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TW200409815A - Human T-lymphotrophic virus (HTLV) fusion protein, nucleic acid and vector encoding the protein, and kit for testing human T-lymphotrophic virus using the protein - Google Patents

Human T-lymphotrophic virus (HTLV) fusion protein, nucleic acid and vector encoding the protein, and kit for testing human T-lymphotrophic virus using the protein Download PDF

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Publication number
TW200409815A
TW200409815A TW091135980A TW91135980A TW200409815A TW 200409815 A TW200409815 A TW 200409815A TW 091135980 A TW091135980 A TW 091135980A TW 91135980 A TW91135980 A TW 91135980A TW 200409815 A TW200409815 A TW 200409815A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
human
htlv
sequence
lymphovirus
fusion protein
Prior art date
Application number
TW091135980A
Other languages
English (en)
Inventor
xin-yu Lin
Qing-Long Huang
Original Assignee
Dev Center Biotechnology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dev Center Biotechnology filed Critical Dev Center Biotechnology
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Priority to US10/423,156 priority patent/US7033751B2/en
Priority to JP2003172782A priority patent/JP3865714B2/ja
Publication of TW200409815A publication Critical patent/TW200409815A/zh
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    • C12N2740/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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Description

200409815 五、發明說明（1) 發明所屬之技術領域 本發明係有關於人類嗜τ淋巴球病毒（human T-lymphotrophic virus，Ηην)，特別是有關於人類嗜τ 穀胱甘肽硫轉移酶或硫氧化還原蛋白之融合 先前技術 人類嗜τ淋巴球病毒（human T_lymph〇tr〇phic HTLV)分類屬於反轉錄病毒科（Retr〇viridae)，是第一 ’ 被發現的人類反轉錄病毒，第一型於1 978年由一位串、 膚型τ細胞淋巴瘤病人體内分離，第二型病毒於198/年皮 現，病毒傳染途徑包括（1)帶原的母親經餵食母乳 給新生兒、（2)與HTLV帶原者發生性接觸造成感染 )共用帶有HTLV帶原者血液的針頭、注射筒、手術、針 炙、紋眉等器械而感染、（4)輸用耵^帶原者的血液或 血液製劑，造成感染。根據文獻顯示，HTLV為地方性疾病 (endemic) ’集中分布於日本南部、加勒比海島嶼非洲 南部及澳洲東北部的美拉尼西亞群島，為防止病毒的擴散 與感染，需例行篩檢捐血者的血液，目前許多國家已將 HTLV的檢驗列為捐血檢查的項目之一。為提供一個安全的 輸血環境，台灣地區捐血中心自民國八十五年元月廿六曰 起以酵素免疫法、西方墨點法全面筛檢HTLV- I *HTLV— n 兩型的抗體。台灣地區目前HTLV- ϊ的感染率約為千分之 四至千分之五，而HTLV - Ε的感染率仍不清楚。 HTLV 分為一型及二型（HTLV - I and HTLV—n)，第一型
200409815 五、發明說明（2) 病毒引起的疾病包括：1.成人T細胞白血病/淋巴瘤 (adult T -ce 11 1 eukemi a/1 ymphoma，AT L)-約 2 -3%感染者 會發展出ATL ; 2 ·中柩神經系統慢性發炎疾病 (HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis, HAM/TSP)-只有2-3% 感染者發展為 HAM/TSP，一般而言HAM/TSP症狀約在中年（4q — 5〇歲）才會 出現’但若是經由輸血感染則病程會縮短至1個月到4年， 其餘9 5 %感染者為終生帶原者並不會有任何症狀出現。第 -一型病毒目前被認為與非典型毛細胞血癌（atypical hairy cell leukemia)有關。 HTLV病毒基因體為單股正向核醣核酸（rna)，基因 體由gag、pol、env、tax和rex基因組成，gag基因轉譯出 一個多單元蛋白（polyprotein )，再切割為pi 9、p24、 pl5專成熟核心蛋白’pol基因轉譯出反轉錄（reverSe transcriptase )、嵌入酶(integrase )及核醣核酸分解 酶（RNAse H) ，env基因則轉譯出p21與p46封套蛋白， tax和rex基因則與病毒複製有關。HTLV感染人體後，最先 引發抗病毒gag蛋白的抗體，主要是針對p24蛋白，此抗體 出現於感染後2個月内，之後人體產生抗病毒表面的封套 蛋白的抗體。 HTLV的檢驗是以ELISA作初步的筛檢，進一步確診需 配合西方墨點法（Western blotting)及聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction )，目前市面上的HTLV 檢 驗試劑，主要是以病毒的全溶胞產物（total lysate)為抗
200409815
原偵測感染者血液 半會再加入病毒封 的全溶胞產物做為 性，若利用基因工 病毒重組蛋白質， 原，將可減少成本 發明内容 中的抗體，為增加敏 套上的蛋白質片段做 抗原，在製備上較為 程的技術，以大腸桿 可大量及快速製備檢 ，增加市場競爭力。 感性及特異性，多 為抗原。利用病毒 繁複且具有危險 菌表現具原性的 驗試劑所需的抗 本發明之目的是要提供一種人類嗜τ淋巴球病毒 (human Τ-lymphotrophic virus，HTLV)融合蛋白、編碼- 該蛋白之核酸與載體、其製備方法以及以該蛋白檢測人類 嗜τ淋巴球病毒之套組。上述HTLV_I/n的抗原融合蛋白1 _ 有對=HTLV-I/II高專一性、敏感性佳之優點，且其製備_ 方法安全又具高效率，可將上述融合蛋白應用於 HTLV-I/π檢驗套組。應用基因工程的技術，利用大腸桿 菌^現具抗原性的病毒重組蛋白質，可大量及快速製備檢 驗武劑所需的抗原，不但可減少成本、增加市場競爭力， 且因製程上不需要培養及純化病毒，其安全性更高。 - 本發明之一型態係提供一種純多胜肽，其特徵為具有 一人類嗜T淋巴球病毒一型醣蛋白21 (HTLV-I gp21)抗原 片段’且其序列如序列辨識編號·· 3之胺基酸序列。 本發明之另一型態係提供一種純多胜肽，其特徵為具 ^ 一人類嗜T淋巴球病毒二型醣蛋白21 (HTLV - II gp21) 抗原片段’且其序列如序列辨識編號：4之胺基酸序列。 •本發明之又一型態係提供一種分離的核酸，其編碼有
〇2%"9l37^(Nl);CHIUMB0W.ptd 第6頁 200409815 五、發明說明（4) 一人類嗜T淋巴球病毒一型醣蛋白21 (HTLV-I gp21)之抗 原片段，其中該抗原片段係由如序列辨識編號：5 5之核苷 酸序列所編碼。 本發明之更一型態係提供一種分離的核酸，其編碼有 一人類嗜T淋巴球病毒二型醣蛋白21 (HTLV - II gp21)之 抗原片段’其中該抗原片段係由如序列辨識編號：5 6之核 普酸序列所編碼。
由上述之人類嗜T淋巴球病毒一型與二型醣蛋白21 (HTLV-I gP21)之抗原片段，分別與穀胱甘肽硫轉移酶 (Glutathione S-transferase，GST)或硫氧化還原蛋白 (Thioredoxin，Thio)片段任意組合之重組核苷酸序列， 形成以下四種編碼之重組核酸·· 1 ·編碼有一穀胱甘肽硫轉移酶與人類嗜T淋巴球病毒一型 醣蛋白21抗原片段之融合蛋白（〇31711丁1^-12?21)的序 列’其中該融合蛋白係由如序列辨識編號：5 7之核苷酸序 列所編碼。 2 ·編碼有一硫氧化還原蛋白與人類嗜τ淋巴球病毒一型醣 蛋白21抗原片段之融合蛋白（Thio/HTLV - I gp21)的序
列’其中該融合蛋白係由如序列辨識編號：5 9之核苷酸序 列所編碼。 3·編碼有一穀胱甘肽硫轉移酶與人類嗜τ淋巴球病毒二型 聽蛋白21抗原片段之融合蛋白（GST/HTLV- I I gp21 )的序 列，其中該融合蛋白係由如序列辨識編號：58之核苔酸序 列所編碼。
200409815 五、發明說明（5) t I，ί 一硫氧化還原蛋白與人類嗜Τ淋巴球病毒二型醣 21 ^原片段之融合蛋白（ΤΜ〇/Ηην-Π 列，其中該融合蛋白係由如序列 j斤 列所編碼。 如序歹i辨减編唬·60之核苷酸序 此，，本發明亦提供包括上述四種重組序列之表現^ =製備人類嗜Τ淋巴球病毒抗原片段之方法。上表、載 f包含以下步驟·1包括上述任一重組序列之 方 中；使該細胞於一適當條件下表現人類嗜1 =病毋抗原片段之融合蛋白；收集並純化該 到人類嗜Ϊ淋巴球病毒抗原片段。 赏曰以侍 一—於上述製備人類嗜7淋巴球病毒抗原片段之方法中之 一貫施例，其中上述細胞為大腸桿菌菌株，例如 3KDE3) 當融合$白為穀胱甘肽硫轉移酶與人類 :了淋巴球病毒抗原片段之融合蛋白時，純化步 :肽瓊脂糖管柱進行。當融合蛋白為硫氧化 人類嗜T淋巴球病毒抗原片段之融合蛋白時，純化步驟係、 以錄離子親和層析管柱（Ni_NTA)進行。 ’、 依照上述步驟，以上之四種核苷酸序列可編碼 之四種融合蛋白： 1·穀胱甘肽硫轉移酶與人類嗜τ淋巴球病毒一型醣蛋白21 抗原片段之融合蛋白（GST/HTLVq gp21)，其係如序列辨 識編號：5之胺基酸序列。 2.硫氧化還原蛋白與人類嗜τ淋巴球病毒一型醣蛋白21抗 原片段之融合蛋白（Thi0/HTLV —丨gp21) ’其係如序列辨識 〇2%.9137TWF(Nl);CHIlJMBa«f.ptd 200409815 五、發明說明（6) 編號：7之胺基酸序列。 3·穀胱甘肽硫轉移酶與人類嗜τ淋巴球病毒二型醣蛋白21 抗原片段之融合蛋白（GST/HTLV-II gP21)，其係如序列辨 識編號：6之胺基酸序列。 ' ' 4·硫氧化還原蛋白與人類嗜τ淋巴球病毒二型醣蛋白21抗 原片段之融合蛋白（Thio/HTLV - II gp21)，其係如序列辨 識編號：8之胺基酸序列。 本發明之再一型態係提供一種人類嗜T淋巴球病毒檢 驗套組。上述套組包括：一固體基質；一第一人類嗜T淋 巴球病毒醣蛋白21抗原片段，其固定於該固體基質上；一 阻隔溶液，用以阻隔該固體基質上未結合於第二人類嗜T 淋巴球病毒蛋白21抗原片段的部分；一第二人類嗜τ淋 巴球病毒醣蛋白21抗原片段；一清洗溶液；以及一訊號產 生工具，其可操作性地與第二人類嗜T淋巴球病毒醣蛋白 21抗原片段連結而產生訊號；其中該第一與第二人類嗜τ 淋巴球病毒醣蛋白21抗原片段係擇自任一上述之融合蛋 白0 於本發明之一實施例，第一人類嗜T淋巴球病毒醣蛋 白21抗原片段係Thio/HTLV - II gP21融合蛋白；第二人類 嗜T淋巴球病毒醣蛋白21抗原片段係(jst/HTLV-I gp 21融釀 合蛋白。
為達上述目的，本發明選擇以UTLV-I/II gp21為抗原 片段’利用大腸桿菌表現系統生產抗原蛋白，並採用GST gene fusion system (Pharmacia Biotech)及His-Patch
200409815
五、發明說明（7)
ThioFusion™ Express ion system (Invitogen)，建構不 同的融合蛋白表現載體，以提昇抗原蛋白表現量及可溶性 且容易純化。 本發明選擇HTLV-I/II gp21之部分作為抗原片段’係 基於對HTLV-I/I I作抗原決定位之分析，此片段有集中之 抗原決定位，如取HTLV-I gp21(序列辨識編號：1)與 HTLV- I I gp2 1 (序列辨識編號：2 )，發現以下之片段具有 集中的抗原決定位’框線區域為抗原決定位： HTLV-Igp21片段(序列辨識編號：3)
A S G K S L il H E V D K D IS Q A T Q A 工 V K N H K N L L K I A Q Y A A Q N R R G L D L I F W E Q G G L C K A L Q E Q C c F L N I T N S H V s| 工 L Q E R P P L i E N R V L T G W G L HTLV-Π gp21 片段(序列辨識編號: 4) A S S K B L L |f E V D K D IS H L T Q A 工 V K N H Q N I L R V A Q Y A A Q N R R G L D L I F W E Q G G L C K A 工 Q E Q C C F L N I S N T H V S |v L Q E R P P I .E :κ |r V I T G W G L
基於以上發現，本發明人等利用基因重組PCR - (assembly PCR)，根據基因銀行所揭示之基因序列’並適 當修飾二型HTLV封套蛋白gp21為大腸桿菌利用率較高之序 列後，合成第一及第二型HTLV封套蛋白gp21基因。再以此 n 為聚合酶連鎖反應的模板，增幅出含有抗原決定位的SP21 片段，長約2 70個鹼基對，分別選殖至質體口〇£乂-1(6及 pThioHisB，可分別表現出GST或Thioredoxin之融合蛋 白0
0296.9137IW(N1) ;CHIUMBOT. ptd 第10頁 200409815 五、發明說明（8) 因此，本發明之特徵為提供以下之純多胜肽： 1 · 一種純多胜肽，其特徵為具有一人類嗜T淋巴球病毒一 型醣蛋白21 (HTLV-I gp21)抗原片段，且其序列如序列 辨識編號：3之胺基酸序列： (序列辨識編號：3 ) ASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDLLFWEQG GLCKALQEQCCFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTGWGL 。 2 · —種純多胜肽，其特徵為具有一人類嗜T淋巴球病毒二 型醣蛋白21 (HTLV - II gp21)抗原片段，且其序列如序列 -辨識編號：4之胺基酸序列·· _ (序列辨識編號：4 ) ASSKSLLFEVDKDISHLTQAIVKNHQNILRV AQYAAQNRRGLDLLFWEQG GLCKAIQEQCCFLNISNTHVSVLQERPPLEKRVITGWGL。 上述之純多胜肽分別係由以下之核苷酸序列所編碼： 1. 一種分離的核酸，其係編碼有一人類嗜T淋巴球病毒一 _ 型醣蛋白21 (HTLV-I gp21) 之抗原片段，其中該抗原片 段係由如序列辨識編號：5 5之核苷酸序列所編碼： ^ (序列辨識編號：5 5 ) GCATCCGGTAAATCTCTGCTGCACGAAGTTGACAAAGACATCTCCCAGCT GACTCAGGCAATCGTTAAAAACCACAAAAACCTGCTGAAAATCGCGCAGT # ACGCTGCACAGAACCGTCGTGGCCTGGACCTGCTGTTCTGGGAACAGGGT GGCCTGTGCAAAGCACTGCAGGAACAGTGCTGTTTCCTGAACATCACTAA CTCCCACGTTTCTATCCTGCAGGAACGTCCGCCGCTGGAAAACCGTGTAC TGACTGGCTGGGGCCTG 。
0296-9137HVF(Nl) ;CHIUMEW.ptd 第11頁 200409815 五、發明說明（9) 2. —種分離的核酸，其係編碼有一人類嗜T淋巴球病毒二 型醣蛋白21 (HTLV- 11 gp21 ) 之抗原片段，其中該抗原片 段係由如序列辨識編號：56之核苷酸序列所編碼： (序列辨識編號：5 6 ) GCTTCCAGTAAAAGCCTTCTCTTCGAGGTTGACAAAGATATCTCCCACCT TACCCAGGCCATAGTCAAAAATCATCAAAACATCCTCCGGGTTGCACAAT ATGCAGCCCAGAATAGACGAGGATTAGACCTCCTATTCTGGGAACAAGGG GGTTTGTGCAAAGCCATACAGGAGCAATGTTGCTTCCTCAATATCAGTAA CACTCATGTATCCGTCCTCCAAGAACGGCCCCCTCTTGAAAAGCGTGTCA ^ TCACCGGTTGGGGACTA 〇 φ 由上述之人類嗜Τ淋巴球病毒一型與二型醣蛋白21 (HTLV-I gp21)之抗原片段，分別與穀胱甘肽硫轉移酶 (Glutathione S-transferase，GST)或硫氧化還原蛋白 (T h i 〇 r e d ο X i η，T h i 〇 )片段任意組合之重組核苔酸序列， 形成以下四種編碼之重組核酸： 。 1. 一重組核酸，其係編碼有一穀胱甘肽硫轉移酶與人類嗜 T淋巴球病毒一型醣蛋白21抗原片段之融合蛋白 _ (GST/HTLV-I gp21)，上述融合蛋白係由如序列辨識編 號·· 5 7之核苷酸序列所編碼：
(序列辨識編號：5 7 ) B
0296-9137IlF(Nl) ;CHIli!BW. ptd 第12頁 200409815 五、發明說明（10)
ATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCA
ACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAA
GAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACA
AAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTA
TATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATA
CGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAA
AAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGA
TATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTT
GAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGC
TGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAA
TGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCT
CTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGT
TCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCC
ACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGG
CCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATC
CTCCAAAATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCCCGGGAATTTC cggtggtggtggtggaattctagrctccrtgggtIgcrtccggt
AAATCTCTGCTGCACGAAGTTGACAAAGACATCTCCCAGCTGA 0296-9137πίΡ(Ν1)；απυΜΕ〇ν.ρΐ(1 第 13 頁 200409815 五、發明說明（11)
CTCAGGCAATCGTTAAAAACCACAAAAACCTGCTGAAAATCGC
GCAGTACGCTGCACAGAACCGTCGTGGCCTGGACCTGCTGTTC
TGGGAACAGGGTGGCCTGTGCAAAGCACTGCAGGAACAGTGCT
GTTTCCTGAACATCACTAACTCCCACGTTTCTATCCTGCAGGA
ACGTCCGCCGCTGGAAAACCGTGTACTGACTGGCTGGGGCCTG AAGCTTAATTCATCGTGA(框線區域為人類嗜T淋巴球病毒 一型醣蛋白21抗原片段〉。 2 · —重組核酸，其係編碼有一硫氧化還原蛋白與人類嗜Τ 淋巴球病毒一型醣蛋白2 1抗原片段之融合蛋白 (Thio/HTLV-I gp21)，上述融合蛋白係由如序列辨識編 號：5 9之核苷酸序列所編碼： (序列辨識編號：5 9 ) _
0296-9137TOF(Nl) ;CHIIB«EDW. ptd 第14頁 200409815 五、發明說明（12)
ATGTCTGATAAAATTATTCATCTGACTGATGATTCTTTTGATAC
TGATGTACTTAAGGCAGATGGTGCAATCCTGGTTGATTTCTGGG
CACACTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCTCCGATTCTGGAT
GAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACT
GAACATCGATCACAACCCGGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCC
GTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCG
GCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTT
CCTCGACGCTAACCTGGCCGGCTCTGGATCCGGTGATGACGATG
ACAAGGTACCCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGC
AGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCATCCGGTAAATC
TCTGCTGCACGAAGTTGACAAAGACATCTCCCAGCTGACTCAGG
CAATCGTTAAAAACCACAAAAACCTGCTGAAAATCGCGCAGTAC
GCTGCACAGAACCGTCGTGGCCTGGACCTGCTGTTCTGGGAACA
GGGTGGCCTGTGCAAAGCACTGCAGGAACAGTGCTGTTTCCTGA
ACATCACTAACTCCCACGTTTCTATCCTGCAGGAACGTCCGCCG
CTGGAAAACCGTGTACTGACTGGCTGGGGCCTGCTCGAGATCTT CGAATTCCGCGGCCGCAGGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGTAATC GTACAGGGTAG (框線區域為人類嗜T淋巴球病毒一型醣蛋白 21抗原S段〉。 第15頁 0296-9137IW(Nl)；aiIUMB0W.ptd 200409815 五、發明說明（13) 3. 一重組核酸，其係編碼有一穀胱甘肽硫轉移酶與人類 嗜T淋巴球病毒二型醣蛋白21抗原片段之融合蛋白 (GST/HTLV - II gp21)，上述融合蛋白係由如序列辨識編 號：58之核苷酸序列所編碼： (序列辨識編號：5 8 )
ATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCA
ACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAG
AGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAA
AAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATAT
TGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTT
ATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAG
CGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAG
ATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTC
TCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATG
TTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCA
TGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTG _
TTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTA
0296-9137TW(Nl);CHIUME0W.ptcl 第16頁 200409815 五、發明說明（14)
GTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAA
GTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCT
GGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGAT ctggttccgcgtggatcc|gcttccrgtaraagccttctcttcga
GGTTGACAAAGATATCTCCCACCTTACCCAGGCCRTAGTCAAAA
RTCATCAAAACATCCTCCGGGTTGCACAATATGCAGCCCAGAAT
RiGACGAGGATTAGACCTCCTATTCTGGGAACAAGGGGGTTTGTG
CRRAGCCATACAGGAGCAATGTTGCTTCCTCAATATCAGTAACA
CTCRTGTATCCGTCCTCCRAGRACGGCCCCCTCTTGAAAAGCGT gtcatcrccggttggggacta|ragcttrattcatcgtga (框線 區域為人類嗜T淋巴球病毒二型醣蛋白21抗原片段>。 4· 一重組核酸，其係編碼有一硫氧化還原蛋白與人類嗜T 淋巴球病毒二型醣蛋白21抗原片段之融合蛋白 (Thio/HTLV-II gp21)的序列，其中該融合蛋白係由如序 列辨識編號：6 0之核苷酸序列所編碼： (序列辨識編號：6 0 )
第17頁 0296-9137HfF(Nl);CHlUMBOT.ptd 200409815 五、發明說明（15)
ATGTCTGATAAAATTATTCATCTGACTGATGATTCTTTTGATAC
TGATGTACTTAAGGCAGATGGTGCAATCCTGGTTGATTTCTGGG
CACACTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCTCCGATTCTGGAT
GAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACT
GAACATCGATCACAACCCGGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCC
GTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCG
GCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTT
CCTCGACGCTAACCTGGCCGGCTCTGGATCCGGTGATGACGATG
ACAAGGTACCCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGC
AGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTTCCAGTAAAAG
CCTTCTCTTCGAGGTTGACAAAGATATCTCCCACCTTACCCAGG
CCATAGTCAAAAATCATCAAAACATCCTCCGGGTTGCACAATAT
GCAGCCCAGAATAGACGAGGATTAGACCTCCTATTCTGGGAACA
AGGGGGTTTGTGCAAAGCCATACAGGAGCAATGTTGCTTCCTCA
ATATCAGTAACACTCATGTATCCGTCCTCCAAGAACGGCCCCCT _
CTTGAAAAGCGTGTCATCACCGGTTGGGGACTACTCGAGATCTT CGAATTCCGCGGCCGCAGGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGTAATC GTACAGGGTAG (框線區域為人類嗜T淋巴球病毒二型醣蛋白 21抗原片段〉。 本發明之範疇亦包括分別具有上述四種重組序列之表
0296-9137TWF(Nl) ;CHIimW.ptd 第18頁 200409815 五、發明說明（16) 現，體以及《 i述表現載冑製備人類嗜τ淋巴球病毒抗原 片段之方法。上述方法包含以下步驟：將任一上述之表現 載體引入、細胞中，使該細胞於一適當條件下表現人類嗜 Τ淋巴球病毒抗原片段之融合蛋白；&集並純化該融合蛋 白以得到人類嗜Τ淋巴球病毒抗原片段。 上述表現載體之實施例分別為pGST/HTLV-i gp21、 pThio/HTLV - I gP2l、pGST/HTLV 一 n gp21 以及 pThio/HTLV II gp2l，且上述表現載體已於中華民國91 年11月29日寄存於中華民國、台灣、財團法人食品工業發 展研究所，寄存編號依序為94〇4〇7、94〇4〇5、94〇4〇8以 940406 。 於上述製備人類嗜T淋巴球病毒抗原片段之方法中之 一實施例’其中上述細胞為大腸桿菌菌株，例如BL21 (DE3)菌株。於上述引入表現載體之菌株誘導融合蛋白的 表現，經單一管柱純化後可得到大量且高純度的抗原蛋 白。當融合蛋白為穀胱甘肽硫轉移酶與人類嗜T淋巴球病 毒抗原片段之融合蛋白時，純化步驟係以榖胱甘肽瓊脂糖 管柱進行。當融合蛋白為硫氧化還原蛋白與人類嗜T淋巴 球病毒抗原片段之融合蛋白時，純化步驟係以鎳離子親和 層析管柱（Ni-NTA)進行。 依照上述步驟，以上之四種核苷酸序列可編碼出如下 之四種融合蛋白： 1·穀胱甘肽硫轉移酶與人類嗜τ淋巴球病毒一型醣蛋白21 抗原片段之融合蛋白（GST/HTLV-I gp21)，其係如序列辨
200409815 五、發明說明（17) 識編號：5之胺基酸序列： (序列辨識編號：5 )
Met S P I L G Y W K I K G L V Q P T 1 R L L L E Y L E E K Y E E H L Y E R D E G D K W R N K K F E L G L E F P W L P Y Y I D G D V K L T Q S Met Ά 工 工 R Y 工 A D K H W Met L G G C P K E R A E I S Met L E G A V L D 工 R Y G V S R I A Y S K D F E T L K V D F L S K L P E Met L K Met F E D R L C H K T Y L Ή G D H V T HP D F Met L Y D A L D V V L Y Met D P Met C L ,D A F P K L V C F K K R I E A 工 P Q I D K Y L 丨K S S K Y 工 A W P L Q G W Q A T F G G G D H P 1 P K S D L V P R G S P G I S G G G G G 工 L D S Met g| A s| G K S L L H E V D K D I S Q L T Q Ά I V K W Hi K W L L K 工 A Q Y A A Q w R R G L D L L F W E Q G G L C K A L Q E Q C c F L N I T Ή S H V S I L Q E R P P L E N R V L T G W G L K L W S S
Stop(框線區域為人類嗜T淋巴球病毒一型醣蛋白21抗原 片段卜 硫氧化還原蛋白與人類嗜T淋巴球病毒一型醣蛋白2 1抗
0296.9137HF(N1) ;CHIUMBW.ptd 第20頁 200409815 五、發明說明（18) 原片段之融合蛋白（Thio/HTLV-I gp21 )，其係如序列辨識 編號：7之胺基酸序列： (序列辨識編號：7 )
MetSDKI IHLTDDSFDTDVLKADG
A I L V D F W Ά H W C G P C K Met I A P I L D E I A D E Y Q G K L T V A K L N I D H N P G T A P K Y G I R G 工 P T L L L F K Ή G E V A A T K V G A L S K G Q L K E F L D A W L A G S G S G D D D D K V P Met G S S H H H H H H S S G L V P R G S H Met S G K S L L H E V D K D I S |q L T Q A 工 V K w H K Ή L L K I A Q Y A A Q W K R G L D L L F w E Q G G L c K A L Q E Q C C F L Ή 工 T W S H V S I L Q E R P P L E N R V l| T G W G L L E I F E F R G R R P L E S T C s -1 W R T G Stop(框線區域為人類嗜丁淋巴球病毒—型醣蛋白 21抗原片段〉。 巴球病毒二型醣蛋白21 S p 21 ) ’其係如序列辨 3·榖胱甘肽硫轉移酶與人類嗜τ、淋 抗原片段之融合蛋白（GST/HTUMI 識編號：6之胺基酸序列： (序列辨識編號：6 )
200409815 五、發明說明（19)
MetSP 工 LGYWKIKGLVQPTRLLLE YLEEKYEEHLYEKDEGDKWRWKK FELGLEFPW LPYYIDGDVKLTQS Met AIIRYiadkhW Met LGGCPKER AElSMetLEGAVLDIRYGVSRIAY SKDFETLKVDFLSKLPE Met L K Met FEDRLCHKTYLWGDHVTHPDFMet LYDALDVVLY Met D P Met C L D A F P K LVCFKKRIEAIPQIDKYLKS SKY iawplqgwqatfgggdhppksdl
Hi K L N S S Stop (框線區域為人類嗜T淋巴球病毒二 型醣蛋白21抗原片段〉。 4·硫氧化還原蛋白與人類嗜Τ淋巴球病毒二型酷蛋白21抗 原片段之融合蛋白（Thio/HTLV-II gP21)，其係如序列辨^ 識編號：8之胺基酸序列： (序列辨識編號·· 8 )
0296-9137TOF(Nl) jCHIUMEOW.ptd 第22頁 200409815 五、發明說明（20)
Met SDKIIHLTDDSFDTDVT&
h ^ A Ώ G ΑΙ LVDFWAHWCGPCK Met I a >
A P I L D u w p g t
^ v A A T G S G S EIADEYQGKLTVAKLWIDH APKYGlRGjpTLLLFKWGF.r K V G A L S K G i Q L K E F L D A w L A G D D D D K V P ： Met G S S H H H H H H V Ρ R G S H Met A S S K S L L F E V |h L T Q A I V K N H Q N I L V A Y、 _ R G L D L L F W E Q G G L C JL A I 一 I 1 — k L W 工 S W T H V S V L Q E X Ύ τ G W G L L E I F E F R G R R P L E s R T G Stop(框線區域為人類嗜T淋巴球病毒二型醣蛋白 21抗原片段）。 本發明之特徵亦為一種人類嗜7淋巴球病毒 組。上述套組包括：一固體基質；一第一人類嗜τ 病毒醣蛋白2 1抗原片段，其固定於該固體基質上.一且 溶液，用以阻隔該固體基質上未結合於第一人類嗜τ淋隔 球病毒醣蛋白21抗原片段的部分；一第二人類嗜τ淋巴球 :毒：蛋白21抗原片段；一清洗溶液；以及一訊號產生工 原片段連結而產生訊號類嗜了淋巴球/毒，蛋白21抗 现，其中該第一與第二人類嗜T淋巴
0296-9137TW(Nl);CHHJMB0W.ptd 第23頁 200409815 五、發明說明（21) 球病蛋白21抗原片段係擇自任-上述之融合蛋白。 笛一 2ί明之一實施例，以酵素免疫反應配對測試後， Th. /imyT淋巴球病毒醣蛋白21抗原片段係 蛋1白021抗斥11 gp21融合蛋白；第二人類嗜T淋巴球病毒醣 蛋白=原片段#gst/HTLV i “ 21融合蛋白。 玻璃、二淋巴球病毒檢驗套組中之固體基質包括 ΪΪ-公曰：士陶兗㈣、金屬、或由有機分子聚合而成 二m其中該有機分子係擇自苯乙烯、㈣、 酉曰類、丙晞酸、丙嫌赫 所組成之族群。s、烷基丙埽酸、及烷基丙烯酸酯 « 牛血士 ί ΐ ΐ产1'淋巴球病毒檢驗套組中之阻隔溶液包括 牛血(bsa)、路蛋白或動物明膠之溶液。 碟酸鹽緩衝溶液（_”㈡2 2清洗溶液包括 或含0.05% Tween 20之述一甲基胺基甲烷緩衝溶液（TBS) 20之磷s夂鹽緩衝溶液（PBST)。 係擇自^射淋巴球病毒檢驗套組中之訊號產生工具 ;物及酵素所組成之族群。上述冷光生 標記物或化學冷光標記物。卜=铩忑物包括生物冷先 過氧化氫酶及Θ -半乳M酵素係擇自鹼性磷酸酶、 A牛礼糖甘酸酶所組成之竑淼。於參说 述人類嗜T淋巴球病毒檢驗::;施 且該基質可與該酵素反應而呈色。 栝基質 套組中另上：:二本發明之人類嗜T淋巴球病毒檢驗 τ 上返訊就產生工且f白虹 ， • /、更匕括一生物素以及一抗生物 〇296-9137IW(Nl);CHIUMB(W.ptd 第24頁
I 200409815 五、發明說明（22) 水，白，該抗生物素蛋白可操作性地與放射性標記物、螢
Id物、填光標記物、冷光標記物或酵素連結；其中上 =酵素係擇自鹼性磷酸酶、過氧化氫酶及沒-半乳糖苷酸 所組成之族群。此外，此套組亦包括一基質，且該基質 可與5亥酵素反應而呈色。 、本發明實施例中係利用免疫酵素分析（EL I S A )方 法’以HTLV血清標準控制組（Anti —HTLV I/n Mixed
Titter Perf0rmance Panel )及捐血中心西方墨點法確診 感染者之血清測試，具有良好的敏感性及專一性，因此由 本發明所生產的抗原蛋白，確可作為檢驗耵^的一良好檢 驗试幻且此檢驗方式具有良好之敏感性（sensitivity ) 以正吊人之血清測试則具良好特異性（s p e c i f i c i t y )，由此而完成本發明。 實施方式 實施例1重組PCR合成HTLV - I/II gp21基因 根據GenBank D1 3784所揭示之HTLV-I gp21基因序 列，將此基因改為大腸桿菌利用率較高的序列（E. c 〇 Η preferred codons)，依序設計互補之引子共2〇條，利用 基因重組PCR (assembly PCR)方式，將20條引子組合成 一段HTLV-I gp21基因，全長505 bp，如第1A圖所示（序 列辨識編號：9 )，兩端分別設計限制酶Nde I (5，端）及 Xho I (3 ’端）切割位，2 0條引子序列如下： I FI CGCAT ATGGG TGCAG GCGTT GCTGG CGGTA TCACC GGCTC (序列辨識編號：10)
0296-9137TWF(Nl);CHIlJMB〇W.ptd 第25頁 200409815 五、發明說明（23) I F2 TGGCA TCCGG TAAAT CTCTG CTGCA CGAAG TTGAC AAAGA (序列辨識編號：11) I F3 AGCTG ACTCA GGCAA TCGTT AAAAA CCACA AAAA CCTGC T (序列辨識編號：1 2) I F4 CGCAG TACGC TGCAC AGAAC CGTCG TGGCC TGGAC CTGCT (序列辨識編號：13) I F5 AACAG GGTGG CCTGT GCAAA GCACT GCAGG AACAG TGCTG (序列辨識編號·· 14) I F6 ACATC ACTAA CTCCC ACGTT TCTAT CCTGC AGGAA CGTCC (序列辨識編號：15) I F7 AAAAC CGTGT ACTGA CTGGC TGGGG CCTGA ACTGG GACCT (序列辨識編號：16) I F8 CTCAG TGGGC TCGTG AGGCG CTGCA GACTG GTATC ACCCT (序列辨識編號：17) I F9 TGCTG CTGCT GGTTA TCCTG GCAGG TCCGT GCATC CTGCG (序列辨識編號：18) I F10 GTCAC CTGCC GTCTC GTGTA CGTTA CCCGC ACTAC TCTCT (序列辨識編號：19) I R1 CGCTC GAGTT ACAGG GAAGA TTCCG GTTTG ATCAG AGAGT AGTGC GGGT (序列辨識編號：20) I R2 CGAGA CGGCA GGTGA CGCAG CTGAC GCAGG ATGCA CGGAC (序列辨識編號：21 ) I R3 ATAAC CAGCA GCAGC AGCGC AACCA GGGTG ATACC AGTCT (序列辨識編號：22)
0296-913TI1fF(Nl);CHIlMB0«i.ptd 第26頁 200409815 .W六ν.今：.|哪. 五、發明說明（24) I R4 TCACG AGCCC ACTGA GACAG GCCCA GGTCC CAGTT CAGGC (序列辨識編號：23) I R5 GTCAG TACAC GGTTT TCCAG CGGCG GACGTT CCTGC AGGA (序列辨識編號：24) I R6 TGGGA GTTAG TGATG TTCAG GAAAC AGCAC TGTTC CTGCA (序列辨識編號：25) I R7 CACAG GCCAC CCTGT TCCCA GAACA GCAGG TCCAG GCCAC (序列辨識編號：26) I R8 TGTGC AGCGT ACTGC GCGAT TTTCA GCAGG ΤΤΤΤΤ GTGGT (序列辨識編號：27) I R9 ATTGC CTGAG TCAGC TGGGA GATGT CTTTG TCAAC TTCGT (序列辨識編號：28) I RIO GATTT ACCGG ATGCC AGGGA CATGG AGCCG GTGAT ACCGC (序列辨識編號：29) 根據GenBank NC_00 1488 所揭示之HTLV-II gp21 基因 序列，設計互補之引子（primers)共20條，利用基因重 組PCR方式，將20條引子組合成一段完整的HTLV - II gp21 基因，全長5 14 bp，如第1B圖所示（序列辨識編號：30 )，兩端分別設計限制酶Nde I (5’端）及Xho I (3’端） 切割位，2 0條引子序列如下： II FI CGCAT ATGGC CGGGA CAGGT ATCGC TGGCG GAGTA ACAGG (序列辨識編號：31) II F2 CTAGC TTCCA GTAAA AGCCT TCTCT TCGAG GTTGA CAAAG (序列辨識編號：32)
0296.9137TW(N1) ;CHIUMBW.ptd 第 27 頁 200409815 五、發明說明（25) II F3 CCTTA CCCAG GCCAT AGTCA AAAAT CATCA AAACA TCCTC (序列辨識編號：33) II F4 AATAT GCAGC CCAGA ATAGA CGAGG ATTAG ACCTC CTATT (序列辨識編號：34) II F5 GGGGG TTTGT GCAAA GCCAT ACAGG AGCAA TGTTG CTTCC (序列辨識編號：35) II F6 TAACA CTCAT GTATC CGTCC TCCAA GAACG GCCCC CTCTT (序列辨識編號：36) II F7 TCATC ACCGG TTGGG GACTA AACTG GGATC TTGGT CTGTC (序列辨識編號：37) II F8 CGAG AAGCC CTCCA GACAG GCATA ACCAT TCTCA CCCTA C (序列辨識編號：38) II F9 CATAT TGTTT GGCCC CTGCA TCCTC CGCCA AATCC AAGCC (序列辨識編號：39) II F10 GGTTA CAAAA CCGAC ATAGC CAGTA TGCCC TTATC AACCA (序列辨識編號：40) II R1 CGCTC GAGTT ATAGC ATGGT CTCTT GGTTG ATAAG GGCA (序列辨識編號：41) m 11 R2 GTCGG TTTTG TAACC GCTGC GGAAG GGCTT GGATT TGGCG (序列辨識編號：42) II R3 GGGCC AAACA ATATG ACAAG GAGGA GTAGG GTGAG A A T G G (序列辨識編號· 4 3 ) II R4 CTGGA GGGCT TCTCG TGCCC ACTGG GACAG ACCAA GATCC (序列辨識編號：44)
0296-9137TW(Nl) ;CHIUMB0W.ptd 第28頁 200409815 五、發明說明（26) II R5 CCCAA CCGGT GATGA CACGC TTTTC AAGAG GGGGC CGTTC (序列辨識編號：45) II R6 GATAC ATGAG TGTTA CTGAT ATTGA GGAAG CAACA TTGCT (序列辨識編號：46) II R7 TTTGC ACAAA CCCCC TTGTT CCCAG AATAG GAGGT CTAAT (序列辨識編號：47) II R8 TCTGG GCTGC ATATT GTGCA ACCCG GAGGA TGTTT TGATG (序列辨識編號：48) II R9 ATGGC CTGGG TAAGG TGGGA GATAT CTTTG TCAAC CTCGA (序列辨識編號：49) II RIO TTTAC TGGAA GCTAG AGATA GGGAG CCTGT TACTC CGCCA (序列辨識編號：50) (1) 實施例2 pHTLV gp21質體的構築 將重組PCR所增幅出的片段，以2 °/◦瓊脂糖凝膠電泳分 離，切下HTLV gp21 之DNA 片段，以QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)純化產物，以50 //1 的elution buffer (10 mM Tris - Cl，pH 8·5)溶出 DNA，以限制酶Nde I及Xho I切割純化後之HTLV gp21片段。也以限制酶Nde I 及Xho I切開載體pET15b，以0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離， 切下約29〇〇乜0之載體〇—片段，用(31八911]^让66 1 Extraction Kit (QIAGEN)純化產物，以DNA Ligation Kit (TaKaRa)接合載體pET15b 與HTLV gp21 片段，於16 t： 反應40分鐘後轉形於大腸桿菌DH5 細胞，經篩選得到較原
0296-9137TW(Nl) ;CHIUMEDW.ptd 第29頁 200409815 五、發明說明（27) 來載體大之質體，以限制酶切割及定序分析，證實將HTLV gp21片段接合至載體pET15b，質體分別命名為 PB119/HTLV-I gp21 及pB119/HTLV-II gp21。 實施例3 pGST/HTLV - I/II gp21 融合蛋白表現質體的構築 構築GST融合HTLV gp21蛋白表現質體。以質體 PB119/HTLV-I gp21 或 pB119/HTLV-II gp21 為 PCR 反應模 板，分別利用下列之引子對增幅HTLV gp21之部分片段 (含重要的抗原決定位，長度約270 bp )，第一型兩端分 別設計限制酶Nco I (5，端）及Hind III (3,端）切割 位，第二型兩端分別設計限制臃BamH I (5,端）及Hind 111 ( 3 ’端）切割位：
I gp21 (270)/GST F CGCCA TGGGT GCATC CGGTA AATCT CTGCT G (序列辨 識編號：51)
I gp21 (270)/GST R CGAAG CTTCA GGCCC CAGCC AGTCA GTAC (序列辨識編 號：52)
II gp21 (270)/GST F CGGGA TCCGCTTC CAGTA AAAGC CTTCT C (序列辨識編 號·· 53)
II gp21 (270)/GST R CGAAG CTTTA GTCCC CAACC GGTGA TGAC (序列辨識編 號：54) 得到之片段為如序列辨識編號：5 5與序列辨識編號：5 6所
0296-9137HfF(Nl) ;CHIlMB(W.ptd 第30頁 200409815 五、發明說明（28) 示之核苷酸序列，將此二片段選殖至載體pGEX-KG，圖譜 如第2A圖所示，以限制酶切割及定序分析，證實將上述之 HTLV gp21部分片段接合至載體pgEX-KG，所得構築體分別 命名為 pGST/HTLV - I gp21 及 pGST/HTLV-II gp21，圓譜依 序分別如第2B與2C圖所示。而其GST/HTLV-I gp21核苷酸 序列如序列辨識編號：57所示，其GST/HTLV-I gp21核苷 酸序列如序列辨識編號：5 8所示。 實施例4 pThioredoxin/HTLV - I/II gp21融合蛋白表現質 體的構築 構築Thi oredoxin融合HTLV gp2 1蛋白表現質體。將質 體PB119/HTLV-I gp21 (270 bp)或pB119/HTLV-II gp21 (270 bp)，以限制酶Nco I (5,端）及Xho I (3,端）切出 含N端六個Histidine的部分gp21片段，將此片段選殖至載 體pThioHisB (Invitrogen)，圖譜如第3A圖所示，以限制 酶切割及定序分析，證實將HTLV gp21部分片段接合至載 體pThioHisB，質體分別命名為pThio/HTLV - I gp21及 pThio/HTLV-II gp21，圖譜依序分別為第3B與3C圖。而其 Thio/HTLV-I gp21核苷酸序列如序列辨識編號：59所示， 其Thio/HTLV-I gp21核苷酸序列如序列辨識編號：60所 示。 實施例5 IPTG誘導蛋白質表現 挑選定序結果正確之表現質體，分別轉形BL21 (DE3) 菌株，然後以1 liter LB/Amp培養液於37°C下2 00 rpm震 盪培養至菌體密度約0.D.595 = 0.8時，先取出1 mi作為
0296-9137T1fF(Nl);CHH»«BW.ptd 第31頁 200409815 五、發明說明（29) 誘導前之對照組（TO),剩餘培養液加入i ml之^異丙基 硫代-沒咄-半乳糖（IPTG)誘導蛋白的表現，誘導3小時 後取出1 ffll培養液（Ta)，將不同時段收集之菌體分別以 lysis buffer打破，lySis buffer的體積依細菌濃度而 疋’其公式如下：〇·!)·值 X volume (ul)/ 20 = lysis buffer volume (ul)，加入等體積之sample buffer，於 95°C加熱5分鐘，取1〇"1的sample以SDS 一 PAGE分析蛋白質 誘導前後的表現情形，其餘菌液以8 〇 〇 〇 Γριη離心1 5分鐘收 集菌體，進行後續之蛋白純化工作。 實施例6破菌並確認蛋白表現形式 將離心後之菌體以1〇〇 ml之IMAC-5 (含0.1% Triton-100)緩衝液打散至均質狀態，用micr〇fluidizer 將菌體打破，離心15000 rpm 30分鐘分離上清液 (supernatant) 與沉澱物（pellet)，以蛋白質電泳確認 蛋白表現後為可溶形式（so 1 ub 1 e f orm )或形成不可溶之 包涵體（inclusion body)。 實施例7 GST融合蛋白之純化 以G lu tathi one Se pharos eTM 4B (am er sham Pharmacia biotech)純化 GST 融合蛋白-GST/HTLV - I gp21 (33 kDa)及 GST/HTLV - II gp21 (33 kDa)。將離心後之菌 體以100 ml之IMAC-5 (含0.1% Triton-100) 緩衝液打散 至均質狀態，用microfluidizer將菌體打破，離心15000 rpm 30分鐘分離上清液（supernatant)，製備2 ml Glutathione SepharoseTM 4B管柱，先以10 ml IMAC-5
0296-9137TW(Nl) ;CHIUMBDIi.ptd 第32頁 200409815 五、發明說明（30) (含0.1% Triton-100)緩衝液進行平衡，再取5〇 mi上清 液通過此管柱2次，以10 ml IMAC-5 (含〇·1%
Triton -100) 緩衝液洗出未結合之蛋白質與雜質，最後用 30 ml 10 inM Glutathione 析出 GST 融合蛋白。 實施例8鎳離子親和層析管柱（以-^^4)純化1^〇^(1(^111 融合蛋白 形成包涵體之重組融合蛋白Thio/HTLV-I gp21 C25 kDa)及 Thio/HTLV - II gp21 (25 kDa)的純化，將破菌後 不溶的沉澱物以60 ml含8M Urea之I MAC-5緩衝液打散，攪 拌隔夜至溶解，以15000 rpm離心30分鐘，取上清液進行 純化。將上清液通過2· 5 ml鎳離子親和層析管柱 (Ni-NTA)，重複此步驟2-3次，依序用下述緩衝液通過管 柱洗出雜質：Buffer B (8M urea， 0.1M NaH2P04， 0.001M Tris.HCl, pH 8.0) ；Buffer C (8M urea, 0. 1M NaH2P04, 0.0 0 1 M Tris.HCl, pH 6.3) ；Buffer D (8M urea, 0. 1M NaH2P04, 0.00 1M Tris.HCl, pH 5.9)； Buffer E (8M urea, 0. 1M NaH2P04, 0.0 0 1 M Tris.HCl, pH 4·5)，最後以含100 mM EDTA之8M urea析出所有管柱 内之蛋白質，上述步驟在室溫環境進行。 實施例9 HTLV-I/II抗原蛋白分析
選取HTLV-I/II gp21中包含重要抗原決定位片段的 270 bp，將其與GST基因序列之C端相接，使其表現為GST
融合蛋白，以增加蛋白表現量與可溶形式之重組蛋白。將 此片段選殖至載體pGEX-KG，所得質體PGST/HTLV-I/II
02%-9137IW(Nl);〇nUMBW.ptd 第33頁 200409815 五、發明說明（31) gp21分別轉形BL21 (DE3)菌株，IPTG誘導3小時後，皆有 33 kDa大小的蛋白質表現量較誘導前增加且表現量相當 多’此重組蛋白有一半為可溶性一半形成包涵體，將可溶 部分以G 1 u t a t h i ο n e S e p h a r 〇 s eTM 4 B純化，純化結果如第4 圖所示’且第一及第二型重組融合蛋白純度皆可達9〇 %以 上。 為降低E L I S A檢測之背景值，我們利用d i r e c t Sandwich ELISA減少非特異性的訊號，因此建構 Thioredoxin 融合蛋白載體，利用His一Patch ThioFusionTM Expression system (Invitogen)表現系統能增加蛋白表 現1 ’並可利用錄離子親和層析管柱（N卜n T A )純化此融合 蛋白。選取gp21中包含重要抗原決定位片段的2 70 bp，將 此片段選殖至載體pThioHisB，所得質體pThio/HTLV-1/II gp21 ，分別轉形BL21 (DE3)菌株，IPTG誘導3小時後， 皆有25 kDa大小的蛋白質表現量較誘導前增加且表現量相 當多’蛋白幾乎都形成包涵體，因此純化不可溶之沉澱物 部份，表現與純化結果如第5圖所示，且第一及第二型重 組融合蛋白純度皆可達9 5 %以上。 實施例1 0標記生物素於抗原蛋白 將已純化之抗原蛋白GST/HTLV-I gP21 (33 kDa)濃 縮至1 mg/ml，並利用透析的方式將蛋白置換至pBS中，取 〇· 5 mg的生物素溶於50 v 1水中（秤重前需回溫至室溫 )’將生物素溶液加入抗原中，於4 °c作用二小時，加入 Tris HC1終止反應 （Final 50 mM)，最後利用透析置換
0296·9137ΠΚΡ(Ν1) ;CHIl*®W.ptd 第34頁 200409815 五、發明說明（32) 標記完成的蛋白於50 mM Tris HC1，此標記蛋白將利用於 Direct Sandwich酵素免疫反應。 實施例11人類血清檢體特異性及敏感性之測試 由於Indirect ELISA assay背景值較高，因此採用 Direct Sandwich ELISA降低背景值，經過配對測試後選 擇鑛盤 Thio/HTLV-II gp21，與 Biotin 標記之 GST/HTLV - I gp21配對。以HTLV血清標準控制組（Anti-HTLV Ι/Π Mixed Titer Performance Panel，BBI)及西方墨點法確 診病患之血清（台南捐血中心）測試HTLV蛋白是否具有良 好之抗原敏感性’以正常人之血清測試抗原蛋白是否具良 好特異性。方法如下：將抗原Thio/HTLV-II gp21鍍盤 (coating)於96 孔盤，每孔l//g 稀釋於 1〇〇 /zl coating buffer (0.013M Na2C03，0.03 5M NaHC03，pH 9·6)，於37 °C作用一小時後，以PBST (PBS含0· 05% Tween 20)清洗 三次，每孔加入200 μΐ Overcoating buffer (GBC corp·) 於37 °C作用二小時，將液體吸除後可直接進行實 驗或保存於-2 0 °C。將待測血清二十倍稀釋於5 H S p e c i m e η Diluent C (GBC corp·)，每孔體積 100 //1，37 °C 作用一 小時，以P B S T清洗六次，加入1 0 0 // 1稀釋2 5 0倍標記生物 素之GST/HTLV-I gp21，稀釋液為2Ha conjugate Diluent (G B C c o r p · )，3 7 °C作用一小時，以P B S T清洗六次，再加 入 100 "1 以 2Ha conjugate Diluent 稀釋之 Avidin conjugate AP (1:5000 dilution) ，37 °C 作用一小時， 以PBST 清洗六次，以5 ml color developing buffer
0296-9137TWF(Nl) ;CHIUMBW. ptd 第35頁 200409815 五、發明說明（33) (10% Diethanolamin，0.5mM MgCl2)溶解—鍵5 mg p-NITROPHENYL PHOSPHATE (Sigma)，每孔加 Aioo/zl 呈 色液，於37 °C作用十五分鐘後，以酵素免疫分析儀 (Bio-Rad Model 5 50)讀取 0D 4 05 nm 吸光值。 以此組合方式檢測捐血中心西方墨點法確診病患（1 9 個第一型病毒樣品）平均吸光值為丨· 〇52，jjTlv血清標準 控制組（Anti-HTLV I/II Mixed Titer perf0rmance Panel， BBI，包含7個第一型及11個第二型病毒樣品）平 均吸光值為1.098 ’92個正常人血清平均吸光值為 〇· 1 528，陽性樣本與陰性樣本讀值有顯著差異，因此此配 對方式具有良好的敏感性與特異性，敏感性與特異性皆在 99 %以上’可作為篩檢HTLV感染的檢驗試劑。 本發明之檢驗方法，僅以二種抗原之組合即可偵測第 一及第二型之人類嗜T淋巴球病毒的感染，敏感性與 ，皆在99%以上，且本發明之抗原製備方法，只需經、一 管柱純化後即可得到大量且高純度的抗原蛋白。
200409815 五、發明說明（34) 序列表 < 11 0 >財團法人生物技術開發中心 <120>人類嗜τ淋巴球病毒融合蛋白、編碼該蛋白之核酸盥 表現載體、以及以該蛋白檢測人類嗜T淋巴玻 "^ U %涡毒之套組 <160>62
<210>1 <211>164 <212>PRT <213>Human T-1ymphotrophic virus type I <220〉
<221>PEPTIDE <300〉 <301>Malik，K.T·，Even，J· and Karpas，A· <302>M〇1 ecu 1ar cloning and complete nucleotide sequence of an adult T cell leukaemia virus/human T cell leukaemia virus type I (ATLV/HTLV-I) isolate of Caribbean origin: relationship to other members of the ATLV/HTLV-I subgroup
0296-9137TW(Nl) ;CHIUMBOW.ptd 第37頁 200409815
Virol. Val Ala Gly Leu Ala Ser Val Asp Lys Ala lie Val Lys lie Ala Arg Gly Leu Gly Gly Leu Cys Cys Phe Val Ser lie 五、發明說明（35) <303> J. Gen, <304>69 <305>Pt 7 <307>1988 <308>D13784 <400>1 Met Gly Ala Gly
Gly Ser Met Ser
Leu Leu His G1u
Gin Leu Thr Gin
Lys Asn Leu Leu
Ala Gin Asn Arg
Phe Trp Glu Gin
Leu Gin Glu Gin
Thr Asn Ser His
Arg 11 e Thr 1 0 Gly Lys Ser 20 Asp lie Ser 30 Lys Asn His 40 Gin Tyr Ala 50 Asp Leu Leu 60 Cys Lys Ala 70 Leu Asn lie 80 Leu Gin Glu 90
0296-9137nfF(Nl) ;CHIUMBOT.ptd 第38頁 200409815 五、發明說明（36)
Arg Pro Pro Leu Glu Asn Arg Val Leu Thr 100
Gly Trp Gly Leu Asn Trp Asp Leu Gly Leu 110
Ser Gin Trp Ala Arg Glu Ala Leu Gin Thr 120
Gly lie Thr Leu Val Ala Leu Leu Leu Leu 130
Val lie Leu Ala Gly Pro Cys lie Leu Arg 140
Gin Leu Arg His Leu Pro Ssr Arg Val Arg 150
Tyr Pro His Tyr Ser Leu lie Asn Pro Glu 160
Ser Ser Leu stop 163 <210>2 <211>166
<212>PRT <21 3>Human T-1ymphotrophic virus type II <220〉
<221>PEPTIDE
0296-9137TW(Nl) ;CHIUMBDW.ptd 第39頁 200409815 五、發明說明（37) <300〉 <301>Shimotohno,K·， Golde，D.W.， Miwa，M·， Sugimura， T. and Chen, I. S.
<302>Nucleotide sequence ana lysis of the long terminal repeat of human T-cell leukemia virus type II
<303>Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A <304>81 <305>4 <306>1079-1083 <307>1984 <308>NC—001488 <400>2
Met Ala Gly Thr Gly lie Ala Gly Gly Val 10
Thr Gly Ser Leu Ser Leu Ala Ser Ser Lys 20
Ser Leu Leu Phe Glu Val Asp Lys Asp lie 30
Ser His Leu Thr Gin Ala lie Val Lys Asn 40
His Gin Asn lie Leu Arg Val Ala Gin Tyr 50
0296-9137H/F(Nl)；aiIUMB0W.ptd 第40頁 200409815 五、發明說明（38)
Ala Ala Gin Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu 60
Leu Phe Trp Glu Gin Gly Gly Leu Cys Lys 70
Ala lie Gin Glu Gin Cys Cys Phe Leu Asn 80 lie Ser Asn Thr His Val Ser Val Leu Gin 90
Glu Arg Pro Pro Leu Glu Lys Arg Val lie 100
Thr Gly Trp Gly Leu Asn Trp Asp Leu Gly 110
Leu Ser Gin Trp Ala Arg Glu Ala Leu Gin 120
Thr Gly lie Thr lie Leu Ala Leu Leu Leu 130
Leu Val lie Leu Phe Gly Pro Cys lie Leu 140
Arg Gin lie Gin Ala Leu Pro Gin Arg Leu 150
Gin Asn Arg His Asn Gin Tyr Ser Leu lie 160 166
Asn Pro Glu Thr Met Leu stop
0296-9137TW(Nl) ;CHIUMB0W.ptd 第41頁 200409815
五、發明說明（39) <210>3 <211>89 <212>PRT <213〉人工序列 <220〉
<221>DOMAIN <223〉選擇抗原集中區域之人類嗜τ淋巴球病毒第-白2 1片段，*胺基酸序列相同只有核酸序列有修飾 <400>3 ^
Ala Ser Gly Lys Ser Leu Leu His Glu Val 10
Asp Lys Asp lie Ser Gin Leu Thr Gin Ala 20 lie Val Lys Asn His Lys Asn Leu Leu Lys 30 lie Ala Gin Tyr Ala Ala Gin Asn Arg Arg 40 Gly Leu Asp Leu Leu Phe Trp Glu Gin Gly 50
Gly Leu Cys Lys Ala Leu Gin Glu Gin Cys 60
0296-9137™p(Nl > ;CHIUMH».ptd 第42頁 200409815 五、發明說明（40)
Cys Phe Leu Asn lie Thr Asn Ser His Val 70
Ser lie Leu Gin Glu Arg Pro Pro Leu Glu 80
Asn Arg Val Leu Thr Gly Trp Gly Leu 89 <21 0>4 <211>89 <212>PRT <213〉人工序列 <220〉
<221>D0MAIN <223〉選擇抗原集中之人類嗜T淋巴球病毒第二型醣蛋白21 片段 <400>4
Ala Ser Ser Lys Ser Leu Leu Phe Glu Val 10
Asp Lys Asp lie Ser His Leu Thr Gin Ala 20 lie Val Lys Asn His Gin Asn lie Leu Arg 30
Val Ala Gin Tyr Ala Ala Gin Asn Arg Arg 40
0296-9137IW(Nl);CHIUMEOW.ptd 第43頁 200409815 五、發明說明（41)
Gly Leu Asp Leu Leu Phe Trp Glu Gin Gly 50
Gly Leu Cys Lys Ala lie Gin Glu Gin Cys 60
Cys Phe Leu Asn lie Ser Asn Thr His Val 70
Ser Val Leu Gin Glu Arg Pro Pro Leu Glu 80
Lys Arg Val lie Thr Gly Trp Gly Leu 89 <210>5 <211>336 <212>PRT <213〉人工序列 <220〉 <221>CHAIN <223〉榖胱甘肽硫轉移酶與人類嗜τ淋巴球病毒第一型醣蛋 白21抗原集中片段之融合蛋白 <400>5 Met Ser Pro lie Leu Gly Tyr Trp Lys lie 10 5 0296-9137IW(Nl) ;CMIUMBOT.ptd 第44頁 200409815
Val Gin 15 Leu Glu 25 Glu Arg 35 Lys Lys 45 Asn Leu 55 Lys Leu 65 Tyr lie 75 Gly Cys 85 Met Leu 95 Tyr Gly 105 Asp Phe 115 Ser Lys 125
Pro Thr Glu Lys Asp Glu Phe Glu Pro Tyr Thr Gin Ala Asp Pro Lys Glu Gly Val Ser Glu Thr Leu Pro 五、發明說明（42) Lys Gly Leu
Leu Glu Tyr
His Leu Tyr
Trp Arg Asn
Glu Phe Pro
Gly Asp Va1 lie lie Arg
Met Leu Gly
Glu lie Ser
Asp lie Arg
Tyr Ser Lys
Asp Phe Leu
Arg Leu Leu 20
Tyr Glu Glu 30
Gly Asp Lys 40
Leu Gly Leu 50
Tyr lie Asp 60
Ser Met Ala 70
Lys His Asn 80
Glu Arg Ala 90
Ala Val Leu 100
Arg lie Ala 110
Leu Lys Val 120
Glu Met Leu 130 第45頁 0296-9137TWF(Nl) ;CHIUMBOW.ptd 200409B15 五、發明說明（43) Lys Met Phe Glu Thr Tyr Leu Asn Pro Asp Phe Met Val Va1 Leu Tyr Asp Ala Phe Pro Lys Arg lie Glu Lys Tyr Leu Lys Trp Pro Leu Gin Gly Gly Gly Asp Leu Val Pro Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ser Gly
Asp Arg 135
Gly Asp 145
Leu Tyr 155
Met Asp 165
Lys Leu 175
Ala lie 185
Ser Ser 195
Gly Trp 205
His Pro 215
Gly Ser 225
Gly lie 235
Lys Ser 245
Leu Cys His Val Asp Ala Pro Met Val Cys Pro Gin Lys Tyr Gin Ala Pro Lys Pro Gly Leu Asp Leu Leu
His Lys 140 Thr His 150 Leu Asp 160 Cys Leu 170 Phe Lys 180 lie Asp 190 lie Ala 200 Thr Phe 210 Ser Asp 220 lie Ser 230 Ser Met 240 His Glu 250 參
0296-9137r»F(Nl) ;〇nUMBW. ptd 第46頁 200409815 五、發明說明（44) Val Asp Lys Asp Ala lie Val Lys Lys lie Ala Gin Arg G1y Leu Asp Gly Gly Leu Cys Cys Cys Phe Leu Val Ser Ile Leu Glu Asn Arg Val Lys Leu Asn Ser lie Ser Gin Leu Thr Gin 255 260
Asn His Lys Asn Leu Leu 265 270
Tyr Ala Ala Gin Asn Arg 275 280
Leu Leu Phe Trp Glu Gin 285 290
Lys Ala Leu Gin Glu Gin 295 300
Asn lie Thr Asn Ser His 305 310
Gin Glu Arg Pro Pro Leu 315 320
Leu Thr Gly Trp Gly Leu 325 330
Ser Stop 335 <210>6 <211>321 <212>PRT <213〉人工序列
0296.9137T1fF(Nl);CHIUMBOT.ptd 第47頁 200409815
<220>
<221>CHAIN <223〉穀胱甘肽硫轉移酶與人類嗜τ淋巴球病主 白21抗原集中片段之融合蛋白 ’—型蛋 <400>6
Met Ser Pro lie Leu Gly Tyr Trp Lys lie 1 5 10 Lys Gly Leu Val Gin Pro Thr Arg Leu Leu 15 20
Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu 25 30
His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys 35 40
Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu 45 50
Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr lie Asp 55 60
Gly Asp Val Lys Leu Thr GLn Ser Met Ala 65 70 lie lie Arg Tyr lie Ala Asp Lys His Asn 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala 85 90
O296-9137T1iF(Nl);CHIUMB0W.ptd 第 48 頁 200409815 五、發明說明（46) G1 u lie Ser Asp lie Arg Tyr Ser Lys Asp Phe Leu Lys Met Phe Thr Tyr Leu Pro Asp Phe Val Val Leu Asp Ala Phe Lys Arg lie Lys Tyr Leu Trp Pro Leu
Met Leu G1u 95
Tyr Gly Val 105
Asp Phe Glu 115
Ser Lys Leu 125
Glu ASp Arg 135
Asn Gly Asp 145
Met Leu Tyr 155
Tyr Met ASp 165
Pro Lys Leu 175
Glu Ala lie 185
Lys Ser Ser 195
Gin Gly Trp 205
Gly Ala Ser Arg Thr Leu Pro Glu Leu Cys His Val Asp Ala Pro Met Val Cys Pro Gin Lys Tyr Gin Ala
Val Leu 100 lie Ala 110 Lys Val 120 Met Leu 130 His Lys 140 Thr His 150 Leu ASp 160 Cys Leu 170 Phe Lys 180 lie Asp 190 lie Ala 200 Thr Phe 210
0296-9137TWF(Nl);CHIUMB0W.ptd 第49頁 200409815 五、發明說明（47)
Gly Gly Gly Leu Val Pro
Asp
Arg
His 215
Gly
Pro
Ser
Pro
Ala
Lys
Ser
Ser
Ser
Asp 220
Lys
Ser Leu Ser His His Gin Ala Ala Leu Phe Ala lie lie Ser Glu Arg Thr Gly Stop
Leu Phe Leu Thr Asn lie Gin Asn Trp Glu Gin Glu ASn Thr Pro Pro Trp Gly 225
Glu Val 235
Gin Ala 245
Leu Arg 255
Arg Arg 265
Gin Gly 275
Gin Cys 285
His Val 295
Leu Glu 305
Leu Lys 315
Asp Lys lie Val Val Ala Gly Leu Gly Leu Cys Phe Ser Val Lys Arg Leu ASn 230 ASp 11 e 240 Lys Asn 250 Gin Tyr 260 Asp Leu 270 Cys Lys 280 Leu Asn 290 Leu Gin 300 Val lie 310 Ser Ser 320
第50頁 0296-9137TW(Nl) ;CHIUMB0W.ptd 200409815 五、發明說明（48) <210>7 <211>253 <212>PRT <213〉人工序列 <220>
<221>CHAIN <22 3〉硫氧化還原蛋白與人類嗜T淋巴球病毒第一型醣蛋白 21抗原集中片段之融合蛋白 <400>7
Met Ser Asp Lys lie lie His Leu Thr Asp 1 5 10
Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala 15 20
Asp Gly Ala lie Leu Val Asp Phe Trp Ala 25 30
His Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met lie Ala 35 40
Pro lie Leu Asp Glu lie Ala Asp Glu Tyr 45 50
Gin Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn 55 60 lie Asp His Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys
02%.9137IW(Nl);CHIUMBOTf.ptd 第51頁 200409815 五、發明說明（49)
Tyr Gly lie Arg
Leu Phe Lys Asn
Lys Val Gly Ala
Lys G1u Phe Leu
Ser Gly Ser Gly
Pro Met Gly Ser
His Ser Ser Gly
His Met Ala Ser
Glu Val Asp Lys
Gin Ala lie Val
Leu Lys lie Ala
Arg Arg Gly Leu 65 Gly lie 75 Gly Glu 85 Leu Ser 95 Asp Ala 105 Asp Asp 115 Ser His 125 Leu Val 135 Gly Lys 145 Asp lie 155 Lys Asn 165 Gin Tyr 175 Asp Leu
Pro Thr Val Ala Lys Gly Asn Leu Asp Asp His His Pro Arg Ser Leu Ser Gin His Lys Ala Ala Leu Phe 70 Leu Leu 80 Ala Thr 90 Gin Leu 100 Ala Gly 110 Lys Val 120 His His 130 Gly Ser 140 Leu His 150 Leu Thr 160 Asn Leu 170 Gin Asn 180 Trp Glu
0296.9137T1fF(Nl);CHIUMB0V.ptd 第52頁 200409815 五、發明說明（50) Gin Gly Gly Leu Gin Cys Cys Phe His Val Ser lie Leu Glu Asn Arg Leu Leu Glu lie Arg Pro Leu Glu Thr Gly Stop <210>8 <211>253 <212>PRT <213〉人工序列 185
Cys Lys Ala 195
Leu Asn lie 205
Leu Gin Glu 215
Val Leu Thr 225
Phe Glu Phe 235
Ser Thr Cys 245 190
Leu Gin Glu 200
Thr Asn Ser 210
Arg Pro Pro 220
Gly Trp Gly 230
Arg Gly Arg 240
Ser Asn Arg 250 <220〉
<221>CHAIN <22 3〉硫氧化還原蛋白與人類嗜T淋巴球病毒第二型醣蛋白 21抗原集中片段之融合蛋白
第53頁 0296.91371W(Nl);CHIUMBW.ptd 200409815 五、發明說明（51) <400>8
Met Ser Asp Lys lie 1 5
Asp Ser Phe Asp Thr 15
Asp Gly Ala lie Leu 25
His Trp Cys Gly Pro 35
Pro lie Leu Asp Glu 45
Gin Gly Lys Leu Thr 55 lie Asp His Asn Pro 65
Tyr Gly lie Arg Gly 75
Leu Phe Lys Asn Gly 85
Lys Val Gly Ala Leu 95
Lys Glu Phe Leu Asp 105
Ser Gly Ser Gly Asp lie His Leu Thr Asp 10
Asp Val Leu Lys Ala 20
Val Asp Phe Trp Ala 30
Cys Lys Met lie Ala 40 lie Ala Asp Glu Tyr 50
Val Ala Lys Leu Asn 60
Gly Thr Ala Pro Lys 70 lie Pro Thr Leu Leu 80
Glu Val Ala Ala Thr 90
Ser Lys Gly Gin Leu 100
Ala Asn Leu Ala Gly 110
Asp Asp Asp Lys Val
0296.9137TW(N1) ;CHIUMEOW.ptd 第54頁 200409815 五、發明說明（52)
Pro Met Gly Ser
His Ser Ser G1 y
His Met Ala Ser
Glu Va 1 Asp Lys
Gin Ala lie Val
Leu Arg Val Ala
Arg Arg Gly Leu
Gin Gly Gly Leu
Gin Cys Cys Phe
His Val Ser Val
Leu Glu Lys Arg
Leu Leu Glu lie 115 Ser His 125 Leu Val 135 Ser Lys 145 Asp lie 155 Lys Asn 165 Gin Tyr 175 Asp Leu 185 Cys Lys 195 Leu Asn 205 Leu Gin 215 Val lie 225 Phe Glu
His His Pro Arg Ser Leu Ser His His Gin Ala Ala Leu Phe Ala lie lie Ser Glu Arg Thr Gly Phe Arg 120 His His 130 Gly Ser 140 Leu Phe 150 Leu Thr 160 Asn lie 170 Gin Asn 180 Trp Glu 190 Gin Glu 200 Asn Thr 210 Pro Pro 220 Trp Gly 230 Gly Arg 國
0296-9137TW(Nl)；ammW.ptd 第55頁 200409815 五、發明說明（53) 235 240
Arg Pro Leu Glu Ser Thr Cys Ser Asn Arg 245 250
Thr Gly Stop <210>9 <211>492 <212>DNA <213〉人工序列 <220>
<221>CDS < 2 2 3 >修飾為大腸桿菌利用率較高之人類嗜τ淋巴球病毒第 一型醣蛋白21 <400>9 atgggtgcag ccctggcatc eggtaaatct cagetgactc aggcaa tegt gcagtaeget gcacagaacc agggtggcct gtgcaaagca gegttgctgg 50 ctgctgcacg 100 taaaaaccac 150 gtcgtggcct 200 ctgcaggaac eggtatcacc aagttgacaa aaaaacctgc ggacctgetg agtgetgt11 ggctccatgt agacatctcc tgaaaatege ttctgggaac cctgaaca tc
0296-91371W(Nl) ;CHIUMBW.ptd 第56頁 200409815 五、發明說明（54) actaac tccc 250 acg111 ctat cctgcaggaa eg tccgccgc tggaaaaccg tgtactgact 300 ggctggggcc tgaactggga cctgggcctg tctcagtggg ctcgtgaggc 350 gctgcagact ggtatcaccc tggttgcgc t gctgctgctg gttatcctgg 400 caggtccgtg cat cc tgcgt cagetgcgt c acctgccgtc tcgtgtacgt 450 tacccgcact actctctgat caaaccggaa tettccctgt aa
<210>1 0 <211>40 <212>DNA <213>人工序歹丨J <220〉
<221>primer^bi nd <223>I FI <400>1 0 cgcatatggg tgcaggcgtt gctggcggta tcaccggctc 4 0 <210>1 1
0296-91371W(Nl) ;CHIUMEOIV.ptd 第57頁 200409815 五、發明說明（55) <211>40 <212>DNA <213〉人工序列 <220> <221>primer_bi nd <223>I F2 <400>1 1 tggcatccgg taaatctctg ctgcacgaag ttgacaaaga 40
<210>1 2 <211>41 <212>DNA <213>人工序歹丨J <220〉 <221>primer_bi nd <223>I F3 <400>1 2 agetgactea ggcaatcgtt aaaaaccaca aaaacctgc t 41 <210>1 3
0296-9137T1»fF(Nl) ;CHIUMEOW. ptd 第58頁 200409815 五、發明說明（56) <211>40 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <221>pr imer_bi nd <223>I F4 <400>13 cgcagtacgc tgcacagaac cgtcgtggcc tggacctgct 40 <210>14 <211〉40 <212>DNA <213〉人工序列 <220> <221>primer_bi nd <223>I F5 <400>14 aacagggtgg cctgtgcaaa gcactgcagg aacagtgctg 40 <210>1 5
0296-9137TW(Nl);CHIUMB0W.ptd 第59頁 200409815 五、發明說明（57) <211>40 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <221>primer_bi nd <223>I F6 <400>1 5 acatcactaa ctcccacgtt tctatcctgc aggaacgtcc 4 0
<210>1 6 <211>40 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <221>primer_bi nd <223>I F7 <400>16 aaaaccgtgt actgactggc tggggcctga actgggacct 40 <210>17
0296-9137TW(Nl) ;CHIUMB0W.ptd 第60頁 200409815 五、發明說明（58) <211>40 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <221>pr i mer_b i nd <223>I F8 <400>1 7 ctcagtgggc tegtgaggcg ctgcagactg gtatcaccct 40 <210>18 <211>40 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <221>primer_bind <223>I F9 <400>18 tgctgctgct ggttatcctg gcaggtccgt gcatcctgcg 4 0 <210>1 9
0296-9137IW(Nl) ;CHIUMB(W.ptd 第61頁 200409815 五、發明說明（59) <211>40
<212>DNA
< 2 1 3 >人工序歹丨J <220〉 <22 1 >pr imer_b i nd <223>I F10 <400>1 9 gtcacctgcc gtctcgtgta egttacccgc actactctct 40 <210>20 <211>49 <212>DNA <213〉人工序列 <220> <22 1 > pr i mer_b i nd <223>I R1 <400>20 egetegagtt acagggaaga ttccggtttg atcagagagt agtgcgggt 49
0296-9137TWF(Nl);CHIUMBOT.ptd 第62頁 200409815 五、發明說明（60) <210>21 <211>40 <212>DNA <21 3>人工序列 <220〉 <221>primer_bi nd <223>I R2 <400>21 cgagacggca ggtgacgcag ctgacgcagg atgcacggac 40 <210>22 <211>40 <212>DNA 〈213〉人工序列 <220〉 〈221>primer_bi nd <223>I R3 <400>22 ataaccagca gcagcagcgc aaccagggtg ataccagtct 40
0296-9137TW(Nl) ;CHIUMBDW.ptd 第63頁 200409815
五、發明說明（61)
<210>23 <211>40 <212>DNA < 2 1 3〉人工序列 <220〉 <2 2 1 >p r i mer_b i nd <223>I R4 <400>23 tcacgagccc actgagacag gcccaggtcc cagttcaggc 40 <210>24 <211>40 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <221>primer_bind <223>I R5 <400>24 gtcagtacac ggttttccag cggcggacgtt cctgcagga 40
0296-9137TW(Nl) ;CHIUMBOW.ptd 第64頁 200409815 五、發明說明（62) <210>25 <211>40 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <221>primer_bind <223>I R6 <400>25 tgggagttag tgatgttcag gaaacagcac tgttcctgca 40 <210>26 <211>40 <212>DNA <213>人工序歹，J <220〉 <221>primer_bi nd <223>I R7 <400>26 cacaggccac cctgttccca gaacagcagg tccaggccac 40
0296-9137T1fF(Nl) ;CHIUMBOW.ptd 第65頁 200409815
五、發明說明（63)
<210>27 <211>40 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <221>p imer一bi nd <223>I R8 <400>27 tgtgcagcgt actgcgcgat tttcagcagg tttttgtggt 40 <210>28 <211>40 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <221>primer_bind <223>I R9 <400>28 attgcctgag tcagctggga gatgtctttg tcaacttcgt 40
0296-9137TW(Nl) jCHIUMEOW.ptd 第66頁 200409815 五、發明說明（64) <210>29 <211>40 <212>DNA <213〉人工序列 <220> <221>primer一bind <223>I R10 <400>29 gatttaccgg atgccaggga catggagccg gtgataccgc 40 <210>30 <211>501 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉
<221>CDS <2 23〉人類嗜T淋巴球病毒第二型醣蛋白21 <400>30 atggccggga caggtatcgc tggcggagta acaggctccc tatctctagc 50
0296-9137WF(Nl);CHIUMB0W.ptd 第67頁 200409815 五、發明說明（65) t tccag taaa ageet tetet tegaggttga caaagata tc tcccacctta 100 cccaggccat agt caaaaat ca tcaaaaca teetccgggt tgcacaatat 150 gcagcc caga atagaegagg at tagacctc ctattctggg aacaaggggg 200 tttgtgcaaa gccat acagg agcaatgttg cttcctcaat atcagt aaca 250 cteatg tatc cgt cc tccaa gaacggccc c ctcttgaaaa gcgtgtcate 300 accggt tggg gac taaactg ggatettggt ctgtcccagt gggeaegaga 350 agccc t ccag acaggcataa ccattctcac cctactcc tc cttgtc atat 400 tgtttggccc ctgea teetc cgccaaatcc aagcccttcc gcagcggtta 450 caaaac egae atagccagta tgccct tat c aaccaagaga ccatgctata 500 a <210>3 1 <211>40 <212>DNA <213〉人工序列
0296-913THfF(Nl) ;CHIUMBW.ptd 第 68 頁 200409815 五、發明說明（66) <220>
<221>primer_bi nd <223>II FI <400>31 cgcatatggc cgggacaggt atcgctggcg gagtaacagg 40 <210>32 <211>40 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <221>primer_bind <223>II F2 <400>32 ctagcttcca gtaaaagcct tctcttcgag gttgacaaag 40 <210>33 <211>40 <212>DNA <213〉人工序列
0296-9137HfF(Nl) ;CHIUMB0W.ptd 第69頁 200409815 五、發明說明（67) <220> <221>prmer_bi nd <223>I I F3 <400>33 ccttacccag gccatagtca aaaatcatca aaacatcctc 4 0 <210>34 <211>40 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <221>pr i mer_b i nd <223>I I F 4 <400>34 aatatgcagc ccagaataga cgaggattag acctcctatt 40 <210>35 <211>40 <212>DNA <213〉人工序歹ij
0296-913TraF(Nl);CMIlMB0«f.ptd 第 70 頁 200409815 五、發明說明（68) <220> <221>primer_bind <223>II F5 <400>35 ggggg11 tgt gcaaagccat acaggagcaa tgttgcttcc 40 <210>36 <211>40 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <221>pr imer_b i nd <223>II F6 <400>36 taacac teat gtatccgtcc tccaagaacg gccccctc 11 40 <210>37 <211>40 <212>DNA <213〉人工序列
0296-913TIW(Nl);CHIUMHW.ptd 第71頁 200409815 五、發明說明（69) <220〉
<221>primer_bi nd <223>I I FT <400>37 teateaccgg ttggggacta aactgggatc ttggtctgtc 40 <210>38 <211>40 <212>DNA <213〉人工序列 <220> <221>primer_bind <223>I I F8 <400>38 egagaa gccc tccagacagg cataaccat t ctcaccctac 40 <210>39 <211>40 <212>DNA < 2 1 3 >人工序列
0296.9137TW(N1) ;CHIUMB0W.ptd 第 72 頁 200409815 五、發明說明（70) <220〉 <221>primer^bi nd <223>II F9 <400>39 catattgttt ggcccctgca tcctccgcca aatccaagcc 40 <210>40 <211>40 <212>DNA <213〉人工序列 <220> <221>primer_bind <223>II F10 <400>40 ggttacaaaa ccgacatagc cagtatgccc ttatcaacca 40
<210>41 <211>39 <212>DNA <213>人工序歹，J
HI 0296-9137TW(Nl) ;CHIUMEOIV.ptd 第73頁 200409815 五、發明說明（71) <220〉 <221>primer_bi nd <223>II R1 <400>41 cgctcgagtt atagcatggt ctcttggttg ataagggca 39
<210>42 <211>40 <212>DNA <213>人工序歹丨J <220〉 <221>primer_bi nd <223>II R2 <400>42 gtcggttttg taaccgctgc ggaagggct t ggatttggcg 40
<210>43 <211>40 <212>DNA <213>人工序歹，J
0296-9137TW(Nl) ;CHIUMEW.ptd 第74頁 200409815 五、發明說明（72) <220> <221>primer^bi nd <400>43 gggccaaaca atatgacaag gaggagtagg gtgagaatgg 40
<210>44 <211>40 <212>DNA <213>人工序歹丨J <220> <221>p r i mer_b i nd <223>I I R4 <400>44 ctggagggct tctcgtgccc actgggacag accaagatcc 40
<210>45 <211>40 <212>DNA <213>人工序歹》J 1^11 0296-9137HF(Nl) ;CHIUMEOW.ptd 第75頁 200409815 五、發明說明（73) <220> <221>primer_bind <223>II R5 <400>45 cccaaccggt gatgacacgc 111tcaagag ggggccg11c 4 0
<210>46 <211>40 <212>DNA <213>人工序歹丨J <220〉 <221>pr imer_bi nd <223>II R6 <400>46 gatacatgag tgttactgat attgaggaag caacattgct 4 0
<210>47 <211>40 <212>DNA <213>人工序歹丨J 0296-9137™F(Nl);CHIUMBW.ptd 第76頁 200409815 五、發明說明（74) <220〉 <2 21>pr imer_bi nd <223>I I R7 <400>47 tttgcacaaa cccccttgtt cccagaatag gaggtctaat 40 <210>48 <211>40
<212>DNA < 21 3 >人工序列 <220> <2 21>p r i mer_b i nd <223>I I R8 <400>48 tctgggctgc atattgtgca acccggagga tgttttgatg 40 <210>49 <211>40
<212>DNA < 2 1 3 >人工序列
0296-9137HF(Nl);CHIUMB0W.ptd 第77頁 200409815 五、發明說明（75) <220> <2 21>p r i mer_b i nd <223>I I R9 <400>49 atggcc tggg taaggtggga gatatctttg tcaacctcga 4 0 <210>50 <211>40 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉
<221>primer_bind <223>II RIO <400>50 tttactggaa getagagata gggagcctgt tactccgcca 40 <210>5 1 <211>3 1 <212>DNA <213〉人工序列
0296-9137TW(Nl) ;CHIUMB0W.ptd 第78頁 200409815 五、發明說明（76) <220〉
<221>primer_bi nd <223>I gp21 (270)/GST F <400>5 1 cgccatgggt gca tccggta aatctctgct g 31 <210>52 <211>29 <212>DNA <213〉人工序列 <220>
<221>primer_bind <223>I gp21 (270)/GST R <400>52 cgaagc ttea ggccccagcc agtcagtac 2 9 <210>53 <211>29 <212>DNA < 21 3 >人工序列
第79頁 0296-9137TW(Nl);CHIlftlB0W.ptd 200409815 五、發明說明（77) <220>
<221>primer_bi nd <223>II gp21 (270)/GST F <400>53 cgggatccgc ttccagtaaa agccttctc 29 <210>54 <211>29 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉
<221>primer_bi nd <223>II gp21 (270)/GST R <400>54 cgaagcttta gtccccaacc ggtgatgac 29 <210>55 <211>267 <212>DNA <213〉人工序列
O296-9137nfF(Nl);CHIUMB0W.ptd 第80頁 2004臓 15 <220〉 <221>M isc_feature 巴球病毒第一型醣蛋白21 <223〉編碼抗原集中之人類嗜τ淋 片段 <400>55 gcatcc ggta tctccc aget gactcaggca ategeg cagt acgctgcaca ggaacagggt ggcctg tgea acatca ctaa ctcccacgtt aaccgt gtac tgactggctg 267 aatctctgct 50 atcgttaaaa 100 gaaccgtcgt 150 aageaetgea 200 tetatcctgc 250 gggeetg gcaegaagt t accacaaaaa ggcctggacc ggaacagtgc aggaacgtcc gacaaaga ca cctgctgaaa tgctgttctg tgtttcctga gccgctggaa <210>56 <211>267 <212>DNA <213〉人工序列
0296-9137reF(Nl) ;CHIUMEOW.ptd 第81頁 200409815 五、發明說明（79) <220> <221〉 Misc一 feature < 2 2 3 >編碼抗 原集中之人 類嗜T淋巴球病毒第二型醣蛋白21 片段 <400>56 gettccagta aaagccttet ct tegaggt t gacaaaga ta tctccc acct 50 taccca ggee atagt caaaa atcatcaaaa cateeteegg gttgcacaat 100 atgcagccca gaa tagaega ggattagacc tcctattctg ggaacaaggg 150 ggtttgtgea aagccataca ggagcaatgt tgcttcctca atatcagtaa 200 cactea tgta teegtcctcc aagaaeggee ccctcttgaa aagcgt gtea 250 tcaccggttg gggacta 267 <210>57 <211>1008 <212>DNA <213〉人工序列 翁
0296-9137HfF(Nl) ;CHIUMBOW.ptd 第 82 頁 200409815 五、發明說明（80) <220〉
<221> CDS <223〉編碼 GST/HTLV - I gp21 融合蛋白 <400>57
atgtccccta tac taggt ta 11 ggaaaa11 aagggcct tg tgcaac ccac 50 tcgact tctt ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttg tatg 100 agcgcgatga agg tgataaa tggcgaaaca aaaag11 tga attggg tttg 150 gagt11 ccca atettcctta 11atat tgat ggtgatgt ta aa11aa caca 200 gtctat ggcc atcataegtt atatagctga caagcacaac atgttgggtg 250 gttgtc caaa agagegtgea gagatt tcaa tgettgaagg agcggt tttg 300 gatat t agat aeggtgtttc gagaat tgea tatagtaaag actttgaaac 350 tctcaaagtt gat 11 tetta gcaagctacc tgaaatgc tg aaaatg 11eg 400 aagatc gt11 atgtcataaa acatat ttaa atggtgat ca tgtaac ccat 450 0296-9137TW(Nl) ;CHIUMBOW.ptd 第83頁 200409815
五、發明說明（81) cctgac t tea tgt tgtatga egetct tga t gttgttttat acatggaccc 500 aatgtgcctg gatgegttee caaaat tagt ttgttttaaa aaacgtattg 550 aageta tccc acaaattgat aagtac t tga aatccagcaa gtatatagea 600 tggee11tgc agggetggea agccacgt11 ggtggtggcg accatcctcc 650 aaaateggat ctggt teege gtggatcccc gggaatttcc ggtggtggtg 700 gtggaa ttet agactccatg ggtgeateeg gtaaatctct gctgcacgaa 750 gttgacaaag aca tc tccca gc tgac tcag gcaatcgt ta aaaacc acaa 800 aaacc t gctg aaaat egege agtacgctgc acagaaccgt cgtggcctgg 850 acctgc tgtt ctgggaacag ggtggcctgt gcaaagcact gcaggaacag 900 tgctg11tee tgaacatcac taactcccac gtttetatcc tgcaggaacg 950 tccgccgctg gaaaaccgtg tactgactgg ctggggcctg aagettaatt 1000 categt ga 1008 0296-9137nifF(Nl) ;CHIUMG0W.ptd 第84頁 200409815 五、發明說明（82) <210>58 <211>963
<212>DNA < 21 3〉人工序列 <220>
<221>CDS <223〉編碼 GST/HTLV - II gp21 融合蛋白
<400>58 atgtccccta tac taggt ta 11ggaaaat t aagggcct tg tgcaacccac 50 tcgact tctt ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg 100 agcgcgatga aggtgataaa tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg 150 gagtttccca atcttcctta ttatattgat ggtgatgt ta aattaacaca 200 gtctat ggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac atgttgggtg 250 gttgtccaaa agagcgtgca gagatt tcaa tgcttgaagg agcggt tttg 300 gatattagat acggtgtttc gagaat tgca tatagtaaag 0296-9137IW(Nl);CHIUMB(»f.ptd 第85頁 200409815 五、發明說明（83) actttgaaac tctcaaagtt aaaatg tteg aagatcgttt tgtaac ccat cctgac ttea acatggaccc aatgtgcctg aaacgt attg aageta tccc gtatat agea tggee11tgc accatc ctee aaaatc ggat agcct t ctct tegagg ttga agtcaa aaat catcaa aaca atagaegagg attaga cctc gccata cagg agcaat gttg cgtcct ccaa gaaegg cccc 350 gattttctta 400 atg tcataaa 450 tgt tgtatga 500 gatgegttee 550 acaaa t tgat 60 0 agggetggea 650 ctgg11ccgc 700 caaagatatc 750 teetccgggt 800 cta 11 ctggg 850 cttcctcaat 900 etcttgaaaa gcaagctacc acatat ttaa egetct tga t caaaat tag t aagtacttga agccacgt11 gtggatccgc tcccacctta tgcacaata t aacaaggggg atcagtaaca gcgtgtcatc tgaaatgc tg atggtgatca gttgttttat ttgttttaaa aatccagcaa ggtggtggcg ttccagtaaa cccaggccat gcagcccaga tttgtgcaaa cteatgta tc accggttggg
0296-9137TWF(Nl) ;CHIUMEOW.ptd 第 86 頁 200409815 五、發明說明（84) gactaaagct 950 taattcatcg 963 tga <210>59 <211>759 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <221>CDS <223〉編碼Thio/HTLV-I gp21融合蛋白 <400>59 atgtct gata aaa 11 at tea tc tgac tga t gattettt tg atactgatgt 50 acttaaggca gatggtgcaa tcctggttga tttctgggca cactgg tgcg 100 gtccgt gcaa aatgateget ccgattctgg atgaaatege tgacgaatat 150 cagggc aaac tgaccgttgc aaaactgaac ategatcaca acccgggcac 200 tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgc tg ctgttcaaaa 250
0296-9137TW(Nl);CHIUMB0V.ptd 第87頁 200409815 五、發明說明（85) acggtgaagt aggtcagttg aaagagttcc gtgatgacga tgacaaggta cacagcagcg gcctggtgcc tctgctgcac gaagttgaca ttaaaaacca caaaaacctg cgtcgtggcc tggacctgct actgcaggaa cagtgc tg11 tcctgcagga acgtccgccg ctgctcgaga tcttcgaatt cagtaa tcgt acagggtag 759 ggcggcaacc 300 tcgacgctaa 350 cccatgggca 400 gcgcggcagc 450 aagacatctc 500 ctgaaaatcg 550 gttctgggaa 600 tcc tgaacat 650 ctggaaaacc 700 ccgcggccgc 750 aaagtgggtg cctggccggc gcagccatca ca tatggca t ccagctgac t cgcagtacgc cagggtggcc cactaactcc gtgtactgac aggcctctag cactgtctaa tctggatccg teatcatcat ceggtaaa tc caggcaat eg tgcacagaac tgtgcaaagc cacgtttc ta tggctggggc agtcgacc tg <210>60
0296.9137TlF(Nl);CHIUMEO«f.ptd 第88頁 200409815 五、發明說明（86) <211>759 <212>DNA <213〉人工序列 <220> <221>CDS <223> 編碼Thio/HTLV-I I gp21融合蛋 白 <400>60 atgtctgata aaattattca tc tgac tga t gattct11 tg atactgatgt 50 acttaaggca gatggtgcaa tcctggttga tttctgggca cactggtgcg 100 gtccgt gcaa aat ga tcgct ccgattctgg atgaaatcgc tgacga atat 150 cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac atcgatcaca acccgggcac 200 tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgc tg ctgttcaaaa 250 acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300 aaagag ttcc tcgacgctaa cctggccggc tctggatccg gtgatgacga 350 tgacaaggta cccatgggca gcagccatca tcatcatcat
0296-9137HfF(Nl) ;CHIUMB0W.ptd 第89頁 200409815
五、發明說明（87) cacagcagcg 400 gcctggtgcc gcgcggcagc ca tatgge11 ccagtaaaag ccttctcttc 450 gaggttgaca aagat atetc ccacct tacc caggccatag tcaaaaatca 500 tcaaaa catc ctccgggttg cacaatatgc agcccagaat agacgaggat 550 tagacc tcct attctgggaa caagggggt t tgtgcaaagc catacaggag 600 caatgt tgct tcc tcaatat cagtaacac t catgtatccg tcctcc aaga 650 acggccccct cttgaaaagc gtgtcatcac cggttgggga ctactcgaga 700 tcttcgaatt ccgcggccgc aggcctctag agtcgacc tg cagtaa tcgt 750 acagggtag 759 0296-9137™F(Nl) ;CHIlMB〇IV.ptd 第90頁 200409815 圖式簡單說明 第1圖顯示HTLV抗原核苷酸序列。第1A圖顯示HTLV -1 gp21之完整核脊酸序列；第1B圖顯示HTLV-II gp21之完整 核苷酸序列。 第2圖顯示載體pGEX-KG(第2A圖），及由其所構築而得 之構築體pGST/HTLV-I gp21(第 2B 圖）與pGST/HTLV-II gp21(第 2C 圖）。 第3圖顯示載體pThi oHi s B(第3A圖），及由其所構築 之構築體01^〇/1^1^-1忌021(第38圖）與？1^〇/1^1^-11 gp21(第 3C 圖）。 第4圖顯示以SDS-PAGE分析純化後之GST/HTLv-I gp21 或 GST/HTLV - II gp21 融合蛋白（33 kDa 位置）。 第5圖顯示以SDS-PAGE分析純化後之τΗο/Η^ν-ί gp21 或 Thio/HTLV - II gp21 融合蛋白（25 kDa 位置）。 m
第91頁 0296.9137T«fF(Nl) ;CHIUMB0!V.ptd

Claims (1)

  1. 200409815
    l. 一種純多胜肽，其特徵為具有一人類 毒一型醣蛋白21 (HTLV-I gP2l)抗原片段，巴球病 列辨識編號：3之胺基酸序列： 、序列如序 (序列辨識編號·· 3 ) ASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDLLFWFor GLCKALQEQCCFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTGWGL 。 2 · —種純多胜肽，其特徵為具有一人類嗜τ淋巴球病 毒二型醣蛋白21 (HTLV-II gp21)抗原片段，其序列如丙序 列辨識編號：4之胺基酸序列： (序列辨識編號：4 ) ASSKSLLFEVDKDISHLTQAIVKNHQNILRVAQYAAQNRRGLDLLFWEQG GLCKAI QEQCCFLNISNTHVSVLQERPPLEKRVITGWGL。 3 ·如申請專利範圍第1項所述之純多胜肽，其更包括 一穀胱甘肽硫轉移（GST )片段，而成為一榖胱甘肽硫轉 移酶與人類嗜T淋巴球病毒一蜇醣蛋白21抗原片段之融合 蛋白（GST/HTLV-I gp21)，其係如序列辨識編號：5之胺基 酸序列： (序列辨識編號：5 ) Met SPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYl EEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELg LEFPNLPYYIDGDVKLTQS Met A I I R Y I A D K Η N Met LGGCPKERAEIS Met L E gavldirygvsriayskdfetlkvd F L S K L P E Met L K Met FEDRLCHKTYLN
    0296-9137T1fF(Nl) ;CHIUME)OT.ptd 第 92 頁 200409815 六、申請專利範圍 GDH VTHPDFMetLYDALDVVLYMetDP MetCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDK YLK SSKY I AWPLQGWQATFGGGDHP PKSDLVPRGSPGISGGGGGILDSMet GASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKN HKN L L K I AQYAAQNRRGLDLLFWEQ GGLCKALQEQCCFLNITNSHVSILQ ERP PLENRVLTGWGLKLNSS Stop ° 4 ·如申請專利範圍第1項所述之純多胜肽，其更包括 一硫氧化還原蛋白（Thioredoxin)片段，而成為一硫氧 化還原蛋白與人類嗜T淋巴球病毒一型醣蛋白2 1抗原片段 之融合蛋白（Thio/HTLV-I gp21)，其係如序列辨識編號： 7之胺基酸序列： (序列辨識編號：7 ) MetSDKI IHLTDDSFDTDVLKADGAI LVDFWAHWCGPCKMetlAPILDEIAD EYQGKLTVAKLNIDHNPGTAPKYGI RGI PTLLLFKNGEVAATKVGALSKG QLKEFLDANLAGSGSGDDDDKVPMet GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMetASGK SLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLL KIAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLCK ALQEQCCFLNITNSHVSILQERPPL ENRVLTGWGLLEIFEFRGRRPLEST
    0296-9137TW(Nl) ;CHIUMB0W.ptd 第 93 頁 200409815 六、申請專利範圍 C S N R T G Stop 〇 5·如申請專利範圍第2項所述之純多胜肽，其更包括 一穀胱甘肽硫轉移酶（GST)片段，而成為一穀胱甘肽硫轉 移酶與人類嗜T淋巴球病毒二型醣蛋白21抗原片段之融合 蛋白（GST/HTLV - II gp2l)，其係如序列辨識編號：6之胺 基酸序列： (序列辨識編號：6 ) Met SPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYL eekyeehlyerdegdkwrnkkfelg LEFPNLPYyidqdvKLTQS Met A I I R YIADKHNMetLGGCPKERAEISMetL KDFETLKV RLCHKTYL D V V L Y Met D I E A I P Q I D ATFGGGDH L F E V D K D I gavldiryqvsriays F L S K L P E Met L K Met FED GDHVTHPDFMetLYDAL Met C L D A F p κ ylksskyiawplqg pksdlvprgsassk HLT QAI V K muam tt R V W L RVAQYAAQNRR GLDLLFWE〇rri rKAlQEQCCFLNI S N Τ Η V S V L ^ GR ίί ϊ E K R V I τ G W C L K L N S S Stop 。 6·如申請專利範圍第2項所述之純多胜肽’其更包括 一硫氧化還原蛋白（Thi〇red〇xin)片段，而成為一硫氧 化還原蛋白與人頬嗜τ淋巴球病毒二犁醣蛋白21抗原片段 翁
    0296-9137nfF(Nl);CMIUMB0W.ptd 第94頁 200409815 六、申請專利範圍 之融合蛋白（Thio/HTLV-II gp21)，其係如序列辨識編 號：8之胺基酸序列： (序列辨識編號：8 ) Met S D K I IHLTDDSFDTDVLKADGAI LVDFWAHWCGPCKMetlAPILDEIAD eyqgkltvaklnidhnpgtapkygi RGI PTLLLFKNGEVAATKVGALSKG QLKEFLDANLAGSGSGDDDDKVPMet GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMetASSK SLLFEVDKDISHLTQAIVKNHQNIL RVAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLCK aiqeqccflnisnthvsvlqerppl EKRVITGWGLLEIFEFRGRRPLEST C S N R T G Stop o 7 · —種分離的核酸，其編碼有一人類嗜T淋巴球病毒 一型醣蛋白21 (HTLV-I gp21)之抗原片段，其中該抗原片 段係由如序列辨識編號：5 5之核苷酸序列所編碼： (序列辨識編號：5 5 ) GCATCCGGTAAATCTCTGCTGCACGAAGTTGACAAAGACATCTCCCAGCT GACTCAGGCAATCGTTAAAAACCACAAAAACCTGCTGAAAATCGCGCAGT ACGCTGCACAGAACCGTCGTGGCCTGGACCTGCTGTTCTGGGAACAGGGT GGCCTGTGCAAAGCACTGCAGGAACAGTGCTGTTTCCTGAACATCACTAA CTCCCACGTTTCTATCCTGCAGGAACGTCCGCCGCTGGAAAACCGTGTAC TGACTGGCTGGGGCCTG 〇
    0296-9137miF(Nl) ;CHIUMBW.ptd 第95頁 六、申請專利範圍 8. —種分離的核酸，其編碼有一人類嗜T淋巴球病毒 二型醣蛋白21 (HTLV-II gp21) 之抗原片段，其中該抗原 片段係由如序列辨識編號：56之核苷酸序列所編碼： (序列辨識編號：5 6 ) GCTTCCAGTAAAAGCCTTCTCTTCGAGGTTGACAAAGATATCTCCCACCT TACCCAGGCCATAGTCAAAAATCATCAAAACATCCTCCGGGTTGCACAAT ATGCAGCCCAGAATAGACGAGGATTAGACCTCCTATTCTGGGAACAAGGG GGTTTGTGCAAAGCCATACAGGAGCAATGTTGCTTCCTCAATATCAGTAA CACTCATGTATCCGTCCTCCAAGAACGGCCCCCTCTTGAAAAGCGTGTCA TCACCGGTTGGGGACTA 〇 9. 如申請專利範圍第7項所述之分離的核酸，其更包 括一編碼有穀胱甘肽硫轉移酶（GST) 之序列，以成為一編 碼一榖胱甘肽硫轉移酶與人類嗜T淋巴球病毒一型醣蛋白 21抗原片段之融合蛋白（GST/HTLV-I gp21)的序列，其中 該融合蛋白係由如序列辨識編號：5 7之核苷酸序列所編 碼： (序列辨識編號：5 7 ) ATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCAC TCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATG AGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTG GAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACA GTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTG GTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTG GATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAAC
    0296-9137TW(Nl) ;CHIUMBW.ptd 第96頁 200409815 六、申請專利範圍
    TCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCG AAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCAT CCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCC AATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTG AAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCA TGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCC AAAATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCCCGGGAATTTCCGGTGGTGGTG GTGGAATTCTAGACTCCATGGGTGCATCCGGTAAATCTCTGCTGCACGAA GTTGACAAAGACATCTCCCAGCTGACTCAGGCAATCGTTAAAAACCACAA AAACCTGCTGAAAATCGCGCAGTACGCTGCACAGAACCGTCGTGGCCTGG ACCTGCTGTTCTGGGAACAGGGTGGCCTGTGCAAAGCACTGCAGGAACAG TGCTGTTTCCTGAACATCACTAACTCCCACGTTTCTATCCTGCAGGAACG TCCGCCGCTGGAAAACCGTGTACTGACTGGCTGGGGCCTGAAGCTTAATT CATCGTGA 〇
    10.如申請專利範圍第7項所述之分離的核酸，其更 包括一編碼有硫氧化還原蛋白（Thioredoxin) 之序列， 以成為一硫氧化還原蛋白與人類嗜T淋巴球病毒一型醣蛋 白21抗原片段之融合蛋白（Thio/HTLV - I gp21) 的序列， 其中該融合蛋白係由如序列辨識編號：5 9之核苷酸序列所 編碼： (序列辨識編號：5 9 ) ATGTCTGATAAAATTATTCATCTGACTGATGATTCTTTTGATACTGATGT ACTTAAGGCAGATGGTGCAATCCTGGTTGATTTCTGGGCACACTGGTGCG GTCCGTGCAAAATGATCGCTCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATAT
    0296-9137TW(Nl);CHIUMEO«f.ptd 第97頁 200409815 六、申請專利範圍
    CAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCACAACCCGGGCAC TGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAA ACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTG AAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGCTCTGGATCCGGTGATGACGA TGACAAGGTACCCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCG GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCATCCGGTAAATCTCTGCTGCAC GAAGTTGACAAAGACATCTCCCAGCTGACTCAGGCAATCGTTAAAAACCA CAAAAACCTGCTGAAAATCGCGCAGTACGCTGCACAGAACCGTCGTGGCC TGGACCTGCTGTTCTGGGAACAGGGTGGCCTGTGCAAAGCACTGCAGGAA CAGTGCTGTTTCCTGAACATCACTAACTCCCACGTTTCTATCCTGCAGGA ACGTCCGCCGCTGGAAAACCGTGTACTGACTGGCTGGGGCCTGCTCGAGA TCTTCGAATTCCGCGGCCGCAGGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGTAATCGT ACAGGGTAG 〇
    11.如申請專利範圍第8項所述之分離的核酸，其更包 括一編碼有穀胱甘肽硫轉移酶（GST) 之序列，以成為一編 碼一穀胱甘肽硫轉移酶與人類嗜T淋巴球病毒二型醣蛋白 21抗原片段之融合蛋白（GST/HTLV-11 gp21)的序列，其 中該融合蛋白係由如序列辨識編號：58之核苷酸序列所編 、碼： (序列辨識編號：5 8 ) ATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCAC TCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATG AGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTG GAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACA
    0296-9137IW(Nl) ;CHIUMB0W.ptd 第98頁 200409815 六、申請專利範圍 GTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTG GTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTG GATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAAC TCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCG AAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCAT CCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCC AATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTG AAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCA TGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCC AAAATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCGCTTCCAGTAAAAGCCTTCTCT TCGAGGTTGACAAAGATATCTCCCACCTTACCCAGGCCATAGTCAAAAAT CATCAAAACATCCTCCGGGTTGCACAATATGCAGCCCAGAATAGACGAGG ATTAGACCTCCTATTCTGGGAACAAGGGGGTTTGTGCAAAGCCATACAGG AGCAATGTTGCTTCCTCAATATCAGTAACACTCATGTATCCGTCCTCCAA GAACGGCCCCCTCTTGAAAAGCGTGTCATCACCGGTTGGGGACTAAAGCT TAATTCATCGTGA 〇 1 2.如申請專利範圍第8項所述之分離的核酸，其更包 括一編碼有硫氧化還原蛋白（Thioredoxin) 之序列，以 成為一硫氧化還原蛋白與人類嗜T淋巴球病毒二型醣蛋白 21抗原片段之融合蛋白（Thio/HTLV-II gp21) 的序列， 其中該融合蛋白係由如序列辨識編號：6 0之核苷酸序列所 編碼： (序列辨識編號：6 0 ) ATGTCTGATAAAATTATTCATCTGACTGATGATTCTTTTGATACTGATGT
    0296-9137TW(Nl) ;CHIUME0W. ptd 第99頁 200409815 六、申請專利範圍
    ACTTAAGGCAGATGGTGCAATCCTGGTTGATTTCTGGGCACACTGGTGCG GTCCGTGCAAAATGATCGCTCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATAT CAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCACAACCCGGGCAC TGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAA ACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTG AAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGCTCTGGATCCGGTGATGACGA TGACAAGGTACCCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCG GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTTCCAGTAAAAGCCTTCTCTTC GAGGTTGACAAAGATATCTCCCACCTTACCCAGGCCATAGTCAAAAATCA TCAAAACATCCTCCGGGTTGCACAATATGCAGCCCAGAATAGACGAGGAT TAGACCTCCTATTCTGGGAACAAGGGGGTTTGTGCAAAGCCATACAGGAG CAATGTTGCTTCCTCAATATCAGTAACACTCATGTATCCGTCCTCCAAGA ACGGCCCCCTCTTGAAAAGCGTGTCATCACCGGTTGGGGACTACTCGAGA TCTTCGAATTCCGCGGCCGCAGGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGTAATCGT ACAGGGTAG °
    13. —種表現載體，其包括一編碼有一穀胱甘肽硫轉 移酶與人類嗜T淋巴球病毒一型醣蛋白21抗原片段之融合 蛋白（GST/HTLV-I gp21)的序列，其中該融合蛋白係由如 序列辨識編號：5 7之核苷酸序列所編碼： (序列辨識編號：57) ATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCAC TCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATG AGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTG GAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACA
    0296-9137TWF(Nl) ;CHHftlB0«r.ptd 第100頁 200409815 六、申請專利範圍
    GTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTG GTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTG GATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAAC TCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCG AAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCAT CCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCC AATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTG AAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCA TGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCC AAAATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCCCGGGAATTTCCGGTGGTGGTG GTGGAATTCTAGACTCCATGGGTGCATCCGGTAAATCTCTGCTGCACGAA GTTGACAAAGACATCTCCCAGCTGACTCAGGCAATCGTTAAAAACCACAA AAACCTGCTGAAAATCGCGCAGTACGCTGCACAGAACCGTCGTGGCCTGG ACCTGCTGTTCTGGGAACAGGGTGGCCTGTGCAAAGCACTGCAGGAACAG TGCTGTTTCCTGAACATCACTAACTCCCACGTTTCTATCCTGCAGGAACG TCCGCCGCTGGAAAACCGTGTACTGACTGGCTGGGGCCTGAAGCTTAATT CATCGTGA 。
    1 4 .如申請專利範圍第1 3項所述之表現載體，其中該 載體係pGST/HTLV-I gp21，且已於中華民國91年11月29日 寄存於中華民國、台灣、財團法人食品工業發展研究所， 寄存編號為940407。 1 5. —種表現載體，其包括一編碼有一硫氧化還原蛋 白與人類嗜T淋巴球病毒一型醣蛋白21抗原片段之融合蛋 白（Thio/HTLV-I gp21) 的序列，其中該融合蛋白係由如
    0296-9137TW(Nl);CHIO®)W.ptd 第101頁 200409815 六、申請專利範圍 序列辨識編號：59之核苷酸序列所編碼： (序列辨識編號：5 9 ) ATGTCTGATAAAATTATTCATCTGACTGATGATTCTTTTGATACTGATGT ACTTAAGGCAGATGGTGCAATCCTGGTTGATTTCTGGGCACACTGGTGCG GTCCGTGCAAAATGATCGCTCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATAT CAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCACAACCCGGGCAC TGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAA ACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTG AAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGCTCTGGATCCGGTGATGACGA TGACAAGGTACCCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCG GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCATCCGGTAAATCTCTGCTGCAC GAAGTTGACAAAGACATCTCCCAGCTGACTCAGGCAATCGTTAAAAACCA CAAAAACCTGCTGAAAATCGCGCAGTACGCTGCACAGAACCGTCGTGGCC TGGACCTGCTGTTCTGGGAACAGGGTGGCCTGTGCAAAGCACTGCAGGAA CAGTGCTGTTTCCTGAACATCACTAACTCCCACGTTTCTATCCTGCAGGA ACGTCCGCCGCTGGAAAACCGTGTACTGACTGGCTGGGGCCTGCTCGAGA TCTTCGAATTCCGCGGCCGCAGGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGTAATCGT ACAGGGTAG 〇 1 6 .如申請專利範圍第1 5項所述之表現載體，其中該 載體係pThio/HTLV - I gp21，且已於中華民國91年11月29 曰寄存於中華民國、台灣、財團法人食品工業發展研究 所，寄存編號為940405。 1 7. —種表現載體，其包括一編碼一榖胱甘肽硫轉移 酶與人類嗜T淋巴球病毒二型醣蛋白21抗原片段之融合蛋
    0296-9137TW(Nl);〇nUMB0IV.ptd 笫102頁 200409815 六、申請專利範圍 白（GST/HTLV- II gp21) 的序列，其中該融合蛋白係由如 序列辨識編號：58之核苷酸序列所編碼： (序列辨識編號：5 8 )
    ATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCAC TCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATG AGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTG GAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACA GTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTG GTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTG GATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAAC TCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCG AAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCAT CCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCC AATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTG AAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCA TGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCC AAAATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCGCTTCCAGTAAAAGCCTTCTCT TCGAGGTTGACAAAGATATCTCCCACCTTACCCAGGCCATAGTCAAAAAT CATCAAAACATCCTCCGGGTTGCACAATATGCAGCCCAGAATAGACGAGG ATTAGACCTCCTATTCTGGGAACAAGGGGGTTTGTGCAAAGCCATACAGG AGCAATGTTGCTTCCTCAATATCAGTAACACTCATGTATCCGTCCTCCAA GAACGGCCCCCTCTTGAAAAGCGTGTCATCACCGGTTGGGGACTAAAGCT TAATTCATCGTGA 。 18.如申請專利範圍第17項所述之表現載體，其中該
    0296-9137TWF(Nl);CHIUMEOW.ptd 第103頁 200409815 六、申請專利範圍 載體係pGST/HTLV - II gp21，且已於中華民國91年11月29 曰寄存於中華民國、台灣、財團法人食品工業發展研究 所，寄存編號為940408。 19. 一種表現載體，其包括一編碼有一硫氧化還原蛋 白與人類嗜T淋巴球病毒二型醣蛋白21抗原片段之融合蛋 白（111丨〇/耵1^-11忌021)的序列，其中該融合蛋白係由如 序列辨識編號：6 0之核苷酸序列所編碼： (序列辨識編號：6 0 ) ATGTCTGATAAAATTATTCATCTGACTGATGATTCTTTTGATACTGATGT ACTTAAGGCAGATGGTGCAATCCTGGTTGATTTCTGGGCACACTGGTGCG ^ GTCCGTGCAAAATGATCGCTCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATAT CAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCACAACCCGGGCAC TGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAA ACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTG AAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGCTCTGGATCCGGTGATGACGA TGACAAGGTACCCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCG GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTTCCAGTAAAAGCCTTCTCTTC GAGGTTGACAAAGATATCTCCCACCTTACCCAGGCCATAGTCAAAAATCA TCAAAACATCCTCCGGGTTGCACAATATGCAGCCCAGAATAGACGAGGAT TAGACCTCCTATTCTGGGAACAAGGGGGTTTGTGCAAAGCCATACAGGAG CAATGTTGCTTCCTCAATATCAGTAACACTCATGTATCCGTCCTCCAAGA ACGGCCCCCTCTTGAAAAGCGTGTCATCACCGGTTGGGGACTACTCGAGA TCTTCGAATTCCGCGGCCGCAGGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGTAATCGT ACAGGGTAG 〇
    0296-9137TWF(Nl) ;CHIUMB0W.ptd 第104頁 200409815 六、申請專利範圍 — -- 20·如申請專利範圍第19項所述之表現載體，其中該 載體係pThio/HTLV-II gp21 ，且已於中華民國“年“月“ 曰寄存於中華民國、台灣、財團法人食品工業發展研究 所，寄存編號為940406。 21. —種製備人類嗜τ淋巴球病毒抗原片段之方法， 方法包含以下步驟： Μ 將如申請專利範圍第13-20項任一項所述之表現載體 引入一細胞中； 巴球病毒抗 巴球病毒抗 使該細胞於一適當條件下表現人類嗜丁淋 原片段之融合蛋白； 收集並純化該融合蛋白以得到人類嗜丁淋 原片段。 22·如申請專利範圍第21項所述之製備人類嗜τ淋巴球 病毒抗原片段之方法，其中該細胞為大腸桿菌菌株。 、2^如申請專利範圍第22項所述之製備人類嗜τ淋巴球 病毒抗原片段之方法，其中該細胞為儿21 (DE3)菌株。 24·如申請專利範圍第21項所述之製備人類嗜τ淋巴球 病毒抗原片段之方法，其中該融合蛋白為穀胱甘肽硫轉 酶與人類嗜Τ淋巴球病毒抗原片段之融合蛋白時，純化步 驟係以榖胱甘肽瓊脂糖管柱進行。 2>5·如申請專利範圍第21項所述之製備人類嗜τ淋巴球 病毒抗原片段之方法，其中該融合蛋白為硫 與人類嗜Τ淋巴球病毒抗原片段之融合蛋白時 係以鎳離子親和層析管柱（Ni-NTA)進行。
    0296-9137TW(Nl)；aiIlMBW.ptd 第105頁 200409815 六、申請專利範圍 ---- ----- 26· —種人類嗜T淋巴球病毒檢驗套組，其包括·· 一固體基質； 一第一人類嗜τ淋巴球病毒醣蛋白21抗原片段，其固 定於該固體基質上； 一阻隔溶液，用以阻隔該固體基質上未結合於第一人 類嗜T淋巴球病毒醣蛋白2 1抗原片段的部分； 、 一第二人類嗜T淋巴球病毒醣蛋白21抗原片段； 一清洗溶液；以及 一訊號產生工具，其可操作性地與第二人類嗜7淋巴 球病毒醣蛋白2 1抗原片段連結而產生訊號； 其中該第一與第二人類嗜T淋巴球病毒醣蛋白2丨抗原 片段係擇自申請專利範圍第3〜6項任一項所述之融合蛋、 白。 27·如申請專利範圍第26項所述之人類嗜τ淋巴球病毒 檢驗套組，其中第一人類嗜T淋巴球病毒醣蛋白2丨抗原片 段係Th i o/HTLV-I I gp21融合蛋白。 、 28·如申請專利範圍第27項所述之人類嗜T淋巴球病毒 檢驗套組，其中第二人類嗜T淋巴球病毒醣蛋白2 1抗原片 段係GST/HTLV - I gp 21融合蛋白。 29·如申請專利範圍第26項所述之人類嗜τ淋巴球病毒 檢驗套組，其中該固體基質包括破璃、矽晶片、陶瓷材 料、金屬、或由有機分子聚合而成之聚合物，其中該有機 分子係擇自苯乙烯、乙烯、丙烯、酿類、丙烯酸、丙烯酸 酯、烷基丙烯酸、及烷基丙烯酸酯所組成之族群。
    0296.9137TOF(Nl);CHIUMEOW.ptd 第 106 育 200409815 六、申請專利^ " 一 ' " '~ -- 3〇·如申請專利範圍第26項所述之人類嗜T淋巴球病毒 檢驗套組，其中該阻隔溶液包括牛血清白蛋白（BSA)、絡 蛋白或動物明膠之溶液。 31·如申請專利範圍第26項所述之人類嗜T淋巴球病毒 f驗套組，其中該清洗溶液包括磷酸鹽緩衝溶液（PBS)、 二煙甲基胺基甲烷緩衝溶液（TBS)或含〇·05% Tween 2〇之 磷酸鹽緩衝溶液（PBST)。 3 2 ·如申請專利範圍第2 6項所述之人類嗜τ淋巴球病毒 檢f套組，其中該訊號產生工具係擇自放射性標記物、螢 光標記物、磷光標記物、冷光標記物及酵素所組成之族 群。 、 33.如申請專利範圍第32項所述之人類嗜τ淋巴球病毒 檢驗套組，其中該冷光標記物包括生物冷光標記 冷光標記物。 3^.如申請專利範圍第32項所述之人類嗜了淋巴球病毒 5车組她，上中胎料素係擇自驗性-酸酶、過氧化氫酶及 泠一 +乳糖甘酸酶所組成之族群。 呈色。 具中該暴質可與該酵素反應而 36·如申請專利範圍第32項所述之人類 檢驗套組，其中該訊號產生工 吐舲冬疋A ^ ^ ^ 生物素以及一抗 生物素蛋白，該抗生物素蛋白可操作性地盥 物、螢光標記物、磷光標記物、冷光 ^，射性铋j ；冷尤^圯物或酵素連結。
    0296-9137TWF(Nl) 第107頁 200409815 六、申請專利範圍 认人3J·如申請專利範圍第36項所述之人類嗜了淋巴球病毒 檢驗套組，其中該酵素係擇自鹼性碘酸酶、過氧化氫酶及 召一半乳糖苷酸酶所組成之族群。 你必丁 & Λ γ嗜之人類嗜τ淋巴球病毒 38·如申請專利範圍第37項所’與該酵素反應而 檢驗套組，更包括一基質，其中該參、 呈色。
    0296-9137TW(Nl);CHIUMEOW.ptd 第108貢
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ES2072346T3 (es) 1989-10-23 1995-07-16 Hoffmann La Roche Peptidos sinteticos de la cubierta del htlv-i.
DE4002636A1 (de) * 1990-01-30 1991-08-01 Boehringer Mannheim Gmbh Expression von hiv1- und 2-polypeptiden und deren verwendung
US6406841B1 (en) * 1993-07-01 2002-06-18 Abbott Laboratories Methods for the detection of HTLV-II antibodies employing novel HTLV-II NRA envelope peptides
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EP0848820A1 (en) 1995-06-05 1998-06-24 Abbott Laboratories Detection of htlv antibodies utilizing recombinant proteins
AU707191B2 (en) * 1995-12-28 1999-07-08 Fujirebio Inc. Fused DNA sequence, fused protein expressed from said fused DNA sequence and method for expressing said protein
JP2000078973A (ja) * 1998-09-03 2000-03-21 Tonen Corp Ｈｔｌｖ−ｉ組換え抗原

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