TW200817456A - Multifunctional mixed micelle of graft and block copolymers and preparation thereof - Google Patents

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,200817456 九、發明說明： 發明所屬之技術領域 本發明係關於一種具有殼核結構之高分子型微胞，尤 其有關一種具有殼核結構之多功能性高分子型微胞，其由 一接枝共聚合高分子與至少一種雙團聯共聚合高分子自我 組裝而形成。 先前技術 多成份微胞在生醫應用上已廣泛的研究，而各種型態 之多成份微胞具有許多有利特性，如：可使微胞具有特殊 功能性、增強微胞對於腫瘤辨識之專一性、可穩定微胞結 構、可克服不同材料的使用缺陷、以及可使微胞顯現多功 能性等Π 4]。在高分子領域中，多成份微胞（亦稱複合型微 胞）之型態包含雙團聯-雙團聯共聚合高分子系統、雙團聯_ 三團聯共聚合高分子系統、三團聯_三團聯共聚合高分子系 統、以及雙團聯接枝共聚合高分子系統[2_10]。然而，至今 尚無文獻報告雙團聯_接枝共聚合高分子系統之複合型微 胞。且在過去數十年間，複合型微胞皆著重於微胞行成機 制探时[]’鮮少有研究將其應用藥物傳輸上[3,4]。複合型 微胞形成之複雜性，以及殼核結構組成之完整性皆成 合型微胞在生醫應用上之限制瓶頸。 發明内容 本毛月係揭露一種新穎的複合型微胞結構，其具有 200817456 功能性内核以及親水性外殼，藉由一接枝共聚合高分子與 一團聯共聚合高分子或多團聯共聚合高分子自我組裝而 成’其中尤以一接枝共聚合高分子與兩或多個雙團聯共聚 合高分子之組成較佳。該複合型微胞之尺寸係介於50至 2〇〇奈米之間。 本發明提供一種新穎的複合型微胞結構，包含一功能 性内核與一親水性外殼，其係由一接枝共聚合高分子與一 個或多個團聯共聚合高分子自我組裝而成。較佳的，由一 接枝共聚合高分子與兩個或多個雙團聯共聚合高分子自我 組裝而成。本發明所合成的微胞具有一粒徑大小為約 50-200 nm 〇 本發明提供一種具殼核結構之高分子型微胞，其中該 結構包含一接枝共聚合高分子與一團聯共聚合高分子該 接枝共聚合高分子包含一主鏈及鍵結於該主鏈的—疏水性 側鏈，該團聯共聚合高分子包含一疏水性高分子鏈段與一 親水性高分子鏈段，其中該接枝共聚合高分子之疏水性側 鏈聚集，肖團聯共聚合高分子之疏水性鏈段堆疊聯合在該 接枝共聚合高分子之聚集的疏水性側鏈上，i該團聯共聚 合高分子之親水性鏈段從其中突出裸露於外而形成殼核結 構。 本發明進一步提供一種 之製備方法，包含下列步驟 具有设核結構的高分子型微胞 團聯共聚合高分子溶解 鬲分子包含一主鏠及一 a)將一接枝共聚合高分子與一 於有機溶劑中，其中該接枝共聚合 6 200817456 鍵結於該主鏈上的疏水性側鏈 該團聯共聚合高分子包含

有機溶劑置換成水。

於步驟a)中一種或多種不同的團聯共聚合高 較佳的，於步驟a)中一 分子被溶解於該有機溶劑。 車乂佳的，一樂物與該接枝共聚合高分子及團聯共聚合 高分子共同溶解於該有機溶劑。 車乂仫的，忒接枝共聚合高分子的疏水性側鏈與該團聯 共聚合咼分子的疏水性鏈段包含相同之重複單元。 辜交佳的，該團聯共聚合高分子係雙團聯共聚合高分 子’其包含該疏水性高分子鏈段與該親水性高分子鏈段。 更佳的，該雙團聯共聚合高分子為曱氧基聚乙二醇吨_聚乳 酸交酯（methoxy-p〇ly(ethylene glycol)-b，poly(jD,ZMactide))。 較佳的’該疏水性高分子鏈段之數目平均分子量介於 5 00-2 5 00，及該親水性高分子鏈段之數目平均分子量介於 2000-10000 〇 較佳的’該團聯共聚合高分子之疏水性鏈段為生物可 分解吸收。 較佳的’該團聯共聚合高分子之疏水性鏈段為聚酯、 聚乳酸交醋、聚乳酸或聚己内酯。更佳的，該團聯共聚合 200817456 高分子之疏水性鏈段為聚乳酸交酯。 車父佳的’該接枝共聚合高分子的親水性鏈段為聚丙烯 酸酯’或酸驗/離子強度敏感型高分子，其中該酸鹼/離子強 度敏感型高分子為聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丁烯二酸 (p〇ly(butenedioicaicd))、聚組胺酸（polyhistidine)、或聚乙 烯基咪唑（p〇ly(vinyl imidazole))。 較佳的’該團聯共聚合高分子之親水性鏈段為聚醚、 聚乙二醇（p〇ly(ethylene glycol))、甲氧基聚乙二醇 (meth〇xy-p〇ly(ethylene glyc〇1))、或聚（2_ 乙基 噁唑 琳）（poly(2-ethyl-2-oxazoline))。 較佳的，該接枝共聚合高分子的主鏈包含具親水性的 第一重複單元，及該疏水性側鏈鍵結於該第一重複單元。 更佳的，中該第一重複單元具有一羧基結構，及該疏水性 侧鏈為生物可分解吸收。 較佳的，該接枝共聚合高分子的主鏈為聚丙烯酸、聚 甲基丙烯酸、聚丁烯二酸、聚組胺酸、或聚乙烯基咪唑。 更佳的，該接枝共聚合高分子的主鏈為聚甲基丙烯酸。 杈佳的，該接枝共聚合高分子之疏水性側鏈為聚酯、 久乳§久父S曰來乳酸或聚己内醋。更佳的，該接枝共聚合 而分子之疏水性側鏈為聚乳酸交酯。 較佳的，該接枝共聚合高分子主鏈進一步包含一第二 重複單元，而該第二重複單元不同於該第一重複單元，其 該第一重複單元應答於溫度變化使該微胞的核崩毀。更佳 的，該接枝共聚合高分子的主鏈之第二重複單元為異丙 200817456 基丙烯醯胺（N-is〇propyl acryiamide)單體所形成者。最佳 的，該接枝共聚合高分子的主鏈為N_異丙基丙烯醯胺與甲 基丙烯酸之共聚合高分子。 較佳的，該高分子型微胞粒徑大小為5〇-2〇〇 nm。 較佳的，該雙團聯共聚合高分子具有一連接於該親水 性高分子鏈段的一末端的末端功能性分子，及該末端功能 性分子為可與腫瘤細胞表面之受器（recept〇r)結合的配體 (ligand)。更佳的，該配體為半乳醣殘基（galact〇se residue)。 較佳的，該雙團聯共聚合高分子具有一連接於該親水 性高分子鏈段的一末端的末端功能性分子，及該末端功能 性分子為一螢光基團（fiuorescence group)。更佳的，該螢光 團基為螢光螢光異硫氰酸鹽（flu〇rescein isQthiQeyanate)。 較佳的，該雙團聯共聚合高分子具有一連接於該親水 性高分子鏈段的一末端的末端功能性分子，及該末端功能 性分子為一染劑（dye)。更佳的，該染劑為近紅外線染劑。 較佳的，该結構包含多個不同的團聯共聚合高分子， 且每一個該團聯共聚合高分子包含一疏水性高分子鏈段與 一親水性咼分子鏈段。更佳的，該多個不同的團聯共聚合 高分子的每一個都是雙團聯共聚合高分子，其包含一疏水 性高分子鏈段與一親水性高分子鏈段。 較佳的，該不同的團聯共聚合高分子之疏水性高分子 鏈段具有一相同之重複單元。 較佳的，該不同的團聯共聚合高分子之親水性高分子 鏈段具有一相同的重複單元。 9 .200817456 較佳的，料_團聯共聚合高分子之親水性高分子 鏈段具有不同的重複單元。 較佳的，該多個不同團聯共聚合高分子於親水性高分 子鏈段本端連接有不同的末端功能性分子。更佳的，該末 端功能性分子中的一個為可與腫瘤細胞表面之受體 (receptor)結合之配體（ligand)。最佳的，該配體為半乳醣殘 基。選擇性的，該末端功能性分子中的一個為螢光基團， 例如螢光異硫氰酸鹽。選擇性的，該末端功能性分子中的 一個為為染劑，例如近紅外線染劑。 實施方式 在本發明中，一種多組成分微胞已由接枝共聚合高分 子/、又團％共聚合咼分子製備而成，並藉由臨界微胞濃度 (CMC)之差異控制微胞粒徑之大小。在匕特殊殼核結構之複 合型微胞可藉由小心設計與操控每一組成分而具有廣泛之 應用性/中—用途即是應用於抗癌藥物載體。細胞内藥 物釋放疋非常重要之癌症治療藥物傳遞途徑。此途徑可 曰加藥物對於標的地區細胞之毒性以纟降低藥物對於正常 細胞或、_之副作用。—般來說，細胞内誘導藥物自載體 釋可藉由4酶體中酵素或是吞噬小體酸鹼值改變造成載 體結構改變0日访 古 曰則巳有开多材料被研發與合成以應用於細 胞内藥物傳輪。然而，物才料由於具強烈帶電性或具疏 ^〖生在體内使用時則會由單核球巨噬細胞系統（Μ”）所辨 識，、捕捉，而難以到達腫瘤組織達到藥物控制釋放之效 10 200817456 用。也因此，若要利用細胞内藥物傳輸方式治療癌症，親 水性分子結構於微胞或粒子載體表面是非常重要的。 本發明之一實施例係製備一具有多功能性殼/核之新 穎複合型微胞，係由一具有環境應答接枝共聚合物：聚（N-異丙基丙烯酸醯胺-CO -曱基丙烯酸）_g_聚乳酸交醋） (poly(N-isopropyl acrylamide-co-methacryl acid)-g-poly(AL-lactide))(簡寫為 P(NIPAAm-co-MAAc)-g-PLA) ’與兩雙團聯共聚合物：曱氧 基聚（乙二醇）-b-聚（LU-乳酸交酯）（meth〇xy p〇ly(ethylene glyC〇l)-b-P〇ly(D，L-lactide))(簡寫為 mPEG_pLA)與聚（八乙 基-2-噁唑琳-b_聚（AZ-乳酸交酯）（p〇ly (2-ethyl-2-〇Xaz〇line)-b-p〇ly(Az]actide))(簡寫為 PE0z_PLA)共同組成’此奈米結構能完整隱蔽高負電性之 接枝共聚合物於内核並使殼核結構呈現多功能性。此多功 能性複合型微胞應用於細胞㈣物傳輸上顯示藥物釋放行 為與微胞之功能性具強烈相關性。此外，複合型微胞外殼 隱蔽性亦壯料性造成複合型微胞與接枝共聚合 物（P(NIPAA㈣。_MAAe)_g_PLA，陳AAm]/[MA圳/[pla] 一 .9 ·2·5 mol/mo1)所形成之微胞相比較，複合型微胞 顯示較高之藥物活性與較低 ^ 、奴低之材枓毒性。本實施例不僅提 出一全新由雙團聯-接枝妓平人古 ，、來a阿分子糸統所構成之微胞 I口構，並且k供一由一接枝妓 _ 文/、♦合咼分子與一雙團聯共聚 合高分子或多雙團聯丘平人古 /、z 口呵/刀子所製備之多功能性微胞 概念以應用於藥物傳遞上。 .200817456 本發明之另一實施例係製備一具有多功能性微胞以應 用於癌細胞標的、分佈顯影、以及抗癌藥物傳遞上，係由 一具有環境應答接枝共聚合物 P(NIPAAm-co-MAAc)-g-PLA、一 雙團聯共聚合物 mPEG_PLA、以及兩功能性雙團聯共聚合物半乳胺糖

(galactosamine)-PEG-PLA (簡寫為 Gal-PEG-PLA)與螢光異 硫氰酸鹽（fluorescein isothiocyanate)-PEG-PLA (FITC-PEG-PLA)所共同組成。多功能性微胞可藉由 asial〇glycoprotein (肝癌細胞）_Gal (多功能性微胞）之受器 調和標的機制（recept〇r-mediated tumor targeting mechanism)準確辨識肝癌細胞。細胞内呑後之酸驗環境改 變破壞多功能性微胞内部結構造成藥物釋放，並進而增加 其對肝癌細胞之毒殺性。而多功能性微胞之顯影功能可利 用，、輛焦顯从鏡（Confocal laser scanning microscopy， CLSM)清楚觀察其於細胞内之分佈。藉由小心設計與精準 的刼控分子組成，本發明之高分子型微胞可同時廣泛應用 於癌症診斷、癌症辨識、與癌症治療上。 本發明可藉由以下幾個實例加以了解，而這些實例僅提 供说明而非限制本發明之範圍。 實例一： 材料 外消旋乳酸交酯（£U_Lactide)與曱基丙烯酸 (methacrylic acid，簡寫為 maAc)訂購自 Lancaster 〇 對甲笨 12 200817456 石黃酸甲酯（Methyl p-toluenesulfonate，簡寫為 MeOTs)、辛 酸亞錫（stannous octoate，簡寫為Sn(Oct)2)、甲基丙稀酸經 乙基酯（2-hydroxyethyl methacrylate，簡寫為 HEMA)、祐 (pyrene)與偶氮二異丁腈（2,2、azobisisobutyronitrile，簡寫 為ΑΙΒΝ)δ丁賭自Aldrich。N-異丙基丙稀酿胺（N-Isopropyl acrylamide，簡寫為NIPAAm)與乙基噁唑琳 (2-ethyl-2-〇xaZ〇line)訂購自 TCI。曱氧基聚乙二醇（mPEG， ， 重量平均分子量（Mw) = 5000 Da)訂購自Sigma。外消旋乳 酸交酯使用前以四氫吱喃（tetrahydrofuran，THF)再結晶兩 次。N-異丙基丙烯醯胺與偶氮二異丁腈使用前分別以正己 烧（hexane)與丙酮（acetone)進行再結晶。甲基丙烤酸與甲基 丙烯酸羥乙基酯使用前以減壓蒸餾進行純化。乙基噁唑琳 與對甲苯績酸甲酯使用前以氫化鈣（CaH2)進行除水後再減 壓蒸餾純化。 、P(NIPAAm-co-MAAc)-g_PLA (接枝 I，G1)接枝共聚合物之 製備 將已純化之外消旋乳酸交酯（AZ_lactide) (4 g)、hema (0.26 g)及除水之甲苯（5 mL)置於圓底雙頸瓶中，連接於真 空管系統下除水除氧。於10(rc下單體完全溶解並加入觸媒

Sn(OCt)2 (1 wt%)，在氮氣環境下進行陽離子開環聚合反 應。反應進行16小時後加入〇] N甲醇K〇H (methan〇iic KOH)終止反應。產物經己烷再沉澱純化、矽膠管柱除去鹽 類及不純物，可得PLA-EMA (Mn = 2〇〇〇)。將定量pla_ema 13 200817456 (〇·3 5 g)、NIPAAm 單體（1.15 g)、MAAc 單體（〇·16 g)及起 始劑AIBN (0.023 g)置於雙頸圓底燒瓶中，加入丙酮（15 mL) 溶解反應物並通入氮氣。於70°C下進行自由基聚合反應共 24小時。反應完成後以h20及乙醚分別進行再沉澱去除未 反應兩次’經乾燥後可得接枝共聚合物 P(NIPAAm-co-MAAc)-g-PLA (接 枝 I， G1) ([NIPAAm]:[MAAc]:[PLA] = 84 : 5·9 : 2·5 mol/mol)。 mPEG-PLA (團聯I，B1)雙團聯共聚合物之製備 將已純化之外消旋乳酸交酯(1 g)、mPEG (10 g，Mw = 5 000 Da)及除水之曱苯（4 mL)置於圓底雙頸瓶 中，連接於真空管系統下除水除氧。於i 3 〇°C單體完全溶解 下加入觸媒Sn(OCt)2 (1 wt%)，在氮氣環境下進行離子開環 聚合反應。反應進行1 6小時後加入〇· 1 N甲醇KOH終止 反應。產物經由二氯甲烧與二乙醚（diethyl ether)之混和液 在低溫下進行結晶，並乾燥可得雙團聯共聚合物 mPEG-PLA (團聯 I，Bl) ([EG]:[LA] = 113:7 mol/mol)。 PEOz-PLA (團聯II，B2)雙團聯共聚合物之製備 PEOz-PLA之合成乃是修飾舊有的反應程序[G H Hsi^， C.Ch.Wang，C.L.Lo，C.H.Wang，J.P.Li，J.L.Yang，Int· J· Pharm· 20 06, 3 17, 69]，其步驟如下。將起始劑Me〇Ts (0.232 mg)置入圓底雙頸瓶中，連接於真空管系統下除水除 氧’再加入丙稀腈（3 0 mL)並控制反應溫度於1⑽。◦。加入 14 200817456 已除水之單體乙基噁唑啉（10 mL)迴流反應3〇小時。反應 終止後加入〇.丨N曱醇K〇H終止反應。產物經乙醚再沉澱 純化、秒膠管柱除去鹽類及不純物，並乾燥可得pe〇z_〇h。 將PE0z (2 §)與外消旋乳酸交酯（0.426 g)以Sn(OCt)2 (1 Wt /°)進行離子開環聚合反應。控制反應溫度在1 3 0°C迴 流’反應1 6小時。反應完成後加入〇·丨n曱醇KOH終止 反應，並經乙_再沉澱純化可得雙團聯共聚合物PE〇z_pLa (團聯 II，B2) ([E〇z]:[LA] = 52.5:9.7 mol/mol)。 共聚合高分子化學結構與數目平均分子量之鑑定乃是 利用核磁共振光譜儀iH-NMR (AMX_5〇〇, Bruke〇。共聚合 咼刀子之I 5度分佈性指數乃是利用凝膠滲透層析儀（GPC) 測里GPC流動相為二甲基曱醯胺（N，N_dimethylf〇rmamide， 簡稱DMF)，流量為i ml/min，測量溫度為4〇它。共聚合 高分子之臨界微胞濃度（critical micelle c〇ncentmiQn， ' CMC)鑑定是以芘為疏水性染劑，螢光光譜儀於激發光譜 393 nm下。觀察最而濃度之樣品與對低濃度之樣品其在 330-340 nm之最高螢光強度，並以此強度之比值（約 133 7.5/133 5)對濃度對數座標作圖，曲線底部與反曲點兩直線 外插交叉點相對之濃度定義為臨界微胞濃度。表1列出各 共聚合高分子之鑑定結果。 15 200817456 表1 Mn [Da] 親水性鏈段 Mn [Da] 親脂性鏈段 聚合度分佈 CMC [g/mL] 接枝I 9970 6150 1.24^ 1.27 χ ΙΟ-6 團聯I 5000 500 1.0^^~~ 8.39 x 10° 團聯II 5200 700 1.70 x 10-6 複合型奈米微胞之製備 將固定濃度之接枝I共聚合物（〇· 1 3 M)溶解於DM SO 中，分別加入不同濃度之團聯I共聚合物，均勻混合後置 入透析袋（MWCO 6000 〜8000，SpectrumLabs，Inc·)，於室 溫下母2〜3小時更換純水一次，共進行4 8小時以製備 G1B1複合型奈米微胞。冷凍乾燥（Het〇_H〇lten a/S，

Denmark)後收集產物進行分析。將固定濃度之接枝Σ共聚

合物（0·13 Μ)與團聯I共聚合物（0.20 μ)溶解於DMSO 中，分別加入不同濃度之團聯Π共聚合物，均勻混合後置 入透析袋（MWC0 6000 〜8000, SpectrumLabs，Inc·)，於室 溫下母2〜3小時更換純水一次，共進行4 8小時以製備 G1B 1B 2複合型奈米微胞。冷凍乾燥後收集產物進行分析。 圖1A係G1B1複合型微胞在不同團聯I雙團聯共聚合 物組成下其平均粒徑大小與粒徑分佈圖。G1Bi複合型微胞 製備過程中接枝I接枝共聚合物濃度皆固定於1〇 〇 mg/L。 圖1B係G1B1B2複合型微胞在不同團聯π雙團聯共聚合 物組成下其平均粒徑大小與粒徑分佈圖。G1B1B2複合型微 胞製備過程中接枝I接枝共聚合物濃度皆固定於1〇 〇 mg/L，團聯I雙團聯共聚合物濃度皆固定於5.625 mg/]L。 16 200817456 表2列出圖1A與圖1B之複合型微胞其組成接枝I、團 聯I與團聯II之濃度。 表2 G1 (mg/L) B1 (mg/L) B2 (mg/L) G1 : B1 ： B2 = 33.9 : 55.7 : 10.4 mol/mol 10.0 5.625 v O / 1.125 G1 : B1 = 50 ： 50 mol/mol 10.0 3.15 二組成G1B1B2複合型奈米微胞（G1 :Β1 :Β2 = 33·9 : 55·7 : 10.4 mol/mol)藉由疏水性高分子鏈段pla聚集與排 列，自我組裝成為微胞結構。將微胞固定濃度（〇1 mg/mL) 分散於生理時鹽水（phosphate buffer saline，簡稱PBS)中經 由動態光散射儀（DLS)觀測其粒徑為182.3 ±1.5 nm，且粒 徑分佈指數（polydispersity index，PDI)為 0.038 土 0.014,具 有均一粒徑大小與狹小分佈。以都普勒顯微電泳法 (Zetasizer 3 00OHS，Malvern)量測複合型微胞於 pbs (〇· 1 mg/mL)中之界面電位值，用以判斷雙團聯共聚合物對於複 合型微胞内核之隱蔽程度。並以接枝共聚合高分子所形成 之接枝I微胞作為比較，其界面電位經量測為_丨5 · 5 土 〇. 9 mV。複合型微胞之界面電位為-7·8 土 ι·3瓜又，内核之高負 電性MAAc已由外殼結構mPEG與pe〇z所遮蔽。複合型 微胞之殼核結構最直接證據可經由醋酸鈾醯（uranyl acetate，2 wt %)對MAAc染色後以穿透式電子顯微鏡（TEM; Hitachi H-600 microscope, accelerating voltage = 100 kV) 17 200817456 所觀測，如圖2所示。由圖2可之染色區域分佈於内核， 亦即内核由接枝I所組成，而外殼無染色區域則由mPEG 與PEOz所組成。此外，複合型微胞之表面型態可由原子 粒顯微鏡（AFM)所觀測。其結果顯示G1 b 1 b2複合型微胞粒 徑大小均一且為球形，粒徑大小與動態光散射所得結果相 符合。 雙團聯共聚合物對於複合型微胞形成之影響乃由不同 比例組成之G1B1複合型微胞與G1B1B2複合型微胞進行 探时。二組共聚合咼分子具有不同之臨界微胞濃度：團聯 I之臨界微胞濃度遠大於團聯Π與接枝I (表1)。當固定濃 度之接枝I與不同濃度之團聯I混合製備複合型微胞時， 各不同比例組成之G1B 1複合型微胞之粒徑皆約丨6〇 nm (如圖1A所示），且小於接枝z微胞與團聯j微胞。G1Bl 複合型微胞之粒徑分佈皆呈現窄分佈。當團聯π加入一固 定濃度之G1B1時（團聯Π臨界微胞濃度接近接枝I臨界微 、 胞濃度但小於團聯I臨界微胞濃度），G1B1B2複合型微胞 之粒徑與團聯II之加入無關（如圖1B所示），且小於各單一 組成微胞或G1B2複合型微胞（33〇·2 土 〇·9 nm; PDI = 〇 〇72 ± 0.011)，但卻與G1B1複合型微胞相近。然而，當團聯π 加入之莫耳含量超過〇·54時則無法形成微胞。這些結果顯 示高臨界微胞濃度之共聚合高分子決定複合型奈米微胞之 粒徑大小。也就是說在本系統中，團聯1的存在可調控與 控制複合型微胞之形成，以及控制與降低微胞之粒徑大小。 來（Ν-異丙基丙烯酸醯胺）（p〇ly(N_is〇p⑺ 18 200817456 簡稱（PNIPAAm))為一水溶性且親水之高分子，且具有溫度 敏感性質。其低溫臨界溶液溫度（LCST)為28-35°C之間。如 溫度低於其低溫臨界溶液溫度時，高分子呈現溶解狀態； 而溫度高於低溫臨界溶液溫度時則呈現聚集狀態。若於 PNIPAAm導入親水材料如MAAc後，則破壞PNIPAAm其 異丙基基團之聚集能力，因而提升共聚合物之相轉移溫 度。而本發明以具有解離能力之MAAc提高材料之相轉移 溫度，並同時賦予酸鹼應答能力。在酸性環境下， P(NIPAAm-co-MAAc)會產生聚集與沉澱，這是由於MAAc 質子化降低P(NIPAAm-co-MAAc)之親水性並使其低溫臨 界溶液溫度降回至32°C，此酸鹼應答性與溫度應答性是具 有相關聯性。在先前研究中顯示接枝I微胞具有在酸性且 高溫環境下產生微胞結構改變之性質（C. L. Lo, K. M. Lin， G. H. Hsiue，J. Controlled Release 2005，104，477) 〇 圖 3 顯 示 G1B1B2 複合型微胞（G1 : B1 : B2 = 33·9 : 55·7 : 10·4 mol/mol)於酸性環境下（pH 4.0)隨溫度變化其結構改變之 情形。複合型微胞結過破壞乃是以芘為疏水性染劑，以螢 光光譜儀觀察芘分子之乃/八變化。芘溶液則作為對照組。 由於芘分子其分子對稱性或π電子雲會受所處極性及環境 擾動（perturbation)之影響，會使第一根放射光譜（/;)產生巨 烈之變化，而相較於其餘四根不同波長之放射光譜則無明 顯之改變，因此在微胞形成機制探討上為一常使用之染 劑，並以/; / /3代表芘所處環境之改變（K· Kalyanasimdaram J. K. Thomas，J. Am. Chem. Soc. 1997, 99, 2039)。/// /3 越 19 •200817456

，7/ / L越面，即表示祐所 祐溶液之/ /3值由於熱 •74。對於複合型微胞在pH 低，即表示芘所處環境極性越低 處環境極性越高。如圖3所示， 消耗隨著溫度升高由1 · 8 1降至1 4.0環境中 1.25 當溫度高於37X：時祐之八//3值快速由 升至1.46，表示芘環境由複合型微胞内部極性較低環境因 微胞破壞後接觸環境極性較高之溶液。 本發明另外以飛行時間二次離子質譜儀（time_〇f_fHght secondary i〇n mass spectr〇metry，簡稱 t〇f_sims)分析複 合型微胞之結構破懷前與結構破壞後之差異。複合型微胞 之結構破懷前與結構破壞後表面化學結構組成分別以正、 負離子進行分析。由二次離子質譜儀分析顯示接枝I由於 結構破壞顯露於外。複合型微胞之結構破懷前與結構破壞 後亦以醋酸轴醯（2 wt %)對MAAc染色，以穿透式電子顯微 鏡（TEM)觀測結構差異。如圖4A與4B所示，G1B1B2複合 型微胞（Gl : Β1 :Β2 = 33·9 : 55.7 : 10.4 mol/mol)在結構破

壞後已無明顯之殼核結構。 實例二： 本實例係利用接枝共聚物p(NIPAAm_co-MAAc)-g_PLA 與雙團聯共聚合物mPEG-PLA混合自組裝形成複合型微胞 用以包覆疏水性抗癌藥物小紅莓（doxorubicin，簡稱 Dox)。血液循環時，藥物可被包覆於内核而不致洩出造成 副作用。 複合型微胞包覆抗癌藥物D〇x相同以透析法（dialysis) 200817456 製備。其步驟與實例一相似。將 P(NIPAAm-co-MAAc)-g-PLA (接枝 I)共聚合物（20 mg)與 mPLA-b-PEG (團聯I)共聚合物（2 mg)溶解於DMSO/DMF (2 mL/8 mL)溶液中，加入已混合之Dox-HCl (20 mg)與三 乙胺(triethylamine，TEA，0.3 mL)混合液，使Dox變成疏水 性以利微胞内核攜帶。先攪拌2小時後，再以透析膜（MWCO 6000-8000)進行透析，每2小時換水一次，共透析72小時。 將透析袋内產物收集冷凍乾燥後，保存於4 °C冰箱。藥物 包覆量之評估乃是將上述複合型藥物微胞溶解於DMSO 中，至其結構溶解後，以超過濾裝置（MWCO 1000)分離藥 物與高分子，再以UV/Vis於485 nm測量Dox之吸收。將 吸收值内插入Dox檢量線換算藥物於複合型微胞中實際含 量。藥物含量估算公式如下：藥物含量（％ w/w) = (藥物於複 合型微胞重量）/(藥物於複合型微胞重量+高分子於複合型 微胞重量）X 1 0 0。 複合型微胞包覆抗癌藥物Dox經AFM觀察其型態呈現 球形，且粒徑大小約1 6 5 nm。 藥物釋放行為探討。複合型藥物微胞定量置於不同酸鹼 值之緩衝溶液中（50 mg/L)，於37°C或25°C下固定時間以超 過濾裝置（MWCO 10000)取樣，並以紫外線光譜儀（UV/Vis) 分析藥物濃度。對照藥物包覆率計算定時間下藥物釋放量 藉以探討複合型藥物微胞之酸鹼應答行為對於藥物釋放之 影響。緩衝溶液酸鹼值分別為pH 7.4磷酸緩衝溶液與pH 5.0琥珀酸緩衝溶液。UV/Vis於485 nm測其吸收值。 21 200817456 甘、月已母木又測试。細胞毒殺實驗（gr〇wth inhib出⑽assay) 、J疋刀別加入藥物、接枝1藥物微胞與複合型藥物微胞， 藥物濃度介於卜⑽_L，計算不同時間與濃度下細胞 、存舌率比較藥物、接枝I藥物微胞與複合型藥物微胞 對HeLa癌細胞毒殺的效果。平均標準差（n = 6卜將 人類子宮頸癌細胞以Dulbecc〇,s m〇dified Eagle，s㈤以匕㈤ (簡稱DMEM)培養基培養在37，5 % c〇2的恆溫培養箱 中至、、、田胞生長至一定數目後，分盤至96 well培養盤中培 養，細胞數為5 xlO3 ceii/mL。約8小時細胞貼附後，移除 培養基並加入含有不同濃度之藥物、接枝！藥物微胞及複 合型藥物微胞培養液。48小時後，以比色分析法（MTT assay) 進行分析。此外，而無藥物之接枝共聚合物微胞與複合型 微胞亦進行材料毒性分析，步驟與上述方法相同。 内吞作用評估。藥物及複合型藥物微胞在細胞内之分佈 情形係利用共輛焦顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM)進行觀察。在6孔培養盤中置入蓋玻 片’蓋玻片上黏貼加強圈標示觀測範圍，每孔種植1 x ；[ 〇5 個細胞。至細胞貼附後，加入藥物濃度1 〇 pg /mL之Dox 與複合型藥物微胞培養液。於固定時間下移除培養基，以 PBS 清洗後加入 LysoTracker DND-26 2 mL (50_70 nM 溶 於DMEM培養基）再次培養0.5小時。以PBS及0·1 % Triton X-100 PBS清洗細胞。細胞試片的固定以三聚曱醛 (paraformaldehyde，4 wt%)之 PBS 溶液反應 30 分鐘，再以 22 200817456

PBS清洗後，於加強圈範圍内滴人8q %甘油（giyeer〇M PBS溶液15叫並貼覆於載玻片避光保存。共輛焦顯微鏡 物鏡設定為40X; Dox激發雷射光波長485 nm，放射光波 長590 nm ; LysoTracker激發雷射光波長5〇4 nm，放射光 波長5llnm。掃猫所得之影像與相位差顯微鏡影像重疊以 判斷Dox釋放所在位置。 複合型藥物微胞、經UV/Vis;則量可知其藥物含量約19 wt.%。藥物釋放測試乃利用透析膜分離藥物與微胞。圖$ 顯示在不同pH環境下藥物自複合型藥物微胞釋放情形。複 合型藥物微胞於pH 5.0緩衝溶液下相較於pH74緩衝溶液 下具有明顯藥物釋放差異。且在pH 5.〇緩衝溶液下於h c與3rc藥物釋放行為亦明顯不同。在pH 緩衝溶液與 25 f下’初期前2小時具有一快速藥物釋放特性，藥物釋 放量達25 Wt. %左右。而後藥物釋放行為隨時間之增長並 無增加㈣，此乃由於複合型微胞内核與外殼有一二氫 鍵作用力，而此氫鍵仙造成微胞壓縮使部㈣物受播壓 而W，_造成初期有25%之藥物釋放。但隨時間增長至％ :時’藥物仍保存於複合型藥物微胞内核，表示微胞内核

;。構並未因氯鍵作用力而產生結構破壞。另—方面，在pH •緩衝溶液與37°C下，初期2 ^、昧g卩古 時即有5〇Wt%左右之藥 里，此乃由於微胞結構破壞所造成。藥物釋放結果 烈顯示微胞結構破壞控制藥物釋放行為。 。 細胞毒殺測試用以瞭解複合型藥物微胞對於癌細胞生 長的抑制效果以及對癌細胞之毒殺能力。研究中⑴除了已以複 23 200817456 合型藥物微胞進行測試外，D〇x · HC1與接枝I藥物微胞亦 共同進行觀察以作為對照組。將不同濃度的複合型藥物微 胞、Dox.HCl、以及接枝I藥物微胞分別與2xl〇4 HeLa細 月匕/、同^養以觀察細胞存活情形。如圖6所示，於4 8小時 培養中Dox.HCl具有較高之毒殺能力，其IC5〇約為〇.8 Kg/mL。而複合型藥物微胞與接枝I藥物微胞其IC5G則分別 為3 pg/mL與6 pg/mL。其原因乃在於d〇x · HC1小分子是 以擴散方式進入細胞並直接毒殺癌細胞，因此其作用速度 較快；而複合型奈米藥物微胞與接枝I藥物微胞則是藉由 胞飲作用進入細胞後，在吞噬小體室（end〇s〇mal compartments)或溶素體室（iyS〇s〇mai c〇mpartments)藉由環 境酸化改變微胞結構後將藥物釋離。此外，48小時培養條 件下，複合型奈米藥物微胞與接枝〗藥物微胞之藥物釋放 S約達總量之65 %與60 %。相較於d〇x.HCi藥物對細胞 作用量較低，因而其細胞毒殺能力較差。另一方面，由於 v接枝I藥物微胞外殼帶強負電性，因此其進入細胞能力較 差，故其細胞毒殺效果相較於複合型奈米藥物微胞與 HC1而言呈現較差之能力。$ 了區隔細胞毒性來源是源自 載體或是藥物，不含藥物之複合型微胞與接枝"敬胞亦對 HeLa細胞進行毒性測試。在48小時培養中，複合型微胞 與接枝I微胞隨著濃度增加對細胞毒性明顯增強。複合型 微胞之IC5〇為2.5 mg/mL ;而接枝J微胞則為15 灿。 顯不複合型微胞毒性低於接枝I微胞，此乃由於強負電由 mPEG所遮蔽。此外，由藥物濃度換算载體濃度可知，接 24 200817456 枝i微胞所造成之細胞毒性亦高於複合型奈米微胞。亦即， 接枝I微胞在癌症治療與細胞内藥物傳遞之應用性較差。 導入雙團聯共聚合物進入微胞後，可穩定微胞結構以及隱 蔽負電性材料如MAAc，不僅增加細胞吞噬量及降低細胞 毒性’亦可克服聚離子型高分子（p〇lyi〇ns)在生醫使用上之 限制。 ， 複合型藥物微胞與藥物於細胞内分佈與藥物釋放行為 以共軛焦顯微鏡針對HepG2細胞（人類肝癌細胞）與複合型 藥物被胞或藥物共同培養進行觀察。加入LysoTracker可觀 察酸性胞器或受酸化胞器之分佈位置，藉以判斷複合型藥 物微胞在細胞内之分佈與藥物釋放。D〇x.HC1不論在1小 日才或8小時與HepG2培養下皆分佈於細胞核内。而 LysoTracker則分佈於細胞質與細胞核，其原因是由於ϋ〇χ · HC1酸化細胞所致。複合型藥物微胞在初期1小時培養時， 其所包覆之Dox釋放於細胞質内，且LyS〇Tracker所顯示 之綠光亦分佈於此區域。而8小時培養時，D〇x不僅分佈 於細胞貝，其亦進入細胞核内，LyS〇Tracker則僅分佈於細 胞夤。這顯示複合型藥物微胞經由胞飲作用進入細胞後， 細胞内吞筮小體至（end〇S〇mal C〇mpartments)或溶素體室 (lysosomal c〇mpartments)酸化造成微胞結構破壞並釋出藥 物，因此在初期1小時培養下藥物僅分佈於細胞質。而8 小時後，D〇x進入細胞核，且微胞仍持續釋放藥物，因此 Dox亦分佈於細胞f。相似之結果亦可在中國倉鼠細胞 25 200817456 (CHO-K1)中觀察到。 複&型藥物微胞於本實例中可藉由細胞内酸驗環境改 變而快速結構破壞以釋放藥物，其亦有一親水性外殼用以 蔽南f電性材料及增加材料之溶解度。 實例三： 同實例一之步驟，圑聯ΠΙ (mPEG5〇〇〇_pLAi_，分子量 分佈為1.15，臨界微胞濃度為16 mg/L)與團聯^ (mPEGwoo-PLAim，分子量分佈為12〇，臨界微胞濃度為 5.4 mg/L)共聚合高分子之合成是將mpEG (Mn 5〇⑼）與外 消旋乳酸交酯（AZ-lactide)以錫觸媒為起始劑進行開環聚 合反應而得。這些高分子具有相同之化學結構，但不同之 組成比例。

本實例是利用具有不同分子量長度與不同臨界為胞濃 度之雙團聯共聚合物（團聯I、團聯Ιπ或團聯Iv)分別與— 接枝共聚合物（實例一所製備之Graft)製備複合型微胞，以 了解雙團聯共聚合物在複合型微胞製備上對於其型態與結 構之影響° f先’-接枝共聚合物與—雙團聯共聚合物共 同溶解於DMSO/DMF (4/1 v/v)混合溶劑中以製備高分切 液。混合溶劑之使用乃在於此溶劑可製備較小粒徑之複合 型微胞。接枝共聚合物於溶劑中之濃度固定於 接枝共聚合物與雙團聯共聚合物組成比$丄：9。複人型微 胞則同實例-之步驟以透析法進行製備。所製備之：組兩 組成複合型微胞（分別為接枝Ϊ與團聯I複合型微胞、接枝 26 200817456 I與團聯III複合型微胞、以及接枝^與團聯ιν複合型微胞） 以TEM觀察其殼核結構與粒徑大小可得到下面三點結論： (1)本貝例中對於所有複合型微胞而言，内核結構經 染色可知其組成為接枝共聚合物，而外殼結構則由親水性 同刀子mPEG所組成。（2)複合型微胞内核半徑（R)隨著雙 團聯共聚合物疏水性鏈段PLA之分子量增加而減少 (Rpla· > RPLA1G88 > RPLA175G)。（3)複合型微胞粒徑大小隨 著雙團聯共聚合物疏水性鏈段PLA之分子量增加而增加。 短鏈段PL·A可形成較小粒徑之複合型微胞。 複合型彳放胞乃測试其在血清或血清蛋白存在下之穩定 性。此測試選用接枝I (25 mol0/〇)與團聯IV (75 m〇1%)所組 成之複合型微胞。將複合型微胞懸浮於含4 wt· %牛灰清白 蛋白（Bovine serum albumin，BSA)之生理食鹽水中 mg/mL)，於37°C固定時間下以動態光散射儀觀察複合型微 胞粒佐之麦化’ G。動悲光散射測量模式設定為CQNTIN。 而未與B S Α混合約之複合型微胞溶液粒徑以動態光散射觀 測為心。接枝I微胞則作為對照組。粒徑變化比率則是將 G除以。’ G·/心。由結果可知複合型微胞在72小時内皆呈 現穩定狀態’這是由於微胞外殼之mPEG阻擔血清蛋白的 吸附而避免聚集產生。此現象顯示複合型微胞具有長時間 血液循環特性。 實例四·· 具標的功能之雙團聯共聚合物Gal-PEG3_-PLA83() 27 200817456 (Gal-PEG-PLA，[Gal]:[PEG]:[LA] = 8·4·:7·6:84 mol/mol)與 具顯影功能之雙團聯共聚合物fitc-peg34()()-pla830 (FITC-PEG-PLA，[FITC；h[PEG；h[LA] = 4:8:88 mol/mol)乃 是利用硫醇-醯胺偶合反應（thiol-maleimide coupling reaction)製備而成。 F7TC-凡EG-PZ乂雙團聯共聚合物之合成。PLA-NH2。首 先將N-Boc-L-丙胺酸醇（alaninol)以鉀/萘 (potassium/naphthalene)處理形成金屬烧氧化物 (N_Boc-L-alaninol-OK)。將外消旋乳酸交酯（Z),L-lactide) (2 g)溶於甲苯（2 mL)中以 N-Boc-L-alaninol-OK (0.35 g)為起 始劑，於1 00°C下反應1 2小時。反應完成後以醋酸終止反 應，再以乙醚進行再沉澱可得高分子PLA-NHBoc。而後 PLA-NHBoc (2.1 g)溶於蟻酸（20 mL)及氯仿（20 mL)混合溶 液中於室溫下處理9小時後以乙醚再沉澱。產物（1.5 g)以 三乙胺（20 mL)及氯仿（20 mL)混合溶液於室溫下處理8小 時去質子後，再以乙醚進行再沉澱則可得pla-nh2。 PLA-SH。將PLA-NH2 (2 g)溶解於乙腈（10 mL)中，加入過 量之2-亞胺基硫烧氯化氫物（2-iminothiolane hydrochloride) (0.45 8 g)後，並添加適量的TEA-緩衝液（濃度為50mM，Ph 8.0)於室溫下反應15小時。未反應之2-亞胺基硫烷 (2-iminothiolane)以 5 mM HC1 溶液與 1 mM HC1 溶液多次 進行透析後去除，冷凍乾燥或真空乾燥後即可得PLA-SH。 馬來醯亞胺-PEG-NH2。N-甲氧羰基馬來醯亞胺 (N-Methoxycarbonylmaleimide) (0·2 g)溶解於 DMSO (10mL) 28 200817456 後於室溫下加入聚氧伸乙基雙（胺）（polyoxyethylene bis(amine)) (1 g)水溶液中反應6小時。反應完成後，在-20 °C下以二氯曱烷與乙醚混合溶液（1 / Γ v/v)進行再結晶可得 馬來醯亞胺-PEG_NH2。PLA-PEG-NH2。PLA-SH (0.8 g)溶 解於 0.1 M Tris/丙烯腈（1/3 v/v) (aq，pH 6.5) (15 mL)中， 而後於室溫下加入馬來醯亞胺-PEG-NH2 (2 g) Tris溶液 (1 0 mL)反應6小時。反應完成後，分別以生理食鹽水及去 離子水進行透析，再進行冷凍乾燥。乾燥之產物溶解於二 氯甲烷後以乙醚進行再沉澱去除PLA-SH可得 NH2-PEG-PLA〇 FITC-PEG-PLA〇 NH2-PEG-PLA(1 g)先溶 解於甲醇（40 mL)後，於室溫避光下加入FITC (0.15 g)反應 24小時。以0·5 M NaCl水溶液與去離子水進行透析去除未 反應物後，冷凍乾燥或真空乾燥後即可得FITC-PEG-PLA。 五G-PLd雙團聯共聚合物之合成。Gal-馬來醯亞 胺。N-甲氧羰基馬來醯亞胺（0.68 g)溶解於DMS0 (10 mL) 後於室溫下加入半乳胺糖氯化氫（galactosamine hydrochloride) (0·5 g)水溶液中反應6小時。反應完成後以 乙醚進行再沉澱可得Gal-馬來醯亞胺。PLA-PEG-SH。 PLA-PEG-NH2 (1 g)溶解於乙晴（15 mL)中，加入過量之2-亞胺基硫烧氯化氫物（2-iminothiolane hydrochloride) (0· 1 g)後，並添加適量的TEA-buffer(濃度為50mM，ρΗ8·0)於 室溫下反應15小時。未反應之2-亞胺基硫烷以5 mMHCl 溶液與1 mM HC1溶液多次進行透析後去除，冷凍乾燥或 真空乾燥後即可得PLA-PEG-SH。Gal-PEG-PLA。 29 200817456 PLA-PEG-SH (1 g)溶解於甲醇（15 mL)後再加入Gal_馬來醯 亞胺（〇·1 g)於室溫下反應24小時。以0·5 M NaCl水溶液與 去離子水進行透析去除未反應物後，冷凍乾燥或真空乾燥 後即可得Gal-PEG_PLA。 實例五： 本實例之多功能性複合型藥物微胞以透析法進行製 備。首先，抗癌藥物Dox溶解於DMSO/DMF (4/1 v/v)混合 溶劑後以過量三乙胺（1.2莫耳）中和HC1。再將接枝t (5〇 mol%)、團聯 iv (20 m〇1%)、Gal_pEG_pLA 〇5 m〇i%)、以 及FITC_PEG_PLA(15 mol%)溶解於藥物溶液中並進行透析 (MWCO 60〇〇-8〇00)。透析後進行冷凍乾燥或真空乾燥即可 得多功能性複合型藥物微胞。將複合型藥物微胞溶解於 DMSO後，藥物含量可經由紫外光光譜儀測得約3丨。 圖7顯示多功能性複合型藥物微胞經醋酸鈾醯（2 染色 後之TEM觀測圖。結果顯示功能性複合型藥物微胞具完整 之殼核結構，且其粒徑約16〇nm左右。由於巨大分子由腫 瘤血管穿透至組織須藉由血管開放間隙、血管細胞膜穴樣 内陷、或血管破洞缺損等。而其孔洞間隙大約38〇至Μ如m 間。本實例所製備多功能性複合型藥物微胞粒徑低於2〇〇 nm且適合藉由上述之孔洞間隙溢出血管。由文獻可知含 PEG覆蓋之微胞其粒徑大小影響到粒子於體内器官之分 佈’粒徑低於2 0 0 n m可僻备Λ睡磁、、風、奋α 士 j避光由胖贓過濾效應。粒徑大小亦 影響細胞内呑能力，粒徑大於$⑽ 了位人於500 nm之粒子需用籠不相關 30 200817456 胞飲作用（clathrin-independent end〇cyt〇sis)，而粒徑小於 200 nm之粒子則可藉由非特定籠相關程序(n〇n-specific Clathrin-dependent process)進入細胞。因此，本實例所製備 之多功能性複合型藥物微胞其粒徑約16〇nm，符合生理條 件所需之粒徑限制。 ' 多功能性複合型藥物微胞對於環境應答能力影響藥物 自微胞之釋放。圖8為容工士么匕α_ 口马夕功月匕性稷合型藥物微胞在ρΗ 7.4 與ΡΗ5.0緩衝溶液中之藥物釋放行為圖。於卩1174且叨 °c環境下，多功能性複合型藥物微胞在初期有15糾.％筚 物突釋（initiai burst)的現象。之後，幾乎無藥物自载體^ 出而保持-穩定藥物總釋放量。在pH 5 ()且抓環境下， 藥物釋放曲線可明顯區分為兩部分。初期兩小時内一快速 突釋現象約釋放35 wt.%藥物。而隨後藥物持續穩定釋放藥 物，約14〇小時後藥物釋放量達7〇败％。此藥物釋放行為 結果證實多功能性複合型藥物微胞具酸驗應答性，改變環 境之酸驗值可破壞微胞内核結構而釋放抗癌藥物。乂 本實例另以接枝I、團聯Iv、FITC_PEG_PLA、以及

Gal-PEG-PLA共同製備多功能性複合型微胞（不含藥物）， 製備方式上述相同。接枝！於多功能性複合型㈣主要扮 演ί哀境應答之功能，以達到藥物控制釋放之效果。團聯^ 於多功能性複合型微胞主要是控制微胞之殼核結構完整性 以及得到粒徑分佈均-之微胞。具螢光顯影功能之 FITC-PEG-PLA雙團聯共聚合高分子主要提供直接證據顯 示多功能性複合型微胞累積位置。具標的功能之 31 200817456

Gal PEG_PLA雙團聯共聚合高分子主要是辨識肝癌細胞表 面之接受器asial〇glyCopr〇tein以達到對癌細胞主動標的 (active tumor targeting)之功能。 此實例係將多功能性複合型藥物微胞於不同濃度下與 癌細胞共同培養，用關斷多功能性複合㈣物微胞對癌 細胞之生長抑制效果以及對癌細胞之毒殺能力。 作為對照組。在共同培養24小時與72小時後，可知d〇x.hci 之1C5〇(致使一半細胞死亡之濃度）約為l_2^/mL。而多功 能性複合型藥物微胞於24小時培養之IC5Q約為25

Pg/mL。而72小時培養下之1〇5〇約為4 ^/mL，與d〇x hci 相=近。另一方面，多功能性複合型微胞（不含藥物）於72 =時之之ICw為792 pg/mL。此結果顯示細胞毒性來自於 多功能性複合型藥物微胞之藥物釋放。 為了評估多功能性複合型藥物微胞在生物標誌應用上 之功能性，以共軛焦顯微鏡觀察多功能性複合型藥物微胞 與HeLa細胞共同培養6小時下之藥物釋放情形與累積位 置對於大部为欲胞載體而言，微胞載體藥物釋放觸發機 制接發生於呑噬小體而後釋放至細胞質。由共輛焦顯微鏡 觀察結果顯示HeLa細胞顯示綠色螢光（FITC)於細胞質，表 示多功能性複合型藥物微胞之累積位置。而紅色發光（D〇x) =累積於細胞質與細胞核中。於本實例中多功能性複合型 樂物微胞之傳遞途徑可清楚由FITC標記之微胞顯現。 實例六： 32 200817456 為了評估多功能性複合型藥物微胞對於腫瘤專一標的 性’由實例五製備之多功能性複合型藥物微胞與實例二之 複合型藥物微胞乃與人類肝癌HePG2細胞共同培養以觀察 細胞毒殺情形。 磨瘤#的從繹活。將HepG2細胞以DMEM培養基培養 在37 C，5 % C〇2的恒溫培養箱中，至細胞生長至一定數 目後，分盤至96 well培養盤中培養，細胞數為2 xl04 / well。約8小時細胞貼附後，移除培養基並加入含有不同 濃度之多功能性複合型藥物微胞及複合型藥物微胞培養液 於4°C或37°C下進行培養。共同培養2小時，再將含有藥 物微胞之培養液洗掉，加入新鮮之培養液於37t：下進行培 養24與48小日守。元成後’以台盼藍（trypanbiue)將細胞染 色’以相位差顯微鏡計算HepG2細胞之存活率。此外，在 咼濃度之半乳糖存在下（1 5 0 mM)亦重複相同實驗進行抑制 標的行為分析。 結果如圖9所示，於24小時共同培養下，多功能性複 合型藥物微胞與複合型藥物微胞於37°C下之細胞毒殺率大 於4。(： ’且多功能性複合型藥物微胞有較高之細胞毒殺率。 由於在4°C時細胞之胞飲作用會停止，因此進入細胞核之 藥物是由於Gal與細胞表面過度表現的接收器 asialoglycoprotein結合，而後於37〇c培養時進入細胞。而 在如兩小時即以37°C培養情況下，多功能性複合型藥物微 胞可藉由胞飲作用以及Gal表面接收器的結合進入細胞 内’因此其細胞毒殺性大於前兩小時以4 處理之細胞毒 33 200817456

殺性。而隨著時間赴具4 nA 1 長細胞的毒殺性越高。將半乳糖 (Galactose)加入系統 +礼糖 爭反庫，谇養倏杜你^夕力此性稷合型藥物微胞進行競 f反應^養條件與時間與上。 論24小時或48小時 ▲ ，、、、、口果如圖1〇,不 夕功能性複合型藥物微胞或 稷口 H★胞之細胞存活率皆大於無半 此競爭實驗可看出，夕 …、 系、冼 由 r ,β6/ι 出夕功此性複合型藥物微胞確實且有腫 瘤標的之功能。 s ® 功nrr實例六可知’多功能性複合型藥物微胞已成 備*成，並可用於癌症診斷與癌症藥物傳遞 M結果可知多功能性複合型藥物微胞呈現球型且 粒:大小約16〇nm，符合生理條件所需之粒徑限制。而腫 瘤才示的分析與共輕焦顯微鏡觀測結果顯示多功能性複合型 藥物微胞可藉由受器調和胞飲作用(recep一一 endocytGsis)進人細胞後顯現強烈細胞毒性。本發明旨在提 供二新概念’即是製儀一同時具有長時間血液循環、腫瘤 辨識、以及結合癌症診斷與癌症藥物控制釋放之理想微 胞。而若將多功能性複合型藥物微胞之：FITC置換為Cy5.5 等近紅外線染劑，將可應用於動物體内以評估多功能性複 合型藥物微胞之體内分佈與癌症治療效果。 圖示之簡單說明 圖1A顯示本發明實例一中G1B1複合型微胞在不同的 雙團聯共聚合物團聯丨的莫耳比下其平均粒徑大小與粒徑 分佈指數，其中G1B1複合型微胞製備過程中接枝共聚合 34 200817456 物接枝I的濃度皆固定於1〇·〇 mg/L。 圖1B顯示本發明實例一中GIB 1B2複合型微胞在不同 的雙團聯共聚合物團聯I的莫耳比下其平均粒徑大小與粒 徑分佈指數，其中G1B1B2複合型微胞製備過程中接枝共 聚合物接枝I的濃度皆固定於10.0 mg/L，雙團聯共聚合物 團聯I的濃度皆固定於5.625 mg/L。 圖2係本發明實例一中G1B1B2複合型微胞之穿透式 電子顯微鏡（TEM)的影像照片（標示刻度為500奈米）。 圖3顯示本發明實例一中GIB 1B2複合型微胞在固定 酸性環境（pH 4.0)，不同溫度下複合型微胞之芘（pyrene)分 子螢光光譜中振動鍵的強度比（/7//3)。 圖4A係本發明實例一中G1B1B2複合型微胞於結構破 壞前之穿透式電子顯微鏡（TEM)影像照片（標示刻度為2〇〇 奈米）。 圖4B係本發明實例一中G1B1B2複合型微胞於結構破 壞後之穿透式電子顯微鏡（TEM)影像照片（標示刻度為2〇〇 奈米）。 圖5係本發明實例二中複合型藥物微胞在不同酸性與 中性環境下，分別於25°C與37°C下之藥物釋放圖。 圖6係本發明實例二中複合型藥物微胞對於人類子宮 頸癌HeLa細胞之生長抑制能力圖，其中以自由D〇x及接 枝共聚合高分子所形成之接枝I藥物微胞作為對照組。 圖7係本發明實例五中多功能性複合型藥物微胞之穿 透式電子顯微鏡（TEM)影像照片。 35 200817456 於 圖 圖8係本1明實例五中多功能性複合型藥物微胞分別 37C下在11±(ΡΗ 5·〇)與巾性（ρΗ 7·4)環境之藥物釋放 多功能性複合型藥物微胞對人 48小時細胞生長抑制圖。以實 對照組。 圖9係本發明實例六中 類肝癌HepG2細胞之24與 例二之複合型藥物微胞作為 圖10係本發明實例4 人類肝癌HepG2細胞在$、、曲以力能性複合型藥物微胞對 24與48小時細胞生長扣^。度之半乳糖含量下（⑼祕）之 月包作為對照組。 |圖。以實例二之複合型藥物微 36 200817456 參考資料： [1] X. Gao, Y. Cui? R. M. Levenson, L. W. K. Chung, S. Nie, Nat. BiotechnoL 2004, 22? 969.

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[10] T. Liu, V. N. Nace, B. Chu5 Langmuir 1999, 75, 3 109. 37

Claims (1)

1. 200817456 十、申請專利範圍 1. 一種具殼核結構之高分子型微胞，其中該結構包含 一接枝共聚合高分子與一圑聯共聚合高分子，該接枝共聚 合高分子包含一主鏈及鍵結於該主鏈的一疏水性側鏈，該 團聯共聚合高分子包含一疏水性高分子鏈段與一親水性高 分子鏈段，其中該接枝共聚合高分子之疏水性側鏈聚集， 該團聯共聚合高分子之疏水性鏈段堆疊聯合在該接枝共聚 合高分子之聚集的疏水性側鏈上，且該團聯共聚合高分子 之親水性鏈段從其中突出裸露於外而形成殼核結構。 2. 如申請專利範圍第1項之高分子型微胞，其中該接 枝共聚合高分子的疏水性側鏈與該團聯共聚合高分子的疏 水性鏈段包含相同之重複單元。 3 ·如申請專利範圍第1項之高分子型微胞，其中該團 、聯共聚合高分子係雙團聯共聚合高分子，其包含該疏水性 高分子鏈段與該親水性高分子鏈段。 4·如申請專利範圍第3項之高分子型微胞，其中該疏 水性高分子鏈段之數目平均分子量介於500-2500，及該親 水性高分子鏈段之數目平均分子量介於2000_ 10000。 5.如申請專利範圍第3項之高分子型微胞，其中該團 聯共聚合高分子之疏水性鏈段為生物可分解吸收。 38 200817456 6·如申#專利|&圍第5項之高分子型微胞，其中該團 聯共聚合高分子之疏水性鍵段為聚_、聚乳酸錢、聚乳 酸或聚己内S旨。 7·如申睛專利範圍第6項之高分子型微胞，其中該團 聯共聚合高分子之疏水性鏈段為聚乳酸交酯。 8·如申請專利範圍第3項之高分子型微胞，其中該接 枝共聚合高分子的親水性鏈段為聚丙烯酸酯，或酸鹼/離子 強度敏感型高分子，其中該酸鹼/離子強度敏感型高分子為 聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丁烯二酸（p〇ly(butenedi〇ic aicd))、聚組胺酸（polyhistidine)、或聚乙烯基咪嗅 (poly(vinyl imidazole)) 〇 9.如申請專利範圍第3項之高分子型微胞，其中該團 聯共聚合高分子之親水性鏈段為聚醚、聚乙二醇 (poly(ethylene glycol))、曱氧基聚乙二醇 (methoxy-poly(ethylene glycol))、或聚（2-乙基 _2-σ惡嗤 琳）（poly(2-ethyl-2-oxazoline))。 10·如申請專利範圍第3項之高分子型微胞’其中該雙 團聯共聚合高分子為甲氧基聚乙二醇-b-聚乳酸交酯 (methoxy-poly(ethylene glycol)-b-poly(AZ-lactide))。 39 200817456 11 ·如申請專利範圍第1項之高分子型微胞，其中該接 枝共聚合高分子的主鏈包含具親水性的第一重複單元，及 該疏水性側鏈鍵結於該第一重複單元。 12·如申請專利範圍第u項之高分子型微胞，其中該第 一重複單兀具有一羧基結構，及該疏水性側鏈為生物可分 解吸收。 13·如申請專利範圍第12項之高分子型微胞，其中該 接枝共聚合高分子的主鏈為聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚 丁烯二酸、聚組胺酸、或聚乙烯基咪唑。 14 ·如申請專利範圍第13項之高分子型微胞，其中該 接枝共聚合高分子的主鏈為聚曱基丙烯酸。 1 5 ·如申請專利範圍第12項之高分子型微胞，其中該 ^來合问分子之疏水性側鏈為聚酯、聚乳酸交酯、聚 乳酸或聚己内酯。 I6·如申請專利範圍第15項之高分子型微胞，其中接 ϋ 取 a /、來3高分子之疏水性側鏈為聚乳酸交酯。 如申請專利範圍第11項之高分子型微胞，其中該接 40 200817456 枝共聚合高分子主鏈進一步包含一第二重複單元，而該第 一重複單兀不同於該第一重複單元，其該第二重複單元應 答於溫度變化使該微胞的核崩毀。 18.如申請專利範圍第17項之高分子型微胞，其中該 接枝共聚合高分子的主鏈之第二重複單元為仏異丙基丙烯 醯胺（N-isopropyl acrylamide)單體所形成者。 1 9.如申請專利範圍第丨8項之高分子型微胞，其中該 接枝共聚合局分子的主鏈為N_異丙基丙烯醯胺與甲基丙烯 酸之共聚合高分子。 20.如申請專利範圍第i項之高分子型微胞，其中該高 分子型微胞粒徑大小為50-200 nm。 2 1.如申請專利範圍第3項之高分子型微胞，其中該雙 團聯共聚合高分子具有一連接於該親水性高分子鏈段的一 末端的末端功能性分子，及該末端功能性分子為可與腫瘤 細胞表面之受器（recept〇r)結合的配體（ligand)·。 22. 如申請專利範圍第21項之高分子型微胞，其中該 配體為半乳醣殘基（galactose residue)。 23. 如申請專利範圍第3項之高分子型微胞，其中該雙 41 200817456 團聯共聚合高分子具有一連接於該親水性高分子鏈段的一 末端的末端功能性分子，及該末端功能性分子為一螢光基 團（fluorescence group) 〇 24·如申請專利範圍第23項之高分子型微胞，其中該 螢光團基為螢光螢光異硫氰酸鹽（fluorescein isothiocyanate)。 25.如申請專利範圍第3項之高分子型微胞，其中該雙 團聯共聚合高分子具有一連接於該親水性高分子鏈段的一 末^0的末端功能性分子，及該末端功能性分子為一染劑 (dye) 〇 26·如申請專利範圍第25項之高分子型微胞，其中該 染劑為近紅外線染劑。 2?·如申請專利範圍第丨項之高分子型微胞，其中該結 構包含多個不同的團聯共聚合高分子，且每一個該團聯共 聚合高分子包含一疏水性高分子鏈段與一親水性高分子鏈 段。 28·如申請專利範圍第27項之高分子型微胞，其中該 多個不同的團聯共聚合高分子的每一個都是雙團聯共聚合 高分子，其包含一疏水性高分子鏈段與一親水性高分子鏈 42 200817456 段。 29.如申請專利範圍第28項之高分子型微胞，其中該 不同的團聯共聚合高分子之疏水性高分子鏈段具有一相同 之重複單元。 30.如申請專利範圍第28項之高分子型微胞，其中該 不同的團聯共聚合高分子之親水性高分子鏈段具有一相同 的重複單元。 31·如申請專利範圍第28項之高分子型微胞，其中該 不同的團％共聚合高分子之親水性高分子鏈段具有不同的 重複單元。 32·如申請專利範圍第28項之高分子型微胞，其中該 多個不同15聯共聚合高分子於親水性高分子鏈段末端連接 有不同的末端功能性分子。 3 3 · 士申明專利範圍第3 2項之高分子型微胞，其中該 末端功能性分子中的一個為可與腫瘤細胞表面之受體 (receptor)結合之配體（ligand)。 34.如申明專利範圍第33項之高分子型微胞，其中該 配體為半乳醣殘基。 43 200817456 請專利範圍第32項之高分子型微胞，其中該 末端功能性分子中的 個為螢 光基團 螢 36·如申請專利範圍第35 光基團為螢光異硫氰酸鹽^ 項之高分子型微胞，其中該 37·如申請專利範圍 末端功能性分子中的一 第32項之高分子型微胞，其中該 個為為染劑。 38·如申請專利範圍第 染劑為近紅外線染劑。 37項之高分子型微胞 其中該 39· —種複合型微胞結構，包含一功能 性外殼，其得、纟一接&共聚合高分子與一 聚合高分子自我組裝而成。 性内核與一親水 個或多個團聯共 40.如申請專利範圍第39項之複合型微胞社 由-接枝共聚合高分子與兩個或多個雙團聯共聚合 自我組裝而成。 ，其係 南分子 4 1 ·如申請專利範圍第 I大小為約50_200 nm。 39項之複合型微胞結構，其粒 44 200817456 42. —種具有殼核結構的高分子型微胞之製備方法 含下列步驟： 匕 a) 將一接枝共聚合高分子與一團聯共聚合高分子溶解、 有機溶劑中，其中該接枝共聚合高分子包含一 於 土鍵及一鍵 結於該主鏈上的疏水性側鏈，該團聯共聚合高分子包人 疏水性高分子鏈段與一親水性高分子鏈段， ^ b) 將步驟a)之高分子溶液對抗水作透析處理 機溶劑置換成水。 將该有 4:如申請專利範圍第42項之製備方 含〇將從步驟b)獲得的水溶液進 ：進步包 高分子型微胞。 7東乾、h而獲得乾燥之 :4·如申請專利範圍第42項之製 心中-種或多種不同的團聯 -中於/驟 溶劑。 K。呵刀子破溶解於該有機 45·如申請專利範圍第42 與該接枝丘聚“八工s員之i備方法’其中-藥物 牧饮，、本口问分子及團 有劑溶劑中。 來合-分子共同溶解於該 45