TARIFNAME c5 SEKER IÇEREN BIR ALTLIK ÜZERINDE BIYOKÜTLENIN ÜRETILMESINE YÖNELIK MAYA SUSLARI Teknik alan: Mevcut bulus, biyokütle üretimi, özellikle maya üretimi alanEiIe ilgilidir. Bulus, en az bir C5 sekeri içeren bir altlllg üzerinde mayalar. üretilmesi ile ve daha özellikle Iignoselülozik malzemelerin hidrolizinden elde edilen bir aItIlEI üzerinde mayalar. üretilmesi ile ilgilidir. Bulus aynEtamanda ekmek yapIilÇlbiyokütIe üretimi, aroma üretimi, ikincil metabolitlerin üretimi, protein üretimi, RNA üretimi, etanol üretimi, bira yapIiEi/eya maya özütü üretimi gibi maya endüstrisi için uygulamalarda üretilen mayalarlîil kullanllîhasEile ilgilidir. Önceki teknik: Aerobik solunum süreci ile çogalma için mayalarIasag-kilere ihtiyaçlarEbqunmaktadlEI - karbon ve enerji kaynaglîilarak karbonlu bilesikler, - amonyum formunda indirgenmis azotlu bilesikler, bununla birlikte bazü mayalar proteinlerin ve nükleik asitlerin sentezi için organik veya oksitli bilesikleri (örnegin nitratlar gibi) kullanabilmektedir, - çesitli mineral elementleri, vitaminler ve mayalara göre degisen büyüme faktörleri. MayanI örnegin karbonlu altlilg olarak fruktoz surubu veya glukoz surubu ve azot ve fosfat kaynaklarßlarak amonyum ve fosfor tuzlarEbazIÇlbelirli bir bilesim ortamlîüzerinde üretilmesi durumunda kültür ortamü mineral tuzlarlÇl vitaminler ve oligoelementler oranlZltarafIan tamamlanmal-ve bu Üretimi karmas[lZlve pahallîlliale getirebilmektedir. Pancar ve seker kamlglEUan üretilen seker melaslarElseker (glukoz ve fruktoz), organik bilesikler ve mineral bilesiklerinden olusmaktadlEl Bu nedenle bu melaslar ekonomik ve teknik aç-an seçilen aItIIEJardlEve günümüzde mayalarlEl endüstriyel olarak üretimi için kullanilan ana ham maddedir. Bununla birlikte seker kamEü/e pancar melaslarIlEl, özellikle biyoetanol üretimi için masif kullanIilarlEla baglEblarak seyreklesmesi bu üretim türünü tehlikeye sokmaktadlE Melaslar taraflEldan saglanan sakkaroz ikameli yeni karbonlu altlÜZlarI bulunmasügerekmektedir. Bununla birlikte endüstriyel biyoetanol, özellikle de ikinci jenerasyon biyoetanol üretimi diger fermantasyon altllElarEl kaynaklar.. uygunlugunu açlga çllaarmaktadß Nitekim ikinci jenerasyon biyoetanol endüstrisi, bitkilerden türetilen Iignoselülozik malzemeler kullanmaktadlE Bitkisel olanlarI büyük çogunlugunu olusturan bu malzemeler selüloz, hemiselüloz ve Iinyinden olusmaktadlîl Hidrolizden sonra bu Iignoselülozik malzemeler C6 (6 karbon atomu) ve CS (5 karbon atomu) sekerlerinin bir karlgliîli IÜermektedir. Mayalar. tümü C6 sekerler metabolize edebilmektedir, buna karslHKl ve genel olarak C5 sekerler, Saccharomyces, özellikle Saccharomyces cerevßi'ae (Sc) cinsinde mayalar tarafIdan düsük oranda fermente edilebilmektedir, hatta hiç edilememektedir. Ikinci jenerasyon biyoetanol üretimine iliskin yakI zamandaki literatür, C5 sekerleri fermente etmeye uygun hale getirilmeleri için modifiye edilmis Sc mayalarElaçiElamaktadlEl Bu 2012/72793 numarallIpatent dokümanlarütlan bahsedilebilmektedir. Ksiloz dehidrojenaz (XDH) kodlayan bir genin sus genomuna dahil edilmesini içeren genetik modifikasyona yönelik bir yöntem ile elde edilen bir maya susunu açllZlamaktadE WO 2012/72793 numaralüatent dokümanEise bir kodlayan izomerazEkodlayan bir ekzojen geninin bir kopyasi. susun genomuna dahil edilmesini içeren bir yöntem ile elde edilmektedir; söz konusu gen tercihen C/ostri'd/'um phytofermentanStan ve bir dehidrojenaz ksilitolü kodlayan bir genin en az bir kopyasIan elde edilmektedir, söz konusu gen P/chi'a st/p/I/s'ten elde edilmektedir. Attfield ve ark.'a ("Use ofpopulation genetics to derive nonrecombinant Saccharomyces cerevisiae strains that grow using xylose as a sole carbon source", Fems Yeast research, makale tek karbon kaynagEblarak ksiloza sahip olan aerobik kosullarda çogalmaya uygun, rekombinant olmayan suslarI üretilmesini açlKlamaktadlEl Bu dokümanlarda açlElanan suslarI bir C5 sekeri içeren bir altlElZl üzerinde çogalabilmelerine ragmen, mevcut bulus sahipleri bir C5 sekerinden olusan veya bunu içeren bir altlllZJ üzerinde çogalma h-I düsük oranda kald[glIl3l'e herhangi bir durumda endüstriyel bir maya üretimi için uygun olmadlglllîirtaya koymustur. Üstelik bulus sahipleri, örnegin ekmek yapIi- iliskin fermantasyon mayalarEl/eya maya özütlerinin üretimi için tasarlanan mayalar, vs. gibi nihai endüstriyel kullanIi slüsIa, bu sekilde elde edilen mayalarI modifiye edilmemis kökenli suslardan elde edilen mayalarI etkinligine göre düsük bir etkinlik sergiledigini de ortaya koymustur. Dolaylglýla ekonomik ve endüstriyel kullanIi ile uyumlu maya üretimi ve verimlerine sahip, karbonlu altllKl olarak C6 sekerlerinin tamamen veya kismen degistirilmesine olanak saglayan mayalarIEl üretilmesine yönelik yeni suslara yönelik gerçek bir ihtiyaç duyulmaktadlEl Ayrlîla bu tür suslarI kültürü, endüstriyel olarak kullanllBiaIarßlEsIa ilgi çekici ve tatmin edici bir etkinlik sergileyen mayalar vermek zorundadlEl Bulusun kßla açüillamaslj Mevcut bulus, endüstriyel maya üretimi ile uyumlu bir çogalma hIZIle oran. sahip en az bir C5 seker içeren bir altllEl üzerinde çogalmaya uygun olan yeni Sc maya suslarlîile ilgilidir. Bulus aynElzamanda kültürün bir uygulama etkinligi, baska bir ifadeyle nihai endüstriyel kullanulara tatmin edici olan, baska bir ifadeyle referans niteliginde uygulama etkinliginin en az %80'ine, tercihen %95'ine esit ve daha tercihen %105'ine esit olan bir etkinlik sergileyen mayalar. elde edilmesine olanak sagladlglüreni suslar ile ilgilidir. Bulusun bir baska amaclîl ekmek yaplü biyokütle üretimi, aroma üretimi, ikincil metabolitlerin Üretimi, protein üretimi, RNA üretimi, etanol üretimi, bira yapIÇlsarap yapIi veya maya özütü üretimi araleUan seçilen endüstriyel bir uygulamada, bulus yöntemi ile elde edilen mayalarIve/veya yeni mayalarI kullanllfhasllü Sekillerin klEla açllillamaslîl Sekil 1, örnek 1'deki PCR analizinin sonucudur. Jelin sol klîinlEUa belirtilen degerler, baz çiftleri olarak belirtilen, boy isaretlerinin DNA fragmentlerinin boylari karsUJE] gelmektedir (km 1). K-ilar 2 ila 5 ise süsüla X1051, XIOSZ, Kontrol Mat a ve Kontrol Mat alfaya karsHJKIQelmektedir. Sekil 2, CP ortamIa 150 rpm'de (dakikada devir sayEDJve 30°C'de kültürleme süresine (saat cinsinden verilmistir) göre Log 10(DO .amma = 600 nm) cinsinden ifade edilen ortam bulanllîlfglll gelisimini gösteren bir grafiktir. Sekil 3, bir YFX ortamIda 150 rpm'de ve 30°C'de, saat cinsinden verilen kültürleme süresine göre 600 nm'lik bir dalga boyunda, DO cinsinden ifade edilen ortam bulanllZIEg'lII gelisimini gösteren bir grafiktir. Sekil 4, dakika cinsinden verilen süre içinde normal hamurda dakika bas. MI cinsinden verilen gaz salIi Iljgösteren bir grafiktir. Bulusun ayrItMllçElilamasE Mevcut bulus, en az bir C5 seker içeren bir altlllg üzerinde çogalmaya uygun olan yeni bir maya susunu amaçlamakta olup; bir ksiloz üzerine büyüme testini karsllâmaslîlle veya CP ortamlîiüzerinde büyüme testini karsllâyacak sekilde maksimal bir çogalma h- sahip olmaslZl ile karakterize edilmektedir. Ksiloz üzerinde büyüme testi: Bu test, 150 rpm'lik sabit karlSIlîilna altIa 30°'de 108 test edilecek sus hücreleri ile inoküle edilen YFX kültür ortamlüdan 50 mL oranlütla barlîidßn bir çözeltinin bulanllîllglll gelisiminin 600 nm'lik dalga boyuna sahip bir spektrofotometri ile zaman içinde takip edilmesinden qusmaktadlEI Test, 24 saatte Optik Yogunluk (DO) 2'nin üzerinde ve 48 saatte en az 3, tercihen en az 10 oldugu zaman karsüânmaktadlü YFX ortamüsagl belirlendigi sekildedir: YFX g/kg mL Yeterli miktarda damlîllüilglsu 1000 Ksiloz 70 EXL tipi J 5 Sitrik asit 11,4 Trisodik sitrat 13,5 ZnSO4(10,6 g/L) MgSO4 7H20 (400 g/L) Tiyamin Vit Bl(18,24 g/L) Piroksidin Vit Bö (5,28 g/L) Biyotin (1,76 g/L) + KOH Pantotenat (3,8 g/L) Nikotinik asit (4 g/L) Mezoinositol (50 g/L) Riboflavin (1 g/L) Para aminobenzoat (1,2 g/L) CP ortam üizerinde büyüme testi: Bu test, 10 g/kg EXL tipi J ve 10 g/kg baktopeptonun yanEtlEâi, 100 g/kg sakkaroz içeren 50 mL'Iik bir CP kültürü ortamIIbarIdEin bir çözeltinin bulanIKl[g]II gelisiminin 600 nm'lik bir dalga boyunda spektrofotometri ile zaman içinde takip edilmesinden olusmaktadlîj söz konusu ortam, 150 rpm'lik sabit karlgtlülna altIa 30°'de 108 test edilecek hücre ile inoküle edilmektedir. Test, DO gelisimi 3,5 ve 7,5 saat araleUa üssel oldugu zaman karsüânmaktadlî.! DO gelisimini temsil eden denklem DO& = DOÜ enüf't') formundadlü burada n bulunmaktadlEI AvantajllZbir yapllândlElna biçimine göre bulusa göre suslar hem ksiloz üzerinde büyüme testini hem de CP ortam [Ilizerinde büyüme testini karsllâmaktadE Bulusa göre maya susu Saccharomyces ve tercihen Saccharomyces cereV/'siae cinsinden seçilmektedir. Bulusa göre C5 seker ile 5 karbon atomu içeren bir 02 veya pentoz anlasliîhaktadIE C5 seker arabinoz, ksiloz ve bunlar. karlgElilarIlIilçeren grup içinden seçilmektedir. Tercihen C5 seker ksilozdur. Bulusa göre en az bir C5 seker içeren altllEl ayrlEla en az bir C6 seker, baska bir ifadeyle 6 karbon atomu barlEUlßn bir 02 veya heksoz içermektedir. C6 seker glukoz, fruktoz, galaktoz, mannoz arasIan seçilmektedir veya sakkaroz, meltoz, trehaloz veya izomaltoz ve bunlar. karlgüilarlîgibi disakkarit bozunmaledan elde edilmektedir. Tercihen bulus altligiÇlO,1 ve 2 arasIa bulun bir C5/C6 oranEile en az bir C5 seker ve en az bir C6 seker içermektedir. Bulusa göre suslarI çogalmaslîile elde edilen mayalar ekmek yapnübiyokütle üretimi, aroma üretimi, ikincil metabolitlerin üretimi, protein üretimi, etanol üretimi, bira yapIÇl sarap yapIi veya maya özütü üretimi arasIan seçilen endüstriyel uygulamalarda faydali] performanslar sergilemektedir. Baska bir ifadeyle bulusa göre suslarlEl kültürlenmesi ile elde edilen mayalar amaçlanan nihai endüstriyel kullannda etkilidir. Bu etkinlik mevcut basvuru doküman a "uygulama etkinligi" olarak adlandlElBiaktadlE Hedeflenen endüstriyel kullannlarüümü için, bulus suslarII kültürlenmesi ile elde edilen mayalarlEl kurutmada bozunmamasEl gerekmemektedir, yani mayalarI %20'den azü kurutmadan sonra inaktif'tir. Özel bir yapliând IEina biçimine göre bulusa göre suslar, asagIki kurutma testini karsilâyacak sekildedir: Kültürlemeden sonra elde edilen biyokütle, %18-22 oranli-atla kuru özüt ("maya kremaslî) içeren maya konsantre süspansiyonunun elde edilmesi için istege bagllîlolarak yilZlama asamalarII kullan [ifhasßuretiyle santrifüj ile ortamdan ayrHB1aktadlEl Bu süspansiyon, %28-34 oranlEtla kuru özüt içeren bir hamursu kütlenin ("preslenmis maya") elde edilmesi için Hltreleme ile bir dehidrasyon asamalela tabi tutulmaktadlü Bu kütle daha sonra aklgkan yatakIElbir kurutucu içinde slaak hava akEEile kurutulan, 0,2 ila 2 mm'lik çapa sahip olan ince seritlerin (eristeler) elde edilmesi için bobinaj islemine (kallîitan çekme) tabi tutulmaktadlB Kurutma kosullarElsiEiakllEl baremi), ürünün lelakllgllEllEl 50°'nin altlElda olmasEIçin kat bir sekilde kontrol edilmektedir. Ince eristeler formunda bulunan nihai kuru maya en az %95 oranIa kuru özüte sahiptir. Kuru mayanlEl hücrelerinin yasayabilirliginin iyilestirilmesi için mayaya (süspansiyon veya preslenmis maya) %0,2 ila 2 oranIa yükseklikte emülsifiye edici maddeler olarak koruma etkili katkElmaddeleri eklenebilmektedir ve bunlar arasIa sorbitan monostearat (MSS) slIZJUZla kullanllân standart bir katklînaddesidir. Suslar, kurutmadan sonra yasayan mayalarI say-I kurutmadan önce yasayan mayalarI en az %80'ine esit olmaslîdurumunda testi karsllâmaktadü Bir baska yapllândlîrlna biçimine göre bulusa göre sus, referans niteligindeki uygulama etkinliginin en az %80'ine esit, tercihen en az %95'ine esit ve daha tercihen en az %105'ine esit oranda bir uygulama etkinligine (EA) sahiptir. Mevcut bulus kapsamIa suslarI bir uygulama etkinligi, söz konusu mayalarI nihai endüstriyel kullan"a kültürleme ile elde edilen mayalarI tatmin edici bir etkinligi, baska bir ifadeyle bu kullan! için bir referans susunun kültürlenmesi ile elde edilen bir mayanI uygulama etkinliginin en az %90'- esit olan bir uygulama etkinligi (EA) anlasllîhaktadü Belirli bir kullanIi için referans susu, bu kullanIi Için klasik olarak kullanllân bir sustur. DolaylîlEa kültürün ekmek yapIiErlandüstrisi için tasarland[g]l:lbir sus için uygulama etkinligi fermantatif kuvvet olacaktlîl ve referans uygulama etkinligi ise no.I-2970 altIa Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonunda tarihinde depolanan susunki olacaktIEve 20 g undan 2 saatte sal-n 120 mL CO: oranIda olacaktlü Belirleme yöntemi, Burrows ve Harris (Journal of Institute of Brewing, cilt LXV, no .1, Ocak-Subat 25, 1959) fermentometresi yardIilýla gerçeklestirilen Rizograf olarak adlandlEllân yöntemdir. Biyokütlenin üretilmesi, "aerobik Fed Batch yöntemi" olarak adlandlElân, "yarlîlsürekli modda kültür" veya "yarElsürekli kültür" veya "yarlîtsürekli mod" olarak da adlandlElIân yöntem dogrultusunda gerçeklestirilmekte olup, burada kültür ortamlîltarafIan asamaIElolarak beslenen bir fermantör (veya reaktör) içinde bir kültürü belirtmektedir ancak hiçbir ortam hacmi çekilmemektedir. Bu tür bir yöntemde kültür hacminin fermantör içinde degiskendir (ve genellikle artmaktad IE), besleme debisi sabit veya degisken olabilmektedir. yayilanan, "Yeast Technology", Bölüm 6, 2.baskü1991, G. Reed ve T.W. Nagodawithana referans kitabHa açlEIanan kosullarda gerçeklestirilmektedir. Kültürün biyokütle üretimi için tasarlandlgElbir sus için uygulama etkinligi üretim verimi olacaktlEve referans uygulama etkinligi ise n0.995 altIia NCYC (National Collection of Yeast Cultures, Institute of Food Research, Norwich Research Park, Colney, Norwich, Birlesik KralllKl NR4 7UA)'de 26 Subat 1981 tarihinde depolanan susunki olacaktlElve kullanllân C6 sekerine göre %80 oranIia verim, yani akan g melas basi 80 g maya oranIIa olacaktlEl Test, üretilen kuru malzeme miktarII ölçülmesiyle gerçeklestirilecektir. Kültürün alkol üretimi için tasarland[g]ü3ir sus için uygulama etkinligi etanol üretimi verimi olacaktlElve referans uygulama etkinligi ise no.I-4071 altIa Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Eylül 2008 tarihinde depolanan susunki olacaktE ve kullanllân 9 C6 seker baslîila üretilen etanol 0,40 9 oranlEba olacak sekildedir. Etanol ve C6 seker miktarlarEHPLC veya enzimatik dozlama ile ölçülmektedir. Kültürün maya özütü üretimi için tasarlandlglEbir sus için uygulama etkinligi elde edilen maya özütünün azot oran belirlenmesi olacaktir-_lve referans uygulama etkinligi Sprmger 0203/0- MG-L referanslZlaltIia Bio Springer sirketi tarafian piyasaya sürülen maya özütününki olacaktlElve kuru maddeye göre %10 azot oranlEUa olacaktE Azot dozlama yanma yöntemi ile gerçeklestirilmektedir. Bir özel yapllândlülna biçimine göre sus, referans niteligindeki uygulama etkinliginin en az uygulama etkinligine (EA) sahiptir; uygulama etkinligi fermantatif kuvvet, biyokütle, aroma, ikincil metabolit, protein, etanol üretme verimini içeren gruptan seçilmektedir. Avantajllîlsekilde bulusa göre sus kurutma testini karsllâmaktadEl ve referans uygulama etkinliginin en az %80'ine esit olan bir uygulama etkinligi (EA) sergilemektedir. Bulus ayn üamanda asaglki yeni suslarßmaçlamaktadlîi - no.I-4670 altIa Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonunda (CNCM, Institut depolanan maya susu - no.I-4671 altütia Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonunda (CNCM, Institut depolanan maya susu. Bu suslar, ksiloz üzerinde büyüme ve CP ortamEüzerinde büyüme testlerinin her birisini karsllâyan ve slüsüla 20 g undan 2 saatte salt-Jan en az 100 mL oranlElda C02 oranlEtla bir fermantatif kuvvet sergileyen ekmek mayasÜsuslarIlEl Bu suslar aynElzamanda kurutma testini de karsllâmaktadlü Yukari açlEland[gll:l üzere bir maya susunun elde edilmesine yönelik bir yöntem açlElanmaktadlEl Bir birinci varyanta göre yöntem bir C5 sekeri metabolize etmeye uygun hale getirilmesi için bir referans uygulama etkinligi sergileyen bir susun (B) genetik modiûkasyonuna yönelik bir asama içermektedir. Bir ikinci varyanta göre yöntem, bir referans uygulama etkinligi sergileyen bir sus (B) ile bir C5 sekerini metabolize etmeye uygun hale getirilen bir susun (A) büyümesini içermektedir. Seçilen varyant hangisi olursa olsun burada açlElanan yöntem ksiloz üzerinde büyüme testi, CP ortamlîlizerinde büyüme testi ve kurutma testi araleUan seçilen testlerden en az birisini karsllâyan ve referans niteligindeki uygulama etkinliginin en az %80'ine esit, tercihen en az olan bir susun (B) seçilmesine olanak saglayan en az bir eleme asamasEiÇerebilmektedir. Eleme asamasülöntemin son asamasIZNarak gerçeklestirilebilmektedir. Bulusa göre bir C5 sekeri metabolize etme kapasitesi, anaerobik durumda bir C5 sekeri içeren bir ortamdan etanol üretme kapasitesine dönüsmektedir. Bir C5 sekerini metabolize etmeye uygun olan suslar genel olarak, pentoz yolunun her bir geninin deregüle edildigi genetik olarak modihye edilmis suslardlîi bir aldoz redüktazElkodlayan GRE.? geninin kopyalarEl silinmektedir; ksilülkinazEl kodlayan dogal XKSJ geni aslîll] eksprese edilmektedir ve yönlendirilmis bir gelisime tabi tutulmaktadß Bir C5 sekerini metabolize etmeye uygun olan bir maya, bir izomeraz ksilozu kodlayan bir ekzojen genin en az bir kopyasIElve tercihen P/'ch/'a st/p/I/s'ten elde edilen bir ksilotol dehidrojenazükodlayan bir ekzojen geninin en az bir kopyasIEiçeren bir maya susudur. Ksiloz izomeraz Üostrid/um, P/romyces, Bacteroid/er, Streptomyces, Haemoph/7us, Burkho/denia, Enteracoccus, Thermotoga, Fusobacter/um, GeobaC/'I/us, Arthrobactei; C/'ona, Physcom/Ire//a/ Ce//V/br/o, Ch/tihophaga, Saccharopo/yspora veya Sal/nibacte/den elde edilen bir gendir ve tercihen C/ostr/d/um phytofermentans veya P/romyces alt cinsinden elde edilen bir gendir. Üstelik bir C5 sekerini metabolize etmeye uygun olan suslar asag-ki modifikasyonlarlZl içermektedir: - bir aldoz redüktazElkodlayan bir genin, tercihen GRE3 geninin en az bir kopyasÇltercihen en az iki kopyasßilinmektedir, ve - bir ksilülkinazElkodlayan bir endojen geni, tercihen XKSI geni anerobiyoz ile veya herhangi bir karbon kaynagEtarafIan indüklenen katabolik represyon ile bastlElIhamlgl bir genin bir promotörünün kontrolü altlEla yerlestirilmektedir ve alkol fermantasyonu sßsia siddetli bir sekilde eksprese edilmektedir, - fosfat pentozlarlîyolunun oksidatif olmayan klîinIlEl, tercihen RPEI, RKJJ, T/(LJ ve TAU arasIan seçilen en az bir endojen geni ve özellikle tercih edilen sekilde bu genlerin tamamünerobiyoz ile veya herhangi bir karbon kaynagEltaraflEUan indüklenen katabolik represyon ile bastlEIlÜiamE bir genin bir promotörünün kontrolü ait. yerlestirilmektedir ve alkol fermantasyonu süsia siddetli bir sekilde ekprese edilmektedir. dokümanlarIa açilZlananIardan birisi olabilmektedir. Burada açlKianan hibridasyon yönteminin bir yapllândlElna biçimine göre söz konusu yöntem asaglElhki asamalarü'çermektedir: - bir C5 sekerini metabolize etmeye uygun olan bir susun (A) seçilmesi; - bir endüstriyel uygulama ile uyumlu performanslara sahip olan bir susun (B) seçilmesi; - susun (B) ayrllân bölümleri ile susun (A) ayrllân bölümünün hibridasyonu. Bir varyanta göre söz konusu hibridasyon yöntemi asaglki ek asamalarüçermektedir: - bir C5 sekerini metabolize etmeye uygun olan bir susun (A) seçilmesi; - bir ayrilân bölümün (X) elde edilmesi için söz konusu susun (A) sporlanmaslîl - bir endüstriyel uygulama ile uyumlu performanslara sahip olan bir susun (B) seçilmesi; - bir ayriiân bölümün (Y) elde edilmesi için söz konusu susun (B) sporlanmasiîl Sus (A), pentoz yolunun her bir geninin deregüle edildigi genetik olarak modifiye edilmis suslar arasiEkzlan seçilmektedir, aldoz redüktazlarIIJkodIayan genin kopyalarßilinmektedir ve yönlendirilmis bir gelisime tabi tutulmaktadiEl AçliZJamanI bir baska formuna göre bir C5 sekerini metabolize etmeye uygun olan bir sus (A), bir izomeraz ksiloz redüktaz enzimini kodlayan Pic/?fa st/p/'Ü's XR geninin en az bir kopyasIiZi/e tercihen ksilotol dehidrojenaz enzimini kodlayan bir Pich/'a sabit/'s XDH geninin en az bir kopyasIEteren bir sustur. AçilZlamanI bir baska formuna göre bir C5 sekerini metabolize etmeye uygun olan bir sus (A), bir izomeraz ksilozu kodlayan bir ekzojen genin en az bir kopyasIEi/e tercihen Pic/?fa st/p/I/s'ten elde edilen bir ksilotol dehidrojenazlîikodiayan bir ekzojen geninin en az bir kopyaslüberen bir maya susudur. Ksiloz izomeraz C/ostr/d/'um, P/'romyces, Bactéroi'des; Streptomyces, HaemophiYL/s, Burkho/der/Za, Enterococcus, Thermotoga, Fusobacteri'um, Geobaci//us A/Ihrobacter, C/'ona, Physcom/Ire/b, Ce//vibr/'o, Ch/t/hophaga, Saccharopolyspora veya Sal/nibacte/den elde edilen bir gendir ve tercihen C/ostr/dium phytofermentans veya Piromyces alt cinsinden elde edilen bir gendir. Üstelik bir C5 sekerini metabolize etmeye uygun olan suslar (A) asagIEIaki modifikasyonlarEI içermektedir: - bir aldoz redüktazlîkodlayan bir genin, tercihen GRE.? geninin en az bir kopyasütercihen en az iki kopyasßilinmektedir, ve - bir ksilülkinazükodlayan bir endojen geni, tercihen XKSJ geni anerobiyoz ile veya herhangi bir karbon kaynagEtaraf-an indüklenen katabolik represyon ile bastüßîamlgl bir genin bir promotörünün kontrolü ait. yerlestirilmektedir ve alkol fermantasyonu süsüda siddetli bir sekilde ekprese edilmektedir, - fosfat pentozlarülolunun oksidatif olmayan klâinIiEl, tercihen RPEJ, R/(II, T/(LJ ve TALI arasIan seçilen en az bir endojen geni ve özellikle tercih edilen sekilde bu genlerin tamamßnerobiyoz ile veya herhangi bir karbon kaynagEtaraflEUan indüklenen katabolik represyon ile bastlülüîamlgl bir genin bir promotörünün kontrolü altlEh yerlestirilmektedir ve alkol fermantasyonu süslöha siddetli bir sekilde ekprese edilmektedir. dokümanlarIa açiKIananIardan birisi olabilmektedir. Sus (A), susun elenmesine yönelik bir yöntem ile seçilebilmektedir. Yukari da açlKIandlglEl üzere sadece ksiloz üzerinde büyüme testi ve/veya CP ortamDüzerinde büyüme testini karsüâyan suslar seçilmektedir. Sus (B), susun elenmesine yönelik bir yöntem ile seçilebilmektedir. Sadece referans niteligindeki uygulama etkinliginin en az %80'ine esit, tercihen en az %95'ine esit ve daha tercihen en az %105'ine esit oranda bir uygulama etkinligine (EA) sahip olan suslar seçilecektir. Sus bir ekmek susu oldugu zaman seçilecek olan sus (B), 5 mL.2sa'1. g un'1 oranII üzerinde, tercihen 6 mL.Zsa'1. g un'1 oranII üzerinde ve daha tercihen 8 mL.25a`1. g un'1 oran üzerinde bir fermantatif kuwet sergileyecektir. Ayruân bölümlerin elde edilmesine yönelik asamalarEkuIIanan yöntem aynüamanda ayrüân bölümün (X) elenmesine yönelik bir asama ve/veya ayrllân bölümün (Y) elenmesine yönelik bir asama içerebilmektedir. Yukari da açHZlandlgllZilizere sadece ksiloz üzerinde büyüme testi ve/veya CP ortamEüzerinde büyüme testini karsHâyan ayrllân bölümler (X) seçilmektedir. Sadece referans niteligindeki uygulama etkinliginin en az %80'ine esit, tercihen en az olan ayrüân bölümler (Y) seçilecektir. Tercih edilen sekilde ayrllân bölüm (X), no.I-4672 ve I-4673 altüda Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonunda (CNCM, Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15) 23 Agustos 2012 tarihinde depolanan suslar aras-an seçilmektedir ve ayrllân bölüm (Y) ise ve no.I-4669 aItIia Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonunda (CNCM, depolanan maya susudur. Bulus ayrlîa yukari açiEiandEglEiüzere bir sustan, en az bir C5 sekeri içeren bir altlliZi üzerinde aerobik "Fed Batch" maya üretimine yönelik bir yöntemi amaçlamaktadlE Aerobik sürekli mod" anlaslliiakta olup, burada kültür ortamEtarafIdan asamalüblarak beslenen bir fermantör (veya reaktör) içinde bir kültürü belirtmektedir ancak hiçbir ortam hacmi çekilmemektedir. Bu tür bir yöntemde kültür hacminin fermantör içinde degiskendir (ve genellikle artmaktadlß, besleme debisi sabit veya degisken olabilmektedir. yaynlanan, "Yeast Technology", Bölüm 6, 2.baskü1991, G. Reed ve T.W. Nagodawithana referans kitablüha açlk`lanan kosullarda gerçeklestirilmektedir. Bulusa göre çogalma oranElgeneIlikle 1,16'dlE Genel bir sekilde bulus suslarElile C5 sekerlerinin kullanIi oranEbu suslarI dogalela baglIEve bazEkosullarda %100'e kadar degisebilmektedir. Ekmek yapIiIa nihai bir uygulama için tasarlanan bir sus, çogalmasü süsIa, fermantasyon altllglîl içinde bulunan C5 sekerlerini %50 oran. kadar kullanabilmektedir, ayrü etanol üretiminde uygulama için tasarlanan bir sus C5 sekerini Bulusun bir baska amacEl ekmek yaplü biyokütle üretimi, aroma üretimi, ikincil metabolitlerin üretimi, protein üretimi, RNA üretimi, etanol üretimi, bira yapIiÜ/eya maya özütü üretimi arasIan seçilen en az bir endüstriyel uygulamada elde edilen mayalarI kullanlEhasIlB Asag ki örnekler kapsamüklglîllamaks- bulusu göstermektedir. Örnekler: Örnek 1: Ayrülin bölüm (X)'in preparasyonu CNCM I-4538 susunun ayrllân bölümlerinin elde edilmesi amaclîla bu sus, 10 g/kg Maya susu (EXL) tipi J100, 10 g/kg pepton ve 20 g/kg glukoz bar-ün YPG ortam a 24 saat boyunca yetistirilmistir. Elde edilen hücrelerin süspansiyonu daha sonra 20 g/kg aragoz ve 7,5 g/kg sodyum asetattan olusan bir SAA ortamIEbarlEblün bir Petri kabDLizerine aktarilBilStB °C'de 5 gün inkübasyondan sonra tetratlar bir mikromanipülatör yardIilýla parçalara ayrlßilgtlü Bu sekilde hazlîlbnan kutular 30°C'de 48 saat inkübe edilmektedir. Elde edilen ayrllân bölümlerin kullanIilEla iliskin sIlEiardan birisi cinsiyet isareti ile ilgilidir. Nitekim ksilozu fermente edebilen suslarI moleküler biyolojisi ile olusum süslüha bu yol için esas olan bazlîgenler, Mat alfaya genetik olarak bagllîrblan bir Iokus içine girmistir` Bu nokta, CNCM I-4538 referanstElaltIa 5 Ekim 2011 tarihinde Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonunda (CNCM, Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15) depolanan sustan elde edilen ve ksilozu metabolize edebilen ayrllân bölümlerin tümünün Mat alfa isaretidir. Bu klîlfliamanl kaldßlüiasüamaclîla bu ayrilân bölümlerin cinsiyet isareti degistirilmistir. Bunun için dogada mevcut olan bir süreci kullandlKl Nitekim bazElvahsi mayalar, haploid durumunda olduklarEizaman cinsiyet isaretlerini degistirebilmektedir. Bu süreç rekombinaz HO eylemi alt-a gerçeklestirilmektedir. Bu, CNCM I-4538 referansßltia CNCM'de depolanan sus içinde fonksiyonel degildir ve dolaylîlýla bu sus içinde artllZi islev görmemektedir. Ilgili ayrilân bölümlerin içine, fonksiyonel HO rekombinazEkodlayan bir gen barlEtlEan bir replikatif plazmidi soktuk. Bu yöntem 1991 tarihinde yay-ana Herskowitz ve Jensen'I çalismalarim dayanmaktadiEI Bahsi geçen plazmit tarafIan tasiEian HO geni, galaktoz ile indüklenen bir promotörün bagnlimjiiîi alt. yerlestirilmistir. Bu sekilde dönüstürülen ayrllân bölümler, 10 g/kg EXL tipi J100, 10 g/kg Pepton ve 20 g/kg galaktoz barlEtlEan bir ortam içinde 16 saat boyunca inkübe edilmistir. Hücreler daha sonra 10 g/kg EXL tipi J100, 20 g/kg agaroz ve 20 g/kg glukoz barIßn bir katElortam üzerine serilmektedir. KIonIarI elde edilmesinden sonra cinsel isaretteki degisim, cinsel isaretin ekspresyonu Iokusu üzerinde bir PCR gerçeklestirilmesi suretiyle dogrulanmlgtiü Bu reaksiyon, her bir potansiyel ayrllân bölümün genomik DNA'sII matris olarak kullanllüiaslîl suretiyle gerçeklestirilmektedir. Oligonükletoidler bir yandan mayanI kromozom III'ü üzerinde eksprese edilen MAT Iokusuna has bir primer (primer Matl AGTCACATCAAGATCG'ITI'ATGG) ve birisi Mat alfaya has (primer Mat2 GCACGGAATATGGGACTACTI'CG) ve digeri Mat a'ya has olmak üzere (primer Mat3 : ACT CCAC'I'I'CAAGTAA-GAG'ITI'G) diger iki primerdir. Mayalar. Mat a genotipi, %0,8 oranlEUa agaroz jeli üzerinde saptanabilir 544 baz çiftinin amplikonunun varl[giüle karakterize edilmektedir. Elde edilen sonuçlar sekil 1'de verilmistir. Örnek 2: Ayrilân bölümlerin (Y) preparasyonu ve ayrüîm bölümlerin hibridasyondan sonra yüksek bir fermantatif kuvvetini aktarma kapasitesinin dog rulanmasü Ayrlßn bölümün preparasyonu: n0.I-4669 altlîakla CNCM'de depolanan ayrllân bölüm, n0.I- 2970 aItIa CNCM'de depolanan ekmek susundan hazlîllanmlgtlîl Sonraki preparasyon modu örnek 1'de açlKIanan ile özdestir. aItIda CNCM'de depolanan ekmek suslarIan elde edilen ayrllân bölümlerin hibridasyonu ile haz Elanmaktadlü Asag-ki tabloda verilen Normal Hamur (PN) ve 2 g Sekerli Hamur (PS 29) üzerinde fermantatif kuvvetler, ayrIEn bölüm I-4669'un hibridasyondan sonra yüksek bir fermantatif kuvvet aktarabildigini göstermektedir. kuvvet Zg Örnek 3: hibridasyon Hazlîlbnan farklljyrllân bölümler, asaglElhki tabloda verildigi üzere çaprazlanmlSIlB Tablo 2: Gerçeklestirilen çaprazlamalar X1054 HCS-G HCS-H X10$5 HCS-I HCS-J Mat a X1056 HCS-K HCS-L PS316 HCS-A HCS-C HCS-B P358 HCS-D HCS-F HCS-E Örnek 4: Eleme Yukar-ki örnek 3'te elde edilen hibrit suslar, asaglfllaki farkllîlemelere tabi tutulmustur. 1/ Ksiloz üzerinde büyüme testi Bu birinci test, karbon kaynaglîblarak ksilozun kullanllüiaslîlsuretiyle çogalma kapasitesine iliskindir. Karbon kaynagüolarak ksilozun kullanllüiaslîlsuretiyle suslarI çogalma kapasitesinin belirlenmesi amaclýla, bilesimin yukarlâla verilen bilesim oldugu 50 mL YFX ortamIda 2x106 hücre/mL yüksekliginde inoküle edilmistir ve 150 rpm'lik karlStEna altia 30°C'de tutulmustur. Biyokütlenin gelisimi, 600 nm'lik bir dalga boyunda spektrofotometre ile ölçülen bulanllZllglE izlenmesi ile belirlenmistir. Bu izlemenin sonucu sekil 2'de verilmistir. YFX ortamEL'izerinde biyokütlenin gelisimi 4 susun seçilmesine olanak saglamlgtlEl Karbon kaynagÜJIarak ksiloz kullanmaya yönelik iyi bir kapasite sergileyen HCS-A, HCS-B, HCS-C ve HCS-D hibritleri söz konusudur. Üstelik bu suslar, hlîllîla ksiloz yükü alabilmektedir, burada HCS-K ve HCS-L hibritleri, ksiloz üzerinde büyümelerinin baslatllüiasüçin gecikme nedeniyle tutulmamlgtß 2/ CP ortam [üzerinde büyüme testi Bir baska önemli kriter ise hücrelerin maksimal çogalma h-E Bunun belirlenmesi için mayalar, mL bas. 2 X 106 yüksekliginde 50 ml CP ortamIEUa inoküle edilmistir. Bu ortam, g/kg EXL ve 10 g/kg baktopepton, ayrlîh 100 g/kg sakkaroz barIlEtltglEliçin çok zengindir. BulanllZHlZIgeIisimi 600 nm spektrofotometrisi ile ölçülmüstür. Daha sonra biyokütle üssel sekilde artt[gll3ürecin tanIilanmaslZsuretiyle maksimal çogalma h-lEl analiz edilmesi söz konusudur. Sekil 3, logaritmik ölçek dogrultusunda ve kültürleme süresine göre bulanüîlllg gelisimini göstermektedir. 3,5 ve 7,5 saat araleUa bulunan alanda bulanlEIllg gelisimi üsseldir ve bu, bir logaritmik ölçegi kullanan grafigimiz üzerindeki dogrusal görünüm ile dogrulanmaktadß Çogalma hlîIIJ zamana göre 600 nm'lik bulanIEllKl gelisimi türevi olarak belirlenmistir. Bununla birlikte farkIEl düz hatlar paralel gibi göründügü için, çogalma hlîlarII da, bu ortamda NCYC 995 referansü aItIda NCYC'de depolanan susun ve CNCM I-4538 referansEbltIa CNCM'de depolanan susunkiler ile karsllâstlülâbilir olarak görüldügü anlaslEhaktadlE 3/ Bir sahte fedbatch sonrasIda fermantatif kuvvet testi HCS-B ve HCS-C Hibritleri (I-4670 ve I-4671 suslarlIl karbon kaynagüolarak rafinozun kullanilBwaslleuretiyle yayHBilStlE Bu triholosidin kullanlliiasüsekerin asamallZblarak mayaya iletilmesine olanak saglamaktadlEl Nitekim mayalarI invertazlZlle yavas bir sekilde hidrolize edilmektedir. SMART System5TM (CEM sirketi ABD) aparatII yardüilýla hacim birim bas- mayanI kuru madde miktarII ölçülmesi suretiyle farklEüretimlerin biyokütle miktarlar.. standardize edilmesinden sonra, bir rizograf fermentometre yardnlýla gaz salIIiEbnaliz edilmistir. Sekil 4'de gösterilen, normal hamur üzerinde gerçeklestirilen bir test için gaz salIIi gelisimi asag-ki sekilde gerçeklestirilmistir: 0 Bir maya süspansiyonu su sekilde hazlEllanmlStlB test edilecek mayanI 1 9 kuru maddesine es deger miktar süspansiyon haline getirilmistir ve 27g/L NaCl ve 4g/L (NH4)ZSO4'e 100 ml çözeltinin eklenmesi ile tamamlanmlgtlEI i Yukarlîlhki süspansiyondan 15 ml (ya da mayanI kuru maddesinden 150 mg), 15 dakika boyunca 30°C'lik bir slîiaklüîta dengelenmektedir. . Daha önceden 30°C'de bir gece boyunca dengelenmis olan 20 g un bu süspansiyona eklenmektedir. Karlglm 35 saniyelik bir süre boyunca homojenize edilmektedir. - Olusturulan hamur, 30°C'de yerlestirilmis olan hermetik sekilde kapatllBiE bir kap içinde inkübe edilmektedir. Gaz salIIiü(760 mm Hg'nI altIa olarak belirtilmektedir), toplamda 120 dakikallKlbir süre boyunca kaydedilmektedir. Sekerli Hamurda (PS) gerçeklestirilen bir test için gaz saIIIiIIIar ölçülmesine yönelik protokol, sekerin (burada 29) diger kuru içerikler ile eklenmemesi dElEUa PN için Elde edilen proûller katabolik represyonun, CNCM I-4538 referansü alta CNCM'de depolanan sus içinde büyük miktarda oldugunu ortaya koymaktadlElve bu, "maltoz oyugu" olarak adlandlîllân büyük diauksi olgusunu indüklemektedir ve ekmek yaplElJygulamalarEl Için kaliteyi düsürmektedir. Buna karsUJKI HCS-A, B, C ve D hibritlerinin, n0.NCYC 995 altIa NCYC'de depolanan sustan daha yavas olmaleb ragmen, ilgi çekici profiller sergiledigi fark edilmistir. HCS-B ve HCS-C Hibritleri (I-4670 ve 1-4671 suslarDîldaha iyi sonuçlar vermistir. No.I-4670 ve no.I-4671 aItIa depolanan suslarI her birisi, ksiloz üzerinde büyüme testine ve CP ortamEüzerinde büyüme testine tabi tutulmustur ve bunlar. fermantatif kuvvetleri ölçülmüstür. Elde edilen sonuçlar asag-ki tabloda verilmistir: Ksiloz üzerindeki büyüme (çogalma hlZDJ 3,5 saat/ jenerasyon 6 saat / jenerasyon CP ortamübüyümesi (çogalma hiZDJ 0.71 0.66 Fermantatif kuwet 139 143 batch yöntemi dogrultusunda çogalmlSIE Kurutmadan sonra elde edilen mayalarI fermantatif kuvvetleri, Normal Hamur (PN) testine göre ve 2 gram Sekerli Hamur (PSZg) testine göre ölçülmüstür. Elde edilen sonuçlar asagida verilmistir: PN fermantatif kuvveti 118 119 120 PSZg fermantatif kuvveti 114 116 107 TR TR TR TR TR TR TR TR