TW200803897A

TW200803897A - Hepatic fibrosis inhibitor

Info

Publication number: TW200803897A
Application number: TW095136225A
Authority: TW
Inventors: Hiroyuki Yoneyama
Original assignee: Stelic Inst Of Regenerative Medicine Stelic Inst & Co
Priority date: 2005-10-27
Filing date: 2006-09-29
Publication date: 2008-01-16
Also published as: JPWO2007049424A1; WO2007049361A1; US20090060892A1; WO2007049424A1; EP1941906A1; EP1941906A4

Description

200803897 4 参九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於肝纖維化抑制劑、肝纖維化之抑制方法，及基於該方法之肝纖維化病症的治療或預防方法。【先前技術】肝臟之慢性纖維化病症為會在肝臟發病之慢性發炎狀悲的終末像的總稱，伴隨著組織的過度纖維化。肝臟之慢性纖維化病症，為經過進行性的肝臟功能衰竭而多數最後 •會致死的嚴重病症群，但是，到目前尚未存在決定性的治 ,療方法。目前對於肝硬變症係以肝臟移殖進行治療，但是該等治療方法不但對於患者的生活品質（Q〇L，quaUty Μ 11 ie)有顯著的妨害，而且許多案例中，已經移殖的臟器會再度陷入纖維化。最近，期待TGF—《抑制劑或血管升壓素 (angiotensin)抑制劑等成為對抗纖維化病症之新治療劑，但是其有效性並未被確立。因此，熱切地期待有能提高患者Q0L，使肝纖維化之進行有效阻止或延遲之新的藥胃劑開發。現在，就肝纖維化病症之候選治療藥而言，被期待的有：抑制慢性發炎的副腎皮質類固醇、秋水仙素 (colchicine)、IL—10等；使纖維芽細胞活化之TGF-p抑制劑、HGF(抑制TGF -/3之作用）、内絲胺酸（end〇serine) 抑制劑、血管升壓素抑制劑等，·除去膠原蛋白之(基質金屬蛋白酶，matrix metal l〇proteinsase);等，但皆未到達治療方法之確立（非專利文獻丨[最新總說]，及非專利文

2125-8362-PF 5 200803897 獻2及3)。蛋白多糖（PG)’係在稱為核蛋白的蛋白質上，具有以共價鍵結1條以上糖胺聚多糖（GAG)鏈之構造的分子。GAG 鍵之特異構造可認為是負責PG之多樣功能。PG基於GAG 鏈之種類’大致分為4類：硫酸軟骨素（ch〇ndr〇itin sul fate)蛋白多糖（CSPG)、硫酸皮膚素（dermatan sul f ate) 蛋白夕糖（DSPG)、&酉夂乙醯肝素（heparin sulfate)蛋白鲁多糖（HSPG)及硫酸角質素（ker討in sulfate)蛋白多糖 (KSPG)(非專利文獻4及5[總說])。尤其，HspG會與多樣的細胞素（cytokine)、化學素（chem〇kine)結合，並將其功能大幅地修飾，故被研究地多。

另一方面，關於硫酸軟骨素蛋白多糖（CSPG)，為胎生期必要的分子，已知在各臟器存在量多，但是隨著出生、成長、老化而緩慢地減少。但是令人驚訝的是其特性的多樣化，CSPG於活體内之功能尚未被解明。另一方面，關於 _CSPG，有於肝硬變或肺纖維病症等之病變臟器中增加的報告（非專利文獻6及7)。但是，但是該等病症之中⑵…增加的意義完全未解明。近年來，由於已瞭解基因上欠缺cspG 之小鼠會有胎生致死或器官形成不全的情形，因此，對於 CSPG為活體必要分子的認識增強。軟骨素酶，已知為具有將硫酸軟骨素（硫酸軟骨素蛋白多糖）分解之活性的細菌性酵素。使用軟骨素酶之治療藥，已知例如：使用軟骨素酶之椎間盤脫出之治療藥（專利文獻 Π'軟骨素酶AC或軟骨素酶傷治瘡促進藥（專利文獻

2125-8362-PF 6 200803897 2)、使用軟骨素酶AC或軟骨素酶B之強皮症、乾癣、疤痕增長症（Keloid)及肺纖維症之治療藥（專利文獻3)等。專利文獻1:美國專利第6, 001，630號說明書專利文獻2:美國專利第5, 9 97, 863號說明書專利文獻3:國際公開第2001 /039795號小冊非專利文獻 l:Betaller R & Brenner DA，J. Clin. Invest. (2005) 115:209-218 非專利文獻 2:Iredale JP，BMJ(2004)327:143-147 _ 非專利文獻 3 : Bi sse 11 DM, Exp. Mo 1 · Med· (2001 ) 33:1 79-1 90 非專利文獻 4:Lin X， Development(2004) 1 31 : 6009-6021 非專利文獻 5:HackerUetal· Nature Rev. Cell Biol (2005)6:530-541 非專利文獻 6:Kovalski I et al.，〇rv Hetil (1993) ^134:p.2019-2026 非專利文獻 7 : Wes ter gren-Thors son Get al.，J Clin Invest. (1993) 92:p· 632-637 【發明内容】 [發明之揭示] 本發明目的之一為提供對於肝纖維化病症之治療或預防有用之能抑制肝組織中纖維化的藥劑、及以·該藥劑為有效成分的肝纖維化病症之治療劑，及肝纖維化抑制劑之篩選方法。 $

2125-8362-PF 7 200803897 本發明者等為了開發像這種藥劑，再三地研究，考慮 7為止未視為肝纖維化病症之病因的硫酸軟骨素蛋白多糖⑽PG)的過度堆積，可能會促進肝組織之纖維化。本發明者等基於此考量淮^千仰〒里進仃研究，結果發現藉由為硫酸軟骨素蛋白多糖分解酵素之趟皆 . 素 (chondri t inase)ABC 能將堆積於纖維化肝的CSPr古4、方，有效率地分解，並藉由體内（in vivo) 投予軟骨素酶ABC，铁紙μ # ^ b多句員者地抑制肝組織的纖維化。再者，猎由投予具有蔣氣有將為硫酸軟骨素蛋白多糖之一種的 versican的核蛋白

• 辦之功犯的稱為ADAMTS-4( A

disintegrin anH metalloproteinase with thrombospondin mn十w ^ 樣的治療效果。：Π白質的咖白多糖之堆積或生人：了藉由抑制硫酸軟骨素蛋 [1]:種肝纖維化抑制劑，含有抑制硫酸軟骨素蛋白多糖產生或堆積之物質作為有效成分。蛋白夕糖產 [2 ]如[1 ]之樂劑，f v ^ “中，該物質為具有硫酸軟骨辛蛋白夕糖分解促進作用之物質。月I蛋白多 [3 ] 如[1 ]之藥齋丨， . ，、中，該物質為具有硫酸軟骨辛蛋白夕糠合成抑制作用之物質。 a I蛋白多 [4]如[1]之藥劑， ”中’該物質為且有疏酸軟骨夸糖脫硫酸化作用之物質。人月素蛋白多 [5 ]如[1 ]之藥劑，其中，該物質為且有硫酸軟骨去糖硫酸化抑制作用之物，八素蛋白多 [6 ]如[1 ]至[5 ]中 _ 一項之樂劑，其中，係抑制在肝中硫

2125-8362-PF 8 200803897 酸軟骨素蛋白多糖之產生或堆積。 [7]如[1]至[6]中任—項之藥劑，其中，係、病症之治療或預防。 ’、於肝纖維化 ⑻如m之藥劑，其中，該肝纖維化病 [9 ]如[7 ]之藥叫，甘士又〖生肝病症。纖維症、肝硬變肝二，該肝纖維化病症為慢性^ 1叉欠、肝衮竭，或肝癌。 ⑽-種㈣維化抑制劑之篩選方法試樣中，選擇I右女^ + /、知徵在於··從受試 t擇具有抑制硫酸軟骨素蛋作用的物質。夕糖之產生或堆積 [11] 如[10]之篩選方法，其中，之中任-項作用之物質的步驟：〜擇具有以下⑷〜⑷ ⑷硫酸軟骨素蛋白多糖之分解促進作用 (b)硫酸軟骨素蛋白多糖之合成抑制作用 (C)硫酸軟骨素蛋白多糖之脫硫酸化作用 ⑷疏酸軟骨素蛋白多糖之硫酸化抑制作用 [12] 如[10]或[u]之篩選方法，其係用於肝纖維化病症之治療或預防〃纖維化抑制劑又’本發明包含以下· [13] 種肝纖維化抑制劑，含有赴# 4 分。有車人月素酶ABC作為有效成 [广 14]如上述[13]之肝纖維化抑制劑，其中，係於慢性肝病症之治療用或預防用。〖生肝病 [15]如上述[14]之肝纖維化抑症為肝硬變。制d，其中，上述慢性肝病

2125-8362-PF 200803897 [16]如上述[13]-[15]中任一馆 , 私風項之肝纖維化抑制劑，豆中，軟骨素酶ABC來自μ , 市」片』其 vulgaris) 。 ι 枰囷（Proteus 再者，本發明係關於以下。 [17 ] —種用途，係將[1 ]至I； 9 ] 造肝纖維㈣·。巾任―項之藥劑使用於製 […-種肝纖維化之治療方法，包含將⑴ 項之藥劑對個體（患者）投予之步驟。 [1 9 ] 一種組成物，包含[丨]至「」王L 9」之中任一項之藥劑攀上可容許的擔體。系d及柰子由本發明瞭解到，肝硬蠻夕八产> 更欠之發病與硫酸軟骨素蛋白多糖之生成或堆積有關。藉由抑制 ^ - P制石瓜酸軟骨素蛋白多糖之生成或堆積顯示能抑制肝纖維化。此棱供至此為止尚沒有的新概念的肝纖維病症的治療筚。欲去尤其，肝纖維化在現代社會t的患者數增多，與慢性肝炎、 > 人 ΛΤ纖維症、肝硬變、肝衰竭、肝癌等慢性肝病症密相關新概念的治療藥劑在酉療上及產業上也具有重要的意義。【實施方式】 (據以實施發明之最佳形態）以下，更詳細說明本發明。就代表性的慢性肝病症之一的肝硬變所伴隨的病態，有肝中的纖維化。本發明者等為了將改善肝中纖維化狀態 :為肝硬變治療之有效方法之一，著眼於硫酸軟骨素蛋白多糖之功能。並且，將抑制硫酸軟骨素蛋白多糖堆積狀態

2125-8362-PF 10 200803897 :肝硬變模式小鼠中製作，並數比起野生型的肝，硫酸軟骨素蛋白==觀察到多細胞’同時肝硬變的病態有所改善。才唐堆積有所改善的硫酸軟骨素蛋白多糖之生成或堆積，=足發現如果抑制切相關之之肝中硫酸軟 /匕促進與肝硬變密與肝纖維化之改善相關連搪的異常堆積的改善，骨素=㈣：關於一種肝纖維化抑制劑’含有抑制硫酸軟 -夕;’’之生成或堆積的物質作為有效成分。為代=中，「硫酸軟骨素蛋白多糖」為-種蛋白多糖，質(核蛋白、:;酸化黏多糖硫酸軟骨素，硫酸皮膚素與蛋白貝/核蛋白貝）之共價鍵化合物的總稱。本發明中，「硫酸軟：素蛋白多糖」’較佳為人類的硫酸軟骨素蛋白多糖，但是其由來之生物種不特別限制’與人類以外之生物中硫酸軟骨素蛋白多糖為同等的蛋白質(h〇m〇i〇g、。咐。二也包含在本發明中之厂硫酸軟骨素蛋白多糖」。例如，只要是具有與人類硫酸軟骨素蛋白多糖相當之蛋白質，及具有與人類之硫酸軟骨素蛋白多糖同等之蛋白質的生物，則可實施本發明。X，本發明之巾，硫酸軟骨素蛋白多糖，也包含由於發炎等於糖胺聚多糖（GAG)而暫時鍵結成為蛋白多糖之各種部分時間（part time)蛋白多糖。於以下之記載，硫酸軟骨素蛋白多糖，例如：aggrican、versican、神經蛋白聚醣（neur〇can)、 brevican、沒醣基（/? giycan)、核心蛋白聚醣（De⑶rin)、

Bigiycan、纖調蛋白（Fibromodul in)、PG-Lb。本發明中， 2125-8362-PF 11 •200803897 硫酸軟骨素蛋白多糖不限於該等，只要具有作為硫酸軟骨素蛋白多糖之活性的物質即可。在此，硫酸軟骨素蛋白多糖之活性，意指例如細胞接著能力，或細胞增殖促進等。該技術領域之人士可以用如下方法評價作為硫酸軟骨素蛋白多糖之活性。於含有硫酸軟骨素蛋白多糖之胺基酸序列一部分區域之蛋白質，或與一部分區域具有高相同性（通常為70%以上，更佳為80%以上，又更佳為9〇%以上，最高為 95%以上）之蛋白質存在下，測定腫瘤細胞（例如Cac〇 — 2、 HT-29細胞等）之分裂增殖。具有促進分裂增殖效果之蛋白質可以判定為具有硫酸軟骨素蛋白多糖活性之蛋白質（int J Exp Pathol· 2005 Aug;86(4):219-29 及 Histochem Cell

Biol· 2005 Aug;124(2):1 39 —49)。在此，高相同性，意指 50%以上，較佳為70%以上，更佳為8〇%以上，又更佳以上（例如，95%以上，再者96%、97%、98%或99%以上）之0 相同性。該相同性，可由mBLAST演算法（Aitschui Μ _al.(199〇) Pr〇c· Nat1· Acad· Sci· USA 87:2264 一 8; Karlin and Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)決定。本發明中，「肝纖維化」係指肝組織中之纖維化狀離。例如’肝組織中之膠原蛋白等細胞外基質的堆積、纖維芽細胞之活化等，但不限於該等。本發明之中，硫酸軟骨素蛋白多糖之「抑制生成或堆積」，例如：硫酸軟骨素蛋白多糖之「分解促進」、「合成抑制」、「脫硫酸化」、「硫酸化抑制」等，但不限於

2125-8362-PF 12 200803897 該等，意指硫酸軟骨素比較對象為低或消失：置、功能或活性較之「抑制生成或堆積的Γ所硫酸軟骨素蛋白多糖軟骨素蛋白多糖之「貝」不特別限定’較佳為硫酸入具有分解促進作用之物質「 e成抑制作用之物、」、具有戎「呈古七、」、具有脫硫酸化作用之物曾或具有抑制硫酸化之物質」。艾物貝」’ 硫酸軟骨素蛋白多糖之」「分解促進 " 酸軟骨素蛋白多^#01 」，例如使成為硫核的蛋白質表現抑制、存左坫丨、此，成為硫酸軟骨素I6 > 減 >。在子人月京蛋白多糖之核的蛋白晳 r 基質（matrix)刑栌舱& 1 贪白貝」，如果為 • χ)型硫酸軟骨素蛋白多糖，例如 versican、mpi1rrx aggrican、 can、brevi can等核蛋白皙膜型硫酸軟骨蛋白貝。又，如果為 Blglycan、F h多糖，例如1 例示，不限於兮笪貝"亥4皆為糖之妨^ 4 ’只要是廣泛的成為硫酸軟骨辛蛋白多糖之核的蛋白質即可。月I蛋白夕及蛋=」「=基因之「轉錄」，或「轉譯」為多肽，核的蛋白質的^ Ρ制」。「成為硫酸軟骨素蛋白多糖之蛋白多糖之’意指發生由編碼為成為硫酸軟骨素錄：=:!白質的基因轉錄及轉譯，或藉由該等轉音。又二：f 硫酸軟骨素蛋白多糖之核的蛋白質之 Μ 又成為硫酸軟骨辛I> 意指例如該… 糖之核的蛋白質的功能」，胞中的構成要素結合等。卜、十、Γ— 月匕，或與其他細士可你、迷各種功能，該技術領域之人 —般的技術，適當評價(測定）。具體而言，可實

2125-8362-PF 13 200803897 施後述實施例記載之方法，或將該方法適當改變後實施。 ώ再者’硫酸軟骨素蛋白多糖之「分解促進」，可為將硫酸軟骨素蛋白多糖切斷或者分解的酵素或與該等有關連的酵素的表現上升。該等酵素之例，例如：金屬蛋白酶（例如：侧、纖MTS_4、麵TS—5等），或軟骨素酶、 al阳η I等，但不限於該等。又，「分解促進」，可為 3衫料酵素或部分而使硫酸軟骨素蛋存在量減少。白夕 Λ解促進」’也可投予促使表現硫酸軟骨素蛋 ^ Ρ制的物質。該等物質，例如：n-bUt細e、Diethyl Γ a:aZePine: TUn“、職^⑽idal estr〇gen、

Ye o enil deiphen〇1等，但不限於該等。以下解促進作用之物質」之較佳態樣，例如擇自 a) (c)所構成群之化合物（核酸）。 (a )與編碼為硫酸軟骨去釺產铷+甘素蛋白夕糖之核蛋白質之基因的轉錄產物或其一部分對應的反義核酸 (b )具有將編碼為硫的轉錄產物專一性的=素二白多糖之核蛋白質之基因酸、赴叙的核糖酵素（riboZyme)活性的核 (c)具有將編碼為硫酸的表現以_效果予,蛋白多糖之核蛋白質之基因文果予以抑制之作用的核酸所構二促進作用之物質」’例如擇…咖 (軟骨素蛋白多糖之核蛋白質結合之抗體

2l25-8362-PF 14 200803897 (b) 對硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質具有優勢負面效應 (d〇minant negaive effect )之性質的硫酸軟骨素蛋白多糖變異體 (c) 舆硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質結合的低分子化合夕硫酸軟骨素蛋白多糖之「合成抑制」，例如：糖胺聚多糖生合成之抑制、與硫酸軟骨素蛋白多糖合成有關之酵素的抑制等’但不—定限於該等，意指硫酸軟骨素蛋白多糖合成過程中的任何抑制。 P制”l S夂軚月素蛋白多糖合成之物質，就抑制糖胺聚夕糖生、合成之物質，例如：/?-D-xyl〇side 、 2-deoxy-D-gluc〇Se(2-DG) > ethane-1-hydroxy-l,i_ diphosphonate(ETDP) . 5-hexyl-2-deoxyuridine(HUdR) 等。以S亥等物質抑制糖胺聚多糖生合成，並抑制碳酸軟骨素蛋白多糖合成。與軟骨素合成有關之酵素

力 “ ’八 ^ 闕〜崎系，例如：^版邮1、h驗4ST个嶋s —6ST、UA2〇st、 n\、GalT—11、gicaim、xyiQsyi τ 等。藉由抑制對亥等之酵素抑制表現，抑制硫酸軟骨素蛋白多糖成0 σ 例如擇自因的轉錄具有合成抑制作用之物質」的較佳態樣，以下（a) (c)所構成群之化合物（核酸）。 (a)與編碼為硫酸軟骨素蛋白多糖合成酵素之基產物或其—部分對應的反義核酸 "

2125-8362-PF 15 200803897 (b)具有將編碼為硫酸轉錄產物專一性的 "、夕糖合成酵素之基因的 (〇且有將編石^ 酵素（rib〇Zyme)活性的核酸 (:)，、有將編碼為硫酸軟骨素蛋白多表現以_效果予以抑制之作用的核酸基因的又’「具有合成抑制作用之物所構成群之化合物。、擇自以下（a)〜（c) (a)與硫酸軟骨紊j ⑴ |蛋白多糖之合成酵素結合之抗體〇〇對硫酸軟骨素蛋白多糖 1 (d〇mi腿t negaive pff + /酵素具有優勢負面效應糖合成酵素變異體ec之性質的硫酸軟骨素蛋白多 (c )與硫酸軟骨幸|ώ夕物 u蛋白多糖之合成酵素結合的低分子化合骨素蛋白多糖之「脫硫酸化」， ^蛋白多糖中之硫酸基除去，例如以内在性或 =脫硫酸化酵素進行脫硫酸化，或以抑制硫酸化之化合卩制硫酸化等’但不限於該等，意指除去硫酸基之過程。 (c二硫酸化酵素’例如：軟骨素+硫酸…

二—“ulfatasW 〇π r〇ltln-6-sulfatase)〇x,#f|Ji^^^^^^^ • orate^EGF ^ ^ #-J (EGF receptor antagonist) 等0 、具有脫硫酸化作用之物質」的較佳態樣，例如擇自以下（a)〜（c)所構成群之化合物（核酸）。 (a)與編碼為硫酸軟骨素蛋白多糖脫硫酸酵素抑制蛋白質

2125-8362-PF 16 200803897 之基因的轉錄產物或其一部分對應的反義核酸 (b) 具有將編瑪為硫酸赴|去又& #丨士、> :屬月素蛋白多糖脫硫酸酵素抑制蛋貝土、轉錄產物專一性的開裂的核糖酵幸 (ribozyme)活性的核酸東 (c) 具有將編碼為硫酸軟骨素蛋白多糖脫硫酸酵素抑白質之基因的表現以RNAi效果予以抑制之作用的核酸

又’「具有脫硫酸化作用之物質」，例如擇自以下（3)〜所構成群之化合物。 C (a)與硫酸軟骨素蛋白多糖之脫硫酸酵素抑制蛋白質結八之抗體、^ η (b )對;^ g欠幸人月素蛋白多糖脫硫酸酵素抑制蛋白質具有停勢負面效應（dominant negaive effect )之性質的硫酸敕月素蛋白多糖脫硫酸化抑制蛋白質變異體 (c)與硫酸軟骨素蛋白多糖之脫硫酸酵素抑制蛋白質結合的低分子化合物 ° 在此，「脫硫酸化抑制化合物」，不限於蛋白質，包含例如輔酶等非蛋白質化合物。硫酸軟骨素蛋白多糖之「硫酸化抑制作用」，例如硫酸基轉移酵素之抑制，但不限於此，意指硫酸軟骨素蛋白多糖合成過程中所發生之硫酸化被抑制之意。硫酸基轉移酵素，例如：C4ST—1(Ch〇ndr〇itin D—N-acetylgalactosamine-4-0-sulfotransferase 1) 、 C4ST-2 (Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-0-sulfotransferase 2) 、 C4ST-3(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-〇- 2125-8362-PF 17 200803897 SUlf〇「transferase 3)、mst、C6ST小 C6ST_2 等。「具有硫酸化抑制作sn的較佳態樣，例如擇以下U)〜（c)所構成群之化合物（核酸）。 (a)與編碼為硫酸赴晋| 夂季人月素蛋白多糖硫酸基轉移酵素之基因的轉錄產物或其一部分對應的反義核豸 ⑻具有將編碼為硫酸軟骨素蛋白多糖硫酸基轉移酵素之基因的轉錄產物專一性的開裂的核糖酵素(―)活性的核酸 (C)具有將編碼為硫酸軟骨素蛋白多糖硫酸基轉移酵素之基因的表現以RNAi效果予以抑制之作用_ 又’ 「具有硫酸化抑制作用之物質」，例如擇自以下 (a) 〜（c)所構成群之化合物。 u)與硫酸軟骨素蛋白多糖之硫酸基轉移酵素結合之抗體 (b) 硫酸軟骨素蛋白多糖硫酸基轉移酵素變異體人月素蛋白多糖之硫酸基轉移酵素結合的低分子化合物上述例示之酵素，不僅是對應於一基因之一酵素，也包含共有某特徵的酵素群。例如，軟骨素酶，料有黏多糖分解酵素之特徵，但是基質專—性等不同之ABC、AC、B 等酵素的總稱。例如’軟骨素酶AC !，將硫酸軟骨素類 C或E)、軟骨素、硫酸軟骨素_硫酸皮膚素雜交塑及透明質酸之N-乙喊己糖醯胺（hexQsaffiinide)鍵⑽離反應地切斷，而產生在非還原末端具有Δ4_葡糖駿酸殘基之寡糖。本酵素對硫酸皮膚素（硫酸軟骨素Β、就己糖㈣而言具有

2125-8362-PF 18 200803897 L-艾杜糖盤酸（i duroni c aci d)、硫酸角質素、硫酸乙醯肝素及肝素作用。又，軟骨素酶AC 11，將軟骨素、硫酸軟骨素類 A及硫酸軟骨素C之N-乙醯基己糖醯胺 (hexosaminide)鍵以脫離反應地切斷，而產生A4-不飽和雙糖（ADi-0S、ΔΙΗ-4S、及ADi-eS)。本酵素對透明質酸也作用良好。對於硫酸皮膚素（硫酸軟骨素不作用，成為本酵素之競爭性抑制劑。軟骨素酶B(Dermatanase)，將結合於硫酸皮膚素之L-艾杜糖醛酸（iduroni c aci d)的之春N-乙醯基己糖醯胺（hexosaminide)鍵以脫離反應地切斷，而產生於非還原末端具有△ 4-己糖醛酸殘基之募糖糖及 4糖）。本酵素對於不含L-艾杜糖酸酸之硫酸軟骨素a及硫酸軟骨素C不作用。硫酸皮膚素之硫酸基已去除之衍生物皮膚素，並非該酵素之基質。硫酸皮膚素之L—艾杜糖醛酸單位的第2位被硫酸化之部位經常被本酵素所切斷。軟骨素酶ABC，將硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素（：、硫酸皮膚素、 _軟骨素及透明質酸的N-乙醯基己糖醯胺（hex〇saminide)鍵以脫離反應地切斷，而主要產生於非還原末端具有Δ4-己糖醛酸殘基之二糖。本酵素對於硫酸角質素、肝素及硫酸乙醯肝素不作用。軟骨素酶為像這種具有不同性質，同時具有黏多糖分解酵素之共通性質的酵素總稱，不一定限於此處所例示的 Ch〇ndr〇itinase Ac ac

Il^Chondroitinase B ^ Chondroitinase ABC 〇 X ’共有像這種特徵的酵素群，不—枝對應於基因體（gen〇me)DNA上的一基因。例如， 2125-8362-PF 19 200803897 chondroitin~4-sulfatase ^ chondroitin-6-sulfatase ^ 都是基因體資料庫上於公共基因資料庫Genbank所檢索以多數登‘編號參照的序列（例如，於Genbank登記編號 NT_039500(其一部分以登記編號CAAA01 098429(序列編號：68)表示）、NT—078575、NT 一 039353、NW—001 030904、 NW—001030811 、 NW—001030796 、 NW—000349)。上述例示者中，對應於個別基因者如下所示。也就是曰兒：上述例示之硫酸軟骨素蛋白多糖：aggrican、 versican λ neurocan λ brevican λ β glycan % Decorin ^ Biglycan、Fibromodulin、PG-Lb、就將硫酸軟骨素蛋白多糖切斷或分解之酵素或與該等有關連的酵素例示者：ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、Calpain I;與軟骨素合成有關的酵素例示者：GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、 GALNAc4S-6ST 、 UA20ST 、 GalT-I 、 GalT-II 、 GlcAT-I 、 XylosylT;就硫酸基轉移酵素例示者：C4ST-1、C4ST-2、 C4ST-3、D4ST、C6ST-1、C6ST-2等，其於人類之中，編碼之基因於公共基因資料庫Genbank中之登記編號、驗基序列、胺基酸序列如下所示。 aggr ican(登記編號NM-007424、驗基序列之序列編號：1、胺基酸序列之序列編號：2) versican(登記編號BC096495、驗基序列之序列編號：3、胺基酸序列之序列編號：4) 1^111'〇〇&11(登記編號丽一01 0875、鹼基序列之序列編號：5、胺基酸序列之序列編號·· 6 ) 2125-8362-PF 20 200803897 brevican(登記編號NM—007529、鹼基序列之序列編號：7、胺基酸序列之序列編號：8 ) 冷glycan(登記編號、驗基序列之序列編號· 9 胺基酸序列之序列編號：10)

Decor in(登記編號龍―007833、鹼基序列之序列編號：11、胺基酸序列之序列編號：12) B i g 1 y c a η (登記編號B C 0 5 71 8 5、驗基序列之序列編5虎· 13 胺基酸序列之序列編號：14 ) _ Fibromodulin(登記編號ΝΜ—021355、驗基序列之序歹〗、’爲號：15、胺基酸序列之序列編號·· 1 6 ) PG-Lb(登記編號NM_007884、鹼基序列之序列編號：I7、胺基酸序列之序列編號：1 8) ADAMTS-1 (登記編號NM—0 0 962卜鹼基序列之序列編號：19、胺基酸序列之序列編號：2 0) ADAMTS-4C登記編號匪-172845、鹼基序列之序列編號：21、胺基破序列之序列編號：2 2 ) _ ADAMTS-5(登記編號AF140673、鹼基序列之序列編號：23、胺基酸序列之序列編號：24)

Calpain I(登記編號NM—007600、鹼基序列之序列編號：25、胺基酸序列之序列編號：26)

GalNAc4ST-l (登記編號NM—175140、驗基序列之序列編號：27、胺基酸序列之序列編號：28)

GalNAc4ST-2(登記編號NM—1 99055、驗基序列之序列編號：29、胺基酸序列之序列編號：30) 2125-8362-PF 21 200803897 6八1^人648-681'(登記編號丽-〇29935、驗基序列之序列編號：31、胺基酸序列之序列編號：32) 2081'(登記編號，一177387、驗基序列之序列編號：33、胺基酸序列之序列編號：34)

GalT-1 (登記編號NM一〇 1 6769、驗基序列之序列編號：35、胺基酸序列之序列編號：36)

GalT-I I (登記編號BC064767、驗基序列之序列編號：37、胺基酸序列之序列編號：3 8) _GlcAT-I(登記編號BC058082、驗基序列之序列編號：39、胺基酸序列之序列編號：4〇 ’或登記編號ΝΜ-0 242 5 6、驗基序列之序列編號：41、胺基酸序列之序列編號：42) XylosylT(登記編號丽—145828、驗基序列之序列編號：43、胺基酸序列之序列編號：44) C4ST-1 (登記編號NM-021439、驗基序列之序列編號：45、胺基酸序列之序列編號：46) C4ST-2(登記編號NM—021 528、驗基序列之序列編號：47、胺基酸序列之序列編5虎：4 8) C4ST-3C登記編號XM—355798、鹼基序列之序列編號：49、胺基酸序列之序列編號：50) D4ST(登記編號腿_〇28117、鹼基序列之序列編號：51、胺基酸序列之序列編號·· 5 2) C6ST-1 (登記編號NM—01 6803、鹼基序列之序列編號：53、胺基酸序列，之序列編號：54) C6ST-2(登記編號AB046 929、鹼基序列之序列編號：55、胺 2125-8362-PF 22 200803897 基酸序列之序列編號β· 56) 上述以外的蛋白質，只凑只要例如舆序列表所記載之序列

能（例如，與細胞内之構成ϋ鮭厶夕ι —

加成、缺失、取代、插入之胺基酸序列所構成的蛋白質，通常變化的胺基酸數在30個胺基酸以内，較佳為1〇個胺基酸以内，更佳為5個胺基酸以内，最佳為3個胺基酸以本發明中’上述基因中，包含例如與序列編號：1、3 5、7、9、η、13、15、17、19、2卜 23、25、27、29、31 51、 53、 55 其中 33 、 35 、 37 、 39 、 41 、 43 、 45 、 47 、 49 、之一記載之鹼基序列所構成之DNA對應之於其他生物的内在性的基因（人類之上述基因的同族體（h〇m〇1〇g)等）。又，與序列編號：1、3、5、7、9、11、13、1 5、17、 19、21、23、25、27、29、3卜 33、35、37、39、4卜 43、 45、47、49 ' 51、53、55其中之一所記载之鹼基序列所構成之DNA對應的其他生物的内在性DNA，一般而言，各與序列編號：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、3卜 33、35、37、39、4卜 43、45、47、49、

2125-8362-PF 23 200803897 51、53、55其中之一所記載之DNA具有高相同性。具有高相同性意指，具有50%以上，較佳為7〇%以上，更佳為80% 以上，又更佳為90%以上（例如，95%以上，更佳為96%、97%、 98%或99%以上）之相同性。該相同性，可藉由11^1^3丁演算法（Altschul et al. ( 1 990) Proc. Natl· Acad· Sci· USA 87:2264-8; Karlin and A1tschul( 1 993) Proc. Natl. Acad.

Sci· USA 90:5873-7)決定。又，該DNA於從活體單離之情形，被認為與序列編號：1、3、5、7、9、11、1 3、1 5、1 了、馨 19、21、23 ' 25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、 45、47、49、5卜 53、55 所記載之 DNA 於嚴格（stringent: 條件下會雜交。在此，「嚴袼條件」例如「2xSSC、〇. 1%SDS、 5(TC」、「2xSSC、〇.l%SDS、4rc」、「lxSSC、〇 mDS、 37(：」，更嚴格條件，例如「2><%(：、〇1%81)3、65它」、

〇· 5xSSC、0· USDS、42°C」及「〇· 2xSSC、0· USDS、65°C 之條件。 …卩一心阿吖日鬥怔ι蛋質’將與上述蛋白質在功能上為同等的蛋白質，藉由炉軟骨素蛋白多糖之分解促進作用、合成抑制作用、脫硫化作用或硫酸化抑制作用夕、、本α、ηϊ + 1 仰制作用之活性測定方法而適當取得。體的活性敎方法，記载於後述本發明之篩選方法的項中又，錢術領域之人士，可將其他生物中相當於上基因之内在性基因，以卜、+、、取彳β $ 士以上述基因之鹼基序列為基礎而適取仔。又，本說明蚩φ 祖月曰中，對於人類以外生物之中盥白質及基因相當之上述蛋，、上这: 心皮曰貝及基因，或者與上述蛋白；

2125-8362-PF 24 200803897 及基因在功能上為同等的上述蛋白質及基因，有時單以上述名稱記載。本發明之上述蛋白質，除了天然蛋白質以外，也可為利用基因重組技術所調製之重組蛋白質。天然蛋白質，例如可藉由將例如認為表現上述蛋白質之細胞（組織）的萃取液，使用對抗上述蛋白質之抗體之親和性層析方法調製。另一方面，重組蛋白質，例如可藉由培養經過編碼為上述蛋白質之DNA進行形質轉換之細胞而調製。本發明之上述蛋白質’例如可適用於後述篩選方法。丰愈月之中，「核酸」意指RNA或DNA。又，所謂pNA( 核酸，Peptide nucleic acid)等化學合成核酸類似; 力 g)也i 3於本發明之核酸。PNA係將為核酸基本 ^構造之五碳糖•磷酸骨架，取代為以甘胺酸為單位之: I胺月木者，具有與核酸很相似的三維構造。就抑制特定内在基因表現之方法而言，利用幻

Se)技術之方法為該技術領域之人士所熟知的。2 義核酸對於目標基因表 — Η 之抑制作用，存在如以下多數ό 二就疋說:由於形成三條鏈造成抑制轉錄開始、“ 議聚合酶而局部打開成環〇卿）狀構轉錄抑制、於内子(11二成進订中之職形成雜交造# 交造成剪切r ,· η)與外子（exon)之接合點形成n 呷位m SP 1Clng)抑制、與剪接體(spliceosome)形成口P位形成雜交造成剪取核移動到細胞質:::、與成雜交造成抑制從風巾目（CaPping)部位或多（A)加成部位

2125-8362-PF 25 200803897 形成雜交造成剪切抑制、與成轉譯起始抑制、與起始密碼；二°因子結合部位雜交造交造" 附近的核糖體結合部位雜

又i攻轉澤抑制、與mRNA 結合部位雜$、皮# a 学匚域或多核醣體（polysome) …:成多肽鏈伸長抑制，及與核酸與蛋白質之父互作用部位雜交造成…蛋白貝之 iir m ^ Λ, S 見抑制等。以該方式，反義核齩猎由抑制轉錄、剪切我 m ^ ^ m ίτ ^ /轉專專各個過程，抑制目標基因之表現（平島及井上，新一土 ^ .. φ 生化予貫驗講座2核酸IV基因之禝製與表現，曰本生仆風土 u r319_347)。予I扁，東京化學同人，1 993, 本發明中使用的反義核酴、我孩酉文，可猎由上述其中之一的作用’將編碼為上述硫酸敕骨热主季人月素蛋白多糖之核蛋白質、合成

酵素、脫硫酸化酵素抑制I 、p制蛋白貝、硫酸基轉移酵素其中之一之基因的表現及/或功台匕力月b予以抑制。就一態樣而言，如果在編碼為上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白f、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質、硫酸基轉移酵素其中之一

之基因的mRNA的5，糾I 附近故計與非轉譯區互補的反義序列’呑忍為對基因之轉譯永矣| 科夺抑制為有效果的。也可使用與編碼區或3’狀非轉譯區為互補的序列。以上述方式，不僅是編碼為上述琉酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、合成酵素、脫石瓜酉义化酵素抑制蛋白質、硫酸基轉移酵素其中之— 之基因的轉譯區，包含非轉譯區之序列的反義序列的核酸，也包含在本發明可利用的反義核酸。所使用之反義核酉夂’連L於適田的促進子（则下游，較佳為在3，側連結包含轉錄終結信號的序列。

2125-8362-PF 26 200803897 以該方式所調製之核酸，可藉由公知的方法所的動物（細月包）進行形質轉換。反義核酸的序列’則土為盘 =綱質轉換的動物(細胞)具有的内在性硫酸軟骨素夕糖之核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白 2或硫酸基轉移酵素之基因或其部分為互補的序列，p 只要能夠有效地抑制基因表現，疋取佳為95%以上的互補性。使 . ± B 從用夂義核酸有效果地抑制目払基因表現，較佳為反義核酸 ^ 〇r ^ ^ 又王夕馬1 5個鹼基以上不 :25:驗基’但本發明之反義核酸不-定限於該長度，例如可為100個驗基以上，或咖個驗基以上。例美因反義核酸不特別限制，例如可基於v⑽咖號⑻、土C4ST:GTnk之登記編號BC096495 序列編序列編序列編合成酵 enBank之登記編號龍_〇21439 ;C4ST-2(GenBank 之登記編號題―〇21528 ::4cn、C4ST—抑—磁之登記編號Μ一355798 谠：49)等製作。

編碼為上述硫酸軟骨素I 素，酸化酵素抑制核蛋白f、合成酵現的抑制，可利用核糖料或編;:;轉移酵素之基因表 /一、$、、扁碼為核糖酵素之DNA推订。核糖酵素係指具有觸媒 4腦進在具有各種活性者，其中，ώ A刀子。核糖酵素存核糖酵素為研究關 =作為將驗切斷之酵素的切斷的核糖酵素。核糖酵;中：晖素中，有丨群内子（GroupI intr〇n)

2125-8362-PF 27 200803897 型或包含於RNase P中之M1 RNA之大小為4〇〇個核苷酸以上者，也有具有鄉頭（hammer head)型或稱為髮夾型之4〇個核苷fee左右之活性結構域（d〇mai n)者（小泉誠及大塚榮子’蛋白質核酸酵素，1 990, 35, 21 91·) 例如，鄉頭（hammer head)型核糖酵素之自切斷結構域，係將稱為G13U14C15序列之C15的3，側切斷，其活性在U14與A9之鹼基對形成為重要的，且顯示將α5改為 A15 或 U15 也可以切斷（Koizumi，M· et al·，FEBS Le^， 1 988，228，228·)。如果設計基質結合部位與標的部位附近之RNA序列為互補的核糖酵素，則可製作認識標的中之UC、UU或UA序列之限制酵素性的RNA切斷核糖酵素 (Koizumi，M· et al·，FEBS Lett，1 988，239，285·、小泉誠及大塚榮子，蛋白質核酸酵素，199〇, 35, 219l.、

Koizumi，l et. Al·，Nucl Acid Res，1 989，17，7059 )。又’髮夾型核糖酵素對於本發明之目的也是有用的。該核糖酵素例如被發現在煙草環斑病毒（T〇bacc〇 ringspot Vlrus )之衛星 RNA 的負鏈（Buzayan，jm.， Nature，1 986，323，349)。有人報告從髮夾型核糖酵素也能製作出標的專一性的RNA切斷核糖酵素（Kikuchi， Y.&Sasaki，N·，Nucl Acids Res，1991，19，6751•、菊池洋，化學與生物，1 992,30，112·)。以該方式，藉由使用核糖酵素，將編碼為上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質或硫酸基轉移酵素之基因的轉錄產物以專一性的切斷，可以抑制該基因的

2125-8362-PF 28 200803897 表現。内在性基因表現之抑制，尚可藉由ΜΑ干擾（RNA interference，以下略稱為「RNAi」），以具有與標的基因序列具有相同或類似序列之雙股RNA來進行。， *由於近年來基因體計晝之完成，人類的全鹼基序列被解項出來’許多疾病相關的基因被熱烈的鑑定，現在以特定基因為標的之治療法 '新藥開發被積極地進行中。其中，以發揮專-性轉錄後抑制效果之小干擾腿（伽u interferingRNA，siRNA)在基因治療上的應用受到注目。 RNAi為一種當雙股RNA(dsRNA)直接進入細胞，則會使帶有 2該dsRNA相同序列之基因表現受到抑制之方法，為目前又到重視的方法。於哺乳動物細胞中’藉由使用短鏈 ds職（si讀），可誘導RNAi，則與基_除小鼠比較，八有效果安定、實驗容易、費用便宜等許多優點。由於.Ai效果而具有抑制作用的核酸，一般稱 3撕或处謝。_卜係藉由將具有與標的基因之顧為相同序列所構成之有義RNA及與該有義RNA為互補的序列所構成之反a RNA而構成的短鏈雙股RNA(以下因：：」）導入：胞等，會專一且選擇性地結合於標的基 ^ ，而誘導破壞，並藉由將該標的基因切斷而以？择政率抑制(inhibit)標的基因表現的現象。例如，如二 d_A導入細胞，則與該_為相同序列之基心到抑制（knock down) 〇以哕方★ ΡΜΔ. At ,Α 4 Μ 文 )以4方式，⑽Αχ能夠抑制標的基表現，因此就取代習知須雜且低效率之以相同重組進行

2l^5-8362-PF 29 200803897 基口破壞方法之簡易基因剔除一 v ^ J除方法而吕，或者應用於基因 >口療方法而言，受刹舌雜 .j. 又到重視。使用於RNAi之RNA，不一定必

需與編碼為上述硫酸軟骨辛I 年月京蛋白多糖之核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化料㈣蛋自質或硫酸基轉料素之基因或 δ亥基因之部分區域完全相同’但較佳為具有完全的相同性。於3薦設計時，就乾而言，只要是編碼為上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白f、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質或硫酸基轉移酵素之基因，則不㈣限定，任音、區域都可以作為乾的候選者。例如可基於Versican基因之驗基序列（序列編號：3)、⑽—！基因之驗基序列（序列編说.45) C4ST-2基因之驗基序列（序列編號：47)、c4st_3 基因之驗基序列（序列編號：49)等製作。更具體而言，可將該序列一部分的區域作為靶的候選者，例#，可基於

VerSiCan基因之驗基序列的—部分區域（序列編號：57)、 C4ST-1基因之驗基序列的一部分區域（序列編號：58)、 C4ST-2基因之驗基序列的一部分區域（序列編號：59)、 C4ST-3基因之驗基序列的—部分區域（序列編號：6〇)、 C6ST-1基因之鹼基序列的—部分區域(序列編號:61)、 C6ST-2基因之驗基序列的-部分區域（序列編號：62)、 GalNAc4ST-l基因之鹼基序列的一部分區域（序列編號：63)、GalNAc4ST-2基因之鹼基序列的一部分區域（序列編號：64) 、GALNAC4S-6ST基因之鹼基序列的一部分區域 (序列編號：65)等製作。將siRNA導入細胞，例如可採用將於.體外（in vi1;r〇) 2125-8362-PF 30 200803897 口成之s i R N A連结；^暂雜Λ 口於貝體DNA而將該等導入細胞之方法將2股RNA黏合（anneal)之方法等。、又’上述2股隨分子，在此可為其中之一端為封閉構l的刀子，例如，具有髮夾構造之（讣。财被稱為短髮夾RNA(short hairpin謝），為因為單股的— 部分區域與其他區域形成互補鏈，而具有莖環(st.i〇〇p)

構le之RNA刀+。亦即’能於分子内形成雙股腿構造之分子也包含於本發明之siRM。 C4ST 1 C4ST 2、C4ST-3等之表現藉由RNAi效果而抑制的RNA(S1RNA) ’於以本說明書中具體顯示之腿序列（序列編號:57〜65)為標的siRNA中’例如，即使是有j個或少數RNA被加成或缺失之構造的雙股RNA，只要是具有抑制編碼為上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質或硫酸基轉移酵素之基因表現的功能’則包含於本發明之s i RNA。又，就本發明之較佳態樣而言，為能將Versican、

為了題Ai(siRNA)使用的RNA，不需要與編碼為上述蛋白質或該基因之部分區域完全同一（相同），但以具有完全同一（相同）性為較佳。 A王對於RNAi機制之細節，尚有不明瞭的部分，但有人卞為是稱為DICER之酵素（RNase ΠΙ核酸分解酵素家族之2 種）與雙股RNA接觸，並將雙股題Α分解為巧僻钓small interfering RNA或^1^八之小斷片。本發明之中， RNAi效果之雙股RNA，亦包含以該方式被dicer八二刀解別的

2125-8362-PF 200803897 雙股RNA。亦即，即使為以原狀態的的長物，由於能期待在細胞中分解：具效果 siRNA，IU此本發明之中雙股讓的長.NAi放果之 , .. 又不4寸別限定。例如，將對應於編碼為上述硫酸蛋白暂、人 > 说士月素蛋白多糖之核蛋貝曰成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋自併 =:基因的-全長或幾乎全長區域的長鏈；: ^ ^如預腦分解，可將該分解產物之樂劑㈣。該分解產物中，期待包含具有咖效果之雔股RNA分子（siRNA)。依照該方法，又 J M不必特別選擇期待具有撕效果之囊上的區域。亦即，二，:待 1 -、有RNAi效果之本舍明之上述基因之mRNA上的區域』匕4不一定需要精確地規定。本發明之上述「可藉由r A ; M s y 1 』猎由KNAl效果而抑制的雙股RNA」，於該技術領域之人士 ’可基於以成為該雙股職之標的之編碼為上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、合成酵素、 •脫硫酸化酵素抑制蛋自質或硫酸基轉移酵素之基因的驗基序列’而適當製作。舉一例來說，可基於序列編號:57之鹼基序列，製作本發明之雙股RNA。亦即，基於序列編號：57 之鹼基序列，選擇為該序列之轉錄產物mRNA之任意連續 RNA區域，並製作與該區域對應之雙股RNA，對於該技術領域之人士而言，可在通常的試作範圍内適當進行。又，從該序列之轉錄產物mRNA，選擇具有較強RNAi效果之siRNA 序列，對於該技術領域之人士而言，可使用公知的方法適當實施。又，如果其中一股被解明，則該技術領域之人士 2125-8362-PF 32 200803897 可以輕易地知道另一股（互補股）的鹼基序列。siRNA，該技術領域之人士可使用市售的核酸合成機適當地製作。又，對於所望RNA之合成，可使用一般的合成委託服務。又，本發明之中，s i RNA不一定必需為對應於標的序列的一組雙股RNA，也可為對應於包含標的序列之多組雙股RNA的混合物。在此，作為與標的序列對應之核酸混合物的siRNA，該技術領域之人士可使用市售的核酸合成機及DICER酵素而適當製作，又，對於所望RNA合成，可利用一般的合成委託服務。又.，本發明之siRNA，包含所謂「混合 siRNA(cocktail siRNA)」。疋所有的核苷酸為又’本發明之siRNA，也可以不一核糖核苷酸（RNA)。亦即，本發明中，構成3刪之】或多數核糖核苦酉夂’可為對應的去氧核糖核普酸。該「對廣 :指雖然糖部分的構造不同，但是為相同的驗基種類(二呤、鳥糞°票呤、胞嘴°定、胸腺哺唆（尿嘴咬））。例如，與具有腺嗓呤之核糖核普酸對應之去氧核糖核普酸，係指具；腺不V之去氧核糖核苷酸。又，前述「多數」不較佳為指”〜5個左右的少數。限疋’ •再者，本發明中可表現上述RNA之DNA(載體），抑制編碼為上述蛋白f之基因表現的化合物的^ :例如，本發明中可表現上述雙股·Α之DNA(载體）為=將編碼為該雙股腿#中之—的股的嶋，及編石馬結二1::: 一股的醜，以分別可表現之方式，連促進子的構造的DNA。本發明之上述DNA，對於該技術

25-8362-PF 33 200803897 領域：人：，可依照一般的基因工程技術適當製作。更具體而吕’ #由將編碼為本發明RNA #職適當插入公知的各種表現載體，可製作本發明之表現载體。又，本發明之表現抑制物匕β稭由與編碼為上述 =軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質或硫酸基轉移酵素之基因的表現調節區域例如’促進子區域。具體例’例如·為Μ—以之促進子區編號：66表示的鹼基序列）結合，而抑制編碼為上述石瓜酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質鉍U 。口成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質或硫酸基轉移酵素之基因表現的化合物。 5亥化合物，可使用例如編碼為上述硫酸軟骨素蛋白多糖之 =白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質或硫酸基 =酵素之基因的促進子嶋斷片，藉由以與該鳩斷片 :合活性作為指標的筛選方法而取得。χ，該技術領域卷對於所望化合物’判斷有無抑制編碼為上述硫酸核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑本白為或硫酸基轉移酵素的基因表現，可藉由公知的方 ’ ’例如報告基因分析(reportor assay)法等適當實施。入处再者，本發明中可表現上述RNA之舰（載體），尚包各月匕將編碼為上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制I白新斗，W 4 辟下邳制蛋白貝或硫酸基轉移酵素的基因表現予以抑制之化合物的較佳態樣，如，本發明 =述雙股鹽之繼（載體），為具有將編碼為該雙股腿 /、中之-的股的驗’及編碼為該雙股腿中另一股的

2l25-8362-PF 34 200803897 觀，以分別可表現之方式，連結於促進子的構造的腦。本發明之上述MA，對於該技術領域之人士，可依奶一# 的基因工程技術適當製作。更具體而言，藉由將編：為：發明應㈣Μ適當插入公知的各種表現載體作發明之表現載體。下本本發明之上述載體的較佳態樣，例如：表現能將

Wn、⑽-卜⑽_2、⑽_3等之表現藉由讓2 效果而抑制之题A(sip财）的載體。與上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋.白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制化合物或硫酸基轉移酵素結合之抗體，可依照该技術領域之人士公知 " 體，則例如可以下方法^ = 如果為多株抗卜万法侍到。可將天然的上述蛋白質，或就與GST融合的融合蛋白質而言在微生物中表現的重組 (recombinant)蛋白質，或並邻公、U刀肽，對兔子等小動物免疫並付到血清。將該等藉由硫安沉澱、蛋白f a、蛋管柱、刪離子交換層析、偶合有上述硫酸軟骨素蛋白糖之核蛋白貝、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制化合物或硫 &基轉私酵素或合成肽之親和管柱而精製以調製。又:如果為=株抗體，則例如可將上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核σ 蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制化合物，或硫酸= 轉移酵素或其部分妝斟丨& & 飞瓜ϊ夂基刀狀對小乳專小動物進行免疫，從該摘出脾臟’並打碎將么的八、丁珥將細胞分離，將該細胞舆小鼠骨髓細胞使用聚乙二醇等每筵^^ 二田5，從藉此產生的融合細胞人瘤，咖心a)之中，選擇產生與上述硫酸軟骨素蛋(=

2125-8362-PF 35 200803897 =之核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白* 酸基轉移酵素結合之抗體的選殖體 ^ < 龍内攸小鼠回收腹水，將得到的單株抗於以例如硫安沉澱、蛋白質體，始麻』 Λ 资白貝G官柱、DEAE離子夺、曰斤、偶“上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋二酵素、脫硫酸化酵素抑制化合物，或硫酸基轉移酵：合成肽的親和管柱而精製以調製。素次本發明之抗體，σ i η &丄… ,^ ^ /、要疋與本發明之上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、人忐祕 ”隻或疏酸基轉移酵辛二ΓΓ 化酵素㈣化合物 .^时，、σ者，即不特別限定，除為上述多株 :人、早株抗體以外，也可為人類抗體、以基因重組製作 1型化抗體’更且為其抗體斷片或抗體修錦物。作為取得抗原之感作抗原使用的本發明蛋白_，㈣物種類不特別限制，較佳為哺乳動物，例如來自、於 /、或人類的蛋白質，尤佳為來自於人類的蛋白質。來自 2類的蛋白質，該技術領域之人士可使用本說明書揭示的基因序列或胺基酸序列而適當取得。月中’作為感作抗原使用之蛋白質，可為完整的新：或者蛋白質之部分肽。蛋白質之部分肽，例如:蛋白 _ 2 土（Ν)末端斷片或羧基（c)端斷片。本說明書中，「抗體」：指與蛋白質全長或斷片反應的抗體。又除了將抗原對人類以外之動物免疫而得到上述融 Β瘤以外，可鸦：λ 丄、類淋巴球，例如感染ΕΒ病毒的淋巴球，蛋白質、蛋白質表現細胞或.其溶解物

2125-8362-PF 36 200803897 感作，並將感作淋巴球與來自於人類之具有永久分裂能力的骨髓瘤細胞，例如ϋ266融合，向传到融合瘤，該融合瘤生產八有對蛋白質之結合活性的所望抗體。入本發明之對抗上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、二硫酸化酵素抑制化合物或硫酸基轉移酵素之抗體，猎由與該蛋白質社人可期待抑制該蛋白質表現或 =效果。於將所得到之抗體以對人類投予為目的(抗體用之情形’為使免疫原性降低，較佳為或人類型化抗體。枋疋再Ϊ ’本發明就能夠抑制上述硫酸軟骨素蛋白多糖之財=、^成酵素、脫硫酸化酵素抑制化合物或硫酸基 =素之功能的物質而言，尚含有與上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白皙、人士级士合成酵素、脫硫酸化酵素抑制化合物或；丨L &L基轉移酵素結合之低旦所該低分子量化合物，可為天”：貝(低分子化合物)。該技術領域之人士二的化合物。通常，為物。可使用公知的方法製造或取得的化合二本發明之化合物，也可藉由後述篩選方法而取得。核蛋白折、人^月^此夠抑制上述硫酸軟骨素蛋白多糖之轉"I夺：Ϊ酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質或硫酸基現或功能的物質而言，例如對於上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白皙、人白f 4 1 Μ 、口成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋體：二轉移酵素’具有優勢負面效應之性質的變異勢負㈣蛋白f)。「對於上述硫酸軟骨素蛋之核蛋白I合成酵素、脫琉酸化酵素抑制蛋白質或硫酸

2125-8362-PF 37 200803897 ;酵素’具有優勢負面效應之性質的該蛋白質變異」广、指藉由使編碼.為對於硫酸軟骨素蛋白多糠之核蛋 :、:成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白f或硫酸基轉移 =土因表現’而具有使内在性野生型蛋白質之活性消像與野貝像-種優勢負面型蛋白質’例如 & rsican核蛋白質競爭與硫酸軟骨素之結合的Versican核蛋白質變異體。 ::本發明中，抑制硫酸軟骨素蛋白多糖之產生或堆織或細胞不特別限定，較佳為肝組織。 :制硫酸軟骨素蛋白多糖之產生或堆積的化合物，期寺成為肝纖維化病症之治療或預防藥劑。在此，「治療或預防」，對於呈現肝纖維一 m哗化之、、且織或細胞，不一定必需要 -—的治療效果或預防效果，具有部分效果即可。 ;广即/巾肝纖維化病症只要是伴隨有肝纖維化之病肝不特別限定’較佳為例如：慢性肝炎、肝纖維症、肝硬變 '肝衰竭、 # r , , Y、忮性肝病症。又，該等病症之合也匕s在本發明之肝纖維化病症。成因肝纖維化抑制劑，具有藉由抑制為肝纖維化成因之硫酸軟骨辛I 夕之祚用π ，蛋夕糖之產生或堆積’抑制肝纖維化肝鑣❹^十月之較“樣，例如提供以本發明之抑制劑作為有效成分之慢性肝病症治療劑或者肝硬變治療劑。席d次者肝又’本發明之’肝纖維化抑制劑」維化治療劑」戋「肸输μ 丁兩肝纖」&肝纖維化改善劑」等。又’本發明之中，

2125-8362-PF 38 200803897 w樂組成物厂治「抑制劑」可表示為「醫藥品」

J 療用醫藥」等。又’本發明之「治療」，包 3月匕將肝纖維化之發生預先抑制之預防效果。又，對於肝_ 丁於肝纖維化表現細胞（組織），不疋限疋於具有完全的治療效果，a γ & 的情形。果也可為具有部分效果本發明之樂劑，可盘味裡與 ^ l、生理學上可容許的擔體、賦形劑或稀釋劑專混合，作成醫藥組合物而以經口或非經口地投予。經口劑可為顆粒劑、散劑、旋劑、膠囊劑、溶劑、乳劑或懸浮劑等劑型。非經口劑， j &擇注射劑、點滴劑、卜用樂诏、吸入劑或坐劑等劑 4 1 ，主射劑可表示皮下注射背J、肌肉、/主射劑或鹿妒^肉、、士直 “ 心腹m射料。相錢，可表示經冗投予劑或軟膏劑等。.以含有々有為主成分之本發明藥劑的方式氣作上述劑型的製劑技術為公知的。例#經口投予用的錠劑，可藉由在本發明的藥劑中二賦形劑、朋散劑、結合劑及潤滑劑等並混合，進行壓朋相，-般使用碳酸刪基甲基纖維素妈等。結合劑， ur伯膠、㈣甲基纖維素，或聚乙稀基^各咬酮。 e w，以滑石或硬脂酸鎂等為公知的。於性Π本發明藥劑之錠劑’為了製作覆膜（_ k i n g )或腸 /合陡氣划，可以产 A知的塗覆。塗覆劑，可使用乙基纖維京或聚氧乙二醇等。 /主射4 ’可藉由將為主成分的本發明藥劑於適當

2125-8362-PF 39 200803897 的分散劑溶解、溶解或分散於分散劑而得到。藉由選擇分散劑，，能成為水性溶劑及油性溶劑其中之一的劑型。製作蒸餘水、生理食鹽水或林格氏液等作為分 ^ ’合剤可使用各種植物油或丙二醇等作為分散需要亦可添加對經苯甲酸醋（P⑽ben)等保存劑。注射月!ί中，可加入氯化納或葡萄糖等公知的等張劑。再者，可添加氯化苯二甲烴銨咖㈣⑽龍㈣或普羅卡因鹽酸鹽（· ^Procaine hydrochloride)等止痛劑。又’本發明之藥劑可藉由成為固體、液體或半固體化. 的組成物而作為外用劑。關於固體或液體組成物，可藉由製作前述同樣的組成物而製成外用劑。半固體的組錢，可在適當溶劑中視需要添加增黏劑而予以調製。溶劑，可使用水、乙醇或聚乙二醇等。增黏劑，—般使用膨潤土、聚乙烯醇、丙稀酸、甲基丙蝉酸或聚乙烯基吼㈣晒等。該組成物中，可添加氯化苯二甲烴銨等保存劑。又，藉由組合像可可脂之油性基材’或像纖維素衍生物之繼膠基材作為擔體，能製作成坐劑。本么明之藥劑於作為基因治療劑使用之情形，除了將本發明藥劑以注射直接投予之方法以外，例如有投予來自於重組有核酸之載體的方法。上述载體，例如:腺病毒載體、腺病毒伴隨載體、疹病毒載體盧主巧背戟股&病骨（vaccinia virus) 載體、反轉錄病毒載體、慢病毒（Lentivirus)載體等，藉由使用该專病毒載體，能以良好效率投予。又，本發明藥劑可導入於核糖體等鱗脂質小胞器，並

2125-8362-PF 40 200803897 扠予该小胞器。將保持有siRNA或shRNA之小胞器以微脂粒感染法（iipofection)導入於既定的細胞。並且，將得到之細胞對靜脈内、動脈内等全身投予。也可對肝纖維化組織等進行局部投予。siRNA在體外呈現非常優異的專一性、彔後抑制效果，但於體内由於血清中的核酸水解酶活性而被迅速分解，使持續時間受限，因此希望開發更佳效果的遞达系統。舉一例，〇chiya， T等於Nature ^ Med.,5:707-71 0, 1 999, Curr, Gene Ther., 1:31-52, 200 1 報告如果將為生體親合性材料的端膠原（Atei〇 —c〇ii叩⑷ ”戈此e形成複合體，則具有保護核酸免於受到活體中刀解酵素之作用，為非常適當的的載體，但本發明之藥劑導入方法不限於此等。本t明之藥劑，係於安全的投予量範圍類的甫礼動物，投予必要量（有效量）。本發明藥劑之投予量，可考慮劑型種類、投予方法、患者年齡或體重、患者症狀等，最後由醫師或獸醫師的判斷來適當決定。舉-例，雖然因年齡、性别、+ } 引症狀、投予路徑、投予次數、劑 1有所不同’例如於腺病毒之情形’投予量為每曰卜欠 1(3〜1Q13個左右週的間隔投予。又，為將siRNA或shRNA導入於目的組織或器官，可使用市售的基因導入套公司）。 ''' Adenoexpress:Clonetec 使用本發明樂劑之声 .^ 贯形’只要是表現肝纖維化之病症其適用部位或病症種類只不特別限定，例如適用於慢性肝

2125-8362-PF 41 200803897 火肝纖、，隹症肝硬變、肝衰竭、肝癌等對象。上述病症可為與其他病症併發者。又本务明之較佳態樣，關於含有軟骨素酶概作為有效成分的肝纖維化抑制劑。在此权月素酶ABC為分類在酵素編號EC4· 2. 2. 4的解離酶（lyase)(軟月素酶ABC解離酶）。軟骨素酶取，具有將含有1，4-/S-D-己糖醯胺（hexaminide)鍵結、 i，3m糖I基鍵結或u_a_L艾杜㈣基鍵結之多糖’分解除去為含冑4_去氧1♦糖+醛基鍵結之二糖的活性。軟骨素酶ABC’作用於硫酸軟骨1 A(軟骨素_4_ 硫酸)、硫酸軟骨素B(硫酸皮膚素），及硫酸軟骨素C(軟骨素-6-硫酸）及透明質酸，並將該等分解。、本發明使用之軟骨素酶胤，不予以限定，例如較佳為來自於普$變型桿菌（PrQteus vui抓⑷等變型桿菌 (Proteus)f 細 n 來自於糞錢桿 g (Baeteroides stercoris)等擬桿菌（Bacter〇ides)屬細菌。本發明使用之軟骨素酶ABC，較佳為來自於普通變型捍菌。本發明使用之軟骨素酶ABC，可為藉由將普通變型桿菌办讨㈣ VUlgariS)之萃取物進行硫安沉澱及DEAE-纖維素層析予以精製者（Yamagata，T. et al J Biol rh 仏，J. βι〇ΐ· Chem.，（1968) 243, P. 1523-1535)。本發明之來自於普通變型桿菌細_’ VUlgariS)的軟骨素酶ABC，例如：具有揭示於日本特開平 06-09讓之序列編號9的胺基酸序列的蛋白質，或於 DDBJ/EMBL/GenBank目際驗基序列資料庫（例如，可從雷

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Data Bank of Japan(DDBJ) 之網站 http: "www· ddb j. nig, ac· ip/Welcome-]存取）登錄為登§己編號E 0 718 3之驗基序列所編碼的蛋白質。本發明之軟骨素酶ABC，較佳為至少具有分解硫酸軟骨素A(軟骨素-4-硫酸）、硫酸軟骨素B(硫酸皮膚素），及硫酸軟骨素 C(軟骨素-6-硫酸）及透明質酸之活性。本發明之軟骨素酶ABC，可使用市售品，例如：軟骨素酶ABC( Proteus vulgar is)(生化學工業（股）公司，東京，曰本），或軟骨素酶 ABC(Proteus vulgaris)(Sigraa-Aldrich 公司，Saint Louis，Missouri， USA)。再者，本發明之軟骨素酶ABC，如果為該技術領域之人士，可藉由將編碼為軟骨素酶(例如，具有登錄為登δ己編號E 0 718 3之驗基序列）者，以重組法表現蛋白質，而輕易地製造。關於重組法等分子生物學的慣用方法，例如，詳述於 Molecular CloningrA Laboratory ^ Manual/Volume 3. Joseph Sambrook and David W Russell. 第 3 版 New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001 等。 ’ 含有本發明之軟骨素酶ABC作為有效成分的肝纖維化抑制劑，能有效果地抑制肝組織的纖維化（肝纖維化。本發月中抑制纖維化」，意指使產生纖維化之組織中的纖維化病變減少或消|，或延遲或阻止更進n纖維化進行（抑制纖維化病變的增大）。肝組織中纖維化的程度，可由該技術領域之人士以公

2125-8362-PF 43 200803897 知的各種方法予以評價。就最基本的方法而言，將肝活體檢查之中所見纖維化，例如將肝活體檢查樣本以特殊染色 (苯胺藍、Tri-Chrome或銀染色等）強調的纖維化組織的影像，予以組織學評價。纖維化之具體評價，例如可依照 K, etal. World J Gactroenterol. 31:4822-4826, 2005,

Hillebrandt S, et al. Nature Genetics 37:835-843, 2005,基於免疫組織學染色，將各試樣的肝纖維化水平以纖維化度數表示來進行。又，也可使㈣明㈣、！型、 ⑴型及IV型等㈣蛋白、纖維芽細胞、巨㈣等肝纖維 :標記’卩更簡便地評價肝組織中之肝纖維化程度。雖然間便，但視情形，4 了將肝纖維化程度靈敏地反應，可基於血小板數計測進行檢查。藉由腹部超音波檢㈣肝影像 H也可大致預騎纖維化之程度。再者，也可使用基於近年來EC〇Sence(EcoSence，France)公司所開發之瞬時舞性圖（transient elastGgraphy)技術的非侵人性肝纖維化測定法的測定機器（Fibro Scan5〇2等），評價肝纖維化含有本發明之軟骨素酶胤作為有效成分的肝纖維化㈣劑對於肝纖維化之抑制水平，可藉由基於該等方法所知到之肝纖維化程度評價來決定即可。含有本發明之軟骨素酶ABC作為有效成分的肝纖維化 =劑對於肝纖維化之抑制效果，尤佳為伴隨著肝組織中父膠原蛋白之延長抑制、！型谬原蛋白之沉殿抑制、纖、准牙、、、田月已之累積抑制、及巨嗔體之累積抑制之中至種’更佳為全部都有。含有本發明之軟骨素酶ABC作^有

2125-8362-PF 44 200803897 效成分的肝纖維化抑制劑對於肝纖維化之抑制水平，可r 將該等抑制效果其中1種以上作為指標來決定。本發明’係基於含有本發明之軟骨素酶ABC作為有效成分的肝纖維化抑制劑的有效成分軟骨素酶ABC ’在如後述實施例實證，發揮了非常高之肝纖維化抑制效果之全新見解者。該軟骨素酶ABC之肝纖維化抑制效果，與其他軟骨素酶比較，顯著地較優異。該軟骨素酶ABc之優異效果，

可認為是由於纖維化肝組織不易被軟骨素酶ac或軟骨素酶B等所讀的錢軟骨素種類或量堆積，而料可首攻被軟骨素酶ABC良好地切斷的原故。從近年來，據報告存在有硫酸化程度不同或硫酸基加成位置不同等各種種類的硫酸軟骨素，也可支持該假說的說服力。但是，本發明不受限於該假說。、本發明’藉由將含有本發明之軟骨素酶贏作為有效成分的肝纖維化抑制劑添加於肝組織試樣而使反應，能減低該肝組織中纖維化的程度。又’本發明，藉由將含有本發明之軟骨素酶ABC作為有效成分的肝纖維化抑制騎受試體投予，能有效果地抑制受試體之肝臟組織的纖維化。含有軟骨素酶侃作為有效成分的肝纖維化抑制劑的投予路徑不限^，較佳為非婉口路徑。非經口路徑之較佳例，例如：靜脈内、動脈内、2 腔内'肝_、直腸内及皮下路徑。含有本發明之軟骨素酶ABC作為有效成分的肝纖維化抑制劑，可進行全身投予，也可局部投予（例如，對肝臟之纖維化組織直接投予。）

2125-8362-PF 45 200803897 骨素酶ABC作為有，而抑制受試體之本發明，係關於將含有本發明之軟效成分的肝纖維化抑制劑對受試體投予肝臟纖維化的方法。再者，由於本發明含有之軟骨素酶ABC作為有效成分的肝纖維化抑制劑能有效果地抑制肝組織纖維化，為^ 療及預防肝纖維化病症(與肝組織之過度纖維化症可有利地使用。本發明-中，較佳肝纖維病症之例；限疋’ Vk性肝病症。慢性病症_般伴隨肝纖維化。本發明中：忮性肝病症之具體例’例如:慢性肝炎(慢性B型肝尺k !生C型肝炎等）、肝纖維症、肝硬變、肝衰竭、肝癌等。本發明之含有軟骨素酶ABC作為有效成分的肝纖維化㈣劑’尤其fi治療及預防肝硬變為有用#。本發明中，肝硬薆」，係指肝臟發生廣泛的纖維化，且喪失正常的 ^小葉f壤，改樣為異常構造（偽小葉/再生結節）之肝臟狀悲。肝硬變，以其病因或偽小葉之特性等而分類為許多種。又，像這種狀恶的肝臟稱為肝硬化。相對於此，「肝翁維症」係指呈現異常纖維化之狀態，但是肝小葉沒有發生改樣的狀態，一般稱為肝硬變的前階段。本發明中，肝硬變之具體例，例如··病毒性肝硬變、寄生蟲性肝硬變、中毒性/ 肝硬變、營養不良性肝硬變、酒精性肝硬變、缺血性肝硬變、肝硬化症、夏柯（charC〇t)肝硬變、托德（T〇dd)肝硬 4、原發性膽汁性肝硬變、續發性膽汁性肝硬變、單葉性肝硬變、伙fe性非化膿性破壞性膽管炎轉移之肝硬變、閉鎖性肝硬變、膽細管性肝硬化、膽汁性肝硬變、萎縮性肝 46

2125-8362-PF 200803897 硬變、壞錢性肝硬變、肝炎後肝硬變、結節性肝硬變、混合型肝硬變、小結節性肝硬變、代償性肝硬變、非性肝硬變、大結節性肝硬變、巾隔性肝硬變、特發性肝= 變、門脈周圍性肝硬變、門脈性肝硬變等，但不限於該等。就本發明之含有軟骨素酶ABC作為有效成分的肝纖維化抑制劑能夠投予之受試體，較佳為包含人類、家畜、气物、實驗動物等哺乳動物。尤其，罹患肝纖維化病症.，例如肝硬變或肝纖維症等之哺乳動物（患者），作為本發明之 :试體為尤佳的。其他實施形態，以未來容易轉變為肝硬文之肝纖維化病症(例如，慢性非化膿性破壞性膽管炎等) 之甫礼動物（患者）作為受試體亦為較佳的。本發明中，藉由對受試體投予本發明之含有軟骨素酶ABC作為有效成: 的肝纖維化抑制劑’能將肝臟之纖維化程度減低或延遲或 :止其邊維化之進行，其結果，能減低纖維化造成之肝臟 P早礙並將肝功能維持或改善為高水平，能夠治療或預防肝纖維化病症。本t月之3有以軟骨素酶ABC作為有效成分的肝纖維化：制劑的投予量，該技術領域之人士可適當決定，一般口以車人月素酶ABC之量，為每公斤體重1〇μ g〜lmg。么本發明亦關於藉由以該方式對受試體（例如患者）投予本’:月之S有以軟骨素酶ABC作為有效成分的肝纖維化抑制劑’而治療或預防包含慢性肝病症之肝纖維化病症（尤其是肝硬變）的方法。本&明之含有以軟骨素酶ABC作為有效成分的肝纖維

2125-8362-PF 200803897 化抑制劑，可為軟骨素酶ABC以外，含有任意製藥上可容 °午之（求學上不活化的）擔體、賦形劑、及/或稀釋劑的醫藥組成物。像這種擔體、賦形劑及/或稀釋劑以，例如：水生理食鹽水、磷酸緩衝液、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、羧基乙烯基聚合物、海藻酸納、水溶性葡聚糖、果膠、三仙踢、阿拉伯勝、明膠、壤脂、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二士蠟、硬脂醇、硬脂酸、人類血清白蛋白、甘露 ;，6山二乳糖等’但不限於該等。本發明之醫藥組成 ::二有保存劑等添加劑。本發明之醫藥組成 J 3有其他樂理成分。本發明之醫藥組成物，可以經口製劑或非絲 =供，較佳為以非經口製劑之形式提供。非：：之 g為液劑、懸浮劑等液體製劑，尤佳為注射劑。又’本置明提供—種肝纖維特徵為從受續巧掸士哪丨w d <師選方法，其 …疋又口式4樣中選擇具有抑制硫酸生或堆積之作用的物質。方^白夕糖產率地取得肝纖維化抑制劑^師選方法，能有效本發明之篩選方、土種肝纖維化抑制之一作用的物質方去之較佳態樣，劑之師選方法，包含匕3選擇以下（a)〜（d) 的步驟。 ) (a )硫酸軟骨素蛋 (b)硫酸軟骨素蛋 (c )硫酸軟骨素蛋白多糖之分解促進作用白多糖之合成抑制作用白多糖之脫硫酸化作用

2125-8362-PF 48 200803897 (d)硫酸軟骨素蛋白多糖之硫酸化抑制作用就該等共通的篩選基本原理，代表例例如包含以下步驟： (1 )石瓜軟骨素蛋白& 士电,4» ώ ,ΓΑΓΛ 蛋白夕搪（CSPG)本身/或糖胺聚多糖 (GAG)鏈/或產生（合成）CSPG或GAG鍵之細胞 (2)受試化合物(例如，製藥企業具有之龐大化合 ^貞測硫酸軟骨素蛋白多糖（GSpG)之切斷剖面/硫酸車人月素蛋白多糖（咖…游離糖胺聚多糖（gag)鏈之方法 "使用上述3種卫具。希望為將⑴與⑵於試管内或培養皿上混合，並對其效果以⑻簡便地谓測的步驟。口 …以下’例示本發明筛選方法之態樣。X，以下記載之態樣中，使用之硫酸軟骨去孕月素蛋白多糖、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制化合物、硫酸基轉移酵素、分解促進酵辛、脫硫酸化酵素之由來，例如有來自於人類、小鼠、大鼠等，自於該等。硫酸軟骨素蛋白多糖之一部分可為糖 f h贫白貝#構成要素或其一部分，不特別限定。又，用於以下態樣之受試化合物，不特別限定，例如. Μ化合物'有機化合物、無機化合物、蛋白質、狀等單合物’及化合物庫⑴brary)、基因庫之表現產物、細胞卒取物、細胞培養上清'發酵微生物產物、海洋生物萃取物、植物萃取物等。 /又，以下態樣中對受試化合物之「接觸」，通常係將 ““人月素蛋白多糖、其一部分、合成酵素、脫硫酸化酵

2125-8362-PF 49 200803897 素抑制化合物、硫酸基轉移酵素化酵素與受試化合物混合以進行，但並、酵素或脫硫酸可藉由將表現該等蛋白質或表現A法不限。例如，合物接觸，以、隹― /、邛匀的細胞與受試化口物接觸，以進行上述「接觸」。又，以下態樣中，「細胞小i、女白笙夕4 A 」乏由來，例如來自於人類、用本“之細胞，但不限於來自該等的細月包，也可利表現各“中使用的蛋白質之方式進行形質轉換的大腸菌、酵母菌等微生物細胞。、 W如表現硫酸軟骨素蛋白夕糖之細胞」’可利用：表現内在性硫酸軟骨素蛋白多糖基因，細胞’或被導人外來性硫酸軟骨素蛋白多糖基因並表現該基因之細胞。表現外來性硫酸軟骨素蛋白多糖之美因的細胞’通常可藉由將插人有硫酸軟骨素蛋白多糖㈣之表現載體導入寄主細胞來製作。該表現載體，可用一般的基因工程技術製作。又，以下記載中，「硫酸軟骨素蛋白多糖核蛋白質」， _例如如果為基質（matrix)型硫酸軟骨素蛋白多糖，為例如 aggrican、versican、neurocan、brevican 等核蛋白質，又’如果為膜型硫酸軟骨素蛋白多糖，為例如Decorin、 Biglycan、Fibromodul in、PG-Lb 等核蛋白質。又，「合成酵素」，例如：GalNAc4ST-1 、 GalNAc4ST-2 、 GALNAC4S-6ST 、 UA20ST 、 GalT-I 、 GalT-II 、 GlcAT-I 、

XylosylT等。又，「硫酸基轉移酵素」，例如：C4ST-1 (Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-0-sulfotransferase 1)、 2125-8362-PF 50 200803897 C4ST-2(Chondrotin D-N-acety1 gal actosamine-4-0-sulfotransferase 2)、 C4ST-3(Chondroi tin D-N-acetylgalactosamine-4-0-sulfotransferase 3)、 D4ST、C6ST-1、C6ST-2等。又，「分解促進酵素」，例如： ADAMTS-1 、 ADAMTS-4 、 ADAMTS-5 、 Chondroitinase ABC(ChABC) 、 Chondroitinase AC 、 Chondroitinase B 、

Calpain 等。又，「脫硫酸化酵素」，例如：Chondroitin-4-sulfatase、Chondroitin-6-sulfatase 等。本务明之篩選方法的態樣，例如包含選擇具有硫酸軟骨素蛋白多糖之分解促進作用的化合物步驟的方法。本發明之上述方法例如由包含以下步驟。 (a)使硫酸軟骨素蛋白多糖或其一部分與受試化合物接觸之步驟步 (b)測定硫酸軟骨素蛋白多糖或其一部分之存在量的一（C)於雙試化合物非存在下測定之情形比較，選擇使存在量降低之物質的步驟八~上述方法之中，首先使硫酸軟骨素蛋白多糖或其一部刀與文試化合物接觸。 :方& ’接著測定硫酸軟骨素*白多，或其一部分之 4子° 'Bj! ^ &面，該技術領域之人士可利用公知的方法适仃。例如，At m

使用與硫酸軟骨素蛋白多糖或其一部分結合 2125-8362-PF 51 200803897 之經標§己的化合物或抗體’藉由測定桿吃又，也可使用層析法或質量分析二里可予以偵測。太旅μ a 丨戌卞从读測。 " ，接著，與未接觸受試化人加以比較，選擇使硫酸軟骨素蛋白:之情形（對照）降低之化合物。使降低之化合，-部分存在量藥劑。、;肝纖維化治療的對於評價(測定)受試化合物是否進作用活性之方法，舉一簡單具體例如下。迹(a)分解促關於上述（a)硫酸軟骨素筛選法態樣：蛋白夕搪之分解促進作用之 CS:二GAG而言，準備硫酸軟骨素·A)、C“、 CS-CX生化.工業公司，ICN公司、Si_等)、來的蛋白多糖（BGN公司、ISL公司等）等， ^ ^ φ 乂 10/^g/inL 的遺又、:、黎；96 井盤（依照 KawashimaHetai ;j· Bi〇i 如 277:12921-12930，2002 等已知方、、表、 · 各種…人板 ⑷方去)。於該盤的各井添加各種又试化合物，於3rc反應2小時後，偵測cs_ga

變化。 J 广使測方法，例如WFA凝集素（紫藤凝集素）結合法為一種簡便的方法。由於WFA凝集素會結合於cs_gag鏈之 GalNAc殘基，能簡便地偵測CS_GAG。受試化合物之陽性控制組，使用軟骨素酶ABC。藉由添加軟骨素酶ABC，是因= 如果CS-GAG鏈分解，便不能與WFA凝集素結合，故利用此原理。更具體而言，將FITC標記WFA凝集素（Εγ公司等），在混合受試化合物前後，添加於cs塗覆井，藉由CS〜G^

2125-8362-PF 52 200803897 分解，能將井中FITC螢光強度變化以螢光盤讀取儀或螢光顯微鏡等偵測機器而極簡便地定量、數值化。於混合前後螢光數值減少最多的化合物，可判定為符合本概念的新穎的治療候選化合物。又，其他偵測方法，可使用將（^乂^本身直接標記的抗CS抗體（選殖體：CS56，生化學工業公司製）。與WFA凝木素同樣，藉由將FITC標記抗CS抗體添加於cs塗覆井，如果觀測螢光數值變化，則能於極短時間且簡便地進行大 _量篩選。更#細的偵測方法，例如藉由以原狀態使用受試化合物此合月後的盤，適用於sGAG Assay Kit(wlESLAB公司

製）、Sulphanated Glycosaminoglycans ELISA

Kit(FUNAK〇SHI公司製）等，將GAG含量精確定量、數值化之方法。更詳細地說，藉由於受試化合物混合前後的盤中添加 _2 AB(2 月女基笨甲醯胺，2 — amin〇benzamide)或 2-AP(2-胺基吡啶，2-amin〇Pyridine;皆為LU])公司製等），將游離 GAG鏠之還原末端簡便地進行螢光標記，並將糖鏈之各型、各型之含有率以HPLC、MALDI-MS、LC-MS等解析，能予以更詳細的解析。為詳細檢查候選化合物特性之篩選的次一階段的方法。 ^本發明篩選方法之其他態樣，例如：包含選擇具有硫酸权骨素*白多糖之合成抑制作用《步驟的方法。本發明之上述方法例如包含以下步驟。

2125-8362-PF 53 200803897 (a) 使表現硫酸軟骨素蛋白多糖或其一部分之細胞、該細胞萃取物，或包含構成硫酸軟骨素蛋白多糖合成過程之酵素及基貝專之物質群與受試化合物接觸之步驟 (b) 測定前述細胞、細胞萃取液或物質群中，硫酸軟骨素蛋白多糖或其合成過程中之中間體合成量的步驟 (C )與未接觸受試化合物之情形比較，選擇使前述合成量降低的化合物的步驟上述方法中，首先使表現硫酸軟骨素蛋白多糖或其一 _部分之細胞、該細胞萃取物，或包含構成硫酸軟骨素蛋白多糖合成過程之酵素及基質等之物質群與受試化合物接觸。接著，測定硫酸軟骨素蛋白多糖或其合成過程中之中間體合成量。測定方面，該技術領域之人士可使用公知的方法，例如，利用經過標記之抗體的方法、質量分析法、層析法等而適當實施。 Φ 再者，與未接觸受試化合物（對照）之情形比較，選擇使合成量降低（抑制）的化合物。使降低（抑制）之化合物成為用於肝纖維化治療的藥劑。對於評價（測定）受試化合物是否具有上述（b)合成抑制作用之方法，舉一簡單具體例如下。關於上述⑻琉酸軟骨素蛋白多糖之合成抑制作用之篩選法態樣：合成硫酸軟骨素之細胞、細胞株為該技術領域之人士已知的。於人類，例如抽取健康者的微血管血後，藉由將

2125-8362-PF 54 200803897 單核球予以分離、培養之標準方法，進行1 6小時細胞培養’產生硫酸軟骨素（Uhl in-Hansen L et a 1.，B1 ood 82 : 2880，1 993等）。又，更簡便地，將例如已知細胞株，例如：纖維芽細胞株 NIH3T3(Phillip HA，etal. J. Biol.

Chem· 279:48640，2004等）、來自於腎小管之癌細胞株 ACHNCKawashima H et al., J. Biol. Chem. 277:12921 2 002)、來自於腎遠曲小管之細胞株MDCK(Borges FT et al

Kidney Int. 68:1 630， 2005等）、血管内皮細胞株 HUVEC(Schick BP et al·，Blood 97:449，2001 等）等多種。於將像這種細胞培養一定時間的過程中，混合各種受試化合物，能將培養前後CS-GAG量的變化以上述（a)之方法簡便地數值化。抑制細胞培養後CS — GAG增加（亦即，反映CS-GAG合成量）之化合物，可輕易地判定為滿足本概念的治療候選化合物。又，也可更有選擇性地，例如將GalNAc4ST—丨或籲XylosylT等CS-GAG合成酵素之基因以周知的方法導入細胞或L細胞，製作成隨時表現的細胞株。藉由使用像這種隨時合成CS-GAG之細胞株，能夠更為清楚地判定治療候選化合物。 Λ 本發明篩選方法的另-態樣，例如包含選擇具有硫酸軟骨素蛋白多糖之脫硫酸化作用之物質的步驟。本發明之上述方法例如包含以下步驟。 (a)使硫酸軟骨素蛋白多糖或其_部分與受試化合物揍觸之步驟

2125-8362-PF 55 200803897 (b)測定硫酸軟骨素十的量的㈣蛋白夕糖或其-部分受到硫酸化 (C)與党試化合物非存在下所測定之情形比叉到硫酸化之量降低之物質的步驟述方法中，f先使硫酸軟骨素蛋白多糖或其一部分與5:试化合物接觸。本發明接著，敎硫酸軟f素蛋白多糖或其—部分受到硫酸化的量。須丨！定可/由1 則疋了使用该技術領域之人士所公知的方 :進行。例如使用與硫酸軟骨素蛋白多糖或其-部分中殘 !:脫硫酸化構造結合之經標記的化合物或抗體，藉由測疋標纪量可予以偵測。又，也曰^ 等予則貞測。用層析法或貝1分析法本發明接著，與未接觸受試化合物之情形（對照）比較’藥擇使賴料素蛋㈠㈣其1分之存在量降低的化合物。使降低的化合物成為用於肝纖維化治療的藥劑。對於評價（測定）受試化合物是否具有上述（c)脫㈣化作用活性之方法，舉一簡單具體例如下。關於上述（C ) 硫酸敕骨去i &夕& 選法態樣： “素蛋b糖之脱錢作用之筛基本上與上述⑷之方法同樣地，準備來自於人類之蛋白多糖（BGN公司、ISL公司等），以的濃度塗覆於 96 井盤（依照 KaWashima H et al;J· Bi〇i· 277:12921_1293ϋ，謹等已知方法）。於該盤的各井⑼ 各種受試化合物，於3rc反應2小時後，偵測cs—㈣的 2125-8362-PF 56 200803897 變化。偵測方法，藉由脫硫酸化，使殘存於蛋白多糖之核蛋白質側的脫硫酸化斷片的2糠構造，與抗蛋白多糖△ d丨4S 抗體（選殖體；2 -B- 6、認識4位受到硫酸化之部分）或抗蛋白多糖△ d i 6S (選殖體；3-B-3、認識6位受到硫酸化之部分，皆為生化學工業公司製）反應，能輕易地偵測受到硫酸化之部分。因此’於混合培養前後的盤，使經過FI tc標記 •的2-B-6或3-B-3抗體反應，能簡便地偵測其螢光數值的變化。使反應前後之螢光強度增加的化合物，可判定為較能促進脫硫酸化的物質，能簡便地鑑定為滿足本概念之新穎治療候選化合物。本發明篩選方法的另一態樣，例如包含選擇具有硫酸軟骨素蛋白多糖之硫酸化抑制作用之物質的步驟。本發明之上缚方法例如包含以下步驟。 (a) 使表現硫酸軟骨素蛋白多糖或其一部分之細胞或 •細胞萃取液或包含構成硫酸軟骨素蛋白多糖之硫酸化過程的酵素、基質等之物質群，與受試化合物接觸之步驟^ (b) 測定前述細胞、細胞萃取液或物質群中硫酸敕蛋白多糖之硫酸化活性的步驟人月” 選擇使前述活性 (c )與未接觸受試化合物之情形比較降低之物質的步驟上述方法中，首先使硫酸軟骨素蛋白多糖或复八與受試化合物接觸。 77 本發明接著，測定硫酸軟骨素蛋白多糖或其為

2125-8362-PF 57 200803897 到硫酸化的量。測定可 ^ 用該技術領域之人士所公知的方知、了例如使用與硫酸軟骨素蛋白多糖或其一部分之硫馱化構造結合之經標記的化合物，可予以偵測。又，也可傕用里也了使用層析法或質量分析法等測。丨只 ^本發明接著，與未接觸受試化合物之情形（對照）比車又’選擇使硫酸軟骨素蛋白多糖或其—部分之存在量降低 •的化合物。使降低的化合物成為用於肝纖維化治療的藥劑。對於評價（測定）受試化合物是否具有上述（d)硫酸化抑制活性之方法，舉一簡單具體例如下。關於上述（d)硫酸軟骨素蛋白多糖之硫酸化抑用之篩選法態樣：促進硫酸軟骨素蛋白多糖之硫酸化的細胞、細胞株與上壤(¢)1細胞、知聰楱為一藜的。於將像這種細胞株培養 -定時間的過程中’與各種受試化合物混合，例如以偵測 • 4位硫酸化之抗體（選殖體；LYm)或偵測6位硫酸化之抗體（選瘦體；MC21C，皆為生化學工業公司製），.能簡便地進行確認培養前後的硫酸化程度。也可使用螢光標記抗體，比較培養前後的螢光數值，也可與上述（c)同樣地，於培養月ίι後進行使用2-B-6或3-B-3抗體之偵測法。抑制培養後硫酸化增加（LY111或M21C之螢光數值增加）的化合物，或促進細胞培養後脫硫酸化進行（2-Β-6或3-Β-3之榮光數值增加）的化合物，能輕易地判定為滿足本概念的治療候選化合物。 2125-8362-PF 58 200803897 又，也可更有選擇性地，例如將C4ST-1或C6SH等硫酸基轉移酵素之基因以周知的方法#人⑽細胞或^ 胞，製作成隨時表現的細胞株。藉由使用像這種隨時進行硫酸基加成之細胞株’能夠更為清楚地判定治療候選化八物。。本發明另-較佳態樣’為—種包含以下⑷〜⑷之步輝的肝纖維化抑制劑的筛選方法，選擇使本發明之硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、人出祕主。成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質或硫酸基轉移酵素之基因表現水平降低之化合物使硫酸軟骨素蛋白多糖之分解促進酵素或脫硫酸化酵素之基因表現水平上升的化合物。 U)使編碼為表現硫酸軟骨素蛋白多耱之核蛋白質、合

成酵素'脫硫酸化酵素抑制蛋白質、硫酸基轉移酵素、I 解保酵素或脫硫酸化_夸夕| m k 刀 (b)測定前述細胞中基因表現量的步驟 (c )將該表現量|於辱叫 u化合物非存在下測定之情形〔對肤）加以比較之步驟 ⑷於μ述基因為錢軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、合酵素1硫酸化酵素抑制蛋白f或硫酸基轉移酵素之: 形’選擇前述基因表旦 ' 見里與對照比較為降低之化合物，於刖返基因為硫酸軟骨夸化酵夸夕味月素蛋白夕糖之分解促進酵素或脫硫酸化合I 選擇前述基因表現量與對照比較為上升的

2125-8362-PF 59 200803897 糖之按去之中’百先使編碼為表現硫酸軟骨素蛋白多合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質、硫 =基2料、分解促進酵素或脫硫酸㈣素之基胞，與受試化合物接觸。著測定編碼為硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白二、Λ 脫硫酸化酵素抑制蛋白質、硫酸基轉移酵 4刀因#促進酵素或脫硫酸化酵素之基因的表現量。在此，二表現量J包含轉錄及轉譯兩者。基因表現量之測定，可利用该技術領域之人士所公知的方法進行。取例Γ將峨從表現上述任-蛋白質之細胞以定法萃取’亚貫施以該Α或f 4c , D…法等，可測定=:北方雜交法、RT-PCR法、 Α , ,. ΟΛ 土因之轉錄量。又，從表現編碼 :::壬蛋白質之基因的細胞中回收蛋白質區分，藉由 11轉i㈣之她ρ 等電泳法摘㈣測 :基=澤量。再者，使用對抗上述任一蛋白質之抗體，貝施西方墨點法（West 譯量。使用於m Blottl叫）’也能敎基因的轉即不特胸偵測的抗體’只要是能偵測的抗體， ’ -ν’例如可利用單株抗體或多株抗體兩者。 “本發明，接著’與未接觸受試化合物之情形（對照）比車父该基因之表現量。本么月’接者’於前述基因為硫酸軟骨核蛋白質、合成酸去^ ^ ㈡夕總< 棘#醢去 V “、石瓜酸化酵素抑制蛋白質或硫酸基夕-形’選擇使前述基因表現量與對照比較為降一 p 1之化合物。使降低（抑制）之化合物，成為用於肝

2125-8362-PF 60 200803897 b抑制之藥劑或肝纖維化治療的候選化合物。去於則述基因為硫酸軟骨素蛋白多糖之分解促進酵為:脫硫酸化酵素之情形，選擇使前述基因表現量與對昭成較為上升（增強）的化合物。使上升（增強）的化合物， = 肝纖維化抑制之藥劑或肝纖維化治療的候選化合又’本發明篩選方 '兵 — 骨夸心樣，為將使本發明硫酸軟 ►蛋白夕糖之核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制二::酸基轉移酵素之基因表現水平降低的化合物之美^ 蛋自多糖之分解'促進酵素或脫硫酸化酵素 ==平上升的化合物，利用報告基因表現作= 才示而予以選擇的方法。本發明勹扣 u)〜u)之步驟。述方法例如包含以下 (a)像含有具有使編碼為硫酸軟骨n ώ & 白質、合成酵素、脫硫酸化酵素= 多糖之核蛋酵素、分解促進酵素或脫硫酸化酵素之^的=基轉移域與報告基因以功能性結合構造之m』的轉錄調節區液’與受試化合物接觸之步驟。的細胞或細胞萃取 =前述報告基因之表現水平的步驟驟未接觸受試化合物之情形（對幻加以比較之步 (d)於前述報告基因係與多糖之核蛋白質、合成酵、、’、丸為硫酸軟骨素蛋白硫酸基轉移酵素以功能性結合==酵㈣制蛋白質或 3 ^ ’選擇前述報告基因

2125-8362-PF 61 200803897 之表現水平與對照比較為降低之化合物，於前述報告基因係與為2酸軟骨素蛋白多糖之分解促進酵素或脫疏酸化酵素以功能性結合之情形，遗姐選擇别述報告基因之表現水平盥對照比較為上升的化合物。〃夕本方法之中’ f先使包含具有將編碼為硫酸軟骨素蛋硫酸基轉移酵辛分解^酸去酵素抑制蛋白質、京”解促進酵素或脫硫酸化酵素之A因的轉錄調節區域與報告基因以功能性結土或細胞萃取液，與受試化合物接觸。〇 & 的細胞在此’ 「功能性結合得蛋白多糖之核蛋白質、人成酵=θ編碼為硫酸軟骨素所心装# 、成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白素、分解促㈣素或脫硫酸化酵辛之灵方式，__素蛋:多：=告基因表現之素、脫硫酸化酵素抑制蛋白 '蛋白質、合成酵進酵素或脫硫酸化酵素之基二轉移酵素、分解促結合。因此，於報告基因已結合區域與報告基因產物形成融合蛋白質之情形，只要是與其他基因軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、人、此藉由在編碼為硫酸制蛋白質、硫酸基轉移酵素、^酵素、脫硫酸化酵素抑素之基因的基因調節區域結合^ 進酵素或脫疏酸化酵蛋白表現，則包含於上述「功能性結=’而能誘導該融合為硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白所、° 口」之意。基於編碼酵素抑制蛋白質、硫酸基 :、合成酵素、脫硫酸化㈣素 '分解促進酵素或脫硫

2125-8362-PF 62 200803897 酸化酵素之基因的 η ί 鹼基序列，該技術領域之人士，可以用周知的方法取得 ^ τ 蛋白多^ 土 _中所存在的編碼為硫酸軟骨素贫臼夕搪之核蛋白質、入 ^ ^ 質、口成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白基轉移酵素、分解促進酵素其因的轉錄調節區域。 — 夂％呼|之基本方法使用之報告基因，σ 不特別限定，例如谓/因月:夠偵測其表現即可， rin 、土口、lacZ基因、發光酶 (uciferase)基因及 gfp 美 θ 笙「a '酸軟骨素I白夕土。匕含具有將編碼為硫抑=! 核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質、硫酸基轉移酵素、、畔京酵素之基因的轉錄調節區域力^脫硫酸化之舰的細胞」，例如導入有已:基=功月u生結合構造有已插入像這種構造之韵雜沾該技㈣域之人士周知的方法二電脈衝穿孔法、微脂粒感染法、微注射法等實施。、具有將編碼為硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋人成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質、硫酸夸二 ==或脫硫酸化酵素之基因的轉錄調二 :於性結合構造之讓的細胞」，亦包含該構造插 ^色體的細胞。對染色體插入_構造，可使用該技術領域之人士一般使用的方法導入法進行。 u如利用相同重組的基因「包含具有將編碼為硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質、硫酸基轉移酵

2125-8362-PF 63 200803897 素、分解促進酵素或脫硫酸化酵素之基因的轉錄調節區域與報告基因以功能性結合構造之DNA的細胞萃取液」，例如：在市售試管内轉錄轉譯套組所含的細胞萃取液中，添加具有編碼為硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白f、合成酵^、σ 脫硫酸化酵素抑制蛋白質或硫酸基轉移酵素之基因的轉錄調節區域與報告基因以功能性結合構造之驗者。、在此，「接觸」係於「包含具有將編碼為硫酸軟骨音 :白多糖之核蛋白f、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質、硫酸基轉移酵素、分解促進酵素或脫硫酸化酵素之其因的轉錄調節區域與報告基因以功能性結合構造之職= 細胞」的培養液中添加受試化合物，或也可藉由將受試化 =物添加於包含該腿之上述市售細胞萃取液以進行。受試化合物為蛋白質之情形，例如可藉由將表現該蛋白質之 DNA霧露麗寒細參導入以燦行。 ' 本方法中’接著，測定該報告基因之表現水平。報告

基因之表現水平，可視該報告基 ..L 口之種類，由該技術領域之人士以公知的方法測定。灼如5亥報告基因為CAT基因 < It形’可藉由測定該其疋亥基因產物所致之綠黴素 =咖P—丨）乙酸化，而測定報告基因的表現量。於報告基因為lacZ基因之情 ffl 了猎由偵測該基因表現產 ::;觸=用所致色素化合物之呈色，又，發光酶基因之 :榮 4錢因表現產物之觸酶作用所致螢光化合物 <愛先，又，為GFP基因之悟拟 π仏螢央之障形，可偵測GFP蛋白質所致愛九’而測定報告基因的表現量。

2125-8362-PF 64 200803897 本方法，接者，將所測定之報告基因表現水平，叉試化合物非存在下測定之情形(對照)加以比較。、酸軟=!:接著，於前述報告基因係與前述基因為破女月素蛋白多糖之核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素、、付矽呷|以功能性結合之情形，選擇人:】述報告基因之表現水平與對照比較為降低(抑制)之化二：，、使降低(抑制)之化合物，成為用於肝纖維化抑制之樂蜊或用於肝纖維化治療的候選化合物。述報σ基111係與為硫酸軟骨素蛋自多糖之分 =進酵素或脫硫酸化酵素以功級結合之情形，選擇使 :述報告基因之表現水平與對照比較為上升(增強)的化合南使上升（增強）的化合物’成為用於肝纖維化抑制之藥 j或用於肝纖維化治療的候選化合物。，錢m射㈣㈣轉維化抑制劑，較佳纖維化病症之治療用或預防用。 ^本發明提供包含心實施本發明㈣方法用之種樂劑、試藥等之套組。合本發”套組，❹可彳林發明之上述各種試藥之 :二實施筛選方法予以適當選擇。例如本發明之套组，發明之賴軟骨素蛋自多糠作為構成要素。本發，等：：可進一步包含本發明方法使用之各種試藥、容 Γ丄例如，可適當包含抗硫酸軟骨素蛋白多糖抗體、探試藥、細胞、培養液、對照樣本、緩衝液、。己載有使用方法之說明書等。

2125-8362-PF 65 200803897 本發明之較佳態樣，法，包含偵測是否抑制τ 肝纖維化抑制劑之篩選方積的步驟。因此二:酸軟骨素蛋白多糖之產生或堆素蛋白多糖侦物以用二中對=可包含在硫酸軟骨白多糖之基因的探針或用、仏編碼為硫酸軟骨素蛋 jr ( · . ^ /以將该基因之任意區域放大的引

子（primer)等寡核苷酴，+ w , 八幻W 碰或認識硫酸軟骨素蛋白多糖之枋體（抗硫酸軟骨素蛋白多糖 A/. ^ 體），作為本發明之抗肝纖維化抑制劑師選用套組的構成要素。上述寡核苦酸，例如與本發明之核蛋白質基因的DNA專一性雜$去。α # 「、寻庄雜乂者。此處，「專一性雜交」，係指於通常的雜交條件下’較佳為嚴格雜交條件下（例如，

Sambrook f > Molecular Cloning, Cold Spring Harbour

Laboratory Press，NewY〇rk，邶八，第卩版“⑽記載的絛件）’见顧著赢皇鴒碼為其他胥白質之DNA產生交互雜父。如果能專一性的雜交，則該寡核苷酸不需要與本發明之Vers i can核蛋白質基因的驗基序列完全互補。本發明中’雜交的條件，例如：「2xssc、0. 1%SDS、 50 C」、「2xSSC、0· USDS、42°C」、「lxSSC、0· 1%SDS、 37°C」，更嚴格條件，例如r 2XSSC、0· 1%SDS、65°C」、「0· 5xSSC、〇· 1%SDS、42X：」及「0· 2xSSC、0· 1%SDS、65°C」

等之條件。更詳細地說，就使用 Rapid-hyb buifer(Amersham Life Science)之方法而言，可於 68°C 保持30分鐘以上進行雜交後，添加探針於68°C保持1小時以後形成雜交物，之後於2xSSC、0. 1%SDS中，於室溫清 2125-8362-PF 66 200803897 洗20分鐘3次，接著，於lxSSC、〇1%SDs中，在37亡進行20分鐘之清洗3次，最後，於lxSSC、〇 i%s此中，在 5〇°C進行20分鐘之清洗2次。此外，例如，於吻匕

Hybridization Soluti〇n(CLONTECH)中，於 55t：進行 3〇分鐘以上預雜交後，添加標記探針，於37〜55它溫育1小時以上，於2xSSC、0.USDS中，於室溫清洗2〇分鐘3次，於以^觸…在咖進行別分鐘之清幻次。在此，藉由將預雜交、雜交或第2次清洗時的溫度設定為較高，能成為更為嚴格的條件。例如，可將預雜交及雜交溫度設為6『C ’更嚴格之條件定為阶。如果為該技術領域之人士，在像這種緩衝液之鹽濃度、溫度等條件以外，可考量探針濃度、探針長声 ^ 又彳木針鹼基序列構成、反應時間等其他條件予以設定條件。錢趁f藥，可用於上堞本#明之筛選用套組之探針或引子。該寡核苷酸作為較佳為17b = 吏用之其長度通常為 “ 為叫3_。引子只要能將上述本發明中之基因的職至少-部分放大即可，不特別限制。、本，勺又明提供—種肝纖維化病症之治療或預防方驟。匕3 :發明之藥劑對個體（例如，患者等）投予的步療對象的個體’只要能發生肝纖、、、：:乂 4勿即可，不特別限定，較佳為人類。對個體的投予，一 .+ 所公知之方法，，又广，可利用該技術領域之人士 j如：動脈内注射、靜脈内注射、皮下注射

2125-8362-PF 67 200803897 等。投予量依照患者之體重或年齡、投予方式等而有所變動，如果為該技術領域之人士（醫師、獸醫師、藥劑師等），可適當選擇適當的投予量。再者，本發明關於本發明之藥劑於肝纖維化抑制劑製造之使用。又’本說明書中所有的先前技術文獻，引入於本說明書中作為參考。實施例以下用實施例對本發明更具體地說明。惟，本發明之技術範圍不限於該等實施例。宜·^ 1:硫_酸軟骨素蛋白多糖模_式中）表現的增加於該實施例中，就慢性纖維化病症模式小鼠之典型例’ ilMJi惠你磷（CC10所衍秦的小鼠肝填維症模式，製作小鼠肝硬變模式，並以免疫組織學染色法檢查蛋白多 _糖的堆積狀態。該小鼠肝纖維病症模式的再現性優異，也廣泛使用於肝硬變模式的實驗系（Sakaida L et al

Hepatology 40:1304-1311， 2004)。首先，對C57BL/6JcL小鼠（雌，5〜6週齡，日本Clea 公司製），將四氯化碳（25/zl/l〇〇g體重；Sigma-Aldrich公司製），每週2次共4週（8次）進行腹腔内注射，誘發肝纖維症。再將四氯化碳以每週2次共2週追加投予（總計12 次），誘導肝硬變。將被誘導肝硬變的小鼠宰殺，並採取其肝臟（肝硬化）。另一方面，於對照實驗，使用從未進行四

2125-8362-PF 68 200803897 氯化碳投予之同週齡C57BL/6JcL小鼠（雌，日本ciea公司製）採取的肝臟（正常肝）。將所採取肝臟之第2葉一部分包埋於冷凍用包埋劑 0CT組合物（Miles公司製），以液態氮製作冷凍塊體。以冷凍組織切片機（Cryostat，Micr〇m公司製）從該冷凍塊體製作厚度6//m的切片。將知到的切片用丙酮（和光公司製）固定i 〇分鐘後，以磷酸缓衝液清洗，再添加作為一次抗體之抗硫酸軟骨素蛋白多糖（CSPG)抗體（選殖體CS56、小鼠單株抗體、1〇#g/mL; 生化學工業公司製）、抗軟骨素-4-硫酸蛋白多糖（C4SPG) 抗體（選殖體LY111、小鼠單株抗體、1〇// g/mL;生化學工業公司製）、抗軟骨素-6-硫酸蛋白多糖（C6spG)抗體（選殖體MC21C、小鼠單株抗體、1〇 " g/mL;生化學工業公司製），或抗硫釀乙醯肝素葦白多糖（HSPG)/Perl ecan抗尊（大鼠單株抗體、10/zg/mL;大日本製藥公司製），於室溫使反應1 籲小犄。接著，使用 HistoFine mouse stain kitOiichirei 公司製；於對抗小鼠單株抗體而使用），或過氧化酶標記抗大鼠IgG(Bi〇source公司製；1:200稀釋；對抗大鼠單株抗體使用）進行二次抗體反應後，添加DAB基質么1 Θ 。以光學顯微鏡（Le i ka公司製）觀察試樣，確認有以才示色"5虎可見化之抗體結合。知到之肝組織的免疫染色像之例子如圖1所示。圖1 中’左侧的列表示正常肝、右側的列表示肝硬化。正常肝，亦即未處置之同週齡小鼠的肝臟，在CSPG(最上排）、 2125-8362-PF 69 200803897 C4SPG(第：排），於肝f狀隙腦。⑷内被認為有稍許的陽性信號，但於C6spG(第三排）為全未铺測到另方面，肝硬化，亦即以四氯化碳誘導肝硬變狀之纖雉化的肝臟，於CSPG(最上排）、C4spG(第二排）、C6sp(j(第三排）皆在竇狀隙中心’與正f肝比較，顯示廣泛地有信號強度顯著增強的陽性信號。關於抗硫酸乙醯肝素蛋白多糖 (HSPG)，於正常肝在竇狀隙中心偵測到強的陽性信號，但是即使為肝硬化，信號強度或分布也不認為有大的差異。

因此，本肝硬變模式，解明肝臟内CSPG量之增加，比起 HSPG為顯著的。小鼠肝廍化姥，砧夂, 軟骨素的切斷能力本貝施例，探时各楂形式的軟骨素酶對於肝硬化組織切片中嚴墓魏.熬骨意（ς就g)的切斷能力。如以下所示，將肝硬化的組織切片以軟骨素酶處理，於該酵素反應結束 _後，將殘存於組織切片的CSPG，亦即以軟骨素酶處理未切斷部分的CSPG，以免疫染色法偵測。首先，對C57BL/6JcL小鼠（雌，5〜6週齡，日本Clea 公司製），將四氯化碳（25/z l/100g體重；Sigma—Aldrich公司製）’母週2次共4週（8次）進行腹腔内注射，誘發肝纖維症。再將四氯化碳以每週2次共2週追加投予（總計12 次），誘導肝硬變。將被誘導肝硬變的小鼠宰殺，並採取其肝臟（肝硬化）。將所採取肝臟之弟2葉一部分包埋於冷束用包埋劑 2125-8362-PF 70 200803897 OCT組合物（M i 1 es公司製），以液態氮製作冷柬塊體。以冷 /東組織切片機（Cryostat，Microm公司製）從該冷凍塊體製作厚度6 /z m的切片。將得到的切片用丙酮（和光公司製）固定〗〇分鐘後，以磷酸緩衝液清洗，接著，於Tris-HCL緩衝液（2〇mM，pH8. 〇) 中，於3 7 C溫育15分鐘後，對每一切片添加1 〇〇 # l軟骨素酶ABC溶液（生化學工業公司製；5u/mL)、軟骨素酶AC溶 _液（生化學工業公司製；5U/mL)、軟骨素酶β溶液（生化學工業公司製；5U/mL)或僅有緩衝液（軟骨素酶（―））而將切片覆蓋，再於37°C溫育1小時。酵素反應結束後，添加抗CSPG抗體（選殖體CS56、小鼠單株抗體、10# g/mL;生化學工業公司製），於室溫反應 1 小％後，使用 HistoFine mouse stain kit(Nichirei 么、 7義）鹿展赛’再添加D AB棊質（N i ch i r e i公47農）。以光學顯微鏡（Leika公司製）觀察試樣，確認有以棕色信號可見化之抗體結合。結果如圖2所示（倍率200倍）。僅以緩衝液處理的切片（亦即未進行酵素處理的切片），cspG陽性信號（棕色）於廣泛範圍以與圖丨之肝硬化為同程度之顯著高強度被偵測到（圖2;最左；軟骨素酶（_))。另一方面，以軟骨素酶ac 處理的切片，與軟骨素酶（-)的切片比較，CSPG陽性信號減弱，陽性面積也減少（圖2;左起算第2圖；軟骨素酶 AO。此表示軟骨素酶AC確實能將堆積於肝硬化組織中的 CSPG切斷。但是，以軟骨素酶仏處理之該切片，仍偵測

2125-8362-PF 71 200803897 到未完全切斷而殘存的CSPG。又，以軟骨素酶B處理之切片，與以軟骨素酶Ac處理之切片比較，CSPG暢性信號更為減弱，陽性面積也更減少。由此可知軟骨素酶B能將堆牙貝於肝硬化組織中的CSPG切斷更多。但是以軟骨素酶B處理之切片，沿著偽小葉構造仍能偵測到殘存的cspG。以上所不，以权骨素酶AC或β處理，不能將沉澱於高度纖維化之肝硬化中的CSPG完全切斷。相對於泫等結果，經過軟骨素酶ABC處理的該切片，幾乎未偵測到CSPG陽性信號（棕色），與軟骨素酶（_)之切片比較’明顯地表示CSPG消失。亦艮p，軟骨素酶ABC，能將沉澱於像肝硬變之高度纖維化病灶的CSPG以非常良好的效率切斷。於小鼠肝硬# 槿式土 1 對C57BL/6JcL小鼠（雌，5〜6週齡，日本ciea公司製）， _將四氯化碳（25//1/1〇〇2體重；以2脱一八1(11^吮公司製），每週2次共4週（8次）進行腹腔内注射，誘發肝纖維症。再將四氯化碳以每週2次共2週追加投予（總計12次）。於追加投予之前，對於小鼠，預先將已注入軟骨素酶 ABC(Chase ABC)(20U/mL;Sigma-Aidrich 公司製）、軟骨素酶 AC(ChaSeAC)(20U/mL;Sigma-Aldrich 公司製）、軟骨素酶 B(Chase B)(20U/mL;Sigma-Aidrich 公司製）或僅有 pBs 各150/z L·的Alzette滲透壓唧筒（MURACH〇u機器公司製），以手術埋在腹腔内。將進行了該處置的小鼠群，各命名為 2125-8362-PF 72 200803897

Chase ABC 群、Chase ΑΓ 淼 ru ^ dse札群、Chase B群及對照群。該處置，各群皆為在接受2 q由接又Z週期間之四氯化碳追加投間，從埋在體内的哪筒一直注入定量的液體。 ^ 於四氯化碳之ϋ加投予結束後，將各群的各小殺1採取肝臟，從採㈣肝臟，以與實調〗同樣的方式製作冷凍切片的樣本，進行免疫組織學的解析。該解析，係將作為-次抗體之兔抗小氣ΙΠ型膠原蛋白抗體（1..25G稀釋；如心取公司製）添加於試樣，於室 ’皿使反應1小時。接著，添加作為二次抗體之驗性碟解酶才不圮抗兔 IgG(l:2〇0 稀釋；jacks〇n immun〇Research 公司製）於至溫再反應3 0分鐘後，添加鹼性磷解酶呈色基質 (Vector Red; Vector Laboratory 公司製）。以光學顯微鏡 (Leika公司製）觀察試樣，確認有紅色信號可見化的抗舍。所得到肝組織的免疫染色像之例如圖3所示。對照群，以兔抗小鼠III型膠原蛋白抗體所偵測到的Ιπ型膠原蛋白纖維，不僅在一般竇狀隙，還從中心靜脈連續延長至門脈，一部分形成偽小葉（圖3之左部）。此為肝硬變的典型影像。相對於此，Chase ABC酵素群，I π型膠原蛋白的伸長很輕微（圖3之右部）。基於上述進行的免疫組織學染色，將各試樣的肝纖維化程度依照已知報告（Dai K, et al· World j Gactroenter〇1_ 31:4822-4826, 2005; Hillebrandt S, et al. Nature

Genetics 37:835-843，2005)，評價纖維化度數。纖維化 2125-8362-PF 73 200803897 度數之評價基準如下。〇度：正常、1度：中心靜脈起有少量的膠原蛋白伸長、2度：中心靜脈起有明白的膠原蛋白伸長，但為未包圍肝臟全體之程度、3度：中心靜脈起有明白的膠原蛋白伸長，為包圍肝臟全體之程度、4度：肝臟全體有瀰没性的膠原蛋白伸長，形成偽小葉。結果如圖4 °各棒代表於各群之纖維化度數的平均值土標準偏差。如圖4所示，對照群為5. 3i〇· 4(η = 6)，相對於此，Chase ABC 酵素群（2· 〇土〇· 6(n=6)、Chase AC 酵素群 (2· 9i_0· 7(n=6)、Chase B 酵素群（2· 6±0· 5(n = 6)。如果與對照群比較，Chase ABC酵素群（ρ=〇· 00018, t檢定）及Chase B酵素群（p=0. 00 29，t檢定）於統計學上纖維化顯著減輕。尤其，Chase ABC酵素群，與chase AC酵素群（p = 〇. 〇〇19， t檢定）或Chase B酵素群（ρ = 〇· 018，t檢定）比較，在統計士上.攀維化抑制效果顯著較咼。另一方面，μ酵章群與Chase B酵素群比較，統計學上未認為有顯著差異 (Ρ = 〇· 15，t檢定）。又，對於從未投予四氯化碳的正常小鼠採取的正常肝也進行同樣的免疫組織學解析，纖維化度數為0。如上所述，軟骨素酶ABC之投予，顯示於臨床上發揮優異的肝纖維化抑制效果。實^例4:軟肝硬變掇式土型膠原蛋白沉殿抑制效杲型膠原蛋白量之增要的因子。因此，試樣，進行I型膠於含有肝硬變之纖維化病症中，I 加，被認為是形成病變構成纖維中最重對於實施例3製作的各群由來的肝組織

2125-8362-PF 74 200803897 原蛋白質免疫染色實驗。於實施例3製作之對照群、Chase ABC酵素群、chase AC酵素群及Chase B酵素群由來之切片試樣，添加作為一次抗體的兔抗小鼠I型膠原蛋白抗體（1:1〇〇稀釋；8〇〇1^1&11(1公司製），於室溫使反應1小時。接著，於試樣中添加作為二次抗體之鹼性磷解酶標記抗兔IgG(丨：2〇〇稀釋·’ Jackson I_unoResearch公司製），於室溫再反應3〇鲁分鐘後，添加鹼性磷解酶呈色基質（Vect〇r Red; Vect〇r Laboratory公司製）。於光學顯微鏡（Leika公司製）下觀察試樣’確認有紅色信號可見化的抗體結合。得到之肝組織的免疫染色像之例如圖5所示。如圖5，對…、群&著偽小葉用構造明確地偵測到I型膠原蛋白，相對於此，Chase ABC酵素群僅有稍許散見。日基翁上述進m療組縳學染色，將丨型膠原蛋白的陽性面積，使用WinROOF影像解析軟體（Win R〇〇F;三谷商事（股）公司）計算。在橫跨肝臟切片上至少i5mm2之範圍進行測量，結果以相對於肝臟面積之陽性面積率（％)表示。結果如圖6所示。如圖6，1¾贩盾疋人1 « 1虫膠原蛋白的陽性面積率（％)，於對照群為5· 16 + 0· 98%，相對於士认 — 邳對於此，於Chase ABC酵素群為 1 · 61土〇· 29%，Chase AC 酵幸雜盔 j Qnin 1Ωη

呼京群為 4. 30±_0. 18%，Chase B 酵素群為3.38 + 0· 50%。與對昭雜知LU > 一〃 τ “、、鮮相比較，所有的酵素群中， I型膠原蛋白之陽性面積率顯者差異減少（Chase ABC 酵素群：Ρ = 0· 0018、Chase AC酸参被 Λ 礼酵素群：Ρ = 〇·〇23、Chase Β酵素群：Ρ = 0· 0059;皆為t檢定）。尤直兀其，Chase ABC酵素群，

2125-8362-PF 75 200803897 與Chase AC酵素群及chase B酵素群比較，！的陽性面積率〇〇在統計學上顯著地減少（與ehaseA^ 群之顯者差異：Ρ=〇. _8、與Chase β酵素群莫異㈣，皆為t檢定），表示！型膠原蛋白沉殿抑= 果極商。另-方面，Chase AC酵素群及.奸B酵: 較，在統計學上不認為有顯著差異（㈣肩8，士檢定對於從未投予四氯化碳之正常小鼠採取之正常肝也’ 樣的解析’ ί型膠原蛋白之陽性面積率為⑽。從該姓果° 表示藉由軟骨素酶ABC之投予，能顯著地抑制纖 I型膠原蛋白之沉澱。 r 酸軟骨素（CSPG)沉澱抑制汾早為了確認藉由投予Chase ABC，使沉殿於纖維化肝之琉魏氣囊急(爲跋)分磬，對於

Chase ABC酵素群的肝組織試樣’與實施例}以同樣''方式，使用抗CSPG抗體、抗C4SPG抗體及抗C6SPG抗體作為一次抗體’進行免疫組織學的解析。得到之肝組織的免疫染色像的例子如圖7所示。圖7 中，左側列為對照群，右側列為Chase ABC酵素群。如圖 7對fl?、群，與貫施例1之肝硬化同樣，各對、C4SpG 及C6SPG，觀察到明顯的陽性信號。另一方面，chase ABC 酵素群與對照群比較，對CSPG、C4SPG及C6spG之信號明白的減弱。尤其於C6SPG之染色像（最下排），於對照群°，在沿著實施例4及5觀察到膠原蛋白伸長巧偽小葉周圍，

2125-8362-PF 76 200803897 偵測到明白的陽性信號，相對於此，於Chase ABC酵素群，該信號幾乎完全消失。由以上結果，實證了藉由投予軟骨素酶ABC，將沉澱於纖維化肝的CSPG分解。式中之纖維芽細胞累穑抑制啟旲就促進纖維化之膠原蛋白產生細胞而言，係以活化纖維芽細胞為主存在。纖維芽細胞之過度累積、固著及活化被涊為使纖維化病變惡化。因此關於在肝硬變模式中之識維芽細胞動態，進行免疫組織學的探討。首先，於實施例3製作之對照群及Chase ABC酵素群由來的切片试樣中，添加作為一次抗體的大鼠抗小鼠纖維胞抗體（選瘦體ER-TR7;1:5〇〇稀釋；MA公司製），於至1 Μ °基# ’麥加作蠢二欠挤薦^場氧化酶標記抗大鼠IgG(l:200稀釋；Bi_rce公司製），於室溫再反應30分鐘後，添加dab基質（Nichirei公司製）。於光學顯微鏡（Le i ka公司製）下兹目&^ 辰）下觀察试樣’確s忍以掠色信號可見化的抗體結合。又，斜认對於從未投予四氯化碳之正常小 _之正常肝也進行同樣的免疫組織學解析。得到之肝組織的免疫染色像的例子如圖8所示。圖8 中’最左排表示正常群（正赍 .t , 一 ^正吊肝）、中間列表示對照群、最右排表示Chase ABC醢去被 % , 酵素群。上排為倍率1〇〇倍之影像，下排表不倍率2 0 0倍之影推 A t. <〜像。於未處置之正常小鼠肝臟，對抗纖維芽細胞之陽性作缺虓強烈地分布在門脈周邊。又，

2125-8362-PF 77 200803897 對照群(肝硬化）’顯示纖維芽細胞明顯地沿著偽小葉累積，但是，但是於Chase ABC群中，累積的程度極為輕微。由此可知，纖維化肝中纖維芽細胞之過度累積或固著，藉由Chase ABC投予，而顯著地被抑制。再者，由於在本實施例中，偵測到肝硬化中纖維芽細胞沿著偽小葉（纖維化層）累積，且前述實施例中，對照群的肝硬化中也沿著偽小葉周圍偵測到明顯的cspg陽性信號，故可認為肝臟之纖維化中以叩係提供纖維芽細胞之支響架。 i施例素酶ABC (—Chase ABC)於]、鼠肝輝鑤样式t之巨噬I累積抑制汾畢產生使纖維芽細胞活化之因子的細胞，被認為主要是巨嗤體。因此，對於肝硬變模式中巨嗤體之動態也進行免綠耝織學的探討。百先，於實施例3製作之對照群及Chase ABC酵素群籲由來的切片減樣中，、添加作為一次抗體的大鼠抗+鼠巨嗟體抗體（選殖體F4/8〇;1:5〇〇稀釋；BMA公司製），於室溫使反應1小時。接著，添加作為二次抗體之過氧化酶標記抗大队IgG( 1·2〇〇稀釋；Bi〇s〇urce公司製），於室溫再反應 3〇刀鐘後，添加DAB基質（Nichirei公司製）。於光學顯微鏡（Leika么司製）下觀察試樣，確認以棕色信號可見化的抗體、、、"口。又，對於從未投予四氣化碳之正常小鼠採取之正$肝也進行同樣的免疫組織學解析。侍到之肝組織的免疫染色像的例子如圖9所示。圖9

2125-8362-PF 78 200803897 中，隶左排表示正常群（正當吊肝）、中間列表示對照群、# 右排表示Chase ABC酵|雜，取跸素群。如圖9所示，正常信號廣泛分布於竇狀隙，可

S 了認為是星狀細胞（Kupffer，s ce 11)。另一方面，對照鮮 '群之肝硬化，明顯地巨噬體的數量增加，於實施例4及5中_ R4々丑旳数里千嬈察有許多到包圍偽小荦纖維側翼。另-方面，於㈤q … 、 e ABC酵素群，巨嗟體數量較對照群，明顯地減少。亦即，Chas“Bc酵素群中，續示肝硬化中的巨喔體累積受到抑制。由該結果可知，對昭群（肝硬化）位於尚為進行性之纖維化病變形成過程，相對於此，Chase胤酵素群之纖維化進行受到抑制。模式之治疮效果（纖維芽細胞浸潤之抑制）小鼠四氯化碳誘發肝硬變模式，以與實施例ι同樣的方I鐘景。又，泠參使用之ADAMTS-4肽序列，為 NH2-DRARSCAIVEDDGLQSAFTA-C00H(序爿、編號：67)(小鼠 ADAMTS 4之具有金屬蛋白酶活性的結構域，合成第 336-355號孓肽者；GeneW〇rld&司製，1//2/隻），對照群使用vehi'le(PBS)。與四氯化碳之追加投予（第9次至第 1 2次，共4次）同樣，將肽或veh丨c ι e進行腹腔内投予共4 次。追加投予結束後，將兩群的小鼠宰殺，製作肝臟組織切片，進行免疫組織學的探討。就促進纖維化之膠原蛋白之產生細胞而言，係以活化纖雄芽細胞為主存在。纖維芽細胞之過度累積、固著及活化被認為使纖維化病變惡化。因此關於在肝硬變模式中之

2125-8362-PF 79 200803897 纖維芽細胞動態，進行免疫組織學的探討。於對照群及ADAMTS-4治療群由來的切片試樣中，添加作為一次抗體的大鼠抗小鼠纖維芽細胞抗體（選殖體 ER-TR7;1 :500稀釋；BMA公司製），於室溫使反應j小時。接著，添加作為二次抗體之過氧化酶標記抗大鼠IgG(丨：2⑽ 稀釋；Bi〇source公司製），於室溫再反應3〇分鐘後，添加 MB基質（Nichirei公司製）。於光學顯微鏡（Leika公司製） _下觀察试樣’確認以標色信號可見化的抗體結合。得到之肝組織的免疫染色像的例子如圖10所示。對照群（肝硬化），顯示纖維芽細胞明顯地沿著偽小葉累積，但是，於ADAMTS-4治療群中，累積的程度極為輕微。由此可知’纖維化肝中纖維芽細胞之過度累積或固著，藉由 ADAMTS-4投予，而顯著地被抑制。复爲、例一 9 : ADAMTS-4肽投予對小I肝硬# ι在之治瘙致^1_1 II型膠原I白之抑制） φ 與實施例8以同樣方式，製作肝臟之冷凍切片試樣，進行免疫組織學解析。添加作為一次抗體的兔抗小鼠j j j 型膠原蛋白抗體（1:250稀釋；Santa Cruz公司製）於試樣，於至使反應1小時。接著，添加作為二次抗體之驗性填解 if 標記抗兔 IgG(l: 200 稀釋；Jackson ImmunoResearch △司製）’於室溫再反應30分鐘後，添加驗性磷解酶呈色基質（Vector Red; Vector Laboratory 公司製）。於光學顯微鏡（Leika公司製）下觀察試樣，確認以棕色信號可見化的抗體結合。

2125-8362-PF 80 200803897 得到之肝組織的免疫染色像之例如圖丨i。對照群中，以兔抗小鼠in型膠原蛋白抗體偵測之Ιπ型膠原蛋白纖維，不僅是竇狀隙，從中心靜脈相連伸長到門脈，一部分形成偽小葉。此為肝硬變典型的影像。相對於此，adamts-4 群，幾乎未認為有111型膠原蛋白之伸長。實施例1_Q.: ADAMTS^^^^^變模式之治效果CM錐化度數之抑制、依據實施例9進行之免疫組織學染色，將各試樣之肝雩纖維化程度’依照先前報告(Dai K，et al. w〇rid】

Gactroenterol. 31:4822-4826, 2005, Hillebrandt S, et al. Nature Genetics 37:835_843, 2〇〇5)’ 評價纖維化度數。纖維化度數之評價基準如下。〇度：正常、丨度：中心靜脈起有少量的膠原蛋白伸長、2度：中心靜脈起有明白的膠屢睪甴1:1，复1秦|亂肝臟倉鬆$察摩、3摩：中心攀脈起有明白的膠原蛋白伸長，為包圍肝臟全體之程度、4 φ度：肸臟全體有瀰漫性的膠原蛋白伸長，形成偽小葉。結果如圖12所不。各棒代表於各群之纖維化度數的平均值土襟準偏差。對照群為3.9±〇·4(η=6)，相對於此， ADAMTS 4治療群》2. 3泣4(n = 6)。與對照群比較， ADAMTS 4冶療群（p<〇. 〇〇1，t檢定）於統計學上纖維化顯著減•工由以上，顯示ADAMTS—4肽之投予於臨床上發揮優異的肝纖維化抑制效果。 [產業之可利用性] 本1明之含有軟骨素酶ABC為有效成分的肝纖維化抑

2125-8362-PF 81 200803897 =之^抑制肝組織之纖維化，具有治療或預防伴隨肝 ……度纖維化之病症（肝纖維化病症）的效果。本發明 ΓιΓ::化抑制劑，由於在纖維化之肝組織中，具有抑制处r原蛋白伸長之效能、抑制J型膠原蛋白沉澱之效 =⑽纖維芽細胞累積之效能、抑制巨_累積之效能纖維化有關的各種症狀以多方面地抑制的效能，因此在抑制肝臟纖維化方面㈣有用。本發明之藉由投予肝纖維=抑制劑之肝纖維化病症的治療或預防方法，由於能猎由藥劑療法有效地改善纖維化錢，能成為對患者生活口口質（Q0L)提高有益之優異療法。 &本說明書中引用之所有刊物、專利及專利申請案係為了參照全體而包含於本說明書中。 X麗農之J JL麗f j 圖1表不以四氯化碳所誘導之肝硬變模式小鼠中， CSPG、C4SPG、C6SPG及HSPG之偵測結果（棕色信號）的照片。倍率100倍。括弧内表示偵測時使用的抗體株名。圖2表不以四氣化碳所誘導之肝硬化中，以抑§(軟骨素酶（-））、Chase AC、Chase B，Chase ABC 處理後之 CSPG 的偵測結果（棕色信號）的照片。倍率2〇〇倍。圖3表不以四氯化碳所誘導之肝硬變模式小鼠中，投予Chase ABC後之ΠΙ型膠原蛋白（棕色信號）的減少效果的照片。倍率100倍。

圖4表示以四氯化碳所誘導之肝硬變模式小鼠中，投 2125-8362-PF 82 200803897 予 Chase ABC、Chase ΑΓ + γμ ^ , 札或Chase β後之纖維化指 *ρ<0_ 05、**ρ<0· 〇ί(卜檢定）。數圖。圖5表示以四氯化碳所誘導之肝硬變模式小鼠中予Chase慰後之ί型膠原蛋白（棕色信號）的減二照片。倍率100倍。禾的圖6表示以四氯化碳所誘導之肝硬變模式小鼠予 Chase ABC、ChaseAC 或 ChaseB 後，ΠΙ 型膠原蛋白= 性面積率（％)圖。*ρ<0.05、**ρ<〇〇1(卜檢定）。圖7表示以四氯化碳所誘導之肝硬變模式小鼠中，浐予Chase ABC後之CSPG、C4SPG、C6spG之檢驗結果（梓^ 信號）的照片。倍率200倍。圖8表示以四氯化碳所誘導之肝硬變模式小鼠中，纖維芽細胞之分布（棕色信號）及Chase八此投予後之分布變化的照片。倍率100倍（上排）、2〇〇倍（下排）。圖9表不以四氯化碳所誘導之肝硬變模式小鼠中，巨鲁噬體之分布（棕色信號）及Chase ABC投予後之分布變化的照片。倍率200倍。圖10顯示投予ADAMTS-4功能性肽所致纖維芽細胞浸潤的抑制的照片。於肝硬變模式肝組織中，ER_TR7染色影像G不）。上排100倍。下排400倍。藉由投予ADAMTS_4功能性肽，除抑制細胞浸潤以外，抑制偽小葉形成之影像。圖11顯示投予ADAMTS-4功能性肽所致Η I型膠原蛋白增生的抑制的照片。於肝硬變模式肝組織中，丨丨丨型膠原蛋白木色影像（棕）。1〇〇倍。係藉由投予4功能性肽， 2125-8362-PF 83 200803897 抑制偽小葉形成之影像。圖12顯示投予ADAMTS-4功能性肽，所致纖維化抑制的照片。將111型膠原蛋白染色所見予以數值化，以作為纖維化分數的圖。係藉由投予ADAMTS-4功能性肽，顯著地抑制肝纖維化。【主要元件符號說明】益

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Claims

200803897 十、申請專利範圍：纖維化抑制劑，其含有一抑制硫酸軟骨素蛋成或堆籍夕I μ “ 1 . 白多糖生成或堆積之物質……一其中該物所Ιι專利範圍第1項所述之肝纖維化抑制劑 X "λ促進硫酸軟骨素蛋白多糖分解之作用。其中《質it利範圍第1項所述之肝纖維化抑制劑 4如’二抑制硫酸軟骨素蛋白多糖合成之作用

中專利關帛1項所述之肝纖維化抑制劑，並中該物皙岌目+ i ^ 所 ' 嶮酸軟骨素蛋白多糖脫硫酸化作用之物貝0 5·如申請專利範中，該物質為具有硫物質。圍第1項所述之肝纖維化抑制劑酸軟骨素蛋白多糖硫酸化抑制作，其用之 6·如申請專利範化抑制劑，其係抑制堆積。圍第1至5項中任一項所述之肝纖維肝臟中硫酸軟骨素蛋白多糖之產生或中月專利规圍第1 i 6項中任-項所述之肝纖維 /剑，其係甩於肝纖維化病症之治療或預防。 8.如申請專利範圍第7項所述之肝纖維化抑制劑，直中該肝纖維化病症為慢性肝病。 /、 ▲ 9·如中請專利範圍帛7項所述之肝纖維化抑制劑，其中5亥肝纖維化病症為慢性肝炎、肝纖維症、肝硬化、肝衰竭或肝癌。 ' 、 1〇· 一種肝纖維化抑制劑之篩選方法，其特徵在於··從 2125-8362-PF 85 200803897 党試樣本中，積作用之物質選擇具麵制硫酸軟骨素蛋白多糖產生或堆 u.如申請專利範圍第10 括選擇具有以下（a) 師&方法，其中包 Cd)之令任一項作用之物夺 ⑷促進硫酸軟骨素蛋白多糖分解之作用、4·· (b)抑制硫酸軟骨素蛋白多糖合成之作用 (〇硫酸軟骨素蛋白多糖之脫硫酸化作用

(d)硫酸軟骨素蛋白多糖之硫酸抑制化作用。 12.如申請專利範圍第1〇或n項所述之篩中該纖維化抑制劑係用於肝纖維化病症之治療或預防，其 2125-8362-PF 86