TR201908358T4 - BACE inhibitörü olarak bir tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-türevi. - Google Patents

Abstract

Bu buluş, yeni kristalize BACE inhibitörlerine, kristalize BACE inhibitörleri içeren farmasötik bileşimlere, fizyolojik rahatsızlıkları tedavi etmede kullanmak için kristalize BACE inhibitörlerine, ve bunların sentezinde yararlı işlemlere ilişkindir.

Description

TARIFNAME BACE INHIBITÖRÜ OLARAK BIR TETRAHIDROPIRROLOI3,4-D] [1,3]TIAZIN- TÜREVI Bu bulus, yeni kristalize BACE inhibitörlerine, kristalize BACE inhibitörleri içeren farmasötik bilesimlere, fizyolojik rahatsizliklari tedavi etmede kullanmak için kristalize BACE inhibitörlerine, ve bunlarin sentezinde yararli islemlere iliskindir.

Bu bulus, amiloid ß (Abeta) peptidi, amiloid öncü proteinin (APP) bir nörotoksik ve oldukça toplayici peptid segmentini içeren Alzheimer hastaligi ve baska hastaliklar ve rahatsizliklarin tedavisi alanindadir. Alzheimer hastaligi, dünya çapinda milyonlarca hastayi etkileyen tahrip edici bir nörodejeneratif rahatsizliktir. Hastaya sadece geçici, semptomatik yararlar saglayan piyasadaki halihazirdaki onay görmüs maddeler bakimindan, Alzheimer hastaliginin tedavisinde dikkate deger bir karsilanmamis ihtiyaç söz konusudur.

Alzheimer hastaligi, beyinde Abeta olusumu, toplanmasi ve çökelmesiyle karakterize edilir. ß-sekretazin tam veya kismi inhibisyonunun (ß-alani amiloid öncü proteinini ayirici enzim; BACE) fare modellerinde plakla ilgili ve plaga bagli patolojiler üzerinde anlamli bir etkiye sahip oldugu gösterilmistir, bu da Abeta peptid seviyelerinde çok küçük azalamalarin dahi, plak yükü ve sinaptik defisitlerde uzun süreli anlamli bir azalmayla sonuçlanabilecegini ileri sürmektedir, dolayisiyla bu, Özellikle Alzheimer hastaligi tedavisinde anlamli terapötik yararlar sunacaktir.

US Patent No 8,158,620”de BACE inhibitör etkisine sahip olan kaynasik aminodihidrotiyazin türevleri açiklanmaktadir ve AB peptidin neden oldugu bir nörodejeneratif hastalik, örnegin Alzheimer tipi demans için yararli terapötik maddeler olarak ayrica açiklanmaktadir. Ilaveten, J. Neuroscience, 3l(46), sayfa 16507-16516lda (2011) agizdan uygulanan bir CNS-aktif BACE inhibitörü, (S)-4-(2,4-difloro-5-pirimidin-5-il-fenil)-4-metil-5,6-dihidro-4H- [1,3]tiyazin-2-ilamin açiklanmaktadir.

BACE inhibitörlerinin kristalize formlarinin, farmasötik formülasyonlarin preparasyonunun kolayligini ve gelistirilmis stabiliteyle farmasötik bilesimleri saglamasi arzu edilmektedir.

Dolayisiyla bu bulus, kristalize olan Formül I`e sahip bir bilesigi sunmaktadir: ýk _N F{ ,`)-N N N NH2 0 F N Formüll / N 1 ~ H \ N i Bu tarifname ayrica bir hastada Alzheimer hastaligini tedavi etmeye yönelik bir usul H3CO sunmaktadir, usul, kristalize olan etkili bir miktarda Formül I”e sahip bilesigin bu tür bir tedaviye ihtiyaç duyan bir hastaya uygulanmasini içerir. Bu tarifname ayrica bir hastada hafif bilissel bozuklugun Alzheimer hastaligina ilerlemesinin önlenmesine yönelik bir usul sunmaktadir, usul, kristalize olan etkili bir miktarda Formül Fe sahip bilesigin bu tür bir tedaviye ihtiyaç duyan bir hastaya uygulanmasini içerir. Bu tarifname ayrica bir hastada BACESnin inhibe edilmesine yönelik bir usul sunmaktadir, usul, bu tür bir tedaviye ihtiyaç duyan kristalize olan etkili bir miktarda Formül I”e sahip bilesigin bir hastaya uygulanmasini içerir. Bu tarifname ayrica amiloid öncü proteininin BACE-aracili bölünmesini inhibe etmeye yönelik bir usul sunmaktadir, usul, kristalize olan etkili bir miktarda Formül I°e sahip bilesigin bu tür bir tedaviye ihtiyaç duyan bir hastaya uygulanmasini içerir. Tarifname ayrica Abeta peptid üretiminin inhibe edilmesine yönelik bir usul sunmaktadir, usul, kristalize olan etkili bir miktarda Formül I”e sahip bilesigin bu tür bir tedaviye ihtiyaç duyan bir hastaya uygulanmasini içerir.

Bundan baska, bu bulus, terapide kullanim için, özellikle Alzheimer hastaliginin tedavisi için veya hafif bilissel bozuklugun Alzheimer hastaligina ilerlemesinin önlenmesi için kristalize olan Formül Pe sahip bir bilesik sunmaktadir. Yine bundan baska, bu bulus, Alzheimer hastaliginin tedavisine yönelik veya hafif bilissel bozuklugun Alzheimer hastaligina ilerlemesinin önlenmesine yönelik bir ilacin imalati için kristalize olan Formül Ise sahip bilesigin kullanimini sunmaktadir.

Bulus ayrica bir veya daha fazla farmasötik olarak kabul edilebilen tasiyici, seyreltici veya eksipiyanla kristalize olan Formül Ve sahip bilesik içeren farmasötik bir bilesim sunmaktadir.

Kristalize olan Formül Fe sahip bilesigin sentezi için ara maddeler ve islemler açiklanmaktadir.

Hafif bilissel bozukluk, hafif bilissel bozukluktan zamanla Alzheimer deinansi sergileyen hastalarda klinik sunumu ve ilerlemeyi baz alan Alzheimer hastaligi ile iliskili demansin bir potansiyel prodromal fazi olarak tanimlanmistir. (Morris, ve digerleri, Arch. Neurol., 58, 397- 405 (2001); Petersen, ve digerleri, Arch. Neurol., 56, 303-308 (1999)). "Hafif bilissel bozukluktan Alzheimer hastaligina ilerlemeyi önleme" terimi bir hastada hafif bilissel bozukluktan Alzheimer hastaligina ilerlemeyi yavaslatma, durdurma veya tersine çevirmeyi içerir.

Burada kullanildigi haliyle, "tedavi etmek" veya "tedavi etme" terimleri bir mevcut semptom veya rahatsizligin ilerlemesini veya ciddiyetini sinirlama, yavaslatma, durdurma, veya tersine çevirme anlamlarini içerir.

Burada kullanildigi haliyle, "hasta" terimiyle bir insana atifta bulunulmaktadir.

"Abeta peptid üretimi inhibisyonu" terimi bir hastada Abeta peptid in vi'vo seviyelerini azaltma anlaminda alinmaktadir.

Burada kullanildigi haliyle, "etkili miktar" terimiyle, bulusun bilesigi, bunun farmasötik olarak kabul edilebilen bir tuzunun miktari veya dozuna atifta bulunulmaktadir, hastaya tekli veya çoklu doz uygulamasindan sonra, tani veya tedavi altinda hastada arzu edilen etkiyi sunmaktadir.

Bu sahada uzman biri olarak, bilinen teknikler kullanarak ve benzer kosullar altinda elde edilen sonuçlar gözlemlenerek, uzman doktor tarafindan etkili bir miktar kolaylikla belirlenebilir. Bir hasta için etkili miktari belirlemede, sinirlayici olmadan, asagidakiler dahil olmak üzere çok sayida faktör, uzman doktor tarafindan dikkate alinmaktadir: hasta türleri; bunun boyutu, yasi, ve genel sagligi; ilgili spesifik hastalik veya rahatsizlik; hastalik veya rahatsizligin derecesi veya katilimi veya ciddiyeti; tek tek hasta yaniti; uygulanan belirli bilesik; uygulama modu; uygun preparasyonun biyoyararlanim karakteristik özellikleri; seçilen doz rejimi; konkomitant ilacin kullanimi; ve diger ilgili kosullar.

Bu bulusun bilesikleri genellikle genis bir dozaj araliginda etkilidir. Örnegin, beher gün için dozajlar normalde yaklasik 0.01 ila yaklasik 20 mg/kg vücut agirligi araliginda yer alir. Bazi örneklerde, söz konusu araligin alt sinirinin altindaki dozaj seviyeleri fazlasiyla yeterli olabilir, diger yandan baska vakalarda kabul edilebilen yan etkilerle birlikte yine daha büyük dozlar kullanilabilir, ve dolayisiyla yukaridaki dozaj araliginin bulusun kapsamini herhangi bir sekilde sinirlamasi amaçlanmamaktadir.

Bu bulusun bilesikleri tercihen oral, transdermal ve parenteral yollar dahil olmak üzere herhangi bir yolla uygulanan, bilesigi biyolojik olarak yararli kilan farmasötik bilesimler olarak formüle edilebilir. En tercih edilen haliyle, bu tür bilesimler agizdan uygulama içindir veya agizdan uygulamayla transdermal özellikle tercih edilir. Bu tür farmasötik bilesimler ve bunlari hazirlamak için islemler bu sahada iyi bilinmektedir. (Bakiniz, örnegin Remington: Science and Practice of Pharinacy (D.B. Troy, Editör, 21. Baski, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).

Formül I'e sahip kristalize bilesikler, tarifhamenin tedavi usullerine özellikle yararlidir, fakat bir takim formlar tercih edilmektedir. Asagidaki paragraflar, bu tür formlari açiklamaktadir.

Bu tercihlerin hem tedavi usullerine hem bulusun yeni bilesiklerine uygulanabildigi anlasilacaktir.

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-floropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4- d][1,3]tiyazin-7a-il]-4-floro- fenil] -5 -metoksi-pirazin-Z-karboksamidin Kristalize Form l”i; N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-tloropirimidin-Z-il)-4,4a,5,7-tetrahidr0pirrolo[3,4- d][l,3]tiyazin-7a-i1]-4-Iloro-fenil] -5 -metoksi-pirazin-Z-karboksamidin Kristalize Form 2”si; 0.2 derecelik kirinim açilari için bir toleransla, 18.6°, 19.30, ve 26.7°'den olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla tepe noktasiyla kombinasyon halinde, 1 1.8°,lik kirinim açisi 2- tetada, X-isini kirinim spektrumunda, önemli bir tepe noktasiyla karakterize edilen, N-[3- [(4aR,7aS)-2-Amin0-6-(5-Iloropirimidin-Z-il)-4,4a,5,7-tetrahidr0pirrolo[3 ,4-d][ l ,3]tiyazin- 7a-il]-4-floro-fenil]-5-metoksi-pirazin-Z-karboksamidin Kristalize Form 2,si; N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-floropirimidin-ZZ-il)-4,4a,5,7-tetrahidr0pirrolo[3,4- d][l,3]tiyazin-7a-il]-4-Iloro-fenil] -5 -metoksi-pirazin-2-karboksamidin Kristalize Form 3,ü; VC 0.2 derecelik kirinim açilari için 18.1°, 27.00, ve 19.7“an olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla tepe noktasiyla kombinasyon halinde, 15.7°”lik kirinim açisi 2-tetada X-isini kirinim spektrumunda önemli bir tepe noktasiyla karakterize edilen N-[3-[(4aR,7aS)-2- Amino-6-(5-floropirimidin-Z-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiyazin-7a-il]-4-Iloro- fenil] -5 -metoksi-pirazin-Z-karboksamidin Kristalize Form 3,ü tercih edilmektedir.

N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amin0-6-(5-floropirimidin-Z-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4- d][l ,3]tiyazin-7a-il]-4-floro-fenil] -5 -metoksi-pirazin-2-karboksamidin Kristalize Form Zasi özellikle tercih edilmektedir. 0.2 derecelik kirinim açilari için bir toleransla, 18.6°, l9.3°, ve 26.7°°den olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla tepe noktasiyla kombinasyon halinde, ll.8°”lik kirinim açisi 2- tetada X-isini kiriniin spektrumunda önemli bir tepe noktasiyla karakterize edilen N-[3- [(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-floropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiyazin- 7a-il]-4-Iloro-fenil] -5 -metoksi-pirazin-2-karboksamidin Kristalize Form 2'si, bilhassa tercih edilmektedir.

Bu sahada siradan uzmanligi olan biri bulusun bilesiklerinin Sema A°da gösterildigi gibi tautomerik formlarda mevcut olabilecegini takdir edecektir. Bu basvuruda bulusun bilesiklerinin spesifik tautomerlerinden birine yapilan herhangi bir referans yapildiginda, bunun hem tautomerik formlari hem de bunlarin tüm karisimlarini kapsadigi anlasilmaktadir. emaA N N - 5 F N i 4{l\l/>_ Â __ \ N NÄNH o 0 F N N / N 1 Jiü L JA `N i-i3co N Ilaveten, asagidaki semalarda açiklanan birtakim ara maddeler bir veya daha fazla azot cho koruyucu grup içerebilir. Degisken koruyucu grup, belirli reaksiyon kosullari ve gerçeklestirilecek belirli dönüsümlere bagli olarak her bir ortaya çikista ayni veya farkli olabilir. Koruyucu ve koruyucu grubu uzaklastirma kosullari bu sahada uzman kisice iyi bilinmektedir ve literatürde açiklanmaktadir (Bakiniz örnegin "Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", Dördüncü Baski, Peter G.M. Wuts ve Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007).

Bir takim stereokimyasal merkezler tanimlanmamis olarak kalmistir ve bir takim sübstitüentler netlik amaciyla asagidaki Semalarda çikarilmistir ve bunlarin Semalardaki Ögretiyi herhangi bir sekilde sinirlamasi amaçlamamaktadir. Bundan baska, tek tek izomerler, enantiomerler, veya diastereomerler, seçici kristallestirme teknikleri veya kiral kromatografi gibi usullerle bulusun bilesiklerinin sentezinde bu sahada siradan uzmanligi olan biri tarafindan herhangi uygun bir noktada ayrilabilir veya ayristirilabilir (Bakiniz, örnegin, J.

Jacques, ve digerleri, "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, ve E.L. Eliel ve S.H. Wilen," Stereocheinistry of Organic Compounds", Wiley- Interscience, 1994). "Izomer 1" ve "izomer 2" tanimlariyla sirasiyla birinci ve ikinci kiral kromatografiden elute edilen bilesiklere atifta bulunulmaktadir, ve kiral kromatografi önce sentezde baslatilirsa, ayni tanim müteakip ara maddelere ve Örneklere uygulanmaktadir.

Bir takim kisaltmalar asagidaki gibi tanimlanmaktadir: "APP" ile amiloid öncü proteinine atifta bulunulmaktadir; "CSF" ile serebrospinal sivisina atifta bulunulmaktadir; "DCM" ile diklorometana atifta bulunulmaktadir; "DIPEA" ile diizopropiletilamin veya N-etil-N-izopropil-propan-2-amine atifta bulunulmaktadir; "DMEM" ile Dulbecco Modifiye Eagle Ortamina atifta bulunulmaktadir; ”DMF" ile dimetilformamide atifta bulunulmaktadir; "DMSO” ile dimetilsülfokside atifta bulunulmaktadir; "EDCI" ile l-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidroklorüre atifta bulunulmaktadir; "ee" ile enantiomerik fazlaliga atifta bulunulmaktadir; "EtOAc" ile etil asetata atifta bulunulmaktadir; "Örn" ile örnege atifta bulunulmaktadir; "F12" ile Ham F12 ortamina atifta bulunulmaktadir; "FBS" ile Fetal Bovin Seruma atifta bulunulmaktadir; "FRET" ile floresan rezonansa enerji transferine atifta bulunulmaktadir; "HEK" ile insan embriyonik böbrege atifta bulunulmaktadir; "HOAc" ile asetik aside atifta bulunulmaktadir; "HOBt" ile l-hidroksilbenzotriazol hidrata atifta bulunulmaktadir; "HPLC' ile yüksek- performansli sivi kromatografisine atifta bulunulmaktadir; "IC50" ile bu madde için muhtemel %50 oraninda azami inhibitör yanitini üreten bir madde konsantrasyonuna atifta bulunulmaktadir; "dk" ile dakika veya dakikalara atifta bulunulmaktadir; "MTBE" ile metil tert-butil etere atifta bulunulmaktadir; "PDAPP" ile amiloid öncü proteininden elde edilen tromboside atifta bulunulmaktadir; "Prep" ile preparasyona atifta bulunulmaktadir; "RFU" ile bagil floresan birimine atifta bulunulmaktadir; "SCX" ile kuvvetli katyon degisimine atifta bulunulmaktadir; "Rt" ile tutma süresine atifta bulunulmaktadir; ve "THF" ile tetrahidrofurana atifta bulunulmaktadir.

Bu bulusun bilesikleri, bu sahada bilinen çesitli prosedürlerle hazirlanabilir, bunlarin bir kismi asagida Preparasyonlarda ve Örneklerde gösterilmektedir. Açiklanan yollarin her biri için spesifik sentetik asamalar farkli sekilde veya bulusun bilesiklerini hazirlamak için farkli preparasyonlardan asamalarla baglantili olarak birlestirilebilir. Her bir asamanin ürünleri, ekstraksiyon, buharlasma, çökeltme, kromatograf'i, filtrasyon, toz haline getirme, veya kristallestirme dahil olmak üzere bu sahada iyi bilinen geleneksel usullerle geri kazanilabilir.

Reaktif maddeler ve baslangiç malzemeleri, bu sahada siradan uzmanligi olan biri için kolaylikla bulunabilmektedir.

Preparasyou 1 2-Br0m0-1 -(5 -bromo-Z-Horofenil)etan-l -0n F 0 @1.

Br N-bromosüksinimid (984 g, 5.53 mol), DCM içinde (7 L) bir 1-(5-br0mo-2-Ilorofenil)etan-1- on (1000 g, 46 mol) ve p-toluen sülfonik asit (1315 g, 7.64 mol) çözeltisine 35 °C”de porsiyon halinde ilave edilir. Karisim karistirilir ve 40 °C”ye isitilir. Karisim 24 °C”ye sogutulur, ve %7 NaHC03 (5 L) ilave edilir. Tabakalar ayrilir ve organik tabaka %10 Na2803 (5 L) ve su (5 L) ile yikanir. Daha fazla saflastirma olinadan kullanilan basliktaki bilesigi sunmak için organik tabaka. 2-3 hacime konsantre edilir.

Preparasyon 2 -Allil-6a-(5-br0m0-2-t10r0fenil)-1-(4-met0ksibenzil)heksahidro-lH-pirrolol3,4- clizoksazol :FN N«° F gýa Toluen içinde (10 L) bir 2-bromo-1-(5-bromo-2-florofeni1)etan-1-on (1363 g, 4.61 mol) çözeltisine diallilamin (537 g, 5.53 mol) ve dipea (2381 g, 18.42 mol) ilave edilir. Izole edilmemis olan 1-(5-bromo-2-tlorofenil)-2-(diallilamino)etan-l-onu sunmak için karisim 4 saat 40 °C`de karistirilir. N-(4-metoksibenzil)hidr0ksilamin (847 g, 5.53 mol) ve Ti(OiPr)4 (1965 g, 6.91 mol) ham 1-(5-bromo-2-Ilorofenil)-2-(dialli1amino)etan-l-onu içeren karisima ilave edilir. Karisim 90 c>C,de 2 saat karistirilir. Karisim 20 °C3ye sogutulur, ve %50 sitrik asit monohidrat (4 L) ve doymus Na2C03 (4 L) ilave edilir. Tabakalar ayrilir ve sulu, MTBE (5 L) ile ekstrakte edilir. Organik ekstrakt suyla (5 L) yikanir, ve diyatomlu topraktan süzülür ve kuruyana kadar konsantre edilir. EtOAc (10 L) ve Oksalik asit (580 g) kalintiya ilave edilir ve bir kati süzülür ve 1 N NaOH°ye ('13 L) ilave edilir. MTBE (5 L) ilave edilir ve karisim, diyatomlu topraktan süzülür. Tabakalar ayrilir ve organik tabaka 2 hacime konsantre edilir.

Heptan (3 L) ilave edilir ve çözelti 10 °C1ye sogutulur. Basliktaki bilesigi (1330 g, %64) suninak için elde edilen kati süzülür. lH NMR(400 MHz, CDC13) ö 2.51-2.49(m, 3H), 3.09- 3.04(m, 3H), 3.78-3.4l(m, 6H), 4.01(m, lH), 5.24-5.01(m, 2H), 5.89-5.85(m, 111), 6.82- 6.80(m, 2H), 7.51-7.l3(m, 3H), 7.63-7.62(m, lH), 7.65-7.64(m, lH).

Preparasyon 3 -Allil-6a-(S-br0m0-2-florofenil)heksahidr0-lH-pirrolo [3,4-c]izoksazol hidroklorür J“ O - N F H HCI Br Tritloroasetik asit (4 L, 52.9 mol), DCM içinde (12 L) bir 5-allil-6a-(5-br0m0-2-Ilorofenil)-l- (4-met0ksibenzil)heksahidro-1l-l-pirrolo [3,4-c]izoksazol (1990 g, 4.45 mol) çözeltisine, sicakligi 35 °C3nin altinda tutacak bir hizda damla damla ilave edilir. Ilave etme tamamlandiktan sonra, karisim 33-43 °C”ye isitilir ve 6 saat karistirilir. NaOH (%20, 10 L) sicakligi 35 °C7nin altinda tutacak bir hizda ilave edilir. Tabakalar ayrilir ve organik tabaka suyla (6 L) yikanir. Çözelti konsantre edilir, etanol (16 L) ilave edilir, ve karisim, diyatomlu topraktan süzülür. Süzüntü konsantre edilir ve EtOAc (10 L) ilave edilir. Basliktaki bilesigi (1385 g, %856) sunmak için EtOAc (8 L) içinde 4 M HC] ilave edilir ve elde edilen kati süzülür ve kurutulur. ES m/z 327.1 (M+l) Preparasyon 4 (1-Allil-4-amin0-4-(5-br0m0-2-H0rofenil)pirrolidin-3-il)metanol OH N :/_ NH2 F Br Sodyum karbonatin doymus sulu bir çözeltisi, bir pH>9°a ulasmak için DCM içinde (7 L) bir -allil-6a-(5-brom0-2-Ilor0fenil)heksahidr0- 1 H-pirrolo[3 ,4-c] izoksazol hidroklon'ir (1400 g, 3.85 mol) çözeltisine ilave edilir. Tabakalar ayrilir ve organik ekstrakt, l.5 hacime konsantre edilir. Asetik asit (1.38 L) ilave edilir ve çözelti 2 Uye konsantre edilir. Asetik asit (7 L) ve çinko tozu (2.5 kg, 38.5 mol) ilave edilir ve karisim 40-50 °C,ye isitilir ve 3 saat karistirilir.

EtOAc (9.8L) ilave edilir ve karisim, diyatomlu topraktan süzülür. Filtre topagi, EtOAc (4 L) ile yikanir. Süzüntü ayrilir ve su (7 L), birlesik organiklere ilave edilir. Amonyum hidroksit bir pH 29,a ulasmak için ilave edilir. Tabakalar ayrilir ve organik tabaka 2 L°ye konsantre edilir. Etanol (2.8 L) ilave edilir ve çözelti 2 L”ye konsantre edilir. Daha fazla saflastirma olmadan kullanilan basliktaki bilesigin bir etanol çözeltisini sunmak için etanol (19 L) ilave edilir ve karisim, diyatomlu topraktan süzülür.

Preparasyon 5 [(3S,4R)-1-allil-3-(5-br0m0-2-floro-fenil)-4-(hidr0ksimetil)pirrolidin-3- il]amonyum;(28,3S)-4-hidr0ksi-2,3-bis[(4-metilbenzoyl)0ksi]-4-0kso-butan0at OH Br Di-p-toluoil-L-tartarik asit monohidrat (1.04 kg, 269 mol), etanol (21 L) içinde bir (l-allil-4- amino-4-(5-bromo-2-florofenil)pirr0lidin-3-il)metanol (1264 g. 3.85 mmol) çözeltisine ilave edilir. Karisim 65-75 oÜye isitilir ve 3 saat karistirilir. Karisim 5-10 °C'ye sogutulur, [(38,4R)-1-allil-3-(5-br0mo-2-floro-fenil)-4-(hidr0ksimetil)pirrolidin-3-il]am0nyum;(28,3S)- 4-hidroksi-2,3-bis[(4-metilbenzoil)0ksi]-4-0kso-butanoat1n (1.0 g) bir tohum kristali ilave edilir, ve karisim 3 saat karistirilir. Kati süzülür ve filtre topagi, soguk etanolle (1.4 L) yikanir. Basliktaki bilesigi beyaz bir kati olarak sunmak için filtre topagi kurutulur. Ikinci elute edici izomerin kiral analiz: Kolon: IC Chiralpak, 4.6 mm * 250 mm * 5 um; eluent: %90 heksan (%03 dietilamin); %10 etanol (%03 dietilamin); UV 270 nm,de 1.0 mL/dakikalik akis hizi, Rt = 7.4 dakika (1050 g, %38) ile enantiomerik olarak zenginlestirilmis (%99 ee) enantiomeri dogrular. lH NMR(400 MHz, CD3OD) ö 2.40(s, 6H), 3.05-3.04(m, lH), 3.57-3.31(m, 3H), 3.66-3.58(m, 4H), 3.75-3.74(m, 2H), 5.38-5.36(m, lH), .50-5.46(m, lH), 5.88(s, 2H), 5.97-5.91(m, lH), 7.10-7.05(m, lH), 7.29(d, J=8.0 Hz, 4H), 7.53-7.51(m, lH), 7.80-7.78(m, lH), 8.01(d, J=8.0 Hz, 4H).

Preparasyou 6 ((3R,4S)-1-Allil-4-amin0-4-(5-br0m0-2-110r0fenil)pirrolidin-3-il)metan01 OH N =/_ NH2 F Br 1 N HCl (500 mL, 500 mmol), bir 0 °C [(3S,4R)-1-allil-3-(5-bromo-2-Ilor0-fenil)-4- (hidroksimetil)pirrolidin-3-il]am0nyum çözeltisine; EtOAc (500 mL) içinde (ZS,SS)-4- hidroksi-Z,3-bis[(4-metilbenzoil)0ksi]-4-0kso-butanoata (100 g, 139.4 mmol) ilave edilir.

Karisim 1 saat karistirilir. Sulu tabaka ayrilir ve pH, 1 N NaOH ile 8,e ayarlanir. Sulu tabaka, EtOAc (350 mL X 2) ile ekstrakte edilir. Basliktaki bilesigi (40 g, %87) sunmak için organik tabakalar birlestirilir, suyla (500 mL) yikanir ve konsantre edilir. Ikinci elute edici izomerin kira] analizi: Kolon: IC Chiralpak, 4.6 mm * 250 mm * 5 um; eluent: %90 heksan (%03 dietilamin): %10 etanol (%03 dietilamin); UV 270 nm”de 1.0 mL/dakikalik akis hizi, R1: 7.4 dakika ile enantiomerik olarak zenginlestirilmis (%99.7 ee) enantiomeri dogrular . IH NMR(400 MHZ, CDCl3) ö 2.78-2.70(m, SH), 3.16-3.00(m, 3H), 3.87-3.75(m, lH), 3.90- 3.84(m, lH), 5.24-5.11(m, 2H), 5.91-5.87(m, lH), 6.95-6.9l(m, lH), 7.35-7.32(m, lH), 7.67- 7.65 (m, lH).

Preparasyon 7 N -(((3S,4R)-l-Allil-3-(5-br0m0-2-I10rofenil)-4-(hidroksimetil)pirrolidin-3- il)karbam0tiy0il)benzamid Br Benzoil izotiyosiyanat (15.0 g, 91.9 inmol), THF (400 mL) içinde bir 0 °C ((3R,4S)-l -allil-4- amino-4-(5-bromo-Z-florofenil)pirr0lidin-3-il)metan0l (30 g, 91.1 mmol) çözeltisine ilave edilir. Daha fazla saflastirma olmadan kullanilan basliktaki bilesigin bir THF çözeltisini sunmak için çözelti 25 oCiye isitilir ve 1 saat karistirilir.

Preparasyou 8 N-((4aR,7aS)-6-AlliI-7a-(5-brom0-2-f10rofenil)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirrolo[3,4- dl [1,3]tiyazin-Z-il)benzamid, dihidroklorür Ü N :/_ NÄNÄû F.` % H Br 2HCI Trifenilfosfin (36.8 g, 140.3 mmol), N-(((3SAR)-1-allil-3-(5-bromo-2-flor0fenil)-4- (hidroksimetil)pirrolidin-3-il)karbamotiyoil)benzamidin (91.1 mmol) bir THF (400 mL) çözeltisine ilave edilir. THF (100 mL) içinde di-t-butil azodikarboksilat (31.6 g, 137.2 mmol) ilave edilir. Karisim 20-30 °C”de 2 saat karistirilir. Karisim konsantre edilir ve MTBE (400 mL) ilave edilir. Çözelti diyatomlu topraktan süzülür ve topak, MTBE (130 mL) ile yikanir.

Süzüntüler birlestirilir ve EtOAc (200 mL) içinde 1 N HC] ilave edilir. Karisim 2 saat karistirilir ve daha sonra 500 mL,ye konsantre edilir. MTBE (320 mL) ilave edilir ve çözelti süzülür ve heptanla (130 mL) yikanir. Kati, EtOAc (650 mL) içinde bulamaç haline getirilir ve 50-60 °C'de 2 saat karistirilir. Sicak bulamaç süzülür ve kati, EtOAC (130 mL) ve heptan (130 mL) ile yikanir. Kati, EtOAC (650 mL) içinde bulamaç haline getirilir ve 50-60 oC,de2 saat karistirilir. Sicak bulamaç süzülür ve EtOAc (130 mL) ve heptan ( 130 mL) ile yikanir.

Basliktaki bilesigi, di-HCl tuzu (40 g, %80, %995 ee) olarak sunmak için kati kurutulur.

Birinci elute edici izomerin kiral analizi: Kolon: IC Chiralpak, 4.6 mm * 250 mm * 5 mm; eluent: %85 heksan (%0.] dietilamin): %15 izopropil alkol (%0.] dietilamin); UV 282 nm”de 1.0 mL/dakikalik akis hizi, Rt : 12.5 dakika ile enantiomerik olarak zenginlestirilmis (%995 ee) enantiomeri dogrular.

Preparasyon 9 N -((4aR,7aS)-6-AlliI-7a-(2-floro-S-(2,2,2-trifloroasetamid0)fenil)-4,4a,5,6,7,7a- heksahidropirrolo[3,4-d] [1,3]tiyazin-2-il)benzamid N S 0 :r NAN F H OýLCF3 %15 Sodyum karbonat (440 mL), EtOAc (3 L) ve su (784 mL) içinde bir N-((4aR,7aS)-6- a11i1-7a-(5-bromo-2-Ilorofenil)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiyazin-2- il)benzamid dihidroklorür (495 g, 717.88 mmol) çözeltisine ilave edilir. Karisim 1-2 saat karistirilir. Tabakalar ayrilir ve organik tabaka, silika jelden (40 g) süzülür ve EtOAC (600 mL) ile yikanir. N-((4aR,7aS)-6-allil-7a-(5-bromo-2-IloroI`eni1)-4,4a,5,6,7,7a- heksahidropirrolo[3,4-d] [1,3]tiyazin-2-il)benzamidi sunmak için süzüntü kuruyana kadar konsantre edilir. Trifloroasetamid (136.7 g, 1.21 mol), NaI (182.5 g, 1.22 mol), 4 A moleküler elekler (342 g), ve K2CO3 (170.9 g, 1.24 mol), DMSO (525 mL) içinde bir N- ((4aR,7aS)-6-allil-7a-(5-bromo-2-Ilorofenil)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirrolo[3,4- d][l ,3]tiyazin-2-il)benzamid (341 g, 494.54 mmol) ve 1,4-dioksan (1.025 L) çözeltisine ilave edilir. DMSO (500 mL) içinde trans-N,N'-dimetilsikloheksan (81.6 g, 573.66 mmol) ve bakir iyodür (27.3 g, 143.34 mmol) reaksiyon karisimina ilave edilir. Karisim 5 dakika karistirilir.

Karisim 100 °C°ye isitilir ve 8 saat karistirilir ve 24 °C°ye sogutulur. Su (5.9 L) ve DCM (5.91) ilave edilir, karisim süzülür, ve tabakalar ayrilir. Daha fazla saflastirma olmadan kullanilan bir DCM çözeltisi içinde basliktaki bilesigi elde etmek için organik tabaka suyla (5.9 L) yikanir.

Preparasyon 10 N-((4aR,7aS)-6-Allil-72-(5-amin0-2-Ilorofenil)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirrolo [3,4- d] [1,3]tiyazin-Z-il)benzamid, hidroklorür S 0 =/ N Nxmkû NH 2 HCI Sodyum hidroksit (28.7 g) ve su (2.7 L) N-((4aR,7aS)-6-alli1-7a-(2-flor0-5-(2,2,2- trifloroasetamido)fenil)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirrolo[3,4-d][l ,3]tiyazin-2-il)benzamidin (250 g, 494.4 mmol) bir DCM çözeltisine ilave edilir ve karisim 24 °C,de 68 saat karistirilir, 1-3'lük bir pH elde etmek için 1 N HCl (3.5 L) ilave edilir. Tabakalar ayrilir ve sulu tabaka, DCM (680 mL) ile yikanir. DCM (4 L), suluya ilave edilir, bunu 8-10Sluk bir pH elde etmek için %21 amonyum hidroksit takip eder. Tabakalar ayrilir ve organik ekstraktlar birlestirilir, silika jelden (170 g) süzülür ve DCM (1.4 L) ile yikanir. Çözücü kuruyana kadar konsantre edilir ve EtOAc (4 L) ile seyreltilir. EtOAc (700 mL) içinde 1 N HCl, 25 °C,nin altinda bir sicaklikta ilave edilir ve karisim 1 saat karistirilir. Karisim, yaklasik 7-8 hacime konsantre edilir ve EtOAC (2.8 L) ilave edilir. Elde edilen çökelti süzülür ve EtOAc (400 mL) ile yikanir. Basliktaki bilesigi sunmak için kati kurutulur. (246 g, %52).

Preparasyon 11 N-((4aR,7aS)-7a-(S-Asetamido-Z-Ilorofenil)-6-allil-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropirrolo [3,4- d] [1,3]tiyazin-2-il)benzamid N 8 O NH 02`e& Asetik anhidrür (23.5g, 0.23 mol) DCM içinde (800 mL) bir N-((4aR,7aS)-6-allil-7a-(5- amino-2-f10r0 fenil)-4,4a,5 ,6,7,7a-heksahidr0pirr010[3,4-d][ 1 ,3]tiyazin-2-il)benzamid hidroklorür ( 100 g, 0.153 mol) ve trietilamin (54.3 g, 0.535 mol) çözeltisine ilave edilir. 20 - °Cade 1 saat karistirildiktan sonra, doymus NaHC03 (700 mL) ve su (600 mL) ilave edilir.

DCM içinde bir çözelti olarak daha fazla saflastirma olmadan kullanilan basliktaki bilesigi sunmak için tabakalar ayrilir.

Preparasyon 12 N-((4aR,7 aS)-7a-(5-Asetamid0-2-1101'0fenil)-4,4a,5,6,7,7a-heksahid ropirrolo[3,4-d] [l,3]tiyazin-2-il)benza mid HN S 0 NANX© F H N H Gicik Trifenilfosfin (4.0g, 0.015 mol) ve 1,3-dimetilbarbiturik asit (15.2 g, 0.097 mol), N- ((4aR,7aS)-7a-(5-asetamid0-2-tlorofenil)-6-allil-4,4a,5,6,7,7a-heksahidr0pirrolo[3,4- d][ l,3]tiyazin-2-il)benzamidin (0.153 mol) bir DCM çözeltisine ilave edilir. Palladyum asetat (1 .7g, 7.7 mmol) ilave edilir ve karisim 20 ila 30 °C°de 1 saat karistirilir. %25 Amonyum hidroksit ilave edilir ve tabakalar ayrilir. Organik tabaka, HOAC (500 mL su içinde 3.0 esdegeri) ile yikanir ve %25 amonyuin hidroksitle pH 8-9,a ayarlanir. Sulu tabaka, DCM (2 X 500 mL) ile ekstrakte edilir. Organik ekstraktlar birlestirilir ve 3-4 hacime konsantre edilir.

MTBE (1 L) ilave edilir ve karisim süzülür. Karisim konsantre edilir ve heptan (1 L) ilave edilir. Basliktaki bilesigi (48 g, %76) sunmak için elde edilen kati süzülür. toplanir, ve kurutulur. lH NMR (400 MHZ, CDC13) 5 2.15 (5, 3H), 2.87-2.83(m, lH), 3.43-3.23(m, SH), 3.70-3.67(m, lH), 712-707 (m, 1H), 728-727 (m, lH), 7.52-7.41(m, 4H), 7.79(m, lH), 8.18-8.16(m, 2H). ES m/z 413.1 (M+1).

Preparasyon 13 N-((4aR,7aS)-7a-(S-Asetamido-Z-Horofeni1)-6-(5-110ropirimidiii-Z-il)-4,4a,5,6,7,7a- heksahidropirrolo [3,4-d] [1,3]tiyazin-Z-il)benzamid %”wgi i : ”r 2-Klor0-5-Iloropirimidin (28.9 g, 218 minol) ve potasyum karbonat (33.46 g, 242.1 mmol), DMF (100 mL) içinde bir N-((4aR,7aS)-7a-(5-asetamido-Z-florofenil)-4,4a,5,6,7,7a- heksahidropirrolo[3,4-d][l,3]tiyazin-2-il)benzamid (50 g, 121.22 mmol) çözeltisine ilave edilir. Karisim 80-85 °C”ye 8 saat isitilir. Karisim 24 °C7ye sogutulur, süzülür, ve DMF (100 mL) ile yikanir. Basliktaki bilesigi (68.5g, %98) elde etmek için katilar, su (2 L) içinde bulamaç haline getirilir ve süzülür. LC-MS: m/z=509.2 (M+1)+, lH NMR (400 MHz, dg- DMSO) ö ppm 1.22 (t, J= 7.28 Hz, 2 H) 1.92 - 2.07 (in. 6 H) 2.89 - 3.20 (m, 2 H) 3.36 - 3.44 (m, 1 H) 3.67 (t, J=9.54 Hz, 1 H) 3.84 (br. s., 1 H) 4.16 (br. s., 2 H) 7.23 (br. s., 2 H) 7.35 - 7.61 (m, 8 H) 7.77 (br. s., 2 H) 7.85 - 8.18 (m, 4 H) 8.48 (5, 4 H) 10.15 (br. s., 1 H) 10.46 - .59 (m, 1 H).

Preparasyon 14 (4aR,7aS)-7a-(5-Amin0-2-110 rofenil)-6-(5-110r0pirimidin-2-il)-4,4a,5,6,7,7a- heksahidropirrolo [3,4-d] [1,3]tiyazin-2-amin N s @M _N NJNxiH2 F NH2 Lityum hidroksit (8.6 g, 204.9 mmol), metanol içinde (400 mL) bir N-((4aR,7aS)-7a-(5- asetamido-2-IlorofeniD-6-(5-flor0pirimidin-2-il)-4,4a,5,6,7,7a-heksahidropi1rolo[3,4- d][1,3]tiyazin-2-il)benzamid (80 g, 157.3 mmol) çözeltisine ilave edilir. Karisim 60-70 °Ciye 4 saat isitilir. Konsantre HC] (132 g) ilave edilir ve karisim 55 °C”de 18 saat karistirilir.

Metanolü gidermek için karisim 30 c›C”ye sogutulur ve konsantre edilir. Basliktaki bilesigi, 920 gllik sulu bir çözelti olarak elde etmek için su ilave edilir ve sulu tabaka, DCM (3 X) ile ekstrakte edilir, toplam kütlenin %5.6,si, daha fazla saflastirma olmadan kullanilan basliktaki bilesiktir.

Preparasyon 15 Benzil N-alliI-N-(Z,2-dimet0ksietil)karbamat 0 l OJLNAgO @m Toluen içinde (180 mL) bir benzil N-(2,2-dimet0ksietil)karbamat (50 g, 208.9 mmol) çözeltisi azot altinda kati potasyum hidroksitle (51.6 g, 919.69 mmol) muamele edilir. 10 dakika sonra, benziltrietilamonyum klorür (0.8 g, 3.1 minol) ilave edilir. Baska bir 10 dakikadan sonra toluen içinde (50 mL) bir allil bromür (33 g, 272.8 mmol) çözeltisi 10 dakika damla damla ilave edilir. Elde edilen karisim 50 C>C,de 48 saat karistirilir. Karisim oda sicakligina sogutulur ve suyla sönümlenir. Basliktaki bilesigi (44 g, %75) sunmak için organik tabaka ayrilir, tuzlu su ile yikanir, magnezyum sülfat üzerinde kurutulur, ve kuruyana kadar konsantre edilir. ES/MS (m/e): 280 (M+H).

Preparasyon 16 Benzil N -allil-N -(2-0ks0etil)karbamat Formik asit (36.8 mL, 860 mmol) ve su (4.84 mL) içinde bir benzil N-allil-N-(2,2- dimetoksietil)karbamat (30 g, 107 mmol) çözeltisi oda sicakliginda gece boyunca karistirilir.

Karisim konsantre edilir ve heksan/etil asetat (122) ve su ile seyreltilir. Organik tabaka ayrilir, pH=6 olana kadar tuzlu su çözeltisi ile yikanir, ve sodyum sülfat üzerinde kurutulur.

Basliktaki bilesigi (25 g, %99) sunmak için çözücü buharlastirilir. ES/MS (m/e): 234 (M+H).

Preparasyon 17 Benzil N-allil-N-[2-hidr0ksiiminoetil]karbamat O / "OH OJLNNN @H 5 Asetonitril içinde (150 mL) bir benzil N-allil-N-(2-0ksoetil)karbamat (25 g, 107 mmol) çözeltisi, hidroksilamin hidroklorür (9.68 g, 139 mmol) ve su (75 mL) içinde bir sodyum asetat trihidrat (16 g, 117.9 mmol) çözeltisiyle muamele edilir. Karisim oda sicakliginda gece boyunca karistirilir. Asetonitril buharlastirilir ve sulu çözelti EtOAc ile ekstrakte edilir.

Basliktaki bilesigi (24 g, %90) sunmak için organik tabaka ayrilir, magnezyum sülfat üzerinde kurutulur, ve vakum altinda konsantre edilir. ES/MS (m/e): 249 (M+H).

Preparasyon 18 Benzil 3 ,3a,4,6-tetrahidr0pirrolo [3 ,4-c]izoksazol-S-karboksilat O »mcse 0 N 6 DCM içinde (338 mL) bir benzil N-allil-N-[2-hidroksiiminoetil]karbamat (24 g, 96.6 mmol) çözeltisi, sodyum hipokloridin ( 106.08 mmol, 143.06 mL) bir a/a %5 sulu çözeltisiyle 10 dakika damla damla muamele edilir. Elde edilen karisim oda sicakliginda gece boyunca karistirilir. Reaksiyon, sodyum bisülfidin (7 g) bir %40 sulu çözeltisi ile sönümlenir. Organik tabaka ayrilir, magnezyum sülfat üzerinde kurutulur, ve vakum altinda konsantre edilir.

Basliktaki bilesigi (18 g, %75) sunmak için ham ürün heksan içinde %5 EtOAc ile elute edilerek silika jel üzerinde saflastirilir. ES/MS (m/e): 247 (M+H).

Preparasyon 19 Benzil 6a-(5-br0m0-2-H0r0-fenil)-3,3a,4,6-tetrahidr0-lH-pirrolo[3,4-clizoksazol-5- ka rboksilat -78 °C7de 15 dakika karistirilan sari bir çözelti sunmak için n-butil lityumun bir 1.6 M heksanlar çözeltisi (25.4 mL, 40.6 mmol), tetrahidrofuran içinde (60 mL) 4-br0mo-l-Ilor0-2- iyodobenzenin bir -78 0C çözeltisine (12.22 g, 40.6 mmol) damla damla ilave edilir.

Boron triflorür eterat (5.14 mL, 40.6 mmol) THF içinde (60 mL) benzil 3,3a,4,6- tetrahidropirrolo[3,4-c]izoksazol-5-karb0ksilatin (5 g, 20.3 mmol) ayri bir -78 0C çözeltisine ilave edilir ve karisim -78 °C°de 5 dakika karistirilir. Bu çözelti, önceden hazirlanan -78 °C organolityum karisimina kanülle ilave edilir. Birlesik karisim 30 dakika -78 °C°de karistirilir.

Karisim, doymus sulu amonyuin klorürle sönümlenir ve oda sicakligina isitilir. Karisim, EtOAc (3 x) ile ekstrakte edilir ve organik ekstraktlar birlestirilir, sodyum sülfat üzerinde kullanilir, süzülür ve çözücü in vacuo giderilir. Basliktaki bilesigi (2.27 g, %27) sunmak için ham ürün, bir 35 dakika heksanlar gradyani içinde %5 ila %100 EtOAc ile silika jel üzerinde saIlastirilir. ES/MS (m/e): (79Br/8'Br) 421/423 (M+H).

Preparasyon 20 Benzil 1-(benzoilkarbamotiyoil)-6a-(S-bromo-Z-floro-fenil)-3,3a,4,6- tetrahidropirrolo [3,4-c] izoksazol-S-karboksilat Benzoil izotiosiyanat (2.87 mL, 21.28 mmol), THF içinde (95 mL) bir benzil 6a-(5-bromo-2- floro-fenil)-3,3a,4,6-tetrahidr0-lH-pirrolo[3,4-c]izoksazol-S-karboksilat (5.977 g, 14.2 mmol) çözeltisine damla damla ilave edilir ve azot altinda gece boyunca karistirilir. Çözücü in vacuo giderilir. Basliktaki bilesigi (605 g, %73) sunmak için ham ürün heksanlar gradyan içinde bir 30 dakika %5 ila %100 EtOAc ile silika jel üzerinde saflastirilir. ES/MS (in/e): (79Br/8'Br) 584/586 (M+H).

Preparasyon 21 Benzil 3 -(benzoilkarbamotiyoilamin0)-3 -(5 -bromo-Z-Iloro-fenil)-4- (hidroksimetil)pirrolidine-1-karboksilat OH O 3% H ÖOF N N:: 8O Bi- Bir benzil l-(benzoilkarbamotiyoil)-6a-(5-bromo-2-flor0-fenil)-3,3a,4,6- tetrahidropirrolo[3,4-0]izoksazol-S-karboksilat (6.05 g 10.4 mmol) ve çinko (toz, mikron) (6.77 g, 103.5 mmol) karisimi asetik asit içinde (52 mL) oda sicakliginda gece boyunca azot altinda karistirilir. Reaksiyon EtOAc ile seyreltilir ve diyatomlu topraktan süzülür. Çözücü in vacuo giderilir ve kalinti EtOAc, su ve doymus sulu sodyum bikarbonatla seyreltilir. Karisim, EtOAc ile (3 X) ekstrakte edilir, birlesik organik tabakalar birlestirilir ve sodyum sülfat üzerinde kullanilir, süzülür ve çözücü in vacuo giderilir. Basliktaki bilesigi (5.222 g, %86) sunmak için ham ürün silika jel üzerinde bir 30 dakika heksanlar gradyani içinde %5 ila %100 EtOAc ile saflastirilir. ES/MS (m/e): (79Br/8'Br) 586/588 (M+H).

Preparasyon 22 Benzil 2-benzamid0-7a-(S-br0m0-2-floro-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidr0pirrolo[3,4-d] [1,3]tiyazin-6-karb0ksilat 0 %:s 0 O\)-N NÄPH/Lkû 1,1'-karb0nildiimidazol (2.87 g, 17.7 mmol), THF içinde (52 mL) bir benzil 3- (benzoilkarbamotiyoilamino)-3-(5-bromo-2-floro-fenil)-4-(hidroksimetil)pirrolidin-1- karboksilat (5.198 g, 8.86 mmol) çözeltisine ilave edilir. Karisim 1.5 saat oda sicakliginda karistirilir ve daha sonra reaksiyon geri akista gece boyunca azot altinda isitilir. Reaksiyon sogutulur, suyla seyreltilir, ve EtOAc (3 x) ile ekstrakte edilir. Organik tabakalar birlestirilir, sodyum sülfat üzerinde kullanilir, süzülür, ve çözücü i'n vacuo giderilir. Basliktaki bilesigi (2.93 g, %58) sunmak için ham ürün, bir 30 dakika heksanlar gradyani içinde %5 ila %100 EtOAc ile silika jel üzerinde satlastirilir. ES/MS (m/e): (7QBr/8lBr). 568/570 (M+H) Preparasyon 23 N-[7a-(5-Bromo-Z-floro-fenil)-4a,5,6,7-tetrahidr0-4H-pirr010[3,4-d] [1,3] tiyazin-Z- il] benzamid so HN AJL: NN FH Br Iyodotrimetilsilan (2.21 mL, 15.46 mmol), oda sicakliginda bir asetonitril içinde (44 mL) benzil 2-benzamido-7a-(5-brom0 -2-floro-fenil)-4,4a,5 ,7-tetrahidr0pirr010[3 ,4-d][1,3]tiazin-6- karboksilat (2.93 g, 5.15 mmol) çözeltisine damla damla ilave edilir. Reaksiyon oda sicakliginda iki saat karistirilir ve çözücü in vacuo giderilir. Basliktaki bilesigi (2.098 g, %94) sunmak için ham ürün, 321 DCM metanol kullanilarak bir SCX kolonuyla ve daha sonra metanol içinde 2:] DCM:7 N amonyakla saflastirilir. ES/MS (in/e): (79Br/81Br) 434/436 (M+H).

Preparasyon 24 tert-Butil 2-benzamid0-7a-(5-bromo-Z-tloro-fenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d] [1,3]tiyazin-6-karb0ksilat °\>_N /s 0 a. gag Di-t-butildikarbonat (1.16 g, 5.31 nimol) ve trietilamin (1.01 mL, 7.25 mmol), DCM içinde (48 mL) bir N-[7a-(5-br0mo-2-Iloro-fenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirrolo[3,4-d][l,3]tiazin-2- il]benzamid (2.098 g, 4.83 mmol) çözeltisine ilave edilir. Reaksiyon 1 saat oda sicakliginda azot altinda karistirilir. Basliktaki bilesigi (2.556 g, %99) sunmak için çözücü in vacuo giderilir ve ham ürün, bir 30 dakika heksanlar gradyani içinde %5 ila %100 EtOAc ile silika jel üzerinde saflastirilir. ES/MS (ni/e): (79Br/8'Br) 534/536 (M+H).

Preparasyon 25 tert-Butil 7a-(5-amin0-2-Ilor0-fenil)-2-benzamid0-4,4a,5,7-tetrahidr0pirr010[3,4-d] [1,31tiyazin-6-karb0ksilat #güç H2N Etanol içinde (50 mL) bir teri-bati] 2-benzamido-7a-(5-br0m0-2-Ilor0-fenil)-4,4a,5,7- tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-karboksilat (2.556 g, 4.8 mmol) ve trans-N,N'-dimetil- 1,2-sikloheksandiamin (150 mg, 1.1 mmol) çözeltisi, sodyum azidle (933 mg, 14.3 mmol) muamele edilir. L-askorbik asit sodyum tuzu (0.66 M, 3.2 mL, 2.1 mmol) ve suyun (1 mL) bir sulu çözeltisi ilave edilir ve deney sisesinin üstü azotla temizlenir. Karisim, bakir(ll)sülfat pentahidratin (0.33 M, 3.2 mL, 1.1 mmol) bir sulu çözeltisiyle muamele edilir ve karisim bir önceden isitilmis sicak plaka üzerinde 80 °C°de 1.5 saat azot altinda hemen isitilir.

Isitildiktan sonra bir homojen karisim elde edilir. Reaksiyon sogutulur, buz suyla seyreltilir, ve karisim. EtOAc (3 ><) ile ekstrakte edilir. Ham azid ürünü sunmak için organik ekstraktlar birlestirilir ve sodyum sülfat üzerinde kullanilir, süzülür, ve çözücü in vacuo giderilir. Ham azid ürün, soguk etanol içinde (150 mL) %10 karbon üzerinde palladyumla (1 g) birlestirilir ve karisim vakum/azot ve daha sonra vakum/hidrojen kullanilarak temizlenir. Karisim oda sicakliginda 30 psi hidrojen altinda 5 saat karistirilir. Reaksiyon havalandirilir, diyatomlu topraktan süzülür, ve süzülen topak, DCM ile durulanir. Basliktaki bilesigi (2.014 g, %89) sunmak için çözücü, süzüntüden in vaciio giderilir ve ham ürün silika jel üzerinde DCM içinde %50 EtOAc ile saflastirilir. ES/MS (in/e): 471 (M+H).

Preparasyon 26 N-[7a-(5-Amin0-2-flor0-feni1)-4a,5,6,7-tetrahîdr0-4H-pirr010[3,4-d] [1,3]tiyazin-2- il]benzamid o HN F H HQN Trifloroasetik asit (10 mL), DCM içinde (30 mL) bir tert-butil 7a-(5-amino-Z-floro-fenil)-2- benzamid0-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-6-karboksi1at (2.013 g, 428 mmol) çözeltisine ilave edilir ve karisim oda sicakliginda azot altinda 4 saat karistirilir. Çözücü i'n vacuo giderilir ve basliktaki bilesigi (1.555 g, %98) sunmak için ham ürün, 3:1 DCMzmetanol ve daha sonra metanol içinde 221 DCM27 N amonyak kullanilarak bir SCX kolonuyla saflastirilir. ES/MS (In/e): 371 (M+H).

Preparasyon 27 N-[7a-(5-Amin0-2-flo ro-fenil)-6-(5-f]0r0pirimidin-Z-il)-4,4a,5,7-tetrahidr0pirr0l0[3,4-d] [1,3]tiyazin-2-il]benzamid _N S 0 \ N/ Nýkaû % :F H H2N Bir N- [7a-(5-amin0-2-110r0-fenil)-4a,5,6,7-tetrahidro-4H-pirrolo[3 ,4-d][ 1,3]tiazin-2- il]benzamid (705 mg, 1.90 mmol), 5-f10r0-2-k10r0pirimidin (1.01 g, 7.61 mmol), ve DIPEA (1.66 mL, 9.52 mmol) çözeltisi, 1,4-dioksan (20 mL) içinde 4 saat azot altinda geri akisa isitilir. Reaksiyon sogutulur, suyla seyreltilir, ve EtOAc (3 x) ile ekstrakte edilir. Ham ürünü sunmak için organik tabakalar birlestirilir, sodyum sülfat üzerinde kullanilir, süzülür ve çözücü in vacuo giderilir. Basliktaki bilesigi (590 mg, %66) sunmak için ham ürün bir 25 dakika heksanlar gradyani içinde %5 ila %100 EtOAc ile silika jel üzerinde saflastirilir.

ES/MS (m/e): 467 (M+H).

Preparasyon 28 N-[(4aR,7 aS)-7 a-(S-Amin0-2-i10ro-fenil)-6-(5-H0r0pirîmidin-2-il)-4,4a,5,7- tetrahidropirr0l0[3,4-d] [1,3]tiyazîn-Z-il]benzamid, (izomer 1) -N s 0 { Hg F H H2N Rasemik N-[721-(5-amino-2-floro-fenil)-6-(5-floropirimidin-Z-i1)-4,4a,5,7- tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-il]benzamid (1.694 g, 3.63 mmol), HPLC (Kolon: Chiralcel OJ, 8 x 35 cm; eluent: %90 metanol (%02 dimetiletilamin) ve %10 asetonitril ile sailastirilir; UV 280 nm°de akis 400 mL/dakika). Birinci elute edici izomerin analizi (Kolon: Chiralcel OJ-H 0.46 x 15 cm; eluent: 10:90 asetonitrilzmetanol (%02 dimetiletilaminle); akis: UV 280 nm7de 0.6 mL/dakika), Rt = 6.70 dakika olarak enantiomerik olarak zenginlestirilmis (%99 ee) enantiomeri (723 mg, %43) dogrular. ES/MS (m/e): 467 (M+H).

Preparasyon 29 N-[3-[(4aR,7aS)-2-Benzamid0-6-(5-flor0pirimidin-2-iI)-4,4a,5,7-tetrahidr0pirr0l0[3,4- d] [1,3]tiyazin-7a-il]-4-110r0-fenil]-S-metoksi-pirazin-Z-karboksamid, (izomer 1) _N s 0 &ag/*ÜÇ NH 0 /N m N-[(4aR,7aS)-7a-(5-Amino-2-Iloro-fenil)-6-(5-floropirimidin-Z-i1)-4,4a,5,7- tetrahidropirrolo[3,4-d][1,3]tiazin-2-i1]benzamid, izomer 1 (0.361 g, 0.77 mmol) bir DCM (4 mL) ve DMF (0.5 mL) karisimi içinde çözündürülür. 5-Metoksipirazin-Z-karboksilik asit (240 mg, 1.55 mmol), HOBT (210 mg, 1.55 mmol) ve EDCI (300 mg, 1.55 mmol) karisima ilave edilir ve karisim gece boyunca oda sicakliginda karistirilir. Reaksiyon çözeltisi, bir 12 g silika jel yükleme kolonuna dogrudan ilave edilir ve bir 40 g silika jel kolonu kullanilarak ve bir %0-% 100 EtOAc/heksanlar gradyaniyla elute edilerek saflastirilir. Ürün, EtOAc (200 mL) içinde çözündürülür, 1 N NaOH (2 X 50 mL) ile, ve tuzlu suyla (1 X 50 mL) yikanir.

Basliktaki bilesigi (350 mg, %74) sunmak için silika jel saflastirilmasi yukarida açiklandigi gibi tekrarlanir. ES/MS (in/e): 603 (M+H).

Preparasyon 30 S-Allil-6a-(2-t10r0feni1)-3,3a,4,6-tetrahidr0-1H-pirrolo[3,4-c]izoksazol INgNî Akis kimyasi reaksiyon asamasi: Bir 343-ml dikissiz paslanmaz çelikten borulu reaktör (O.D=l/8 inç) bir GC firini için yerlestirilir ve 20 mL/dakikada 20 dakika toluenle çalkalanir.

Azot basinci (720 psig) geri uygulanir ve GC sicakligi 210 °C,ye ayarlanir. Sicaklik 210 °C”ye ulastiktan sonra, toluen içinde (5.81 L) bir 2-(diallilamino)-1-(2-f10r0fenil)etanon oksim (480.51 g, 1.74 mol) çözeltisi, 15 dakikalik bir alikonma süresi saglamak için bir sürekli modda çalisan bir çift yüksek basinçli siringa pompalari kullanilarak 22.866 mL/dakikada reaktörden pompalanir. Tüin stok çözelti tüketildikten sonra, reaktör, 22.866 mL/dakikada 30 dakika toluenle çalkalanir. GC firini sicakligi 25 °Csye ayarlanir ve tamamlanmis çözelti toplanir ve vakum altinda konsantre edilir. Çözücü buharlastirilir ve kalinti, metilen klorür (2.5 L) ve su (5 L) içinde çözündürülür. pH, hidroklorik asitle l *e ayarlanir ve sulu tabaka ayrilir ve pH,i 10,a ayarlamak için sodyum hidroksitle nötralize edilir. Sulu tabaka, MTBE (3 X 2.5 L) ile ekstrakte edilir. Daha fazla saflastirrna olmadan kullanilan basliktaki ham bilesigi (248 g, %47) sunmak için organik ekstraktlar birlestirilir, sodyum sülfat üzerinde kurutulur, süzülür, ve kuruyana kadar buharlastirilir. ES/MS (m/e): 249 (M+1).

Preparasyon 31 1-Allil-4-amin0-4-(2-110rofenil)pirr01idin-3-il]metanol OH :rN NH2 F Çinko tozu (590 g, 9 mol), bir metanol (2.85 L) ve amonyum klorür doymus sulu çözeltisi (3.56 L) karisimi içinde bir 5-alli1-6a-(2-Ilorofenil)-3,3a,4,6-tetrahidro-1H-pirrolo[3,4- c]izoksazol (3559 g, 1.29 mol) çözeltisine ilave edilir ve karisim 16 saat 70 °C9de isitilir.

Reaksiyon 60 °C”ye sogutulur, THF (285 L) ile seyreltilir, ve diyatomlu toprak üzerinden sicakken süzülür. Süzüntü, organik çözücüyü gidermek için buharlastirilir, ve sulu karisim, sitrik asit a/a %10 sulu çözelti (4 L) ve EtOAc (3.5 L) ile seyreltilir. Organik tabaka ayrilir ve sulu tabaka, EtOAc (2 X 2 L) ile yikanir. Sulu tabaka, pH,i 10°a ayarlamak için a/a %SOSodyum hidroksitle nötralize edilir, ve ardindan EtOAc (2 X 1.5 L) ile ekstrakte edilir.

Basliktaki ham bilesigi (299 g, %92) sunmak için organik ekstraktlar birlestirilir, sodyum sülfat üzerinde kurutulur, süzülür, ve kuruyana kadar buharlastirilir. ES/MS (m/e): 251 (MH ).

Preparasyon 32 [(3R,4S)-1-Allil-4-amin0-4-(2-llorofeniDpirrolidin-3-il]metanol; 2,3-bis[(4- metilbenzoil)0ksi]butanedioik asit OH HO O NH 0 2 0 N F 0 /' o 0 OH l-metoksi-Z-propanol (1.13 L) içinde bir di-p-toluoil-L-tartarik asit (348.6 g, 884 mmol) çözeltisi, 40 °C3de önceden isitilmis 1-metoksi-2-pr0panol (1.13 L) içinde bir [(3R,4S)-l- allil-4-amino-4-(2-florofenil)pirrolidin-3-il]metanol (225.9 g, 902 mmol) çözeltisine ilave edilir. Reaksiyon 22 °C*ye sogutulur ve 18 saat karistirilir. Beyaz bir kati süzülerek toplanir ve 1-metoksi-2-propanol (600 ml) ile yikanir. Basliktaki bilesigi (183.01 g, %318) sunmak için toplanan kati kurutulur. ES/MS (m/e): 251 (M+l).

Preparasyon 33 [(3R,4S)-1-Allil-4-amin0-4-(2-110rofenil)pirr01idin-3-il]metanol OH NH2 N f F / [(3R,4S)-1-Allil-4-amino-4-(2-Ilorofenil)pirrolidin-3-il]metanol;2,3-bis[(4- metilbenzoil)0ksi]butanedioik asit (211 g, 331 mmol) su (2.] L) ve EtOAc (2.3 L) içinde çözündürülür. a/a %35 Hidroklorik asit, pHH 1,e ayarlamak için ilave edilir. Sulu tabaka ayrilir ve a/a %50 sodyum hidroksitle, pH 10,a ayarlanir ve EtOAc (2><) ile ekstrakte edilir.

Sulu tabakanin pHH, sulu NaOH ile 10,a ayarlanir, ve ayrica sulu çözeltinin pHH szlûada tutulurken, MTBE (3X) ile ekstrakte edilir. Basliktaki ham bilesigi (73 g, %88, %948 ee) sunmak için organik ekstraktlar birlestirilir, sodyum sülfat üzerinde kurutulur, süzülür, ve kuruyana kadar konsantre edilir. Basliktaki bilesigi ikinci elute edici izomer olarak sunmak için, ürün, kiral kromatografiyle: Kolon AS-H, eluent %10 izopropil alkol, %2 izopropil amin; UV 220ide 3 mL/dakikalik akis hizi; 35 °C,de 100 bar*11k basinçta, Rf= 2.26 dakika analiz edilir. ES/MS (in/e): 251 (MH).

Preparasyon 34 N-[(4aR,7aS)-6-Allil-7a-(2-florofenil)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolol3,4-d] [1,3] tiyazin-Z- il] benzamid 8 O JNgNANkû F H THF (2,3L) içinde bir [(3R,4S)-l-allil-4-amino-4-(2-florofeniDpirrolidin-3-il]metanol (129.7 g, 414 mmol) çözeltisi 0 °C”de bir azot atmosferi altinda so gutulur. Benzoil izotiyosiyanat (61.5 mL, 456 mmol), sicaklik 5 °C”nin altinda tutularak ilave edilir. Reaksiyon, 3 saat oda sicakligina isitilir ve l,l'-karb0nildiimidazol (87.4 g, 538.9 inmol) ilave edilir ve reaksiyon 22 °C3de 1 saat karistirilir, bunu 70 °C”de 16 saat isitma takip eder. Reaksiyon karisimi 22 °C9ye sogutulur ve çözücü buharlastirilir. Kalinti,n EtOAc (1 L) ve su (1 L) olarak ayrilir.

Organik tabaka ayrilir ve sulu tabaka, EtOAc (2 X 400 mL) ile ekstrakte edilir. Basliktaki ham bilesigi sunmak için organikler birlestirilir, sodyum sülfat üzerinde kurutulur, süzülür, ve kuruyana kadar buharlastirilir. Basliktaki bilesigi soluk sari kati (170 g, %99) olarak sunmak için ham ürün, %0-%40 DCM'den kalinti çözücü içeren bir EtOAc/ DCM gradyaniyla elute edilerek silika jel kromatografisiyle saflastirilir. ES/MS (m/e): 396 (M+l).

Preparasyon 35 N-[(4aR,7aS)-7a-(2-Florofenil)-4a,5,6,7-tetrahidr0-4H-pirr0l0[3,4-d] [1,3]tiyazin-2- il]benzamid Benzoik Asit, 2-merkapto- (122 g, 793 mmol), bis(dibenzilidenaseton)palladyum (4.15 g, 7.21 mmol), ve l,4-bis(difenilfosfino)butan (3.14 g, 7.21 mmol), bir azot atmosferi altinda susuz 2-metiltetrahidr0furan (1.96 L) içinde bir N-[(4aR,7aS)-6-allil-7a-(2-florofenil)- 4,4a,5,7-tetrahidr0pirrolo[3,4-d][l,3]tiyazin-2-il]benzamid (178.21 g, 360 mmol) çözeltisine ilave edilir. Çözeltinin, vakum/ azot döngüsüyle üç kez gazi giderilir, ve ardindan azot, 15 dakika reaksiyonla köpürtülür. Reaksiyon karisimi, azot reaksiyonla köpürtülürken 40 °C9ye isitilir. Reaksiyon 40 °Csye ulastiginda, köpürme giderilir ve reaksiyon karisimi 40 °C,de 3 saat bir azot atmosferi altinda karistirilir. Reaksiyon 22 °C7ye sogutulur ve suyla (2 L) seyreltilir. pH& lle ayarlamak için HCl (5 M) çözeltisi ilave edilir. Sulu tabaka ayrilir ve ilave EtOAc (2 X 800 mL) ile yikanir. Sulu tabakanin pH,i a/a %50 sodyum hidroksitle 10°a ayarlanir ve ardindan EtOAc (10 L) ile ekstrakte edilir. Sulu tabaka, ilave EtOAc (2 X 750 mL) ile yikanir. Basliktaki ham bilesigi soluk sari kati (124.7 g, %97) olarak sunmak için organik ekstraktlar birlestirilir, tuzlu su ile yikanir, sodyum sülfat üzerinde kurutulur, süzülür, ve kuruyana kadar buharlastirilir. ES/MS (m/e): 356 (M+l).

Preparasyon 36 N-[(4aR,7aS)-7a-(2-Flor0fenil)-6-(5-t10ropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d] [1,3]tiyazin-2-il] benza mid F4 N-metilpirrolidon (997 mL) içinde bir N-[(4aR,7aS)-7a-(2-florofenil)-4a,5,6,7-tetrahidr0-4H- pirr010[3,4-d][1,3]tiyazin-2-il]benzamid (124.7 g, 256 mmol), DIPEA (67 mL), 5-Iloro-2- kloropirimidin (29.3 ml, 307 mmol) çözeltisi 100 °C,ye 16 saat isitilir. Sicaklik 15 °C°nin altinda tutulurken reaksiyon 22 °C9ye so gutulur ve 10 oC'de (10 L) sogutulmus suya akitilir.

Soluk krem rengi bir kati süzülerek toplanir ve ilave su ile yikanir. Islak kati, EtOAc (2 L) içinde çözündürülür ve bir ayirma hunisine aktarilir. a/ a %5 Sodyum klorür sulu çözeltisi (1 L) ilave edilir ve organik tabaka ayrilir, sodyum sülfat üzerinde kurutulur, süzülür, ve süzüntü indirgenmis basinç altinda buharlastirilir. Basliktaki bilesigi soluk sari bir kati (116 g, %70) olarak sunmak için ürün bir %0-%40 EtOAc/izoheksan gradyani kullanilarak silika jel kromatografisiyle saflastirilir. ES/MS (m/e): 452 (M+1).

Preparasyon 37 (4aR,7aS)-7a-(2-Florofenil)-6-(5-110ropirimidin-Z-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo [3,4-d] [1,3]tiyazin-2-amin _N>_ 8 F N {N/ F AN..

Lityum hidroksit (9.26 g, 386 mmol), metanol içinde (1.6 L) bir N-[(4aR,7aS)-7a-(2- florofeni1)-6-(5-floropirimidin-Z-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirr010[3 ,4-d][1,3]tiyazin-2- il]benzamid (158.6 g, 351.6 mmol) karisimina ilave edilir. Karisim 70 °Csde 4 saat isitilir ve ardindan 22 °C,ye sogutulur. Reaksiyon karisimi, vakum altinda sari bir kalintiya buharlastirilir. Kalinti, su (1 L) ve EtOAC (750 mL) olara bölünür. HCl (5 M sulu çözelti), pH°in 1°e ayarlanmasi için ilave edilir. Sulu tabaka ayrilir ve organik tabaka, EtOAc (2 X 200 mL) ile yikanir. Sulu tabakanin pH”1, a/a %50 sodyum hidroksit sulu çözeltisiyle pH=10,a ayarlanir ve EtOAc (3 X 1 L) ile ekstrakte edilir. Basliktaki ham bilesigi soluk sari bir kati (133.3 g, %99, %12 kalinti EtOAc içerir) sunmak için organik ekstraktlar birlestirilir, sodyum sülfat üzerinde kurutulur, süzülür, ve indirgenmis basinç altinda buharlastirilir. ES/MS (in/e): 348 (M+1).

Preparasyon 38 (4aR,7aS)-7a-(5-Amin 0-2-f10 rofenil)-6-(5-il0r0pirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo [3,4-d] [1,3]tiyazîn-2-amin _N>_ 8 F N {N/ F *MH NH2 Süliîirik asit (33.4 m1, 626.6 mmol), trifloroasetik asit (626 mL) içinde bir (4aR,7aS)-7a-(2- florofenil)-6-(5-flor0pirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidr0pirr010[3,4-d] [1,3]tiyazin-2-amin (45.8 g, 125,3 mmol) çözeltisine ilave edilir. Karisim 0 °C,ye sogutulur ve 20 dakika karistirilir. Dumanli nitrik asit (6.2 mL, 144.1 mmol) ilave edilir ve reaksiyon karisimi 22 °Csye isitilir ve 3 saat karistirilir. Reaksiyon karisimi buharlastirilir ve MTBE (250 mL) ilave edilir ve iki kez buharlastirilir. Kalinti vakum altinda sabit bir agirliga kurutulur ve ardindan su (147 mL) ve etanol (885 mL) içinde çözündürülür ve köpüren azotun 15 dakika gazi alinir. Çözelti bir basinç reaktörüne aktarilir ve %10 Pd/C macun tipi 87L (6.6 g, 6.27 mmol) ilave edilir. Karisim, ilave etanol (700 mL) ile seyreltilir ve 80 psi°de 16 saat hidrojenle basinçlandirilir. Reaksiyon karisimi süzülür ve ardindan %10 Pd/ C macun tipi 87L (6.6 g, 6.27 mmol) bir ikinci katalizör yükü ilave edilir ve karisim 80 psi5ye basinçlandirilir ve 3 gün basinç reaktöründe karistirilir. Reaksiyon karisimi, azot ile temizlenir ve diyatomlu topraktan süzülür. Süzüntü buharlastirilir ve kalinti su (200m1) ve EtOAc (200 m1) olarak ayrilir. Sulu tabaka ayrilir, 5 °C`ye sogutulur, ve a/a %15 amonyum hidroksitle nötralize edilir. Sulu tabaka, EtOAc (3 X 150 mL) ile ekstrakte edilir. Basliktaki bilesigi açik kahverengi kati (47.7 g, %99 kalinti EtOAc içerir) olarak sunmak için organikler birlestirilir, sodyum sülfat üzerinde kurutulur, süzülür, ve indirgenmis basinç altinda buharlastirilir. ES/MS (in/e): 363 (M+1). Örnek 1 N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amin0-6-(S-floropirimidin-Z-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4- d] [1,3]tiyazin-7a-il]-4-110r0-fenil]-S-metoksi-pirazin-Z-karboksamid hidroklorür. _N S H- CI F N {N/* NA Ni-i2 0 N / N \ H300 N F N-[3-[(4aR,7aS)-2-Benzamid0-6-(5-Iloropirimidin-Z-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4- d][l,3]tiazin-7a-il]-4-Ilor0-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karb0ksamid, izomer 1 (0.350 g, 0.58 mmol) THF (2 mL) içinde çözündürülür ve daha sonra metanol (4 mL) ve etanol (4 mL) ilave edilir. O-Metilhidroksilamin hidroklorür (495 mg, 5.81 mmol) ve piridin (470 uL, 5.81 mmol) karisima ilave edilir ve reaksiyon 50 °C”ye isitilir ve gece boyunca karistirilir. Silika jel (~10 g) reaksiyona ilave edilir ve karisim konsantre edilir. Numune, silika jel üzerinde kurutulur, bir bos kartusa yüklenir ve diklorometan içinde bir %0-%10 7 N amonyak metanol gradyaniyla elute edilerek saflastirilir. Ürün, 321 diklorometanzmetanol ve daha sonra metanol içinde 221 diklorometan:7 N amonyak kullanilarak bir SCX kolonu üzerinde bir ikinci kez satlastirilir. Basliktaki bilesigin serbest bazini sunmak için ürün silika jel üzerinde DCM içinde bir %0 ila %10 7 N amonyak metanol gradyaniyla son bir kez saflastirilir. Bu malzeme DCM içinde (5 mL) çözündün'ilür ve dietil eter (0.20 mL, 660 umol) içinde 1 M hidrojen klorür ilave edilir. Basliktaki bilesigi (71 mg, %23) sunmak için çözücü in vacuo giderilir.

ES/MS (m/e): 498 (M+H).

X-isini toz kirinimi (XRD: Kristalize katilarin XRD paternleri, 35 kV ve 50 mAlda çalisan bir CuKd kaynagi (X = 1.54060 Â) ve bir Vantec detektörü ile donatilmis bir Bruker D4 Endeavor X-isini toz kirinim ölçeri üzerinde elde edilir. Numune, 297da 0.009°”lik bir Asama boyutu ve 0.5 saniye/asamalik bir tarama hizi, ve 0.6 mm sapma, 5.28 sabit saçilma-önleyici, ve 9.5 mm detektör delikleriyle 26,da 4 ve 40° arasinda taranir. Kuru toz, bir kuartz numune tutucu üzerinde ambalajlanir ve bir lam kullanilarak pürüzsüz bir yüzey elde edilir. Kristal formda kiriniin paternleri ortam sicakliginda ve bagil nemde toplanir. Kristallografi sahasinda belirtilen herhangi bir kristal form için, kirinim tepe noktalarinin nispi yogunluklarinin, kristal morfolojisi ve yapisi gibi faktörlerden elde edilen, tercih edilen oryantasyona bagli olarak degisebilecegi iyi bilinmektedir. Tercih edilen oryantasyonun etkileri mevcut oldugunda, tepe noktasi yogunluklai degisir, fakat polimorfun karakteristik tepe noktasi pozisyonlari degismeden kalir. Bakiniz, örnegin Amerika Birlesik Devletleri Farmakopesi #23, National Formulary #18, sayfa 1843-1844, 1995. Bundan baska, belirtilen herhangi bir kristal form için krista110grafi sahasinda açili tepe noktasi pozisyonlarinin çok az degisebilecegi ayrica iyi bilinmektedir. Örnegin, tepe noktasi pozisyonlari, bir numunenin analiz edildigi sicaklik veya nemde bir degiskene, numune yer degisimine, veya bir iç standardin varligi veya yokluguna bagli olarak kayabilir. Mevcut durumda, 207da ± 0.2”lik bir tepe noktasi pozisyon degiskenligi, belirtilen kristal formun net tanimina mani oluninadan bu potansiyel varyasyonlari dikkate alacaktir. Bir kristal formun dogrulanmasi, ayirt edici tepe noktalarinin (° 2971ik birimlerde), tipik olarak daha belirgin tepe noktalarinin herhangi bir özgün kombinasyonu baz alinarak yapilabilir. Ortam sicakligi ve bagil nemde toplanan kristal form kirinim paternleri, 8.853 ve 26.774 derece 2-teta°da NIST 675 standart tepe noktalari baz alinarak ayarlanir. Örnek la Kristalize Form 1 N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amin0-6-(5-Ilor0pirimidin-Z-il)-4,4a,5,7- tetrahidropirrolo[3,4-d] [1,31tiyaziii-7a-il]-4-flor0-feiiil]-S-metoksi-pirazin-Z- karboksamid F4<:N>-N S \ NI A 0 N / N r i& H3CO N N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amin0-6-(5-Ilor0pirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4- d][l,3]tiyazin-7a-il]-4-Ilor0-fenil]-5-metoksi-pirazin-Z-karboksamid (201 mg, 403.20 umoles), 4 mL butil asetatla karistirilir ve bir 120°C karistirma plakasi üzerinde karistirilir.

Kati, yaklasik 5 dakika sonra çözünür, bu, berrak renksiz bir çözelti sunar. Numune daha sonra oda sicakligina sogutulur ve beyaz bir kati, çözeltiden çökelir. Numune daha sonra oda sicakliginda 10 dakika bulamaç haline getirilir, beyaz katinin kivamli bir bulamaci elde edilir.

Beyaz kati, vakumla süzülerek izole edilir ve 5 dakika hava akimi altinda kurutulur.

Basliktaki bilesigi (110 mg) sunmak için beyaz katinin elde edilen topagi, haftasonu 60°C3de vakumlu firina bir darasi alinmis Ilakona yerlestirilir. Kristalize Form l N-[3-[(4aR,7aS)-2- amino-6-(5-flor0pirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3,4-d] [l ,3]tiyazin-7a-iI]-4-floro- fenil]-5-met0ksi-pirazin-Z-karboksamid, oda sicakliginda ve yaklasik %15”ten az bagi] nemde stabil kristal formdur. Örnek lb Kristalize Form 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amin0-6-(5-flor0pirimidin-Z-il)-4,4a,5,7- tetrahidropirr010[3,4-d] [1 ,3]tiyazîn-7a-il]-4-t10r0-fenil]-S-metoksi-pirazin-Z- karboksamid (hidratlanmis) Oksalil klorür (888 uL, 10.2 mmol), asetonitril (53 mL) ve DMF (848 uL) içinde bir 5- metoksipirazin-2-karboksilik asit (1.6 g, 10.2 mmol) çözeltisine ilave edilir. 15 dakika sonra, yeni hazirlanan çözelti, 50 °C,de önceden isitilan bir su (53 mL) ve etanol (53 mL) karisimi içinde bir (4aR,7aS)-7a-(5-amin0-2-flor0fenil)-6-(5-floropirimidin-Z-il)-4,4a,5.7- tetrahidropirrolo[3,4-d][l,3]tiyazin-2-amin (2.65 g, 7.3 mmol) çözeltisine ilave edilir.

Reaksiyon karisimi 50 °C”de bir saat karistirilir, 22 0C”ye sogutulur, ve ardindan gece boyunca bu sicaklikta karistirilir. Organik çözücü, vakum altinda buharlastirilir ve pH= 10°u ayarlamak için sulu karisim, a/a %50 sodyum hidroksit sulu çözeltisiyle muamele edilir.

Soluk krem rengi bir kati izole edilir ve ilave su ile yikanir. Kati, izopropil alkol (2><) ile seyreltilir ve çözücü buharlastirilir. Ham malzeme, bir amonyaklanmis metanol (2 N) / metilen klorür gradyani kullanilarak silika jel kromatografisiyle satlastirilir. Basliktaki bilesigi grimsi beyaz bir kati (1.9 g, %52) olarak sunmak için arzu edilen ürünü içeren fraksiyonlar birlestirilir ve çözücü buharlastirilir. ES/MS (in/e): 499 (M+l).

Kristalize Form 2 N-[3-[(4aR.7aS)-2-Amin0-6-(5-flor0pirimidin-Z-il)-4,4a.5,7- tetrahidropirroloBA-d]I1,31tiyazin-7a-il]-4-110r0feni11-5-met0ksi-pirazin-Z- karboksamidin (hidratlanmis) Alternatif Preparasvonu Asetonitril (500 mL), DMFsye (19.2 mL, 248.9 mmol) ilave edilir. Oksalil Klorür (393 g, 309.63 mmol), ardindan 5-metoksipirazin-Z-karboksilik asit (46.0 g, 298.4 mmol) DMF/asetonitril çözeltisine ilave edilir. Ayri bir deney Sisesinde, (4aR,7aS)-7a-(5-amin0-2- florofenil)-6-(5-floropirimidin-Z-il)-4,4a,5,7-tetrahidropirrolo[3 ,4-d][1,3]tiyazin-2-aminin sulu çözeltisi (56.8 g, 156.75 mmol), asetonitrile (500 mL) ilave edilir ve pH, amonyum hidroksitle (95 mL) 97a ayarlanir. Bu karisim daha sonra 50 -55 °C°ye isitilir. Oksalil klorür çözeltisi damla damla ilave edilir ve karisim 3 saat karistirilir. pH, amonyum hidroksitle 8- 9la ayarlanir. Basliktaki bilesigi (123 g) elde etmek için elde edilen çökelti süzülür, suyla yikanir, ve kurutulur. Kati, aseton (250 mL) içinde 1.5 saat bulamaç haline getirilir ve süzülür. Basliktaki bilesigi (110 g HPLC ile %905 satlik) elde etmek için islak topak, asetonla yikanir. THF (1 L) ve aktif karbon (9 g), katiya ilave edilir ve karisim gece boyunca geri akisa isitilir. Karisim diyatomlu topraktan süzülür ve THF (150 mL) ile yikanir. Organik çözelti 10 hacime konsantre edilir ve 60 °C`ye isitilir. Su (430 mL) ilave edilir ve karisim 60 °Cide 8 saat karistirilir. Karisim oda sicakligina sogutulur ve 10 saat karistirilir. Basliktaki bilesigi (69 g, %88) LC-MS: m/z=499 (M+l), saflik: %983 sunmak için elde edilen kati süzülür, THF/su (7:6) ile yikanir ve kurutulur. iH NMR (400 MHz, DMSO-dö) ö ppm 2.99 - 3.07 (m, 2 H) 3.07 - 3.14 (m, 1 H) 3.58 - 3.67 (m, 1 H) 3.68 - 3.76 (m, 1 H) 3.76 - 3.84 (m, 1 H) 4.02 (5, 3 H) 4.07 (d, J=10.92 Hz, 1 H) 6.08 (5, 2 H) 7.19 (dd, J=1 1.98, 8.72 Hz, 1 H) 7.78 - 7.89 (m, 2 H) 8.41 (5, 1 H) 8.44 (5, 2 H) 8.88 (5, 1 H) 10.60 (5, 1 H).

Kristalize Form 2 N-I3-[(4aR,7aS)-2-Amin0-6-(5-Ilor0pirimidin-Z-il)-4,4a,5,7- tetrahidropirroloßA-d] [1,31tivazin-7a-il]-4-tlor01'enill-5-met0ksi-pirazin-Z- karboksamidin ghidratlanmis! Preparasyonu için Genel prosedür N-[3-[(4aR,7aS)-2-amin0-6-(5-Iloropirimidin-2-il)-4,4a.5,7-tetrahidr0pirr010[3,4- d][ l,3]tiyazin-7a-il]-4-Ilor0-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamid THF içinde yaklasik 23 °C9de bir yaklasik 71 mg/mL çözücü konsantrasyonunda bulamaç haline getirilir. Bulamaç, yaklasik 60 °C ila yaklasik 63 °C°de meydana gelen çözünme gerçeklesene kadar karistirilarak isitilir. Yaklasik 95:5”lik bir THF:su çözücü orani sunmak için su, sicak çözeltiye ilave edilir. Form 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-Ilor0pirimidin-2-il)-4,4a,5,7- tetrahidropirrolo [3 ,4-d][1 ,3]tiyazin-7a-il] -4-Iloro-fenil]-5-met0ksi-p irazin-2-karb0ksamidin tohum kristalleri (yaklasik agirlikça % 3 yük) ilave edilir. Elde edilen seyreltilmis bulamaç yaklasik 60 °C ila yaklasik 63 °C”de yaklasik 20 dakika tutulur, bunu yaklasik 2 ila yaklasik 4 saat yaklasik 5.3 ila yaklasik 5.5 hacim su ilavesi takip eder, yaklasik 69:31 *lik bir THF:su çözücü orani elde edilir. Bulamaç daha sonra yaklasik 30 dakika yaklasik 60 0C ila yaklasik 63 OC”de tutulur ve ardindan yaklasik 1 saat yaklasik 23 °C`ye sogutulur, ve ardindan yaklasik 8-12 saat karistirilir. Hidratlanmis olan, arzu edilen kristalize Form 2 N-[3- [(4aR,7aS)-2-amin0-6-(5-Iloropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidr0pirrolo[3 ,4-d][ 1,3]tiyazin-7a- il]-4-floro-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamidi sunmak için bulamaç daha sonra süzülür, THF :su (35:65) ile hafifçe durulanir, ve yaklasik 40 °C3de indirgenmis vakum altinda yaklasik 8- 12 saat kurutulur.

Kristalize Form 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-Iloropirimidin-Z-il)-4,4a,5,7- tetrahidropirrolo [3 ,4-d][l ,3]tiyazin-7a-il] -4-flor0 fenil]-5-met0ksi-p irazin-2-karboksamidin hazirlanmis bir numunesi, asagida Tablo l,de açiklandigi gibi kirinim tepe noktalarina (2-teta degeri) sahip olan CuKa radyasyonu kullanilarak bir XRD paterniyle karakterize edilir.

Spesifik olarak, patern, 0.2 derecelik kirinim açilari için bir toleransla, 18.6°, l9.3°, ve 26.7°,den olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla tepe noktasiyla kombinasyon halinde 11.8°?de bir tepe noktasi içerir.

Tablo 1: Örnek 1b7nin kristalize Form 2”sinin X-isini toz kirinim tepe noktalari.

Tepe noktasi Açi (2-Teta °) +/- 0.2° Bagil Yogunluk (en yogun tepe noktasi (70,81) 1 11.8 100.0 2 18.6 71.4 3 19.3 45.5 4 26.7 41.9 20.6 27.3 6 9.0 19.0 7 24.8 18.5 8 22.4 15.5 9 31.9 14.3 10.6 11.2 Kristalize Form 2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amino-6-(5-floropiriniidin-Z-il)-4,4a,5,7- tetrahidropirrolo[3,4-d][ l ,3]tiyazin-7a-il]-4-t10ro-fenil] -5 -metoksi-pirazin-Z-karboksamid, oda sicakliginda ve yaklasik %15,ten büyük bagi] nemde stabil kristal formdur. Örnek lc Kristalize Form 3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amin0-6-(5-flor0pirimidin-Z-il)-4,4a,5,7- tetrahidropirrolo [3,4-d] [1,3] tiyazin-7a-il]-4-Ilor0-fenil] -5-met0ksi-pirazin-2- ka rboksa mid.

Bir termogravimetrik analiz kabina, N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-floropirimidin-2-il)- 4,4a,5,7-tetrahidr0pirrolo[3 ,4-d][ 1,3 ]tiyazin-7a-il]-4-florofenil]-5 -metoksi-pirazin-Z- karboksamid koyulur ve yaklasik 170 c>C1ye isitilir ve 170 °C5de yaklasik 5 dakika tutulur.

Basliktaki bilesigi sunmak için oda sicakligina sogutulur.

Kristalize Form 3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-Amin0-6-(5-floropirimidin-Z-il)-4,4a,5,7- tetrahidropirrolo [3,4-d] [1,3]tiyazîn-7a-il] -4-flor0fenil] -5 -metoksi-pirazin-Z- karboksamidin Alternatif Preparasyonu.

N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-tloropirimidin-2-il)-4,4a,5,7-tetrahidr0pirrolo[3,4- d][1,3]tiyazin-7a-i1]-4-floro-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamid (121 mg), asetonitrille (5 mL) bir flakonda birlestirilir, ve bir 90 °C karistirma plakasina isitilir. Yaklasik 30 dakika sonra, katinin çogu çözünür, bulanik bir çözelti elde edilir. Form 3 tohumlari ilave edilir ve numune, yaklasik 1 saat yaklasik 90 °C5de karistirilir. Karistirma bitirilir ve parlak beyaz bir kati sunmak için karisim karistirilir. Basliktaki bilesigi sunmak için kati, vakumla süzülerek izole edilir, bir hava akimi altinda yaklasik 10 dakika, ve ardindan indirgenmis vakum altinda yaklasik 80 °C'de yaklasik 8 ila 12 saat kurutulur.

Kristalize Form 3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-amino-6-(5-Iloropirimidin-Z-il)-4,4a,5,7- tetrahidrOpirrolo [3 ,4-d][1 ,3]tiyazin-7a-il] -4-tloro fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karb0ksamidin hazirlanan bir numunesi, asagida Tablo 2”de açiklandigi gibi kirinim tepe noktalarina (2-teta degeri) sahip olan CuKa radyasyonu kullanilarak bir XRD paterniyle karakterize edilir.

Spesifik olarak, patern, 0.2 derecelik kirinim açilari için bir toleransla, 18.1°, 27.0°, ve 19.7°,den olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla tepe noktasiyla kombinasyon halinde15.7°,de bir tepe noktasi içerir.

Tablo 2: Örnek lc,nin kristalize Form 37ünün X-isini toz kirinim tepe noktalari.

Tepe noktasi Açi (2-Teta 0) +/- 0.2° Bagi] Yogunluk (en yogun tepe noktasinin %951) 1 15.7 1000 2 18.1 98.5 3 27.0 80.2 4 19.7 75.4 25.3 75.2 6 18.7 50.0 7 17.3 49.7 8 5.2 44.0 Tepe noktasi Açi (2-Teta °) +/- 0.2° Bagi] Yogunluk (en yogun tepe noktasinin %”si) 9 10.4 41.7 11.9 37.7 In vitro Analiz Prosedürleri: In vitro enzimatik ve hücresel analizler için, test bilesikleri, bir 10 mM stok çözeltisi elde etmek için DMSO içinde hazirlanir. Stok çözeltisi, in vitro enzimatik ve tam hücre analizlerini gerçeklestirineden önce 96-kuyucuklu yuvarlak tabanli bir plakada 10 mM ila 0.05 nM arasinda degisen nihai bilesik konsantrasyonlariyla bir on noktali seyreltme egrisini elde etmek için DMSO içinde seri sekilde seyreltilir.

In vitro proteaz inhibisvon analizleri: Insan BACEl ekspresyonu Insan BACE] (erisim sayisi: AF190725), RT-PCR ile toplam beyin cDNASSIndan klonlanir.

Amino asit dizisi #1 ila 460,a karsilik gelen nükleotid diziler, insan lgGi (FC) polipeptidi kodlayan cDNA,ya yerlestirilir (Vasser ve digerleri, Science, 286, 735-741 (1999)).

BACEl(1-460) ve insan Fcsnin bu füzyon proteini, yani huBACElzFc, pJB02 vektörüne yapilandirilir. Insan BACEl(1-460):Fc (huBACElzFc), HEK293 hücrelerinde geçici olarak eksprese edilir. Her bir yapinin 250 pg cDNA”si, Fugene 6 ile karistirilir ve 1 litre HEK293 hücrelerine ilave edilir. Transfeksiyondan dört gün sonra, sartli ortam, saflastirma için toplanir. huBACE1:Fc sailastirilmasi. huBACElzFc, Protein A kromatografisiyle saflastirilir. Enzim - 80 °C`de küçük sivi bölüntüler halinde muhafaza edilir.

BACEl FRET Analizi Test bilesiklerinin seri seyreltmeleri yukarida açiklandigi gibi hazirlanir. Bilesikler ayrica KH2P04 tamponunda 20X seyreltilir. Her bir seyreltmenin on pUsi, reaksiyon karisimini (25 uL 50 mM KH2P04, pH 4.6, 1 mM TRITON® X-lOO, l mg/mL Bovin Serum Albumin, ve uM FRET substrat) (Bakiniz, Yang, ve digerleri, J. Neurochemistry, 91(6) 1249-59 (2004)) içeren karsilik gelen bir düsük protein baglayici siyah plakanin A ila H sirasindaki her bir kuyucuga ilave edilir. Içerik, bir plaka çalkalayici üzerinde 10 dakika iyice karistirilir.

KH2P04 tamponu içinde iki yüz pM insan BACE1(l-460):Fc,nin (Bakiniz Vasser, ve digerleri, Science, 286, 735-741 (1999)) on bes uL,si, reaksiyonu baslatmak için substrat ve test bilesikleri içeren plakaya ilave edilir. Zaman 0°da karisimin RFUssu, bir plaka çalkalayici üzerinde kisaca karistirildiktan sonra eksitasyon dalga boyu 355 nm°de ve emisyon dalga boyu 460 nm°de kaydedilir. Reaksiyon plakasi, alüminyum folya ile kaplanir ve bir koyu nemlendirilmis firinda oda sicakliginda 16 ila 24 saat tutulur. Inkübasyon sonunda RFU, zaman Oida kullanilan ayni eksitasyon ve emisyon ayarlariyla kaydedilir. Zaman Oda ve inkübasyon sonunda RFU farki, bilesik muamelesi altinda BACEl aktivetisinin temsilcisidir.

RFU farklari, inhibitör konsantrasyonuna karsi çizilir ve bir egri, EC50 ve IC50 degerlerini elde etmek için bir dört-parametreli lojistik denklemiyle uydurulur. (Bakiniz Sinha, ve digerleri, Nature, 402, 537-540 (2000)). Örnek l”in bilesigi esas itibariyle yukarida açiklandigi gibi test edilir ve 0.615 nM (± 0.101, n=5) [Ortalama + SEM; SEM = ortalamanin standart hatasi] bir BACE] IC50”yi sergiler. Bu veriler, Örnek 1'in bilesiginin, saflastirilmis rekombinant BACEl enzim aktivitesini in vitro inhibe ettigini gösterir.

PDAPP Primer Nöron Analizi Bir dogrulayici tam hücre analizi ayrica PDAPP transjenik embriyonik farelerden olusturulan primer nöron kültürlerde baslatilir. Primer kortikal nöronlar, Einbriyonik Gün 16 PDAPP embriyolardan hazirlanir ve 96 kuyucuklu plakalarda (DMEM/F12 (121) ve %10 PES içinde x 104 hücre/kuyucuk) kültürlenir. [n vitro 2 gün sonra, kültür ortami, B27 takviyesi ve 2 uM (nihai) Ara-C (Sigma, C1768) içeren serum içermeyen DMEM/F 12 (111) ile ikame edilir.

In vitro gün 5”te, nöronlar, 37 °C”de 24 saat arzu edilen konsantrasyonda inhibitörlerin varliginda/yoklugunda (DMSO içinde seyreltilir) inkübe edilir. Inkübasyon sonunda, kosullu ortam, beta-sekretaz aktivitesinin kaniti için, Örnegin, Abeta peptidlerin analiziyle analiz edilir. Toplam Abeta peptidler (Abeta l-x), bir yakalama antikoru olarak monoklonal 266ve raporlama antikoru olarak biyotinlenmis 3D6 kullanilarak bir sandviç ELISA ile ölçülür.

Alternatif olarak, Abeta 1-40 ve Abeta 1-42 peptidler, bir sandviç ELISA, Abeta l-4O için bir yakalama antikoru olarak monoklonal 2G3, ve Abeta 1-42 için bir yakalama antikoru olarak monoklonal 21F12 kullanilarak Ölçülür. Hem Abeta 1-40 hem Abeta 1-42 ELISA raporlama antikoru olarak biyotinlenmis 3D6,y1 kullanir. Bilesik muamelesinden sonra kosullu ortamda salinan Abeta konsantrasyonu bu tür kosullar altinda BACEl aktivitesine karsilik gelir.

Abeta-düsürücü etki için EC50 ve 1C50 degerlerini elde etmek amaciyla 10 noktali inhibisyon egrisi çizilir ve dört parametreli lojistik denklemine uydurulur. Örnek 1°in bilesigi esas itibariyle yukarida açiklandigi gibi test edildi ve Abeta düsürücü etki için asagidaki aktiviteyi sergiledi: Tablo 3 Ö k PDAPP Nöron A-beta (1-40) ELISA IC50 PDAPP Nöron A-beta (1-42) ELISA IC50 rne (nM) (nM) 1 0.275 (± 0.176, n:4) 0.228 (± 0.244, n:3) Ortalama ± SEM; SEM = ortalamanin standart hatasi Bu veriler, Örnek 1°in bilesiginin inhibits tüm hücrelerde Abeta üretimini inhibe ettigini gösterir.

Beta-Sekretazin in vi'vo Inhibisvonu Fare, hint domuzu, köpek, ve maymun dahil olmak üzere çesitli hayvan modelleri, bilesik muamelesinin ardindan in vivo beta- sekretaz aktivitesinin inhibisyonunu taramak için kullanilabilir. Bu bulusta kullanilan hayvanlar vahsi tip, transjenik, veya gen nakavt hayvanlar olabilir. Örnegin, Games ve digerleri, Nature 373, 523-527 (1995),te açiklandigi gibi hazirlanan PDAPP hayvan modeli, ve diger transjenik olmayan veya gen nakavt hayvanlar, inhibitör bilesiklerinin varliginda Abeta ve sAPPbeta üretiminin in vz'vo inhibisyonunu analiz etmek için yararlidir. Genellikle, 2 ila 12 aylik PDAPP fareleri, gen nakavt fareler veya transjenik olmayan hayvanlara vehiküllerde, örnegin misir yagi, siklodekstran, fosfat tamponlari, PHARMASOLVE®, veya diger uygun vehiküllerde formüle edilen bilesik uygulanir. Bilesigin uygulanmasindan bir ila yirmidört saat sonra, hayvanlar Öldürülür, ve beyinler ayni zamanda serebrospinal sivi ve plazma, Abetas, C99, ve sAPP fragmentleri analizi için çikarilir. (Bakiniz May, ve digerleri, Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011)).

Standart in vi'vo farmakoloji çalismalari için, hayvanlar, bilesigin çesitli konsantrasyonlariyla dozlanir ve ayni zamanda dozlanan bir vehikülle muamele edilen kontrol grubuyla kiyaslanir.

Zaman zarfli çalimalarda, beyin dokusu, plazma, veya serebrospinal sivi bir taban hattini olusturmak için zaman 0”dan baslanarak seçilen hayvanlardan elde edilir. Bilesik veya uygun vehikül diger gruplara uygulanir ve dozlamadan sonra çesitli zamanlarda öldürülür. Beyin dokusu, plazma, veya serebrospinal sivi seçilen hayvanlardan elde edilir ve Abeta peptidler, sAPPbeta, ve diger APP fragmentleri dahil olmak üzere APP ayrilma ürünlerinin varligi için, örnegin, spesifik sandviç ELISA analizleriyle analiz edilir. Test süresinin sonunda, hayvanlar öldürülür ve beyin dokulari, plazma, veya serebrospinal sivi uygun olarak Abeta peptidleri, C99, ve sAPPbetanin varligi bakiinindan analiz edilir. APP transjenik hayvanlarin beyin dokulari ayrica bilesik muamelesinden sonra beta-amiloid plaklar miktari bakimindan analiz edilebilir. "Abeta l-x peptid" ile, burada kullanildigi haliyle ile, kalinti 1 ile baslayan ve kalinti 28Sde büyük bir C-ucuyla sonlanan Abeta türlerinin toplamina atifta bulunulmaktadir.

Bu, Abeta türlerinin çogunu tespit eder ve buna çogu kez "toplam Abeta" olarak atifta bulunulur.

Bir inhibitör bilesigin uygulandigi hayvanlar (PDAPP veya diger APP transjenik veya transjenik olmayan fareler) beyin dokulari, plazma veya serebrospinal sivilarda, vehikülle muamele edilen kontrollerle veya zaman sifir kontrolleriyle kiyaslandiginda, Abeta veya sAPPbeta indirgemesini ve beyin dokusunda beta amiloid plaklarin azalmasini gösterebilir. Örnek 1 için, bilesigin 0.3, 1, veya 3 mg/kg oral dozunun uygulanmasindan üç saat sonra, Abeta l-X peptid seviyeleri, vehikülle muamele edilen farelerle kiyaslandiginda sirasiyla beyin hipokampüste yaklasik olarak %31, %3 9, ve %61, ve beyin korteksinde yaklasik olarak %28,% 42, ve %64 indirilir.

BACE enzimine karsi Örnek 1'in aktivitesi in vitro verildiginde, bu Abeta düsürücü etkiler in vivo BACE inhibisyonuyla tutarlidir, ve ayrica N-[3-[(4aR,7aS)-2-amin0-6-(5-flor0pirimidin- 2-il)-4,4a,5 ,7-tetrahidr0pirr010[3,4-d] [l ,3]tiyazin-7a-il]-4-flor0-fenil]-5-metoksi-pirazin-Z- karboksamidin CNS penetrasyonunu göstermektedir.

Bu çalismalar, bulusun bilesiklerinin, BACE”yi inhibe ettigini ve dolayisiyla, Abeta seviyelerini indirgemede yararli oldugunu göstermektedir.

Claims (7)

ISTEMLER

1. Kristalize olan asagidaki Formüle sahip bir bilesik: F4( , N H3CO N

2. Istem l”e göre kristalize bilesik olup, özelligi, 0.2 derecelik kirinim açilari için bir toleransla, 18.6°, 19.3°, ve 26.7°”den olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla tepe noktasiyla kombinasyon halinde, 11.8°”lik kirinim açisi 2-tetada; X-isini kirinim spektrumunda önemli bir tepe noktasina sahip olmasidir.

3. Istem l”e göre kristalize bilesik olup, özelligi, 0.2 derecelik kirinim açilari için bir noktasiyla kombinasyon halinde, 15.7°7lik kirinim açisi 2-tetada; X-isini kirinim spektrumunda önemli bir tepe noktasina sahip olmasidir.

4. Istem 1 ila 3sün herhangi birine göre bir bilesik olup, terapide kullanim içindir.

5. Istem 1 ila 3°ün herhangi birine göre bir bilesik olup, Alzheimer hastaligi tedavisinde kullanim içindir.

6. Istem 1 ila 3sün herhangi birine göre bir bilesik olup, hafif bilissel bozuklugun Alzheimer hastaligina ilerlemesinin önlenmesinde kullanim içindir.

7. Istein 1 ila 3”ün herhangi birine göre bir bilesik ile bir veya daha fazla farmasötik olarak kabul edilebilen tasiyici, seyreltici veya eksipiyan içeren bir farmasötik bilesim.