TARIFNAME YENIDEN SOGURULABILIR, ÇAPRAZ BAGLI, YAPISI STABIL MEMBRAN Bulus, aglîl boslugunda kullanIi için yeni bir yeniden sogurulabilir, çapraz baglüyaplâßtabil membran, bu membran. haziEllanmasEiçin bir islem ve bunun, bir insan veya hayvanda dis kemigi kusuru içermeyen bir alanda kemik olusumu, kemik rejenerasyonu, kemik onarIiEl ve/veya kemik degisiminin desteklenmesi için implant olarak kullanIEîle ilgilidir. Örnegin, üst çene kemigi veya alt çene kemiginde yatay veya dikey artlgarda oldugu gibi, kemik olusumuyla kemik kusurlarüiçermeyen alanlarI yeniden olusturulmasElamacEla, kusurun mekanik stabilizasyonu gerekmektedir (Bendkowski 2005 "Space to Grow" The Am. 22(3): 353-68). Gerçekten, aglîldokularüçigneme, yutkunma, dil hareketi, konusma, dis hareketi ve ortodontik islem süsü-Ma karmaslEl mekanik kuwetlere tabi tutulmaktadlB Özellikle, cerrahi islemlerin ardiEUan yara iyilesmesi süslütla, iç ve dlSl kuvvetler olusabilmektedir, yenileyici cihaz ve yeni olusturulmus doku üzerinde balelç, kayma kuvvetleri ve egilme momentleri olusturmaktadlü Bu kuwetlere dayanan bir yaplîlîlstabil membran, bu mekanik stabilizasyona neden olmak için bir kullaniglüraçtlîl Bu amaçla, bir ikinci ameliyat süislîilda kemik rejenerasyonundan sonra kaldEllIhasügereken Ti-gözcükleri, Ti-plaka veya Ti-güçlendirilmis PTFE yaplîEbtabil membranlarI kullan-@El bilinmektedir. Bir ticari olarak mevcut olan Ti-güçlendirilmis yapEBtabil bir membranI bir örnegi, Osteogenics taraflian pazarlanan Cytoplast® membrandlü Ancak, genisletilmis Ti- güçlendirilmis membranlarü kullanIIglia açllBIalarI veya diger komplikasyonlar. olusumunun yüksek oldugu bildirilmistir (Strietzel 2001 Mund Kiefer Gesich-tschir. 5(1): 28- (8 Suppl): 203-15). Güçlendirilmemis PTFE membranlarÇl1996'da yeniden sogurulabilir kolajen membranlarII uygulanmasIan önce yaygI bir sekilde kullanilhlgtlü ancak kolajen membranlarI uygulanmasIan sonra çok hEIEibir sekilde yok olmustur. Bir ikinci ameliyatta bir yaplîßtabil membran veya ag. ortadan kald lEIIIBiaSIBJI gerekliliginin önlenmesi için, yeniden sogurulabilir yaplglîlstabil bir membran ilgili çekicidir. Esasen, PLA (polilaktik asit) veya PLGA (polilaktik ko-glikolik asit)'dan yapllân birçok yeniden sogurulabilir yaplîüstabil membran veya ag yapüaçüîlanmaktadlîl Örnekler, özellikle (1) KLS Martin'den dezavantajlarÇl/'n w'i/o hidrolitik bozunmalarElsBisHa, doku tahrisine ve bozulmus bir yara iyilesmesinin histolojik isaretlerine neden olan Iaktik ve/veya glikolik asit salmalarIlEI(Coonts, PLGA/PLA ile ilgili yara iyilesmesi sorunlarII üstesinden gelmek için, hastadan otolog kemik bloklarII ve örnegin Geistlich Bio-Oss® Block (Geistlich Pharma A.G.) veya Puros® Allograft Block (RTI Surgical Inc.) gibi kismen veya tümüyle arlfllBilgl kemik bloklarII kullanlüyaygl bir sekilde kabul edilmektedir. Otolog kemik bloklarü daha fazla agrüla neden olarak bir ikinci sahadan aIlEmalarüjezavantajIEla sahiptir (Esposito, Grusovin ve ark. Genellikle, ksenojenik kemik grefti parçacllglarlýla birlikte ameliyat süsü-Jin aI-n otolog kemik klEIEtllârII kullannII saglanmasüiçin, sözde kemik kalkanlIlteknigi, alt çene kemiginden otolog kortikal kemigi kullanarak gelistirilmistir (Khoury, Hadi ve ark. 2007 "Bone Augmentation in Oral Implantology", Londra, Quintessence). Bu islemin dezavantajlarüson derece teknige duyarIEI olmaslîl ve ikinci sahada hastalElZla ve daha fazla agrlîlile iliskilendirilmesidir. Ayrlîla, kemik kalkanlarÇlyalnlîta yan olarak uygulanmaktadlEl dolaylîlýla, kusurun koronal görünümünden hiçbir mekanik koruma verilmemektedir. "Kemik kalkanlZI terimi, PLA/PLGA membranlarEliIe birlikte kismen demineralize edilmis kortikal kemik kalkanII tanlEllBiasEIçin kullanllßîaktadß(Tecnoss'tan yarEl/umusak ve yumusak Lamina Osteobiol®). Bu demineralize kemik kalkanII dezavantajlarüegik kemik kalkanlarII her zaman sabitlenmesi gerektigi, örnegin Ti-güçlendirilmis PTFE membranlarlEb klýbsla göreceli olarak kaII olmalarEl/e kemik kusurunun koronal görünümünde kavisli kenarlarla yalnlîta yuvarlak sekillerde olmalarIE Dis hekimleri için, ç-II koronal görünümünde 6-8 mm genisliginde bir plaka daha çok tercih edilmektedir (Wang ve AI-Shammari 2002 Int. J. Periodontics Restorative Dent. 22(4): 335-43). Sorunsuz iyilesme ve sekil stabilitesinin birlestirilmesi için bir deneme, dondurarak kurutma ve 100 ila 140°C aralehla Eltîlna ile bir kalir-:ta %5 ila 25'lik etanoI/suda bir kolajen asilII-an hazlîlianan, US-8353967-BZ numaralElPatent DokümanIda açilZIanan yeniden sogurulabilir yapiêlîlstabil kolajen membranIlE Bu tür bir zar, Osseous Technologies of America tarafIan üretilmektedir ve Zimmer taraflEtlan "Zimmer CurV Preshaped Collagen Membrane" ticarlZbdMa pazarlanmaktadlü Ticari membran, zayitîlsekil stabilitesine ve tuz çözeltisinde inkübasyondan sonra yaklasllZl 2,3 mm'ye yükselen yaklasiIZl 1,5 mm'lik bir kaliEIigb sahiptir; bu, yüksek bir açilBia oran üiskine neden olabilmektedir. Özetle, dolaylgEa mevcut çözümler, dis hekimleri veya hastalar için tümüyle tatmin edici degildir. Bir ikinci ameliyat gereklidir ve/veya yüksek bir sorunlu yara iyilesmesi riski bulunmaktadlü Yüksek bir sorunlu yara iyilesmesi riskiyle iliskili olmayan çözümler ya yaplEEl stabil membranlar degildir ya bir ikinci ameliyat gerektirmektedir ya da baska dezavantajlara sahiptir. üretilmesini içeren bir islemi açiElamaktadlEla) kolajen içeren bir jelin kontrollü bir miktarIIZI gözenekli olmayan kolajen bazIEmalzemenin bir yaplgma yüzeyine uygulayarak gözenekli olmayan bir kolajen bazllînhalzeme ile gözenekli bir kolajen bazlünalzemenin birlestirilmesi ve malzemeler araslîidaki ara yüzde gözenekli malzemenin bir bölümünün kElnen hidratlanmasEl için yaplglna yüzeyine uygulanan jel ile gözenekli kolajen bazlünalzemenin bir yüzeyinin temas ettirilmesi; b) malzemelerin birbirine baglanmasEiçin jelin kurutulmasÜ/e c) baglaylEEl tabakalarda kolajenlerin çapraz baglanmaslîl Elde edilen üretilen biyomalzeme, mineralize edilebilen ([0042], [0048]) bir gözenekli kolajen bazlünalzemeyi ve mekanik olarak güçlü bir gözenekli olmayan kolajen bazIEmalzemeyi birlestirmektedir, dolaylîlsîla hem gözeneklilige hem de mekanik dayanIia sahip olan, örnegin leJStIEilna ve gerilme kuwetlerine dayanabilen, yük taslýlan dokular. yeniden olusturulmasEiçin (özellikle menüsküs, eklem kiEIElagütendon ve bag doku) bir iskele saglamaktadß Birlestirilmis biyomalzemenin egilme momentlerine dayanilZIiEigElIeya mineralize gözenekli kolajen bazlülnalzeme bilesimi hakkIa hiçbir sey açllZlanmamaktadlEl üretilmesinde, çapraz baglanmasElöncesinde kolajenin gerilmesinin, mekanik dayanIilElü özellikle son çekme dayaniIIZI(UTS), sertlik ve esneklik katsay-D(Young katsayELIl arttEl [gilljçiElamaktad lEl(bakIlZlözellikle [0109], [0110]). membran. çapraz baglanmasi. öncesinde, gerilme dayanIiüve sertligini arttlîrliigiIEl açilZlamaktadlEl Shu-Hua Teng ve ark.: "Three-layered membranes of collagen/hydroxyapatite and chitosan for guided bone regeneration", JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH. PART B: APPLIED BIOMATERIALS, cilt 87B, no. 1, 1 bir üst ve bir alt mukozalarIEI/e kitosandan yapilân bir orta tabakayEilçeren sogurulabilir bir üç tabakalEtandviç yaleÜnembranllçlElamaktadlEl Söz konusu membran, Kllâvuzlu Kemik Rejenerasyonu için kullanilüiaktadE Mevcut bulusun amacÇlyukarIki dezavantajlara sahip olmayan, kemik kusuru içermeyen bir alanda, özellikle üst çenede veya alt çenede yatay veya dikey artlglarda, kemik olusumu, kemik rejenerasyonu, kemik onarIilIlve/veya kemik degisimini destekleyecek nitelikte olan baleç, kayma kuvvetleri ve egilme momentlerine dayanabilen, aglîl boslugunda kullanIi için yeniden sogurulabilir sekildeki bir degismez membran saglanmalel Amaç, ekli istemlerde açlKIandigiügibi bulusla elde edilmektedir. Bulus, esnek önceden gerilmis kolajen malzemesinden iki tabaka aras. yerlestirilen, kolajen malzemenin 1 aglEllilZI ölçüsü için inorganik seramikten 1,5 ila 3,5 aglîllilZJ ölçüsü içeren kolajen malzemenin ve inorganik seramik parçacilZlarI bir kompozit tabakasIElçeren agEl boslugu içerisinde kullan! için yeniden sogurulabilir bir çapraz bagllîlyaplglîlstabil membran saglamaktadß kolajen malzeme, agEllilZl'ag IEEE cinsinden %50 ila 100 kolajen ve aglEllilgVaglElllla cinsinden %0 ila 50 elastin içermektedir. aglEllilZl'agüliEl cinsinden %0 ila 50 elastin içeren bir kolajen baleZImalzeme anlam. gelmektedir. Elastin içerigi burada, hidroliz ve RP-HPLC içeren bilinen bir yöntemin degistirilmesine göre desmozin/iyodesmozin belirlenmesi ile ölçülmektedir (bakIlîI örnegin, Guida E. ve ark. 1990 Development and validation of a high performance chromatography method for the determination of desmosines in tissues iri Journal of Chromatography or Rodriguqe P 2008 Quantification of Mouse Lung Elastin During Prenatal Development in The Open Respiratory Medicine Journal). Kuru elastinin desmozin/izo-desmozin içeriginin belirlenmesi için, kolajen malzemnin elastini, 1976'da Starcher ve Galione taraflan açlElandlgEgibi (Purification and Comparison of Elastin from Different Animal Species In Analytical Biochemistry) elastin izolasyon islemlerine tabi tutulmaktadlE Bu kolajen malzeme uygun bir sekilde, kolajen ve elastinden bu oranlarda içeren dogal kökenli dokulardan türetilmektedir. Bu dokularlEl örnekleri, omurgalü özellikle memeli (örnegin, domuz, slgllü at, koyun, keçi, tavsan) periton veya perikardiyum membranD plasenta membranlZlince baglEtak alt mukozaslîlSIS), cilt, sert membran, bag doku, tendon, diyafram (torasik diyafram), omentum, kaslarI veya organlar. fasyasIlZlçermektedir. Bu dokular tercihen, domuz, slglElve attlEl Ilgi çekici bir doku, bir domuz, sEgîlßveya at periton membranIlB Genellikle kolajen aglEllllZlEblarak, tip I kolajen, tip III kolajen veya bunlari bir karlglEliIE Kolajen aynüamanda, tip II, tip IV, tip VI veya tip VIII'nin bir oranIEl/eya bunlarI veya herhangi bir kolajen tipinin herhangi bir kombinasyonunu içerebilmektedir. Tercihen, kolajen malzeme, aglElllKl'aglElllKl cinsinden %70 ila 90 kolajen ve aglHlllZl'aglEllUZl cinsinden %30 ila 10 elastin içermektedir. Bu tür bir kolajen malzemenin hazlEllanmasEilçin uygun bir baslangümalzemesinin bir örnegi, EP-Bl-1676592 numaralElpatent doküman-n "Örnek"inde açüîlanan benzer bir islemle hazlEllanan domuz, slglEveya at periton veya perikardiyumundan bir kolajen membran veya bu tür bir islemle domuz peritonundan hazmbnan Geistlich Bio-Gide® membran IEl(Geistlich Pharma A.G., Isviçre'den elde edilebilir). Tercihen kolajen malzeme, bir domuz, slglîl veya at peritonundan veya perikardiyum membranIan, ince baglßak mukozasEaSIS) veya kas fasyasIan türetilmektedir. Kolajen malzeme genel olarak ve tercihen, ya bir dogal lif yaplEEile veya kesik kolajen lifleri Ancak, yeterli biyo- uyumluluga ve yeniden sogurulabilirlige sahip olan moleküler kolajen veya çapraz bagllîibarçalardan yeniden olusturulan Iifçikler gibi, lifli olmayan kolajen malzeme de, kolajen malzeme ve inorganik seramik parçacllZlarI kompozit tabakasIa veya kolajen malzemenin, esneklik katsaylgîlile birlikte maksimum gerilme dayanH-Elaçan yeterli mekanik stabiliteye sahip olmasIElsaglayarak esnek önceden gerilmis kolajen malzeme tabakalarIa kullanllâbilmektedir (asagüh bakIlî). Burada "yeniden sogurulabilir" terimi, çapraz baglElIapEBtabil membranlEl, in v/i/o kolajenaz ve elastazlarI etkisiyle oldukça yeniden sogurulabildigi anlam. gelmektedir. Çapraz baglü yaplîlîstabil membran. kontrollü bir /n V/i/o yeniden sogurulabilirligi, fazla enflamasyon veya açuüia olmaks- iyilesme için gereklidir. Asag- ayrlütmçllglanan (Örnek 4, 3) Üastrid/um hi'sto//cumdan kolajenazlîliiullanarak enzimatik bozulma testi, in V/'i/o yeniden sogurulabilirligin mükemmel bir tahminini saglamaktadlEl Test edilmis, bulusun yeniden sogurulabilir çapraz bagIEl/aplgjstabil membran. tüm test edilmis prototipleri, 4 saat sonra en az %10 kolajen bozulmasüsergilemektedir (standart olarak tip I kolajen kullanarak DC Protein testi ile degerlendirildigi gibi), kolajen bozulmasII hlîElGeistlich Bio-Gide® membranEiçin olandan daha düsüktür), kullanllân çapraz baglama kosullarlEla bagIIlEl baglama, genellikle kimyasal çapraz baglama (örnegin EDC ve NHS kullanarak) veya dehidrotermal islem ile (DHT) çapraz baglama asamasi tabi tutuldugu anlam. gelmektedir, bu asama, genellikle kimyasal çapraz baglama ile (örnegin, EDC ve NHS'yi kullanarak) veya dehidrotermal islem ile (DHT), iki esnek önceden gerilmis kolajen malzeme tabakasElaralela yerlestirilen, kolajen malzeme ve inorganik seramik parçacilZlarII birlestirilmis kompozit tabakasEL'izerinde gerçeklestirilmektedir. Istege bagllZbIarak, kolajen malzeme ve inorganik seramik parçaclKlarI kompozit tabakaslZl bulusun membranlEb birlestirilmesinden önce, genellikle kimyasal çapraz baglama ile veya dehidrotermal islem (DHT) ile, çapraz baglanmaktadm baglElnembranlBl, kusurun bir mekanik stabilizasyonu, örnegin agIZl boslugunda olusabilen basIEç, kayma kuvvetleri ve egilme momentlerine dayanIi saglayarak, bir insan veya hayvanda dis kemigi kusuru içermeyen bir alanda kemik olusumu, kemik rejenerasyonu, kemik onarlElve/veya kemik degisimini destekleyebildigi anlam. gelmektedir. Bulusun membranII sekil stabilitesi, asagüb ayrlEtiIJEçllîianan bir tek eksenli 3-noktalllgilme testi açlKlanan yöntemlere benzerdir, bulusun membranl:l7,4'lük bir pH'da ve 37°C'Iik bir süklüîta PBS'ye daldlEllBiaktadE Bu test, bulusun membranIlEl, rekabetçi PLA membranEResorb-X® (KLS Martin)'den büyük ölçüde daha güçlü bir stabilizasyon sagladlgllrîlügiöstermektedir. Genellikle, bu tek eksenli 3 nokta egilme testinde, yeniden sogurulabilir sekildeki degismez membran, 8 mm gerilme için, en az 0,20 N'lik, tercihen en az 0,30 N'lik bir kuvvete dayanabilmektedir. kolajen malzeme tabakalarIlEl, gerilme uzama egrisinin uç bölgesinden dogrusal (aynlâaman esnek de denilen) bölgesine, kolajen malzeme tabakalarII baslanglgl boyutunun bir uzatllöiaslüh veya gerilmesine neden olarak bir gerilmeye tabi tutuldugu anlam- gelmektedir (BakIlZl Blayne A. Roder ve ark., 2002, Journal of Bio-mechanical Engineering, bölgede, esneklik katsaylîlîlen yüksek halindedir ve dolaylîls-Lla en yüksek sertlik elde edilebilmektedir. Bu gerilme, örnegin yaylarla, kolajen malzeme parçalarEÜzerinde radyal olarak gerçeklestirilebilmektedir. Gerilme uzama egrisinin dogrusal bölgesine kolajen malzemenin bir uzatllBiasEl/eya gerilmesine neden olmak amaclsîla bu tür bir gerilme için uygulanan kuvvetler kolajen malzemeye baglIlE Kolajen malzeme, domuz, slgilîl veya at peryton membranIan türetildiginde, kolajen malzemenin gerilme uzama egrisinin dogrusal bölgesine neden olan gerilme, kolajen malzeme tabakalarIlEl baslangiç] boyutlara %40 ila 100'Iük bir uzatma veya gerilmeye neden olarak, 1 ve 3N arasEUa gerilen yaylarla, radyal olarak kolajen malzeme parçalarüûzerinde gerçeklestirilebilmektedir. Dolaylglýla, "esnek önceden gerilmis kolajen malzeme" terimi, gerilme uzama egrisinin dogrusal/esnek bölgesinde olacak sekilde gerilen kolajen malzeme anlam. gelmektedir. Önceden gerilmis kolajen malzemenin esneklik katsayEüaynEizamanda Young katsayiggj örnegin MPa olarak ifade edilen gerilme uzama egrisinin dogrusal bölgesindeki egim, genel Kolajen malzeme ve inorganik seramik parçaclKlarI kompozit tabakasIBraya alan iki "esnek önceden gerilmis kolajen malzeme" tabakasII varllglÇlmembran, gerilme, sllZIgtlElna, kayma kuwetlerine ve egilme momentine maruz kald [glIa, kompozit tabakanI klElIBîasII önlenmesi için gerekli olmaktadlE Tercihen, esnek önceden gerilmîs kolajen malzeme tabakalarIan biri, 5 ila 500 um'lik delikler içermektedir. Membran, esnek önceden gerilmîs kolajen malzemenin delinmis tabakaslÇl kemik kusuruna dogru yönlendirilecegi yerde oldugunda, delikler, inorganik seramik-kolajen kompozit malzeme içerisine kemik olusturan hücreler tarafIan kolay bir invazyonuna olanak tan aktadß Inorganik seramik, hidroksiapatit veya bir dogal kemik minerali gibi kemik rejenerasyonunu destekleyen bir biyouyumlu malzemedir. Dis, periyodontal ve maksillofasiyal kemik kusurlarIa kemik büyümesini destekleyen iyi bilinen bir dogal kemik minerali, Geistlich Pharma AG'de ticari olarak mevcut olan Geistlich Bio-Oss®'dur. Bu hidroksiapatit bazIEkemik minerali malzemesi, dogal kemigin trabeküler mimarisi ve nanokristalin yap-I korunmaleia olanak tanlýhn, US 5,167,961 numaralEl Patent DokümanIa açilZlanan bir islemle dogal kemikten üretilmektedir. Tercihen, inorganik seramik, örnegin Geistlich Bio-Oss® gibi bir hidroksiapatit bazllZUogal kemiktir. özellikle 250 ila 400 um'lik bir boyuta sahiptir. Kolajen malzeme ve inorganik seramik parçacilîl kompoziti, kolajen malzemenin 1 aglEllilg ölçüsü için inorganik seramikten 1,5 ila 3,5 aglîllilîl ölçüsü, tercihen 2,0 ila 3,0 aglEIliEl ölçüsü içermektedir. Gerçekten, beklenmedik sekilde, kolajen malzemenin 1 aglEIlilZJ ölçüsü için inorganik seramikten 1,5 aglEIIIKJ ölçüsünin altIa veya kolajen malzemenin 1 aglEllilZ] ölçüsü için inorganik seramikten 3,5 ag lHliEl ölçüsünin üzerinde, membranlül, yukar- açlEIandiglEgibi ve asagüb ayrlEtiIJIlaçiElanan tek eksenli 3 nokta egilme testi ile degerlendirildigi gibi "yapEEI stabil" 0Imad[g]l:l(Örnek 4.2'de) bulunmustur. Kolajen malzeme ve inorganik seramik parçaciElarI kompoziti, kolajen malzemeden 1 aglHllE] ölçüsü için 2,0 ila 3,0 aglîllilîl ölçüsü içerdiginde, sekil stabilitesi özellikle yüksektir. Bulusun yeniden sogurulabilir çapraz baglEýapEßtabil membran, hidrofiliktir, genellikle PBS ile 5 ila 10 dakika tümüyle Elatilmaktadlîl Bulusun yeniden sogurulabilir çapraz baglü'aplglîstabil membranüdüsük oranda açllüia veya fazla enflamasyon ile iyi iyilesme özellikleri için iyi bilinen, Geistlich Bio-Gide®'inkilere benzer hücre yapEmasEözelliklerine sahiptir. Bu, açilma veya fazla enflamasyon gibi ters olaylar olmadan iyi iyilesme özelliklerinin göstergesidir. Bu tür iyi iyilesme özellikleri, tavsanlarI kafataslia olusan kemik kusurlarIEl korunmasEilçin bulusun çapraz baglülaplîßtabil membranEýerlestirildiginde gözlenmektedir. Bulusun yeniden sogurulabilir çapraz bagllj/aplîßtabil membranII kalIlglEgenellikIe, 0,5 Bulusun yeniden sogurulabilir çapraz bagllîyapmtabil membranII tipik sekilleri ve tipik boyutlarESekil 1'de gösterilmektedir. Bulus aynüamanda, bir insan veya hayvanda dis kemigi kusuru içermeyen bir alanda kemik olusumu, kemik rejenerasyonu, kemik onariÜ/e/veya kemik degisiminin desteklenmesi için bir implant olarak kullan! için stabil olan yukaridaki yeniden sogurulabilir çapraz bagIESekil ile ilgilidir. Bulus ayn Elzamanda, esnek önceden gerilmis kolajen malzemeden iki tabakasElaras- yerlestirilen kolajen malzeme ve inorganik seramik parçacllZIardan bir kompozit katman içeren yukar- açiKlanan yeniden sogurulabilir çapraz baglEyaplîEStabil membranI hazlEIianmasü için bir islem ile ilgilidir, islem asag-ki adllarüçermektedir: (a)KoIajen malzeme ve inorganik seramik parçacilZIardan bir kompozit tabakanI hazlEIhnmasÇlistege bagllîcblarak bu kompozit tabakanI çapraz baglanmasü (b) Gerilme uzama egrisinin dogrusal bölgesinde kolajen malzemenin esnemesine neden olarak gerilmeye tabi tutulan iki kolajen malzeme tabakasüaras. kolajen malzeme ve inorganik seramik parçaclklardan kompozit tabakanI birlestirilmesi ve yaplStlElüîasÇl dolaylgIEa, esnek önceden gerilmis kolajen malzemeden iki tabaka araleh yerlestirilen kolajen malzeme ve inorganik seramik parçaclKlarI bir kompozit tabakasII elde edilmesi, ve (c) ArdIan bir hidrofilik hale getirme isleminin geldigi, esnek önceden gerilmis kolajen malzemeden iki tabaka aras. yerlestirilen kolajen malzeme ve inorganik seramik parçaclElardan kompozit tabakanI çapraz baglanmasü Asama (a) asagldhkiler ile gerçeklestirilebilmektedir: Inorganik seramik parçacllZlar olarak, US-A-S417975 numarallîlpatent dokümanIa açllZlanana benzer bir islem ile kortikal veya süngerimsi kemikten hidroksiapatit kemik minerali parçacllîlarlfill üretilmesi veya alternatif olarak, Geistlich Bio-Oss Small Granules (Geistlich Pharma AG'de mevcut olan)'lerin küçük parçacllîlara ögütülmesi ve bu elemeye tabi tutulmasüdolayEls-Lla, elenmis hidroksiapatit kemik minerali parçacllZlarII elde edilmesi. Asaglkiler ile lifli kolajen malzemenin hazlEllanmasEl ° domuz, siglßveya at peritonu veya perikardiyumundan kolajenden zengin dokunun, EP-Bl-1676592 numarallîibatent dokümanII örneginde açlKlanana benzer bir isleme tabi tutulmasEh/eya alternatif olarak, bu tür bir islemle domuz peritonundan elde edilen Geistlich Bio-Gide membrandan (Geistlich Pharma AG'da mevcut olan) veya burada steril olmayan Geistlich Bio-Gide membranEldenilen, Geistlich Bio-Gide membranII endüstriyel üretiminde sterilizasyondan önce elde edilen ara üründen baslanmasi: ° bu sekilde elde edilen kolajen lifli dokunun parçalara kesilmesi (örnegin, makasla), kesilmis kolajen lifli dokularI bu parçalarllEl, blglak degismeni kullanarak kuru buzla karlîstlBlhasÇldolaylîlýla kesilmis kolajen Iiflerinin elde edilmesi, °bir elek ile bir kesme degirmeni ile kolajen lifli dokularI parçalara kesilmesi, dolayElýla kolajen lifi parçalarII elenmis bir bölümünün elde edilmesi. Asaglkilerin yapllfhaslýla, lifli kolajen malzeme ve hidroksiapatit kemik mineralinden bir kompozit tabakanI hazlEllanmasEl ° kesilmis kolajen Iiflerin aglîllilîça %0 ila 40'.. ve yukari elde edilen kolajen lif bölümlerinin elenmis bölümünün aglEllllZça %60 ila 100'ünün, fosfat tamponlu tuz PBS çözeltisinde karlgtlElIBiasEl/e sallanmasÇl ° yukarEIiaki paragrafta elde edilen lifli kolajenin 1 aglEllilZl ölçüsüne yukarlîzlla elde edilen elenmis hidroksiapatit kemik minerali parçaclKlarIan, 1,5 ila 3,5 aglîlllKl ölçüsü, 5000 xg'de santrifüjlenmesi, elde edilen peletin, bir dikdörtgen sekilde dökülmesi ve bir spatula kullanarak bir plakanI olusturulmasDElde edilen lifli kolajen malzemenin ve hidroksiapatit kemik minerali parçaclElarII kompozit tabakasübir vakumlu etüvde kurutulmaktadlEl Asama (a)'nI sonunda kolajen malzeme ve inorganik seramik parçac[lZIarII kurutulmus kompozit tabakaslfill çapraz baglanmasElgerekli degildir, ancak (b) asamasElsßsIa bu kompozit tabakanI islenmesini kolaylastlElna avantaj. sahiptir. Bu çapraz baglama, kimyasallar kullanarak veya dehidrotermal islem (DHT) ile gerçeklestirilebilmektedir. Kimyasallarla çapraz baglama, çapraz bagllJIapElEtabil membrana gerekli mekanik dayanliü verebilen herhangi bir farmasötik olarak kabul edilebilir çapraz baglama maddesini kullanarak gerçeklestirilebilmektedir. Bu tür uygun çapraz baglama maddeleri, gluteraldehit, gliksoal, formaldehit, asetaldehit, , N-sülfosüksinimidiI-6-(4'-azid0-2'- nitrofenilamino) heksanoat, heksametilen diizosiyanat (HM-DC), sinamit, difenilfosforilazit, genipin, EDC (1-etiI-3-(3-dimetilaminopropiI)-karb0diimit) ve EDC ve NHS (N- hidroksisüksinimit)'in bir karElEJlIEiçermektedir. KimyasallarEkuIlanarak çapraz baglama, EDC ve NHS'nin karlglfnllüullanarak, uygun bir sekilde gerçeklestirilmektedir. Bu durumda, yukar- elde edilen lifli kolajen malzeme ve hidroksiapatit kemik minerali parçaclElarII kurutulmus kompozit tabakasÇlbir -etansülfonik ila 3 saat oda lelakllgIEUa çapraz baglanabilmektedir. Tepkime sonra, pH 9,5'de 1 ila 3 saat 0,1 M Na2HPO4 tamponunda iki kez prototipleri inkübe ederek durdurulabilmektedir. Polar kalütllâr, prototiplerin bir 1M sodyum klorür çözeltisinde 1 saat ve bir 2 M sodyum klorür çözeltisinde bir saat iki kez inkübe edilmesiyle aIIbilmektedir. Kimyasal olarak çapraz baglanan prototipler, damlElIBig suda 30 ila 60 dakika toplamda 8 kez yllîlanabilmektedir. Sonra kurutma, toplamda 5 kez 15 dakika etanole batlüna ile gerçeklestirilebilmektedir, ardIan, 5 dakika üç kez dietileter islemesi ve sonra 10 mbar'da ve 40 °C'de gece boyu kurutma veya Iiyofilizasyon ( -5°C'nin aItIa dondurma ve geleneksel Iiyofilizasyon Islemi ile kurutma) gelmektedir. dehidrotermal islem (DHT) ile gerçeklestirilmektedir. Bu durumda, sonraki bir kurutma yöntemi gerekli degildir. Asama (b), asagidiakiler ile gerçeklestirilmektedir: - Asag-kilerle bir kolajen Iifinin hazlEIlanmasD ° kolajen parçalar.. yukariEIh elenmis bölümlerinin, 1500 ila 2000 bar'da bir yüksek basiEÇIEliiomojenlestirici kullanarak %3'lük bir yogunlukta 3,5'Iik pH'da bir sulu H3PO4 çözeltisinde karlgtlEiIIhasÇibu karigtlîiina birkaç kez tekrarlanmaktadiü ° bir sodyum hidroksit çözeltisi ekleyerek elde edilen bulamacI pH 7,0'a nötrlestirilmesi, kolajenin liyofilizasyonu ile yogunlastlElB'iasü/e bgkla ögütme ile bunun homojenlestirilmesi, ° daha fazla parçacilg görünmeyene kadar 60°C'ye @Birak pH 7,4'Iük fosfat tampon tuz çözeltisi PBS'de %2 ila 10'Iuk bir çözelti olarak elde edilen bulamaçtan kolajen lif yaplSt-I haziElianmaslÇb/e - Örnegin Sekil 2'dekine benzer bir aletin kullanilBiaslÇIkolajen malzemenin önceden Elatlliiigl iki tabakaslü, gerilim uzama egrisinin dogrusal bölgesinde kolajen malzemenin bir esnemesine neden olarak, gerilmeye tabi tutulmasÇl dolayEiýia, islak esnek önceden gerilmis kolajen malzemeden iki tabaka elde edilmesi, yukarIki kolajen lif yapigtlEElîijle sogurulan, (a)`da elde edilen kolajen malzeme ve inorganik seramik parçadElarI kompozit tabakasIlEi, Elak esnek önceden gerilmis kolajen malzemenin yukarlîiiiaki iki tabakasljras- yerlestirilmesi, örnegin Sekil 3'tekine benzer bir aletin kullanilBiasÇliâlak esnek önceden gerilmis kolajen malzemenin bu iki tabakasIiEi, kolajen lif yaplStBEEDle sogurulan kolajen malzeme ve inorganik seramik parçaclElariEiiEi kompozit tabakasi karsEiiiastlEIiiIhasEie Elak esnek önceden gerilmis kolajen malzemenin iki tabakasüaras. yerlestirilen kolajen malzeme ve inorganik seramik parçacilZlarI kompozit tabakasIiEi, düsük baslik; aItIa (örnegin 20 ila lmbar) 35 ila 45°C'Iik bir leiakIlEta kurutulmasEl Yukarüla açiEIanan yöntemde, kolajen malzemenin önceden Elatilüilgltabakalarll biri, 5 ila 500 um'lik delikler içerecek sekilde ignelerle delinmeye tabi tutulabilmektedir. Asama (c)'de, esnek önceden gerilmis kolajen malzemenin iki tabakaslîaras- yerlestirilen kolajen malzeme ve inorganik seramik parçaclElarI bu kompozit tabakasII çapraz baglanmasü kimyasallar kullanarak (örnegin EDC ve NHS kullanarak) veya dehidrotermal islem DHT ile gerçeklestirilebilmektedir. Kimyasal çapraz baglama, çapraz bagIEl/apEElstabil membrana gerekli mekanik dayanIiIZI verebilen herhangi bir farmasötik olarak kabul edilebilir çapraz baglama maddesini kullanarak gerçeklestirilebilmektedir. Bu tür uygun çapraz baglama maddeleri, gluteraldehit, glioksal, formaldehit, asetaldehit, , N-sülfosüksinimidiI-6-(4'-azido-2'- nitrofenilamino) heksanoat, heksametilen diizosiyanat (HM-DC), siyanamit, difenilfosforilazit, genipin, EDC (1-etiI-3-(3-dimetilaminopropiI)-karbodiimit) ve EDC ve NHS (N- hidroksisüksinimit)'in bir karglüllüçermektedir. Kimyasallar kullanarak çapraz baglama, EDC ve NHS'nin bir karEEJlIEkullanarak uygun bir sekilde gerçeklestirilmektedir. Bu durumda, yukar- elde edilen lifli kolajen malzeme ve hidroksiapatit kemik minerali parçacllîlarII kurutulmus kompozit tabakasÇlbir -etansülfonik ila 3 saat oda lelakllgIEUa çapraz baglanabilmektedir. Tepkime sonra, pH 9,5'de 1 ila 3 saat 0,1 M Na2HPO4 tamponunda iki kez prototipleri inkübe ederek durdurulabilmektedir. Polar kaIEtllâr, prototiplerin bir 1M sodyum klorür çözeltisinde 1 saat ve bir 2 M sodyum klorür çözeltisinde bir saat iki kez inkübe edilmesiyle aI-bilmektedir. Kimyasal olarak çapraz baglanan prototipler, damlüßîlgl suda 30 ila 60 dakika toplamda 8 kez yllZbnabilmektedir. Sonra dehidratasyon ve kurutma, toplamda 5 kez 15 dakika etanole batüria ile gerçeklestirilebilmektedir, ardIan, 5 dakika üç kez dietileter islemesi ve sonra 10 mbar'da ve 40 °C'de 30 dakika kurutma veya çözücü islemesi olmaks- liyofilizasyon (-10°C'nin aItIda dondurma ve geleneksel liyofilizasyon islemi ile kurutma) gelmektedir. dehidrotermal islem (DHT) ile gerçeklestirilmektedir. Bu durumda, sonra bir kurutma yöntemi gerekli degildir. Asama c)'nin hidrofilik hale getirme Islemi genel olarak, hidrofilik esnek önceden gerilmis kolajen malzemesinin iki tabakasüiras- yerlestirilen kolajen malzeme ve inorganik seramik parçaciEJarI çapraz baglEkompozit tabakaslü, bir sodyum klorür çözeltisi gibi, tercihen bir edilebilir bir tuz çözeltisine batlElBiasIüÇermektedir. Tercihen, hidrofilik hale getirme islemi, hidrofilik esnek önceden gerilmis kolajen malzemesinin iki tabakasElarasIEh yerlestirilen kolajen malzeme ve inorganik seramik parçacllglarI çapraz baglEkompozit tabakasII bir sodyum klorür çözeltisine batBHiasIEl içermektedir. Bulusun yeniden sogurulabilir çapraz bagIEyaplEElstabil membranÇIX-ISIElübeta [SIEIEl/eya gama lglüliasüle sterilize edilebilmektedir. Sekillerin klêla açlElamasEl Bulus, bulusun tercih edilen yapHândlBlnalarII açllZlaylEEörneklerine ve ekli sekillere göre asag- daha ayrlEtUIEiçEanacaktlEI sekillerde: Sekil 1, bulusa göre yeniden sogurulabilir çapraz baglEyaplgElstabil membranlarI tipik sekillerini ve tipik boyutlarIEgöstermektedir. Bu membranlar, egriligi ön, sol taraf veya sag tarafi veya protezin arkas- yerlestirilen 1 ila 3 dislik (kesici ön disler, köpek disi, küçük azüjisleri veya azlIiHisler) dis yuvasEbosIuklarlîib karsHJIZl gelecek sekilde, düz (1), (1'), U- seklinde düz (2), (2') veya U seklinde egri (3), (3') olabilmektedir. Ön ürünlerin boyutu, arka ürünlerinkine benzerdir, egriligin yarlgbpüdis yuvasüslîli- uyacak sekildedir. Tipik boyutlar a = 5 ila 20nm, b = 8 ila 20 mm, c = 6 ila 10 mm, d = Sekil 2, bulusun bir düz veya U seklindeki degismez membranlEla birlestirilmelerinden önce polimer tabakalarlEl gerilmesine olanak tanlEmasEilçin uygun olan aletin sematik bir görünümüdür. Sekil 3, bir düz sekilli degismez membran. birlestirilmesini göstermektedir, burada (1), bir çelik plakadlü (2), silZlgtlîllIhS bir poliüretan süngerdir, (3) bir poliyamit agdB (4) bir esnek önceden gerilmis kolajen tabakasIEve (5), çapraz bagIElbir hidroksiapatit kolajen plakasIB Sekil 4, PLA membran Resorb-X® (KLS Martin)'a klýbsla EDC/NHS veya DHT ile çapraz baglanan bulusun yeniden sogurulabilir yaplQZStabil membranElçin bir 3 nokta egilme analizi testinde gerilmenin bir fonksiyonu olarak kuwetin degisimini göstermektedir. Sekil 5, domuz peritonundan türetilen Geistlich Bio-Gide® kolajen membranüGeistlich Pharma AG), domuz perikardiyumundan türetilen Jason® kolajen membranEl(aap BiomateriaIs/Botiss) ve domuz SIS'Ian türetilen Dynamatrix® kolajen membranüCOOk Biotech Inc.) ve fasya kasIan türetilen bir kolajen malzeme gibi bulusa göre yeniden sogurulabilir çapraz baglElyaplgDstabil membranlarI esnek önceden gerilmis kolajen malzemesinin tabakalarlEtla kullanllâbilen bir kaç ticari olarak mevcut, islak ve steril kolajen malzemesinin gerilme uzama egrilerini göstermektedir. Bu gerilme egrilerinin her birinde, küçük gerilme degerleri üzerine büyük sekil degisimleriyle karakterize edilen bir uç bölge, birim gerilme bas. uzamada dogrusal bir artlgile karakterize edilen dogrusal veya esnek bir bölge ve polimerik liflerin parçalanmasls-Lla karakterize edilen bir bozulma bölgesi bulunmaktadlü Bu sekilde gösterilen gerilme uzama egrilerinde, esneklik katsayEElveya Young katsayElZl örnegin, gerilme uzama egrisinin dogrusal bölgesinin egimi), Geistlich Bio-Gide® membranüiçin yaklasllZl 8 MPa, Jason membranlIliçin yaklasllZl 64 MPa, Dynamatrix® membranEilçin yaklasilZJ 54 MPa ve fasya kasIan türetilen kolajen malzeme için yaklasllZJ 56 MPa'dlB Sekil 6, Geistlich Bio-Gide® kolajen membranElDHT (FRM) ile çapraz baglanan yeniden sogurulabilir sekildeki degismez membranI bir prototipi ve Cystoplast® PTFE membranEI (Keystone Dental) için 37°C'de PBS'de 24 saat inkübasyondan sonra, membrana yaplgtlîllân insan diseti fibroblastlarII %'sinin bir kolon semasIlB Asaglöhki örnekler, kapsamII-ßEHamalG bulusu açllZlamaktadE Örnek 1 Ham maddelerin haziEllanmasEl 250 ila 400 um'lik bir boyuta sahip olan hidroksiapatit ince parcacllZlarI hazlîllanmaslîllA) Hidroksiapatit kemik minerali ince parçaclKlarlZl 250 ve 400 um arasIa bir ek eleme asamasIEIkulIanarak US-A-5417975 numaralüpatent doküman-n Örnekler 1 ila 4'te açllZIandlglgibi kortikal ve süngerimsi kemikten üretilmektedir. Alternatif olarak, hidroksiapatit kemik minerali ince parçacllZJarÇlbir püskürtücü ve 250 ve 400 um arasHa bir ek eleme asamasIEkullanarak dikkatli impaktasyon ile Geistlich Bio-Oss® Small Granules (Geistlich Pharma AG, CH-6110, Isviçre'de mevcut)'leri ögüterek üretilmektedir. Yukarlilhki (A)'da hazlîlhnan 250 ila 400 um'lik bir boyuta sahip olan hidroksiapatit kemik minerali ince parçacßarükullanlia kadar cam siselerde saklanmaktadlE Kolaien Iiflerin hainianmaslîüBl EP-Bl-1676592 numaralD patent doküman-n "Örnek" inde açüîlandlgilîi gibi, genç domuzlardan periton membranlar tümüyle, mekanik araçlarla et ve yagslîi hale getirilmektedir, akan su altia yiEhnmaktadlEl ve 12 saat %2'lik NaOH çözeltisi ile islenmektedir. Sonra membranlar, akan su aItIa yllZlanmaktadlE ve %0,5'lik HCI ile asitlendirilmektedir. Malzemenin tüm kal-[giEiboyunca asitlendirilmesinden sonra (yaklaslki 15 dakika), malzeme, 3,5'lik bir pH elde edilene kadar suyla yiKlanmaktadlEl Sonra malzeme, %7 tuz çözeltisi ile büzdürülmektedir, %l'lik NaHC03 çözeltisi ile nötrlestirilmektedir ve akan su aItlEUa yllZlanmaktadE Sonra malzeme, asetonla dehidrate edilmektedir ve n-heksan ile yagIII allElnaktadlEl ve etanol eter kullanarak kurutulmaktadlEl Bu sekilde elde edilen kolajen membranlariElI 2 x 2 cm'lik parçalarÇImakas kullanarak elle kesilmektedir. Alternatif olarak, Geistlich Bio-Gide® membranlEUan (Geistlich Pharma AG'da mevcut olan) 2x 2 cm'lik parçalar, makas kullanarak elle kesilmektedir. Yukari elde edilen kolajen membranII 2 x 2 cm'lik parçalarIan 1 g, 200 ml kuru buzla karlgtlîllîhaktadlîlve tlElanma olusmayana kadar 5000 dds'de (rpm) bir biçak degirmeninde (Retsch® Grindomix) Kuru buz buharlastßlûiaktadlîl ve bu sekilde (B)'de elde edilen kolajen lifler, sonraki kullanIia kadar Minigrip streç filmlerinde saklanmaktadiîl Kesme deöirmeni kolaien lif parcalar" haziîlianmaslIüC) Yukari elde edilen 2 x 2 cm'lik kolajen lif parçalarülSOO dds'de 0,8 mm'lik bir elek ile bir kesme degirmeninde kesilmektedir, kesme degirmeni kolajen Iif parçalarII (C) elenmis bir bölümü elde edilmektedir. Bir kola`enlif a _[5] hazlEIlanmas D Kesme degirmeni kolajen lif parçalarlElI elenmis bölümü (C), %3'Iük bir çözeltinin elde edilmesi için suda karlStlEllIliaktadlîl pH, fosforik asit H3PO4 ekleyerek 3,5'e ayarlanmaktadlEl tekrarla nmaktad [El Elde edilen bulamaç, bir sodyum hidroksit çözeltisi NaOH ekleyerek yaklasllZl pH 7'ye nötrlestirilmektedir ve gece boyunca 4°C'de jellestirilmektedir. Kolajen, -40°C'de 4 saat dondurulduktan sonra -10°C'de ve 0,310 mbar'da liyofilizasyon ile yogunlastmiaktadlîlve bükla ögütme ile homojenlestirilmektedir. Kolajen lif yaplgtlHElgîKD), daha fazla parçaclEl görünmeyene kadar 60°C'ye @Birak pH 7,4'de, fosfat tamponlu tuz çözeltisinde %2 ila 10'luk çözelti olarak elde edilen bulamaçtan hazEllanmaktadlEl Örnek 2 Istege baglElolarak çapraz baglanan bir hidroksiapatit/kolajen plakasII hazlîllanmaslIaE) Örnek 1'de hazlEllanan kolajen Iiflerinden (B) 4 g ve kesme degirmeni kolajen lif parçalarlEUan (C) 6 g, 140 g fosfat tamponlu tuz çözeltisi ile karlgtlEllBiaktadlElve bir kokteyl karlgt- sallanmaktadlü Bir baska örnekte, kolajen lifleri tümüyle, kesme degirmeni kolajen lif parçalarEile ikame edilmektedir. Örnek 1'de hazlEIlanan hidroksiapatit ince parçaclKlardan (A) 20 g eklenmektedir ve elle karlgtlElIhaktadlB santrifüjlenmektedir. Pelet, 8 x 12 cm'lik bir düz dikdörtgen seklinde iki poliyamit aglîaras. (21 pm'lik gözenek boyutu ve toplam %17'Iik açIEl yapDJdökülmektedir ve madde, bir laboratuvar kaslglülle fazla suyun allElnasElle yogunlastlElBîaktadlB Elde edilen plakalar, 1 ila 1,7 kPa'IlKl bir balebta etüvde kurutulmaktadlB Poliyamit aglarßlümaktadlü Hidroksiapatit-kolaien DlakasII isteGe baölßlarak çapraz baGlanmasEl Hidroksiapatit kolajen plakasII islenmesinin kolaylastlElllIhasEiçin, bu, kimyasal olarak veya dehidrotermal islem ile (DHT) çapraz baglanmaktadE EDC/NHS ile kolajenin kimyasal çapraz baglanmasElgerçeklestirilmektedir, hidroksiapatit kolajen plakalarII genel stabilitesinde bir artlgla neden olmaktadE Sonra kurutulmus plakalar, ve %40 etanolde, pH 5,5'de 2 saat Tepkime, pH 9,5'de bir saat 0,1 mol/I Na2HPO4 tamponunda iki kez prototipleri inkübe ederek durdurulmaktadlEl Polar kallEtllâr, prototiplerin bir 1 mol/l sodyum klorür çözeltisinde 1 saat ve bir 2 mol/l sodyum klorür çözeltisinde bir saat iki kez inkübe edilmesiyle aIlEi'naktadlE Kimyasal olarak çapraz baglanan prototipler, damlfllüilgl suda 30 ila 60 dakika toplamda 8 kez ylEtinabiImektedir, sonra toplamda 5 kez 15 dakika etanole batlElna ile dehidrate edilmektedir. Sonra kurutma, 5 dakika üç kez dietileter islemenin gerçeklestirilmesi ile ve ardIan 10 mbar'da ve 40 °C'de 30 dakika kurutma veya liyofilizasyon (-10°C'nin aItIa dondurma ve geleneksel liyofilizasyon Islemi ile kurutma) ile gerçeklestirilmektedir. dehidrotermal islem (DHT) ile gerçeklestirilmektedir. Bu durumda, sonra bir kurutma yöntemi gerekli degildir. Örnek 3 Önceden gerilmis iki esnek tabakanlEl, hidroksiapatit/kolajen plakalarII iki karslîl yüzü üzerinde birlestirilmesi ve yapistülîhasEile yeniden sogurulabilir bir çapraz baglÇlyaplgEl stabil membranI(M) hazlEllanmasmE) Asaglki açiElama, Sekil 2 ve 3'e göre daha iyi anlasiiâcaktlEl Bir düz veya U-seklindeki prototipin birlestirilmesi, kolajen malzemenin tabakalari. gerilmesine olanak tanlýlan sabit veya egilebilir çerçevelerin kullanlIÜgierektirmektedir. Düz veya U-seklindeki prototiplerin olusturulmasEaF) Sekil 2, bulusun bir düz veya U-seklindeki yaplîElstabil membran. birlestirilmelerinin öncesinde, kolajen malzemenin tabakalarII gerilmesine olanak tanIiak Için uygun olan aletin sematik bir görünümüdür. Bu alet, herhangi bir uygun malzemeden örnegin çelik veya alüminyumdan yapllâbilen, bir çerçeveden (a) olusmaktadlEI Çerçeve için ana amaç, yaylarEIb) tutturmaktlü bu iki islak kolajen tabakasIlîic) germektedir. Hidroksiapatit/kolajen plakasEiE), iki kolajen tabakaslîdc) aras. yerlestirilmektedir. Eger bir U seklindeki yeniden sogurulabilir çapraz bagllîsekilde degismez membran istenirse, kolajen plakasII (E) egilmesi için bir negatif sekil (e) ve menteselerle (f) çerçeveler kullanlEhaktadlEI dolaylîlýla bu U- seklindeki düz prototiplere neden olmaktadIEl Steril olmayan Geistlich Bio-Gide Collagen tabakalarllül kolajen malzemesi tabakalarÇlkoIajen malzemenin gerilim egrisinin dogrusal bölgesinde olacak sekilde, her yayI 2 ila 3 N gerilmesiyle baslanglgtaki uzunlugun %40 ila 100'ü uzatarak veya esneterek önceden gerilmektedir. Bu dogrusal bölgede, esneklik katsaylîlln yüksek degerindedir ve dolaylîlsîla, en yüksek sertlik elde edilmektedir. Kolajenöz dokularI viskoelastik dogasüiedeniyle, Elak ve gerilmis malzemeler, yaklaslEl 30 dakika gerilmis halde tutulmaktadlü Önceden gerilmis kolajen membran. gevsemesi nedeniyle, yaylar, kolajen malzemenin gerilim egrisinin dogrusal bölgesinde olacak sekilde, tekrar 1 ila 3 N'ye gerilmektedir. Steril olmayan Geistlich Bio-Gide® kolajen membranEtlan kesilen 10 cm'lik bir çapa sahip olan iki yuvarlak kolajen parçasEkullanUBiaktadE biri, 0,88 mm'lik bir mil çapEille cm2 basi 50 igne içeren bir igne makarasEille delinmektedir. Kolajenin bu iki yuvarlak parçaslZlkolajen parçalarII baslanglgboyutunun %40 ila 100'Iük bir uzamas- neden olarak, Elatllmakta ve her biri 1 ila 3 N gerilen 12 yay ile radyal bir sekilde gerilmektedir. Bu asama tamamlandHZtan sonra, hidroksiapatit/kolajen plakalarüE), kolajen lif yaplgtlEElgEl (C) ile her iyi yüzden Elatllüiaktadlîl ve sonra, hidroksiapatit/kolajen plakasü iki esnek önceden gerilmis kolajen tabakasEiarasIEla yerlestirilmektedir. Merkezi çubukla (e) birlikte menteseler (f), U seklindeki prototiplerin üretilmesi için gereklidir (asaglýla bakIlZ). Esnek önceden gerilmis membranlar, bir @Bina plakasi yerlestirilmektedir ve 40°C'ye ön Örnek 2'de elde edilen çapraz bagIElBio-Oss plakaleE), ön Elflßißlkolajen lif yaplgtlElEîEGD) içerisine kisaca daldlEllBwaktadlE ve iki esnek önceden gerilmis kolajen membranElairas- yerlesti riI mektedir. Poliyamit aglarEiIe birlikte, süngerler (5cm kal-[Eta, yaklasüîlZO ila 25 mg/cm3 yogunlukta, aralarIa baglanmlgdelikler içeren, poliüretandan yapllân), her iki tarafa yerlestirilmektedir, 120 kPa'ya kadar leJStlEtlna baleblar- neden olarak %50 ila 95 SEIZIglEllBiaktadE BakIlîJ bir düz yaplîßtabil membran. birlestirilmesini gösteren Sekil 3, burada (1), bir çelik plakadlEl (2), SUZEIEIIBiEbIr poliüretan süngerdir, (3), bir poliyamit agdE (4), esnek önceden gerilmis kolajenin bir tabakasIlElve (5), bir çapraz bagl[Hiidroksiapatit-kolajen plakasIlEl ArdIan, yapütoplam 32 saat hava baletIda 10 mbar'a bir sabit düsüsle 40 °C'de bir vakumlu etüvde kurutulmaktadIE U-seklindeki prototiplerin olusturulmasEl Uzman kisi, Sekil 2 ve 3'deki cihazEl/e uygun bir negatif sekil üzerinde yaplýlîtegerek ve süngerlerden birini daha ince bir poliüretan sünger veya bir lifsiz kâglîlhavlu ile degistirerek, U-seklindeki prototiplerin düz veya kavisli olusturulmasElçin yukari aç[E]anan yöntemi, kolay bir sekilde uyarlayacaktlü Düz veya U-seklindeki prototiplerin Çapraz baglanmasEaG) Düz veya U-seklinde prototipler (F), makas kullanarak veya küçük bir dairesel testere kullanarak istenen boyutlara kesilmektedir. Sonra prototipler, kimyasal olarak veya dehidrotermal islem (DHT) ile çapraz baglanmaktadß yogunlugunda pH 5,5'da 0,1 mol/L MES tampon ve hacimce %40'IlK] bir etanol içeriginde gerçeklestirilmektedir. Çapraz baglama çözeltisinde prototip yogunlugu %10'dur. Homojen çapraz baglamaya olanak tanlEhnasEliçin, plakalar ilk olarak vakum altIa (<40 mbar) Islenmektedir ve çapraz baglama tepkimesi, 4 °C'de 2 saat gerçeklestirilmektedir, tüm tamponlar, bu sükltgh önceden sogutulmaktadlB Tepkime, bir saat pH 9,5'de 0,1 mol/l NazHPO4 tamponunda iki kez prototipleri inkübe ederek durdurulmaktadlEI Polar kaIiTitllâr, prototiplerin bir 1 mol/I NaCI çözeltisinde 1 saat ve bir 2 mol/I NaCI çözeltisinde bir saat iki kez inkübe edilmesiyle aIiEmaktadlEl Prototipler, damüßilgl suda 30 ila 60 dakika toplamda 8 kez yiiZlanabiImektedir. Sonra dehidrasyon ve kurutma, 15 dakika 5 kez etanol islemi ve 5 dakika üç kez dietileter islemenin gerçeklestirilmesi ile ve ardIan 10 mbar'da ve 40 °C'de gece boyunca veya ürün tümüyle kuruyana kadar kurutma veya geleneksel Iiyofilizasyon (-10°C'nin aItIa dondurma ve geleneksel Iiyofilizasyon islemi ile kurutma) ile gerçeklestirilmektedir. dehidrotermal islem (DHT) ile gerçeklestirilmektedir. Bu durumda, sonraki bir kurutma yöntemi gerekli degildir. Yukarlîzlh açilZlanan yöntemlerle elde edilen prototipler, bir veya iki saat içerisinde tuz çözeltisi veya PBS'de Elatilîhaktadlîl 10 dakika içerisinde Elatmaya olanak tanlEmasEilçin, prototipler, yaklasiEJ olarak 1 ila 2 saat dammg suda yeniden ElatiiBiaktadEl Bu slgda, yukari açllZIanan igne makarasiîîle bir taraf. delinmesi de mümkündür. Sodyum klorür, prototiplerin, üç kez 40 dakika 200 g/I'Iik bir NaCI çözeltisinde inkübe edilmesiyle uygulanmaktadlB Sodyum klorür, asag- açÜZlandlgiiîgiiibi (H) çökeltilmektedir. Capraz baglillüz veya U-seklinde prototiplerin kurutulmasEüH) Çapraz bagllîprototipler, toplamda 5 kez 15 dakika etanole batiEina ile dehidrate edilmektedir. Sonra, ya çözücü ile kurutma ile (5 dakika üç kez dietileter islemi ve ardIan 10 mbar'da ve 40 °C'de kurutma) veya geleneksel Iiyofilizasyon (-10°C'nin aItiEUa dondurma ve geleneksel mm, çogunlukla 1,2 ila 1,8 mm'dir. Kurutulmus prototipler istege baglüblarak, 27-33 kGy'de x-SiEiEüe EiEIama ile sterilize edilmektedir. Örnek 4 Yeniden sogurulabilir çapraz baglüraplîl] stabil membranI özellikleri Örnek 3'de elde edilen, yeniden sogurulabilir çapraz bagIEiyapEEIstabil zarI asaglîliaki özellikleri belirlenmistir: (1) PBS'de Elatllâbilirlik, (2) Mekanik dayann, (3) C/ostr/d/'um hi'sto/yti'cumöan kolajenaz kullanarak enzimatik bozulma ve (4) Hücre yaplgmaslî(5) Esnek önceden gerilmis kolajen malzeme tabakalarII uzamasII ölçülmesi (6) Kolajen hidroksiapatit plakalarüle son prototiplerin kalIigill ölçülmesi (1) PBS'de Elatüâbîlirlik Görsel olarak degerlendirilebildigi gibi PBS'de (Fosfat tampon tuz çözeltisi) tümüyle Elanma süresinin, yeniden sogurulabilir çapraz baglEl/apmtabil membranI farkllîibrototipleri için 5 ve 10 dakika arasIa oldugu gözlenmektedir, bu zaman temelde, etanolle dehidrasyon ve kurutma öncesinde sodyum klorür islemine baglIE (2) Mekanik dayann Bulusun membranII sekil stabilitesi, EN ISO 178 ve ASTM D6272-10'da açilZJanan yöntemlere benzer olan tek eksenli bir 3 noktalEIegiIme testi ile degerlendirilmektedir, bulusun membranÇI7,4'Iük bir pH'da ve 37°C'Iik bir slîlakliiîta PBS'ye daldlîilîhaktadlü Bu test, en kullanlîsllîtest olarak degerlendirilmektedir, çünkü kemik kusuru içermeyen bir alanda bir kemik sorununun mekanik olarak stabilize edilmesi için tasarlanan her yapiîßtabil membran egilme momentlerine ugrayacaktiEl DolayElýla, 3- veya 4-nokta egilme, kullanilân malzemelerin karakterize edilmesi ve ayri& örnegin farklEikalIiElarla farklEIürünlerin karsüâstlîilüiasüçin bir test olarak kullanüâbilmektedir. Malzeme karakterizasyonu için, egilme katsayEElen uygun parametredir. Ancak, farklükaIIEElara sahip olan farkIIZIürünIerin karsüâstlîlliiasüçin, 8 ila 10 mm'lik girintiden sonra maksimum kuwet, daha uygundur ve dolaylîlüa ürünün karakterize edilmesi için kullanilBiaktadIB Kullanilan tek eksenli bir 3-nokta egilme testinde, örnekler, 50 x 13 mm'lik bir boyuta kesilmektedir ve tümüyle Elanma görsel olarak gözlenene kadar 37 °C'de PBS'de inkübe edilmektedir. Mekanik test, her destekleme yap.. 26 mm'lik bir destek mesafe genisligi ve mm'lik bir yarüap ile bir 3-nokta egilme cihazlEUa dakika basi 5 mm'de gerçeklestirilmektedir. Egilme katsaylîÇl %1 ve 5 arasia egilme uzamasIa hesaplanmaktadlîi Elde edilen maksimum kuvvetler, merkezi disleyiciyi 8 ve 10 mm arasiEb indirdikten sonra bildirilmektedir. Test, EDC/NHS ile çapraz baglanan 1,5 mm kalIIthaki bulusun bir membranÇlDHT ile çapraz baglanan 1,6 mm kalIiKtaki bulusun bir membranü/e 0,137 mm kalIlKtaki KLS Martin'den PLA membran Resorb-X® için gerçeklestirilmektedir. Bu membranlar için uzamanI bir fonksiyonu olarak kuvvetin degisimini gösteren Sekil 4, EDC/NHS ile çapraz baglanan (8 mm uzama için yaklasiiîi 0,65 N) veya DHT ile çapraz baglanan (8 mm uzama için yaklasüa 0,40 N) bulusun membranII mekanik dayanIiIiEi, PLA membran Resorb-X®'inkinden (8 mm uzama için yaklaslEl 0,10 N) büyük ölçüde daha (3) C/ostr/d/'um h/StO/yticumtlan kolaienazI kullanIigliEnzimatik bozulma testi Insan vücudunda, kolajenler, insan dokusu matris-metalloproteinaz (MMP), katepsinler ve tahminen bazlZiserin proteinazlar ile bozulmaktadiEi KolajenazlarI (özellikle MMP-1, MMP-8, MMP-13 ve MMP-18) dogrudan kolajen bozulmasüiçin en önemli enzimler oldugu MMP'ler en iyi sekilde incelenmistir (Lauer-Fields ve ark. 2002 Matrix metalloproteinases and collagen catabolism in Biopolymers - Peptide Science Section and Song ve ark. 2006 Matrix metalioproteinase dependent and independent collagen degradation in Frontiers in Bioscience). KolajenazI kolajen dokularIDe membranlarmozabilmesi, substrat esnekligi ve kolajen tipi, MMP aktif alanlar ve MMP eksozit'lere baglIE Kolajenazlar, üçlü sarmal kolajende dizilmekte, onu açmakta ve sonra onu aylEnaktadlE(Song ve ark. 2006, yukarEibakIlü. Farklükolajen tipleri arasIaki bozulma farklarII üstesinden gelinmesi aç-an, kolajenin kolajenaz bozulmaslZ] genellikle, yüksek bir katalitik hlîti sahip olan C/ostr/U/'um hi'stoß/t/'cumdan kolajenaz kullanarak degerlendirilmektedir (Kadler ve ark. 2007 Collagen at a glance in J Cell Sci). Genellikle, dogal bir kolajen ürünü kimyasal olarak çapraz baglanmigi bir kolajen ürününden daha hlîIEbozulmaktadlEi Bu testte, kolajen ürünleri (1 mg/ml kolajende yeniden sogurulabilir çapraz bagllîyapmtabil membranI örnekleri), Tris-tampon içeren bir kalsiyumda C/ostr/'d/um h/Stolyt/cumöan 50 birim/ml ile 37 °C'de inkübe edilmektedir (bir birim, kalsiyum iyonlarII varliglIa pH 7,4'de 37 °C'de 5 saat 1,0 mikromol Iösin ninhidrin renkte sigilEl asil tendonu esdegerinden kolajenden peptitlerin serbest bßklißîasüolarak tanIilanmaktadlE) ve kolajen matrisinin bozulmasEgörsel olarak ve referans malzemesi olarak Kolajen Tip I'i kullanarak Bio-Rad LaboratuvarlarIan "DC Protein testi" ile ölçülmektedir (Hercules, USA, Order Nr. 500-0116). Kolajen yogunlugu, bir mikro kuyucuklu plakalElspektrometre kullanarak belirlenmektedir (Infinite M200, Tecan'dan mevcut olan). Bulusun yeniden sogurulabilir çapraz baglülaplîßtabil membranII tüm prototipleri, 4 saat sonra en az %10 kolajen bozulmasEtergilemektedir (standart olarak kolajen tip I'i kullanan DC Protein testi ile degerlendirildigi gibi), kolajen bozulmasII oranüGeistlich Bio-Gide® membranEilçin olandan daha düsük) kullan Hân çapraz baglama kosullar. bagl- (4) Hücre yapgjasü Farklljnembranlara hücre yaplginasÇliIk olarak daha önce bir floresanla, Iipofilik boya ile etiketlenen 100'000 insan diseti fibroblastlarEile 8 mm membran deliklerinin ekilmesi, 24 saat PBS'de 37 °C'de inkübe edilmesi, PBS'de membranlarüyllîbyarak yaplgkan olmayan hücrelerin allîitnasÇIyaplSkan hücrelerin çözündürülmesi ve 485 nm'de floresanI ölçülmesiyle onlarI ölçülmesi ile degerlendirilmektedir. Floresan, Iiziz öncesinde ylEbnmamlSl olan hücre ekilmis membran delikleriyle olusturulan bir standart egriye normalize edilmektedir. Yaplîßtabil yeniden sogurulabilir membran için elde edilen sonuçlar, yüzde olarak, farkllîlis membranEtiplerine, bulusun yeniden sogurulabilir çapraz baglElyapEEBtabil membranEl/e Cystoplast® PTFE membranüKeystone Dental) üzerine yaplgiabilen hücrelerin %'sini yatay olarak gösteren bir kolon diyagramliölan Sekil 5'te gösterilmektedir. Sekil 5, bulusun yeniden sogurulabilir çapraz bagIlZlyaplEEistabil membran. yaplgmanü, yaklaslEl %4'lük Cystoplast® PTFE membranIlEkinden, yaklas[la%13'lük Geistlich Bio-Gide® membranIEkine çok daha yakI bir deger olan, yaklasllg %10,5 oldugunu göstermektedir. Geistlich Bio-Gide® membranÇIdüsük oranda açllîha (Zitz-mann, Naef ve ark. 1997; TaI, Kozlovsky ve ark. 2008) veya fazla enflamasyonsuz (Jung, 2012) iyi iyilesme özellikleriyle iyi bilinmektedir. Bulusun yeniden sogurulabilir çapraz bagllîlyaplgîstabil membran. insan diseti fibroblastlarII yaplgmasII bu ölçülen degeri, fazla enflamasyon veya açiliia gibi ters olaylar olmadan yumusak doku iyilesmesi için belirleyicidir. (5) Esnek, önceden qerilmis kolaien malzeme tabakalarII uzamasII ölcülmesi Kolajen tabakalar.. gerilme miktarII belirlenmesi Için, kuru kolajen tabakasÇl henüz gerilmemis yaylarleuIlanarak (Sekil 2, b bölümü) bir germe halkasi (Sekil 2, a bölümü) monte edilmektedir. MembranI merkezinde, birbirinden birkaç santimetre uzakta olan en az 4 nokta, bir kursun kalem veya tükenmez kalem kullanarak isaretlenmektedir. Her nokta araslßhaki mesafe, bir cetvel kullanarak ölçülmektedir. Ölçülen mesafeler, her nokta arasIaki baslanglgi uzunluklarElolarak belirlenmektedir. Kolajen tabakaslZI su içerisine daldlîllîhaktadlîl ve istenen kuvvete gerilmektedir. Kolajen tabaka, suda 30 dakika inkübe edilmektedir. Çogu kolajen tabakasII viskoelastik dogasEhedeniyle, gerilim azalmaktadlEl Dolayiglýla, kolajen tabakalariEllEJ, tekrar gerilmesi gerekmektedir. 30 ila 40 dakika inkübasyondan sonra, her nokta arasIaki mesafe bir cetvel ile ölçülmektedir. Uzama yüzdesi, gerilmeden sonraki uzunluktan ilk uzunlugu çlElararak, onu ilk uzunluga bölüp 100 ile çarparak belirlenmektedir. Gerilme uzama egrisinin dogrusal bölgesinde olacak tipik sonuçlar, steril olmayan Geistlich BioGide için %40 ve 100 araleUa uzamadlE](uzanIi, esneme). Bu yöntemle ölçülen uzama degerleri, bir tek eksenli uzama testinde elde edilen uzama degerleriyle dogrudan klýhslanamamaktadlü (6) Kolaien hidroksiaDatit Dlakasüie son prototinin kalir-ligiglrîl ölcülmesi Son prototiplerin veya kolajen/hidroksiapatit plakasII ("E") kaII[glÇl yukari aç[lZIand[g]l:l gibi veya bir sürmeli kumpas kullanarak ölçülebilmektedir. (7) FarklERolaien tabakalar.. mekanik özelliklerinin analizi (Sekil 5) Kolajen tabakalarII farklEkaynakIarII karsüâstlülüiasEi/e mekanik özelliklerinin tahmin edilmesi için, Elak örneklerin standart tek eksenli gerilmesi kullanilîhaktadIB Bu tür bir analitik yöntem için genel bir düzenek, ASTM D882-09 "Standard Test Method for Tensile Propeities of Thin Plastic Sheeting"de açiElanmaktadlEI Kullanilân kolajen membranlarII yüksek maliyetleri nedeniyle, testin çesitli parametreleri uyarlanmaktadlEI Örnekler, örnegin 2 x 1 cm'lik dikdörtgen tabakalara kesilmekte, izotonik fosfat tamponlu tuz çözeltisinde önceden Elatißîakta ve her örnek tutucu arasIa 1 cm'lik bir mesafeyle bir gerilim test makinesine monte edilmektedir. Örnekler, dakika bas. ilk uzunlugun %33'ü bir sabit hlîüa gerilmektedir. %100 ilk uzunlugun kaydedildigi ön kuvvet, tipik olarak 50 kPa'ya ayarlanmaktadß Örnegin uzamasü iki örnek tutucu arasIaki mesafeyi kullanarak hesaplanmaktadlîi Bu sekilde, Sekil 5'teki gerilme-uzama egrileri elde edilmektedir. Bulus, sekillerde ve yukarlkui tarifnamede ayrlEtllIüolarak gösterilir ve aç[lZlanlHken, bu gösterim ve açlKIama, açllîlaylîü/eya örneklendirici olarak degerlendirilmeli, kElîliaylEEdJlarak degerlendirilmemelidir: bulus açilZlanan yapilândßnalarla sIElland EllBmmaktadE TR TR TR TR TR TR TR TR