TW200402303A

TW200402303A - Composition containing bioactive materials and method of preparation and treatment

Info

Publication number: TW200402303A
Application number: TW092106321A
Authority: TW
Inventors: Grant Thomas Rawlin; Gottfried Lichti
Original assignee: Anadis Ltd
Priority date: 2002-03-21
Filing date: 2003-03-21
Publication date: 2004-02-16
Also published as: NZ535195A; EP1485111A4; WO2003080082A1; US20050175597A1; KR20040106298A; CN100571715C; CN1642561A; EP1485111A1; KR20100137015A

Description

200402303 玖、發明說明： [技術領域] 本發明有關一種包含生物活性物質之組合物及其投藥之方法。 [先前技術] 具有效生理作用之生物活性物質常對敵意環境非常敏感，如哺乳類的胃環境、南溫環境或南濕環境。此常限制其用途及指其不便於口服投藥，或其不便於保存或其不便於應用在溫產品線上。生物活性物質可選自以下一群，包括維生素、營養補充品、生長促進劑、抗贅瘤劑、口服疫苗、吸入劑、活微生物（例如益生菌如乳酸桿菌屬）、肽類、多肽類、核苷酸、多核芬酸、核：y：、蛋白質、醣蛋白、糖類和複合醣類、抗感染劑、殺菌劑、消毒劑、防腐劑、抗抑鬱劑、精神活性劑、基因修飾生物及作為其他生物活性物質載體之感染劑，其載體例如細菌載體（包括大腸桿菌、沙門桿菌、弧菌、乳酸桿.菌、芽孢样菌、分支桿菌、志賀桿菌）、病毒載月五（1括腺病母、痘病毒、桿狀病毒、疱疹病毒、腸病毒、副黏液病毒和流感病毒）、植物載體（包括煙草、馬鈐薯和香焦）、酵母載體、免疫球蛋白或親和力純化之免疫球蛋白包括對抗疾病之柷體和致病劑（例如幽門桿菌、大腸桿菌、芽孢才干固屬、病原性耶爾森氏菌屬和過敏原)及段片、衍生物及含有任何以上之複合物。生物；舌性*質功能之㉟意區域實例包括冑酸或高鹼 84475 200402303 區域、含蛋白水解酵素之區域；其中乾燥發生之區域、高濕區域、高溫區域、其中升壓導致變性之區域，例如製錠機及含DNA酶之區域。 “ 妥協生物活性物質功能之特殊敵意區域為哺乳類的胃環境，其含有高酸條件、升溫、潮濕、高濃度蛋白水解酵素及醣類消化酵素之部位。本發明之特殊應用在於保留其生物功能妥協於哺乳類胃環境之生物活性劑。多種於哺乳類胃環境中保留生物功能之方法在技藝中已知。此些包括腸衣、緩衝劑、福馬林安定劑、加入抗分泌劑’與餐點一起給予物質及改變乳牛之免疫化學以導致生物活性物質分泌至初乳。

Freichel〇L和Lippold BC (國際藥理學期刊，2001，三月 23; 216(1-2): 165-9)建議使用包括甲基羥乙基纖維素和羥丙基甲基纖維素乙酸酯琥珀酸酯之腸衣，以提供保護其内容物於哺乳類胃之腸衣。

Tackei C等人（新英格蘭醫學期刊，1986，五月12，ι24〇- 1243)使用蘇打之碳酸氫鹽緩衝溶液以降低人類胃中之蛋白水解。

Paliwal R和 London E (生化學 1996，二月 20; 35 (7): 2374-9)描述使用福馬林處理以安定白喉類毒素之構形。 Asad Μ等人（生命科學2001，十一月21; mg): 17·24)分別使用催產素和拉提尼化物（rantinide)以降低哺乳類胃中酸分泌而增加胃溃癌疲合率。 84475 200402303

McClead和Gregory，感染與免疫44: 474-478已顯示乳牛分泌至初乳之特異蛋白質更安定於胃環境中，其預期於相同類蛋白質由替代過程產生。此保留生物活性功能之原理已由Abbot美國專利號5260037所採用，其在採集初乳前使乳牛免疫。免疫化導致特異抗體（例如對抗幽門桿菌）分泌至初乳（即稱為高度免疫初乳）。高度免疫牛初乳亦述於國際專利申請案PCT/AU94/ 005 62，其生物活性安定於高壓環境，例如於製錠機中。高度免疫牛初乳亦由以下教導： • Mitra等人，Acta Paediatrica，84: 996-1001，1995。高度免疫乳牛初乳降低因輪狀病毒之下痢：雙盲控制之臨床研究。 • Nord等人，AIDS 4，581-584，1990。於 AIDS病患中以牛高度免疫初乳治療隱孢子蟲下痢。 • Tacket等人，新英格蘭醫學期刊，五月12，1988。牛乳免疫球蛋白濃縮物保護對抗腸毒素大腸桿菌之口服激發。 • Tacket等人，美國熱帶醫學衛生期刊47(3): 276-283, 1992。牛乳免疫球蛋白濃縮物於預防彎曲志贺桿菌激發疾病之效力。以上技藝中，高度免疫初乳為生物活性物質源及其後操作（若有時）涉及不想要成份例如水、脂肪、細胞物質、細菌和乳糖之除去。無教導指出添加初乳或初乳萃取物或初乳成份導致增強在敵意環境中保護生物活性物質之功能。與在哺乳類胃環境中保留生物活性功能之以上方法有關 84475 200402303 之問題包括以下：作用之藥劑。關於以被用對抗幽門桿菌之抗體著致因），此為特殊之限使用腸衣之策略不適合傳送胃中動免疫之途徑，由口服疫苗和/或使來控制幽門桿菌感染（其為胃炎之顯制0 使用緩衝溶液以降低哺乳類胃中蛋白水解之策略不適合於生物活性物質因酵素例如肽酶、殿粉酶之作用而喪失功能。如此酵素常與蛋白質療法與基於活生物之療法之功能喪失有關。再者，使用緩衝劑如碳酸氫鹽在一般基礎下並不需要。在敵意環境中使用福馬林處理（或其他交聯策略）以保留生物活性功能常無效於交聯反應摧毁物質之結構和功能。正因如此，此技術很少使用，除了存在有表面抗原以刺激免疫反應（例如白喉毒素，如述於petre等人，發展生物標準 1996; 87: 125-34) 〇激發乳牛分泌生物活性物質至初乳之方法有許多限制。些生物活性物質很難或不可能使乳牛將其分泌至初乳中0 生物活性物質之量會變化及此常於品質控制方面不被接受0 初乳中特異生物活性物質之最大量亦低及典型少於5 %免疫球蛋白。在錠劑療法中可接受之最大體積為每錠0·5立方公分（可接受每天2至3錠）。低濃度特異抗體嚴重限制治療選擇。 84475 200402303 再者，產生初乳之免浐 „ 丄兒反化礼牛斫產生供人類消費之牛

礼。在法規與食品安I 叉王咪璉下此呈現困難。再者，初乳每一與生產成本上造成泌至初乳時。年自乳牛產子後僅採集一次及此在邏輯門題’特別地在生物活性組份由牛乳分 [發明内容j 發明簡要吾等驚人地發現由不安定生物活性物質與哺乳類初乳或其成份在試管中（體外）混合操作中組合來保留不安定生物活性物質之功能是可能的。哺乳類初乳可為加工形式之哺乳類初乳。、本發明於是提供一種供投予不安定生物活性物質之組合物’包括不安足生物活性物質與哺乳類初乳之混合物。、、不女疋生⑱活性物質為一種在其使用之環境中其功能被，弱j生物活性物質’特別地在敵意環境如哺乳類胃或瘤 θ、咼溫環境或高濕環境之例中。在另樣怨中，本發明提供一種投予不安定生物活性物質（例如在哺乳類胃或其他敵意環境中其功能被減弱之生物活性物質方法，包括形成生物活性物質和哺乳類初乳之混合物，及施用組合物至在生物活性物質不安定之環境如胃環境或其他敵意環境中。在具體實施例中，組合物經口投藥。本發明進一步提供一種使用不安定生物活性物質於製造冶療或預防疾病之可攝取藥劑之方法，其物質功能在哺乳 fss'e 84475 -10- 200402303 類胃環境或其他敵意環境中被減弱，其方法包括將治療物質與哺乳類初乳或其成份混合。雖然大於預期’乳牛分泌至初乳之物質安定性已由許多研先者所狂記，但並無建議初乳或加工初乳可加入生物活性物質以在胃或瘤胃或其他敵意環境中保留其功能。較佳地，生物活性物質為一種能使生物之生理或醫藥參數有可測變化之物質。在特別佳具體實施例中，生物活性物質為抗生素。於疋，本發明提供一種抗生素組合物，包括抗生素與哺乳類初乳及視情況賦形劑。在本發明之另一樣態中，吾等提供一種益生菌組合物，包括一種益生細菌如乳酸桿菌屬及哺乳類初乳。發明之詳細說明本發明車父佳使用一種生物活性物質，其物質在3 7。〇下在

包括〇·32%豬胃蛋白酶溶液於0.03 M NaCl及以HC1調至PH 1·2之液中經培養6〇分鐘後，顯示其功能至少減弱。較佳地’哺乳類初乳為保持自分娩後最初4天之牛初乳，更佳地保持自分娩後最初2天之牛初乳，甚更佳地自保持分挽後第1天之牛初乳，及最佳地保持自分娩後第1次之牛初乳。才乳司在此使用時包括初乳；加工初乳如經加工以部伤或70王除去一或多種脂肪、細胞碎屑、乳糖及酪蛋白之初乳’及由冷/東乾燥、噴霧乾燥或其他技藝中已知之乾燥方法乾燥之初乳或加工初乳。初乳通常取自分娩後5天内之 84475 -11 - 200402303 哺乳類如乳牛。較佳地，哺乳類初乳使用脂操作及除去細胞碎屑之操去細胞碎屬之操作及除去鹽些水之操作。脫脂操作加工，更佳地使用脫作’更佳地使用脫脂操作、除、糖、其他低分子量實體和一乳和/或生物活性物f可為乾燥形式。成份可在乾燥過程㈤、期間或其後間歇混合。、較佳地生物活性物質和喷乳類初乳經混合及混合液可為較佳由冷凍乾燥法乾燥之水性混合液。 -在具體實施例中，生物活性物質與初乳萃取物之混合物經冷滚乾燥及至少冷;東乾燥物質之_半重包含加入之初乳或加工初礼。纟另一個具體實施例中’至少冷凍乾燥物質之3 /4重包含加入之初乳或加工初乳。較侄地，自乳牛收集之牛初乳包含至少4%總蛋白質（重量 %)，更佳地5%，更佳地至少8%，更佳地至少1〇%。較佳地，自乳牛收集之初乳中IgG對總蛋白質之比值至少 10%，更佳地20%。較佳地，生物活性物質選自由以下組成之一群：生長促進劑、抗贅瘤劑、口服疫苗、吸入劑、活微生物（例如益生菌如乳酸桿菌屬）、肽類、多肽類、核苷酸、多核苷酸、核蛋白貝、醣蛋白、糖類和複合醣類、抗感染劑、殺菌劑、消毒劑、防腐劑、抗抑鬱劑、精神活性劑、基因修飾生物及作為其他生物活性物質載體之感染劑，其載體例如細菌載體（包括大腸桿菌、沙門桿菌、弧菌、乳酸桿菌、芽 ?3：62 84475 -12- 200402303 孢=菌、分支桿菌、志賀桿菌）、病毒載體（包 :==、翁病毒、腸病毒、副黏液病毒和流感 ’丙母）植物載體（包括煙草、馬铃薯和呑萑备#坫疋& +、 τ署和香焦）、酵母載體、體二致广^親和力純化之免疫球蛋白包括對抗疾病之抗 I耶偷："如幽門桿菌、大腸桿菌、芽孢桿菌屬、病原 ":::氏菌屬和過敏原)及段片、衍生物及含 <複合物。特別佳地，生物活性物質嵌人刑單匕括早株或多株免疫球蛋白或早株抗月里或人化單株抗體或樹狀體呈現之免疫活性〇片如_)和_)2段片或重組免疫活性嵌片，或親和力純化之免疫球蛋白或些免疫球蛋白或其段片可盥病站奴片。此胳主主丄” 涡原囷結合，包括幽門桿菌、駘母素大細桿菌、假性結核病耶爾森氏菌。合物中初乳以物活性物質之比值將依賴活性物質 < 本質與其對胃中條件之八双愁度而足。血刑从 4胡對活性物質之重量比值大於〇 5 #社u I κ , 更佳地大於2 : 1，甚、加人初乳成份之上限受限於可方便投藥 <治療藥物量之實際限度。本發明組合物可以一範_ ®十丨丨，欲又朱如膠囊、錠劑、喑液體或其他技藝中已知之形式。組合物可進 —步包括適合胃腸投藥之载劑了進 ^ ^ . 、二賦^制。載劑和賦形劑之 :Ά ·石、滑石、二氧化敘、礬土、搬粉、古嶺 Ϊ:粉末：維素、微晶纖維素、果膠_、薦糖、乳：：匍萄糖、聚乙缔基吡咯啶酮、工丙基纖維素、甲基纖維 >3 84475 13 200402303 素、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、檸檬酸、碳酸氫斜' 硬脂酸鎂、蟲膠、纖維素乙酸酯、鯨蠟、檸檬酸三乙g旨、聚乙二醇。在另一個具體實施例中，生物活性物質包括免疫性蛋白質、醣蛋白或疫苗之其他成份或表現疫苗成份之生物。疫苗可針對病原性生物例如幽門桿菌、腸毒素大腸桿菌、假性結核病耶爾森氏菌。在另一個具體實施例中，生物活性物質選自由以下組成之-群：幽門桿菌之抗體、幽門桿菌之黏膜疫苗、腸毒素大腸桿菌（ETEC)之抗體' ETEC之黏膜疫苗、炭疽耶爾森氏菌之抗體、炭疽耶爾森氏菌之黏膜疫苗、毒素如萬麻毒素、志賀毒素和霍I毒素之抗體、輪狀病毒之抗體、輪狀 .、母《黏膜疫w g病母如腸病毒71之抗體及腸病毒如腸病毒71之黏膜疫苗。 =別佳之具體實施例中，本發明提供_種在病患中治 Μ疾病之方法，包括投予病患-種組合物，包括（a)對抗選自幽門}覃苗& + 及⑹m 腸桿菌群之病原微生物之疫苗及（b)哺乳類初乳。初孰活性之量存在將以足以增進疫苗在胃環境中在另—個特別佳之具體實施例患中治療或預&胃發月提供一種在祸病患-種組二=:門桿菌感染之方法，包括投予步包括哺乳類初乳。自門桿菌之結合蛋白質及進一在具随實施例中，夯 a 象蛋白或其段片衍生自卵，較佳 84475 今.Λ V:..〆 -14- 200402303 地自以對抗病原菌之死滅疫苗免疫化之母雞。本發明特财用於料在胃巾作用之生物㈣劑。例如對抗幽門桿菌感染之藥劑。然而，甚至用㈣”㈣霧形式生物活性物質在置於模擬胃液或其他敵思裱境時會失去活性。初乳或加工上二匕十i 子刀孔可保護其對抗此功此喪失及此保護作用預期有利於生物活性物質以吸入嗔霧劑傳送時。本發明有用於保護生物活性劑免於因酵素作用之蛋白水解以及因低pH條件發生之蛋白水解。益生菌領域在過去10年内快速發展。益生菌使用一些「友吾」細菌以處理或預防胃腸官能障礙。攝取友善細菌阻播有害腐敗和病原細菌之存在，乳酸桿菌屬為用於商業盈生菌而售於澳洲超市之主要細菌。此些細菌中之乳酸產生阻擋無法在酸環境中生長之有害細菌。乳酸桿菌亦可產生特異抗生素。例如會酸性乳酸桿菌產生嗜酸菌素 (acidophiline)，而保加利亞乳酸桿菌產生保加利亞菌素 (bulgarican)。雙又桿菌亦可作為益生生物。經報導益生菌 €助消化’幫助清除胃腸及促進正縈腸場動，以致摧毁黴菌、病毒和寄生蟲及平衡腸内pH。益生菌亦有用於治療或預防酸腸症候群，源自胃腸道中酸蓄積和毒素產生。經口投予益生菌可因益生菌通過胃中嚴厲條件之故而造成顯著活性喪失。與本發明一致之口服投藥時，吾等發現保留更大量之益生菌活性。 84475 -15- 200402303 益生菌可含有賦形物和佐劑及可為錠劑、粉劑或膠囊或液體形式。本發明進一步提供一種治療或預防胃腸功能障礙之方法，包括投予一種含有一種益生細菌如乳酸桿菌屬及哺乳類初乳之組合物。 · 細菌劑量可依賴病患病狀及功能障礙本質而定，但典型為每天105 CFU乳酸桿菌。本發明有用於保留非交聯生物活性物質之功能。本發明調配出治療劑，其顯著優於高度免疫初乳於以下方面： >生物活性物質之量可經控制至緊密限度内。 >與初乳分開製備之生物活性物質量不再受制於乳牛免疫活性物質之易變生產。自品質控制觀點而言，此為高度必要的。 >可以給足體積呈現之生物活性物質量可隨高度免疫初乳而增加大於4倍。例如自鳥類卵，特別地自免疫化母雞之卵黃S高度免疫球蛋白可經親和力純化及製成F(ab)2段片。此提供顯著擴張之治療選擇。 >本發明允許治療劑之生產而不需妥協於供人類消費牛乳生產之元整性。例如生物活性物質可在實驗室中製造及初乳自正常乳牛採集。 >牛初礼萃取物為一種澳洲治療物品當局所列補充醫藥之物質，因而促進在口服治療中初乳之利用。本發明現將隨參閱以下實施例而說明。當然，實施例藉說月本發月而提供且其不以任何方式限制本發明範缚。 84475 200402303 [實施方式】實施例實施例1 : 在胃環境内初乳由酵素活性之保嗜 1禾邊作為生物活性蛋白皙之保護實施例、前言：牛初乳作為胃環境中生物活性蛋白質活性保護劑之角色使用尿㈣酵純討。域討初乳之保護性質，模擬胃液對尿素酶活性之作用，在有或無牛初乳存在下相比較。材料輿方法：試劑 ULtLSigma傑克豆尿素酶第ΙΠ型（目錄號Uel 5〇〇)經作為酵素源。凍乾之尿素酶（16單位之引用活性/毫克；在pH 7〇和25 C下一單位自尿素每分鐘釋出1.0微莫耳氨）經溶於 MmiQ水至0·3單位/微升（約21毫克/毫升）及保存在冰中直至研究。模擬胃液（SGF、：（詞適自Hilger等人，2001)。0.32% Sigma 豬胃蛋白酶（目錄號P_7012，自胃黏膜）溶液在0.03 M NaCl 中製備及以HC1調至pH 1.2。初乳：脫脂之柬乾牛初乳萃取物（Anadis公司，「Gastran」批號G01)來自非免疫化之乳牛及原料製備物在300毫克/毫升下於MilliQ水中復原。見附件A之牛初乳萃取物之生產方法。尿素酶以模擬胃液（SGF〉虛揮 -17- 84475

/. W 200402303 培養混合液以4重覆’由尿素酶溶液之部份與等體積復原初乳或MilliQ水組合來製備。亦製備初乳製備物之控制組混合液和水（2重覆）。培養混合液1-4 ·· 100微升尿素酶+ 1〇〇微升MilHQ水培養混合液5 - 8 ·· 1 0 0微升尿素酶+1 〇〇微升初乳培養混合液9-10 : 100微升初乳+1〇〇微升MilliQ水混合液在添加50微升SGF至試管1、2、5、6和9而開始處理箣在37 C水浴中預熱5分鐘。假處理組由添加5〇微升0 03 M NaCl至試管3、4、7、8和10而開始。所有樣品在添加〇·25體積冷160 mM NazCO3至各試管而中止反應前在37。〇下培養15分鐘。試管然後在2〇,8〇〇客下在Eppend〇rf離心管 5417C中離心3分鐘及保存在冰中。上清液經分析尿素酶活性。尿素酶分析尿素酶分析使用增加敏感度之耦合酵素分析法（修飾自

Kaitwasser和Schlegel，1966)分析。此反應中，尿素酶酵素催化尿素之水解：尿素 + Η2〇 + 2H+ => 2NH4+ + C02 其由耦合氨產生與麩胺酸去氫酶反應來測定： 2NH + 2α -酮基戊二酸+2 naDH => 2麩胺酸+ 2 NAD+ + 2Η20 反應接著還原NADH成NAD。終分析體積1毫升含有終濃度1 ·6 mM之α -酮基戊二酸 (Boehrmger Mannheim 目錄號 m 205)、丨5 mM 84475 200402303 NADH(Sigma /3 -NADH 目錄號 N-8129)、1 5 單位 / 毫升 L-麩胺酸去氫酶（Sigma目錄號G-4387)、10 mM尿素（Boehringer Mannheim目錄號100 164)和1 mM硫化鉤（Sigma目錄號S-4766)在50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0)中。此些試劑在1厘米徑長聚苯乙烯光析管（Sarstedt目錄號67.742)中混合及然後允許在貝克曼DU70紀錄型分光光度計中平衡幾分鐘至室溫。分光光度計在添加樣品前，使用上述混合液歸零。 1 0微升各培養混合液之上清液樣品經加至分析混合液以開始分析。反應率在室溫與340毫微米下每10秒鐘紀錄至4 分鐘。反應率自曲線之線性部份（通常在最初1-2分鐘後）計算及尿素酶活性然後以每毫克蛋白質每分鐘水解尿素之微莫耳數表示。結果混料樣品處理尿素酶活性 (微莫耳尿素/分鐘/毫克酵素）平均 SD 1-2 尿素酶+ h2o SGF 0.027 0.022 3-4 尿素酶+ η20 假 0.158 0.021 5-6 尿素酶+初乳 SGF 0.138 0.018 7-8 尿素酶+初乳假 0.173 0.014 背景尿素酶活性 (ABS340毫微米/分鐘） 9 尿素酶+h2o SGF 0.021 10 1尿素酶+h2o 假 0.019 84475 -19- 200402303 如示於結果之表及圖l，添加模擬胃液至稀釋尿素酶溶液造成不可逆之酵素變性，及其後之活性喪失。SGF後剩低量尿素酶活性相當於見於單獨初乳（無尿素酶）控制組的。註：「假」處理組為鹽水而非模擬胃液（SGF)之處理組。相反地，添加初乳至尿素酶溶液提供尿素酶之保護免於胃蛋白酶和酸的作用。在初乳存在下，保護的尿素酶保有約80%假處理組尿素酶/初乳混合液之活性。使用此酵素模式，牛初乳經顯示提供模擬胃環境中蛋白質活性之保護。參考文獻

Hilger C, Grigioni F? De Beaufort C3 Michel G5 Freilinger J和Hentges F (2001)。lgG和IgA抗體與牛血清白蛋白抗原決 Λ 物之差異性結合。ciin Exp Immunol，123: 387_394。

Kaltwasser Η和 Schlegel HG (1966)<5 尿素酶與其他氨產生系統之依賴NADH耦合酵素方析法。分析生化學，16: 132- 138 。 5

Scott DR，Weeks D，Hong C，Postius S，Melchers K和 Sachs S (1998)。體内尿素酶在幽門桿菌酸抗性中之角色。胃腸學， 114: 58-70 。 ’ 實施例2 : 加工牛初乳粉之製備方法以下说程圖顯示用以提取初a及將其轉成加工形式之原理。 84475 -20- 200402303 加工廢產品

粗初乳自乳牛，最佳在產子後第一次授乳時收集。初乳在農場經保存在下及然後轉至-201下更長期保存或直接送至濕製造。粗初乳經溫至約371及然後以旋轉牛乳分離器脫脂以r 去脂肪。生成之液體可經低溫滅菌或以7_1〇微米陶瓷過系統微過濾（除去細菌與碎屑p液體然後經超過濾（例^ 平方米超過滤廠）以除去大部份水份、乳/ ^留下高蛋白質濃縮物。生成之高蛋白質、濃縮物進一 ’較佳地由冷;東乾燥(;東乾)或噴霧乾燥。 / 以上万法產生有如下規格之加工此產品經澳洲治療物品當乃σ下界足3 質。 “適合包含於治療物… 外觀：自由流動之淡黃色粉末。溫和牛乳氣味。性質：可分散於水中。當與水接觸時 84475 200402303 水份範圍2至5%質量比AS 2300.1.1(1988) 脂肪範圍1至4%質量比AS 2300· 1.3(1988) 灰份（@5 5 0°C )不多於 8% 質量比 AS 2300.1.5(1988) 總氮（TN)參考用 ** AS 2300· 1.2(1991) 非蛋白質氮（NPN)參考用 ** AS 2300· 1.2.2(1988) 純蛋白質不少於60%質量比（ΤΝ-ΝΡΝ)%χ6·38 蛋白質不少於60%質量比AS 2300.1.2(1991) 乳糖（單水和物）不多於15%質量比 UV为析’接奢酵素水解及氧化（B〇ehringer Mannheim) 總免疫球蛋白不少於20%質量比放射免疫擴散分析 (M/M質量比指成分之質量除以組成之總質量）微生物限度順從TGA指引殘留物：重金屬農業與獸醫化學品接觉乳製品之ANZFA食品標準碼。因無可用之食品標準，採用重金屬之BP試驗（以鉛計算之2 ppm)以及農藥殘量之61> 要求。 **用以計算純蛋白質之值「AS」指「澳洲標準」之澳洲標準組織系列文件一此例中，指乳製品品質與成份測試之標準化方法。實施例3 毯丄買蛋白酶處星之初乳保謹牛初乳在胃環境中作為蛋白質活性保護劑之角色使用抗體模式探討。為探討初乳之保護性質，模擬胃液對流感病 84475 -22- 200402303 毒特異單株抗體之生物活性作用，在有或無牛初乳存在下相比較。材料與方法：試劑盛感病毒與.，特_異單株_抗體：_用於本研究之A型流感病毒為 Mem71H_BelN(H3N3)。使用之抗體為Mem71『BeiN特異 IgG2a單株（Mab 36/2)在磷酸鹽緩衝鹽水中: 1〇稀釋。模·ΑΧ 液（SGF):(調適自 Hilger 等人，2001)。o n% sigma 豬胃蛋白酶（目錄號P-7012，自胃黏膜）溶液在〇〇3 M NaC1 中製備及以HC1調至pH 1.2。鼓旨之凍乾牛初乳萃取物（Anadis公司，「Gastran」批號G01)來自非免疫化之乳牛及原料製備物在3〇〇毫克/毫升下於MilliQ水中復原。單株抗體36/2以SGFit搜培養混合液由磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)中以丨：1〇稀釋之抗體部伤與等體積復原初乳或MilliQ水組合來製備。亦製備初乳製備物和水之控制組混合液。培養/此合液1-2 : 100微升Mab 36/2+100微升]yiilliQ水培養合液3_4: 100微升Mab 3 6/2 + 1 〇〇微升初乳培養混合液5_6 : 100微升初乳+ 1〇〇微升MilHQ水混合液在添加50微升SGF至試管1、3和5而開始處理前在 37°C水浴中預熱5分鐘。假處理組由添加5〇微升〇〇3 % NaCl至試管2、4和6而開始。所有樣品在添加〇·25體積冷 160 mM NaaCO3至各試管而中止反應前在37。〇下培養15分 84475

-23- 200402303 鐘。試管在16，100 g下在Eppendorf離心管5415D中離心3分鐘及保存在冰中。上清液經分析抗體活性。凝血抑制分析法抗體活性使用凝血抑制（HI)分析法分析。凝血滴定與HI 分析法由具有96孔U型底微滴盤（Sartedt群，SA，澳洲）和 1 %(體積比）雞紅血球之標準程序進行。凝血分析法經用以定量用於HI分析法之病毒凝血單位（HAU)。各培養混合液在PBS中以1 : 3.2稀釋，其造成1:100起始濃度之Mab 3 6/2。培養混合液然後以2重複在微滴盤上經系列稀釋2倍至每孔 25微升之終體積。4 HAU濃度之等體積病毒經加至各孔及抗體與病毒在室溫下培養30分鐘。30分鐘後，25微升雞紅血球（1%體積比在PBS中）經加至各孔及培養30分鐘。HI滴定值為抑制4 HAU病毒之最高抗體滴定值之倒數。分析以二重複進行2次。結果樣品處理 HI滴定值平均 SD Mab 36/2 + H2〇 SGF 200 0 Mab 36/2 + H20 假 1200 462 Mab 36/2 +初乳 SGF 9600 3695 Mab 36/2 +初乳假 8000 3200 Mab 36/2(1/100稀釋）未處理 800 0 背景初乳活性初乳+ H20 SGF 250 100 初乳+ h2o 假 350 300 84475 -24- 200402303 如示於結果之表及圖2，具有模擬胃液之Mab 36/2處理造成抗體凝血抑制活性之6倍降低。相反地，添加初乳至抗體製備物提供抗體之保護免於胃蛋白酶和酸的作用。在初乳存在下，保護的抗體未顯出活性之降低。使用此抗體模式，牛初乳經顯示提供模擬胃環境中抗體活性之保護。參考文獻

Hilger C, Grigioni F, De Beaufort C5 Michel G3 Freilinger J和Hentges F (2001)。IgG和IgA抗體與牛血清白蛋白抗原決定物之差異性結合。Clin Exp Immunol，123: 387-394。 * Deliyannis G，Jackson D，Dyer W，Bates J，Coulter A， Harling-McNabb L，Brown L (1998)。兩種具潛能供人類使用之佐劑對去活化流感疫苗之體液和細胞反應之免疫可能性。疫苗，16: 2058-2068。

Anders EM，Hartley C，Jackson D (1990)。流感 A 病毒之牛與小鼠血清/3抑制劑為結合苷露糖之凝集素。Proc Natl Acad USA，87: 4485-4489 〇實施例4 : 酸/胃蛋白酶處理期間胚芽乳酸桿菌活力之初乳保護前言：牛初乳在胃環境中作為細菌活力保護劑之角色使用乳酸桿菌屬活力平板計數分析法探討。為探时初乳之保遵性 84475 -25·

200402303 質，模擬胃液對胚芽乳酸桿菌之作用，在有或無牛初乳存在下相比較。材料輿方法：試劑涯__牙乳酸桿国.用於本研究之胚芽乳酸桿菌株為用於益生菌之菌株及獲自微生物研究單元之菌種收集中心，皇家兒重醫院’帕克維拉’維多利亞及類型由1 6 5次定序（自核糖體次單元之DNA定序）供口服投藥。菌株在馬血瓊脂（hba) 板上在37°C C〇2培養箱中培養48至72小時。乳酸桿菌之菌種製備由選取HBA板上至少2個菌落及接至2毫升鹽水以達到相當於〇·5 McFarland標準之濁度。此菌種然後用於所有處理組。模·擬胃液i_gGF):(調適自 Hilger等人，2001)。0.32% Sigma 豬3蛋白酶（目錄號P-7012，自胃黏膜）溶液在〇〇3 μ NaCl 中製備及以HC1調至pH 1.2。包iu_脫脂之凍乾牛初乳萃取物（Anadis&司，「Gastran」批號G01)來自非免疫化之乳牛及原料製備物在3〇〇毫克/毫升下於MilliQ水中復原。乳酸桿菌以SGF虛揮培養混合液由胚芽乳酸桿菌之菌種部份與等體積復原初乳或MmiQ水組合來製備。亦製備初乳製備物和水之控制組混合液。培養混合液1-2 : 100微升乳酸桿菌+1〇〇微升MilUQ水培養混合液3-4: 100微升乳酸桿菌+1〇〇微升初乳 84475 -26- 200402303 培養混合液5_6 : 100微升初乳+100微升MiUiQ水混合液在添加50微升SGF至試管1、3和5而開始處理前在 37 C水浴中預熱5分鐘。假處理組由添加5〇微升〇〇3 M NaCl至試管2、4和6而開始。所有樣品在添加〇·25體積冷 160 mM Na/O3至各試管而中止反應前在37^下培養15分鐘。 1L酸桿菌活力平板計勃處理後乳酸桿菌殘存使用活力平板計數技術分析。培養混合液之ίο倍稀釋液在處理後立即在鹽水中製備。微升之各稀釋液然I塗布至二重複之板上。平板經培養48小時及計算每板之菌落數。培養混合液之每毫升菌落生成單位 = 數然後由稀釋懸浮液之cfu/毫升數乘以稀釋倍數來計算。分析以二重複進行2次。 " 結果樣品 -----—----- 處理平板計數 (logio cfu/g ------ ------j 平均 SD 乳酸桿菌+ h2o SGF 3.99 〇 36 菌 + h2o 假 6.99 0.24 旱菌+初乳 SGF 7.01 ---------- 0.19 旱菌+初乳__^ ίκ 6.96 0.27 ——-~__ ----- 背景初乳活性初乳+ h2o SGF 0 0 jl|L^H20__ 假 u------ 〇__ 0__— 84475 -27- 200402303 如示於結果之表及圖3 ’添加模擬胃液至乳酸桿菌菌種造成乳酸桿菌活力之1000倍降低。相反地，添加初乳至乳酸桿菌菌種提供細菌保護免於胃蛋白酶和酸的作用。在初乳存在下，保護的乳酸桿菌未顯出活力之降低。使用此活力計數技術，牛初乳經顯示提供模擬胃環境中益生菌活力之保護。參考文獻

Hilger C? Grigioni F5 De Beaufort C5 Michel G5 Freilinger J和Hentges F (2001)。IgG和IgA抗體與牛血清白蛋白抗原決定物之差異性結合。Clin Exp Immunol，123: 387_394。

Miles A，Misra S (1938)。血液殺菌力之估計。j Hyg 38· 7*32-749 〇實施例6 : 酸/胃蛋白酶處理期間紅黴素活性之初乳保護前言 : 牛初乳在胃環境中作為生物活性部分活性保護劑之角色使用抗生素模式探討。為探討初乳之保護性質，模擬胃液對紅黴素活性之作用，在有或無牛初乳存在下相比較。材料輿方法：試劑紅黴素..J_Boehringer Mannheim紅黴素（C^HnNC^)作為抗生素源，在1毫克/毫升之原液濃度下溶於95%乙醇及保存在4 。(：下。為本研究，紅黴素原液在MilliQ水中稀釋至1〇〇微克/ 毫升及保存在冰中直至使用。

84475 -28- 200402303 模—擬胃液（SGF) : Π周適自 Hilger等人，2001)。0.32% Sigma 豬胃蛋白酶（目錄號P-7012，自胃黏膜）溶液在0·03 μ NaCl 中製備及以HC1調至pH 1.2。奴Jk」脫脂之滚乾牛初乳萃取物（Anadis公司，「Gastran」批號GO 1)來自非免疫化之乳牛及原料製備物在3 〇〇毫克/毫升下於MilliQ水中復原。紅黴素以SGF虛理培養混合液由紅黴素溶液部份與等體積復原初乳或 MilliQ水組合來製備。亦製備初乳製備物和水之控制組混合液。培養混合液1-2 : 100微升紅黴素+1〇〇微升MilliQ水 ‘培養混合液3-4 : 1 〇〇微升紅黴素+1 〇〇微升初乳培養混合液5-6 : 100微升初乳+1〇〇微升MilliQ水混合液在添加50微升SGF至試管1、3和5而開始處理前在 37C水浴中預熱5分鐘。假處理組由添加5〇微升0.03 Μ NaCl至試管2、4和6而開始。所有樣品在添加〇·25體積泠 160 mM Na2C〇3至各試管而中止反應前在37。^下培養15分鐘。試管然後在16，100 g下在Eppendorf離心管5415D中離心 3分鐘及保存在冰中。上清液經分析紅黴素活性。紅黴素易受性分析紅黴素活性使用枯草桿菌碟擴散易受性分析法分析。枯草桿菌（ATCC 6633)菌種製備由選取在馬血瓊脂（HBA)上生長過夜菌種之至少2個菌落及接至2毫升鹽水以達到相當於〇·5 McFarland標準之濁度。本分析之HBA板然後由無菌棉 84475 -29- 200402303 花畫線接種，、、* 彿反入‘準化溶液，在平板整個表面上均勻於3 個方向以彳| &丨^ 、力勻接種。平板然後在碟施用前允許乾燥3至 5分鐘。、、各處理組以MiUiQ水系列稀釋丨：2，造成各有6種稀釋履。20微升之各稀釋液然後載至二重複空白易受性碟 (Ox— ’美普郡，英國)。此些碟在置於二重複平板前允許乾燥至少30分鐘。各平板含有6個均勻放置之碟，對應著單。，理組的6個稀釋液。在_叫水巾稀釋至相當處理組樣 …辰度〈未處理紅黴素亦作為控制組，以得到標準曲線。平板在37°C下培養16-18小時。 •18小時培養後，枯草桿菌對紅黴素之易受性由測定環 ^菜《抑制環直徑來評估。此些環源自抗生素自堞擴散至衣％I瓊I日。準曲線使用源自系列稀釋之未處理红控制組之環直徑產生。試验烊σ^ … Μ彳驗‘-〈直徑然後用以得到相較於未處理控制組下，剩下纟黴本们下、、、工挺素活性之百分率重複進行3次。一結果

84475 -30 200402303 紅黴素+ η2ο 未處理 100 ......... — —-~— -η 0 背景紅黴素活性 (%) 初乳+ η2ο 初乳+ η2ο ---—--- SGF 0 U__ 0__ _ ................ ........ 如π於結果之表及圖4，添加模擬胃液至1〇〇微克/毫升溶液造成紅黴素活性之92%降低。相反地，添加初乳至紅黴素溶液提供紅黴素保護免於胃蛋白酶和酸的作用。在初乳存在下，保護的紅黴素保有 100%活性及相較於未處理控制組（見圖1和2)下真實顯示改進之活性。此增強之活性亦明顯於假處理之紅黴素與初乳溶液。初乳單獨未顯示背景抗生素活性，因此見於添加初乳之增強活性無法由初乳存在之背景紅黴素來解釋。使用此抗生素模式，牛初乳經顯示提供在模擬胃環境中抗生素活性之保護。參考文獻

Hilger C, Grigioni F, De Beaufort C, Michel G, Freilinger J和Hentges F (2001)。IgG和IgA抗體與牛血清白蛋白抗原決定物之差異性結合。Clin Exp Immunol，123 : 387-394。

Barry AL和Thomsberry C (1991)。易受性試驗：擴散試驗程序。於Balos A，Hauser WJ，Herman KL，Isenberg HD和 Shadomy HJ。臨床微生物學手冊，第5版，美國微生物學會，華盛頓，1117-1125。英國殺菌化學療法學會（1991)敏感性測試。英國殺菌化學 -31 - 84475 / -ΐΟΐ 200402303 療法學會，聖地牙哥。實施例7 : 酸/ 5蛋白_處理期間shirota酿蛋白乳酸桿菌活力之初乳保護前言：牛初乳在胃環境中作為益生菌活力保護劑之角色使用乳酸桿菌活板計數分析探討。為探討初乳之保護性質，模擬 Ώ液對自養樂多發酵液分離之shirota酪蛋白乳酸桿菌之作用’在有或無牛初乳存在下相比較。技料與方法：試劍 * gillm❻酷蛋白乳酸桿茼：用於本研究之shirota酪蛋白乳酸桿菌株分離自益生菌產品一養樂多。菌株在馬血瓊脂（hba) 板上在37°C C〇2培養箱中培養48至72小時。乳酸桿菌之菌種製備由選取HB A板上至少2値菌落及接至2毫升鹽水以達到相當於0.5 McFarland標準之濁度。此菌種然後用於所有處理組。遂_毯胃液（SGF):(調適自Hilget·等人，2〇〇υ。〇 32% Sigma豬胃蛋白酶（目錄號Ρ-7012，自胃黏膜）溶液在〇〇3 μ NaCl中製備及以HC1調至pH 1.2。 I乳：脫脂之凍乾牛初乳萃取物（Anadis公司，「Gastran」批號G01)來自非免疫化之乳牛及原料製備物在 300毫克/毫升下於MilliQ水中復原。乳酸槔茴以SGF處理 -32- 200402303 培養混合液由shirota酪蛋白乳酸桿菌之菌種部份與等體積復原初乳或MUiiQ水組合來製備。亦製備初乳製備物和水之控制組混合液。培養混合液1-2 : 100微升乳酸桿菌+1〇〇微升MilHQ水培養混合液3-4: 100微升乳酸桿菌+1〇〇微升初乳培養混合液5-6 : 100微升初乳+ 1〇〇微升MilHQ水混合液在添加50微升SGF至試管丨、3和5而開始處理前在 37 C水浴中預熱5分鐘。假處理組由添加5〇微升〇〇3 %

NaCl至試管2、4和6而開始。所有樣品在添加〇·25體積冷 160 mM NaKO3至各試管而中止反應前在37〇c下培養15分鐘。乳酸择茼活力平板計备

處理後礼酸桿菌殘存使用活力平板計數技術分析。培養匕否液之10倍稀釋液在處理後立即在鹽水中製備。工⑼微升 <各稀釋液然後塗布至二重複之板上。平板經培養48小時及計算每板之菌落數。培養混合液之每毫升菌落生成單位 (yfu)數然後由稀釋懸浮液之毫升數乘以稀釋倍數來計算。分析以二重複進行2次。結果

84475 -33- 200402303 初乳 SGF 7.01 0.18 +初乳假 6.97 0.03 背景初乳活「性初乳+ h2〇 SGF 0 0 初乳+ h2〇假 0 0 如不於結果之表及圖5，添加模擬胃液至shirota酪蛋白乳酸桿菌菌種造成乳酸桿菌活力之至少1〇,〇〇〇倍降低。相反地，添加初乳至乳酸桿菌菌種提供細菌保護免於胃蛋白酶和酸的作用。在初乳存在下，保護的乳酸桿菌未顯出活力之降低。使用此活力計數技術，牛初乳經顯示提供模擬胃環境中益生菌活力之保護。參考文獻

Hilger C3 Grigioni F, De Beaufort C5 Michel G, Freilinger J和Hentges F (2001)。IgG和IgA抗體與牛血清白蛋白抗原決定物之差異性結合。Clin Exp Immun〇i，123: 387-394。

Miles A，Misra S (193 8)。血液殺菌力之估計。j Hyg，38: 732-749 ° 實施例8 : 酸/胃蛋白酶處理期間霍亂毒素活性之初乳保護前言：牛初乳在胃壤境中作為佐劑活性保護劑之角色使用黏膜佐劑探討。為探討初乳之保護性質，模擬胃液對霍亂毒素活性之作用，在有或無牛初乳存在下相比較。材料輿方法i 84475 -34- 200402303 試劑震釓毒素及Y1腎上腺細胞：Sigma震亂弧菌霍亂毒素（目錄號C-8052)經作為佐劑源。霍亂毒素在MilliQ水中稀釋至 3.12微克/毫升之濃度及保存在冰中直至使用。Y1小鼠腎上腺細胞在每孔2x104個細胞下接種至96孔微低盤，在補充以 10%胎牛血清（FCS)和慶大黴素之DMEM生長培養基中。模擬胃液（SGF):(調適自Hilger等人，2001)。0.32% Sigma豬胃蛋白酶（目錄號P-70 12，自胃黏膜）溶液在〇.〇3 Μ NaCl中製備及以HC1調至pH 1.2。初乳：脫脂之；東乾牛初乳萃取物（Anadis公司，「Gastran」批號G01)來自非免疫化之乳牛及原料製備物在 300毫克/毫升下於MilliQ水中復原。震亂奏素以SGF虛理培養混合液由3 · 12微克/毫升霍亂毒素原液部份與等體積復原初乳或MilliQ水組合來製備。亦製備初乳製備物和水之控制組混合液。培養混合液1-2: 100微升霍亂毒素+ 1〇〇微升MilliQ水培養混合液3-4: 100微升霍亂毒素+ 100微升初乳培養混合液5-6 : 100微升初乳+1〇〇微升MilliQ水混合液在添加50微升SGF至試管1、3和5而開始處理前在 3 7 C水洛中預熱5分鐘。假處理組由添加5 〇微升〇·〇3 Μ NaCl至試管2、4和6而開始。所有樣品在添加0.25體積冷 160 mM NaeO3至各試管而中止反應前在37t下培養15分鐘。试管然後在16，100 g下在Eppendorf離心管5415D中離心 84475 -35- 200402303 3分鐘及保存在冰中。上清液經過濾滅菌及然後分析毒素活性。 Y1腎上臉細胞生物分析法霍亂毒素活性使用Y1腎上腺細胞生物分析法分析。γ 1小鼠腎上腺細胞在每孔2X 104個細胞濃度下接種至96孔微低盤。48小時後，細胞以PBS清洗3次。生長培養基置換以 DMEM，其補充以10% FCS和慶大黴素（1〇〇微升），含有處理組試管之二重複樣品，在1 : 1 〇之最初稀釋後，經系列稀釋2倍。霍毒素導致Y1小鼠腎上腺細胞自其常延長之型態變化為更圓的形狀。此些變化依賴濃度。細胞經培養丨8小時及然後以相對比顯微鏡檢查典型之圓形。分析之終點經定義為顯示多於50%細胞圓形之最高稀釋。分析以二重複進行2次。霍亂毒素之2倍稀釋在1〇毫微克/毫升之起始濃度下在相同板上分析及結果用以決定分析之靈敏度。結果樣品處理霍亂滴定值 dog 2) 平均 SD 霍亂毒素+ h2o SGF 0 0 霍亂毒素+ h2o 假 8 0 霍亂毒素+初乳 SGF 8 0 霍亂毒素+初乳假 7.5 0.71 霍亂毒素（10毫微克/ 毫升）未處理 8 0 84475 * 36 - 200402303 背景初乳、;Μ 初乳+ h2o SGF 2.5 〇 7 1 初乳+ h2〇假 3 U . / 1 0 噙丁於〜果之表及圖6，以模擬胃液處理霍亂毒素造成霍亂毒素生物活性之完全消除。相反地，添加初乳至霍亂毒素製備物提供毒素保護免於胃虫白酶和酸的作用。在初乳存在下，保護的霍亂毒素未顯示活性之降低。使用此霍亂毒素分析，牛初乳經顯示提供在模擬胃環境中黏膜佐劑之保護。參考文獻

Hilger C, Grigioni F, De Beaufort C, Michel G, Freilinger J和Hentges F (2001)。IgG和IgA抗體與牛血清白蛋白抗原決定物之差異性結合。Clin Exp Immunol，123: 387_394。

Tauschek M, Gorrell R, Strugnell R, Robins-Browne R (2002)。内毒素大腸桿菌菌株分泌}不穩内毒素之蛋白質分泌途徑鑑定。Proc Natl Acad Sci USA，99: 7066-7071。實施例9 : 胚芽乳酸桿菌在體内小鼠模式之保護前言：牛初乳在胃環境中作為益生菌活力保護劑之角色使用體内小鼠模式探討。為探討初乳之保護性質，小鼠經餵以具或不具初乳之胚芽乳酸桿菌或作為正控制組之碳酸氫鈉。材料與方法丄試劑 84475 -37- 200402303 胚芽乳MiL菌：用於本研究之胚芽乳酸桿菌株為實施例4 提及之菌株。菌株在馬血瓊脂（HBA)板上在37°C C02培養箱中培養48至72小時。乳酸桿菌之菌種製備由採取自至少2 個板之融合層細菌及接至50毫升鹽水以達到相當於 McFarland 4標準之濁度。細菌經片層化及丟棄上清液。細菌片然後再懸浮於2 · 5毫升鹽水。此菌種與生物盾、碳酸氫鈉或鹽水以1 : 1混合，得到1 X 1 〇9 cfu/毫升之終細菌濃度。包乳萃取物（或稱生物盾）：脫脂之凍乾牛初乳萃取物 (Anadis公司，「Gastran」批號G01)來自非免疫化之乳牛。樣品製備物在20、40和1〇〇毫克/毫升下於MilliQ水中復原。碳酸氩鈉：碳酸氫鈉亦在20、40和100毫克/毫升下於 MilliQ水中復原。企鼠以乳酸桿菌感染小鼠在接種前禁食3小時以確保其空腹。小鼠然後強飼以 100微升各製備物來接種，〜1x1 〇8 cfu之乳酸桿菌菌種（各製備物中乳酸桿菌之真實數目由活板計數決定）。共有7組小鼠，每組3隻小鼠，小鼠給予以下製備物：乳酸桿菌+鹽水乳酸桿菌+20毫升/毫克生物盾乳故桿菌+40愛升/毫克生物盾乳酸桿菌+100毫升/毫克生物盾乳酸桿菌+20毫升/毫克碳酸氫鈉乳酸桿菌+40毫升/毫克碳酸氫鈉乳酸桿菌+100毫升/毫克碳酸氫鈉 84475 -38- 200402303 小鼠f實驗期間經禁食，.但允許自由取食高壓減菌的水 >。札酸桿菌體内保護由計算3小g寺後移植大腸之乳酸桿菌數來分析。大腸（盲腸和結腸）自各小鼠無菌取下至2毫升無菌鹽水。樣品經稱重和均質及在鹽水中製備切倍稀釋液。 100微升之各稀釋液經塗上乳酸桿菌選擇性培養基（含⑺微克/毫升溫哥黴素和12.5微克/毫升多黏桿菌素之馬血瓊脂）。平板在5% C〇2中培養48小時及計算每板之菌落數。胚芽乳酸桿菌易與常存在於小鼠正常菌相之乳酸桿菌區分出來，因為其橢圓之白色外型。每克腸之菌落生成單位（cfu) 數經計算。結果 •如示於圖7，®芽乳酸桿菌殘存在生物盾和«氫納存在下增加。更高濃度之生物盾或碳酸氫鈉造成增加之殘存及因此更佳之保護。實施例10: 在潮濕環境下胚芽乳酸桿菌活力之初乳保護前言：牛初乳萃取液在不同濕度環境中作為益生菌活力保護劑之角色使用乳酸桿菌活板計數分析法探討。為探討初乳萃取液之保護性質，胚芽乳酸桿菌之活力在三純定濕度環境中保存14天後比較。材料與方法：試劑胚芽乳酸槔茴：用於本研究之胚芽乳酸桿菌（L · p ·)菌株為 84475 -39- 200402303 實施例4提及之菌株。菌株在馬血瓊脂（HBA)板上在37°C C02培養箱中培養48至72小時。L.p.菌種製備由選取HBA板上至少2個菌落及接至2毫升鹽水以達到相當於0.5 McFarland標準之濁度。此菌種然後用於所有處理組。凍乾培養基：用於此些實驗之凍乾培養基（FDM)衍生自 Conrad等人（2000)。2χ濃縮之FDM使用40°/。重量體積比α 5 α -蕈糖二水和物（Sigma)和5.7%重量體積比四测酸納十水和物（Sigma)在無菌0.6 Μ磷酸鉀pH 7.2中製備。此FDM之pH最初以固體檸檬酸（Sigma)調至pH 6.5及然後以氫氧化銨 (Sigma 29.5%)調至pH 8.5。2χ濃縮之FDM然後經無菌過濾至0.2微米。 ‘初乳：脫脂之凍乾牛初乳萃取物（Anadis公司，「Gastran」批號G01)來自非免疫化之乳牛。原液製備物在 40毫克/毫升下於2χ濃縮之FDM中復原。樣品製備：各以下混合液之四部份在冷凍乾燥前製成： (a) L.p.+2xFDM(0.5毫升+0.5毫升） (b) L.p. +含40毫克/毫升初乳之2xFDM(0.5毫升+0.5毫升）此些樣品經混合及然後在室溫下培養1小時及然後在乾冰中冷凍。樣品然後經冷凍乾燥過夜。胚芽乳酸桿菌在不同相對濕度下之安定性三種恆定濕度槽使用含不同溶液之密閉箱子設定。飽和 LiCl(Sigma)溶液維持相對濕度（RH)在11.3%下（水活性 aw=0.113)。80%重量比苷油（BDH Analar)在水之溶液維持 5 0%之 RH(aw=0.5 0)及飽和 KC1(BDH Analar)溶液維持 85%之 84475 -40- 200402303 RH(aw=0.85)(參閱 Forney & Brandi 1992及默克索引）。冷;東乾燥後’各樣品使用研蛛及杆溫和研磨成細粉。兩種樣品 (L.p.+FDM和L.p. +含初乳之FDM)在各槽之開放式廣口藥瓶中在2 0 °C下培養14天。各混合液之控制組樣品在密閉藥瓶中在20°C下保存。乳酸桿菌活力平板計數不同相對濕度下培養後之乳酸桿菌殘存使用活力平板計數技術分析。培養混合液之10倍稀釋液在含0.05%界面活性劑Tween 20之鹽水中製備。100微升之各稀釋液然後塗布至二重複之板上。平板經培養48小時及計算每板之菌落數。培養混合液之每毫升菌落生成單位（cfu)數然後由稀釋懸浮液之cfu/毫升數乘以稀釋倍數來計算。此些數值然後以控制組樣品之百分率表示。結果相對濕度樣品 L.p.之殘存 11.3% L.p+FDM+初乳 100% 11.3% L.p+FDM 99.3% 50% L.p+FDM+初乳 61.3% 50% L.p+FDM 36.7% 85% L.p+FDM+初乳 18.1% 85% L.p+FDM 8.5% 牛初乳萃取物在暴露至中和高濕度控制條件期間增加凍乾益生菌胚芽乳酸桿菌之殘存。 84475 -41 - 200402303 參考文獻

Conrad PB， Miller DP， Cielenski PR 和心 D u uc Pablo jj

(2000)。嗜酸性乳酸桿菌在醣基質中之安定性與保留。低、、㈤生物學41 ·· 17-24。

Forney CF和Brandi \i592)。小控制環境槽中使用苷、由杈溶液控制濕度。園藝技術，一/三月2(1): 52_5 4。十互定濕、度默克索引：Misc-98「飽和溶液」及Misc-l〇3 溶液」。

最後，當然地不同的修飾和/或改變法可製成，而不偏離如在此概要之本發明精神。 [圖式簡單說明] *許多實施例隨參閱示於隨附圖之結果而討論。以下圖中：圖1為顯示實施例1中報導尿素酶活性之初乳保護圖表；圖2為顯示實施例3中報導抗體活性之初乳保護圖表； ϋ 圖3為顯示實施例4中報導胚芽乳酸桿菌活力之初乳保護圖表；圖4為顯示實施例6中報導紅黴素活性之初乳保護圖表；圖5為顯示實施例7中報導shirot^蛋白乳酸桿菌活力之初乳保護圖表；圖6為顯示實施例8中報導霍亂毒素之初乳保護圖表；圖7為顯不實施例9中報導胚芽乳酸桿菌之初乳保護圖表0 84475 -42-

Claims

200402303 拾、申請專利範園： 1 · 一種投至敵意之環境時，改進不安定生物活性物質之活力之方法，該方法包括形成生物活性物質和哺乳類初乳之混合物。 2·如申凊專利範圍第1項之方法，其中生物活性物質在37 °C下在包括0.32%豬胃蛋白酶溶液於〇〇3 M NaCi及以 HCL調至pH 1·2之液體中經培養6〇分鐘後，顯示其功能" 至少20%減弱。其中混合物經胃腸道或其中混合物經口投藥。其中生物活性物質選自抗贅瘤劑、口服疫苗、 3·如申請專利範圍第1項之方法呼吸道投藥。 4·如申請專利範圍第1項之方法， 5:如申請專利範圍第1項之方法由以下組成之群：生長促進劑吸入劑、活微生物（例如益生菌如乳酸桿菌屬）、肤類多肽類、核#酸、多核#酸、核菩、蛋白質、醣蛋白、糖類和複合醋類、抗感染劑、抗微生物、消毒劑、防腐劑、抗抑修劑、精神活性劑、基因修飾生物及作為立他生物活性物質載體之感染劑，其載體例如細菌載體、(包括大腸桿菌、沙門桿菌、旅菌、乳酸桿菌、芽跑样菌、 t支桿菌、志賀样菌）、病毒載體（包括腺病毒、癌病母、桿狀病毒、疱疹病毒、腸病产主、^ ^ ^ . 岫黏硬病毒和流感病母）、植物載體（包括煙草、$ 、千馬鈴薯和香蕉）、酵母裁體、免疫球蛋白或親和力純化之I 兒反球蛋白包括對抗疾病（柷體和致病劑（例如幽門禅、、大腸桿菌' 芽孢样 84475 200402303 菌屬、病原性耶爾森氏菌屬和過敏原)和片段、衍生物及含有任何以上之複合物。 6.如申請專利範園第1之方法，其中生物活性物質包括 -或多種免疫球蛋白、科或多株抗體、嵌人型單株、人化單株抗體或樹狀體呈現之免疫活性片段或其免疫活性片段。如申請專利範圍第1項之方法，其中生物活性物質包括免疫活性片段，其選自由F(ab)和_)2片段、重組免疫活性片段、親和力純化之免疫球蛋白和其免疫活性片段及混合液組成之群。其中生物活性物質包括 8·如申請專利範圍第〗項之方法至少一種益生菌。 9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中一或多種乳酸桿菌屬及雙叉桿菌屬。生物活性物質包括其中生物活性物質選自 1 〇·如申請專利範圍第1項之方法由以下組成之群·· ⑷U其片段，其對抗疾病生物幽Η桿菌、腸毒素大腸桿菌（ETEC)、細小RNA病毒，特別為腸毒素、輪狀病毒、炭疽菌及鼠疫耶爾森氏菌。 (b)抗及其片段，其對抗由幽門桿菌、e丁沉、炭症菌和鼠疫耶爾森氏菌產生之毒素及對抗莲麻毒素之抗體；及 ⑷ 口服疫苗及吸入疫苗’其對抗幽門桿菌、職、細小RNA病毒’特別為腸毒素、輪狀病毒、炭症菌 84475.doc

200402303 及鼠疫耶爾森氏菌。 11 ·如申請專利範圍第10項之方法，其中生物活性物質選自對抗幽門桿菌或腸毒素71之口服疫苗或抗體或抗體片段。 12·如申請專利範圍第1項之方法，其中生物活性物質包括衍生自初乳或鳥類卵之多株抗體或其片段。 13 ·如申請專利範圍第丨項之方法，其中生物活性物質包括酸不安定之抗生素。 14· 一種治療或預防胃腸疾病之醫藥組合物，其包（a)對抗選自幽門桿菌和大腸桿菌群之病原微生物之疫苗及（b)哺乳類初乳之混合物。 15·如申請專利範圍第丨項之組合物，其中初乳與生物活性物質之重量比值大於〇.5 : 1。 16.如申請專利範圍第15項之方法，其中該重量比值大於 2:1。 17·如申請專利範圍第丨項之方法，其中混合物在組合物中投予，其組合物包括一或多種適合經口或吸入投藥之載劑或賦形劑。 18_如申請專利範圍第丨項之方法，其中初乳包括保持自分娩後不超過2天之牛初乳。 19·如申請專利範圍第18項之方法，其中初乳包括保持自分娩後當天之牛初乳。 20_如申請專利範圍第1項之方法，其中形成初乳與生物活性物質之混合液及混合液經乾燥形成固體。 84475.doc 200402303 的。 22. 如申請專利範圍第7項之方法，其中採集之初乳中砂與總蛋白質之比值至少10%。 23. -種投予不安定生物活性物質之組合物，該組合物包括生物活性物質和哺乳類初乳之混合物。 24. 如申請專利範圍第23項之組合物，其中生物活性物質選自由以下組成之群：生長促進劑、抗贅瘤劑、口服疫苗、吸入劑、活微生物（例如益生菌如乳酸桿菌屬）、^ 類、多肽類、核#酸、多核I酸、核誓、蛋白質、醋蛋白質、糖類和複合醣類、抗感染劑、抗微生物劑、消毒劑、防腐劑、抗抑鬱劑、精神活性劑、基因修飾生物： .作為其他生物活性物質載體之感染劑，其載體例如細菌載體（包括大腸桿菌、沙門桿菌、弧菌、乳酸桿菌、跑才干因、分支桿菌、志管坦苗、 ,. ^杯鹵）、病毒載體（包括腺病毒、痕病毒、桿狀病毒、祕病毒、腸病毒、副黏液病毒和流感病毒）、植物載體（包括煙草、馬铃著和香酵母載體、免疫球蛋白或親和力純化之免疫球蛋白包括對柷疾病之抗體和致病劑(例如幽門桿菌、大腸桿菌、芽孢桿菌屬、病原性耶爾森氏菌屬和過敏原)及片段、衍生物及含有任何以上之複合物。 25.如申請專利範圍第23 甘| Λ & 貝之組合物，其中生物活性物自由以下組成之群： ^ (a)抗體及其片段，並盤户八對k疾病生物幽門桿菌、腸毒夺大腸桿菌（ETEC)、知小βΜΔ十主 ’ 小RNA病毒，特別為腸毒素、： 84475 200402303 輪狀病毒、炭疽菌及鼠疫耶爾森氏菌。 (b)抗體及其段片，並齊、，、十杬由幽門桿菌、ETEC、炭疽菌和乳疫耶爾森氏菌產座生又母素及對抗惹麻毒素之抗體；及几 ⑷口服疫苗及吸人疫苗1對抗幽Η桿菌、ETEC、細小屬病毒，特別為腸毒素、輪狀病毒、炭疽菌及鼠疫耶爾森氏菌。 %如：請專利範圍第23項之組合物，其中生物活性物質選自杬生素、显生菌、免疫球蛋白、免疫球蛋白片段及其混合物。 A如申請專利範圍第23項之組合物，其中初乳與生物活性物質之重量比值大於2 : 1。 28.如申請專利範圍第23項之組合物，其中哺乳類初乳包括保持自分娩後不超過2天之牛初乳。 29·如申请專利範圍第23項之組合物，其中混合物由乾燥生物活性物質與哺乳類初乳之親密混合液而形成。 3 0· —種哺乳類初乳於製造治療或預防疾病之藥劑之用途，其中牛初乳與治療疾病之不安定生物活性物質混合，因此更完全保留生物活性物質之活性。

84475