TW200803894A - Prostate cancer therapeutic agents - Google Patents

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200803894 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於治療前列腺癌的藥劑，該藥劑包含作 為有效成分（active ingredients)的介白素_6抑制劑 (_il-6 inhibitQr)以及其使用方法。本發明也有關於治療 刖列腺癌的方法’該方法包括投與一 二 又一 白素—6抑制劑至患 有前列腺癌之個體的步驟。 【先前技術】 目前治療前列腺癌的方法包括··荷爾蒙療法（hormona i therapy)、手術療法、放射治療或化學療法或是併用這些 療法。荷爾蒙療法抑制與前列腺癌發展有關之雄性素 (androgen)的產生或活化。荷爾蒙療法係移除產生雄性素 的睪丸，或投與作用於腦垂體腺（pituitarygland)並降低 睪固酮（testosterone)量的黃體生成激素釋放激素類似物 (LH-RH anal〇g)、雌激素製劑（estr〇gen preparati〇n)* 抗雄性素劑（anti—andr〇genagent)#。荷爾蒙療法係目前 唯 種可治療晚期前列腺癌（advanced prostate cancer 的療法。然而’許多晚期前列腺癌病患在接受數年的荷爾 篆療法之後便產生荷爾蒙抗性（h〇rm〇ne resi stance)，造 成治療上的困難。因此需要能有效治療已經對荷爾蒙療法 產生抗性之前列腺癌的方法。 介白素-6(IL-6)係一種稱為b細胞刺激因子2(B-cell stimulating factor 2 (BSF2))或干擾素石 2(inte:rferon 2125-8465-PF;Kai 5 200803894 ^ 卢2)的細胞素（cytokine)。研究發現介白素一6係一種參與 B細胞淋巴球（B-cell lymphocytes)活化作用的分化因子 (Hirano，T. eia/·，Nature (1 986) 324，73-76)，而且

後來證明它是一種多功能的細胞素，影響各種細胞的功能 (Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1 993) 54s 1 - 78)。已有報告敘述介白素-6會誘發τ淋巴細胞（T lymphocyte cells)的成熟（Lotz，Μ· ei a/·，J. Exp· Med· ( 1 988) 1 67，1253-1258)。 ⑩ 介白素-6藉由二種細胞上的蛋白質傳送其生物活性。 第一種蛋白質是介白素-6受體，其為一種介白素一6所結合 的配位子結合蛋白（1 igand binding protein);介白素-6 受體的分子量大約為80千道爾頓（kDa)(Taga，T. a/.， J. Exp. Med. (1 987) 1 66, 967-981; and Yamasaki, K. et 5人，Science (1988) 241，825-828)。介白素一6 受體以 膜結合形式（membrane-bound f o rm)存在，其穿透且表現在 _細胞膜上’同時它也是一種可溶性介白素_6受體（s〇丨ub i e IL-6 receptor)，主要由膜結合形式的細胞外區域 (extracellular region)組成 〇 另 種蛋白貝係膜蛋白gpl30(membrane protein gpl30)，其分子量大約為130千道爾頓並且參與非配位子 結合訊息傳遞（non—ligand binding signal transduction)。經由介白素一 6與介白素一 6受體形成介白 素-6/介白素-6受體複合物（il-6/IL-6 receptor complex)，接著結合該複合物與pgl 30，介白素-6的生物 2125-8465-PF;Kai 6 200803894 % 活性可傳送至細胞内（Ta§a，T.以习厶，Cell ( 1 989) 58, 573-581)。 介白素-6抑制劑係抑制介白素-6生物活性之傳送的 物質。近來已知的介白素-6抑制劑可包括抵抗介白素-6的 抗體（抗介白素-6抗體（anti-IL-6 antibodies))、抵抗介 白素-6受體的抗體（抗介白素—6受體抗體（anti-IL — 6 receptor antibodies))、抵抗 pgl30 的抗體（抗 pgl3〇 抗 體（anti-gpl30 antibodies))、介白素 _6 變異體（IL-6 肇variants)、介白素-6或介白素—6受體的部分肽（partiai peptides)以及這類物質。 有數篇關於抗介白素-6受體抗體的報告（Novick，D. etal., Hybridoma (1991) 1〇, 137-146; Huang, Y. W. et aA，Hybridoma ( 1 993) 1 2，621-630 ;國際專利申請公告 號（International Patent Application Publication No·)W0 95/09873 ;法國專利申請案號（French Patent 籲 Application No· )FR 2694767 ;以及美國專利案號（U· S. Patent No· )521 61 28)。其中一篇報告詳述一種人化pm-1 抗體（humanized PM-1 antibody)，該抗體係經由將小鼠抗 體PM-1 (其為一種抗介白素-6受體抗體）的互補決定區 (complementarity determining region (CDR))(Hirata, Y. eia/·，J. Immunol· ( 1 989) 143，2900 - 2906)移植入人 類抗體（（W0 92/1 9759))而獲得。 最近的報告顯示介白素-6以自體（autocr i nal ly )或旁 分泌（paracrinal ly)的方式作用而促進前列腺癌的發展 2125-8465-PF;Kai 7 200803894 ’ ★ (0kam〇t〇 W·，Cancer Res· 570)，141—6，1997)。 由腫瘤所過度產生的介白素—6也被認為是晚斯前列腺癌病 患之惡病質（eachexi a)的主因。 一近來體外實驗的報告顯示抗介白素—6抗體在某些條件 下會抑制人類前列腺癌細胞（LNCaP，DU145, andpc3)的生 長（非專利文件 10(0kam〇t〇 以 aA，CancerRes· 57(^， 14卜6，1 997)。然而，目前尚無報告提到經由介白素—6的 專一抑制作用可抑制體内前列腺癌的生長。眾人所周知的是 ”扃胞/素（oytokine)(例知奔：介气素-6)有關的疾病中泰 一特定的細胞介素會與其他細胞介素形成複雜的網狀j 、先而已知有許多細胞介素對於相@的細胞形式具有相似 的活1*生目此’介白素—6抑制劑是否能有效治療前列腺癌 仍然不明。 【發明内容】

入為達成本發明完成，本發明係提供含有作為有效成分 素6抑制劑的&列腺癌治療藥劑。本發明之另提供 -種治療前列腺癌的方法，該等方法包括投與—介白素二 抑制劑至患有前列腺癌之病患的步驟。 為了解決以上的閉 ^ 上的問碭，本發明之發明者研究抗介白素

• 6受體抗體在抵抗前^彳HP 脲届上的抗腫瘤效力。 百先，本發明之發明者以西方轉印法（Western blot ting)檢查介白素—6 株 PC3 、 DU145 與 JCA-1 受體是否會表現在人類前列腺癌 §中。其結果顯示介白素—6受體 2125-8465-PF;Kai 8 200803894 《 會表現在以上二種細胞株中（第一圖）。另外，以酵素纟士人 免疫吸附測定（EL I SA )分析上述細胞的培養上清沾 4 ’、、%果顯 示這些細胞產生介白素-6(第二圖）。 接著，將上述之細胞培養於體外之各種不同濃声的人 化 PM-1 抗體（humanized PM-1 antibody (hPMl))中。±立養 24與48小時之後分析其抗腫瘤效力，結果顯示— i於 體以時間依賴與濃度依賴方式 、丄me〜 and concentration-dependent manner)呈現細胞生長抑制作 _用（第三圖）。以®方轉印、法比較訊息轉⑼導與轉錄激活子 -3CSTAT3)磷酸化作用（phosphorylati〇n)的方式檢查 hPM-1抗體是否經由介白素-6受體展現其抗腫瘤效力。結 果顯示前列腺癌細胞株當中的訊息轉導與轉錄激活子-3磷 酉文化在投與hPM-1抗體之後6 〇分鐘便被抑制。同時也發現 hPM-Ι抗體會抑制訊息轉導與轉錄激活子—3(STAT3)之介白 素-6刺激提型的磷酸化作用（第四圖）。 φ 此外，將hM—1抗體投與至一具有皮下腫瘤之患癌小 鼠模式以確定抗介白素-6受體抗體的體内抗腫瘤效力。其 結果顯示投與hPl-1抗體顯著地抑制腫瘤生長與體重下降 (第五圖）。 本發明之發明者首次發現投與抗介白素-6受體抗體可 抑制前列腺癌的生長，因此完成本發明。 具體地來說，本發明提供下列的[1 ]至[22 ] ·· [1 ] 一種含有作為有效成分之介白素·_ 6抑制劑的前列腺 癌治療藥劑； 2125-8465-PF/Kai 9 200803894 • [ 2 ][ 1 ]所述的藥劑，其中之介白素- 6抑制劑係識別介白 素-6的抗體； [3] [ 1 ]所述的藥劑，其中之介白素一6抑制劑係識別介白 素-6受體的抗體； -· ;· [4 ][ 2 ]或[3 ]所述的藥劑，其中之抗體係為一單株抗體； [5 ][ 2]或[3 ]所述的藥劑，其中之抗體係識別人類介白素 -6(human IL-6)或人類介白素一6受體； [6] [2]或[3]所述的藥劑，其中之抗體係為一重組抗體； • [7] [6]所述的藥劑，其中之抗體係為一嵌合、人化或人類 抗體（chimeric, humanized, or human antibody); [8 ][ 1 ]至[7 ]所述的任一種藥劑，其中之前列腺癌係荷爾 豕抗性之前列腺癌（hormone-refractory prostate cancer) ° [9] 一種治療一個體之前列腺癌的方法，該方法包括投與 一介白素-6抑制劑至患有前列腺癌之個體的步驟； ” • [ 10 ] [ 9 ]所述的方法，其中之介ώ备β如 W ，、τ〈；丨白素一6抑制劑係為一識別 介白素-6的抗體； 其中之介白素-6抑制劑係為一識別 [11] [9]所述的方法， 介白素-6受體的抗體 [1 2 ] [ 1 0 ]或[11 ]所述的方法 體； 其中之抗體係為一單株抗 [13][10]或[11]所述的方法， 白素-6抗體或抗人類介白素、 Π4] [10]或[11]所述的方法 其中之抗體係為一抗人類介 6受體抗體； ’ ’其中之抗體係為一重組抗 2125-8465-PF;Kai 10 I * 200803894 戚 · m， [15] [14]所述的方法，其中之抗體係為一嵌合、人化或人 · 類机m， [16] 製造用以治療前列腺癌之藥劑時介白素-6抑制劑的 使用方法； ' [17] [16]所述的使用方法，其中之介白素—6抑制劑係識 別介白素-6的抗體； β [18] [16]所述的使用方法，其中之介白素一6抑制劑 •別介白素-6受體的抗體； μ [19 ][ 17 ]或[18 ]所述的使用方法，其中之抗體係單株抗 體； 几 [20 ][ 1 7 ]或[18 ]所述的使用方法，其中之抗體係抗人類介 白素-6抗體或抗介白素-6受體抗體； [21 ] [17]或[18]所述的使用方法，其中之抗體係為_重組 抗體；以及 _ [22] [21]所述的使用方法，其中之抗體係為一嵌合、人化 .或人類抗體。 【實施方式】 本發明之發明者發現抗介白素_6受體抗體— 〗L—6 receptor antibody)的投與可抑制前列腺癌的生長。本發 明即以這些發現為基礎。 本發明係有關於用以治療前列腺癌的藥劑，該藥劑包 含作為有效成分的介白素-6抑制齊j。 2125-8465-PF;Kai 11 200803894 « * ▼ 勺白素—6 抑制劑（il-6 inhibitor)” 係一 種阻斷；I白素-6作用之訊息傳遞（iL—6-mediated 8丨叩&1 transduetion)並抑制介白素—6生物活性的物質。該介 白素6抑制劑最好是具有抵抗介白素一6、介白素—6受體或 gpl30結合之抑制功能的物質。 本發明之介白素—6抑制劑的例子包括：坑介白素-6抗 體、抗介白素—6受體抗體、抗gpl30抗體（anti-gpl30 ibodi es) ;| 白素一β 變異體（il-6 variants)、可溶性 •介白素-6受體變異體（s〇luMe 6⑽咖variants) 與川白素6或；丨白素-β受體的部分肽Hdes) 以及表現相似活性的低分子量化合物，但不只限於此類。 本發明之較佳介白素-6抑制劑包括能識別介白素一6受體 的抗體。 抗體的來源並未特別限定在本發明中；然而，該抗體 最好衍生自哺乳動物，更佳的抗體係衍生自人類。 φ 利用已知的方法可獲得本發明所使用之抗介白素—6抗 體的單株或多株抗體。由哺乳動物衍生的單株抗體特別適 合作為本發明所使用的抗介白素一6抗體。由哺乳動物衍生 的單株抗體包括從雜種瘤（hybridomas)產生的抗體以及經 由基因工程方法從包含抗體基因之表現載體所轉殖之宿主 而產生的抗體。抗體藉由與介白素—6結合來抑制介白素—6 結合至介白素-6受體，並且因此阻斷介白素—6的生物活性 傳送至細胞内。 該等抗體包括：MH166(Matsuda，T· 人，Eur j 2125-8465-PF;Kai 12 200803894 省 Immunol· (1988) 18，951-956)、SK2 抗體（^1:〇，](.以 <3/·， transaction of the 21st Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology (1991) 21，166)等。 基本上，利用以下的習知技術可製備會產生雜種瘤的 抗介白素-6抗體：具體地來說，利用傳統的免疫法 (immunization method)將介白素-6 作為致敏抗原 (sensitizing antigen)可製備該等雜種瘤以進行免疫作 用（immunization);利用傳統的細胞融合法（ceU fusi〇n m method)將所得到的免疫細胞與已知的母細胞（parent cel Is)融合；並且利用傳統的篩選方法篩選產生單株抗體 的細胞（monoclonal antibody-producing cells)。 更具體地來說，抗介白素—6抗體可如下製備：例如， 利用 Eur· J· Biochem· ( 1 987) 1 68, 543-550、J· Immunol· (1 988) 140, 1534-1541 和/或 Agr· Biol· Chem· ( 1990) 54, 2685-2688所揭露的介白素_6和/或胺基酸序列可得到為 _ 了獲得抗體而用來作為致敏抗原的人類抗介白素-6。 以已知的表現載體（一介白素-6基因序列嵌入該表現 載體）轉化一適當的宿主細胞之後，利用已知的方法從宿主 、’、田I内邛或培養上清液純化所要的介白素—6蛋白質。該純 化的介白素—6蛋白質可作為致敏抗原。或者，介白素-6蛋 白質的融合蛋白與另一蛋白質也可作為致敏抗原。 利用習知方法可獲得本發明所使用之抗介白素-6受體 抗體的單株或多株抗體。本發明所使用的抗介白素-6受體 抗體最子為仿生自哺乳動物的單株抗體。由哺乳動物衍生 2125-8465-PF；Kai 13 200803894 的單株抗體包括那些從雜種瘤（hybrid〇mas)產生的抗體以 及那些利用基因工程方法從包含抗體基因之表現載體所轉 殖之宿主而產生的抗體。該抗體藉由與介白素-6受體結合 來抑制介白素-6結合至介白素一6受體，因此阻斷介白素一6 的生物活性傳送至細胞内。 該等抗體包括：MR16-1 抗體（Tamura，T. eis/.，Proc.

Natl· Acad· Sci. USA (1 993) 90，11924-1 1928) ; PM-1 抗體（Hirata，Y.以 a/·，j· Immun〇1. 〇989) 143, _ 2900-2906) ; AUK12-20 抗體、AUK64-7 抗體與 AUK146-15 抗體（WO 92/1 9759)等。其中，pm-1抗體可當作一個抵抗 人類介白素-6受體之較佳單株抗體的例子，而jjRHi抗 體則是抵抗小鼠介白素-6受體的較佳單株抗體。 基本上’產生抗介白素—6受體單株抗體的雜種瘤可利 用以下的習知技術來製備：具體地來說，利用像統的免疫 法（immunization method)將介白素一6作為致敏抗原 籲 （sensitizing antigen)可製備該等雜種瘤以進行免疫作 用（inununizat ion) ’利用傳統的細胞融合法（ce 1f usi 〇n method)將所得到的免疫細胞與已知的母細胞（parent cel Is)融合；並且利用傳統的篩選方法篩選產生單株抗體 的細月包（monoclonal antibody-producing cells) ° 更具體地來說，抗介白素-6受體抗體可如下製備：例 如，利用歐洲專利申請公開號（European patent

Application Publication No·)EP 325474 與 Japanese Patent Application Kokai Publication No· (JP-A) Hei 2125-8465—PF;Kai 14 200803894 t 3-155795所揭露的介白素-6受體基因和/或胺基酸序列可 分別得到為了獲得抗體而用來作為致敏抗原的人類抗介白 素-6受體或小鼠介白素—6受體。 有二種介白素-6受體蛋白質：一種表現在細胞膜上， 而另一種與細胞膜分離（可溶性介白素_6受體）（Yasukawa， Κ· Ms/.，J· Biochem· (1990) 108，673-676)。該可溶 性介白素- 6受體係由結合細胞膜之介白素一 6受體（c e u membrane-bound IL-6 receptor)的細胞外區域組成，與結 _合細胞膜之介白素-6受體不.同的是該可溶性介白素—6受 體缺乏細胞膜間區域（transinembrane region)或缺乏細胞 膜間與細胞内的區域。只要介白素—6受體可作為產生本發 明中所使用之抗介白素一6受體抗體時所需的致敏抗原，該 介白素-6受體便可作為介白素-6受體蛋白質。 以已知的表現載體系統，其包含一介白素受體基因 序列肷入該表現載體，轉化至一適當的宿主細胞後，利用 _習知方法從宿主細胞的内部或培養上清液中純化所要的介 白素-6受體蛋白質。該純化的介白素-6受體蛋白質可作為 致敏抗原。或者，介白素—6受體蛋白質的融合蛋白與另一 蛋白質也可作為致敏抗原。 利用習知方法可獲得本發明所使用之抗gpl 3〇抗體的 單株或多株抗體。尤其本發明所使用的抗gpl3〇抗體最好 為衍生自哺乳動物的單株抗體。由哺乳動物衍生的單株抗 體包括那些從雜種瘤（hybridomas)產生的抗體以及那些利 用基因工程方法從包含抗體基因之表現載體所轉化之宿主 2125-8465-PF;Kai 15 200803894 . , 中所產生的杬體。該抗體藉由與gpl3〇結合而抑制別 結合至介白素-6/介白素-6受體複合物，因此阻斷介白素 -6的生物活性傳送至細胞内。 該等抗體包括：AM64 抗體（1?41^1 3-21 9894);4811 抗體與2H4抗體（US 5571 51 3) ; B-S12抗體與b — P8抗體 (JP-A Hei 8-291199)等。 基本上，產生抗gpl 30單株抗體的雜種瘤可利用以下 的習知技術來製備：具體地來說，利用傳統的免疫法將 _ gpl30作為致敏抗原可製備該等雜種瘤以進行免疫作用； 利用傳統的細胞融合法將所得到的免疫細胞與已知的母細 胞（parent cel Is)融合；並且利用傳統的篩選方法筛選產 生單株抗體的細胞。 更具體地來說，單株抗體可如下製備：例如，利用歐 洲專利申請公告號EP 41 1946所揭露的gpl3〇基因和/或胺 基酸序列可得到為了獲得抗體而用來作為致敏抗原的 • gpl30 。 以已知的表現載體系統（一 gpl3〇基因序列嵌入該系 統）轉化一適當的宿主細胞之後，利用習知方法從宿主細胞 的内部或培養上清液中純化所要的gpl3〇蛋白質。該純化 的gpl30 |白質可作為致敏抗原。或者，細胞表現的 gpl30(cell expressing| gpl3〇)或 gpl3〇 蛋白質的融合蛋 白與另一蛋白質也可作為致敏抗原。 以致敏抗原免疫的哺乳動物（ma_als t〇 “ immunized with a sensitizing antigen)並未特別限定， 2125-8465-PF;Kai 16 200803894 _ * • 但最好選擇與母細胞（該母細胞係用以作細胞融合）相容的 動物。一般常使用小鼠、大鼠與倉鼠等齧齒目動物。 根據習知方法，利用致敏抗原（sensitizing an1：igens) 使動物免疫。例如，一般係經由腹膜内或皮下注射致敏抗 原使動物免疫。具體地來說，該致敏抗原最好以適量的磷 酸鹽鍰衝液（PBS)、生理食鹽水或同類物質稀釋或懸浮其 中’並且與適量的一般佐劑（例如：傳氏完全佐劑 (Freund’ s complete adjuvant))混合，進行乳化，然後 每4至21天投·與數次至哺乳動物。另外，可使用適當的載 體以及一致敏抗原進行免疫作用。 在該免疫作用之後，確定所要的抗體量在血清中增 加，然後從哺乳動物得到免疫細胞以進行細胞融合。特別 適用於進行細胞融合的免疫細胞包括脾臟細胞。 作為母細胞（即與上述免疫細胞融合的母細胞）的哺乳 動物骨髓癌細胞（myeloma cel Is)包括各種已知的細胞株 _ (cell strains)，例如：P3X63Ag8· 653 (Kearney，J· F· ef J· Immunol (1 979) 123，1548-1 550)、P3X63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1~7) - NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C. , Eur. J. Immunol. (1976) 6， 511-519) 、 MPC-11 (Margulies， D, H· etal., Cell ( 1 976) 8, 405-415) ^ SP2/0 (Shulman, M. et al. , Nature ( 1 978) 276, 269-270) 、 FO (de St. Groth， S. F. ei a人，J. Immunol. Methods ( 1 980) 35，1-21)、 S194 (Trowbridge, I. S. , J. Exp. Med. (1978) 148, 2125-8465-PF;Kai 17 200803894 w .313~323) > R210 (Galfre, G. et aL , Nature (1979) 277, 131 -13 3 )以及這類細胞株。 基本上’上述之免疫細胞與骨聽癌細胞的細胞融合可 利用習如方法來進行，例如：Milstein等人的方法（K〇hler， G· and Mi lstein，C·，Methods Enzymol· (1981) 73，3-46) 以及這類方法。 更具體地來說，在細胞融合增效劑（enhancingagent) 的存在下可在一般的營養培養基中完成上述的細胞融合。 例如，聚乙二醇（p〇lye1：hylene giyc〇i (pEG))、仙台病毒 (Sendai virus (HVJ))與這類物質係作為融合增效劑。再 者，為了提高融合效力，可依據需求添加辅助劑，例如： 二甲亞石風（dimethyl sulfoxide)。 免疫細胞對骨髓癌細胞（myel〇ma cells)的比例最好 為一例如：1至10個免疫細胞對一個骨髓癌細胞。用於上 述之細胞融合的培養基為—例如：rpmi164〇或MEM培養 _基，廷些培養基適用於上述之骨髓癌細胞的增生。也可以 使用培養這類細胞的常用培養基。此外，也可併用血清補 充品（serum supplements)，例如：胎牛血清（fetal caif serum (FCS)) 〇 在細胞融合方面，對於所要之融合細胞（雜種瘤 (hybr 1 domas ))的形成步驟如下：將確定含量之上述免疫細 胞與骨髓癌細胞混合於上述的培養基中，接著添加以 合預先加熱至37。(：之濃度30%至60%(重量/體積）的聚乙2 醇（PEG)溶液（例如：平均分子量約u 〇〇〇至6, 〇〇〇的聚乙 2125-8465-PF;Kai 18 200803894 銕 , 二醇溶液）。然後，經由重覆添加適當之培養基並且離心移 除上清液便可移除不適合雜種瘤生長的鈿胞融合劑以及這 類物質。 吾人透過將細胞培養在一般選擇的培養基—例如：HAT 培養基（含有次黃嗓呤（hypokanthine)、胺蝶呤 (aminopterin)與胸腺嘧啶（thymidine)的培養基）一中來 選擇以上的雜種瘤。為了殺死除了所要之雜種瘤之外的細 胞（未融合的細胞），要持續在HAT培養基中培養一段足夠 胃的時間（通常為數天至數週）。然後，實行標準限制稀釋法 (standard limited dilution method)以便筛選與複製會 產生所要抗體的雜種瘤。

為了獲得上述的雜種瘤，除了利用抗原使非人類動物 免疫的方法外，透過以下方式可獲得具有結合至預期抗原 (desired antigen)或抗原表現細胞之活性的預期人類抗 體（desired human antibodies):在體外以預期抗原蛋白 ❿或抗原表現細胞敏化（sensi t izing)人類淋巴球，並且以人 類骨髓癌細胞（myeloma cells)(e.g·，U266)融合敏化的B 淋巴球（見 Japanese Patent Application Kokoku

Publication No· (JP-B) Hei 卜59878)。另外，預期人類 抗體可由以下的方式獲得：投與一抗體或抗體表現細胞至 擁有一整套人類抗體基因的轉殖動物，然後再實行上述的 方法（見國際專利申請公告號W0 93/12227、W0 92/03918、 W0 94/02602、W0 94/25585、W0 96/34096 以及 w〇 96/33735)。 2125-8465-PF;Kai 19 200803894 ^ - • 如此製備的雜種瘤（其產生單株抗體）可在傳統的培養 基中繼代培養並貯存在液態氮當中一段長時間。

從上述雜種瘤獲得單株抗體時，即可使用下列方法： (1)根據傳統方式培養雜種瘤並且所獲得之抗體為培養上 清液形式的方法；（2)雜種瘤係藉由投與至相容哺乳動物而 增生而且所獲得之抗體為腹水形式的方法等等。前者常被 用來獲得高純度的抗體，後者則常用來製造大量的抗體。 _ 例如，產生抗介白素-6受體抗體的雜種瘤可利用jp —A

Hei 3-139293所揭露的方法製備。該等雜種瘤的製備如 下：將產生PM-1抗體的雜種瘤（PM—i an1：ib〇dy-pr〇ducing hybridoma)注射入BALB/c小鼠的腹腔，取得腹水，然後從 腹水中純化出PM-1抗體；或將雜種瘤培養在適當的培養基 内（例如：含有10%胎牛血清（fetal bovine “^…與5% BM-Condimed Hl(Boehringer Mannheim)的 RPMI 1 640 培養 基’雜種瘤無血清培養基（hybridoma SFM _ medium)(GIBCO-BRL);無蛋白質雜種瘤培養基（pFHM—n medium)(GIBC0-BRL)等），然後從培養上清液中取得pM一 1 抗體。 重組抗體可作為本發明之單株抗體，其中之抗體係利 用基因重組技術製造，其製造過程如下：從一雜種瘤當中 複製一抗體基因，將該基因插入一適當的載體，然後將該 載體帶入一宿主（請參考Borrebaeck， C. A. K. and Larrick, J. W., Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the United Kingdom by Macmillan 2125-8465-PF/Kai 20 200803894 %

Publishers Ltd， 1990)。 镡 更具體地來說，抗體可變（V )區的信使核醣核酸編碼係 從那些產生吾人所要抗體的細胞（例如：雜種瘤)中分離出 來。根據習知方法一例如：脈超高速離心法（guan i di ne ultracentrifugation method)(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18， 5294-5299)與 AGPC 法 (Chomczynski, P. etaJ.y Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159)—製備總核醣核酸以及利用信使核醣核酸純化套 ⑩組（Pharmacia)與這類方法可分離出信使核醣核酸。另外， 利用QuickPrep信使核醣核酸純化套組（QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia))可直接製備信使核醣核 酸。 利用反轉錄酶可從所得到之信使核醣核酸合成抗體可 變區的互補去氧核糖核酸。利用禽成髓細胞瘤病毒反轉錄 酶第一股互補去氧核糖核酸合成套組（AMV Reverse _ Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit)與這 類物質可合成互補去氧核糖核酸。另外，為了合成與擴增 互補去氧核糖核酸，可實行使用5，-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech)與聚合酶連鎖反應的5端互補去氧核糖核 酉夂末端的快速擴增法（5，-RACE method)(Frohmaii，Μβ A et al、、Proc. Natl· Acad· Sci. USA (1 988) 85 8998-9002; Belyavsky, A. et al. . Nucleic Acids Res. (1989)17，2919 - 2932)。從所得的聚合酶連鎖反應產物中 純化出所要的去氧核糖核酸片段，然後再與一載體去氧核 2125-8465-PF;Kai 21 200803894 ^ 糖核酸連接。然後，利用上述的去氧核糖核酸製備一重組 載體並且將該·重組載體帶入大腸桿菌（c〇//) 或同類物，然後選取其菌落以製備預期的重組載體。經由 例如雙去氧法（di deoxy method)的方法可確定所要之去氧 核糖核酸的核苷酸序列。 當獲得編碼所要之抗體可變區的去氧核糖核酸時，該 去氧核糖核酸與一編碼預期抗體之不可變區（c regi〇n)的 _去氧核糖核酸連接，並且嵌入一表現載體。另外，編碼抗 體可變區的去氧核糖核酸可被嵌入表現载體，該奉現載體 含有抗體不可變區的去氧核糖核酸。 為了製造本發明所用的抗體，如以下所述地將一抗體 基因嵌入一表現載體，如此該抗體基因在表現調節區（例 如：增強子（enhancer)或啟動子）的控制下表現。然後，以 此表現載體轉化一宿主細胞便可表現該抗體。 在本發明中，為了減少人類與動物的異抗原性 _ (heter〇antigenicity)，可使用人工修飾的基因重組抗 體，例如：嵌合抗體（chimeric antib〇dy)、人化抗體 (humanized antibodies)或人類抗體（human antibodies)。利用習知方法可製備這些修飾抗體。 獲得嵌合抗體的過程如下：連接以上所得之編碼抗體 可變區的去氧核糖核酸與編碼人類抗體不可變區的去氧核 糖核酸，然後將去氧核糖核酸嵌入一表現載體並帶入一宿 主以進行製造（見歐洲專利申請公告號EP 125〇23 ;國際專 利申凊公告號W0 92/19759)。該習知方法可用以獲得本發 2125-8465-PF;Kai 22 200803894 . 明所使用的嵌合抗體。 蟑 人化抗體也稱為人改型抗體（reshaped human antibodies)，，而且該抗體係來自人類以外的哺乳動物（例 如：小鼠抗體），該抗體之互補決定區（c〇mplementarity determining regions (CDRs))係轉移入人類抗體的互補決 定區。此基因重組也為一般習知的方法（見歐洲專利申請公 告號EP 1 25023、國際專利申請公告號w〇 92/1 9759)。 …更具體地來說，被設計成小鼠抗體之互補決定區（CDRs) 與人類抗體之骨架區（framework regi〇ns (FRs))連接的去 氧核糖核酸序列係經由聚合酶連鎖反應從數個募核苷酸的 末端合成，且該募核苷酸係為了包含重疊部分而產生。所 得到的去氧核糖核酸與編碼人類抗體不可變區的去氧核糖 核酸（human antibody C region-encoding DNA)連接，然 後嵌入一表現載體。並將該表現載體帶入一宿主以產生人 化抗體（歐洲專利申請公告號EP 239400、國際專利申請公 _ 告號 W0 92/1 9759)。 選取藉由互補決定區來連接的人類抗體骨架區，如此 互補決定區便形成一適當的抗原結合區域。有必要時，抗 體可變區之骨架區内的胺基酸可被取代，如此人改型抗體 (reshaped human antibody)的互補決定區便形成一適當的 抗原結合區域（Sato，K· ei a/·，Cancer Res. (1 993) 53， 851-856) 〇 人類抗體不可變區係用於嵌合與人化抗體，並且包括 c r。例如，可使用C r 1、c r 2、c r 3或c r 4。此外，為 2125-8465-PF;Kai 23 200803894 * 了增加抗體的安定性或其產量，可修改人類抗體不可變區。 彼合抗體係由衍生自非人類哺乳動物抗體的可變區以 及衍生自人類抗體的不可變區所組成；人化抗體係由非人 類哺乳動物抗體的互補決定區（CDRs)以及衍生自人類抗體 的骨架區與不可變區所組成。這二種抗體皆降低人體内的 抗原性（ant igenici ty)，因此作為本發明中所使用的抗體。 用於本發明之人化抗體的較佳特定例子包括人化的 PM-1抗體（hUmanized PH antib〇dy)(見國際專利申請公 響告號 W0 92/1 9759)。 此外，除了用來取得人類抗體的上述方法之外，利用 人類抗體:貝料庫（human antibody library)篩選而得到人 類抗體的技術也是習知技術。例如，利用噬菌體展示法 (phage display method)可讓人類抗體的可變區成為單鏈 抗體（scFv)而表現在噬菌體表面上，然後可選擇結合抗原 的噬菌體。分析所選擇的噬菌體之後，便可確定編碼人類 •抗體可變區的去氧核糖核酸序列。只要結合至抗原之單鏈 抗體（scFv)的去氧核糖核酸序列顯現，便可製造包含該序 列的適¥表現載體’以獲取人類抗體。這些方法皆為習知 的方法，請參考 W0 92/01 047、W0 92/2079卜 W0 93/0621 3、 W0 93/1 1236、W0 93/19172、W0 95/01438 與 W0 95/15388。 根據傳統的方法可表現以上製造的抗體基因。當使用 哺乳動物細胞時，利用一去氧核糖核酸可表現抗體基因， 其中’被表現的抗體基因功能性地連接至一有用且常用的 啟動子以及該抗體基因的poly A訊息下游（p〇iy a signal 2125-8465-PF/Kai 24 200803894 downstream)或包含該去氧核糖核酸的載體。促進劑/增強 劑的例子包括人類細胞巨大病毒即興早期增加子/啟動子 (human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer) ° •此外，可在本發明中用來表現抗體的其他促進劑/增強 劑包括來自反轉錄病毒（retroviruses)、多瘤病毒 (polyoma viruses)、腺病毒（aden〇viruses)、猴病毒 40(SV40)與此類病毒的病毒增加子/啟動子；也包括哺乳動 馨物細胞衍生的增加子/啟動子，例如：人類延長因子j α (human elongation factor 1 a (HEFla))〇 例如，當使用猴病毒40促進劑/增強劑時，依照 Mulligan等人的方法可輕易地進行其表現（MuUigan，R· c, 以 a/·, Nature ( 1 979) 277，108-114)。或者，在使用人 類延長因子 1 α促進劑/增強劑（HEF1 α promoter/enhancer)時，可使用 Mizushima 等人的方法 ❿（Mizushima，S· and Nagata S·，Nucleic Acids Res ( 1 990) 18， 5322)。 當使用大腸桿菌（及co//)時，抗體基因可經由功能性 地連接一傳統的促進劑、一用來作抗體分泌的訊息序列以 及將被表現的抗體基因而表現。促進劑的例子包括1 acZ促 進劑、araB促進劑與這類促進劑。當使用iacZ促進劑時， 可根據Ward等人的方法表現基因（fard，E. s.以a/·， Nature (1 989) 341, 544-546; Ward, E. S. et al., FASEB J. (1992) 6，2422-2427);以及根據Better等人的方法 2125-8465~PF;Kai 25 200803894 使用 araB 增加子（Better，Μ· eia/·，Science (1988) 240, 藝 104卜1043)。 當抗體在大腸桿菌的胞外質（periplasm)中產生時， pel B 訊息序列（Lei，S. P· eia/·，J. Bacteriol. (1987) 16 9，4379-4383)可作為抗體分泌時的訊息序列。將產生至 胞外質内的抗體分離’然後在適當地再折疊（refolding) 該抗體結構後使用該分離的抗體（其例可見W0 96/30394)。 可使用衍生自猴病毒40(SV40)、多瘤病毒（polyoma viruses)、腺病毒（adenoviruses)、牛乳頭狀瘤病毒 (bovine papilloma virus (BPV))與這類病毒的複製起點 (replication origin)。此外，為了增加宿主細胞系統中 的基因複製數量，表現載體可包括胺基糖苷磷酸轉移基囱 (APH ene)、胸腺嘧啶激酶基因（TK gene)、大腸桿菌黃嘌 呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因（昃 c〇u xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) _ gene)、二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolate reductase (dhfr) gene)或這類基因，這些基因係作為篩選標諸 (selection marker) 〇 任何製造系統皆可用來製備本發明中所使用的抗體。 用來製備抗體的製造系統包括體外（h汴〇)與體内（如 ^ 的製造系統。體外的製造系統包括那些使用真核細胞 或原核細胞的系統。 使用真核細胞的製造系統包括使用動物細胞、植物細 胞或真菌細胞的系統。該等動物細胞包括：（丨）哺乳動物細 2125-8465-PF;Kai 26 200803894 胞一例如：中國倉鼠卵巢細胞（CHO)、COS、骨髓癌細胞 (myeloma)、幼倉鼠腎細胞（baby hamster kidney (BHK))、 HeLa、Vero與這類細胞；（2 )兩棲動物細胞一例如：爪蟾 卵母細胞oocyte);以及（3)昆蟲細胞一例如： sf9、sf21、Tn5與這類細胞。已知的植物細胞包括衍生自 煙草（的細胞，該細胞可培養成癒合組 織（ca 11 us)。已知的真菌細胞包括酵母菌一例如：酵母菌 亀 {SaccharomycesQ 例如：啤酒酵母菌 （& cereF/s/ae)))、黴菌（mold fungi) —例如:·麴菌屬 “印例如：黑色麴菌（儿Wger)))以及這類真 菌。 使用真核細胞的製造糸統包括那些使用細菌細胞的系 統。已知的細菌細胞包括大腸桿菌與枯草桿菌（如 subti1is)。 利用轉化作用將所要的抗體基因帶入這些細胞便可獲 得抗體，揍著在體外培養這些轉化的細胞。根據習知方法 進行培養。例如，DMEM、MEM、RPMI 1 640、IMDM可作為培 養基，並且可併用胎牛血清（FCS)等血清補充品。再者，為 了在體内產生抗體，可將帶有抗體基因的細胞轉移至腹腔 内或動物的體腔内。 /另方面豸内的製造系統包括那些使用動物或植物 的系統。使用動物的製i生糸& $ & I w糸、、先匕括那些使用哺乳動物或昆 蟲的系統。 小鼠、牛 可使用的哺乳動物包括：山羊、豬、綿羊 2125-8465-PF;Kai 27 200803894 ,與這類動物（Vicki Glaser， SPECTRUM Biotechnology Appl i cations, 1993)。另外，可使用的昆蟲包括：蠶。當 使用植物時，可使用—例如：煙草。 將抗體基因帶入這些動物或植物，抗體便在動物或植 物體内產生’然後再重新取得該抗體。例如，將抗體基因 嵌入一基因（該基因編碼一蛋白質—例如：羊冷酪蛋白 (goat冷case in)(該羊々酪蛋白只產生於乳中）)中央便 可將抗體基因製備成一融合基因。將包含融合基因（其包含 _抗體基因）的去氧核糖核酸片段注射入羊胚胎，然後將該胚 胎帶入雌羊體内。從接受該胚胎之轉殖動物（羊）所產生的 乳中或從這些動物的子代取得所要的抗體。為了增加轉殖 羊所產生之含有所要之抗體的乳量，可給予該轉殖羊荷爾 象（Ebert， K. M. a/·， Bio/Technology (1994) 12， 699-702)。 當使用蠶時，以一被嵌入所要之抗體基因的桿狀病毒 _ (baculovirus)感染這些蠶，然後從這些蠶的體液中取得所 要的抗體（Maeda， S. s/.， Nature ( 1 985) 315, 592-594)。此外’當使用煙草時，所要的抗體基因係嵌入 植物表現載體（例如·· pMON530)，而該載體則被帶入細菌— 例如’根瘤土壤桿菌“以^此^^歷广⑽^批^似^以此 細菌感染煙草（例如：，如此便可從此 煙草葉中獲得所要的抗體（julian，κ. - C. Ma 45/.，Eur. J· Immunol· (1994) 24，13卜138)。 當如以上所述地利用體外或體内的製造系統製造抗體 28 2125-8465-PF;Kai 200803894 ， 時，編碼抗體重鏈（heavy chain (H chain))與輕鏈（1 ight chain (L chain))的去氧核糖核酸可被嵌入不同的表現載 體’然後一宿主與該等載體共轉化（c〇-transformed)。或 者’為了轉化一宿主，該等去氧核糖核酸也可被欲入一單 一表現載體（見國際專利申請公告號W0 94/11 523)。 本發明所用的抗體可為抗體片段或其修飾產物，只要 它們可適當地用在本發明中。抗體的例子包括：Fab、 F(ab )2、Fv以及單鏈Fv(scFv)，其中，重鏠與輕鏈的 ⑩Fvs係藉由適當的連接器（linker)連接。 具體地來說’該抗體片段係以酶（例如：木瓜酵素 (papain)或胃蛋白酶（pep sin))處理抗體後而產生，或者， 編碼這些片段的基因形成並且被帶入表現載體，並在適當 的宿主細胞内表現（其例見Co，M. S. e is/·，J. Immun〇i. (1994) 152, 2968-2976 > Better, M. & Horwitz, A. H., Methods inEnzymology (1989) 178, 476-496 ； Plueckthun, φ A. & Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515 ； Lamoyi, E. , Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663 ； Rousseaux, J. et al. , Methods in Enzymology ( 1 989) 121, 663-666 ； Bird, R. E. etal., TiBTECH ( 1 991 ) 9， 132-137)。 連接抗體的重鏈可變區與輕鏈可變區可得到scFv。在 scFv中，重鏈可變區與輕鏈可變區係藉由一連接器連接， 該連接器最好為肽連接器（peptide linker)(Hus1:on，J. S. et aL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1 988) 85， 2125-8465-PF;Kai 29 200803894 5879-5883)。scFv當中之重鏈與輕鏈的可變區可衍生自任 何上述的抗體。連接可變區的肽連接器例子包括由12至 19個胺基酸殘基（amino acid residues)組成的任何單鏈 肽（single chain peptides) 〇 使用上述抗體之編碼重鏈或可變區的去氧核糖核酸以 及編碼輕鏈或可變區的去氧核糖核酸為模板，再使用聚合 酶連鎖反應擴增去氧核糖核酸片段，該去氡核糖核酸片段 編碼模板序列中所要的胺基酸序列並且使用定義片段之末 端的引子，然後以一去氧核糖核酸與一引子對進一步地擴 增該已擴增的去氧核糖核酸即可得到編碼scFv的去氧核 糖核酸，其中該去氧核糖核酸編碼一肽連接體片段，且該 引子將該連接體的兩端連接至重鏈與輕鏈。 一旦得到編碼scFv的去氧核糖核酸（scFv-enc^i叫 DNA)，即可根據傳統的方法得到包含該去氧核糖核馥的表 現載體以及以該載體轉化的宿主。此外，根據傳統的方法 使用該宿主便可得到scFv。 如上所述，經由獲取與表現宿主的基因可產生這些抗 體片段（antibody fragments)。本文所述之“抗體，，包含 該等抗體片段。 結合至不同分子（例如：聚乙二醇（pEG)的抗體也可作 為修飾抗體（modified antibodies)。本文所述之“抗體” 包含該等修飾抗體。經由化學上修飾所得之抗體可得到這 些修飾抗體。該等方法係已建立的技術。 如上所產生與表現的抗體可從細胞内或細胞外或從宿 2125-8465-PF;Kai 30 200803894 本 , ， 主分離出來，然後純化至均質（homogene i ty)。利用親和層 析法（affinity chromatography)可分離和/或純化出本發 明中所使用的抗體。用於親和層析法的管柱，例如，蛋白 質A管柱（protein A columns)與蛋白質G管柱。用於蛋白 貝A管柱的載體（carriers)例子包括：Hyperj)、p〇R〇s、

Sepharose FF與這類載體。除了上述方法之外，也可使用 其他用來分離和/或純化一般蛋白質的方法，並且不以任何 方式限定。 例如’除了親和層析法、過濾器、超濾 (ultrafiltration)、鹽析、透析與這類方法之外，適當地 選擇以及結合層析術可分離和/或純化本發明所使用的抗 體。層析術（chromatographies)的例子包括：離子交換層 析術、疏水層析術、凝膠過濾法以及這類層析術。這些層 析術可應用於高效液相層析法（HPLC)，或者可使用逆相高 效液相層析法（reverse phase HPLC)。 _ 利用吸光值測定（absorbance measurement)、酵素結 合免疫吸附測疋（E LIS A )與這類方法可確定以上所獲得之 抗體的濃度。具體地來說，確定吸光值的步驟如下：以磷 酸鹽緩衝液（-)(PBS(-))適當地稀釋抗體溶液，在28〇nra值 下測定吸光值，並且計算其濃度（1· 35光通量 (0D) = lmg7ml。或者，當使用酵素結合免疫吸附測定時，其 測量過程如下：以〇· 1M之重碳酸鹽缓衝緩衝液 (bicarbonate buff er) (pH 9· 6)將羊抗人 G 型球蛋白（goat anti-human IgG (TAG))稀釋至 l/zg/mi，再將 ι〇〇#ι 之 2125-84 65-PF;Kai 31 200803894 ，， ‘ - ， 該稀釋液加入96孔盤（Nunc)中，並且將其培養於4Ό下一 整夜使該抗體固定化。在封阻（bl〇cking)之後，將1〇〇微 升之適當稀釋之本發明的抗體或適當稀釋之含有該抗體的 樣品以及人類G型球蛋白（human IgG)(CAPPEL)加入作為一 標準品，並且在室溫下靜置1小時。 沖洗之後，加入1〇〇微升之稀釋5, 000倍的驗性磷酸 S#才不。己抗人 G 型球蛋白（alkaline phosphatase-labeled _ anti-human IgG)(BI0 SOURCE)並且在室溫下靜置！小時。 再一次沖洗之後，加入基質溶液（subsi：ra1：e s〇lution)| 且靜置之’然後利用 Micr〇plate Reader Model 3550 (Bio-Rad)在405奈米下測量吸光值以計算所要抗體的濃 度。 本發明所使用的介白素一 6變異體（IL —6 variants)係 具有結合至介白素-6受體之活性並且未轉移介白素_6生 物活性的物質。即該介白素—6變異體會與介白素_6互相競 _爭與介白素-6受體的結合，但不會轉移介白素一6的生物活 性’因此會阻斷介白素-6作用的訊息傳遞。 經由引發突變來取代介白素—6之胺基酸序列中的胺基 酸殘基而製造介白素-6變異體。作為介白素一6變異體之基 礎（base)的介白素-6起點並未限制，但考慮到抗原性與相 關問題最好是使用人類介白素—β。 更具體地來說，胺基酸取代的過程如下··利用習知的 分子模型程式（molecular model ing programs)來預測介白 素-6月女基酸序列的弟一結構（sec〇n(jary 並且 2125-8465-PF;Kai 32 200803894 ’ 進一步地評估取代之胺基酸殘基對於整個分子的影響（例 如·· WHATIF ,· Vriend 以 a/·，J· Mol· Graphics (199〇) 8, 52-56)。在確定將被取代的適當胺基酸殘基之後，將編碼 人類介白素-6基因的核苷酸作為模板，進行常用的聚合酶 連鎖反應，然後引發突變進而引起胺基酸胺基酸取代，如 此便可獲得編碼介白素-6變異體的基因。如果有需要，可 將此基因嵌入適當的表現載體，然後進行上述之重組抗體 _蚱表現、製造與純化方法便可獲得介白素—6變異體。

Brakenhoff et al. , J. Biol. Chem. (1 994) 269, 86-93、 Savino 以 s/·， EMBOJ· (1994)13， 1357-1367、 WO 96/1 8648與WO 96/1 7869揭露介白素一6變異體的特定 例子。 本發明中所使用之介白素-6的部分肽與介白素一6受 體的部分肽係分別具有結合至介白素受體與介白素一 6 之活性並且不會轉移介白素—6生物活性的物質。即經由結 _合並且捕捉介白素-6受體或介白素—6,該介白素一 6部分肽 或介白素-6受體部分肽可專一地抑制介白素一6結合至介 白素-6受體。因此，介白素—6的生物活性未被轉移，而介 白素-6作用的訊息傳遞（IL—6—mediate(i signal transduction)貝1J 被阻斷。 介白素-6或介白素一6受體的部分肽係包含介白素一6 或介白素-6受體胺基酸序列區之部分或全部胺基酸序列 (該胺基酸序列參與介白素-6與介白素—6受體之間的結合） 的肽。該等肽通常包含1 〇至8 0個胺基酸殘基，最好包含 2125-8465-PF;Kai 33 200803894 ，20至5G個胺基酸殘基，更好的是包含2q至4Q個胺基酸 殘基。 根據-般的習知方法(例如：基因工程方法或肽合成法 月確扣疋參與介白素_6與介白素_6受體間之結合的介白 素-6或介白素-6受體胺基酸序㈣，而使用指定區域的胺 基酸序列片段或全部便可製造介白素_6部分狀或介白素_6 受體部分肽。 _ 田利用基因工程方法製備介白素-6部分肽或介白素一6 受體部分肽時，編碼所要之肽的去氧核糖核酸序列被嵌入 一表現載體，然後使用前述方法表現、製造與純化重組抗 體便可獲得該肽。 當利用肽合成法製備介白素—6部分肽或介白素一6受 體邛刀肽％，可使用一般常用的肽合成法一例如：固相合 成法或液相合成法。 具體地來說，根據 “Continuation of Development of _ Pharmaceuticals， Vol· 14， Peptide Synthesis (in Japanese) (ed. Haruaki Yajima, 1991, Hirokawa Shoten)’’所述的方法可合成該等肽。若使用固相合成法， 可進行下列例子中的方法：將相當於將被合成之肽之c端 的胺基酸結合至一不溶於有機溶劑的支持物，然後重覆以 下反應來延長該肽股（peptide strand) : (1)濃縮胺基酸的 反應’這些胺基酸的α —胺基（a —amin〇 gr〇UpS)與支鍵官 月&基（branch chain functional groups)從 C 至 N 末端方 向每次都有一個被適當的保護基保護；以及（2)從結合樹脂 2125-8465-PF;Kai 34 200803894 * 之胺基酸或胜肽（resin-bound amino acids or peptides) 的a -胺基中移除保護基的反應。根據使用的保護基形式， 固相肽合成係廣泛地分類為B〇c法與Fm〇c法。 如上所述地合成所要的片段之後，進行去保護反應 (deprotection reactions)，然後該肽股便從其支持物分 離。在Boc法中通常使用氟化氫（hydrogen f lu〇ride)或三 氟曱〜酸（1：1^$111〇1'〇11161:113116 sulfonic acid)進行狀股的 _ 分裂反應（cleavage reaction)，Fmoc法則常使用三氣醋 酸（TFA)。例如，Boc法係於苯曱鱗（anis〇ie)存在下以氟 化氫處理上述之被保護的肽樹脂（pr〇tec1：ed resin)。接著，移除保護基並且從肽的支持物上將肽分離 即可重新獲得該肽。將該重新獲得的肽冷凍乾燥後便可得 到粗肽（crude peptide)。另一方面，Fmoc法利用相似於 上述例子的方法進行去保護反應以及將肽股與其支持物分 離的反應。 φ 利用高效液相層析法可分離和/或純化所得的粗肽。利 用水-乙氰（acetonitrile)溶劑系統在最佳條件下進行沖 提（e 1 ut i on)’該沖提通常用於蛋白質純化。收集與所獲得 之層析圖相符的分液（fractions)並將其冷凍乾燥。如此再 經由質譜分析、胺基酸組成分析、胺基酸序列分析或這類 方法分析分子量，進而確定純化的肽分液。 介白素-6部分體與介白素—β受體部分體的特定例子 係揭露於 JP-A Hei 2-188600、JP-A Hei 7-324097、JP-A Hei 8 - 31 1 098 與美國專利公告號（United States Patent 2125-8465-PF;Kai 35 200803894

Publication No.)US 5210075 〇 本發明所使用的抗體也可為結合抗體，其結合至各種 刀子例如·聚乙二醇、放射性物質與毒素。經過化學修 飾所獲得的抗體可得到料結合抗體。修飾抗體的方法係 已建立的技術。本發明中的“抗體，，包含這些結合抗體。 本發明之前列腺癌治療藥劑可用以治療前列腺癌。本 文所述之則列腺癌係指前列腺細胞（叩glandular cells)的癌化（cancera1：i〇n)。 本文中之“前列腺癌的治療（treatment 〇f pr〇state cancer)係指抑制可列腺癌生長、抑制或預防前列腺癌轉 和、或抑制惡病質或伴隨的前列腺癌惡化。上述的治療也 包括抑制手術後的前列腺癌復發。 在本發明中，前列腺癌生長的抑制作用可經由以下方 式確定：利用直腸檢查（加al examinatiGn)檢視前列腺 :外形與狀況，利用影像診斷（diagnQStie imaging)評估 刚列腺癌的原發病灶(primary Iesi〇n)與轉移病灶 (㈣static Iesion)，或測量前列腺特異抗原（⑽ 抓山c antigen (PSA))的量（前列腺特異抗原測試⑽ test))。已知當前列腺癌發展時，前列腺特異抗原量會上 升。換言之，如果投與本發明之藥劑而使前列腺特異^原 量降低’即可認定前列腺癌的生長被抑制。

C 或者，也可利用影像診斷或這類方法評估前列腺癌之 原發病灶（primary Iesion)與轉移病灶 lesion)的大小（或體積）來確定前列腺癌生長是否被抑 36 2125-8465-PF;Kai 200803894 •制。當投與本發明之藥劑而使前列腺癌的體積減少時，即 可認定前列腺癌生長被抑制。利用習知的方法以及實施例 中所欽述的方法可測量前列腺癌的體積。 或者，將收集自前列腺的組織樣本進行組織病理學檢 ^(hm〇path〇1〇gical examinati〇n (±^(bi〇psy)))^ 可確定前列腺癌的生長是否受到抑制。以格里森分數 (Gleason score)為基準的分類最常用來代表惡性前列腺 癌的等級。利用生檢（bi〇psy)從組織病理 •的組織，並且將癌症分為2至丨。分的等級。愈高的= 表愈高的惡性腫瘤等級，因此具有較高的轉移可能性。如 果該癌症具有低惡性腫瘤等級以及在前列腺之狹小區 Οι町area)内的格里森分數為5或5以下，便認為其預 後（prognosis)是順利的。此傾向與病患的年紀無關。相較 之下，若格里森分數為7或7以上之癌症則認定其預後差。 換。之w格里森分數因為投與本發明之藥劑而降低時， _便認定該前列腺癌的生長受到抑制。 當别列腺癌在發展時，惡病質（例如··體重下降與貧血） 隨之發生，而且整體健康狀況惡化。當整體健康狀況因為 投與本發明之藥劑而改善時，即可認定該藥劍對於前列腺 癌病患是有用的。 在本發明中，用傳統的方法可評估介白素_6抑制劑在 抑制介白素-6訊息傳遞時的活性。具體地來說，將介白素 -6加入介白素-6依賴人類骨髓癌細胞株（iL_6_depende的 human myeloma cell lines)(S6B45 and κρΜΜ2))、人類 2125-8465-PF;Kai 37 200803894

Lennert T 淋巴瘤細胞株 KT3(human Lennert T lymphoma cell line KT3)或介白素-6 依賴細胞株 MH60.BSF2(IL-6-dependent cell line MH60.BSF2)培養基 中；並且在介白素-6抑制劑的存在下測量被介白素-6依賴 細胞攝入的3H-胸腺癌12定（3H-thymidine)。或是培養介白素 -6 受體表現的 U266 細胞（IL-6 receptor-expressing U266 cells)，同時將 1251-標記的介白素-6(125I-labeled IL-6) 與介白素-6抑制劑加入該培養基中；然後定量結合至該介 _白素-6受體表現細胞之125I-標記的介白素—6。除了介白素 - 6抑制劑組之外，上述的分析系統中也包括一組不含介白 素-6抑制劑的陰性對照組（negative control group)。比 較兩組的結果之後可評估介白素—6抑制劑抑制介白素一6 的活性。將介白素-6受體訊息途徑（IL-6 recept〇r Signal pathway )的訊息轉導與轉錄激活子—3填酸化下游（ςτat3 phosphorylation downstream)定量後也可評估介白素一 β ⑩抑制劑在抑制前列腺癌細胞株中之介白素—6訊息傳導的活 性。當訊息轉導與轉錄激活子一 3填酸化因為添加介白素一 6 抑制劑而受到抑制時，即可認定該介白素—6抑制劑會抑制 介白素-6訊息傳導（iL-6 signaling)並且會抑制前列腺癌 的生長。利用習知方法以及實施例中所述方法可確定气阜 轉導與轉錄激活子—3磷酸化。 如以下之實施例所示，吾人發現抗介白素〜6受體抗體 的技與了抑制蚰列腺癌生長。此發現意味介白素—6抑制巧 (例如：抗介白素_6受體抗體）係可用以治療前列腺癌的藥 38 2125-8465-PF;Kai 200803894 劑。 本發明之前列腺癌治療藥劑所投與的個體為哺乳動 物。該哺乳動物最好為人類。 本發明之前列腺癌治療藥劑可用藥物形式投與，並且 可經由口服或非腸道（parenteral )方式進行全身性或局部 投與。例如，可選擇靜脈注射（例如：點滴輸注）、肌内注 射、腹膜内注射、皮下注射、栓劑、灌腸劑（enemas)、口 _服腸溶片（〇ral enteric tablets)或類似物。可根據病患 的年紀與症狀選擇適當的投與方式。每次投與的有效劑量 乾圍為〇·01-1〇〇毫克/每公斤體重。或者，所選擇的劑量 乾圍可為I — 1 000毫克/每位病患，最好的劑量範圍是5一5〇 毛克/每位病患。較佳的劑量與投與方法如下^例如，當使 用抗介白素-6 受體抗體（anti-IL — 6 recept〇r antitJdy) 時i其有效劑量係游離抗體（f ree ant ib〇dy)存在於血液中 的量。具體地來說係經由靜脈注射（例如：點滴輸注）、皮 鳴下注射或這類方式投與0·5 —4〇毫克/每公斤體重/每個月 (四週）的劑κ一最好是投與卜2〇毫克/每公斤體重/每個 月的劑量，每個月投與i次至4次—例如：一週2次、一 週1次、每二週1次或每四週丨次。在檢視移植後的狀況 與血液測試值的改變之後，可調整投與時程，例如：投與 間隔從每週2次或每週1次延長至每二週丨次、每三週\ 次或每四週1次。 本發明之治療前列腺癌的藥劑可包含藥學上可接受的 載體，例如：防腐劑與安定劑。“藥學上可接受的載體” 2125-8465-PF；Kai 39 200803894 係指可與上述藥㈣同投與的原料；而其本身可能 或不會產生上述之抑制前列腺癌生長的作用。或者： 體可=不具抑制前列腺癌生長之作用的料，但是當其乂鱼 介白素-6抑制劑併用時，會產生附加的或加乘的安定作用、 該等藥學上可接受的原料包括：無菌水、生理食鹽水、 安定劑：賦形劑、缓衝劑、防腐劑、清潔齊卜螯合劑 (chelating agents)(乙烯二胺四醋酸二鈉（edta)與這類 物質）以及黏合劑（binders)。 、

本發明中的清潔劑（detergents)包括非離子清潔劑 (non-ionic detergents)，其典型例子包括：去水山梨醇 脂肪酸酯（sorbitan fatty acid esters)—例如：去水山 梨醇單辛酸酯（s〇rbitan monocaprylate)、去水山梨醇單 月桂酸醋（sorbi tan monolaurate)與去水山梨醇單棕櫚酸 西曰（s o r b i t a n mo n o p a 1 in i t a t e )，甘油脂肪酸酉旨（g 1 y。g j-i η fatty acid esters)—例如：甘油單辛酸酯（giyCerin monocaprylate)、 甘油單肉豆蔻酸酯 （glycerin monomyristate) 與甘油單硬脂酸酯 （giycerin monostearate);聚甘油脂肪酸酯（polyglycerin fatty acid esters)—例如：單硬脂酸十甘油酯（decaglycery 1 monostearate)、二硬脂酸十甘油 SI (decaglyceryl distearate)與單亞麻油酸十甘油S旨（decaglyceryl monolinoleate);聚氧乙烯去冰山梨醇脂肪酸酯 (polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters)—例如： 聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酉旨（P〇lyoxye1:hylene 2125-8465-PF;Kai 40 200803894, sorbitan monolaurate)、聚氧乙烯去水山梨醇單油酸酯 (polyoxyethylene sorbitan monooleate)、聚氧乙烯去水 山梨醇單硬脂酸酯（jiol yoxy ethylene sorbitan monostearate)、聚氧乙烯去水山梨醇單棕櫚酸酯 (polyoxyethylene sorbitan monopalmitate)、聚氧乙烯 去水山梨醇三油酸酯（polyoxyethylene sorbitan trioleate)與聚氧乙烯去水山梨醇三硬脂酸酯

(polyoxyethylene sorbitan tristearate);聚氧乙婦山 梨糖醇脂肪酸酯（polyoxyethylene sorbit fatty acid esters)—例如：聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯 (polyoxyethylene sorbit tetrastearate)與聚氧乙烯山 梨糖醇四 油酸醋（polyoxyethylene sorbit tetraoleate);聚氧乙烯甘油脂肪酸酯（polyoxyethylene glycerin fatty acid esters)—例如··聚氧乙烯甘油單硬 月旨酸酯（polyoxyethylene glyceryl monostearate);聚乙 二醇脂肪酸自旨（polyethylene glycol fatty acid esters) —例如：聚乙二醇二硬脂酸酯（polyethylene glycol distearate);聚氧乙浠烧基醚（polyoxyethylene alkyl ethers)—例如：聚氧乙烯月桂醚（polyoxyethylene lauryl ether); 聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚 (polyoxyethylene polyoxypropy1ene alkyl ethers)—例 如··聚氧乙烯聚氧丙稀乙二醇（polyoxyethylene polyoxypropylene glycol)、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚 (polyoxyethylene polyoxypropylene propyl ether)與聚 2125-8465-PF;Kai 41 200803894 乳乙烯聚氧丙烯十六 _ (polyoxyethylene polyoxypropylene cetyl ether);聚氧乙烯烧基苯基醚 (polyoxyethylene alkyl phenyl ethers)一例如：聚氧乙 烯壬基苯基鱗（0〇1丫〇;^6让；716116 11〇1171口1^11；7161：]16]：);聚 ✓ 氧乙烯硬化繁麻油（polyoxyethylene hardened castor

oils) 一 例如：聚氧乙烯蓖麻油（polyoxyethy lene castor oi 1)與聚氧乙稀硬化萬麻油（polyoxyethylene hardened castor oil)(聚氧乙稀氫化蓖麻油（p〇iyOXyethylene hydrogenated castor oil));聚氧乙烯蜂蠟衍生物 (polyoxyethylene beeswax derivatives)—例如：聚氧乙 稀山梨糖醇蜂壤（polyoxyethy lene sorb it beeswax);聚 氧乙烯羊毛脂衍生物（polyoxyethylene lanolin derivatives)—例如：聚氧乙烯羊毛脂（polyoxyethy 1 ene lanolin);以及聚氧乙稀脂肪酸醯胺（polyoxyethylene fatty acid amides)與親水親油平衡值（HLB)在6至18之 間的同類物質——例如··聚氧乙烯硬脂酸醯胺 (polyoxyethylene stearic acid amide) ° 清潔劑也包括陰離子清潔劑（anionic detergents)， 其典型的例子包括：具有一 1 0至18個碳原子之烷基的烷 基硫酸鹽（alkylsulfates)—例如：十六烧基硫酸鈉 (sodium cetylsulfate)、月桂基硫酸鈉（sodium 1 aurylsulfate)與油基硫酸鈉（sodium oleylsulfate);聚 氧乙烯炫基醚硫酸鹽（polyoxyethylene alkyl ether sulfates)，其中之烧基具有1〇至18個碳原子，所添加之 2125-8465-PF;Kai 42 200803894 環氧乙烧（ethylene oxide)的平均摩爾數（molar number) 為2至4，其例子包括：聚氧乙烯月桂基硫酸納（sod i um polyoxyethylene lauryl sulfate);具有一 8 至 18 個碳 原子之烧基的烧基確基琥轴酸酯鹽類（alkyl sul f osuccinate ester salts)，月桂基石黃基琥珀酸酯鈉 (sodium lauryl sul f osuccinate ester)；天然清潔劑一 例如：卵鱗脂 （lecithin)； 甘 油填脂 (glycerophospholi pids) ； 神 經鞘鱗 月旨 類 _ (sphingo-phospholipids)—例如：神經鞘填脂 (sphingomyelin);以及蔗糖脂肪酸酯（sucrose fatty acid esters)，其中之脂肪酸具有12至18個碳原子。 上述之一個、二個或以上的清潔劑可與本發明之藥劑 併用或添加至該藥劑中。用於製備本發明的較佳清潔劑包 括聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯（p〇ly〇xyethylene sorbitan fatty acid esters)—例如：聚山梨糖醇酯 ⑩（polysorbates)20、40、60 與 80。聚山梨糖醇酯 20 與 80 尤仏 I氧乙烯聚氧丙烯乙二醇（Polyoxyethylene polyoxypropylene glycols)—例如：泊洛沙姆 (poloxamer)(plur〇niC F-68② and such)—也是較佳選擇。 所添加的清潔劑量當根據所用清潔劑的形式而改變。 當使用聚山梨糖醇酯2〇與8〇時，其一般用量範圍為〇· 〇〇1 至1〇〇耄克/毫升，最好是在0 003至5〇毫克/毫升之間， 更好的是在0.005至2毫克/毫升之間。 本發明中的緩衝劑包括磷酸鹽、檸檬酸鹽緩衝劑、醋 2125-8 4 65-PF;Kai 43 200803894 酸、、蘋果酸（mal ic acid)、酒石酸（七81^&1^〇&(^(1)、琥珀 酸（succinic acid)、乳酸（iactic acid)、磷酸鉀 (potassium phosphate)、葡萄糖酸（gluconic acid)、癸 酸（capric acid)、去氧膽酸（deoxycholic acid)、水楊酸 (salicylic acid)、三乙醇胺（triethanolamine)、反丁烯 二酸（fumaric acid)與其他的有機酸；以及碳酸缓衝劑 (carbonic acid buffer)、Tris 緩衝液（Tris buffer)、 組胺酸缓衝劑（histidine buffer)與味唾缓衝劑 (imidazole buffer) ° 將藥劑溶解在液體製劑（1 iqu id preparations)領域 所使用的水性緩衝液當中可配製液體製劑。缓衝液的濃度 範圍通常在1至500毫摩爾（mM)之間，最好是在5至100 毫摩爾之間，更好的是在10至20毫摩爾之間。 本發明之藥劑也可包含其他低分子量的多肽 (polypeptides);蛋白質一例如：血清白蛋白（serum

albumin)、 白明膠（gelatin)與免疫球蛋白 (immunoglobulin);胺基酸；糖與碳水化合物一例如：多 St (polysaccharides)與單 St (monosaccharides)、糠醇 (sugar alcohols)與這類物質。 本文中的胺基酸包括鹼性胺基酸（basic amino acids) —例如：精胺酸（arginine)、離胺酸（lysine)、組胺酸 (histidine)與鳥胺酸（ornithine)，以及這些胺基酸的無 機鹽類（最好是鹽酸鹽與磷酸鹽，即胺基酸磷酸鹽 (phosphate amino acids))。當使用游離胺基酸時，透過 2125-8465-PF;Kai 44 200803894 • T加適當之生理上可接受的緩衝物質（例如：無機酸—特別 是鹽酸、磷酸、硫酸、醋酸與甲酸，以及其鹽類）將其邱 調整至較佳值。在此例中，使用磷酸鹽特別有利，因為磷 酸鹽可給予相當安定的冷凍乾燥產物。當製劑大體上未含 有機酸（例如：蘋果酸、酒石酸、擰檬酸、琥珀酸與反丁烯 一酸）或對應的陰離子（蘋果酸鹽離子（malate i〇n)、酒石 酸鹽離子（tartrate ion)、檸檬酸鹽離子（citrate i〇n)、 _琥珀酸鹽離子（succinate i〇n)、反丁烯二酸鹽離子 (fumarate ion)以及這類離子）時，鱗酸鹽便特別有益。較 佳的胺基酸為精胺酸（arginine)、離胺酸（lysine)、組胺 酸（histidine)與鳥胺酸（ornithine)。也可使用酸性胺基 酸（acidic amino acids)—例如：麩胺酸（glutamic acid) 與天門冬胺酸（aspartic acid)及其鹽類（最好為鈉鹽）；中 性胺基酸一例如：異白胺酸（is〇leucine)、白胺酸 (leucine)、甘胺酸（glycine)、絲胺酸（serine)、經丁胺 _ 酸（threonine)、 纈胺酸（valine)、 曱硫胺酸 (methionine)、半胱胺酸（cysteine)與丙胺酸（alanine); 以及芳香族胺基酸（aromatic amino acids)—何如：苯丙 胺酸（phenylalanine)、赂胺酸（tyrosine)、色胺酸 (tryptophan)及其衍生物一 N-乙醯色胺酸（N-acetyl tryptophan) ° 本文之糖與碳水化合物（例如：多醣與單醣）的例子包 括：聚葡萄醣（dextran)、葡萄糠（glucose)、果糖 (fructose)、乳糠（lactose)、木糠（xylose)、甘露糖 2125-8465-PF;Kai 45 200803894 • (mann〇se)、麥芽糖（maltose)、蔗糖（sucr〇se)、海藻糖 (trehalose)以及棉子糖（raffinose)。 本文中的糖醇（sugar alcohols)包括：甘露糖醇 (mannitol)、山梨聚糖醇（sorbitol)與肌醇（inosit〇1)等。 當本發明之藥劑係配製成水性的注射溶液時，該藥劑 可與生理食鹽水和/或含有葡萄糖或其他輔助劑（例如：D-山梨水糖酵（D-sorbitol)、D -甘露糖（D-mannose)、D -甘露 糖醇（Diannitol)與氯化鈉）的等張溶液等混合。該水性溶 _液可與適當的助溶劑併用，該等助溶劑的例子包括：醇（乙 醇與同類物質）、多元醇（p〇lyalc〇h〇is)(丙二醇 (propylene glycol)、聚乙二醇（PEG)與同類物質）或非離 子清潔劑（聚山梨糖醇酯80(polysorbate 80)與氫化乙氧 基化蓖麻油（HC0-50))。

如果有需要，該藥劑可另外包含稀釋劑、助溶劑、pH 調節劑、鎮靜劑（soothing agents)、含硫的還原劑 (sulfur-containing reducing agents)、抗氧化劑 (antioxidants)與這類試劑° 本文中的含硫還原劑（sul fur-containing reducing agents)例子包括含有硫氫基（sulfhydry 1 groups)的化合 物一例如：N-乙醯半胱胺酸（N-acetyl cysteine )、N-乙醯 高半胱胺酸（N-acetylhomocysteine)、類脂酸（thioctic acid)、硫二乙二醇（thiodiglycol)、硫乙醇胺 (thioethanolamine)、硫甘油（thioglycerol )、硫山梨聚 糖醇（thiosorbitol)、硫乙醇酸（thioglycol ic acid)及其 2125-8465-PF;Kai 46 200803894 鹽類、硫代硫酸納（sodium thiosulfate)、魏胺硫 (glutathione)以及具有 1至 7個碳原子的硫烷酸 (thioalkanoic acids) ° 此外，本發明中之抗氧化劑的例子包括：異抗壞金酸 (erythorbic acid)、羥基甲苯二丁酯（dibutylhydroxy toluene)、丁基經基茴香 i|(butylhydroxy anisole)、α -生育紛（ο： -tocophero 1)、維他命 E(tocopherol acetate)、L-抗壞血酸（L-ascorbic acid)及其鹽類、L-抗壞血酸棕櫚酸酷（L-ascorbic acid palmitate)、L-抗壞 血酸硬脂酸鹽（L-ascorbic acid stearate)、亞硫酸氫鈉 (sodium hydrogen sulfite)、亞硫酸鈉（sodium sulfite)、沒食子酸三戊酯（tri amyl gal late)、沒食子酸 丙酯（propy 1 gal late)與螯合劑（chelating agents)—例 如：乙烯二胺四醋酸二鈉（disodium ethylenediamine tetraacetate (EDT A))、焦填酸鈉（sodium pyrophosphate)

與偏填酸鈉（sodium metaphosphate)。 如果有需要可將該藥劑充填至微膠囊 (microcapsules)( 羥甲基 纖維素 (hydroxymethylcellulose)、白明膠（gelatin)、聚[曱基 異丁 烯酸](poly[methylmethacry 1 ic acid])或這類材質 的微膠囊）内，或是製備成膠質藥物傳輸系統（c〇ll〇idal drug delivery systems)(脂質體（liposome)、白蛋白微球 (albumin microspheres)、微乳液（microemul si on)、奈米 粒子（nano-particles)、奈米膠囊（nano-capsules)與這類 2125-8465-PF;Kai 47 200803894 傳輸系統）（見 “Remington，s Pharmaceutical Science 16th edition”，Oslo Ed.，1 980以及這類參考文獻）。此 外，將藥劑製備成緩釋藥劑（sustained —release agents) 的方法也是習知方法，該等方法可應用於本發明中（Langer et al.j J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15： 167-277 i

Langer, Chem. Tech· 1 982，12 : 98一 1 05 ; U· S· 3，773 91 9 ; EP 58,481 ； Sidman et al., Bi〇p〇lymers 1983, 22: 547-556; and EP 133, 988)。 所使用之藥學上可接受的載體係根據劑型而適當地選 自上述載體或併用，但並未限定。 本發明係#關於治療前列腺癌❸彳法，該$法包括投 與一介白素-6抑制劑至患有前列腺癌之個體的步驟。 本文中的4固0係' 指為了治療前列腺癌而被投與本 發明之藥劑之生物或生物體的部位（〇rganisin㈣

Pa⑸。該等生物包括動物（例如：人類、家畜動物與野生 動物），但並未特別限定。 該“生物體的部位” 腺（prostate gland)、前 並未特別限定，但最好包括前列 列腺的周邊部位、或轉移的部位。 本文中的“投與，，包括口服與非腸道的投與。口服投 與的例子包括口服藥劑的投與。該等π服藥劑的例子包 括·顆粒（granules)、M (卿㈣、錠劑（tablets)、 capsules)、溶液、乳劑(_isi〇ns)以及懸浮液 (suspensions)。 該等注射的例子包 非腸道投與的例子包括注射投與。 48 2125-8465-PF；Kai 200803894 * ^ • 括·靜脈注射（例如··輸注）、皮下注射、肌内注射以及腹 膜内注射（intraperitoneal injecti〇n)。同時，利用基因 冶療技術（gene therapy techniques)將含有欲投與之寡核 苷酸的基因帶入活體，便可達到本發明之方法的效果。或 者，本發明之藥劑可局部地投與至欲治療區域。例如，該 藥劑在手術期間可經由局部注射而投與、透過使用導管而/ 投與或經由編碼本發明胜肽之去氧核糖核酸之目標基因傳 送而投與。 本發明之藥劑可和已知的前列腺癌療法（例如：前列腺 切除術（prostatectomy)、放射治療、荷爾蒙療法、化學療 法以及此類方法）同時併用或先後使用。 所有在此引用的專利、公告的專利申請（pubUshed patent applications)與出版品（publicati〇ns)皆以引用 的方式併入本文中。 實施例 • 在下文中將具體地以實施例描述本發明，但該實施例 並非用以限定本發明。 實施例1 確認人類前列腺癌細胞株當中之介白素-6受體的表現 如以下所述地以西方轉印法檢查人類前列腺癌細胞株 是否表現介白素-6受體。所用的人類前列腺癌細胞株為 PC3 、 DU145 與 JCA-1 〇 將上述的細胞株培養在補充10%胎牛血清（FBS)與鏈黴 素（Strept⑽ycin)的 RPMI 1640 培養基（Invitr〇gen， 2125-84 65-PF;Kai 49 200803894

Groningen, The Netherlands)當中，然後在冰上冷卻並且 以鱗酸鹽缓衝液（PBS )沖洗二次。取下該細胞並且以2 0 0 /z 1 的放射免疫沉澱測定緩衝液（RIPA buffer)(20mM 的

Tri s-HCl (pH 7· 4)、1 50mM 氯化鈉、2mM 乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraacetic acid) > 1% NP-40、1%去氧 膽酸鈉（sodium deoxycholate)、0· 1% 十二基硫酸鈉 (sodium dodecyl sulfate [SDS])、50mM 爾氟化鈉（NaF)、

ImM爾叙酸鈉（sodium orthvanadate)、ImM苯曱基石黃醢氰 (phenylmethylsulfonyl fluoride) 、 10# g/ml 抑肽酶 (aprotinin)以及 1 〇 // g/ml 亮抑酶肽（1 eupept in))溶解細 胞。根據製造廢商（BioRad Laboratories， Hercules

California)的操作說明以染料結合測定法（dye binding method)確定上清液的蛋白質濃度。利用十二基硫酸鈉一聚 丙豨醯胺電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) 將如此取得的蛋白質轉移至硝酸織維素膜（Bi〇Rad _1^1)0”1：01^63)上。利用含有5%脫脂奶之1^3緩衝生理食 鹽水抑制非專一性的吸附作用，並且使該膜與稀釋5 〇 〇倍 的兔抗人類介白素-6受體抗體（Santa CruzBiotechnology) 反應。根據製造廠商的操作說明（Bi〇Rad Laboratories) 利用增殖性鹼性磷酸酶系統（Amplified Alkaline

Phosphatase System)獲得免疫反應帶。 結果顯示人類前列腺癌細胞jCH、PC3與DU145表現 介白素-6受體（第一圖）。 實施例2 2125-8465-PF;Kai 50 200803894 • 確定人類前列腺癌細胞中之介白素-6的產生 乂下述方法;^查介白素-6疋否在人類前列腺癌細胞株 當中產生。 具體地來說，利用實施例1所述的培養基將實施例1 所述的細胞株培養在24孔盤（24-well piates)中，每個孔 培養5 χΙΟ4個細胞，培養48小時，然後利用酵素結合免 疫吸附測定（ELISA)確定上清液甲的介白素一6濃度。 結果顯示介白素-6在人類前列腺癌細胞JCA-1、PC3 響與DU145中產生（第二圖）。 實施例3 確定人化PM-1抗體的體外抗腫瘤效力 利用下述的方法檢查人化PM-1抗體是否具有體外的 抗腫瘤效力。 利用補充10%胎牛jk清（FBS)與鍵徽素（streptomyeiη) 的 RPMI 1640 培養基（invitrogen， Groningen， The _ Nether lands)培養實施例1所述的細胞株，將該細胞株培 養在96孔盤中24小時，每個孔培養5 X 1〇3個細胞，然 後將濃度30、100或300微升/毫升的人化PM-1抗體 (humanized PM-1 antibody (hPMl))加入。經過 24 與 48 小時之後，以MTT檢測分析抗腫瘤效力。人化pm-1抗體 (Hirata T et s/. , Leuk Res. 2003; 27(4):343-9, Sato K a/·， Cancer Res· 1993; 53(4):85卜6)由 Chugai

Pharmaceutical Co. Ltd.提供。 結果顯示人化PM-1抗體以時間依賴以及濃度依賴方 2125-8465-PF;Kai 51 200803894 wV 參 , 式抑制細胞生長（第三圖）。 實施例4 確定介白素-6受體作用之人化PM_1抗體的體外效力 利用下述的方法檢查人化PM-1抗體是否經由介白素、 -6受體展現其效力。 本發明之發明者著重在介白素-6受體訊息途徑的訊息 轉導與轉錄激活子-3下游（STAT3 downstream of the IL-6 receptor signal pathway)。將 DU145 培養在上述的培養 _基中24小時，然後在培養基中加入1 〇〇微克/毫升的人化 PM-1抗體（hPMl)，60分鐘之後，如以上所述地利用西方轉 印法比較該細胞與對照細胞的訊息轉導與轉錄激活子—3鱗 酸化作用（STAT3 phosphorylation)。接著經過24小時的 培養之後，在存有或缺乏100微克/毫升之人化PM-1抗體 的狀態下刺激該等細胞，並在3 0與6 0分鐘之後以西方轉 印法比較其訊息轉導與轉錄激活子—3磷酸化作用。該最初 _使用的抗體為稀釋1 〇 〇 〇倍的兔抗人類填酸化訊息轉導與 轉錄激活子-3 抗體（rabbit anti-human pSTAT3 antibody)(Cell Signaling Technology)。 結果顯示投與人化PM_ 1抗體6 〇分鐘之後便抑制前列 腺癌細胞株的訊息轉導與轉錄激活子—3磷酸化。其結果也 顯示人化ΡΜ-1抗體可抑制藉由介白素—β所刺激提高的訊 息轉導與轉錄激活子_3磷酸化（第四圖）。 實施例5 確定人化ΡΜ-1抗體的體内抗腫瘤效力 2125-8465-PF;Kai 52 200803894 ^ * m τ 利用下述的方法確定人化PM-l抗體是否具有體内的 抗腫瘤效力。 將DU 145細胞（1 〇7個細胞/動物體）經由皮下移植入嚴 重複合免疫不全症小鼠（SCID mice)體内，進而產生皮下的 腫瘤模式。在確認腫瘤移植物之後5天開始投與人化PM4 抗體（hPMl)(每3天投與200微克/動物體）。隨著時間測量 腫瘤的體積與小鼠的體重以評估人化PM—1抗體的體内抗 腫瘤效力。 結果顯示投與人化PM-1抗體至被植入DU145的嚴重複 合免疫不全症小鼠（SCID mice)會明顯地抑制其腫瘤生長 與體重下降（第五圖）。在腫瘤模式中，抑制體重下降即表 不本發明之介白素—6抑制劑也可有效治療伴隨前列腺癌而 發生的惡病質（cachexia)。 產業的應用

何爾蒙療法係唯 種可治療晚期前列腺癌 (advanced prostate cancer)的療法。然而，許多晚期前 列腺癌病患在接受數年的荷爾蒙療法之後便產生荷爾蒙抗 性（honnone resistance)，造成治療上的困難。本發明之 前列腺癌治療藥#κ其含有作為有效成分的介白素_6抑制 劑）被預期是荷爾蒙療法之外的另一種有效療法，並且甚至 可有效地治療已對荷爾蒙療法產生 々座王ί几性的刖列腺癌。本發 明之前列腺癌治療藥劑被預期呈古土 只Μ >、有抑制手術後之前列腺癌 復發的效力。一般認為本發明夕义u ^ ^ 1 4 % Θ之則列腺癌治療藥劑可有效 2125-8465—PF;Kai 53 200803894 m 一 • 地治療伴隨前列腺癌而發生的惡病質。 【圖式簡單說明】 第一圖係西方轉印法分析的照片，其顯示介白素-6受 體表現在人類前列腺癌細胞株jCA_i、pC3與DU145IL-6中。 第二圖係顯示人類前列腺癌細胞株jCA-1、PC3與 DU145之培養上清液當中的介白素一6濃度增加。 ⑩ 第三圖係顯示人化PM-1抗體（hPMl)在體外展現抵抗 人類前列腺癌細胞株JCA-〗、pC3與M145的抗腫瘤效力。 水平軸代表人化PM-1抗體的濃度。 第四圖係顯示以介白素-6刺激DU145細胞60分鐘後， 磷酸化訊息轉導與轉錄激活子—3(pSTAT3)的表現增加，而 增加之磷酸化訊息轉導與轉錄激活子-3的表現在使用人化 PM-1抗體之後便被抑制。 第五圖係顯示人化PM-1抗體在具有皮下腫瘤之患癌 _小鼠模式中的體内抗腫瘤效力，該模式係將人類前列腺癌 細胞株DU145移植入嚴重複合免疫不全症小鼠（SCID mice) 而產生。上圖係顯示當投與人化pjj-j抗體或對照抗體（免 疫球蛋白G( IgG))至患癌的小鼠時之腫瘤大小隨時間的變 化。·下圖係顯示當投與人化PM-i抗體或對照抗體（免疫球 蛋白G (I gG))至患癌的小鼠時之體重隨時間的變化。 【主要元件符號說明】 無0 2125-8465-PF;Kai 54

Claims (1)

1. 200803894 十、申請專利範圍·· 種治療前列腺癌的藥劑 介白素-6抑制劑 6抑=申請專利範㈣1項所遂的藥劑，其中該介白素 抑制劑係為-種識別介白素-6的抗體。 -fi Λ如中請專利範圍帛1項所述的藥劑，其中該介白素 卩背1係為-種識別介白素-6受體的抗體。

   > ^如中請專利範圍第2或第3項所述的藥劑，其中該 抗體係為一單株抗體。 2或第3項所述的藥劑，其中該 或人類介白素-6受體。 2或第3項所述的藥劑，其中該 5·如申請專利範圍第 抗體係識別人類介白素一6 6·如申請專利範圍第 抗體係為一重組抗體。 、如申明專利範圍帛6項所述的藥劑，其中該抗體係 為一嵌合、人化或人類抗體（chimeric，h_ized，π 參 human antibody)。 、8·Μ請專利範圍帛1至帛7項中任一項所述的藥 劑，其中該前列腺癌係為荷爾蒙抗性的前列腺癌 (hormone-refractory prostate cancer)。 9· 一種治療一個體前列腺癌的方法，該方法包括投與 "白素-6抑制劑至患有該前列腺癌之個體的步驟。 10·如申請專利範圍第9項所述的方法，其中該介白素 -6抑制劑係為一種識別介白素刊的抗體。 11·如申請專利範圍第9項所述的方法，其中該介白素 2125-8465-PF;Kai 55 200803894 *达 -6抑制杳ί| 糸炎 .. ， w你為—種識別介白素-6受體的抗體。 12 如由上太 •甲請專利範圍第10或第1丨項所述的方法，苴中 該抗體係為一單株抗體。 13 七由过 • °甲請專利範圍第1 〇或第丨i項所述的方法，其中 呑才體係為抗人類介白素- 6抗體或抗人類介白素一 6受 '體抗體。 、 14·如申睛專利範圍第1 〇或第11項所述的方法，其中 該抗體為一重組抗體。 15 ·如申凊專利範圍第14項所述的方法，其中該抗醴 為一嵌合、人化或人類抗體。 種I^用以治療前列腺癌藥劑之介白素~ 6抑制 劑的使用方法。 17.如申請專利範圍第16項所述的使用方法，其中該 介白素-6抑制劑係為一種識別介白素—6的抗體。 18·如申請專利範圍第16項所述的使用方法，其中該 _介白素—6抑制劑係為一種識別介白素一6受體的抗體。 19·如申請專利範圍第17或第18項所述的使用方法， 其中該抗體係為一單株抗體。 2〇·如申請專利範圍第17或第！8項所述的使用方法， 其中該抗體係為一抗人類介白素一 6抗體或抗介白素-6受 體抗體。 21 ·如申請專利範圍第1 7或第18項所述的使用，其中 該抗體係為一重組抗體。 22·如申請專利範圍第21項所述的使用，其中該抗體 2125-8465-PF;Kai 56 200803894 係為一嵌合、人化或人類抗體。

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