胺酸（-3.4)。 應理解：一胺基酸可由另一具有類似親水性數值之胺基 酸取代並仍產生生物學上等效及免疫上等效的蛋白。在此 4變化中，其親水性數值在·+_·2内之胺基酸取代為較佳， 彼等在·+-·1内之胺基酸取代為尤佳，且彼等在·+_·0.5内之 胺基酸取代為甚至尤佳。 123851.doc -27· 200817510 如本文所述，胺基酸取代通常係基於胺基酸側鏈取代基 之相對類似性，例％，其疏水性、親水性、電荷、大小及 諸如此類。彼等熟習此項技術者熟知考慮各種上述特性之 例不丨生取代且包括··精胺酸與離胺酸之取代；麩胺酸與天 ;胺馱之取代，絲胺酸與蘇胺酸之取代；麩胺醯胺與天冬 醯胺之取代，及纈胺酸、亮胺酸與異亮胺酸之取代。 製備本發明之多肽的另一實施例係使用肽模擬物。模擬 物係杈擬蛋白二級結構之組成部分的含肽分子(—η麵 1993)。使用肽模擬物之理論基礎係：蛋白之肽骨架之存 在形式主要是以便於分子相互作用（例如，彼等抗體及抗 原之相互作用）之方式定向胺基酸側鏈。肽模擬物預期可 谷許類似於自然分子之分子相互作用。此等原理可聯合上 文所述原理用於改造具有人類Iga或Igp之許多自然性質及 改變和改良特性的第二代分子。 因此，編碼人類Iga或Igp的核酸序列變體及人類〗抖或 igP之功能等效多肽的核酸序列變體可用於本發明。 可將含有相關基因之基因轉殖載體導入一個或多個受體 細胞中且隨後藉由隨機整合或藉由定向整合來整合入一個 或多個受體細胞之基因組中。 對於隨機整合而言，可藉由標準基因轉殖技術將含有人 類Iga或Igp之基因轉殖載體導入動物受體細胞中。舉例而 5，可將基因轉殖載體直接注入受精卵母細胞之原核中。 基因轉殖載體亦可藉由在卵母細胞受精之前將精子與基因 轉殖載體共同培育來導入。基因轉殖動物可由受精卵母細 123851.doc -28- 200817510 胞發育而成。導入基因轉殖載體之另一種 刀 ®万去係藉由轉染 胚胎幹細胞且隨後將經基因修飾之胚胎幹細胞注入正在發 育的胚t。或者’可將基因轉殖載體（赤裸的或與異化劑 之組合）直接注入正在發育的胚中。最終，自含有整合入 基因轉殖動物至少某些體細胞之基因組中之人類（化）1§轉 殖基因的胚產生嵌合基因轉殖動物。 在特定實施例中，將含有人類Iga或IgP之轉殖基因隨機 整合入源自其中内源性Iga或IgP表現減少之動物種屬的受 體細胞（例如，受精卵母細胞或正在發育的胚）基因組中。 此等動物種屬之使用有利於來自人類（化）基因轉殖4基因 座之免疫球蛋白分子之優先表現。或者，可使具有人類 (化）Iga及/或Igp轉殖基因之基因轉殖動物與其中内源性 及/或Igp表現受損之動物種屬交配。可獲得受損及/或 IgP及人類（化）Iga及/或Igp之純合後代。或者，可使用反義 技術、細胞内抗-Iga及/或Igp表現及諸如此類來抑制或降 低内源性Iga及/或Igp之表現。在一個實施例中，選擇用於 降低宿主動物之Iga及/或Igp内源性生產的方法係RNA干擾 (RNAi)方法，其將雙鏈rnA (ds RNA)或（更佳）短的或小的 干擾RNA雙螺旋體（siRNA)導入具有細胞内宿主動物Iga及/ 或Igp核酸序列之B細胞中。此可使用市售套組（包括但不 限於購自 Invitrogen 公司之 Block iT™ 或 Stealth™ RNA 套 組）來達成。 對於定點整合而言，可將基因轉殖載體導入適當動物受 體細胞中，例如，胚胎幹細胞或已經分化之體細胞。然 123851.doc -29- 200817510 後，可藉由標準方法選擇其中轉殖基因已經整合入動物基 因組中並藉由同源重組代替對應内源性基因之細胞（參 見，例如，Kuroiwa等人，Nature Genetics 2004 年 6月 6 曰）。隨後可將所選細胞與全能及能夠形成功能新生體之 去核的核轉移單位細胞（例如，卵母細胞或胚胎幹細胞）融 合。依照公認的習知技術實施融合。亦可藉由顯微外科術 使用注射微管實施卵母細胞去核及核轉移。（參見，例 如，Wakayama等人，Nature (1998) 394:369·)隨後在適當 培養基中培養所得卵細胞並轉移至同步受體以產生基因轉 殖動物。或者，可將所選經基因改造之細胞注入正在發育 的胚中，該胚隨後發育成嵌合動物。 而且’依照本發明，能夠產生人類（化）Iga及^Igi3之基 因轉殖動物亦可藉由下列來製造：將一或多個上文所述重 組載體導入一個或多個受體細胞中，其中一個重組載體攜 T連接到與内源性Iga& /或IgP基因片段之側端序列同源之 5及3’側端序列的人類Iga及/或Igp基因片段；隨後選擇其 中内源性Iga及/或igp基因片段藉由同源重組由人類Iga及/ 或Igp基因片段取代之細胞，並自所選經基因改造之受體 細胞獲得動物。 類似於基因轉殖載體之靶插入，在此方法中適用作受體 細胞之細胞包括胚胎幹細胞或已經分化之體細胞。可藉由 任一可行的方法（例如，轉染）將攜帶人類Iga及/或IgP基因 片段之重組载體導入此等受體細胞中。然後，可藉由標準 方法選擇其中人類Iga及/或IgP基因片段已藉助同源重組取 123851.doc -30· 200817510 代對應内源性iga及/或Igp基因片段之細胞。此等經基因修 飾之、、、田胞在用於選殖基因轉殖動物之核轉移程序中可用作 核i、體細胞。或者’可將所選經基因改造之胚胎幹細胞注 入正在發育的胚中，該胚隨後可發育成嵌合動物。 在特疋實施例中，可在胚胎壽命期間藉由將轉殖基因直 接注入胚或以間接方式將轉殖基因注入妊娠母體或產卵母 雞申來將本發明之轉殖基因構建體導入基因轉殖動物中。 藉由任上述方法所產生基因轉殖動物形成本發明之另一 實施例。該基因轉殖動物在基因組中具有至少一個（即， 個或夕個）人類（化）Iga及/或Igp基因，自該基因轉殖動物 可產生功能性人類（化）Iga及/或1§|3蛋白。 而且，本發明之轉殖基因構建體，即人類或人類化Iga 及/或Igp轉殖基因及人類化免疫球蛋白轉殖基因較佳可針 對内源性Ig以及内源性Iga及/或1§(3剔除中的一種或更佳兩 種剔除背景而表現。因此，本發明之基因轉殖動物能夠重 排人類（化）Ig基因座並針對具有實質減少内源性Ig表現以 及（更佳）實質減少内源性Iga及/或Ig(3之背景有效地表現功 能性人類（化）抗體譜。在此上下文中”實質上，，意指單獨的 内源性Ig表現或另外地内源性Iga及/或Igp表現之内源性產 生程度較佳減少至少約30%_49%，或更佳至少約5〇%_ 79 /〇或甚至更佳至少約80-89%，或最佳約9〇_ 1 〇〇%。 本备明k供表現一個或多個人類（化）Ig基因座及人類 (化）Iga及/或lgp之基因轉殖兔，其能夠重排基因並轉換人 類（化）Ig基因座且表現功能性人類（化）抗體譜。較佳地， 123851.doc -31 · 200817510 此等兔亦不會產生大量的功能性、内源性兔免疫球蛋白或 功能性、内源性兔Iga及/或Igp。 本發明亦提供表現一個或多個人類（化）Ig基因座及人類 (化）Iga及/或igp之其他較大基因轉殖動物，包括但不限於 鳥類、齧齒類動物及飼養動物，如牛、豬、綿羊、山羊、 驢、馬及諸如此類。同樣，較佳地，此等動物亦不會產生 大量的功能性、内源性免疫球蛋白或功能性、内源性Iga 及/或IgP。因此，此等基因轉殖動物能夠以高產率有效地 表現功能性人類（化）抗體譜及重排人類（化）4基因座。 本發明亦係關於自上述不同類別基因轉殖動物分離之B 細胞，其表現人類（化）Iga及/或Igp基因及人類（化）免疫球 蛋白基因座。而且，可藉助熟習此項技術者已知及使用的 舀用方法（包括但不限於，使用病毒進行轉化等）對此等B 細胞實施永生化。 使用抗原實施免疫化可在該等基因轉殖動物中達成針對 相同抗原之人類（化）抗體的生產。 儘管本發明之較佳實施例係關於具有人類（化）Ig基因座 之基因轉殖動物，應理解：具有靈長源化Ig基因座及靈長 源化多株抗血清之基因轉殖動物亦屬於本發明精神之範 圍。類似於人類（化）多株抗血清組合物，靈長源化多株抗 血清組合物在人類個體中亦具有減少免疫原性。 在製造能夠產生各種人類（化）免疫球蛋白分子之基因轉 殖非人類動物時（如在下文中進一步所述），可藉由使用抗 原對動物實施免疫化來容易地獲得針對該抗原之人類（化） 123851.doc -32- 200817510 免疫球蛋白及人類（化）抗體製劑。各種抗原可用於免疫化 基因轉殖宿主動物。此等抗原包括微生物，例如，病毒及 單細胞生物（例如，細菌及真菌）、活的、減毒或死的微生 物片段、或抗原自該等微生物分離的分子。 用於免疫化動物之較佳細菌抗原包括來自金黃色葡萄球 菌（57叩似⑽mw)之純化抗原，例如$型及8型莢膜 多糖、重組形式之毒性因子（例如，α•毒素）、黏附素結合 蛋白、膠原結合蛋白、及纖連蛋白結合蛋白。較佳細菌性 抗原亦包括減毒形式之金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌 所⑽似aer叹、腸道球菌、腸 桿菌屬⑽er)、及肺炎克雷伯氏菌（幻Μ…//β 謂om’ae)、或來自此等細菌細胞之培養物上清液。可 用於免疫化之其他細菌抗原包括經純化脂多糖類（Lps)、 莢膜抗原、莢膜多糖及/或重組形式之外膜蛋白、纖連蛋 白結合蛋白、内毒素及來自綠膿假單胞菌之外毒素、腸道 球菌、腸桿菌屬、及肺炎克雷伯氏菌。 用於產生針對真菌之抗體的較佳抗原包括減毒形式之真 囷或其外膜蛋白，該等真菌包括但不限於白色念珠菌 (―α 、近平滑假絲酵母（c—油 …）' 熱帶假絲酵母菌（c⑽心▲卜、及新 型隱球菌（CV別。 用於免疫化以產生針對病毒之抗體的較佳抗原包括包膜 蛋白及減毋开>式之病毒，其包括但不限於呼吸道合胞病毒 (RSV)(尤其是F_蛋白）、c型肝炎病毒（HCV)、b型肝炎病毒 123851.doc -33 - 200817510 (HB V)、巨細胞病毒（CMV)、EB V、及 HS V。 可藉由使用下列免疫化基因轉殖動物來產生用於治療癌 症之治療性抗體：分離腫瘤細胞或腫瘤細胞系；腫瘤相關 之抗原，其包括但不限於Her_2-neu抗原（針對其之抗體可 用於治療乳腺癌）；CD19、CD20、CD22及CD53抗原（針對 其之抗體可用於治療B細胞淋巴瘤）、前列腺專一性膜抗 原（PMSA)(針對其之抗體可用於治療前列腺癌）、及^^^ 分子（針對其之抗體可用於治療結腸癌）。

该等抗原（連同佐劑或在無佐劑時）可以任一習知方式投 予基因轉殖宿主動物且可按照預定計劃投予。 在實施免疫化之後，為了純化對該抗原具有專一性之醫 藥級別多株抗體’可精製來自經免疫化基因轉殖動物之血 /月或奶。在基因轉殖鳥之情形中，抗體亦可藉由精製印黃 來裝備。可藉由層析（親和型、離子交換型、凝膠過渡 等）、用鹽（例如，硫酸銨）、有機溶劑（例如，乙醇）或聚=

物（例如’聚乙二醇）實施選擇性沉殿來獲得經濃縮純化免 疫球蛋白部分。 可在適用於對人類實施靜脈注射之無毒、無熱原介質 (例如1菌緩衝鹽水）中溶解或稀釋精製人類（化）抗體。、 通*，用於投藥之抗體製劑的特徵在於具有自"毫 毫升至HK)毫克/毫升，更通常^毫克/毫升至 之免疫球蛋白濃度。該抗體製劑可含有免疫球蛋白之各種 同種型。或者，該抗體製劑 多選擇同種型。 丨h有抗體之唯-同種型或許 123851.doc -34- 200817510 為了製備人類（化）單株抗體，可自表現該動物之内源性 免疫球蛋白之B細胞已經刪除的經免疫化基因轉殖動物分 離脾細胞。分離脾細胞可用於與轉化細胞系之細胞融合以 生產雜交瘤，或cDNA編碼抗體可藉由標準分子生物技術 來選殖並在經轉染細胞中表現。用於製備單株抗體之程序 為此項技術所熟知。參見，例如，歐洲專利申請案第〇 5 83 980 A1 號（’’Method For Generating Monoclonal

Antibody From Rabbits，，）、美國專利第 4,977,081 號（"Stable

Rabbit-Mouse Hybridomas And Secretion Products Thereof，，）、WO 97/16537 ("Stable Chicken B-cell Line And Method of Use Thereof”）及歐洲專利第 EP 0 491 057 B1號 (ffHybridoma Which Produces Avian Specific Immunoglobulin G”），該等案件之揭示内容均以引用方式併入本文中。單 株抗體自選殖cDNA分子之活體外生產已經闡述於Andris-Widhopf 等人，’’Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display’’， J Immunol Methods 242:159 (2000)及 Burton， D. R·， ’’Phage display’’，1:87 (1995)，該等文獻之揭示 内容均以引用方式併入本文中。 在大多數情形中，抗體製劑係由未經修飾免疫球蛋白構 成，即，自動物製備的未經額外修飾（例如，藉由化學製 品或酵素）之人類（化）抗體。或者，可對該免疫球蛋白部分 實施處理（例如，酶促消化（如用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、 纖溶酶、糖苷酶、核酸酶等消化）、加熱等）及/或進一步精 123851.doc -35- 200817510 製以產生”抗體片段，，。 本發明亦包括包合疏1 I»、1、 ^ 精由上述方法所獲得抗體或其片段之 醫藥組合物或抗體製畚丨 衣Μ 本文所用術語，，醫藥上可接受之 成份”或"調配物”意欲涵蓋包含特定數量之所主張活性成 份（即，人类員（化）抗冑或抗體片段）之產品以及任一直接或 間接由若干特定量$ Μ ^ ^ 之特疋活性成份之組合產生的產品。此 術—奴/函盍包括一種或多種活性成份與組成載劑的一種 或夕種h 14成h之產品’以及任—可直接或間接由該等成 份中任兩種或更多種之組合、複合或凝聚而產生、或由該 等成份m多種之解離而產生、或由該等成份中一種 或多種之其他類型反應或相互作用而產生的產品。因此， 本t月之百藥組合物”涵蓋藉由混合任一本發明化合物與 醫藥上可接受之載劑而製成的任一組合物。 術^ 化a物之投予’’及、或"投予一化合物"應理解為 意指對需要治療之個體以任一調配物形式提供任一本發明 化合物。 用於投予本發明化合物之醫藥組合物可方便地以劑量單 位形式提供且可藉由醫藥業熟知之方法製備。適宜方法及 所用載劑係彼等在此項技術中已有明確闡述者，例如，在 Remington, The Science and Practice of Pharmacy, ed Gennaro等人，第20版（2000)中，但彼等熟習免疫學領域者 應容易地瞭解：其他方法可知且適用於製備本發明之組合 物。所有方法均包括使活性成份與構成一種或多種辅助成 份之載劑結合之步驟。一般而言，該等醫藥組合物可藉由 123851.doc -36- 200817510 使活性成份與液體载劑或微細固體载 %…虱兩者均勻且緊宓 結合且隨後(若必要)使該產物成形為所需調配物來势備： 在醫藥組合物中，活性成份係以足精疾病之過程或狀況 產生期望效果之量納入，如上文所述。 運而5之，用於控 制、延長釋放抗體分子之調配物已經闌述於美國專利第 6,706,289號中，該等方法均以引用方式併入本文中。 因此，基因轉殖構建體、包含該等轉殖基因構建體之載

體及使用上述方法產生的基因轉殖動物係本發明之所有實 施例。 下列實例進一步闡明本發明而非以任何方式限制本發 明。 & 實例1 兔B細胞系與人類Iga及Igfi之轉染 為了證實人類Iga及Igp對人類mlgM在兔B細胞中之表現 的作用’使用編碼人類Iga或Igp或人類mlgM之表現載體轉 染此等細胞。 在表現載體中選殖人類Iga及人類Igp及人類IgM編碼基 因。 用表現載體轉染永生兔B細胞系並於新黴素存在下在培 養基中培養之以選擇穩定的轉染子。藉由流式細胞儀使用 對人類IgM及人類Iga及/或Igp具有專一性之抗體分析抗性 細胞。用編碼人類IgM之表現載體轉染兔B細胞可達成人 類IgM之較低細胞表面表現。用人類Iga及/或Igp實施共轉 染可達成人類IgM之較高細胞表面表現。此證實：人類Iga 123851.doc -37- 200817510 及/或IgP為人類（化）或嵌合mlgM之較高細胞表面表現所需 並足以達成人類（化）或嵌合mlgM之較高細胞表面表現。 實例2 源自任一具有人類Iga及Igp之動物之B細胞系的轉染 為了證實人類Iga及IgP對人類mlgM在源自動物之B細胞 中之表現的作用，在源自雞（DT40)、牛及豬之B細胞中轉 染編碼人類Iga或IgP或人類mlgM之表現載體。 用該等表現載體轉染永生B-細胞系並於新黴素存在下在 培養基中培養之以選擇穩定的轉染子。藉由流式細胞儀使 用對人類IgM及人類Iga及/或Igp具有專一性之抗體分析抗 性細胞。使用編碼人類IgM之表現載體轉染兔B細胞可達 成人類IgM之較低細胞表面表現。用人類Iga及/或IgP實施 共轉染可達成人類IgM之較高細胞表面表現。此證實：人 類Iga及/或IgP為人類（化）或嵌合mlgM之較高細胞表面表現 所需並足以達成人類（化）或嵌合mlgM之較高細胞表面表 現。 實例3 具有或不具有人類Iga及/或Ιξβ之表現人類化免疫球蛋白 輕鏈及/或重鏈轉殖基因的基因轉殖兔 按照 Fan 等人（Pathol· Int· 49: 583-594，1999)所述產生基 因轉殖兔。簡而言之，使用標準方法使雌性兔超數排卵並 使其與雄性兔交配。自輸卵管收集原核期接合子並將其置 於適當培養基（例如，補充有20%胎牛血清之Dulbecco攝酸 緩衝鹽溶液）中。藉助一對控制器將外源性DNA (例如，含 123851.doc -38- 200817510 有人類（化）免疫球蛋白基因座或人類Iga或人類igp之表現 載體）顯微注射至原核中。將形態存活接合子轉移到假孕 兔之輸卵管中。藉由注射人類絨膜促性腺激素（hCG)引發 假孕。；I於約0 · 1 -1 %之注射接合子發展成活基因轉殖兔。 藉由PCR及FISH證實轉殖基因至基因組之整合。 藉助ELISA分析來確定含有人類IgG及/或人類杧輕鏈抗原 決定簇之抗體於基因轉殖創始兔之血清子中的存在。藉由 流式細胞儀分析B細胞表面上之抗體表現。具有編碼人類 (化）免疫球蛋白重鏈基因座之轉殖基因的兔表現丨_1〇 毫升人類IgM。幼小動物（6-9周）表現1〇〇-4〇〇〇 μ§/毫升人 類IgG。然而，人類IgG之表現迅速下降至1〇_1〇〇 毫升 之水平。Β細胞在外周血液中之流式細胞分析揭示少量人 細胞（1-2%)。幼小兔之盲腸含有多達1〇%人類 mIgM+細胞，其隨年齡增長會迅速消失。 編碼人類Iga及/或IgP之轉殖基因的導入可達成丨〇〇_2〇〇〇

兔及人類（化）mlgM或mlgG。

得且可在不會實質改變實施本發 夕1J加以閣述，但其並不限於 ••各種修改形式可容易地獲 务明之方式的條件下實施。 123851.doc -39- 200817510 特定言之，所有此等修改形式均欲屬於本文所主張本發明 之範圍。 【圖式簡單說明】 圖1展示人類Iga多肽序列（SEQ ID NO: 1)與其他非人類 Iga序列（SEQ ID NOs: 2_6)之胺基酸對比。 圖2展示人類IgP多肽序列（SEQ ID NO: 7)與其他非人類 IgP序列（SEQ ID NOs: 8_12)之胺基酸對比。 123851.doc •40· 200817510 序列表 <110>美國人類多株抗體醫療有限公司 <120〉於非人類基因轉殖動物中增加人類或人類化免疫球蛋白之表現 <130〉39691-0016 <140〉096132651 <141〉2007-08-31 <150> 60/841,890 <151〉2006-09-01 <160〉 12 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 226 <212> PRT <213〉智人 <400> 1

Met Pro Gly Gly Pro Gly Val Leu Gin Ala Leu Pro Ala Thr lie Phe 15 10 15

Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys Gin Ala 20 25 30

Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu 35 40 45

Asp Ala His Phe Gin Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn Ala Asn Val 50 55 60

Thr Trp Trp Arg lie Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro Pro Glu Phe 65 70 75 80

Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr Leu He He Gin Asn Val 85 90 95

Asn Lys Ser His Gly Gly lie Tyr Val Cys Arg Val Gin Glu Gly Asn 100 105 110

Glu Ser Tyr Gin Gin Ser Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Gin Pro 115 120 125

Pro Pro Arg Pro Phe Leu Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg lie 130 135 140 lie Thr Ala Glu Gly lie lie Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly 145 150 155 160

Thr Leu Leu Leu Phe Arg Lys Arg Trp Gin Asn Glu Lys Leu Gly Leu 165 170 175

Asp Ala Gly Asp Glu Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn 180 185 190

C

Leu Asp Asp Cys Ser Met Tyr Glu Asp lie Ser Arg Gly Leu Gin Gly 195 200 205

Thr Tyr Gin Asp Val Gly Ser Leu Asn lie Gly Asp Val Gin Leu Glu 210 215 220

Lys Pro 225 <210〉 2 <211> 65 <212> PRT <213> 普通牛(Bos Taurus) <400> 2

Glu Gin Ala Ser Pro lie Ala Gly Val Glu Trp Gly Pro Val Thr Val 1 5 10 15

Glu Val Arg Leu Thr Gly Thr His Val Gin Ser Ser Ser Val Met Tyr 20 25 30

Arg Gly Asp Val Gly Ala Gly Glu Lys Pro Thr Arg Met Arg Gin Ser 35 40 45

Asp Lys Lys lie Arg Asp Leu Asn lie Met Phe Ala lie Gin Asp His 50 55 60

Ala 65 123851.doc 200817510 <211> 66 <212〉 PRT <213〉家鼠 <400〉 3

Leu Glu Ala Arg Leu Leu Leu Tyr Ala Cys Arg Val Glu Gly Gly Pro 1 5 10 15

Thr Asn Glu Arg Leu Thr Glu Asn Gly Arg Pro He Phe Ser Gin Ser 20 25 30 lie Val Pro Gin Gly Thr Thr Gin Phe Phe Pro Glu Asn Arg Leu Trp 35 40 45

Gin He Asn Asn lie Leu Lys Arg Asn Val Phe Val Met Pro Asp Asn 50 55 60

His Ala 65 <210> 4 <211> 66 <212> PRT <213〉犬屬 <400> 4

Leu Cys Thr lie Gly Gly Ser Val Asp Gly Gly Pro Met Thr Thr Arg 15 10 15

Leu Leu Arg Arg Leu Ser Ser Lys Leu lie Val Gin Ala Asp lie Ser 20 25 30

C

Tyr Lys Gly Glu Thr Asp Thr Met Met Arg Gin Glu Lys Asp Leu Asn 35 40 45

Gin Lys lie Leu Ser Ser Glu Arg Leu Asn Met Phe Val Gin Asp His 50 55 60

Gly Asp 65 <210> 5 <211〉 73 <212〉 PRT <213〉羊屬 <400> 5

Ser Ala Val Arg Glu Trp Pro Ser Pro Gly Pro Tyr Ser His Cys Pro 15 10 15

Ala Gly Asp Thr Arg Phe lie Phe Glu Val Gly lie Glu Pro lie Pro 20 25 30

Ser Met Trp Val Ser Asn Arg Leu Gly Gin Arg Asp Gly His Ser Pro 35 40 45

Leu Gin Lys Val Ser Pro Leu Gly Pro Leu Ser Gin Pro Gly Glu Gly 50 55 60

Leu Gly Arg Gly Thr Pro Asn Ala Gin 65 70 <210〉 6 <211> 2 <212> PRT <213〉兔科(oryctolagus cuniculus) <400> 6 Asp His <210〉 7 <211〉 229 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 7

Met Ala Arg Leu Ala Leu Ser Pro Val Pro Ser His Trp Met Val Ala 15 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ala Glu Pro Val Pro Ala Ala Arg Ser Glu 20 25 30

Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser Arg He Trp Gin 35 40 45 123851.doc 200817510

Ser Pro Arg Phe lie Ala Arg Lys Arg Arg Phe Thr Val Lys Met His 50 55 60

Cys Tyr Met Asn Ser Ala Ser Gly Asn Val Ser Trp Leu Trp Lys Gin 65 70 75 80

Glu Met Asp Glu Asn Pro Gin Gin Leu Lys Leu Glu Lys Gly Arg Met 85 90 95

Glu Glu Ser Gin Asn Glu Ser Leu Ala Thr Leu Thr lie Gin Gly lie 100 105 110

Arg Phe Glu Asp Asn Gly lie Tyr Phe Cys Gin Gin Lys Cys Asn Asn 115 120 125

Thr Ser Glu Val Tyr Gin Gly Cys Gly Thr Glu Leu Arg Val Met Gly 130 135 140

Phe Ser Thr Leu Ala Gin Leu Lys Gin Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly 145 150 155 160 lie lie Met lie Gin Thr Leu Leu lie He Leu Phe lie lie Val Pro 165 170 175 lie Phe Leu Leu Leu Asp Lys Asp Asp Ser Lys Ala Gly Met Glu Glu 180 185 190

Asp His Thr Tyr Glu Gly Leu Asp lie Asp Gin Thr Ala Thr Tyr Glu 195 200 205

Asp lie Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu 210 215 220

His Pro Gly Gin Glu 225

<210> 8 <211> 51 <212> PRT <213>犬屬 <400> 8

Gly Val His Asn Leu Val Gly Lys Thr His Gin Asp Thr Gly Gly Ala 15 10 15

Val Glu lie Arg His Thr Lys Asp Val Ala Arg Leu Glu Lys Pro Pro 20 25 30

Arg Asp Leu Leu Gin Asp Val Gin Ser Ser Lys Gly Ser Phe Ser Lys 35 40 45

Arg Asp Asn 50 <210〉 9 <211> 70 <212> PRT <213〉大鼠 <400> 9

Thr Val Cys Leu Met Phe Gly Met Thr Lys Ser Gin Pro Pro lie Phe 15 10 15

Gin Pro Lys His Ala Lys Ser Ser Met Phe His Thr Asp Tyr Val Met 20 25 30

Thr Phe Arg Gin Lys Gly Asn Gin Arg Glu Phe Pro Asp His lie Ser 35 40 45

Gin Thr Arg Gly Val Tyr Leu Asn Gin Tyr Ser Thr Glu Pro Asp Thr 50 55 60

Asp Leu Leu Asp Arg Asn 65 70

<210> 10 <211> 71 <212〉 PRT <213> 普通牛(Bos Taurus) <400〉 10

Gly Ser lie Gly Leu Asn Asn Leu Leu Gly Gly Lys Leu Asp Lys Thr 15 10 15

Asp Leu Leu Asp Asn Thr His Val Lys Gly Ser Glu lie Arg His Val 20 25 30

Glu Asp Asp Leu Phe Arg Pro Lys Pro Ser Glu Lys Thr His Ala Gin 35 40 45 lie Leu Gin His Lys Glu Val Leu Ser Val Gin Gin Lys Glu Ala Lys 50 55 60

Gly Gin Arg Thr Glu His Arg 123851.doc 200817510 65 70 <210> 11 <211> 70 <212> PRT <213〉家鼠 <400> 11

Thr Val Ser Met Cys Leu Leu Phe Phe Gly Met Thr Ser Leu Pro Leu 15 10 15

Phe Gin Pro Gin His Ala Lys Ser Ser Met Phe Thr His Ala Leu Thr 20 25 30

Phe Arg Arg Gly Ser Gin Gin Glu Val Ser Glu lie Val Gin Thr Gly 35 40 45

Val Tyr Asn Gin Tyr Lys Asp Ser Ala Asn His Asn Thr Asp Ser Leu 50 55 60

Leu Asp Arg Leu Gly Asn 65 70 <210> 12 <211> 139 〈212〉 PRT <213〉紅原雞 <400> 12

Met Gly Asp Phe Cys Arg Arg Leu Trp Val Leu Gin Val Asn Trp Met 15 10 15

Ala Ala Ala Gly Gly lie Pro Thr Asp Gly Asn Ser Thr Ser Arg Thr 20 25 30

Glu Val Gly Met His Tyr Ala Lys Asn Thr Ser His Phe lie Thr Ser 35 40 45

Gin Pro His Ala Met Gin Tyr Lys Ala Leu Gly Asn Gly Lys Glu Phe 50 55 60

His Val Asp Gin Ser Ser Asp Phe Ser lie Asn Asn Thr Asn Asp Arg 65 70 75 80 lie Ser Phe Ser Arg Ser Tyr Val Asp Ser Asn Leu Thr Glu Glu Lys 85 90 95

Arg Gin Pro Asn Ser lie Ser Arg Asn lie Gin He Gin Asn Thr lie 100 105 110 lie Leu Val lie Ser Met Leu Phe Glu Gly Arg Glu Arg Pro Glu Val 115 120 125

Glu lie Thr Pro Phe Asp Met Lys Ala Thr Glu 130 135 4- 123851.doc

Claims (1)

1. 200817510 十、申請專利範圍： 1· 一種編碼BCR之嵌合Iga亞單位之轉殖基因構建體，該嵌 合Iga亞單位包括： Ο)非人類Iga多肽序列之細胞内結構域序列及跨膜結 構域序列；及 (b)與SEQ ID NO·: 1之人類Iga之細胞外結構域具有至 少85%序列一致性之多肽。 2· —種編碼BCR之嵌合IgP亞單位之轉殖基因構建體，該嵌 合igP亞單位包含： (a) 非人類lgp亞單位之細胞内結構域序列及跨膜結構 域序列；及 (b) 與SEQ ID NO·: 7之人類Igp之細胞外結構域具有至 少85%序列一致性之多肽。 3. 如請求項1之轉殖基因構建體，其中該非人類Iga多肽序 U 4. 列包括牛序列（SEQ ID NO: 2);鼠序列（SEQ ID NO: 3); 犬序列（SEQ ID NO: 4);靈長類序列GSEQ id N〇: 5); 兔序列（SEQ ID NO: 6)或其他非人類序列。 如印求項2之轉殖基因構建體，其中該非人類多肽序 列包括犬序列（SEQ ID NO: 8);大鼠序列（SEQ m N〇: 9);牛序列（SEQIDN0: 10);鼠序列（SEQidn〇: n); 雞序列（SEQ ID NO: 12);或其他非人類序列。 5. 一種非人類基因轉殖動物，其包含： ⑷如請求項丨之編碼SEQ ID N〇: 1全長人類iga亞單 位或嵌合Iga亞單位的轉殖基因構建體；及/或， 123851.doc 200817510 (b) 如請求項2之編碼SEq ID NO·: 7全長人類Igp亞單 位或喪合IgP亞單位的轉殖基因構建體；及 (c) 編碼人類（化）免疫球蛋白基因座之轉殖基因構建 體’其中該等所得之轉殖基因產物組合以形成人類（化）b 細胞受體複合體。 6.如請求項5之非人類基因轉殖動物，其中該非人類基因 轉殖動物之任一内源性Ig生成及/或Iga及/或Igp亞單位的 表現實質上減少。 Ί·如請求項5之非人類基因轉殖動物，其中該動物係選自 由兔小鼠、大鼠、豬、綿羊、山羊、鳥、馬、驢及牛 組成之群。 8·如請求項5之非人類基因轉殖動物，其係兔。 9· 一種來自如請求項5之非人類基因轉殖動物的分離人類 (化）免疫球蛋白，其中該人類（化）免疫球蛋白係抗體或 抗體片段。 10·如明求項9之分離人類（化）免疫球蛋白，其中該抗體係多 株或單株抗體。 Η.如請求項9之分離人類（化）免疫球蛋白，其中該抗體片段 係多株或單株抗體之片段。 12.如請求項9之分離人類（化）免疫球蛋白，其中該抗體或抗 體片段經標記。 13· 士 1求項9之分離人類（化）免疫球蛋白，其中該抗體或抗 體片丨又融合至毒素以形成免疫毒素或者其與治療劑偶 合0 123851.doc 200817510 14·如請求項9之分離人類（化）免疫球蛋白，其中該抗體或抗 體片段融合至異源胺基酸序列。 15·如請求項^之分離人類（化）免疫球蛋白，其中該抗體片 段係 Fc、Fv、Fab、Fab，或 F(ab，）2片段。 16· —種來自該如請求項5之該非人類基因轉殖動物之分離b 細胞’其中該B細胞表現該天然人類Iga亞單位或嵌合Iga 亞單位及/或該天然人類IgP亞單位或嵌合IgP亞單位、及 該人類（化）免疫球蛋白基因座。 17·如請求項16之分離B細胞，其中該B細胞經永生化。 18·如請求項16或17之分離B細胞，其中該B細胞源自兔。 19· 一種包含如請求項9之分離人類（化）免疫球蛋白的抗體製 劑。 20· —種醫藥組合物，其包含如請求項19之抗體製劑與醫藥 上可接受成份之混合物。 21·如請求項20之醫藥組合物，其包含一單株抗體或其片 段。 22·如請求項2〇之醫藥組合物，其包含一種或複數種多株抗 體或其片段。 23· —種用於在非人類動物中產生人類㈠匕）抗體之方法，其 包括： Ο)將編碼天然人類Iga亞單位或嵌合Iga亞單位之轉殖 基因構建體及/或編碼天然人類Igp亞單位或嵌合亞單 位之轉殖基因構建體導入該非人類動物中並在其中表現 之；及 123851.doc 200817510 (b) 將編碼人類（化）免疫球蛋白基因座之轉殖基因構建 體導入該非人類動物中並在其中表現之； (c) 對該動物實施抗原刺激；及 (d) 自該動物分離人類（化）抗體。 24.如請求項23之用於產生人類（化）抗體的方法，其中該抗 體係多株或單株抗體。 25·如請求項23之用於產生人類（化）抗體的方法，其中該抗 體片段係多株或單株抗體之片段。 26.如請求項23之用於產生人類（化）抗體的方法，其中該抗 體或抗體片段經標記。 27·如請求項23之用於產生人類（化）抗體的方法，其中該抗 體或抗體片段融合至毒素以形成免疫毒素或者其與治療 劑偶合。 28·如請求項23之用於產生人類（化）抗體的方法，其中該抗 體或抗體片段融合至異源胺基酸序列。 29· —種用於產生表現人類（化）抗體之非人類動物的方法， 其包括： (a) 將編碼天然人類iga亞單位或欲合Iga亞單位之轉殖 基因構建體及/或編碼天然人類I g β亞單位或欲合I g β亞單 位之轉殖基因構建體導入該非人類動物之Β細胞中並在 其中表現之；及 (b) 將編碼人類（化）免疫球蛋白基因座之轉殖基因構建 體導入該非人類動物中並在其中表現之； 其中該等所得之轉殖基因產物組合以形成人類（化）B細胞 123851.doc 200817510 受體複合體。 3 0.如請求項27之用於產生表現人類（化）抗體之非人類動物 的方法，其中該動物藉由基因轉化及/或體細胞超突變而 產生抗體多樣性。 31.如請求項27之用於產生表現人類（化）抗體之非人類動物 的方法，其中該動物係兔。 ί 123851.doc