TW200815598A - Methods of inhibiting tumor cell aggressiveness using the microenvironment of human embryonic stem cells - Google Patents

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200815598 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於使用由胚胎幹細胞產生之化合物以治療及/ 或預防患者中之侵襲性腫瘤細胞生長及/或播散之方法。 更特定言之，本發明係關於向該患者投與Nodal活性抑制 劑’其包括（但不限於）專門由人類胚胎幹細胞產生之彼等 抑制劑。本發明亦係關於偵測患者之侵襲性腫瘤之方法， 其包含偵測該患者細胞中Nodal的存在。 【先前技術】 侵襲性腫瘤細胞與胚胎祖細胞共有許多特徵。在脊椎動 物發育期間，多能前驅細胞經由信號轉導分子的自分泌或 旁分泌傳遞而逐漸被指定為特定命運，且在癌症進展期 間，惡性細胞類似地釋放及接收促進腫瘤生長及轉移之指 示信號（cue)。如由侵襲性腫瘤細胞之表示反分化、多能成 形表型（亦即，能對微環境因子作出反應且經由後生機制 影響其他細胞者）之分子簽名所證明，該等侵襲性腫瘤細 胞（尤其黑素瘤細胞）顯示類幹細胞成形（Bittner等人， 2000，406:536-540 ; Hendrix等人，2003，iVW. C⑽3:411-421)。此外，侵襲性黑素瘤細胞能模擬血管 生成，亦即，其能形成類血管生成網路，同時表現與内皮 細胞類型相關之基因（Seftor等人，2002，Crit. Rev

Oncology Hematol. 44:17-27 ; Maniotis 等人，Am· j.

Pathol· 155:739-752) ° 先前研究藉由檢驗胚胎微環境調節腫瘤細胞行為的能力 123180.doc 200815598 而利用癌症與幹細胞之間的相似性（Pierce等人，1982, 42:1082-1087 ; Gerschenson等人，1986，Proc· TVa". Jcai 5W· ίλ & / SJ:7307-7310 ; Lee等人，2005, Dev. 233:1560-1570 ; Mintz等人，1975，Pr%· dca次 &ζ·. t/, & d 7:3585-3589)。舉例而言，Pierce及同 事報導神經胚期小鼠胚胎調節神經母細胞瘤細胞，且胚胎 皮膚抑制黑素瘤生長（Pierce等人，1982，Cancer 42:1082-1087 ; Gerschenson等人，1986，Proc· dead·

5W. [/· & j 53:73 07-7310)。儘管研究已集中於胚胎信號在 調節腫瘤細胞中之作用，但極少數利用胚胎模型作為工具 以發現癌細胞調節其微環境之分子機制及所得相互作用。 促成幹細胞成形之主要因子中之一者為Nodal。Nodal為 屬於轉化生長因子P(TGFp)超家族之高度保守成形素 (Schier等人，2003，^(㈣ 1/. i?ev. Ce// Dev.价<9/. 19:589-621)。藉由充當原腸胚形成前之組織信號，Nodal引發胚 軸形成，且先前研究證明Nodal的異位表現誘導異位上之 中内胚層命運（Whitman，2001，Dev. Ce// 1:605-617 ; Schier, 2003, Annu. Rev. Cell Dev. BioL 19:589-621 ； Iannaccone 等人，1992，Z)ev. 194:198-208 ; Smith， 1995, Curr. Opin. Cell BioL 7:856-861 ; Zhou等人，1993, iVaiwre 361:543-547 ; Rebagliati 等人，1998，/V(9c· iVai/· Acad· Sci· C/· d 95:9932-9937 ; Toyama 等人，1995, Deve/opmeni 121:383-391) 〇

Nodal活化包括與辅受體Cripto結合且隨後使I型及II型活 123180.doc 200815598 化素樣激酶受體（ALK)磷酸化。轉而，使SMAD2及SMAD3 活化（Lee 等人，2006，Nature Medicine 12:882-884)。此 外，人類胚胎幹細胞表現No dal且分泌No dal之内源性抑制 劑，諸如 Lefty A/B(Besser，D.，2004，J•价〇/. C/2em· 279:45076-45084)。分別為鼠類Lefty 2及Lefty 1之人類同 源物之Lefty A及Lefty B在染色體lq42上彼此分隔約50 kb 且具有 96%—致性（Kosaki等人，1999，Am· J· Hum· Genet· 64:712-21)。Lefty A及Lefty B為TGFf超家族之成員，且被 視為有效Nodal抑制劑中之一者。 【發明内容】 本發明提供包含一或多種來自人類胚胎幹細胞（hESC)之 微環境之經分離因子的組合物，其包括（但不限於）Lefty及 Nodal抑制劑。本發明進一步提供藉由用人類胚胎幹細胞 調節基質所產生之經分離Lefty蛋白質。本發明進一步提供 包含糖基化Lefty(包括自人類胚胎幹細胞之微環境分離之 糖基化Lefty)之蛋白質、其組合物，及抑制哺乳動物中之 腫瘤細胞生長之方法，該方法包含向該哺乳動物投與該等 組合物。 本發明亦提供利用源自人類胚胎幹細胞（hESC)及其微環 境之因子以治療及預防腫瘤形成及進展且抑制腫瘤細胞侵 襲之方法。本發明進一步提供抑制哺乳動物中之腫瘤細胞 生長及/或治療該哺乳動物之侵襲性腫瘤之方法，其包含 向體内存在至少一種腫瘤細胞之哺乳動物投與有效量之 Nodal活性抑制劑，該抑制劑包括（但不限於）：如本文所論 123180.doc 200815598 述之源自hESC之Lefty及合成衍生物、糖基化Lefty、重組 Lefty、抗Nodal抗體、活化素受體樣蛋白ALK 4、ALK 5及/ 或ALK7中之一或多者之抑制劑、Cripto抑制劑、抗Nodal 反義部分（諸如抗Nodal嗎淋基），及包括（但不限於)Notch 4 抑制劑（諸如Notch 4 siRNA)之Notch抑制劑。 本發明亦提供抑制哺乳動物中之腫瘤細胞生長之方法， 其包含向體内存在至少一種腫瘤細胞之哺乳動物投與有效 量之已與人類胚胎幹細胞接觸之預調節微環境。 本發明進一步提供用於偵測患者之侵襲性腫瘤（包括（但 不限於）黑素瘤及乳癌）之方法，其包含以下步驟：自患者 獲得樣本；對該樣本檢定Nodal的存在及Nodal抑制劑（諸 如Lefty或經修飾之Lefty或Lefty衍生物）的缺乏；及若樣本 中存在Nodal且不存在Lefty，則偵測侵襲性腫瘤細胞。本 發明亦提供鑑別用於治療侵襲性腫瘤之化合物之方法，其 包含：提供複數個表現Nodal之細胞；在存在及不存在候 選化合物的情況下對該等細胞檢定Nodal活性；及gNodal 活性在存在候選化合物的情況下比在不存在該候選化合物 的情況下小，則將該化合物鑑別為用於治療侵襲性腫瘤之 化合物。 另外，本發明提供用於監測作為治療患者之侵襲性腫瘤 之藥劑的醫藥組合物之有效性之方法、用於偵測侵襲性腫 瘤細胞存在之方法，及用於偵測哺乳動物中具有反分化、 多能成形表型之細胞存在之方法。 鐾於以下對某些較佳實施例之更詳細描述及申請專利範 123180.doc 200815598 圍，本發明之特定實施例將變得顯而易見。 【實施方式】 在某些實施例中，本發明提供包含_或多種來自人類胚 胎幹細胞（hESC)之微環境之經分離因子的組合物。如本文 所用之"一或多種經分離因子”係指存在於hEsc之微環境中 之任-種或任-組因子。該等因子可個別地加以分離，或 以提供組合形式之一組因子的方式加以分離。或者，，，一 或多種經分離因子"可係指存在於確定基質上之任一種因 子或-組因子。如本文所用之"微環境,,為包含與胚胎幹細 胞、較佳人類胚胎幹細胞接觸且受該等胚胎幹細胞影響之 基底膜或其他確定基質之環境。”預調節，，微環境為在如本 文所述之適當條件下已與人類胚胎幹細胞接觸之微環境， 且其描述於（例如）Postovii等人，2006，&㈣24·5〇ι_ 505中且在本文圖1中加以說明。本文圖丨說明利用人類胚 胎幹細胞微環境來抑制腫瘤細胞侵襲。 在一實施例中，來自hESC之微環境之經分離因子抑制 Nodal。如本文所述，侵襲性腫瘤細胞表現Ndai，且 Nodal為成形、致瘤性及侵襲性所必需。因此，抑制^^^以 提供用於治療及預防侵襲性腫瘤之極佳方法。如本文所用 之術語”侵襲性腫瘤，，及”侵襲性癌症，，（包括"侵襲性黑素瘤" 及”侵襲性乳癌”）係指具有涉及或不涉及轉移之贅生性生長 之惡性細胞。在一非限制性實例中，侵襲性腫瘤可係指具 有特徵為通常限於其他細胞譜系之異常基因表現，伴隨有 譜系特異性因子缺失之轉分化表型的惡性細胞。舉例而 I23180.doc 200815598 言，侵襲性黑素瘤細胞具有指示上皮細胞之角蛋白陽性中 間纖維’且其異常表現通常與内皮細胞相關之基因（包括 VE-鈣黏附蛋白)。此外’在侵襲性黑素瘤細胞中，黑素細 胞特異性標記（諸如酪胺酸酶）的表現顯著降低，且有時2 表現。酪胺酸酶催化酪胺酸至黑色素之轉化，且與其弱侵 襲性對應物相比，侵襲性黑素瘤減少35倍以上。侵襲性腫 瘤細胞亦具有表現多個幹細胞標記之能力，此表明其為多 能、反分化表型。此等侵襲性腫瘤細胞亦具有高度 性。 在本發明之一實施例中，來自hESC之微環境之因子為 Lefty。如本文所述，Lefty(包括源自hES(：之^⑺為 之抑制劑。如本文所用之術語"Lefty A/B"及"Lefty"可互換 且係指Lefty A或Lefty B，或呈組合形式之Lefty八與]^7 B。在一實施例中，自微環境分離之Lefty可為大體上純 的。在另一實施例中，Lefty可與其他hES(：因子組合存 在。 在另一實施例中，本發明提供藉由用人類胚胎幹細胞調 即基質所產生之經分離Lefty蛋白質。如本文所用之”調節 基貝係指製備如本文所定義之預調節微環境。在某些實 施例中，基質係用hESC調節0至10天或在其間的任何範 圍，包括（但不限於）5至10天、2至8天、3至6天、3至5天、 3至4天，或1、2、3、4或5天。可由熟習此項技術者已知 之任何方法（包括經由使用抗Lefty抗體）使Lefty自基質分 123180.doc -11 - 200815598 在一實施例中，本發明提供包含糖基化Lefty之蛋白 質。在此實施例中，可使Lefty糖基化至不同程度，且其可 包含一或多個N_連接及/或0-連接之糖基化位點，或其組 合。在一實施例中，糖基化Lefty之特徵在於大於0%、 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%之可能N-及/或0-糖基化位點經糖基化。在另一實施例 中，糖基化Lefty之特徵在於小於100%、95%、90%、 85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、 40%、35%、30%、25%、20%、15%、10% 或 5%之可能 N-及/或0-糖基化位點經糖基化。在另一實施例中，糖基化 Lefty之特徵在於經糖基化之可能N_及/或0-糠基化位點之 百分數係基於”大於”及”小於”上述百分數之組合。因此， 在一非限制性實例中，糠基化Lefty之特徵在於大於30%且 小於70%之可能N-及/或0-糠基化位點經糖基化。在另一實 施例中，100%之可能N-及/或0-糖基化位點經糖基化。 在一實施例中，使糖基化Lefty糠基化至與源自hESC之 Lefty大體上相同之程度。 可由包括重組方法之任何方法來製備糖基化Lefty(參 見，例如 Sambrook 等人，2QQ1，Molecular Cloning: A ⑺ry Mam/a/，第 3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。在一實施例中，在中國 倉鼠卵巢（CH0)細胞中以重組方式製備糖基化Lefty。或 者，可由化學合成方法（諸如固相肽合成）使用此項技術中 123180.doc •12· 200815598 已知之技術（諸如由Merrifield等人，1963，J. Am. Chem.

Soc· 85:2149 ; Houghten等人，1985，Proc Natl Acad· Sci· USA 82:5132 ;及 Stewart 及 Y〇ung，Solid Phase Peptide

Synthesis (Pierce Chemical Co· 1984)所陳述之彼等技術）或 由合成及重組技術之組合來製備糖基化Lefty。亦可藉由自 hESC分離（包括自hESC之微環境分離）來製備糖基化 Lefty 〇

本發明之範疇内包括Lefty或糖基化Lefty之片段或衍生 物。如本文所用之”片段”意謂具有全長蛋白質活性（包括 (但不限於）抑制Nodal之能力）之全長Lefty序列之任何部 分。’’片段”之範疇内包括天然產生之酶裂解產物。術語 M衍生物”之範疇内包括全長Lefty以及其片段之衍生物。如 本文所用之’’衍生物”包括具有一或多個已經添加、缺失、 插入或取代之胺基酸殘基之Lefty變體，其中所得多肽具有 Lefty之活性，包括（但不限於）抑制N〇dal之能力。如本文 所用之”衍生物”亦包括Lefty及其變體之化學衍生物。熟習 此項技術者應瞭解，此等變體可以任何組合形式出現。 可由熟習此項技術者鑒於本文所述之揭示内容來製備經 化學修飾之糖基化Lefty衍生物。以與多肽天然連接之分子 之類型或位置不同之方式來修飾糖基化Lefty衍生物。衍生 物可包括藉由缺失一或多個天然連接之化學基團而形成 丁之 分子’或其可藉由共價連接一或多種聚合物而加以修飾。 舉例而言，所選擇之聚合物通常具有水溶性以使其所連 之蛋白質在水性環境（諸如生理環境）中不沈〉殿。合適之聚 123180.doc -13- 200815598 合物之範.内包括聚合物之混合物。較佳地，對於最終產 物製劑之治療用途而言，聚合物應為醫藥學上可接受的。 聚合物各自可具有任何分子量且可為分枝或未分枝的。 聚合物各自通常具有約2 kDa至約1〇〇 kDa之間的平均分子 量（術語"約"指示在水溶性聚合物之製劑中，一些分子之分 子量將大於規定分子量，一些分子之分子量將小於規定分 子置）。各聚合物之平均分子量較佳在約5 kDa與約5〇 kDa 之間，更佳在約12 kDa與約40 kDa之間，且最佳在約2〇 kDa與約35 kDa之間。 a適之水/容性聚合物或其混合物包括（但不限於）：N_連 接或0-連接之碳水化合物、糖、磷酸鹽、聚乙二醇 (PEG)(包括已用於使蛋白質衍生之pEG形式，包括單π〗· 虎氧基-聚乙二醇或單芳氧基·聚乙二醇）、單甲氧基_聚 =二醇、葡聚糖（諸如低分子量葡聚糖，例如約6 kD之葡 來糖）、纖維素，或其他基於碳水化合物之聚合物、聚（N- 二烯基，咯啶，)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙浠/ f乙烯共ΛΚ物、聚氧乙烯化多元醇（例如丙三醇）及聚乙 、·本發明亦涵盍可用於製備共價連接之糖基化多 肽多聚體之雙官能交聯分子。 叙而5 ’可在用於使蛋白質與經活化之聚合物分子反 ^ I適條件下進行化學衍生作用。最佳反應條件將基於 茶數及所要結果來確定。舉例而言，聚合物分子與蛋 比率愈大，所連接之聚合物分子之百分數愈大。在 貝&例中，Μ基化Lefty衍生物在胺基末端可具有單一聚 123l80.doc -14- 200815598 合物分子部分。參見，例如美國專利第5,234,784號。 可使用此項技術中已知之任何聚乙二醇化反應來特定進 行多肽的聚乙二醇化。該等反應描述於（例如）以下文獻 中.Francis等人 ’ 1992，Focus on Growth Factors 3:4-10 ; 歐洲專利第OI543 l6號及第0401384號；及美國專利第 4，179,337 號。

在另一實施例中，可使糖基化Lefty多肽與生物素化學 偶合。接著使生物素/糖基化Lefty多肽分子與抗生蛋白結 合，產生四價抗生蛋白/生物素/糖基化Lefty多肽分子。亦 可使糖基化Lefty多肽與二硝基紛（dnp)或三硝基紛（TNP) 共價偶合且所得結合物與抗DNP或抗TNp_IgM 一起沈澱以 形成10價十聚結合物。 一般而言，可藉由投與本發明糖基化Lefty衍生物而緩 解或調節之病狀包括本文對於糖基化Lefty所述之彼等病 狀。然而，與未衍生之分子相比，本文所揭示之糖基化 Lefty何生物可具有其他活性，增強或降低之生物活性；或 其他特徵，諸如增加或減短之半衰期。 在又一實施例中，本發明提供包含糖基化Lefty之組合 物°可如熟習此項技術者所知或如本文所述來調配組合 物。在另—實施财，本發明提供抑制哺乳動物中之腫瘤 細胞生長之方法’其包含向該哺乳動物投與包含生理學上 :接^劑量之糖基化Lef_組合物。可以有效量或治療 =里投與該組合物。如本文所用之"有效量，，及"治療有 效ΐ可互換使用。 123180.doc -15- 200815598 哺乳動物意謂人類；伴侣動物，諸如貓及狗；靈長類動 物，諸如猴及黑猩猩；及家畜，諸如馬、乳牛、豬及綿 羊；或需要或將得益於施與本發明之方法或化合物或組合 物中之任一者的任何患者。如本文所用之術語”患者"包括 人類及動物受檢者。 在一實施例中，本發明包含抑制哺乳動物中之腫瘤細胞 生長之方法，其包含向該哺乳動物投與包含以下劑量之糖 基化Lefty之組合物：介於0.01 ng/mL與500 ng/mL之間、 介於 0.01 ng/mL與 200 ng/mL之間、介於 0.1 ng/mL與 200 ng/mL之間、介於0· 1 ng/mL與100 ng/mL之間、介於1 ng/mL 與 100 ng/mL 之間、介於 10 ng/mL 與 100 ng/mL 之 間、介於1 0 ng/mL與75 ng/mL之間、介於20 ng/mL與75 ng/mL之間、介於20 ng/mL與50 ng/mL之間、介於25 ng/mL與50 ng/mL或介於30 ng/mL與40 ng/mL之間。在另 一實施例中，本發明包含抑制哺乳動物中之腫瘤細胞生長 之方法，其包含向該哺乳動物投與包含以下劑量之糖基化 Lefty 之組合物：約 1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL、30 ng/mL、3 5 ng/mL、40 ng/mL、45 ng/mL、50 ng/mL、75 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL或 500 ng/mL。如該情形中所用之”約”意謂在所述濃度之0 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL 或 3 ng/mL 内。 在某些實施例中，本發明提供使用一或多種來自人類胚 胎幹細胞之微環境之因子以抑制腫瘤細胞侵襲之方法。在 一實施例中，該（等）因子為Nodal之抑制劑，其包括（但不 123180.doc -16- 200815598 限於)Lefty及糖基化Lefty。 在此等方法之一實施例中，抑制腫瘤細胞侵襲之因子藉 由增加細胞凋亡來抑制腫瘤細胞侵襲。如本文所用之"細 胞周亡係扣在胚胎發育期間及在維持組織内穩定期間通 常出現之漸進式細胞死亡之生理過程。在又一實施例中， 抑制腫瘤細胞侵襲之因子藉由減少細胞增殖來抑制腫瘤細 胞侵襲。與生長（其為個別細胞質量增加）相反，細胞增殖 _ 係疋義為因細胞週期完成而引起之細胞數目的增加。在又 一實施例中，抑制腫瘤細胞侵襲之因子藉由增加細胞〉周亡 及藉由減少細胞增殖及/或藉由減小腫瘤細胞增殖與細胞 〉周亡比來抑制腫瘤細胞侵襲。 在另貝知例中’本發明提供抑制哺乳動物中之腫瘤細 胞生長之方法，其包含向體内存在至少一種腫瘤細胞之哺 乳動物杈與有效罝之已與人類胚胎幹細胞接觸之預調節微 環境。 _ 在本發明之其他實施例中，Nodal及/或Lefty係用作侵襲 性腫瘤細胞侵襲及預後性、診斷性及臨床性診斷包括（但 不限於）黑素瘤及乳癌之侵襲性癌瘤之生物標記。在某些 貝施例中，本發明提供用於偵測患者之侵襲性腫瘤（包括 (但不限於）黑素瘤或乳癌）之方法，其包含以下步驟：自患 者獲知樣本；對該樣本檢定]^〇(^1及1^行^的存在；及若樣 本中存在Nodal且不存在Lefty，則偵測侵襲性腫瘤。如該 个月形中所用之”樣本”包括（但不限於）如本文所定義之腫瘤 細胞、組織樣本及體液。在一非限制性實例中，樣本可為 123180.doc -17- 200815598 血清。 在某些實施例中，可藉由檢定No dal基因或基因產物來 偵測Nodal的存在。舉例而言，基於核酸之檢定或基於蛋 白質之檢定可用於偵測腫瘤樣本中Nodal的存在。可用於 偵测Nodal之例示性檢定包括本文所述之彼等檢定。可類 。似地偵測Lefty的存在。熟習此項技術者易於瞭解，可按照 如（例如）Sambrook 等人，2001，C/cm/ng.· d Laboratory Manual，第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ν·Υ·中所述之習知方法來設計其他 檢定。 在另一實施例中，可由以下步驟鑑別用於治療侵襲性腫 瘤之化合物：提供複數個表現Nodal之細胞，在存在及不 存在候選化合物的情況下對該等細胞檢定Nodal活性；及 若Nodal活性在存在化合物的情況下比在不存在候選化合 物的情況下小，則將該化合物鏗別為適合於治療侵襲性腫 ^ 瘤之化合物。如該情形中所用之’’Nodal活性”係指Nodal表 現及/或本文所述活性中之任一者，包括維持腫瘤細胞成 形、致瘤性及侵襲性。 — 在本發明之另一方法中，可監測作為用於治療患者之侵 : 襲性腫瘤之藥劑的醫藥組合物之有效性。該方法包含：自 患者獲得第一樣本；對該第一樣本檢定Nodal的存在；將 一定量醫藥組合物投予該患者；對自患者隨後收集之生物 樣本檢定Nodal的存在；及將第一樣本中所偵測之Nodal量 與隨後樣本中所偵測之Nodal量比較，其中該醫藥組合物 123180.doc •18· 200815598 之有效性係藉由偵測與第一樣本相比在隨後收集之樣本中 Nodal量的變化來監測。如該情形中所用之"樣本”或n生物 樣本”包括（但不限於）如本文所定義之腫瘤細胞、組織樣本 及體液。在一非限制性實例中，樣本可為血清。 在本發明之另一方法中，可由以下步驟偵測哺乳動物中 侵襲性腫瘤細胞的存在：自患者獲得腫瘤細胞之樣本；進 行該等腫瘤細胞中Nodal CpG島之基於序列之甲基化分 馨析’將腫瘤細胞中Nodal CpG島之曱基化程度與非侵襲性 腫瘤細胞或非腫瘤細胞中Nodal CpG島之甲基化程度比 較；及使Nodal之過甲基化與侵襲性腫瘤細胞的存在相關 聯。基於序列之曱基化分析可係基於CpO島整體或基於其 子部分。在本發明之又一方法中，可由以下步驟偵測哺乳 動物中具有反分化、多能成形表型之細胞的存在：自哺乳 動物獲得樣本，對該樣本檢SN〇dal的存在；及使的 存在與具有反分化、多能成形表型之細胞的存在相關聯。 _ 樣本可為體液。體液包括（但不限於）：全血、血漿、血 清、尿、精液、唾液、淋巴液、腦膜液、羊水、腺液、痰 及驷脊髓液。體液亦包括含有均質固體物質（諸如組織及 活、、且織;^查樣本）之所有前述各物及溶液或混合物之經實 驗刀離部分。此等方法可用作侵襲性癌症或對侵襲性癌症 /、有敏感度之預後性或診斷性檢定，該侵襲性癌症包括 (但不限於）黑素瘤及乳癌。 在其他μ &例中，本發明提供抑制哺乳動物中腫瘤細胞 長之方法，其包含向體内存在至少一種腫瘤細胞之哺乳 123180.doc -19- 200815598 動物投與有效量之Nodal活性抑制劑。 本發明亦提供治療哺乳動物之侵襲性腫瘤之方法，其包 含向體内存在至少一種腫瘤細胞之哺乳動物投與有效量之 Nodal活性抑制劑。如本文所用之短語”治療侵襲性腫瘤" 係指包含將Nodal抑制劑投予需要其之哺乳動物之方法， 其中該Nodal抑制劑預防哺乳動物中之侵襲性腫瘤細胞生 長，及/或預防該哺乳動物中之侵襲性腫瘤細胞轉移。 在一實施例中，本發明提供抑制腫瘤細胞生長及/或治 療侵襲性腫瘤之方法，其包含使該腫瘤細胞與包含人類胚 胎幹細胞之微環境或已由人類胚胎幹細胞預調節之微環境 ("CMTX”）接觸。在某些實施例中，基底膜基質可為 Matrigel™。在Matrigel基底膜基質組之間存在可變性，其 可影響預調節培養基的製備。更特定言之，偶然的 Matrigel組將不產生本發明之具有腫瘤抑制特性之預調節 微環境。在該等情況下，可使用一替代組。熟習此項技術 者將瞭解，可使用其他基質。 如本文所用之’’抑制劑”可為任何可降低Nodal活性或干 擾Nodal基因表現之化學化合物、核酸分子、内源性蛋白 質（諸如Lefty A/B)、肽或多肽（諸如抗Nodal抗體）。術語 ”抑制劑’’之範疇内包括兩種或兩種以上該等抑制劑之任何 組合同時或分別以任何次序投與。Nodal抑制劑可直接或 間接抑制Nodal蛋白質之活性。直接抑制可以例如藉由與 No dal蛋白質結合且進而防止該N〇 dal蛋白質結合所欲之標 靶（諸如受體）來完成。間接抑制可以例如藉由與Nodal蛋白 123180.doc -20- 200815598 質之所欲標靶（諸如受體或結合搭配物）結合，進而阻斷或 降低Nodal蛋白質之活性來完成。此外，Nodal抑制劑可藉 由減少或抑制Nodal基因表現，尤其藉由干擾Nodal基因表 現（轉錄、力^工、轉譯、轉譯後修飾）’例如藉由干擾Nodal mRNA及阻斷Nodal基因產物的轉譯或藉由轉譯後修飾 Nodal基因產物，或藉由使細胞内定位改變來抑制Nodal基 因。

Nodal抑制劑亦可為一種内源性產生之蛋白質，其包括 (但不限於）源自人類胚胎幹細胞之微環境之Lefty A/B。舉 例而言，Lefty A/B係在人類胚胎幹細胞中產生且分泌至該 等細胞周圍之微環境中。Lefty A/B可自該微環境分離。或 者，Lefty A/B可直接自人類胚胎幹細胞分離（亦即，在其 分泌至微環境中之前）。在另一實施例中，本發明之範疇 内之Nodal抑制劑為重組Lefty A/B(rLefty)，其可由此項技 術中已知之任何習知方法製備。Lefty A/B可經糖基化或未 經糠基化。在某些實施例中，本發明之Nodal抑制劑為由 hESCs產生之糖基化Lefty A/B。在其他實施例中，糖基化 Lefty A/B可藉由使用CHO(中國倉鼠卵巢）細胞來製備。在 一些情況下，糖基化Lefty A/B比其非糖基化或重組對應物 可為更有效之No dal抑制劑，因此在治療應用中可以較低 劑量投與。 在其他實施例中，Nodal抑制劑為干擾Nodal信號轉導之 分子，諸如活化素樣激酶（ALK)抑制劑。舉例而言，Nodal 藉由與I型（ALK 4/5/7)與II型（ActRIIB)活化素樣激酶受體 123180.doc -21- 200815598

之間的異二聚複合物結合來傳播其信號。複合物的裝配促 使ALK 4/5/7經ActRIIB磷酸化及活化，其後繼之以ALK 4/5/7介導之 Smad-2/3磷酸化。ALK 4、ALK 5及/或 ALK7 之抑制劑包括於本發明之範疇内；如本文所述，alk 4/5/7抑制劑可終止Nodal表現。在一實施例中，ALK抑制 劑為 SB43 1 542(Sigma，St· Louis，MO) 〇 在一實施例中，抑制劑可為（例如）小分子抑制劑、抗 體、核酸（諸如反義募核苷酸)、短干分子， 或短髮夾狀RNA(shRNA)分子。另外，可使用本文所述之 方法或使用此項技術中已知之方法特定設計該等抑制劑。 在某些實施例中，反義寡核苷酸與Nodal基因之至少一 部分互補’只要該反義募核苷酸的雜交抑制N〇dal活性。 如本文所用之術語”募核苷酸”包括由天然產生及/或非天然 產生之养核苷酸鍵連接在一起之天然產生且經.修飾之核苷 酸。募核苷酸為一般包含不多於2〇〇個核苷酸之聚核苷酸 支組。在某些實施例中’寡核苷酸之長度為丨〇至6〇個核普 酸。在某些實施例中，募核苷酸之長度為12、13、14、 15 、 16 、 17 、 18 、 19 、 20 、 21 、 22 、 23 、 24 、 25或30至40 们驗基。券核苦酸為單股的（例如）在使用定位突變技術構 築基因突變體中使用。 本發明之募核苷酸亦可包含可更適合作為治療或實驗試 劑之核芽酸類似物。寡核苷酸類似物之一實例為肽核酸 (PNA)，其中DNA(4RNA)中之脫氧核糖（或核糖）鱗酸鹽骨 架經與肽中所發現之聚醯胺骨架類似的聚醯胺骨架置換（p. 123180.doc -22- 200815598 E. Nielsen等人，Science，1991，254，1497)。已展示 PNA 類 似物對酶降解具有抗性且活體内及活體外壽命延長。pna 亦與互補DNA序列更強結合，此係歸因於PNA股與DNA股 之間缺乏電荷排斥。其他寡核苷酸可含有具有聚合物骨 架、環狀骨架或非環狀骨架之核苷酸。舉例而言，核苦酸 可具有嗎啉基骨架結構（美國專利第5,034,506號）。寡核普 酸亦可含有諸如報導體基團之基團，用於改良募核苷酸之 藥物動力學特性之基團或用於改良寡核苷酸之藥效學特性 之基團。募核苷酸亦可具有糖模擬物。 可使用化學合成及酶連接反應使用此項技術中已知之程 序來構柴反義核酸分子。可使用經設計以增加分子之生物 穩定性或增加與mRNA或原生基因形成之雙鏈體之物理穩 定性的天然產生之核苷酸或經不同修飾之核苷酸（例如硫 代磷酸酯衍生物及經吖啶取代之核苷酸）來化學合成本發 明之反義核酸分子或其片段。可使用以重組質體、噬粒或 減弱病毒形式引入細胞中之表現載體來以生物方法產生反 義序列’其中反義序列係在高效率調節區域之控制下產 生，其活性可由該載體所引入之細胞類型來確定。 在一實施例中’本發明之Nodal抑制劑為抗Nodal嗎啉 基。 在一實施例中，由本發明提供之某些抑制劑為短干擾 RNA(siRNA)種類。如本文所用之術語”短干擾rna”或 "siRNA”係指能夠進行RNA干擾或”RNAi”之雙股核酸分 子’如（例如）揭示於 Bass，2001，Nature 411: 428-429 ; 123180.doc -23 - 200815598

Elbashir 等人，2001，Nature 411: 494-498 ;及 Kreutzer 等 人，國際PCT公開案第 WO 00/44895 號；Zernicka-Goetz 等 人，國際PCT公開案第WO 01/36646號；Fire，國際PCT公 開案第WO 99/32619號；Plaetinck等人，國際PCT公開案 第冒0 00/01846號；以611〇及卩1代，國際？(：1[公開案第界0 01/29058 號；Deschamps-Depaillette，國際 PCT 公開案第 WO 99/07409號；及Li等人，國際PCT公開案第WO 00/44914號中。如本文所用之siRNA分子無需限於僅含有 RNA之彼等分子，而進一步涵蓋具有RNAi能力或活性之 經化學修飾之核苷酸及非核苷酸。可使用熟習此項技術者 已知之方法或市售技術（諸如由Dharmacon Research， Lafayette，CO提供之技術）來設計抑制Nodal活性之特異性 siRNA分子。 在另一實施例中，本發明之Nodal抑制劑包括抑制Notch 之任何化學化合物、核酸、蛋白質、肽、多肽、抗體或其 他分子。在某些實施例中，Nodal抑制劑為Notch4抑制 劑。在某些實施例中，Nodal抑制劑為Notch siRNA。在某 些實施例中，Nodal抑制劑為Notch4 siRNA。 在某些實施例中，本發明提供選擇性結合Nodal之抗體 或其具有免疫學功能之片段，及用於選擇性抑制或干擾 Nodal蛋白質之活性之方法。用於製備單株抗體及多株抗 體及其具有免疫學活性之片段的標準方法在此項技術中為 熟知的，例如，如描述於Harlow及Lane(1988，ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory 123180.doc -24- 200815598

Press: New York)中。用於產生保持抗原決定基結合能力及 特異性之抗體片段、尤其Fab片段及其他片段之方法亦為 沾知的，完全人類抗體及嵌合抗體，包括"人源化"抗體亦 為如此。”人源化”抗體包括（例如）在小鼠中產生，藉由用 人類抗體之部分置換小鼠抗體之某些部分而”人源化”以減 少可在投予人類受檢者期間出現之負面免疫作用的抗體。 因此’本發明涵蓋使用Nodal之抗體抑制劑，該等抗體抑 _ 制*彳包括（但不限於）：單鏈抗體、單鏈Fv抗體、F(ab)抗 體、F(ab)’抗體及（Fab，）2抗體、一或多個區域已經同源人 類或非人類部分置換之嵌合抗體，及完全人類抗體。單鏈 抗體詳細論述於國際專利申請公開案第w〇 88/〇1649號及 美國專利第4,946,778號及第5,260,203號中。可（例如）經由 穿膜肽（penetratin)標記（HIV或觸角足（antennaepedia))或由 重組方式（例如由引入細胞病毒載體中之聚核苷酸編碼）來 傳遞該等抑制劑。 _ 在較佳實施例中，本發明之方法包含以下步驟：投與包 含有效量之一種或複數種Nodal抑制劑連同醫藥學上可接 文之稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑 之醫藥組合物，其中該醫藥組合物在適當投予患者時能誘 導所要治療作用。較佳地，可接受之調配物質在所使用之 劑量及濃度下對接受者無毒。 應瞭解’關於包含一種或複數種Nodal抑制劑之醫藥組 合物之表述”有效量"根據本發明意謂能防止或減少侵襲性 黑素瘤細胞生長之該醫藥組合物的量。舉例而言，當患有 123180.doc -25- 200815598 侵襲性黑素瘤之患者在用醫藥組合物治療後與該治療前相 比黑素瘤細胞數目減少及/或黑素瘤細胞轉移減少時，該 醫藥組合物具有治療有效性。當防止患有黑素瘤、具有黑 素瘤病史（例如，患者處於症狀緩解中）或被視為可能呈現 黑素瘤(例如’具有促成黑素瘤發作之遺傳傾向)之患者中 發生黑素瘤細胞轉移時，投予患者之醫藥組合物亦具有治 療有效性。 在某些實施例中，適用於本發明之方法之醫藥組合物可 含有用於調節、維持或保留該組合物之（例如）pH值、容積 滲透濃度、黏度、澄清度、顏色、等張性、氣味、無菌 性、穩定性、溶解或釋放速率、吸附性或渗透性之調配物 質。在該等實施例中，合適之調配物質包括（但不限於）： 胺基酸(諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或 離胺酸）；抗菌劑；抗氧化劑（諸如抗壞血酸、亞硫酸納或 亞硫酸氫鈉）；緩衝劑（諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris_ 則、棒檬酸鹽、鱗酸鹽或其他有機酸广膨化劑（諸如甘 露糖醇或甘胺酸）；螯合劑（諸如乙二胺四乙酸（贿 錯合劑(諸如咖啡驗、聚乙烯料唆輞、β_環糊精或經丙 基-β-:糊精)’·填充劑；單聽；雙酷；及其他碳水化合物 (諸如葡萄糖、甘露糖或糊精）；蛋白質（諸如血清白蛋白、 明膠或免疫球蛋白）；著色劑、調味劑及稀釋劑；乳化 劑’親水性聚合物（諸如聚乙婦吼嘻咬⑷；低分子量多 狀；成鹽平衡離子（諸如納）；防腐劑（諸如氯化苯甲㈣、 苯甲酸、水揚酸、硫柳采、苯乙基醇、對經基苯甲酸甲 123180.doc -26- 200815598 醋、對經基苯甲酸丙酉旨、洗必太（chlorhexidine)、山梨酸 或過氧化氫）；溶劑（諸如丙三醇、丙二醇或聚乙二醇）、；糖 醇（諸如甘露糖醇或山梨糖醇）；懸浮劑；界面活性劑或濕 潤劑（諸如pluronic、PEG、脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯 (諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、三硝基曱苯 (triton)、緩血酸胺、卵填脂、膽固醇、泰洛沙泊 (tyloxapal));穩定性增強劑（諸如蔗糖或山梨糖醇）；張力 增強劑（諸如鹼金屬鹵化物，較佳為氣化鈉或氯化鉀；甘 露糖醇；山梨糖醇）；傳遞媒劑；稀釋劑；賦形劑及/或醫 藥佐劑。參見 REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES， 第 18 版，（A.R. Germaro，編），1990，Mack Publishing Company 〇 在某些實施例中，最佳醫藥組合物將由熟習此項技術者 視（例如）所欲之投藥途徑、傳遞形式及所要劑量而確定。 參見，例如 REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES， 龙上文。在某些實施例中，該等組合物可影響Nodal抑制 劑之物理狀態、穩定性、活體内釋放速率及活體内清除速 率。 在某些實施例中，醫藥組合物中之主要媒劑或載劑在性 質上可為水性或非水性的。舉例而言，合適之媒劑或載劑 可為注射用水、生理食鹽水溶液或人造腦脊髓液，其可能 補充有用於非經腸投藥之組合物中常用之其他物質。中性 緩衝生理食鹽水或與血清白蛋白混合之生理食鹽水為其他 例示性媒劑。在較佳實施例中，本發明之醫藥組合物包含 123180.doc -27- 200815598

約pH 7.0-8.5之Tris緩衝液或約pH 4.0-5.5之乙酸鹽缓衝 液’且可進一步包括山梨糖醇、蔗糖、Tween_2〇&/或其 合適之替代物。在本發明之某些實施例中，可藉由將具有 所要純度之選定組合物與可選調配劑（REMINGTON*S PHARMACEUTICAL SCIENCES，名 J：jt)以；東乾餅塊或水 溶液形式混合來製備Nodal抑制劑組合物以便儲存。另

外，在某些實施例中，可使用諸如蔗糖之適當賦形劑將 Nodal抑制劑產物調配成凍乾物。 可選擇本發明之醫藥組合物用於非經勝傳遞。或者，可 選擇組合物用於吸入或用於經由呼吸道傳遞，諸如經口傳 遞。該等醫藥學上可接受之組合物的製備在熟習此項技術 者之技能範圍内。 調配物組份較佳以可為投藥部位所接受之濃度存在。在 某些實施例中，緩衝劑用於使組合物維持在生理pH值下或 略低PH值下，通常在約5至約8之pH值範圍内。 當涵盍非經腸投藥時，可以包含在醫藥學上可接受之媒 劑中之所要Nodal抑制劑之無熱原質、非經腸可接受之水 溶液形式提供用於本發明之治療組合物。用於非經腸注射 之尤其合適之媒劑為Nodal抑制劑於其中調配成經適當防 腐之無菌、等張溶液之無菌蒸镏水。在某些實施例中，製 備可包括將所要分子與試劑靠，該試劑諸如可注射微球 體、 醇酸 產物 生物可侵蝕性粒子、聚合化合物（諸如聚 卜珠粒或脂質體，其可提供可經由積存注射傳=之 之控制释放或持續釋放。在某些實施例中，玻祕酸 123180.doc -28- 200815598 亦可用於促進在循環中之持續時間。在某些實施例中，可 植入藥物傳遞裝置可用於引入所要Nodal抑制劑。 可調配本發明之醫藥組合物用於吸入。在此等實施例 中’將Nodal抑制劑有利地調配成乾燥、可吸入散劑。在 較佳實施例中，亦可將Nodal抑制劑吸入溶液與氣霧劑傳 遞用推進劑一起調配。在某些實施例中，可使溶液成喷霧 狀。由此，肺部投藥及調配方法進一步描述於國際專利申 φ 請案第PCT/US94_875號中，該申請案以引用的方式併 入且描述經化學修飾之蛋白質的肺部傳遞。 亦預期可經口投與調配物。可在有或無通常用於混配固 體劑型（諸如錠劑及膠囊）之載劑的情況下調配以此方式投 與之Nodal抑制劑。在某些實施例中，可設計膠囊以在胃 腸道中§生物可用性最大且體循環前降解最小時釋放調配 物之活性部分。可包括其他試劑以促進抑制劑吸 收亦可使用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑 馨 劑、懸浮劑、錠劑崩解劑及黏合劑。 較佳提供本發明L合物以包含有效量之-種或複 數種與適合於製造錠劑之無毒賦形劑混合之Nodal抑制 劑。藉由將錠劑溶解於無菌水或其他適當媒劑中，可以單 位劑型製備溶液。合適之賦形劑包括(但不限於)：惰性稀 釋劑，諸如碳酸約、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或填酸弼，· 或站口剡’諸如澱粉、明膠或阿拉伯膠；或潤滑劑，諸如 硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。 “、、白此項技術者應想到其他醫藥組合物，包括將ΝΜΜ 123180.doc -29- 200815598 抑制劑包括於持續或控制傳遞調配物中之調配物。用於調 配諸如月曰貝體載劑、生物可侵蝕性微粒或多孔珠粒及積存 注射劑之多種其他持續或控制傳遞劑之技術亦為熟習此項 技術者所知。參見，例如國際專利申請案第 PCT/US93/00829號，其以引用的方式併入且描述用於傳遞 面梁、、且&物之夕孔聚合微粒的控制釋放。持續釋放製劑可 包括呈成开》物品（例如薄膜或微囊）形式之半透性聚合物基 質。持績釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚乳酸交酯（如 揭示於美國專利第35773,919號及歐洲專利申請公開案第Ερ 058481號中，該等專利各以引用的方式併入）、L_麩胺酸 及γ-乙基-L_麩胺酸酯之共聚物（Sidrnan等人，1983, penmen 22:547_556)、聚（2·經乙基-曱基丙烯酸 酉日）（Langer荨人 ’ 1981，J. 15:167-277 及 Langer, 1982，C/zem· rec/z. 12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯 (Langer等人，龙i文）或聚羥基丁酸（歐洲專利申 請公開案第EP 133,988號）。持續釋放組合物亦可包括可由 此項技術中已知之若干方法中之任一者製備之脂質體。參 見’例如Eppstein等人，1985，iVoc. #如/· /cW. 5W. [/以 82:3 68 8-3 692 ;歐洲專利申請公開案第ΕΡ 〇36,676號；第 EP 088,046號及第EP 143,949號，該等文獻以引用的方式 併入。 用於活體内投藥之醫藥組合物通常以無菌製劑形式提 供。可藉由經由無菌濾膜過濾來完成滅菌。當將組合物凍 乾時’可在束乾及復水之前或之後進行使用此方法之滅 123180.doc -30- 200815598 :物可以1 東乾形式或以溶液形式健存用於非經腸投率之έ “匆二般將非經腸組合物置放於具有無菌接取 中，δ亥谷器例如靜脈内溶液袋或具有可 、 合器 之塞子的瓶子。 下〉主射針刺穿 -旦已調配醫藥組合物’即可以溶液 體形式或以脫水或康乾粉末形式將其儲存 :二=式或，前復一式〜:: 可使用製藥技術中所熟知之方法來將適用於 法之Nodal抑制劑與其他分子、分子結構或化合物之2 物(例如脂質體’受體靶向分子，經口、經、：。 /、他凋配物)此雜、囊封、結合或以其他方式締合：二 於在患者體内攝取、分布及/或吸收。 乂助 有習知無毒醫藥學上可接受之載劑、佐劑及媒劑 之h早位調配物形式經口、局部、非經腸、經吸入 務或經直腸投與Nodal抑制劑。如本文所用之術語非經腸 包括經皮、皮下、血管内(例如靜脈内)、肌肉内或鞘内注 射或輸注技術及類似技術。 意欲用於π服之組合物可根據製造醫藥組合物之技術中 任何已知方法來製備，且該等組合物可含有一或多種選自 由甜味劑、調味劑、著色劑及防腐劑组成之群的試劑以提 供醫藥學上美觀且可口之製劑。錠劑含有與適合於製造錠 劑之無毒醫樂學上可接受之賦形劑混雜之活性成份。此等 賦形劑可為(例如)惰性稀釋劑，諸如碳酸約、碳酸納、乳 123180.doc 31 200815598 糖、磷酸鈣或磷酸鈉；成粒劑及崩解劑，例如玉米澱粉或 褐藻酸；黏合劑，例如澱粉、明膠或阿拉伯膠；及潤滑 劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。錠劑可未經包衣或可 由已知技術進行包衣。在一些狀況下，可由已知技術製備 該等衣料以延遲在胃腸道中崩解及吸收且進而提供經更長 。 日守段之持繽作用。舉例而言，可使用諸如單硬脂酸甘油酯 或二硬脂酸甘油酯之延時物質。 _ 用於口服之調配物亦可以硬明膠膠囊的形式存在，其中 活性成份係與例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土（ka〇lin)之惰 性固體稀釋劑混合；或以軟明膠膠囊的形式存在，其中活 性成份係與水或例如花生油、液體石蠟或撖欖油之油介質 混合。 用於口服之調配物亦可以口含劑形式存在。 水性懸浮液含有與適合於製造水性懸浮液之賦形劑混雜 之活性物質。該等賦形劑為懸浮劑，例如羧曱基纖維素 • 鈉、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯啶酮、黃 耆膠及阿拉伯膠·，分散劑或濕潤劑可為天然產生之磷脂 ♦ (例如卵磷脂），或氧化烯與脂肪酸之縮合產物（例如聚氧乙 稀硬知酸自曰），或氧化乙烯與長鏈脂族醇之縮合產物（例如 • 十七伸乙基氧基十六醇），或氧化乙烯與衍生自脂肪酸及 己醣醇之偏酯的縮合產物（諸如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸 酯），或氧化乙烯與衍生自脂肪酸及己醣醇酐之偏酯的縮 合產物（例如聚乙烯山梨糖醇酐單油酸酯）。水性懸浮液亦 可含有一或多種防腐劑，例如對羥基苯甲酸乙酯或對羥基 123180.doc -32 - 200815598 苯甲酸正丙醋；一或多種著色劑；-或多種調味劑；及-或多種甜味劑，諸如蔗糖或糖精。 可精由使活性成份懸浮於例如花生油、橄欖油、芝麻油 或椰子油之植物油中或諸如液體石壤之礦物油中來調配油 性懸浮液。該等油性懸浮液可含有增稠劑，例如蜂樣、固 體石壤或十六醇。可添加甜味劑及調味劑以提供可口口服 製劑。可藉由添加諸如抗壞錢之抗氧化劑來保藏該等組 合物。 k合於糟由添加水來製備水性懸浮液之可分散散劑及顆 粒提供與分散劑或濕潤劑、懸浮劑及一或多種防腐劑混雜 之活性成份。合適之分散劑或濕潤劑或懸浮劑由上文已提 及之彼等物質例示。例如甜味劑、調味劑及著色劑之其他 賦形劑亦可存在。 本發明之醫藥組合物亦可呈水包油乳液形式。油相可為 植物油或礦物油或其混合物。合適之乳化劑可為天然產生 • 之膠，例如阿拉伯膠或黃耆膠；天然產生之磷脂，例如大 豆、卵磷脂·，及衍生自脂肪酸及己醣醇酐之酯或偏酯，例 如山梨糖醇酐單油酸酯；及該等偏酯與氧化乙烯之縮合產 物，例如聚氧化乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。乳液亦可含有 甜味劑及調味劑。 可用甜味劑來調配糖漿及酏劑，該等甜味劑例如丙三 醇、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖。該等調配物亦可 含有缓和劑、防腐劑、調味劑及/或著色劑。醫藥組合物 可呈無菌可注射水性或油性懸浮液形式。可根據已知技術 123180.doc • 33 - 200815598 使用上文已提及之彼等合適之分散劑或濕潤劑及 調配此懸浮液。無菌可注射製劑亦可為於“非 ^之稀釋劑=溶劑中之㈣可注射溶液或懸浮液，例如於

，一 之喊。可使用之可接受媒劑及溶劑為水、 林格氏液（Ringer，s SGlutiGn)及等張氯化納溶液。另外，益 菌不揮發性油常規用作溶劑或懸浮介質。為達成此’、 的，可使用任何溫和不揮發性油，包括合成甘油單酿^ 油二酯。另外，諸如油酸之脂肪酸可用於製備可注射劑。 亦可以栓劑形式投與Nodal抑制劑，例如用於經直=投 與忒藥物。可藉由將藥物與合適之非刺激性職形劑混合來 製備此等組合物，該賦形劑在常溫下為固體但在直腸:度 下為液體且由此將在直腸中熔融以釋放該藥物。該等 包括可可脂及聚乙二醇。 、 可在無菌介質中非經腸投與N〇dal抑制劑。視所使用之 媒劑及濃度而定，可使藥物懸浮或溶解於該媒劑中。有利 地，可將諸如局部麻醉劑、防腐劑及緩衝劑之佐劑溶解於 媒劑中。 亦可較佳地以含有（例如）0.075%至30% w/w、較佳〇.2% 至20% w/w及最佳〇.4%至15% w/w之總量之活性成份的局 部凝膠、噴霧、軟膏或乳膏形式，或栓劑形式應用調配 物。當調配成軟膏時，可將活性成份與石蠟族或水可混溶 軟賞基一起使用。 或者，可將活性成份與水包油乳膏基一起調配成乳膏。 必要時，乳膏基之水相可包括（例如）至少30% w/w之多元 123180.doc -34- 200815598 ^ ^ 一‘、 -1，3,二醇、甘露糖醇、山梨糖醇、丙 二醇、聚乙二醇及其混合物。局部調配物可理想地包括增 強活丨生成伤經由皮膚或其他受侵染區域吸收或穿透之化合 物^等皮膚牙透增強劑之實例包括二甲亞石風及相關類似 物。 亦可由、、二皮衣置投與本發明之化合物。較佳局部投藥將 使用儲集②及多孔膜類型或固體基質變體中之任—者之貼 片來成。在任一狀況下，活性劑係連續自儲集器或微囊 經由膜傳遞至活性劑可渗透黏_中，_著劑與接受者 之皮膚或黏膜接觸。若活性劑係經由皮膚吸收，則將受控 及預定流量之活性劑投予接受者。在微囊的狀況下，囊封 劑亦可充當膜。經皮貼片可包括於合適之溶劑系統與黏著 系統中之化合物，諸如丙烯酸系乳液及聚酯貼片。 可以已知方式自已知成份構成本發明之乳液之油相。儘 管忒相可僅包含乳化劑，但其可包含至少一種乳化劑與脂 肪或油或與脂肪與油兩者之混合物。較佳地，包括親水性 乳化劑連同充當穩定劑之親脂性乳化劑。亦為較佳的，包 括油與脂肪。總之，伴以或不伴以穩定劑之乳化劑組成所 謂乳化堪’且該躐連同油及脂肪組成所謂乳化油膏基，該 乳化油貧基形成乳膏調配物之油性分散相。適合於在本發 明之調配物中使用之乳化劑及乳液穩定劑包括Tween 60、 Span 80、十六醇十八醇混合物、十四醇、單硬脂酸甘油 酯及月桂基硫酸鈉等。 用於調配物之合適之油及脂肪的選擇係基於達成所要外 123180.doc -35- 200815598 觀特性’此係由於活性化合物在可能在醫藥乳液調配物中 使用之多數油中的溶解度極低。因此，乳膏應較佳為具有 合適稠度之非油脂性、無污染且可洗滌之產品以避免自管 或其他容器漏出。可使用直鏈或支鏈一元或二元烷酯，諸 如二異己二酸酯、硬脂酸異十六烷酯、椰子脂肪酸之丙二 醇二_、十四烷酸異丙酯、油酸癸酯、棕櫚酸異丙酯、硬 脂酸丁醋、棕櫚酸2-乙基己酯，或支鏈酯之摻合物。視所

需特性而定，此等物質可單獨或組合使用。或者，可使用 鬲熔點脂質，諸如白色軟石蠟及/或液體石蠟或其他礦物 油0 對於治療用途而言，通常將本發明之N〇dal抑制 或多種適於指定投藥途徑之佐劑組合。若經口投藥，則可 將化合物與㈣、蔗糖、殿粉粉末、㈣之纖維素醋、纖 ' ⑺石、硬脂酸、硬脂酸鎂、氧化鎂、填酸及硫 酸之鈉鹽及鈣鹽、明膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉、聚乙烯吡 σ各疋ag及/或聚乙烯醇混雜，且接著製成錠劑或囊封以便 =。該等膠囊或旋劑可含有可以活性化合物於經丙基 非維素中之分散液形式提供的控制釋放調配物。用於 :::二藥：調配物可呈水性或非水性等張無 此等溶液及懸浮液可由具有所提及之用於 :、凋配物的载劑或稀釋劑中之 末或顆粒來製備。 芩扪"、、囷和 了將化合物溶解於水、聚乙二醇、丙二 %、乙醇、玉米 吁叼一 化鈉及/赤々 棉籽油、花生油、芝麻油、节醇、氯 、’ 或各種緩衝劑中。JL 4 ^ 、 他佐劑及投藥模式在製藥技 123180.doc * 36 - 200815598 術中充分且廣泛知曉。 约每公斤體重每天約01毫克至約刚毫克之劑量含量適 用於治療上文所指示之病狀（每位患者每天約0.5毫克至約 Μ公克）。可與載劑物質組合以產生單一劑型之活性成份 的里將視所/口療之主體及特定投藥模式而改變。劑量單位 形式-般將含有約i mg至約5〇〇叫之間的活性成份。日劑 量可：每天一至四次給藥來投與。在皮膚病的狀況下，較

佳可每天兩次至四次將本發明之化合物之局部製劑塗覆於 受侵染區域。 ^ 然而，應瞭解，對於任何特定患者之特㈣量含量將視 多種因素而定’該等因素包括所使用之特定化合物之活 性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、投藥時 間、投藥途徑及排泄速率、藥物組合及經受治療之特定疾 病之嚴重性。 對於投予非人類動物而言，亦可將組合物添加至動物飼 料或飲用水中。可適宜地調配動物飼料及飲用水組合物以 使動物連同其飲食一起獲取治療適當量之組合物。亦可適 且地使組合物以添加至飼料或飲用水中之預混物的形乂存 在。 給藥頻率將視調配物中所使用之特定N〇del抑制劑之藥 物動力學參數而定。通常，臨床醫師投與組合物直至達到 達成所要作用之劑量為止。由此，組合物可以單次劑量或 經一定時間以兩次或兩次以上劑量（其可能或可能不含有 相同量之所要分子），或以連續輸注經由植入裝置或導管 123180.doc -37 - 200815598 投與。適當劑量之進一步改進通常係由一般熟習此項技術 者作出且在由其通常所進行之工作範圍内。可經由使用適 當劑量反應資料來確定適當劑量。在某些實施例中，可在 整個延長之時段内將Nodal抑制劑投予患者。 可單獨或與其他治療劑組合、尤其與其他化學治療劑組 合來投與醫藥組合物及/或Nodal抑制劑。 另外，本發明提供用於監測作為治療患者之侵襲性黑素 瘤之藥劑的醫藥組合物之有效性的方法，其包含以下步 驟：（a)自患者獲得皮膚細胞之樣本；（b)對該等皮膚細胞 檢定Nodal的存在；（c)將一定量醫藥組合物投予該患者； (d)使用自患者獲得之隨後收集之生物樣本重複步驟（a); 及（e)將來自步驟（a)之皮膚細胞中所偵測之Nodal的量與來 自步驟（c)之皮膚細胞中所偵測之Nodal的量比較，其中該 醫藥組合物之有效性係藉由偵測與步驟（a)中所獲取之皮膚 細胞相比在隨後收集之皮膚細胞中Nodal量的變化來監 除非本文另有規定，否則本文所用之單數術語應包括複 數且複數術語應包括單數。 實例 提供以下實例（包括所進行之實驗及所達成之結果）僅為 達成說明之目的且並不視作限制本發明。 實例1 ·由人類胚胎幹細胞預調節之3-D基質促進侵襲性腫 瘤細胞之後生變化 如圖1所說明，在經調節之幹細胞培養基存在下，將H1 123180.doc -38- 200815598

或HSF-6人類胚胎幹細胞（hESC)，以於緊密群落中之5 χ ίο4個細胞接種於包含生長因子減少之Matrigel(BD

Biosciences)之3-D基質上歷時3至4天。隨後，用NH4〇H將 hESC自其3-D基質移除，接著用雙蒸餾pj2〇、pBS及完全 培養基徹底洗滌，留下裸露預調節3_D基質（CMTX Matdgel)。將人類無黑色素轉移性皮膚黑素瘤細胞 (C8161)以每個6孔盤2·5χ1〇5個細胞接種於此預調節基質上 _ 歷打3至4天。在培育時段結束時，對暴露於hESC預調節 基質微環境之黑素瘤細胞的形態、基因及蛋白質表現及行 為功能之潛在變化進行分析。細胞外基質的預調節對黑素 瘤細胞形態發揮顯著作用（圖2所示）。在對照未調節 Matngel基質上，C8161黑素瘤細胞（圖2A)生長至過度融合 單層中，而未分化H1(圖2B)及HSF-6(圖2C)人類胚胎幹細 胞（hESC)形成具有高細胞核與細胞質比之緊密細胞群落。 然而，接種於由人類胚胎幹細胞預調節之3_D基質上之 • 〇8161黑素瘤細胞獲得藉由形成類似於由人類胚胎幹細胞 形成之群落的橢球體顯現之改變表型（圖^。。相反，來 自人類胚胎幹細胞之經調節培養基並不使C8l6i>胞發生 後生變化（圖2G)，此表明hESC經由改變緊接微環境來影響 黑素瘤細胞表型。 為進一步分析暴露於人類胚胎幹細胞微環境之c8〗6 j細 胞之表型的後生變化，進行黑素細胞標記（Melan_A)之西 方墨點及RT-PCR分析（圖3 a及3B)。Melan A不存在於 Matrige丨上之H1人類胚胎幹細胞中（指示其缺乏分化色素細 123180.doc •39· 200815598 胞表型）與Matrigel上之C8161黑素瘤細胞中（說明其反分化 表型）。然而，在暴露於H1預調節Matrigel基質之無黑色素 C8161黑素瘤細胞中誘導Melan-A表現（圖3A)，此證明黑素 細胞特異性表型標記的後生誘導，其類似於Matrigel上之 對ft?、黑素細胞（HEMn)。相反，未誘導暴露於由正常HEMn 預調節之3-D基質之C8 161黑素瘤細胞改變其形態或表現 Melan-A(圖3B)。因此，正常黑素細胞微環境並不共有 hESC微環境後生性地使轉移性黑素瘤細胞再程式化以表 現類黑素細胞表型的能力。此係由圖3C之結果加以證實， 圖3C展示半定量RT-PCR分析，其證明由人類黑素細胞預 調節之膠原蛋白I 3-D基質（HEMnl8或HEMn20 CMTX)不改 變所測試之基因的表現，此指示良性黑素細胞微環境不以 後生方式影響轉移性黑素瘤細胞以改變其成形、分子表 型。 實例2 :在hESC微環境上培養後侵襲性腫瘤細胞之侵襲性 及致瘤性降低 腫瘤細胞之侵襲與其侵襲穿過細胞外基質之能力相關 聯；因此’研究hESC微環境對黑素瘤細胞侵襲的影響。 如圖4A所說明，在由hESC預調節之基質上培養後侵襲性 C 8 161細胞之活體外侵襲性顯著受抑制，其表明與此人類 胚胎微環境相關之抑制性抗侵襲指示信號。 相當結果見於活體内腫瘤形成中。如上所述製備人類胚 胎幹細胞之微環境（H9 CMTX)。將C8161人類皮膚黑素瘤 細胞暴露於H9 CMTX或Matrigel歷時3至4天，隨後移植於 123180.doc -40- 200815598 小鼠模型中。免疫功能不全之裸鼠接受C8161細胞至肩胛 中間區域中之皮下注射（以模擬人類癌症中所發現之自發 性轉移性播散）。使用25或27號針以每隻小鼠於〇〇5 ml RPMI培養基中之2.5xlO5個腫瘤細胞來對動物進行注射。 隔日監測腫瘤大小且使用測微計量測。在屍體剖檢時 (注射後19天），使用C〇2壓縮氣體窒息、接著頸椎脫位來 對小鼠施以無痛致死術且移除腫瘤及主要器官且為組織學 刀析作準備。將切片用抗No dal抗體（R&d Systems)染色以 測疋腫瘤中之Nodal表現（參見實例6)。如圖4A及4B所示， 在hESC微環境上培養後，黑素瘤細胞之活體内侵襲性及 致瘤性降低。 實例3 :人類正常細胞、轉移性癌細胞、人類胚胎幹細胞 及其他幹細胞類型中之Nodal信號轉導路徑成員的表徵： 侵襲性腫瘤表現Nodal而非Lefty 為闡明正常細胞、贅生性細胞及幹細胞類型中之N〇dal 信號轉導路徑之關鍵組份的表現，進行西方墨點分析，其 揭示以類似於hESC之方式，轉移性黑素瘤（C81.61)及乳癌 (MDA-MB-23 1)細胞表現約48 kDA之Nodal蛋白質（圖5A)。 此與未偵測到Nodal之相應正常細胞類型[黑素細胞、肌上 皮細胞（Hs 578 Bst)及初級人類乳腺上皮細胞（HMEpC)]相 反0

Lefty蛋白質（Lefty-A、Lefty-BKTGF-β超家族之分支成 員）空間上及時間上對胚胎系統中之Nodal產生拮抗作用 (Tabibzadeh等人，2006，汾Ce/b 24:1998-2006)。此 123180.doc -41 - 200815598 外，Lefty基因為Nodal信號轉導之下游標靶，進而為此路 徑提供有效負反饋迴路。同君。使用西方墨點分析，確定 hESC表現約42 kDA、34 kDA及28 kDA之Lefty蛋白質。相 反，Lefty並不由轉移性乳癌及黑素瘤細胞或由相應正常體 細胞類型表現（圖5A)。即時RT-PCR分析證實Lefty mRNA 表現之此等結果為hESC細胞株所專有（圖5B)。

Nodal藉由與I型（ALK 4/7)與II型（ActRIIB)活化素樣激酶 受體之間的異二聚複合物結合來傳播其信號。斑馬魚及小 鼠之遺傳研究已確定Cripto(表皮生長因子-Cripto-l/FRLl/ 隱秘（EGF-CFC)家族成員）與ALK 4及Nodal直接相關且此 等相關性促進Nodal傳播其信號的能力（Schier等人；Yeo等 人，2001，Mo/· Ce// 7:949-957)。使用西方墨點分析及免 疫螢光顯微法，確定hESC均一表現約35、kDA之高量 Cripto ;然而，僅轉移性人類黑素瘤（C8161)及乳癌（MDA-MB-23 1)細胞之亞群表現相對低量之Cripto(圖5 A、5C)。 為分析Nodal、Lefty及Cripto於其他人類幹細胞類型中 及頭三個月人類細胞滋養層細胞（HTR-8/SVneo)中之表 現，進行西方墨點分析，其揭示源自臍帶之g葉幹細胞 (MSC ; SC00125)及成人 MSC 不表現 Nodal及 Cripto，且儘 管源自羊水之幹細胞（GM00473、GM00957A)及細胞滋養 層細胞表現Cripto，但僅後一發育細胞類型表現明顯量之 Nodal(圖5D)。注意，與hESC相反，所檢驗之其他幹細胞 株均不表現明顯量之Lefty蛋白質4mRNA(圖5B)。 總之，與hESC相同，癌細胞表現Nodal ;而與hESC不 123180.doc •42- 200815598 同，其不表現Lefty。C8 161細胞（人類轉移性黑素瘤細胞） 及MDA-MB-231細胞（人類轉移性乳癌細胞）表現Nodal及 Cripto(低 3：) ’ 且其不表現 Lefty。Nodal、Lefty 及 Cripto 的 表現在正常人類黑素細胞、Hs 578 Bst正常人類肌上皮細 胞及HMEpC正常人類乳腺上皮細胞中不可偵測。 實例4 : Nodal表現與腫瘤進展相關聯 對人類黑素瘤樣本篩檢Nodal蛋白質的存在性。福馬林 (Formalin)固定、石蠟包埋之存檔組織係獲自患有原發性 或轉移性皮膚黑素瘤之患者（Loyola University Chicago, IL)。在具有多種HRP/AEC偵測系統之HNS 710i自動免疫 染色器（Richard-Allan Scientific(RAS)，Kalamazoo，MI) 上進行免疫組織化學染色。在二甲苯中脫去石蠟、乙醇降 解、及用檸檬酸鹽緩衝液恢復抗原後，應用四個阻斷步 驟：0.03%過氧化氫、抗生蛋白及生物素阻斷（抗生蛋白/ 生物素阻斷套組，Vector Laboratories，Inc·，Burlingame， CA)及無血清蛋白質阻斷。應用抗Nodal抗體（20 pg/mL， R&D)歷時90分鐘。載玻片在TBS-T中沖洗，與結合生物素 之抗山羊 IgG(2 pg/ml，Vector Labs)— 起培育，用 TBS-T 洗，且與抗生蛋白鏈菌素過氧化酶試劑一起培育1 5分鐘。 用AEC(紅色）受質（RAS)產生顏色，且用邁爾蘇木素 (Mayer’s hematoxylin)對比染色。樣本在試劑級醇中脫 水，且用永久封固劑蓋上蓋玻片。以ChromPure山羊 IgG(Jackson Labs)，用同型匹配且以Nodal抗體相同之濃 度，進行陰性對照反應。 123180.doc •43- 200815598 免疫組織化學證明Nodal不存在於正常皮膚中（圖6A)且 在原發性黑素瘤中微弱表現或不存在（圖6B)。在原發性病 變中，Nodal免疫染色一般局限於垂直生長期中之小簇腫 瘤細胞，且很少在輻射狀病變中觀測到（n=5 ;圖6C及 6D)。反之，Nodal蛋白質在所研究之60%皮膚黑素瘤轉移 中表現（n=10 ;圖6E及6F)。免疫染色為異質的，各患者在 程度、強度及定位方面有所不同。舉例而言，發現Nodal 定位於細胞膜，及在細胞質中廣泛表現（圖10)。西方墨點 (blot)分析類似地揭示所測試之45%轉移性黑素瘤為Nodal 陽性（n=22)。其與正常皮膚（n=9)及黑素細胞（n=5)相反， 該兩者均不表現Nodal(數據示於表1中）。總之，此等結果 證明Nodal表現與黑素瘤進展正相關。 表1

Nodal 染色(IHC) 實例類型 NodaK言號(西方） 正常皮膚 - 正常皮膚 - 正常皮膚 - 正常皮膚 - 正常皮膚 - 正常皮膚 - 正常皮膚 - 正常皮膚 - 正常皮膚 晴 黑素細胞 - 黑素細胞 - 黑素細胞 - 原發性 - 黑素細胞 - 原發性 - 黑素細胞 - 原發性 樹突狀細胞 - 原發性 樹突狀細胞 原發性 轉移性黑素瘤 - 轉移 _氺 轉移性黑素瘤 - 轉移 轉移性黑素瘤 + 123180.doc -44- 200815598 轉移 + 轉移性黑素瘤 + 轉移 + 轉移性黑素瘤 - 轉移 - 轉移性黑素瘤 - 轉移 - 轉移性黑素瘤 - 轉移 - 轉移性黑素瘤 + 轉移 ++ 轉移性黑素瘤 - 轉移 ++ 轉移性黑素瘤 - 轉移 轉移性黑素瘤 + 轉移性黑素瘤 - 轉移性黑素瘤 + 轉移性黑素瘤 - 轉移性黑素瘤 - 轉移性黑素瘤 + 轉移性黑素瘤 - 轉移性黑素瘤 + 轉移性黑素瘤 + 轉移性黑素瘤 + 轉移性黑素瘤 - 轉移性黑素瘤 +

++表示涵蓋>75%之腫瘤塊之對於Nodal的強陽性染色 +表示涵蓋>50%之腫瘤塊之對於Nodal的陽性染色或使用西方墨點 分析彳貞測Nodal 表示腫瘤塊之小亞群(<10%)中的Nodal染色 -表示不存在Nodal 由於No dal表現與黑素瘤進展正相關，以致於No dal蛋白 質並不在正常黑素細胞或輻射狀生長期黑素瘤中表現，但 存在於更具侵襲性之垂直生長期及轉移性病變中，人類乳 房組織微陣列（TMA)之免疫組織化學分析揭示Nodal蛋白 質同樣不存在於正常乳房組織中，且其表現與乳癌進展正 相關（圖7)。 乳房組織中Nodal染色的表現及流行率表示為無、弱 (<25%)、中等（25-75%)或強（>75%)。〇0：18為乳腺管原位癌 且IDC為侵襲性乳腺管癌。史皮爾曼等級相關（Spearman’s rank correlation)展示乳癌進展與Nodal表現之間的顯著正 123180.doc -45- 200815598 相關（Ρ<0·05)(表2中概述之資料）。 表2 無 弱 中等 強 合計 良性 26 1 0 0 27 DCIS 3 0 0 0 3 IDC 24 1 3 5 33 實例5 : Nodal及Lefty在hESC基質中的定位 進行以共焦顯微法之免疫螢光定位以觀測Lefty於hESC 微環境中之沈積。利用此方法，確定Lefty蛋白質定位於 hESC與下伏Matrigel基質接觸之區域，且源自hESC之 Lefty滲透至下伏基質中（圖8)。其與Nodal蛋白質相反，該 Nodal蛋白質定位於hESC群落之表面。此等結果係以西方 墨點分析加以證實，其證明Lefty蛋白質可在由H9 hESC調 節之Matrigel(H9 CMTX ;圖8)中偵測，但Nodal蛋白質在 此H9 CMTX中不可偵測。此外，在單獨未調節對照 Matrigel中既未發現Nodal，亦未發現Lefty。 實例6 ··在暴露於hESC調節基質之侵襲性腫瘤細胞中向下 調節的Nodal表現 著手確定H9 CMTX對轉移性黑素瘤（C8161)及乳癌 (MDA-MB-231)細胞中Nodal表現的影響。如圖9所說明， 人類胚胎幹細胞（hESC)之微環境使暴露於胚胎預調節基質 之成形轉移性黑素瘤及乳癌細胞中之Nodal表現及致瘤性 降低。西方墨點分析（見下文）揭示hESC之微環境使多能黑 素瘤（C8161)及乳癌（MDA-MB-231)細胞中之Nodal蛋白質 表現減少（圖9A)。暴露於H9 CMTX向下調節黑素瘤與乳癌 123180.doc -46- 200815598 細胞中之Nodal蛋白質表現，且此影響隨時間為可逆的（圖 9B)。暴露於H9 CMTX類似地終止黑素瘤及乳癌細胞中之 Nodal mRNA表現（圖 9C)。 圖9D展示源自預暴露於Matrigel或hESC調節基質（H9 CMTX)之C8 161細胞之正位腫瘤（來自實例2之活體内實驗） 中的Nodal染色之免疫組織化學分析。暴露於H9 CMTX之 C8 161細胞表現更少Nodal。 由於功能相關，確定C8161及MDA-MB-231細胞暴露於 H9 CTMX使其經歷固著非依賴性生長的能力顯著下降，且 此活體外群落形成抑制可藉由將重組Nodal(100 ng/mL)包 括在内而得以部分缓解（圖9E)。注意，使用與即時RT-PCR 結合之西方墨點分析，展示抑制癌細胞中之Nodal表現的 能力為hESC之微環境所專有（圖9F及9G)。舉例而言， C8161細胞暴露於由黑素細胞、源自羊水之幹細胞 (GM00473、GM00957A)或細胞滋養層細胞（HTR-8/SVneo) 調節之基質並不抑制Nodal蛋白質或mRNA表現（圖9F及 9G)，由此闡明hESC微環境之後生影響的排他性。 西方墨點分析 如先前 Hess等人，2001，C^cer 61:3250-3255 中所 述來製備及量化蛋白質溶解產物。藉由在還原條件下進行 SDS-聚丙稀醯胺凝膠電泳來分離等量蛋白質，且將溶解蛋 白質轉移至Immobilon-P 膜（Millip〇re c〇rp，Bedf〇rd，MA) 上。將膜在 1% TBS、0·1〇/〇 Tween 20(TBS-T)及 5%乾燥奶 粉或3%明膠中阻斷（用於Nodal西方墨點分析）。將墨點與 123180.doc -47、 200815598 抗 Nodal 或抗 Lefty抗體（多株兔抗 No dal (Η-110)1:500 Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz, CA ;多株山羊抗 Lefty 1:500 R&D Systems，Minneapolis，MN)— 起培育，在 TBS-T 中洗滌，且與適當辣根過氧化酶標記之二次抗體一起培 育。由增強型化學發光（Super Signal ; Pierce，Rockford， IL)及暴露於自動放射線照相膠片（Molecular Technologies， St Louis，MO)來偵測二次抗體。偵測到Nodal蛋白質呈約 48 kDa及約35 kDa之兩個主要帶，其分別表示前驅體及前 Nodal。Nodal常呈現為多個帶，此可能係歸因於蛋白質修 飾的降解。所有實驗進行至少三次。 實例7 : Lefty為負責抑制轉移性癌細胞中之Nodal表現及 群落形成之主要的源自hESC之因子 如先前所述，人類胚胎幹細胞（hESC)之微環境使暴露於 胚胎預調節基質之成形轉移性黑素瘤及乳癌細胞中之 Nodal表現及致瘤性降低。確定hESC調節基質（圖10A ; CMTX)内Nodal抑制劑Lefty充足。相反，Lefty蛋白質不存 在於C8161細胞自身調節基質（圖10A ; C8161+CMTX)上之 C 8161細胞中。 亦將癌細胞暴露於由hESC調節之Matrigel，其中Lefty蛋 白質表現係用對Lefty-A及Lefty-B具有特異性之FITC標記 之嗎啉基募核苷酸（MOLEFTY)敲除。在超過75%之所處理之 hESC群落中可顯微偵測到經榮光標記之嗎啉基（圖10B)， 且西方墨點分析證實有效敲除hESC中之Lefty蛋白質歷時 至多3天（圖i〇c)。及㈣g的表現（代表hESC多能 123180.doc -48 - 200815598 性）在此時期内不受影響，且不改變hESC群落之形態。因 此’儘管“(^爪有效敲除hESC中之Lefty蛋白質表現，但 其並不誘導幹細胞分化（圖10D)。即時rT_PCR分析揭示轉 移性黑素瘤細胞暴露於由經m〇lefty處理之H9 hESC調節 之Matrigel並不使Nodal表現終止（圖10E)。實際上，此，Ή9 Lefty缺乏”基質向上調節C8161細胞中之Nodal mRNA表現 (圖 10E)。 另外’與抗Lefty抗體共價偶合之Dynabead用於自在無 餵養層之Matrigel基質上培養之hESC分離Lefty。隨後將此 經純化之源自hESC之Lefty接種於新鮮Matrigel中且檢驗 ’’含Lefty”基質對癌細胞表型的影響。西方墨點分析揭示源 自hESC之Lefty分別終止及減少轉移性黑素瘤（C8 161)及乳 癌（MDA-MB-231)細胞中之Nodal蛋白質表現（圖10F)。 又，發現C8161及MDA-MB-231細胞暴露於，，含H9 Lefty" 基質顯著降低固著非依賴性生長，且此活體外群落形成抑 制可藉由將重組Nodal(100 ng/mL)包括在内而得以完全緩 解（圖10G)。 實例8:能抑制高濃度之Nodal的rLefty 如圖11中之西方墨點所示，添加rLefty至C8161細胞中減 少所示濃度之Nodal表現。rLeftyB可抑制C8161細胞中之 Nodal蛋白質，但在比其hESC對應物劑量高之劑量下。此 等結果與先前發現（Tabibzadeh，S等人，2006，CW/s 24: 1998-2006)—致。 實例9 :源自hESC之Lefty(不同於重組Lefty)經糖基化 123180.doc • 49- 200815598 試圖瞭解源自hESC之Lefty與rLefty之間對於Nodal信號 轉導之全異結果’著手分析rLefty_B、rLefty-A及來自H9 hESC加上其調節基質之溶解產物之醣蛋白含量。發現與 rLefty蛋白質相反，源自H9之Lefty經高度糖基化（圖12)。 實例10 : Nodal抑制及hESC之微環境終止活艘内致瘤性 使用正位小鼠模型檢驗hESC微環境對黑素瘤及乳癌細 胞之活體内致瘤性的影響。轉移性黑素瘤（C816!)及乳癌 (MDA-MB-231)細胞暴露於H9 CMTX使得與暴露於未調節 Matrigel之細胞相比致瘤性顯著降低（圖4B&13A)。為進一 步證實Nodal對致瘤性的作用且闡明hESC微環境（先前展示 減少Nodal表現（圖9))之腫瘤抑制特性的潛在機制，使用正 位小鼠模型來檢驗以下影響：（a)異位Nodal表現對C8 1 -61 細胞（轉移性C8161黑素瘤細胞株之同基因匹配之非致瘤性 變異體）之致瘤潛能的影響；及（b)Nodal抑制對MDA-MB-231乳癌致瘤性的影響。當注射5〇〇,〇〇〇個細胞時，對照 C8 1 -61黑素瘤細胞株不能形成可觸及之腫瘤，且接種後 5 · 5週使用大體觀察及組織學分析，在注射部位不可偵測 此等腫瘤細胞。相反，1〇〇%之經Nodal表現載體轉染之 C81-61細胞在注射3.5週内形成可觸及之腫瘤（圖13B)。可 觸及之腫瘤在注射500,〇〇〇個對照MDA-MB-231細胞後2.5 週内出現’且當注射相同數目之細胞時，用Nodal嗎琳基 (MON°dal)敲除Nodal表現使得MDA-MB-231致瘤性顯著降 低（圖13C)〇 為確立暴露於hESC微環境終止致瘤性之機制，分析此 123180.doc -50- 200815598 /口療對活體内腫瘤細胞增殖與細胞凋亡比的影響。使用 Kl67之免疫組織化學染色作為細胞增殖之量測，且使用末 端脫氧核苷酸轉移酶生物素_dUTP切口端標記（TUNEL)作 為細胞 >周亡之量測，確定Nodal敲除及暴露於hESC CMTX 相應減小轉移性C8161黑素瘤細胞中及轉移性mdA-MB-231乳癌細胞中之細胞增殖與細胞凋亡比（圖13D及13E)。 此外，細胞增殖之活體外分析證明經M〇n。^處理之C8161 及MDA-MB-23 1細胞相對於經M〇對照處理之細胞增殖減少 (圖 13F)。 實例11 :為腫瘤形成所必需iNodal信號轉導；N〇dal信號 轉導之抑制劑降低侵襲性及致瘤性 分析Nodal信號轉導在腫瘤形成中的作用，且發現向下 调節Nodal信號轉導引起類黑素細胞表型之獲得及反分化 成形表型之缺失。 投與抗Nodal嗎啉基（MO Nodal)亦使得Nodal向下調節且 活體内減少腫瘤形成。活體外群落形成檢定用於分析弱侵 襲性C81-61細胞、侵襲性C8161細胞、經MON()dal處理之 C8161細胞及經MONQdal處理且經重組N〇dal(100 ng/mL)救 助之C8161細胞之群落形成能力。使用懸浮於含有丨血 /月之RPMI中之〇. 3 5 %瓊脂糖中的5 〇，〇〇〇個細胞進行檢定， 將違荨細胞塗於6孔盤中相同培養基中之〇. $ %壤脂上。群 落生長’且在第7天拍照。2週後，將群落用結晶紫 (Crystal Violet)染色且進行計數。 利用活體外檢定，發現C8 161鈿胞能在7天内在軟瓊脂中 123180.doc -51- 200815598 形成群落’且其較低侵襲性同基因對應物（ί：81-61)不具有 群洛形成性（圖14Α)。用M〇N〇dal抑制Nodal顯著降低以“！ 細胞級歷固著非依賴性生長的能力。甚至在2週後， MON〇dal仍使C8161細胞之群落形成減少57%(n=16， Ρ〈〇·⑼1) ’此現象藉由將rNodal(l00 ng/mL)包括在内而得 以緩解。令人關注地，rN〇dal並不誘導C81_61細胞株中形 成群落。對於細胞群落檢定而言，使用測試測定統計顯著 性。在所有狀況下，p<〇〇5之差異具有統計顯著性。 作為此等發現之必然結果，正位小鼠模型用於檢驗 Nodal抑制對黑素瘤腫瘤形成的影響。對於實驗性致瘤形 成模型而言’將5週齡裸鼠（Harlan，Madison，WI)用50 pL 完全RPMI中之25 0,000個經對照或抗Nodal嗎啉基處理之 C8161細胞進行皮下注射。在注射後第3天、第7天、第14 天及第17天進行腫瘤量測，且在第17天將小鼠處死。在用 經MO對照或MONodal處理之C8161細胞注射之小鼠中的活體 内腫瘤形成展示於圖14B中。對於正位小鼠腫瘤形成研究 而言’使用克-瓦二氏單因子等級變異數分析（Kruskal_ Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks)、接著使用 鄧恩氏法（Dunn1 s method)測定統計顯著性。 可觸及之皮下腫瘤在注射僅250,000個對照C8161細胞後 7天内出現。相反，當注射相同數目之細胞時，敲除N〇dal 表現使得C8161致瘤性顯著降低（圖12B ; η=5，ρ<〇·〇5)。 此致瘤性降低之特徵為腫瘤發生率下降30%以及腫瘤生長 減少。 123180.doc -52- 200815598 免疫組織化學用於分析來自小鼠之腫瘤，其展示直至第 17天’在MON()dal治療組中所形成之腫瘤開始恢復^““表 現（圖14C)。 另外，弱知襄性黑素瘤細胞（C81-61細胞）當經Nodal cDNA轉染時獲得致瘤潛能。將C81_61細胞經空載體或 Nodal表現構築體轉染（n==5)。如圖14D所示，該等細胞顯 不腫瘤生長。 投與ALK 4/5/7抑制劑使得各種血管生成模擬成形生物 標記之表現降低。圖15 A展示投與媒劑或Alk 4/5/7抑制劑 (SB431542 ’ 1 μΜ，10 μΜ)後 48 小時 C8161 細胞中之 Nodal、麟酸化SMAD-2、總SMAD 2/3及肌動蛋白的西方 墨點分析。所有Nodal帶表示前體蛋白。圖15B展示投與媒 劑或不同濃度之ALK抑制劑後24小時C8161細胞中之 Nodal、酪胺酸酶及肌動蛋白的西方墨點分析，而圖15(：展 不在媒劑或不同濃度之ALK抑制劑存在下在3-D膠原蛋白I 基質上培養6天之C8161細胞中之VE-鈣黏附蛋白、角蛋白 18及肌動蛋白的西方分析。圖15D展示侵襲能力下降，且 圖15E展示在用ALK 4/5/7抑制劑向下調節N〇dal後血管生 成模擬得以終止。 上述實驗揭示轉移性黑素瘤表現胚胎成形素Nodal，彼 Nodal為腫瘤形成所必需，且其作用可經由直接或間接抑 制Nodal路徑（例如，經由抑制alk)而減輕。 實例I2 :藉由抑制Notch來向下調節Nodal表現 為提出作為使暴露於hESC基質微環境之黑素瘤細胞再 123180.doc -53- 200815598 程式化之基礎的可能分子機制，開始分析Nodal啟動子， 發現Notch路徑之推定結合序列效應子（CBF-1)，且研究 Notch與Nodal路徑之間的分子串話之可能性。經Notch siRNA、尤其經Notch 4 siRNA處理之轉移性黑素瘤細胞中 之Nodal表現得以敲除。相反，Notch表現相對不受Nodal 敲除影響，其表明Notch為具有可能分子串話之Nodal上 游。 如圖16A所示，在投與Notch siRNA後72小時，C8 161細 胞中之Nodal表現得以敲除。即時RT-PCR及西方墨點分析 證實在此時間點各Notch靜默。相反，如圖16B所示， Notch表現相對不受C8161細胞中No dal敲除（經由用Nodal 抑制劑SB43 1542處理）影響。 實例13 :過甲基化在侵襲性腫瘤細胞中之Nodal路徑中起 作用 在高度轉移性C8161細胞中，而非同基因匹配之C81-61 黑素瘤細胞中，亦非黑素細胞或hESC(H9)中觀測到Nodal 的過甲基化。由此，可使用基於定序之甲基化分析來指示 人類腫瘤中之甲基化狀態，且因此充當有價值的疾病病況 預後性標記。

Nodal之甲基化狀態由Feinberg實驗室之工作支持，其展 示CTCF結合位點甲基化使強化子與啟動子分離（Gins，等 人，2004，Ce// 6:361-371)。在彼工作中，發現氮 雜胞嘧啶核苷使其所活化之眾多基因的表現停止；目前已 知此基因支組在啟動子CpG島内含有CTCF結合位點。尤其 123180.doc -54- 200815598 對於 Nodal，序列為 CCGCGCTGGGTGCCCAG [SEQ ID NO: 1]。在由曱基化活化之基因中鑑別之一致序列為 CCGCGN(N)GG(G)(N)GCC(N)CAG [SEQ ID NO:2]，且 Feinberg已直接證明甲基化依賴性活化，其中在具有此一 致序列之若干啟動子中CTCF絕緣子結合終止。異常地， 當使此位點曱基化時，CTCF可不再結合，且啟動子得以 致能。其為主要印記機制，且已與在癌症與發展期間可能 如何調節Nodal顯著相關。 參看圖17，儘管在hESC微環境（H9 CMTX)存在下培養 C8161細胞使曱基化全面增加僅6.8%，但當細胞在只9 CMTX上培養時，與在單獨MatHgel上培養相比，陰影區 域之曱基化增加32%。序列比對揭示差異性曱基化之胞_ 啶與推定轉錄因子結合位點相關。陰影區域含有EBP、 Spl及ΑΡ·2α之一致序列，且在此區域中之曱基化增加32% 可指示暴露於hESC CMTX之腫瘤細胞中之Nodal基因靜 默。 實例14 ··例示性檢定及程序 一般維持細胞株 先前已描述人類黑素瘤細胞株之衍生及表型特彳|文。

Seftor，等人，2002，C/k. Exper/m. 19:233 246 ; Seftor，等人，2005 Cancer 及es. 65:10164-10169 0 除維持於補充有15% FBS、IX Mito+(BD Bioscience)及石泉 酸慶大黴素（gentamycin sulfate)之Ham氏F10培養基中之 C81-61細胞以外，將黑素瘤細胞株維持於補充有10%胎牛 123180.doc •55· 200815598 血清（FBS，Gemini Bioproducts)及0.1%硫酸慶大黴素之 RPMI 1640培養基（Invitrogen)中。正常人類黑素細胞可購 得（Cascade Biologies)或自新生兒包皮分離。Seftor，等 人，2005。製備單一細胞懸浮液，將其添加至塑膠燒瓶中 用於黏附黑素細胞及在具有包括100單位/毫升盤尼西林 (penicillin)、100 pg/ml 鏈黴素及 250 ng/mL 兩性黴素 B(amphotericin B)之人類黑素細胞生長補充液（Cascade Biologies)之培養基254中繁殖之細胞。如先前所述培養人 類胚胎幹細胞株。Thomson，等人，1998， 282··1145-1147。簡言之，使細胞在用0.1%豬明膠預塗覆且 含有每孔1.9X 105個經照射之小鼠胚胎纖維母細胞（菌株CF-1 ; ATCC)之6孔盤中生長。將細胞維持於含有 DMEM/F12(1:1)、20%基因剔除血清替代品、非必需基本 胺基酸、L-麩胺醯胺（Invitrogen)、β-魏基曱醇及4 ng/ml FGF-2(R&D Systems)之培養基中，且用膠原酶（1 mg/ml)使 其分裂，其後群落開始重疊。使用基於PCR之檢定（Roche) 確定培養物無支原體污染。按照經銷商說明書維持正常人 類新生兒表皮黑素細胞（HEMn-LP ; Cascade Biologies， Portland OR)、肌上皮細胞（Hs 578 Bst ;美國菌種保存中 心（American Type Culture Collection)(ATCC)，Manassas， VA)及初級乳腺上皮細胞（HMEpC ; Cell Applications Inc.，San Diego CA)。在推薦條件下維持活臍帶血幹細胞 (SC00125 ； New Jersey Stem Cell Resource, Coriell Institute for Medical Research)、源自羊水之幹細胞 123180.doc -56- 200815598 (GM00473、GM00957A)及源自成人骨髓之間葉幹細胞 (Stem Cell Technologies，Vancouver BC，Canada)。ΗΤΊ 8/SVneo為經良好表徵之永生化人類絨毛外細胞滋養層細 胞株，且如先前Graham等人，1993，五：^p. Ce// 206:204-211所述來維持。按照製造商建議來稀釋重組 Nodal及Lefty(R&D Systems)。野生型Nodal之表現載體係 由Daniel Constam博士（瑞士實驗癌症研究所（Swiss Institute for Experimental Cancer Research)(ISREC)， Epalinges，Switzerland)友情提供且如先前戶斤述將其轉染 至 C81-61細胞中。Le Good等人，2005，Cwrr. Βζ·ο/· 15:31-36 〇 製備/預調節3-Ό人類基質 將25-3 0 μΐ之確定人類基質（50 gg/ml人類昆布胺酸；於3 mg/ml人類膠原蛋白I基中之50 pg/ml人類膠原蛋白IV ; Sigma)展布於蓋玻片上或直接置放於12孔培養盤中且在室 溫下施加100%乙醇下而聚合。用PBS廣泛洗滌後，將 hESC接種於完全幹細胞培養基中之3-D基質上。3-4天後， 使用Zeiss Televal倒置式顯微鏡及Hitachi HV-C20 CCD照 相機數位式擷取影像。接著用20 mM NH4OH移除細胞，繼 而用無菌水、PBS及接著完全培養基徹底洗滌。接著由2-D LDS-PAGE及西方墨點直接分析經調節之基質，或用黑 素瘤細胞再接種且再培育3天。接著再收集細胞用於進一 步生物化學、分子及功能分析。 3-D調節基質實驗 123180.doc -57- 200815598 如先前所述在生長因子減少之Matrigel(14 mg/mL ; BD Biosciences)上使用hESC、黑素細胞、肌上皮細胞、源自 羊水之細胞或滋養層細胞製備經調節之基質。Postovit等 人，2006，Ce/k 24: 501-505。在所有狀況下，在調 節基質期間細胞有80-100%融合。或者，在聚合前將源自 hESC之Lefty蛋白質接種於Matrigel中。隨後將人類黑素瘤 (〇8161)或乳癌（]^1〇八-]\43-231)細胞以每個6孔盤2.5><105個 細胞暴露於此預調節基質歷時3至4天。 侵襲/遷移檢定 如先前所述，膜侵襲培養系統（MICS)腔室用於評估活體 外腫瘤細胞侵襲穿過基質之程度（受刺激與未受刺激）。 Hendrix，M.J.C.等人，1992，J· iVai/· /似ί.，84:165- 174 〇 測定細胞生存力及增殖 藉由在多個時間點BrdU併入新近合成之複製細胞DNA中 的免疫組織化學染色（BrdU標記及偵測套組III ; Roche)來 檢定細胞增殖。由Ki-67表現來監測增殖指數的評定。 增殖檢定 在標準組織培養條件下將1.5 X 104個細胞塗於24孔盤之 個別孔中，且收集後每日進行細胞計數。 軟瓊脂細胞群落檢定 如先前所述評定細胞之群落形成性。Hamburger，A.W.， 及 Salmon，S.E·，1977，197:461-463。對於軟瓊脂中 之純系形成，每個參數以三重複測試。簡言之，將104個 123180.doc -58- 200815598 細胞塗於置放於軟瓊脂上之完全培養基中之60 mm皮氏培 養皿（Petri dish)中。在塗佈細胞後特定日，使用具有 Hitachi HCV-20彩色照相機之Zeiss Axiovert 25獲取群落之 相差影像。 固著非依賴性生長檢定 如先如所述進行固者非依賴性生長檢定。T o p c z e w s k a等 人，2006, TVfli· MW. 12: 925-932 〇 幹細胞群髏及以選殖形式獲得之黑素瘤幹細胞之分化檢定 如先前所述，收集來自各種3-D預調節基質之幹細胞且 將其再塗於特定分化培養基中之適當ECM上。Hendrix等 A 5 2003, Nature Rev. Cancer 3:411-421 ； Hsu^ A 5 2004, Methods Mol· Med· 107:13-28 ; Pittenger 等人，1999, 沉e 284:143-147 o 實驗性正位腫瘤模型 將5週齡小鼠用於50 gL完全RPMI中之250,000個08161 或500,000個C81-61人類皮膚黑素瘤細胞皮下注射；或將 於50 μΐ完全RPMI中之500,000個MDA-MB-23 1細胞注射至 8週齡小鼠之乳腺脂肪塾中。當腫瘤可觸及時，每週兩次 進行量測。 2-D L(M)DS-PAGEA m S Μ 按照製造商之方案，使用處於第一維之invitrogen之3-10 pH IPG條帶及處於第二維之4-12% Bis/Tris LDS-聚丙烯醢 胺梯度凝膠、使用MES(蛋白質至多約100 kDa)或MOPS(蛋 白質大於100 kDa)儲集緩衝液進行由不同細胞調節之前或 123180.doc -59 - 200815598 之後的細胞外基質組份之分析。將凝膠用Sypr〇紅染色， 接著電潰於Immobilon P膜（Millipore)上用於使用特異性細 胞外基質抗體（Chemicon ; R&D Systems ; Life Technologies) 進行西方墨點分析。

Lefty自細胞調節基質復原 按照製造商之方案，以8 抗體/lxl〇T個珠粒之最終濃 度使Μ-280甲苯石黃醯基活化之Dynabeads(Dynal Biotech)與 抗 Lefty 抗體（M-20:sc7408 ; Santa Cruz Biotechnology, Inc.)共價偶合。將細胞調節基質溶解於RIPA緩衝液中，超 音波處理，離心且藉由在4°C下旋轉1小時使上清液與珠粒 混合。用PBS洗滌兩次後，使用50 mM甘胺酸-HCl(pH 3.0)，接著用0·1體積之1 M Tris(pH 8·5)標準化至pH 7.4， 或 0.2 M Tris(pH 8.5)加上 0·5 M NaCl來使Lefty復原。 RNA提取及逆轉錄酶聚合酶鏈反應（RT-PCR) 使用TRIzol試劑（Invitrogen)分離總RNA且如先前所述使 1 pg逆轉錄。Topczewska等人，2006。如先前所述（尽#) 使用以下基因之TaqMan®基因表現人類引子/探針組進行 即時 PCR ·· F£OP(Hs00173626—ml)、raiM(Hs00170236—ml)、 [/67(Hs00606991—ml)、 Ze/〇；"5(Hs00764 128 — s 1)、 TWa/(Hs0025 063 0_sl)。使靶基因表現標準化成内源性對 照基因 GAPDH(GAPDH : 4333764F)、RPLPO(RPLPO ： 4333761F)及 / 或 18S rRNA(Hs99999901—sl)。使用 Applied Biosystems序列偵測軟體（1.2.3版)分析資料。 FAC分析/分選 123180.doc -60 - 200815598 使用BD FACs Aria進行螢光活化細胞（FAC)分析及分選。 在FAC分析前，按照製造商說明書將細胞與抗體一起培育 且在先前已滲透之細胞中偵測細胞内蛋白質。對於細胞表 面蛋白質（諸如CD34)與細胞内蛋白質（諸如角蛋白），使 FAC方案最佳化。使用1〇〇 μπ1喷嘴及無菌技術進行活細胞 分選。對細胞表面蛋白質、螢光標記細胞及含有螢光反義 嗎啉基之細胞進行成功活分選。 辕蛋白測定 蛋白質溶解產物經歷SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳及轉移且 使用 Pro-Q Emerald 300染色套組（Molecular Probes)對醣蛋 白進行染色。乾燥墨點後，使用紫外透射照明儀觀測醣蛋 白，且使用配備有深黃色15號濾光片之彩色CCD照相機 (Toshiba)擷取發綠色螢光蛋白質之影像。接著按照製造商 說明書使墨點再水合，且以免疫墨點法偵測Lefty蛋白。 IVIS成像系統200系列 使用Xenogen IVIS成像系統200系列成像儀進行小鼠模 型中之GFP標記之腫瘤細胞的即時生物光子成像。此系統 含有疋製透鏡及改良解析度以及之單一細胞敏感性用於活 體外分析。雷射掃描儀及相關軟體提供進行内部來源之單 視圖擴散斷層成像重建之3-D表面構形的能力以追縱腫瘤 形成及GPF標記之腫瘤細胞的轉移潛能。使用雙重報導體 進行定量活體内檢定以區分細胞增殖的增加與特定基因表 現的增加。 雷射擷取顯微切割 123l80.doc -61 - 200815598

Veritas雷射擷取顯微切割（LCM)系統（Arctimis)組合用於 觀測安裝於載片上之樣本且選擇所關注之區域的三個接物 鏡顯微鏡（至多40倍）、用於繞所關注之區域周邊切割之UV 雷射，及使集光器帽蓋之表面溶融且進而使其黏著於此等 區域之IR雷射，或用於分離之個別細胞。Veritas LCM可 用於分離在3-D基質上培養之活細胞，該等3-D基質已在含 有與Veritas系統相容之載片（PEN框架载片）之特製膜的蝕 刻空間中澆鑄。隨後溶解所擷取之物質用於RNA分離 (Picopure，Arcturus)及包括Q-PCR及微陣列基因表現分析 之下游應用。 共焦、兔疫m微法 使用Zeiss LSM 510 ΜΕΤΑ共焦顯微鏡進行免疫共焦顯微 法。在分析前，按照先前實驗室中所確立之方案將3-D培 養物或組織切片與抗靶蛋白之特異性抗體一起培育。 原位雜交 將3-D培養物或組織樣本置放於基底顯微鏡載片上，且 如先前所述加以製備。Kulesa，等人，2000， 127(13):2843-2852。

Nodal及 Lefty 敲除

使用反義嗎琳基募核苷酸（Gene Tools Inc·，Philomath， OR)抑制Nodal及Lefty蛋白質表現。基於製造商之建議來 選擇嗎啉基序列（21-25mer反義嗎啉基寡核苷酸）。螢光素 (FITC)結合之對照（5’-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3f) [SEQ ID NO: 19] > Nodal(5t-AAGCAGCACCTCCAGCCCTTATATC-3,) [SEQ 123180.doc -62· 200815598 ID NO: 20] ^ Lefty-A(5f-GCCACATGGTGCTGCCCTGGG-3f) [SEQ ID NO: 21]，及Lefty-BpCTGCATGGTGCTGCCCTGGAGGAJ1) [SEQ ID NO: 22]。使用刮法傳遞嗎啉基（20 μΜ)。Topczewska等 人，2006。在實驗前將癌細胞就FITC進行分選且復原歷時 1天。 由siRNA敲除基因表現 將細胞塗於6孔組織培養盤中且使其在含有血清，無抗 生素之培養基中生長至50%融合。接著根據製造商說明書 (Invitrogen)，使用寡 FECTAMINE使細胞經 10 nM或 100 nM 基因特異性siRNA或非特異性siRNA對照轉染。接著在轉 染3天後收集細胞且由RT-PCR、Q-PCR及西方墨點分析以 及功能檢定來評定其基因表現。定量PCR(Q-PCR):根據 製造商說明書，使用Trizol RNA分離試劑（Invitrogen)自細 胞分離總RNA。根據製造商說明書（Clontech)使用 Advantage PCR套組在Robocycler梯度96溫度循環器 (Stratagene) 中進行總RNA的逆轉錄。使用 7500即時PCR系 統（Applied Biosystems)及TaqMan®基因表現引子/探針組 (Applied Biosystems)進行 Q-PCR。簡言之，將總計25 μΐ 之 5 μΐ cDNA、1·25 μΐ 2〇x Assays-on-Demand基因表現檢定 混合物及12.5 μΐ 2x TaqMan®通用PCR母體混合物用以下 溫度循環器方案進行擴增：50°C下歷.時2 min循環1次； 95°C下歷時10 min循環1次；且95°C下歷時15秒/60°C下歷 時1 min循環40次。用序列偵測軟體（1.2.3版，Applied Biosystems)分析所有資料，且將每個靶基因的表現標準化 123180.doc -63- 200815598 成内源性對照基因。每個實驗重複兩次且每個樣本以三重 複進行。 微陣列分析 使用來自Affymetrix之U133A人類基因組陣列根據與轉 譯基因組學（Translational Genomics)之合作協定（TGen ; Phoenix 5 AZ ； Jeffrey Trent博士）來進行細胞之微陣列及 生物資訊分析。 比較基因組雜交分析：基因組DNA分離 使用PUREGENE DNA分離套組（Gentra Systems)使基因 組DNA自細胞分離。如先前所述，將5 pg gDNA用EcoRI消 化，用苯酚：氯仿萃取，經乙醇沈澱，且再懸浮於無菌蒸 瘤水中。〇*Hagan等人，2003，Cancer 及以· 53:5352-5356。 統計分析 使用Microsoft Excel之試算表軟體進行所有統計分析， 其中大部分統計由"單因子變異數分析’’（ANOVA)測定組 成，認為ρ^0·05之值具有顯著性。對於正位小鼠腫瘤形成 研究而言，吾人使用克-瓦二氏單因子等級變異數分析、 接著使用鄧恩氏法或單因子變異數分析（ANOVA)、接著使 用學生-紐曼-柯爾法（Student-Newman-Keuls method)用於 成對多重比較來測定統計顯著性。對於群落形成及增殖檢 定而言，吾人使用ANOVA、接著使用學生·紐曼-柯爾法用 於成對多重比較來測定統計顯著性。對於乳癌期與Nodal 表現的相關性而言，使用斯皮爾曼等級相關（Spearman Rank Order Correlation)。在所有狀況下，ρ<0·05之差異具 123180.doc -64- 200815598 有統計顯著性。 藉由對經亞硫酸氫鈉處理之DNA定序來分析DNA甲基化 藉由用蛋白酶K(Quiagen)消化獲得基因組DNA，接著以 苯酚/氯仿萃取，且使用‘CpGenomeTM DNA修飾套 組’（Chemicon International)使其經受亞硫酸氩鈉處理以將 未甲基化之胞嘧啶修飾成尿嘧啶。由巢式PCR方案使用表 1中所述之引子來使經亞硫酸氫鹽處理之DNA擴增。 表1·在DNA亞硫酸氫鹽轉化後用於擴增之引子

引子 序列 NODAL 基因 CpGl(52 個 CpG) NODAL-1 EF 5, - TTT TAG AAG GGA GTG AAT TGG -31 (SEQ ID NO: 3) NODAL-1 ER 51 - AAA AAA TAA AAA CTT CTA ATC TCC - 3' (SEQ ID NO: 4) NODAL-1 IF 5f - AGT ATT TTA GTA AAT TTT TTATTG - 3' (SE〇 ID NO: 5) NODAL-1 IR 5f - ATTAATATTACTATAATAATTTAATC - 3' (SE〇 IDNO: 6) NODAL 基因 CpG2(47 個 CpG) NODAL-2 EF 5, - TAA TTT TAT AAG ATT GGA GAT TAG - 3' (SEQ ID NO: 7) NODAL-2 ER 5' - TAG TAA AAC CCA AAA TAT AAA AAC - 31 (SEQ ID NO: 8) NODAL-2 IF 5, - TTT AAA TTA AAA TTT AGA GAT AAT GG _ 3, (SEQ ID NO: 9) NODAL-2 IR 5丨-ACT TTC AAA CCT AAC CAA CCC - 3,（SEQ ID NO: 10) LEFTY 1(B)(61 個 CpG) LEFTY1 EF Ί 5, - TAG TTTTTAAGG TTT AGG GTG TG - 3,（SEQ ID NO: 11) LEFTY1 ER — 5, - TAC TAA CCC TAC TCT TAT CCC - 3,（SEQ ID NO: 12) LEFTY1 IF 5f - AG TTT TAG TTG GGG TTT TTT AAG - 3' (SE〇 ID NO: 13) LEFTY1 IR 51 - TTA AAA ACC AAC ACA CAC CTA C - 3f (SEO ID NO: 14) LEFTY2iA¥66 個 CpG) LEFTY2 EF 5, - TAG TTT TTG AGG TTT AGG GTG TG - 31 (SEQ ID NO: 15) LEFTY2 ER 5! - TAT CTC CTA ACC TAA CTA CC - 31 (SEQ ID NO: 16) LEFTY2 IF 5’ - AG TTT TAG TTG GGG TTT TTT AAG · 3, (SEQ ID NO: 17) LEFTY2 IR 51 - CTC AAT AAC CCT ACC ATC CTC - 3' (SEO ID NO: 18) *EF/R=外部引子組；IF/r=内部引子組

以含有 PCR 緩衝液（Qiagen)、1.5 mM 之 MgCl2(Qiagen)、 2〇〇41^之(11<^?(111¥士(^611)、〇.32 0]\/1之各引子及11；之熱 啟動Taq Plus DNA聚合酶（Qiagen)之25 μΐ體積進行PCR。 PCR條件為：94〇C下歷時10 min、94〇C下歷時3 min、48〇C 123180.doc -65- 200815598 下歷時3 min、72°C下歷時2 min循環一次；94°C下歷時3 min、50°C下歷時3 min、72°C下歷時2 min循環五次及94°C 下歷時1 min、52°C下歷時1 min、72°C下歷時1 min循環35. 次用於第一反應，且相同退火溫度（48°C、50°C及52°C)用 於巢式反應。使用凝膠純化套組（Qiagen)純化擴增產物且 使用TOPO TA選殖套組（Invitrogen)使其與載體接合。對於 每一樣本使用載體之正向及反向引子來對二十四個陽性純 系進行定序。根據製造商說明書，使用‘DNA dRhodamine 終止子循環定序預備反應’套組（Applied Biosystems)及 ABI3730xl 序列器（Applied Biosystems)進行 DNA 定序反 應。 免疫墨點法 如先前 Hess等人，2001，Cawcer 61:3250-3255 中所 述來製備及量化蛋白質溶解產物。藉由在還原條件下進行 SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳來分離等量蛋白質，且將溶解蛋 白質轉移至Immobilon-P膜（Millipore Corp·，Bedford，MA) 上。將膜在 1% TBS、0.1% Tween 20(TBS-T)及 5%乾燥奶 粉或3%明膠中阻斷（用於Nodal西方墨點分析）。將墨點與 一次抗體（表2) —起培育，在TBS-T或含有0·5 M NaCl之 TBS-T中洗滌用於Nodal西方墨點分析，且與適當辣根過氧 化酶標記之二次抗體一起培育。由增強型化學發光（SuPer Signal ; Pierce，Rockford, IL)及暴露於自動放射線照相膠 片（Molecular Technologies，St Louis，MO)來摘測一次抗 體。偵測到Nodal蛋白質呈約48 kDa及約35 kDa之兩個主 123180.doc -66- 200815598 要帶，其分別表示前驅體及前Nodal。Nodal常呈現為多個 帶’此可能係歸因於蛋白質修飾的降解。 表2·用於西方墨點（WB)、免疫組織化學（IHC)及免疫螢光 (IF)分析之抗體

—__抗體 濃度及用途 公司 夕株山羊抗mNodal 2 pg/mL，IF 2 pg/mL，IHC R&D Systems，Minneapolis， MN 多株兔抗 NodalCH-110；) 1:500，WB Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA 多株山羊抗Lefty 1:500，WB 1:50，IF Santa Cruz Biotechnology, Santa Cmz，CA 單株小鼠抗Cripto 1 pg/mL，WB 10 pg/mL，IF R&D Systems, Minneapolis, MN 多株山羊抗Ki67 1:20，EHC Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz，CA 單株小鼠抗肌動蛋白 1:5000，WB Chemicon International， Temecula，CA

免疫螢先法 將細胞用4%三聚曱醛固定，用20 mM Hepes、0.5% TritonX-100製成可滲透的，且用無血清蛋白質阻斷液 (DAKO，Carpinteria，CA)阻斷。將一次抗體在抗體稀釋液 (DAKO)中稀釋至SI表2所述之濃度，且根據製造商建議使 用適當螢光染料結合之二次抗體。對於某些影像而言，用 DAPI(〇.l nig/mL ; Molecular Probes)將細胞核染色，且使 用共焦顯微法（Zeiss 510 META，Carl Zeiss Inc.)獲得影 像0 免疫組織化學法 福馬林固定、石蠟包埋之存檔組織係自患有原發性或轉 移性皮膚黑素瘤之患者（Loyola University Chicago，IL)獲 123180.doc -67- 200815598 得。在具有多種HRP/AEC偵測系統之HNS 710i自動免疫染 色器（Richard-Allan Scientific(RAS)，Kalamazoo，MI)上 進行免疫組織化學染色。在二曱苯中脫去石蠟、乙醇降解 及用檸檬酸鹽缓衝液抗原修復後，應用四個阻斷步驟： 0.03%過氧化氫、抗生蛋白及生物素阻斷（抗生蛋白/生物 素阻斷套組，Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA)及 無血清蛋白質阻斷。應用抗Nodal抗體（20 pg/mL，R&D Systems，Minneapolis，MN)歷時 90分鐘。將載片在 TBS-T 中沖洗，與經結合生物素之抗山羊IgG(2 pg/ml，Vector Labs)—起培育，用TBS-T洗滌且與抗生蛋白鏈菌素過氧化 酶試劑一起培育15分鐘。用AEC(紅色）受質（RAS)產生顏色 且用邁爾蘇木素對比染色。將樣本在試劑級醇中脫水且用 永久封固劑蓋上蓋玻片。用同型匹配且以與Nodal抗體相 同之濃度使用之ChromPure山羊IgG(Jackson Labs)進行陰 性對照反應。如先前所述在乳癌進展TMA(CBL-TMA-029 ; Creative Biollabs，Port Jefferson Station，NY)中對 Nodal進行免疫組織化學染色。Topczewska等人，2006。 如先前所述，將來自正位腫瘤模型之組織以福馬林固定且 以石蠟包埋，且使用Ki67特異性抗體（表2)或ChromPure山 羊IgG(Jackson Labs)在此組織上進行免疫組織化學染色。 Topczewska等人，2006。根據說明書（Upstate)進行 TUNEL 檢定以量測細胞凋亡。 應瞭解，上述揭示内容著重於本發明之某些特定實施例 且該等特定實施例之所有修改或等效替代物在隨附申請專 123180.doc -68 - 200815598 利範圍所陳述之本發明之精神及範疇内。本發明之各個實 施例之特定態樣之組合包括於本發明之範疇内。本文任何 地方所涉及之所有專利、專利申請案及其他科學或技術文 案皆以引用的方式全部併入本文中。 【圖式簡單說明】 圖1展示示範利用人類胚胎幹細胞微環境以抑制腫瘤細 胞侵襲之實驗方法流程圖。 圖2展示人類胚胎幹細胞之微環境誘導黑素瘤細胞橢球 體形成。（A-G)相差顯微法展示與由H1(B)及HSF-6(C)人類 胚胎幹細胞（hESC)在3-D Matrigel基質上形成群落相比， C8161無黑色素、人類轉移性皮膚黑素瘤細胞在3-D Matrigel基質（A)上之融合生長；將hESC自其3-D基質移除 (留下裸露預調節基質CMTX，插圖所示）之後，將C8161腫 瘤細胞接種於H1(D、E)及HSF-6(F)hESC預調節基質 CMTX(Matrigel)上，現形成類似於hESC群落之橢球體（D-F)。（"A”中之長條等於200 μηι)。相反，暴露於經H1細胞 調節之培養基之C8 161細胞不能形成橢球體（G)。 圖3展示暴露於人類胚胎幹細胞之微環境之人類轉移性 皮膚黑素瘤細胞之後生變化。（Α)對於黑素細胞榡記 Melan-A而言，全細胞溶解產物（每個樣本所負載之蛋白質 量相等）之西方墨點分析展示其不存在於Matrigel上之hi hESC及Matrigel上之C8161腫瘤細胞中；且與Matrigel上之 對照人類表皮黑素細胞（HEMn)中之Melan-A相比，誘導暴 露於HI hESC預調節基質CMTX(Matrigel)之C8161細胞中 123180.doc -69- 200815598 之Melan-A(晝面上方）。（B)與Matdgel上之C8161細胞相 比，與暴露於HEMN預調節基質CMTX(Matrigel)之C8161 細胞相比，在Matrigel上培養之HEMn中之Melan-A基因表 現的半定量RT-PCR分析。CMTX色帶充當對照，其證明在 接種C8161黑素瘤細胞之前HEMn細胞自預調節基質完全移 除。GAPDH用作RNA之負載對照（晝面下方）。（C)證明由 人類黑素細胞預調節之膠原蛋白I 3-D基質（HEMnl 8或 HEMn20 CMTX)並不改變所測試之基因表現的半定量RT-PCR分析。其指示良性黑素細胞微環境並不後生性地影響 轉移性黑素瘤細胞以改變其成形分子表型。 圖4展示人類胚胎幹細胞之微環境降低黑素瘤細胞侵襲 及腫瘤形成。（A)在未調節Matrigel(對照）或由H1或HSF-6 hESC預調節之Matrigel上培養後C8 161細胞之侵襲係以使 用MICS(膜侵襲培養系統）檢定在24小時時段内能侵襲穿過 確定基質（膠原蛋白IV、昆布胺酸及明膠）塗覆之膜的細胞 之百分數來計算。長條表示平均、標準化、侵襲指數土標 準差。由星號（*)指示之值顯著不同於對照細胞之侵襲指 數。（B)用預暴露於對照基質（Matrigel)或由hESC調節之基 質（H9 CMTX)歷時3天之C8161細胞注射之小鼠中之活體内 腫瘤形成（n=21)。值表示中值腫瘤體積（mm3)土四分位差， 且在由星號（*)指示之時間點處之腫瘤體積顯著不同 (尸<0.05)。 圖5展示hESC、侵襲性腫瘤細胞及正常人類細胞中之 Nodal、Lefty及Cripto的差異表現。（A)以下細胞中之 123180.doc -70- 200815598

Nodal、Lefty及Cripto的西方墨點分析：HI及H9，人類胚 胎幹細胞（hESC)株；C8161，人類轉移性黑素瘤細胞；正 常人類黑素細胞；MDA-MB-23 1，人類轉移性乳癌細胞； Hs 578 Bst，正常人類肌上皮細胞；及HMEpC，正常人類 乳腺上皮細胞。肌動蛋白係用作負載對照。（B)以下細胞 中之mRNA表現的即時RT-PCR分析：H9，人類胚 胎幹細胞（hESC) ; C8161，人類轉移性黑素瘤細胞；正常 人類黑素細胞；MDA-MB-23 1，人類轉移性乳癌細胞；Hs 578 Bst，正常人類肌上皮細胞；HMEpC，正常人類乳腺 上皮細胞；GM00473及GM00957A，源自人類羊水之幹細 胞；SC00125，源自人類臍帶之幹細胞；人類成人間葉幹 細胞（MSC);及HTR-8/SVneo，永生化人類細胞滋養層細 胞。（C)100%之 H9 hESC 中及 C8161黑素瘤及 MDA-MB-231 乳癌細胞之小亞群中之Cripto的免疫螢光定位。長條等於 1 0 μπι。（D)以下細胞中之Nodal、Lefty及Cripto的西方墨 點分析：H9，hESC ; GM00473及GM00957A，源自人類羊 水之幹細胞；SC00125，源自人類臍帶之幹細胞；人類成 人間葉幹細胞（MSC);及HTR-8/SVneo，永生化人類細胞 滋養層細胞。肌動蛋白係用作負載對照。 圖6展示原發性及轉移性黑素瘤病變中之Nodal表現之圖 案。圖6(A-F)展示（A)正常皮膚、（B-D)原發性皮膚黑素瘤 及（E及F)皮膚黑素瘤轉移中之Nodal染色的免疫組織化學 分析。箭頭描繪（A)正常黑素細胞及（F)定位於黑素瘤細胞 膜之Nodal蛋白質。（C)及（D)分別表示輻射狀生長期及垂直 123180.doc -71 · 200815598 生長期。圖6(A-D)代表5個患者樣本且圖6(E-F)代表10個患 者樣本。同型對照在插圖中描繪，且長條等於5 0 。 圖7展示乳癌中之Nodal表現之圖案。正常乳房組織、乳 腺管原位癌（DCIS)、侵襲性乳腺管癌（IDC)及轉移性IDC中 之Nodal染色的免疫組織化學分析。長條等於1〇〇 μπι。 圖8展示在Matrigel上所培養之hESC上Nodal及Lefty的分 布。在Matrigel上所培養之H9 hESC中之Lefty及Nodal的免 疫螢光定位及由hESC所調節之基質（H9 CMTX)中之Lefty 蛋白質的西方墨點分析。畫面頂部表示描繪具有其下伏基 質之hESC群落之橫截面的重建共焦影像。虛線表示細胞-基質界面且箭頭指向hESC群落之上表面。右邊之相應影 像說明細胞表面（箭頭）及細胞-基質界面（虛線）處之Lefty及 Nodal。大影像為用Lefty及Nodal染色之hESC群落之三維 共焦投影（插圖）。長條等於25 μηι。 圖9展示人類胚胎幹細胞（hESC)之微環境使暴露於胚胎 預調節基質之成形轉移性黑素瘤及乳癌細胞中之Nodal表 現及致瘤性降低。（A)證明hESC之微環境使多能黑素瘤 (C8161)及乳癌（MDA-MB-231)細胞中之Nodal蛋白質表現 減少的西方墨點分析。（B)暴露於對照（未調節）Matrigel或 暴露於由hESC調節之Matrigel(H9 CMTX)歷時3天之人類轉 移性黑素瘤細胞（C8161)及人類轉移性乳癌細胞（MDA-MB-231)中之Nodal蛋白質的西方墨點分析。隨後，在西方墨 點分析之前使一些暴露於H9 CMTX之癌細胞在對照（未調 節）Matrigel上復原歷時2或7天。肌動蛋白係用作負載對 123180.doc -72- 200815598 照。（C)暴露於對照（未調節）Matrigel或暴露於由hESC調節 之Matrigel(H9 CMTX：)歷時3天之人類轉移性黑素瘤細胞 (C8161)及人類轉移性乳癌細胞（MDA-MB-231)中之iWW mRNA的即時RT-PCR分析。隨後，在分析之前使一些暴露 於H9 CMTX之癌細胞在對照（未調節）Matrigel上復原歷時2 或7天。（D)第19天在裸鼠中形成腫瘤之C8 161細胞中Nodal 的免疫組織化學定位。與暴露於H9 CMTX之C8161細胞中 Nodal染色減少（與較低腫瘤負荷相關聯）相比，Matrigel對 照注射之腫瘤細胞中Nodal染色最強。（長條等於50 μιη。）(E)在軟瓊脂上培養14天、接著暴露於對照（未調 節）Matrigel或暴露於H9 CMTX歷時3天之C8161及MDA-MB-231細胞的相對群落形成。在存在或不存在rNodal(100 ng/mL)的情況下進行檢定。長條表示平均標準化群落形成 ±標準差。由星號（*)指示之值顯著不同於對照細胞之群落 形成能力且由雙星號（**)指示之值顯著不同於對照細胞及 經H9 CMTX處理之細胞的群落形成能力（η=12，Ρ<0·05)。 (F)暴露於對照（未調節）Matdgel或暴露於由正常黑素細胞 調節之Matrigel(黑素細胞CMTX)、由正常肌上皮細胞調節 之Matrigel(Hs 578 Bst CMTX)、由源自羊水之幹細胞調節 之Matrigel(GM00473/GM00957A CMTX)或由滋養層細胞調 節之Matrigel(HTR-8/SVneo CMTX)歷時3天之人類轉移性 黑素瘤細胞（C8161)及人類轉移性乳癌細胞（MDA_MB-231) 中之Nodal蛋白質的西方墨點分析。肌動蛋白係用作負載 對照。（G)暴露於對照（未調節）Matrigel或暴露於由源自羊 123180.doc -73- 200815598 水之幹細胞調節之Matrigel(GM 00473/GM 00957A CMTX) 或由滋養層細胞調節之Matrigel(HTR-8/SVneo CMTX)歷時 3天之人類轉移性黑素瘤細胞（C8161)中之mRNA的 即時RT-PCR分析。使用18s標準化基因量且長條表示標準 化成H9(A、B)或Matrigel(C、D)值之平均基因表現。 圖10展示源自hESC之Lefty在Nodal向下調節中的作用。 (A)hESC調節基質（CMTX)内Nodal抑制劑Lefty充足。Lefty 蛋白質不存在於C8161細胞自身調節基質（C8161 +CMTX) 内之C8161細胞中。（B)Matrigel上之H9 hESC群落中FITC 結合之抗Lefty嗎啉基（MOLEFTY)的免疫螢光定位。（C)經媒 劑（對照）、MO對照（MO對照）或MOLefty(MO Lefty)處理之H9 hESC中之Lefty蛋白質的西方墨點分析。肌動蛋白係用作 負載對照。（D)經媒劑（H9)、MO對照（MO對照）或MOLefty(MO Lefty)處理之H9 hESC中之及表現的即時RT-PCR分析。使用18s標準化基因量且長條表示標準化成H9 之平均基因表現。（E)在對照（未調節）Matrige卜由hESC調 節之Matrigel(H9 CMTX)或由Lefty蛋白質表現經Lefty特異 性嗎啉基剔除之hESC調節之Matrigel(H9 CMTX MO Lefty) 上培養3天之C8161細胞中之心/ mRNA表現的即時RT-PCR分析。（F)暴露於對照（未調節）Matrigel或暴露於接種 有自hESC純化之Lefty蛋白質（源自H9之Lefty)之Matrigel歷 時3天之人類轉移性黑素瘤（C8161)及乳癌（MDA-MB-231) 細胞中之Nodal蛋白質的西方墨點分析。分析前使MDA-MB-231細胞在新鮮Matrigel上復原歷時2天且肌動蛋白係 123180.doc -74- 200815598 用作負載對照。（G)在存在或不存在rNodal(l〇〇 ng/mL)的 情況下，在軟瓊脂上培養14天、接著暴露於對照Matrigel 或接種有自hESC純化之Lefty(Lefty)之Matrigel歷時3天之 C8161及MDA-MB-231細胞的相對群落形成。長條表示平 均標準化群落形成土標準差。由星號（*)指示之值顯著不同 於對照細胞之群落形成能力〇=6，P<0.05)。 圖11展示由重組Lefty向下調節Nodal。暴露於不同濃度 (0-1000 ng/mL)之[1^!^-3歷時48小時之〇8161細胞中之 Nodal蛋白質的西方墨點分析，其展示添加rLefty至C8 161 細胞中減少Nodal表現。 圖12展示源自hESC之Lefty經糖基化。在含有重組 Lefty(rLefty)-B、rLefty-A及來自H9人類胚胎幹細胞 (hESC)加上由H9 hESC調節之基質（CMTX)之溶解產物的西 方墨點上歷時3天，對醣蛋白進行染色且偵測Lefty-A及 Lefty-B。SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳後，將蛋白質轉潰且 對醣蛋白進行染色，由綠色帶所鑑別（底部）。隨後由西方 墨點分析偵測Lefty· A及Lefty-B(頂部）。箭頭指向西方墨點 上之Lefty蛋白質且指向展示經染色醣蛋白之影像上之相同 位置。 圖13展示Nodal抑制及hESC之微環境終止活體内致瘤 性。（A)以預暴露於對照基質（Matrigel)或由hESC調節之基 質（H9 CMTX)歷時3天之MDA-MB-231細胞注射之小鼠中 之活體内腫瘤形成〇=10)、(B)經空載體或Nodal表現構築 體轉染之C8 1-61細胞注射之小鼠中之活體内腫瘤形成 123180.doc -75- 200815598 0=5)及（C)經MO對照或MONodal處理之MDA-MB-231細胞注 射之小鼠中之活體内腫瘤形成h=l〇)。值表示平均腫瘤體 積（mm3)=t標準誤差（A)或標準差（B、C)，且在由星號（*)指 示之時間點處腫瘤體積顯著不同（尸<0.05)。（D)由對Ki67之 免疫組織化學染色及末端脫氧核苷酸轉移酶生物素-dUTP 切口端標記（TUNEL)測定之源自C8161及MDA-MB-231之 腫瘤的腫瘤細胞增殖與細胞凋亡比。注射至小鼠前，將 C8161及MDA-MB-231細胞在對照基質或hESC調節之基質 (H9 CMTX)上培養3天或經MONQdal處理以敲除Nodal表現。 長條表示平均標準化值±標準差，且由星號（*)指示之值顯 著不同於對照值（Ρ<0·05)。（E)正位黑素瘤（C8161)及乳癌 (MDA-MB-231)腫瘤中之Ki67表現之免疫組織化學分析（紅 色/棕色）及TUNEL染色。注射至小鼠前，將細胞用MON°dal 處理，暴露於H9 hESC CMTX，或未加以處理（對照）。由 Ki67染色指示增殖，且用共焦顯微法根據定位於凋亡 C8161或MDA-MB-231細胞之細胞核上的紅色染色來偵測 >周亡細胞核。對於TUNEL分析而言，用DAPI對細胞核進 行對比染色。長條等於25 μιη 〇 (F)經MO對照或MONodal處理 之C8161及MDA-MB-231細胞的活體外增殖。值表示塗佈 15,000個細胞後4天，平均細胞計數（χΙΟΟΟμ標準差。星號 (*)指示對照與經MON°dal處理之細胞之間的顯著差異 (π=4，Ρ<〇·〇5) 0 圖14展示Nodal抑制終止黑素瘤致瘤性。（Α)在軟瓊脂檢 定中培養7天之細胞的相差顯微法。晝面表示弱侵襲性 123180.doc -76- 200815598 C81-61細胞、侵襲性C8161細胞、經MONc)dal處理之C8161 細胞及經MONc)dai處理且經重組N〇dal(100 ng/rnL)救助之 C8 161細胞的群落形成能力。長條等於20 μιη。（B)在用經 ΜΟ對·照或MONodai處理之C8161細胞注射之小鼠中之活體内 腫瘤形成。值表示中值腫瘤體積（mm3)士四分位差，且在由 星號（*)指示之時間點處MO對照與MON()dal腫瘤體積顯著不同 (n=5，p<0.05)。（C)源自經MON()dal處理之C8161細胞之正 位腫瘤中之Nodal染色的免疫組織化學分析。直至注射後 17天，C8161細胞已開始再表現Nodal。長條等於50 μιη。 (MON()dai = Nodal之反義嗎淋基）。（D)與經模擬物轉染之 C81-61對照相比，經NodalcDNA轉染之C81-61弱侵襲性黑 素瘤細胞致瘤潛力之獲得·值報導為3 8天後之中值腫瘤體 積土標準差（*ρ<0·05，n=5/參數）。

圖15展示向下調節Nodal信號轉導引起類黑素細胞表型 之獲得及反分化成形表型之缺失。（A)投與媒劑或ALK 4/5/7抑制劑（SB431542，1 μΜ，10 μΜ)後 48 小時 C8161 細 胞中之Nodal、磷酸化SMAD-2、總SMAD 2/3及肌動蛋白 的西方墨點分析。（A、B)所有Nodal帶表示前體蛋白。（B) 投與媒劑或不同濃度之ALK抑制劑後24小時C8 161細胞中 之Nodal、酷胺酸酶及肌動蛋白的西方墨點分析，而（◦)為 在媒劑或不同濃度之ALK抑制劑存在下在3-d膠原蛋白ϊ* 質上培養6天之C8161細胞中之VE_鈣黏附蛋白、角蛋白18 及肌動蛋白的西方分析。（D)侵襲能力下降，及（E)用alk 4/5/7抑制劑向下調節Nodal後終止血管生成模擬。 123180.doc -77- 200815598 圖16展示Nodal與Notch之間的分子串話。（A) jN〇tch siRNA、尤其Notch 4 siRNA敵除C8161細胞中之Nodal表 現。投與siRNA後72小時C8161細胞之西方墨點分析。即 時RT-PCR及西方墨點分析證實在此時間點各Notch靜默。 (B)Notch表現相對不受敲除C8161細胞中之Nodal所影響。 經Nodal抑制劑SB431542處理之C8 161細胞中之Notch 1、2 及4的西方墨點分析。 圖17展示將侵襲性C8161人類黑素瘤細胞暴露於由hESC 調節之基質誘導而/啟動子中前半部分CpG島中之特定 胞嘧啶殘基（CpG殘基6-17)的甲基化增加。圖描繪在 Matrigel上或在由H9 hESC調節之Matrigel上培養之侵襲性 C8 161人類皮膚黑素瘤細胞中前半部分Nodal CpG島的曱基 化狀態。每個圓表示CpG島中之CpG二核苷酸。黑色及灰 色圓分別表示經甲基化及未經甲基化之殘基。每一列表示 個別純系或等位基因。儘管在hESC微環境（H9 CMTX)存在 下培養使曱基化全面增加僅6.8%，但當將細胞在H9 CMTX上培養時，與在單獨Matrigel上培養相比，陰影區 域之曱基化增加32%。 123180.doc 78- 序列表 200815598 <110>美國芝加哥兒童紀念醫院 <120>使用人類胚胎幹細胞之微環境抑制腫瘤細胞侵襲之方法 <130> 06-399-d <140〉 096127677 <141> 2007-07-27 <150〉 60/820,740 <151> 2006-07-28 <150〉60/941,343 <151〉 2007-06-01 <160〉 22 <170> Patentln version 3.3

<2i0> 1 <211> 17 <212> DNA <213〉人工序列 <223〉合成序列 <400> 1 ccgcgctggg tgcccag <210> 2 <211〉 18 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成序列 <220〉 <221> misc_feature <222〉 (6).. (7) <223〉N可為任何核苷酸 <220> <221> misc_feature <223> <220> <221> misc_feature <222> (15).,(15) <223〉N苛爲任倾亥苷酸 <400〉 2 ccgcgnnggg ngccncag <210〉 3 <21i> 21 <212〉 DMA <213〉人工序列 <220〉Λ _ r <223〉合成序列 <400> 3 ttttagaagg gagtgaattg g 123180.doc 200815598 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213〉人工序列 <223〉合成序列 <400> 4 aaaaaataaa aacttctaat ctcc <210> 5 <21i> 24 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成序列 <400〉 5 agtattttag taaatttttt attg

<210> 6 <211〉 26 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成序列 <400> 6 attaatatta ctataataat ttaatc <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成序列 <400> 7 taattttata agattggaga ttag <210> 8 <211〉 24 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成序列 <400> 8 tactaaaacc caaaatataa aaac <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成序列 <400> 9 tttaaattaa aatttagaga taatgg

<210〉 10 <211〉 21 <2I2> DNA 123180.doc 200815598 <213〉人工序列 <220> <223〉合成序列 <400〉 10 actttcaaac ctaaccaacc c <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <220> _ <223〉合成序列 <400> 11 tagtttttaa ggtttagggt gtg

<210> 12 <211〉 21 <212> DNA <213〉人工序列 <22〇> <223〉合成序列 <400> 12 tactaaccct actcttatcc c <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成序列 <400> 13 agttttagtt ggggtttttt aag <210〉 14 <211〉 22 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成序列 <400> 14 ttaaaaacca acacacacct ac <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213〉人土序列 <220> <223〉合成序列 <400> 15 tagtttttga ggtttagggt gtg <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列 123180.doc <220〉 200815598 <223〉合成序列 <400> 16 tatctcctaa cctaactacc <210> 17 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成序列 <400> 17 agttttagtt ggggtttttt aag <210> 18 <211〉 21 <2I2> DNA <213〉人工序列 <220〉

<223〉合成序列 <400〉 18 ctcaataacc ctaccatcct c <210> 19 <2I1> 25 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成序列 <400> 19 cctcttacct cagttacaat ttata <210> 20 <211〉 25 <212〉 DNA <213〉人工序列 <223〉合成序列 <400> 20 aagcagcacc tccagccctt atatc <210> 21 <211〉 21 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成序列 <400> 21 gccacatggt gctgccctgg g <2I0> 22 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <220> a子™ <223〉合成序列 <400> 22 I23180.doc 200815598 ctgcatggtg ctgccctgga gga

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Claims (1)

1. 200815598 十、申請專利範圍： 1. 一種組合物’其包含一或多種來自人類胚胎幹細胞之微 環境之分離因子。 2·如凊求項1之組合物，其中該或該等分離因子抑制 Nodal 〇 3 ·如明求項1之組合物，其中至少一種因子為。 4· 一種分離之Lefty蛋白質，其係藉由使用人類胚胎幹細胞 調節一種基質而產生。 5· 一種蛋白質，其包含糖基化Lefty或其片段或衍生物。 月求項5之蛋白質，其中該糖基化係自人類胚胎 幹細胞之微環境分離。 7· 一種組合物，其包含如請求項5之蛋白質。 • 種如％求項7之組合物之用途，其係用於製造抑制哺 乳動物中之腫瘤細胞生長之藥劑。 9·如"月求項8之用途，其中該藥劑之劑量在0·1 rig/mL與200 ng/mL之間。 1〇·或夕種來自人類胚胎幹細胞之微環境之因子的用途， /、係用於製造抑制腫瘤細胞侵襲之藥劑。 11·如請求項10之用途，其中該等因子中之至少一者為 Nodal活性抑制劑。 Η·如請求項11之用途，其中該Nodal活性抑制劑為Lefty。 13·如％求項u之用途，其中活性抑制劑為糖基化 Lefty 〇 14·如明求項11之用途，其中該抑制劑增加細胞凋亡且減少 123180.doc 200815598 細胞增殖。 1 5 · —種Nodal活性抑制劑之用冷 』^之用攻，其係用於製造抑制體内 存在至少一種腫瘤細胞之喃詞執 商孔動物中腫瘤細胞生長及/或 治療該哺乳動物中侵襲性腫瘤的藥劑。 16_如請求項15之用途，直中嗜永 T通抑制劑阻斷Nodal與受體之 結合。 17 ·如請求項1 5之用途，豆中兮知 八干及抑制劑為一或多種來自人類 胚胎幹細胞之微環境之分離因子。 1 8·如請求項15之用途，苴中哕永 ，、T篇抑制劑為糖基化Lefty。 19 ·如請求項1 6之用途，1中与Γ 3 ，、甲該抑制劑為抗體。 20·如請求項15之用途，苴φ诗 八中該抑制劑阻斷Nodal蛋白之表 現。 21.如清求項15之用途，直φ兮々 〃中5亥抑制劑為活化素樣（activity like)激酶受體抑制劑。 22·如请求項21之用途，其中兮 、T，舌化素樣激酶受體抑制劑為 ALK 4/5/7抑制劑。 23_如睛求項22之用途，苴中兮八了 一甲 μ ALK 4/5/7抑制劑為 SB431 542。 24·如請求項15之用途，盆中 2 5 ·如請求項2 0之用途 26·如請求項25之用途 琳基（Morpholino)。 27·如請求項15之用途 28·如請求項15之用途 29·如請求項15之用途 八中"亥抑制劑為Cripto抑制劑。 其中該抑制劑為反義寡核苷酸。 八中該反義寡核普酸為抗Nodal嗎 其中該抑制劑為Lefty。 其中該抑制劑為重組Lefty。 & +該抑制劑為糖基化Lefty 123180.doc 200815598 30·如請求項2〇之用途，其中 31·如請求項30之用途， siRNA。 "亥抑制劑為Notch抑制劑 其中該KTotch抑制劑為 Notch 32.如請求項3G之用途’其中該抑制劑㈣痛抑制劑。 月A員用途，其中該抑制劑為N〇⑽4 8觀八。 认如請求項15之用途，其中該抑制劑係源自人類胚胎幹細 胞之微環境。 35· -種已與人類胚胎幹細胞接觸之預調節微環境之用途， 其係用於製造抑制體内存在至少—種腫瘤細胞之哺乳動 物中腫瘤細胞生長的藥劑。 種偵測彳文襲性腫瘤細胞之方法，其包含以下步驟： &•自患者獲得樣本； b.對5亥樣本檢定Nodal及Lefty的存在；及 C•若該樣本中存在Nodal且不存在Lefty，則偵測侵襲性 腫瘤細胞。 37·如請求項36之方法，其中檢定N〇dali存在及之不 存在包含一種基於核酸之檢定。 3 8·如凊求項36之方法，其中檢定Nodal之存在及Lefty之不 存在包含一種基於蛋白質之檢定。 3 9 · —種鑑別用於治療侵襲性腫瘤之化合物之方法，其包 含： a·提供多數表現Nodal之細胞； b·在候選化合物存在及不存在下對該等細胞檢定Nodal 活性；及 123180.doc 200815598 Λ /Nodal活性在該候選化合物存在下比該候選化合 物不存在下小’則該化合物鑑別為可用於治療侵襲性 腫瘤之化合物。 4〇·:種用於監測醫藥組合物作為治療患者之侵襲性腫瘤之 蕖蜊之啕效性的方法，其包含以下步驟： a•自患者獲得樣本； b·對該樣本檢定N〇dai的存在； c.將一定量醫藥組合物投予該患者； d_對Ik後自该患者收集之樣本重複步驟（b)及（c);及 e·將步驟（a)之該樣本中所偵測之N〇dai量與步驟（幻之該 等樣本中所偵測之Nodal量比較，其中該醫藥組合物 之有效性係藉由偵測該等隨後收集之樣本與步驟（^所 取之該樣本相比Nodal量的變化來監測。 41 · 一種用於偵測侵襲性腫瘤細胞之存在之方法，其包含以 下步驟： a ·自患者獲得腫瘤細胞之樣本； b·在該等腫瘤細胞中進行Nodal CpG島之基於序列之曱 基化分析； c.比較該等腫瘤細胞中與非侵襲性或非腫瘤細胞中 Nodal CpG島之甲基化程度； d·使Nodal之過曱基化與侵襲性腫瘤細胞的存在相關 聯。 42. —種用於偵測哺乳動物中具有反分化、多能成形 (plastic)表型之細胞存在的方法，其包含以下步驟： 123180.doc 200815598 a. 自哺乳動物獲得樣本， b. 對該樣本檢定Nodal的存在； c. 使Nodal的存在與具有反分化、多能成形表型之細胞 的存在相關聯。 43. 如請求項42之方法，其中該樣本為體液。 44. 如請求項43之方法，其中該體液為血清。

   123180.doc 200815598 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（1)圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： (無元件符號說明） 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無）

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