TW200536827A - Enzymatic ammonolysis process for the preparation of intermediates for DPP IV inhibitors - Google Patents

Description

200536827 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 木案請求2004年5月4 日$ _靑之美國臨時申請案號 6 0 / 5 6 8，0 9 7之優先權利益，其全文所掲示之內谷係併入本 文作爲參考。 本發明關於一種製備可用於製備二狀釀狀酶（D p p) IV抑制劑之中間產物的酶催化氨解方法’及一種利用該 中間產物以製備DPP IV抑制劑之方法。 【先前技術】 2002年12月9日申請之美國臨時申請案號 6 0/43 1，8 14揭示一種製備中間產物（5S ) — 5 —胺基羰基 一4，5—二氫一1只—吡咯—1—羧酸 1— (1，1—二甲基 乙基）酯（式A )之方法，

A 其係自，4，5 -二氫—1 Η —吡咯—丨，5 —羧酸i — (1，1 一二甲基乙基）一5—乙酯或甲酯（式b)， -5- 200536827 (2)

藉由與LiOH之皂化反應以水解化合物： 氯和氨反應以生成該式A中間產物。 該式A 中間產物係用於製備二肽醯肽酶 IS，3S，5 S ) — 2 — [ ( 2 S ) — 2 —胺基—2 — 環[3.3.1.I3,7]癸—1 一基）—1—酮基乙基]— [3.1 .0]己烷—3 —腈（揭示於 USP 6,3 95 ^67 | 文作爲參考）， i並與甲磺醯 IV抑制劑（ (3 -羥基三 2-氮雜雙環 μ，其倂入本

0H

)，該抑制 (參閱國臨時申請案號60/4 3 1,8 1 4之描 劑係用於治療糖尿病。 【發明內容】 (即（5 S )- 本發明提供一種製備結構式A中間產物 -6 - 200536827 (3) 5 —胺基羰基—4，5 —二氫一 1 Η —吡咯—1 —羧酸1 — ( 1 ，1 一 一甲基乙基）醋，亦稱爲（2S) — 2 —胺基凝基一 2 ，3 —二氫一 1Η-吡咯—1—羧酸]—(1，1—二甲基乙基 )酯，其係用於製備二肽醯肽酶IV抑制劑（1 S，3 S，5 S )—2— [(2S) — 2—胺基—2— (3—羥基三環[3.3.1.13,7] 癸一 1 一基）一 1 一酮基乙基]一 2—氮雜雙環[3.1.0]己烷一 3—腈（揭示於1^? 6,395,767中））之方法。

本發明製備中間產物Α之方法包括下述之步驟：提供 下述結構式B之化合物（5 S ) - 4，5 —二氫一 1 Η -吡咯 H — 1，5—二殘酸 1— (1，1 一二甲基乙基）一5—乙酯或 甲酯

(亦分別稱爲（2 S ) - 1 Η —吡咯一 1，2 —二羧酸 2 ，3 — _氯一1 一 （1，1一 一甲基乙基）一2—乙醋或甲醋 -7- 200536827 (4) )，及在氨源（諸如氨氣、氨基甲酸銨、甲酸銨、磷酸銨 、乙酸銨及類似物）之存在下，利用能夠催化該式B化合 物或其鹽之氨解反應以生成式A化合物或其鹽之酶、產製 該酶之微生物或具有源自該微生物之酶的結構之酶，令該 化合物B進行酶催化氨解反應以生成該中間產物A。

在進行化合物B生成化合物A之酶催化氨解反應中， 適宜地在溶劑（諸如支鏈叔醇，例如特丁醇、特戊醇及三 一甲基一3 —戊醇）之存在下，於約2 5至約8 0 °C (適宜地 約40至約7〇t )之溫度下，令該化合物B或化合物B之 甲苯溶解適宜地與（1 )念珠假絲酵母菌脂肪酶- B ( Cal 一 B )，其係能夠催化該式B化合物或其鹽之氨解反應以 生成該式A化合物或其鹽、及（2)氨氣及/或氨源（諸如 氨基甲酸銨）反應。可使用分子篩3A、4A或13X以幫助 除去乙醇。 本發明之方法中所使用之酶係水解酶，其適宜地係源 自含念珠假絲酵母菌，且較適宜地係念珠假絲酵母菌之分 級份B脂肪酶。 可溶解型式、粉末及固定化調製劑及冷凍乾燥調製劑 之念珠假絲酵母菌脂肪酶- B係可購得之商品。 該化合物B生成化合物A之酶催化氨解反應係產生乙 醇及當利用基甲酸銨時之C02。該反應中可包括使用各種 不同之添加劑以推進該反應以生成該醯胺化合物A。因此 ，爲幫助除去乙醇，可加入CaCl2、鹼石灰、CaO、 Ca(OH) 2、Mg(OH) 2 或 NaC03，適宜者係 CaCl2。該 200536827 (5) 乙醇除去添加劑之使用量係約1至約1 〇莫耳當量/莫耳酷 化合物B，適宜地係約1至約4莫耳當量/莫耳酯化合物B 。可選擇地，可使用分子篩3A、4A或13X以幫助除去乙 醇。

爲幫助除去C 〇2，可加入鹼金屬氧化物、氫氧化物或 碳酸鹽（諸如NaOH、KOH、Na2C03或鹼石灰，適宜者係 NaOH )或鹼土金屬氧化物、氫氧化物或碳酸鹽（諸如 CaO、Ca ( OH ) 2、Mg ( OH ) 2 )或叔胺（諸如三乙胺） 。該C〇2除去添加劑之使用量係約1至約1 0莫耳當量/莫 耳酯化合物B，適宜地係約1至約4莫耳當量/莫耳酯化合 物B。 於本發明之方法的一個較佳體系中，進行該酶催化氨 解反應係於氨基甲酸銨之存在下並利用莫耳比例約1 : 1 至約5 : 1 (適宜地約2 : 1至約4 : 1 )之氨基甲酸銨：化 合物B以生成約1至約5當量（適宜地係2至約4當量） 之氨氣。 於一適宜較佳體系中，單獨使用氨氣（約1至約5當 量，適宜地約2至約4當量）或倂用氨氣和氨基甲酸銨。 於另一適宜較佳體系中，係於芳香族溶劑（諸如甲苯 )之存在下，進行化合物B與氨及/或氨基甲酸銨之反應 。反應溫度係介於約2 5至約8 0 °C，適宜地係介於約4 0至 約 7 0〇C 。 可使用之念珠假絲酵母菌脂肪酶- B適宜地係爲冷凍 乾燥型式或固定化型式，其催化用量係介於約1至約5 0 -9- 200536827 (6) w/v%，適宜地介於約5至約4〇w/v%。 於本發明之另一方面，如示於下述之反應，該中間產 物A係用於產製中間產物J，其係藉由令該中間產物A經 由S i m m ο n s - S m i t h反應進行環丙院化反應以生成化合物Η ([IS- (α，3β，5 α) ] - 3 — （胺基碳基）—2- 氮雜雙 環[3·1·0]己烷一2 —羧酸1，1一二甲基乙酯），其係與

H C 1或甲烷磺酸（M S A )反應以除去Β Ο C基並生成片段（ IS，3S，5S) — 2 —氮雜雙環[3.1.10] —己烷一 3 —羧醯胺J

之氫氯化物鹽或MSA鹽，

其細節係描述於2002年12月9日申請之美國臨時申 請案號60/43 1，814及下述之說明中。 該片段（IS’ 3S，5S) — 2-氮雜雙環[3·1·〇]己垸一 3 —羧醯胺（式J)係於產製（IS，3S，5S) - 2 - [(2S) —2—胺基一2— (3—羥基三環[3.3.1.13,7]癸—；ι—基）一 1 一酮基乙基]一 2—氮雜雙環[3·1·0]己烷一 3—腈且可依據 下述反應圖II所示之方法產製。 本發明之酶催化氨解方法提供一種得到式Α化合物之 有效手段，該式A化合物係製備二肽醒肽酶抑制劑之 中間產物。藉由使用本發明之酶催化氨解方法可以環境友 -10- 200536827 (7) • 善之方式（減少廢棄物）達成減少或除去不欲之副產物（ • 其可使用先前技藝方法得到），保留對映異構純度（相對 於化學消旋反應）及縮短循環時間。使用本發明之酶催化 氨解方法的另一有益處係在於可利用溫和反應條件（即溫 度介於約4 0至約7 0 °C )進行該反應。 發明詳細說明

4，5 —二氫一 1H —吡咯—1，5 - 二羧酸 1 一（1，1 一二甲基乙基）一 5—乙酯或甲酯B轉化爲（5S) — 5—胺 基鑛基—4，5 -二氫一 1H —吼咯—1—殘酸 1— (1，1 — 二甲基乙基）酯之酶催化氨解反應係示於反應圖I。

反應圖I 酶催化氨解反應

念珠假絲酵母菌脂肪酶 叫源_ 40-60°C

如美國臨時申請案號60/431，814 (2002年12月9日 申請）所描述之方法和下述反應圖Π所示之方法，製備起 始化合物B ( RfEt )。 200536827 (8)

反應圖II

(Boc)20 (1.07 當量） DMAP(1 莫耳 ％) 甲苯，室溫，3h

1.LiEt3BH(l.l 當量） 甲苯,-45X ’COOEt 2. DIPEA, DMAP (cat.) TFAA Cal-B, NH3 tooEt 無水 t-Bu〇H, 40-80°C

conh2 CONH2

如示於反應圖II，首先令L 一焦谷胺酸（式E )酯化 以產生L 一焦谷胺酸乙酯（式F )。該L 一焦谷胺酸乙酯 隨後於其氮上經B 0 C保護以生成（5 S ) - 2 —酮基吡咯啶 —1，5—二羧酸 ！_(；[，；！ 一二甲基乙基）—5 —乙酯（ 式G)。隨後進行SuperHydride還原和除去反應以生成4 ’ 5 —二氫—1H —吡咯—1，5 —二羧酸 1— (1，1—二甲 基乙基）一5 —乙酯（式。 依據本發明之方法，令化合物B進行酶催化氨解反應 以生成化合物 A。 （5S) - 5 —胺基羯基一 4，5 —二氫一 1 Η —吡略—]—羧酸 1 — ( 1，1 一二甲基乙基）酯（式a )經由S i m m ο n s - S m i t h反應進行環丙烷化反應以生成[1 s -12- 200536827 Ο) (1°1 3β，5α) ]— 3 —胺基羰基）一 2 -氮雜雙環 [•3.1.0]己烷_ 2_羧酸1，1 一二甲基乙酯（式Η )。隨後 除去B〇C，生成該片段（iS，μ，5S) 一2 一氮雜雙環 [〕.1 · 〇 ]己燒—3 —羧醯胺之酸鹽（諸如η C 1鹽或M S A鹽， 式J )。

依據下述之反應圖！ I〗，其係詳細描述於2 〇 〇 2年1 2 月9日申請之美國臨時申請案號6〇/4 31 j 14及其對應之非 臨時申請案號10/7 ：! 6,〇 1 2 ( 2003年u月18日申請）中， 後者係倂入本文作爲參考，利用該化合物】製備式M之二 肽醯肽酶IV抑制劑化合物。

-13- 200536827 (10)

如示於反應圖III，令該片段（otS ) - α —胺基一 3 -羥基三環[3·3·1 ·13,7]癸烷一 1 一乙酸（式 V )於鹼（諸如 NaOH )之存在下與B0C20反應使該式V化合物首先經 B0C保護以產生（aS) — α[[(1，1—二甲基乙氧基）羰 基]胺基]一 3—羥基三環[3·3· 1 ·13’7]癸烷一 1 —乙酸（式VI )，隨後經乙酸乙酯（EtOAc )萃取以分離出自由酸VI。 可選擇地，可使用乙酸異丙酯/庚烷（2.25 : 1 )取代乙酸 乙酯以結晶析出自由酸VI。 -14- 200536827 (11) 令式 VI化合物之適當有機溶劑（諸如四氫呋喃（ THF )，冷卻至約2 0至約3 0 °C之溫度下）的溶液與甲烷

磺醯氯（Mesyl C1 )和Hunig鹼（二異丙基乙胺或DIPEA )反應以生成式VI化合物對應之甲烷磺酸鹽。 隨後利用偶合反應，在1 一羥基苯並三唑（HOBT )之

存在下將（aS) — αΙΙ(1，1 一二甲基乙氧基）羰基]胺基] —3 —羥基三環[3 . 3 · 1 .13，7 ]癸烷—1 —乙酸（式VI )偶合爲 (IS，3S，5S) - 2 —氮雜雙環[3·1·0]己烷一3 —羧醯胺（ 式J )甲烷磺酸鹽或HC1鹽、或在其他已知偶合劑之存在 下產生3 - （胺基類基）—（as) - a- （」一經基二環 [3.3.1.13,7]癸一1—基）—0—酮基—（13，33，53)—2 一氣雜雙環[3.1.0]己院一 2 —乙院氨基甲酸 1’ 1— 一甲基 乙酯（式K )。藉由令該化合物K與有機鹼（諸如吡啶或 三乙胺）和三氟乙酸酐或其他之脫水劑（諸如磷醯氯（ P0C13 )或氰尿醢氯）反應以使該式K化合物脫水，隨後 藉由令該反應產物冷卻至約25至約40 °C並與NaOH或其 他強鹼（諸如K0 Η或Li OH )反應以使該反應產物水解， 進而生成化合物L。隨後使3 -氰基一（aS) - α— (3 — 羥基三環[3·3·1·13,7]癸一 1—基）—β—酮基 一（1S，3S， 5S) —2 —氮雜雙環[3·1·〇]己烷一2 —乙烷氨基甲酸 1，1 一二甲基乙酯（式L )去保護以生成二肽醯肽酶IV抑制 劑（1S，3S，5S) - 2— [(2S) — 2-胺基—2— (3 —羥 基三環[3·3·1·13,7]癸一 1 一基）一1—酮基乙基]一 2 —氮雜 雙環[3. 1 .〇]己烷一 3 —腈（式Μ )。 -15- 200536827 (12) 如示於反應圖IV，藉由與強酸（諸如H c丨）反應可使 化合物1去保護。

反應圖IV

參閱反應圖IV，如下所述可自該經Β Ο C保護之中間 產物L生成自由鹼單水合物μ。 在二氯甲烷和甲醇之存在下，同時保持反應溫度介於 約2 0至2 5 °C，令經Β Ο C保護之中間產物l與濃H C1反

應以生成鹽酸鹽1/。令該鹽酸L，與HC1反應，再與NaoH 或其他強鹼反應以生成自由鹼Μ。隨後令該自由鹼Μ與水 反應以生成自由鹼單水合物Ν。 自該中間產物[1S— （α，3β，5α) — 3 —胺基端基]— 2—氮雜雙環[3·1·0]己烷_2—羧酸1，1—二甲基乙酯（ 式Η)除去BOC亦可生成該片段（is，3S，5S) — 2-氮 雜雙環[3.1 ·0]己烷一 3 -羧醯胺（式J )。於該較佳體系中 -16- 200536827 (13) ，該方法可進一步包含產製[IS - （ Ια，3β，5α) - 3-胺 基羰基]一 2 -氮雜隻環[3 · 1 . 〇 ]己烷一 2 —羧酸 1，1 一二甲 基乙酯（式Η )之步驟，其係適宜地經由Simmons-Smith 反應之（5S) — 5-胺基羰基—4，5 —二氫—1H —吡咯—1 一羧酸1 一（〗，1 一二甲基乙基）酯（式A)之環丙烷化 反應。

本發明之方法所使用之酶或微生物，無論其來源或純 度，可爲具有本文所描述之催化該轉化之能力的任何酶或 微生物。適合作爲催化酶之來源的微生物屬包括假絲酵母 菌（Candida )、桿菌（B a c i 11 u s )、假單胞菌（ Pseudomonas)及曲霉（Aspergillus)屬。 本發明之方法所使用之適宜酶係念珠假絲酵母菌脂肪 酶—B ( Cal — B )，其係爲 Biocatalytics公司所提供之 Chirazyme L— 2之商品化可購得之商品。於一適宜之較佳 體系中，將該Cal— B酶固定在一載體（適宜者係丙基矽 氧烷-二氧化矽—PVA溶解或其他已知之載體，如 Accurel MP — 100 ( Membrana GmbH 提供）或寅氏鹽 Celite R— 633 (矽藻土，Manville Co·提供））上，其載 入量係約40至約90w/w%，適宜者係約60至約80w/w%。 酶和微生物 關於微生物之使用，實施本發明之方法可使用具有本 文所描述之催化該轉化之能力的任何微生物細胞材料。該 細胞之使用型式可爲完整濕細胞或乾細胞（諸如冷凍乾燥 -17- 200536827 (14) 細胞、噴霧乾燥細胞或熱乾燥細胞）。該細胞之使用型式 亦可爲經處理之細胞材料，諸如破裂細胞或細胞萃取物。 所使用之細胞或細胞材料（諸如經分離之真菌菌絲）可爲 自由狀態或固定在載體上（藉由諸如物理吸附或陷入作用 )。進行本發明之方法可使用一或多種微生物。

實施本發明之方法可在所使用之微生物生長之後，其 係例如在或不在式B起始化合物之存在下生長該微生物， 收集並適宜地清洗（例如利用水）該微生物材料，隨後令 所得到之微生物材料與該式B起始化合物接觸。亦可於原 位醱酵和反應以實施本發明之方法，即在活性生長微生物 之存在下進行反應。 當使用酶時’該酶係適宜地源自上述之微生物，或可 經合成或其他方法加以製備。例如，該酶可源自經遺傳工 程之宿主細胞。亦可使用經遺傳工程之宿主細胞本身或已 經改質之細胞’其中該細胞能夠產製具有源自上述微生物 屬之酶的結構之酶。 反應條件 在缺少足夠量水之情況下，可於有機基質中進行本發 明之方法。適於該生物轉換之有機基質的實例包括甲苯、 己ί元、庚丨元、環己院、甲基特丁醚、丙酮、乙腈、二甲亞 砸、二甲基甲醯胺、環己烷、二甲苯、三氯三氟乙烷、四 氫呋喃、1，4 一二噁烷、醇類（諸如甲醇或乙醇、支鏈叔 醇（如特丁醇、特戊醇、3 -甲基—3 _戊醇））及包括彼 -18- 200536827 (15) • 等之混合物的類似物。 • 適宜之溶劑係甲苯、3 -甲基一 3 —戊醇及甲基特丁醚 與特丁醇（約9 : 1至1 : 1 )之混合物。該反應基質適宜 地含有約1 0至約1 0 0 m g式B起始化合物/ 液體基質。 本發明之方法中，添加之酶量適宜地係介於約〇 . 〇 J 至約lg/g式B起始化合物。 該反應基質適宜地係維持於約2 5至8 0 °C之溫度下， β 最適宜地係維持於約4 0至約7 0 °C之溫度下。典型之反應 時間係介於約2 5至約7 2小時。藉由增加反應溫度及/或 增加加入至反應溶液中之酶用量，可減少反應時間。適宜 地可使用分子篩3A、4A或13X以幫助除去乙醇。 【實施方式】 下述實施例代表本發明之較佳體系。

實施例1 酶催化氨解反應、

(2S) — 2 —氨基甲醯基—2，3-二氫—吡咯—1 一羧 酸特丁酯 (化合物A ) -19- 200536827 (16) 利用 50.0g/L 4，5 —二氫一1H —吡咯—1，5 —二羧酸 1 — ( 1，1 —二甲基乙基）—5 —乙酯（化合物B，約7 5 % 純度），25% w/v 固定念珠假絲酵母菌（Candida A 111 a r c t i c a )脂肪酶一B ( C a 1 — B，C h i r a z y m e L - 2，c . · f ‘ ·

C21yo )及1.7當量NH3 ( 5g/L氨基甲酸銨和50 2無水氨 氣）於總體積1 〇 2下進行反應。於7 5 t及培育搖動器搖 動2 0 0 r p m下，在緊密密封特氟隆燒瓶中進行該反應。經 42小時後，基於投入起始物，（5 S ) - 5 -胺基羰基一 4 ，5 —二氫一1H—吡咯—1—羧酸 1 一 （1，1—二甲基乙 基）酯（化合物A)之產率爲93%。 分析： 反應進展經由HP LC分析。藉由將20 // 1反應溶液加 入至9 8 0 # 1乙腈中並加以混合以稀釋樣品。 管柱： YMC-Pack ODS-A，1 50mmx6mm 移動相： c-h2o D-乙腈 流速： 1 . 0 m£ /分

梯度： 0 分-8 0 % C / 2 0 % D 1 2 分-2 5 % C / 7 5 % D 1 2·0 1 分-80%C/20%D 15.0分-結束 溫度： 4 0 t： U V 偵測： 2 3 0n m -20-

200536827 (17) ， 注射量： 5 μ \ * 滯留時間： 化合物Β-12.7分 化合物A - 6.7分 實施例2 4，5 —二氫一 1H —吡咯—1，5 —二羧酸，1— (1 甲基乙基）5 —乙酯（化合物B )之酶催化氨解反應 於5 0°C和400rpm下，利用冷凍乾燥之念珠假 菌脂肪酶一B ( Cal — B ; 16g/L )並於甲苯溶劑中令 (50g/L)化合物B與氨基甲酸銨固體（85g/L，5 量），進行氨解反應，經反應時間1 8小時和7 0小 分別生成6 0 %和8 4 %產率之對應醯胺（5 S ) — 5 — 基—4，5 —二氫—1H—吡咯—1—羧酸 1— (1，1 基乙基）酯（經由RP— HPLC測定）。 利用固定於丙基砂氧院一二氧化砂一 P V A溶膠 一 B (負載量爲8w/w% )係得到相似之結果。 在0.2至0.4 2等級，利用粗酯流作爲進料以 應。 酯進料： 50g/L (包含200g/L溶

之酯的產程流之1/4稀 NH3供應進料： 85g/L

觸酶進料： 16g/L

反應溫度· 5 0 °C 反應時間： 7 Oh ，1 一二 絲酵母 0.22M 莫耳當 時後， 胺基羰 一二甲 之CAL 進行反 於甲苯 釋流） -21 - 200536827 (18) 產物產率（分析）： 產物濃度： 質量生產力： 8 4%

46g/L 2.9g產物/g-觸媒 實施例3

固定化，Cal-B，分子篩 MTBE/特丁醇/NH3 50°C

EtOH (2S) — 2—氨基甲醯基—2，3 —二氫—口比略一 1 一殘 酸特丁酯 (化合物A ) 在Accurel MP — 1000上固定Cal — B脂肪酶 得到 B 型可溶性念珠假絲酵母菌脂肪酶（

Biocatalytics)，其具有 5 05 IU/J之專一活性。將可溶性

酶（750 ，0.38MIU)力卩入至含有1275 水、225 2異 丙醇及 90g Accurel MP — 1000 ( Membrana GmbH)之混合

物中。未經調整，該反應混合物之pH値係5.2。於25 °C 下，利用下置攪拌器攪拌該混合物達4小時以使該Accurl Μ P — 1 0 0 0均勻地分散於該混合物中。利用B u c h n e r漏斗 上之Whatman#l濾紙過濾該樹脂。利用2倍體積水（45 00 2 )沖洗該樹脂，並於室溫和真空下令該樹脂置於該

Buchner漏斗上乾燥，直至該樹脂重量等於原始置入之重 量。於4°C下貯存該Accurel固定化CAL — B酶。最終產 物之重量係9 0 g，專一活性係1 9 7 0 T U / g及產率係4 7 % ( -22- 200536827 (19) 0· 1 8MIU ) 〇 酌分析如下：將含有〇·2Μ二丁酸甘油酯、2%阿拉伯 膠、0.2Μ CaCl2 及 10mM Hepes 緩衝液（ρΗ7 5 )之乳化 反應混合物（2 0 )置入2 5 °C之套層容器中。加入酶（

口J溶性或固定化）並藉由 Radi〇meter滴定器）機型 PM290 )利用〇.〇5N NaOH滴定該反應混合物5分鐘。測 得速率介於2至4分鐘。若在該範圍內速率非呈線性，則 調整酶濃度。專一活性（單位/ g或)係界定爲在上述反 應條件下每分鐘產生1微莫耳丁酸之酶用量（藉由基礎攝 入測量）。

製備化合物A 於501：和20至30托之壓力下，濃縮（5S) — 4，5 —二氫一 1H —吡咯一 1，5—二羧酸丨―（1’，Γ一二甲基 乙基）5 —乙酯（化合物Β ; 54 J，〇.1〇96§/^，藉由1Η 一 NMR利用乙腈爲內部標準進行定性；24.5毫莫耳）之 甲苯溶液以除去溶劑。含殘餘物溶解於200 J特丁基甲醚 (ΜΤΒΕ )中，並於相同之條件下再次除去溶劑。於配備 有磁石攪拌棒之三頸圓底燒瓶中，令該殘餘物溶解於24〇 Μ T B E中。將6 0 1 . 5 Μ銨之丁醇溶液（其製備係藉 由氣體銨冒氣至特丁醇中）加入至該Μ ΤΒΕ溶液中。攪拌 該溶液並持續自該燒瓶藉由泵令該溶液通過分子篩（ Linde 4Α，60g，於250 °C烘箱中隔夜先期乾燥）之套層管 柱，隨後再通過Accurel固定化Cal — B( 1970lU/g’ 15g -23-

200536827 (20)

- )之套層管柱，隨後再回流至該燒瓶中。循環速IS . 1 5 2 /分鐘。經由循環器，該管柱套層溫度控制在 而利用加熱罩令燒瓶中溶液之溫度控制在5 0 °C Η P L C ( U V 2 1 0 nm )監控反應之進行。經2 3小時卷 完成約50% (基於HPLC面積％ )。冷卻反應溶谉 並令其通過矽膠（Aldrich，目錄編號 2 3 6 8 3 — 7， 管柱（其已經由4 : 1 MTBE/1 .5 NH3之特丁醇溶 φ 3 00 2 )先期平衡）。丟棄該管柱之置入溶液。隨 :1 MTBE/1.5M NH3之特丁醇溶液（300 2)通遇 。將含有83%化合物B和1 7%化合物A ( HPLC 3 之置入溶液（約3 0 0 )轉移至該三頸燒瓶中。於 件下重新開始該反應。利用4 : 1 MTBE/1.5M NH3 醇溶液（5 00 W )輕洗該砂膠管柱。所收集之溶液 有化合物A。 另經2 0小時後，發現反應完成約4 0 °/。。經片 溫後，利用相同之方式再次將該反應溶液置於矽歷 。將含有大部份酯（94%化合物B和6%化合物A) 液（3 0 0 J )轉移至該三頸燒瓶中。於相同條件"T 始該反應。利用4 ·· 1 MTBE/1.5M NH3之特丁醇溶 d )輕洗該矽膠管柱。所收集之溶液主要含有化合 另經23小時後，發現反應完成約40%。經片 溫後，利用相同之方式再次將該反應溶液置於矽膠 。濃縮含有大部份酯之分級液（3 〇〇 )，並經IS 進一步乾燥後，回收總量爲2 · 3 5 g之化合物B ( 92 :控制在 5 0°C， 。利用 :，反應 ί至室溫 150g ) 液（約 :後令4 !該管柱 5 積 0/〇 ) ‘相同條 之特丁 :主要含 ‘卻至室 ;管柱上 之分級 重新開 液（500 物A。 •卻至室 管柱上 真空下 1%面積 • 24- 200536827 (21) ，3 9.7 %回收產率）。利用4 : 1 Μ T B E /1 · 5 Μ N Η 3之特丁 酯溶液（5 〇〇 1U£ )輕洗該矽膠管柱。令所收集之溶液與先 前2次分離所收集之2個5 〇 〇 2分級液結合。經除去溶劑 並於高真空下乾燥後，得到總量爲3.4 1 g無定形之化合物 A ( 98.7%面積）。總體而言，自化合物B之物質平衡係 105% ’主要產率係65.6%及3 9 7%回收之酯。

隨後再結晶該無定形之化合物A。因此，令該3.4 1 g 醯胺溶解於乙酸乙酯（8 )中。加入環己烷（2 4 J )。 經攪動約1小時後後，結晶析出產物。得到總量爲2.5 g 淡黃色固體（7 3.5 %回收率，純度爲1 0 0重量％，1 0 0 %面 積’ 100 % e.e)藉由NMR確認該產物與先前分離者相同並 爲化合物A。乾燥母液生成〇.9g油狀物，其至要含有化合 物A ( 95 %面積）。

3-甲基各戊醇氨基甲酸銨 60°C，批式反應 B 實施例4 Cal-B c.f. C2,分子篩

EtOH A 固定化脂肪酶及3 —甲基一 3 -戊醇作爲溶劑（批式） 令甲苯中之粗化合物B ( 2.78g ; lg酯，4.2毫莫耳） 溶解於3 -甲基一 3 —戊醇（2 0 )中。將固化C A L — Β 脂肪酶 c.f.C2(lg，Biocatalytics) ，4A 分子篩（2g)及 氨基甲酸銨（1 g，1 2.8毫莫耳，約3當量）加入至錐形燒 瓶中，並於6 0 °C和2 0 01· p m下搖動該混合物。經6 6小時 -25- 200536827 (22) 後’反應顯示99.2%莫耳轉化。經由通過燒結玻璃過濾該 混合物’生成其中未能偵測出起始酯之樣品。藉由真空下 蒸發進行濃縮，生成2.2 g粗產物，A P = 9 2 %，3 7 %效能（ 其代表0 · 8 1 4 m g化合物a ( 3 . 8毫莫耳，9 3 % ))。利用 己烷：EtOAc ( 1 : 9 )令該樣品通過二氧化矽以進行過濾 ，生成 9 9 5 m g 油狀（a P = 9 8 · 5 %，效能=8 2 %，代表 8 1 5 m g ，3.8毫莫耳，93%)。藉由溶解殘餘物於1.5 EtOAc

中並加入約7 環己烷之結晶作用，生成白色晶體，經收 集及乾燥後產生 5 5 5 mg，62%，AP = 99.4%，92%效能（ w/w HPLC )之產物。 實施例5

A

B

Cal^B c.f. C3,分子餘 特戊醇細3~ 60oC, 2-管柱製程 固定化脂肪酶且特戊醇作爲溶劑（2 -管柱製程） 令化合物B之粗甲苯溶液（14以，3 6%效能，5 g活 性）與86 NH3之特戊醇飽和溶液混合。將該混合物置 入配備有冷凝器之三頸圓底燒瓶中並於60 °C下進行加熱。 利用磁石攪拌棒攪拌該混合物，並令其通過2個管柱（皆 保持於60 °C下），其中1個管柱含有2.5g固定化脂肪酶 C3(7142U/g)且另一個管柱含有5g之4A分子篩（其已 於高於1 〇 〇 °C之烘箱中先行乾燥）。流速係1 0至1 5分 。第24小時時轉化率係78%，而第46小時時轉化率係 >26- 200536827 (23)

92%。過濾所生成之溶液，真空下濃縮濾液，並利用己烷 :EtOAc. ( 4 : 1 )將其載入二氧化矽（約10g )管柱上， 且利用己烷、己烷：EtOAc ( 80 : 2 0 )、己烷：EtOAc ( 65: 35)，己烷：EtOAc(35: 65)及己烷 EtOAc( 1: 1 )進行流洗。最後2個流洗液之分級液含有化合物A，並 進行集中、濃縮且利用EtOAc作爲溶劑及約7倍體積之己 烷作爲抗溶劑以進行結晶。收集並乾燥白色結晶（2.9 g， 65%，ΑΡ = 99·6%，97%效能（w/w HPLC ))。 實施例6

EtCH 冷凍乾燥Cal-B，分子篩 ι

3-甲基-3·戊醇/NH3" 60°C 冷凍乾燥粉末’ 3 -甲基- 3 -戊醇作爲溶劑，批式反應 將5g化合物B乙酯（先前藉由自Me CN萃取至己烷 中加以純化）溶解於經氨飽和之3 -甲基一 3 —戊醇（1 0 0 d )中。先後加入經乾燥之4A分子篩（i〇g)和CAL — B 脂肪酶冷凍乾燥粉末（0 · 5 g )。於錐形燒瓶中且於6 0 t：下 搖動該反應溶液；於66小時內莫耳轉化率大於97% ( Η P L C )。過濾去酶和分子篩，濃縮濾液並通過S i Ο 2 (約 l〇g )進行過濾，且以己烷：EtOAc ( 4 : 1 )溶液之方式載 入。隨後經己院、己院·· E10 A c ( 8 0 : 2 0 )、己院： EtOAc(35: 65)及己烷：EtOAc(l: 1)流洗。最後 2 個流洗液之分級液含有化合物A，並進行集中，濃縮且利 -27- 200536827 (24) • 用EtOAc作爲溶劑及約7倍體積己烷作爲抗溶劑以進行結 ♦ 晶。收集並乾燥白色結晶（2 · 8 g，6 4 %，A P = 9 9 · 9 %，9 9 % 效能（w / w Η P L C ))。 實施例7

A

EtOH

B

冷凍乾燥Cal-B，分子篩 t 3-甲基各戊醇（NH3 "

60°C 冷凍乾燥粉末’ 3 -甲基-3 -戊醇作爲溶劑，批式反應

將5 g化合物B乙酯（先前已藉由自甲苯萃取至己烷 加以純化）溶解於9 5 4經氨飽和之3 —甲基一 3 -戊醇中 。先後加入l〇g乾燥之4A分子篩和CAL - B脂肪酯冷凍 乾燥粉末。於60 °C下和圓底燒瓶中，磁石攪拌該反應溶液 ;於18小時內，莫耳轉化率大於95% ( HPLC )。過濾除 去酶和分子篩，濃縮濾液，經己烷：EtOAc ( 4 : 1 )稀釋 ，利用己烷：EtOAc ( 8 0 : 2 0 )並過濾通過 Si02 (約20g )墊以除去殘餘之酯，隨後利己烷：EtOAc ( 20 : 8 0 )以 收集產物A。濃縮富含產物之濾液並於室溫下利用EtOAc 作爲溶劑及約7倍體積之環己烷作爲拮抗劑以進行結晶。 收集並乾燥白色結晶（3.6g，82% ) ，AP=100%，效能 10 0% ( w/w HPLC )，母液損失約9%，質量平衡約91%。 實施例8 藉由固定在寅氏鹽R - 6 3 3上之念珠假絲酵母菌脂肪 - 28- 200536827 (25) 酶B酶催化氨解4，5 —二氫一 1 Η —吡咯一 1，5 —二羧酸1 —(1 ’，1 ’ 一二甲基乙基）一5 —乙酯 製備念珠假絲酵母菌脂肪酶Β -寅氏鹽R — 6 3 3生物 觸媒 於40°C、氮氣及400rpm攪拌下，將3—胺基丙基三 甲氧基矽烷（1.32 4 ’得自 Aldrich，WI，USA)之甲醇 (4 )溶液加入至聚（乙二醇）二甘油醚（2g，得自

Aldrich，WI，USA )和氯化鉻（IV ) ( 50mg，得自

Aldrich，WI，USA )之混合物中。經1小時後，溫度升至 8 0 °C並持續攪拌2 0小時。該混合物以1 : 3之比例經無水 乙醇稀釋，將部份所生成之溶液（1 W )塗覆至寅氏鹽R —63 3 ( 1 g，0.5 至 2mm 顆粒，得自 Manrille Co·，USA ) 上，並於室溫下在流體化床乾燥器中乾燥該濕顆粒達0.5 小時。於烘箱中，在1 2 0 °C和空氣下，烘烤該乾粉末達2 0 小時，生成約1 — 17g經改質之寅氏鹽R— 6 3 3。令念珠假 絲酵母菌脂肪酶 B粉末（0.20g，125KUg — 1，得自 Biocatalytics，Inc·, CA，USA)溶解於冰冷磷酸鹽緩衝液 (0.8 ，0·2Μ，ρΗ7·0 )中，令該溶液與聚（乙二醇）貯 存液（0.4 m£，25%w/w PEG— 100，得自 Sigma，WI， USA，溶解於0.2M磷酸鹽緩衝液（ΡΗ7·0 )中）混合，並 將混合物塗覆至經改質之寅氏鹽R - 63 3 ( 1 g )上。於室 溫和真空下，在乾燥器Drierite上乾燥該塗覆物達20小 時，生成1.32g固定化物，其中酶載入量約爲15%w/w。 -29 - 200536827 (26) 利用固定化念珠假絲酵母菌脂肪酶B -寅氏鹽R ~ 6 3 3 生物觸媒之氨解反應

將該固定化生物觸媒（0 · 2 g )、氨基甲酸銨（〇 · 2 g ) 、氯化I丐珠（〇 . 2 g )及4 ’ 5 -二氫—1 Η —吼略—1 ’ 5 —二 羧酸 1 — ( Γ，1 ’ 一二甲基乙基）一5 —乙酯溶液（4.0 ，約1 2% w/w甲苯溶液，相當於〇.48g酯）載入20 4小 瓶中。利用配備有懸吊式磁石攪拌器之雙層PTFE -矽酮 —PTFE隔板蓋密封該小瓶，且於5CTC和3 5 0至40〇rpm 下攪拌該反應混合物。經8小時後，打開該小瓶並載入額 外之氨基甲酸銨（〇 . 1 g )和氯化鈣（〇 · 2 g )，隨後密封該 小瓶，持續進行該反應達42小時，隨後HPLC分析顯示 約8 2 %之該酯轉化爲醯胺。 分析 藉由Shimadzu LC — 1 0系統，經由RP — HPLC分析樣 品：Phenomenex Synergi Max — RP，4// m，2x50mm 管柱 ，利用10至1〇〇%Β以超過8分鐘之時間進行梯度流洗， 其中A爲8: 2(v/v)水一含有0.05%TFA之甲醇且B度 8 : 2 ( v/\〇乙腈一含有0.05%TFA之甲醇。流速爲0.6 J /分，注射體積爲5 μ 1，溫度爲室溫，偵測波長爲220和 22 5ηηι。RT (酯）=6.9 分，且 RT (醯胺）=2·0 分。 實施例9 藉由利用念珠假絲酵母菌脂肪酶Β進行4，5 -二氫 - 30 - 200536827 (27) —1 Η —吡咯一1，5 —二羧酸 1 — ( 1 1，1，一二甲基乙基） - 5 -乙酯之酶催化氨解反應 將念珠假絲酵母菌脂肪酶Β粉末（〇 · 1 2 g，1 2 5 kU/g， 得自 Biocatalytics, Inc.，CA· USA) ，4，5 —二氫—1H — 吡咯一1，5 —二羧酸 1— (l’，r —二甲基乙基）一5 —乙 酯溶液（6.0 ，20% w/w甲苯溶液，相當於1 .2g或5.9

毫莫耳之酯）、氨基甲酸銨（〇.4g，5.1毫莫耳）、氯化 金丐（0.6g)，經 NaOH 塗覆之二氧化 5夕（Ascarite-Aldrich ;0.60g，置入打孔懸吊小瓶上方之聚丙烯管中）及攪拌 棒載入2 0 J小瓶中。利用隔板蓋密封該小瓶，並於5 0 °C 和4 0 Or pm下攪拌該反應混合物72小時。經72小時後， HPLC分析顯示94%之受質已經轉化，其中87%轉北爲醯 胺，即對應於7.7g醯胺/g酶粉末之生產力。 分析 藉由Shimadzu LC — 10系統，經由RP— HPLC分析樣 品：Phenomenex Synergi Max — RP，4//m，2x50mm 管柱 ，利用1 〇至1 〇 〇 以超過8分鐘之時間進行梯度流洗， 其中A爲8 : 2 ( v/v )水一含有0.05%TFA之甲醇且B度 8 : 2 ( v/v )乙腈一含有〇.〇5%TFA之甲醇。流速爲0.6 m£ /分，注射體積爲5 // 1，溫度爲室溫，偵測波長爲220和 225nm。RT (酯）=6.9 分，且 RT (醯胺）=2.0 分。 實施例I 〇 -31 -

200536827 (28) 藉由利用固定化念珠假絲酵母菌脂肪 —二氫—1 Η —吼咯—1，5 —二殘酸 1 — 乙基）一 5 —乙酯之酶催化氨解反應 製備念珠假絲酵母菌脂肪酶Β -砂酮召 令念珠假絲酵母菌脂肪酶Β粉末（0. 得自 Biocatalytics，Inc·，CA，USA)，充 化石夕粉末（〇.15g，Aerosil，購得 Aldrich 合，並令其與矽烷醇終端之聚（二甲基矽_ ，包含90、750及1800 kC st寡聚物之1 合物，得自 Aldrich, WI，USA)混合以生 其邊速地與聚（矽酸二乙酯）（0.182 PA，USA )和辛酸錫（II ) ( 12 // 1，得 USA )之混合物摻合，並將所生成之糊狀 玻璃反應小瓶之內側壁，且於室溫下硬化 產生〇.73g之固定化產物，其中酶粉末載/ 利用固定化念珠假絲酵母菌脂肪酶B 之氨解反應 將 4，5 —二氫一1 Η —卩比咯—1 ’ 5 — ，1’一二甲基乙基）一 5—乙酯溶液（6.0 , 苯溶液，相當於〇 . 7 5 g或3 . 1 1毫莫耳之酯 (2 8 0 m g，3 · 6毫莫耳）、氯化鈣（〇 . 3 g ) 酶B進行4，5 (1，，1 一 二甲基 三物觸媒 1 5g，1 25kU/g， 分地與烘製二氧 ，W I，U S A )摻 氧院）(0.45 m£ :1 : 1 ( v / v )摻 成濃糊狀物。令 ，得自 Geleste， 自 Aldrich, WI， 物塗覆在20 J 達1 8小時。此 人量係2 1 % w / w -矽酮生物觸媒 二羧酸 1 一（ Γ 〇£，2 0 °/〇 w / w 甲 )、氨基甲酸銨 、燒鹼石棉劑（ -32- 200536827 (29)

3 g，置入打孔懸吊小瓶上方之聚丙烯管中）及攪拌棒載入 含有該固定化生物觸媒之小瓶中。利用隔板蓋密封該小瓶 ，並於5CTC和400rPm下攪拌該反應混合物。經48小時 後，HP LC分析顯示受質已完全轉化，令反應混合物流出 該小瓶，利用甲苯（24 5 ln£，於室溫和400rpm下攪拌15 分鐘）沖洗該固定化觸媒，將該反應混合物和燒鹼石棉劑 再載入該小瓶中，並重覆上述之實驗。實施4次上述4 8 小時之批式氨解反應得到下述之結果：醯胺生成之起始速 率（於反應開始後2小時測量）係1 · 4、1 · 4、1 · 2及1.0 莫耳/小時/kg，且該醯胺產率（於48小時）分別係87%、 8 8%、85%&82%(HPLC)。藉由旋光性Η P L C未偵測到 該醯胺產物顯著之消旋作用。平均醯胺產率係8 5 %，且累 積醯胺產量估計（HPLC )爲2.26g，對應於15.1g醯胺/g 酶粉末之淨生產力。該結果顯示該固定化生物觸媒可再次 使用至少1 〇次，其可達到之生產力至少爲3 0g醯胺/g酶 粉末。 分析 藉由Shimadzu LC — 1 0系統，經由RP — HPLC分析樣 品：Phenomenex Synergi Max — RP，4// m，2x50mm 管柱 ，利用1 〇至1 00%B以超過8分鐘之時間進行梯度流洗， 其中A爲8 : 2 ( ν/ν )水—含有0.05%TFA之甲醇且B度 8 : 2 ( v/v )乙腈一含有0.05%TFA之甲醇。流速爲〇·6 m£ /分，注射體積爲5 μ 1，溫度爲室溫，偵測波長爲220和 22 5 nm。RT (醋）=6 · 9 分，且 RT (醯胺）=2 · 0 分。 -33-

Claims (1)

1. 200536827 (1) 十、申請專利範圍 種製備式A化合物之方法，

   其包含於氨源之存在下令式B化合物

   與能夠催化該式B化合物之氨解反應以生成該式A化 合物的酶，產製該酶之微生物或具有源自該微生物之酶的 結構之酶接觸並達成該氨解反應以生成該式A化合物之步 驟。

   2.如申請專利範圍第 項之方法，其中該酶係水解 3 ·如申i靑專利範圍第2項之方法，其中該水解酶係 源自念珠假絲酵母菌（Candida antarctica) 4 ·如申請專利範圍第2項之方法，其中水解酶係源 自念珠假絲酵母菌之分級份B脂肪酶。 5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該念珠假絲 酵母菌脂肪酶- B係經固定化。 6. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該念珠假絲 酵母菌醋肪酶- B係固定在載體上’該載體係丙基砂氧院 -34 - 200536827 (2) 一二氧化砂—PVA溶膠或Accurel MP - 100或寅氏鹽R — 6 3 3。 7.如申請專利範圍第4項之方法，其中該念珠假絲 酵母菌脂肪酶- B係經冷凍乾燥。 8 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該氨解反應 係於約2 5至約8 0 °C之溫度下進行。

   9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該氨解反應 係於氨基甲酸銨及/或氨之存在下進行。 10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該氨解反應 係於4A分子篩及/或無水CaCl2之存在下進行。 11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該氨解反應 係於氨或氨基甲酸銨及4 A分子舗之存在下並利用甲苯作 爲溶劑下進行。 12·如申請專利範圍第1項之方法，其中該氨解反應 係於氨或氨基甲酸銨及4 A分子篩之存在下並利用支鏈叔 醇作爲溶劑下進行。 13·如申請專利範圍第1項之方法，其中該氨解反應 係藉由經4 A分子篩包覆於管柱反應器中之固定化生物觸 媒及/或在該生物觸媒反應器之後包覆於另一管柱中之無 水CaCl2進行。 14·如申請專利範圍第1項之方法，其包括維持反應 溫度於約25至約80 °C下及反應時間介於約2.5至約72小 時之間，令式B化合物於氨源之存在下與念珠假絲酵母菌 脂肪酶- B接觸之步驟。 -35- 200536827 (3) 如申W專利範圍第1 4項之方法，其中該式b化 口物係於势基甲酸銨及/或無水氨氣之存在下與念珠假絲 酵母菌脂肪酶一 B接觸。

   16.如申請專利範圍第丨丨項之方法，其中該式b化 口物係於氧基甲酸銨及/或無水氨氣之存在下且於作爲溶 劑之甲苯、3 —甲基一 3 —戊醇或甲基特丁醚/特丁醇（約4 • 1 )之混合物中與念珠假絲酵母菌脂肪酶- B接觸。 1 7 ·如申請專利範圍第丨1項之方法，其中該式b化 合物係與固定於載體上之念珠假絲酵母菌脂肪酶一 B接觸 ’該載體係丙基矽氧烷一二氧化矽一 PVA溶膠或Accurel MP — 100或寅氏鹽R— 633。 1 8*如申請專利範圍第1項之方法，其中係使用該式 八化合物以製備（18，38，53)-2—氮雜雙環[3.1.0]-己烷一 3-羧醯胺之氫氯化物或甲磺酸鹽（式。 19.如申請專利範圍第1項之方法，其中係使用該式 A化合物以製備二肽醯肽酶IV抑制劑。 2 0 · —種製備式J化合物之方法，

   其包含 a )利用申請專利範圍第1項之方法以製備式A化合 36- 200536827 (4)

   b )令式 A化合物經由S i m m ο η s - 烷化反應以生成式H化合物 A Smith反應進行環丙

   合物。 令式H化合物去保護以生成式J 2 1 . —種製備式Μ化合物之方法

   ΟΗ

   法所製備之式J化 物 -37- 200536827 (5)

   J b )令式J化合物與式VI化合物偶合， OH

   以生成式K化合物

   ΟΗ

   c )令式Κ化合物脫水以生成式L化合物 -38 - 200536827 (6) OH

   d )令式L化合物去保護以生成式M化合物。

   -39- 200536827 七 匕曰 定

   無 無 $ 本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學 式：

   〇