TW200800009A - Human G protein-coupled receptor and modulators thereof for the treatment of ischemic heart disease and congestive heart failure - Google Patents
Human G protein-coupled receptor and modulators thereof for the treatment of ischemic heart disease and congestive heart failure Download PDFInfo
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Description
200800009 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明關於辨識候選化合物是否為孤兒（orphan)G蛋白-‘ 偶聯受體（GPCR)之調節劑。較佳者該GPCR為人類GPCR。 在一些具體實施例中，GPCR由心肌細胞内生性表現。在 一些具體實施例中，GPCR與Gi-偶聯，且降低細胞内環單 磷酸腺苷的濃度。在一些具體實施例中，GPCR的過度表 φ 現促使心肌細胞存活。在一些具體實施例中，GPCR的過 度表現可挽救因缺氧/回氧所導致的心肌細胞凋亡。在一 些具體實施例中，GPCR在患有充血性心衰竭的個體中被 向下調節。本發明的促效劑預期可作為治療缺血性心臟病 (包含心肌梗塞）、心肌梗塞後之重塑及充血性心衰竭之治 療藥物。 【先前技術】 A·缺血性心臟病及充血性心衰竭 • 充血性心衰竭（CHF)影響約5百萬美國人，且每年有50萬 個新病例產生。就定義而言，CHF為一種心臟病，其臨床 病徵為降低心輸出量，靜脈壓增加力，且伴隨著化學分子 的不正常而造成心臟衰竭持續惡化及心臟細胞過早死亡 (請參《心衰竭：疾病生理學，分子生物學，及臨床管 理》，Katz，AM，Lippincott Williams and Wilkins，2000)。 在成人心臟，因為喪失的細胞無法取代替換，肌肉細胞 (心肌細胞）死亡為心衰竭自然原因的重要元素。因為心衰 竭一旦出現症狀，5年存活率少於50%，任何心衰竭的定 122352.doc 200800009 義若不能考慮促進心肌死亡的分子過程均忽略此症狀的主 要臨床特徵。因此，如今許多團體的研究集中於規範心肌 死亡及存活的分子機制及訊息傳遞路徑。細胞培養及小動 物實驗清楚的證實心肌上的G蛋白-偶聯受體為心肌收縮功 能的重要調節劑，同時也與心肌細胞死亡或存活的調節有 關（請參 Adams 及 Brown，0ncogene(2001)20:1626-1634)。然
而，目前並沒有臨床上可得的藥物是設計用來抑制心肌細 胞死亡或直接活化其存活路徑。近來公佈小氣及大鼠證據 顯示，心肌細胞存活路徑的活化或死亡路徑之抑制顯著改 進心臟功能及動物存活（請參Lee等人，End〇crin〇1〇gy (1999) 140:4831-40 ; Langwitz 等人，Hum Gene Ther (2001) 12:2051-63)。因此類似的治療策略顯然對於人類心 衰竭的治療相當值得期待。 B· G蛋白·偶聯受體 計可編碼GPCR。包含GPCR在内， 出的受體，稱之為「已知配體」受 被辨識出的受則是「孤兒（〇rphan)」 雖然人類體内存在許多類別的受體，目前所知數量最多 且與治療相關的即為G蛋白·偶聯受體（GpcR) _類。據估 計有3萬至4萬個基因存於人類基因組中，這當中約㈣估 其内生性配體已被辨識 體’而内生性配體尚未 受體。 隹樂劑製 上八〜孤•恍UID種已- 配體GPCR當中大概2〇種， > 沾〜 開I出全部處方藥劑之约60 的。例如，於1999年， 处方藥的品牌，就右下； 藥物與GPCR作用胖Ml /、°亥樂物相關的主要治療2 122352.doc 200800009 病及/或失調）：
Claritin®(過敏）、 Prozac®(憂鬱）、 Vasotec®(高血壓）、 - Paxil®(憂鬱）、 Zoloft®(憂鬱）、 Zyprexa®(精神疾病）、 . Cozaar®(高血壓）、Imitrex®(偏頭痛）、 Zantac®(胃食道逆流）、
Propulsid®(胃食道逆流）、Risperdal®(精神分裂症）、Serevent®(氣喘）、 Pepcid®(憂鬱）、 Gaster®(潰瘍）、 Atrovent®(支氣管痙攣）、
Effexor®(憂鬱）、 Depakote®(癩癇）、 Cardura®(前列腺炎）、
Allegra®(過敏）、 Lupron®(前列腺癌）、Zoladex®(前列腺癌）、 鲁 Diprivan®(麻醉）、BuSpar®(焦慮）、 Ventolin®(支氣管痙攣）、
Hytrin®(高血壓）、 Wellbutrin®(憂鬱）、Zyrtec®(鼻炎)、
Plavix®(MI/ 中風）、Toprol-XL®(高血壓）、Tenormin®(心絞痛）、 Xalatan®(青光眼）、Singular®(氣喘）、 Diovan®(高血壓)及
Hamal® (前列腺肥大） (Med Ad News 1999 資料） GPCR都具有一種基本結構基元，其有22至24個疏水性 φ 胺基酸形成的7個序列片段形成7個α螺旋結構，其各自跨 越細胞膜（各段以數字編號以供識別，如跨膜區-1 (ΤΜ· 1) ’ 跨膜區-2(ΤΜ-2)等）。在位於細胞膜外部（或「細胞外」側） 之跨膜α螺旋間，即跨膜區-2及跨膜區-3之間、跨膜區-4及 跨膜區-5之間以及跨膜區-6及跨膜區-7之間（這些稱為「胞 外」區1、2及3(EC-1、EC-2及EC-3))，皆以胺基酸鏈連 結。在位於細胞膜内部（或「細胞内」侧）之跨膜α螺旋 間，即跨膜區-1及跨膜區-2之間、跨膜區-3及跨膜區-4之 間以及跨膜區-5及跨膜區-6之間（這些分別稱之為「胞内」 122352.doc 200800009 區1、2及3(IC-1、ic_2及IC-3))，亦以胺基酸鏈相連。受體 之「羧基」（，，Cn)端位於細胞内，而受體「胺基」（”N”）端 " 位於細胞外。 ‘ 一般而言，當配體與受體結合（一般稱為受體「活化」） 時’受體之構形會產生變化而有助於其胞内區與細胞内之 「G蛋白」偶聯。曾有報告指出GPCR對於g蛋白之結合為 「雜亂的」，也就是說一個GPCR可與一種以上的G蛋白作 用。請參Kenakin，T·, 43 Life sciences 1095 (1988)。雖 然’存在其他G蛋白’目前所辨$忍出的G蛋白為Gq、Gs、 Gi、Gz及Go。被配體活化的GPCR與G蛋白偶聯而起始一 連串訊號傳遞過程（稱之為「訊息傳遞」）。在一般的情況 下’訊息傳遞最後造成細胞活化或細胞抑制。雖然不希望 被理論所侷限，咸認為受體的IC-3環與羧基端均會與〇蛋 白交互反應。 在生理情況下，GPCR存在於細胞膜中並達到2種不同構 • 形之平衡：「不活化」狀態及「活化」狀態。在不活化狀 態下的受體不能夠連結細胞内訊息傳遞路徑以觸發訊息傳 遞而引起生物反應。改變受體構形為活化狀態允許其與訊 息傳遞路徑連鎖（經由G蛋白）而產生生物反應。 受體可因為配體或如藥品之類的化合物而在維持穩定的 活化狀態。近來發現，包含，但不限於，修飾受體胺基酸 序列，提供有別於配體或藥物的方法可幫助及穩定受體處 於活化狀態的構形。這些方法模擬配體與受體結合所產成 的結果而有效地將受體穩定維持於活化狀態。此不需配體 122352.doc 200800009 而穩定活化的方法稱之為「本質性（持續性）受體活化作用 (constitutive receptor activation)」〇 【發明内容】 本發明關於孤兒GPCR，本文中稱為RUP41。RUP41與 GPR22(GenBank® Accession No. U6658 1)有關。 RUP41由心肌細胞内生性表現。人類RUP41的基因表現 圖譜由Affmetrix基因晶片測量，並以多組織點潰法及北方 墨潰法確認。經由基因體DNA放大而得之大鼠異種同源 (ortholog)之RUP41的部份編碼序列已被辨識出並公開。此 大鼠RUP41聚核苷酸片段與已發表的小鼠RUP41聚核苷酸 序列（XM—137998)具有97%序列同一性（identity)。揭示於 本文的RUP4 1可與Gi偶聯，導致腺環化酶抑制作用且抑制 cAMP產生。本文進一步揭示，在缺血性及充血性心臟病 的實驗模式中，内生性RUP41表現量降低。本文亦進一步 揭示RUP41的過度表現促進心肌細胞存活。由揭示的 RUP41特性顯示RUP41的促效劑可能有助於治療心肌細胞 凋亡相關的心臟病。 本發明之一部份係關於辨識候選化合物是否為RUP41調 節劑的方法。在一些其他的具體實施例中，本發明係關於 調節RUP41活性的方法，其包含將RUP41與RUP4 1調節劑 接觸之步驟。在一些具體實施例中，該調節劑可降低細胞 内cAMP含量。在一些具體實施例中，該調節劑為促效 劑。 在一些具體實施例中，該接觸發生於活體外Wiro)。 122352.doc -10- 200800009 在一些具體實施例中，在判定 T牡列疋调即劑是否可有效抑制心肌 細胞调亡时法中’ RUP41調節劑被導切肌細胞调亡的 細胞坧養模式中在一些具體實施例中，該調節劑可降低 細胞内cAMP含量。在—些具體實施例中，該調節劑為促 效劑。
在一些具體實施例中，接觸發生於活體内〇•"㈣。在 -些具體實施例中，在判定調節劑是否可有效降低缺企性 心臟病及心衰竭之相關病理的方法中，Rup41調節劑係投 予經歷缺血性心臟病及心衰竭手術模式之小鼠及大鼠。另 一個具體實施例，在判定調節劑是否有益心臟重塑及其功 能的方法中，1^?41調節劑係投予受實驗性的心肌梗塞處 理之動物。在一些具體實施例中，該調節劑可降低細胞内 cAMP含里。在一些具體實施例中，該調節劑為促效劑。 RUP4 1调谛劑預期可作為治療缺血性心臟病（包含心肌 梗塞）、心肌梗塞後之重塑及充血性心衰竭之治療藥劑。 在一些具體貝施例中，該調節劑可降低細胞内c AM?含 量。在一些具體實施例中，該調節劑為促效劑。 人類RUP41之第一對對偶基因的聚核苷酸片段及其編碼 之多肽片段分別如序列表中序列識別號:1及序列識別號： 2所示（對應序列識別號：2多肽之編碼區為序列識別號··丄的 核苷酸237至1538)。人類RUP41多肽之第二對對偶基因的 胺基酸序列（GenBank⑧ Accession No. AAB63815)，包含將 序列識別號：2胺基酸位置425上的離胺酸（以以116)單取代為 半胱胺酸（cycteine)，即為序列識別號：3(相對之編碼序列 122352.doc * 11 - 200800009 為 GenBank® Accession No· AC002381 的 79559至 80860核 苦酸）。小鼠RUP41的聚核苷酸序列及其編碼之多肽序列， 分別如序列表所示之序列識別號：4及序列識別號：5。包 3大乳RUP41部份編碼序列之聚核苷酸序列如序列識別 號：6所示。 在第個發明恶樣中，本發明特徵為一種識別候選化合 物是否為RUP41 GPCR的調節劑之方法，該受體包含選自 下列群組的多肽： U)序列識別號：2的多肽； (b) 序列識別號：3的多肽；及 (c) 序列識別號·· 5的多肽； 或其片段或變異體，其中該受體與G蛋白偶聯，該方法 包含下列步驟： O’）將候選化合物與受體接觸；及 (b’）測定受體功能是否可被調節，其中受體功能改變表 示該候選化合物為該GPCR之調節劑。 本發明亦關於一種識別候選化合物是否為心臟保護作用 之調節劑的方法，其包含下列步驟： (a)將候選化合物與GPCR接觸，該受體包含選自下列 群組的多肽： (i) 序列識別號·· 2的多肽； (ϋ) 序列識別號：3的多肽；及 (iii) 序列識別號：5的多肽； 或其片段或變異體，其中受體與G蛋白偶聯；及 122352.doc -12- 200800009 (b)測定該受體功能是否被調控； 其中受體功能改變表示該候選化合物為心臟保護作用 (cardioprotection)的調節劑。 在一些具體實施例中，該受體包含選自序列識別號：2 胺基酸2至433或序列識別號：3胺基酸2至433的多肽片 段。 在一些具體實施例中，RUP41 GPCR為内生性。 RUP41 GPCR對偶基因的變異體亦屬於本發明之範圍 中。 序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41多肽的喵 乳類異種同源基因亦屬於本發明之範圍中。在一些具體實 施例中，該哺乳類異種同源基因包含小鼠RUP4 i、大鼠 RUP41及非人類的靈長類動物之RUP41。 與序列識別號：2、序列識別號：3或序列識別號：5之 RUP41 多肽具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%或99%序列同一性之多肽變異體亦 屬於本發明之範圍中。在一些特定實施例中，多肽序列同 源性係使用習知的「基本局部序列比對搜索工具」 (「BLAST」）評估（請參例如 Karlin 及 Altschul，Proc Matl Acad Sci USA (1990) 87:2264-8 ; Altschul等人，j Mol Biol (1990) 215:403-410 ; Altschul等人，Nature Genetics (1993) 3:266-272 ;及 Altschul 等人，Nucleic Acids Res (1997) 25:3 3 89-3 402 ;該等文獻之揭示皆以參考其整體併入本 文）。該多肽變異體可包含一或多個胺基酸缺失、插入及 122352.doc -13- 200800009 取代。序列識別號：2、序列識別號：3或序列識別號：5 之RUP41多肽的本質性活化塑多肽變異體亦屬於本發明之 範圍中。在一些具體實施例中，該本質性活化型之RUP41 多肽的即為序列識別號：2或序列識別號：3的多肽，其中 在序列識別號：2或序列識別號：3胺基酸位置3 12的苯丙 胺酸（phenylalanine)以離胺酸取代0 在一些具體實施例中，該RUP41 GPCR為重組體。 在一些具體實施例中，該RUP41 GPCR包含一個或多個 抗原決定基標記。在一些具體實施例中，該抗原決定基標 記為血液凝集抗原（HA)抗原決定基標記。在一些具體實施 例中，該抗原決定基標記為核酸序列FLAG抗原決定基標 記。在一些具體實施例中，抗原決定基標記為V5抗原決定 基標記。提供該等HA、FLAG或V5抗原決定基標記的程序 為發明所屬技術領域中具有通常知識者所習知者（例如
Clonthech，Palo Alto, CA及 Invitrogen，Carlsbad，CA)。 在一些具體實施例中，該G蛋白調控細胞内cAMP濃度。 在一些具體實施例中，該G蛋白為Gi。 在一些具體實施例中，該測定係經由使用黑色素細胞分 析。在一些具體實施例中，色素聚集程度提高。在一些具 體實施例中，色素分散降低。 在一些具體實施例中，該測定為測量選自環 AMP(cAMP)、環 GMP(cGMP)、三磷酸肌醇（1?3)、二醯甘 油（DAG)及Ca2+之二級傳訊子的濃度。在一些具體實施例 中，该一級傳訊子為cAMP。在一些具體實施例中，該 122352.doc * 14 - 200800009 cAMP之濃度降低。在一些具體實施例中，該測定是以與 CART-TSH共轉染（co-transfect)的 COS-7細胞進行。 在一些具體實施例中，該測定是以包含該GPCR的細胞 膜進行。在一些具體實施例中，該胞膜係將細胞使用 Brinkman PolytronTM均質機均質化製成。在一些具體實施 例中，該細胞膜是使用該Polytron均質機強力攪拌3次每回 10至20秒而製備成。 在一些具體實施例中，該測定係測量由細胞内部cAMP 濃度降低所中介的活性。在一些具體實施例中，該活性為 促進細胞生存。在一些具體實施例中，該細胞為初生大鼠 心室心肌細胞細胞（NRVM)。在一些具體實施例中，該活 性為挽救從缺氧/回氧反應誘導凋亡之細胞。在一些具體 實施例中，該細胞為NRVM。 在一些具體實施例中，該G蛋白為嵌合之Gq(del)/G α次 單元且該該測定為測量ΙΡ3或Ca2+。 在一些具體實施例中，該測定為測量GTPYS結合至包含 該GPCR的細胞膜上。在進一步具體實施例中，GTPYS以 [35S]標示。 在一些具體實施例中，該接觸是在GPCR之已知配體存 在下進行。在一些具體實施例中，該已知配體為該GPCR 的促效劑。 在一些具體實施例中，該方法進一步包含比較由候選化 合物所導致之受體調節反應與將受體和已知的受體調節劑 接觸所造成的第二種受體調節反應的步驟。 122352.doc -15- 200800009
在第—個發明怨樣中’本發明特徵為-種RUP41 GPCR 調節劑或以如第一個發明態樣之方法所辨識出的心臟保護 - 作用之調節劑。 • 在—些具體實施例中’該調節劑係選自促效劑、部份促 效劑、反向促效劑及拮抗劑。 在-些具體實施例巾’該調節劑對於序列識別號：2或 序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的狀5〇或ic5〇小於選 φ 自1㈣至刚_之範圍中的值。在-些具體實施例中， 該調節劑對於序列識別號：2或序列識別號：3之人類 RUP41 GPCR的EC50或IC5〇小於選自下列之濃度值：i μΜ、10 μΜ、20 μΜ、30 μΜ、4〇 _、5〇 _、6〇 _、 70μΜ、80μΜ、90_及100_。在一些具體實施例中， 該調節劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUp41 GPCR的EC50或IC50小於選自1 μΜ至1〇 μΜ之範圍中的 值。在一些具體實施例中，調節劑對序列識別號：2或序 ❿ 列谶別號· 3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自 下列之濃度值：1 μΜ、2 μΜ、3 μΜ、4 μΜ、5 μΜ、ό μΜ、7 μΜ、8 μΜ、9 μΜ及 1〇 μΜ。 在一些具體實施例中，該調節劑可降低細胞内cAMP濃 度。 在一些具體實施例中，該調節劑為促效劑。 在一些具體實施例中，該調節劑有選擇性。 在一些具體實施例中，該調節劑可為生物口服利用。 在一些具體實施例中，該調節劑為包含至少一個結合區 122352.doc -16 - 200800009 的抗體或其衍生物。 在第三個發明態樣中’本發明特徵為一種調節rUP41 ^ GPCR活性的方法，該受體包含選自下列群組的多狀： . (a)序列識別號：2的多肽； (b) 序列識別號：3的多肽；及 (c) 序列識別號：5的多肽； 或其片段或變異體’其中該受體與G蛋白偶聯，該方法 I 包含將受體與如第二個發明態樣之調節劑接觸的步驟。 在一些具體實施例中’該受體包含選自序列識別號：2 胺基酸2至433及序列識別號：3胺基酸2至433的多肽片 段。 RUP41 GPCR之對偶基因變異體亦屬於本發明之範圍 中〇 序列識別號：2或序列識別號：3的人類RUP41多肽之哺 乳類異種同源體亦屬於本發明範圍中。在一些具體實施例 φ 中，該哺乳類異種同源體包含小鼠RUP41、大鼠RUP41及 非人類之靈長類動物的RUP41。 具有與序列識別號：2、序列識別號：3或序列識別號： 5 之 RUP41 多肽至少 90%，91%，92%，93%，94%，95%， 96%，97%，98%，或99%序列同一性的變異體多肽亦屬於 本發明之範圍中。在一些特定實施例中，多肽序列同源性 (homology)係使用習知的「基本局部序列比對搜索工具」 (「BLAST」）評估（請參例如 Karlin 及 Altschul，Proc Matl Acad Sci USA (1990) 87:2264-8 ; Altschul等人，J Mol Biol 122352.doc -17- 200800009 (1990) 215:403-410 ; Altschul等人，Nature Genetics (1993) 3:266-272 ;及 Altschul 等人，Nucleic Acids Res (1997) 25:3 3 89-3402 ;該等文獻之揭示皆以參考其整體併入本 文）。該多肽變異體可包含一或多個胺基酸缺失、插入及 取代。序列識別號：2、序列識別號：3或序列識別號：5 之RUP41多肽的本質性活化型變異體亦屬於本發明之範圍 中。在一些具體實施例中，該RUP41多肽的本質性活化型 為序列識別號：2或序列識別號：3的多肽，其中在序列識 別號·· 2或序列識別號：3胺基酸位置312的苯丙胺酸以離 胺酸取代。 在一些具體實施例中，該調節劑係選自促效劑、部份促 效劑、反向促效劑及拮抗劑。 在一些具體實施例中，該調節劑對於序列識別號：2或 序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選 自1 μΜ至100 μΜ之範圍中的值。在一些具體實施例中， 該調節劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之濃度值：i μΜ、10 μΜ、20 μΜ、30 μΜ、40 μΜ、50 μΜ、60 μΜ、70 μΜ、 80 μΜ、90 μΜ及100 μΜ。在一些具體實施例中，該調節 劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR 的EC50或IC50小於選自1 μΜ至10 μΜ之範圍中的值。在一 些具體實施例中，該調節劑對序列識別號：2或序列識別 號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之 濃度值：1 μΜ、2 μΜ、3 μΜ、4 μΜ、5 μΜ、6 μΜ、7 122352.doc -18- 200800009 μΜ、8 μΜ、9 μΜ及 1〇 μΜ。 該”周節劑可降低細胞内c AMP濃 在一些具體實施例中 度0 在一些具體實施例中 在一些具體實施例中 在一些具體實施例中 在一些具體實施例中 該受體的細胞膜。 ，該調節劑具有選擇性。 ，該調節劑可為生物口服利用。 ’該調節劑為促效劑。 ，该接觸包含將該調節劑投予包含
在一些具體實施例中，該接觸包含將該調節劑投予包含 該受體的細胞或組織。 在一些具體實施例中，該接觸包含將該調節劑投予包含 該受體的個體。 在-些具體實施例中’該個體為哺乳動物。在—些呈體 實施例中’該哺乳動物為馬、牛、羊、豬、描、狗:、兔 子、小鼠、大鼠、非人類靈長動物或人。較佳者為小鼠、 大鼠或人。最佳者為人。 在一些具體實施例中，該方法係用來識別調節劑是否具 有預防或治療選自下列組群之心血管失調症之療效：^ (a) 心臟輸出量降低；及 (b) 靜脈壓增加； 該方法包含以下步驟： (a，）將調節劑投予心肌細胞凋亡的細胞培養模式中；及 (b，）測定該凋亡是否被抑制，其中該測定是透過選自下 列組群之測量法： 122352.doc -19- 200800009 (i) 測量細胞數目； (ii) 測量DNA斷裂；及 (ii〇測量細胞核染色質濃縮； 示對該調節劑具有該治療 其中測得細胞凋亡之抑制反應表 效果。
在一些具體實施例中， 用 DAPI(4’，6^二甲脒基-2一 細&核染色質濃縮的測量係為使 苯°引哚）染劑進行。 在一些具體實施例中 有預防或治療選自下列 (a)心肌梗塞； ’遠方法係用於識別調節劑是否 、、且群之缺血性心臟疾病之療效： 具 (b)心肌梗塞後之重塑；及 (c)充血性心衰竭； 該方法包含下列步驟： (a’)將調節劑投予心肌細胞凋亡的細胞模式中丨及
(b·)測定該凋亡是否被抑制，其中該測定是透過 列組群之測量法： 、下 (0 測量細胞數目； (ii) 測量DNA斷裂；及 (iii) 測量細胞核染色質濃縮； 其中測得細胞凋亡之抑制反應表示對該調 療效果。 #有讀治 在一些具體實施例中，細胞核染色質濃縮的蜊量/、 用DAPI(4，6 曱脒基笨ϋ弓卜朵）染劑進行。 人為使 在一些具體實施例中，該方法係於識別 即舞丨是x 122352.doc -20- 200800009 有預防或治療選自下列組群之心血管失調症的療效： 0)心臟輸出量降低；及 (b)靜脈壓增加； 該方法包含下列步驟： (a’）將調節劑投予或不投予心血管失調症的小鼠或大鼠 模式中；及 (b’）測定該調節劑的投予是否具有選自下列組群的效 果：
(i) 心臟肥大降低； (ii) 心臟射出分率增加； (iii) 心室腔體積降低；及 (iv) 心肌細胞凋亡降低； 其中若能測定出上述效果即丧干兮兮 μ I衣不該忒调即劑具有所述的療 效。 、 在一些具體實施例中，# 。亥方法係用於識別調節劑是否具 有預防或治療選自下列組群中之缺‘祕、、时— 、 f甲之缺血性心臟疾病之療效： 心肌梗塞； (b) 心肌梗塞後之重塑；或 (c) 充血性心衰竭； 不投予缺血性心臟病的 該方法包含下列步驟： (af)將調節劑投予或 模式中；及 下列組群的致 (b,)測定該調節劑的投予是否具有選 果： 122352.doc 21 200800009 (V) 心臟肥大降低； (vi) 心臟射出分率增加，· ^ (vii)心室腔體積降低；及 > (viii)心肌細胞〉周亡降低； 其中若能測定出上述效果即表示該該調節齊彳具有所述的療 效。 在一些具體κ施例中，該個體需要預防成治療選自下列 組群之心血管失調症疾病： Φ (a) 心臟輸出量減少；及 (b) 靜脈壓增加； 在一些具體實施例中，該個體需要預防或治療選自下列 組群之缺血性心臟病： (a) 心肌梗塞； (b) 心肌梗塞後的重塑；及 (c) 充企性心衰竭； • 在一些具體實施例中，該個體需要改變選自下列組群之 心血管功能： (a) 心臟肥大降低； (b) 心臟射出分率增加； (c) 心室腔體積降低；及 (d) 心肌細胞凋亡降低。 在/ > /、體属施例中，該個體為遺傳學上易患有選自下 列組群之心血官失調症的小鼠或大鼠： (a)心臟輪出量減少；及 122352.doc -22- 200800009 (b)靜脈壓增加； 古在一t具體實施例中，該方法係用於識別調節劑是否且 有預防或治療選自下列組群之心血管失調症之療效：、 (a) 心臟輸出量降低；及 (b) 靜脈壓增加； 該方法包含下列步驟： (a*)將調節劑投予或不投予遺傳 予上易患有心血營失响 症的小鼠或大鼠；及 々兩 (b*)測定該調節劑的投予是否 宁疋企具有選自下列組群的致 果· (0 心臟肥大降低； (Π)心臟射出分率增加； (iii) 心室腔體積降低；及 (iv) 心肌細胞凋亡降低； 其中若能測定出上述效果即砉+兮兮^ ^ ^ 禾即表不該该调節劑具有所述的療 在第四個發明態樣中’本發明特徵為一種對有需要之個 體改變其心血管功能的方法，該方法包含將治療有效量之 如第二個發明態樣之調節劑與RUP4l gpcr接觸，該受體 包含選自下列組群中的多肽： Ο)序列識別號：2的多肽； (b) 序列識別號：3的多肽；及 (c) 序列識別號：5的多肽； 或其對偶基因變異體。 122352.doc -23 - 200800009 在一些具體實施例中，該心血管功能的改變係選自下列 組群. (a) 心臟肥大降低； (b) 心臟射出分率增加； (c) 心室腔體積降低；及 (d) 心肌細胞凋亡降低。 在一些具體實施例中，該調節劑係選自促效劑、部份促 效劑、反向促效劑及拮抗劑。 在一些具體實施例中，該調節劑對於序列識別號：2或 序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選 自1 μΜ至100 μΜ之範圍中的值。在一些具體實施例中， 該調節劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之濃度值：1 μΜ、10 μΜ、20 μΜ、30 μΜ、40 μΜ、50 μΜ、60 μΜ、70 μΜ、 80 μΜ、90 μΜ及100 μΜ。在一些具體實施例中，該調節 劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR 的EC5 0或IC5 0小於選自1 μΜ至10 μΜ之範圍中的值。在一 些具體實施例中，該調節劑對序列識別號：2或序列識別 號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之 濃度值：1 μΜ、2 μΜ、3 μΜ、4 μΜ、5 μΜ、6 μΜ、7 μΜ、8 μΜ、9 μΜ及 1〇 μΜ ο 在一些具體實施例中，該調節劑可降低細胞内cAMP濃 度。 在一些具體實施例中，該調節劑具有選擇性。 122352.doc -24- 200800009 在-些具體實施例令，該調節劑可為生物口服利用。 在一些具體實施例中，該調節劑為促效劑。 - 在一些具體實施例中，該接觸係將該調節劑以口服投 . 進行。 在-些具體實施财，該個體為哺乳動物。在—些具體 實施例中，該哺乳動物為馬、牛、羊、豬、猶、狗、兔 子、小鼠、大鼠、非人類靈長動物或人。較佳者為小鼠、、 g 大鼠或人。最佳者為人。 在第五個發明態樣t，本發明特徵為—種對有需要之個 體預防或治療其心企管失調症的方法，該方法包含將治療 有效里之如第二發明態樣之調節劑與Rup41 接觸％，、 該受體包含選自下列組群的多肽： (a) EQ ID NO:2的多肽； (b) 序列識別號：3的多肽；及 (c) 序列識別號：5的多肽； B 或其對偶基因變異體。 在一些具體實施例中，該心血管失調症係選自下列組 群： 、 (a) 心臟輸出降低；及 (b) 靜脈壓增加； 在一些具體實施例中，該調節劑係選自促效劑、部份促 效劑、反向促效劑及拮抗劑。 在一些具體實施例中’該調節劑對於序列識別號：2或 序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的此50或1(：50小於選 122352.doc -25- 200800009 自1 μΜ至100 μΜ之範圍中的值。在一些具體實施例中’ 該調節劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之濃度值：1 μΜ、10 μΜ、20 μΜ、30 μΜ、40 μΜ、50 μΜ、60 μΜ、70 μΜ、 80 μΜ、90 μΜ及100 μΜ。在一些具體實施例中，該調節 劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR 的EC50或IC50小於選自1 μΜ至10 μΜ之範圍中的值。在一 些具體實施例中，該調節劑對序列識別號：2或序列識別 號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之 濃度值:1 μΜ、2 μΜ、3 μΜ、4 μΜ、5 μΜ、ό μΜ、7 μΜ、8 μΜ、9 μΜ及 10 μΜ。 在一些具體實施例中 该調節劑可降低細胞内cAMP濃
在一些具體實施例中，該 進行。 口服利用。 口服投藥
在一些具體實施^丄 物。在一些具體 豬、1结、狗、兔 較佳者為小鼠、 實施例中’該哺乳動物為馬 子、小鼠、大鼠、非人類靈4 大鼠或人。最佳者為人。
在第六個發明態樣中， 體預防或治療缺血性心臟病的 122352.doc -26- 200800009 效量之如第二發明態樣之調節劑與RUP41 GPCR接觸，續 受體包含選自下列組群的多肽： • (a)序列識別號：2的多肽； . (b)序列識別號：3的多肽；及 (c)序列識別號：5的多肽； 或其對偶基因變異體。 在一些具體實施例中’該缺血性心臟病係選自下列組 群： (a) 心肌梗基， (b) 心肌梗塞後之重塑；及 (C)充jk性心衰竭； 在一些具體實施例中，該調節劑係選自促效劑、部份促 效劑、反向促效劑及拮抗劑。 在一些具體實施例中，該調節劑對於序列識別號：2或 序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選 Φ 自1 μΜ至100 μΜ之範圍中的值。在一些具體實施例中， 該調節劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC5 0或IC50小於選自下列之濃度值：1 μΜ、10 μΜ、20 μΜ、30 μΜ、40 μΜ、50 μΜ、60 μΜ、70 μΜ、 80 μΜ、90 μΜ及100 μΜ。在一些具體實施例中，該調節 劑對序列識別號·· 2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR 的EC50或IC50小於選自1 μΜ至10 μΜ之範圍中的值。在一 些具體實施例中，該調節劑對序列識別號：2或序列識別 號：3之人類RUP41 GPCR的EC5 0或IC50小於選自下列之 122352.doc -27- 200800009 邮、6 μΜ、7 濃度值：1 μΜ、2 μΜ、3 μΜ、4 μΜ μΜ、8 μΜ、9 μΜ及 10 μΜ 〇 在一些具體實施例中 度0 該調節劑可降低細 胞内cAMP濃 在-些具體實施例中’該調節劑具有選擇性。 在一些具體實施例中，該調節劑可為生物口服利用。 在二具體貝施例中，该調節劑為促效劑。
在-些具體實施例中’該接觸係將該調節劑以口服投藥 進行。 在-些具體實施例中，該個體為哺乳動物。在—些且體 實施例中，該哺乳動物為馬、牛、羊、豬m 子、小乳、大鼠、非人類靈長動物或人。較佳者為小鼠、 大乳或人。最佳者為人。 在第七個發明態樣中，本發明特徵為一種製備組合物的 方法，其包含識別出RUP41 GPCR調節劑，接著混合載體 及該調節劑，其中該調節劑係以如第一個發明態樣的方法 識別。， 在一些具體實施例中，該調節劑選自促效劑、部份促效 劑、反向促效劑及拮抗劑。 在一些具體實施例中，該調節劑對於序列識別號：2或 序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選 自1 μΜ至1〇〇 μΜ之範圍中的值。在一些具體實施例中， 該調節劑對序列識別號·· 2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之濃度值：1 μΜ、10 122352.doc -28- 200800009 μΜ、20 μΜ、30 μΜ、40 μΜ、50 μΜ、60 μΜ、70 μΜ、 80 μΜ、90 μΜ及1〇〇 μΜ。在一些具體實施例中，該調節 劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR 的ECSO或IC50小於選自1 μΜ至10 μΜ之範圍中的值。在一 些具體實施例中，該調節劑對序列識別號：2或序列識別 號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之 、/辰度值：1 μΜ、2 μΜ、3 μΜ、4 μΜ、5 μΜ、ό μΜ、7 μΜ、8 μΜ、9 μΜ及 10 μΜ。 在一些具體實施例中，該調節劑可降低細胞内cAMp濃 度 在一些具體實施例中 在一些具體實施例中 在一些具體實施例中 在一些具體實施例中 該調節劑具有選擇性。 该调節劑可為生物口服利用。 該調節劑為促效劑。 §亥可由如第一個發明態樣之方法 識別的調節劑是以第一個發明態樣的方法識別。 在一些具體實施例中，該胡含々如认_ 、 肩即Μ為弟二個發明態樣之調 節劑。 在第八個發明態樣中，本發 a月特欲為一種藥學及生理學 可接受的組合物，其包含第二 — U ^明恶樣之調節劑、或基 本上由弟二個發明態樣之調節 & 、、且成、或是由第二個發明 悲樣之調節劑組成，。 在一些具體實施例中，該調 、 d係選自促效劑、部份促 效劑、反向促效劑及拮抗劑。 I切促 號：2或 在一些具體實施例中’該調節_於序列識別 122352.doc -29- 200800009
序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選 自1 μΜ至100 μΜ之範圍中的值。在一些具體實施例中， 該調節劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之濃度值：1 μΜ、10 μΜ、2〇 μΜ、30 μΜ、40 μΜ、50 μΜ、60 μΜ、70 μΜ、 80 μΜ、90 μΜ及100 μΜ。在一些具體實施例中，該調節 劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR 的EC50或IC50小於選自1 μΜ至10 μΜ之範圍中的值。在一 些具體實施例中，該調節劑對序列識別號·· 2或序列識別 號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之 濃度值：1 μΜ、2 μΜ、3 μΜ、4 μΜ、5 μΜ、6 μΜ、7 μΜ、8 μΜ、9 μΜ及 10 μΜ。 在一些具體實施例中，該調節劑可降低細胞内cAMp濃 度。 在些具體實施例中，該調節劑具有選擇性。 在-些具體實施例中，該調節劑可為生物口服利用。 在一些具體實施例中，該調節劑為促效劑。 在弟九個發明態樣中’本發明特徵為一種改變心血管功 、方法八3對有需要该改變的個體提供或投予如第 八個發明態樣之藥學或生理學可接受組合物，該心血管功 能的改變係選自以下組群： 〇)心臟肥大降低； (b)心臟射出分率增加； (0心室腔體積降低；及 122352.doc -30- 200800009 (d)心肌細胞凋亡降低。 在一些具體實施财’該個體為哺乳動物。在—些具體 實施例中，該哺乳動物為mm、兔 子、小鼠、大鼠、非人類$長動物或人。較佳者為小鼠、 大鼠或人。最佳者為人。 在第十個發明態樣中，本發明特徵為-種治療心血管失 職的方m含對有需要該治療之個體提供或投予如
=八個么明怨樣之藥學或生理學可接受的組合物，該心血 管失調症係選自下列組群： (a) 心臟輸出降低；及 (b) 靜脈壓增加； 在一些，具體實施例中，該個體為哺乳動物。在-些具體 實施例中，該哺乳動物“mm 子、小氣、大鼠、非人類靈長動物或人。較佳者為小鼠、 大鼠或人。最佳者為人。
在第十一個發明錤揭由，丄W '樣中本發明特徵為一種治療缺血性 臟病的方去其包含對於需要該治療的個體提供或投予 如第八個發明態樣之藥學或生理學可接受的組合物，該缺 血性心臟係選自下列組群： (a) 心肌梗塞； (b) 心肌梗塞後之重塑；及 (0充血性心衰竭； 。在一些具體 、貓、狗、兔 在-些具體實施例中，該個體為哺乳動物 實施例中，該哺乳動物為馬、牛、羊、豬 122352.doc -31- 200800009 子、小鼠、大鼠、非人類靈長動物或人。較佳者為小鼠、 大鼠或人。最佳者為人。 在第十二個發明態樣中，本發明特徵為一種使用由第二 個發明態樣之調節劑以製備治療個體心企管失調症之藥劑 的方法。 在一些具體實施例中，該調節劑係選自促效劑、部份促 效劑、反向促效劑及拮抗劑。 在一些具體實施例中，該調節劑對於序列識別號：2或 序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選 自1 μΜ至100 μΜ之範圍中的值。在一些具體實施例中， 該調節劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類rxjP4 1 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之濃度值：1 μΜ、1〇 μΜ、20 μΜ、30 μΜ、40 μΜ、50 μΜ、60 μΜ、70 μΜ、 80 μΜ、90 μΜ及100 μΜ。在一些具體實施例中，該調節 劑對序列識別號· 2或序列識別號：3之人類ruP41 GPCR 的EC50或IC50小於選自1 μΜ至1〇 μΜ之範圍中的值。在一 些具體實施例中，該調節劑對序列識別號·· 2或序列識別 號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之 濃度值.1 、2 μΜ、3 μΜ、4 μΜ、5 μΜ、ό μΜ、7 μΜ、8 μΜ、9 μΜ及 10 μΜ。 在一些具體實施例中，該調節劑可降低細胞内cAMp濃 度。 在一些具體實施例中，該調節劑具有選擇性。 在一些具體實施例中，該調節劑可為生物口服利用。 122352.doc -32- 200800009 在一些具體實施例中，該調節劑為促效劑。 在一些具體實施例中，該心血管失調症係選自下列組 群： 0)心臟輸出降低；及 (b)靜脈壓增加。 在一些具體實施例中，該個體為哺乳動物。在一些具體 實施例中，該哺乳動物為馬、牛、羊、豬、貓、狗、兔 子、小鼠、大鼠、非人類靈長動物或人。較佳者為小鼠、 大鼠或人。最佳者為人。 在第十三個發明態樣中，本發明特徵為一種使用由第二 個發明態樣之調節劑以製備治療個體缺血性心臟病之藥劑 的方法。 在一些具體實施例中，該調節劑係選自促效劑、部份促 效劑、反向促效劑及拮抗劑。 在一些具體實施例中’該調節劑對於序列識別號：2或 序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選 自1 μΜ至100 μΜ之範圍中的值。在一些具體實施例中， 該調節劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之濃度值·· 1 μ]νΙ、10 μΜ、20 μΜ、30 μΜ、40 μΜ、50 μΜ、60 μΜ ' 70 μΜ、 80 μΜ、90 μΜ及100 μΜ。在一些具體實施例中，該調節 劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP4 1 GPCR 的EC50或IC50小於選自1 μΜ至10 μΜ之範圍中的值。在一 些具體實施例中，該調節劑對序列識別號：2或序列識別 122352.doc -33- 200800009 號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之 濃度值：1 μΜ、2 μΜ、3 μΜ、4 μΜ、5 μΜ、ό μΜ、7 μΜ、8 μΜ、9 μΜ及 10 μΜ。 在一些具體實施例中，該調節劑可降低細胞内cAMP濃 度。 在一些具體實施例中，該調節劑具有選擇性。 在一些具體實施例中，該調節劑可為生物口服利用。
在一些具體實施例中’該調節劑為促效劑。 在-些具體實施例中，該缺血性心臟病係選自下列組 群： (a) 心肌梗塞； (b) 心肌梗塞後之重塑；及 (c) 充血性心衰竭。 實施例中，該哺乳動物為馬、牛、羊、豬、猶、狗兔 子、小鼠、域、非人類靈長動物或人。較佳者為小鼠、、 大鼠或人。最佳者為人。 在第十四個發明態樣中，本發明特徵 除小鼠的方法，其中該基因_小=剔 之心血管失調症： 下列組群 (a) 心臟輸出降低；及 (b) 靜脈壓增加； 多肽之基因的步 該方法包含剔除編碼序列識別號 驟0 122352.doc -34- 200800009 在-些具體實施例中，該剔除具心肌細胞選擇性。 在第十五個發明態樣中，本發明特徵為一種製造基因剔 ^ 除小鼠的方法，其中該基因剔除小鼠易患有選自下列組群 , 之缺血性心臟病： (a) 心肌梗塞； (b) 心肌梗塞後之重塑·，及 (c) 充血性心衰竭； 該方法包含剔除編碼序列識別號：5多肽之基因的步 驟。 在一些具體實施例中，該剔除具心肌細胞選擇性。 在第十六個發明態樣中，本發明特徵為一種如第十四個 發明態樣或第十五個發明態樣所述之基因剔除小鼠。 在第十七個發明態樣中，本發明特徵為一種使用第十六 個發明態樣之基因剔除小鼠以識別候選化合物是否具有預 防或治療心血管失調症之療效的方法，該心血管失調症係 ❿ 選自下列組群： (β心臟輸出降低；及 (b)靜脈壓增加； 該方法包含以下步驟： O’）將化合物投予或不投予小鼠；及 (b ) ’則疋该调節劑的投予是否具有選自下列組群之岐 果： ’ (0 心臟肥大降低； (ii)心臟射出分率增加； 122352.doc -35- 200800009 (iii) 心室腔體積降低；及 (iv) 心肌細胞凋亡降低； 八中右忐測疋出上述效果即表示該該調節劑具有所述的療 效。 、 在第十八個發明態樣中，纟發明特徵為一種使用第十六 個發明態樣之基因剔除小鼠以識別候選化合物是否具有預 防或治療缺血性心臟病療效的方法，該缺錄心臟病擇自 以下組群： (a) 心肌梗塞； (b) 心肌梗塞後之重塑；及 (c) 充血性心衰竭； 該方法包含以下步驟： (a’）將化合物投予或不投予小氣；及 (b。測定該調節劑的投予是否具有選自下列組群之效 果： (i) 心臟肥大降低； (ii) 心臟射出分率增加； (iii) 心室腔體積降低；及 (iv) 心肌細胞凋亡降低； 八中若此/貝]疋出上述效果即表示該該調節劑具有所述的療 效。 在第十九個發明態樣中，本發明特徵為一種製造基因剔 除大鼠的方法’其中該基因剔除大鼠易患有選自以下組群 之心灰管失調症： 122352.d〇, •*36- 200800009 (a) 心臟輸出降低；及 (b) 靜脈壓增加； 為方法包含剔除編碼序列識別號：6多肽之基因的步驟。 在一些具體實施例中，該剔除具心肌細胞選擇性。 在第二十個發明態樣中，本發明特徵為一種製造基因剔 除大鼠的方法’其中該基因剔除大鼠易患有選自下列組群 之缺血性心臟病：
(a)心肌梗塞； (b) 心肌梗塞後之重塑；及 (c) 充血性心衰竭； 該方法包含剔除編碼序列識別號：6多肽之基因的步 在-些具體實施例中，該剔除具心肌細胞選擇性。 在第二十-個發明態樣中，本發明特徵為—種如第十九 個發明態樣或第二十個發 ^ τ 1U七明悲樣所述的基因剔除大鼠。 在第一十—個發明態樣中，本發明特徵為—種使用第二 十一個發明態樣之基因剔除女_ … 易】除大鼠以識別候選化合物是否具 有預防或治療心血管失調症瘆 庇縻效的方法，該心血管失調症 係選自下列組群： (a) 心臟輸出降低；及 (b) 靜脈壓增加； 該方法包含下列步驟·· (a*)將化合物投予或不投予大鼠；且 下列組群之效 (b’）測定該調節劑的投予是否具有選 果： /、込 122352.doc 37 200800009 (i) 心臟肥大降低； (ii) 心臟射出分率增加； (iii) 心室腔體積降低；及 (iv)心肌細胞瑪亡降低· 其中若能測定出上述效果即表示該該調節 效0 在第二十 τ狀1默钩一禋使用第一
劑具有所述的療 十一個發明態樣之基因剔降 — 口則除大鼠以識別候選化合物是 有預防或治療缺血性心臟病療效 /、 两縻政的方法，該缺血性心 係選自下列組群： (a) 心肌梗塞； (b) 心肌梗塞後之重塑；及 (c) 充血性心衰竭； 該方法包含下列步驟： (a’）將化合物投予或不投予大鼠；且
(b1)測定該調節劑的投予是否 果： 具有選自下列組群之效 122352.doc 不該該調節劑具有所述的療 在第二十四個發明態樣中 本發明特徵為一種經分離大 '38- 1 心臟肥大降低； (ii) 心臟射出分率增加； (iii) 心室腔體積降低；及 (iv)心肌細胞凋亡降低 其中若能測定出上述效果即表 效0 200800009 鼠RUP41多肽，其係選自下列組群： (a) 包含序列識別號·· 6中至少連續75個核苷酸聚核聲 酸； (b) 包含序列識別號：6中至少連續150個核苷酸的聚核 苷酸； (0包含序列識別號：6中至少連續250個核苷酸的聚核 苷酸； (d) 包含序列識別號：6中至少連續350個核苷酸的聚核 苷酸；或 (e) 包含序列識別號：6中至少連續500個核苷酸的聚核 苷酸。 在一些具體實施例中，該連續序列不包含序列識別號： 6之核苷酸514。 在一些具體實施例中，該經分離大鼠RUP41多肽包含編 碼與序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR 同源之内生大鼠RUP41 GPCR的核苷酸序列、或基本上由 編碼與序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR^源之内生大鼠RUP41 GPCR的核苷酸序列組成，或 由編碼與序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR同源之内生大鼠ruP41 GPCR的核苷酸序歹4組成。 與上述（a)至（e)中任何一個RUP41聚核苷酸具有至少 60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%或99%序列同一性之多肽變異體亦 屬於本發明之範圍中。在一些具體實施例中，多肽序列同 122352.doc -39- 200800009 源性係使用習知的「基本局部序列比對搜索工具」 (「BLAST」）評估（請翏例如 Karlin及 Altschul，Proc Matl Acad Sci USA (1990) 87:2264-8 ; Altschul等人，J Mol Biol (1990) 215:403-410 ; Altschul等人，Nature Genetics (1993) 3:266-272 ;及 Altschul 等人，Nucleic Acids Res (1997) 25:3389-3402 ;該等文獻之揭示皆以參考其整體併入本 文）。該多肽變異體可包含一或多個胺基酸缺失、插入及 取代。
在進一步的具體實施例中，本發明特徵為一種該經分離 多肽之互補序列。 在第二十五個發明態樣中，本發明特徵為一種重組載 體’該載體包含第二十四個發明態樣之經分離多肽。在一 些具體實施例中，該重組載體為一種表現載體。又一些具 體實施例中，該表現載體為真核表現載體。適合的表現載 體對發明所屬技術領域中具有通常知識者為顯而易知者。 在一些具體實施例中，該重組載體係使用於暫時或穩定 轉染。在-些具體實施例中，該重組載體係使用於感染方 法0 在一些具體實施例中’該重組載體係使用於不活化 RUP41基因之方法的目標載體。 在一些具體實施例中，該重組載體係經分離。 在第二十六個發明態樣中，本發明特徵為—種包含第二 十五個發明態樣之重組載體的原核及真核宿主細胞。在一 些具體實施例中，該宿主細胞為原核細胞，且使用該重組 122352.doc 200800009 載體穩定轉形（transform)。在一些具體實施例中，該宿主 細胞為真核細胞，且使用該重組載體暫時轉形。在其他進 一步具體實施例中，宿主細胞為真核細胞，且使用該重組 載體穩定轉形。 在一些具體實施例中，該宿主細胞為真核細胞，較佳者 為哺乳動物細胞，更佳者係選自下列組群：293、293T、 CH0及C0S-7細胞。在一些具體實施例中，該宿主細胞為 真核細胞’更佳者為黑色素細胞。其他適合的宿主細胞對 發明所屬技術領域中具有通常知識者為顯而易知者。 在一些具體實施例中’該宿主細胞為哺乳動物真核幹細 胞或真核的類幹細胞，且該重組載體係使用於不活化 RUP41基因的方法。在一些具體實施例中，該宿主細胞為 哺乳動物真核體細胞，且該重組載體係使用於不活化 RUP41基因的方法。 一個進一步具體實施例包含一種為第二十四個發明態樣 之多肽的原核或真核宿主細胞重組體。 在一些具體實施例中，該宿主細胞係經分離。 在第二十七個發明態樣中，本發明特徵為一種GpcR融 合蛋白’其包έ本貝性活化之G蛋白-偶聯受體及〇蛋白， 該受體包含選自下列組群的RUP40多肽： (a) 序列識別號：2的多肽； (b) 序列識別號：3的多肽；及 (c) 序列識別號：5的多肽； 或其片段或變異體。 122352.doc -41- 200800009 在-些具體實施例中，該受體包含選自序列識別號：2 胺基酸2至433或序列識別號：3胺基酸2至433的該多肽片 ， 段。 - 在RUP41 GPCR對偶基因的變異體應屬於本發明之範圍 中〇 序列識別號：2或序列識別號·· 3的人類RUP41多肽之鳴 乳類異種同源體亦屬於本發明之範圍中。在一些具體實施
例中，該哺乳類異種同源體包含小鼠RUP41、太鼠RUP41 W 及非人類之靈長類動物RUP41。 與序列識別號：2、序列識別號：3或序列識別號：5之 RUP41 多肽具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%或99%序列同一性之多肽變異體亦 屬於本發明之範圍中。在一些特定實施例中，多肽序列同 源性係使用習知的「基本局部序列比對搜索工具」 (「BLAST」）評估（請參例如 Karlin及 Altschul，Proc Matl 參 Acad Sci USA (1990) 87:2264-8 ; Altschul等人，J Mol Biol (1990) 215:403-410 ; Altschul等人，Nature Genetics (1993) 3:266-272 ；及 Altschul 等人，Nucleic Acids Res (1997) 25:33 89-3402 ;該等文獻之揭示皆以參考其整體併入本 文）。該多肽變異體可包含一或多個胺基酸缺失、插入及 取代。序列識別號：2、序列識別號：3或序列識別號：5 之RUP41多肽的本質性活化型之多肽變異體亦屬於本發明 之範圍中。在一些具體實施例中，該RUP41多肽的本質性 活化型為序列識別號·· 2或序列識別號：3的多肽，其中在 122352.doc -42- 200800009 序列識別號：2或序列識別號：3胺基酸位置312的苯丙胺 酸係以離胺酸取代。 " 在弟二十八個發明態樣中，本發明特徵為一種識別候選 - 化合物是否為RUP 41 GpCR配體的方法，該受體包含選自 下列組群的多肽： (a) 序列識別號：2的多肽； (b) 序列識別號：3的多肽；及 (c) 序列識別號：5的多肽； • 或其片段或變異體，該方法包含下列步驟： (af)在候選化合物存在或不存的情況下將該受體與視需 要標記的該受體之已知配體接觸； (b*)檢測該已知配體與受體之複合物；及 (cj測定该複合物的生成於候選化合物存在時是否較候 選化合物不存在時少； 其中該測定即判定該識別候選化合物為該受體的配體。 _ 在一些具體實施例中，該受體包含選自序列識別號：2 胺基酸2至433及序列識別號：3胺基酸2至433的多肽片 段。 RUP41 GPCR對偶基因變異體應屬於本發明之範圍中。 序列識別號：2或序列識別號：3的人類RUP41多肽之哺 乳類異種同源體亦屬於本發明範圍中。在一些具體實施例 中，該哺乳類異體同源體包含小鼠RUP41、大鼠RUP41及 非人類靈長類動物RUP41。 與序列識別號· 2、序列識別號· 3或序列識別號：5之 122352.doc -43 - 200800009 RUP41 多肽具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%或99%序列同一性之多肽變異體亦 - 屬於本發明之範圍中。在一些特定實施例中，多肽序列同 源性係使用習知的「基本局部序列比對搜索工具」 (「BLAST」）評估（請參例如 Karlin及 Altschul，Proc Matl Acad Sci USA (1990) 87:2264-8 ; Altschul等人，J Mol Biol (1990) 215:403-410 ; Altschul等人，Nature Genetics (1993) 3:266-272 ;及 Altschul 等人，Nucleic Acids Res (1997) 馨 25:3389-3402 ;該等文獻之揭示皆以參考其整體併入本 文）。該多肽變異體可包含一或多個胺基酸缺失、插入及 取代。序列識別號·· 2、序列識別號·· 3或序列識別號：5 之RUP41多肽的本質性活化型之多肽變異體亦屬於本發明 之範圍中。在一些具體實施例中，該RUP41多肽的本質性 活化型為序列識別號·· 2或序列識別號：3的多肽，其中在 序列識別號：2或序列識別號：3胺基酸位置3 12的苯丙胺 φ 酸係以離胺酸取代。 在一些具體實施例中，該受體之已知配體為第二個發明 態樣之調節劑。 在一些具體實施例中，該受體之已知配體包含選自下列 組群的標記： (a) 放射性同位素； (b) 酵素；及 (c) 螢光圑。 在一些較佳具體實施例中，該標記為放射性同俊素。在 122352.doc -44- 200800009 一些具體實施例中，該放射性同位素VH。 在第二十九個發明態樣中， 爭方沐甘A人1 乃特被為一種放射線照 &方法，其包含提供或投 ^ ^ 而要该放射線照影之個體放射 !·生枯3己的化合物，其中該化 β 1 初你k自弟二個發明態樣之 5 周即d及弟二十八個發明態樣的配體。 在一些具體實施例中，兮徊鱗A # > D亥個體為哺乳動物。在-些具體 貝轭例中，該哺乳動物為馬、 艺 1 干平、豬、貓、狗、兔
子、小鼠、大鼠、非人類霤具私‘ 長動物或人。較佳者為小鼠、 大鼠或人。最佳者為人。 在第三十個發明態樣中，本發明特徵為一種帶有人類 RUP41 GPCR基因的非人類哺乳類基因轉殖動物。在一些 具體實施财，該非人類哺㈣物為 在一些具體實施例中，該人類卿41gpcr^=自下 列組群的多肽·· (a) 序列識別號：2的多肽； (b) 序列識別號：2的多肽，其中在序列識別號：2胺基 酸位置3 12上的苯丙胺酸被離胺酸取代； (c) 序列識別號：3的多肽；或 (d) 序列識別唬· 3的多肽，其中在序列識別號：3胺基 酸位置3 12上的苯丙胺酸被離胺酸取代。 RUP41 GPCR的對偶基因變異體亦屬於本發明之範圍 中〇 在一些具體實施例中，該人類RXJP41基因轉殖表現具有 心肌細胞選擇性。 122352.doc -45 - 200800009 在第三十一個發明態樣中，本發明為使用第三十個發明 態樣的非人類哺乳類基因轉殖動物以識別本發明的化合物 是否具有心臟保護作用療效。 在一些具體實施例中，該非人類哺乳動物為小鼠、大鼠 或豬。
該化合物之心臟保護作用療效可藉由將該化合物投予該 非人類哺乳類基因轉殖動物，並測定將該化合物投予如實 例18之大鼠活體内模式或其類似的小鼠或豬的活體内模式 中，與單獨投予媒劑（vehicle)之該非人類哺乳類基因轉殖 動物相較，是否會導致IS/AAR降低而評估。 在一些具體實施例中，該化合物之心臟保護作用療效可 藉由將該化合物投予該非人類哺乳類基因轉殖動物，並測 定該投予是否會導致選自以下組群之效果： Ο)心臟肥大降低； (b) 心臟射出分率增加； (c) 心室腔體積降低；及 (d) 心肌細胞〉周亡降低； 其：若能測定出上述效果即表示該該化合物具有所述的療 二具體實施例中，該本發明化合物 樣之調節劑。 個發# 在—些具體實施例中，該調節劑係選 效劑、θ A / 口 效月j、4伤 双^ 反向促效劑及拮抗劑。 在些具體實施例中，該調節劑對> & 4对於序列識別號：： 122352.doc -46- 200800009 序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選 自1 μΜ至1〇〇 μΜ之範圍中的值。在一些具體實施例中’ 該調節劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC5 0或IC50小於選自下列之濃度值：1 μΜ、10 μΜ、20 μΜ、30 μΜ、40 μΜ、50 μΜ、60 μΜ、70 μΜ、 80 μΜ、90 μΜ及100 μΜ。在一些具體實施例中，該調節 劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR 的EC50或IC50小於選自1 μΜ至10 μΜ之範圍中的值。在一 些具體實施例中，該調節劑對序列識別號：2或序列識別 號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之 濃度值：1 μΜ、2 μΜ、3 μΜ、4 μΜ、5 μΜ、6 μΜ、7 μΜ、8 μΜ、9 μΜ及 10 μΜ。 在一些具體實施例中，該調節劑可降低細胞内cAMp濃 度。 在一些具體實施例中，該調節劑具有選擇性。 在一些具體實施例中，該調節劑可為生物口服利用。 在一些具體實施例中，該調節劑為促效劑。 在一些具體實施例中，該本發明化合物為第三十個發明 態樣的配體。 在第三十二個發明態樣中，本發明特徵為一種製造 RUPAl GPCR調節劑的方法，其包含下列步驟· (a) 以請求項1或2的方法識別出該調節劑；及 (b) 合成由步驟（a)所識別出的調節劑。 在一些具體實施例中，該調節劑传溪自 J 自促欢劑、部份促 122352.doc -47- 200800009 效劑、反向促效劑及拮抗劑。 在一些具體實施例中，該調節劑對於序列識別號：2或 序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選 自1 μΜ至1〇〇 μΜ之範圍中的值。在一些具體實施例中， 該調節劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之濃度值：1 μΜ、10 μΜ、20 μΜ、30 μΜ、40 μΜ、50 μΜ、60 μΜ、70 μΜ、 80 μΜ、90 μΜ及100 μΜ。在一些具體實施例中，該調節 劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類rxjP4 1 GPCR 的EC50或IC50小於選自1 μΜ至10 μΜ之範圍中的值。在一 些具體實施例中，該調節劑對序列識別號·· 2或序列識別 號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之 濃度值：1 μΜ、2 μΜ、3 μΜ、4 μΜ、5 μΜ、ό μΜ、7 μΜ、8 μΜ、9 μΜ及 10 μΜ ο 在一些具體實施例中，該調節劑可降低細胞内cAMp濃 度。 在一些具體實施例中，該調節劑具有選擇性。 在一些具體實施例中，該調節劑可為生物口服利用。 在一些具體實施例中，該調節劑為促效劑。 在第三十三個發明態樣中，本發明特徵為一種如第二個 發明態樣之調節劑，其係用於改變心血管功能。 在一些具體實施例中，該心血管功能之改變係選自： (a) 心臟肥大降低； * (b) 心臟射出分率增加； 122352.doc -48- 200800009 (C)心室腔體積降低；及 (d)心肌細胞凋亡降低。 在一些具體實施例中，該調節劑係選自促效劑、部份促 效劑、反向促效劑及拮抗劑。 在一些具體實施例中，該調節劑對於序列識別號：2或 序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選 自1 μΜ至100 μΜ之範圍中的值。在一些具體實施例中， 該調節劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之濃度值：1 μΜ、10 μΜ、20 μΜ、30 μΜ、40 μΜ、50 μΜ、60 μΜ、70 μΜ、 80 μΜ、90 μΜ及100 μΜ。在一些具體實施例中，該調節 劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR 的EC50或IC50小於選自1 μΜ至10 μΜ之範圍中的值。在一 些具體實施例中，該調節劑對序列識別號：2或序列識別 號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之 濃度值：1 μΜ、2 μΜ、3 μΜ、4 μΜ、5 μΜ、6 μΜ、7 μΜ、8 μΜ、9 μΜ及 10 μΜ。 在一些具體實施例中，該調節劑可降低細胞内cAMp濃 度。 在一些具體實施例中，該調節劑具有選擇性。 在一些具體實施例中，該調節劑可為生物口服利用。 在一些具體實施例中，該調節劑為促效劑。 在第三十四個發明態樣，本發明特徵為一種如第二個發 明態樣之調節劑，其係用於預防或治療心血管失調症。 122352.doc -49- 200800009 在一些具體實施例中，該心血管失調症係選自： (a) 心臟輸出降低；及 (b) 靜脈壓增加。 在一些具體實施例中，該調節劑係選自促效劑、部份促 效劑、反向促效劑及抬抗劑。 在一些具體實施例中，該調節劑對於序列識別號·· 2或 序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選 自1 μΜ至100 μΜ之範圍中的值。在一些具體實施例中， 該調節劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之濃度值：1 μΜ、1〇 μΜ、20 μΜ、30 μΜ、40 μΜ、50 μΜ、60 μΜ、70 μΜ、 80 μΜ、90 μΜ及100 μΜ。在一些具體實施例中，該調節 劑對序列識別號：2或序列識別號·· 3之人類RUP41 GPCR 的EC50或IC50小於選自1 μΜ至10 μΜ之範圍中的值。在一 些具體實施例中，該調節劑對序列識別號：2或序列識別 號·· 3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之 ?辰度值.1 μΜ、2 μΜ、3 μΜ、4 μΜ、5 μΜ、6 μΜ、7 μΜ、8 μΜ、9 μΜ及 10 μΜ 〇 在一些具體實施例中，該調節劑可降低細胞内〇八]^1)濃 在一些具體實施例中，該調節劑具有選擇性。 在一些具體實施例中，該調節劑可為生物口服利用。 在一些具體實施例中，該調節劑為促效劑。 在弟二十五個發明恶樣’本發明牲外么 个七明特被為一種如第二個發 122352.doc -50- 200800009 明態樣之調節劑’其係用於預防或治療缺血性心臟病。 在一些具體實施例中，該缺血性心臟病係選自： (a) 心肌梗塞； (b) 心肌梗塞後之重塑；及 (c) 充血性心衰竭。 在一些具體實施例中，該調節劑係選自促效劑、部份促 效劑、反向促效劑及拮抗劑。 在一些具體實施例中，該調節劑對於序列識別號：2或 序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選 自1 μΜ至100 μΜ之範圍中的值。在一些具體實施例中， 該調節劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之濃度值：1 μΜ、1〇 μΜ、20 μΜ、30 μΜ、40 μΜ、50 μΜ、60 μΜ、70 μΜ、 80 μΜ、90 μΜ及100 μΜ。在一些具體實施例中，該調節 劑對序列識別號：2或序列識別號：3之人類RUP41 GPCR 的EC50或IC50小於選自1 μΜ至10 μΜ之範圍中的值。在一 些具體實施例中，該調節劑對序列識別號：2或序列識別 號：3之人類RUP41 GPCR的EC50或IC50小於選自下列之 濃度值·· 1 μΜ、2 μΜ、3 μΜ、4 μΜ、5 μΜ、6 μΜ、7 μΜ、8 μΜ、9 μΜ及 1〇 μΜ ο 在一些具體實施例中，該調節劑可降低細胞内cAMp濃 度。 在一些具體實施例中，該調節劑具有選擇性。 在一些具體實施例中，該調節劑可為生物口服利用。 122352.doc -51 - 200800009 在一些具體實施例中，該調節劑為促效劑。 申請人保留排除本發明中任何具體實施例中的一種或多 種候選化合物之權利。申請人亦保留排除本發明任何具體 實施例中的任何聚核苷酸或多肽之權利。申請人另外保留 排除本發明任何具體實施例中的任何缺血性心臟病或任何 心血管失調症或任何心肌細胞调亡之權利。 【實施方式】 科學文獻對於受體及對受體有不同影響的配體已發展許 多詞彙。為求明卻與一致性，下列定義將使用於此整份專 利文件中。這些定義若與這些名詞其他定義抵觸，將以下 列定義為準： 促效劑（AGONISTS)意指當其與受體結合時可活化細胞 内反應之物質（如配體、候選化合物）。在一些具體實施例 中，促效劑為先前並不知其與受體結合時會活化細胞内反 應（如增加CTPyS與細胞膜結合或降低内生性cAMP量）的物 質。在一些具體實施例中，促效劑為先前並不知其與受體 結合時會抑制脂肪分解的物質。 異位調節劑（ALLOSTERIC MODULATORS)意指會影響 受體功能活性但不會抑制内生性配體與受體結合之物質 (如配體、候選化合物）。異位調節劑包含反向促效劑、部 份促效劑及促效劑。 本文中所用之胺基酸縮寫（AMINO ACID ABBREVIATIONS)列於表 A 中： 122352.doc -52- 200800009
表A 丙胺酸（ALANINE) ALA A 精胺酸（ARGININE) ARG R 天冬醯胺酸 (ASPARAGINES) ASN N 天冬胺酸 (ASPARTIC ACID) ASP D 半胱胺酸 (CYCTEINE) CYS C 麩胺酸（GLUTAMIC ACID) GLU E 麩醯胺酸 (GLUTAMINE) GLN Q 甘胺酸（GLYCINE) GLY G 組胺酸（HISTIDINE) HIS H 異白胺酸 (ISOLEUCINE) ILE I 白胺酸（LEUCINE) LEU L 離胺酸（LYSINE) LYS K 甲酸胺酸 (METHIONINE) MET M 苯丙胺酸 (PHENYLALANINE) PHE F 脯胺酸（PRALINE) PRO P 絲胺酸（SERINE) SER S 蘇胺酸 (THREONINE) THR T 色胺酸 (TRYPTOPHAN) TRP w 酪胺酸（TYROSINE) TYR T 纈胺酸（VALINE) VAL V 122352.doc -53 - 200800009 拮抗劑（ANTAGONISTS)意指與促效劑在受體之相同位 置競爭結合，但不會活化細胞内反應，因此可抑制由促效 劑引起的細胞内反應之物質（如配體、候選化合物）。拮抗 劑在促效劑不存在時不會降低細胞内反應基準值。在一些 具體實施例中，拮抗劑為先前並不知當其與受體結合時會 與促效劑競爭而能抑制細胞反應的物質，例如其中細胞反 應為GTPyS與胞膜結合或降低細胞内cAMP濃度。 抗體（ANTIBODIES)在本文中可包括單株抗體及多株抗 體。抗體可進一步包括IgG、IgA、IgD、IgE及IgM。抗體 包括整個抗體，其包括單鏈之整個抗體及抗原結合片段， 其包括Fab、Fabf、F(ab)2及F(ab，）2。抗體之來源可為任何 動物。較佳之抗體來自人類、鼠、兔子、山羊、天竺鼠、 倉鼠、絡駆、驢、羊、馬或雞。最佳之抗體具有解離常數 或 Kd值小於 5χ10-6 Μ、1(Γ6 Μ、5xl(T7 Μ、1〇_7 Μ、5xl(T8 Μ、1(Γ8 Μ、5χ10_9 Μ、10_9 Μ、5χ1(Τ10 Μ、ΙΟ·10 Μ、 5χ1(Γ11Μ、1(Τ11Μ、5χ1(Τ12Μ、10·12Μ、5χ1(Γ13Μ、1(Γ 13 Μ、5χ1〇-14 Μ、ΙΟ·14 Μ、5χ1〇-15 Μ及 1〇]5 Μ之偶聯親合 力。本發明抗體可由任何適合的習知技術製備。 細胞凋亡（APOPTOSIS)(亦稱為計劃性細胞死亡）意指一 種細胞死亡形式，其中細胞受在細胞中運作的訊息傳遞系 統調控而計劃性的死亡。反之，壞死（necrosis)為細胞因外 來因素而死亡。 候選化合物（CANDIDATE COMPOUND)意指可以通過 篩檢之分子（例如，但不限於，化合物）。較佳者，「候選 化合物」不包括選自受體之反向促效劑、拮抗劑或促效劑 122352.doc -54- 200800009 的已知化合物；更佳者，其不包括先前已被測定在至少一 種哺乳動物具有療效的化合物；且最佳者，其不包括先前 已被測定對人類有療效的化合物。 心臟射出分率（CARDIAC EJECTION FRACTION)意指 左心室單次收縮時的血液射出分率。例如，若左心室内有 100毫升血液而在收縮時射出90毫升，其心臟射出分率為 90% 〇 心臟肥大（CARDIAC HYPERTROPHY)意指心臟肌肉（心 肌）增大。心臟肥大一般是，但並不一定是，對加於心肌 上增加的血液動力學負載之調適反應。 密碼子（CODON)意指三個核苷酸（或核苷酸之等效物） 所組成之單位，該核苷酸一般包含與磷酸基偶聯之核苷 (腺嘌呤核苷（A)、鳥嘌呤核苷（G)、胞嘧啶核苷（C)、尿嘧 啶核苷（U)及胸腺嘧啶核苷（T))，且當該密碼被轉譯時編碼 一胺基酸。 組合物（COMPOSITION)意指包含至少一種組份的物 質；「醫藥組合物（pharmaceutical composition)」為該組 合物的一例。 化合物效力（COMPOUND EFFICACY)意指化合物抑制 或刺激受體功能之能力的測量值，即活化/抑制訊息傳遞 路徑的能力，而非指受體結合親和力。測定化合物效力的 方法實例揭示在本專利文件的實施例中。 包含（COMPRISING)、基本上由…組成（CONSISTING ESSENTIALLY OF)及由…組成（CONSISTING OF)在本文 122352.doc -55- 200800009 中之定義係如其標準定義。Μ.Ρ·Ε·Ρ·所給的定義在發明所 屬技術領域中的定義之上，而由聯邦巡迴法院之判例所給 * 的定義在Μ·Ρ·Ε·Ρ_所給的定義之上。 充血性心衰竭（CONGESTIVE HEART FAILURE (CHF))意指心臟喪失其有效送血能力的失調症。隨年齡增 加充血性心衰竭變的更普及。缺血性心臟病為充jk性心衰 竭最常見之原因，約占所有案例的60至70%。靜腐屋大於 12 mmHg即為充血性心衰竭一種主要判別標準，心腐 ⑩ f的綮愈，即相當於循環時間大於25秒，亦為一種判別標 準。
本質性活化受體（CONSTITUTIVELY ACTIVE RECEPTOR)意指受體以與配體或其化學等效物結合之 外的方法使受體穩定處於活化狀態。本質性活化受體可 為内生性或非内生性。 經本質性活化之受體（CONSTITUTIVELY ACTIVATED _ RECEPTOR)意指經修飾而使其本質性活化之内生性受 體。CART為「本質性活化受體技術（Constitutively Activated Receptor Techinology)」的首字縮寫，且當本文 中使用此做為GPCR的前綴詞時，應暸解該帶有此前綴詞 之GPCR為經本質性活化之受體。 本質性受體活化作用（CONSTITUTIVE RECEPTOR ACTIVATION)意指在不經與配體或其化學等效物結合的 受體活化作用。 接觸（CONTACTC或CONTACTING)意指使至少兩部份 122352.doc -56- 200800009 碰在一起，不論是在活體内系統或活體外系統。 減少（DECREASE)係指可測量的數量減低，其與「減低 (reduce)」、「減小（diminish)」、「降低（lower)」及「使減小 (lessen)」同義。 心贜超音波（ECHOCARDIOGRAPHY)係指使用聲波測 量活的動物心臟結構及功能的方法。 内生性（ENDOGENOUS)意指哺乳動物自然產生之物 負。舉例a之’内生性用於形容術語「受體」時，意指該 受體可由哺乳動物（例如，但不限於，人類）自然產生。相 對地，術語非内生性（ΝΟΝ-ENDOGENOUS)在本文中意指 非由哺乳動物（例如，但不限於，人類）所自然產生者。舉 例言之，在本文中當受體之内生性形式並不為本質性活化 者’但經處理後變成本質性活化之受體時，該受體最宜被 稱為「非内生性被本質性活化之受體」。此二術語皆可被 用於描述「活體内Wvo)」及Γ活體外（h 」系 統。舉例言之，在一篩檢方法中，該内生性或非内生性受 體皆可用於活體外系統之描述。在另一非限定性例子中， 當哺乳動物的基因組（genome)經操作而包括非内生性被本 質性活化之受體時，可藉由活體内系統的方法來篩檢候選 化合物。 表現載體（EXPRESSION VECTOR)在此定義為在轉錄 選殖的DNA時以及在適t之宿主細胞重構物將轉錄的 mRNA轉譯時，所需要之廳片段。適當建構的表現載體 應包含可在宿主細胞中自動複製的複製起始點、可用於挑 122352.doc -57- 200800009 選的記號、一定數量的限制酶切位、可大量複製的潛能及 具活性的啟動子（promoter)。該要被轉錄之選殖DNA在該 的表現載體中係與本質性活化或條件性活化的啟動子以操 作方式連結。在一非限定性例子中，pCMV即為一表現載 體。 G蛋白偶聯受體融合蛋白（G PROTEIN COUPLED RECEPTOR FUSION PROTEIN)及 GPCR融合蛋白（GPCR FUSION PROTEIN)在本發明之揭示文件中係指包含内生 性本質性活化GPCR或非内生性被本質性活化之GPCR與至 少一個G蛋白融合之非内生性蛋白，最佳者為該G蛋白的ex 次單元（此為結合GTP之次單元），且該G蛋白最佳者為與和 内生性孤兒GPCR自然偶聯之G蛋白同屬一類者。舉例言 之，但不限於此，在内生的狀態下，若G蛋白「Gsa」為與 特定GPCR偶聯的主要G蛋白，那麼基於此特定GPCR的 GPCR融合蛋白可能為包含與Gsa融合之GPCR的非内生蛋 白；在一些情況下，如下文所詳述者，非主要G蛋白可與 GPCR融合。G蛋白可與本質性活化GPCR的C端直接融合 或在兩者之間有間隔基。 宿主細胞（HOST CELL)為一種能夠納入載體的細胞。 宿主細胞可為原核細胞或真核細胞。在一些具體實施例 中，宿主細胞為真核細胞，較佳者為哺乳動物細胞，更佳 者係選自293、293T、CHO及COS-7細胞。在一些具體實 施例中，宿主細胞為真核細胞，更佳者為黑色素細胞。 需要治療（IN NEED OF TREATMENT)在本文中意指由 122352.doc -58- 200800009 照顧者（若照顧的是人類那就是内科醫生、護士、護理人 員等；若是動物，包含非人類哺乳動物，則為獸醫）判斷 認為個體或動物需要治療或可因治療得益。此判斷基於照 顧者專業上的許多評量標準，但亦應考量個體或動物因可 由本發明化合物治療之症狀而導致生病或將要生病。 靜脈壓增加（INCREASED VENOUS PRESSURE)意指因 循環系統衰弱所導致血液鬱積於靜脈系統（靜脈）而導致的 血壓上升。 個體（INDIVIDUAL) —詞在本文中意指任何動物，包含 哺乳動物，較佳者為小鼠、大鼠、其他鼠類、兔子、狗、 貓、豬、牛、羊、馬或靈長類動物，最佳者為人類。 抑制（INHIBIT或INHIBITING)與「反應」一詞合用時 意指該反應在化合物存在時相對於該化合物不存在時的反 應被降低或被阻止。 反向促效劑（INVERSE AGONISTS)意指會與受體之内 生形式或本質性活化形式結合而降低在促效劑不存在時該 受體之細胞内反應的基準值之物質（如配體、候選化合 物）。 缺血性心臟病（ISCHEMIC HEART DISEASE)意指心臟 組織缺氧所導致之失調症，其中心肌被影響使得心臟不能 適度的輸送血液。缺血性心臟病在美國為常見的心臟病。 經分離（ISOLATED)意指物質係從來源環境（如其為自然 產生，指的就是自然環境）中移出。舉例言之，在於活體 動物中自然產生的聚核苷酸或多肽存即沒有經分離，但相 122352.doc -59- 200800009 同的聚核苷酸或DNA或多肽，從自然系統中與部分或全部 併存的物質分開，即稱為經分離。此聚核苷酸可為載體之 一部分及/或此聚核苷酸或多肽可為組合物的一部分，但 因為載體或組合物並非其自然環境之一部分移除，因此仍 稱此聚核苷酸為經分離。 基因剔除小鼠/大鼠（KNOCKOUT MOUSE/RAT)在本文 中包含經由基因重組法改造的小鼠或大鼠，使得所選擇的 單個基因失活或「被剔除（knocked-out)」但不影響其他基 因表現。 已知配體受體（KNOWN RECEPTOR)意指内生性受體， 對此受體特有的配體已被辨識出。 配體（LIGAND)意指對自然產生之受體有特異性的分 子。 本文所使用之調節（MODULATE)或修飾（MODIFY) —詞 意指特定活性、功能或分子之數量、品質或效果增加或減 少〇 心肌梗塞（MYOCARDIAL INFARCTION)意指因對心肌 之部分區域供氧不適當而使該區域之心肌受傷或死亡。心 肌梗塞通常由血塊阻斷一條冠狀動脈（攜帶血及氧氣至心 肌之i管）而造成。血·塊阻止血液及氧氣到達該心臟區 域，使此區域心臟細胞死亡。 非孤兒受體（NON-ORPHAN RECEPTOR)意指對一被辨 認出之配體有特異性之内生性自然產生之分子，其中配體 結舍至受體可活化細胞内訊息傳遞路徑。 122352.doc -60- 200800009 孤兒受體（ORPHAN RECEPTOR)意指一種内生性受 體，其特有之配體未被識別出或為未知。 部份促效劑（PARTIAL AGONISTS)意指當與受體結合 時，會以低於促效劑之程度/範圍活化細胞内反應之物質 (如配體、候選化合物）。 醫藥組合物（PHARMACEUTICAL COMPOSITION)意 指包含至少一種活性成份的組合物，藉此該組合物可用於 在哺乳動物（例如，但不限於，人類）内進行對於特定功效 之研究。發明所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解了解 並認同適用於測定一活性成分是否具有欲求之療效結果所 使用之技術係依據技藝人士之需要所選擇。 聚核苷酸（POLYNUCLEOTIDES)意指 RNA、DNA 或一 個以上的單股或雙股核苷酸組成之RNA/DNA雜交片段。 本發明之聚核苷酸可用任何已知的方法製備，包括合成、 重組、胞外生成或上述方法的組合，也可以利用任何技術 領域中已知的純化方法。 多肽（POLYPEPTIDE)意指不限長度的胺基酸聚合物。 因此，胜肽、寡肽及蛋白質皆包含於多肽之定義中。此名 詞並未指明或排除多肽之表現後修飾。舉例言之，包含共 價附接之糖基、乙基、磷酸基、脂基等的多肽亦包含於 「多肽」一詞之範圍中。 心肌梗塞後之重塑 （POST_MYOCARDIAL INFARCTION REMODELING)。因為心肌梗塞之心肌組 織喪失導致在心室的持續地過度血液流動重載。心室肥大 122352.doc -61- 200800009 即為心臟為補償所增加負載的主要機制之一。然而，在血 液動力過度負載下這種維持心臟表現的適應法有其能力限 制’當長期維持在這種狀態下就會變成無法適應。一般而 言’適應性的心室肥大表現型因擴大的心室日漸鬆馳且收 縮功能變弱而轉變成外顯的心衰竭。心臟對心肌梗塞的適 應性或無法適應之反應的自然過程即稱作是「重塑現 象」。
提及心肌梗塞後之重塑，若干參數有助於理解其病理進 程： (a) 若心臟肥大增加，即為不利； (b) 若心臟心肌細胞凋亡，即為不利； (c) 若心臟射出分率降低，即為不利； (d) 若心室腔體積減少，即為不利。 射出分率、肥大、心室腔擴張均可在活體動物以心臟超 音波測量，包括在大鼠及小鼠。這些參數基本上可作為一 開始的評估。然而，為了準確查明涉及的發病機制，，動 物通常需要被犧牲以測量心臟心肌細胞〉周亡。 引子（PRIMER)在本文中意指特殊的寡核苷酸片段，其 可與目標核《片段互補’而用來與目標核酸序列雜交。 引子可做為以DNA聚合酶、RNA聚合酶或反轉錄酶所催化 之核酸聚合反應的起點。 受體功能（RECEPTOR, FUNCTI〇NALITY)意指受體在 接收刺激後調節細胞内作用的正常活動，其包含，但不限 於，調節基因轉錄、調節離子流入流出、影響催化反應及 122352.doc -62- 200800009 /或透過G蛋白調節活性。 心臟輸出量降(REDUCED CARDIAC OUTPUT)意指 由於衰弱的心臟送血能力降低而導致每一次心室收縮時較 少的血液打入循環系統（動脈）。 二級傳訊子（SECOND MESSENGER)意指受體活化後所 產生的細胞内反應。二級傳訊子包含如三磷酸肌醇（IP3)、 二醯甘油（DAG)、環單磷酸腺苷（cAMP)、環單磷酸鳥苦 (cGMP)及Ca2+。可測量二級傳訊子反應來測定受體活化反 應。此外，二級傳訊子反應之測量可直接用於辨識候選化 合物，例如包含反向促效劑、部份促效劑、促效劑及拮抗 劑。 訊號雜訊比（SIGNAL TO NOISE RATIO)意指在活化、 放大或刺激反應中產生之訊號，其中該訊號高過背景雜訊 或非活化、非放大或非刺激反應的基準值。 間隔基（SPACER)意指數個經轉譯的胺基酸，其位於基 因（如有興趣之GPCR)最後端密碼子或最後胺基酸之後，但 在起始密碼子或有興趣之G蛋白的起始區域前，其中該等 經轉譯的胺基酸係與與有興趣之G蛋白的起始區域相連。 該經轉譯之胺基酸的數目可為1、2、3、4至最多20。 刺激（STIMULATE 或 STIMULATING)與「反應 (response)」一詞合用時表示當一化合物存在時，相對於 此化合物不存在的情況下該反應增加。 受試者（SUBJECT)意指靈長類（其包含，但不限於，人 及彿拂）、龍物（如狗及猶）、實驗動物（如大鼠及小鼠）及農 122352.doc -63- 200800009 場動物（如馬、羊及牛）。 有效劑量（THERAPEUTICALLY EFFECTIVE AMOUNT)在本文中係指可在組織、系統、動物、個體或 人類身上引發研究員、獸醫、醫師（medical doctor)或其他 臨床醫師（clinician)所要得到的生物或藥學反應之活性化 合物或藥劑的用量，該生物或藥學反應包括下列一種或多 種： (1) 預防疾病；例如對傾向患有疾病、症狀或失調症但 尚未表現或呈現此疾病的病理或症狀之個體預防該 疾病、症狀或失調症； (2) 抑制疾病；例如對表現或呈現疾病、症狀或失調症 之病理或症狀的個體抑制其疾病、症狀或失調症（阻 止病理及/或症狀進一步發展）；及 (3) 改善疾病；例如對表現或呈現疾病、症狀或失調症 病理或症狀的個體改善其疾病、症狀或失調症（反轉 其病理及/或症狀）。 轉殖基因小鼠/大鼠（TRANSGENIC MOUSE/RAT)在本 文中係指以基因重組方法改造而帶有所選之外來基因或轉 殖基因作為其本身基因物質的小鼠或大鼠。 心室腔體積（VENTRICULAR CHAMBER VOLUME)意 指測量心臟左及右心室腔的内部容積。在衰竭的心臟，其 具有增大的心室腔。 A.前言 下列段落的順序是以呈現的效率做安排，並無意也不應 122352.doc -64- 200800009 被解釋為對本發明或隨後之申請專利範圍有所侷限。 B.篩檢候選化合物 * 1.通用的GPCR篩檢分析技術 當G蛋白受體被活化，其結合至G蛋白（如Gq、Gs、Gi、 Gz、Go)且促進GTP結合至G蛋白。G蛋白接著如GTPase — 般作用且緩慢水解GTP為GDP，因此在正常狀況下，受體 失去活性。然而，活化的受體持續將GDP變成GTP。一種 不可水解的GTP類似物（analog)，[35S]GTP r S，可被使用 ^ 來監控G蛋白與表現出活化受體之細胞膜的結合增加。有 報告指出不論配體是否存在，[35S]GTPyS均可被使用來監 控G蛋白與胞膜的結合。除了其他技藝人士所習知及可獲 得之實例，此監控之一例為由1>3；/11〇]：及>^11〇^]<:丨於1995所 發表。本分析系統較佳之用途為候選化合物最初篩檢，因 為不管在受體細胞内功能部位與其作用的特定G蛋白為 何，此系統皆可適用全部的G蛋白-偶聯受體。 φ 2.特殊的GPCR篩檢分析技術 一旦候選化合物使用「通用的」G蛋白-偶聯受體分析 (也就是選出是促效劑或反向促效劑之化合物的測定方法） 識別，在一些具體實施例中，最妤能做進一步篩檢以證實 該化合物可與受體的連結位置交互作用。舉例言之，由通 用篩檢測定法所辨認出的化合物可能無法結合至受體，而 是僅能在細胞内功能部位將G蛋白「去偶聯（uncouple)」。 a. Gs、Gz及 Gi
Gs刺激腺核苷環化酶。另一方面，Gi(及Gz與Go)抑制腺 122352.doc -65 - 200800009 核苷環化酶。腺核苷環化酶催化由ATP轉變成cAMP ;因 此，活化之與Gs蛋白偶聯的GPCR與細胞内cAMP量的增加 有相關。另一方面，活化之與Gi(或Gz、Go)蛋白偶聯的 OPCR與細胞内cAMP量的降低相關。總體來說可參見《突 觸傳送間接機制》第八章，〈Neuron To Brain〉（第三 版）Nichols，JLG·等編，Sinauer Associates，Inc· (1992)。因 此偵測cAMP的測定法可用來判定例如候選化合物是否為 此受體的反向促效劑（這種化合物可降低cAMP量）。習知技 術已有多種方法用以測量cAMP ;在一些具體實施例中， 一種較佳的方式是在ELISA中使用anti-cAMP抗體。另一可 被利用的測定法為全細胞二級傳訊子報導系統測定法。啟 動子驅動一特定基因所編碼之蛋白質表現。cAMP藉著可 與該cAMP反應之DNA結合蛋白或轉錄因子（CREB)結合進 而結合至稱為cAMP反應元素（cAMP response elements)的 特殊位置上，因此可驅動基因的表現。報導基因系統的構 成可在報導基因（如β半乳糖酶或螢光酵素）前帶有包含多重 cAMP反應元素的啟動子。因此，被活化的Gs連結受體造 成cAMP累積，接著活化基因，且表現報導基因。報導蛋 白如β半乳糖酶或螢光酵素可使用標準生化測定法（Chen等 人，19 9 5 )測定。 b _ G 〇及0巧·
Gq及Go與磷脂酶C的活化有關，後者再將磷脂？1?2水 解，釋放2個細胞内傳訊子：二醯甘油（DAG)及肌醇1，4,5-三磷酸（IP3)。IP3累積量的增加與Gq及Co結合受體之活化 122352.doc -66- 200800009 有關。總體來說可參見《突觸傳送間接機制》第八章， 〈Neuron To Brain〉（第三版）Nichols，J.G.等編，Sinaner Associates，inc· (1992)。偵測％累積的測定法可被利用來 判斷例如候選化合物是否為Gq4 G〇-偶聯受體的反向促效 劑（此種化合物降低IPS濃度）。Gq相關受體亦可使用Ap j報 導測定法，其中Gq相關磷脂酶C會引發含有API元件的基 因活化；因此，活化的Gq相關受體即顯示上述基因表現增 加’因為反向促效劑即顯示此基因表現降低而促效劑即顯 示此基因表現增加。一般這些測定分析法皆可購得。 3· GPCR融合蛋白 使用内生性本質性活化GPCR或非内生性本質性活化 GPCR以直接辨識反向促效劑或促效劑的選候選化合物篩 檢法，提供十分有趣的挑戰，因為按其定義此類受體即使 在内生性配體並未與之結合的情況下亦被活化。因此為了 區別非内生性受體處於存在或不存候選化合物的兩種情況 時的差異，如此區別的主要目的在於想要了解候選化合物 是否可為反向促效劑或促效劑或對受體沒影響，在一些具 體實施例中，最好能採用一種可以增加該差異的方法。在 一些具體實施例中，較佳之方法為使用GPCR融合蛋白。 一般來說，只要使用前述分析技術（或其他技藝人士所 熟知的技術）測定出非内生性本質性活化的GPCR，就可能 測疋出與其内生性GPCR結合的主要G蛋白。G蛋白與 GPCR偶聯可提供一個可被測得的訊息傳遞路徑。在一些 具體實施例中，其較佳者係使用哺乳動物表現系統篩檢， 122352.doc -67- 200800009 在此系統中應該會有内生性G蛋白。因此，以定義而言， 在此系統中非内生性本質性活化GPCR將不斷發訊號。在 - 一些具體實施例中，較佳者此訊號在諸如受體反向促效劑 ^ 存在時增加，因此特別在篩檢時，當其與反向促效劑接觸 時，更容易顯現訊號的差異。 GPCR融合蛋白傾向於增加〇蛋白與非内生性GpCR偶聯 效率。在一些具體實施例中，針對内生性本質性活化 馨 GPCR或非内生性本質性活化(3]?(：^的篩檢最好是用gPCR 融合蛋白，因為此方法使此篩選技術所產生的訊號增加。 重要的是能產生顯著的「訊號雜訊」比；此顯著比例對本 文所揭示候選化合物的篩檢尤佳。 可用於表現GPCR融合蛋白構成物的製備法為熟習本技 藝人士所知曉。市面上可得之表現載體及系統提供多樣方 法其可配合研究者特別的需求。在製作此GPCR融合蛋 白構成物％的重要標準為，包含，但不限於，GPCR序列 參 及G蛋白序列位於同一讀框中（較佳者内生性GPCR序列位 於G蛋白序列下游位置），且GpCR的「終止」密碼子被刪 示或取代以致於在GpCR表現時G蛋白亦.表現出來。GPCR 可直接連結至G蛋白，或在兩者之間有間隔的殘基（最好不 超過12個，雖然此數量可由熟習此技藝之人士確認）。為 了,用方便，最好能使用間隔基。在-些具體實施例中， 氣成GPCR一合蛋白構成物前最好先將與非内生性gpcr 結合的G蛋白識別出。由於目前僅有少數g蛋白被辨識 出最好有一個包含G蛋白序列（意即通用的g蛋白構成 122352.doc -68 - 200800009 物，見實例5(a))的構築體可用於嵌入内生性GPCR序列； 如此可對具有不同序列的不同内生性GPCR之大範圍篩檢 法更增效率。 如上所述，因為與Gi，Gz及Go偶聯的經活化GPCR預期可 抑制cAMP生成，使得以這些GPCR為基礎的測定法更具挑戰 性（即，其活化時cAMP訊號降低，對諸如促效劑（其進一步 降低此訊號）的直接識別更難）。如本文件所將揭示者，可確 定的是，對此類的受體而言，要建立一能用的環化酶為主的 測定法，可用並未以此GPCR之内生G蛋白為基礎所構成的 GPCR融合蛋白。因此，舉例言之，一種内生性Gi-偶聯受體 可與Gs蛋白融合一此一融合構築體的表現，將「驅動」或 「強迫π」内生性GPCR與諸如Gs而不是「原本的」Gi蛋白結 合，如此可建立一環化酶測定法。因此，Gi，Gz，或Go-偶 聯受體，在一些具體實施例中，當GPCR融合蛋白被使用且 δ玄測疋法是以腺普環化酶活性為基礎，融合構築體最好可用
Gs製成（或可刺激腺苷環化酶生產的同等〇蛋白）。 表2 G蛋白 GPCR活化對 cAMP生成的 影響(例如，本 質性活化或與 促效劑結合） GPCR活化對ip3 累積的影響(例 如，本質性活化 或與促效劑結 合)下效果 與反向促效劑 接觸對cAMP生 成的影響 與反向促效劑 接觸對Π>3累積 的影響 Gs ----- 增加 N/A 減少 N/A Gi’ 減少 N/A 增加 N/A Gz 減少 N/A 增加 N/A Go 減少 增加 增加 減少 —GqS N/A 增加 ^N/A 減少 122352.doc -69 - 200800009 利用Gq蛋白與Gs、Gi、Gz4Go蛋白融合的G蛋白融合 構築體也同樣有效。在一些具體實施例中，較佳的融合構 築體可為與Gq蛋白融合而成，其中g蛋白α次單元體 (「Gaq」）的前六個胺基酸被删除，且在Gaq的c端後5個 胺基酸以所用G蛋白的Ga所對應之胺基酸取代。舉例言 之’ 一融合構築體可能是Gq(6胺基酸被删除）與Gi蛋白融 合’產生「Gq/Gi融合構築體」。此融合構築體將強迫内 生性Gi_偶聯受體與偶聯於其非内生性的G蛋白（Gq)以致於 其二級傳訊子，舉例言之，三磷酸肌醇或二醯甘油，可以 用cAMP生成的測得量代替。 4·目標GM禹聯GPCR與一訊號增強劑Gs-偶聯GPCR的共 轉染（以cAMP為基礎的測定法） 一 G i -偶聯受體已知其可抑制腺苦環化酶，因而降低 cAMP產量，對cAMP量的測定變得困難。在一些具體實施 例中，測量cAMP產量減少以做為在活化狀態時主要與⑴ 結合之受體被活化指標的有效技術，可由共轉染訊號增強 劑，如一個内生性本質性活化受體完成，此受體在活化狀 態主要是與Gs連結的GPCR(如TSHR-A623 1 ;見下文）。顯 而易見，Gs-偶聯受體的活化可藉CAMP產量的增加而測 定。Gi-偶聯受體的活化導致cAMP產量減少。因此，共轉 染方法就是要利用這些「相」π反應。舉例言之，非内生 性、本質性活化Gs-偶聯受體（「訊號增強劑」）與表現载體 共轉染提供cAMP基礎訊號（換言之，雖然偶聯受體將減 少cAMP量，「減少」將是相對於由本質性性活化偶聯 122352.doc -70- 200800009 訊號增強劑所建立的eAMP量增加而論）。接著將訊號增強 J與目枯叉體」共轉染，Gi-偶聯目標受體的反向促效 劑將增加測出的cAMP訊號，而Gi_偶聯目標受體促效劑將 減少訊號。 使用此方法直接識別的候選化合物必須另經獨立測定以 確認其並非針對目標訊號增強受體（此獨立測定可在共轉 染受體篩檢期間或之後進行）。 C·藥物化學 候選化合物 任何本技藝已知的分子均可測試其調節（增加或減少）本 發明GPCR活性的能力。若要識別出一個可調節活性的化 合物’候選化合物可直接提供至表現該受體的細胞。 本發明具體實施例可適用於篩檢化學資料庫中何者能調 節受體的表現量或其活性，即，拮抗劑或促效劑。化學資 料庫可為胜肽資料庫、胜肽模擬物資料庫、.化學合成資料 庫、重組體（如噬菌體表現資料庫）、活體外轉譯的資料庫 及其他非胜肽合成有機資料庫等。本發明具體實施例將適 合篩檢含有生物材料的内生性候選化合物，包含，但不 限，於血漿及組織萃取液，及篩檢含已知具生化活性的内 生性化合物資料庫。 在一些具體實施例中候選化合物的直接識別法是用於以 組合的化學技術產生之化合物，因此可為此類分析隨機製 備數以千計的化合物。候選化合物可能屬於某一化學資料 庫。此資料庫可包含任何合宜數目的個別化合物，例如i 〇 122352.doc -71 - 200800009 至100至1000至百萬適合的化合物，舉例言之，胜肽、胜 肽及其他募聚物（環狀或直線狀）及以模板為基底的較小分 子，例如像疋苯二氮平類、乙内醯脲類、雙芳香基類、碳 環及聚環化合物（如奈甲駿類、硫二苯胺類、σ丫錢、類 固醇等）、碳水化合物及胺基酸衍生物、二氫吡啶類、二 苯甲基類及雜環類（如三氮六環H硫氮二稀五環 專）所述數目及列出的化合物種類僅為說明用，其並非 用於限至本發明之範疇。較佳的化學資料庫包含低分子量 化合物及可能的藥劑。 化學資料庫的範例購自數個來源（ArQule，Trip()s/PanLabs， ChemDesign ’ Pharmacopoeia)。在一些實例中，這些化學 資料庫使用組合策略產生，其可在基質上編碼資料庫中每 個成員之身份，而化合物附接於該基質上，因此允許直接 且快速識別分子是否為一有效調節劑。因此，在許多結合 方法中，化合物在玻片上顯現的位置具體指明其成份。同 時，在某個實例中，每個玻片位置可帶有1至2〇個化學物 質，可直接加入盛有所要篩檢之化合物的培養盤小孔中。 因此，若分子被測出具有調節作用，可縮小測定的範罔。 由此方法，許多候選化合物可被篩檢。 許多種適合使用的資料庫為已知技藝且可被使用來提供 化合物由本發明之方法測定。或者，資料庫可使用標準方 法自行建造。進一步，更一般來說，亦可使用結構有限的 別種有機資料庫（如非胜肽）。由範例的方法，可用一種苯 二氮平資料庫（見，Bunin等，1994，Pr〇c. Natl. Aea(L Sei 122352.doc -72- 200800009 USA 91:4708-4712) 〇 本發明另一個具體實施例，組合化學可用來辨識本發明 ^ GPCR調節劑。組合化學能夠建立包含數以千計化合物的 . 負料庫’可以為結構相似。同時尚產能篩檢程序能夠針對 已知目標篩檢這些大規模資料庫，已有新的方法可製造出 總數量較少但化學多樣性更高的資料庫。（見Matter， 1997，Journal of Medicinal Chemistry 40:1219-1229) 〇 一種組合化學方法，即親和度指紋圖譜，之前是用來測 ® 試小分子零散資料庫對一群特定蛋白質的親和度。由上述 篩檢法所得之指紋圖譜可被使用來預測資料庫上個別分子 對其他蛋白質或受體的親和力（在本發明中，即為本發明 的受體）。所得指紋圖譜可與其他已知會和蛋白質起反應 之化合物的指紋圖譜比較，預測資料庫中的化合物是否會 有同樣反應。舉例言之，先不要針對一化合物或蛋白質成 分逐一測試大資料庫中的每一個配體，僅測試與其他已知 φ 具有活性之化合物指紋圖譜類似的配體。（請参Kauvar等 人，1995，Chemistry and Biology 2:107-118 ； Kauvar， 1995 ， Affinity fingerprinting ， Pharmaceutical
Manufacturing International. 8:25-28 ；及 Kauvar，Toxic-
Chemical Detection by Pattern Recognition in New Frontiers in Agrochemical Immunoassay，D. Kurtz. L. Stanker及 J.H. Skerritt· Editors，1995，AOAC: Washington, D.C·，305-3 12)。 候選化合物被識別為調節劑 122352.doc -73- 200800009 一般，此篩檢結果將為有一致核心結構，因此這些化合 物可沿一個最好的核心結構提供額外的化學修飾至進一步 增加藥物特性。此技術為已知技藝，且將不會詳細說明於 專利文件中。 在一些具體實施例，識別的分子為生物可利用。多數計 算方法可利用這些技藝有建立預測藥物口服生理利用性 (請参 Ooms等人，Biochem Biophys Acta (2002) 1587:118-25 ； Claek & Grootenhuis，Cirr OpinDrug Discov Devel (2002) 5:382-90 ； Cheng 等人，J Comput Chem (2002) 23:172-83 ； Norinder & Haeberein, Adv Drug Deliv Rev (2002) 54:291-313 ; Matter 等人，Comb Chem High
Throughput Screen (2001) 4:453-75 ； Podlogar & Muegge, Curr Top Med Chem (2001) 1:257-75 ;揭示於此均以其整 體作為參考）。進一步，正子放射斷層攝影（PET)有很多種 運用方式可直接測量藥物分布，包含口服給藥後隨即對哺 乳動物估計其口服生物利用率，包含非人類靈長類及人體 (請参 Noda等人，J. Nucl Med (2003) 44:105-8 ; Gulyas 等 人，Eur J Nucl Med Mol Imaging (2002) 29:1031-8 ； Kanerva等人，Psychopharmacology (1999) 145:76-81 ;揭 示於此均以其整體作為參考）。亦可見於後揭之實例，包 含實例19。 D.醫藥組合物
本發明提供一種治療（或預防）方法可將本發明之調節劑 以其有效劑量施用於需要此治療（或預防）的個體（請参PCT 122352.doc -74- 200800009 申請編號PCT/IB02/01461，公告 W002/066505，2002年8 月29曰’揭示於此均以其整體作為參考）。在一個最佳發 明態樣中，該調節劑已被純化。此個體最好為動物，包 含’但不限於，如牛、豬、馬、雞、貓、狗、兔子、大 鼠、小鼠等，且較佳者為哺乳動物，最佳者為人。
本發明調節劑可用至非人類動物（見之後實例）及/或人， 其可單獨使用或在藥學或生理可接受之組合物中，可使用 習知技藝的技術將其與適合的載體或賦型劑混和。習知技 藝中可獲得之藥學可接受載體皆適用；舉例言之，參見
Remington^ Pharmacetical Sciences, 16th Edition, 198( Marking Publishing Co·，（Oslo等人編）。 藥學或生理可接受組合物接著便可以其有效劑量施用方 個體。有效劑量指的是調節劑的量足夠產生預防或改善每 血性心臟病之症㈣生理狀_，包含錢梗塞、心肌梗售 後的重塑現象及充血性心衰竭;可以如本文所揭示之方钱 決定其量’但不限於該等方法揭露者。在—些具體實施例 中’有效劑罝指的是調節劑的用量能充分產生預防或改盖 心血管失調症的症狀或生理狀態， 心 ° 匕3、贓輸出降低及靜 脈反杧加，可以如本文所揭 ^ ^ x 〜刀忒厌疋其夏，但不限於 该荨方法揭露者。在一此且齅無 一、體A例中，有效劑量指的是 口周即绡的用1足以產生 ^ 厅要之心臟功能改變，包含降低 心臟肥大、增加心臟輪出 " 肌％腧、. 丨中低〜至通到體積及降低心 肌-胞屑亡，可以如本文所揭示之 於該等方法揭露者。 里’但不限 1223 52.doc -75- 200800009 在此需明白指出本發明調節劑可單獨或與其他藥學或生 理可接受組合物合併施用。其他用以治療本發明失調症的 化合物為已知技藝。本發明一個發明態樣包含使用揭示於 此具體實施例，其進一步包含一個或多個選自卡特普 (captopril)、依那普利順丁 烯二酸鹽（enalapril maleate)、 林諾普利（lininopril)、雷米普力（ramipril)、培哚普利 (perindopril)、弗西邁（furosemide)、托拉西邁 (torasemide)、氣苯塞啶（chlorothiazide)、水合氯苯塞啶 (hydrochlorothiazide)、阿米羅鹽酸鹽（amn〇ride hydrochloride) σ定、螺内酉旨（spironolactone)、天諾敏（atenolol)、比索洛爾 (bisoprolol)、卡維地洛（carvedil〇l)、美托洛爾酒石酸鹽 (metoprolol tartrate)及地谷新（digoxin)的試劑。 在一些具體實施例中，缺血性心臟病係選自下列組群： 包括心肌梗塞、心肌梗塞後的重塑現象及充血性心衰竭。 在一些具體實施例中，心血管失調症係選自下列組群：包 括心臟輸出降低及靜脈壓增加。在一些具體實施例中，需 要改變的心血管功能係選自下列組群：心臟肥大、心臟射 出量增加、心室腔體積減少及心肌細胞凋亡降低。 給藥途徑 適合的給藥途徑包含口服、鼻腔、直腸、黏膜、或腸吸 收、非腸道擴散，包含肌肉、皮下、脊椎注射及技術領域 中已知的腦脊椎膜注射、直接腦室内注射、靜脈注射、腹 腔注射、鼻内栓劑及肺内（吸入）或眼内注射。其他特殊的 給藥途徑為喷霧式及總儲製劑（depot formulation)。持續釋 122352.doc -76- 200800009 96125738 放製劑（特別是總儲製劑）特別適用於本發明的藥劑。在一 些具體實施例中給藥途徑為口服。 ， 組合/配方 , 適用於本發明藥學或生理可接受組成或藥劑可以由常見 的方法配置，使用一種或多種生理可接受載體包含賦型劑 及輔助劑。適合的配方取決於給藥途徑的選擇。 某些描述於此的藥劑將包含藥學或生理可接受載體及至 _ 少一種本發明的調節劑。用於注射時，本發明試劑可製成 水性溶液，較佳者為加上生理相容之緩衝液溶 液、Rmger’s溶液、生理食鹽水如磷酸或重碳酸鹽溶液。 若經黏膜給藥，藥劑之中需用到可滲透該屏障的適當滲透 劑。此滲透劑為習知技藝。 可供口服的藥學或生理可接受調劑包含由凝膠製成的插 承膠囊，収凝膠及塑化劑如甘油及卩梨醇製成的柔軟密 封膠囊。插承膠囊可包含與填充劑如乳糖、結合劑如殿粉 • 及7或潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂及穩定劑混合的活性成 份。在軟膠囊中，活性成份可溶解或懸浮於適合的液體如 油、液化石钱液化聚乙婦甘油。另外，可添加穩定劑。 全部口服給藥配方都應以適合此給藥途徑的劑量擎成。 口服給藥，其配方型式可為由f見方法製成的劑或鍵 吸入給藥，本發明所用的 霧喷灑方便投遞，使用適合 為加壓喷霧藥劑其投藥量可 配方型式以從喷嘴尖端提供喷 的氣體推進，如二氧化碳。若 由控制閥計量。使用於吸入 122352.doc -77- 200800009 器或吹藥器的膠囊及卡匣，如凝膠製成，可由包含該化合 物以及一種像是乳糖或澱粉的適合粉狀基底的混合粉末= 成。 本發明化合物若要採用$經口服的㉟藥途徑可做成注射 劑，如大劑量注射或連續注射。注射劑的組成可以單位劑 量存在’如安瓶或多次劑量容器，且添加保存劑。注射劑 的組成可為以水為載體的懸浮液、溶液或乳液，並可包含 功能劑如懸浮劑，穩定劑及/或分散劑。 靜脈方式的藥學或生理可接受製劑包含水溶形式活化成 伤的水狀/谷液。水狀懸浮液可包含增加懸浮黏性的物質， 如鈉羧甲機纖維素、硬脂醇或澱粉。此外，懸浮液可包含 適合的穩定劑或可增加成份溶解的試劑，以允許製備高濃 度溶液。 另一方面，活性成份在使用前可為粉狀或凍乾形式，使 用時再配合適合的載體，如無菌無熱源水。 除上述組成以外，本發明彳b合物也可製成一總儲製劑。 此長效配方可由植入方式（例如皮下或黏膜植入）或肌肉注 射。因此，舉例言之，本發明化合物可以適合的聚合物或 疏水性材料配製（例如像是乳化於可接受的油中）或離子交 換樹脂，或如少量可溶解衍生物，例如少量可溶解鹽類。 在一個特別的具體實施例中，化合物可經由釋放控制系 統投遞。在一個具體實施例中，可使用一幫浦（請參 Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biom. Eng. 14:201-240； Buchwald et al.5 1 9805 Surgery 88:507-516; 122352.doc -78- 200800009
Saudek et al·，1989, N_ Engl. J. Med. 321:574_579)。在另 一個具體實施例中，可使用聚合材料（請参Medical ， Applications of Controlled Release，Langer and Wise，eds·， w CRC Press，Boca Raton，Florida，1974; Controlled Drug
Bioavailability，Drug Product Design and Performance, S，molen and Ball，eds·，Wiley，New York，1984; Ranger and Peppas，1983，Macromol· Sci· Rev. Macromol. Chem. 23:61; Levy et al·，1985，J. Neurosurg· 71:858-863)。其他釋放控 制系統揭示於Langer( 1990, Science 249:1527-1533)。 另外，本發明化合物可使用持續性釋放系統傳送，如包 含治療劑的固狀疏水聚合物半滲透基質。有多種持續性釋 放物質以為技藝人士所發展出且知曉。依其化學性質，持 續釋放膠囊可釋放本發明之化合物達數週到100天以上。 依治療劑的化學性質及生物穩定性，可使用額外的調節 劑穩定劑。 φ 藥學及生理可接受化合物亦包含合適的固體或膠體相的 載體或賦形劑。此載體或賦形劑範例包含，但不限於，碳 酸鈣、磷酸鈣、多種糖類、澱粉、纖維素衍生物、凝膠及 聚合物，如聚乙烯乙二醇。 有效劑量 適合本發明使用的藥學及生理可接受組合物包含成份其 中活性成份達到其預期目標。特定言之，一種治療有效量 指有效預妨形成或減輕要治療目標目前的症狀。有效量的 測量已為技藝人士所熟知，尤其是本文中所詳細揭示者。 122352.doc -79- 200800009 對於任何制於本發明的化合物，其有效劑量可由細胞 培養分析估算。舉例言之，動物模式的配方劑量達到循環 濃度範圍’其包含或含有_濃度點或範圍顯示在活體外系 統中細胞死亡保護。（見後揭實例之活體外及動物體内模 式。）此資訊被用於更精準測量人體劑量。 治療有效量係指化合物之用量可改善病人的症狀。此化 合物毒性及治療效果可由細胞或實驗動物標準藥學程序測 定法，如LD5()(測試族群50%致死率量）及EDsg(測試族群 50%有效劑量）測得。毒性跟治療有效量間的比為治療指 數，且其可以LD5〇與EDwi比表示。表現高治療指數的化 合物較佳。 從細胞分析及動物試驗獲得的數據可被使用配製用在人 類身上的劑量範圍。化合物劑量最好落在循環濃度範圍 内，包含具有少量毒性或無毒性之EDw。在範圍内的劑量 可多樣化，取決於使用的劑量及利用的方法。精確的配 方、使用方法及劑量可隨個別醫師針對病人狀況選擇。 (參見，Fingl等人，1975，治療的藥學基礎第一章）。 劑量的量及間隔以適應提供活化物質的i漿濃度，其充 分預防或治療本發明失調，取決於特殊的情境。需要達到 有效的劑量江取決於個體特性及服用方法。 劑量間隔一使用最小劑量濃度體積測定法。化合物必須 使用攝食給予以維持血漿濃度在最低有效濃度1 〇至9〇〇/0 倍，較佳為30至99%，更佳為50至90%間。區域給予或選 擇性攝入的例子中，藥物的有效區域濃度與血漿濃度無 122352.doc -80- 200800009 關。 組合物之投予量取決於香、、Λ ^ 又/〇療之對象、受治療者體重、 嚴重程度、給予方法及藥劑師之判斷。 本發明調節劑較佳劑量範圚Α 里靶固為ο·1至1〇〇毫克/公斤體重， 其可為每天投藥或以規律的太—^ 佯的方式以達到需要的結果，其包 含，但不限於，預防或户淼士 & ^ α療本务明缺血性心臟病、預防或 治療本發明充血性心臟疝*客 丙或產生本發明心肌細胞功能需要 的改變。其他最佳劑量笳圚盔 里靶圍為0·1至30毫克/公斤體重。當 然，每曰劑量可在一天當中小曰 Α田宁J 1週期性地給予或投藥。必 須注意的是這些劑量範圍僅兔界 μ w僅為最仫靶圍，並非用於限制本 發明。 本發明係關於預防或治療缺血性心臟病，包含心肌梗塞 後之重塑及充血心衰竭之方法，其包含提供有需要之: 體本發明之調節劑。本發明亦關於預防或治療心血管失， 症，包含心臟輸出降低及靜脈麼增加，其包含提供有需要 之個體本發明之調節劑。本發明亦關於產生所需之心肌細 胞功能改變的方法’心肌細胞功能改變包含降低心臟肥 大、增加心輸出體積、降低心肌細胞凋亡，該方法包含提 供有需要之個體本發明之調節劑。在—些具體實施例中， 調節劑可為生物口服利用性。在些具體實施例中，調節 係以口服醫藥組合物提供給個體。較佳者個體為哺;:二 物’且更加者為人類。 勒 F-其他用途 122352.doc ，81 - 200800009 可调郎（即增加、降低或P且齡、 牛似及阻畊）心肌細胞保護作用的 獲41受體功能的試劑可以將候選化合物與咖41受體接 觸並測定在RUP41受體上候選化合物效^方法而識別 出。可調節驗41受體功能的化合物之選擇性可以其對 腳41受體及對其他受體之功效比較而評估。為確認或定 1該等或合物之活性，在辨識出可調節RUP41受體功能的 化合物後’該化合物可以其他分析法測試，其包括但不 限於’活體内模式。RUP41受體功能的調節劑可用於治療 正常或異常RUP41受體功能有關之疾病及生理狀。 調節（即增加、降低或阻斷）心臟保護作用的試劑可由將 候選化合物與RUP41受體接觸並測定在Rup4i受體上候選 化合物的效用而識別出。在一些具體實施例中，該心臟保 護作用包含預防紐低心肌死亡。在—些具體實施例中， 該心肌死亡包含心肌細胞祠亡。在一些具體實施例中，該 心臟保護作用包含降低梗塞大小。在—些具體實施例中， 該心臟保護作用包含改善的缺血後收縮回復，在一些具體 實施例中，該心臟保護作用包含抑制惡性局部缺血導致之 心律不整。可調節RUP41受體功能的化合物之選擇性可以 其=咖41受體及對其他受體之功效比較而評估。為確認 或定量該等或合物之活性，在辨識出可調節Rup4i受體功 能的化合物後，該化合物可以其他分析法測試，其包括， 但不限於，活體内模式。RUP41受體功能的調節劑可用於 治療正常或異常RUP41受體功能有關之疾病及生理狀。 本發明亦關於本發明化合物的放射性同位素標記型，其 122352.doc -82- 200800009 係經辨識為RUP41調節劑或載體，其不僅用於放射線造影 (清参 Lemstra等人，Geront〇i〇gy (2003) 49:55-60; Myers 等 人’ J Psychopharmacol (1999) 13:352-7;揭示於此均以其
整體作為參考），亦可用於在活體内或活體外之分析，以 進行包含人類之組織樣品中RUP4i之定位及定量，及藉由 抑制放射線同位素標記之化合物之結合來識別rUP4i配 體。本發明進一步之目的係發展新穎的RUP41分析法，其 包含此放射性同位素標記化合物。就說明之目的而非限制 本發明而言，可預期經由放射線造影之RUP41影像顯像可 辨識可能有罹患缺血性心臟，包含心肌梗塞、心肌梗塞後 的重塑及充血性心衰竭，危險性之個體。 本發明亦包含識別為RUP41調節劑或配體之本發明放射 線同位素標記型的化合物。 在些具體實施例中，放射線同位素標記型的化合物與 化合物本身相同，但被一個或多個原子量或原子數不同於
一般發現於自然界（即自然產生）之原子的原子量或原子數 的原子置換或取代。可結合本發明化合物的適合放射性核 種包含2H(重氫）、3H(氚）、nc、、"N、150、170、18〇、i8F、35S、36C1、82]3r、75Br、76以、77]3γ、 Ϊ、124I、125I及131I。併入放射性標記之化合物之放射性 核種將取決於該放射性標記之化合物的特殊用途。舉例言 之，在用於活體外RUP41標示及競爭分析時，通常使用含 有3H、14C、82Br、1251、⑴域〜之化合物。在放射線造影 13, 15- 時，通常使用 、18ρ、！231、12、、125l、131工、、 76
Br 122352.doc -83- 200800009 或77βΓ。在許多具體實施例中，放射性核種係選自由3h hc, 124 125 13 lT 35 82 1 1、 I、35S及82Br組成之群。 將放射同位素併入有機化合物的合成方法適合本發明化 合物且為習知技藝。此合成方法，舉例言之，將氣活化程 度併入目標分子，如下： Α·以氣氣催化降解—此過程一般產生高比活性產物及 需要商化或未飽和先趨物。
Β·以硼氣化鈉降解―此過程較不貴且需要包含可還原 的官能基如醛基、酮基、内酯、酯類及相似的前驅 物0 c·以鋰鋁氚降解一此過程在理論比活性下提供產物。 其亦需要包含可還原的官能基如醛基、酮基、内 酯、酯類及相似的前驅物。 D.重氫氣體暴露標記法—此過程包含暴露包含在合適 催化存在下可改變質子至氚氣的前驅物。 Ε·使用甲基吲哚[3 Η ]的Ν-曱醇化物—此過程一般被使 用來製備0-甲基或Ν_甲基（3Η)產物以以高比活性甲 基吲哚（3Η)治療適當的前驅物。此方法_般允許高 比活性，例如70至90Ci/毫莫耳。 將1251活化物併入目標分子的合成方法包含： A ·榮仏美爾及相似反應--此過程將芳基或雜芳某胺轉 變為重氮鹽化合物，如四氟硼酸鹽，且使用 合的125ι標記。一種具代表性的程序發表於zhu，D，_ G·及共同合作者於 J. Org. Chem. 2002, 67 。 122352.doc -84- 200800009 Β·正5Ι酚-此過程允許125Ι併入酚的正向位置如揭示於
Collier，Τ· L·及共同合作者’於 j. Labeled Compd Radiopharm· 1999, 42, S264-S266。 C·以1251取代的芳香族羥基或異芳香族羥基溴―此方法 一般為2個步驟。第一步驟使用例如j>d催化反應[即 Pd(Ph3P)4]或在三·烷基錫鹵（tri-alkylthinhalide)或六 烷基二錫（hexaalkylditin)[如（CH3)3SnSn(CH3)3]存在 下或通過芳基或雜芳基鋰將芳基或雜芳基溴化物轉 換為相對應之與三-烧基錫（tri_alkyltin)中間體。代 表性程序揭示於Bas，M· -D·及及共同合作者，於j.
Labeled Compd Radiopharm· 2001，44，S280-S282 〇 在一些具體實施例中，放射線同位素標記型的化合物與 該化合物相同，但另加上包含放射性核種的取代基。在一 些進一步的具體實施例中，該化合物為多肽。在一些更進 一步的具體實施例中，該化合物為抗體或其抗體結合片 段。在一些更進一步的具體實施例中，抗體為單株抗體。 可結合本發明化合物的適合放射性核種包含2h(重氫）、 3H(氣）、uc、13c、14c、13N、15n、15〇、17〇、以〇、uF、 35s、36C1、82Br、75Br、76Br、77Br、123I、124i、125l 及 Ϊ。併入放射性標記之化合物之放射性核種將取決於該 放射性標記之化合物的特殊用途。舉例言之，在用於活體 外RUP41標示及競爭分析時，通常使用含有3h、"c、 82Br、125Ι、131ι或358之化合物。在放射線造影時，通常使 用"C、％、123ι、124ι、125ι、131ι、75βΓ、76仏或 7?Br。在 122352.doc -85> 200800009 許多具體實施例中，放射性核種係選自由3H、uc、I8f、 i4c、124][、125ϊ、134、358及82以組成之群。 添加一種或多種包含放射性核種取代基的方法為技藝人 士所應知曉，包含但不限於以酵素法添加放射性峨(請参 Marchalonic JJ，Biochemical Journal (1969)1 13:299-305; Thorell JI and Jahansson BG, Biochimica et Biophysica Acta (1909) 251:363-9 ;揭示於此均以其整體作為參考），
或以 Chloramine-T/Iodogen/Iodobead 法（請参 Hunter WM and Greenwood FC, Nature (1962) 194:495-6; Greenwood FC et al·，Biochemical Journal (1963) 89:1 14-23 ;揭示於此 均以其整體作為參考）。 技藝人士讀過此專利申請文件後，應能明白理解本文所 揭示之受體的其他應用。 實例 下列實例為說明目的，其並非用於不限制本發明。雖揭 示某些特定的核酸及胺基酸序列，熟習本技藝的人士應有 能力對這些序列進行小幅修飾而同時可達到與下述實例相 同或基本上相同的結果。揭示於此的突變法並不是依靠其 方法本身而是依照一演算法計算位在人類GPCR之TM6區 域内的脯胺酸殘基的距離決定。只要其方法可以信任，熟 白本技藝的人士應有能力對這些序列進行小幅修飾而達到 與下述實例相同或基本上相同的結果（例如本質性活化）。 這些修飾的方法均應視為屬於本文件揭示的範圍内。 隨後實例之提出是為說明目的而不是限制目的。熟習此 122352.doc -86 - 200800009 技藝者應能夠設計出與本發明揭示於此之全部或部份相等 的測定法與方法。 雖然技藝有許多種表現載體可用，為了内生性及非内生 性GPCR利用的目的，在一些具體實施例中，其載體最好 使用pCMV。此載體依「專利申請程序所需微生物提存之 國際認證布達佩斯協定」於1998年10月13日寄存於美國菌 種保存中心（ATCC)(10801 University Blvd·，Manassas，VA 20110-2209 USA)。其DNA由ATCC測試且證實其可用。 ATCC給予之寄存編號為pCMV : ATCC #203351 〇在一些 具體實施例中，其較佳之載體為腺病毒表現載體。 與本發明内容有關的DNA重組技術為熟習本技藝人士所 通曉並可查書得知，如Maniatis等人·，Molcular Cloning: A Laboratiry Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory ； 美國專利編號6399373 ;及PCT申請號PCT/IB02/01464，公 告如2002年8月29日WO/02/0665 06 ;揭示於此均以其整體 作為參考。 實例1 内生性人類RUP41全長片段選殖 此處所揭示之人類RUP41為使用基因銀行的資料庫識別 確認。在資料庫中搜尋，取用編號U66581.選殖而成的 cDNA被辨認出來應為出自於第7號染色體的人體基因片 段。RUP41全長選殖以PCR使用引子： 5、TCCCCCGGGAAAAAAACCAACTGCTCCAAA-3r(序列識 別號：7 ;義股） 122352.doc -87- 200800009 5，-TAGGATCCATTTGAATGTGGATTTGGTGAAA-3,（序列 識別號：8 ;反義股，包含BamHI位置） 並以人類基因體DNA作用模板。放大程序使用rTth聚合酶 (Perkin Elmer)及製造商提供的緩衝液系統，每一個引子為 0.25 mM，且每4個核苷酸為0.2mM。循環條件為94°C 1分 鐘，50°C 1分鐘及72°C 1.5分鐘30循環。5’ PCR引子經活化 而所得1.38 kb PCR片段以BamHI酶解，且選殖進pCMV表 現載體的EcoRV-BamHI位置。核酸序列請見序列識別號： 1而其推導出的胺基酸序列則為序列識別號：2。 實例2 製備非内生性本質性活化的人類RUP41 熟習本技藝的人士應具備能力選擇核酸序列突變所需技 術。下面所揭的方法是用來製成人類GPCR非内生性轉 型。以下所揭示在RUP41上的突變以運算方法為基礎’因 此第16個胺基酸（位在GPCR IC3位置）從原先的脯胺酸（或 其内生性的保留性取代）殘基（位在GPCR的TM6位置，接近 TM6/IC3交界處)發生突變，成為丙胺酸、組胺酸、精胺酸 或離胺酸殘基，較佳者為離胺酸殘基。 非内生性本質性活化的人類RUP41全長片段之製備是由 苯丙胺酸殘基在序列識別號：2或序列識別號：3的3 12位 置變異成離胺酸（F312K)。 1. Site-DirectedTM轉換子突變法 製備非内生性人類GPCRs，特別可以蓮用Slt& Directed™轉換子突變基法套件（Clontech)依製造手冊的指 122352.doc -88 - 200800009 示在人類CPGR上實施。所用兩種突變引子，最好為離胺 酸突變的離胺酸突變基因募聚核苷酸，以及一種選擇標記 寡聚核苷酸。為了操作便利，與人類GPCR連結的密瑪子 突變亦以其標準形式記錄下來。 2. QuikChange™ Site-DirectedTM突變法 製備非内生性人類GPCR亦可使用QuikChangeTM Site、 Directed™突變法套件（Stratagene，依製造手冊的指示）。 模板最好使用一内生性GPCR而兩個突變引子，和上述方 法一樣，最好是離胺酸突變基因寡聚核苷酸，及一種選擇 標記寡聚核苷酸（包含於套件中）。為了操作便利，密碼子 突變連結至此新穎的人類GPCR而且各寡聚核苷酸分別以 標準形式註記。 實例3 受體表現 雖然技藝中有許多種細胞可利用來表現蛋白質，其最佳 者係利用哺乳動物細胞或黑色素細胞。最主要的理由為可 預期之實用性，即當可能使用諸如酵母菌細胞表aGpcR 時’在非哺乳動物細胞中可能沒有包含哺乳動物系統所演 化出的受體偶聯基因機制及訊息傳遞路徑（在酵母菌的例 子中，確實沒有）；因此，以非哺乳動物細胞所得結果， 就算是有可能使用，也不如用哺乳動物細胞或黑色素細胞 所的結果那麼好。雖然依技藝人士所需可選用特別的哺乳 動物細胞，在哺乳動物細胞當中，較佳者是用ch〇、c〇s_ 7、293及293T細胞。關於黑色素細胞請參見下文，包含實 122352.doc -89- 200800009 例8 〇 a. 暫時轉染 ^ 第一天，6χ106個293細胞置於10公分培養盤中。第二 ι 天，準備兩個反應試管（下述每個試管的藥劑量以每個培 養盤為單位）：試管Α由混合4pg DNA混合製備（pCMV載 體；受體cDNA的pCMV載體，等）於0.5毫升無血清 DMEM(Gibco BRL);試管 B 由混合 24pg 脂質體（Gibco BRL)於0·5毫升無血清DMEM。試管A及B倒轉混合（數 ^ 次），隨後在室溫下培養30至45分鐘。混合稱之為”轉染混 合液’’。製成的293細胞以1XPBS清洗，隨後添加5毫升無 血清DMEM。取1毫升的轉染混合液物添加至細胞，在37 °C/5% C02下培養4小時。轉染混合液物以移液管吸出，隨 後添加10毫升DMEM/10%胎牛血清。細胞在37°C/5% C〇2 下培養。經48小時培養後，採收細胞且用以分析。 b. 穩定的細胞株 ^ 12xl06的293細胞置於15公分組織培養盤。在DME高葡 萄糖培養基包含10%胎牛血清及1%丙胺酸鈉，L-麩醯胺酸 及抗生物素。293細胞分盤24小時後（或約達成80%融合）， 細胞使用12 pg DNA轉染。12 pg DNA以60毫升脂質體及2 毫升無血清DME高葡萄糖培養基結合。將培養基從盤中吸 出，且細胞以無血清之培養基清洗一次。DNA，脂、質體， 及培養基混合物添加至僅有10毫升無血清培養基盤中。隨 後在37°C培養4至5小時，將培養基吸出且添加25毫升包含 血清之培養基。轉染24小時後，再次吸出培養基被，且添 122352.doc -90- 200800009 加有血清之新鮮培養基。轉染48小時後，吸出培養基且添 加抗g素（G418藥物）在最終濃度500 μηι/毫升中培養。轉 染細胞選擇出有效轉染包含G4 18抗菌基因的細胞。選擇過 程中，培養基每4至5天更換一次。在選擇期間，細胞成長 形成穩定族群，或再經區分以供穩定選殖篩選。 實例4 GPCR活化測定法 多種方法可利用來測定人類GPCRs活性。下文所述僅為 示實例；熟習本技藝人士應具能力可判斷依其需要最適用 的測定法。 1.細胞膜結合測定法：[35s]gtpys測定法 當G蛋白-偶聯受體在其活化狀態，如配體偶聯或本質性 活化結果，受體與G蛋白偶聯並促進GDP釋放，且隨後將 GTP結合至G蛋白。G蛋白受體化合物的α單元體如GTP水 解酶般作用，且緩慢將GTP水解成GDP，受體正常來說為 不活化。活化的受體持續將GTP換成GDP。不可水解的 GTP類似物（[35S]GTPYS)可被利用來表示[35S]GTPYS與表現 出活化受體之胞膜的結合增加。使用[35S]GTPYS結合來測 量活性的優點為：（a)可通用至全部的G蛋白-偶聯受體； (b)其靠近胞膜表面使其較不容易再獲得會影響細胞内訊息 傳遞的化學分子。 此分析利用G蛋白-偶聯受體刺激[35S]GTP r 8結合至胞 膜上表現出相關受體的能力。因此，此分析可使用於直接 辨識方法針對内生性GPCRs及非内生性本質性活化GPCRs 122352.doc -91 - 200800009 來師選候選化合物。此測定法為通用方法，可應用至針對 所有G蛋白-偶聯受體的藥物開發。
[35S]GTPYS測定法為培養於20福耶哪及以⑼福氯 化鎭間（此里可再調整以取得最佳的結果，雖然別福較 佳）PH 7.4，緩衝液與〇3至12 nM [35s]gtp^(此量可再調 整以取得最佳的結果，雖然12較佳）結合，及12.5至75吨 膜蛋白(此量可再調整以取得最佳的結果）及1〇 μΜ GDp(此 里可再凋整以取得結果）〗小時。接著添加小麥胚芽凝集素 (25 μΐ ; Amersham)且在室溫混合培養3〇分鐘。試管接著以 1 500 X g，室溫下離心5分鐘，且以閃爍計數器計數。 2·腺苷酸環化酶 設計用於以細胞為基礎之測定法所用的Flash piateTM腺 誓酸環化酶套件（新英格蘭中心；Cat· ΝΟ· SMP004A)可經 t飾供使用在未經加工的質體胞膜。Flash piate的培養盤 各孔可包含一閃爍覆蓋層並可包含特別的抗體辨別 cAMP。孔中生成之cAMp可由放射性cAmp追蹤劑與CAMP 抗體結合的直接競逐測得其量。以下提出一簡短程序可用 來測量表現出受體之完整細胞内CAMP濃度的改變。 轉染細胞在暫時轉染後24小時採收。將培養基小心吸出 且丟棄。10毫升PBS緩慢添加至每一盤細胞中再小心吸 出。1毫升Sigma細胞裂解緩衝液及3毫升PBS添加入每一 個培養盤中。將細胞以微量滴管移出培養盤而細胞懸浮液 收集於50毫升圓錐形離心管。細胞接著在室溫下以11〇〇 rpm離心5分鐘。細胞沉澱塊小心再懸浮於足夠量的PBS中 122352.doc -92- 200800009 (約3毫升/盤）。細胞接著使用血球計數並再加入PBS以取 得足夠數量的細胞（最終體積為50 μΐ/盤）。 cAMP標準及檢測緩衝液[包含1 pCi的125IcAMP追蹤劑 (50 μΐ)至11毫升檢測緩衝液中]依製造商的說明書配製並 保持備用。測定缓衝液為即席配置以供篩選使用且包含50 μΐ刺激緩衝液，3 μΐ測試化合物（12 μΜ最終分析濃度）及50 μΐ細胞，測定緩衝液儲存在冰上備用。此測定法是先添加 5 0 μΐ cAMP標準液至適當的孔中，隨後添加50 μΐ PBSA至 Η-ll及Η-12孔。50μ1刺激緩衝液添加至所有孔中。取 DMSO(或選擇的候選化合物）使用能夠分配3 μΐ化合物溶液 的針狀工具添加至適當的孔中，測試化合物最終測定濃度 為12 μΜ而最終測定液總體積為100 μΐ。接著將細胞加入 孔中在室溫下培養60分鐘。100 μΐ包含cAMP追蹤劑的偵測 混合液添加入孔中。培養盤接著再培養2小時後以Wallac MicroBeta閃爍計數器計數。每一孔的cAMP含量可由各 培養盤的標準cAMP曲線推導算出。 3.以細胞為基礎的Gi-偶聯目標GPCRs之cAMP測定法 TSHR為Gs-偶聯GPCR，其在活化時造成cAMP累積。 TSHR若在胺基酸殘基623位置突變將成為本質性活化（將 丙胺酸殘基改成異白胺酸殘基）。一種Gi-偶聯受體應抑制 腺苷環化酶，且，因此，降低cAMP產生量，這就使得 cAMP濃度的測量較困難。一種能效測量cAMP生成量降低 而顯示Gi-偶聯受體之本質性活化的技術可藉由共轉染達 成，其中最好是用一非内生性本質性活化TSHR(TSHR- 122352.doc -93- 200800009 A623 1)(或一種内生性本質性活化Gs-偶聯受體）當做Gi-偶 聯目標GPCR的π訊號增強劑”而得出cAMP濃度基準值。一 旦造出一種非内生性Gi-偶聯受體的轉型，接著將此目標 GPCR的非内生轉型與訊號增強劑共轉染，這就是可以用 來篩檢候選化合物的材料。在一 cAMP測定法中我們將利 用上述方法有效地產生訊號；此方法最好是使用於針對 Gi-偶聯受體直接識別候選化合物。請注意，就一 Gi-偶聯 GPCR而論，當使用此方法時，目標GPCR的反向促效劑將 增加cAMP訊號，且其促效劑將降低cAMP訊號。 第一天，每一孔2χ104個293細胞置於培春盤中。第二 天，準備兩個反應試管（下文中每個試管的藥劑用量以培 養盤為單位）：試管A的製備是將每個受體2 pg DNA轉染到 哺乳動物細胞中，總共為4 pg DNA (例如pCMV載體、帶 有突變之THSR(TSHR-A6231)的 pCMV載體、TSHR-A6231 及 GPCR 等）於 1.2 毫升無血清 DMEM (Irvine Scientific, Irvine，CA);試管B的製備則是混合120μ1脂質體（Gibco BRL)於1.2毫升無血清DMEM。試管A及B由倒轉混合（數 次），隨後在室溫下培養30至45分鐘。混合液稱之為「轉 染混合液」。已分盤的293細胞以IxPBS清洗，隨後添加10 毫升無血清DMEM。2.4毫升的轉染混合液添加至細胞，再 置於37°C /5% C02下培養4小時。轉染混合液物由吸除，隨 後添加25毫升DMEM/10%胎牛血清。細胞在37°C/ 5% C02 下培養。在24小時培養後，採收細胞且用以分析。
Flash Plate™腺苷酸環化酶套件（新英格蘭中心；Cat· 122352.doc -94- 200800009 NO. SMP004A)設計以細胞為主的分析，然而，可依熟知 此技藝人士的需要修飾以使用於未經加工的原生質胞膜。
Flash Plate的培養盤可包含一閃爍體覆蓋層其中也包含可 辨別cAMP的特定抗體》產生於孔中的cAMp可由放射性 cAMP追蹤劑直接競逐要與cAMp抗體結合而測得其量。以 下提出一簡短程序可用來測量表現出受體之完整細胞的 cAMP濃度改變。 轉染細胞在暫時轉染後24小時採收。培養基小心吸出且 丟棄。每一培養盤的細胞緩慢添加1〇毫升pBS再小心吸 除。將1毫升Sigma細胞裂解緩衝液及3毫升pBS添加入每 一個培養盤中。將細胞以微量滴管移出培養盤且將細胞懸 浮液收集於50毫升圓錐形離心管。細胞接著在室溫下以 1100 q>m離心5分鐘。細胞沉澱塊小心再懸浮於足夠體積 的PBS中（約每盤3毫升）。細胞接著使用血球計數且另外添 加PBS以得到足夠數量的細胞（最終體積約為每孔5〇 μ1)。 cAMP標準及檢測緩衝液（包含丨的追蹤劑 [IcAMP(5〇 μ〇]至11毫升檢測緩衝液中）依製造商的說明 曰配I並保持備用。用來師選的測定緩衝液必須即用即配 且包含50 μΐ刺激緩衝液，3 μΐ測試化合物（丨2 μΜ最終測定 、/辰度）及50 μΐ細胞，測定緩衝液置於冰上備用。此測定法 首先添加50 μ1的CAMP標準液至適當的孔，隨後添加5〇 μ1 的PBSA至Η-ll及Η-12孔。50 μΐ刺激緩衝液添加至所有 孔中。將所選擇的化合物（例如TSH)使用能夠分配3 μ1化合 物溶液的針狀工具添加至適當的孔中，達丨2 μΜ最終測定 122352.doc -95- 200800009 濃度的受測北合物及100 μΐ總測定體積。接著加入細胞於 孔中在室溫下培養60分鐘。100 μΐ包含cAMP追蹤劑的偵測 混合液添加入孔中。培養盤接著培養2小時後在Wallac MicroBeta scintillation閃爍計數器中計數。每孔的cAMP數 值可由各個培養盤的標準cAMP曲線推算得知。 4·以報導基因為基礎的測定法 a. CRE-LUC報導基因測定法（Gs相關受體） 293及293T細胞在以每孔2x104細胞的密度分於96培養 盤，隔天根據廠商說明書使用脂質體試劑（Lipofectamine Reagent，BRL)轉染。每6孔轉染製備一種DNA/脂質混合 液，其法如下：：100 μΐ DMEM中260 ng質體DNA和缓與 100 μΐ DMEM中的2 μΐ月旨質混合（該260 ng質體DNA包含 200 ng的8xCRE-Luc報導基因質體，50 ng包含内生性受體 或非内生性受體的pCMV或僅為pCMV，及10 ng GPRS表 現質體（pcDNA3(Clontech)之中的 GPRS)。8xCRE-Luc報導 基因質體製備如下：載體SRIFJ-gal是由在ppgal載體 (Clontech)的BglV-Hindlll位置上選殖大鼠體抑素受體（-71/+51)獲得。腺病毒模板AdpCF126CCRE8以PCR獲得8 份的 cAMP反應元素（見，ifwm㈣ 7:1883 (1996))且在Kpn-BgalV位置選殖插入SRIFJ-gal載體，取 得8xCRE-p-gal報導基因載體。8xCRE-Luc報導基因質體是 將8xCRE-P-gal報導基因載體中的β-半乳糖苷酶基因，代之 以pGL3基本載體（Promega)在Hindlll-BamHI位置上的螢光 素酶。在室溫下培養30分鐘後，將DNA-脂質混合液與400 122352.doc -96- 200800009 μΐ的DMEM稀釋且在每一個孔中添加入100 μΐ的稀釋混合 液。在細胞培養箱培養4小時後，將100 μΐ的DMEM與10% FSC添加入每一個孔中。隔天轉染細胞換上每孔200 μΐ的 DMEM與10% FSC。8小時後，以PBS清洗一次後，又換成 每一孔100 μΐ不含酚紅的DMEM，隔天使用LucLiteTM報導 基因測定套件（Packard)依廠商的說明書測量螢光素酶活 性，且以1450 MicroBetaTM閃爍與螢光計數器（Wallac)讀 取。 b· API報導基因測定法（Gq-相關受體） 有一種偵測Gq刺激量的方法是依靠Gq蛋白相關之磷脂 酶C的已知特性，後者會導致啟動子當中包含API元素的 基因被活化。有一 PathdetectTM AP-1順式報導基因系統 (Stratagene，Catalogue # 219073)可依上文中有關 CREB報 導基因測定法所提出的標準程序運用，不過其中的磷酸鈣 沉澱成份為410 ng pAPl_Luc，80 ng pCMV受體表現質體 及 20 ng CMV-SEAP。 c· SRF-Luc受體分析（Gq-相關受體） 有一種偵測Gq刺激量的方法是依靠Gq-相關之磷脂酶C 的已知特性，後者會導致在其啟動子中包含血清反應因子 的基因被活化。PathdetectTM SRF-Luc報導基因系統 (Stratagene)可用於測定，例如像是COS7細胞中，的Gq-偶 聯活性。細胞是用該系統的質體成份進行轉染，此表現質 體是運用 Mammalian TransfectionTM 套件（Stratagene， Catalogue #200285)依廠商指示而編碼有内生性或非内生 122352.doc -97- 200800009 性 GPCR。簡言之，410 ng SRF-Luc，80 ng pCMV受體表 現質體及20 ng CMV-SEAP(分泌鹼性磷酸酶表現質體；測 量轉染細胞培養基當中的驗性構酸酶活性以控制各樣品的 轉染效率）如操作說明書所示在混合後以磷酸鈣沉澱物析 出。將一半的沉澱物平均分配在96孔培養盤上的三3孔 中，保持細胞於無血清培養基24小時。在最後5小時，依 指示在某些孔中加入1 pMjk管收縮素培養。接著將細胞酶 解並使用 Luclite™ 套件（Packard，Cat.#6016911)及"Trilux 1450 體閃爍與螢光計數器（Wallac)如廠商之 操作說明測定其螢光素酶活性。所得數據可由GraphPad PrismTM2.0a(Graphpad Software Inc.)分析。 細胞内IP3累積分析（Gq相關受體） 第一天，包含受體（内生性及/非内生性）的細胞分盤於24 孔培養盤，一般為每孔1x105個細胞（此數目尚可最佳化整 調）。第二天，細胞首先以每孔50μ1無血清DMEM之中的 0.25 pg DNA及每孔50 μΐ無血清DMEM之中的2 μΐ脂質體 混合以進行轉染。混合液溫和攪拌且在室溫培養15至30分 鐘。細胞以0.5毫升PBS及400 μΐ無血清培養基清洗再與轉 染培養基混合且添加入細胞中。細胞接著在37°C/5% C02 下培養3至4小時，然後把轉染培養基移除且代之以每孔1 毫升的一般成長培養基。第三天，細胞以3H-myo-肌醇標 記。簡言之，先將培養基移除且以0 ·5毫升PB S清洗細胞。 接著添加每孔0.5毫升無肌醇無血清培養基（GIBCO BRL)以 及每孔0.25 pCi的3H-myo-肌醇，且細胞在37°C/5°/〇 C02下 122352.doc -98- 200800009 培養16至18小時。第四天，細胞以0·5毫升PBs清洗且添加 〇·45毫升包含無肌醇無血清培養基1〇 μΜ巴吉林（pargyline)， • 10 m]V^化經或〇·4毫升測定培養基以及及50μ1 1〇χ酮色林 (ket)至最終濃度為10 μΜ。細胞接著在37°C培養30分鐘。 細胞接著添加每孔〇·5毫升PBS及200 μ1新鮮/冰過的冷停止 溶液（1 Μ氫氧化鉀；硼酸鈉；3.8 mM EDTA)。溶液 置於冰上5至10分鐘或直到細胞被酶解，接著以2〇〇 新 _ 鮮/冰過的冷中和溶液中和（75%鹽酸）。然後把溶胞產物移 入1 ·5毫升微量離心管並在每根試管中添加丨毫升氯仿/甲醇 (1 : 2)。溶液離心15秒取上清液用Bi〇ead α〇^Χ8τμ離子 父換feM日（100至200孔徑）。首先，樹脂以1 : ι·25 w/V的水 清洗，再將0.9¾升上清液裝入管柱中。管柱以5 mM my〇一 肌醇10毫升及5 mM爛酸納/60 mM甲酸鈉1 〇毫升清洗。以 二填酸肌醇洗提放進裝有1〇毫升包含2毫升〇1 M曱酸Η Μ 甲酸銨之閃爍劑混合液的閃爍計數瓶。管柱之再生可用1〇 • 笔升0^ Μ甲酸/3 Μ甲酸銨清洗且以去離子蒸餾水浸潤2次 並儲存於4°C水中。 實例5 融合蛋白製備 a· GPCR : Gs融合構築體 本質性活化GPCR與G蛋白融合構築體設計以下述方法達 成：大鼠G蛋白Gscx的5,及3|末端（長結構；祕，H等人，83 PiVM 3776 (1986))經加工均包含一 mndm序列（5，_ AAGCTT-3’）。確認其為正確序列後（包含兩側嵌入的 122352.doc -99- 200800009
Hindlll序列），全部序列運用 pcDNA3.1(-)(Invitrogen，cat· No. V795-20)的Hindlll限制位點次選殖進入該載體中。 Gsa序列正確的方向在次選殖進入pcDNA3.1(-)後測量。接 著再確認經過修飾之pcDNA3.1(-)在Hindlll序列包含大鼠 Gsoi基因；此載體可當做是「通用」Gscx蛋白載體。 PcDNA3.1(-)載體在Hindlll位置上游包含多種已知的限制 位點，因此更有能力在Gs蛋白上游處提供嵌入内生性本質 性活化GPCR編碼序列。相同的方法可利用來製成其他”通 用％蛋白載體，當然，其他技藝人士所曉得的市面可得載 體或專屬載體均利用於此一重要的標準為GPCR序列位於G 蛋白上游處且在同一讀框中。 b. Gq(6胺基酸删除）/Gi融合構築體
Gq(del)/Gi融合構築體的設計可依下述步驟完成：N端6 胺基酸（胺基酸2至7)，具TLESIM Gaq-次單元體的序列將 被刪除；且C端5胺基酸，具EYNLV的序列將以對應為Gai 蛋白具DCGLF序列胺基酸取代。融合構築體可使用下列引 子以PCR獲得： 5、gatcAAGCTTCCATGGCGTGCTGCCTGAGCGAGGAG -3’（序列識別號：9)及 5f-gatcGGATCCTTAGAACAGGCCGCAGTCCTTCAGGTTC AGCTGCAGGATGGTG靖3’（序列識別號：10) 並以包含帶有紅血球凝集素標記的小鼠野生型Gaq之質 體633 13做為模板。低位末端蓋的核苷酸也被包含進來當 做間隔。 122352.doc -100- 200800009
TaqPlus Precision DNA 聚合酶（Stratagene)將用於以下的 放大程序，其循環條件為：步驟2至4重複35次：95°C2分 • 鐘；95°C 20 秒；56°C 20 秒；72°C 2 分鐘；及 72°C 7 分鐘。 PCR產物將選殖於pCRII-TOPO載體（Invitrogen)，並使用 ABI Big Dye Terminator套件（Ρ·Ε· Biosystems)定出序列。 從包含融合構築體片段的TOPO選殖嵌入物將用2個步驟的 選殖程序送入表現載體pcDNA3.1(+)的Hindll/BamHI位 置。同時請參考，PCT申請編號PCT/US02/05625，公告為 W002068600，2002年9月6日，揭示於此均以其整體作為 參考。 實例6 標準程序：反向促效劑與促效劑的直接識別 A. [35S]GTPyS測定法
在一些具體實施例中，内生性GPCR將被用來直接識別 候選化合物是否為促效劑或拮抗劑。在一些具體實施例 φ 中，内生性本質性活化GPCR或非内生性本質性活化GPCR 被利用來直接識別候選化合物是否為反向促效劑或促效 劑。在一些具體實施例中，包含内生性本質性活化GPCR 或非内生性本質性活化GPCR的GPCR融合蛋白將被利用來 直接識別候選化合物是否為反向促效劑。在上述之具體實 施例中，該直接識別是用以下所提出的標準程序。 細胞膜製備 在一些具體實施例中，細胞膜包含所要用的GPCR/融合 蛋白且用以直接識別候選化合物是否為反向促效劑、促效 122352.doc -101 - 200800009 劑或拮抗劑，其較佳製備法如下： a. 材料 「細胞膜刮除緩衝潘
1打履」包含20 mM HEPES及1〇 mM EDTA ’ ρΗ7·4 ; 「胞膜、、主冰於， 、/月洗緩衝液」包含2〇 mM HEPES及 0·1 mM EDTA，ph 7 4 · 「
4 ’ 結合緩衝液」包含20 mM HEPES及 lOOmM氣化铷 β ! A x 虱化鈉及10 mlV[氯化鎂，ρΗ 7·4。 b. 過程 全部的材料在整個過裎φ ❿枉甲皆置於冰上。首先，將聚合之 單層、、、田胞的培養基吸出，隨後以㈣升冰冷的ρ耶浸潤， 再吸出。此後’添加5毫升胞臈刮除緩衝液將以刮除細 胞；再將細胞萃取物移至5〇毫升離心管中（在代，2〇〇〇〇 啊離心17分鐘卜然後，將上清液吸出，沉澱塊再次懸浮 於3〇毫升膜清洗缓衝液中並在4。。，2〇〇〇〇啊離心㈣ 鐘。將上清液吸出，沉澱塊再次懸浮於緩衝液中。接著使 用Brinkman PGlytrGnTN^ f機均f (i 5至2()秒㈣多次直到 全部材料均懸浮於液中）。此液在此稱之為"膜蛋白"。 Bradford蛋白質測定法 在均質後，胞膜的蛋白質濃度將由Bradford蛋白質測定 法測出（蛋白質稀釋至！·5毫克/毫升，能整除且冷朴8〇。〇 待務後使用；當冷;東，使用如下標準程序：在分析當天， 冷凍的膜蛋白在室溫下融化，隨後以p〇lytr〇nwi2xl〇〇〇 —轉動且均質5至10分鐘；其值得注意的是若要多次製備 均質機必需在不同的製備程序間先完全清理乾淨。 a.材料 122352.doc -102 · 200800009 依廠商提供之操作說明書（Biorad，cat. No. 500-0006)， 尚會用到結合缓衝液（如上述）；Bradford染劑；Bradfore蛋 白質標準液。 b.過程 準備相同的試管，一個包含胞膜，另一個”空白”做為對 照組。每一試管包含80〇 μ1結合緩衝液。然後，將1〇 μ1 Bradford蛋白質標準液（1毫克/毫升）添加至每一個試管，再 來是將10 μΐ膜蛋白添加至某一管（可不是空白管）。此後， 將200 μΐ Bradford染劑添加至每一管中，均經渦流攪拌。5 分鐘後，將試管再經渦流攪拌且將物質轉移至比色管中。 將比色官用CECIL3041分光光度計，在波長595下讀取。 直接識別分析 a.材料 包含37·5宅升結合緩衝液及2毫克GDP(signia，cat. No. G-7127)的GDP緩衝液，經結合緩衝液連續稀釋成為〇·2 _ μΜ GDP(每孔的最終GDP濃度為〇1 μΜ的GDp);每一個孔 包含一種候選化合物，最終體積為2〇〇 μ1，包含1〇〇 y 緩衝液（最終，辰度，〇. 1 GDP)，50μ1溶於結合緩衝 液中的膜蛋白及5〇 μΐ溶於結合緩衝液中之[35s]GTF^s (〇·6 ηΜ)(母l〇毫升結合緩衝液有2·5 y [35s]GTp丫s)。 b ·過程 候選化合物最好使用96孔的培養盤進行篩檢（其可以冷 東至8〇 C )。膜蛋白（或不含GPCR融合蛋白表現載體的胞 膜做為對照組），經快速均質直到懸浮於溶液中。蛋白 122352.doc -103- 200800009 質濃度將使用上文所述之Bradford蛋白質測定法。接著將 膜蛋白（及對照組）稀釋於結合緩衝液直到0.25毫克/毫升（最 終分析濃度為每一孔12.5 gg)。接下來以一種5 μΐ針狀工具 用來轉移5 μΐ候選化合物至每一孔（即5 μΐ於200 μΐ總分析 體積，比例為1 : 40，因此最終候選化合物的篩檢濃度為 10 μΜ)。同樣的，為避免污染，在每一個轉移步驟後，針 狀工具將以裝有水（IX)，乙醇（IX)及水（2Χ)的三個儲液清 洗---清洗後將多餘液體從工具上甩掉並以紙或紙巾擦 乾。此後，將50μ1膜蛋白添加至每一孔（同時也有用到一 包含胞膜而沒有GPCR融合蛋白的對照組孔），且在室溫下 預先培養5至10分鐘。此後，將溶於結合緩衝液中的 [35S]GTPyS 50 μ1(0·6 nM)添加至每一孔，隨後在室溫下 置於震盪器培養60分鐘（同樣地，在此實例中，將培養盤 以鋁箔覆蓋）。測定程序的終止是將培養盤在22°C，4000 rpm轉動15分鐘。將培養盤以與8通道多管移液器吸除且以 培養盤的蓋子密封。將培養盤使用Wallac 1450 設定（如廠商說明書所示）讀取。 B.環單磷酸腺苷測定 另一個直接辨識屬選化合物是否為反向促效劑，促效 劑，或拮抗劑的方法，是利用以環化酶為基礎的測定法。 除了可用來直接識別，此測定法可當做是上述[35S]GTPyS 測定法所得結果的獨立確認方式。 本測定法最好利用一種經修改的Flash 苷環化 酶套件（New England Nuclear; Cat· No· SMP004A)以直接 122352.doc -104 - 200800009 識別候選化合物是否為内生性或本質性活化GPCR的反向 促效劑或促效劑，其方法如下列標準程序所述。 - 轉染細胞在轉染後3天採收。胞膜的製備是將細胞均質 懸浮在包含20 mM HEPES，pH 7.4，及10 mM氯化鎂溶液 中。均質最好在冰上使用Brinkman PolytroiiTM約10秒。產 生的均質物再經4°C，49000X克下離心15分鐘。所得沉澱 塊接著再次懸浮於含有20mMHEPE，pH7.4及0·lmM EDTA溶液中，均質10秒，隨後在4°C，49000X克下離心15 分鐘。所得沉澱塊接著儲存於-80 °C備用。直接辨識篩檢 當天，將胞膜沉澱塊在室溫下緩慢融化，再次懸浮於含20 mM HEPES，pH 7.4，及10 mM氯化鎂溶液中以達成最終 蛋白質濃度為每毫升0.60毫克（懸浮胞膜溶液置於冰上備 用）。 cAMP標準緩衝液及測定缓衝液[包含2 pCi追蹤劑1251 cAMP(100 μΐ)於11毫升測定缓衝液]依廠商之操作說明製 φ 備及儲存。測定緩衝液為進行篩檢時才配製且包含20 mM HEPES，pH 7·4，10 mM 氯化鎂，20 mM磷酸肌酸 (Sigma)，0.1單位/毫升肌胺酸構酸轉移酶（Sigma)，50 μΜ GTP(Sigma)，及0.2 mM ATP(Sigma)。測定緩衝液接著儲 存於冰中備用。 取一最好為96孔的培養盤，將候選化合物（若冷凍，在 室溫下融化）添加（3 μΐ/孔；12 μΜ最終測定濃度），與40 μΐ 膜蛋白（30 pg/孔）及50μ1測定緩衝液。混合溶液在室溫下 伴隨輕微振盪培養30分鐘。 122352.doc -105- 200800009 培養後，100 μΐ測定偵測缓衝液添加至每—個孔中，隨 後培養2至24小時。培養盤使用—n μ__τμ培:
盤讀取儀的释序，，prot.#31"(如操作說明）讀取其數值。° x 舉例來說但不僅限於此，一示範性的筛檢測定培養盤 (96孔）所得結果可見於圖。每—線段代表各孔中不同化 合物所測得結果，「目標受體」為一内生性本質性活化 Gs-偶聯蛋白GPCR的Gsa融合蛋白構築體。在圖工中示範的 結果亦提供每一培養盤(”m”)結果的平均值以&兩偏好的 判斷標準，此初步篩檢要選出反向促效劑時的"領先者"， 所選出候選化合物其反應百分率的降低至少達平均值再減 去2個標準差。反之，此初步篩檢要選出促效劑時的"領先 者"所選出的候選化合物其反應百分率的增加至少達到平 均值加再上2個標準差。基於上述選擇程序，下述孔中的 候選化合物直接識別為針對該内生性GpCR推定的反向促 效劑（化合物A)及促效劑（化合物B)，分別對應於孔A2及孔 G9。見圖1。明白來說，需知：這些化合物的直接辨識並 不需對此GPCR的内生性配體有任何了解。將測定技術以 文體的功能為基礎，而非化合物的_偶聯親合度，我們能 夠同時弄清那些化合物能降低此受體功能活性（化合物A) 又看那些會增加受體功能活性（化合物B)。 實例7 測量細胞内鈣濃度的螢光影像培養盤讀取機（flipr) 目標受體（實驗組）及pCMV(反向控制組）的穩定轉染細胞 分別由其轉殖細胞株中取出以每孔5·5χ1〇4細胞的數量植於 122352.doc -106— 200800009 預鍍有聚-D-離胺酸的96孔培養盤（Becton-Dickinson， #3 56640)再加入培養基（含有1〇%卩68的〇]^£]^，2 111]^1^ 麩胺酸，ImM丙酮酸鈉）以作為隔天測定用。製備Fluo4-AM(Molecular Probe，#F14202)培養缓衝液的儲液，將1毫 克 Fluo4-AM 溶解於 467 μΐ DMSO 及 467 μΐ Pluoronic acid(Molecular Probe，#P3000)以得到 1 mM儲液，其可以 儲存於-20°C —個月。Fluo4-AM為螢光鈣指示染劑。 候選化合物製備於清洗缓衝液中（IX HBSS/2.5 mM Probenicid/20 mM HEPES，pH 7.4) 〇 在分析時，將培養基從孔中移除且在細胞中加入100 μΐ 之 4μΜ Fluo4-AM、2·5 mM羧苯磺胺（Sigma，#P8761)、20 mM HEPES，成為pH 7·4的培養基。培養於37°C/5% C02 60分鐘。 在培養1小時後，將Fluo4-AM培養液移除並把細胞以 1 00 μΐ清洗缓衝液清洗兩次。每一孔中留下100 μΐ清洗缓 衝液。培養盤再次培養於37°C/5% C02 60分鐘。 FLIPR(螢光影像培養盤讀取機；Molecular Device)的設 定是要在第30秒添加50 μΐ候選化合物，且記錄由候選化合 物所引起細胞内鈣濃度（[Ca2+])的即時改變共達150秒。總 螢光改變的計數是用FLIPR軟體判定促效劑活性。儀器的 軟體會將螢光讀數常規化使得其起始讀數都是從〇開始。 在一些具體實施例中，包含目標受體的細胞進一步包含 不具專一性的G α 15/16或變異的Gq/Gi α次單位。 雖然前文提供一種使用穩定轉染細胞的促效劑活性 122352.doc 107- 200800009 FLIPR分析，熟習此技藝者應能針對拮抗劑活化的特性修 改此測定法。熟悉此項技術者也應能體會，或可換用暫時 轉染的細胞。 實例8 黑色素細胞技術 黑色素細胞為低等脊椎動物的皮膚細胞。其包含具有色 素的胞器稱之為黑色素體。黑色素細胞能夠靠G蛋白-偶聯 受體（GPCR)活化微管網狀物上再分散這些黑色素。這些色 素移動的結果為細胞外觀變亮或變暗。在黑色素細胞中， 因Gi-偶聯受體活化所導致降低細胞内camp濃度下降會造 成黑色素體移動至細胞中央，造成其顏色急劇變亮。若接 下來隨著Gs-偶聯受體的活化CAMP量上升，黑色素體會再 分散且細胞看起又變暗。Gq-偶聯受體活化產生的二醯甘 油濃度增加亦可引起黑色素體再分散。另外，此技術液適 合研究某些受體酪胺酸激酶。黑色素細胞的反應在受體活 化後幾分鐘就生成，且產生簡單、持久之顏色改變。此反 應可使用常見吸光度微量讀取器或適當的錄影成像系統輕 鬆測得。不像其他皮膚細胞，黑色素細胞是由神經胚分化 而得且似乎表現為訊號蛋白質的完全補體。尤其是細胞表 現出相當多種的G蛋白，也就能夠在功能上表現所有的 GPCR 〇 黑色素細胞可用來針對GPcr辨識化合物，包含其天然 配體。此方法可藉由引進黑色素細胞株的測試細胞達成， 其能夠因應一特定刺激分散或聚集它們的色素同時可表現 122352.doc 200800009 出该GCPR的外生之選殖編碼序列。刺激劑（例如褪黑激素） 可以设定色素配置的最初狀態，其中若該GPCr會引發色 素聚集’色素會聚集在該測試細胞内。相反地，假設該 GPCR的活性引發色素聚集，為了引起色素分散，可以利 用黑促素來設定一色素配置的最初狀態，其色素分散開 來。之後將該測試細胞與化合物接觸，以及測定是否在該 細胞中色素的配置與該色素配置的最初狀態有任何變化。 候選化合物，包括，但不限於，配體，若能連結該GpCR 並導致色素的分散，將在該培養皿上呈現深色，而色素的 聚集將使培養m呈現淡色。 隨後所敘述的材料與方法是依據美國專利編號5462856 及美國專利編號6051387所揭示。這些專利揭示於此以其 整體列為參考。 將細胞置於9 6孔培養盤（每盤一種受體）。轉染4 8小時 後’在每一培養盤上一半的細胞以10 nM褪黑激素處理。 褪黑激素活化一種黑色素細胞之内生性Gi-偶聯受體，且 造成其色素聚集。其餘另一半的細胞則換用無血清培養基 0.7X L-15(Gobco)。一小時後，在無血清培養基中的細胞 保持在色素分散狀態，同時黑色素治療細胞是在色素聚集 狀態。此時，細胞以一反應劑量的候選化合物處理。若般 中的GPCRs與候選化合物結合，黑色素細胞表現應會對化 合物做出反應而改變顏色。若受體為Gs或Gq-偶聯受體^， 且若候選化合物為促效劑’那麼黑色素聚集之黑色素細於 將經歷色素分散。相反的，若受體為Gi-偶聯受體，且若 122352.doc -109 - 200800009 候選化合物為促效劑，那麼色素分散細胞應會經歷一種與 劑量相關的色素聚集。 實例9 人類RUP41組織分布 A. AFFYMETRIX GENECHIP®技術 胺基酸序列送交Affymetrix公司使用GeneChip®技術設 計並製造包含寡聚核苷酸微陣列以監測G蛋白-偶聯受體 (GPCRs)的表現。在微陣列上還含有從Harvard Brain Band 或其他市場上可得的特殊人類腦組織探針。RNA樣品經放 大，標記並雜合至微陣列，且依廠商的操作說明分析數 據。 使用GeneChip，要測的是人類RUP41表現圖譜。見圖 2A。圖2A為在多種組織中人類RUP41表現量的圖示。檢視 此圖顯示出RUP41表現於腦及心臟中。除腦部的組織以 外，RUP41選擇性表現於心臟。RUP41選擇表現使得對 RUP41的調節所導致不良副作用的機會減少。 墨點測定法（圖2B)及北方墨潰測定法（圖2C)所得結果與 GeneChip的結果一致。
B. RT-PCR RT-PCR是用來測人類RUP41表現。所用寡聚核苷酸為 RUP41特有’並且用cDNA為模板。依廠商的指示，運用
Taq DNA聚合酶（Stratagene)放大一 4〇μ1的反應。PCR循環 條件為9 6 C 2分鐘’隨後是3 0循環的9 6 °c 3 0秒，5 5 °C 3 0秒 及72°C 2分鐘’再經72°C 10分鐘。將2〇μ1反應物裝載於 122352.doc -110- 200800009 1.5%洋菜膠以分析RT-PCR產物。 5’PCR引子序列： . 5’-GTAATAATTGCCCTCCGGCGAGC-3,(序列識別號：11)。 ^ 3TCR引子序列： 5，-CTAGTCTGTGACAACCTGAGG-3’（序列識別號：12)。 放大的DNA片段長度為390鹼基對。 舉例來說，人類RUP41的RT-PCR顯示於圖7，充血性心 衰竭病人心臟組織的RUP41表現與心臟功能正常之病人的 • 心臟組織RUP41表現作比較。 熟悉本技藝者應有能力對小鼠RUP41及大鼠RUP41如上 所述施行RT-PCR。 C.北方墨潰測定法 人類RUP41表現的北方墨潰測定法可由熟悉本技藝者所 通曉的程序達成。相當於序列識別號：1核苷酸1 104-1538 的人類RUP4 1編碼區域片段被當探針使用。 春 實例10 原位雜交：成年大鼠心臟RUP41表現 原位雜父顯不成年大鼠心臟的大區域心肌表現（見第二 圖）。反意的RUP41放射性標籤探針偵測出所有心臟腔室内 都表現出RUP41。還有些額外的切片用反意的對照 (GAPDH)及心房特異（心房例鈉因子，ANF)探針以顯示出 這些心臟切片對此探針具專一性。 原位雜交 固定的心臟組織浸於50 : 50的OCT混合液：Aqua 122352.doc -111 - 200800009
Mount(VWR，#41799-008，West Chester，PA)且冷;東於乾 冰/乙醇中。塊狀物保持在-80°C直到進行冷凝切片，此時 將製備10微米的連續切片。待冷凝切片後，組織切片儲存 在在細胞培養玻片中置於-20°C。 大鼠RUP41序列識別號：6的聚核苷酸次選殖進入 PCRII-TOPO 載體（Invitrogen，Carlsbad，CA)前後分別為 SP6 及T7啟動子。與序列識別號：6聚核苷酸互補的[35S]-放射 性標記反義大鼠RUP41 mRNA探針使用Promega RiboProbe 轉錄套件（#P1460 ; Madison，WI)之SP6 RNA聚合酶製備， 依廠商之說明書操作。對照的放射性標記有意股探針使用 T7RNA聚合酶依前法製備。 固定的組織切片解凍且立即在室溫下進行一系列的固定 後之細胞培養：PBS 3分鐘；10%福馬林1〇分鐘；PBS 10 分鐘；及PBS 10分鐘。 組織切片接著提供至穿透作用及乙醯作用。為此，將組 織切片培養於κ蛋白酶（0.001% κ蛋白酶於0·5 M Tris， 0.25 M EDTA，pH 8.0)在37°C下1〇分鐘，隨後在室溫下以 水清洗5分鐘。組織切片接著在室溫下以三乙醇胺緩衝液 (0.1 M TEA，pH 8.0)作用5分鐘，隨後在室溫下以溶於0_1 M TEA pH 8.0的2.5%醋酸酐培養5分鐘。組織切片接著在 室溫下以2X SSC ; 50%乙醇；95%乙醇；及100%乙醇各作 用2分鐘。接著將組織切片風乾且保持乾燥直到後隔天進 行雜交。 組織切片的雜交是在每一切片80至100 μΐ之0.47 Μ氯化 122352.doc -112- 200800009 鈉，54%甲醯胺於60°C下進行20小時。放射性標記探針用 量為IxlO7 cpm/毫升。組織切片接著以4X SSC在室溫下清 洗4次，每次10分鐘。未雜交探針在以RNase A(20 pg/毫升 於 0.5 Μ氯化鈉，10 mM Tris，1 mM EDTA，pH8)在 37°C 酶解30分鐘。組織切片接著以2X SSC在室溫下清洗2次， 每次5分鐘，隨後以IX SSC在室溫下清洗10分鐘，隨後以 0.5X SSC在室溫下清洗10鐘。接著組織切片再以〇·1Χ SSC 在65°C下清洗30鐘，隨後以0_1X SSC在室溫下清洗5鐘， 隨後以酒精脫水。 經歷雜交的組織切片接著對X光底片感光且RUP41雜交 訊號可由自動放射照相術呈現。為此，將組織切片以 Biomax MR底片感光1天，4天，及皆著1星期。在自動放 射照相後，將組織切片使用NTB-2液體感光乳膠（VWR， #IB1654433，West Chester，PA)浸泡。乳膠浸泡過的組織 切片在該乳膠感光1星期後將之顯影。在顯影後’組織切 片以螢光染劑（1^3七81^111^(16，0.001%於？68)對比染色並加 蓋。組織切片使用暗視野聚光鏡（銀顆粒顯現白色）及DAPI 螢光濾鏡（觀察螢光染劑的對比染色）照相。 對由部份大鼠GAPDH序列及心房利鈉因子（ANF)所得之 雜交探針也用相同的方法。 實例11 在肥大的新生大鼠心室心肌細胞中RUP41之向下調控 新生大鼠心室心肌細胞（NRVMs)如前文所描述方法製備 (請参 Adams，JW等人，J Biol Chem (1996) 271 : 1179- 122352.doc 113- 200800009 86 ;揭示於此均以其整體作為參考）。簡言之，心臟由1至 2天齡的Sprague_Dawley系新生大鼠獲得且以膠原酶酶 解，心肌細胞以通過Percoll梯度純化。將細胞分置於預先 覆有0.1%明膠的組織培養盤，在4 : lDMEM/medium-199 中保持過夜並另加1 〇%馬血清，5%新生牛血清，及抗體 (100單位/毫升盤尼西林及100 pg/毫升鏈黴素）。在培養基 中18小時後，心肌細胞以維持培養基清洗（DMEM/medium-199加抗菌素）以移除死細胞及雜物且在實驗期間時常換新 維持培養基。 圖4A。RT-PCR顯示新生鼠心室心肌細胞（NRVMs)保持 在無血清情況下24小時的RUP41轉錄表現。RUP41轉錄量 在添加脫羥腎上腺素（PE)或新生牛血清（NCS)至培養基後 24小時急劇下降，且與肥大的表現型有關。脫羥腎上腺素 用量為100 μΜ(再加2 μΜ以阻斷β腎上腺素受體，且因此允 許選擇性活化α腎上腺素受體）。新生牛血清用量為10%。 G3PDH PCR產物顯示PCR反應中使用相同量之模板及電泳 上樣量的一致性。
RT-PCR 如上所述從NRVMs分離的全部RNΑ當做模板用來製造反 向轉錄 DNA(RT-DNA)，用 PCR套件的 RT(Becton Dickenson) 依廠商的說明操作。在PCR所產出的RT-DNA樣品可偵測 得RUP41表現。PCR循環條件為96°C2分鐘，隨後96°C30 秒，55°C 30秒及72°C 2分鐘30循環，隨後72°C 10分鐘^ 20 μΐ反應物加在1.5%洋菜膠以分析RT-PCR產物。 122352.doc -114- 200800009 5’PCR引子具以下序列： 5，-GTAATAATTGCCCTCCGGCGAGC-3,(序列識別號：11)。 3*PCR引子具以下序列： 5’-CTAGTCTGTGACAACCTGAGG-3’(序列識別號：12)。 放大的DNA片段有390鹼基對。 圖4B。北方墨潰測定法顯示，經過24小時以增肥劑治 療，其包含脫羥腎上腺素（PE)，巴豆酯-12肉豆寇酸-13醋 酸（PMA)，前列腺素F2a(PGF2a)，及新生小牛血清 (NCS)，表現於NRVMs的RUP41程度降低。脫羥腎上腺素 使用100 μΜ(加2 μΜ以阻斷β腎上腺受體，且因此允許選擇 性活化a腎上腺受體）。巴豆酯-12肉豆寇酸-13醋酸使用 ΙΟΟηΜ。前列腺素F2a使用1 μΜ。新生牛血清使用10%。 心房利鈉因子（ANF)，一種會對所有肥大刺激均有反應心 肌細胞肥大之基因標記為向上調節。28S rRNA的曱烯藍染 色顯示RNA完整性及電泳上樣量的一致性。 北方墨潰分析 1-2天齡的大鼠（SD)心房心肌細胞（NRVMs)分離且如上 所述分於培養盤上。經過多樣處理，總RNA依廠商說明用 Trizol試劑（Invitrogen)分離。15毫克的總RNA在含甲醛的 洋菜膠上用電泳方式分離且轉移至PVDF胞膜（Amersham)。 相當於序列識別號：6之核苷酸53-488的大鼠RUP41編碼區 片段被使用做為北方墨潰分析的探針。32P標記探針使用 標準方法製成且在55°C雜交至細胞膜上。將細胞膜在高嚴 格度條件下清洗且在-80°C以X光底片感光2-4天。 122352.doc -115- 200800009 實例12 受到血壓過度負荷心肌肥大之小鼠心臟中RUP41之向下調 々々 即 圖5，上圖。在：壓過度負荷所引發的心肌肥大之小鼠 活體模式中，其RUP41 mRNA向下調節。北方墨潰分析是 對橫向大動脈緊縮（TAC)或經模擬手術小鼠（Sham)取得之 左心室中分離的全部RNA連續測7天。ANF表現的增加顯 示在TAC心臟中確實有肥大的反應。28S t*RNA甲烯藍染色 顯示此RNA之完整性及電泳上樣量的一致性。相當於序列 識別號：4核苷酸775-1269的小鼠RUP41編碼區片段被當作 北方墨潰分析的探針。32P標記探針使用標準方法製成且 在55°C雜交至細胞膜上。細胞膜在高嚴格度條件下清洗且 在-80°C以X光底片感光2-4天。 圖5，下圖。RUP41訊號以濃度儀測量並以rRNA訊號正 規化所得數據。*以Anova統計分析6 隻模擬手術小鼠 (Sham)及6隻TAC樣品顯示出RUP41 mRNA顯著降低， Ρ<0·00005 〇 橫向大動脈緊縮（TAC) 小鼠的橫向大動脈緊縮手術之實行如前人述（Rockman等 人，Proc Natl Acad Sci. 1991 9 月 15 日；88(18) : 8277-81)。簡言之，8週齡小鼠（C57/BL6)以 Ketamine 及 xylazine 混合物麻醉。在解剖顯微鏡下，以顯微手術進行頸中線切 開使氣管及頸動脈露出。順利在氣管内插管後，插管連接 至傷齒類循環換氣機（volume cycled rodent ventilator， 122352.doc -116- 200800009
Harvard Apparatus)，氧氣以0·2毫升潮氣量供應且呼吸率 為每分鐘110次。以一個小切口在左上胸骨邊緣穿過進入 . 第二肋間的胸腔，大動脈緊縮手術以下述方法達成··以Τ ο尼龍缝合線在 27號針上 打結產 生一個 0.4公 釐直徑 的緊縮 環，將針移除後得到一 65%到70%的大動脈緊縮。大動脈 綁上之後隨後排空氣胸，將動物拔管並令其復原。 實例13 受到缺氧之NRVM中RUP41之向下調節 • 北方墨潰分析結果顯示，在患有組織缺氧NRVMs之後6 小時所分離的總RNA中RUP41的mRNA濃度減少（圖6)。 在缺氧後回氧24小時（H6/R24)後RUP41的mRNA恢復至對 照（正常）值。c-fos表現（Hypox-6)增加顯示心肌細胞對缺氧 狀況出現壓力反應。28S rRNA甲烯藍染色顯示此RNA之完 整性及電泳上樣量之一致性。對應於序列識別號：6核苷 酸53-488的大鼠RUP41編碼區片段被當作北方墨潰分析的 φ 探針。32P標籤探針使用標準方法產生且在55 °C雜交至胞 膜上。胞膜在高嚴格度條件下清洗且在-80°C以X光底片感 光2-4天。 NRVM之組織缺氧作法描述於Van Heugten等人，J Mol Cell Cardiol (1994) 26 : 1513-24，揭示於此均以其整體作 為參考。簡言之，組織缺氧是使用密閉培養箱灌入92%N2 及5%C02達成。在缺氧處置達所要求的時間後，將細胞從 培養箱中取出至環境空氣中且將無血清DMEM/F12培養基 更新。見實例17。 122352.doc -117- 200800009 實例14 在有充血性心衰竭之人類中RUP41之向下調節 圖7A。RT-PCR是以人類心臟分離之總RNA進行。充血 性心衰竭（CHF)病人RNA中的RUP41轉錄量較正常心臟功 能（正常）病人為低。人類GAPDH引子添加至每一個PCR反 應做為模板濃度及電泳結果一致性的内部控制。 圖7B。* Anova統計分析顯示在CHF病人的RUP41轉錄較 正常病人顯著降低，ρ<〇·〇5。心肌梗塞（MI)病人的RUP41 轉錄量與正常心臟並無不同。 人類心臟疾病樣本 RT-PCR(其方法如上述）針對市面可得（Clinomics)經診斷 為以下數種心臟之屍體解剖而取得的總RNA進行：正常心 臟功能，充血性心衰竭（CHF)，及心肌梗塞（MI)。每一組 内RUP41表現的相對量在對GAPDH内部對照組進行正規化 後判定。 實例15 在COS-7細胞中Gi的RUP41偶聯 圖 8，上圖。COS-7細胞與 pCMV-HARUP41(HA-RUP41) 或pCMV-HA骨幹（CMV)，以及本質性活化的Gs偶聯甲狀 腺刺激荷爾蒙受體（PCMV-TSHR-A6231)共轉染。 (HARUP41即紅血球凝集素（HA)-標記RUP41)。另外， CRE-螢光酵素酶報導基因構築體共轉染以測定百日咳毒素 (PTX)存在或不存在時的cAMP活化路徑。同時表現CART-TSHR及HARUP41的細胞其螢光酵素酶報導基因活性較同 122352.doc -118- 200800009 時表就C ART-TSHR及pCMV-HA的細胞之對照組低，可推 測RUP41與Gi偶聯。經RUP41與PTX處理而抑制cAMP降低 則證實Gi與此受體偶聯。 圖8，下圖。在百日咳毒素（PTX)存在或不存在的情況 下，以 pCMV-HA(CMV)或 pCMV-HARUP41(HA-RUP41)構 築體共轉染的COS-7細胞。Forskolin(lpM)刺激cAMP量的 增加會被RUP41表現抑制。經PTX處理之RUP41的cAMP降 低被抑制，證實Gi與此受體結合。 RUP41載體的構成 將序列識別號·· 3之胺基酸2-433編碼有人類RUP41的聚 核苷酸送入pCMV-HA中以進行暫時轉染表覌研究。 暫時轉染 DNA轉染使用帶有5’-HA標記的RUP41表現構築體（HA-pCMVRUP41)。簡言之，依廠商的操作說明用Fugene-6轉 染劑（Roche)將HA-pCMVRUP41轉染入分於細胞培養玻片 的COS-7或HEK細胞。帶有5’-HA標記GPR(孤兒GPCR ; GenBank® Accession No. NM—007223)及 HA-pCMV載體轉 染至COS-7及HEK細胞做為對照組。 cAMP測量 COS-7細胞以RUP41表現質體轉染24小時後，以PBS清 洗，且在FlashPlate分析（PerkinElmer)所得細胞前，於無血 清有或無l〇〇ng/毫升PTX培養基在37°C下培養18小時。依 廠商說明測量cAMP濃度。 CRE-螢光素酶報告基因測定法 122352.doc -119- 200800009 COS-7細胞以pCMVRUP41及TSHR-A6231表現質體共同 轉染 24 小時（TSHR_A6231 : RUP41(或 CNV)的 DNA 比值 =1 : 7(w/w))。以PBS清洗細胞，且在依廠商說明使用 LucLite螢光素酶報告基因套件（Parkard)前，培養於無血清 以及有或無lOOng/毫升PTX的培養基於37°C下18小時。 cAMP量由操作說明偵測。 實例16 腺病毒中介之RUP41過度表現促進NRVM存活 圖9A。NRVM以編碼有RUP41(AdRUP41)的重組腺病毒 處理，其不同程度的感染是由病毒滴定量的每細胞之成斑 單位（PFU)區分。腺病毒轉染24小時後，總RNA被分離出 來且以北方墨潰分析法判定病毒所表現的RUP41濃度。50 PFU/細胞的RUP41表現即可被偵測出，但100 PFU/細胞才 顯示出。 圖9B。以每細胞100 PFU的量與 AdRUP41感染的NRVM 顯示細胞在無血清培養基當中的存活率增加。NRVM與結 合蕈毒素（phalloidin)之德州紅及Hoechst 33342共同染色。 RUP41載體的構成 為腺病毒實驗，在製造腺病毒RUP41(AdRUP41)結合體 之前先將序列識別號：3編碼有人類RUP41多肽的聚核苷 酸次選殖進入pShuttleCMV(Qbiogene)。 腺病毒感染 NRVM被腺病毒載體感染的實作方法如先前描述（請参 Adams JW等人，Circ Res (2000) 87 : 1 180-7 ;揭示於此均 122352.doc -120 - 200800009 以其整體作為參考）。簡言之，nrvm於覆有層粘連蛋白 (3.5毫克/平方公分）的細胞培養玻片（Nunc)加入血清培養隔 夜，在腺病毒感染前清洗並於無血清培養基中再培養8小 時。複感染（MOI)的理想值是每細胞50至100成斑單位 (PFU)而劑量範圍則是每細胞〇·1至50〇 PFU。50 PFU/細胞 的MOI可得大於95%的感染結果（此值可以此對照病毒感染 之NRVMs中的GFP表現判定）而在感染後的48小時内沒有 任何細胞毒素’不論是用AdRUP41或對照組編碼有 GFP(AdGFP)的腺病毒感染。 實例17 RUP41過度表現挽救NRVMs免於組織缺氧/回氧引起的凋 亡 寡聚核苷酸DNA斷裂（又稱裂解）的分析顯示在缺氧（8小 時）後回氧（24小時）會刺激以對照組（AdGFP)腺病毒用每細 胞100 PFU之量感染的NRVMs其凋亡增加（H8/N24)。然 而，以腺病毒中介之序列識別號：3所示之人類RUP41多 肽過度表現（100 pFU/細胞）降低因缺血(normox)及缺氧後 回氧（H8/N24)引起的DNA斷裂程度（圖10)。 組織缺氧/回氧 分離的NRVMs加入血清（10% FBS，5%HS)培養隔夜， 接著在缺氧處置前24小時將培養基替換成無血清培養基 DMEM-F12(Sigma)。組織缺氧使用密閉培養箱灌入92%N2 及 5%C02 達成。（請参 Van Heugten 等人，JT Mol Cell Cardiol (1994) 26 : 1513-24，揭示於此均以其整體作為參 122352.doc -121- 200800009 考）。缺氧處置達所要求的時間後，細胞從密閉箱中移至 周遭空氣中且將無血清DMEM/F12培養基換新。 DNA片段化 依廠商之操作說明運用PUREGENE DNA分離套件 (Gentra)從NRVMs中分離出DNA。等量DNA分置於2%洋菜 膠中且以溴化乙錠（Ethidium Bromide)染色在紫外光下债 測其片段化。 實例18 心臟保護作用 本發明之一種調節劑使用於Fryer等人提出的大鼠體内 模式顯示其具心臟保護作用（請参Circ Res (1999) 84 : 846-5 1 ;揭示於此均以其整體作為參考）。該調節劑由腹腔内 注射給藥。最佳劑量為0.1至10 0毫克/公斤。其他最佳劑量 係選自以下組群：0.1毫克/公斤、0.3毫克/公斤、1.0毫克/ 公斤、3、0毫克/公斤、30毫克/公斤及100毫克/公斤。安慰 劑對照組僅施用藥物賦型劑。在一些具體實施例中，該調 節劑為促效劑。 350至450克之雄性Wistar大鼠使用於此實驗所有階段。 大鼠在進行手術程序前1、12、24、48或72小時先以腹腔 内注射給予調節劑或生理食鹽水。隨後，大鼠以腹腔給藥 用硫 丁巴比妥納鹽（thiobutabarbital sodium) (Inaction， Research Biochemical International ; 100 毫克/公斤）麻醉。 施行氣管切開術，其插管連接一嚙齒類呼吸器（型號CIV-101 ，Columbus Instruments，或型號 683，Harvard 122352.doc -122 - 200800009
ApparatUS)。大鼠用室内空氣輔氧氣以每分鐘60至65次推 送。維持5至1〇毫米水柱的吐氣終了正壓以預防肺膨脹不 全。動脈PH，Pc〇2，及P02以血液氣體分析儀（AVL995pH/ 血液氣體刀析儀，AVL Medical Instruments)監測控制，15 刀鐘阻塞接著60及120分鐘回血，並調校呼吸速率及/或 體積來維持在正常生理範圍（pH 7.35至7 45 ; ⑽為乃至 44毫米汞柱；及？〇2為8〇至11〇毫米汞柱）。體溫有加熱墊維 持在38 C，且視需要以靜脈注射重碳酸鹽以維持動脈血液 pH在正常生理範圍内。 右頸動脈血管插入一管經由G〇uld PE 5〇 1G〇uld pE 23壓力轉換器連結至Grass(模式7)多種波動描寫器以測量 血壓及心臟速率。右頸靜脈插入一管以灌注生理食鹽水， 重碳酸鹽及藥劑。在第五肋間位置施行左胸廓切開術，然 後施行心包膜穿刺放液術並拉開左心耳以顯露左冠狀動脈 位置。取一缚線（6_〇丙烯）從左心耳底下區域通過冠狀動 脈至左〜至右部。縫合線兩末端穿過一丙烯管以形成一線 圈刃。將縫合口兩端拉緊使得該線圈夾住心外膜表面形成 一止血钳而阻塞冠狀動脈。冠狀動脈阻塞可由心外膜發紺 以及其造成之血壓降低證實。心臟再回血可將上述線圈解 開而鬆開止血鉗，且可由肉眼所見之心外膜充血反應證 實。在進行實驗程序前應先讓心跳速率及血麼維持移定。 大鼠隨機分配於設計的實驗組中。對照組大鼠在局部缺 血3 0分鐘及回血2小時（I/R)前先施以生理食鹽水24小時。 為顯示調節劑急性心臟保護作用，在延長缺血前施用該調 i22352.doc -123- 200800009 節劑1小時。為顯示對急性缺血的延遲心臟保護作用，在 Ι/R前12或24小時以所需的劑量施用該調節劑。也在Ι/R前 4 8或7 2小時以戶斤需的劑量施用該調節劑。 一但完成上述程序，即將冠狀動脈阻塞，且危險區 (AAR)由專利的藍色染劑經由頸靜脈提供負染色判定。大 鼠以1 5%氯化鉀安樂死。心臟取出，左心室與其餘組織分 離，然後切成6塊縱剖薄片。這樣就可以看出染成藍色的 正常區，以及大致保持粉紅色危險區之輪廓。危險區從非 缺血區切出，組織置於數個小藥瓶且以1.0%的2,3,5-三苯 基四唑氯（TTC)染色於37 °C，100毫莫耳/公升磷酸溶液 (ρΗ7·4)培養15分鐘。TTC為組織是死是活的指示劑。TTC 由存在於可培養心肌細胞的脫氳酶酵素還原，且產生甲鑽 (formazan)沉殿，其顯示一種深紅色，反之梗塞區維持灰 色（請参 Klein 等人，Virchows Arch [Pathol Anat] (1981) 393 : 287-97)。組織儲存於10%甲醛瓶中過夜，且梗塞之 心肌在顯微鏡下由AAR切下（Cambridge Instruments)。梗 塞大小（IS)，AAR，及左心室重（LV)由重量分析測定法。 AAR是以LV的百分率表示（AAR/LV)，且IS以AAR的百分 率表示（IS/AAR)。 若大鼠表現極度低血壓（收縮壓小於30毫米汞柱）或因為 新陳代謝的酸中毒或鹼中毒而在正常生理範圍内不能維持 適當的血氧值，將會從數據分析中剔除。 全部數值以平均值±標準差表示。運用一個維度的 ANOVA與BonferronTs檢驗以測定組群之間的血液動力力 122352.doc -124 - 200800009 學，IS及AAR是否有任何顯著差異存在。顯著差異的判定 為P<0.05°IS/AAR減少表示心臟保護作用。 實例19 口服生物可用率 直接測定口服生物可用率的生化技術為熟悉本技藝者所 通曉並可運用於此（参見，但不限於，Wang PC等人， Cardiovase Drug Rev(2002)20 ·· 137-52 ;及 Buchan P 等 人，Headache(2002)Suppl2 : S54-62 ;揭示於此均以其整 體作為參考）。為求進一步說明而非設限，所謂的別種分 析方法可包含液相色層分析儀-串連質譜儀（請参Chavez-Eng CM等人，J ChromatogrB Analyt Technol Biomed Life Sci (2002) 767 : 117-29 ; Jetter A等人，Clin Pharmacol Ther (2002) 71 ·· 21-9 ; Zimmerman JJ 等人，J Clin
Pharmacol (1999) 39 : 1 155-61 ;及 Barrish A 等人，Rapid Commun Mass Spectrom (1996) 10 : 1033-7 ;揭示於此均 以其整體作為參考）。 正子放射斷層攝影（ΡΈΤ)已可成功使用來直接測量藥物 分布，包含在口服給藥物後哺乳動物體内之口服生物可用 率（請参 Gulyas 等人，Eur J Nucl Med Mol Imaging (2002) 29 : 1031-8 ;揭示於此均以其整體作為參考）。 此外，本發明調節劑的口服生物可用率可用體内模式的 數據為基礎判定，例如但不僅限於於實例1 8的老鼠模式。 調節劑以〇· 1毫克/公斤至100毫克/公斤範圍經口餵食給 藥。調節劑口服給藥顯示可提供心臟保護作用。調節劑效 122352.doc -125 - 200800009 果顯示出劑量依存且可與經腹腔給藥的效果比擬。調節劑 口服給藥以達成IS/AAR最大減低量一半所需的劑量，也可 與經腹腔給藥以達成IS/AAR最大減底量之半數所需之劑量 作一比較。舉例來說，若口服劑量為腹腔劑量的2倍，那 麼此調節劑的口服生物可用率為5〇%。更一般來說，若口 服劑量為0毫克/公斤而腹腔劑量為p毫克/公斤，則調節 劑的口服生物可用率為p / 0 )χ1〇〇]。 熟悉本技藝的人士即應明白本發明調節劑的口服生物可 用率可使用本文為舉例而非限制所提出之活體動物模式以 卜的方去判疋。热悉本技藝的人士也應明白，該口服生物 了用率的生物利用性讀取值可為IS/AAR以外的別種參數。 應可推想所參照的給藥途徑可為腹腔給藥以外的別種方 在些具體貫施例中，該參照給藥途徑可為靜脈注 射。 在一些具體實施例中，本發明調節劑的口服生物可用率 至少為腹腔内注射的1%、至少5%、至少1〇%、至少、 乂 20/。至少25%、至少30%、至少35%、至少40%或至 少 45% 〇 實例20 包含人類RUP41 GPCR表現的基因轉殖小鼠/大鼠/豬 本發明亦提出以人類RUP41 GPCR基因轉殖於非人類哺 乳動物的方法及其相關組合物，該受體包含選自下列組群 中的多肽： (a)序列識別號：2的多肽； 122352.doc -126 - 200800009 (b) 序列識別號：2的多肽；其中在序列識別號：2之胺 基酸位置3 12上的苯丙胺酸以離胺酸取代； (c) 序列識別號：3的多肽；或 (d) 序列識別號：3的多肽；其中在序列識別號：2之胺 基酸3 12位置上的苯丙胺酸以離胺酸取代。 在一些具體實施例中，非人類哺乳動物為小鼠，大鼠或 豬。 製造包含小鼠，大鼠及豬的基因轉殖方法為熟悉本技藝 者所通曉，且任何此種方法皆可被使用於本發明。簡言 之’基因轉殖動物的產生，譬如可將編碼有人類RUP41 GPCR的聚核苷酸轉染一多可能幹細胞es(「基因轉 殖」）。成功轉化的ES細胞接著引入早期胚胎中，其接著 移植入相同物種的哺乳動物子宮。在某些實例中轉形 (「基因轉殖」）細胞將包含所產生動物的部份生殖系，所 以在此生殖糸中含有基因轉殖細胞的成年動物可與其他動 物配對，因此最終產生一群基因轉殖動物在其每一個細胞 皆有轉殖基因且可以穩定傳送轉染細胞至其後代。其他引 入聚核苷酸的方法亦可採用，例如像是經由微注射引入編 碼有人類RUP41 GPCR的聚核苷酸進入受精卵或早期胚 胎。此外，基因轉殖可由受精卵與包含轉殖基因的腺病毒 感染進入動物體内（請参jaenisch，R，Pr〇c Natl Aad USA (1976) 73 : 1260-4)。製造轉殖基因哺乳動物的方法 描述於 Wall專人，j Cell Biochem (1992) 49 : 1 13-20 ·
Hogan 等人，Manipulating the M〇use 加心㈧ a 122352.doc -127- 200800009
Laboratory Munual. (1986) 13 ： 1762-73 ； WO 91/08216 ； 美國專利編號4736866及美國專利編號6504080 ;揭示於此 均以其整體作為參考]。 在一些具體實施例中，該該人類RUP41 GPCR表現具心 肌細胞選擇性。在一些具體實施例中，該具心肌選擇性的 人類RUP41 GPCR表現是由α肌凝蛋白重鏈探針給予 [Subramaniam Α等人，J Biol Chem (1991) 266 ·· 24613- 2〇 ;揭示於此均以其整體作為參考。
實例21 心臟保護作用的基因轉殖活體動物模式 使用描述於實例20的基因轉殖活體動物模式，本發明化 合物可顯示出具有心臟保護作用功效。在一些具體實施例 中’ 5亥動物為小鼠、大氣或豬。 該合物可施用於基因轉殖動物來測定其心臟保護作用功 效，並判斷是否該施用，相較於只對基因轉殖動物施用賦 型劑，可導致如實例18之大鼠活體模式、小鼠活體模式或 豬的類同模式，其is/AAr降低。 一在一些較佳具體實施例，該化合物為本發明調節劑。在 一些具體實施例中，該調節劑降低細胞内cAMP的量。在 一些具體實施例中’該調節劑為促效劑。在-些具體實施 :中’該化合物由腹腔内注射給藥。較佳劑量為"至⑽ 笔克/公斤。其他較佳劑量選自下列組群，包括：〇 1毫克/ ;/V:，3毫克/公斤、U毫料、3.咖 克/公斤及100臺古/八& —扮+丨 克/λ斤。女慰劑僅為賦型劑。在一些具體 122352.doc -128- 200800009 實施例中，該劑量每天投藥。在一些具體實施例中，該劑 量的給藥間隔選自下列組群：一星期、二星期、三星期及 四生期。須知’此給藥途控’劑量範圍，給藥頻率，及給 藥所本質性本質性性時間均為舉例而不應侷限本發明。 實例22 含有剔除RUP41基因的小鼠/大鼠/豬 小鼠 一較佳DNA構築體將包含，從5,末端至3,末端：（a)第一 核苷酸序列包含於小鼠RUP41基因體序列中；（b) 一核皆酸 序列包含正選擇標記’如抗心黴素（neo)標記；且（c)第二 核苷酸序列包含於小鼠RUP41基因序列中且位在第一小鼠 RUP41核皆酸序列（a)下游位置的基因組中。小鼠ruP4 1基 因體序列可使用熟悉本技藝者所通曉的技術分離（Maniatis T專人 ’ Molecular Cloning : A Laboratory Manual (1989)
Cold Spring Harbor Laboratory ;揭示於此均以其整體作為 參考）。小鼠RUP41基因體序列分離的探針將從編碼有一小 鼠RUP41多肽的cDNA衍生而得，其中該cdnA可使用 mRNA模板從小鼠心臟，肺臟，或脂肪組織獲得。 在一些較佳具體實施例，此DNA構築體亦包含一個位在 核酸序列（a)上行位置或核酸序列（c)下行位置的負選擇標 記。最好此負選擇標記包含胸腺嘲唆激酶（tk)基因（請参
Thomas 等人，Cell (1986) 44 : 419-28)，潮黴素 β基因[Te Riel等人，Nature (1990) 248 : 649-51]，hprt基因（請参 Van der Lugt等人，Gene (1991) 105 : 263-7 ; Reid等人， 122352.doc -129- 200800009
Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87 : 4299-4303]或白喉毒素 A片段（Dt-A)基因；Nada等人，Cell (1993) 73 ; 1125.35 ;
Yagi等人，Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87 : 9918- 9922)，揭示於此均以其整體作為參考。最好正選擇標記 位在小鼠RUP41外顯子序列内而打斷編碼有小鼠ruP41的 多肽。這些取代載體已有前人提出，舉例言之，由Th〇mas 專人 ’ Cell (1986) 44 · 419-28 ; Thomas等人，Cell (1987) 51 · 503-12 ; Mansour等人，Nature (1988) 336 : 348-52 ; Koller等人，Annu Rev Immunol (1992) 10 : 705-30 ;及美 國專利編號563 1 153 ;揭示於此均以其整體作為參考。 弟一及弟二核酸序列（a)及（c)可以無區別地位於一小鼠 RUP41調節劑序列，内含子序列，外顯子序列或包含調節 劑及/或内含子及/或多顯子序列之内。核酸序列（a)及〇)大 小範圍在1至5 0 kb，最好從1至1 〇 kb，更好從2至6 kb，且 更好從2至4kb。 製造將一種選定基因剔除之小鼠的方法已為熟悉此技藝 者所通曉，且被使用來成功地使多種基因失去活性。 大鼠 大鼠目標基因技術較小鼠不健全且一直受人們關注。有 一種方法可將大鼠似胚胎幹細胞（ESC)上的大鼠RUP41不 活性化，且接著以不活化大鼠RUP41基因注入由2細胞之 胚胎融合後製成的大鼠胚囊（請参Krivokharchenko等人，
Mol Reprod Dev (2002) 61 : 460-5) 〇 大鼠基因的識別是使用序列識別號：6的大鼠ruP4 1聚 122352.doc -130- 200800009 核苷酸在嚴格雜交條件下篩檢大鼠基因資料庫。全長或基 本上全長的大鼠RUP41 cDNA將以相同條件篩檢大鼠心臟 或腦部DNA識別。嚴格的核苷酸雜交條件已為熟悉本技藝 者所通曉（請参 Manuatis T等人（1982)Molecular Cloning : A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York) 0 另有一法將在大鼠似ESC細胞中不活性化大鼠RUP41基 因，接著將有有不活性化大鼠RUP41基因的大鼠似ESC細 胞移殖進入摘除細胞核的卵母細胞（請参Sato K等人，Hum Cell (2001) 14 : 301-4 ; Wakayama及 Yanagimachi，Semin Cell Dev Biol (1999) 10 ·· 235-8 ; Hochedlinger及 Jaenish， Nature (2002) 415 ： 1035-8 ； Yanagimachi ^ Mol Cell Endocrinol (2002) 1 87 : 241-8 ;揭示於此均以其整體作為 參考）。 上述方法的類同或替代（請参Zan等人，Nature Biotechnology (2003) 21 : 645-51 ;揭示於此均以其整體作 為參考）可能被使用來製成包含剔除RUP41基因的大鼠。 豬 類似或替代的方法可被使用來製成包含剔除RUP41基因 的豬（請参 Lai等人，Science (2002) 295 : 1089-1092 ;揭示 於此均以其整體作為參考）。
Cre-LoxP系統： 含有心肌細胞選擇性剔除RUP41基因的小鼠/大鼠/豬 小鼠 這種新的DNA構築體使用P1噬菌體系統的特殊重組位置 122352.doc -131 - 200800009 製成。P1嗟菌體具有一種稱Cre的重組酶，其與34驗基對 的1〇xP位置反應。l〇xP位置是由8bp保留序列所分閧的兩個 — 13bP迴紋序列所組成（請参Hoess RH等人，Nucleic Acid
Res (1986) 14 : 2287-300 ;揭示於此均以其整體作為參 考）。兩個具相同方向之l〇xp位置間因Cre酵素的重組將導 致此DNA片段遭刪除。 將Cre-loxP系統與同源重組技術合用是由Gu等人首先提 出（請参 Gu 等人，Cell (1993) 73 : 1 155-64 ; Gu 等人， ® Science (1994) 26S : 103-0 ;揭示於此均以其整體作為參 考）。簡言之，將嵌入基因體目標位置的某一核苷酸序列 帶有至少兩個相同方向l〇xP位置，且分別位在要由重組基 因體中刪除之核苷酸序列的兩末端。刪除的發生需要在重 組之細胞佰主的細胞核中存有重組酶（cre)。重組酶可在需 要時由以下方法引入，（a)在含有此酵素的培養基中培養重 組細胞伯主，直接注射Cre酶進入所要的細胞，譬如由酵 φ 素脂質體進入細胞，如Baub〇nis等人描述（請参Baub〇nis w 及 Sauer B，Nucleic Acid Res (1993) 21 : 2025-9 ;揭示於 此均以其整體作為參考）；（b)與包含Cre之編碼序列之載體 轉染細胞宿主使該序列和重組之細胞宿主的啟動子功能實 質相連，其啟動子可依需要誘發，再將該载體引入再結合 細胞宿主，如Gu等人（請参π等人，Cell (1993) 73 : 1155-64 ;揭示於此均以其整體作為參考）及8抓以等人（請 参 Sauer B及Henderson N，Pr〇c Natl Aead Sci USA (1988) 85 : 5166-70 ;揭示於此均以其整體作為參考）描述；細 122352.doc -132- 200800009 胞宿主基因體引入一聚核苷酸，其包含Cre之編碼序列與 重組之細胞宿主的啟動子功能實質相連，其啟動子可依需 要誘發，而該聚核苷酸嵌入細胞宿主基因體的情況是隨意 肷入或同源重組’如Gu等人描述（請参Gu Η等人，Science (1994) 265 : 103-6 ;揭示於此均以其整體作為參考）。 使用Cre-loxP系統的載體及方法在下列文件中被提出：
Zou等人（1994) ; Minamisawa S等人，J Biol Chem (1999) 274 : 10066-70 ; Chen等人，J Biol Chem (1998) 273 : 1252-6 ; Chen等人，Development (1998) 125 : 1943-9 ;揭 示於此均以其整體作為參考。 本發明一些較佳的具體實施例，Cre由上述策略（c)引入 細胞宿主基因體，其中該啟動子具心肌細胞選擇性且導致 具心肌細胞選擇性之小鼠RUP41基因體序列瓦解（1〇χΡ-内 欣’ ’内解floxed1’）。在一些具體實施例中，該具心肌細胞 選擇性的啟動子即為肌凝蛋白輕鏈2號（mic-2v)之心室特化 異構體（請参 Minamisawa S等人，J Biol Chem (1999)274 : 10066-70 ; Chen等人，J Biol Chem (1998) 2731252-6 ;揭 示於此均以其整體作為參考）。將Cre重組酶之編碼序列插 入内生性mlc-2v位置的基因轉殖小鼠（”mlc-2v植入小鼠，，) 之爾曾被提出（請参Chen等人，Development (1998) 125 : 1943_9 ;揭示於此均以其整體作為參考）。内解⑺⑽匕“某 一所選基因的方法應屬熟悉本技藝者的已知領域（請参
Chen等人，Development (1998) 125 : 1943-9)。 在一些具體實施例中，本發明特徵為一種製造包含具心 122352.doc -133 - 200800009 肌細胞選擇性之RUP41基因剔除小鼠的方法，包含將mlc-2 cer對偶基因與一被「内解」之RUP4 1基因一起刪除，如前 β 文所述。 其他製造具心肌選擇性之RUP41基因剔除小鼠的方法為 熟悉本技藝者所通曉；可見於Kuhn R及Torres RM， Methods Mol Biol (2002) 180 ： 175-204 ； Sauer B ^
Methods (1998) 14 : 381-92 ; Gutstein DE 等人，
Circulation Research (2001) 88 : 333 ; Minamino 丁等人， _ Circulation Research (2001) 88 : 587 ;及 Bex A 等人，J Urol (2002) 168 : 2641-2644 ;揭示於此均以其整體作為參 考。 大鼠 類似或替代方法（請参Zan等人，Nature Biotechnology (2003) 21 : 645-51 ;揭示於此均以其整體作為參考）可使 用來製造具心肌選擇性之RUP41基因剔除大鼠。 •緒 類似或替代方法可使用來製造具心肌選擇性之RUP41基 因剔除豬。（請参 Lai 等人，Science (2002) 295 : 1089-1092 ;揭示於此均以其整體作為參考）。 本申請案通篇引用許多刊物、專利及專利申請公開資 料。本申請案揭示之該等刊物、專利及專利申請公開資料 均以其整體併入本文作為參考。依熟悉本技藝者所能理解 本發明之修飾及延伸均包含在上文之揭示及以下將提出的 申請專利範圍中。 122352.doc -134- 200800009 【圖式簡單說明】 圖1 :描述候選化合物對「目標受體」的初步篩檢，其 為内生本質性活化的Gs-偶聯GPCR之Gsa融合蛋白。A2孔 表示「化合物A」的結果。G9孔表示「化合物B」的結 果，僅為說明但並不限制本發明。 圖2A至C:A.以訂製之高密度募聚核苷酸微陣列用於 人類組織樣品所得的微陣列分析結果，微陣列包含可顯現 RUP41基因表現量的探針。圖譜中每一個組織的長條顯示 的是針對RUP41多次測量的相對表現量（平均差）及標準 誤。各組織以垂直的文字在其長條圖上標明。 檢閱長條圖譜顯示人類腦部及心臟有RUP41表現。 B ·人類多重組織點潰測定結果顯示在成人及胎兒心臟 組織有高度RUP41 mRNA表現。RUP41 mRNA表現也可在 許多不同區域的腦組織偵測出。 C·人類多重組織北方墨潰測定結果顯示在心臟及腦部 有高度RUP41 mRNA表現。 圖3 :原位雜交顯示成年大鼠心臟内有廣泛的心肌細胞 RUP41表現。反義之RUP41放射性標籤探針測出RUP41表 現於所有的心臟腔室。將反義對照組（GAPDH)及心房特異 性探針（心房納尿因子（atrial natriuretic factor)，ANF)使用 於另外的切片以顯示探針標記對心臟切片具特異性。 圖4A至B : A. RT-PCR顯示在無血清條件下24小時的初 生大鼠心室心肌細胞（NRVMs)之RUP41轉錄表現。添加脫 羥腎上腺素（PE)或初生牛金清（NCS)於培養基後24小時， 122352.doc -135- 200800009 RUP41轉錄表現量急劇下降且與心肌肥大的表現型有關。 G3PDH PCR產物顯示PCR反應中使用相同量之模板及電泳 上樣量的一致性。 B·北方墨潰測定顯示NRVMs在經過促肥厚藥劑處理24 小時後其RUP41 mRNA表現降低，該促肥厚藥劑包括脫經 腎上腺素（PE)、巴豆酯-12肉豆蔻酸-13醋酸（PMA)、前列 腺素F2a(PGF2o〇及初生牛血清（NCS)。心房利鈉因素 (ANF)(其為心肌肥大的基因標記）對所有上述的肥厚刺激 都有向上調升之反應。28S rRNA之曱烯藍染色顯示RNA完 整性及電泳上樣量的一致性。 圖5 :上圖，在高血壓所引發之心室肥大的活體小鼠模 式中RUP41 mRNA為往下調節。北方墨潰分析是針對於從 橫向大動脈緊縮（TAC)小鼠左心室或小鼠經模擬手術7天後 所分離出的總RNA。增加的ANF顯示TAC心臟已形成確實 的肥大反應。28S rRNA曱烯藍染色顯示RNA完整性及電泳 上樣量的一致性。 下圖，RUP41訊號以濃度儀分析且對28S rRNA訊號正規 化。*6隻模擬手術小鼠（Sham)及6隻TAC小鼠樣本的Anova 統計分析顯示RUP41 mRNA顯著降低，P<〇.00005。 圖6 :北方墨潰分析顯示由缺氧6小時的NRVMs分離的總 RNA中RUP41 mRNA表現量降低。RUP41 mRNA表現量在 缺氧又回氧後24小時（H6/R24)回到正常量。增加的c_f0S表 現（Hypox-6)顯示於缺氧情況下的心肌細胞壓力反應。28S rRNA甲烯藍染色顯示RNA完整性及電泳上樣量的一致 122352.doc -136- 200800009 性。 圖7A至B : A. RT-PCR實施於人類心臟分離出的總 • RNA。充血性心衰竭（CHF)病人較正常心臟功能（正常）病 人的RNA當中RUP41轉錄程度降低。每次PCR反應均加入 人類GAPDH引子做為模板濃度及電泳上樣量一致性之内 部控制。 B. *Anova統計分析顯示CHF病患相較於正常病患其 RUP41轉錄有顯著降低，ρ<0·05。心肌梗塞（MI)病人的 ⑩ RUP41轉錄程度與正常心臟無差異。 圖 8:，上圖，COS-7細胞以 pCMV-HARUP41(HA-RUP41) 或pCMV-HA骨幹（CMV)及本質性活化的Gs結合甲狀腺刺 激荷爾蒙受體（PCMV-TSHR-A6231)共轉染。（HARUP41即 紅血球凝集素（HA)-標記RUP41)。另外，將CRE-螢光酵素 酶報導基因構築體共轉染以測定百曰咳毒素（PTX)存在或 不存在時的cAMP活化路徑。螢光酵素酶報導基因活性在 ^ 同時表現CART-TSHR及HARUP41的細胞中較同時表現 CART-TSHR及pCMV-HA的細胞之對照組中低，表示 RUP41與Gi結合。經PTX處理時，因RUP41而抑制cAMP降 低則證實Gi與此受體結合。 下圖：在百曰咳毒素（PTX)存在或不存在的情況下，以 pCMV-HA(CMV)或 pCMV-HARUP41(HA-RUP41)構築體共 轉染的COS-7細胞。Forskolin (ΙμΜ)刺激所導致的cAMP量 增加會被RUP41表現抑制。經PTX處理時，因RUP4 1而抑 制cAMP降低則證實Gi與此受體結合。 122352.doc -137- 200800009 圖9A至B : A· NRVMs以編碼RUP41的重組腺病毒 (AdRUP41)處理，以每細胞之成斑單位（PFU)之病毒滴定 . 量定義感染程度。腺病毒轉染24小時後，總RNA被分離出 來且以北方墨潰分析法測定病毒所表現的RUP41濃度。在 5 0 PFU/細胞時，RUP41表現即可被偵測出，但100 PFU/細 胞時才顯示出高度表現。 B.以100 PFU/細胞的量之AdRUP41感染48小時的 NRVMs顯示細胞在無血清培養基中的存活率增加。 響 NRVMs以結合簟毒素（phalloidin)之德州紅及Hoechst 33342共同染色。 圖10 :寡核苷酸DNA片段化（又稱斷裂（laddering))的分 析顯示在缺氧（8小時）後回氧（24小時）（H8/N24)之刺激會使 以100 PFU/細胞對照組（AdGFP)腺病毒感染的NRVMs之細 胞凋亡增加。然而，以腺病毒中介之RUP41多肽過度表現 (100 PFU/細胞）會降低因缺血（normox)及缺氧後回氧 (H8/N24)引起的DNA片段化程度。 122352.doc -138- 200800009 序列表 <11〇>美商艾尼納製藥公司 <120>用於治療缺血性心臟病及充血性心衰竭之人類G蛋白-偶聯受體及其調節劑 <140> TW 092120775 <141> 2003-07-30 <150> US 60/400,774 <151> 2002-08-01 <160〉 12 <170> Patentln version 3.2
<210〉 1 <211〉 1881 <212〉 DNA <213>人類 <400> 1 gttatttctt caaaaggaaa acacaatttt cttttatatc aaaacaatgc aaacttgatg 60 gttcttaatt ctacattttc tattaatagt ttacaaactt aaaaattaaa ctaagtacac 120 aattgaaaga tttttttttc ttacaaagaa cacgttatac gtcatttaaa ttgccaaata 180 tcaaatagtt tattctattt cactttctag ggaaaaaaac caactgctcc aaaagaatgt 240 gtttttctcc cattctggaa atcaacatgc agtctgaatc taacattaca gtgcgagatg 300 acattgatga catcaacacc aatatgtacc aaccactatc atatccgtta agctttcaag 360
tgtctctcac cggatttctt atgttagaaa ttgtgttggg acttggcagc aacctcactg 420 tattggtact ttactgcatg aaatccaact taatcaactc tgtcagtaac attattacaa 480 tgaatcttca tgtacttgat gtaataattt gtgtgggatg tattcctcta actatagtta 540 tccttctgct ttcactggag agtaacactg ctctcatttg ctgtttccat gaggcttgtg 600 tatcttttgc aagtgtctca acagcaatca acgtttttgc tatcactttg gacagatatg 660 acatctctgt aaaacctgca aaccgaattc tgacaatggg cagagctgta atgttaatga 720 tatccatttg gattttttct tttttctctt tcctgattcc ttttattgag gtaaattttt 780 tcagtcttca aagtggaaat acctgggaaa acaagacact tttatgtgtc agtacaaatg 840 aatactacac tgaactggga atgtattatc acctgttagt acagatccca atattctttt 900 tcactgttgt agtaatgtta atcacataca ccaaaatact tcaggctctt aatattcgaa 960 122352-序列表.doc 1020 1020
200800009 taggcacaag attttcaaca gggcagaaga agaaagcaag aaagaaaaag acaatttctc taaccacaca acatgaggct acagacatgt cacaaagcag tggtgggaga aatgtagtct ttggtgtaag aacttcagtt tctgtaataa ttgccctccg gcgagctgtg aaacgacacc gtgaacgacg agaaagacaa aagagagtct tcaggatgtc tttattgatt atttctacat ttcttctctg ctggacacca atttctgttt taaataccac cattttatgt ttaggcccaa gtgacctttt agtaaaatta agattgtgtt ttttagtcat ggcttatgga acaactatat ttcaccctct attatatgca ttcactagac aaaaatttca aaaggtcttg aaaagtaaaa tgaaaaagcg agttgtttct atagtagaag ctgatcccct gcctaataat gctgtaatac acaactcttg gatagatccc aaaagaaaca aaaaaattac ctttgaagat agtgaaataa gagaaaaacg tttagtgcct caggttgtca cagactagag aaaagtctca gtttcaccaa atccacattc aaatgagttt taaatttaaa ttgtaaaaac tgatattact gccaaatata agaaaaatat tttaagtatt ggttatgttg taaattttca atgtgaaatg ctaattagat aggtcatata tattcaattt cttcattact taatgtattt gttgcatggc agtttgttaa agtactatca tgtgtatatt ttgtcaatat tatgtccaac agaaaatatt catgtaagtc atatttttta aggaataaat acatagcctt aaaacagtgt ataactttaa aatgtaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a <210> 2 <211> 433 <212〉 PRT <213〉人類 <400〉 2
Met Cys Phe Ser Pro lie Leu Glu lie Asn Met Gin Ser Glu Ser Asn 15 10 15 lie Thr Val Arg Asp Asp He Asp Asp lie Asn Thr Asn Met Tyr Gin 20 25 30
Pro Leu Ser Tyr Pro Leu Ser Phe Gin Val Ser Leu Thr Gly Phe Leu 35 40 45
Met Leu Glu lie Val Leu Gly Leu Gly Ser Asn Leu Thr Val Leu Val 50 55 60 122352-序列表.doc -2 - 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 I860 1881 200800009
Leu Tyr Cys Met Lys Ser Asn Leu He Asn Ser Val Ser Asn He lie 65 70 75 80
Thr Met Asn Leu His Val Leu Asp Val He lie Cys Val Gly Cys lie 85 90 95
Pro Leu Thr lie Val lie Leu Leu Leu Ser Leu Glu Ser Asn Thr Ala 100 105 110
Leu lie Cys Cys Phe His Glu Ala Cys Val Ser Phe Ala Ser Val Ser 115 120 125
Thr Ala lie Asn Val Phe Ala lie Thr Leu Asp Arg Tyr Asp lie Ser 130 135 140
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<211> 542 <212> DNA <213>大鼠 <220〉 <221> misc_feature <222〉 （514)..(514) <223> n is a, c, g, or t <400〉 6 atgcatgctc gagcggccgc cagtgtgatg gatatctgca gaattcgccc ttgtaataat tgccctccgg cgagccgtga aacgacaccg ggaacgacga gagaggcaga aaagagtctt caaaaatgtc gttatggata atttctacat ttcttctctg ttggacacca atttctgttt 122352-序列表.doc 200800009 taaataccac cattttatgt ttaggcccaa gtgacctttt agtaaaatta agattgtgtt 240 ttctagtcat ggcttatgga acaactatat tccatcctct cctgtatgca ttcaccagac 300 aaaaatttca aaaggtctta aaaagtaaga tgaaaaagcg agttgtttcc atagttgaag 360 ctgatcccat gcctaataac gctgtaatac acaactcatg gatagatcct aaaagaaaca 420 aaaaggttac ctacgaagac agtgaaataa gagagaaatg tttagtacct caggttgtca 480 cagactagaa gggcgaattc cagcacactg gcgnccgtta ctagtggatc cgagctcggt 540 542 ac <210〉 7 <211> 30 <212〉 DNA <213> 人工序列 <220> <223> 新穎序列
<400〉 7 30 31 tcccccggga aaaaaaccaa ctgctccaaa <210〉 8 <211〉31 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉新穎序列 <400〉 8 taggatccat ttgaatgtgg atttggtgaa a
<211> 36 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>新穎序列 <400〉 9 gatcaagctt ccatggcgtg ctgcctgagc gaggag <210〉 10 <211〉 53 <212> DNA <213〉人工序列 <220> 1223 52-序列表.doc 36 200800009 <223〉新穎序列 <40〇> 10 gatcggatcc ttagaacagg ccgcagtcct tcaggttcag ctgcaggatg gtg 53 e <210〉11 * <211〉 23 <212> DNA ‘ <213〉人工序列 <220> <223〉新穎序列 <40〇> 11 gtaataattg ccctccggcg age 23
<210> 12 <211〉 21 ^ <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>新穎序列 <40〇> 12 ctagtctgtg acaacctgag g 21
10- 122352-序列表.doc
Claims (1)
- 200800009 十、申請專利範圍： 1 一種製造基因剔除非人類哺乳動物之方法，其基因體包 含不活化之哺乳類RUP41基因，其中該哺乳類RUP4i基 因基因編碼與序列識別號：3具有至少90%序列同一性之 受體’且其中該基因體包含不活化之RUP41基因的非人 類哺乳動物易於患有選自由下列組成之群的心血管失調 症： (a) 心臟輸出量減少；及 (b) 靜脈壓增加； 該方法包含不活化RUP41基因。 2· 一種製造基因剔除非人類哺乳動物之方法，其基因體包 含不活化之哺乳類RUP41基因，其中該哺乳類RUp4丨基 因基因編碼與序列識別號：3具有至少9〇。/〇序列同一性之 文體，且其中該基因體包含不活化2Rup41基因的非人 類哺乳動物易於患有選自由下列組成之群的的缺血性心 臟病： (a) 心肌梗塞； (b) 心肌梗塞後之重塑；及 (c) 充血性心衰竭； 該方法包含不活化RUP41基因。 3.如明求項丨或2之方法，其中該非人類哺乳動物為小鼠、 大鼠或豬。 4· 一種非人類哺乳動物，其基因體包含不活化之 因’其係由如請求項1或2之方法製得。 122352.doc 200800009 5·如w求項4之非人類哺乳動物，其巾該非人_哺乳動物 為小鼠、大鼠或豬。 ▲ 6·—種非人類哺乳動物，其基因體絲修飾已提供心肌細 &中甫乳類RUP41基因選擇性的不活化反應，其中該哺 礼類RUP41基因編碼與序列識別號：3具有至少9〇%序列 同一性之受體。 3 '東項6之非人類哺乳動物，其中該非人類哺乳動物 為小鼠、大鼠或豬。 籲8·-種如請求項4至7中任—項之非人類哺乳動物之用途， 其係用於篩選可作為心臟保護作用調節劑之候選化合 物’其中該篩選包含： (a) 將候選化合物投予該與非人類哺乳動物；及 (b) 測定該化合物是否可提供心臟保護作用。 9·如請求項8之用途，其中部分（b)包含評估該非人類哺乳 動物的心血管失調症及缺血性心臟病。 φ 10·如請求項9之用途，其中該心血管失調症係選自由下列 組成之群： (a) 心臟輸出量減少；及 (b) 靜脈壓增加。 11·如請求項9之用途，其中該缺血性心臟病係選自由下列 組成之君羊： (a) 心肌梗塞； (b) 心肌梗塞後之重塑；及 (c) 充血性心衰竭。 122352.doc 200800009 ，其中該非人類哺乳動 12.如請求項8至11中任一項之用途 物為小鼠、大鼠或豬。122352.doc 200800009 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（1)圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： (無元件符號說明） 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學 式： (無） 122352.doc
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