TARIFNAME FARKLI ÖRNEKLERDEKI BRUCELLA TÜRLERINI TESHISI VE GENOTIPLENMESI IÇIN SNP BELIRTEÇLERI VE KOMBINASYONLARI Teknik Alan Bulus konusu farkli örneklerdeki Bruce/la türlerini teshisi ve genotiplenmesi için SNP belirteçleri ve kombinasyonlari sayesinde tek bir örnege ait genomik DNA kullanilarak bakteriyel türlerden hangisi veya hangileri ile enfekte oldugu multipleks reaksiyonlar gerçeklestirilerek yüksek dogrulukta ve kisa sürede belirlenmesinin saglanmasi, hem isgücünün azaltilmasi, çoklu örnekte çalisildigi zaman maliyetin düsük tutulmasinin saglanmasi hem de kullanilan sistemin yüksek duyarliligi sayesinde hatali ya da negatif sonuç vermenin önüne geçilmesini saglayan bir tani panelinde kullanilan SNP noktalari ve kombinasyonlari ile ilgilidir. Önceki Teknik Günümüzde saglik alaninda hizli teshis araçlarinin uygulanmasi ve kullanilmasi, antimikrobiyal ajanlarin yersiz uygulanmasinin önlenmesinde büyük önem tasimaktadir. Insanlarda ve hayvanlarda, mikroorganizmalar çesitli hastaliklara neden olmaktadir. Mikroorganizmalar, çiplak gözle görülemeyecek kadar küçük ve tek hücreli canlilardir. Bakteriler, mayalar, küfler, algler, virüsler, mantarlar ve protozoa temel mikroorganizmalari olusturmaktadir. Mikroorganizmalardan ileri gelen hastalik etkenlerinin kesin tanisi laboratuvarda gerçeklestirilmektedir. Bu nedenle laboratuvara getirilen numunelerde çok yönlü inceleme yapilmasi gerekmektedir. Bu incelemelerde ise klinik bulgular ve nekropsi sonuçlari yönlendirici olmaktadir. Klinisyenlerin hastalar için uygun farmakolojik müdahaleye iliskin bilinçli kararlar vermelerine yardimci olan zamaninda ve dogru bilgilerle donatilmasi ve hizli teshis araçlarinin kullanilmasiyla elde edilmektedir. Teshis araçlari, antibiyotige dirençli bakteriyel enfeksiyonlarin zamaninda tespit ve teshisini kolaylastirma, hastalik takibini kolaylastirma ve hastalik bulasmasini azaltma potansiyeline sahip olmaktadir. Yeni tani teknolojilerinin ilerlemesini ve benimsenmesini hizlandirmak için pragmatik önlemlerin düsünülmesi zorunlu olmaktadir. Buna ek olarak, dünya çapinda antimikrobiyal direnç yükü artmaya devam ettikçe, hizli antimikrobiyal duyarlilik testinin kullanimi tedavi planlamasinin giderek daha kritik bir bileseni haline gelmektedir. Gereksiz antibiyotik kullanimini azaltmanin önemli oldugu, enfeksiyonu sagaltmaya ve antibiyotik kullanimini gerektirmeyen -enfeksiyöz olmayan- enflamatuvar durumlari belirlemeye yardimci olabilecek tani yöntemlerinin gelistirilmesi büyük önem tasimaktadir. Mikroorganizmalarin tanisi, tiplendirilmesi, siniflandirilmasi, direnç ve duyarliliklarinin belirlenmesi, mikroorganizma-konak iliskilerinin açiklanmasi, mikrobiyom ve mikrofloralar üzerinde yapilan metagenomik çalismalar biyoinformatik araçlar ve gelisen dizileme-genotipleme teknolojisi ile giderek artmaktadir. Hastaneye yatirilan çocuk ve yetiskinlerde bakteriyel enfeksiyonlar oldukça yaygindir. Vincent ve arkadaslarinin 24 Avrupa ülkesinde bulunan 198 yogun bakim ünitesindeki 3147 hastayi inceledikleri bir çalismada hastalarin basvurdugu bildirilmistir. (Vincent vd., 2006) Bu bireyler söz konusu oldugunda, enfeksiyonlar yüksek morbidite, ölüm ve saglik harcamalarindaki yüksek maliyetler baglantilidir (Vos vd., 2020; Lagu vd., 2012). Enfeksiyonla baglantili tehlikeler ayni zamanda yüksek antibiyotik tüketimiyle sonuçlanmaktadir; küresel bir nokta prevalans arastirmasina göre, tüm YBÜ hastalarinin %70'i herhangi bir günde en az bir antibiyotik almaktadir ve bu yüksek antibiyotik kullanimi, enfeksiyonla iliskili tehlikelerin dogrudan bir sonucudur (Vincent vd., 2009). Bakteriyel enfeksiyonlarin klinik tedavisinde en önemli adimlardan biri, hastaliga neden olan organizmayi hizli ve dogru bir sekilde tespit edebilmektir. Buna ek olarak, dünya çapinda antimikrobiyal direnç yükü artmaya devam ettikçe, hizli antimikrobiyal duyarlilik testinin kullanimi tedavi planlamasinin giderek daha kritik bir bileseni haline gelmektedir. Gereksiz antibiyotik kullanimini azaltmanin önemli oldugu, enfeksiyonu sagaltmaya ve antibiyotik kullanimini gerektirmeyen -enfeksiyöz olmayan- enflamatuvar durumlari belirlemeye yardimci olabilecek tani yöntemlerinin gelistirilmesi büyük önem tasimaktadir (Denny vd., 2020; O'Neill Bruce/la cinsine ait bakteriler tarafindan olusturulan bulasici, genellikle subakut ve kronik seyirli bir enfeksiyondur. B. abortus ve B. melitensis besicilikte karsilasilan brusellozisinin baslica etkenleridir. B. melitensis ayrica insanlarda Malta hummasi olarak bilinen hastaliga sebep olmaktadir. Bruselloz, çogunlukla sigir, domuz, keçi, koyun ve köpekleri enfekte eden çesitli Bruce/la türlerinin neden oldugu bakteriyel bir hastaliktir. Insanlar hastaligi genellikle enfekte hayvanlarla dogrudan temas yoluyla, kontamine hayvansal ürünleri yiyerek veya içerek ya da havadaki etkenleri soluyarak alirlar. Vakalarin çogu, enfekte keçi veya koyunlardan elde edilen pastörize edilmemis süt veya peynirin tüketilmesiyle ortaya çikmaktadir. Bruselloz, hayvanlar tarafindan bulastirilan en yaygin zoonozlardan biridir ve endemik bölgelerde insan brusellozunun ciddi halk sagligi sonuçlari vardir. Hayvan endüstrilerinin ve sehirlesmenin genislemesi ve hayvancilikta ve gida islemede hijyenik önlemlerin eksikligi, brusellozun bir halk sagligi tehlikesi olarak kalmasini kismen açiklamaktadir. (WHO, 2020c). Insanlarda da enfeksiyona sebep olan baslica Bruselloz etkenleri Bruce/la abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis, ve B. neotomae'dir. Enfeksiyona neden olan Bruce/la türlerin her birinin tanisi her bir örnek için, ayri ayri reaksiyonlarda yapilmakta ve çoklu enfeksiyon durumu için pratik olarak bakilamamakta ve belki gözden kaçmaktadir. Bu durum isgücü kaybina, çoklu örnekte mali kayba ve özellikle enfeksiyonun baslangiç evrelerinde ve çoklu enfeksiyonlarda hatali negatif sonuç elde edilmesine neden olmaktadir. Hastalik kontrolü için uygulanan serolojik, biyokimyasal ve kültür temelli klasik testler ile klasik PCR ve qPCR temelli moleküler yöntemler mevcuttur. Ancak mevcut klasik yöntemler her bir bakteri türü için ayri ayri uygulanmak zorunda olundugu için özellikle kitlesel testler ve örnek tani oraninin yüksek oldugu referans farkli enfeksiyonlarin gözden kaçirilmasina neden olabilmektedir. Ayrica kullanilan bu klasik yöntemlerin duyarliligi düsüktür, bazi yöntemlerin uygulanmasi uzun zaman almaktadir ve özellikle bazi enfeksiyonlarin erken evrelerinde etmenin belirlenmesine imkân vermemektedir. Teknigin bilinen durumunda görülen CA3111751A1 antibiyotik duyarlilik testi için cihazlar ve yöntemleri anlatilmaktadir. Açiklama genel olarak tek bir nükleotid polimorfizmi (SNP) lokusunu amplifiye etmek ve SNP'nin iki veya daha fazla alelik varyanti arasinda ayrim yaparak bir hedef alelin varligini veya yoklugunu belirtmek üzere konfigüre edilmis moleküler teshis cihazlari ile ilgili olmaktadir. Bazi düzeneklerde moleküler teshis cihazlari, bakim noktasinda, bakteriyel enfeksiyonlarin antibiyotik tedavisine direnç veya yatkinlikla baglantili SNP'Ieri tespit edebilmektedir. Diger yönlerde açiklama, bu tür moleküler teshis cihazlari tarafindan belirlendigi üzere bir SNP lokusunda bir alelin varligi veya yoklugu ile tedavinin yönlendirildigi hastalik veya bozukluklar (örn. bakteriyel enfeksiyonlar) için tedavi yöntemleri saglamaktadir. Biyolojik bir numuneyi almak üzere konfigüre edilmis bir numune hazirlama modülü olup, burada biyolojik numune bir polinükleotit içermektedir. Polinükleotitte tek bir nükleotid polimorfizmi (SNP) lokusunu hedefleyen bir primer seti içeren bir reaktif modülü; bir reaksiyon hacmi ve bir isitici içeren bir amplifikasyon modülü, biyolojik numuneyi alacak sekilde konfigüre edilmis reaksiyon hacmi ve primer seti içeren bir amplifikasyon solüsyonu içermektedir. Isitici, SNP lokusu içeren bir hedef amplikon içeren bir çikti üretmek üzere polinükleotidi amplifiye etmek için reaksiyon hacmine termal enerji iletmek üzere konfigüre edilmistir. Hedef amplikonu alacak sekilde konfigüre edilmis bir tespit modülü, SNP lokusu bir hedef alel içeriyorsa hedef amplikonun SNP lokusuna baglanmak üzere tasarlanmis bir prob içermektedir. SNP lokusu alternatif bir alel içeriyorsa hedef amplikonun SNP lokusuna baglanmayi en aza indirmek amaçlanmistir. polimorfizminin romatoid artrit teshis etkinligine uygulanmasi anlatilmaktadir. XRCC1 gen polimorfizminin romatoid artrit teshis etkinligine uygulanmasi ve XRCC1 geninin SNP lokuslarinin, romatoid artrit duyarliligini teshis etmek için bir saptama kitinin hazirlanmasina uygulanmasidir. XRCC1 geninin 641.locusunun polimorfizmi ile romatoid artrit arasindaki korelasyon ilk kez kesfedilmistir. SNP araciligiyla romatoid artrit duyarlilik riskini saptamak için bir yöntem ve bir kit ortaya çikarilmistir. belirticiler ve bunlarin kullanimlari anlatilmaktadir. Prokaryotlarin 16S ribozomal RNA'sinda bir veya daha fazla tek nükleotid polimorfizmi (SNP'ler) ve/veya ökaryotlarin 5.85 ribozomal RNA'sinda bir veya daha fazla SNP kullanarak mikroplari tanimlama ve/veya siniflandirma yöntemleridir. Ayrica, bu yöntemlerde yararli olan problar, primerler ve kitler de açiklanmaktadir. Bu SNP'lere dayanan sepsis teshisine yönelik yöntemler de açiklanmaktadir. Önceki teknikte görülen CN1847852A numarali dokümanda hizli mononükleotit polimorfizmi, test kâgidi seridini ve saptama yöntemini anlatmaktadir. Iki polimorfizm bazli SNP'nin nükleik asit test kâgidi seridi ile tespit edilmesi yöntemini açiklamaktadir. Nükleik asit test kâgidi seridi ile çesitli polimorfizm bazli SNP'leri tespit etme yöntemi ve SNP ile ilgili insan genetik hastaliklarinin moleküler teshisinde tespit yöntemlerinin uygulanmasi, bakteri, virüs ve diger patojenik mikroplarin ilaca dirençli gen mutasyonunun tespiti, insan vücudundaki ilaç reaksiyon farkinin tespiti ve taranmasi, SNP'nin insan sagligi genetik temeli olarak taranmasi ve tiplendirilmesi ile ilgili olmaktadir. Amplifikasyon teknikleri, tek nükleotit uzatma teknikleri ve nükleik asit seridi tespit teknikleri kullanilarak bir nükleik asit sekansindaki tek baz mutasyonlarinin hizli bir sekilde saptanmasina yönelik bir yöntemdir. Tek nükleotid polimorfizmlerinin hizli saptanmasi ve tiplendirilmesi alaninda hizli nükleik asit teshisi için test seritleri kullanilmaktadir. Ayrica nükleik asit dizisindeki tek nükleotit polimorfizmlerinin hizli saptanmasi için bir kitin kullanimina iliskin olmaktadir. Mevcut teknikte bulus sahipleri adina kayitli TR 2016/08981 sayili patent basvurusu bulunmakta olup, bulus bakteri türlerinin tanisi için kullanilan prob, SNP marker ve SNP kombinasyonlari ile ilgilidir. 2016/08981 sayili bulusta özellikle bulus konusu bakteri türlerinin, tür düzeyinde tanimlanmasini saglayan, bakteri türlerine özgü, SNP Marker, SNP Marker kombinasyonlari ve bahsedilen SNP Markerlarin belirlenmesini saglayan problar açiklanmakta olup, bu teknikte forward ve reverse problar yardimi ile tespit, tani saglanabilmektedir. Bulus, alintilanan mevcut tekniklerden ve özellikle 2016/08981 sayili basvurudan farkli olarak bulusta reverse ve forward proba gerek duyulmadan çoklu Bruce/la türlerinin yalniz bir kit ile öncekinden farkli SNPLER tespit edilmesi saglamaktadir. Teknigin bilinen durumunda hastalik kontrolü için uygulanan serolojik, biyokimyasal ve kültür temelli klasik testler ile klasik PCR ve qPCR temelli moleküler yöntemler açiklanmistir. Ancak mevcut klasik yöntemler her bir bakteri türü için ayri ayri uygulanmak zorunda olundugu için özellikle kitlesel testler ve örnek tani oraninin yüksek oldugu referans laboratuvarlar için isgücü ve maliyet açisindan karli olmamaktadir. Ayni örnekteki farkli enfeksiyonlarin gözden kaçirilmasina neden olabilmektedir. Ayrica teknikte kullanilan bu klasik yöntemlerin duyarliligi düsüktür, bazi yöntemlerin uygulanmasi uzun zaman almaktadir ve özellikle bazi enfeksiyonlarin erken evrelerinde etmenin belirlenmesine imkân vermemektedir. Bu sebeple bu alanda bir ar-ge çalismasi yapilmasi gerekmektedir. Bulusun Amaci Bulusun ana amaci, farkli örneklerdeki Bruce/la türlerini teshisi ve genotiplenmesi için snp belirteçleri ve kombinasyonlarinin tespiti olup, gelisen yazilim teknolojileri ile filogenetik açidan anlamli gen bölgelerinde türler arasi ayrimi saglayacak Tek Nükleotit Polimorfizmlerinin (SNP) ilk kez tespit edilerek, bu noktalarin kombinasyonlari ile seçilen bakterinin veya bakteri grubunun tanisini, kaynaga bagli olmaksizin yüksek dogrulukta, çoklu örnekte yapabilecek bir bakteriyel tani panelinin ve bu biyoinformatik süreci yürütecek bir yazilimin gelistirilmesinin saglanmasidir. Bulusun amaci, tek bir örnege ait genomik DNA kullanilarak bakteriyel türlerden hangisi veya hangileri ile enfekte oldugunun multipleks reaksiyonlar gerçeklestirilerek yüksek dogrulukta, kisa sürede belirlenebilmesi için hem daha az isgücü ile çoklu örnekte çalisildigi zaman maliyetin düsürülmesi hem de kullanilan sistemin yüksek duyarliligi nedeni ile hatali negatif sonuç vermenin önüne geçilmesinin saglanmasidir. Bulusun baska bir amaci, yapilan islemlerin es zamanli olarak tek bir örnegin DNA'si için degil daha fazla örnegin DNA'si için yapilmasinin saglanmasidir. Bulusun diger bir amaci, farkli kaynaklardan gelen örneklerde karsilasilabilen birincil ve ikincil patojenlerin tek platformda, hizli, erken ve etkin tanisina yönelik Bulusun bir baska amaci, çoklu örnekte farkli bakteri türlerinin türe özgü farkliliklari tespit edilerek, es zamanli taninin yüksek dogrulukta ve duyarlilikta tespit edilmesinin saglanmasidir. Bulusun amaci, Bruce/la türünde ayrimin gerçeklestirilebilmesi için tespit edilen SNP'lerin, tür bazindaki ayrim noktalarinin tespit edilerek, belirlenen SNP noktalarinin türler arasinda genotip farki olusturmasi ve Bruce/la abortus, Bruce/la melitensis, Bruce/la neotomae, Bruce/la ovis, Bruce/la suis arasi tür ayrim profillerinde her bir tür için türlerin bir diger türden ayrilmasini saglayan SNP numaralarinin tespitinin saglanmasidir. Bulusun baska bir amaci, gen dizleri için MySQL v8.0.32 platformu kullanilarak bir veri tabani kurulmasiyla, NCBI Nucleotide veri tabani sorgulama ekrani ve sorgu dizisi indirilerek veri tabanina kaydedilmesi ve böylece 235, 165 ve rpoB gen dizileri hizalama asamasinda kullanilmasinin saglanmasidir. Bulusun amaci, dizi hizalamalarinin dinamik olarak yapilabilmesi için dinamik programlama teknigi kullanilarak, dizi hizalamalarini tür ve cins düzeyinde ve veri yogunluguna bagli biaslardan kaçinma stratejisi gelistirilerek, yerel bir hizalama aracinin gelistirilmesinin saglanmasidir. Bulusun diger amaci, tespit paneli aracina sorgunun girilmesinden SNP tespitine kadar çoklu dizi hizalamalari da dahil olmak üzere birçok basamagi içinde barindiracak sekilde gelistirilmesidir. Bulusun amaci, tespit panelinde kullanilan islemlerden biri olan çoklu dizi hizalama isleminin, hizalama yapilan tüm dizilerin esdeger uzunluklara atanmasi, ayni türe ait farkli suslarin dizilerden, tür içi polimorfizmlerin dizi üzerinde `X' olarak tanimlandigi türü ifade eden nükleotid profilinden ortak bir sablon hazirlanmasi, dizi hizalarinin dogruluk ve hassasiyetini arttirmak, veri yogunluguna bagli biasi azaltmak amaciyla dizilerin tür içinde hizalandiktan sonra olusan %90 uzlasi dizisi (konsensus dizi) hedef kabul edilerek hizalamanin yapilmasi basamaklarina sahip olmasidir. Bruce/la türleri için hizalama çalismalari tamamlanan rpoB dizilerinin nokta taramasi yapilmistir. Elde edilen sablonlarin her bir nükleotid pozisyonunun, istem kümesindeki diger tür sablonlarin esdeger pozisyonlari ile karsilastirilmasi yapilmistir. Karsilastirma sonucunda ayrimsal tanida kullanilabilecek aday noktalar belirlenmis ve her bir aday nokta için tanimlama gücü hesaplanarak bir fark matrisi olusturulmustur. Fark matrisinde çözüm olusmayan nokta çikmamis türlerin ikili kombinasyonlarinda en az 1 en çok 1203 noktanin ayrim potansiyeli belirlenerek aday nokta olarak belirlenen 84 nokta saklanmistir. Ardindan çözüm kümesindeki aday noktalardan asgari kullanim ile ayirt edici en güçlü noktalar hesaplanarak kapsama alanindaki her bir konum için ayirt edici bir nokta belirlenmistir. Hesaplanan konum yogunlugu ile islem sonucunda Bruce/la abortus, Bruce/la melitensis, Bruce/la neotomae, Bruce/la ovis, Bruce/la suis türlerinin ayriminin 846, çikmistir. Bulusun Kisa Açiklamasi Mevcut bulus, yukarida bahsedilen gereksinimleri karsilayan, tüm dezavantajlari ortadan kaldiran ve ilave bazi avantajlar getiren farkli örneklerdeki Bruce/la türlerini teshisi ve genotiplenmesi için SNP belirteçleri ve kombinasyonlari ile Klasik sistemler (mevcut teknik ve literatür çalismalari) ile bakteri türlerinin tanisi ayri ayri yapilmaktadir. Her bir bakteri türünün tanisi için duyarliligi farkli yöntemler kullanilabilmekte ve bazi enfeksiyonlarda erken tani yapilamamakta çoklu enfeksiyonlar gözden kaçabilmektedir. Farkli bakteriler farkli enfeksiyonlara sebep olurlar. Her bir bakterinin de gen dizisi digeri ile ayni degildir, türe özgü farkliliklar gösterirler. Bulus iIe çoklu örnekte farkli bakteri türlerinin bu essiz farkliliklari tespit edilerek; es zamanli tanisi yüksek dogrulukta ve duyarlilikta tespit edilmesi saglanmaktadir. Insanlar hastaligi genellikle enfekte hayvanlarla dogrudan temas yoluyla, kontamine hayvansal ürünleri yiyerek veya içerek ya da havadaki etkenleri soluyarak brusellozu alirlar. Vakalarin çogu, enfekte keçi veya koyunlardan elde edilen pastörize edilmemis süt veya peynirin tüketilmesiyle ortaya çikmaktadir. Bruselloz, hayvanlar tarafindan buIastiriIan en yaygin zoonozIardan biridir ve endemik bölgelerde insan brusellozunun ciddi halk sagligi sonuçlari vardir. Hayvan endüstriIerinin ve sehirlesmenin genislemesi ve hayvancilikta ve gida islemede hijyenik önlemlerin eksikligi, brusellozun bir halk sagligi tehlikesi olarak kalmasini kismen açiklamaktadir (WHO, 2020c). Insanlarda da enfeksiyona sebep olan baslica Bruselloz etkenleri Bruce/la abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis, ve B. neotomae'dir. Bulus iIe Brucella türlerinin bu basvuruya konu olan farkliliklari (SNP'Ier) ilk defa bu çalismada belirlenmistir. Bulusun bir diger özelligi; panelin hedef bakterilerinin izole edildigi örnek veya doku kaynagindan (kan, FFPE dokulari, taze doku, gida örnegi vb.) bagimsiz olarak analizini mümkün hale getirmesidir. Bulusun bir özelligi; tani için her bir bakteride belirlenen prob dizilerinin tespit edilmesini saglamistir. Prob dizilerinin tespiti ilk defa bu çalisma ile tespit edilmistir. Çoklu dizi hizalama islemi sirasinda, yüksek sayida dizi iIe yapildiginda ilk karsilasilan zorluk çok sayidaki dizi arasinda baz çifti uzunluklarinin birbiri ile uyusmamasidir. Bunun için öncelikle veri tabanina kaydedilen nükleotid dizileri uzunluklarina göre hizalanmis, ardindan en uzun dizi kendinden bir sonraki ile hizalandiktan sonra 2. dizinin uzunlugu hizalama sonucuna göre güncellenmistir. Bu islemin ardindan tüm dizilerin uzunlugu en uzun diziyle esitlenmistir. Bu dizilerin tamaminin hizalanmasi amaciyla çok sayida farkli strateji üzerinde durulmustur. Bulusun amaçlarindan biri; tüm dünyada bakteriyel enfeksiyon kaynakli ölümlerin etkenlerinin tanisini yapacak SNP temelli panel ortaya koymaktir. Bulus ile ayrica gelisen bilgisayar ve saglik teknolojileri ile birlikte, gelecek pandemiler ve hizla ilerlemekte olan antibiyotik direnci tehlikesine karsi tani, tedavi ve koruma yollarinin gelistirilmesi araciligi ile toplum sagligina büyük katki saglamasi amaçlanmaktadir. Mevcut teknikte yer alan çözümler ile bu basvuruya konu bulus ile gelistirilen çözümün karsilastirmasi asagida tabloda verilmistir. Tablo a: Mevcut teknik ile bulusun özellikler açisindan karsilastirmasi .. _ BULUS Çgggffi RAKIP sAiçii› sAiçip OZELLIK SNP Klasik ÇOZUM 2 ÇOZUM 3 ÇOZUM 4 Genotipleme PCR qPCR Serolojik Kültür Maliyet ++ + + ++ +++ Hassasiyet ++++ ++ +++ + ++ özgünlük ++++ ++ +++ + + Bulusun yapisal ve karakteristik özellikleri ve tüm avantajlari asagida verilen sekiller ve bu sekillere atiflar yapilmak suretiyle yazilan detayli açiklama sayesinde daha net olarak anlasilacaktir ve bu nedenle degerlendirmenin de bu sekiller ve detayli açiklama göz önüne alinarak yapilmasi gerekmektedir. Bulusun Detayli Anlatimi Bulus konusu kapsaminda tespit panelinin yapilan analizleri için Altinbas Üniversitesi Mühendislik ve Mimarlik Fakültesi Yazilim Mühendisligi Bölümü'nde 1080 Ti GPU donanimli bilgisayar kullanilmistir. Çalisma boyunca olusturulan yerel veri tabanlari Microsoft SQL v16.0 ve MySQL v8.0.32 platformlari kullanilarak olusturulmustur. Bulus konusu kapsaminda gelistirilen ODOTool Strateji Temelli yerel HizaIama Araci Python v3.8.10 platformunda hazirlanmis ve Biopython v1.75 kütüphanesinden (Cock vd., 2009) yararlanilmistir. (Deoksiribo Nükleik Asit (DNA), Ribonükleik asid (RNA), Adenin (A), Sitozin (C), Timin (C), Guanin (G) olmaktadir.) Ayrica çalismanin farkIi basamaklarinda C# v9.0 platformu da kullanilmistir. Bulus konusu kapsaminda bakteriyel tani panellerinin olusturulmasi amaciyla 16S ribozomaI DNA, 23S ribozomaI DNA ve RNA poIimeraz Beta aIt ünitesi (rpoB) gen dizileri kullanilmistir. Belirlenen panele ait bakteriyel gen dizilerinin indirilmesi için NCBI, NucIeotide veri tabani sorgulama ekrani ve sorgu etiketleri kullanilarak tarama yapilmistir. Bulus konusu kapsaminda çalisilan cins ve tür düzeyindeki 5 mikroorganizma ile bu mikroorganizmalarin taksonomi, mikrobiyom veya anlamlandirilamayacak sekilde 165 olmak üzere toplam 3760 gen dizisi belirteç tespit analizlerinde kullanilmistir. Gen dizIeri için MySQL v8.0.32 platformu kullanilarak bir veri tabani kurulmustur. NCBI Nucleotide veri tabani sorgulama ekrani ve sorgu etiketleri kullanilarak indiriIerek veri tabanina kaydedilmistir. Veri tabanina her bir gen için fasta formatinda verilen bilgiler (Gen dizisi, erisim numarasi, molekül tipi, organizma adi, taksonomik sinif basamaklari, diziIeme platformu, ürün, izolasyon kaynagi, kültür koleksiyonu biIgisi, serotip- biovar, ikili organizma adi) ile veri tabanina kayit sirasinda verilen bilgiler (Tür no, Dizi no, Girdi no,) esIestiriIerek kayit tamamlanmistir. Daha sonra elde edilen veriler dizi uzunlugu 1000 baz çiftinden küçük ve 5000 baz çiftinden büyük olan, istenilen organizma listesinde olmadigi halde metagenomik çalismalardan gelen, farkIi gen parçalarini barindiran, içinde disinda tutulmustur. Veri temizleme sonrasinda 235, 165 ve rpoB gen dizileri hizalama asamasinda kullanilmistir. Bruce/la abortus, Bruce/la melitensis, Bruce/la neotomae, Bruce/la ovis, Bruce/la suis türlerinin/cinslerinin tür düzeyinde tanimlanmasini ve türler arasinda genotip farki olusturularak tür tespitini saglanmasi için tek bir numunede birden fazla bakteriyel patojenin ya da tür/cins ayriminin yapilmasini saglayan tani panelinin olusturulmasi olup; - sorgularin hazirlanmasi ve açik erisimli veritabanindan indirilmesi, - verilerin istenen kategorilerde kümeleyecek bilgilerin tutularak yerel veri tabanina kaydedilmesi, - gen dizilerinin hizalanarak veri tabaninda yeniden düzenlenmesi, - hizalanan gen dizileri içerisindeki korunmus ve varyasyonel bölgelerin belirlenmesi, - korunmus bölgeler içerisindeki SNP'lerin tespit edilmesi, - tespit edilen SNP'lerin Brucella türlerinin tanisinda kullanilabilecek kombinasyonel bir panel tanimlamasi, islem adimlarindan olusmaktadir. Bu kapsamda yukarida verilen islem basamaklarini gerçeklestirilebilen bir yazilim olarak, Strateji Temelli Yerel Hizalama Araci gelistirilmis ve ilk kez 2020 yilinda yayinlanan makalede (Ugurel vd., 2020a) bahsedilen ODOTool yer almaktadir. Bruce/la türlerinin tek bir panel ile çoklu örnekte tanisinin yapilmasina yönelik prob ve SNP kombinasyonlari tespit paneli, çoklu örnekte farkli bakteri türlerinin bu essiz farkliliklari tespit edilerek; es zamanli tanisi yüksek dogrulukta ve duyarlilikta tespit edilmis olmasini saglamaktadir. Bruce/la türlerinin bu basvuruya konu olan farkliliklari (SNP'ler) ilk defa bu çalismada belirlenmis olup, tani için her bir bakteride belirlenen prob dizileri ilk defa bu çalisma ile tespit edilmistir. Panelin hedef bakteriler olan Bruce/la türlerinin izole edildigi örnek veya doku kaynagindan (kan, FFPE dokulari, taze doku, gida örnegi vb.) bagimsiz olarak analizi mümkün olmaktadir. Asagida tespiti saglanacak Bruce/la türlerinin listesi verilmistir. Belirlenen SNP biyobelirteçlerin, hassasiyet ve özgünlügü BLASTN araci kullanilarak arastirilmistir. Bu dogrulama analizi iki asamali olarak gerçeklestirilmistir. Birinci asamada genotiplemede kullanilacak oligo dizisi yalnizca o organizmaya ait olup, SNP tespitinde kullanilamayan genomlar için arasindan taranarak, tespit edilen SNP'nin tür içi polimorfizm riskine bakilmistir. Ikinci asamada ise ayni panelde bulunan diger türler arasinda bir çapraz reaksiyon riskine karsin tüm genomlarda bulunan bir bölge ile benzerlik olusmasi riski arastirilmistir. Tablo 1. Panelde ayrimi yapilan Bruce/la türlerinin listesi No CINS TÜR 1 Bruce/la abortus 2 Bruce/la melitensis 3 Bruce/la neotomae 4 Bruce/la ovis Bruce/la suis Bes Brucella türünde ayrimin gerçeklestirilebilmesi için tespit edilen SNP'lerin, tür bazindaki ayrim noktalari Tablo 2'de gösterilmistir. Bu çalismada belirlenen SNP noktalari türler arasinda genotip farki olusturmaktadir. Tablo 2. Genotip Kombinasyon Tablosu Bruce/la abortus C T A C Bruce/la melitensis T G A C Bruce/la neotomae C G G C Bruce/la ovis C G A T Bruce/la suis C G A C Hizalama çalismalari tamamlanan rpoB dizileri, nokta taramasi yapilmistir. Elde edilen sablonlarin her bir nükleotid pozisyonunun, istem kümesindeki diger tür sablonlarin esdeger pozisyonlari ile karsilastirilmasi yapilmistir. Karsilastirma sonucunda ayrimsal tanida kullanilabilecek aday noktalar belirlenmis ve her bir aday noktanin için tanimlama gücü hesaplanarak bir fark matrisi olusturulmustur. Fark ikili kombinasyonlarinda en az 1 en çok 1203 noktanin ayrim potansiyeli belirlenerek matrisinde çözüm olusmayan nokta çikmamis türlerin aday nokta olarak belirlenen 84 nokta saklanmistir. Bu asamada kontrol edilen ikili kombinasyon sayisi 85.113'tür. Ardindan çözüm kümesindeki aday noktalardan asgari kullanim ile ayirt edici en güçlü noktalar hesaplanarak kapsama alanindaki her bir konum için ayirt edici bir nokta belirlenmistir. Hesaplanan konum yogunlugu ile islem sonucunda bu 5 türün ayriminin 846, 771, çikmistir Elde edilen in silico sonuçlarin taramasi önce Jalview ile yapilmistir. Bes türün RNA Polimeraz Beta Alt Ünitesi üzerindeki ayrimlarinin Jalview görüntüleri verilmistir. (Sekil - 1) Asagida verilmis olan türler arasi ayrim profillerinde her bir tür için karsisindaki türden ayrildigi SNP numarasi Tablo 3'te ifade edilmistir. Tablo 3. Türler arasi ayrim Matrisi Bruce/la abortus Bruce/la me/itensis 5 N P2 Bruce/la neotomae SN P2 SNP1 Bruce/la ovis SN P2 SN P4 SN P4 Bruce/la suis SNP2 SNP1 SNP3 SNP4 abortus me/itensis neotomae ovis suis Tablo 4. Genotipleri belirlemede kullanilacak nükleotid dizileri Nükleotit dizisi 1 CGCTI'CAAGGGCAT 2 GAAGCTGACCGCGC Tablo 5. Bes türün RNA Polimeraz Beta aIt ünitesi üzerindeki ayrim noktalari ayrim matrisi Nokta Konumlari Bruce/la abortus C T A C Bruce/la melitensis T G A C Bruce/la neotomae C G G C Bruce/la ovis C G A T Bruce/la suis C G A C Elde edilen SNP'Ierin türler arasinda ayriminin gösterilmesi için tür-ayrim matrisi olusturularak ayrimi saglayacak SNP'lerin hangi türleri ayirdigi belirlenmis ve Tablo 6'da verilmistir. matrisi 6. RNA Polimeraz Beta aIt ünitesi üzerindeki SNP'Ier için bes türün ayrim RNA Polimeraz Beta alt birim gen dizisi, yüksek oranda korundugu ve yakindan iliskili türIer arasinda ayrim yapmak için kuIIanilabiIdigi için bakteriyel tanimlama çalismalari için degerli bir gendir. Bu durum, yanlis veya gecikmis teshisin hasta sonuçlari açisindan ciddi sonuçlar dogurabilecegi antibiyotik direnci baglaminda da özellikle önemlidir. Genel olarak, bu önlemlerin uygulanmasi bakteri teshisi alaninda ileriye dogru atilmis önemli bir adimi temsil etmektedir ve önemli bir etki yaratma potansiyeline sahiptir. Dogru teshisin önemine ek olarak, bakteri türleri içindeki genetik çesitliligin anlasilmasi da çok önemlidir. NCBI BLAST araci ile yapilan çalismada NCBI nükleotit veri tabani taranmis ve Bruce/la abortus, Bruce/la melitensis, Bruce/la neotomae, Bruce/la ovis, Bruce/la suis tanisini yapabilecek biyobelirteçler arastirilmistir. BLAST dogrulamalari sonucunda panelde bu 4 noktanin kullanilabilir oldugu belirlenmistir. Belirlenen SNP 1, SNP 2, SNP 3, SNP 4, SNP 5 biyobelirteçlerin hassasiyet ve özgünlügünün arastirilmasini saglayan BLASTN araci olmasidir. Çoklu dizi hizalamalarina bakilmasini ve düzenlenmesini saglayan Jalview araci olmasidir. Elde edilen sonuçlar ile bulus kapsaminda, olusturulan dizileme sonucu elde edilen SNP noktalari ile Bruselloz tanisi için ayrimini saglayacak bir tani paneli olusturulmustur. Böylece önceki tekniklerde kullanilan problara ihtiyaç kalmadan direkt olarak SNP belirteçleri, kombinasyonlari ve noktalarinin belirlenmesi ile türler arasi ayrim yapilmasi saglanmistir. TR TR TR TR TR TR