TW200817019A

TW200817019A - De novo formation and regeneration of vascularized tissue from tissue progenitor cells and vascular progenitor cells

Info

Publication number: TW200817019A
Application number: TW096124779A
Authority: TW
Inventors: Jeremy J Mao
Original assignee: Univ Columbia
Priority date: 2006-07-10
Filing date: 2007-07-06
Publication date: 2008-04-16
Also published as: CA2659673A1; WO2008008229A2; AU2007273095A1; EP2040640A2; WO2008008229A3; US20100136114A1; EP2040640A4

Description

200817019 九、發明說明相互參照相關之申請案本申請案主張美國臨時申請案序號60/8 1 9833( 2006 年7月1〇日提出）及美國臨時申請案序號6 0/ 82459 7 ( 2006年9月5日提出）之優先權，彼等各以參照方式整體納入本發明。聯邦資助硏究或發展聲明本發明部份係由美國國家生物醫學影像暨生物工程院及美國國家牙科暨顱顏硏究院計畫 R01DE 1 529 1及 R01EB02332之政府資助產生，美國政府對本發明有特定權利。以光碟提交之參照納入材料未提交。【發明所屬之技術領域】本發明大抵關於來自組織祖細胞和血管祖細胞之血管形成組織或器官的重新形成及再生。【先前技術】臨床上對於用於重建創傷、慢性疾病、腫瘤切除及先天性畸型之組織移植需求甚鉅。目前外科手術依賴自體移植、異體移植、異種移植或合成材料。現行臨床處置程序 -4- 200817019 之缺失廣爲外科暨科學社群所知。發展可供臨床移植之三維工程組織或器官有其限制，因爲超過 100至 200微米之組織組合物（tissue assemblies )需要灌流血管床’以提供養分及移除廢物、代謝中間物及分泌產物。成熟之功能性血管網難以構建，因爲血管發展係牽涉許多細胞類型及多種不同生長因子之複雜事件。在胚胎發育期間，內皮細胞形成管柱狀並連接以形成原始微血管網，這個過程稱爲血管新生（ angiogenesis)。新血管之形成係藉由原有血管分裂爲二，或自原有血管萌生。此原始血管網在名爲血管成熟之過程中被重塑及修剪，以形成包括微血管、動脈及靜脈之獨特微循環單位。未竟理想之血管新生仍是組織工程學的關鍵阻礙，尤以大型組織缺損爲甚。先前構建血管新生之方法依賴釋放血管新生生長因子或製造血管類似物。然而，仍有生長因子輸送成本、潛在毒性、血管吻合不理想及大型組織移植物內皮遷移緩慢方面的問題。二種幹細胞亞群可分離自單一骨髓樣本：間質幹細胞 (mesenchymal stem cells, MSCs)及造血幹細胞（ hematopoietic stem cells，HSCs)。間質幹細胞可分化成幾乎所有結締組織細胞系之細胞。造血幹細胞分化成內皮細胞，以及形成血管形成組織所需之血源細胞。因此，有工程化血管形成組織建構組成物及製造彼之方法的需求。 -5- 200817019 【發明內容】發明摘要本發明揭露一種自組織祖細胞和血管祖細胞之共同作用構建血管形成組織之新顆方法。利用該揭露之組成物和方法所產生的血管形成組織模組可被用於不同臨床應用。本發明之一些態樣係關於血管形成組織模組。在不同構型中，組織模組包含生物相容性基質、組織祖細胞及血管祖細胞。該些祖細胞可被導入（例如經由同時或相繼注射、內視鏡或輸注）至生物相容性基質材料支架之中或之上。本發明之其他態樣提供一種形成血管形成組織模組之方法。這些方法包括提供生物相容性基質及導入組織祖細胞和血管祖細胞至基質。祖細胞可利用該領域熟知之方法 (諸如注射、內視鏡或輸注）輸送至生物相容性基質材料之中或之上。在不同構型中，該輸送可同時或相繼進行。該法可進一步包含培養包含該組織和血管祖細胞之基質。在一些構型中，組織型態發生及/或細胞分化可發生於培養期間。這類培養可爲至少部份於活體外、大部份於活體外、至少部份於活體內或大部份於活體內。在一些構型中，至少部份模組可於活體外形成’然而在一些其他構型中，該生物相容性基質、該組織祖細胞及該血管祖細胞中至少一項對預定接受者而言（諸如需要組織修復或替換治療的人）可爲異源性。 -6 - 200817019 在不同態樣中，組織祖細胞可爲間質幹細胞（MS Cs )、間質幹細胞源性細胞、成骨細胞（osteoblasts )、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞、神經元細胞、心肌細胞、神經膠質細胞、許旺細胞（S c h w a η n c e 11 s )、上皮細胞、皮膚纖維母細胞（fibroblasts )、間質纖維母細胞、牙齦纖維母細胞、牙周纖維母細胞、顱骨縫纖維母細胞、腱細胞、韌帶纖維母細胞、尿道細胞、肝細胞、骨膜細胞、β胰島細胞、或彼等之組合。在一些構型中，該組織祖細胞可適宜地爲間質幹細胞、間質幹細胞源性細胞或彼等之組合〇在不同態樣中，血管祖細胞可爲造血幹細胞（HSC ) 、造血幹細胞源性內皮細胞、血管內皮細胞、淋巴管內皮細胞、內皮細胞系、原代培養內皮細胞、源自幹細胞之內皮細胞、骨髓源性幹細胞、臍帶血源性細胞、人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC )、淋巴內皮細胞、內皮祖細胞、分化成內皮細胞之幹細胞、源自胚胎幹細胞之血管祖細胞、源自脂肪組織或牙周組織或牙髓之內皮細胞，較佳者爲造血幹細胞或造血幹細胞源性內皮細胞。在不同態樣中，該基質可包含諸如纖維蛋白、纖維蛋白原、膠原蛋白、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚醯胺、聚碳酸酯、瓊脂糖、褐藻酸酯、聚乙二醇'聚乳酸、聚乙醇酸、聚己內酯（P〇lycaPr〇lact〇ne )、聚乙烯吡咯院酮、海洋生物黏著蛋白、氰基丙烯酸酯、聚合物水凝膠、類似物或彼等組合之材料。在一些較佳之構型中，該基質材料可爲 200817019 聚合物水凝膠。在不同態樣中，基質可包括至少一個巨通道及/或微通道。在一些具體例中，數個巨通道之平均直徑可爲至少約0·1毫米至約50毫米。舉例來說，巨通道之平均直徑可爲約〇·2毫米、約〇·3毫米、約0.4毫米、約0.5毫米、約0.6毫米、約0.7毫米、約0.8毫米、約0.9毫米、約1 · 0毫米、約1 · 1毫米、約1 · 2毫米、約1 · 3毫米、約 1 · 4毫米、約1 · 5毫米、約1.6毫米、約1 .7毫米、約1 .8 毫米、約1 · 9毫米、約2.0毫米、約2 · 5毫米、約3.0毫米、約3 · 5毫米、約4 · 0毫米、約4 · 5毫米、約5.0毫米、約5 · 5晕:米、約6.0毫米、約6 · 5毫米、約7.0毫米、約7.5毫米、約8.0毫米、約8.5毫米、約9.0毫米、約 9.5毫米、約1 0毫米、約1 5毫米、約2 0毫米、約2 5毫米、約30毫米、約35毫米、約40毫米、或約45毫米。在不同態樣中，基質可包括至少一種生長因子，較佳者爲新生血管生長因子，更佳者爲鹼性纖維母細胞生長因子（bFGF )、血管內皮生長因子（VEGF )、血小板源性生長因子（PDGF )、類胰島素生長因子（IGF )、轉化生長因子β ( TGFb)或彼等之組合。在不同態樣中，本發明之組織模組可包含密度約〇·5Μ總祖細胞至約100 M/ml之組織祖細胞及/或血管祖細胞。舉例來說，在不同構型中，組織模組可包含密度約 1 M/ml、5 M/ml、10 M/ml、15 M/ml、20 M/ml、 25 M/ml、30 M/ml、35 M/ml、40 M/ml、45 M/ml、50 200817019 M/ml、55 M/ml、60 M/ml、65 M/ml、70 M/ml ' 75 M/ml 、80 M/ml、85 M/ml、90 M/ml、95 M/ml、或 100 M/ml 之祖細胞。在一些構型中，組織模組可包含密度約 0.0001 M細胞（M)/ml至約1 0 0 0 M/ml之祖細胞。在一些構型中，組織模組可包含密度至少約1 M/ml至約100 M/ml 之祖細胞。在一些構型中，組織模組可包含密度至少約5 M/ml至約95 M/ml之祖細胞。在一些構型中，組織模組可包含密度至少約1〇 M/ml至約90 M/ml之祖細胞。在一些構型中，組織模組可包含密度至少約15 M/ml至約85 M/ml之祖細胞。在一些構型中，組織模組可包含密度至少約20 M/ml至約80 M/ml之祖細胞。在一些構型中，組織模組可包含密度至少約25 M/ml至約75 M/ml之祖細胞。在一些構型中，組織模組可包含密度至少約30 M/ml至約70 M/ml之祖細胞。在一些構型中，組織模組可包含密度至少約35 M/ml至約65 M/ml之祖細胞。在一些構型中，組織模組可包含密度至少約40 M/ml至約60 M/ml之祖細胞。在一些構型中，組織模組可包含密度至少約 45 M/ml至約55 M/ml之祖細胞。在一些構型中，組織模組可包含密度至少約45 M/ml至約50 M/ml之祖細胞。在一些構型中，組織模組可包含密度至少約5 0 M/ml至約5 5 M/ml之祖細胞。在不同態樣中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可介於約1 00 : 1至約1 : 1 〇〇。舉例來說，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲約 2 0 : 1、1 9 : 1、1 8 : 1、1 7 : 1、1 6 : 1、1 5 : 1 -9 - 200817019 、1 4: 1、1 3 : 1、1 2 : 1、1 1 :1、1 0 : 1、9 :1、8 :1、7 : 1、6 :1、 5 : 1、4 : 1、3 :1、2 :1、1 : 1、1:2、1 : 3、1 : 4、1:5' 1 : 6、1 : 7 、1:8、 1:9、 1:10、 1:11、 1:12、 1:13、 1:14、 1:15、 1:16 、1:17、1:18、1:19、或 1:20。在一些構型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約20:1至約1:20。在一些構型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約 1 9 :1至約1 ·. 1 9。在一些構型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約1 8 : 1至約1 : 1 8。在一些構型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約1 7 : 1至約1 : 1 7 。在一些構型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約1 6 : 1至約1 : 1 6。在一些構型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約1 5 : 1至約1 :1 5。在一些構型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約14: 1至約 1 : 1 4。在一些構型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約1 3 : 1至約1 : 1 3。在一些構型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約1 2 : 1至約1 : 1 2。在一些構型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約11:1 至約1 : 1 1。在一些構型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約1 〇 : 1至約1 :1 0。在一些構型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約9:1至約1:9。在一些構型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約8 : 1 至約1 : 8。在一些構型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約7 : 1至約1 : 7。在一些構型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約6 : 1至約1 : 6。在一些構 -10- 200817019 型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約5 :1至約1 : 5。在一些構型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約4: 1至約1 :4。在一些構型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約3 : 1至約1 : 3。在一些構型中，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲介於約2 :1至約 1:2。本發明之另一態樣提供治療組織或器官缺損之方法。在不同構型中，這些方法包括移植本發明之組織模組至需要之個體體內。本發明之其他態樣提供一種識別調節組織血管形成之候選分子的方法。這類方法包括形成本發明之組織模組；令候選分子與基質、組織祖細胞、血管祖細胞、彼等之組合物或該組織模組接觸；測量該工程化組織組成物之血管形成；及測定該候選分子是否能調節該工程化組織組成物相較於未與該候選分子接觸之對照物中之血管形成。在一些構型中，該候選分子與基質、組織祖細胞或血管祖細胞接觸之時機可於組合基質與該些祖細胞之前、細胞已接種至基質上但血管型態發生尙未發生之前，或於血管形成開始之後。此處所指之調節組織血管形成可包括相較於對照組增加血管形成或減少血管形成。其他目的及特性將在以下部份顯見及部份指出。本發明之詳細說明本發明所描述之方法至少部份係根據造血及間質幹細 -11 - 200817019 胞共同作用形成血管形成組織之發現在組織工程上之應用。本發明證實當聚合物生物材料與組織祖細胞和血管祖細胞組合可令聚合物生物材料形成血管。本發明亦證實當血管祖細胞被導入含有、組織祖細胞之多孔支架之中或之上時 ’血管祖細胞可於體內誘發血管樣結構。另外，本發明證 - 實實體內建之巨通道及/或基質材料中之成血管生長因子誘發活體內宿主源性血管新生及血管形成。 φ 因此’本發明提供一種來自血管祖細胞和組織祖細胞之協同作用的新穎組織缺損再生方法，如此可使該總效應高於個別效應之合。這類方法得益於本發明所揭露之對於血管祖細胞（例如HSCs)、組織祖細胞（例如MSCs)及其細胞系衍生物之間的交互作用與調節性血管新生生長因子在血管形成組織或器官的重新形成中之新認識。舉例來說’本發明所揭露之組成物及方法可提供用於修復長骨缺損諸如節段性缺損、生物衍生性全關節置換之軟骨下骨再 φ 生，及骨髓置換中之生體可存活之工程化硬組織模組。在 ~ 其他實施例中，本發明所揭露之組成物及方法可提供用於，修復因創傷、腫瘤切除及先天異常導致之軟組織缺損的生體可存活之工程化軟脂肪組織模組。本發明之態樣提供工程化血管形成組織或器官之組成物。這類組成物通常包括被導入生物相容性基質之中或之上的組織祖細胞和血管祖細胞。本發明之其他態樣提供用於形成這類工程化血管形成組織或器官之方法。根據這些組織工程及組織再生之方法，組織祖細胞和血管祖細胞被 -12- 200817019 導入生物相容性基質之中或之上，以產生血管形成組織或器官。其它態樣提供一種藉由移植本發明之組成物至需要之個體體內以治療組織缺損之方法。生體可存活之組織或器官可自組織祖細胞構建，並透過使用血管祖細胞以改善血管形成。可根據本發明所揭露之方法形成的血管形成組織或器官類型包括但不限於膀胱、骨、腦、乳房、骨軟骨接合、神經組織（包括中樞神經系統、脊椎及周邊神經）、神經膠質、食道、輸卵管、心臟、胰臟、小腸、膽囊、腎臟、肝臟、肺臟、卵巢、前列腺、脊椎、脾臟、骨骼肌、皮膚、胃、睾九、胸腺、甲狀腺、氣管、泌尿生殖道、輸尿管、尿道、間質軟組織、骨膜、牙周組織、顱骨縫、毛囊、口腔黏膜及子宮。由本發明之方法所形成之較佳軟組織組成物係工程化血管形成脂肪組織。由本發明之方法所形成之較佳硬組織組成物係工程化血管形成骨組織。組織通常是具有類似型態及功能之細胞的集合，且經常由具有多種細胞類型及血液供應之異質性間質組織支持。器官通常是進行一種生物功能之組織的集合。器官可以是（但不限於）膀胱、腦、神經組織、膠質組織、食道、輸卵管、骨、滑膜關節、顱骨縫、心臟、胰臟、小腸、膽囊、腎臟、肝臟、肺臟、卵巢、前列腺、脊椎、脾臟、胃、睪九、胸腺、甲狀腺、氣管、泌尿生殖道、輸尿管、尿道、子宮、乳房、骨骼肌、皮膚、骨及軟骨。器官之生物功能可利用熟習該領域之技術人士所知之標準方法檢測。 -13- 200817019 輸注及培養爲了形成本發明之組成物，組織祖細胞和血管祖細胞被導入（例如植入、注射、輸注或接種）可支持三維組織或器官形成的人工構造之中或之上（例如包含基質材料之支架）。該組織祖細胞和血管祖細胞可一起導入或相繼導入。該組織祖細胞和血管祖細胞可被導入彼此相對上相同的空間位置、類似的空間位置或不同的空間位置。較佳之組織祖細胞和血管祖細胞導入該基質材料之不同區域之中或之上。本發明考慮到一種以上的組織祖細胞類型可被導入該基質中。同樣的，本發明考慮到一種以上的血管祖細胞類型可被導入該基質中。組織祖細胞及/或血管祖細胞可藉該領域熟習之許多方式被導入該基質材料之中（參見例如實施例1 ;實施例 4 ;實施例1 1 ;實施例12 ;實施例20 ;實施例23 )。用於導入（例如輸注、接種、注射等）祖細胞至該基質材料之中或之上的方法係討論於例如Ma and Elisseeff，ed. (2005) Scaffolding In Tissue Engineering, CRC, ISBN 1574445219; S alt zm an (2004) Tissue Engineering:

Engineering Principles for the Design of Replacement Organs and Tissues，Oxford ISBN 0 1 95 1 4 1 3 0X; Minuth et al. (2005) Tissue Engineering: From Cell Biology to

Artificial Organs, John Wiley & Sons, ISBN 3 5273 1 1 866 。舉例來說，祖細胞可藉由包括以細胞懸浮液（例如濃度 -14- 200817019 爲1 00細胞/毫升至數百萬細胞/毫升）水化凍乾支架之方法被導入該基質之中或之上。添加額外藥劑之方法如下述有所不同。

在支架之中或之上培養及分化祖細胞的方法通常係該領域所熟知（參見例如 Saltzman (2004) Tissue Engineering: Engineering Principles for the Design of Replacement Organs and Tissues, Oxford ISBN 019514130X; Vunjak-Novakovic and Freshney，eds. (2006) Culture of Cells for Tissue Engineering, Wiley-Liss, ISBN 0 4 7 1 6 2 9 3 5 9; Minuth et a 1. (2005) Tissue Engineering:

From Cell Biology to Artificial Organs, John Wiley & Sons，ISBN 3 5 273 1 1 866 )。熟習該項技術之人士將能了解，從導入祖細胞至該基質之中或之上到移植該形成基質之間的時間可視特定應用而定。該基質材料之中或之上包含組織祖細胞和血管祖細胞之工程化組成物的培養（及後續複製及/或分化）可例如至少部份於活體外、大部份於活體外、至少部份於體內或大部份於體內進行。理想培養時間之決定係屬該領域之一般技藝。適當之培養基可被用於活體外祖細胞輸注、分化或細胞轉分化（參見例如 Vunjak-Novakovic and Freshney，eds· (2 0 0 6) Culture of Cells for Tissue Engineering， Wiley-Liss, ISBN 0471629359; Minuth et al. (2005) Tissue Engineering:

From Cell Biology to Artificial Organs, John Wiley & Sons，ISBN 3 5 273 1 1 866 )。該培養時間可自約1小時、 -15- 200817019 數小時、1天、數天、1週或至數週不等。存在該基質中之細胞數量及類型可藉例如形態學、酵素連結免疫吸附分析法（E LI S A )、蛋白質檢測法、基因檢測法、機械分析法、反轉錄聚合酶連鎖反應、及/或篩檢細胞類型特異標記之免疫染色法加以特徵化（參見例如 Minuth et al. (2005) Tissue Engineering: From Cell Biology to

Artificial Organs, John Wiley & Sons, ISBN 352731 1866 )° 在一些實施態樣中，該工程化血管形成組織或器官組成物係藉由如本發明所揭露之導入組織祖細胞和血管祖細胞至基質材料之中或之上形成，而不需使用額外的生物活性劑，特別是生長因子及該類似物。在缺乏生長因子的情況下形成工程化血管形成組織或器官之能力，提供傳統方法無法達到的組織工程好處。血管形成導入組織祖細胞和血管祖細胞至基質材料之中或之上發生在導致該組成物血管形成的條件下。較佳之血管生長遍及該工程化組織或器官。血管形成可發生在活體外（參見例如實施例2 ;實施例22 )、體內（參見例如實施例1 ;實施例23 )或彼等組合之工程化組織或器官中。舉例來說，分化可藉由在該支架的基質材料中培養組織祖細胞和血管祖細胞進行。在另一實施例中，該祖細胞可被輸注至該基質中，且該基質立刻被移植到個體體內，以使分化 -16- 200817019 在體內發生。該工程化組織或器官應於何時導入個體體內，至少部份可根據該組織或器官中所形成的血管形成量決定。測量該工程化組織或器官中血管新生之方法係該領域之標準方法（參見例如Jain et al. (2002) Nat. Rev. Cancer 2: 266-276; Ferrara, ed. (2006) Angiogenesis， CRC，ISBN 0849328446 )。在早期血管形成中，不成熟的血管類似發育中的血管叢，也就是直徑比較大及缺乏形態學之血管分化。經過一段時間後，該網樣型態之不成熟血管新生血管逐漸成熟爲具有功能的微循環單位，該微循環單位發展成爲具有分化之小動脈及小靜脈的緻密微血管網。血管新生可藉由例如測量非分支血管節段數量（單位面積中節段數量）、功能性血管密度（單位面積中灌流血管總長）、血管直徑或血管體積密度（單位面積中根據各節段長度及直徑所計算之血管總體積）分析。本發明之組成物相較於以慣用方法產生之工程化組織或器官通常具有增加之血管形成。舉例來說，相較於非以本發明所揭露之導入血管祖細胞和組織祖細胞所形成的對應工程化組織或器官，該工程化組織或器官中之血管形成 (例如血管新生、脈管生成、形成不成熟之血管網、血管重塑、血管穩定、血管成熟、血管分化或建立功能性血管網）可增加至少 5 %、1 0 %、2 0 %、2 5 %、3 0 %、4 0 %、或 5 0%、60%、70% > 80% ^ 90% 或甚至高達 100%、1 5 0% 或 200%。該工程化組織或器官組成物之血管形成係適宜地 -17- 200817019 爲持續至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2 週、3週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6 個月或甚至1 2個月或更久之穩定血管網。該工程化組織或器官組成物在導入該組織、器官或個體時，其血管網係適宜地整合至其循環系統之中。在使用小型支架（體積< 100立方毫米）之組織或器官再生方面，可手動更換活體外之培養基並定期添加額外藥劑（例如每3至4天）。若使用大型支架，該培養可於例如生物反應器系統中維持，並利用迷你幫浦更換培養基。該迷你幫浦可建置於培養箱中，以將新鮮培養基送至該支架的基質材料中。循環回到及通過該基質之培養基可含有約1%至約100%之新鮮培養基。幫浦速率可被調整以最佳化培養基及/或培養基中包含之額外藥劑的分佈。該培養基輸送系統可依製造之組織或器官的類型加以調整。所有培養係適宜地於無菌條件下進行。祖細胞本發明之組成物及方法同時採用組織祖細胞和血管祖細胞。這類細胞可利用該領域熟習之不同方法分離、純化及/或培養（參見例如實施例9;實施例21)。用於分離及培養祖細胞之方法在例如 Vunjak-Novakovic and Freshney (2006) Culture of Cells for Tissue Engineering, Wiley-Liss，ISBN 04 7 1 6293 59 中討論。在一些態樣中，祖細胞可源自與所欲移植接受者相同或不同之物種。舉例來 -18- 200817019 說，祖細胞可源自動物，其包括但不限於脊椎動物諸如哺乳類、爬蟲類或鳥類。在一些構型中，較佳之哺乳類或鳥類係馬、牛、狗、貓、羊、豬或雞，且最佳爲人類。本發明之組織祖細胞包括可分化成目標組織或器官之細胞，及/或可進行型態發生以形成目標組織或器官之細胞。組織祖細胞之非限制性實例包括間質幹細胞（MS Cs )、MSCs源性細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞、神經元細胞、神經元支持細胞諸如神經膠質細胞 (諸如許旺細胞）、纖維母細胞諸如間質纖維母細胞、肌腱纖維母細胞、皮膚纖維母細胞、韌帶纖維母細胞、牙周纖維母細胞諸如牙齦纖維母細胞、顱顏纖維母細胞、心肌細胞、上皮細胞、肝細胞、尿道細胞、腎細胞、骨膜細胞、膀胱細胞、β胰島細胞、成齒質細胞（odontoblasts)、牙髓細胞、牙周細胞、肺臟細胞及心臟細胞。舉例來說，在本發明之血管形成骨組織中，導入基質之組織祖細胞可以是可分化成骨組織之祖細胞，諸如間質幹細胞（MS C) 、MSC源性成骨細胞或MSC源性軟骨細胞。應了解的是，MSC源性軟骨細胞係分化自MSCs的軟骨細胞。同樣的，MSC源性成骨細胞係成骨細胞MSC成骨細胞。在另一實施例中，本發明之血管形成脂肪組織中，導入基質的組織祖細胞可以是可分化成脂肪組織之祖細胞，諸如MSCs 或MSC源性成脂肪細胞（也就是分化自MSCs的成脂肪細胞）。導入基質材料中或基質材料上的血管祖細胞係可分化 -19- 200817019 或以其它方式形成血管組織之祖細胞。血管祖細胞可例如可分化成內皮細胞之幹細胞，諸如造血幹細胞（ )、HSC內皮細胞、血管內皮細胞、淋巴管內皮細胞皮細胞系、原代培養之內皮細胞、源自幹細胞之內皮、骨髓源性幹細胞、臍帶血源性細胞、人類臍靜脈內胞（HUVEC )、淋巴內皮細胞、內皮祖細胞、內皮系、在活體外自幹細胞產生之內皮細胞、自脂肪組織滑肌細胞、間質纖維母細胞、肌纖維母細胞、牙周組牙髓或血管源性細胞萃取之內皮細胞。應了解的是，內皮細胞係自HSCs分化的內皮細胞。血管祖細胞可自例如骨髓、軟組織、肌肉、牙齒、血液及/或血管。在一些構型中，血管祖細胞可源自組織祖細胞。本發明包括理想化組織祖細胞和血管祖細胞（及胞系衍生細胞）之密度以最大化該血管形成組織或器生結果的方法（參見例如實施例4 ;實施例5 ;實施 )。在這些方法中，可在一段時間及終點時監測基質細胞密度。組織特性可利用例如熟習該項技術者所知準技術決定，諸如組織學、結構分析、免疫組織化學物化學分析及力學特性。熟習該項技術者將了解，該祖細胞及/或血管祖細胞之細胞密度可視例如祖細胞、組織或器官類型、基質材料、基質體積、輸注方式種模式、培養基、生長因子、培養時間、培養條件及似物而異。一般來說，在基質中組織祖細胞和血管祖之各細胞類型的細胞密度可各自爲介於0.0001 Μ 以是 HSC 、內細胞皮細細胞、平織、 HSC 分離系統其細官再例6 中之之標、生組織類型、接該類細胞細胞 -20 - 200817019 (M)/ml至約1 000 M/ml。舉例來說，該組織祖細胞和該血管祖細胞可各自以約0.001 M/ml、〇.〇1 M/ml、0.1 M/ml 、1 M/ml、5 M/ml、10 M/ml、15 M/ml、20 M/ml、25 M/ml、30 M/ml、35 M/ml、40 M/ml、45 M/ml、50 M/ml 、55 M/ml、60 M/ml、65 M/ml、70 M/ml、75 M/ml、80 M/ml、85 M/ml、90 M/ml、95 M/ml、100 M/ml、200 M/ml、3 00 M/ml、400 M/ml、5 00 M/ml、600 M/ml、700 M/ml、8 00 M/ml、或900 M/ml之密度存在於該基質中。血管祖細胞和組織祖細胞可以各種比例被導入該基質之中或之上（參見實施例5 )。熟習該項技術者將了解，該血管祖細胞對組織祖細胞之細胞比例可視例如祖細胞類型、目標組織或器官類型、基質材料、基質體積、輸注方式、接種模式、培養基、生長因子、培養時間及/或培養條件而定。一般來說，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可介於約100:1至約1:100。舉例來說，該血管祖細胞對組織祖細胞之比可爲約 20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、 1 5 :1、1 4 :1、1 3 : 1、1 2 :1、1 1 : 1、1 〇 : 1、9 : 1、8 : 1、7 : 1、 6 :1、5 : 1、4 :1、3 · 1、2 : 1、1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 ·· 4、1 : 5、1 : 6 、1:7、 1:8、 1:9、 1:10、 1:11、 1:12、 1:13、 1:14、 1:15 、1 : 1 6、1 : 1 7、1 : 1 8、1: 1 9、或 1:2 0。在一些實施態樣中，被導入該基質之祖細胞可包含異源性核酸，以表現生物活性分子諸如異源性蛋白質或過度表現內源性蛋白質。在非限制性實例中’導入該基質之祖細胞可表現螢光蛋白標記，諸如綠螢光蛋白（GFP )、增 -21 - 200817019 強型綠螢光蛋白（EGFP )、藍螢光蛋白（BFP )、青綠螢光蛋白（CFP)、黃螢光蛋白（YFP)或紅螢光蛋白（RFP )。在另一實施例中，導入該基質之祖細胞可表現血管新生相關因子，諸如激活素（activin A )、腎上腺髓質素（ adrenomedullin)、酸性纖維母細胞生長因子（aFGF )、激活素受體樣激酶1(ALK1)、激活素受體樣激酶5 ( ALK5 )、心房利鈉因子（ANF )、血管生長素（ angiogenin)、血管生成素 1 ( angiopoietin-Ι)、血管生成素 2 ( angiopoietin-2 )、血管生成素 3 ( angiopoietin-3 )、血管生成素 4 ( angiopoietin-4)、血管抑制素（ angio statin )、血管營養素（angiotropin)、血管加壓素 2 ( angiotensin-2 )、AtT20內皮細胞生長因子、β細胞調節素（betacellulin )、鹼性纖維母細胞生長因子（bFGF )、B61配體、bFGF誘導活性、鈣黏附蛋白（cadherins )、細胞黏附分子調節因子（CAM-RF )、環鳥苷單磷酸類似物、軟骨細胞源性抑制素（ChDI )、黃體血管生成因子（CLAF)、緊密連接蛋白（claudins)、膠原（ collagen)、膠原受體 αιβ1& α2βι、連接蛋白（connexins )、環氧化酶2 ( Cox-2 )、內皮細胞源性生長因子（ ECDGF)、內皮細胞生長因子（ECG)、內皮細胞抑制因子（ECI)、內皮源性單核球（EDM )、內皮生長因子（ EGF )、內皮單核細胞活化多肽（EMAP )、內皮膜抗原 (endoglin)、內皮素（endothelins)、內皮抑制素（ endostatin)、內皮細胞生長抑制素、內皮細胞存活維持 -22- 200817019 因子、內皮分化鞘磷脂G蛋白偶聯受體1 ( EDGl) 、Eph 配體（ephrins)、促紅血球生成素（Epo)、肝細胞生長因子（HGF)、腫瘤壞死因子a ( TNF-alpha)、轉化生長因子β ( TGF-beta )、血小板源性內皮細胞生長因子（ PD-ECGF )、血小板源性生長因子（PDGF )、類胰島素生長因子（IGF)、介白素8(IL8)、生長激素、纖維蛋白片段E、纖維母細胞生長因子5 ( FGF5 )、纖維連接蛋白及纖維連接蛋白受體、因子X ( factor X)、肝素結合表皮生長因子樣生長因子（HB-EGF )、肝素結合促軸突生長因子（HBNF )、肝細胞生長因子（HGF )、人子宮血管生成因子（HUAF )、心臟源性血管細胞增生抑制素、干擾素γ ( IFN-gamma)、介白素1 ( IL1 )、類胰島素生長因子 2(IGF-2)、干擾素 Y(IFN-gamma)、整合素受體（例如α亞單位之不同組合（例如a i、α2、α3、 α4、α5、α6、α7、α8、α9、αΕ、αν、anb、aL、αΜ、αχ)) 、卡波西纖維母細胞生長因子（k-FGF )、白血病抑制因子（LIF )、平滑肌瘤源性生長因子、單核細胞趨化蛋白 1 ( MCP-1 )、巨噬細胞源性生長因子、單核細胞源性生長因子、巨噬細胞源性內皮細胞抑制素（MD-ECI )、單核細胞源性內皮細胞抑制因子（MECIF )、基質金屬蛋白酶2 ( MMP 2)、基質金屬蛋白酶3( MMP 3 )、基質金屬蛋白酶9 ( MMP 9 )、尿激酶纖溶酶原激活物、神經纖毛蛋白（神經纖毛蛋白1 ( NRP 1 )、神經纖毛蛋白2 ( N R P 2 ))、神經內皮素（n e u r 〇 t h e 1 i η )、一氧化氮捐贈 -23- 200817019 者、一氧化氮合成酶（NOSs) 、notch蛋白、閉鎖蛋白（ occludins)、帶狀閉鎖蛋白（zona occludins)、抑瘤素 M ( oncostatin Μ )、血小板源性生長因子（PDGF )、血小板源性生長因子B ( PDGF-B )、血小板源性生長因子受體、血小板源性生長因子受體β ( PDGFR-β )、血小板源性內皮細胞生長因子（PD-ECGF )、纖溶酶原激活劑抑制物2 ( ΡΑΙ-2 )、血小板源性內皮細胞生長因子（PD-ECGF )、血小板因子4 ( PF4 )、胎盤生長因子（P1GF ) 、激動素原受體1 ( PKR1 )、激動素原受體2 ( PKR2 )、過氧化物增殖因子活性受體γ ( PPAR-gamma )、過氧化物增殖因子活性受體γ配體、磷酸二酯酶、泌乳激素、前列環素、S蛋白、平滑肌細胞源性生長因子、平滑肌細胞源性遷移因子、鞘胺醇-1·磷酸鹽-1(51)11丨1^08丨11心1-phosphate-1，S1P1 ) 、Syk、SLP76 蛋白、速激肽（ tachykinins )、轉化生長因子 β ( TGF-beta )、酪胺酸激酶受體1 ( Tie 1 )、酪胺酸激酶受體2 ( Tie 2 )、轉化生長因子P(TGF-p)、及轉化生長因子β受體、金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs )、腫瘤壞死因子a ( TNF-alpha ) 、腫瘤壞死因子β ( TNF-beta)、轉鐵蛋白、凝血酶敏感蛋白（thrombospondin)、尿激酶、血管內皮生長因子 a (VEGF-A)、血管內皮生長因子B(VEGF-B) 、血管內皮生長因子C(VEGF-C)、血管內皮生長因子d(VEGF-D)、血管內皮生長因子E(VEGF-E)、血管內皮生長因子（VEGF)、血管內皮生長因子164(VEGFsub.l64) -24- 200817019 、血管內皮生長抑制因子（VEGI )、內分泌腺源性血管內皮生長因子（EG-VEGF )、血管內皮生長因子受體、血小板因子4 ( PF4 )、泌乳激素之1 6千道爾頓片段、前列腺素E1及E2、類脂醇（steroids)、肝素、1-丁醯甘油 (單丁醯甘油）、或菸鹼醯胺。在其他實施例中，導入基質之祖細胞可包含降低或消除宿主免疫反應之基因序列（例如抑制細胞表面抗原諸如第一型及第二型組織相容性抗原之表現）。在一些實施態樣中，除了第一種組織祖細胞和第一種血管祖細胞之外，可導入一或多種細胞類型至該基質材料之中或之上。這類額外之細胞類型可選自以上所說明者，及/或可包括（但不限於）皮膚細胞、肝臟細胞、心臟細胞、腎臟細胞、胰臟細胞、肺臟細胞、膀胱細胞、胃細胞、腸細胞、泌尿生殖道細胞、乳房細胞、骨骼肌細胞、皮膚細胞、骨細胞、軟骨細胞、角質細胞、肝細胞、胃腸道細胞、上皮細胞、內皮細胞、乳腺細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、實質細胞、鈾骨細胞或軟骨細胞。這些細胞類型可於該基質血管形成之前、之期間或之後導入。這類導入可發生於活體外或活體內。當這些細胞於活體內被導入時，該導入可於該工程化血管形成組織或器官組成物之處或自該處移除之處。投服該細胞之示範性途徑包括注射及手術植入。基質 -25- 200817019 本發明之組成物及方法採用在其中或其上導入祖細胞以形成血管形成組織或器官建構物之基質。這類基質材料可讓細胞附著及遷移；運輸及滯留細胞及生化因子；使細胞養分及表現產物得以擴散；及/或展現特定機械及生物影響以調整該細胞期之行爲。該基質通常是一種以生物相容性材料製成之多孔微細胞支架，其於活體外培養及之後活體內植入時提供導入血管祖細胞和組織祖細胞之實體支持及黏附基質。具高度孔洞性及適當孔洞大小之基質較佳，其有利於細胞導入及細胞和養分擴散遍佈整個結構。可生物分解之基質亦較佳，因爲由周圍組織吸收基質可免除手術移除之需要。分解發生之速率應儘可能與組織或器官形成之速率相符。因此，當細胞在它們自身周圍建構自己的天然結構時，該基質可提供結構完整性且最後分解以留下可獲得機械負荷之新生組織、新形成之組織或器官。在一些臨床應用上可注射性亦爲適宜之特性。適當之基質材料被討論於例如 Ma and Elisseeff，ed· (2005) Scaffolding In Tissue Engineering，CRC，ISBN 1574445219; S altzman (2004) Tissue Engineering: Engineering Principles for the Design of Replacement Organs and Tissues，Oxford ISBN 0 1 9 5 1 4 1 3 0 X 中。基質構型可視欲修復或產生之組織或器官而定，但較佳之基質係可讓血管及目標組織或器官生長之柔軟、生物相容性、多孔模板。該基質可被製成結構支持物，其中該結構物之幾何學（例如形狀、大小、多孔性、微通道或巨 -26- 200817019 通道）適合其應用。基質之多孔性係影響細胞導入及/或細胞浸潤之設計參數。基質可被設計爲包含胞外基質蛋白，其可影響基質中之細胞黏附及遷移。基質可由合成之聚合物形成。這類合成聚合物包括但不限於聚胺酯（polyurethanes )、聚原酸酯（ polyorthoesters )、聚乙烯醇、聚醯胺、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚己內酯（polycaprolactone )、聚乙燒D比咯院酮（polyvinyl pyrrolidone)、海洋生物黏著蛋白、及氰基丙烯酸酯、或上述之類似物、混合物、組合物及衍生物。或者，基質可由天然發生之聚合物或天然來源之聚合物形成。這類聚合物包括但不限於瓊脂糖、褐藻酸酯、纖維蛋白、纖維蛋白原、纖維連接蛋白、膠原蛋白、明膠、玻尿酸（hyaluronic acid)、及其他適當聚合物及生物聚合物、或上述之類似物、混合物、組合物及衍生物。另外，基質可自天然發生之生物聚合物及合成聚合物之混合物形成。基質材料可包括例如膠原凝膠、聚乙烯醇海綿、D，L 型式聚乳酸-乙醇酸共聚物（poly ( D，L-lactide-C0-glycolide ))纖維基質、丙交酯乙交酯共聚酯（ polyglactin)纖維、褐藻酸15凝膠、聚乙醇酸網、聚酯（例如L型聚乳酸或聚酸酐）、多醣（例如褐藻酸酯）、聚磷腈（polyphosphazene )、或聚丙烯酸酯、或聚環氧乙烷-聚丙二醇塊體共聚合物。基質可自蛋白質（例如胞外 -27- 200817019 基質蛋白諸如纖維蛋白'膠原蛋白及纖維連接蛋白）、聚合物（諸如聚乙烯吡咯烷酮）或玻尿酸產生。亦可使用合成聚合物，包括生物溶蝕性聚合物（例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚己內酯、聚碳酸酯、聚醯胺、聚酸酐、聚胺基酸、聚原酸酯、聚甲醛、聚氰基丙烯酸酯）、可分解之聚胺酯、不可溶飩之聚合物（例如聚丙烯酸酯、乙烯醋酸乙烯酯聚合物及其他醯基取代之醋酸纖維及其衍生物）、不可溶飩之聚胺酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚乙烯基咪唑、氯磺化聚烯烴、聚環氧乙烷、聚乙烯醇、鐵氟龍（Teflon® )及尼龍。基質亦可包括一或多種酶類、離子、生長因子、及/ 或生物劑。舉例來說，基質可包含生長因子（例如血管新生生長因子或組織特異性生長因子）。這類生長因子可以約0至1 000奈克/毫升之濃度使用。舉例來說，該生長因子可以約100至700奈克/毫升之濃度、約200至400奈克/毫升之濃度、或約25 0奈克/毫升之濃度存在。基質可包含一或多個實體通道。這類實體通道包括微通道及巨通道。微通道之平均直徑通常爲約0.1微米至約 1 000微米。如本發明所示，基質巨通道可促進血管新生及骨或脂肪組織形成，且可引導血管形成發生及宿主細胞侵入（參見例如實施例3 ;實施例20 ;實施例23 )。巨通道及/或微通道可以是特定基質材料之天然特性及/或在該基質材料中特別建構者。微通道及/或聚通道可利用例如機械及/或化學方式形成。 -28-

200817019 巨通道可延伸至基質中不同深度，或完全貫穿基巨通道可有不同之直徑。一般來說，巨通道之直徑可增加該組織模組之最佳灌流、最佳組織生長及最佳血成來選擇。巨通道之平均直徑可爲例如約0.1毫米至毫米。舉例來說，巨通道之平均直徑可爲約0.2毫米 0 · 3毫米、約〇. 4毫米、約〇. 5毫米、約0.6毫米、| 毫米、約0.8毫米、約0.9毫米、約1 .0毫米、約1 米、約1 · 2毫米、約1 .3毫米、約1.4毫米、約1 .5 、約1.6毫米、約1.7毫米、約1 · 8毫米、約1.9毫約2 · 0毫米、約2.5毫米、約3.0毫米、約3 .5毫米 4.0毫米、約4 · 5毫米、約5.0毫米、約5.5毫米、毫米、約6.5毫米、約7.0毫米、約7.5毫米、約S 米、約8.5毫米、約9.0毫米、約9.5毫米、約1 0毫約1 5毫米、約2 0毫米、約2 5毫米、約3 0毫米、毫米、約40毫米、或約45毫米。熟習該項技術者將瞭解，巨通道之直徑分布可爲分布之直徑或非常態分布之直徑。添加藥物及/或診斷劑在一些實施態樣中，本發明之方法及組成物進含與組織祖細胞和血管祖細胞一起被導入基質之中的額外藥劑。可被導入之不同藥劑包括但不限於生分子、生物劑、診斷劑及增強劑。基質可進一步包含生物活性分子。基質之細胞質。根據管形約50 、約勺0.7 • 1毫毫米 :米、 :、約 β 6.0 ί·〇毫 :米、約35 &常態步包之上活性例如 -29- 200817019 經基因工程建構以表現生物活性分子，或生物分子可被加至基質中。基質亦可於生物分子存在下培養。生物活性分子可於祖細胞被導入基質之前、之期間或之後添加。生物活性分子之非限制性實例包括激活素（activin A )、腎上腺髓質素（adrenomedullin)、酸性纖維母細胞生長因子 (aFGF )、激活素受體樣激酶1 ( ALK1 )、激活素受體樣激酶5 ( ALK5 )、心房利鈉因子（ANF )、血管生長素 (angiogenin)、血管生成素 1 ( angiopoietin-Ι)、血管生成素 2 ( angiopoietin-2 )、血管生成素 3( angiopoietin-3 )、血管生成素 4 ( angiopoietin-4)、血管抑制素（angiostatin)、血管營養素（angiotropin)、血管加壓素2 ( angiotensin-2 )、AtT20內皮細胞生長因子、β細胞調節素（betacellulin )、鹼性纖維母細胞生長因子（bFGF) 、B61配體、bFGF誘導活性、鈣黏附蛋白 (cadherins )、細胞黏附分子調節因子（CAM-RF )、環鳥苷單磷酸類似物、軟骨細胞源性抑制素（ChDI )、黃體血管生成因子（CLAF)、緊密連接蛋白（claudins)、膠原（collagen)、膠原受體（Μβ!及α2βι、連接蛋白（ connexins )、環氧化酶2 ( Cox-2 )、內皮細胞源性生長因子（ECDGF)、內皮細胞生長因子（ECG)、內皮細胞抑制因子（ECI )、內皮源性單核球（EDM )、內皮生長因子（EGF )、內皮單核細胞活化多肽（EMAP )、內皮膜抗原（endoglin)、內皮素（endothelins)、內皮抑制素（endostatin )、內皮細胞生長抑制素、內皮細胞存活 -30- 200817019 維持因子、內皮分化鞘磷脂G蛋白偶聯受體1 ( EDGl ) 、Eph配體（ephrins )、促紅血球生成素（Epo )、肝細胞生長因子（HGF)、腫瘤壞死因子a(TNF-alpha)、轉化生長因子β ( TGF-beta )、血小板源性內皮細胞生長因子（PD-ECGF )、血小板源性生長因子（PDGF )、類胰島素生長因子（IGF)、介白素8(IL 8)、生長激素、纖維蛋白片段E、纖維母細胞生長因子5 ( F GF 5 )、纖維連接蛋白、纖維連接蛋白受體aji、因子X( factor X)、肝素結合表皮生長因子樣生長因子（H B-EGF)、肝素結合促軸突生長因子（HBNF )、肝細胞生長因子（HGF ) 、人子宮血管生成因子（HUAF )、心臟源性血管細胞增生抑制素、干擾素Y(IFN_gamma)、介白素1(IL1)、類胰島素生長因子2(IGF-2)、干擾素y(IFN-gamma) 、整合素受體（例如α亞單位（例如on、ct2、〇t3、〇t4、α5 、α6、α7、α8、α9、αΕ、αν、aIIb、aL、αΜ、αχ)及 β 亞單位（例如 β!、β2、β3、β4、β5、β6、β7、及 β8 )之不同組合）、卡波西纖維母細胞生長因子（k-FGF )、白血病抑制因子（LIF )、平滑肌瘤源性生長因子、單核細胞趨化蛋白1 ( MCP-1 )、巨噬細胞源性生長因子、單核細胞源性生長因子、巨噬細胞源性內皮細胞抑制素（MD-ECI )、單核細胞源性內皮細胞抑制因子（MECIF )、基質金屬蛋白酶2(MMP2)、基質金屬蛋白酶3(MMP3)、基質金屬蛋白酶9 ( MMP 9 )、尿激酶纖溶酶原激活物、神經纖毛蛋白（神經纖毛蛋白1 ( NRP 1 )、神經纖毛蛋白 -31 - 200817019 2 ( NRP2 ))、神經內皮素（neurothelin )、一氧化氮捐贈者、一氧化氮合成酶（NO Ss) 、notch蛋白、閉鎖蛋白 (〇 c c 1 u d i n s )、帶狀閉鎖蛋白（Ζ ο n a 〇 c c 1 u d i n S )、抑瘤素Μ ( oncostatin Μ )、血小板源性生長因子（P DGF )、血小板源性生長因子B ( PD GF-B )、血小板源性生長因子受體、血小板源性生長因子受體β ( PDGFR-β )、血小板源性內皮細胞生長因子（PD-ECGF )、纖溶酶原激活劑抑制物2 ( Ρ ΑΙ-2 )、血小板源性內皮細胞生長因子（PD-ECGF )、血小板因子4 ( PF4 )、胎盤生長因子（P1GF ) 、激動素原受體1 ( PKR1 )、激動素原受體2 ( PKR2 )、過氧化物增殖因子活性受體γ ( PPAR-gamma )、過氧化物增殖因子活性受體γ配體、磷酸二酯酶、泌乳激素、前列環素、S蛋白、平滑肌細胞源性生長因子、平滑肌細胞源性遷移因子、鞘胺醇_1_磷酸鹽-1(30]11118〇3丨116-1-phosphate_l，S1P1 ) 、Syk、SLP76 蛋白、速激肽（ tachykinins )、轉化生長因子 β ( TGF-β )、酪胺酸激酶受體1 ( Tie 1)、酪胺酸激酶受體2 ( Tie 2)、轉化生長因子β受體、金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs )、腫瘤壞死因子a(TNF-alpha)、腫瘤壞死因子p(TNF-beta)、轉鐵蛋白、凝血酶敏感蛋白（thrombospondin)、尿激酶、血管內皮生長因子A(VEGF-A)、血管內皮生長因子 B ( VEGF-B )、血管內皮生長因子C(VEGF-C)、血管內皮生長因子D ( VEGF-D )、血管內皮生長因子E( VEGF-E)、血管內皮生長因子（VEGF)、血管內皮生長 -32- 200817019 因子164 ( VEGF164 )、血管內皮生長抑制因子（VEGI ) 、內分泌腺源性血管內皮生長因子（EG-VEGF )、血管內皮生長因子受體、血小板因子4 (PF4)、泌乳激素之16 千道爾頓片段、前列腺素E1及E2、類脂醇（steroids) 、肝素、1-丁醯甘油（單丁醯甘油）、及菸鹼醯胺。在其他適宜之實施態樣中，基質包括化學治療劑或免疫調節分子。這類藥劑及分子爲熟習該項技術者所熟知。較佳之基質包括鹼性纖維母細胞生長因子（bFGF )、血管內皮生長因子（VEGF )、或血小板源性生長因子（PDGF )、或彼等之一些組合（參見實施例3 ;實施例7 )。工程化組織移植物中HSC及MSC源性之血管新生可利用生長因子之控制釋放來調節。工程化血管可能因內皮細胞之異常高度穿透性而「滲漏」。藉由微膠囊輸送血管新生生長因子至植入體內之HSC源性及MSC源性血管形成組織移植物，可促進人HSC內皮細胞之成熟。可添加至本發明之組成物的生物藥劑包括免疫調節劑及其他生物反應調節劑。生物反應調節劑通常包含與調節生物反應（諸如該免疫反應或組織或器官之生長及修復）有關之生物分子（例如胜肽、胜肽片段、多醣、脂肪、抗體），該調節以改善所欲之特定治療效應（例如細菌細胞之細胞溶解或組織或器官特異性細胞或血管形成之生長）的方式進行。生物藥劑亦可被直接加入基質成份中。熟習該項技術者將知道（或可輕易地查出）可作爲適當之非生物及生物藥劑之其他物質。 -33- 200817019 本發明之組成物亦可修改爲加入診斷劑，諸如造影劑。這類藥劑之存在可讓醫師監測發生在體內之傷口癒合的進展。這類化合物包括硫酸鋇以及各種含碘之有機化合物。後者化合物之實例包括碘西他酸（iocetamic acid )、碘膽胺（iodipamide )、碘氧胺酸葡胺（i o d o x am at e meglumine )、碘泛酸（iopanoic acid )以及泛影酸（ d i a t r i z o a t e )衍生物（諸如泛影酸鈉（d i a t r i z o a t e s o d i u m ))。其它可用於本發明之組成物中之造影劑可由熟習該項技術者輕易地查出，且可能包括放射標記脂肪酸或其類似物之用途。該組成物中之藥劑濃度將視化合物之特性、其生理功能、及所欲之治療或診斷效應而定。治療有效量通常係指足以顯示該所欲效應但無過度毒性之治療劑濃度。診斷有效量通常係指可有效監測該組織移植物之整合且潛在毒性最小化之診斷劑濃度。在任何事件中，特定化合物於特定情況之所欲濃度可輕易地由熟習該項技術者得知。基質組成物可透過使用補充劑加以改善或增強，諸如人血清白蛋白（HAS )、羥乙基澱粉、葡萄聚糖或彼等之組合物。基質組成物之溶解性亦可藉由添加非變性非離子清潔劑（諸如聚山梨醇酯80)提高。這些化合物於本發明之組成物中所使用的適當濃度係爲熟習該項技術者所知 ’或可被輕易查出而不需過度實驗。基質組成物亦可藉由使用可選擇之穩定劑或稀釋劑而被進一步改善。這些藥劑之正確使用係爲熟習該項技術者所知，或可被輕易確知而 -34· 200817019 不需過度實驗。植入本發明之工程化組織或器官組成物具有重要的臨床價値，因爲相較於以習知技藝之其它方式所生產之類似階段的其他工程化組織或器官，它們的血管形成程度較高。此增加之血管形成可令組織及器官更有效地再生，這是本發明之組成物與其他傳統治療選擇不同之處。需要治療之決定通常由顯示關鍵組織或器官缺損之病史及理學檢查來評估。被認爲需要治療之個體包括該些經診斷具有組織或器官缺損者。較佳之個體係動物，包括但不限於哺乳類、爬蟲類及鳥類，更佳者爲馬、牛、狗、貓、羊、豬及雞，且最佳者爲人。在一實施例中，需要治療之個體可缺損至少5 %、 1 0 %、2 5 %、5 0 %、7 5 %、9 0 %或更多之特定細胞類型。在另一實施例中，需要治療之個體具有受損之組織或器官，且該方法增加該組織或器官至少5 %、1 0 %、2 5 %、5 〇 %、 75%、90%、100% 或 200%、或甚至高達 3 00%、400% 或 5 00%之生物功能。在另一實施例中，需要治療之個體具有疾病、異常或狀況，且該方法提供足以改善或穩定該疾病、異常或狀況之工程化組織或器官建構物。舉例來說，該個體可能具有導致細胞喪失、萎縮、功能失調或死亡之疾病 '異常或狀況。示範性需要治療之狀況包括神經、神經膠質或肌肉退化性疾病、肌肉萎縮症或營養失調、心臟 -35- 200817019 病諸如先天性心衰竭、肝炎或肝硬化、自體免疫性疾病、糖尿病、癌症、導致組織或器官缺失之先天缺損、或需要切除組織或器官之疾病、異常或狀況、局部缺血疾病諸如心絞痛、心肌梗塞及肢體缺血、意外造成之組織缺損或受傷諸如骨折或傷口。在其他實施例中，需要治療之個體具有發生可藉該方法延緩或預防之疾病、異常或狀況的較高風險。該組織或器官可選自膀胱、腦、神經組織、神經膠質、食道、輸卵管、心臟、胰臟、小腸、膽囊、腎臟、肝臟、肺臟、卵巢、前列腺、脊椎、脾臟、胃、睪九、胸腺、甲狀腺、氣管、泌尿生殖道、輸尿管、尿道、乳房、骨骼肌、皮膚、脂肪、骨、及軟骨。該血管祖細胞及/或組織祖細胞可來自該工程化組織組成物所欲移植之相同個體。或者，該祖細胞可來自相同物種或甚至不同物種。植入工程化組織或器官建構物係於習知技藝之範圍內。基質及細胞組合物可完全或部分植入個體之組織或器官中，以成爲其有功能之一部分。較佳之植入物初期透過細胞單層與宿主連接及溝通。經過一段時間，該導入細胞可擴增並遷移出聚合物基質至周圍組織。在植入後，工程化血管形成組織組成物周圍的細胞可藉細胞遷移進入其中。在工程化組織周圍之細胞可被生物活性物質（包括生物反應調節劑）吸引，諸如多醣、蛋白質、胜肽、基因、抗原及抗體，其可被選擇性納入基質中以提供所需之選擇性，例如將細胞受體繫鏈至基質或刺激細胞遷移進入基質或二 -36- 200817019 者均採用。一般來說’該基質係多孔性，具有互相連接可讓細胞遷移之微通道及/或巨通道，而該遷移同時受生物及物理化學梯度增大。舉例來說，在植入基質周圍之細胞可受到生物活性物質吸引，包括一或多種血管內皮生長因子、纖維母細胞生長因子、轉化生長因子β、內皮細胞生長因子、ρ -選擇素及細胞間黏附分子。熟習該項技藝者將了解及知道如何使用可適當吸引細胞至該基質之其他生物活性物質。在基質中可加入生物分子，使生物分子被埋入其中。或者，可利用化學修飾方法以共價連接生物分子至基質表面。基質成份之表面官能基可與生物分子之反應官能基偶合，以利用該領域所熟知之偶聯劑諸如醛化合物、碳化二亞胺（earbodiimides )及該類似物形成共價鍵。此外，間隔分子可被用來隔開膠原蛋白中之表面反應基與生物分子之反應基，以使這類基質表面分子具有更高的可塑性。其他連接生物分子至基質內部或外部之類似方法係該領域之技術人士所熟知。本發明之方法、組成物及設備可包括以一或多種酶類、離子、生長因子及生物劑（諸如凝血酶及鈣）或其組合物同時或相繼處理。本發明之方法、組成物及設備可包括以非生物及/或生物藥劑同時或相繼處理。篩選本發明之另一態樣提供一種篩選調節血管形成之分子 -37- 200817019 的方法。此方法包括以下步驟：導入組織祖細胞和血管祖細胞至基質材料；培養該基質材料以形成工程化組織；令該基質材料或工程化組織與候選分子接觸；測量該工程化組織之血管形成；及決定該候選分子是否能調節基質/組織中相較於未與該候選分子接觸之對照組的血管形成。篩選方法亦可任意包括植入基質材料或工程化組織至個體及誘導內源性組織祖細胞及/或血管祖細胞遷移至該植入建構物中。較佳之候選分子係部份之測試混合物，諸如細胞溶解物、組織溶解物或文庫（library )。調節血管形成之分子可增加或減少該培養、基質、組織或器官相較於未與該分子接觸之對應對照組至少 5 %、1 0 %、2 0 %、2 5 %、3 0 %、 4 0%、或 50%、60% ^ 70% > 80%、90%或甚至高達 100%、 150%或200%之血管形成（例如血管新生、脈管生成、形成不成熟之血管網、血管重塑、血管穩定、血管成熟、血管分化或建立功能性血管網）。經過詳細地說明本發明，很清楚的是在不背離申請專利範圍中所定義之本發明的範圍之內，可能有修飾、變異及相等之實施態樣。另外應了解的是，本發明所揭露之所有實施例係作爲非限制性實施例。引用文獻本申請案引用之所有公開書、專利、專利申請案及其他文獻係以參照方式整體納入本發明以符合所有目的，如 -38- 200817019 同特別及各別指出以令各篇獨立之公開書、專利、專利申請案或其他文獻以參照方式整體納入以符合所有目的。在此處引用文獻不應被解讀爲承認其係本發明之先前技藝。【實施方式】下列非限制性實施例係用來進一步說明本發明。該領域之技術人士應瞭解，在這些實施例中所揭露採用之技術代表發明人發現可有效實施本發明之方法，因此可被視爲構成其實施模式之樣例。然而，熟習該項技術者依本揭示應了解所揭露之特定實施態樣可做出許多改變，仍得到不違背本發明之精神及範圍的類似或相同結果。應了解實施例所說明之任何方法不論使用何種動詞時態，可能已經或未經實際實施，或實施例所說明之任何組成物可能已經或未經實際形成。實施例1 :活體內工程化骨建構物中與MSC成骨細胞空間共同接種之內皮細胞產生血管樣結構按先前建立之方法（Shi et al·，1 998; Alhadlaq et al·， 2004; Yourek et al·，2 0 0 4; Marion et al.9 2 0 0 5; Moioli et al.，2006; Troken and Mao，2006)，製備人骨髓樣本（ AllCells，Berkely，CA)以分離間質幹細胞（MSCs)及造血幹細胞（H S C s )。接種初期之骨髓內容物如圖1 A所示，可見已知爲異質性之密集群聚細胞（參見Alhadlaq and

Mao，2004; Marion and Mao，2006) o -39- 200817019 間質幹細胞可分化爲成骨細胞。二種不同的細胞系（人間質幹細胞（MSCs)及人臍靜脈內皮細胞（HUVEC) )被用於建構活體內血管形成骨。如上所述（參見例如圖 IB) ( Alhadlaq and Mao? 2 0 0 3; Alhadlaq et al.5 2004; Yourek et al.5 2004; Alhadlaq and Mao, 2 0 0 5; Moioli et al. 9 200 6; Marion and Mao, 2006; Troken and Mao, 2006 )，自人骨髓樣本分離 MSCs 。經培養擴增之hMSCs的亞族群分化成爲成骨細胞（ Marion et al·，2005; Moioli et al·，2006)。該 hMSC 源性成骨細胞（hMSC-Ob )呈鹼性磷酸酶染色陽性（參見例如圖1 C )及馮庫薩染色陽性（參見例如圖1 D )。在輕真空下，將hMSC源性成骨細胞（5χ106細胞/毫升）接種至β-磷酸三鈣試片之多孔表面（PTCP ;平均孔洞大小：3 00微米）（參見例如圖2Α之亮粉紅區域）。內皮細胞與MSC成骨細胞共同接種於活體內之工程化骨建構物。人臍靜脈內皮細胞（HUVEC )經培養擴增，接著亦在之輕真空下以5χ106細胞/毫升之密度被包封於Matrigel之液態相中（參見例如圖2A之紅點）。 Matrigel係已被廣泛用於內皮細胞黏著及血管新生硏究之基底膜聚合水凝膠（Abilez et al·，2 006; Baker et al·， 2 0 0 6; Bruno et al. ? 2006; Mondrinos et al. ? 2006;

Rajashekhar et al.9 2006 )。 HUVEC-Matrigel建構物（參見圖2A之紅點）被灌注至已接種hMSC源性成骨細胞之PTCP試片的孔洞中。接 -40- 200817019 著該Matrigel於37°C下經培養聚合。具有灌注HUVEC、 111^(：-〇13-接種01^?建構物（參見圖2八之紅點）之組成建構物被植入嚴重聯合免疫缺損（SCID )鼠背部4週。對照建構物包含hMSC-Ob-接種pTCP試片及無細胞之 βΤΧΡ試片。當收成活體內植入物時，該收成之HUVEC灌注、 hMSC-Ob-接種βΊΧΡ.建構物於馮庫薩染色下顯示βΤΧΡ支架材料之間的礦化區域（參見例如圖2Β )。以蘇木紫及伊紅染色可見礦物結節（參見例如圖2C )之間由內皮樣細胞所形成的血管樣空腔（參見例如圖2 C中之PV )。檢視較高倍數之馮庫薩切片時，可見βΤΧΡ建構物中有大量礦化區域（參見例如圖2D )。由於HUVECs係均勻地接種於MaUigel中，很明顯地由內皮樣細胞排列所形成之空腔樣結構（參見例如圖2C )與活體內植入時HUVECs重新組織有關。這些資料證實，人MSC成骨細胞和人內皮細胞共同接種於生物相容性材料之不同空間區域可調節礦物組織t 間的血管樣結構。因此，在工程化血管形成骨中一些細胞系可被最佳化，諸如H S C s、M S C s、及/或它們的細胞系衍生細胞包括HSC源性內皮細胞及MSC源性成骨細胞。實施例2 :活體外骨髓源性造血幹細胞分化成內皮樣纟田@ 在臨床應用上，可藉最小侵入之方式自骨髓+ _ M S C s分離之H S C s係較佳。有硏究指出H S C s的擴增緩慢 -41 - 200817019 (Shihet al·，20 00; Li et al.，2004)，而 FGF-2 可加速 HSC 之擴增速率（Wilson and Trump，2006; Yeoh et al·， 2006 )。發明人的經驗顯示，HSCs之擴增速率確實較 MSCs及HUVECs緩慢。或者，HSCs可分化成內皮細胞，再擴增HSC源性內皮細胞。製備人骨髓樣本（與上述相同）以分離HSCs。利用 CD34及磁珠分離術分離非黏附性細胞（EasySep， AllCells, Berkeley, CA )。該分離之 C D 3 4 陽性細胞（ CD34+ )被認爲是HSCs。在塗覆纖維連接蛋白之培養皿上，HSCs呈現圓形之細胞形狀（參見例如圖3A)，與具有紡錘形狀之二維培養MSCs成明顯對比（與例如圖1B 比較）。將HSCs轉移到新的培養皿，在DMEM中添加內皮分化補充劑，包含 VEGF ( 10奈克/毫升）、bFGF ( 1 奈克/毫升）及IGF-1 ( 2奈克/毫升）（Shi et al· 1 998; Shih et al., 2000; Li et aL, 2004 )。 HSCs經大約2週後開始形成集落（參見例如圖3B ) 。接著在內皮分化補充劑之刺激下，HSCs分化成不連接之細胞，並形成互相連接該些細胞之管狀構造（參見例如圖3C ) 。HSC源性細胞爲乙醯化低密度脂蛋白（Ac- LDLs)陽性細胞，此爲典型的內皮細胞標記，以Ac-LDL 螢光位於細胞內爲證（參見例如圖3D ) 。HSC源性內皮細胞亦表現溫韋伯氏因子（v ο n W i 11 e b r a n d F a c t 〇 r，v W F ) ，這是一種原生內皮細胞之標記，可以抗體染色顯示（參見例如圖3E ) 。HSC源性內皮細胞（HSC-ECs )(參見 -42- 200817019 例如圖3F左長條）相較於對照組纖維母細胞（FBs )(參見例如圖3F右長條）表現顯著較多之VWF。綜上所述，這些資料證實分離自人骨髓之HSCs可分化成內皮樣細胞，以原始內皮細胞形態學及標記爲證。這些HSC源性內皮細胞形成細胞間管狀連接。因此，工程化血管形成骨可由HSCs與MSCs及/或 HSC源性內皮細胞與MSC源性成骨細胞混合產生。此模擬發育期間血管侵入之天然骨形成方式。長骨骨幹中段之成骨作用伴隨血管，證明造血及間質幹細胞在（血管形成之）骨生成中的天然協同作用。實施例3:生長因子誘導活體內聚合水凝膠之血管新生本發明證實HSCs及MSCs可分化成終末細胞系，諸如構成血管及骨骼之一些建造單位的內皮細胞及成骨細胞。本發明亦證實活體內骨支架可建構血管樣結構。然而，現存文獻顯示工程化血管可因異常過高之內皮細胞穿透性而滲漏（Richardson et al·，2001; Valeski and Baldwin， 2003)。要決定bFGF對宿主源性血管新生之影響，令血管生成因子bFGF輸送至緻密之聚合性水凝膠聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA )，其在先前試驗中已知無法令活體內宿主源性血管穿透（Alhadlaq and Mao，2003; Alhadlaq et al·，2004; Alhadlaq and Mao，2005; Stosich and Mao, 2006 )。當組織工程化骨之規模擴大至癒合大型、關鍵大小之 -43- 200817019 骨缺損臨床應用時，次理想之血管形成將是特別嚴重的問題。以下資料顯示實體巨通道及包封於聚合性水凝膠中之生物活性因子誘發宿主源性血管新生。設計四種PEG水凝膠之構型（參見例如圖4)( Stosieh et al·，2006 )。第一組由PEG水凝膠單獨構成。 PEG圓柱體以6x4毫米（直徑X厚度）之體積生產（參見例如圖 4A )。第二組由巨通道單獨構成。在光聚合性 PEG圓柱中產生總共3條巨通道（各爲1毫米直徑）（參見例如圖4B)。第三組單獨由bFGF組成。共10微克/毫升之bFGF被添加至液相之PEG水凝膠，然後進行光聚合作用。在這組不產生巨通道（參見例如圖4C)。第四組由bFGF及巨通道構成。共10微克/毫升之bFGF被添加至液相之PEG水凝膠，然後進行光聚合作用及產生3個巨通道（各爲1毫米直徑）（參見例如圖4D )。無外源性細胞被輸送至四組中之任何一組。所有PEG圓柱體均具有6x4毫米（直徑X厚度）之相同體積，且活體皮下植入SCID鼠背部4週（每組N = 8 )。經活體植入免疫缺損鼠背部4週後，取出樣本進行分析得到下列觀察結果。無添加bFGF或巨通道之PEG水凝膠並未顯示血管浸潤之巨觀證據（參見例如圖5 A )。相反的，有3個實體巨通道之PEG水凝膠自活體取出時顯示3個紅點（參見例如圖5 B )。下列組織學及免疫組織化學證據顯示這些樣本含有宿主源性血管組織。添加 bFGF但不含巨通道之PEG水凝膠整體的顏色較暗（參見 -44 - 200817019 例如圖5 C )。以下的組織學及免疫組織化學證據顯示隨機區域之宿主源性血管組織浸潤。具有巨通道及添加 bFGF之PEG水凝膠自活體取出時，不光是整體顏色較暗同時還顯示3個紅點（參見例如圖5 D )。下列組織學及免疫組織化學證據顯示宿主源性血管組織僅浸潤至巨通道管腔中，但無法浸潤至PEG水凝膠之其他區域。組織及免疫組織化學結果（Stosich et al. (2006))如下。無bFGF或巨通道之PEG水凝膠組（第一組）與先前資料一致（Alhadlaq and Mao，2003; Alhadlaq e t al·， 2 0 0 4; Alhadlaq and Mao，2005; Stosich and Mao, 2005 ) ，未顯示宿主細胞侵入或任何血管生成之徵兆（參見例如圖6A )。有巨通道但無bFGF之PEG水凝膠組（如上第二組）顯示宿主細胞僅侵入巨通道但非PEG之其他區域 (參見例如圖6B )。相反的，無巨通道但添加bFGF之 PEG水凝膠組（第三組）顯示宿主細胞浸潤明顯隨機區域 (參見例如圖6C )。添加bFGF且有巨通道之PEG水凝膠組（如上第四組）顯示宿主細胞僅侵入巨通道，但非 PEG之其他區域（參見例如圖6D)。這些結果顯示下列。有巨通道及bFGF之PEG水凝膠之宿主組織長入面積爲〇.47±0·18平方毫米，顯著高於不含bFGF但有巨通道之PEG水凝膠（〇·13±0·05平方毫米 )(平均値土標準差；Ρ<0·01;每組Ν = 8 )(參見例如圖7 )。因此，組合實體及生物活性設計之ΡΕ〇水凝膠促進宿主組織長入。 -45- 200817019 較高倍數影像分析顯示血管浸潤至PEG水凝膠，其他方式拒絕宿主細胞長入（參見例如圖8)。宿主組織長入發生於有或無bFGF之巨通道中（參見例如圖8A、8B及圖8E、8F)。然而例如圖7所示，含 bFGF之PEG水凝膠之巨通道中宿主組織之浸潤量（參見例如圖8E、8F)顯著高於有巨通道但不含bFGF之PEG 水凝膠（參見例如圖8 A、8B )。含bFGF但無巨通道之 PEG水凝膠顯示零星結締組織長入（參見例如圖8C、8D )。血管樣結構包含在以內皮樣細胞爲內襯且被纖維母細胞樣細胞圍繞之血管樣結構中類似紅血球之細胞（參見例如圖 8 E、8 F )。利用抗血管內皮生長因子（VEGF )抗體染色之免疫定位顯示長入之宿主組織爲血管組織。抗VEGF之強染色出現在有或無bFGF之巨通道中之浸潤宿主組織（參見例如圖9B、9D ) 。VEGF抗體亦標記該宿主纖維包膜（參見例如圖9A)及浸潤至含bFGF但無巨通道之PEG水凝膠中之宿主組織（參見例如圖9C )。這些資料證實血管樣結構（如圖8所示）係由PEG 水凝膠中之bFGF及/或巨通道所誘發之宿主源性血管新生。血管新生不見於無bFGF或巨通道之PEG水凝膠中（參見例如圖9A ) 。PEG水凝膠之孔洞大小應足以讓生長因子及養分擴散，以先前硏究中成脂、成軟骨及成骨細胞存活爲證據（Burdick et al·，2003; Kim et al·，2003;

Alhadlaq et al.，2004; Alhadlaq and Mao, 200 5; Moioli et -46 - 200817019 al·，2006; Stosich and Mao，2006)。然而 ’ PEG 水凝膠之孔洞大小並不足以讓宿主細胞長入除非導入通道及生長因子諸如bFGF。因此，巨通道之宿主組織長入可被用來沿預定途徑引 ^ 導血管新生及宿主細胞侵入。另外，bFGF或其他血管新 • 生因子之放大額外加速長入。這些結果支持骨建構物中宿主源性血管新生之調節及促進工程化血管之成熟。實施例4 :組織工程之細胞接種密度在工程化生物構造中的一個實際問題是應導入多少細胞至支架中（Moioli and Mao，2006 )。當間質幹細胞發育成成骨祖細胞及發育末期之成骨細胞時，密度依賴性細胞分裂抑制（之前稱爲接觸抑制）係影響細胞存活之因素 (Alberts et al.，2 002 )。在工程化組織支架中接種太多細胞造成局部獲得之分裂原、生長因子及存活因子不足， • 可能導致細胞凋亡及不必要的活體外細胞擴增時間浪費（ • Moioli and Mao, 2006 )。另一方面，在工程化組織支架 * 中接種太少細胞可能導致不良的再生結果。因此，應決定 HSCs、MSCs及其細胞系衍生細胞之理想密度以最佳化該工程化血管骨之再生結果（參見例如圖1 0 )。本發明顯示各種初期細胞接種密度之MSCs、MSC源性成骨細胞及MSC源性軟骨細胞的影響。如上所述及依照先前方法，自多位健康供應者之各個骨髓樣本分離人 MSCs，於單層培養中擴增並分別分化爲成軟骨細胞及成 -47- 200817019 骨細胞（Alhadlaq et al·，2004; Marion et al·，2005; Yourek et al·，2005; Moioli et al·, 2006)(參見例如圖 10)。各種細胞系（人間質幹細胞（hMSCs )、人間質·幹細胞源性成骨細胞（hMSC-Ob)及人間質幹細胞源性軟骨細胞（hMSC-Cy))均採用四種細胞密度：OxlO6細胞/毫升、5χ106細胞/毫升、40χ106細胞/毫升及8〇χ106細胞/ 毫升。先前已硏究過中間的細胞接種密度2〇xl 06細胞/毫升（Alhadlaq and Mao，2005 ) 。ΟχΙΟ6 細胞 / 毫升=無細胞之建構物。各種細胞密度及細胞系之細胞懸浮液被包封於液相PEG水凝膠中，然後經光聚合反應，及繼續培養三維PEG建構物4週（參見例如圖1 0 )。分別於經常更換培養基之DMEM、含成骨培養基之 DMEM或含成軟骨培養基之DMEM中持續培養三維PEG 水凝膠建構物4週後，進行組織學染色及生物化學檢查。成骨培養基包含 100奈莫耳地塞米松（dexamethasone) 、50微克/毫升抗壞血酸及10 0毫莫耳β-甘油磷酸，而成軟骨培養基包含10奈克/毫升轉化生長因子β3 (詳見下述 )° 結果顯示經4週於對應之01£!^1、含成骨培養基之 DMEM及含成軟骨培養基之DMEM培養基培養後，PEG 水凝膠維持起始細胞接種密度（參見例如圖11)(參見例如Troken and Mao，2006)。圖11爲H&E染色之示範性結果，顯示包埋各種密度之人間質幹細胞（上列）、 hMSC源性成骨細胞（中列）及hMSC源性軟骨細胞（下 48- 200817019 列）的PEG水凝膠經4週三維建構物培養後之組織學觀察結果。大致來說，PEG水凝膠支架中之終點細胞密度類似5M細胞/毫升、40M細胞/毫升及80M細胞/毫升（5M 細胞/毫升=每毫升細胞懸浮液含5 Μ細胞）之起始細胞接種密度模式。 PEG水凝膠中之人間質幹細胞源性軟骨細胞（hMSC-Cy ).經培養4週後，不光維持它們的成軟骨細胞表現型同時也維持其對應起始細胞接種密度（參見例如圖1 2，番紅染色）（參見例如Troken and Mao，2006 )。番紅是一種陽離子染劑，其與軟骨相關糖胺聚醣（ glycosaminoglycans)結合諸如硫酸角質素及硫酸軟骨素，且被廣泛用於標示天然關節及生長板軟骨（參見例如 Mao et al·, 1 998; Wang and Mao, 2002; S undar amurthy and Mao，2006 )。相反的，雖然PE G水凝膠中之h M S C s 經培養4週後仍維持它們的起始細胞接種密度，但它們對番紅染色呈現陰性反應（參見例如圖1 2 )。 PEG水凝膠中之人間質幹細胞源性成骨細胞（hMSC-〇b )經4週培養後，不光維持它們的成骨細胞表現型同時也維持其對應起始細胞接種密度（參見例如圖1 3，馮庫薩染色）（Troken and Mao，2006 )。馮庫薩染色法慣用於標示天然成骨作用及組織工程化成骨作用中之礦物形成（參見例如 Alhadlaq and Mao? 2003; Alhadlaq et al.? 2004; Marion et al·，2005; Moioli et al·，2006)。相反的，雖然PEG水凝膠中之hMSCs經4週培養後仍維持它們 -49- 200817019 的起始細胞接種密度，但它們對馮庫薩染色呈現陰性反應 (參見例如圖1 3 )。令包封相同密度之hMSCs、hMSC-Ob及hMSC-Cy的 PEG水凝膠植入裸鼠體內，該活體內資料顯示起始細胞接種密度增加導致由hMSC源性成骨細胞及hMSC源性軟骨細胞所形成之基質含量增加（參見例如圖14)，此延續上述之活體外資料（參見例如圖1 1至1 4 )。此細胞密度試驗證實先前比較5M細胞/毫升及20M 細胞/毫升二種細胞密度之活體內試驗結果（Alhadlaq et al·，2004; Alhadlaq and Mao，2005)，也就是較高的細胞接種密度例如20M細胞/毫升之再生結果優於5M細胞/毫升之接種密度。然而，細胞接種密度過高可能引起諸如營養素短缺、異常細胞-細胞接觸、細胞凋亡及浪費不必要之活體外細胞擴增時間的問題（Moioli and Mao，2006 ) 這些細胞密度實驗證實組織工程支架之最佳化包封細胞接種密度可最大化再生結果（參見 Alhadlaq et al.， 2004; Alhadlaq and Mao, 2005; Troken and Mao, 2006 ) 〇實施例5 : HSCs及MSCs之最佳比例以下實驗探討在工程化血管形成骨中理想的HSCs及 M S C s比例。 -50- 200817019

表2.利用8x8x2之因子設計試驗探討HSCs及MSCs對工程化血管形成骨之相對影響：細胞比例（8) X樣本大小（8) X活體內植入時間（2)。活體外各支架中之細胞總數（HSCs及MSCs總數 )固定維持在8xl06細胞/毫升，而HSCs和MSCs之相對比例從 1:1至1:15不等，如此可決定HSCs及MSCs對工程化形成骨之相對影響。組別 HSCs MSCs HSC:MSC 樣本大小活體內植入 (細胞數量/毫升) (細胞數量/毫升) 比 (每組裸鼠數量）時間（週） 1 0 8xl06 0 8 8, 16 2 0.5xl06 7.5x106 1:15 “ “ 3 2xl06 6χ106 1:3 “ “ 4 4x106 4χ106 1:1 “ “ 5 6x106 2χ106 3:1 “ “ 6 7·5χ106 0.5χ106 15:1 “ “ 7 8χ106 0 0 “ “ 8 無細胞支架 ςς “ 鼠總數 128=8組X每組8個樣本X 2個時間點人HSCs及MSCs係按上述試驗及先前建立之方法（ Alhadlaq and Mao, 2 0 0 3; Alhadlaq et al·，2004; Yourek et al” 200 4; Alhadlaq and Mao，2005; Moioli and Mao，2006; Moioli et a 1.5 2 0 0 6 ; Marion and Mao, 2006; Troken and Mao，2006; Stosich et al·, 2006 )自數個骨髓樣本中之各個樣本分離。每個建構物使用來自單一捐贈者之HSCs及 MSCs，以避免任何可能的免疫排斥反應。HSCs如上述試驗所述被均勻接種於Matrigel中，並注入已先接種MSCs 之PTCP孔洞中。將細胞-支架建構物植入裸鼠背部，該鼠不排斥人類細胞。採用活體內植入8及1 6週之時間係根據先前經驗中血管新生（若發生的話）預期在這段時間內 -51 - 200817019 發生（Stosich et al·，2006) 該植入樣本於取出後進行下表3所列之分析。表3_工程化血管形成骨之結果評估及評估標準。這些技術之詳細方法於下說

明。 __-:__________— 組織學構造分析免疫組織化學及生化分析血管形成骨之力學特性參數骨血管骨血管骨血管 H&E H&E 顯微電腦斷層血管數量及平骨橋蛋白、骨鈣素、 α·平滑肌，肌功蛋白以原子力顯微鏡微壓入 Von Kossa Masson’s trichrome 數位X光組織形態學均直徑骨唾液酸蛋白 Connexin-43, 具雙軸能力之傳統力學測試血小板內皮細胞黏附分子

KDR/VEGFR -2/Flk-l 成功標準血管樣構造存在類似小樑骨構造之礦化組這些骨及血管標記存在整體力學特性爲天礦化組織存在織形成骨及血管標記之定量生然小樑骨之至少化分析_50%_

Alhadlaq and Kopher and Mao, et al” 2003 Mao, 2003 Mao et al., 2003 Alhadlaq et al” 2004 Vij and Mao, 2006 Sundaramurthy Ho et ai, 2006 and Mao, 2006 Takai et al., 2006 Vij and Mao, 2006 Meinel et al., 2005 & 2006

Mao et al.，1998 Radharkrishnan and

Mao, 2004

Alhadlaq and Mao, 2005

Allen and Mao, 2004

Sundaramurthy and Mao, 2006 Guo, 2000

Landesberg et al.，1999 Guo and Kim, 2002

Stosich et al., 1999 Vunj ak-N o vako vie et al, 1999

Stosich et al., 2006

Xin et al., 2006_ H&E :蘇木紫及伊紅染色，用於多種分化組織之普通組織學染色；曼森氏三色染色法（Masson’s Trichrome):用於血管之組織學染色；〇CN :骨鈣素，成骨細胞之黏附蛋白，其爲成骨細胞分化之晚期標記；OPN :骨橋蛋白，成骨細胞之黏附蛋白，其爲成骨細胞分化之晚期標記；vWF :溫韋伯氏因子，在內皮細胞上發現之表面醣蛋白，其爲內皮細胞分化之晚期標記；VEGFR :血管內皮生長因子受體，爲內皮細胞分化之早期-晚期標記；KDR/VEGFR-2/Flk-l : 血管內皮生長因子受體2,爲內皮細胞分化之早期-晚期標記。 -52- 200817019 工程化血管骨體積係以下面詳述之方法利用數位χ 光及微觀斷面X射線照像法（μ(：Τ )定量。工程化血管骨之力學分析係利用原子力顯微鏡（AFM )之微壓入測試以及傳統力學測試中之壓縮及剪切試驗進行。工程化血管骨之顯微力學特性受到注意，可輕易地利用原子力顯微鏡進行硏究，但無法利用Instron或MTS實驗儀之巨觀力學測試硏究。然而’ MTS可測試工程化血管骨之整體壓縮及剪切特性，這無法以AFM測試。因此，AFM及MTS爲互補之工程化血管骨的力學測試方法。所有數據資料進行統計分析。對於常態資料分布，利用邦弗朗尼檢定（ Bonferroni tests )進行變異數分析（ANOVA )。如果資料分佈偏斜’則利用非參數檢定諸如克-瓦氏（Kruskal-Wallis)進行變異數分析。統計顯著性係定於〇·05之α水準。自體細胞及異體細胞都曾被用於組織工程。本發明說明自體細胞之組織工程模式（人細胞植入裸鼠）。該裸鼠作爲模擬人之「培養器」。相較於異體細胞，自體細胞具備一些重要的優點，諸如無免疫排斥及病原傳播。異體細胞可輕易地製備以供接受者使用，因此可縮短與自體細胞相關之細胞調控所需的時間。然而，這可能需要投服免疫抑制藥物並可能使血管形成骨之組織工程結果複雜化。選擇骨髓幹細胞至少部份是因爲骨髓源性MSCs及HSCs之特徵已被明確定義且具有建構血管形成骨之潛力的觀察（如上述試驗所示）。最近被報告的脂肪源性幹細胞可能作 -53- 200817019 爲骨髓源性細胞之替代細胞。實施例6 : HSCs、MSCs及其細胞系衍生細胞之理想細胞密度最佳化工程化血管形成骨之結果雖然HSCs及MSCs在血管形成骨之發育具有協同作用，一些其他細胞系亦參與血管形成之成骨作用，包括內皮細胞及成骨細胞。成骨細胞是MSC源性終末細胞之一。因此，有必要探討混合HSCs與MSC源性成骨細胞以及混合MSCs與HSC源性內皮細胞是否可最佳化血管形成成骨工程。內皮細胞是否源自MSCs、HSCs或其他祖細胞並未完全了解（Yin and Li，2006 )。內皮樣細胞係分化自HSCs，因此提供可存活之細胞來源以硏究HSC源性內皮細胞於工程化血管骨之功能。下列實驗設計不僅探討HSCs及MSCs於血管形成骨工程中之細胞接種密度，亦探討其細胞系衍生細胞包括 H S C源性內皮細胞及M S C源性成骨細胞。 -54- 200817019 表4.實驗1之實驗設計-113(^及]^8(：源性成骨細胞。利用8\8乂 2之因子設計方法探討HSCs及MSC源性成骨細胞對工程化血管形成骨之相對影響：細胞密度（8) X樣本大小（8) X活體內植入時間（2)。組別 HSCs MSC(源性成骨細 HSC:MSC- 樣本大小活體內植入 (細胞數量/毫升）胞(細胞數量/毫升) 〇b比例侮組裸鼠數量) 時間(週） 1 0 8xl06 0 8 8, 16 2 0.5x 106 7.5x 106 1:15 “ “ 3 2χ 106 4x 106 1:3 ςς “ 4 4χ ΙΟ6 2xl06 1:1 “ “ 5 6χ106 lx 106 3:1 ςς “ 6 7.5χ ΙΟ6 0.5x 106 15:1 “ “ 7 8χ106 0 0 “ “ 8 無細胞支架 “ “ 鼠總數 128=8組X每組8個樣本X 2個時間點表5. 實驗2之實驗設計-MSCs 及HSC源性內皮細胞。利用8x8 X2之因子設計方法探討MSCs及HSC源性內皮細胞對工程化血管形成骨之相對影響：細胞密度（8 ) X樣本大小（8 ) X活體內植入時間（2 )。組別 MSCs HSC(源性成骨細 HSCrMSC- 樣本大小活體內植入 (細胞數量/毫升)胞(細胞數量鹰升) Ob比例侮組裸鼠數量) 時間(週) 1 0 8x106 0 8 8, 16 2 0·5χ106 7·5χ106 1:15 “ CC 3 2x106 4x106 1:3 “ “ 4 4χ106 2x106 1:1 U “ 5 6x106 ΙχΙΟ6 3:1 “ 6 7.5χ106 0.5χ106 15:1 “ “ 7 8χ106 0 0 “ “ 8 無細胞支架 “ “ 鼠總數 128=8組X每組8個樣本x2個時間點 -55- 200817019 人HSCs及MSCs係按上述試驗方法及先前建立之方法(Alhadlaq and Mao, 2 0 0 3; Alhadlaq et al.，2004; Yourek et al·，2 0 0 4; Alhadlaq and Mao，2005; Moioli and Mao 5 2 0 0 6 ; Marion and Mao，2006; Troken and Mao, 2006; Stosich et al·，2006 )自數個骨髓樣本中之各個樣本分離。每個細胞接種建構物使用來自單一捐贈者之HSCs及 M S C s，以避免任何可能的免疫排斥反應。在實驗1中， MSCs係按先前建立之方法（Alhadlaq and Mao，2003; Alhadlaq et al·，2 0 0 4; Yourek et al·，2004; Alhadlaq and Mao，2005; Moioli and Mao，2006; Troken and Mao，20 06; Marion and Mao，2006 )分化成成骨細胞樣細胞。在實驗 2中，HSCs係按上述試驗之方法分化成內皮樣細胞。HSC 源性內皮細胞如上述試驗被均勻接種於Matrigel中，並注入已先接種MSC源性成骨細胞之βΤΧΡ孔洞中。在實驗2 中，於接種HSC源性內皮細胞至Matrigel之前，先將 MSCs接種至βΤΧΡ孔洞中。在實驗1及2中，將細胞-支架建構物植入裸鼠體內，該鼠不排斥人類細胞。採用活體內植入8及1 6週之時間係根據我們過去的經驗，其顯示血管新生（若發生的話）預期在這段時間內發生（31〇以(：11 et al.，2006) 〇結果評估及資料分析統計學如上述。亦可共同接種HSC源性內皮細胞與MSC源性成骨細胞或軟骨細胞。 -56- 200817019 實施例7 :血管新生生長因子促進HSC及MSC源性血管形成骨中之血管成熟工程化血管系統必須在新形成之骨組織中發揮適當功能，諸如提供適當養份供應、氧氣、氣體交換及細胞供應。血管新生涉及一連串事件，包括內皮細胞活化、移動及增生。工程化血管可因異常過高之內皮穿透性而滲漏（ Richardson et al·，2 0 0 1; Valeski and Baldwin，2 0 0 3 )。已知有一些血管新生生長因子在天然發育中調節血管形成（ Thurston，2 002; Ehrbar et al., 2003; Valeski and Baldwin, 2003; Ferrara, 2005 ) 。V E GF於骨血管新生作用之最初數天高度表現（Nissen et al·，1 996; Hu et al·, 2003; Bohnsack and Hirschi，2 0 0 4; Ferrara，2005 ) 〇 PDGF 於 VEGF作用後作用在血管，促進血管內皮細胞成熟（ D ar 1 and and D’Amore， 1 9 9 9; Richardson et al” 200 1; Bohnsack and Hirschi，2004 )。組織工程中其他「滲漏」

血管可能因缺乏相關之管壁細胞諸如周細胞及平滑肌細胞所致。硏究證實PDGF可誘發管壁細胞之招募（Darland and D’Amore, 1 999; Yancopoulos e t al. 5 2 0 0 0; Valeski

and Baldwin, 2003; Ferrara, 2005 )。因此，輸送 PDGF 亦藉由招募管壁細胞而促進工程化新生血管之成熟。要決定能促進自HSCs或HSC源性細胞成熟爲工程化血管之VEGF及PDGF的理想劑量，使用相較於所認爲之生理劑量更高及更低之劑量。快速釋放VEGF於血管新生細胞之招募及增生方面係爲所欲（Nissen et al.，1 996; Hu -57- 200817019 et al.? 2003; Ferrara, 2005 )。因此，以浸泡方式令 VEGF 被吸收至PTCP試片中，以於活體植入之前數小時或數天內被快速釋放。PDGF作用在VEGF之後，其不僅促進內皮細胞成熟，亦爲管壁細胞之化學趨化物（Darland and D’Amore，1 9 9 9; Yancopoulos et al.，2000; Valeski and Baldwin, 2003; Ferrara, 2005 )。因此，P D G F 被包封於微顆粒中以非突然釋放之方式持續釋放（Moioli et al.， 2006 )，如此可使PDGF在快速釋放之VEGF作用後逐漸而緩慢的釋放。依上述試驗之經驗，令PEGF微顆粒包封於Matri gel中將進一步延緩其釋放速率。組別水凝膠中之微VEGF微雜構物 PDGF 微粒中之PDGF (奈克/毫升）細胞 HSC:MSC HSC-EC:MSC MSC-Ob:HSC 樣本大小活體內植 (鼠/組）入(週） 1 0 安慰劑微粒自Aims 1及2中理想化 8 8, 16 2 1 10 “ “ “ 3 1 100 “ ςς “ 4 10 10 “ “ 5 1 1 “ “ “ 鼠總數 80=8個樣本χ5組χ2 個時間點表6.促進工程化骨中新生血管成熟之實驗設計。HSC-EC:造血幹細胞源性內皮細胞；MSC-Ob :間質幹細胞源性成骨細胞。結果以8x5x2之因子設計方法進行探討：樣本大小（8) X生長因子劑量（5 ) X活體內植入時間（2) 。 _ 在Matrigel中加入VEGF，然後注入βΊΧΡ之孔洞中以供快速釋放。PDGF係以複乳化技術包封於PLGA微顆 -58· 200817019 粒中，技術細節於本發明中說明及按先前方法進行（ Moioli et al.5 2006 ) 。PDGF以緩慢速率釋放且無突然釋放。於添加生長因子之前進行細胞接種，其方法與實施例 1相同。結果評估及資料分析統計學係如上述。 VEGF及PDGF之劑量係得自上述試驗及現存文獻（參見例如 Darland and D’Amore，1 999; Yancopoulos et al., 2000; Richardson et al·，2001 ; Valeski and Baldwin，2003 ; Ferrara，2005 )。或者，可使用 bFGF取代 VEGF，亦得自過去經驗（Stosich et al·，2006 )。添加多種生長因子至細胞傳遞產生一個複雜的系統，雖然這是天然血管新生及成骨作用進行的方式。添加VEGF至Matrigel中之替代方式爲冷凍乾燥至βΤΧΡ。已知PLGA在分解時會產生酸性副產物。然而，因爲在製造微顆粒時僅使用少量PLGA ，該酸性副產物的問題並不嚴重，在之前的硏究可忽略這個問題（Moioli et al·，2006 )。我們預期P D GF如現存文獻所示可招募血管平滑肌細胞（Darland and D，Amore， 1 999; Yancopoulos et al·，2000; Valeski and Baldwin， 2003; Ferrara, 2005 )。考慮到最終臨床治療之經濟性，通常採用最低有效劑量。在導入H S C s及M S C s以建構血管形成骨所需要之血管新生生長因子的量，可能不像未導入HSCs及MSCs (及/或其細胞系衍生細胞）時那麼高。我們可以合乎邏輯地認爲，HSCs和MSCs及/或其細胞系衍生細胞也可能調節必要的血管新生生長因子。 -59- 200817019 實施例8 :理想輸送HSCs、MSCs及/或血管新生生長因子令關鍵大小之顱骨缺損有效癒合以上說明之實驗利用異位成骨方式，提供理想之細胞及/或生長因子基底之建構血管形成骨的方法。顱骨缺損爲重要之臨床需求，亦是可用於測試該理想之細胞及/或生長因子基底建構血管形成骨方法之原位部位。此實驗提供原位骨缺損環境以測試依上述方法決定之理想條件相較於任何單獨組成份及/或傳統骨組織工程法，是否可更有效地令關鍵大小之顱骨缺損癒合。顱骨缺損代表與上述實驗所使用之異位植入部位不同的實驗模式。表7.以理想化之血管形成骨建構方法令關鍵大小顱骨缺損癒合之實驗設計。HSC-EC :造血幹細胞源性內皮細胞；MSC-Ob :間質幹細胞源性成骨細胞。結果以8x7x2之因子設計方法進行探討 :細胞組成份（7) X樣本大小（8) X活體內植入時間(2)。組別 VEGF 及 PDGF 輸送劑量細胞輸送細胞密度及比例自Aims 1及2理想化樣本大小侮組鼠數量）活體內植入 (週） 1 自實施例3理想化 HSCs 8 8,16 2 “ MSCs “ “ 3 “ HSCs 及 MSCs “ “ 4 “ HSCs 及 MSC-Ob “ “ 5 “ MSCs 及 HSC-EC “ “ 6 “ 無細胞之PTCP “ “ 7 ifirr 黑無細胞之PTCP ςς “ 鼠總數量112=8個樣本X 7組X 2個時間點結果評估如上所述。此外，於預定犧牲時間點之前2 -60- 200817019 週及1週，腹腔注射15黃綠素（calcein )及茜素（ alizarin )以供後續判斷新形成之顱骨（Parfitt et al.， 1987; Kopher and Mao, 2 0 0 3; Clark et al·，2005 )。資料分析及統計學如上所述。此外，骨形成速率（bfr )及礦物沉積速率（MAR )以具動態組織形態學功能之螢光顯微鏡定量（Parfitt et al·，1 987; Kopher and Mao，2003; Clark et al.，2005) o 該輸送之雙重生長因子不光是對輸送之細胞系有複雜的作用，同時也對侵入該顱骨環境之宿主細胞有複雜影響。舉例來說，除了促進血管新生之外，PDGF有利成骨祖細胞之增生（Park et al·，2000 )。這個複雜的系統係提供干涉工具所必需，若無該工具則關鍵大小之顱骨缺損無法癒合。雖然在上述實施例3中已得到該雙重生長因子（此處爲VEGF及PDGF)之理想劑量，但這些劑量可能需要調整，因爲顱骨缺損模式中可能存有內源性生長因子。實施例9 :分離及培養擴增骨髓源性造血幹細胞及間質幹細胞根據上述實驗之方法及我們先前發展之方法分離骨髓源性造血幹細胞及間質幹細胞（參見例如 Alhadlaq and Mao，2 0 0 3; Alhadlaq et al·，2004; Alhadlaq et al·, 2005; Stosich and Mao 5 2 0 0 5; Marion et al.，2005; Yourek et al·，2005; Moioli et al·，2006; Marion and Mao，2006; Stosich et al.，2006)。如先前硏究（Alhadlaq et al·， 200817019

2005; Marion et al·，2005; Yourek et al·，2005 )，購買商用之匿名成人捐贈骨髓樣本（AllCells, Berkeley，CA)。利用 RosetteSep 套組（AllCells，Berkeley，CA)之陰性選擇技術，使用一部份之各骨髓樣本以分離間質幹細胞（ hMSCs)。該分離之MSCs利用添力〇 1〇%胎牛血清（卩33 )(Biocell，Rancho Dominguez，CA)及 1 %抗生素（1χ抗生素-抗真菌素，包括100單位/毫升青黴素G鈉鹽、100 微克/毫升鏈黴素硫酸鹽及0.25微克/毫升兩性黴素B( amphotericine B ) ( Gibco，Invitrogen，Carlsbad，CA)) 之低糖 DMEM 培養基（Dulbecco’s Modified Eagle ’ s Medium-Low Goucose，DMEM-LG; Sigma，St. Louis，MO) 培養擴增（Alhadlaq et al·，2005; Marion et al·，2005;

Yourek et al·，2 0 0 5; Moioli et al·，2005; Stosich et al.， 2006 )。各實驗中每個骨髓樣本之hMSCs擴增不超過3 代。在過去之經驗中，很少需要擴增超過3至5代。細聛培養於37°C下95%空氣/5%二氧化碳中進行。利用同一位捐贈者之骨髓樣本分離造血幹細胞。利用與磁珠連接之CD34抗體（RosetteSep )進行陽性篩選。該純化細胞使用流式細胞儀測定該分離細胞中CD34陽性 (CD3 4+ )之百分比。細胞存活性亦藉台酚藍排除法評估。CD3 4 +細胞係分離自初期非黏附性細胞，以添力口 1 〇°/◦胎牛血清之IM D M ( H S C生長培養基）於3 7 °C下於9 6孔纖維連接蛋白塗覆塑膠培養盤上培養3天，之後收集非黏附性細胞（Shi et al. 1 998 )。該非黏附性細胞被移出及轉 -62- 200817019 換至新鮮孔洞。重複這個步驟二次，此時該剩餘之懸浮細胞被接種並令其黏附至纖維連接蛋白塗覆盤上。實施例10 : HSCs分化成內皮樣細胞及MSCs分化成成骨樣細胞當細胞匯集時，hHSCs被連續轉換至纖維連接蛋白塗覆之24、12及6孔之組織培養盤，最後換到培養皿中（ Petri dishes)。繼續擴增H S C源性內皮樣細胞。初步資料顯示這些細胞顯示內皮細胞形態，且表現數種內皮細胞標記（參見例如上圖3 )。此外，hHSC源性內皮細胞相較於對照細胞表現顯著較多之溫韋伯氏因子（vWF )( — 種內皮細胞標記）（參見例如上圖3 )。纖維連接蛋白粘附細胞於添加內皮細胞分化補充劑（ECS )(其包括 VEGF ( 10奈克/毫升）、bFGF ( 1奈克/毫升）及IGF-1 ( 2奈克/毫升））之含10%胎牛血清之HSC生長培養基中分化。MSCs根據先前方法分化成成骨樣細胞，其成骨刺激補充劑包含 1 〇〇奈莫耳地塞米松（d e X a m e t h a S ο n e )、 50微克/毫升抗壞血酸及100毫莫耳β-甘油磷酸（參見例如 A1 had 1 aq and Mao, 2003 ; A1 had 1 aq et a 1.， 2004;

Alhadlaq et al·，2 0 0 5; Stosich and Mao, 2005; Marion et al·， 2 0 0 5; Yourek e t al·， 2005; Moioli et al.? 2006; Marion and Mao, 2006 ) o

實施例11 :製造PLGA微顆粒及包埋PDGF -63- 200817019 這些方法依照上述實驗進行，亦參考Μ o i ο 1 i等人（ 2006 )之文獻中所提到者。PLGA係聚L-乳酸及聚乙醇酸之生物相容及生物降解性合成共聚物，已經被廣泛使用（參見例如 Lu et al·，2000; Shea et al.，2000; Burdick et al.5 2 0 0 1 ; Hedberg et al., 2003; Karp et al.5 2 003 a; Ochi et al.，2003; Moioli et al·，2006)。總共 250 毫克之聚 L-乳酸及聚乙醇酸（PLGA: 50:50，PLA:PGA) (Sigma, St Louis，Mo)被溶解於1毫升之二氯甲烷。pdGF以我們先前硏究中（Moioli et al.，2006 )之複乳化技術包封於 PLGA微顆粒中。令該混合物震盪混合1分鐘。加入2毫升1 % PV A後，再震盪混合混合物1分鐘。該形成之乳液被加入100毫升0.1% PVA溶液中。將PVA/微顆粒之混合物加入1〇〇毫升之2%異丙醇以除去二氯甲烷，並使微顆粒硬化，置於化學通風櫃中持續攪拌2小時。過濾收集 PDGF微顆粒，經冷凍乾燥，接著令其溶解於氯仿中4小時，然後劇烈搖晃2分鐘。經過4小時靜置澄清後，每單位微顆粒所包覆之PDGF濃度利用PDGF酵素連結免疫吸附套組（R&D Systems，St. Louis, MO)依產品說明定量。包覆預定劑量之PDGF的微顆粒被懸浮於10微升之磷酸鹽緩衝溶液中。在接種細胞後及植入前’將包覆PD GF 之PLGA微顆粒以微量注射器注入Matrigel溶液中。實施例1 2 :灌流細胞接種建構物如果灌注Matrigel之βΊΧΡ建構物中細胞存活不佳’ -64 - 200817019 可利用先前硏究所發展之灌流生物反應器促進大量傳遞（ Vunjak-Novakovic et al，1999; 2002)。簡單來說，建立以介於1 0至1 00微米之線性流速通過支架之培養基灌流，此流速對應天然骨中之灌流速率。在每次通過時，培養 ^ 基於外部圏環式氣體交換器中就氧氣及pH進行平衡。培 # 養基以每二天50%之速度更換。灌流時間以上表3所列出之工程化血管骨結果爲函數加以理想化。實施例13:產生全厚度顱骨缺損、支架及手術植入工程化建構物十一週齡裸鼠以含90% K他命（ketamine )( 100毫克/毫升；Aveco，Fort Dodge，IA)及10%二甲苯胺噻嗪（ Xylazine ) (20 毫克 / 毫升；Mobay，Shawnee, KS)之混合物腹腔注射（IP )麻醉。使用聚維酮碘（1 〇% )消毒手術區域。沿顱骨矢狀中線切開長3公分之直線切口。剝開 # 皮下組織及骨膜以露出皮質骨表面。依照先前使用之方法 (參照例如 Hong and Mao，2004; Moioli et al·，2006)， - 在磷酸鹽緩衝食鹽水灌洗下，於頂骨中央使用無菌牙科圓頭銼製作全厚度之顱骨缺損（5 X 1立方毫米：5毫米直徑 )。按先前之經驗，此5毫米直徑之全厚度顱骨缺損構成重大缺損，若不移植骨該缺損無法癒合（參照例如Hong and Mao，2004; Moioli et al·，2006 )。硬膜及相鄰顱骨縫保持完整(Kopher and Mao ? 2003; Hong and Mao ? 2 0 0 4; Moioli et al.9 2006 ) 。H S C s或H S C源性內皮細胞如上述 -65- 200817019 實驗所述在4°C輕真空下被接種至液態相之Matrigel中。 Matrigel是一種基底膜聚合性水凝膠，已被廣泛運用於內皮細胞黏附及血管新生試驗（參見例如 Abilez et al.， 20 06; Baker et al·，2006; Bruno et al·，2006; Mondrinos et al.，2006; Rajashekhar et al, 2 0 0 6 ) ^ 細胞-Matrigel 溶液被注入已接種hMSC源性成骨細胞之βΤΟΡ試片孔洞中，之後於37°C下膠化Matrigel。βΤΧΡ可購自商業來源，孔洞大小介於 200 至 400 微米（BD BioScience，San Diego, CA)。將βΤΧΡ支架之工程化組織建構物置入5毫米直徑、全厚度之顱骨缺損中，接著以4-0可吸收原質腸線縫合包括骨膜、皮下軟組織及皮膚之手術瓣。實施例1 4 :組織收成、組織學及免疫組織化學包含工程化骨之收成顱骨樣本被用於製備脫礦處理石蠟包埋及未脫礦塑膠包埋切片，利用雙螢光標記（鈣黃綠素及茜素）新形成骨以定量骨組織形態學。在脫礦製備時，樣本被固定於10%多聚甲醛中，以相同體積之20%檸檬酸鈉及50%蟻酸脫礦，以石蠟包埋，並利用上述試驗中標準組織學方法橫向切片10微米厚度（比較Mao et al.， 1 998; Wang and Mao，2002; Kopher et al·，2003 ) ° 以蘇木紫及伊紅、馮庫薩及曼森氏三色法染色連續切片，以觀察工程化骨之不同部位。未脫礦製備如下所述。成骨及血管新生標記之免疫組織化學法按先前發展之方法進行（參見例如 Alhadlaq and Mao, 2005; Stosich et al.，2006; -66 - 200817019

Sundaramurthy and Mao? 2 0 0 6 ) 〇實施例1 5 :利用電腦組織形態計量學定量骨該工程化骨藉電腦化組織形態計量分析 (ImagePr 〇 and Nikon Eclipse E800， Melville, NY)。建構標準柵格（1 1 7 5 x 8 8 0 將之放在4倍物鏡下之組織學樣本上，以定。數據資料如各實施例中所述經統計分析。實施例1 6 :藉雙螢光標記及電腦輔助動態量學定量新形成顱骨利用電腦輔助動態骨組織形態計量學觀前2週及1週經腹腔注射之鈣黃綠素綠（i 及茜素紅（20毫克/公斤）（Parfitt et al 2 0 0 2; Kopher and Mao, 2003; Clark et al. ? 顱骨樣本，令其於分級乙醇及丙醇中脫水，甲基丙烯酸甲酯（MMA)及15%鄰苯二甲未脫礦包埋。該聚合MMA-樣本塊利用帶鋸切割未脫礦鈣化組織樣本之Leica p〇lycut 矢狀面切出15微米之連續未脫礦切片。在，鈣黃綠素標記之新礦化骨係於螢光顯微鏡 2 0 0 2; Kopher and Mao，2003; Clark et al” 沉積速率（MAR)藉由測量之後鈣黃綠素及的平均距離除以注射標記之間的時間間隔（幾何學進行定量評估 Nikon C 〇 rp.5 平方微米）並量該工程化骨骨組織形態計測於動物犧牲 5毫克/公斤） •，1 9 9 7; Mao， 2 0 0 5 )。修剪接著利用85% 酸二丁酯製備修剪。使用可切片機，以旁未脫礦切片中下成像（Mao, 2 0 0 5 )。礦物茜素標記之間 7天）計算（ -67- 200817019

Clark et al·，2005 )。骨形成速率（BFR)係定義爲MAR xBSf/Bs ( Clark et al., 2005 )。數據資料如各實施例中所述經統計分析。實施例1 7 :利用原子力顯微鏡進行工程化骨之微壓入測試

工程化骨之力學特性藉由已建立之方法利用原子力顯微鏡（AFM)測試（參見例如 Hu et al·，200 1; Patel and Mao, 2003; Radhakr i shnan et al. 5 2 0 0 3 ; Allen and Mao ? 2 0 0 4; T omkoria et al·, 2004; C1 ar k e t al ·，2 0 0 5 ) 〇 AF M 力學測試優於巨觀力學測試，因爲後者無法區別工程化骨之個別力學特性。快速乾燥樣本，將其以快乾之氰基丙烯酸酯黏在玻片上。用雙面膠帶將玻片固定在AFM之不鏽鋼架設盤上，接著將該盤以磁力吸附於AFM之壓力掃描計上。該檢體於AFM微壓入時以磷酸鹽緩衝食鹽水持續灌洗。使用額定力常數k = 0.12牛頓/米及具有氧化削尖之氮化矽針尖懸臂，在新收成之建構物表面進行微壓入。在 Z平面驅動懸臂尖端以取得力譜資料。紀錄力繪製，其關於伸出及縮回懸臂尖端時Z平面之微壓痕負載及相對位移之資料取得。然後按照赫氏（Hertz )模式自力譜資料計算楊氏模數（Young’s modulus) (E)，該模式定義接觸半徑、微壓入負載及中心位移之間的關係： E = 3F(1-v)/4>/R δ3/2 式中Ε爲楊氏模數，F爲所施予之奈米機械負載，ν -68- 200817019 爲特定區域之波森比（poisson’s ratio) ，&爲AFM針尖之曲率半徑及δ爲壓痕之量。測量所有組別之建構物的楊氏模數値，並與先前測量天然小樑骨得到之類似數値比較。不同位置之平均楊氏模數經統計分析以顯示它們各別之力學特性。實施例1 8 :以雙軸MTS機械試驗機進行工程化骨之壓縮及剪切特性之力學測試取出整個工程化骨。該取出之樣本以磷酸鹽緩衝溶液沖洗，之後徹底吸乾以除去多餘水分，並利用牙科石膏（ Lab Buff, Miles Dental Products, South Bend，IN)灌封以令該檢體固定於測試設備上（MTS 8 5 8 Mini Bionix II Machine，MTS Corp·，Minneapolis，MN)。樣本以初加載速率〇·1 mm/s加載壓縮。測量試樣之力量（牛頓）與位移（毫米），並計算各試樣之彈性模數E (千帕）。在剪力測試中，經灌封之側邊周圍骨末端之一被連接至加載軸 ’而另一側端部分連接至固定台。初期移動軸以低速位移 (〇·〇 1毫米/秒），令移動側相對固定側移動。利用 Station Manager軟體測量所導致之剪力模數。在壓縮及剪力加載測試中，硏究不同的加載速率以決定加載速率對力學測試結果之影響，且若加載速率影響結果，則使用物理加載範圍1至4赫茲之加載速率（Collins et al.，2004 -69- 200817019 實施例19:工程化骨之數位X光及顯微CT造影，利用數位X光（Faxitron，Wheeling, IL )依照我們發表之方法（Collins et al. 2005 )進行工程化骨造影。工程化骨係固定於1 〇 %之福馬林，使用空間分辨率2 1微米之顯微電腦斷層（pCT )系統（ViVA CT 40，Scanco, Switzerland)多重切面造影。影像重建爲5x5x1立方亳米體積，且根據影像直方圖中骨像素與軟組織像素峰之間的谷決定各影像之臨界値。定量工程化骨之幾何寬度。所有數値利用邦弗朗尼檢定進行變異數分析（ANOVA )。亦進行相鄰之天然人字縫骨顯微電腦斷層造影以作爲工程化骨之對照組。天然人字縫骨之顯微電腦斷層資料分析與工程化骨相同。實施例20 :巨通道及bFGF促進宿主組織血管新生進行與實施例3所述類似之實驗，但bFGF之濃度較令聚乙二醇二丙烯酸酯（分子量 3400 ; Nektar， Huntsville，AL，USA)溶解於添加133單位/毫升青黴素及 133 毫克/毫升鏈黴素（Invitrogen，Carlsbad，CA，US A )之磷酸緩衝液（6.6%重量/體積）。加入濃度50毫克/ 毫升之光起始劑2-羥基-1-[4-(羥基乙氧基）苯基]-2-甲基-1-丙酮（Ciba，Tarrytown，NY，USA)。所形成之 PEG 圓柱以 3 65奈米之紫外線光聚合 5分鐘（Glo-Mark， Upper Saddle River，NJ，USA )。共製造 3 種 PEG 水凝膠 -70- 200817019 之構型：1 )在光聚合性P E G水凝膠中共穿透出3條巨通道（直徑〗毫米）（參見例如圖15A) ;2)在無巨通道之PEG水凝膠中添加0.5微克/微升之bFGF (參見例如圖 15B):及3) 0·5微克/微升bFGF與巨通道之組合（參見例如圖1 5 C )。嚴重聯合免疫缺損（SCID )公鼠（品系C.B17 ; 4至 5週齢）以K他命（1 00毫克/毫升）及二甲苯胺噻嗪（ Xylazine ) ( 4毫克/毫升）腹腔注射麻醉。剃除鼠背部毛並置於俯臥姿勢，以10%聚維酮碘及70%醇消毒。沿上背部矢狀中線切開長1公分之直線切口，接著鈍剝以產生皮下囊。每隻SCID鼠植入3個PEG水凝膠：有巨通道但無 bFGF之PEG、無巨通道但添力卩bFGF之PEG或有巨通道及bFGF之PEG。以4-0可吸收原質腸線縫合切口。所有 PEG水凝膠圓柱植入活體內4週。經皮下植入SCID鼠背部4週後，取出PEG水凝膠樣本。以二氧化碳令鼠窒息後，以無菌方式切開SCID鼠背部。小心移除周圍之纖維包膜後，取出宿主之PEG水凝膠圓柱，以磷酸緩衝液沖洗並固定於1 〇 %福馬林2 4小時。該PEG樣本接著被包埋於石躐中，以5微米之厚度橫向切片（巨通道之橫剖面，比較圖1 5 A )。石蠟切片以蘇木紫及伊紅染色。製備連續相鄰切片以進行免疫組織化學分析。切片經脫躐及磷酸緩衝液清洗，在室溫下以牛睾九透明質酸酶（ 1600單位/毫升）於含150毫莫耳氯化鈉、 pH 5.5之醋酸鈉緩衝液中消化30分鐘。所有免疫組織化 -71 - 200817019 學方法按我們先前之方法進行（Mao et al.，1 998; Alhadlaq and Mao, 2 0 0 5; S undaramurthy and Mao，2006 ) 。簡單地說，於室溫下以5%牛血清白蛋白（BSA )處理切片20分鐘，以防止非特異性反應。使用下列抗體：抗血管內皮生長因子抗體（anti-VEGF ) ( ABcam，

Cambridge, MA USA)及有或無其抑制劑（乙醯神經胺糖酸）之來自小麥（triticum vulgaris )的生物素標記凝集素（麥胚凝集素）（WGA) (Sigma, St. Louis? MI, USA )。WGA與富含α-D-GlcNAc及NeuAc之血管內皮細胞的碳水化合物基團結合（Jinga et al.，2000; Izumi et al.， 2003 )。切片置於潮溼培養箱中與原始抗體隔夜培養後，用PBS沖洗並以IgG抗鼠二次抗體（1:500; Antibodies Inc.，Davis，CA)培養30分鐘。接著令切片與鏈親合素_ 辣根過氧化物酶共軛物於潮溼培養箱中培養3 0分鐘。以 PBS清洗之後，重複該二次抗體之雙重連結法。以二胺基聯苯胺（DAB )溶液令切片呈色，並以邁爾（Mayer’s ) 蘇木紫液複染3至5分鐘。複染切片以分級乙醇脫水及二甲苯清洗。使用相同方法處理陰性對照組，但省略加入原始抗體之步驟。結果顯示經過4週活體內植入SCID鼠背部後，有巨通道但不含bFGF之無細胞PEG水凝膠證實宿主組織浸潤僅發生在巨通道管腔中，PEG其他部分則否（參見例如圖 1 5A’）。相反的，添加bFGF但無巨通道之無細胞PEG水凝膠證實宿主組織浸潤發生於明顯隨機且分離之區域（參 -72- 200817019 見例如圖15B，）。而同時具有巨通道及bFGF之PEG水凝膠證實宿主組織生長進入巨通道，但非PEG之其他區域（參見例如圖15C，）。無巨通道及bFGF之PEG水凝膠未顯示宿主組織浸潤（資料未顯示），與之前顯示缺乏宿主細胞進入PEG水凝膠之宿主組織浸潤的資料一致（ Alhadlaq et .，2 0 0 5; Stosich and Mao, 2005; 2006 ) o

實施例21 :分離及培養擴增人骨髓源性間質幹細胞（ hMSCs ) 進行人骨髓源性間質幹細胞（hMSCs)之分離及培養擴增，方法與實施例9相同。人 MSCs係按先前方法（參見例如 Marion et al·， 2005; Yourek et al·，2005; Moioli et al·，2006; Marion and Mao，2006 )分離自二位匿名成年捐贈者之新鮮骨髓樣本（AllCells，Berkeley，CA)。將骨髓樣本換至50毫升試管中，共加入750微升之RosetteSep溶液（StemCell Technologies, Vancouver，Canada)並於室溫下培養 20 分鐘。然後在骨髓樣本中加入含2%胎牛血清及1毫莫耳 EDTA溶液之15毫升磷酸緩衝液，以使總體積約爲30毫升。接著將骨髓樣本置於15毫升 Ficoll-Paque上（ StemCell Technologies)，在室溫下以 3 0 0 0 g 離心 2 5 分鐘。自Ficoll-Paque介面吸出整層富集細胞。以每分鐘 1 00 0轉離心該混和液10分鐘。溶液被吸出加入至500微升含 10% 胎牛血清（FBS ) ( Atlanta Biologic a Is， -73- 200817019

Lawrenceville，GA)及 1%抗生素-抗真菌素（Gibco, Carlsbad, CA)之 DMEM 培養基中（Sigma-Aldrich Inc ?

St. Louis, MO)(以下稱爲基底培養基）。計數該分離之單核細胞，每個100毫米培養皿塗抹約0.5-1 Χίο6細胞且於3 7°C及5 %二氧化碳下培養於基底培養基中。經過24小時後，丟棄未黏附細胞，以磷酸緩衝液（PBS )沖洗黏附單核細胞二次，每二天更換一次新鮮培養基以培養1 2天 (25 )。當90%的細胞匯集時，利用0.25%胰蛋白酶及1 毫莫耳EDTA於3 7°C下反應5分鐘以使細胞自培養皿脫離，計數，再塗抹於1 〇〇毫米培養皿上，此爲第1代細胞。實施例22 :人間質幹細胞分化成成脂肪細胞按先前之方法（參見例如 Alhadlaq et al.，2005; Stosich and Mao, 2005，2 0 0 6; Marion and Mao, 2006 )，藉由接觸成脂培養基以使第2及3代之人間質幹細胞被誘導分化爲成脂細胞，成脂培養基由添加0.5微莫耳地塞米松、〇·5微莫耳異丁基甲基黃嘌呤（IBMX)及50微莫耳吲哚美辛（indomethacin )之基底培養基構成。人間質幹細胞之亞族群繼續於基底培養基中培養，其培養環境亦爲 37°C下之95%空氣及5%二氧化碳中，培養基每二天更換一次。利用油紅 0(〇il_red 〇)染色（Sigma-Aldrich，St· Louis，MO )確認成脂形成（脂肪形成）。要在活體外評估成脂分化，以成脂培養基處理人間質幹細胞5週。成脂分化或未成脂分化之單層培養人間質幹細胞以1 〇%福馬林 -74- 200817019 固定，並進行油紅0染色。該玻片於1 〇倍倒置顯微鏡下檢查是否有脂肪空泡存在。結果顯示在觀察的3 5天活體外培養中，人間質幹細胞於活體外分化成成脂細胞（參見例如圖16)。與未成脂分化之人間質幹細胞比較（參見例如圖1 6Α至1 6Ε )， hMSC源性成脂細胞呈油紅Ο染色陽性，且在3 5天期間逐漸增加（參見例如圖16F至 16J )。這與之前顯示 hMSC源性成脂細胞經不到2週之成脂培養基處理表現過氧化物增殖因子活性受體γ2 ( PPAR-Y2 )的資料一致（參見例如 Alhadlaq et al.，2005 )。在觀察的 35天期間， hMSCs與hMSC源性成脂細胞之間的培養樣本DNA總含量並無統計顯著差異（參見例如圖17A)。然而在培養第 28及35天時，hMSC源性成脂細胞樣本之甘油含量顯著高於hMSCs，表示活體外之hMSC源性成脂細胞逐漸累積細胞內脂肪空泡。實施例23 :於PEG水凝膠中包埋hMSC源性成脂細胞及活體內植入在利用上述包含巨通道及生物活性因子之PEG水凝膠模型系統（參見實施例3 )之平行試驗中，包埋hMSCs 及hMSC源性成脂細胞以決定該工程化巨通道及bFGF是否促進血管化成脂形成。 PEG水凝膠以終溶液10%重量/體積之濃度被溶解於添加1〇〇單位/毫升青黴素及1〇〇微克/毫升鏈黴素（ -75- 200817019

Gibco，Carlsbad, CA，USA)之無菌磷酸緩衝液中。於該 PEGDA溶液中力D入光起始齊！I 2-羥基-1-[4-(羥基乙氧基）苯基]-2-甲基-1-丙酮（Ciba，Tarrytown，NY )。經過 1 週之成脂分化或培養於培養基中，利用0.25%胰蛋白酶及1 毫莫耳EDTA於37°C下反應5分鐘以使hMSCs或hMSC 源性成脂細胞自培養皿脫離，計數，並以3 X 1 06細胞/毫升之密度分別再懸浮於PEG聚合物/光起始劑溶液中。取 75微升之細胞/聚合物/光起始劑懸浮液加至.075毫升微量離心管之無菌塑膠蓋中（6x4毫米：直徑X高度）（Fisher Scientific，Hampton，NH)，然後用長波、3 6 5奈米紫外線燈（Glo-Mark，Upper Saddle River，NJ)以約 4 毫瓦 / 平方公分之強度進行光聚合反應5分鐘。將該光聚合細胞 PEG建構物自塑膠蓋移出，換至含成脂培養基之12孔盤中。在光聚合反應前共添加0.5微克/微升之bFGF至PEG 水凝膠。依照前述方法產生3個巨通道（參見實施例20 )。皮下植入無胸腺裸鼠背部12週之後，取出PEG水凝膠圓柱。所有組織處理、組織學及免疫組織化學程序均與上述者相同（參見實施例2 0 )。結果顯示PEG水凝膠無法令細胞浸潤（參見例如圖 18A’）。此發現與先前試驗一致（參見例如 Alhadlaq et al·，200 5; Stosich and Mao, 2005; 2006 )。然而，建置工程化巨通道及bFGF之PEG水凝膠不僅顯示較深的顏色，在橫切面上亦顯示3個紅色圓圈（參見例如圖1 8B ’）。另外，有巨通道及bFGF並接種hMSC源性成脂細胞之 -76- 200817019 PEG水凝膠不僅顯示較深的顏色，還顯示紅色圓圈（參見例如圖1 8C’）。在組織學及免疫組織化學檢查中，包埋 hMSC源性成脂細胞及建置巨通道及bFGF之PEG水凝膠顯示組織形成島（參見例如圖19A)。許多工程化組織島呈現油紅〇陽性（以圖19B爲代表），顯示成脂作用存在。抗VEGF抗體在明顯爲間質組織中呈現陽性染色（參見例如圖19C)，且抗WGA凝集素抗體侷限於工程化脂肪組織附近（參見例如圖1 9D )，顯示工程化血管形成促進脂肪形成。實施例24 :血管內皮細胞之分子標記分析血管祖細胞中血管內皮生長因子2或Flk 1之表現，二者均爲血管內皮細胞之分子標記。如實施例2中所述，進行造血幹細胞之分離、培養、分化及標示。結果顯示血管祖細胞（第1管柱中爲第1代細胞，第 2管柱中爲第2代細胞）可表現血管內皮生長因子2或 Flk 1，而緩衝液則不表現VEGF/Flkl (參見例如圖20 ) 。VEGF2定量顯示，P1及P2細胞相較於緩衝液培養基表現顯著較多之VEGF2 (參見例如圖21 )。這些資料證實自人骨髓分離之HSCs可分化成內皮樣細胞，其證據爲表現內皮細胞標記VEGF2及Flkl。實施例25 :細胞標記試驗分析接種骨祖細胞及血管祖細胞之多孔PTCP支架中 -77- 200817019 這二種細胞類型之分佈情況。灌注祖細胞至實施例1相同。結果顯示標示綠螢光蛋白（GFP)之骨紅色C Μ - D i 1之血管祖細胞共同存在於多孔 (參見例如圖22 )。活體內植入接種骨祖' 細胞之PTCP支架導致血管形成骨之形成，見例如實施例1 ;圖2 )。這些資料顯示共同接種於生物相容性材區域中的人骨祖細胞及血管祖細胞可分別成及血管組織，同時共同分布於支架中。【圖式簡單說明】所屬技術領域中具有通常知識者將暸解式僅用於說明。該些圖式並非意欲以任何方之範圍。圖1爲人間質幹細胞（hMSCs)分化成系列組織切片圖。圖1 A係自多位人類捐贈骨髓樣本，其顯示大量細胞。圖1 B顯示自群培養擴增hMSCs成紡錘狀細胞。圖1C代培養基處理之MS Cs，其顯示鹼性磷酸酶染1 代表以馮庫薩（von Kossa)染色顯示MSC 產生礦物結節的情況。比例尺：1 〇〇微米。其他細節如實施例1中所述。圖2爲源自人類間質幹細胞（hMSCs) 支架之方法與砠細胞與標示 PTCP支架中瓶胞及血管祖如上所示（參料之不同空間功地分化爲骨以下說明之圖式限制本發明成骨細胞之一者之一製備的黏附性細胞族表以成骨分化色陽性。圖1 D 源性成骨細胞有關方法學之之內皮細胞和 -78- 200817019 成骨細胞之工程化骨建構物的一系列圖形。圖2A代表源自hMSCs之成骨細胞被接種至磷酸三鈣（TCP ··亮粉紅色 )之孔洞中。人臍靜脈內皮細胞（HUVEC )於4°C下被擴增及接種至水狀基底膜水凝膠Matrigel中，並注入TCP 之孔洞中，然後於37°C下令Matrigel膠化。圖2B顯示自免疫不全鼠背部取出之活體植入樣本中TCP區域之間的骨樣組織區（B )。圖2C代表蘇木紫及伊紅（H&E )染色切片，其顯示周圍有圓細胞環繞之空腔形成。由於 HUVECs係均質接種於水狀Matrigel中，很明顯的當空腔及原始血管樣（PV )構造於建構物中形成時會重新組織該些接種的HUVECs。圖2D爲更高倍數之馮庫薩染色切片，其顯示TCP中之礦化組織島。比例尺：100微米。有關方法學之其他細節如實施例1中所述。圖3爲一系列照片及一長條圖，顯示造血幹細胞分化成工程化血管形成骨之內皮細胞。圖3 A代表接種於纖維連接蛋白塗覆細胞培養聚苯乙烯上之骨髓分離、CD 34+、非黏附性細胞。雖然這些細胞係分離自與上圖1之MS Cs 來源相同的骨髓，這裡的HSCs呈現圓形，與圖1B之紡錘形MSCs相當不同。圖3B代表培養二週後HSCs形成集落。圖3C顯示當集落形成HSCs被接種於Matrigel中，未連接細胞之間形成管狀結構。圖3 D顯示乙醯化低密度月日蛋白（Ac-LDLs) 性標g己’以Ac-LDLs營光位於細胞內爲證據。圖3 E顯示H S C源性內皮樣細胞亦表現溫韋伯氏因子（von Willebrand Factor，vWF )，該因子爲原生 -79- 200817019 內皮細胞之標記。圖3 F顯示H S C源性內皮樣細胞（左長條）相較於對照細胞（纖維母細胞）（右長條）產生顯著較多之vWF。有關方法學之其他細節如實施例2中所述。圖4以一系列簡圖說明peg水凝膠之構型。圖4A代表不含bFGF或巨通道之單獨peg水凝膠。圖4B代表經光聚合作用後產生3個巨通道（直徑1毫米）但不含 bFGF之PEG水凝膠。圖4C代表溶液中加入10微克/毫升bFGF，然後經光聚合但不產生巨通道之PEG水凝膠。圖4D代表含10微克/毫升bFGF及3個巨通道之PEG水凝膠。來自Stosichetal. (2006)。有關方法學之其他細節如實施例3中所述。圖5爲一系列活體植入樣本收成影像。圖5A顯示收成之不含細胞、bFGF或通道的PEG水凝膠，其並無肉眼可見之宿主組織侵入現象。圖5B顯示收成之有3個巨通道（直徑各爲1毫米）的PEG水凝膠，其顯示宿主組織長入工程化巨通道管腔內。圖5C顯示收成之含bFGF但無巨通道的PEG水凝膠，其整體顯示紅色。圖5D顯示收成之有bFGF及巨通道的PEG水凝膠，其顯示整體紅色及宿主組織長入3個工程化巨通道管腔內。比例尺：6毫米。來自Stosich et al· ( 2 0 0 6 )。有關方法學之其他細節如實施例3中所述。圖6爲一系列以H&E染色之活體植入3週後的PEG 水凝膠樣本。圖6A代表無bFGF或巨通道的PEG水凝膠 (Η )未顯示宿主細胞侵入。圖6B代表宿主組織長入有3 -80- 200817019 個巨通道（箭頭C)之PEG水凝膠（Η)。注意巨通道外之其他PEG部分無宿主細胞浸潤。圖6C代表含bFGF但無通道之PEG水凝膠（Η )，其顯示明顯隨機的宿主組織浸潤。圖6D代表宿主組織浸潤；這類浸潤僅發生在含 bFGF之pEG水凝膠的巨通道中。雖然圖6C與圖6D中之 bFGF劑量相同，但有巨通道之bFGF PEG水凝膠（圖6D )誘發顯著宿主組織生長。來自Stosich et al· ( 2006)。有關方法學之其他細節如實施例3中所述。圖7之長條圖顯示電腦化組織形態分析宿主組織之生長量。宿主組織長入含bFGF之PEG水凝膠巨通道中之量顯著高於不含bFGF之巨通道PEG水凝膠中宿主組織的量。每組8隻動物。來自stosich et al. (2006)。有關方法學之其他細節如實施例3中所述。圖8爲一系列pEG水凝膠長入宿主組織之h&E染色圖片。圖8 A代表有巨通道但不含bFGF之PEG水凝膠（ Η ) ’其顯示宿主組織僅長入巨通道中。箭頭表示血管。圖8Β爲放大倍數的圖8Α，顯示血管樣結構（白色箭頭）內襯內皮樣細胞，周圍爲纖維母細胞樣細胞。圖8C代表含bFGF但無巨通道之PEG水凝膠（Η)，其顯示稀疏的宿主組織生長及內襯內皮樣細胞之血管樣結構（黑色箭頭 )。圖8D代表放大倍數之圖8C。圖8E代表含bFGF及巨通道之P E G水凝膠，其顯示緻密的宿主組織長入高密度之血管樣結構中（黑色箭頭）。圖8F爲高倍數之圖8E ’顯示大的血管樣構造（白色箭頭），其中有類似紅血球 -81 - 200817019 的細胞及內襯內皮樣細胞。纖維母細胞樣細胞圍繞該血管樣構造。來自Stosich et al· ( 2006)。有關方法學之其他細節如實施例3中所述。圖9爲一系列利用抗VEGF抗體染色之免疫定位組織切片。圖9A代表無bFGF或巨通道之PEG水凝膠（H) ，顯示除了該宿主纖維包膜（C)之外並無VEGF陽性組織。圖9B代表有3個巨通道但不含bFGF之PEG水凝膠，顯示巨通道中宿主組織之強烈VEGF染色。圖9C代表含bFGF但無巨通道之PEG水凝膠（H)，顯示明顯隨機散佈之VEGF陽性組織。圖9D代表有bFGF及巨通道之 P E G水凝膠（Η )，.顯示巨通道中宿主組織之強烈V E G F 染色。來自Stosich et al. ( 2006 )。有關方法學之其他細節如實施例3中所述。圖1 0以一系列簡圖說明細胞密度實驗之實驗設計。人間質幹細胞（MSCs )、間質幹細胞源性成骨細胞（ MSC-Ob )及間質幹細胞源性軟骨細胞（MSC-Cy )。在 PEG水凝膠中包封4種細胞濃度之各細胞系細胞懸浮液：每毫升0、5、40及8 0M細胞。OS培養基··含地塞米松 (dexamethasone )、抗壞血酸及β-甘油磷酸之成骨刺激培養基。CS培養基：含轉化生長因子β3之成軟骨培養基。圖1 〇 Α代表未分化成任何細胞系之人間質幹細胞。圖 1 0B代表人間質幹細胞源性成骨細胞。圖1 0C代表人間質幹細胞源性軟骨細胞。在各例中，立體培養之細胞經胰蛋白酶消化並製成細胞懸浮液。接著在水狀PEG水凝膠中 -82- 200817019 加入該懸浮細胞，然後進行光聚合及膠化。就每種條件而言（A、B 及 C)，取得包埋 MSCs、MSC-Ob 及 MSC-Cy 之膠化建構物以供進一步體外及體內試驗使用。來自 Troken and Mao ( 2006 )。有關方法學之其他細節如實施例4中所述。圖1 1爲一系列經4週體外培養後不同細胞密度之組織學觀察結果。上列：培養於DMEM中之對照組或未分化之M S C s。中列：培養於成骨培養基中之M S C源性成骨細胞（MSC-Ob )。下列：培養於成軟骨培養基中之MSC 源性成軟骨細胞（MSC-Cy ) 。5M細胞/毫升=每毫升之細胞懸浮液含5M細胞。最左行之圖代表無細胞之PEG水凝膠。下一行代表每毫升5M細胞之起始細胞接種密度，然後是每毫升40M細胞及最右行爲每毫升8 0M細胞。對各細胞系來說，4週體外培養維持其起始細胞接種密度。 H&E染色。來自 Tro ken and Mao (2006)。有關方法學之其他細節如實施例4中所述。圖12爲一系列包埋人間質幹細胞（MSCs)(圖12A 至12D )及MSC源性軟骨細胞（MSC-Cy )(圖12A’至 12D’）之PEG水凝膠於體外培養4週後之番紅（safranin 〇 )染色結果。最左行代表無細胞之PEG水凝膠。下一行代表起始細胞包埋密度爲每毫升5M細胞，接著是每毫升 40M細胞及最右行每毫升80M細胞。番紅染色陽性顯示標記區域爲起始細胞接種密度之函數。MSCs呈番紅染色陰性。PEG水凝膠中之起始細胞接種密度與分化之成軟骨 -83- 200817019 表現型一起被維持。來自Troken and Mao ( 2006)。有關方法學之其他細節如實施例4中所述。圖1 3爲一系列包埋人間質幹細胞（μ S C s )(圖1 3 A 至1 3 D )和M S C源性成骨細胞（μ S C - Ο b )(圖1 3 A，至 1 3D’）之PEG水凝膠經4週體外培養的馮庫薩染色結果。最左行代表無細胞之PEG水凝膠。下一行代表起始細胞包埋密度爲每毫升5M細胞，然後是每毫升40M細胞及最右行每毫升80M細胞。馮庫薩染色爲陽性且顯示標示區域爲該起始細胞接種密度之函數。M S C s呈現馮庫薩染色陰性。這表示若未如下列之試驗組（圖1 3 A，至1 3 D，）添加成骨刺激物，MSCs無法分化成成骨細胞。PEG水凝膠中之起始細胞包埋密度與分化之成骨表現型一起被維持。來自Troken and Mao ( 2006 )。有關方法學之其他細節如實施例4中所述。圖1 4爲二幅顯示M S C源性軟骨細胞及M S C源性成骨細胞之基質形成定量的長條圖。圖1 4 Α代表活體植入4 週後之總愛爾新藍（Aleian blue )面積除以總支架面積。 MSC源性軟骨細胞（MSC-Cy )相較於hMSCs及HMSC源性成骨細胞（hMSC-Ob )合成顯著較多的GAG。圖14B 代表總馮庫薩面積除以總支架面積。MSC_Ob較之hMSCs 及HMSC-Cy誘發顯著較多之礦化。每組8隻動物。來自 T r 〇 k e n a n d M a 〇 ( 2 0 0 6 )。有關方法學之其他細節如實施例4中所述。圖1 5以一系列簡圖說明PEG水凝膠之構型及該對應 -84- 200817019 之水凝膠於植入4週後的免疫組織化學圖像。圖1 5 A爲有巨通道但無bFGF之PEG水凝膠。圖15B爲有bFGF但無巨通道之PEG水凝膠。圖15C爲有巨通道及bFGF之 PEG水凝膠。圖15A’係圖15A之植入？£0水凝膠的免疫組織化學之組織圖像。圖1 5 B ’係圖1 5 B之植入P E G水凝膠的免疫組織化學組織圖像。圖1 5 C ’係圖1 5 C之植入 PEG水凝膠的免疫組織化學組織圖像。有關方法學之其他細節如實施例20中所述。圖1 6以一系列圖像說明3 5天活體外培養之人間質細胞體外分化爲成脂細胞。組織切片以油紅O ( oil-red Ο ) 染色，hMSC源性成脂細胞對該染劑呈陽性反應。圖16A 至16E代表無成脂分化之hMSCs，而圖16F至16J代表 hMSC源性成脂細胞。有關方法學之其他細節如實施例2 1 至22中所述。圖1 7爲一系列長條圖，說明h M S C s和h M S C源性成脂細胞在3 5天培養樣本中的DN Α總含量（圖1 7 A )及 hMSCs和hMSC源性成脂細胞樣本之甘油含量（圖17B) 。有關方法學之其他細節如實施例22中所述。圖1 8以一系列簡圖及照片說明包封於PEG水凝膠中之hMSCs和hMSC源性成脂細胞於植入4週後的血管形成脂肪新生。圖1 8A爲無巨通道、無bFGF且未投遞細胞之PEG水凝膠。圖18B爲有巨通道、有bFGF但未投遞細胞之PEG水凝膠。圖18C爲有巨通道、有bFGF且有 hMSC源性脂肪細胞之PEG水凝膠。圖18A’、圖18B’及 -85- 200817019 圖18C’分別爲圖18A、圖18B及圖18C之PEG水凝膠於植入鼠1 2週後的照片圖像。有關方法學之其他細節如實施例2 3中所述。圖1 9以一系列圖像說明包封hMSC源性成脂細胞之巨通道PEG微通道水凝膠組織於植入1 2週後之染色組織切片。圖1 9 A爲免疫化學染色組織。圖1 9 B爲油紅〇染色陽性組織。圖19C爲以抗VEGF抗體染色之組織。圖 19D爲被抗WGA凝集素抗體染色之組織。有關方法學之其他細節如實施例23中所述。圖20以一系列圖像說明血管祖細胞中血管內皮生長因子2或Flkl之表現。有關方法學之其他細節如實施例 24中所述。圖21之長條圖顯示定量血管祖細胞中之VEGF2。有關方法學之其他細節如實施例24中所述。圖22之圖像顯示多孔pTCP支架中綠螢光蛋白（GFP )標記之骨祖細胞及紅色CM-Dil標記之血管祖細胞。有關方法學之其他細節如實施例25中所述。 -86- 200817019 附錄：引用文獻

Abilez 0, Benharash P, Mehrotra M, Miyamoto E, Gale A, Picquet J, Xu C, Zarins C (2006) A novel culture system shows that stem cells can be grown in 3D and under physiologic pulsatile conditions for tissue engineering of vascular grafts. J Surg Res 132:170-178.

Alberts B, Johnson B, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P (2002) Molecular Biology of the Cell. 4th Ed. New York, Garland Publishing, pp. 1183-1184.

Alhadlaq A, Elisseeff JH, Hong L, Williams CG, Caplan Al, Sharma B, Kopher RA, Tomkoria S, Lennon DP, Lopez A, Mao JJ (2004) Adult stem cel! driven genesis of humanshaped articular condyle. Ann Biomed Eng 32:911-923.

Alhadlaq A, Mao JJ (2003) Engineered neogenesis of human-shaped mandibular condyle from rat mesenchymal stem ceils. J Dent Res 82:951-956.

Alhadlaq A, Mao JJ (2004) Mesenchymal stem cells: Isolation and therapeutics.

Stem Cells Dev 13:436-448.

Alhadlaq A, Mao JJ (2005) Osteochondral Tissue Engineering - Regeneration of Articular Condyle from Mesenchymal Stem Cells. In Ma PX, Elisseeff JH (Ed) Scaffolding for Tissue Engineering. Taylor & Francis, Boca Raton, FL, pp. 545-564.

Alhadlaq A, Mao JJ (2005) Tissue-engineered osteochondral constructs in the shape of an articular condyle. J Bone Joint Surg Am 87:936-944.

Alhadlaq, A. and J.J. Mao. Tissue-engineered neogenesis of human-shaped mandibular condyle from rat mesenchymal stem cells. J Dent Res 82:951- 956, 2003.

Alhadlaq, A., and J.J. Mao. Mesenchymal stem cells: Isolation and therapeutics. Stem Cells Dev. 13: 436-448, 2004.

Alhadlaq, A., J.H. Elisseeff, L. Hong, C.G. Williams, A.I. Caplan, B. Sharma, R.A. Kopher, S. Tomkoria, D.P. Lennon, A. Lopez, J.J. Mao. Adult stem cell driven genesis of human-shaped articular condyle. Ann Biomed Eng 32:911- 923t 2004.

Alhadlaq, A., M.H. Tang, J.J. Mao. Engineered adipose tissue from human mesenchymal stem cells maintains predefined shape and dimension: implications in soft tissue augmentation and reconstruction. Tissue Eng.11:556-66, 2005.

Allen DM, Mao JJ (2004) Heterogeneous nanostructural and nanoelastic properties of pericellular and interterritorial matrices of chondrocytes by atomic force microscopy. J Struct Biol 145:196-204. -87- 200817019

Almubarak R, Dasilveira A, Mao JJ (2005) Expression and mechanical modulation of matrix metalloproteinase 1 and 2 genes in facial and cranial sutures. Cell & Tiss Res 321:465-471.

Alsberg E, Anderson KWf Albeiruti A, Rowley JA, Mooney DJ (2002) Engineering growing tissues. Proc Natl Acad Sci U S A 17,99:12025-12030.

Anusaksathien, 0., and W.V. Giannobile. Growth factor delivery to reengineering periodontal tissues, Curr Pharm Biochnol 3:129-139, 2002.

Arai F, Hirao A, Suda T (2005) Regulation of hematopoiesis and its interaction with stem cell niches. Int J Hematol 82:371-376.

Arzate, H., J. Chimal-Monroy, L. Hemandez-Lagunas, L. Diaz de Leon. Human cementum protein extract promotes chondrogenesis and mineralization in mesenchymal cells. J Periodontal Res 31:144-148,1996.

Aubin JE (1998) Bone stem cells. J Cell Biochem Suppl 30-31:73-82.

Badylak SF, Park K, Peppas N, McCabe G, Yoder M (2001) Marrow-derived cells populate scaffolds composed of xenogeneic extracellular matrix. Exp Hematol 29:131 ΟΙ 318.

Baker JH, Huxham LA, Kyle AH, Lam KK, Minchinton Al (2006) Vascular-specific quantification in an in vivo Matrigel chamber angiogenesis assay. Microvasc Res 71:69-75.

BarKana,!., A.S Narayanan, A. Grosskop, N. Savion, S. Pitaru. Cementum attachment protein enriches putative cementoblastic populations on root surfaces in vitro. J Dent Res 79:1482-1488, 2000.

Batra RKt Sharma S, Dubinett SM (2000) New gene and cell-based therapies for lung cancer Semin Respir Crit Care Med 21:463-472.

Benoit DS, Anseth KS (2005) The effect on osteoblast function of colocalized RGD and PHSRN epitopes on PEG surfaces. Biomaterials 26:5209-5220.

Bianco P, Riminucci M, Gronthos S, Robey PG (2001) Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells 19:180-192.

Boabaid, F.t C.W. Gibson, M.A. Kuehl, J E. Berry, M.L. Snead, F.H. Nociti, E. Katchburian, M J. Somerman. Leucine-rich amelogenin peptide: a candidate signaling molecule during cementogenesis. J Periodontol 75:1126-1136, 2004.

Bohnsack BL, Hirschi KK (2004) Red Light, Green Light: Signals That Control Endothelial Cell Proliferation during Embryonic Vascular Development. 12:1506-1511.

Bollerot K, Pouget C, Jaffredo T (2005) The embryonic origins of hematopoietic stem cells: a tale of hemangioblast and hemogenic endothelium. APMIS 113:790-803. -88- 200817019

Boyd FT, Cheifetz S, Andres J, Laiho M, Massague J (1990) Transforming growth factor-beta receptors and binding proteoglycans. J Cell Sci Suppl 13:131-138.

Bruder SP, Jaiswal N, Ricalton NS, Mosca JD, Kraus KHf Kadiyala S (1998). Mesenchymal stem cells in osteobiology and applied bone regeneration. Clin Orthop 355 Suppl:S247-S256.

Bruno S, Bussolati B, Scacciatella P, Marra S, Sanavio F, Tarella C, Camussi G (2006) Combined administration of G-CSF and GM-CSF stimulates monocyte-derived pro-angiogenic cells in patients with acute myocardial infarction. Cytokine 34:56-65.

Burdick JA, Mason MN, Anseth KS (2001).In situ forming lactic acid based orthopaedic biomaterials: influence of oligomer chemistry on osteoblast attachment and function. J Biomater Sci Polym Ed 12:1253-1265.

Burdick JA, Mason MN, Hinman AD, Thorne K, Anseth KS (2002) Delivery of osteoinductive growth factors from degradable PEG hydrogels influences osteoblast differentiation and mineralization. J Control Rel 83:53-63.

Caffesse, R.G., M. de la Rosa, L.F. Mota. Regeneration of soft and hard tissue periodontal defects. Am J Dent 15:339-345, 2002.

Caplan Al (1994) The mesengenic process. Clin Plast Surg 21:429-435.

Caplan AI (2005) Review: mesenchymal stem cells: cell-based reconstructive therapy in orthopedics. Tissue Eng 11:1198-1211.

Caplan, A.I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res 9:641-650, 1991.

Carter DR, Beaupre GS, Giori NJ, Helms JA (1998) Mechanobiology of skeletal regeneration. Clin Orthop 355 Suppl:S41-S55.

Caterson EJ, Nesti LJ, Albert T, Danielson Kt Tuan R (2001) Application of mesenchymal stem cells in the regeneration of musculoskeletal tissues. Med Gen Med. 5:E1.

Chen G, Ushida T, Tateishi T (2001). Poly(DL-lactic-co-glycolic acid) sponge hybridized with collagen microsponges and deposited apatite particulates. J Biomed Mater Res 57:8-14.

Cho SW, Kim I, Kim SH, Rhie JW, Choi CY, Kim BS. Enhancement of adipose tissue formation by implantation of adipogenic-differentiated preadipocytes. Biochem Biophys Res Commun. 2006 Jun 30;345(2):588-94.

Choi SH, Park TG (2002) Synthesis and characterization of elastic PLGA/PCL/PLGA tri-block copolymers. J Biomater Sci Polym Ed 13:1163-1173. -89- 200817019

Chowdhury S, Thomas V, Dean D, Catledge SA, Vohra YK (2005) Nanoindenfation on porous bioceramic scaffolds for bone tissue engineering. J Nanosci Nanotechnol 5:1816-1820.

Clark PA, Clark AC, Hu K, Mao JJ (2006) Nanomechanical and micromechanical manipulation of bone -implant interface. Materials Science and Engineering C Special Issue on Nanostructured Materials for Biomedical Applications. (In press).

Clark PA, Sumner DR, Clark AM, Mao JJ (2005) Modulation of bone ingrowth of rabbit femur titanium implants by in vivo axial micromechanical stresses. J App Physiol 98:1922-1929.

Collier JH, Camp JP, Hudson TW, Schmidt CE (2000) Synthesis and characterization of polypyrrole-hyaluronic acid composite biomaterials for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res 50:574-584.

Collins JM, Ramamoorthy K, Da Silveira A, Patston, PA, Mao JJ (2005) Microstrain in intramembranous bones induces altered gene expression of MMP1 and MMP2 in the rat. J Biomech 38:485-492.

Colnot Cl, Helms JA (2001) A molecular analysis of matrix remodeling and angiogenesis during long bone development. Mech Dev 100:245-250.

Correia AS, Anisimov SV, Li JY, Brundin P (2005) Stem cell-based therapy for Parkinson's disease. Ann Med 37:487-498.

Deng MJ, Jin Y, Shi JN, Lu HBr Liu Yt He DW, Nie X, Smith AJ (2004) Multilineage differentiation of ectomesenchymal cells isolated from the first branchial arch. Tissue Eng 10:1597-1606.

Ebihara Y, Masuya M, Larue ACf Fleming PA, Visconti RP, Minamiguchi H, Drake CJ, Ogawa M. (2006) Hematopoietic origins of fibroblasts: II. In vitro studies of fibroblasts, CFU-F, and fibrocytes. Exp Hematol 34:219-229.

Ehrbar M, Djonov VG, Schnell C, Tschanz SA, Martiny-Baron G, Schenk U, Wood J, Burri PH, Hubbell JA, Zisch AH (2004) Cell-demanded liberation of VEGF121 from fibrin implants induces local and controlled blood vessel growth. Circ Res 94:1124-1132.

Einhorn TA (1998). The cell and molecular biology of fracture healing. Clin Orthop 355 SuppI:S7-S21.

Einhorn TA (2005) The science of fracture healing. J Orthop Trauma 19(10 Suppl);S4-S6.

Evans DJ, Noden DM (2006) Spatial relations between avian craniofacial neural crest and paraxial mesoderm cells. Dev Dyn 235:1310-1325. -90- 200817019

Ferrara N (2005) VEGF as a therapeutic target in cancer. Oncology 69 Suppl 3:11- 16.

Feve B. (2005) Adipogenesis: cellular and molecular aspects. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2005 Dec;19(4):483-99.

Freed, L.E., A.P. Hollander, I. Martin, J.R. Barry, R. Langer, G. Vunjak- Novakovic. Chondrogenesis in a cell-polymer-bioreactor system. Exp Cell Res 240:58-65,1998.

Freed, L.E., G. Vunjak-Novakovic, R. Langer. Cultivation of cell-polymer cartilage implants in bioreactors. J Cell Biochem 51:257-264,1993.

Friedenstein AJ, Deriglasova UF, Kulagina NN, Panasuk AF, Rudakowa SF, Luria EA, Ruadkow lA (1974) Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol 2:83-92.

Fukuchi Y, Nakajima H, Sugiyama D, Hirose I, Kitamura T, Tsuji K (2004) Human placenta-derived cells have mesenchymal stem/progenitor cell potential. Stem Cells 22:649-658.

Gao, J.t J.E. Dennis, LA Solchaga, A.S. Awadallah, V.M. Goldberg, A.I. Caplan. Tissue-engineered fabrication of an osteochondral composite graft using rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Tissue Engineering 7:363-371, 2001.

Gestrelius, S.t C. Andersson, D. Lidstrom, L. Hammarstrom, M. Somerman. In vitro studies on periodontal ligament cells and enamel matrix derivative. J Clin Periodontol 24:685-692,1997.

Gimble Jt Guilak F (2003) Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cytotherapy 5:362-369.

Glaser RL, Jiang W, Boyadjiev SAt Tran AKt Zachary AA, Van Maldergem L,

Johnson Dt Walsh S, Oldridge M, Wall SA, Wilkie AO, Jabs EW (2000). Paternal origin of FGFR2 mutations in sporadic cases of Crouzon syndrome and Pfeiffer syndrome. Am J Hum Genet 66:768-777.

Goldberg VMt Caplan Al (1994). Biological resurfacing: an alternative to total joint arthroplasty. Orthopedics 17:819-821.

Goldstein SA (2002). Tissue engineering: functional assessment and clinical outcome. Ann N Y Acad Sci 961:183-192.

Grainger DW (2004) Controlted-release and local delivery of therapeutic antibodies. Expert Opin Biol Ther 4:1029-1044. -91 - 200817019

Grau N, Daw J, Patel RVt Lewis NW, Mao JJ (2005) Nanomechanical and nanostructural properties of synostosed human cranial sutures. J Craniofac Surg 16:789-794.

Griffith LG, Naughton G (2002) Tissue engineering-current challenges and expanding opportunities. Science 295:1009-1014.

Grunewald M, Avraham I, Dor Y, Bachar-Lustig E, Itin A, Yung S, Chimenti S, Landsman L, Abramovitch R, Keshet E (2006) VEGF-induced adult neovascularization: recruitment, retention, and role of accessory cells. Cell 124:175-189.

Guldberg RE, Oest M, Lin AS, Ito Ht Chao X, Gromov K, Goater JJ, Koefoed M, Schwarz EM, O'Keefe RJ, Zhang X (2004) Functional integration of tissue-engineered bone constructs. J Musculoskelet Neuronal Interact 4:399-400.

Guo XE (2000) Mechanical Properties of Cortical Bone and Cancellous Bone Tissue, in Bone Mechanics Handbook, 2nd Edition, Edi: Cowin SC, CRC Press. Pp. 66-74.

Guo XE, Kim CH (2002) Mechanical consequence of bone loss and treatment in trabecular bone: A 3D microstructural model. Bone 30:404-411.

Harel S, Watanabe K, Linke I, Schain RJ (1972). Growth and development of the rabbit brain. Biol Neonate 1:381-399.

Harris WH, Crothers OD, Moyen B J, Bourne RB (1978). Topical hemostatic agents for bone bleeding in humans. A quantitative comparison of gelatin paste, gelatin sponge plus bovine thrombin, and microfibrillar collagen, J Bone Joint Surg Am 60:454-456.

Hedberg EL, Tang A, Crowther RS, Carney DH, Mikos AG (2003). Controlled release of an osteogenic peptide from injectable biodegradable polymeric composites. J Control Release 84:137-150.

Hee CK, Jonikas MA, Nicoll SB (2006) Influence of three-dimensional scaffold on the expression of osteogenic differentiation markers by human dermal fibroblasts. Biomaterials 27:875-884.

Helms JA, Cordero D, Tapadia MD (2005) New insights into craniofacial morphogenesis. Development 132:851-861.

Hiraoka Y, Yamashiro H, Yasuda K, Kimura Y, Inamoto T, Tabata Y. In situ regeneration of adipose tissue in rat fat pad by combining a collagen scaffold with gelatin microspheres containing basic fibroblast growth factor. Tissue Eng. 2006 Jun;12(6):1475-87.

Ho MM, Kelly TN, Guo XE, Ateshian GA, Hung CT (2006) Spatially varying material properties of the rat caudal intervertebral disc. Spine (In press). -92- 200817019

Hollinger JO, Seyfer AE (1994) Bioactive factors and biosynthetic materials in bone grafting. Clin Plast Surg 21:415-418.

Hong L, Mao JJ (2004) A engineered cranial suture from autologous cells and BMP2. Journal of Dental Research 83:751-756.

Hori, Y., T. Nakamura, K. Matsumoto, Y. Kurokawa, S. Satomi, Y. Shimizu. Experimental study on in situ tissue engineering of the stomach by an acellular collagen sponge scaffold graft. ASAIO J 47: 206, 2001.

Hu K, Radhakrishnan P, Patel RV, Mao JJ (2001). Regional structural and viscoelastic properties of fibrocartilage upon dynamic nanoindentation of the articular condyle. J Struct Biol 136:470-475.

Ikezawa, K., C.E. Hart, D.C. Williams, A.S. Narayanan. Characterization of a cementum derived growth factor as an insulin-!ike growth factor-l like molecule. Connect Tissue Res 36:309-319,1997.

Ishii M, Merrill AE, Chan YS, Gitelman I, Rice DP, Sucov HMf Maxson RE Jr (2003) Msx2 and Twist cooperatively control the development of the neural crest-derived skeletogenic mesenchyme of the murine skull vault. Development 130:6131-6142.

Jen A, Madorin K, Vosbeck K, Arvinte T, Merkle HP (2002). Transforming growth factor beta-3 crystals as reservoirs for slow release of active TGF-beta3. J Control Release. 17,78(1-3):25-34.

Jiang X, Iseki S, Maxson RE, Sucov HM, Morriss-Kay GM (2002). Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Dev Biol 241:106-116.

Jin H, Aiyer A, Su J, Borgstrom P, Stupack D, Friedlander M, Varner J (2006) A homing mechanism for bone marrow-derived progenitor cell recruitment to the neovasculature. J Clin Invest 116:652-662.

Jones EA, Kinsey SE, English A, Jones RA, Straszynski L, Meredith DM, Markham AF, Jack A, Emery P, McGonagle D (2002). Isolation and characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells. Arthritis Rheum. 46(12):3349-3360.

Kafri T, Blomer U, Peterson DA, Gage FH, Verma IM (1997) Sustained expression of genes delivered directly into liver and muscle by lentiviral vectors. Nature Genet 17:314-317.

Kaigler D, Krebsbach PH, Polverini PJ, Mooney DJ (2003) Role of vascular endothelial growth factor in bone marrow stromal cell modulation of endothelial cells. Tissue Eng 9:95-103.

Kamminga LM, de Haan G (2006) Cellular memory and hematopoietic stem cell aging. Stem Cells 24:1143 -1149. -93- 200817019

Kan SH, Elanko N, Johnson D, Cornejo-Roldan L, Cook J, Reich EW, Tomkins S, Verloes A, Twigg SR, Rannan-Eliya S, McDonald-McGinn DM, Zackai EHf Wall SA, Muenke M, Wilkie AO (2002). Genomic screening of fibroblast growth-factor receptor 2 reveals a wide spectrum of mutations in patients with syndromic craniosynosfosis. Am J Hum Genet 70:472-486.

Kao, R.T., G. Conte, D. Nishimine, S. Dault. Tissue engineering for periodontal regeneration. J Calif Dent Assoc 33: 205-215, 2005.

Karp JMt Rzeszutek K, Shoichet MS, Davies JE (2003b) Fabrication of precise cylindrical three-dimensional tissue engineering scaffolds for in vitro and in vivo bone engineering applications. J Craniofac Surg 14:317-323.

Karp JMt Shoichet MS, Davies JE (2003a) Bone formation on two-dimensional poly(DL-lactide-co-glycolide) (PLGA) films and three-dimensional PLGA tissue engineering scaffolds in vitro. J Biomed Mater Res 64A:388-396.

Kawamura, S., S. Wakitani, T. Kimura, A. Maeda, A.I. Caplan, K. Shino, T. Ochi. Articular cartilage repair. Rabbit experiments with a collagen gelbiomatrix and chondrocytes cultured in it. Acta Orthop Scand 69: 56-62,1998.

Kelly JL, Findlay MW, Knight KR, Penington A, Thompson EW, Messina A, Morrison WA. Contact with Existing Adipose Tissue Is Inductive for Adipogenesis in Matrigel. Tissue Eng. 2006 (In press).

King, G.N., D.L. Cochran. Factors that modulate the effects of bone morphogenetic protein-induced periodontal regeneration: a critical review. J Periodontol 73:925-936, 2002.

King, G.N., F.J. Hughes. Bone morphogenic protein-2 stimulates cell recruitment and cementogenesis during early wound healing. J Clin periodontal 28:465-475, 2001.

Knez P, Nelson K, Hakimi M, Al-Haidary J, Schneider C, Schmitz-Rixen T (2004) Rotational in vitro compliance measurement of diverse anastomotic configurations: a tool for anastomotic engineering. J Biomech 37:275-280.

Koenig ALr Gambillara V, Grainger DW (2003) Correlating fibronectin adsorption with endothelial cell adhesion and signaling on polymer substrates. J Biomed Mater Res A 64:20-37.

Koepp HE, Schorlemmer S, Kessler S, Brenner RE, Claes L, Gunther KP, Ignatius AA (2004) Biocompatibility and osseointegration of beta-TCP: histomorphological and biomechanical studies in a weight-bearing sheep model. J Biomed Mater Res B Appl Biomater 70:209-217.

Kopher RA, Mao JJ (2003) Sutural growth modulated by the oscillatory component of micromechanical strain. J Bone Miner Res 25:107-113. -94- 200817019

Kopher RA, Nudera JA, Wang X, O'Grady K, Mao JJ (2003) Expression of in vivo mechanical strain upon different wave forms of exogenous forces in rabbit craniofacial sutures, Ann Biomed Eng 31:1125-1131.

Krebsbach PH, Kuznetsov SA, Bianco P, Robey PG (1999). Bone marrow stromal cells: characterization and clinical application. Crit Rev Oral Biol Med 10:165-181.

Krebsbach PH, Kuznetsov SA, Satomura K, Emmons RV, Rowe DW, Robey PG (1997) Bone formation in vivo: comparison of osteogenesis by transplanted mouse and human marrow stromal fibroblasts. Transplantation 63:1059-1069.

Krebsbach PH, Robey PG (2002) Dental and skeletal stem cells: potential cellular therapeutics for craniofacial regeneration. J Dent Educ 66:766-773.

Krebsbach, P.H., S.A. Kuznetsov, K. Satomura, R.V. Emmons, D.W. Rowe, P.G. Robey. Bone formation in vitro: comparison of osteogenesis by transplanted mouse and human marrow stromal fibroblasts. Transplantation 63:1059-1069,1997.

Kuboki, Y., M.Sasaki, A.Sato, H.Takita, H.Kato. Regeneration of periodontal ligament and cementum by BMP-applied tissue engineering. Eur J Oral Sci 106:197-203,1998.

Kuznetsov, S A, P.H. Krebsbach, K. Satomura, J. Kerr, M. Riminucci, D. Benayahu, P.G. Robey. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. J Bone and Mineral Res 12:1335-1347,1997.

Lammi M, Tammi M (1998). Densitometric assay of nanogram quantities of proteoglycans precipitated on nitrocellulose membrane with safranin O. Analytical Biochem 168:352-357.

Landesberg R, Takeuchi E, Puzas JE (1999) Signal transduction by cytokines in temporomandibular joint disc cells. Arch Oral Biol 44:41-49.

Langer R, Vacanti JP (1993) Tissue engineering. Science 260(5110):920-926.

Langer RS, Vacant! JP (1999) Tissue engineering: the challenges ahead. Sci Am 280:86-89.

Langer, R., J.P. Vacanti. Tissue engineering. Science 260:920-926,1993.

Lee KY, Mooney DJ (2001) Hydrogels for tissue engineering. Chem Rev 101:1,869- 1,879.

Lennon DP, Haynesworth SE, Young RG, Dennis JE, Caplan Al (1995). A chemically defined medium supports in vitro proliferation and maintains the osteochondral potential of rat marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp Cell Res 219:211-222. -95- 200817019

Leung, K.S., L. Qin, L.K. Fu, C.W. Chan. A comparative study of bone to bone repair and bone to tendon healing in patella-patella tendon complex in rabbits. Clinical Biomechanics 17:594-602, 2002.

Levenberg S (2005) Engineering blood vessels from stem cells: recent advances and applications. Curr Opin Biotechnol 16:516-523.

Li W, Johnson SA, Shelley WC, Yoder MC (2004) Hematopoietic stem cell repopulating ability can be maintained in vitro by some primary endothelial cells. Exp Hematoi 32:1226-1237.

Lieb, Em J. Tessmar, M. Hacker, C. Fischbach, D. Rose, T. Blunk, A.G. Mikos, A. Gopferich, M.B· Schulz. Poly(D，L-lactic acid)-poly(ethylene glycol)- monomethyl ether diblock copolymers control adhesion and osteoblastic differentiation of marrow stromal cells. Tissue Engineering 9:71-84, 2003.

Lo, H., S. Kadiyala, S.E. Guggino, K.W. Leong. Poly(L-lactic acid) foams with cell seeding and controlled-release capacity. J Biomed Mater Res 30:475- 484,1996.

Lu L, Peter SJ, Lyman MD, Lai HL, Leite SM, Tamada JA, Uyama S, Vacanti JP, Langer R, Mikos AG (2000) In vitro and in vivo degradation of porous poly(DL-lactic-co-glycolic acid) foams. Biomaterials 21:1837-1845.

Luo Y, Shoichet MS (2004) A photolabile hydrogel for guided three-dimensional cell growth and migration. Nat Mater 3:249-253.

Lutolf MP, Hubbell JA (2005) Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol 23:47-55.

Maniatopoulos, C., J. Sodek, A.H. Melcher. Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res 254:317-330,1988.

Mankani MH, Kuznetsov SA, Shannon B, Nalla RK, Ritchie RO, Qin Y, Robey PG (2006) Canine cranial reconstruction using autologous bone marrow stromal cells. Am J Pathol 168:542-550.

Mankani MH, Kuznetsov SA, Wolfe RM, Marshall GW, Robey PG (2006) In Vivo Bone Formation by Human Bone Marrow Stromal Cells: Reconstruction of the mouse calvarium and mandible. Stem Cells (In press).

Mao JJ (2002) Mechanobiology of craniofacial sutures. J Dent Res 81:810-816.

Mao JJ (2005a) Calvarial development: cells and mechanics. Curr Opin Orthop 16:331-337.

Mao JJ (2005b) Stem cell driven regeneration of synovial joint. Biol Cell 97:289-301. -96- 200817019

Mao JJ, Giannobile WVt Helms JA, Hollister SJ, Krebsbach PH, Longaker MT, Shi S (2006) Crantofacial tissue engineering by stem cells, J Dent Res (In press).

Mao JJ, Nah HD (2004) Growth and development: hereditary and mechanical modulations. Am J Orthod Dentofac Orthop 125:676-689

Mao JJ, Rahemtulla F, Scott PG (1998) Proteoglycan expression in articular tissues of the rat temporomandibular joint in response to bite raise. J Dent Res 77:1520-1528.

Mao JJ, Wang X, Kopher RA (2003) Suture biomechanics: implications on craniofacial orthopedics. Angle Orthod 73:128-135.

Mao JJ, Wang X, Kopher RA, Nudera JA, Mooney MP (2002) Strain induced osteogenesis in the cranial suture upon controlled delivery of low-frequency cyclic forces. Front Biosci 7:a246-252.

Marion NW, Liang W, Reilly GC, Day DEf Rahaman MN, Mao JJ (2005) Borate glass supports the in vitro osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Mech Adv Materials Struct 12:1-8.

Marion NW, Mao JJ (2006) Mesenchymal stem cells. In Robert Lanza, Irina Klimanskaya (Eds). Methods in Enzymology. Elsevier/Academic Press (In press).

Markopoulou, C.E., I.A. Vrotsos, H.N. Vavouraki, X.E. Dereka, Z.S. Mantzavinos Human periodontal ligament cell responses to recombinant human bone morphogenetic protein-2 with and without bone allografts. J Periodontol 74:982-989, 2003.

Martens, P.J., S.J. Bryant, K.S. Anseth. Tailoring the degradation of hydrogels formed multivinyl poly (ethylene glycol) and poly (vinyl alcohol) macromers for cartilage tissue engineering. Biomacromolecules 4:283-292, 2003.

McKee JA, Banik SS, Boyer MJ, Hamad NM} Lawson JH, Niklason LE} Counter CM (2003) Human arteries engineered in vitro. EMBO Rep 4:633-638.

Meinel L, Betz O, Fajardo R, Hofmann S, Nazarian A, Hilbe M, McCool J, Langer R, Vunjak-Novakovic G, Merkle HP, Rechenberg B, Kaplan DL, Kirker-Head C (2006) Silk-based biomaterials for the healing of critical-size long bone defects. Bone (In press)

Meinel L, Fajardo R, Hofmann S, Langer R, Chen J, Snyder B, Vunjak-Novakovic G, Kaplan DL (2005) Silk implants for healing critical size cranial defects. Bone 37:688-698.

Miranda P, Saiz E, Gryn K, Tomsia AP (2006) Sintering and robocasting of beta· tricalcium phosphate scaffolds for orthopaedic applications. Acta Biomater (In press).

Miura M, Gronthos S, Zhao Mt Lu B, Fisher LW, Robey PG, Shi S (2003) SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proc Natl Acad Sci U S A 100:5807-5812. -97- 200817019

Moioli ΕΚ, Hong L, Guardado J, Clark PA, Mao JJ (2006) Controlled release of ΤΟΡβ3 on early osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Tissue Eng 12:537-546.

Moioli EK, Mao JJ (2006) Cell density and stem cell homing. Tissue Eng (In press).

Mondoro TH, Thomas JWt Henslee-Downey PJ, Peterson CM (2005) NHLBl plans for the promise of cell -based therapies. Cytotherapy 7:317-327.

Mondrinos MJ, Koutzaki S, Jiwanmall E, Li M, Dechadarevian JP, Lelkes PI, Finck CM (2006) Engineering three-dimensional pulmonary tissue constructs. Tissue Eng 12:717-728.

Mooney DJ, Mazzoni CL, Breuer C, McNamara K, Hern D, Vacanti JP, Langer R (1996) Stabilized polyglycolic acid fibre-based tubes for tissue engineering. Biomaterials 17:115-124.

Motlagh D, Yang J, Lui KY, Webb AR, Ameer GA (2006) Hemocompatibility evaluation of poly(glycerol -sebacate) in vitro for vascular tissue engineering. Biomaterials 27:4315-4324.

Murphy WL, Simmons CA, Kaigler D, Mooney DJ (2004) Bone regeneration via a mineral substrate and induced angiogenesis. J Dent Res 83:204-210.

Muschler GF, Nakamoto C, Griffith LG (2004) Engineering principles of clinical cell-based tissue engineering. J Bone Joint Surg Am 86-A:1541-1558.

Nair LS, Bhattacharyya S, Laurencin CT (2004) Development of novel tissue engineering scaffolds via electrospinning. Expert Opin Biol Ther 4:659-668.

Nehrer, SM H.A. Breinan, A. Ramappa, H.P. Hsu, T. Minas, S. Shortkroff, C.B. Sledge, I.V. Yannas, M. Spector. Chondrocyte-seeded collagen matrices implanted in a chondral defect in a canine model. Biomaterials 19: 2313- 2328,1998.

Neubauer M, Hacker M, Bauer-Kreisel P, Weiser B, Fischbach C, Schulz MB, Goepferich A, Blunk T. (2005) Adipose tissue engineering based on mesenchymal stem cells and basic fibroblast growth factor in vitro. Tissue Eng. 2005 Nov-Dec;11(11-12):1840-SI.

Nevins, Μ., M. Camelo, M.L. Nevins, R.K. Schenk, S.E. Lynch. Periodontal regeneration in humans using recombinant human platelet-derived growth factor-BB (rhPDGF-BB) and allogenic bone. J Periodootol 74:1282-1292, 2003.

Nishimura, K., M. Hayashi, K. Matsuda, Y. Shigeyama, A. Yamasaki, A. Yamaoka. The chemoattractive potency of periodontal ligament, cementum and dentin for human gingiva! fibroblasts. J Periodontal Res 24:146-148, 1989. -98- 200817019

Noden DM, Trainor PA (2005) Relations and interactions between cranial mesoderm and neural crest populations. J Anat 207:575-601.

Oberheim MC, Mao JJ (2002). Bone strain patterns of the zygomatic complex in response to simulated orthopedic forces. J Dent Res 81:608-612.

Ochi K, Chen G, Ushida T, Gojo S, Segawa K, Tai H, Ueno K, Ohkawa H, Mori T, Yamaguchi A, Toyama Y, Hata J, Umezawa A (2003). Use of isolated mature osteoblasts in abundance acts as desired-shaped Bone regeneration in combination with a modified poly-DL-lactic-co-glycolic acid (PLGA)-collagen sponge. J Cell Physiol 194:45-53.

Ohgushi H, Caplan Al (1999) Stem cell technology and bioceramics: from cell to gene engineering. J Biomed Mater Res 48:913-927.

Ohgushi, Η., A.I. Caplan. Stem cell technology and bioceramics: from cell to gene engineering. J Biomed Mater Res 48:913-927, 1999.

Osborne CS, Barbenel JC, Smith D, Savakis M, Grant MH (1998). Investigation into the tensile properties of collagen/chondroitin-6-sy|phate gels: the effect of crosslinking agents and diamines. Med Biol Eng Comput. 36:129-134.

Osyczka, A.M. and P.S. Leboy. BMP regulation of early osteoblast genes in human marrow stromal cells is mediated by ERK and PI3-K signaling. Endocrinology 146:3428-3437, 2005.

Pacifici M, Koyama E, Iwamoto M (2005) Mechanisms of synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Res C Embryo Today 75:237-248.

Parfitt AM, Drezner MK, Glorieux FH, Kanis JA, Malluche Ht Meunier PJ, Ott SM, Recker RR (1987) Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res 2:595-610.

Park YJ, Lee YMt Lee JY, Seol YJ, Chung CP, Lee SJ (2000) Controlled release of platelet-derived growth factor-BB from chondroitin sulfate-chitosan sponge for guided bone regeneration. J Control Rel 67:385 -394.

Parker GC, Anastassova-Kristeva M, Eisenberg LM, Rao MS, Williams MAt Sanberg PR, English D; Editorial Board of Stem Cells and Development (2005) Stem cells: shibboleths of development, part II: Toward a functional definition. Stem Cells Dev 14:463-469.

Passegue E, Wagers AJ (2006) Regulating quiescence: new insights into hematopoietic stem cell biology. Dev Cell 10:415-417. -99- 200817019

Patel RV, Mao JJ (2003). Microstructura! and elastic properties of the extracellular matrices of the superficial zone of neonatal articular cartilage by atomic force microscopy. Front Biosci 8:a123-a130.

Pei M, Solchaga LA, Seidel J, Zeng L, Vunjak-Novakovic G, Caplan Al, Freed LE (2002). Bioreactors mediate the effectiveness of tissue engineering scaffolds. FASEB J 16:1691-1694.

Pelissier P, Villars F, Mathoulin-Pelissier S, Bareille R, Lafage-Proust MH, Vilamitjana-Amedee J (2003) Influences of vascularization and osteogenic cells on heterotopic bone formation within a madreporic ceramic in rats. Plast Reconstr Surg 111:1932-1941.

Peptan IA, Hong L, Mao J J (2006) Comparison of osteogenic potentials of visceral and subcutaneous adipose -derived cells of rabbits. Plastic Reconstruct Surg 117:1462-1470.

Pereira, R.F., K.W. Halford, M.D. O'Hara, D.B. Leeper, B.P. Sokolov, M.D. Pollard, O. Bagasra, D.J. Prockop. Cultured adherent cells from marrow can serve as long-lasting precursor cells for bone, cartilage, and lung in irradiated mice. Proc. NatL Acad. Sci. U.S.A. 92: 4857-4861, 1995.

Peters MC, Polverini PJ, Mooney DJ (2002) Engineering vascular networks in porous polymer matrices. J Biomed Mater Res 60:668-678.

Pitaru, S., S.A. Narayanan, S. Olson, N. Savion, H. Hekmati, I. Alt, Z. Metzger. Specific cementum attachment protein enhances selectively the attachment and migration of periodontal cells to tooth root surfaces. J Periodontal Res 30:360-368, 1995.

Pittenger MFt Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RKt Douglas Rf Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR (1999). Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284:143-147.

Pittenger, M.F., A.M. Mackay, S.C. Beck, R.K. Jaiswal, R. Douglas, J.D. Mosca, M.A. Moorman, D.W. Simonetti, S. Craig, D.R. Marshak. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284,143-147,1999.

Ponticiello MS, Schinagl RM, Kadiyala S, Barry FP (2000). Gelatin-based resorbable sponge as a carrier matrix for human mesenchymal stem cells in cartilage regeneration therapy. J Biomed Mater Res 52:246-255.

Posnick JC (2000) Craniosynostosis and the craniofacial dysostosis syndromes: current surgical management In: Cohen MM Jr and MacLean RE (Eds). Craniosynostosis: Diagnosis, Evaluation and Management. 100- 200817019

Pradeep, A.R. and B.V. Karthikeyan. Tissue engineering: prospect for regenerating periodontal tissues. Indian J Dent Res 14:224-229, 2003.45. Ripamonti, U. Bone induction by BMPs/OPs and related family members in primates. J.Bone Joint Surg.Am 83: S116-127, 2001.

Radhakrishnan P, Lewis NT, Mao JJ (2004) Zone-specific micromechanical properties of the extracellular matrices of growth plate cartilage. Ann Biomed Eng 32:284-291.

Radhakrishnan Pf Mao JJ (2004) Nanomechanical properties of facial sutures and sutural mineralization front. J Dent Res 83:470-475.

Rahaman MN, Mao JJ (2005) Stem cell based composite tissue constructs for regenerative medicine. Biotechnol & Bioeng 91:261-284.

Rajashekhar G, Willuweit A, Patterson CE, Sun P, Hilbig A, Breier G, Helisch A, Clauss M (2006) Continuous endothelial cell activation increases angiogenesis: evidence for the direct role of endothelium linking angiogenesis and inflammation. J Vase Res 43:193-204.

Rivas R, Shapiro F (2002) Structural stages in the development of the long bones and epiphyses: a study in the New Zealand white rabbit. J Bone Joint Surg Am 84-A:85-100.

Rose, L.F., B.L.Mea!eyt R. J.Genco, D.W. Cohen. Medicine, Surgery, and Implants, periodontics: ISBN 0-8016-7978-8. Elsevier Mosby, 238-239;573-601, 2004.

Rotte, N., J. Aigner, A. Naumann, H. Planck, C. Hammer, G. Burmester, M. Sittinger. Cartilage reconstruction in head and neck surgery: Comparison of resorbable polymer scaffolds for tissue engineering of human septal cartilage. J Biomed Mater Res 42: 347-356, 1998.

Rubin CT, Lanyon LE (1987). Osteoregulatory nature of mechanical stimuli: function as a determinant for adaptive remodeling in bone. J Orthop Res;5:300-310.

Ruiz de Almodovar C, Luttun A, Carmeliet P (2006) An SDF-1 trap for myeloid cells stimulates angiogenesis. Cell 124:175-89.

Satomura, K., P. Krebsbach , P. Bianco, P. G. Robey . Osteogenic imprinting upstream of marrow stromal cell differentiation. J Cell Biochem. 78:391-403, 2000.

Schmitt JM, Hwang K, Winn SRt Hollinger JO (1999) Bone morphogenetic proteins: an update on basic biology and clinical relevance. J Orthop Res 17:269-278.

Schultz G, Rotatori DS, Clark W (1991). EGF and TGF-alpha in wound healing and repair. J Cell Biochem 45:346-352. •101 - 200817019

Sculean, AM G.C. Chiantella, P. Windisch, N. Donos. Clinical and histologic evaluation of human intrabony defects treated with an enamel matrix protein derivative (Emdogain}· Int J Periodontics Restorative Dent 20:374-381, 2000.

Sculean, A., N. Donos, M. Brecx, T. Carring, E. Reich. Healing of fenestration-type defects following treatment with guide tissue regeneration or enamel matrix proteins. An experimental study in monkeys. Clin Oral Invest 4:50-56, 2000.

Seo BM, Miura M, Gronthos S, Bartold PM, Batouli S, Brahim J, Young M, Robey PG, Wang CY, Shi S. (2004) Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. Lancet 364:149-155.

Seruya M, Shah A, Pedrotty Df du Laney T, Melgiri R, McKee JA, Young HE, Niklason LE (2004) Clonal population of adult stem cells: life span and differentiation potential. Cell Transplant 13:93-101.

Sharpe EE 3rd, Teleron AA, Li B, Price Jt Sands MS, Alford K, Young PP (2006) The origin and in vivo significance of murine and human culture-expanded endothelial progenitor cells. Am J Pathol 168:1710-1721.

Shea LD, Wang D, Franceschi RT, Mooney DJ (2000). Engineered bone development from a pre-osteoblast cell line on three-dimensional scaffolds. Tissue Eng 6:605-617.

Shen W, Li Y, Huard J (2005) Musculoskeletal gene therapy and its potential use in the treatment of complicated musculoskeletal infection. Infect Dis Clin North Am 19:1007-1022.

Sherman R, Chapman WC, Hannon G, Block JE (2001). Control of bone bleeding at the sternum and iliac crest donor sites using a collagen-based composite combined with autologous plasma: results of a randomized controlled trial. Orthopedics 24:137-141.

Shi Q, Rafii S, Wu MH, Wijelath ES, Yu C, Ishida A, Fujita Y, Kothari S, Mohle R, Sauvage LR, Moore MA, Storb RF, Hammond WP (1998) Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood 92:362-367.

Shi Q, Rafii S, Wu MH, Wijelath ES, Yu C, Ishida A, Fujita Y, Kothari S, Mohle R, Sauvage LR, Moore MA, Storb RF, Hammond WP (1998) Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92:362-367.

Shi St Gronthos S, Chen S, Reddi Af Counter CM, Robey PG( Wang CY (2002). Bone formation by human postnatal bone marrow stromal stem cells is enhanced by telomerase expression. Nat Biotechnol 20:587-591. -102- 200817019

Shi YJ, Shen RN, Lu L, Broxmeyer HE (1994) Comparative analysis of retroviral-mediated gene transduction into CD34+ cord blood hematopoietic progenitors in the presence and absence of growth factors. Blood Cells 20:517-524.

Shih C, Digiusto D, Forman SJ (2000) Ex vivo expansion of transplantable human hematopoietic stem cells. J Hematotherapy & Stem Cell Res 9:621-628.

Shimizu, Y. Tissue engineering for soft tissues. In: Ikada, Y., ed. Tissue Engineering for Therapeutic Use 1. Tokyo: Elsevier, pp. xv-xvii, 1998.

Shive MS, Anderson JM (1997). Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres. Adv Drug Deliv Rev 13;28(1 ):5-24.

Sikavitsas VI, Temenoff JS, Mikos AG. Biomaterials and bone mechanotransduction. Biomaterials 22:2,581 -2,593, 2001.

Sokal RR, Rohlf FJ (1981) Biometry: The Principles and Practice of Statistics in Biological Research. 2nd Ed., p. 672 and pp. 583-591. W.H. Freeman & Co., New York.

Somerman, M.J., B. Shroff, W.S. Argraves, G. Morrison, A.M. Craig, D.T. Denhardt, R.A. Foster, JJ. Sauk. Expression of attachment proteins during cementogenesis. J Biol Buccale 18:207-214, 1990.

Stahl A, Wu X, Wenger A, Klagsbrun M, Kurschat P (2005) Endothelial progenitor cell sprouting in spheroid cultures is resistant to inhibition by osteoblasts: a model for bone replacement grafts. FEBS Lett 579:5338-5842.

Stevens MM, Marini RP, Schaefer D, Aronson J, Langer R, Shastri VP (2005) In vivo engineering of organs: the bone bioreactor. Proc Natl Acad Sci U S A 102:11450-11455.

Stosich MS, Bastian B, Clark PA, Marion NM, Mao JJ (2006) Engineered neovascularization in hydrogel promotes de novo adipogenesis from human mesenchymal stem cells. FASEB J Express Manuscript submission invited (FASEBJ/2006/052746).

Stosich MS, Mao JJ (2005) Stem cell based soft tissue grafts for plastic and reconstructive surgeries. Sem Plastic Surg 19:251-260.

Stosich MSt Mao JJ (2006) Adipose tissue engineered from adult human stem cells: therapeutic applications in reconstructive and plastic surgeries. Plast Reconstruct Surg (In press).

Sundaramurthy S, Mao JJ (2006) Mechanical modulation of endochondral development in the distal femoral condyle. J Orthop Res 24:229-241.

Takai E, Costa KD, Shaheen A, Hung CT, Guo XE (2005) Osteoblast elastic modulus measured by atomic force microscopy is substrate dependent. Ann Biomed Eng 33:963-971. -103- 200817019

Talwar, R., L.De. Silvio, F.J. Heghes, G.N. King. Effects of carrier release kinetics on bone morphogenic protein-2-induced periodontal ligament regeneration in vivo. J Clin Periodontol 28:340-347, 2001.

Tang M, Mao JJ (2006) Matrix and Gene Expression in the Rat Cranial Base Growth Plate. Cell Tiss Res 324:467-474.

Tang, M.H., H. Takita, T. Kohgo, M. Ilzuka, Y. Doi, Y. Kuboki. BMP-induced osteogenesis with two geometrically different biodegradable carbonate apatites. J Hard Tissue Biology 10: 7-16,2001.

Tanihara M, Suzuki Y, Yamamoto E, Noguchi A, Mizushima Y (2001) Sustained release of basic fibroblast growth factor and angiogenesis in a novel covalently crosslinked gel of heparin and alginate. J Biomed Mater Res 56:216-221.

Tapadia MD, Cordero DR, Helms JA (2005) It's all in your head: new insights into craniofacial development and deformation. J Anat 207:461-477.

Thurston G (2002) Complementary actions of VEGF and angiopoietin-1 on blood vessel growth and leakage. J Anat 200:575-580.

Tomkoria S, Patel RV, Mao JJ (2004) Heterogeneous micromechanical properties of articular and zonal regions of the rabbit radius condyle by atomic force microscopy. Med Eng Phys 26:815-22.

Troken A, Wan LC, Marion NW, Mow VC, Mao JJ (2006) Properties of Cartilage and Menisci. Wiley Encyclopedia of Medical Devices and Instrumentation (In press).

Troken, Mao JJ (2006) Cell density in TMJ tissue engineering. J Eng Med (In press).

Trumpp WA (2006) Bone-marrow haematopoietic-stem-cell niches. Nat Rev Immunol 6:93-106.

Tsang VL, Bhatia SN (2004) Three-dimensional tissue fabrication. Adv Drug Deliv Rev 56:1635-1647.

Tuan RS (2004) Biology of developmental and regenerative skeietogenesis. Clin Orthop Relat Res 427 (Suppl):S105-117.

Tuli, R., S. Nandi, W.J. Li, S. Li, X. Huang, P.A. Manner, P. Laquerrieer, U. Noth, D.J. Hall, R.S. Tuan. Huaman mesenchymal progenitor cell-based tissue engineering of a singleunit osteochondral construct. Tissue Engineering 10:1169-1179, 2004.

Udani VM (2006) The continuum of stem cell transdifferentiation: possibility of hematopoietic stem cell plasticity with concurrent CD45 expression. Stem Cells Dev 15:1-3.

Valeski JE, Baldwin AL (2003) Role of the actin cytoskeleton in regulating endothelial permeability in venules. Microcirculation 10:411-420. -104- 200817019

Velegol D, Lanni F (2001) Cell traction forces on soft biomaterials. I. Microrheology of type I collagen gels. Biophys J 81:1786-1792.

Vij K, Mao JJ (2006) Geometry and cell density of rat craniofacial sutures during early postnatal development and upon in vivo cyclic loading. Bone 38:722-730.

Volk SW, Leboy PS (1999) Regulating the regulators of chondrocyte hypertrophy. J Bone Miner Res 14:483 -486.

Vunjak-Novakovic G, Obradovic B, Martin I, Freed LE (2002). Bioreactor studies of native and tissue engineered cartilage. Biorheo! 39:259-268.

Vunjak-Novakovic G·，Martin I” Obradovic B·，Treppo S, Grodzinsky AJ·，Langer R.， Freed L (1999) Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue engineered cartilage. J Orthop Res 17:130-138.

Wang Xt Mao JJ (2002) Accelerated chondrogenesis of the rabbit cranial base growth plate upon oscillatory mechanical stimuli. J Bone and Miner Res 17:457-462.

Weinand C, Pomerantseva I, Neville CM, Gupta R, Weinberg E, Madisch I, Shapiro F, Abukawa H, Troulis MJ, Vacanti JP (2006) Hydrogel-beta-TCP scaffolds and stem cells for tissue engineering bone. Bone 38:555-563.

Wenger A, Stahl A, Weber H，Rnkenzeller G，Augustin HG，Stark GB，Kneser U (2004) Modulation of in vitro angiogenesis in a three-dimensional spheroidal coculture model for bone tissue engineering. Tissue Eng 10:1536-1547.

Wikesjo U.M., M. Qahash, R.C. Thomson, A.D. Cook, M.D. Rohrer, J.M. Wozney, W.R. Hardwick. Space-providing expanded polytetrafluoroethylene devices define alveolar augmentation at dental implants induced by recombinant human bone morphogenetic protein 2 in an absorbable collagen sponge carrier. Clin Implant Dent Relat Res 5:112-123, 2003A.

Wikesjo, U.M., A.V. Xiropaidis, R.C. Thomson, A.D. Cook, K.A. Selvig, W.R. Hardwick. Periodontal repair in dogs: rhBMP-2 significantly enhances bone formation under provisions for guided tissue regeneration. J Clin Periodontol 30:705-714, 2003B.

Williams CGT Malik AN, Kim TK, Manson PN, Elisseeff JH (2005) Variable cytocompatibility of six cell lines with photoinitiators used for polymerizing hydrogels and cell encapsulation. Biomaterials 26:1211-1218,

Wilson A, Trumpp A (2006) Bone-marrow haematopoietic-stem-cell niches. Nat Rev Immunol 6:93-106. -105- 200817019

Xin XJ, Hussein MA, Mao JJ (2006) Human mesenchymal stem cells and osteogenic derivatives differentiate on PLGA nanofibers in vitro: molecular and nanotopographic characterization. Biomaterials (In press).

Yamanouchi K, Satomura K, Gotoh Y, Kitaoka E, Tobiume St Kume K, Nagayama M (2001) Bone formation by transplanted human osteoblasts cultured within collagen sponge with dexamethasone in vitro. J Bone Miner Res 16:857-867.

Yeoh JS, van Os R, Weersing E, Ausema A, Dontje B, Vellenga E, de Haan G (2006) Fibroblast growth factor -1 and 2 preserve long-term repopulating ability of hematopoietic stem cells in serum-frae cultures. Stem Cells (In press).

Yin T, Li L (2006) The stem cell niches in bone. J Clin Invest 116:1195-1201.

Yoo, J. U. and B. Johnstone. The role of osteochondral progenitor cells in fracture repair. Clin Orthop Relat Res 355 Suppl:S73-81,1998.

Young, R.G., D.L. Butler, W. Weber, A.I. Caplan, S.L. Gorden, D.J. Fink. Use of mesenchymal stem cells in a collagen matrix for Achilles tendon repair. J Orthop Res 16: 406-413, 1998.

Yourek G, Alhadlaq A, Patel R, McCormick S, Reilly GC, Mao JJ (2004)

Nanophysical properties of living cells: The Cytoskeleton. In Dutta M, Strosoio M (Eds) Biological Nanostructures and Applications of Nanostructures in Biology: Electrical, Mechanical, and Optical Properties. New York, NY, Kluwer Academic Publishing, pp. 69-97.

Zabka AG, PluharGE, Edwards RB 3rd, Manley PA, Hayashi K, Heiner JP, KalscheurVL, Seeherman HJ, Market (2001). Histomorphometric description of allograft bone remodeling and union in a canine segmental femoral defect model: a comparison of rhBMP-2, cancellous bone graft, and absorbable collagen sponge. J Orthop Res 19:318-327.

Zhang N, Mustin D, Reardon W, Almeida AD, Mozdziak P, Mrug M, Eisenberg LM, Sedmera D (2006) Blood -borne stem cells differentiate into vascular and cardiac lineages during normal development. Stem Cells Dev 15:17-28.

Zhou X, Stuart A, Dettin LE, Rodriguez G, Hoel B, Gallicano Gl (2004) Desmoplakin is required for microvascular tube formation in culture. J Cell Sci 117:3129-3140.

Zisch AH (2004) Tissue engineering of angiogenesis with autologous endothelial progenitor cells. Curr Opin Biotechnol 15:424-429.

Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH (2001) Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng 7:211-228. -106-

Claims

200817019 十、申請專利範圍 - 1 · 一種組織模組，其包含 (a )生物相容性基質； (b )血管祖細胞；及 (c )組織祖細胞； ^ 其中該模組係於體外，或（a ) 、（ b )或（c )中至少一項對脊椎動物接受者係異源性。 # 2·—種形成血管形成組織模組之方法，其包含：組合（a )生物相容性基質、（b )組織祖細胞，及（ c)血管祖細胞；藉此形成基質、組織祖細胞及血管祖細胞之組合物。 3 .如申請專利範圍第2項之方法，其進一步包含培養該基質、組織祖細胞及血管祖細胞之組合物。 4.如申請專利範圍第2至3項中任一項之方法，其中該組合發生於體外。 # 5.如申請專利範圍第3項之方法，其中該培養包含於 * 體外培養。氣 6 .如申請專利範圍第3項之方法，其中該培養包含於活體內培養。 7.如申請專利範圍第1項之模組或申請專利範圍第2 項之方法，其中該組織祖細胞係選自間質幹細胞（MS C ) 、間質幹細胞源性細胞、成骨細胞（osteoblasts )、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞、神經元、膠質細胞、纖維母細胞（fibroblasts )、心肌細胞、肝細胞、腎細胞、膀胱細 -107- 200817019 胞、β胰島細胞、成齒質細胞（odontoblasts )、牙髓細胞、牙周細胞、腱細胞、肺臟細胞、心臟細胞或彼等之組合〇 8·如申請專利範圍第7項之模組或方法，其中該纖維母細胞係選自間質纖維母細胞（interstitial fibroblasts) 、肌腱纖維母細胞（tendon fibroblasts )、韌帶纖維母細胞、牙周膜纖維母細胞或顱顏纖維母細胞。 9 ·如申請專利範圍第7項之模組或方法，其中該組織祖細胞係間質幹細胞源性軟骨細胞。 I 〇 .如申請專利範圍第7項之模組或方法，其中該組織祖細胞係間質幹細胞。 II ·如申請專利範圍第1項之模組或申請專利範圍第2 項之方法，其中該血管祖細胞係選自造血幹細胞（HSC) 、造血幹細胞源性內皮細胞、血管內皮細胞、淋巴管內皮細胞、培養之內皮細胞、原代培養內皮細胞、骨髓幹細胞、臍帶血細胞、人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC )、淋巴內皮細胞、內皮祖細胞、分化成內皮細胞之幹細胞、平滑肌細胞、間質纖維母細胞或肌纖維母細胞。 1 2 ·如申請專利範圍第1 1項之模組或方法，其中該血管祖細胞係造血幹細胞。 1 3 .如申請專利範圍第1 1項之模組或方法，其中該血管祖細胞係造血幹細胞源性內皮細胞。 14.如申請專利範圍第1項之模組或申請專利範圍第2 項之方法，其中該基質包含選自纖維蛋白、纖維蛋白原、 -108- 200817019 膠原蛋白、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚醯胺、聚碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、海洋生物黏著蛋白、氰基丙烯酸酯、聚合物水凝膠或彼等之組合之材料。 1 5 ·如申請專利範圍第1 4項之模組或方法，其中該基質包含聚合物水凝膠。 • 1 6 .如申請專利範圍第1項之模組或申請專利範圍第2 項之方法，其中該基質包含至少一個實體通道。 • 1 7.如申請專利範圍第1 6項之模組或方法，其中該基質包含數個平均直徑至少約〇 . 1毫米至約5 〇毫米之實體通道。 18.如申請專利範圍第17項之模組或方法，其中該數個實體通道之平均直徑係約〇·2毫米、約0.3毫米、約〇 . 4毫米、約0 · 5毫米、約0 · 6毫米、約0 · 7毫米、約〇 . 8 毫米、約0.9毫米、約1.0毫米、約1.1毫米、約1.2毫米、約1 .3毫米、約1.4毫米、約1 · 5毫米、約1 . 6毫米 Φ 、約1 · 7毫米、約1 · 8毫米、約1 · 9毫米、約2 · 0毫米、約2 · 5毫米、約3.0毫米、約3.5毫米、約4 · 0毫米、約 ‘ 4 · 5毫米、約5 · 0毫米、約5 · 5毫米、約6 · 0毫米、約6.5 毫米、約7.0毫米、約7.5毫米、約8.0毫米、約8.5毫米、約9.0毫米、約9.5毫米、約1〇毫米、約15毫米、約20毫米、約25毫米、約30毫米、約35毫米、約40 毫米、或約45毫米。 1 9 ·如申請專利範圍第1項之模組或申請專利範圍第2 項之方法，其中該基質進一步包含生長因子或導入生長因 -109- 200817019 子至基質材料之步驟。 20.如申請專利範圍第19項之模組或方法，其中該生長因子係新生血管生長因子。 21·如申請專利範圍第19項之模組或方法，其中該生長因子係選自鹼性纖維母細胞生長因子（b F G F )、血管 ’ 內皮生長因子（VEGF )、血小板源性生長因子（pDGF ) 、轉化生長因子β ( TGFb )或彼等之組合。 • 22.如申請專利範圍第1項之模組或申請專利範圍第2 項之方法，其中該模組包含密度至少約 0.000 1 M細胞 (M)/ml至約1 000 M/ml之祖細胞。 23.如申請專利範圍第22項之模組或方法，其中該祖細胞係以約1 M/m卜約5 M/ml、約10 M/m卜約15 M/ml 、約 20 M/ml、約 25 M/ml、約 30 M/ml、約 35 M/ml、約 40 M/ml、約 45 M/ml、約 50 M/ml、約 55 M/ml、約 60 M / m 1、約 6 5 M / m 1、約 7 0 M / m 1、約 7 5 M / m 1、約 8 0 M / m 1 _ 、約 8 5 Μ / m 1、約 9 0 Μ / m 1、約 9 5 Μ / m 1、或約 1 〇〇 Μ / m 1 之密度存在於該基質中。 ‘ 24 ·如申請專利範圍第1項之模組或申請專利範圍第2 項之方法，其中該血管祖細胞對組織祖細胞之比係介於約 1 0 0 : 1 至約 1 :1 0 0。 25·如申請專利範圍第24項之模組或方法，其中該血管祖細胞對組織祖細胞之比係約20:1、約19:1、約18:1 、約 1 7 : 1、約 1 6 :1、約 1 5 : 1、約 1 4 : 1、約 1 3 : 1、約 1 2 : 1 、約 1 1 : 1、約 1 0: 1、約 9: 1、約 8 : 1、“ 7 : 1、約 6 : 1、約 -110- 200817019 5 :1、約 4:1、約 3 : 1、約 2 : 1、約 1 :丨、約 1 :2、約 1 : 3、約 1 : 4、約 1 : 5、約 1 : 6、約 1 : 7、約 i : 8、約 i : 9、約！： i 〇、約 1 :1 1、約 1 :1 2、約 1 :1 3、約 1 :! 4、約 i : ! 5、約 1 : 1 6、約 1 ·· 1 7、約 1 :1 8、約 1 :1 9、或約 i : 2 〇。 26·—種申請專利範圍第i項之組織模組於製備供移植至個體以治療該個體之組織或器官缺損之藥物上之用途〇 φ 27· —種活體外識別用於增加組織血管形成之候選分子之方法，其包含：令候選分子與基質、組織祖細胞、血管祖細胞、其組合物或申請範圍第1項或第7至2 5項中任一項之組織模組接觸；培養該組織模組；及測量該組織模組之血管形成。 2 8.如申請專利範圍第27項之方法，其進一步包含測 ® 定該組織模組中之血管形成相較於未與該候選分子接觸之對照組織模組是否增加。 ' 29·—種活體外識別用於減少組織血管形成之候選分子之方法，其包含：令候選分子與基質、組織祖細胞、血管祖細胞、其組合物或申請範圍第1項或第7至25項中任一項之組織模組接觸；成形管及血 ; 之且且模模織織該該養量培測 -111 200817019 30·如申請專利範圍第29項之方法，其進一步包含測定該組織模組中之血管形成相較於未與該候選分子接觸之對照組織模組是否減少。 3 1 ·如申請專利範圍第1項之模組或申請專利範圍第2 項之方法，其中該組織模組係骨、脂肪、膀胱、腦、乳房、骨軟骨接合、中樞神經系統、脊髓、周邊神經、她神經驂質、食道、輸卵管、心臟、胰臟、小腸、膽囊、腎臟、/ 臟、肺臟、卵巢、前列腺、脾臟、骨骼肌、皮膚、咳 _ 、睾九、胸腺、甲狀腺、氣管、泌尿生殖道、輸尿管、^ 曰床道、間質軟組織、骨膜、牙周組織、顱骨縫、毛囊、η ^ 褰D腔黏膜或子宮組織模組。 3 2·如申請專利範圍第3 1項之模組或方法，甘& 其中該組織模組係骨組織模組。 3 3 .如申請專利範圍第3 1項之模組或方法，甘云其中該組織模組係脂肪組織模組。 -112-