TW200533673A - Proline cci-779, production of and uses therefor, and two-step enzymatic synthesis of proline cci-779 and cci-779 - Google Patents

Description

200533673 % 九、發明說明： 【發明所屬技術領域】 本發明係關於CCI- 7 79之合成法及脯胺酸-CC1-7 79，包括 涉及經脂肪酶-催化之雷帕黴素42-羥基之醯化，以2,2-雙（羥 基甲基）丙酸乙烯酯於有機溶劑中處理，隨後脫保護之方 法，亦提供含有脯胺酸-CCI-779之產物及其用途。 【先前技術】 具2,2-雙（經基甲基）丙酸之雷帕黴素（Rapamycin) 42 -酯 • (CCI-779)爲雷帕黴素之酯衍生物，其在活體外及活體內模 式兩者中已證實對腫瘤生長之顯著抑制效果。雷帕黴素羥基 酯之製備及用途已述於 US專利案 Nos·: 5，362,718及 6,277,98 3 〇 先前已經由直接將雷帕黴素與醯化劑反應進行於42-位置 之雷帕黴素酯化，然而，當雷帕黴素於位置3 1及42上含有 兩個第二羥基時，企圖區別此兩官能中心以便達到42-單醯 化產物之選擇性合成仍具有困難的挑戰。目前，CCI-77 9之 Φ 區域選擇性製法涉及至少5個步驟（US專利案 No. 6,277,983、國際專利公告No· WO 01 /2 3395)。其首先，將雷 帕黴素以矽烷化劑處理而形成雷帕黴素31，42-雙-甲矽烷基 醚，然後選擇性移除42-甲矽烷基醚保護基而得到雷帕黴素 42-011-3 1-甲矽烷基醚。然後將此自由42-011以2,2,5-三甲 基[1，3 -二曙院]-5-殘酸之2，4,6 -三氯节基混合酐處理及兩個 隨後脫保護步驟完成所欲之CCI-779。 200533673 驚 身 CCI-779結合至細胞質蛋白質fKbp並與其形成複合物， 其抑制一種酵素mTOR(雷帕黴素之哺乳類動物標的，亦已知 爲FKBP 12-雷帕黴素相關蛋白質[FRAP])。mTORs激酶活性 之抑制會抑制各種訊號傳導路徑，包括經胞激素（cytokine ) -刺激之細胞增殖、數種關鍵蛋白質（調節細胞週期之G 1期） 之mRNAs轉譯，及il-2-誘導轉錄，導致細胞週期由G1至 S期進行之抑制。CCI-7 7 9已被證實在多重應用上爲有效 的，包括中樞神經系統癌症、白血病、乳癌、前列腺癌、黑 § 色素瘤、神經膠細胞瘤及神經膠母細胞瘤之抑制。 更有效率之區域專一性生產CCI-779之方法及其類似物爲 一種需求。 【發明內容】 發明摘述 本發明提供CCI-779之脯胺酸類似物（具2,2-雙（羥基甲基） 丙酸之脯胺酸-雷帕黴素42-酯或脯胺酸-CC 1-7 79)及合成其 之方法。脯胺酸-CC 1-779爲一種在癌症學及其他相關適應症 # (免疫抑制、抗炎症性、抗增殖及抗腫瘤）上有用之活性藥 物物質。 於某一方面，脯胺酸-CCI-779之合成係透過脯胺酸雷帕黴 素雙甲矽烷基化、單-脫保護31,42-雙-三甲基甲矽烷基脯胺 酸雷帕黴素及醯化單-甲矽烷基脯胺酸雷帕黴素隨後水解而 完成。 於另一方面，本發明提供涉及雷帕黴素之區域專一性醯化 之2步驟酵素性方法，使用微生物脂肪酶及2,2-雙（羥基甲 200533673 m ϊ 基）丙酸活化酯衍生物於有機溶劑，隨後脫保護得到 CCI- 7 79。 於另一方面’本發明之方法使脯胺酸c C I - 7 7 9由脯胺酸-雷帕黴素合成，於雷帕黴素家族中密切相關之雷帕黴素化合 物。 本發明之其它方面及優點對於此項技藝之人士爲顯而易 見的。 發明詳細說明 | 本發明描述雷帕黴素二羥基酯之脯胺酸類似物及其用 途。於一具體實施例中，本發明提供脯胺酸CCI-779，其核 心特徵如下：

脯胺酸-CCI-779 本發明另提供一種合成雷帕黴素二羥基酯之脯胺酸類似 物之方法。於一具體實施例中，脯胺酸雷帕黴素用於作爲起 始材料。雷帕黴素及其製備述於US專利案No. 3,92 9,992， 頒佈於I975年12月3〇日。或者，雷帕黴素可自商業上購 得[Rapamune®，Wyeth]。脯胺酸雷帕黴素及其製備已被描 述，參閱例如歐洲專利N 〇 . 0 5 8 9 7 0 3。 200533673 * 身 於一具體實施例中，脯胺酸雷帕黴素爲雙-甲矽烷基化而 形成31,42-雙-三甲基甲矽烷基脯胺酸雷帕黴素。此轉形可 使用之甲矽烷基化劑劑包括，例如，商業上可取得之氯烷基 石夕院，如氯三甲基砂院、氯三乙基砂院、氯三丙基砂院或氯 三異丙基砂院。於一具體實施例中，此甲ϊ夕院基化劑爲氯三 甲基矽烷。儘管可使用龐大的甲矽烷基化劑，於隨後反應之 酸媒劑中此等劑需更多時間脫保護。此外，於酸媒劑中反應 時間愈長，會形成愈多降解副產物。於另一具體實施例中， # 以適當有機鹼及適當有機溶劑以氯化三甲基矽烷於冰溫下 進行甲矽烷基化反應，形成31，42-雙-三甲基甲矽烷基脯胺 酸雷帕黴素。於一具體實施例中，此反應溫度爲約0至5 °C， 於其他具體實施例中，於低溫進行此反應，以較長時間生 成。可輕易選擇適當的有機溶劑包括例如DMF。於一具體實 施例中，乙酸乙酯爲溶劑，相似地，適當有機鹼可輕易由彼 等此項技藝中已知者中選出，例如，咪唑、1 -甲基咪唑、三 烷基胺及N，N-二異丙基乙基胺。於一具體實施例中，此鹼 ® 爲咪唑，於完全反應中少於1小時生成，於本文所述條件下。 於稀酸條件下〇至5°C在42-位置上單脫保護提供31-三甲 基甲矽烷基脯胺酸雷帕黴素。 於-1 5至-1 0°C，於4-二甲基胺吡啶或相似催化劑於二氯甲 烷之存在下，使用2,2,5 -三甲基[1，3-二曙烷]-5-羧酸之2，4,6-三氯苄醯基混合酐達成單-甲矽烷基脯胺酸雷帕黴素之醯化 得到中間物。於另一具體實施例中，單-甲矽烷基脯胺酸雷 帕黴素與2,2,5-三甲基[1，3_二曙烷；1-5-羧酸之偶合，於有機 200533673 * < 鹼催化劑如4-二甲基胺基吡啶存在下。其他有機催化劑可取 代4-二甲基胺基吡啶，例如包括其他三級有機鹼如N，N-二 甲基苯胺、吡啶、三乙基胺及二異丙基乙基胺，及其他者。 於一具體實施例，醯化反應之溶劑爲二氯甲烷，於其他具 體實施例中，使用THF、二乙基醚或t-丁基甲基醚，於少於 〇°C之溫度下可進行此反應。於一具體實施例，於-1 0°C或更 低下進行反應。於一具體實施例中，於-1 2 °C下以混合酐及 二甲基胺基吡啶於二氯甲烷偶合單-甲矽烷基脯胺酸雷帕黴 φ 素，得到中間產物。 於另一具體實施例中，醯化可如US專利申請公告No. US 2005/0033046 Al(2005年2月10日公告）所述。因此，於一 具體實施例中，於-1 1至-5 °C，4 -二甲基胺基吡啶或相似催 化一氯甲；^兀中之存在下，使用苯基硼ϋ山 (phenylborinane)之2,4,6-三氯苄基混合酐得到中間物而達 成單-甲矽烷基脯胺酸雷帕黴素之醯化。於另一具體實施例 中’此苯基硼卩山爲2-苯基-i，3,2-二噚硼卩山_5_羧酸。於另一 # 具體實施例中，此苯基硼_爲2-苯基-1，3,2_二噚硼卩山-4-基， 其中苯基可選擇經取代。於再另一具體實施例中，苯基硼_ 爲5-甲基-2-苯基_1，3,2_二曙硼羧酸。 方々力具體貫施例中，苯基經烷基取代，如c 1、C 2、C 3、 C4、C5、或C0烷基。於此反應中可使用其它芳基包括苯 基-)硼酸，此等包括單、二及三取代芳基硼酸，其中取代基 爲相鬥或不同。於方基上之取代基包括鹵素、烷基、烷氧基、 芳氧基（例如，苯氧基）、芳烷基、硝基、氰基、及稠合苯基， 200533673 » 梟 如萘基硼酸。當烷基用於基團之一部分時如作爲烷氧基或芳 烷基之一部份，烷基部分包括1至12個碳原子，例如1 -6 個碳原子。芳基一詞作爲基團之一部分時，例如芳烷基或芳 氧基，意指包括彼等6-10個碳原子之芳族基團，例如苯基 或萘基。 於一具體實施例中，醯化反應之溶劑爲二氯甲烷。於其他 具體實施例中，使用THF、二乙基醚或t-丁基甲基醚。此反 應可於低於〇 °C之溫度下進行。於一具體實施例中，此反應 φ 於-1 〇 °C或更低之溫度下進行。於一具體實施例中，以於二 氯甲烷之混合酐及二甲基胺基吡啶在-12°C下偶合單-甲甲 矽烷基脯胺酸雷帕黴素以得到中間產物。 於適當溶劑（例如THF)及溫度中之弱酸水解得到CCI-779 之脯胺酸類似物。於一具體實施例中，使用稀釋無機酸如硫 酸、氫氯酸或磷酸。於另一具體實施例中，使用稀釋含水硫 酸，濃度範圍由0.1N至約3N。於一具體實施例中，濃度爲 2N ’於此等條件縮醛及甲矽烷基保護基於相同時間經水解。 φ 於更稀釋酸條件下，水解花更多時間完成。於一具體實施例 中’於25 °C或低於此溫度或約〇至5 °C下進行此步驟。 可使用熟習此項技藝者彼等已知之方法純化，例如包括色 層分析隨後最終結晶化（例如經醚處理）以供給純化之脯胺 酸 CCI-77 9。 於另一具體實施例，本發明提供一種具2,2-雙（羥基甲基） 丙酸之雷帕黴素42-酯（CCI-779)及脯胺酸CCI-779之新穎製 -10- 200533673 備方法，CCI-779之製備方法描述於下，然而，如下所述， 脯胺酸-CC 1-7 79可以相同方法由脯胺酸雷帕黴素製備。 此合成需兩步驟，第一步驟爲以2,2-雙（羥基甲基）丙酸衍 生物之活化酯於有機溶劑中將雷帕黴素經微生物脂肪酶催 化醯化，此反應爲極高區域選擇性的’造成過量形成之單 -42-醯化產物（例如經保護CCI-7 79)，接近定量產率。隨後 脫保護提供絕佳全部產率之CCI-779。與化學製備比較，此 化學-酵素性路徑提供較高產率之較短步驟。此外，此方法 不需任何保護雷帕黴素31-OH基團之步驟。 【實施方式】 下列流程說明此CCI-779之酵素性製備，下列實施例意圖 用作爲示例說明請求之發明，而不應解釋爲對請求發明的限 制。雷帕黴素及其製備述於US專利案No· 3,929,992，1975 年12月30日頒布。或者，可由商業上購買雷帕黴素 [Rapamune®，Wyeth] 〇

已發現2,2-雙（羥基甲基）丙酸側鏈之適當活化酯之界定爲 此脂肪酶催化之醯化的成功關鍵，本發明者們已發現對應烯 醇酯提供最高活性及最佳產率，尤其是乙烯酯。然而，亦可 使用其他醯化試劑如甲基、乙基酯、2,2,2-三氯乙基、2,2,2- -11- 200533673 三氟乙基酯及N-琥珀醯亞胺基酯。於丙酸之兩個雙羥基之 保護基於反應中亦扮演一種角色。於一具體實施例，使用環 縮酮及環硼酸酯，然而，其他保護基可選自保護基團中小到 足以適應此側鏈至酵素的活化位上者。 2,2-雙（羥基甲基）丙酸之活化酯具有下式結構：

OR, 0R2 起形 其中R爲氫或甲基，1及R2爲氫，或與結構

成縮酮，R3及R4各自獨立爲氫、W鏈或支鏈Ch6烷基，或 一起形成C5-7環烷基或與結構/ 5—起形成環硼酸酯，R5 選自甲基、乙基、η-丙基、異丙基、η-丁基、異丁基及苯基。 已選擇具異亞丙基縮酮（I)或硼酸甲酯（II)保護基之乙烯酯 (R = H)說明本發明結構。

於一具體實施例中，本發明方法之第一步驟係於微生物脂 肪酶存在下經由反應雷帕黴素與乙烯酯（I)或（II)而進行，於 適當有機溶劑中，於特定時間之理想溫度下。 如本文之使用，“微生物脂肪酶”，即，微生物來源之脂肪 酶，包括原始分離自非真核細胞來源之酵素，如黑曲黴菌 (Aspergillus niger )、南極念珠菌（C an d i d a an t a r c t i c a )、 皺措念珠菌（Candida rugosa)、毛黴菌（Mucor miehei)、 洋蔥假單胞菌（Pseudomonas cepacia)、螢光假單胞菌 (Pseudomonas fluorescens)、根黴菌（Rhizopus delemar) 〇 -12- 200533673 1 弟 然而，本發明使用選擇之酵素本發明不需直接分離及純化自 有機體來源，亦可以合成或重組製備，或其他適當方式製 備。各種此等酵素可自一些商業來源取得。此外，此等酵素 製備可呈來自不同微生物來源之粗製產物、部分純化、純化 或固定，由各種供應商以不同商品名提供。 於一具體實施例中，本發明方法中使用之PS-C“Amano” II 脂肪酶爲一種來自Amano之固定形式脂肪酶PS，然而，本 發明之使用可選擇其他脂肪酶。此等脂肪酶提供將雷帕黴素 φ 轉化成經保護CCI-779中間物之程度，以大於60%、大於 75%、或大於90%之程度。於另一具體實施例中，此等脂肪 酶避免來自脂肪酶催化性水解之斷裂-(seco-)衍生物的顯 著量形成。 以有效催化量使用此脂肪酶，即，於合理反應速率下有效 催化之量，雷帕黴素42-羥基之醯化形成經保護之CCI-779。 彼等熟習此項技藝者應明瞭此酵素使用量約 25至約 3 00wt%(相對於雷帕黴素之量）。於一具體實施例中，酵素之 φ 使用量爲約50至約250wt%、約50至約200wt%、或約75 至約 1 5 0 w t %。 適當有機溶劑包括（但未限於）甲苯、第三丁基甲基醚 (TBME)、乙基醚、THF(四氫呋喃）、MeCN、CH2C12、CHC13、 iPr20、己烷、二噚烷、或含此等溶劑之混合物。於一具體實 施例中，使用TB ME (第三丁基甲基醚）。熟習此項技藝者會 明瞭於開始時可有效溶解所有或部分起始雷帕黴素並使反 應以合理速率進行之此溶劑之量。例如’溶劑如TB ME，以 -13- 200533673 . * 至少4 wt量（即，超過4倍雷帕黴素之量）至約10 wt量使用， 或約5至8 wt量。 TB ME可含有殘餘水（例如，約0.05%)，其可分解雷帕黴 素成稱爲斷裂-衍生物，一種巨內酯環開環產物。爲了最小 化此副反應，於此反應系統維持低量溼度。於一具體實施例 中，以此脂肪酶催化劑之標準商業製劑使用無水溶劑。於另 一具體實施例中，可透過經由添加乾燥劑調整存於脂肪酶溶 液中的水量而控制溼度。於再另一具體實施例中，可使用分 φ 子篩控制溼度，由於分子篩將減緩反應，可添加更多酵素爲 補償，或使用較長的反應時間。於使用分子篩時，5 A篩特 別爲所冀欲的。然而，於其他者中之其他篩孔徑，包括4A 及3A，可輕易被利用。適當分子篩可由各種商業來源取得。 於再另一具體實施例中，乾燥劑如MgS04、Na2S04，於其他 者中，可用於控制溼度含量。 此反應於足以減少不欲之副產物形成之低溫度下進行，但 不至於低至需要不合理的長時間，此酵素方法之適當溫度可 鲁爲約2 0。。至約7 5 °c、約3 0。(：至6 5 °C、或約4 0 °c至5 5。(：。 於一具體實施例中，容許此反應之溫度爲於4 5 °c進行，當使 用TB ME作爲溶劑時。於此條件下，於48小時內此反應可 實際上完全完成（> 9 9 %轉化）。然而，如本文所述可使用較 低或較高溫度，反應時間長度會變化。於另一具體實施例 中’可容許反應進行約1 2小時至約1 20小時、1 8小時至96 小時、24小時至72小時、或約30小時至60小時，如所欲 或所需時。本發明未限制反應時間長度。於另一具體實施例 -14- 200533673 I 靡 中，此反應於N 2下進行直到起始材料耗盡。此反應可以各 種技術監測，如薄層色層分析（T L C )及高效能液體色層分析 (HP LC)。或者，可使用熟習此項技藝者使用之其他監測方法。 於一具體實施例中，經於45 °C 48小時混合雷帕黴素、 100wt%(相對於雷帕黴素之量）脂肪酶PS-C “Amano” II及於 無水TBME中之2,2-雙（羥基甲基）丙酸（I)之異亞丙基縮酮經 保護乙烯酯，經過濾移除酵素後，以〉9 8 %產率獲得縮酮經 保護 CCI-779。 於另一具體實施例中，此方法之進行係經由混合雷帕黴 素、160wt%脂肪酶PS-C “Amano” II及2,2-雙（羥基甲基）丙 酸（II)之硼酸甲酯經保護乙烯酯於無水第三丁基甲基醚 (TBME)，於45°C 60小時，經過濾移除酵素後，以高產率獲 得環甲基硼酸酯經保護CCI-779,以回收之雷帕黴素爲基礎。 於縮酮或硼酸酯經保護2,2-雙（羥基甲基）丙酸之酵素性安 裝至雷帕黴素42-位置後，於隨後生成中間物之脫保護獲得 CCI-779。 於硼酸酯衍生物之情形，硼酸酯保護基之移除可使用醇溶 劑實現。於本發明之具體實施例中，適當醇溶劑可選自甲醇 (MeOH)、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、乙二醇、 1，3-丙二醇及2-甲基戊烷-2,5-二醇，或此等溶劑之混合物。 於一具體實施例中，將由酵素反應生成之粗產物溶解於 MeOH且硼酸酯部分於CCI-77 9形成易變的二甲基硼酸酯， 經由與M eOH交換然後於減壓下隨者溶劑蒸發。剩餘殘餘物 200533673 ^ * 含所欲CCI-779伴隨著一些未反應雷帕黴素，其可經一般方 法分離，如砂膠色層分析。 縮酮保護基之移除可於弱酸條件下完成。一般而言，可依 據公告於US專利案No· 6,277,983之步驟及其引用之文件。 於一具體實施例中，於單相水性酸/有機溶劑系統中進行此 脫保護，例如，於四氫呋喃中之稀釋硫酸（THF)，如2N H2S04/THF，於約〇至5°C。然而，此反應可花3日或更多 時間完成且於反應完成後需溶劑提取以自水性媒劑中回收 φ 產物。 於另一具體實施例中，此酸促進脫保護可於其他水易混合 溶劑如乙腈（Me CN)、η-丙醇及異丙醇中進行，可單獨或以乙 腈與η-丙醇或異丙醇之混合物使用此等溶劑。如本文所述， 混合溶劑之比率可變化，由約5份乙腈與1份丙醇（ν/ν)，至 約1份乙腈與5份丙醇。本發明之此比率並未限制，當使用 上述溶劑或其他混合物作爲反應媒劑時，於一具體實施例 中，當最小化使用之其他酸如含水氫氯酸產生的不純物形成 φ 時，使用含水硫酸，如述於U S專利案Ν 〇 . 5，3 6 2，7 1 8。含水 硫酸濃度範圍可爲3Ν至0.25Ν，約2Ν至0.35Ν，或約1.5Ν 至0 · 5 Ν。此反應可於約2 5 °C或更低之溫度下進行，約-5 °C 至約1 〇 °C，或約〇 °C至約5 °C。當反應完全時，可由溶劑提 取回收粗產物，如US專利案No. 6,277,9 83 (國際專利公告 No. WO 0 1 /23 3 9 5 )中所述，或經由添加反應混合物至冰冷 (0 °C至5 °C )磷酸鹽緩衝液沉澱中。於一具體實施例中，磷酸 鹽緩衝液之濃度爲約2M至〇.〇5M、1M至0.1M、或0.5M至 200533673 » 0 0.15M，具有pH値之範圍約6至9，或7.5至8.5。 體實施例中，於〇°C至5°C含1·2 N H2S04之η-丙醇 脫保護，此反應於24h間完成，經由添加反應混合物 浴冷卻之磷酸鹽緩衝液（〇·5 M，pH 8)回收呈灰白色: 粗產物。於另一具體實施例中，此脫保護於〇°C至 乂^.11-丙醇（2.5/1.5乂~)之混合溶劑中進行，進行 28小時，於0.6 N H2S04存在下，經由添加反應混合 酸鹽緩衝液（〇·25 M，pH 7.8)回收呈灰白色粉末之粗產 • 於另一具體實施例中，CCI-7 79可經酵素性反應混 直接水解而獲得，使用含水2N H2S04之THF，不需 產物縮酮-經保護CCI-779。於此方法中，如上所述進 性反應，當反應完全時，濾除酵素並以2倍體積THF 然後濃縮混合物至一定量並以THF稀釋。以2N H2 0-5 °C處理一定期間後，以高產率分離出CCI-779。 本發明之合成路徑提供數種超過 US專利_ 5,362,718及6,277,983發表之合成法之不同優點，此 # 包括容易處理，僅涉及2步驟操作，且改良所欲42-體產率，例如，US專利案No. 5,362,7 1 8所述合成法提 產率之異亞丙基縮酮保護之CCI-779，且述於US專利 6,277,9 83之合成法提供85%產率，而本文所述2步 性合成法提供接近定量產率之產物。 於另一具體實施例中，此提供一種製備脯胺酸-CCI 方法，接近相關化合物CCI- 77 9，由脯胺酸-雷帕黴素 所述相同酵素性方法合成。脯胺酸-雷帕黴素，來自 於一具 中進行 至以冰 粉末之 之 此反應 物至磷 :物。 合物之 分離粗 行酵素 洗滌， S〇4於 ? Nos. 等優點 酯之整 供3 5% 丨案N 〇 . 驟酵素 -779 之 以本文 雷帕黴 -17- 200533673 e $ 素發酵粗產物之次要組份，僅有i個結構上不同之胺基酸單 元’即’雷帕黴素中之六氫吡啶甲酸以脯胺酸置換，脯胺酸 雷帕黴素、脯胺酸- CCI-779及其衍生物述於EP 5 89703。

脯胺酸-雷帕黴素 脯胺酸· c C I - 7 7 9 B 依據本發明製備生成之CCI-779及脯胺酸CCI-779有用於 醫藥組成物，此等組成物可以雷帕黴素或其衍生物之技藝中 所述適當方法調配。含本文所述活性成分之口服調配物可包 含任何習用口服型式，包括錠劑、膠囊、頰型、片劑及口服 液體、懸浮液或溶液。膠囊可含有活性化合物與惰性塡充劑 及/或稀釋劑之混合物，如醫藥上可容許澱粉（例如，玉米、 馬鈴薯、或木薯澱粉），糖，人工增甜劑，粉末化纖維素， 如結晶及微結晶纖維素，榖粉、明膠、樹膠等。有用的錠劑 φ 調配物可以形用壓製、濕顆粒或乾顆粒法製備，並利用醫藥 上可容許之稀釋劑、結合劑、潤滑劑、分解劑、表面修飾劑 (包括界面活性劑）、懸浮或穩定劑，包括（但未限於）硬脂 酸鎂、硬脂酸、滑石、月桂基硫酸鈉、微結晶纖維素、羧甲 基纖維素鈣、聚乙烯吡咯啶酮、明膠、褐藻酸、阿拉伯膠、 黃原膠、檸檬酸鈉、複合矽酸鹽、碳酸鈣、甘胺酸、糊精、 蔗糖、山梨醇、磷酸二鈣、硫酸鈣、乳酸、高嶺土、甘露糖 醇、氯化鈉、滑石、乾澱粉及粉末化糖。於一具體實施例中， -18- 200533673 > 麵 表面修飾劑包括非離子及陰離子表面修飾劑。表面修飾劑之 代表例包括（但未限於）卜洛姆（Pol〇xamer·) 188、氯化苄 院錢、硬脂酸釣、十八十六醇、聚西托醇（cetomacrogol) 乳化蠟、山梨糖醇酐酯、膠體二乙化矽、磷酸鹽、十二烷基 硫酸鈉、矽酸鎂鋁及三乙醇胺。本文之口服調配物可利用標 準延遲或時間釋放調配物以改變活性化合物之吸收。口服調 配物亦可由投與活性成分於水或果汁而組成，視需要含有適 當助溶劑或乳化劑。 | 於一具體實施例中，具3-羥基-2-(羥基甲基）-2-甲基丙酸 之雷帕黴素42-酯之口服調配物述於US公開專利申請案No. US 2004-0077677 A1 (亦爲 US 專利申請案 No· 1 0/663,5 06)，其以參考文獻倂入本文中。此口服調配物含有 使用濕顆粒法製備之顆粒。相似口服調配物可使用本發明之 脯胺酸-CCI-779製備。 於一些情形，以氣溶膠形式直接投與化合物至呼吸道爲所 欲的。 φ 亦可腸胃外或腹腔內投與此化合物，呈自由鹼或藥理學上 可容許鹽之此等活性化合物可於水中適當混合界面活性劑 如羥基-丙基纖維素而製備成溶液或懸浮液。懸浮液亦可製 備於甘油、液體聚乙二醇及其於油中之混合物。於常規儲存 及使用條件下，此等製劑含有防腐劑以防止微生物生長。 適於注射使用之醫藥型式包括無菌注射溶液或懸浮液之 即刻可用製劑用之無菌水溶液或分散液及無菌粉末。於所有 情形’此型式必須爲無菌的且必須爲流體至容易注射性存在 -19- 200533673 » · 之範圍。於製造及儲存條件下其必須爲穩定的，且必須防止 微生物如細菌及黴菌之污染。載劑可爲溶劑或分散媒劑，含 有例如水、乙醇、多元醇（例如，二醇、丙二醇及液體聚乙 二醇），其適當混合物，及植物油。 於一具體實施例中，可注射調配物述於US專利公開案No· US 2004-0167152 A1(亦爲 US 專利申請案 No. 10/626,943)， 其以參考文獻倂入本文。脯胺酸CCI-7 79之相似腸胃外調配 物可輕易製備。 | 於另一具體實施例中，本發明有用之可注射調配物提供含 有如上所述之腸胃外可容許溶劑及抗氧化劑之CCI-779或脯 胺酸-CCI-7 79共溶劑濃縮物，及含 CCI-779或脯胺酸 -CCI-779，由CCI-779或脯胺酸- CCI779、腸胃外可容許共 溶劑、抗氧化劑、稀釋溶劑及界面活性劑之腸胃外調配物。 所提供之本發明有用調配物中可含有每種組份之多種成 分。於一具體實施例中，腸胃外可容許溶劑可包括非醇溶 劑、醇溶劑、或其混合物。適當的非醇溶劑之例包括例如二 φ 甲基乙醯胺、二甲基亞颯或乙腈，或其混合物。“醇溶劑”可 含一或多種作爲此調配物醇溶劑組份之醇類，於此調配物中 有用溶劑之例包括（但未限於）乙醇、丙二醇、聚乙二醇300、 聚丙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇1000或其混合物。 此等共溶劑係特別冀望的，因位經由氧化及內脂裂解之降解 發生於此等共溶劑之較低範圍。此外，可合倂乙醇及丙二醇 以生產較不易燃的產物，但於混合物中較大量的乙醇一般造 -20- 200533673 * 9 成較佳化學穩定性。混合物中3 0至1 0 0 % v/v濃度之乙醇爲 較佳。 於另一具體實施例中，於腸胃外可容許醇溶劑中之 CCI-7 79或脯胺酸-CCI-779經由添加抗氧化劑至調配物中而 改良。可容許之抗氧化劑包括（但未限於）檸檬酸、d，l-a-生育酚、BHA、BHT、單硫甘油、抗壞血酸、沒食子酸丙酯， 及其混合物。一般而言，於本發明具體實施例中有用之腸胃 外調配物含有抗氧化劑組份，以濃度範圍由共溶劑濃縮物之 • 0.001%至1% w/v，或0.01%至0.5% w/v，然而較低或較高 濃度爲可能的。於一具體實施例中，d，l-a-生育酚以共溶劑 濃縮物之〇·〇1至0.1% w/v或0.075% w/v之濃度使用。 於其他具體實施例中，本發明調配物之抗氧化劑組份亦展 現螯合活性，此等螯合劑之例包括例如檸檬酸、乙酸、及抗 壞血酸（其於本發明調配物中可作爲傳統抗氧化劑及螯合劑 兩者）。其它螯合劑包括此等於溶液中能夠結合金屬離子之 材料，如乙二胺四乙酸（EDTA)、其鹽，或胺基酸如能夠增進 φ CCI-779或脯胺酸-CCI-779穩定性之甘胺酸。於再其他具體 實施例中，具螯合活性之組份包括於本發明調配物中單獨作 爲“抗氧化劑組份”。於一具體實施例中，此金屬結合組份， 當作爲螯合劑時，以提供於此之抗氧化劑組份之較低範圍使 用。此外，此螯合劑可與作爲本發明抗氧化劑組份之一部分 之其他抗氧化劑合倂使用，例如，可容許之調配物可含檸檬 酸及d，l-a-生育酚兩者。基於本文提供之資料，所選擇的抗 氧化劑之理想濃度可由此項技藝之人士輕易決定。 -21 - 200533673 於本發明中有用之非腸胃調配物之某些具體實施例中，透 過含於稀釋劑溶液中界面活性劑之使用可有利地防止 CCI-779或脯胺酸- CCI-779於以含水輸注溶液或血液稀釋之 沉澱，此稀釋劑最重要的組份爲腸胃外之可容許界面活性 劑，一種特別所欲之界面活性劑爲聚山梨醇酯20或聚山梨 醇酯80。然而，此項技藝之人士可輕易由膽酸鹽類（牛磺膽 酸鹽、甘胺膽酸鹽、膽酸鹽、去氧膽酸鹽等）中選擇其他適 當界面活性劑，其可選擇與卵磷脂合倂。或者，乙氧化植物 0 油如聚乙烯二醇化（pegylated )蓖麻油[例如，如爲固體之 PEG-35蓖麻油，例如，商品名爲Cremophor EL，B ASF]、維 生素E生育酚丙二醇琥珀酸酯（維生素E TGPS)、及聚氧乙 烯-聚氧丙烯嵌段共聚物可用於稀釋劑中作爲界面活性劑， 以及其他聚山梨醇酯家族如聚山梨醇酯20或60。稀釋劑之 其他組份可包括水、乙醇、聚乙二醇300、聚乙二醇400、 聚乙二醇600、聚乙二醇1000,或含一或多種此等聚乙二醇、 丙二醇及其他腸胃外可容許之共溶劑或藥劑之混雜物以調 φ 整溶液滲透性如氯化鈉、乳糖、甘露糖醇或其他腸胃外可容 許糖類、多元醇及電解質。預期界面活性劑含有2至1 00% w/v之稀釋劑溶液、5至80% w/v、10至75% w/v、1 5至60% w/v、或至少5% w/v、或至少1 0% w/v之稀釋劑溶液。 本發明中有用的腸胃外調配物可製備成單一溶液。於另一 具體實施例中，有用於本發明之腸胃外調配物可製備成含有 CCI-7 7 9或脯胺酸-CCI_779、醇溶劑及抗氧化劑之共溶劑濃 縮物，其隨後與含稀釋劑溶劑及適當界面活性之稀釋劑合 -22- 200533673 、 % 倂。於使用之前，將共溶劑濃縮物與含稀釋劑溶劑及界面活 性劑之稀釋劑合倂。當CCI- 779或脯胺酸CCI-7 79依據本發 明製備成共溶劑濃縮物時’此濃縮物可含有CCI-779或脯胺 酸-CCI-779 之濃度由 〇.〇5mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、 10mg/mL或25mg/mL至多至約50mg/mL。此濃縮物可與稀 釋劑混合，以多至約1份稀釋劑’得到具有CCI-779或脯胺 酸 CCI-779 由 Img/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL 至多 至約25mg/mL之濃度之腸胃外調配物。例如，CCI-779或脯 胺酸-CCI-779於腸胃外調配物之濃度可由約 2.5至 10mg/mL，本發明亦包含具有較少濃度之CCI-779或脯胺酸 -CCI-779於共溶劑濃縮物之使用，且調配物中濃縮物之一部 份與大於1份之稀釋劑混合’例如濃縮物：稀釋劑之比率爲 約 1 : 1 .5、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、或 1 : 9 v/v 等，於具 有CCI-77 9或脯胺酸-CCI-779之腸胃外調配物低至最低偵測 量° 於一具體實施例中，抗氧化劑可包含由約0.0005至0.5% w/v之調配物，界面活性劑可含有由約〇·5 %至約10% w/v之 調配物，及醇溶劑可含有由約10%至約90% w/v之調配物。 本發明中有用之腸胃外調配物可用於生產一種適於直接 注射投與或經添加至靜脈內輸注用之無菌輸注液體中之劑 型。 於此揭示之目的，了解經皮投與包括所有通過身體表面及 身體通道之內層（包括上皮及黏膜組織）之投與，此等投與 -23 - 200533673 可使用本發明化合物或其醫藥上可容許鹽於洗液、霜劑、泡 沫、貼片、懸浮劑、溶液及栓劑（直腸及陰道）。 經皮投與可透過含活性化合物及對活性化合物爲惰性而 對皮膚無毒的載劑之經皮貼片之使用而完成，可使其由皮膚 全身性吸收至血液而遞送藥劑。此載劑可有各種型式如霜劑 及油膏、糊劑、凝膠、及閉鎖裝置。霜劑及油膏可爲水包油 或油包水型式之黏稠液體或半固體乳劑。含活性成分之含吸 收性粉末分散於石油或親水性石油之糊劑爲亦適當的。各種 φ 閉鎖裝置可用於釋放活性成分至血流中，如半滲透膜覆蓋之 含活性成分的（含或不含載劑）儲存器，或含活性成分基質。 於文獻中已知其它閉鎖裝置。 栓劑調配物可由傳統材料製作，包括可可油，添加或不添 加蠟以改變栓劑熔點，及甘油。可使用水可溶栓劑基質，如 各種分子量之聚乙二醇。 本發明另提供含依據本發明生產之脯胺酸CCI-779或 CCI-779並調配成適於投遞之方法之調配物之包裝及套組。 φ 各種適當容器，包括瓶子、小瓶、氣泡包裝等爲彼等此項技 藝之人士已知，此等包裝及套組可令含有其他組份，包括使 用裝置、注射筒、塗藥器等。 下列實施例說明脯胺酸CCI-7 79之生產，由前述詳細說明 應容易知悉本發明不限於此等實施例中所提供之試劑及條 件。 實施例1 脯胺酸CCI-779之合成 -24- 200533673 f η

EtOAc, 0-5 C -0H p-TsOH Toluene

0.5 N H2S〇4 0-5 t B

t,^〇H

C

CH2Cl2 NEt(IPr)2

2NH2S04 E x〇-V-

ch3

on OH

色層分析 Η3^〇°ν〇 2.醚純化

ch3 脯胺酸-C C I - 7 7 9

此實施例描述C C I - 7 7 9之脯胺酸類似物之合成法，其說明 於上列提供之圖解中。 A· 31,42-雙（三甲基甲矽烷基）脯胺酸雷帕黴素（化合物B) 之製備 將脯胺酸雷帕黴素（圖解中之化合物 A)C1.47g， 1.63111111〇1)、咪卩坐（0.458，6.6111111〇1，4 69.)及乙酸乙酯（22.5 -25 - 200533673 mL)注入50 mL之3-頸燒瓶中，磁攪拌混合物成爲混濁的， 將混合物冷卻至0-5 °C，於氮保護下，經由注射器超過〇.5h 添加氯化三甲基矽烷（〇.62g，5.7mmol，3.5 eq.)，於添加時溫 度維持於0-5 °C。注射器以2· 5 mi乙酸乙酯清洗並將混合物 維持0.75小時（0.75 h)，於其間形成白色沉澱物。以薄層色 層分析（TLC)(3 0 : 70丙酮：庚烷洗析液）監測此反應，TLC 樣品經由淬火3-4滴反應混合物至〇.25 mL飽和碳酸氫鈉及 1 〇滴乙酸乙酯而製備，搖晃此混合物並使其沉澱，上層有機 φ 層有污跡爲有起始材料（脯胺酸雷帕黴素）。當不再有起始材 料存在時，此反應完全。 B. 3 1-三甲基甲矽烷基脯胺酸雷帕黴素化合物E之製備 當上列反應完全後，移除2-3滴此反應混合物並保留於下 列步驟中作爲31，42-雙（三甲基甲矽烷基）脯胺酸雷帕黴素參 考標準。於50ml燒瓶中以超過〇.5 h加入0.5N硫酸（4.5 niL)，維持溫度於0-5 °C，此混合物成爲較不混濁，維持此 混合物2.5 h並以薄層色層分析（TLC，30: 70丙酮：庚烷洗 φ 析液）監測，TLC樣品經由淬火3-4滴反應混合物至0.25 mL 飽和碳酸氫鈉及1 0滴乙酸乙酯而製備，搖晃此混合物並使 其沉澱，上層有機層有污跡爲有3 1,42-雙（三甲基甲矽烷基） 脯胺酸雷帕黴素參考物，當基本上不再有31，42-雙（三甲基 甲矽烷基）脯胺酸雷帕黴素存在時，此反應完全。添加乙酸 乙酯（5mL)並分離各層，下層水層以乙酸乙酯（7.5 mL)提取， 合倂之有機層以鹽水（7.5 mL)洗滌，依序以飽和碳酸氫鈉（6 m L)隨後以水（3 X 7.5 m L)洗滌，最後水洗之p Η爲6 - 7。有 -26- 200533673 « t 機層再次以鹽水（7.5 ml)洗滌並於硫酸鈉（4 g)上乾燥 2〇min，將混合物塡充至2 5 0mL燒瓶並濃縮至乾燥，於室溫 高抽真空（10 mmHg或更少）下乾燥此固體20 h，秤重=1.51 g 之灰白色泡沬。 C.中間物化合物F之製備： 將 2,2,5-三甲基[1，3-二曙烷-5·羧酸，化合物 C(0.63g， 3.6mmol)於二氯甲烷（7.5 mL)注入裝配有機械攪拌器之 10 0ml 3-頸燒瓶中，加入二異丙基乙基胺（0.77g，5.9mm〇l)， φ 隨後以二氯甲烷（1 ml.)洗滌，加入 2,4,6-三氯苄醯基氯 (0.85g，3.5mm〇l)，隨後以二氯甲烷（1.5mL)洗滌，將混合物 維持於室溫4.5 h，將溶液冷卻至-12±2°C。 溶解3 1-三甲基甲矽烷基脯胺酸雷帕黴素化合物E( 1.51 g) 於二氯甲烷（8 mL)並添加至100ml燒瓶中，以漂洗加入二氯 甲烷（2 mL)，製備二甲基胺基吡啶（DMAP)(0.77g，6.8mmol) 於二氯甲烷（3 mL)並超過2.5 h將其添加至lOOmL燒瓶中， 維持於溫度-12±2°C。以漂洗添加二氯甲烷（lmL)，將混合物 φ 維持1 6 h並以色層分析監測，經由淬火3 -4滴反應混合物至 0.25 mL水及0.2 mL乙酸乙酯，此HP LC樣品經抽取2滴上 層有機層，於氮氣下吹乾於HPLC小瓶之樣品並使用移動相 再溶解而製備。 HPLC 管柱：CSC Hypersil ODS / BDS 5gm 移動相：68.5 % 二曙烷··水 + 0.01M KH2P〇4 波長：λ= 2 8 0 nm 流速：1 mL/min -27- 200,533.673 時間：60 min 停留時間： 化合物E 〜 14.0-14.5 min 化合物 F 〜33.4-33.8min 當<0· 5 %之起始材料存在下此反應完全，反應混合物以水 (6 mL)終止，加入二氯甲烷（10 mL)並分開各層。水層以二氯 甲烷（10 mL)提取，合倂之有機層依序以 0.5 N硫酸（12 mL)、鹽水（10 mL)、飽和碳酸氫鈉（6 mL)及水（3 X 10 mL)洗 滌，最後之水的pH値爲6-7。將清徹黃色溶液濃縮至泡沫， φ 於室溫高抽真空（10 mmHg或更低）下乾燥此固體24 h，秤重 =1 . 8 8 g之黃色泡沬。 D·粗脯胺酸CCI-779之製備 將於THF(18.8 mL，10 vols)之化合物F注入裝配有機械攪 拌器之50mL 1-頸燒瓶中，然後冷卻至0-5°C (或約-2.5t：)， 以超過2.5 h加入2N硫酸（9.4 mL，5 vols)，完成添加後， 將混合物回溫至2 · 5 °C，然後維持4 5 h，以Η P L C監測此反 應，淬火 3-4滴反應混合物至 0.25 mL飽和碳酸氫鈉及 φ 〇.25mL乙酸乙酯，此HPLC樣品經抽取5滴上層有機層，於 氮氣下吹乾於HPLC小瓶之樣品並使用移動相再溶解而製 備。 HPLC 管柱：CSC Hypersil ODS / BDS 5μηι 移動相：68.5 % 二曙烷··水 + 0.01Μ ΚΗ2Ρ04 波長·· λ= 280 nm 流速·· 1 mL/min 時間：6 0 m i η -28- 200533673 停留時間： 化合物F 〜 3 3.4-3 3.8 min

去甲矽烷基化之化合物F 〜10.5-11.5 min (中間物） 脯胺酸〇(：1-779 〜5.0-5.5 111111 首先形成化合物F之去烷基化中間物，當<0.5 %之甲矽烷 基化類似物保持時則反應完全。將乙酸乙酯（27 mL)及鹽水 (7.5 mL)加入並分開各層，以乙酸乙酯提取水層（10 mL)，合 φ 倂之有機層依序以鹽水（10 mL)、飽和碳酸氫鈉（7.5 mL)及水 (3 X 7.5 mL)洗滌，最後之水洗pH爲6-7，將此混合物於硫 酸鈉（5 g)上乾燥30min，過濾至2 5 0mL燒瓶並濃縮至乾燥。 重量=1.58g之黃色泡沫。 E. 粗製脯胺酸CCI-779之色層分析純化 製備矽膠管柱（31.6g，60 A, 200-400 網格）（22 cm 長 X 2.5 cm直徑）並以1 5 : 85丙酮：HP LC等級己烷（1 L)，製備於丙 酮（1.58 mL)之黃色粗製脯胺酸CCI-779 ( 1.5 8 g)並色層分 φ 析，以剩餘15 :㈠丙酮：己烷混合物隨後爲2 5 : 75丙酮： 己烷（4 L)於丙酮洗析，合倂陽性濾份並濃縮至乾燥，生成的 泡沬於35°C高真空（即，lOmmHg或更少）乾燥24 h，重量= 1 . 1 2 g之淡黃色泡沬。 F. 脯胺酸CCI-779之醚處理 將脯胺酸C C 1 -7 7 9 (1 .1 2 g)注入5 〇 m L之1 -頸燒瓶中並如 溶解於醚（1 · 5 mL)中，維持此混合物2 h，除去醚得到泡沫， 於3 5°C於高抽真空（lOmmHg或更少）乾燥泡沫12 h，然後於 -29- 200533673 室溫隔夜（12 h)，重量=1.09g。4 NMR (500 及 600 MHz, DMSO-d6) δ 5.45 (H-l)，6.12 (H-2)，6·27 (H-3)，6.41 (H-4)， 6.20 (H-5)，3.66 (H-7)，1.14 及 1.86 (H-8)，4.02 (H-9)，1.19 及 1.81 (H-10)，1·52 (H-ll)，2.03 (H-12)，3.23 及 3.54 (H-18)，1.76(H-19)，2.20 及 1.89 (H-21)，4.22 (H-22)，4.87 (H-25)，2·28 及 2.70 (H-26)，3.22 (H-28)，5·11 (H-29)，

4.04(H-31)，4.17 (H-32)，2.25 (H-34), 0.9 8 5 及 1.38 (H-35), 2.22(H-3 6), 1.7 6(H-37)，0.961 及 1.11 (H-38), 1.3 1 (H-39)， 0.726 及 1.90 (H-40)，3.14(H-41)，4.46 (H-42)，1.22 及 1.81 (H-43)，0.8 8 8 及 1·60 (H-44)，1.60 (H-45)，3.05 (H-46, OCH3)， 0.697 (H-47)， 6.48 (H-48)， 0.821 (H-49)， 1.76 (H-50)， 約 5.1- 5.3 (H-51)， 3.17 (H-52， OCH3)， 0.755(1 1-53)， 0.966( 1 1 -54), 0.805 (H-55)， 3.29(H-56,

OCH3)，3.46(H-59), 1.01 (H-60)，約 4 · 3 - 4 · 7 ( 0 - 6 1 ) · 13 C NMR (75 MHz，DMSO-d6) δ 139.12 (C-l)，1 3 0.5 3 (C-2)， 1 32.49 (C-3)，1 27.08 (C-4)，127.21 (C-5)，137.12 (C-6)， 81.93 (C-7)，40.40 (C-8)，6 5.8 3 (C-9)，29.45 (C-10)，25.87 (C-ll)，34.21 (C-12)，99.2 5 (C-13)，198.17 (C-15)，165.55 (C-16)，47.01 (C-18)，24.04 ( C -1 9 )，2 8 · 9 3 ( C - 2 1)，5 8 · 5 0 (C-22)，1 70.44 (C-23)，73.24 (C-25)，3 9.96 (C-26)，207.67 (C-27)，44.51 (C-28)，1 23.92 (C-29)，1 3 6.5 6 (C-30)，75.84 (C-31)，84.8 6 (C-32)，209.49 (C-33)，40.76 (C-34), 3 9.20 (C-35)，3 5.05 (C-36)，3 2.73 (C-37)，3 8.42 (C-38)，32.06 (C-39)，36.01 (C-40)，80.12 (C- 41)，75.92 (C-42)，29.25 -30- 200533673 » · (C-43)，30.24 (C-44)，10.27 (C-45)，5 5.48 (C-46，OCH3)， 15.46 (C-47)，15.59 (C-49)，14.41 (C-50)，5 6.5 6 (C-52, OCH3)，12.67 (C-53)，21.50 (C-54)，14.89 (C-55)，57.27 (C-56，OCH3)，1 74.22 (C-57)，49.90 (C-58)，63.5 9 及 63.98 (C-59)， 16.82 (C-60)。MS [M + NH4 + ] 1 03 3.5， [ESI( + )， M + Na + ] 1 03 8.7。 下列實施例說明CCI-779之區域特異性生產。實施例2說 明本發明中有用的乙烯酯生產，然而，本發明並未限於此等 • 乙烯酯或此等生產方法。生產乙烯酯之適當改變方法爲熟習 此項技藝者所知。實施例3說明使用實施例2之乙烯酯之 CCI-779之區域特異性生產，及實施例4說明使用實施例2 v之乙烯酯之脯胺酸-CCI_ 7 79之區域特異性生產，由前述詳細 說明應可輕易了解本發明並未限於此等實施例中提供之試 劑及條件。 實施例2-乙烯酯之合成： A. I之合成：

PdCI2/LiCI(2% mol)

MeCN 0.25N H2S04

(MeB0)3

PdCl2(708 mg，4mmol)、LiCl(168 mg，4mmol)方令 MeOH (16 mL)於反流下加熱直到混合物成爲清澈溶液，然後於減壓下 移除MeOH，加入乙酸乙烯酯（1〇 mL)並將溶液濃縮至乾 -31- 200533673 真 島 燥，然後將殘餘物再溶解於乙酸乙烯酯（20 mL)中並加至2,2-雙（羥基甲基）丙酸（34.8g，200mmol)於乙酸乙烯酯（280 mL) 之混合物中，然後輕微反流混合物隔夜（約1 6 h) ’於減壓下 濃縮此溶液，將庚烷（1 5 0 m L)加至殘餘物中，並通過賽利特 (c elite)墊過濾移除黑色沉澱，濃縮庚烷溶液並於減壓下 蒸餾殘餘物得到成無色液體之乙烯酯1(30.1 g，75%)。 Β· II之合成： 1(10 g)於MeCN (50 mL)之溶液於室溫以含水H2SO4(20 φ mL，0.25 N)處理4 h，然後將此混合物以EtOAc稀釋，以鹽 水、2.5% NaHC03及鹽水洗滌，有機層於MgS04上乾燥， 過濾並濃縮至約60 mL，然後逐滴加入（MeB 0)3 (2.2 mL)至上 述溶液，於室溫攪拌混合物I·5 h，以己烷（6 〇 mL)稀釋，加 入MgS04(3 g)並另攪拌此混合物lOmin，過濾並濃縮得到油 狀殘餘物，其於減壓下經蒸餾得到成無色液體之11(7.2g， 7 8%) ° 實施例3 - C C I - 7 7 9之合成：

A·經由中間物A之CCI_779之合成 -32- 200533673 % 馨 方法1 : 於45°C Ah下加熱雷帕黴素（6 g)、乙烯酯I(2 g)、脂肪酶 PS-C “Amano” 11(6 g)於無水 TBME (36 mL)之混合物 2 日， 將混合物冷卻至室溫並經過濾移除酵素，濃縮濾液，於攪拌 下將油狀殘餘物加至庚烷，然後將此批冷卻至-1 5 °C 2 h，於 布氏漏斗上收集固體並以冷庚烷洗滌，獲得呈灰白色固體之 A，粗製產率：98 % .MS (E1): 1070。 上列粗製 A(6g)，溶解於以冰浴冷卻至〇°C之n-PrOH , (24mL)，將含水H2S04(12 mL，1.2N)加至此溶液，於0°C攪 拌此混合物24h，然後加至冷磷酸鹽緩衝液（3 00ml，pH7.8)， 於布氏漏斗上收集固體並以DI水洗滌並於真空下乾燥，以 己烷-丙酮洗析矽膠管柱純化提供呈白色固體之 CCI-779(5.2g，90%)，MS (El) ： 1 030。 方法2 : 將雷帕黴素（30.0g，32.8mm〇l)、乙酸乙烯酯（lO.Og， 50mmol)、月旨肪酶 P S - C‘‘Am an 〇 ” 11 ( 3 0 g )及分子篩（5 A) (1 0 · 0 • g)於無水TBME (150 mL)之混合物於42-43 °C Ar2下加熱48 小時，加入THF( 100 mL)溶解沉澱，並將混合物冷卻至室溫， 經過濾移除酵素並以THF(200 mL)洗滌，濃縮濾液至約60mL 並以THF (3 20 mL)稀釋，然後將溶液冷卻至0-5°C，逐滴添 加H2SO4(180 mL，2N)超過lh，於0-5°C攪拌此混合物48h 直到以TLC偵測A消失，以鹽水稀釋此混合物（3 00ml)並以 EtOAc提取（3次），合倂之有機層以H20、5% NaHC03，然 後以鹽水洗滌並乾燥（MgS04)，蒸發溶劑得到淡黃色半固 -33- 200533,673 體，其經驟色層分析純化（己烷/丙酮，2 : 1)得到呈白色固體 之 CCI-779(30.77g, 91%於兩步驟）。 B.經由中間物B之CCI-779之合成： 將雷帕黴素（3g)、乙烯酯11(1.2g)、脂肪酶PS-C“Amano”II (5g)於無水TBME(45 mL)之混合物於45°CAr2下加熱60h， 將混合物冷卻至室溫並經過濾移除酵素，濃縮濾液，將 MeOH(20 mL)加入殘餘物並濃縮至乾燥，以己烷-丙酮洗析 粗產物之矽膠管柱純化提供呈白色固體（2.3 g)之CC 1-779， φ 並回收雷帕黴素（〇 · 8 1 g)，基於經回收雷帕黴素之產率爲 93%。 實施例4-脯胺酸- CCI-779之合成 本發明之酵素性方法亦可應用於由脯胺酸-雷帕黴素至脯 胺酸CCI-779之合成，以基本上相同於實施例2方法A由雷 帕黴素至C C I - 7 7 9之合成所述條件。

脯胺酸-雷帕黴素 脯胺酸-c C I - 7 7 9 本發明並未限於本文所述特定具體實施例中範疇’的確’ 除了彼等本文所述者外，本發明之各種改質對於彼等熟習此 項技藝者由前述說明及附隨之圖示而爲顯而易見的。意圖將 此等改質涵括於附加之申請專利範圍之範疇中。 另應了解說明書提供之數値爲大略値。 -34- 200533673 本申請書全文引用之專利、專利申請案、公告、程序等， 其揭示完全以參考文獻倂入本文，對於說明書與參考文獻間 存有衝突時，以本文揭示之語言爲主。

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Claims (1)

1. 20Q533.673 十、申請專利範圍： 1. 一種具2,2-雙（羥基甲基）丙酸之脯胺酸-雷帕黴素42-酯 (脯胺酸-CCI-779)。 2. —種區域特異性製備具2,2-雙（羥基甲基）丙酸之雷帕黴 素42-酯或脯胺酸-雷帕黴素42-酯（CCI-779及脯胺酸 -CCI-779)之方法，其包含下列步驟： (a)將雷帕黴素或脯胺酸-雷帕黴素與具下列結構之2,2-雙（羥基甲基）丙酸之經活化酯衍生物反應

   其中Rt及R2爲氫，或與結構广〜一起形成縮酮，R3 及R4各自獨立爲氫、直鏈成支鏈d.6烷基，或一起 、B-Rr 形成C5_7環烷基或與結構/ 一起形成環硼酸酯，其 中R5選自甲基、乙基、η-丙基、異丙基、η-丁基、異 丁基及苯基； 於適當有機溶劑中’於有效量之微生物脂肪酶之存在 下；及 (b)由步驟（a)生成之中間物脫保護得到cci-779或脯胺 酸-CCI-779。 3 ·如申請專利範圍第2項之方法，其中經活化酯具有下列 結構

   -36· 200,533.673 其中R爲氫或甲基’11!及R2如申請專利範圍第2項之定 義。 4 ·如申請專利範圍第2或3項之方法，其中經活化酯爲乙 烯基酯。 5 ·如申請專利範圍第4項之方法，其中經活化酯係選自乙 燦基醋（I)及乙嫌基醋（II)組成之群

   6 ·如申請專利範圍第2至5項中任一項之方法，其中使用 之微生物脂肪酶係來自微生物黑曲黴菌（Aspergillus niger)、南極念珠菌（Candida antarctica)、皺褶念珠 菌（Candida rugosa)、毛黴菌（Mucormiehei)、洋菌 假單胞菌 （Pseudomonas cepacia )、螢光假單胞菌 (Pseudomonasfluorescens )、根黴菌（Rhizopus delemar ) ° φ 7.如申請專利範圍第6項之方法，其中使用之脂肪酶係來 自洋蔥假單胞菌之脂肪酶PS或PS-C。 8 ·如申請專利範圍第2至7項中任一項之方法，其中適當 有機溶劑係選自甲苯、第三丁基甲基醚（TB ME)、乙酸乙 酯、THE(四氫呋喃）、MeCN、CH2C12、CHC13、Pr20、 己烷、二噚烷、或包括此等溶劑之混合物。 -37- 20Q533673 9. 如申請專利範圍第2至8項中任〜項之方法，其另包含 於步驟（a)添加乾燥劑，乾燥劑選自無水MgS〇4及無水 Na2S04組成之群。 10. 如申請專利範圍第2至9項中任〜項之方法，其另包含 於反應步驟（a)中施用分子篩。 1 1 ·如申請專利範圍第2至10項中任〜項之方法，其中於步 驟（a)之反應於20°C至75°C之溫度下進行。 1 2 ·如申請專利範圍第2至1 1項中任〜項之方法，其中脫 保護步驟（b )包含溶解硼酸酯-經保護之c C I - 7 7 9或硼酸 酯-經保護之脯胺酸C C I - 7 7 9於醇溶劑，此醇溶劑選自甲 醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、乙二醇、1，3-丙二醇、及2-甲基戊烷-2,5-二醇或其混合物。 1 3 ·如申請專利範圍第2至1 1項中任一項之方法，其中縮酮 -經保護之C C I - 7 7 9或縮酮-經保護之脯胺酸-C C I - 7 7 9用 之脫保護步驟（b)於冰冷稀釋酸中進行，於水可易混合的 有機溶劑存在下。 14· 一種製備具2,2_雙（羥基甲基）丙酸之脯胺酸-雷帕黴素 42-酯（脯胺酸-CCI-779)之方法，其包含下列步驟： 使用氯化三甲基矽烷及咪唑於乙酸乙酯使脯胺酸雷帕 黴素雙-甲矽烷基化，形成31，42-雙-三甲基甲矽烷基脯胺 酸； 在稀釋酸條件下於4 2 -位置單-脫保護3 1，4 2 -雙-三甲 基甲矽烷基脯胺酸雷帕黴素，以提供3 1 -三甲基甲矽烷基 脯胺酸雷帕黴素； -38- 200533.673 反應混合酐與3 1 -三甲基甲矽烷基脯胺酸雷帕黴素及 於二氯甲烷之二甲基胺基吡啶；及 水解此產物以提供脯胺酸-CCI-779。 1 5 . —種如申請專利範圍第2至1 3項中任一項之方法製備之 具2,2-雙羥基甲基）丙酸之脯胺酸-雷帕黴素42-酯（脯胺 酸-CCI-779)。 16. —種組成物，其含有如申請專利範圍第1或15項之具 2,2_雙（羥基甲基）丙酸之脯胺酸-雷帕黴素42-酯（脯胺酸 • -CCI-779)及生理學上可相容之載劑。 1 7. —種如申請專利範圍第2至1 3項中任一項方法製備之具 2,2-雙（羥基甲基）丙酸之雷帕黴素42-酯（CCI-779)。 18. —種組成物，其含有如申請專利範圍第17項之具2,2-雙 (羥基甲基）丙酸之雷帕黴素42-酯（CCI-779)及生理學上 可相容之載劑。 1 9 · 一種產品，其含有如申請專利範圍第1 6或1 8項之組成 物及該組成物用之容器。 -39- 200533673 七、指定代表圖·· (一) 本案指定代表圖為：無。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明: 〇 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：